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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-27
(54)【発明の名称】腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230620BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230620BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230620BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230620BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230620BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230620BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230620BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230620BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230620BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230620BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230620BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20230620BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230620BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230620BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230620BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20230620BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230620BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230620BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230620BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/867 Z
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12N5/0783
C12N5/10
C12N7/01
C07K19/00
C07K14/705
C07K16/30
C12N15/13
A61P35/00
A61P35/02
A61K38/02
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/17
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022572364
(86)(22)【出願日】2021-05-21
(85)【翻訳文提出日】2022-11-21
(86)【国際出願番号】 CN2021095107
(87)【国際公開番号】W WO2021233411
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】202010441127.2
(32)【優先日】2020-05-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520272880
【氏名又は名称】重▲慶▼精准生物技▲術▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＯＮＧＱＩＮＧ ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯＭＰＡＮＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３８ Ｈａｎｘｉｎｇ Ｒｄ， Ｈａｎｇｕ Ｔｏｗｎ， Ｊｉｕｌｏｎｇｐｏ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３８ Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】522456165
【氏名又は名称】重▲慶▼精准生物産業技▲術▼研究院有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＯＮＧＱＩＮＧ ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】ＮＯ．３８ Ｈａｎｘｉｎｇ Ｒｏａｄ，Ｈａｎｇｕ Ｔｏｗｎ，Ｊｉｕｌｏｎｇｐｏ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３８，ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】徐艶敏
(72)【発明者】
【氏名】梅恩典
(72)【発明者】
【氏名】趙永春
(72)【発明者】
【氏名】単娟娟
(72)【発明者】
【氏名】斉亜男
(72)【発明者】
【氏名】趙文旭
(72)【発明者】
【氏名】陳軍
(72)【発明者】
【氏名】黄霞
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC12
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA41
4C084MA66
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4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
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4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087CA12
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は免疫治療の技術分野に属し、具体的には、腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質、腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ及び発現ベクター、免疫細胞及び使用に関する。該融合タンパク質はＣＥＡ、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、ＢＣＭＡ等の様々な標的の異なるＣＡＲ構造に結合して腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲとなり、又はこれらと併用し、ＣＤ４７陽性腫瘍細胞を標的に殺傷する。前記腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ及び免疫細胞は腫瘍組織中の抑制性シグナルによるＣＡＲ－Ｔ機能への影響をなくし、ＣＡＲ－Ｔ治療有効性を実現し、しかも、所定の安全性を確保することができる。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞外部分、膜貫通構造及び細胞内シグナル領域を含むＳＩＲＰγ融合タンパク質であることを特徴とする腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質。
【請求項2】
膜貫通構造はヒトＣＤ２８膜貫通領域又はヒトＣＤ８由来膜貫通領域に由来し、好ましくは、前記細胞内シグナル領域はＣＤ２８又は４－１ＢＢに由来することを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記膜貫通構造はアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示され、好ましくは、前記細胞内シグナル領域はＣＤ２８に由来し、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されることを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質の構造はＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８又はＳＩＲＰγ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記ＳＩＲＰγ細胞外部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はその機能的バリアントに示されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はその機能的バリアントに示されることを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はその機能的バリアントに示されることを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されることを特徴とする請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む発現ベクター。
【請求項11】
レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのうちのいずれか１種であることを特徴とする請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項12】
請求項１０～１１のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む免疫細胞。
【請求項13】
Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体又はＮＫ細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の免疫細胞。
【請求項14】
腫瘍抗原を認識するキメラ抗原受容体構造を有し、前記キメラ抗原受容体は腫瘍抗原を認識する細胞外部分、ｈｉｎｇｅ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、前記腫瘍抗原は、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＧＰＣ３、５Ｔ４、ＣＤ３３、Ｈｅｒ２、ＧＤ２、ＣＤ７０、ＣＬＬ－１、Ｔｒｏｐ２、ＣＤ４７、ＧＰＣ３、ＣＬＮＤ１８．２、ＣＤ１３３、ＣＳ１、ＣＤ１５５、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＭＵＣ１、ＩＬ１３ＲＡα２又はｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎなど、腫瘍標的として認識し得る抗原分子を含むが、これらに限定されないことを特徴とする請求項１３に記載の免疫細胞。
【請求項15】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、ＣＡＲ１と、を含み、前記ＣＡＲ１は腫瘍抗原を認識する細胞外部分、ｈｉｎｇｅ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含むことを特徴とする腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項16】
前記融合タンパク質は多シストロン構造によってＣＡＲ１に連結され、前記多シストロン構造は自己切断性ポリペプチド又は内部リボソーム進入部位ＩＲＥＳであり、前記自己切断性ポリペプチドはＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａであることを特徴とする請求項１５に記載の新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項17】
前記ＣＡＲの構造はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ融合タンパク質又はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ融合タンパク質であることを特徴とする請求項１５に記載の新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項18】
前記ＣＡＲの構造はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８又はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８であることを特徴とする請求項１５に記載の新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項19】
ＣＡＲ１構造では、ｈｉｎｇｅのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はその機能的バリアントに示され、ＴＭのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示され、ＣＤ３ζのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はその機能的バリアントに示され、融合タンパク質構造では、ＳＩＲＰγＳＩＲＰγ細胞外部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は機能的バリアントに示され、ヒトＣＤ２８由来の膜貫通領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示され、ヒトＣＤ２８由来の細胞内シグナル領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されることを特徴とする請求項１５に記載の新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項20】
前記ＳｃＦｖはＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＭＯｖ－γ、ＰＳＭＡ、ＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＧＤ２、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、Ｍｅｓｏ、ＣＤ１３３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３８、ＬｅＹ、ｋ－Ｌｉｇｈｔ、ＣＤ３３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＰＳＣＡ、ＣＬＬ－１、ＣＤ７０、ＣＤ４７のうちのいずれか１種又は複数種を認識することを特徴とする請求項１７又は１８又は１９に記載の新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項21】
前記ＳｃＦｖのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はその機能的バリアントに示されることを特徴とする請求項２０に記載のＣＡＲ。
【請求項22】
前記ＣＡＲ１は以下の複数種のうちの１種を含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。ａ）ＣＡＲ１はＣＥＡ一本鎖抗体、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ１３７及びＣＤ３ξ二重刺激シグナルを含み、好ましくは、前記ＣＡＲ構造ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はその機能的バリアントに示され、又は
ｂ）前記ＣＡＲ１はＣＤ１９一本鎖抗体、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ１３７及びＣＤ３ξ二重刺激シグナルを含み、好ましくは、前記ＣＡＲ構造ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７又はその機能的バリアントに示され、又は
ｃ）前記ＣＡＲ１はＰＳＣＡ一本鎖抗体、ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ξ三重刺激シグナルを含み、前記ヒンジ領域はＧ４Ｈ又は７Ｈであり、好ましくは、前記ＣＡＲ構造ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はその機能的バリアントに示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はその機能的バリアントに示される。
【請求項23】
前記ａ）及びｂ）のＣＡＲ１構造は低酸素プロモータをさらに含み、前記低酸素調節性プロモータの核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列を含むことを特徴とする請求項２２に記載の新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項24】
請求項２１又は２２に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲをコードし、前記核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される配列を含むことを特徴とする核酸配列。
【請求項25】
請求項１５～２３のいずれか１項に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲを含む発現ベクターであって、レンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのうちのいずれか１種であることを特徴とする発現ベクター。
【請求項26】
請求項２５に記載の発現ベクターを含む免疫細胞。
【請求項27】
Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆体又はＮＫ細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の免疫細胞。
【請求項28】
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させ、又は前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させることを特徴とする請求項１４に記載の免疫細胞の製造方法。
【請求項29】
請求項１～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の免疫細胞、請求項２６～２７のいずれか１項に記載の免疫細胞、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の発現ベクター、請求項２５に記載の発現ベクター又は請求項２４に記載の核酸配列を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項30】
ＣＡＲ発現活性を増強し得る活性化剤及び／又は治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項31】
請求項２９又は３０に記載の医薬組成物の腫瘍治療薬の製造における使用。
【請求項32】
前記腫瘍は悪性腫瘍、例えば急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝癌、脳癌及び皮膚癌であり、前記腫瘍はＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＭＯｖ－γ、ＰＳＭＡ、ＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＧＤ２、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、Ｍｅｓｏ、ＣＤ１３３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３８、ＬｅＹ、ｋ－Ｌｉｇｈｔ、ＣＤ３３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＰＳＣＡ、ＣＬＬ－１、ＣＤ７０、ＣＤ４７のうちのいずれか１種又は複数種を高発現させることを特徴とする請求項３１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は免疫治療の技術分野に属し、具体的には、腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質、新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ及び発現ベクター、免疫細胞及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＡＲは完全にキメラ抗原受容体と呼ばれ、ＣＡＲ－Ｔはキメラ抗原受容体Ｔ細胞、すなわちキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴリンパ球である。現在、ＣＡＲ－Ｔ治療は血液系腫瘍で画期的な進展を遂げており、しかし、固形腫瘍における効果は血液系腫瘍に及ばず、その原因としては、ＣＡＲ－Ｔが固形腫瘍の内部に入りにくい一方、ＣＡＲ－Ｔ細胞が固形腫瘍の内部に入っても腫瘍微小環境のため正常に機能を発揮できず、これらはＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍への治療効果に影響することである。腫瘍微小環境は腫瘍の発生、生長や転移と密接な関係があり、近年の臨床研究により、腫瘍微小環境、特に固形腫瘍の免疫微小環境は免疫治療（免疫細胞治療を含む）の治療効果と予後のいずれにも顕著な影響があることを明らかにした。そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞による固形腫瘍の治療には、腫瘍微小環境抑制を解決すること、すなわち腫瘍微小環境抵抗を実施することが不可欠である。
【0003】
ＣＤ４７はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４に続く新たな免疫チェックポイントとして、マクロファージに「私を食べないで」シグナルを送ることで自然免疫の進行を抑制する。現在、ＣＤ４７ ＳｃＦｖを標的としたＣＡＲ－Ｔを用いて腫瘍治療を行うことが報告されている。ＣＤ４７は腫瘍脱出の免疫微小環境の形成を促進することができるが、腫瘍の異質性のため、ＣＤ４７単独を標的する場合、治療効果が限られ、しかも、外因性のＳｃＦｖはその強い親和性によりＣＡＲ－Ｔ細胞の過剰活性化、悪い存続性、非特異性を招き、安全上の潜在的なリスクを引き起こす恐れがある。そのため、より安全で有効な手段を用いてＣＤ４７を認識して腫瘍微小環境の脱出シグナルを解除することは非常に重要である。
【0004】
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）はＣＤ４７のリガンドの１つであり、ＣＤ４７と結合し、マクロファージの貪食作用を抑制することができ、現在、ＣＤ４７に関するほとんどの研究はＳＩＲＰαに関するものである。ＳＩＲＰγもＣＤ４７に結合することができ、Ｔ細胞表面に存在し、細胞外領域が１つのＶドメインと２つのＣ１ドメインから構成され、細胞内シグナルがなく、ＣＤ４７を通じて単方向シグナルを伝達するため、現在ＳＩＲＰγに対する改変を行う研究者は少ないが、本発明者らはＳＩＲＰγがＣＤ４７に対して腫瘍微小環境解除を行うのにもっと適するリガンドであると考えている。そのため、ＳＩＲＰγタンパク質の細胞外部分について改変設計を行い、さらに腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲを設計した。
【発明の概要】
【0005】
本発明の目的は、腫瘍微小環境を逆転させて、腫瘍細胞を標的に殺傷することができる腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質、該タンパク質を含む発現ベクター及び免疫細胞を提供することである。
【0006】
上記の目的を達成させるために、本発明は以下の形態を採用する。
【0007】
ＳＩＲＰγタンパク質の細胞外部分について改変設計を行うことで、腫瘍組織中の抑制性シグナルをなくする腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質。
【0008】
前記融合タンパク質は構造として細胞外部分、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含むＳＩＲＰγ融合タンパク質である。
【0009】
さらに、膜貫通構造はヒトＣＤ２８膜貫通領域に、又はヒトＣＤ８由来膜貫通領域に由来する。
【0010】
さらに、前記膜貫通構造のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。
【0011】
好ましくは、前記細胞内シグナル領域はＣＤ２８に由来し、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される。
【0012】
さらに、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質の構造はＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８、ＳＩＲＰγ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢである。
【0013】
さらに、前記ＳＩＲＰγ細胞外部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はその機能的バリアントに示される。
【0014】
さらに、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はその機能的バリアントに示される。
【0015】
さらに、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はその機能的バリアントに示される。
【0016】
さらに、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質はヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるようなＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８である。
【0017】
さらに、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される。
【0018】
さらに、前記発現ベクターを含む免疫細胞。
【0019】
さらに、前記免疫細胞はＴ細胞、Ｔ細胞前駆体又はＮＫ細胞である。
【0020】
具体的には、前記Ｔ細胞はαβＴ細胞であってもよいし、γδＴ細胞であってもよく、γδＴ細胞は受容体γ及びδ鎖を表面に含む特殊なＴ細胞亜群であり、全てのｔリンパ球の０．５～５％を占め、該細胞群は１９８７年に初めて発見された。γδＴＣＲを有するが、その認識抗原又はリガンドが非ＭＨＣ制限であるので、従来のαβＴ細胞と異なる。現在、ＣＮ１０７８１０２６７ＡやＣＮ１０７７７１２１５Ａなどの複数の特許では、γδＴ細胞を細胞治療及びＣＡＲ－Ｔ細胞治療に適用することが開示されている。
【0021】
具体的には、ＳＩＲＰγ融合タンパク質を設計するとともに、ＰＤ－１の融合タンパク質ＰＤ－１－２８ＴＭ－２８、ＰＤ－１－８ＴＭ－ＢＢを設計する。
【0022】
具体的には、前記設計されたＳＩＲＰγ融合タンパク質は、ＣＡＲ１と併用する場合、単独で発現してもよいし、ＣＡＲ１と共発現して作用を発揮してもよい。また、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質は単独で免疫治療に用いられてもよい。
【0023】
具体的には、本発明では、発明者らは、ＳＩＲＰγタンパク質がＣＤ４７に対して腫瘍微小環境解除を行うのにより適するリガンドであると考えている。したがって、ＳＩＲＰγタンパク質の細胞外部分について改変設計を行い、腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲを設計し、このため、本発明は、設計・構築した低酸素調節性プロモータとＣＡＲ－Ｔ細胞技術との組み合わせ、及び低酸素調節性プロモータとＳＩＲＰγタンパク質とＣＡＲ－Ｔ細胞技術との組み合わせを腫瘍の免疫治療に適用し、即ち、さらに従来のＣＡＲ構造を改変することで、ＣＡＲ－Ｔの固形腫瘍に対する治療効果及びＣＡＲ－Ｔの安全性を向上させる。
【0024】
さらに、前記免疫細胞は腫瘍抗原を認識するキメラ抗原受容体構造を有し、前記キメラ抗原受容体は腫瘍抗原を認識する細胞外部分、ｈｉｎｇｅ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、腫瘍抗原はＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＧＰＣ３、５Ｔ４、ＣＤ３３、Ｈｅｒ２、ＧＤ２、ＣＤ７０、ＣＬＬ－１、Ｔｒｏｐ２、ＣＤ４７、ＧＰＣ３、ＣＬＮＤ１８．２、ＣＤ１３３、ＣＳ１、ＣＤ１５５、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＭＵＣ１、ＩＬ１３ＲＡα２又はｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎなど、腫瘍標的として認識し得る抗原分子を含む。
【0025】
本発明の目的はまた、新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ、及び前記ＣＡＲを含む発現ベクターと免疫細胞を提供することである。前記新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ及び免疫細胞は、腫瘍組織中の抑制性シグナルによるＣＡＲ－Ｔ機能への影響をなくし、ＣＡＲ－Ｔ治療有効性を実現し、しかも、所定の安全性を確保することができる。
【0026】
上記目的を達成させるために、本発明は以下の手段を採用する。
【0027】
前記新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲは、目的その一に記載した腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質と、ＣＡＲ１と、を含み、前記ＣＡＲ１は腫瘍抗原を認識する細胞外部分、ｈｉｎｇｅ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含む。
【0028】
さらに、前記融合タンパク質は多シストロン構造によってＣＡＲ１に連結され、前記多シストロン構造は自己切断性ポリペプチド又は内部リボソーム進入部位ＩＲＥＳであり、前記自己切断性ポリペプチドはＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａである。
【0029】
さらに、前記ＣＡＲの構造はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ融合タンパク質又はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ融合タンパク質である。
【0030】
さらに、前記ＣＡＲの構造はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８又はＳｃＦｖ －ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８である。
【0031】
さらに、前記ＣＡＲ構造ａは一般的な第１世代、第２世代、第３世代のＣＡＲ構造であってもよく、改良したデュアルＣＡＲ、調節性ＣＡＲ構造（例えばＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２調節）などの新規ＣＡＲ構造であってもよい。
【0032】
さらに、ＣＡＲ１のヒンジ領域の配列はＩｇＧ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ４に由来してもよく、ＣＡＲ構造の膜貫通領域はＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ１３７、ＣＤ８０及びＣＤ８６に由来してもよく、ＣＡＲ構造の細胞内シグナル領域はＣＤ３、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＰＤ１Ｌ、Ｂ７－Ｈ３、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ１２７に由来してもよい。
【0033】
さらに、前記ＳｃＦｖはＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＭＯｖ－γ、ＰＳＭＡ、ＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＧＤ２、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、Ｍｅｓｏ、ＣＤ１３３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３８、ＬｅＹ、ｋ－Ｌｉｇｈｔ、ＣＤ３３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＰＳＣＡ、ＣＬＬ－１、ＣＤ７０、ＣＤ４７のうちのいずれか１種を認識し得る。
【0034】
さらに、前記ＳｃＦｖはＣＤ４７、ＣＥＡ、ＰＳＣＡ、ＣＤ１９又はＢＣＭＡを認識し得る。
【0035】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲ構造はトランケートされたＥＧＦＲｔ調節タグを有し、いくつかの実施形態では、前記ＰＳＣＡを標的としたＣＡＲ構造は汎用型ＣＡＲ構造であり、いくつかの実施形態では、前記ＰＳＣＡを標的としたＣＡＲ構造はｉＣａｓｐ９などの自殺遺伝子を持つ。
【0036】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲ構造は天然キラー細胞受容体（ＮＫＲ）の成分の１種又は複数種を含むので、ＮＫＲ－ＣＡＲを形成する。ＮＫＲ成分はキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、例えばＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１及びＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ－Ａ、ＣＲＡ、ＢＬＡＭＥ及びＣＤ２Ｆ－１０；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、ＣＤ１６、及びＣＤ６４；Ｌｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃのいずれかの天然キラー細胞受容体由来の膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン又は細胞質ドメインであってもよい。前記ＮＫＲ－ＣＡＲ分子は適応分子又は細胞内シグナルドメイン（例えば、ＤＡＰ１２）と相互作用することができる。
【0037】
好ましい態様１として、前述ＳＩＲＰγ融合タンパク質とＣＡＲ１とからなるＣＡＲ構造であって、前記ＣＡＲ１では、ｈｉｎｇｅのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はその機能的バリアントに示され、ＴＭのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示され、ＣＤ３ζのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はその機能的バリアントに示され、融合タンパク質構造では、ＳＩＲＰγの細胞外部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は機能的バリアントに示され、ヒトＣＤ２８由来の膜貫通領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示され、ヒトＣＤ２８由来の細胞内シグナル領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。
【0038】
さらに、前記ＳｃＦｖのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はその機能的バリアントに示される。
【0039】
具体的には、この好ましい態様は、新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ：ＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８、ＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢ、ＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８、ＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢ及びＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＰＤ－１－２８ＴＭ－２８とＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＰＤ－１－８ＴＭ－ＢＢを発現させる遺伝子修飾Ｔリンパ球を設計して、新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲの作用を検証する。
【0040】
さらに、前記ＣＡＲ構造の製造方法は、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させ、又は前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させることである。
【0041】
好ましい態様２として、前述ＳＩＲＰγ融合タンパク質とＣＡＲ１とからなるＣＡＲ構造であって、前記ＣＡＲ１は抗ＣＥＡ一本鎖抗体、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ１３７及びＣＤ３ξ二重刺激シグナルを含む。
【0042】
好ましくは、前記ＣＡＲ構造ａはＣＥＡ ＳｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ領域－ＣＤ８膜貫通領域－ＣＤ１３７－ＣＤ３ξ構造であり、そのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示される配列を含む。ＣＥＡ一本鎖抗体をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、ＣＤ８ヒンジ領域－ＣＤ８膜貫通領域－ＣＤ１３７－ＣＤ３ξ構造をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される。
【0043】
さらに、低酸素調節性プロモータを含む前記ＣＡＲ構造をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される配列を含む。
【0044】
好ましい態様３として、前述ＳＩＲＰγ融合タンパク質とＣＡＲ１とからなるＣＡＲ構造であって、前記ＣＡＲ１はＣＤ１９一本鎖抗体、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ１３７及びＣＤ３ξ二重刺激シグナルを含む。
【0045】
好ましくは、前記ＣＡＲ構造ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７又はその機能的バリアントに示される。
【0046】
さらに、前記ＣＡＲ構造をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される配列を含む。
【0047】
さらに、前記ＣＡＲ構造の製造方法は、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させ、又は前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含むＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させることである。
【0048】
好ましい態様４として、前述ＳＩＲＰγ融合タンパク質とＣＡＲ１とからなるＣＡＲ構造であって、前記ＣＡＲ構造ａはＰＳＣＡ一本鎖抗体、ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ξ三重刺激シグナルを含み、前記ヒンジ領域はＧ４Ｈ又は７Ｈである。
【0049】
好ましくは、前記ＣＡＲ構造ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はその機能的バリアントに示され、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はその機能的バリアントに示される。アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はその機能的バリアントに示されるのはヒンジ領域がＧ４ＨであるＣＡＲ構造ａであり、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はその機能的バリアントに示されるのはヒンジ領域が７ＨであるＣＡＲ構造ａである。
【0050】
さらに、前記ＣＡＲ構造をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される配列を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５は低酸素調節性プロモータを含む。
【0051】
さらに、前記ＣＡＲ構造の製造方法は、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させ、又は前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させる。
【0052】
好ましい態様５として、前述ＳＩＲＰγ融合タンパク質と、好ましい態様１－好ましい態様４のいずれかのＣＡＲ１とを含むＣＡＲ構造であって、前記ＣＡＲ構造は低酸素プロモータをさらに含み、前記低酸素調節性プロモータの核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列を含む。低酸素プロモータを含んでＣＤ１９を標的としたＣＡＲ構造は、低酸素微小環境にて生体内の腫瘍を効果的に除去する役割を有し、しかも、低酸素微小環境により誘導されるプロモータは低酸素環境で目的遺伝子、タンパク質などの因子の発現を強化し、腫瘍治療薬の治療効果やＣＡＲ－Ｔ治療の有効性と安全性を向上させることができ、しかも、Ｔリンパ球に効果的に発現できるだけではなく、低酸素環境にてＣＡＲ分子の発現を強化し、ＣＡＲ－Ｔ細胞に高いＩＦＮ－γ分泌能を付与し、腫瘍の標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷を強くし、腫瘍標的治療に有用である。
【0053】
さらに、前記低酸素調節性プロモータは、Ｈｉｆｌａ調節エレメントとミニプロモータとを連結してなり、前記ミニプロモータはサイトウィルスプロモータ、ＨＳＶチミジンキナーゼのプロモータ、サルウイルス４０のプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ及び合成プロモータから選ばれるいずれか１つである。
【0054】
さらに、前記ＣＡＲ構造の製造方法は、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させ、又は前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させることである。
【0055】
本発明の目的はまた、前記の新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ（好ましい態様１－好ましい態様５における態様及び好ましい態様以外のものを含む）のいずれかを含む発現ベクター、該発現ベクターを含む免疫細胞を提供する。
【0056】
さらに、前記発現ベクターはレンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのうちのいずれか１種である。
【0057】
さらに、前記免疫細胞はＴ細胞、Ｔ細胞前駆体又はＮＫ細胞である。
【0058】
さらに、前記免疫細胞の製造方法は、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させ、又は前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させることである。
【0059】
いくつかの実施形態では、前記レンチウイルスベクターは実質的には、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、マエディ・ビスナウイルス（ＶＭＶ：ｖｉｓｎａ－ｍａｅｄｉ ｖｉｒｕｓ）ウイルス、ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選ばれる。
【0060】
いくつかの実施形態では、ベクターは左（５'）レトロウイルスＬＴＲ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、中心ポリプリン区画／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス導出エレメント、本発明に含まれるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモータ及び右（３'）レトロウイルスＬＴＲを含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）又はマーモット転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及び最適マーモット転写後調節エレメント（ｏＰＲＥ）を含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、前記５'ＬＴＲのプロモータは異種プロモータで置換される。
【0063】
いくつかの実施形態では、前記異種プロモータはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）プロモータ又はサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモータである。
【0064】
いくつかの実施形態では、前記５'ＬＴＲ又は３'ＬＴＲはレンチウイルスＬＴＲである。
【0065】
いくつかの実施形態では、前記３'ＬＴＲは自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである。
【0066】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲ構造の核酸配列は最適化Ｋｏｚａｒｋ配列を含む。
【0067】
いくつかの実施形態では、本発明に含まれるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される前記プロモータは、サイトメガロウイルス初期遺伝子プロモータ（ＣＭＶ）、伸長因子１αプロモータ（ＥＦ１－α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１プロモータ（ＰＧＫ）、ユビキチン－Ｃプロモータ（ＵＢＱ－Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチンプロモータ（ＣＡＧ）、ポリオーマウイルスエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（ＭＣ１）、βアクチンプロモータ（β－ＡＣＴ）、サルウイルス４０プロモータ（ＳＶ４０）及び骨髄増殖肉腫ウイルスエンハンサー、陰性対照領域を欠損させた、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモータからなる群から選ばれる。
【0068】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含むベクターは分泌型抗ＰＤ－１ＳｃＦｖを含んでもよく、いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含むベクターはＰＤ－１共役伝達ペプチド（例えばＰＤ－１－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３シグナル構造）を含み、いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含むベクターは複数のＣＡＲ、例えば異なる抗原又は同一の抗原の異なる認識部位を標的とする２つのＣＡＲを組み合わせる。
【0069】
本発明の目的はまた、医薬組成物及びその使用を提供することである。
【0070】
上記目的を達成させるために、本発明は以下の手段を採用する。
【0071】
前記医薬組成物は、前記融合タンパク質又は前記融合タンパク質を含む発現ベクターと、免疫細胞又は前記新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ若しくは前記新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲを含む免疫細胞と、を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質はＳＩＲＰα又はＳＩＲＰαの部分ドメインとしてもよく、融合タンパク質の構造はＳＩＲＰα－２８ＴＭ－２８、ＳＩＲＰα－８ＴＭ－１３７、ＳＩＲＰα－８ＴＭ－ＯＸ４０、ＳＩＲＰα－８ＴＭ－ＩＣＯＳなどの複数種の融合タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、上記ＳＩＲＰα融合タンパク質を発現させた免疫細胞を単独で使用してもよいし、上記ＳＩＲＰα融合タンパク質とＣＡＲ分子を同一の免疫細胞に共発現させ、又はＳＩＲＰα融合タンパク質、ＣＡＲ分子をそれぞれ発現させた免疫細胞を所定の割合で混合してもよい。
【0073】
いくつかの特定の実施形態では、前記活性化剤及び／又は治療は、手術、化学療法、放射線療法、免疫抑制剤例えばシクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、マイコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）及びＦＫ５０６、抗体又は他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅａｇｅｎｔｓ）例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体又は他の抗体治療、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、ＦＫ５０６、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄ）、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ＦＲ９０１２２８、サイトカインや放射線であってもよい。
【0074】
いくつかの実施形態では、前記細胞は他の活性化剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞活性を増強する活性化剤を発現させてもよい。活性化剤は抑制性分子を遮断する活性化剤であってもよい。抑制性分子例えばＰＤ１は、いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の免疫エフェクター反応開始能を抑制することができる。抑制性分子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ，ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣ Ｉクラス、ＭＨＣ ＩＩクラス、ＧＡＬ９、アデノシン、ＴＧＦＲ（ＴＧＦＲβ）及びＴＧＦＲβを含む。前記抑制性分子の細胞外ドメインは膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＰＤ１ ＣＡＲに融合してもよい。
【0075】
さらに、前記の融合タンパク質のいずれか、前記ＣＡＲ構造のいずれか、前記核酸配列のいずれか、前記発現ベクターのいずれか、又は前記免疫細胞のいずれかの、腫瘍治療薬の製造における使用。
【0076】
さらに、前記腫瘍は急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝癌、脳癌及び皮膚癌を含む悪性腫瘍である。
【0077】
本発明では、ＣＡＲ構造において、ＺはヒトＣＤ３細胞内シグナルＣＤ３ζ、ＢＢはヒト４－１ＢＢ細胞内シグナル、ＢＢＺは４－１ＢＢ ＩＣＤ－ＣＤ３ζの細胞内ドメイン、２８ＺはＣＤ２８ＩＣＤ－ＣＤ３ζの細胞内ドメインである。
【0078】
本発明では、前記「機能的バリアント」は、通常、ある配列とは実質的に同じ機能（例えば、前記キメラ抗原受容体の性質を備えてもよい）を有し、しかも、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものを意味する。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸配列のバリアントはこの配列とは実質的に同じ機能を有する。
【0079】
本発明では、ＣＡＲ構造において、ＣＥＡＺは細胞内構造としてＣＤ３ζしかないＣＥＡを標的とするＣＡＲ構造であり、ＣＥＡ－２８Ｚは細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＣＥＡを標的としたＣＡＲ構造であり、ＣＥＡ－ＢＢＺは細胞内に４－１ＢＢ細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＣＥＡを標的としたＣＡＲ構造であり、ＢＣＭＡ－ＢＢＺは細胞内に４－１ＢＢ細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＢＣＭＡを標的としたＣＡＲ構造であり、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８は細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来のシグナルしかないＳＩＲＰγ融合ペプチドであり、略語としてＳＩＲＰγ－２８と使用した。ＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢは細胞内に４－１ＢＢ細胞内ドメイン由来のシグナルしかない融合ペプチド、略語ＳＩＲＰγ－ＢＢである。
【発明の効果】
【0080】
本発明の有益な効果は以下の通りである。
【0081】
本発明による腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質は、腫瘍微小環境を逆転させ、ＣＤ４７陽性腫瘍細胞を標的に殺傷することができ、前記融合タンパク質を含む新規腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ及び免疫細胞は、腫瘍組織中の抑制性シグナルによるＣＡＲ－Ｔ機能への影響をなくし、ＣＡＲ－Ｔ治療有効性を実現し、しかも、所定の安全性を確保することができる。
【図面の簡単な説明】
【0082】
【図1】免疫抑制解除融合タンパク質の構造図である。
【図2】免疫抑制型ＣＡＲ構造の概略図。
【図3】ＣＡＲ構築プラスミドを検証する図である。
【図4】標的細胞の構築結果である。
【図5a】新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－ＴのＣＡＲ陽性率である。
【図5b】新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔの発現強度である。
【図6a】新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔのインビトロ機能の検証である。
【図6b】新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔのインビトロ殺傷率である。
【図7】新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔの腫瘍抑制環境解除の検証である。
【図8a】ＮＣＧマウスのＣＥＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７の３陽性発現である。
【図8b】ＮＣＧマウスの腫瘍体積測定データで作成された腫瘍体積増加曲線である。
【図9】第２世代の免疫抑制型ＣＡＲのインビボ有効性である。
【図10】ＣＥＡ標的の各実験群の平均蛍光強度である。
【図11】ＣＥＡ標的の各実験群の陽性率である。
【図12】ＣＥＡ標的の各実験群ＣＡＲ－Ｔのインビトロ増幅倍数曲線である。
【図13】ＣＥＡ標的の各実験群ＣＡＲ－Ｔの標的細胞ＤＬＤＬ１－ＣＥＡへの殺傷効率である。
【図14】ＣＥＡ標的の各実験群のＤＬＤ１－ＣＥＡ及びＤＬＤ１－ＣＥＡ（ＣＤ４７－）細胞のそれぞれにおけるＩＦＮ－γ分泌である。
【図15】ＣＥＡ標的の各実験群のＤＬＤ１－ＣＥＡ及びＤＬＤ１－ＣＥＡ（ＣＤ４７－）細胞のそれぞれにおけるＩＬ－２分泌である。
【図16】ＣＥＡ標的の各実験群のＤＬＤ１－ＣＥＡ及びＤＬＤ１－ＣＥＡ（ＣＤ４７－）細胞のそれぞれにおけるＴＮＦ－α分泌である。
【図17】ＣＥＡ標的スクリーニング対照群ａの生体内低酸素モデルによるマウス腫瘍成長を検証する実物図である。
【図18】ＣＥＡ標的スクリーニング対照群ａの生体内低酸素モデルによる担癌マウス体内の生物発光量の検証である。
【図19】フローサイトメトリー検出によるＣＤ１９を標的とした各実験群ＣＡＲ－Ｔの陽性率である。
【図20】ＣＤ１９を標的とした各実験群の細胞殺傷である。
【図21】ＣＤ１９を標的とした各実験群のＩＦＮ－γ因子分泌である。
【図22】ＣＤ１９を標的とした各実験群のマウス体内の生物発光である。
【図23】ＣＤ１９を標的とした各実験群のマウス体内の腫瘍成長である。
【図24】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８のＩＦＮ－γ因子分泌である。
【図25】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８のＩＦＮ－γ因子分泌である。
【図26】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８のＩＦＮ－γ因子分泌である。
【図27】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８のＩＦＮ－γ因子分泌である。
【図28】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８のＩＦＮ－γ因子分泌である。
【図29】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８のＩＦＮ－γ因子分泌である。
【図30】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８の陽性／陰性細胞のそれぞれにおける細胞殺傷である。
【図31】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８の陽性／陰性細胞のそれぞれにおける細胞殺傷である。
【図32】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８の陽性／陰性細胞のそれぞれにおける細胞殺傷である。
【図33】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８の陽性／陰性細胞のそれぞれにおける細胞殺傷である。
【図34】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８における細胞殺傷である。
【図35】ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８における細胞殺傷である。
【0083】
図１０～図１８においては、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺは細胞内に４－１ＢＢ細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＣＥＡを標的とした低酸素ＣＡＲ構造、ＣＥＡ－ＢＢＺは細胞内に４－１ＢＢ細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＣＥＡを標的としたＣＡＲ構造、ＣＥＡ－２８Ｚは細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＣＥＡを標的としたＣＡＲ構造、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８は細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来のシグナルのみを有する融合ペプチドであり、以降略語ＳＩＲＰγ－２８を使用する。
図１９～図２３においては、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺは細胞内に低酸素プロモータ、４－１ＢＢ（略語ＢＢ）細胞内ドメインに由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζのＣＤ１９を標的としたＣＡＲ構造、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８（ＳＩＲＰγ－２８）は細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来のシグナルのみを有する融合ペプチド、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－ＳＩＲＰγ－２８は構造５ＨＣＤ１９－８Ｈ－８ＴＭ－ＣＤ１３７－ＣＤ３ζのＣＡＲであり、ＳＩＲＰγ－２８－５ＨＣＤ１９－ＢＢＺは低酸素プロモータを含むＣＡＲ融合タンパク質を２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させて得たＣＡＲ－Ｔである。
図２４～図３５においては、ＲＴ４－Ｌｕｃ－ＧＦＰは陽性細胞、ＰＣ－３－Ｌｕｃ－ＧＦＰは陰性細胞、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８（ＳＩＲＰγ－２８）は細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来のシグナルのみを有する融合ペプチド、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ及びＳＩＲＰγ－２８と融合タンパク質ＳＩＲＰγ－２８とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させて得たものである。ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ及びＳＩＲＰγ－２８と融合タンパク質ＳＩＲＰγ－２８とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させて得たものである。
図１９～図２３においては、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺは細胞内に低酸素プロモータ、４－１ＢＢ（略語ＢＢ）細胞内ドメインに由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζのＣＤ１９を標的としたＣＡＲ構造、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８（ＳＩＲＰγ－２８）は細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来のシグナルのみを有する融合ペプチド、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－ＳＩＲＰγ－２８は構造５ＨＣＤ１９－８Ｈ－８ＴＭ－ＣＤ１３７－ＣＤ３ζのＣＡＲであり、ＳＩＲＰγ－２８－５ＨＣＤ１９－ＢＢＺは低酸素プロモータを含むＣＡＲ融合タンパク質を２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させて得たＣＡＲ－Ｔである。
図２４～図３５においては、ＲＴ４－Ｌｕｃ－ＧＦＰは陽性細胞、ＰＣ－３－Ｌｕｃ－ＧＦＰは陰性細胞、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８（ＳＩＲＰγ－２８）は細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来のシグナルのみを有する融合ペプチド、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ及びＳＩＲＰγ－２８と融合タンパク質ＳＩＲＰγ－２８とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させて得たものである。ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ及びＳＩＲＰγ－２８と融合タンパク質ＳＩＲＰγ－２８とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させて得たものである。
【発明を実施するための形態】
【0084】
以下、図面を参照して本発明の好適な実施例について詳細に説明する。好適な実施例において具体的な条件が明示されていない実験方法は通常一般的な条件、例えば分子クローニング実験ガイドライン（第３版、Ｊ．サムブルックら編）に記載の条件やメーカにより推薦される条件に従う。挙げられる実施例は本発明の内容をよりよく説明するために過ぎず、本発明の内容は係る実施例に制限されるわけではない。当業者が上記発明内容に基づいて実施形態について行う実質的ではない改良や調整も本発明の特許範囲に属する。
【0085】
本発明の実施例では、関連するベクター構造エレメントの配列を以下の表１に示す。
【0086】
【表1】
【0087】
本発明の実施例（表１）では、ＺはＣＤ３ζであり、ＣＥＡＺは細胞内構造にＣＤ３ζのみを有するＣＡＲ構造（ＳｃＦｖ（ＣＥＡ）－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ）、ＣＥＡ－２８Ｚは細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＣＥＡを標的としたＣＡＲ構造（ＳｃＦｖ（ＣＥＡ）－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）であり、ＣＥＡ－ＢＢＺは細胞内に４－１ＢＢ細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＣＥＡを標的としたＣＡＲ構造（ＳｃＦｖ（ＣＥＡ）－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）であり、ＢＣＭＡ－ＢＢＺは細胞内に４－１ＢＢ（略語ＢＢ）細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＢＣＭＡを標的としたＣＡＲ構造であり、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８は細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来のシグナルのみを有する融合ペプチドであり、以降略語ＳＩＲＰγ－２８を使用し、ＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢは細胞内に４－１ＢＢ細胞内ドメイン由来のシグナルのみを有する融合ペプチドであり、以降略語ＳＩＲＰγ－ＢＢを使用する。
【0088】
本発明の実施例では、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺは細胞内に低酸素プロモータ、４－１ＢＢ（略語ＢＢ）細胞内ドメイン由来の共刺激シグナルとＣＤ３ζを有するＣＤ１９を標的としたＣＡＲ構造、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８（略語ＳＩＲＰγ－２８）は細胞内にＣＤ２８細胞内ドメイン由来のシグナルのみを有する融合ペプチド、ＳＩＲＰγ－２８＋５ＨＣＤ１９－ＢＢＺは低酸素プロモータを含むＣＡＲ融合タンパク質を２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させて得たＣＡＲ－Ｔである。５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は低酸素プロモータを含むＣＡＲ融合タンパク質を同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させて得たＣＡＲ－Ｔである。
【0089】
本発明の実施例では、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ及びＳＩＲＰγ－２８と融合タンパク質ＳＩＲＰγ－２８とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させて得たものである。ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ及びＳＩＲＰγ－２８と融合タンパク質ＳＩＲＰγ－２８とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させて得たものである。
【0090】
本発明の実施例では、リン酸カルシウム法によるレンチウイルスパッケージング方法は使用され、具体的には、１０％ＦＢＳ（ｗ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地を用いて２９３Ｔ細胞を良好な状態まで培養し、パッケージングプラスミド（ＲＲＥ：ＲＥＶ：２Ｇ）と発現プラスミドとを所定の割合で１．５遠心分離管に加え、ＣａＣｌ２と２×ＨＢＳを加え、均一に混合した後、室温で静置し、次に、処理された２９３Ｔ細胞培養液に加え、３～５ｈ後、液を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地１０ｍＬに交換し、４８ｈ又は７２ｈ後、細胞上清を収集し、ウイルスを精製する。
【0091】
本発明の実施例では、抗体はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌ－ＰＥであり、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌは抗体軽鎖を認識することができ、ＣＡＲ抗原認識領域のＳｃＦｖ配列の軽鎖はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌにより認識され得、このため、ＣＡＲ陽性率及びＣＡＲ発現強度はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌを用いて検出可能である。ＳＩＲＰγ－２８の後にＧＦＰタグが付いており、ＳＩＲＰγ－２８の発現はＧＦＰ陽性率によって決定される。
【0092】
本発明の実施例では、各ＣＡＲ－Ｔの標的細胞への殺傷能力を検出する方法はＡＣＥＡ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＭＰ機器にて行われ、実験のステップは機器の取扱書に従って行われる。ＡＣＥＡ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＭＰ原理は、ウェル底部に付着した腫瘍細胞について抵抗指数データを１５分間ごとに１回記録し、抵抗指数によって接着標的細胞の増殖や死亡を判断することである。抵抗指数分析結果を用いた式はＣＡＲ－Ｔ細胞殺傷率＝ベースライン抵抗指数－リアルタイム抵抗指数である。
【0093】
本発明の実施例では、ＩＦＮ－γ検出はＢＤ ＩＦＮ－γキットを用い、実験ステップは製品の取扱書に従って行われ、ＩＬ－２検出はｉｎｒｉｔｒｏｇｅｎ ＩＬ－２キットを用い、実験ステップは製品の取扱書に従って行われ、ＴＮＦ－α検出はＢｉｏｌｅｇｅｎｄキットを用い、実験ステップは製品の取扱書に従って行われる。
【0094】
本発明の実施例では、低酸素モデルの構築が終了したか否かを検証する方法として、組換えプラスミドウイルスで活性化ＰＢＭＣを感染し、生体外低酸素細胞モデルを構築し、１２～１８ｈ培養後、液を交換し、その後、ＣｏＣｌ２を利用して低酸素環境を誘導し、Ｎ日目まで培養すると、ＣＡＲ構造の軽鎖抗体を検出することでＣＡＲ発現を検出する。
【0095】
本発明の実施例では、インビボ検証に使用されるマウスはＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＩ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＣｒｌであり、ＮＯＧマウスと略称し、日本実験動物研究所（ＣＩＥＡ）のＭａｍｏｒｕ Ｉｔｏにより飼育されたものであり、国際的にはＣＡＲ－Ｔインビボで関連腫瘍形成実験での最も一般的な系統である。
【0096】
本発明の実施例では、生体内低酸素モデルの検証方法としては、６～８週齢雌ＮＯＧマウスを選んで、マウスの耳に番号をマークした後、マウスの背部に標的細胞を１×１０６／匹の細胞量で皮下注射し、腫瘍形成１２日目にマウスの腫瘍体積を測定する。
【0097】
第１部分
実施例１ プラスミドの構築
図１に示すＣＡＲ概略図に基づいて、ＳＩＲＰγ及びＣＤ４７全長プラスミド、ｐＬ－ＣＡＧ－２ＡＧＦＰ、ｐＬ－ＣＡＧ－ＰＤ１－ＣＤ２８－２ＡＣｈｅｒｒｙ、ｐＬ－ＣＡＧ－ＰＤ１－ＢＢ－２Ａｃｈｅｒｒｙをテンプレートとして、図２に示すＣＡＲ構造及び対応する単一標的ＣＡＲ構造を構築した。ベクター：ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ、ＢＣＭＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８及び単一標的ＣＡＲ：ＣＥＡＺ、ＰＤ１－２８、ＰＤ１－ＢＢ、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８、ＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢを構築した。酵素切断及び配列決定、アラインメントして検証した結果、図３に示すように、組換えプラスミドの酵素切断同定の結果、１－３：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８プラスミドは、順次、元のプラスミド、ＣＥＡＺ（１３７１ｂｐ）、ＰＤ１－２８（７８３ｂｐ）であり、４－６：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢプラスミドは、順次、元のプラスミド、ＣＥＡＺ（１３７１ｂｐ）、ＰＤ１－ＢＢ（７９８ｂｐ）であり、７－９：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８プラスミドは、順次、元のプラスミド、ＣＥＡＺ（１３７１ｂｐ）、ＳＩＲＰγ－２８（１３７４ｂｐ）であり、１０－１２：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢプラスミドは、順次、元のプラスミド、ＣＥＡＺ（１３７１ｂｐ）、ＳＩＲＰγ－ＢＢ（１３６８ｂｐ）であり、Ｍ１はＤＬ５０００ＤＮＡ分子量マーカーであり、Ｍ２はＤＬ１５０００ＤＮＡ分子量マーカーであり、１３－１５：ｐＬ－ＣＡＧ－ＳＩＲＰγ－２８－２ＡＧＦＰプラスミドは、順次、元のプラスミド、ＳＩＲＰγ－２８（１２９２ｂｐ）、２ＡＧＦＰ（７８５ｂｐ）であり、１６－１８：ｐＬ－ＣＡＧ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ－２ＡＧＦＰプラスミドは、順次、元のプラスミド、ＳＩＲＰγ－ＢＢ（１２８６ｂｐ）、２ＡＧＦＰ（７８５ｂｐ）であり、１９－２０：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＤ４７プラスミドは順次、ＣＤ４７（９７４ｂｐ）、元のプラスミドであり、Ｍ３はＤＬ５０００ＤＮＡ分子量マーカーである。構築は成功した。
実施例１ プラスミドの構築
図１に示すＣＡＲ概略図に基づいて、ＳＩＲＰγ及びＣＤ４７全長プラスミド、ｐＬ－ＣＡＧ－２ＡＧＦＰ、ｐＬ－ＣＡＧ－ＰＤ１－ＣＤ２８－２ＡＣｈｅｒｒｙ、ｐＬ－ＣＡＧ－ＰＤ１－ＢＢ－２Ａｃｈｅｒｒｙをテンプレートとして、図２に示すＣＡＲ構造及び対応する単一標的ＣＡＲ構造を構築した。ベクター：ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ、ＢＣＭＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８及び単一標的ＣＡＲ：ＣＥＡＺ、ＰＤ１－２８、ＰＤ１－ＢＢ、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８、ＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢを構築した。酵素切断及び配列決定、アラインメントして検証した結果、図３に示すように、組換えプラスミドの酵素切断同定の結果、１－３：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８プラスミドは、順次、元のプラスミド、ＣＥＡＺ（１３７１ｂｐ）、ＰＤ１－２８（７８３ｂｐ）であり、４－６：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢプラスミドは、順次、元のプラスミド、ＣＥＡＺ（１３７１ｂｐ）、ＰＤ１－ＢＢ（７９８ｂｐ）であり、７－９：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８プラスミドは、順次、元のプラスミド、ＣＥＡＺ（１３７１ｂｐ）、ＳＩＲＰγ－２８（１３７４ｂｐ）であり、１０－１２：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢプラスミドは、順次、元のプラスミド、ＣＥＡＺ（１３７１ｂｐ）、ＳＩＲＰγ－ＢＢ（１３６８ｂｐ）であり、Ｍ１はＤＬ５０００ＤＮＡ分子量マーカーであり、Ｍ２はＤＬ１５０００ＤＮＡ分子量マーカーであり、１３－１５：ｐＬ－ＣＡＧ－ＳＩＲＰγ－２８－２ＡＧＦＰプラスミドは、順次、元のプラスミド、ＳＩＲＰγ－２８（１２９２ｂｐ）、２ＡＧＦＰ（７８５ｂｐ）であり、１６－１８：ｐＬ－ＣＡＧ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ－２ＡＧＦＰプラスミドは、順次、元のプラスミド、ＳＩＲＰγ－ＢＢ（１２８６ｂｐ）、２ＡＧＦＰ（７８５ｂｐ）であり、１９－２０：ｐＬ－ＣＡＧ－ＣＤ４７プラスミドは順次、ＣＤ４７（９７４ｂｐ）、元のプラスミドであり、Ｍ３はＤＬ５０００ＤＮＡ分子量マーカーである。構築は成功した。
【0098】
実施例２ 標的細胞の構築
リン酸カルシウム法によってＣＥＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７抗原ウイルスを製造し、ＣＨＯ細胞をそれぞれ感染して、ＣＨＯ－ＣＥＡ細胞、ＣＨＯ－ＣＥＡ－ＰＤ－Ｌ１細胞系及びＣＨＯ－ＣＥＡ－ＣＤ４７細胞系を構築した。シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰγ）はＣＤ４７のリガンドの１つであり、ＣＤ４７に結合することができるので、ＣＤ４７陽性標的細胞はＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ、ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ－ＢＢを評価することに用いられる。
３つの細胞系について１０世代継代培養後、その陽性率を検出した結果、図４に示すように、ＣＨＯ－ＣＥＡの陽性率は９７．１％であり、ＣＨＯ－ＣＥＡ－ＣＤ４７の二重陽性率は９７．６％であり、ＣＨＯ－ＣＥＡ－ＰＤ－Ｌ１の二重陽性率は８７％であり、実験の要件を満たし、細胞系は構築に成功し、標的細胞として後のＣＡＲ－Ｔ薬効評価に用いられることを示した。
リン酸カルシウム法によってＣＥＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７抗原ウイルスを製造し、ＣＨＯ細胞をそれぞれ感染して、ＣＨＯ－ＣＥＡ細胞、ＣＨＯ－ＣＥＡ－ＰＤ－Ｌ１細胞系及びＣＨＯ－ＣＥＡ－ＣＤ４７細胞系を構築した。シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰγ）はＣＤ４７のリガンドの１つであり、ＣＤ４７に結合することができるので、ＣＤ４７陽性標的細胞はＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ、ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ－ＢＢを評価することに用いられる。
３つの細胞系について１０世代継代培養後、その陽性率を検出した結果、図４に示すように、ＣＨＯ－ＣＥＡの陽性率は９７．１％であり、ＣＨＯ－ＣＥＡ－ＣＤ４７の二重陽性率は９７．６％であり、ＣＨＯ－ＣＥＡ－ＰＤ－Ｌ１の二重陽性率は８７％であり、実験の要件を満たし、細胞系は構築に成功し、標的細胞として後のＣＡＲ－Ｔ薬効評価に用いられることを示した。
【0099】
実施例３ レンチウイルスの製造及びＴリンパ球への感染
リン酸カルシウム法によってレンチウイルスをパッケージングし、実施例１における５つの単発現ＣＡＲ（ＣＥＡＺ、ＰＤ１－２８、ＰＤ１－ＢＢ、ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ－ＢＢ）及び６つの新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ（ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ、ＣＥＡＢＢＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＢＢＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ）ウイルス粒子を得た。
勾配遠心分離法によってリンパ球を分離し、遠心分離後、２層目の白色リンパ球層を生理食塩水で洗浄し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地を加えて培養し、ヒトＰＢＭＣ細胞を得た。得られたＰＢＭＣ細胞を抗ＣＤ３、ＣＤ２８モノクローナル抗体で２４ｈ活性化させた後、所定の感染多重度（ＭＯＩ）で活性化ＰＢＭＣを感染し、ウイルス感染１２日目にＣＡＲ－Ｔの陽性率を検出し、検出方法はフローサイトメトリー検出、抗体はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌ－ＰＥとし、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌは抗体軽鎖を認識することができ、ＣＡＲ抗原認識領域のＳｃＦｖ配列の軽鎖はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌにより認識され得、このため、ＣＡＲ陽性率及びＣＡＲ発現強度はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌによって検出可能である。
その結果、図５ａに示すように、免疫抑制解除融合タンパク質はＴ細胞表面に発現させることができ、図５ｂに示すように、新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲは発現に成功した。
リン酸カルシウム法によってレンチウイルスをパッケージングし、実施例１における５つの単発現ＣＡＲ（ＣＥＡＺ、ＰＤ１－２８、ＰＤ１－ＢＢ、ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ－ＢＢ）及び６つの新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ（ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ、ＣＥＡＢＢＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＢＢＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ）ウイルス粒子を得た。
勾配遠心分離法によってリンパ球を分離し、遠心分離後、２層目の白色リンパ球層を生理食塩水で洗浄し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地を加えて培養し、ヒトＰＢＭＣ細胞を得た。得られたＰＢＭＣ細胞を抗ＣＤ３、ＣＤ２８モノクローナル抗体で２４ｈ活性化させた後、所定の感染多重度（ＭＯＩ）で活性化ＰＢＭＣを感染し、ウイルス感染１２日目にＣＡＲ－Ｔの陽性率を検出し、検出方法はフローサイトメトリー検出、抗体はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌ－ＰＥとし、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌは抗体軽鎖を認識することができ、ＣＡＲ抗原認識領域のＳｃＦｖ配列の軽鎖はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌにより認識され得、このため、ＣＡＲ陽性率及びＣＡＲ発現強度はＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌによって検出可能である。
その結果、図５ａに示すように、免疫抑制解除融合タンパク質はＴ細胞表面に発現させることができ、図５ｂに示すように、新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲは発現に成功した。
【0100】
実施例４ 新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔインビトロ機能の検証
免疫抑制解除融合タンパク質を発現させていないＣｏｎｔｒｏｌ Ｔ細胞を対照として、免疫抑制解除融合タンパク質ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８、ＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢの機能を検証した。標的細胞はＣＤ４７を発現させるＣＨＯ細胞系である。その結果、図６ａに示すように、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８及びＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢ融合タンパク質は全てＣＤ４７陽性標的細胞に対して殺傷作用を有する。
ＣＥＡＺ群を陽性対照、Ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｔ群を陰性対照、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ群を実験群、ＣＨＯ－ＣＥＡ－ＣＤ４７とＣＨＯ－ＣＥＡ－ＰＤ－Ｌ１を標的細胞として、新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔのインビトロ有効性を検証した。その結果、図６ｂ及び以下の表２に示すように、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８とＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８群では、細胞殺傷率はＣＥＡＺ群よりも有意に高く、一方、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢとＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ群では、標的細胞に対する殺傷はＣＥＡＺ群に比べ明らかな向上が認められなかった。さらに、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ群がＣＨＯ－ＣＥＡ－ＣＤ４７と共培養する場合やＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ群がＣＨＯ－ＣＥＡ－ＰＤ－Ｌ１と共培養する場合、殺傷効率はＣＥＡＺ群に比べ明らかな差が認められず、新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔ群は殺傷特異性を有し、しかも、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８とＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８は標的細胞に対して有意な殺傷効果があることが示された。
免疫抑制解除融合タンパク質を発現させていないＣｏｎｔｒｏｌ Ｔ細胞を対照として、免疫抑制解除融合タンパク質ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８、ＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢの機能を検証した。標的細胞はＣＤ４７を発現させるＣＨＯ細胞系である。その結果、図６ａに示すように、ＳＩＲＰγ－２８ＴＭ－２８及びＳＩＲＰγ－８ＴＭ－ＢＢ融合タンパク質は全てＣＤ４７陽性標的細胞に対して殺傷作用を有する。
ＣＥＡＺ群を陽性対照、Ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｔ群を陰性対照、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ群を実験群、ＣＨＯ－ＣＥＡ－ＣＤ４７とＣＨＯ－ＣＥＡ－ＰＤ－Ｌ１を標的細胞として、新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔのインビトロ有効性を検証した。その結果、図６ｂ及び以下の表２に示すように、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８とＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８群では、細胞殺傷率はＣＥＡＺ群よりも有意に高く、一方、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢとＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ群では、標的細胞に対する殺傷はＣＥＡＺ群に比べ明らかな向上が認められなかった。さらに、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ群がＣＨＯ－ＣＥＡ－ＣＤ４７と共培養する場合やＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ群がＣＨＯ－ＣＥＡ－ＰＤ－Ｌ１と共培養する場合、殺傷効率はＣＥＡＺ群に比べ明らかな差が認められず、新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔ群は殺傷特異性を有し、しかも、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８とＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８は標的細胞に対して有意な殺傷効果があることが示された。
【0101】
【表2】
【0102】
Ｋ５６２－ＢＣＭＡを標的細胞、Ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｔ群を陰性対照として、ＢＣＭＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８の機能を検証した結果、ＢＣＭＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は優れた殺傷機能を示す。
【0103】
実施例５ 新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔによる腫瘍抑制環境解除の検証
ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍組織へ浸潤した後腫瘍免疫抑制環境による影響を受けやすく、ＰＤ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３疲弊分子を高発現させ、腫瘍細胞を効果的に殺傷する機能が低下し、ＣＡＲＴ細胞自体のアポトーシスが増加する。新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔが腫瘍抑制微小環境シグナルを解除できるか否かを検証するために、ＣＥＡＺ、ＣＥＡ－２８Ｚ、ＣＥＡ－ＢＢＺ、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ及びＣｏｎｔｒｏｌ－Ｔ群のＣＡＲ－Ｔ細胞をＤａｙ７まで培養すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＤＬＤ－１－ＣＥＡ－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を１２ウェル細胞培養板にて共培養し、４８ｈ後ＣＡＲ－Ｔ細胞を収集し、抗ヒトＣＤ３、ＰＬ、ＰＤ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３フローサイトメトリー抗体を標識した後、フローサイトメトリー検出を行い、検出結果を分析し、その効果と能力を評価した。ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８及びＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ群は、ＰＤ１の外因性発現のため、これらの群のＰＤ１陽性率がＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊の度合いを評価することに用いられない。疲弊分子の検出結果、図７及び以下の表３に示すように、ＣＤ３＋ＰＬ＋では、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８のＰＤ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３の発現の度合いはＣＥＡＺ群よりも低く、抗原刺激後ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８の疲弊の度合いが低いことが示された。
ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍組織へ浸潤した後腫瘍免疫抑制環境による影響を受けやすく、ＰＤ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３疲弊分子を高発現させ、腫瘍細胞を効果的に殺傷する機能が低下し、ＣＡＲＴ細胞自体のアポトーシスが増加する。新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔが腫瘍抑制微小環境シグナルを解除できるか否かを検証するために、ＣＥＡＺ、ＣＥＡ－２８Ｚ、ＣＥＡ－ＢＢＺ、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８、ＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－ＢＢ及びＣｏｎｔｒｏｌ－Ｔ群のＣＡＲ－Ｔ細胞をＤａｙ７まで培養すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＤＬＤ－１－ＣＥＡ－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を１２ウェル細胞培養板にて共培養し、４８ｈ後ＣＡＲ－Ｔ細胞を収集し、抗ヒトＣＤ３、ＰＬ、ＰＤ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３フローサイトメトリー抗体を標識した後、フローサイトメトリー検出を行い、検出結果を分析し、その効果と能力を評価した。ＣＥＡＺ－ＰＤ１－２８及びＣＥＡＺ－ＰＤ１－ＢＢ群は、ＰＤ１の外因性発現のため、これらの群のＰＤ１陽性率がＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊の度合いを評価することに用いられない。疲弊分子の検出結果、図７及び以下の表３に示すように、ＣＤ３＋ＰＬ＋では、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８のＰＤ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３の発現の度合いはＣＥＡＺ群よりも低く、抗原刺激後ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８の疲弊の度合いが低いことが示された。
【0104】
【表3】
【0105】
同様に、ＢＣＭＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８もＢＣＭＡ抗原刺激後に疲弊分子の発現が低かった。
【0106】
実施例６ 新規免疫抑制抵抗型ＣＡＲ－Ｔのインビボ機能の検証
インビボ検証に使用されるマウスはＮＣＧマウスとした。ＮＣＧマウス３０匹にＤＬＤ－１－ＣＥＡ－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＣＥＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７の３陽性発現、図８ａ参照）を注入して担癌させた。腫瘍が緑豆のようなサイズに成長して測定可能になると、腫瘍のサイズを測定し、実験中、実験群のマウスでは、萎靡瀕死、半身や全身麻痺が認められ、体重が２０％減少し（実験前と比較）、腫瘍体積が１５００ｍｍ３以上になると、実験を停止した。
担癌５日後、マウス腫瘍の蛍光値を測定し、各群のマウスの体重及び蛍光度値に有意差がないように生体のイメージング蛍光値によってランダムに群分けし、体重平均値を算出した。６日目にＣＡＲ－Ｔ細胞を１００μＬ（有効ＣＡＲ－Ｔ細胞数３×１０６を含む）再注入し、同じ細胞総数を投与した未トランスフェクションＴ細胞を対照群とした。ＮＣＧマウスの腫瘍体積の測定データから腫瘍体積増加曲線を作成した結果、２７～３０日に、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８は腫瘍に対して顕著な抑制効果を示し、その結果は図８ｂに示される。
さらに、第２世代ＣＡＲと融合タンパク質を組み合わせて設計された免疫抑制型ＣＡＲ即ちＣＥＡＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８構造のインビボ有効性を検証しており、同様に、ＮＣＧマウスにＤＬＤ－１－ＣＥＡ－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を注射して担癌させ、担癌１３日後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を細胞総数８×１０６で再注入した。その結果、図９に示すように、本発明の免疫抑制型ＣＡＲ－Ｔ（ＣＥＡＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）はインビボで機能を効果的に発揮することができ、効果が対照群である第２世代ＣＡＲ構造のＣＥＡＢＢＺよりも優れた。
インビボ検証に使用されるマウスはＮＣＧマウスとした。ＮＣＧマウス３０匹にＤＬＤ－１－ＣＥＡ－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＣＥＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７の３陽性発現、図８ａ参照）を注入して担癌させた。腫瘍が緑豆のようなサイズに成長して測定可能になると、腫瘍のサイズを測定し、実験中、実験群のマウスでは、萎靡瀕死、半身や全身麻痺が認められ、体重が２０％減少し（実験前と比較）、腫瘍体積が１５００ｍｍ３以上になると、実験を停止した。
担癌５日後、マウス腫瘍の蛍光値を測定し、各群のマウスの体重及び蛍光度値に有意差がないように生体のイメージング蛍光値によってランダムに群分けし、体重平均値を算出した。６日目にＣＡＲ－Ｔ細胞を１００μＬ（有効ＣＡＲ－Ｔ細胞数３×１０６を含む）再注入し、同じ細胞総数を投与した未トランスフェクションＴ細胞を対照群とした。ＮＣＧマウスの腫瘍体積の測定データから腫瘍体積増加曲線を作成した結果、２７～３０日に、ＣＥＡＺ－ＳＩＲＰγ－２８は腫瘍に対して顕著な抑制効果を示し、その結果は図８ｂに示される。
さらに、第２世代ＣＡＲと融合タンパク質を組み合わせて設計された免疫抑制型ＣＡＲ即ちＣＥＡＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８構造のインビボ有効性を検証しており、同様に、ＮＣＧマウスにＤＬＤ－１－ＣＥＡ－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を注射して担癌させ、担癌１３日後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を細胞総数８×１０６で再注入した。その結果、図９に示すように、本発明の免疫抑制型ＣＡＲ－Ｔ（ＣＥＡＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）はインビボで機能を効果的に発揮することができ、効果が対照群である第２世代ＣＡＲ構造のＣＥＡＢＢＺよりも優れた。
【0107】
第２部分
ＣＥＡを標的としたＣＡＲ構造（ＣＡＲ１のアミノ酸配列は２７）の実験部分
ＣＥＡを標的としたＣＡＲ構造（ＣＡＲ１のアミノ酸配列は２７）の実験部分
【0108】
実施例７ ＣＥＡを標的としたプラスミドの構築
（１）実験群プラスミドの構築
ミニプロモータｍｉｎｉＣＭＶを用いて、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される低酸素開始配列５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒを合成した。その後、５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、レンチウイルス発現ベクター、ＣＥＡＳｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ領域－ＣＤ８膜貫通領域－ＣＤ１３７－ＣＤ３ξ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８（５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）のＣＡＲ構造を二重酵素切断によりそれぞれ切断し、断片を回收し、遺伝子断片を連結して、形質転換し、モノクローナルを採取し、ＣＥＡを標的としたＣＡＲ－Ｔ細胞製剤のＳＩＲＰγ融合タンパク質含有の組換えプラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＥＡ－ＯＰＲＥ（ＳＩＲＰγ融合タンパク質）を構築し、このステップでは、ＣＡＲと融合タンパク質とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させ、又はＣＡＲと融合タンパク質とを個別のベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させるという２つの方法によって、融合タンパク質を含有するＣＡＲ構造を構築し、ここで、ＣＡＲと融合タンパク質とを個別のベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させて得たものは略語「５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ＋ＳＩＲＰγ－２８」で表される。
（２）対照群プラスミドの構築
実施例１の（１）の方法に従って、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８を構築した。
（１）実験群プラスミドの構築
ミニプロモータｍｉｎｉＣＭＶを用いて、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される低酸素開始配列５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒを合成した。その後、５ＨＲＥ－ＣＭＶｍｉｎｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、レンチウイルス発現ベクター、ＣＥＡＳｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジ領域－ＣＤ８膜貫通領域－ＣＤ１３７－ＣＤ３ξ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８（５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）のＣＡＲ構造を二重酵素切断によりそれぞれ切断し、断片を回收し、遺伝子断片を連結して、形質転換し、モノクローナルを採取し、ＣＥＡを標的としたＣＡＲ－Ｔ細胞製剤のＳＩＲＰγ融合タンパク質含有の組換えプラスミドＰＢＫＬ１－５Ｈ１Ｐ－ＣＥＡ－ＯＰＲＥ（ＳＩＲＰγ融合タンパク質）を構築し、このステップでは、ＣＡＲと融合タンパク質とを同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させ、又はＣＡＲと融合タンパク質とを個別のベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させるという２つの方法によって、融合タンパク質を含有するＣＡＲ構造を構築し、ここで、ＣＡＲと融合タンパク質とを個別のベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させて得たものは略語「５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ＋ＳＩＲＰγ－２８」で表される。
（２）対照群プラスミドの構築
実施例１の（１）の方法に従って、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８を構築した。
【0109】
実施例８ ＣＥＡを標的としたプラスミドのインビトロ機能のモデル検証
５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ－２８はＣｏＣｌ２を加えて、それぞれ実験群の検証用低酸素モデルとして設置され、その結果、図１０及び図１１に示すように、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ－２８では、平均蛍光強度及び陽性率は類似しており、図１２に示すように、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は、増幅倍数に関して、より優れている。
５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ－２８はＣｏＣｌ２を加えて、それぞれ実験群の検証用低酸素モデルとして設置され、その結果、図１０及び図１１に示すように、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＳＩＲＰγ－２８では、平均蛍光強度及び陽性率は類似しており、図１２に示すように、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は、増幅倍数に関して、より優れている。
【0110】
実施例９ ＣＥＡを標的としたＣＡＲ－Ｔ有効性の検証
（１）標的細胞ＤＬＤＬ１－ＣＥＡへの殺傷効率
ＣＥＡ陽性ＤＬＤ１－ＣＥＡ及びＤＬＤ１－ＣＥＡ（ＣＤ４７－）細胞をそれぞれ標的細胞とした。エフェクター細胞（通常のＣＡＲ－Ｔ細胞及び低酸素プロモータ含有ＣＡＲを発現させたＣＡＲ－Ｔ細胞）を低酸素化した後、１：１のエフェクター・ターゲット比で標的細胞に敷き、各ＣＡＲ－Ｔの標的細胞殺傷能力を検出した。
ＣＡＲ－Ｔ添加２４ｈ後、各群ＣＡＲ－Ｔの標的細胞ＤＬＤＬ１－ＣＥＡへの殺傷効率の結果、図１３及び以下の表４に示すように、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ＋ＳＩＲＰγ－２８及び５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は高い殺傷機能を有し、ＳＩＲＰγ－２８群も殺傷機能を有する。
（１）標的細胞ＤＬＤＬ１－ＣＥＡへの殺傷効率
ＣＥＡ陽性ＤＬＤ１－ＣＥＡ及びＤＬＤ１－ＣＥＡ（ＣＤ４７－）細胞をそれぞれ標的細胞とした。エフェクター細胞（通常のＣＡＲ－Ｔ細胞及び低酸素プロモータ含有ＣＡＲを発現させたＣＡＲ－Ｔ細胞）を低酸素化した後、１：１のエフェクター・ターゲット比で標的細胞に敷き、各ＣＡＲ－Ｔの標的細胞殺傷能力を検出した。
ＣＡＲ－Ｔ添加２４ｈ後、各群ＣＡＲ－Ｔの標的細胞ＤＬＤＬ１－ＣＥＡへの殺傷効率の結果、図１３及び以下の表４に示すように、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ＋ＳＩＲＰγ－２８及び５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は高い殺傷機能を有し、ＳＩＲＰγ－２８群も殺傷機能を有する。
【0111】
【表4】
【0112】
（２）ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α分泌検出
（１）に続き、２４時間殺傷後、細胞上清を収集し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞刺激後のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α分泌能力を検出した。収集した上清について、キットによりＥＬＩＳＡ方法でＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌を検出した。
検出の結果、図１４、図１５、図１６に示すように、標的細胞がＤＬＤ１－ＣＥＡである場合、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８はＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αの分泌が少なく、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αの分泌が５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８群よりも高く、標的細胞がＤＬＤ１－ＣＥＡ（ＣＤ４７－）細胞である場合、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αは、少ないか、又は検出不可である。本発明の５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は、ＣＡＲ－Ｔの増殖や腫瘍殺傷関連因子の分泌により有利であり、このことから、ＣＡＲ－Ｔの有効性を確実に向上できることを示した。
（１）に続き、２４時間殺傷後、細胞上清を収集し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞刺激後のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α分泌能力を検出した。収集した上清について、キットによりＥＬＩＳＡ方法でＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌を検出した。
検出の結果、図１４、図１５、図１６に示すように、標的細胞がＤＬＤ１－ＣＥＡである場合、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８はＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αの分泌が少なく、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αの分泌が５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８群よりも高く、標的細胞がＤＬＤ１－ＣＥＡ（ＣＤ４７－）細胞である場合、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αは、少ないか、又は検出不可である。本発明の５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は、ＣＡＲ－Ｔの増殖や腫瘍殺傷関連因子の分泌により有利であり、このことから、ＣＡＲ－Ｔの有効性を確実に向上できることを示した。
【0113】
実施例８ ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含有するプラスミドのインビボ機能の検証
生体内検証に使用される腫瘍形成標的細胞としてＤＬＤ１－ＣＥＡ－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を用い、ヒトＣＥＡ＋固形腫瘍担癌モデルを構築した。
腫瘍体積によってＣｏｎｔｒｏｌ Ｔ（ＣＴ）群、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８にランダムに群分けし、対照群をＣｏｎｔｒｏｌ Ｔ群とした。腫瘍形成１２日目に、各群のマウスに対応するＣＡＲ－Ｔ細胞を１＊１０７Ｃｏｐｉｅｓ／匹で尾静脈注射し、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ群では、８１２日目に、同じ数のＴリンパ球を再注入した。各群のマウスの腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、実験の結果、図１７及び図１８に示すように、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８は、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８群のマウスと比較して、インビボ有効性が有意に向上し、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８群も、腫瘍に対して顕著な消除作用を有する。
生体内検証に使用される腫瘍形成標的細胞としてＤＬＤ１－ＣＥＡ－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を用い、ヒトＣＥＡ＋固形腫瘍担癌モデルを構築した。
腫瘍体積によってＣｏｎｔｒｏｌ Ｔ（ＣＴ）群、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８にランダムに群分けし、対照群をＣｏｎｔｒｏｌ Ｔ群とした。腫瘍形成１２日目に、各群のマウスに対応するＣＡＲ－Ｔ細胞を１＊１０７Ｃｏｐｉｅｓ／匹で尾静脈注射し、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ群では、８１２日目に、同じ数のＴリンパ球を再注入した。各群のマウスの腫瘍体積を３日ごとに１回測定し、実験の結果、図１７及び図１８に示すように、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８は、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８群のマウスと比較して、インビボ有効性が有意に向上し、５ＨＣＥＡ－ＢＢＺ－８Ｈ－８群も、腫瘍に対して顕著な消除作用を有する。
【0114】
第３部分 ＣＤ１９標的ＣＡＲ構造の実験部分
実施例９ ＣＤ１９を標的としたプラスミドの構築
ＳＩＲＰγ及びＣＤ４７全長プラスミド、ｐＬ－ＣＡＧ－２ＡＧＦＰ、ｐＬ－ＣＡＧ－ＰＤ１－ＣＤ２８－２ＡＣｈｅｒｒｙ、ｐＬ－ＣＡＧ－ＰＤ１－ＢＢ－２Ａｃｈｅｒｒｙをテンプレートとして、ＣＤ１９標的ＣＡＲ構造を構築した。ベクター：ＳＩＲＰγ－２８、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－ＳＩＲＰγ－２８を構築した。配列決定により比較して検証した結果、構造は成功した。
実施例９ ＣＤ１９を標的としたプラスミドの構築
ＳＩＲＰγ及びＣＤ４７全長プラスミド、ｐＬ－ＣＡＧ－２ＡＧＦＰ、ｐＬ－ＣＡＧ－ＰＤ１－ＣＤ２８－２ＡＣｈｅｒｒｙ、ｐＬ－ＣＡＧ－ＰＤ１－ＢＢ－２Ａｃｈｅｒｒｙをテンプレートとして、ＣＤ１９標的ＣＡＲ構造を構築した。ベクター：ＳＩＲＰγ－２８、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－ＳＩＲＰγ－２８を構築した。配列決定により比較して検証した結果、構造は成功した。
【0115】
実施例１０ レンチウイルスの製造及びＴリンパ球への感染
リン酸カルシウム法によってレンチウイルスをパッケージングし、実施例１の３つのウイルス粒子（ＳＩＲＰγ－２８、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）を得た。
勾配遠心分離法によってリンパ球を分離し、遠心分離後、２層目の白色リンパ球層を生理食塩水で洗浄し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地を加えて培養し、ヒトＰＢＭＣ細胞を得た。得られたＰＢＭＣ細胞を抗ＣＤ３、ＣＤ２８モノクローナル抗体で２４ｈ活性化させた後、所定の感染多重度（ＭＯＩ）で活性化ＰＢＭＣを感染し、ウイルス感染８日目にフローサイトメトリーによってＣＡＲ－Ｔの陽性率を検出し、結果を図１９及び以下の表５に示す。
リン酸カルシウム法によってレンチウイルスをパッケージングし、実施例１の３つのウイルス粒子（ＳＩＲＰγ－２８、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）を得た。
勾配遠心分離法によってリンパ球を分離し、遠心分離後、２層目の白色リンパ球層を生理食塩水で洗浄し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地を加えて培養し、ヒトＰＢＭＣ細胞を得た。得られたＰＢＭＣ細胞を抗ＣＤ３、ＣＤ２８モノクローナル抗体で２４ｈ活性化させた後、所定の感染多重度（ＭＯＩ）で活性化ＰＢＭＣを感染し、ウイルス感染８日目にフローサイトメトリーによってＣＡＲ－Ｔの陽性率を検出し、結果を図１９及び以下の表５に示す。
【0116】
【表5】
【0117】
実施例１１ ＣＤ１９を標的としたインビトロの薬効学的評価
Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔを対照群として、ＳＩＲＰγ－２８群、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ群、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８群を実験群として設置し、Ｎａｍ６－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＣＤ１９陽性）、Ｋ５６２－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＣＤ１９陰性）を標的細胞として、インビトロ殺傷とインビトロ因子分泌によってインビトロ有効性を検証した。その結果、図２０及び以下の表６に示すように、同一の共発現ベクタートランスフェクション免疫細胞を用いて得たもの（５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）及び、それぞれ発現させた２つのベクター共トランスフェクション免疫細胞を用いて得たもの（ＳＩＲＰγ－２８＋５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ）は、インビトロ殺傷がＳＩＲＰγ－２８群及び５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ群よりも有意に高く、陰性細胞に殺傷がなかった。
図２１及び表７に示すように、同一の共発現ベクタートランスフェクション免疫細胞を用いて得たもの（５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）及びそれぞれ発現させた２つのベクター共トランスフェクション免疫細胞を用いて得たもの（ＳＩＲＰγ－２８＋５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ）は、因子分泌がＳＩＲＰγ－２８群及び５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ群よりも有意に高かった。
Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔを対照群として、ＳＩＲＰγ－２８群、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ群、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８群を実験群として設置し、Ｎａｍ６－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＣＤ１９陽性）、Ｋ５６２－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＣＤ１９陰性）を標的細胞として、インビトロ殺傷とインビトロ因子分泌によってインビトロ有効性を検証した。その結果、図２０及び以下の表６に示すように、同一の共発現ベクタートランスフェクション免疫細胞を用いて得たもの（５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）及び、それぞれ発現させた２つのベクター共トランスフェクション免疫細胞を用いて得たもの（ＳＩＲＰγ－２８＋５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ）は、インビトロ殺傷がＳＩＲＰγ－２８群及び５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ群よりも有意に高く、陰性細胞に殺傷がなかった。
図２１及び表７に示すように、同一の共発現ベクタートランスフェクション免疫細胞を用いて得たもの（５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）及びそれぞれ発現させた２つのベクター共トランスフェクション免疫細胞を用いて得たもの（ＳＩＲＰγ－２８＋５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ）は、因子分泌がＳＩＲＰγ－２８群及び５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ群よりも有意に高かった。
【0118】
【表6】
【0119】
【表7】
【0120】
実施例１２ ＣＤ１９を標的としたインビボ薬効学的評価
ＮＣＧマウス（雌、６週齢）に、１×１０６Ｃｅｌｌｓ／匹の用量でＮａｌｍ６－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を皮下注射（ｓ．ｃ．）し、インビボ担癌モデルを作成し、担癌８日後、１×１０７ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌｓ／匹の用量で各群（Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）のＣＡＲ－Ｔを尾静脈注射（ｉ．ｖ．）した。生体イメージングによってインビボの腫瘍成長を観察し、各ＣＡＲ－Ｔのリンパ腫の治療効果をインビボで評価した。その結果、図２２及び図２３に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ群及び５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ群と比較して、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は、インビボ抗腫瘍効果が明らかであり、腫瘍を明らかに除去できる。
ＮＣＧマウス（雌、６週齢）に、１×１０６Ｃｅｌｌｓ／匹の用量でＮａｌｍ６－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を皮下注射（ｓ．ｃ．）し、インビボ担癌モデルを作成し、担癌８日後、１×１０７ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌｓ／匹の用量で各群（Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）のＣＡＲ－Ｔを尾静脈注射（ｉ．ｖ．）した。生体イメージングによってインビボの腫瘍成長を観察し、各ＣＡＲ－Ｔのリンパ腫の治療効果をインビボで評価した。その結果、図２２及び図２３に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔ群及び５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ群と比較して、５ＨＣＤ１９－ＢＢＺ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８は、インビボ抗腫瘍効果が明らかであり、腫瘍を明らかに除去できる。
【0121】
第４部分 ＰＳＣＡ標的ＣＡＲ構造の実験部分
実施例１３ ＰＳＣＡを標的としたプラスミドの構築及びＴ細胞への感染
（１）プラスミドの構築
レンチウイルス発現ベクター、ＰＳＣＡ ＳｃＦｖ－Ｇ４Ｈヒンジ領域－ＣＤ２８膜貫通領域－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３ξ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８（ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）のＣＡＲ構造を二重酵素切断によりそれぞれ切断し、断片を回収し、遺伝子断片を連結して、形質転換してモノクローナルを採取した。
レンチウイルス発現ベクター、ＰＳＣＡ ＳｃＦｖ－７Ｈヒンジ領域－ＣＤ２８膜貫通領域－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３ξ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８（ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）のＣＡＲ構造を二重酵素切断によりそれぞれ切断し、断片を回収し、遺伝子断片を連結して、形質転換してモノクローナルを採取した。
（２）Ｔ細胞への感染
得たプラスミドでＴ細胞を感染し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。
実施例１３ ＰＳＣＡを標的としたプラスミドの構築及びＴ細胞への感染
（１）プラスミドの構築
レンチウイルス発現ベクター、ＰＳＣＡ ＳｃＦｖ－Ｇ４Ｈヒンジ領域－ＣＤ２８膜貫通領域－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３ξ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８（ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）のＣＡＲ構造を二重酵素切断によりそれぞれ切断し、断片を回収し、遺伝子断片を連結して、形質転換してモノクローナルを採取した。
レンチウイルス発現ベクター、ＰＳＣＡ ＳｃＦｖ－７Ｈヒンジ領域－ＣＤ２８膜貫通領域－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３ξ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８（ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８）のＣＡＲ構造を二重酵素切断によりそれぞれ切断し、断片を回収し、遺伝子断片を連結して、形質転換してモノクローナルを採取した。
（２）Ｔ細胞への感染
得たプラスミドでＴ細胞を感染し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。
【0122】
実施例１４ ＰＳＣＡを標的としたＩＦＮ－γ因子分泌
Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔを対照群とし、実験群としてＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭをそれぞれ設置して、ＲＴ４－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＰＳＣＡ陽性）を標的細胞として、インビトロ因子分泌によってインビトロ有効性を検証した。その結果を表８～表１３及び図２４～図２９に示す。同一の共発現ベクタートランスフェクション免疫細胞を用いて得たものＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８及び、それぞれ発現させた２つのベクター共トランスフェクション免疫細胞を用いて得たものＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８は、ＩＦＮ－γ因子分泌が、対照群及びＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ群又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ群よりもはるかに高く、陰性細胞に対して殺傷がなかった。
Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔを対照群とし、実験群としてＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭをそれぞれ設置して、ＲＴ４－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＰＳＣＡ陽性）を標的細胞として、インビトロ因子分泌によってインビトロ有効性を検証した。その結果を表８～表１３及び図２４～図２９に示す。同一の共発現ベクタートランスフェクション免疫細胞を用いて得たものＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８及び、それぞれ発現させた２つのベクター共トランスフェクション免疫細胞を用いて得たものＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８は、ＩＦＮ－γ因子分泌が、対照群及びＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ群又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ群よりもはるかに高く、陰性細胞に対して殺傷がなかった。
【0123】
【表8】
【0124】
【表9】
【0125】
【表10】
【0126】
【表11】
【0127】
【表12】
【0128】
【表13】
【0129】
実施例１４ ＰＳＣＡを標的とした細胞殺傷
実験群としてＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭをそれぞれ設置して、ＲＴ４－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＰＳＣＡ陽性）、ＰＣ－３－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＰＳＣＡ陰性）をそれぞれ標的細胞とし、その結果を表１４～表１９及び図３０～図３５に示す。同一の共発現ベクタートランスフェクション免疫細胞を用いて得たものＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８及び、それぞれ発現させた２つのベクター共トランスフェクション免疫細胞を用いて得たものＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８は、インビトロ殺傷が対照群及びＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ群又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ群よりもはるかに優れ、陰性細胞に対して殺傷がなかった。
実験群としてＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ、ＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭをそれぞれ設置して、ＲＴ４－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＰＳＣＡ陽性）、ＰＣ－３－Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＰＳＣＡ陰性）をそれぞれ標的細胞とし、その結果を表１４～表１９及び図３０～図３５に示す。同一の共発現ベクタートランスフェクション免疫細胞を用いて得たものＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ－Ｐ２Ａ－ＳＩＲＰγ－２８及び、それぞれ発現させた２つのベクター共トランスフェクション免疫細胞を用いて得たものＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ＋ＳＩＲＰγ－２８は、インビトロ殺傷が対照群及びＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－Ｇ４Ｈ－２８ＴＭ群又はＰＳＣＡ－２８ＢＢＺ－７Ｈ－２８ＴＭ群よりもはるかに優れ、陰性細胞に対して殺傷がなかった。
【0130】
【表14】
【0131】
【表15】
【0132】
【表16】
【0133】
【表17】
【0134】
【表18】
【0135】
【表19】
【0136】
なお、以上の実施例は本発明の技術的手段を説明するために過ぎず、限定するものではなく、本発明は好ましい実施例を参照して詳細に説明されたが、当業者によって明らかなように、本発明の技術的手段の主旨及び範囲を逸脱することなく、本発明の技術的手段について修正や同等置換を行うことができ、これらは全て本発明の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞外部分、膜貫通構造及び細胞内シグナル領域を含むＳＩＲＰγ融合タンパク質であり、好ましくは、前記ＳＩＲＰγ細胞外部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はその機能的バリアントに示されることを特徴とする腫瘍微小環境を逆転させる融合タンパク質。
【請求項2】
膜貫通構造はヒトＣＤ２８膜貫通領域又はヒトＣＤ８由来膜貫通領域に由来し、好ましくは、前記膜貫通構造のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記細胞内シグナル領域はＣＤ２８に由来し、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示され、好ましく、前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質の構造はＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８又はＳＩＲＰγ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢであることを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はその機能的バリアントに示され；又は
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はその機能的バリアントに示され；又は
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示され；又は
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質ＳＩＲＰγ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、ＣＡＲ１と、を含み、前記ＣＡＲ１は腫瘍抗原を認識する細胞外部分、ｈｉｎｇｅ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含むことを特徴とする腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項6】
前記融合タンパク質は多シストロン構造によってＣＡＲ１に連結され、前記多シストロン構造は自己切断性ポリペプチド又は内部リボソーム進入部位ＩＲＥＳであり、前記自己切断性ポリペプチドはＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａであることを特徴とする請求項５に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項7】
前記ＣＡＲの構造はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ融合タンパク質又はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ融合タンパク質であり、又は
前記ＣＡＲの構造はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８又はＳｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－自己切断性ペプチド－ＳＩＲＰγ－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８であることを特徴とする請求項５に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項8】
ＣＡＲ１構造では、ｈｉｎｇｅのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はその機能的バリアントに示され、ＴＭのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示され、ＣＤ３ζのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はその機能的バリアントに示され、融合タンパク質構造では、ＳＩＲＰγ細胞外部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は機能的バリアントに示され、ヒトＣＤ２８由来の膜貫通領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示され、ヒトＣＤ２８由来の細胞内シグナル領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されることを特徴とする請求項５に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項9】
前記ＳｃＦｖはＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＭＯｖ－γ、ＰＳＭＡ、ＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＧＤ２、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、Ｍｅｓｏ、ＣＤ１３３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３８、ＬｅＹ、ｋ－Ｌｉｇｈｔ、ＣＤ３３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＰＳＣＡ、ＣＬＬ－１、ＣＤ７０、ＣＤ４７のうちのいずれか１種又は複数種を認識することを特徴とする請求項７に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項10】
前記ＳｃＦｖのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はその機能的バリアントに示され、又は
前記ＣＡＲ１は以下の複数種のうちの１種を含み、
ａ）ＣＡＲ１はＣＥＡ一本鎖抗体、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ１３７及びＣＤ３ξ二重刺激シグナルを含み、好ましくは、前記ＣＡＲ構造ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はその機能的バリアントに示され、又は
ｂ）前記ＣＡＲ１はＣＤ１９一本鎖抗体、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ１３７及びＣＤ３ξ二重刺激シグナルを含み、好ましくは、前記ＣＡＲ構造ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７又はその機能的バリアントに示され、又は
ｃ）前記ＣＡＲ１はＰＳＣＡ一本鎖抗体、ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ξ三重刺激シグナルを含み、前記ヒンジ領域はＧ４Ｈ又は７Ｈであり、好ましくは、前記ＣＡＲ構造ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８又はその機能的バリアントに示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はその機能的バリアントに示される、
好ましくは、前記ａ）及びｂ）のＣＡＲ１構造は低酸素プロモータをさらに含み、前記低酸素調節性プロモータの核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列を含むことを特徴とする請求項９に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ。
【請求項11】
請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項１０に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲをコードし、前記核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される配列を含むことを特徴とする核酸配列。
【請求項12】
請求項１１に記載の前記核酸配列又はその相補配列を含む発現ベクターであって、好ましくは、前記発現ベクターはレンチウイルス発現ベクター、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、アデノ随伴ウイルス発現ベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドのうちのいずれか１種であることを特徴とする発現ベクター。
【請求項13】
請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項５～１０のいずれか１項に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ、請求項１１に記載の核酸配列、又は請求項１２に記載の発現ベクターを含む免疫細胞であって、
好ましくは、前記免疫細胞はＴ細胞、Ｔ細胞前駆体又はＮＫ細胞であることを特徴とする免疫細胞。
【請求項14】
前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を同一のベクタートランスフェクション免疫細胞に共発現させ、又は前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質を含まないＣＡＲ構造と前記ＳＩＲＰγ融合タンパク質とを２つのベクタートランスフェクション免疫細胞にそれぞれ発現させることを特徴とする請求項１３に記載の免疫細胞の製造方法。
【請求項15】
請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項５～１０のいずれか１項に記載の腫瘍免疫抑制抵抗型ＣＡＲ、請求項１１に記載の核酸配列、請求項１２に記載の発現ベクター又は請求項１３に記載の免疫細胞を含むことを特徴とする医薬組成物であって、好ましくは、前記医薬組成物は腫瘍治療ための医薬組成物であり、更に好ましくは、前記腫瘍は悪性腫瘍、例えば急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝癌、脳癌及び皮膚癌であり、前記腫瘍はＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＭＯｖ－γ、ＰＳＭＡ、ＩＬ１３Ｒα２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＧＤ２、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、Ｍｅｓｏ、ＣＤ１３３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３８、ＬｅＹ、ｋ－Ｌｉｇｈｔ、ＣＤ３３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＰＳＣＡ、ＣＬＬ－１、ＣＤ７０、ＣＤ４７のうちのいずれか１種又は複数種を高発現させることを特徴とする医薬組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】