(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-28
(54)【発明の名称】抗ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20230621BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230621BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20230621BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230621BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230621BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
A61K39/395 N
A61K31/4745
A61P35/00
C07K16/28 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022530214
(86)(22)【出願日】2022-04-29
(85)【翻訳文提出日】2022-06-14
(86)【国際出願番号】 US2022072008
(87)【国際公開番号】W WO2022232834
(87)【国際公開日】2022-11-03
(31)【優先権主張番号】63/181,963
(32)【優先日】2021-04-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512212195
【氏名又は名称】アッヴィ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フィリップス，アンドリュー・シー
(72)【発明者】
【氏名】ライリー，レジーナ・エム
(72)【発明者】
【氏名】ドハーティ，ジョージ・エイ
(72)【発明者】
【氏名】ジー，チェン
(72)【発明者】
【氏名】ブランコ，ミラン
(72)【発明者】
【氏名】ボガート，アーウィン・アール
(72)【発明者】
【氏名】アンダーソン，マーク
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076EE41
4C076EE59
4C085AA14
4C085AA23
4C085AA26
4C085BB01
4C085CC23
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB22
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、組成物を含む、ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、及びそのようなＡＤＣを使用する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の構造：【化1】
ｎは１～１０の整数であり、
Ａｂは、
配列番号３として示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号２として示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号１として示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域、並びに
配列番号６として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３ドメイン、配列番号５として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号４として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域
を含むＩｇＧ１抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である）
を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体。
【請求項2】
前記抗体Ａｂが、配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体。
【請求項3】
前記抗体Ａｂが、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれかに記載の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体を含む医薬組成物。
【請求項5】
非小細胞肺がんを処置する方法であって、請求項１～３のいずれかに記載の抗体薬物複合体を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項6】
構造：【化2】
【請求項7】
構造：【化3】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０２１年４月２９日に出願した米国特許仮出願第６３／１８１，９６３号の利益を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０２１年４月２９日に出願した米国特許仮出願第６３／１８１，９６３号の利益を主張する。
【0002】
２．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年４月２８日に作成され、６３２ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、２２，９１８バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年４月２８日に作成され、６３２ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、２２，９１８バイトのサイズである。
【0003】
３．技術分野
本出願は、とりわけ新規トポイソメラーゼ阻害薬、薬物リンカー、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）及びそれらを作製する方法に関する。
本出願は、とりわけ新規トポイソメラーゼ阻害薬、薬物リンカー、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）及びそれらを作製する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
４．背景
ｃ－Ｍｅｔは、上皮細胞及び内皮細胞の表面上に発現されるシグナル伝達チロシンキナーゼ受容体である。その唯一の公知のリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）によるｃ－Ｍｅｔの活性化は、細胞増殖、血管新生、生存、及び細胞運動性を制御することが示されている。
ｃ－Ｍｅｔは、上皮細胞及び内皮細胞の表面上に発現されるシグナル伝達チロシンキナーゼ受容体である。その唯一の公知のリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）によるｃ－Ｍｅｔの活性化は、細胞増殖、血管新生、生存、及び細胞運動性を制御することが示されている。
【0005】
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、全ての肺がんの８５％を表し、世界全体でがん関連死の原因の第一位である。異常なｃ－Ｍｅｔシグナル伝達は、ＮＳＣＬＣにおいて一般的であり、複数の機序を介して起こると考えられている。脱制御されたｃ－Ｍｅｔシグナル伝達は、不良な予後、腫瘍形成、化学療法／放射線療法に対する抵抗性、及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対する獲得耐性に関連している。
【0006】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、化学リンカーを介して細胞傷害薬に複合体された抗体を含む比較的新規クラスの治療剤を表す。ＡＤＣの治療の考え方は、抗体の結合能を薬物と組み合わせることであり、ここで抗体は、腫瘍細胞において過剰発現又は増幅された標的表面抗原を含む標的表面抗原に結合することによって薬物を腫瘍細胞に送達するために使用される。
【0007】
しかし、いかなる抗体薬物複合体も、非小細胞肺がんの処置に関して承認されていない。非小細胞肺がんの処置などの治療目的のために使用されることができる抗体薬物複合体が、当技術分野においてなおも必要である。
【発明の概要】
【0008】
５．概要
本開示は、ヒトｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体薬物複合体を提供する。例示的なＣＤＲのアミノ酸配列、並びに例示的な抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣの抗体の重鎖及び軽鎖のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、以下の詳細な説明に提供される。
本開示は、ヒトｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体薬物複合体を提供する。例示的なＣＤＲのアミノ酸配列、並びに例示的な抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣの抗体の重鎖及び軽鎖のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、以下の詳細な説明に提供される。
【0009】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載された抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣを含む組成物を提供する。組成物は一般的に、本明細書に記載された１つ以上の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ、及び１つ以上の賦形剤、担体、又は希釈剤を含む。
【0010】
本開示は、ＮＳＣＬＣを有するヒト対象などの対象を処置する方法であって、本明細書に開示される抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣの有効量を投与することを含む、方法を提供する。抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、典型的に静脈内注入及び／又は静脈内注射として投与される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
６．図面の簡単な説明
【図1】式ＩのトポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ１）阻害剤の合成経路を示す図である。
【図2A】Ｃａｌｕ－６（肺腺癌）に関する、ＴＯＰ１阻害剤化合物の投与後の細胞増殖を示すグラフである。
【図2B】Ａ３７５（悪性黒色腫）に関する、ＴＯＰ１阻害剤化合物の投与後の細胞増殖を示すグラフである。
【図3A】ＳＮＵ－５（ヒト胃癌）を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図3B】Ｈｓ ７４６Ｔ（胃腺癌）を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図3C】ＥＢＣ１（ヒト肺扁平上皮癌）を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図3D】ＮＣＩ－Ｈ４４１（ヒト肺腺癌）を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図3E】ＮＣＩ－Ｈ１５７３（肺腺癌）を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図3F】ＨＣＣ８２７（肺腺癌）を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図3G】ＮＣＩ－Ｈ８２０（肺乳頭腺癌）を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図3H】Ｃａｌｕ－３（肺腺癌）を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図3I】ＭＩＡ ＰａＣａ－２（膵管腺癌）を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図3J】ＨＥＫ－２９３を含む細胞株に及ぼす本開示のＡＤＣ（ＡＤＣ－１）のインビトロ活性を示すグラフである。
【図4A】ＮＣＩ－Ｈ４４１（ヒト腺癌）異種移植片腫瘍モデルにおけるＡＤＣ－１のインビボ活性を示すグラフである。
【図4B】Ｈｓ ７４６Ｔ（胃腺癌）異種移植片腫瘍モデルにおけるＡＤＣ－１のインビボ活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
７．詳細な説明
本発明の様々な態様は、トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ１）阻害剤、及びそのようなＴＯＰ１阻害剤を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体に関する。ある特定の実施形態において、本発明は、ＴＯＰ１阻害剤を含む抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣを含む抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ、ＡＤＣを合成するために有用な合成等価体、ＡＤＣを作製する方法及びＡＤＣを使用する様々な方法を提供する。
本発明の様々な態様は、トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ１）阻害剤、及びそのようなＴＯＰ１阻害剤を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体薬物複合体に関する。ある特定の実施形態において、本発明は、ＴＯＰ１阻害剤を含む抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣを含む抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ、ＡＤＣを合成するために有用な合成等価体、ＡＤＣを作製する方法及びＡＤＣを使用する様々な方法を提供する。
【0013】
７．１．トポイソメラーゼ１阻害剤（ＴＯＰ１ｉ）
トポイソメラーゼ１（ＴＯＰ１）は、ＤＮＡ複製の際に形成されたスーパーコイルを除去する。ＴＯＰ１阻害剤（ＴＯＰ１ｉ）は、ＴＯＰ１－ＤＮＡ複合体に結合して安定化し、ＤＮＡ鎖切断及びアポトーシスを誘導することができる。本明細書において、抗体とのコンジュゲーションによる細胞への標的化送達が目的とされ得る、構造式（Ｉ）で表されるトポイソメラーゼＩ阻害薬（「ＴＯＰ１ｉ薬」）が提示される。
トポイソメラーゼ１（ＴＯＰ１）は、ＤＮＡ複製の際に形成されたスーパーコイルを除去する。ＴＯＰ１阻害剤（ＴＯＰ１ｉ）は、ＴＯＰ１－ＤＮＡ複合体に結合して安定化し、ＤＮＡ鎖切断及びアポトーシスを誘導することができる。本明細書において、抗体とのコンジュゲーションによる細胞への標的化送達が目的とされ得る、構造式（Ｉ）で表されるトポイソメラーゼＩ阻害薬（「ＴＯＰ１ｉ薬」）が提示される。
【0014】
【化1】
【0015】
複数の実施形態において、ＴＯＰ１ｉ薬は、式（Ｉ）で表される化合物である。複数の実施形態において、ＴＯＰ１ｉ薬は、（７Ｓ）－１４－（３－アミノビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－７－エチル－７－ヒドロキシ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－８，１１（７Ｈ，１３Ｈ）－ジオン又はその構造上の等価物型である。
【0016】
本明細書において企図されるＴＯＰ１ｉ薬は、構造式（ＩＩ）：
【0017】
【化2】
【0018】
【化3】
に示されるようにＡＤＣにおいて抗体にコンジュゲートされ得る。
【0019】
７．２．抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ
本明細書に記載されたトポイソメラーゼ阻害剤は、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体にコンジュゲートされて、抗ｃ－Ｍｅｔ ＴＯＰ１ｉ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成し得る。抗体薬物複合体は、ＡＤＣが、１つ以上の薬物部分（複数可）を標的組織、例えば腫瘍関連抗原、例えばｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍に選択的に送達する能力のために、疾患の処置における抗体の治療有効性を増加させ得る。このように、複数の実施形態において、本開示は、例えば非小細胞肺がんの処置における治療的使用のための抗ｃ－Ｍｅｔ ＴＯＰ１ｉ ＡＤＣを提供する。
本明細書に記載されたトポイソメラーゼ阻害剤は、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体にコンジュゲートされて、抗ｃ－Ｍｅｔ ＴＯＰ１ｉ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成し得る。抗体薬物複合体は、ＡＤＣが、１つ以上の薬物部分（複数可）を標的組織、例えば腫瘍関連抗原、例えばｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍に選択的に送達する能力のために、疾患の処置における抗体の治療有効性を増加させ得る。このように、複数の実施形態において、本開示は、例えば非小細胞肺がんの処置における治療的使用のための抗ｃ－Ｍｅｔ ＴＯＰ１ｉ ＡＤＣを提供する。
【0020】
ある特定の実施形態において、ＴＯＰ１ｉ薬は、構造式（ＩＩＩ）：
【0021】
【化4】
に従ってリンカーによって抗体にコンジュゲートされる。
【0022】
本明細書に記載された抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣにおいて、ＴＯＰ１ｉ薬は、リンカー部分によって抗ｃ－Ｍｅｔ抗体にコンジュゲートされている。当業者によって認識されるように、リンカーは、１つの位置でＴＯＰ１ｉ薬と共有結合による連結を形成し、別の位置で抗体と共有結合による連結を形成することによって、ＴＯＰ１ｉ薬を抗ｃ－Ｍｅｔ抗体と接続する。共有結合による連結は、リンカー上の官能基とＴＯＰ１ｉ薬及び抗ｃ－Ｍｅｔ抗体上の官能基との間の反応によって形成されている。
【0023】
ＡＤＣを形成するために使用され得る合成中間化合物としては以下のものを挙げることができる：
７．２．１．リンカー薬物ＬＤ１（構造式（Ｖ））
７．２．１．リンカー薬物ＬＤ１（構造式（Ｖ））
【0024】
【化5】
【0025】
７．２．２．リンカー薬物ＬＤ２（構造式（ＶＩ））
【0026】
【化6】
【0027】
７．２．３．リンカー薬物ＬＤ３（構造式（ＶＩＩ））
【0028】
【化7】
【0029】
７．２．４．連結された薬物の数
本明細書に開示されるＡＤＣは、抗体の立体配置、及び少なくとも部分的に、コンジュゲーションを行うために使用された方法に応じて、様々な化学量論的モル比で抗体部分に連結された薬物分子を含む。
本明細書に開示されるＡＤＣは、抗体の立体配置、及び少なくとも部分的に、コンジュゲーションを行うために使用された方法に応じて、様々な化学量論的モル比で抗体部分に連結された薬物分子を含む。
【0030】
用語「薬物ロード」又は「薬物ローディング」は、個々のＡＤＣ分子における抗体あたりの薬物分子の数を指す。抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣに連結されたＴＯＰ１ｉ薬の数は、変化し得て、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体上の利用可能な結合部位の数によって制限されている。本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣに関して企図されるように、リンカーは、単一のＴＯＰ１ｉ薬を抗体抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣに連結させる。抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣが、使用及び／又は保存の条件下で許容されない凝集レベルを示さない限り、最大１０のｎを有する抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ（すなわち、構造式（ＩＩＩ））が企図される。一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、１～１０の範囲のｎを有する。一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０から選択されるｎを有する。複数の実施形態において、ｎは、２、４、６、８、又は１０である。複数の実施形態において、ｎは６である。複数の実施形態において、薬物ローディングは、１つの薬物分子、２つの薬物分子、３つの薬物分子、４つの薬物分子、５つの薬物分子、６つの薬物分子、７つの薬物分子、８つの薬物分子、９つの薬物分子、又は１０個の薬物分子を含み得る。
【0031】
７．２．５．抗体ＡｂＡ
ＡｂＡは、マウスモノクローナル抗体２２４Ｇ１１のヒト化型であり、これは米国特許第８，３２９，１７３号明細書において初めて開示され、具現化された。マウス抗体ｍ２２４Ｇ１１は、配列番号１３として示される可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｄｏｍａｉｎ）及び配列番号１４として示される可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｄｏｍａｉｎ）を有する：
ｍ２２４Ｇ１１重鎖可変ドメイン（ＣＤＲを下線で示し、配列番号１５、１６、及び１７として示されている）
ＡｂＡは、マウスモノクローナル抗体２２４Ｇ１１のヒト化型であり、これは米国特許第８，３２９，１７３号明細書において初めて開示され、具現化された。マウス抗体ｍ２２４Ｇ１１は、配列番号１３として示される可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｄｏｍａｉｎ）及び配列番号１４として示される可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｄｏｍａｉｎ）を有する：
ｍ２２４Ｇ１１重鎖可変ドメイン（ＣＤＲを下線で示し、配列番号１５、１６、及び１７として示されている）
【0032】
【化8】
【0033】
【化9】
【0034】
ＡｂＡは、免疫グロブリン－プレキシン－転写因子相同性（ＩＰＴ）ドメイン１内に位置するｃ－Ｍｅｔのユニークエピトープを標的とするヒト化組み換えＩｇＧ１κ（米国特許第８，７４１，２９０号明細書において２２４Ｇ１１［ＴＨ７ Ｈｚ３］として開示された）であり、ＨＧＦ依存的ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達及びＨＧＦ非依存的ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達の両方の遮断をもたらす。
【0035】
ＩＭＧＴ命名法において定義されるように、ＡｂＡのＣＤＲ配列は以下の配列を含む：
【0036】
【化10】
【0037】
一部の実施形態において、本開示のＡＤＣを構成する抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２；及び配列番号６として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３を含む。
【0038】
一部の実施形態において、本開示のＡＤＣを構成する抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域：
【0039】
【化11】
【0040】
【化12】
【0041】
一部の実施形態において、本開示のＡＤＣを構成する抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖（定常領域を太字で示し；ＣＤＲを下線で示す（出現順に配列番号１～３としてそれぞれ、開示されている））：
【0042】
【化13】
【0043】
【化14】
【0044】
複数の実施形態において、本開示の抗体は、配列番号９の重鎖及び配列番号１０の軽鎖を含む。
【0045】
一実施形態において、本開示のＡＤＣを構成する抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の重鎖は、以下のヌクレオチド配列（配列番号２１として開示される全長の配列）によってコードされている：
【0046】
【化15】
【0047】
一実施形態において、本開示のＡＤＣを構成する抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の軽鎖は、以下のヌクレオチド配列（配列番号２５として開示される全長の配列）によってコードされている：
【0048】
【化16】
【0049】
７．２．６．例示的な抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣ
特定の実施形態において、本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、切断可能なバリンアラニン（ｖａ）リンカーを通してＴＯＰ１ｉ薬にコンジュゲートされている抗体ＡｂＡのＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体を含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、ＡＤＣの抗ｃ－Ｍｅｔ抗体からの還元されたシステインのスルフヒドリルとのコンジュゲーションのためにブロモアセトアミド官能基を含む。他の実施形態において、リンカーは、ＡＤＣの抗ｃ－Ｍｅｔ抗体からの還元されたシステインのスルフヒドリルとのコンジュゲーションのためにマレイミド官能基を含む。一部の実施形態において、リンカーは、自己犠牲的なスペーサー、好ましくはｐ－アミノベンジルカルボニル（ＰＡＢＣ）又はそのアナログをさらに含む。
特定の実施形態において、本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、切断可能なバリンアラニン（ｖａ）リンカーを通してＴＯＰ１ｉ薬にコンジュゲートされている抗体ＡｂＡのＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体を含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、ＡＤＣの抗ｃ－Ｍｅｔ抗体からの還元されたシステインのスルフヒドリルとのコンジュゲーションのためにブロモアセトアミド官能基を含む。他の実施形態において、リンカーは、ＡＤＣの抗ｃ－Ｍｅｔ抗体からの還元されたシステインのスルフヒドリルとのコンジュゲーションのためにマレイミド官能基を含む。一部の実施形態において、リンカーは、自己犠牲的なスペーサー、好ましくはｐ－アミノベンジルカルボニル（ＰＡＢＣ）又はそのアナログをさらに含む。
【0050】
複数の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基によって形成された連結を介してリンカー薬物ＬＤ１（構造式（Ｖ））にコンジュゲートされている抗体ＡｂＡのＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体を含む。一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、抗体ＡｂＡの可変重（ＶＨ）鎖領域配列及び可変軽（ＶＬ）鎖領域配列を含む。一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、抗体ＡｂＡの重鎖（ＨＣ）配列及び軽鎖（ＬＣ）配列を含む。
【0051】
複数の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、以下の構造式（ＶＩＩＩ）：
【0052】
【化17】
を有する。複数の実施形態において、抗体Ａｂは、配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である。複数の実施形態において、抗体Ａｂは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である。複数の実施形態において、リンカー－薬物の抗体とのコンジュゲーションは、抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基によって形成された連結を介している。複数の実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の値を有する。複数の実施形態において、ｎは、２、４、６、８、又は１０の値を有する。複数の実施形態において、ｎは６である。一実施形態において、構造式（ＶＩＩＩ）の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体Ａｂを含み、ｎは、２、４、６、８、又は１０の値を有する。一実施形態において、構造式（ＶＩＩＩ）の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体Ａｂを含み、ｎは６の値を有する。
【0053】
ある特定の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基によって形成された連結を介してリンカー薬物ＬＤ２（構造式（ＶＩ））にコンジュゲートされている抗体ＡｂＡのＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体を含む。一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、抗体ＡｂＡの可変重（ＶＨ）鎖領域配列及び可変軽（ＶＬ）鎖領域配列を含む。一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、抗体ＡｂＡの重鎖（ＨＣ）配列及び軽鎖（ＬＣ）配列を含む。
【0054】
一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、以下の構造式（ＩＸ）：
【0055】
【化18】
を有する。複数の実施形態において、抗体Ａｂは、配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である。複数の実施形態において、抗体Ａｂは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である。複数の実施形態において、リンカー－薬物の抗体とのコンジュゲーションは、抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基によって形成された連結を介している。複数の実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の値を有する。複数の実施形態において、ｎは、２、４、６、８、又は１０の値を有する。複数の実施形態において、ｎは６である。一実施形態において、構造式（ＩＸ）の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体Ａｂを含み、ｎは、２、４、６、８、又は１０の値を有する。一実施形態において、構造式（ＩＸ）の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体Ａｂを含み、ｎは６の値を有する。
【0056】
ある特定の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基によって形成された連結を介してリンカー薬物ＬＤ３（構造式（ＶＩＩ））にコンジュゲートされている抗体ＡｂＡのＣＤＲに対応する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体を含む。一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、抗体ＡｂＡの可変重（ＶＨ）鎖領域配列及び可変軽（ＶＬ）鎖領域配列を含む。一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体は、抗体ＡｂＡの重鎖（ＨＣ）配列及び軽鎖（ＬＣ）配列を含む。
【0057】
一部の実施形態において、抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、以下の構造式（Ｘ）：
【0058】
【化19】
を有する。複数の実施形態において、抗体Ａｂは、配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＩｇＧ１抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である。複数の実施形態において、抗体Ａｂは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ｃ－Ｍｅｔ抗体である。複数の実施形態において、リンカー－薬物の抗体とのコンジュゲーションは、抗体のシステイン残基のスルフヒドリル基によって形成された連結を介している。複数の実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の値を有する。複数の実施形態において、ｎは、２、４、６、８、又は１０の値を有する。複数の実施形態において、ｎは６である。一実施形態において、構造式（Ｘ）の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体Ａｂを含み、ｎは、２、４、６、８、又は１０の値を有する。一実施形態において、構造式（Ｘ）の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣは、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体Ａｂを含み、ｎは６の値を有する。
【0059】
本開示のＡＤＣは、対象に投与するために適した組成物として提供され得る。一部の実施形態において、ＡＤＣ組成物は、本開示のＡＤＣ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。本明細書に開示されるＡＤＣの所定の式は、異なる薬物ローディング、すなわち異なるｎの値を有する抗体の分布を含み得る。
【0060】
７．３．使用方法
複数の実施形態において、本明細書に開示される方法は、非扁平上皮ＮＳＣＬＣを有する患者を本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣによって処置することを伴う。
複数の実施形態において、本明細書に開示される方法は、非扁平上皮ＮＳＣＬＣを有する患者を本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ ＡＤＣによって処置することを伴う。
【実施例】
【0061】
８．実施例
以下の実施例は、本明細書に記載された抗体及び結合断片の例示的な実施形態のある特定の特色及び特性を強調するものであり、例示目的のために提供されている。
以下の実施例は、本明細書に記載された抗体及び結合断片の例示的な実施形態のある特定の特色及び特性を強調するものであり、例示目的のために提供されている。
【0062】
【化20】
【0063】
［実施例１］
（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド
（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド
【0064】
【化21】
【0065】
［実施例１Ａ］
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（メトキシ（メチル）カルバモイル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバメート
３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－カルボン酸（４．９ｇ）、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２．２ｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１１．３０ｍＬ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）中溶液に、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（８．６１ｇ）を１０℃で少しずつ加えた。反応混合物を２０℃で１２時間攪拌した。追加の２つの反応物を設定し、記載されたように２０℃で１２時間攪拌した。３つ全ての反応物を組み合わせた。反応物を、ジクロロメタン（２００ｍＬ）によって希釈し、１Ｎ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）に加えた。形成された沈殿物をろ過し、ろ液を分離させた。有機層を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、１～５０％酢酸エチルの石油エーテル中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ４．９７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ３．６６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ６Ｈ）， １．４５ （ｓ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ２７１．２（Ｍ＋Ｈ）＋
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（メトキシ（メチル）カルバモイル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバメート
３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－カルボン酸（４．９ｇ）、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２．２ｇ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１１．３０ｍＬ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）中溶液に、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（８．６１ｇ）を１０℃で少しずつ加えた。反応混合物を２０℃で１２時間攪拌した。追加の２つの反応物を設定し、記載されたように２０℃で１２時間攪拌した。３つ全ての反応物を組み合わせた。反応物を、ジクロロメタン（２００ｍＬ）によって希釈し、１Ｎ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）に加えた。形成された沈殿物をろ過し、ろ液を分離させた。有機層を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、１～５０％酢酸エチルの石油エーテル中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ４．９７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ３．６６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ６Ｈ）， １．４５ （ｓ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ２７１．２（Ｍ＋Ｈ）＋
【0066】
【化22】
【0067】
［実施例１Ｂ］
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバメート
５－ブロモベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール（８．８３ｇ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、ｎ－ブチルリチウム（１７．５７ｍＬ、ヘキサン中で２．５Ｍ）を窒素ガス下の－６５℃でゆっくりと加えた。混合物を－６５℃で３０分間攪拌した。実施例１Ａ（４．７５ｇ）のテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中溶液を、ゆっくりと加えた。混合物を－６５℃で３時間攪拌した。追加の３つの反応物を設定し、－６５℃で３時間攪拌した。４つ全ての反応物を組み合わせた。混合物を、飽和塩化アンモニウム水溶液（５００ｍＬ）によってクエンチし、酢酸エチル（３×５００ｍＬ）によって抽出した。組み合わせた有機層を塩水（５００ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、１～５０％酢酸エチルの石油エーテル中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．６３ （ｄｄ， １Ｈ）， ７．４５ （ｄ， １Ｈ）， ６．８２ （ｄ， １Ｈ）， ６．０３ （ｓ， ２Ｈ）， ５．０４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ２．５０ （ｓ， ６Ｈ）， １．４６ （ｓ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３５４．２（Ｍ＋Ｎａ）＋
ｔｅｒｔ－ブチル（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバメート
５－ブロモベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール（８．８３ｇ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中溶液に、ｎ－ブチルリチウム（１７．５７ｍＬ、ヘキサン中で２．５Ｍ）を窒素ガス下の－６５℃でゆっくりと加えた。混合物を－６５℃で３０分間攪拌した。実施例１Ａ（４．７５ｇ）のテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）中溶液を、ゆっくりと加えた。混合物を－６５℃で３時間攪拌した。追加の３つの反応物を設定し、－６５℃で３時間攪拌した。４つ全ての反応物を組み合わせた。混合物を、飽和塩化アンモニウム水溶液（５００ｍＬ）によってクエンチし、酢酸エチル（３×５００ｍＬ）によって抽出した。組み合わせた有機層を塩水（５００ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、１～５０％酢酸エチルの石油エーテル中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．６３ （ｄｄ， １Ｈ）， ７．４５ （ｄ， １Ｈ）， ６．８２ （ｄ， １Ｈ）， ６．０３ （ｓ， ２Ｈ）， ５．０４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ２．５０ （ｓ， ６Ｈ）， １．４６ （ｓ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３５４．２（Ｍ＋Ｎａ）＋
【0068】
【化23】
【0069】
［実施例１Ｃ］
Ｎ－（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド
ステップ１：実施例１Ｂ（６．２ｇ）のジクロロメタン（６２ｍＬ）中溶液に、トリフルオロ酢酸（６２ｍＬ）を０℃でゆっくりと加えた。反応物を２５℃で４時間攪拌した。追加の２つの反応物を設定し、２５℃で４時間攪拌した。各混合物を減圧下で濃縮した。各残渣をさらに精製することなく次のステップに使用した。
Ｎ－（３－（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド
ステップ１：実施例１Ｂ（６．２ｇ）のジクロロメタン（６２ｍＬ）中溶液に、トリフルオロ酢酸（６２ｍＬ）を０℃でゆっくりと加えた。反応物を２５℃で４時間攪拌した。追加の２つの反応物を設定し、２５℃で４時間攪拌した。各混合物を減圧下で濃縮した。各残渣をさらに精製することなく次のステップに使用した。
【0070】
ステップ２：上記の粗生成物のジクロロメタン（６２ｍＬ）中溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１６．３４ｍＬ）及び無水トリフルオロ酢酸（３．９６ｍＬ）を０℃で滴下して加えた。混合物を２５℃で２時間攪拌した。追加の２つの反応を記載されたように設定し、２５℃で２時間攪拌した。３つ全ての反応物を組み合わせて、水（２００ｍＬ）中に注ぎ、ジクロロメタン（２×２００ｍＬ）によって抽出した。有機層を塩水（２００ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、２５％酢酸エチルの石油エーテル中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．６１ （ｄｄ， １Ｈ）， ７．４３ （ｄ， １Ｈ）， ７．００ （ｓ， １Ｈ）， ６．８５ （ｄ， １Ｈ）， ６．０５ （ｓ， ２Ｈ）， ２．６２ （ｓ， ６Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３２８．２（Ｍ＋Ｈ）＋
【0071】
【化24】
【0072】
［実施例１Ｄ］
２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（３－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）アセトアミド
実施例１Ｃ（４．３ｇ）の無水酢酸（２５ｍＬ）中溶液に、硝酸銅（ＩＩ）三水和物（４．７６ｇ）を０℃で少しずつ加えた。混合物を０℃で３時間攪拌した。追加の３つの反応物を設定し、記載されたように０℃で３時間攪拌した。４つ全ての反応物を組み合わせた。混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（５×１００ｍＬ）によって抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、７５％酢酸エチルの石油エーテル中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．６１ （ｓ， １Ｈ）， ６．７７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．６４ （ｓ， １Ｈ）， ６．２１ （ｓ， ２ Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ６ Ｈ）．ＭＳ（ＡＰＣＩ＋） ｍ／ｚ ３７３．１（Ｍ＋Ｈ）＋
２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（３－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）アセトアミド
実施例１Ｃ（４．３ｇ）の無水酢酸（２５ｍＬ）中溶液に、硝酸銅（ＩＩ）三水和物（４．７６ｇ）を０℃で少しずつ加えた。混合物を０℃で３時間攪拌した。追加の３つの反応物を設定し、記載されたように０℃で３時間攪拌した。４つ全ての反応物を組み合わせた。混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（５×１００ｍＬ）によって抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、７５％酢酸エチルの石油エーテル中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ７．６１ （ｓ， １Ｈ）， ６．７７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．６４ （ｓ， １Ｈ）， ６．２１ （ｓ， ２ Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ６ Ｈ）．ＭＳ（ＡＰＣＩ＋） ｍ／ｚ ３７３．１（Ｍ＋Ｈ）＋
【0073】
【化25】
【0074】
［実施例１Ｅ］
Ｎ－（３－（６－アミノベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド
実施例１Ｄ（４ｇ）のエタノール（４０ｍＬ）及び水（８ｍＬ）中溶液に、塩化鉄（５．４ｇ）及び塩化アンモニウム（５．１７ｇ）を窒素下で加えた。混合物を１００℃で３時間攪拌した。追加の３つの反応物を設定し、記載されたように１００℃で３時間攪拌した。周囲温度に冷却後、４つ全ての反応物を組み合わせた。混合物を水（１Ｌ）中に注ぎ、酢酸エチル（５×５００ｍＬ）によって抽出した。組み合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１０～７５％酢酸エチルの石油エーテル中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.22 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.50 (s, 2H), 6.14 (s, 1H), 5.92 (s, 2H), 2.63 (s, 6H).ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３４３．２（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｎ－（３－（６－アミノベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－カルボニル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド
実施例１Ｄ（４ｇ）のエタノール（４０ｍＬ）及び水（８ｍＬ）中溶液に、塩化鉄（５．４ｇ）及び塩化アンモニウム（５．１７ｇ）を窒素下で加えた。混合物を１００℃で３時間攪拌した。追加の３つの反応物を設定し、記載されたように１００℃で３時間攪拌した。周囲温度に冷却後、４つ全ての反応物を組み合わせた。混合物を水（１Ｌ）中に注ぎ、酢酸エチル（５×５００ｍＬ）によって抽出した。組み合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１０～７５％酢酸エチルの石油エーテル中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.22 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.50 (s, 2H), 6.14 (s, 1H), 5.92 (s, 2H), 2.63 (s, 6H).ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ３４３．２（Ｍ＋Ｈ）＋
【0075】
【化26】
【0076】
［実施例１Ｆ］
（Ｓ）－Ｎ－（３－（７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド
実施例１Ｅ（３．５ｇ）及び（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシ－７，８－ジヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３，４－ｆ］インドリジン－３，６，１０（４Ｈ）－トリオン（２．６９ｇ）のトルエン（１４０ｍＬ）中懸濁液に、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（１．９４５ｇ）を加えた。混合物を１１５℃で１２時間攪拌した。追加の３つの反応物を設定し、記載されたように１１５℃で１２時間攪拌した。周囲温度に冷却後、４つ全ての反応物を組み合わせた。混合物をろ過し、収集した固体をアセトニトリル（２００ｍＬ）によって研和し、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ １０．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．４７ （ｓ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄｄ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３６ （ｓ， ２Ｈ）， ２．８７ （ｓ， ６Ｈ）， １．９４ － １．７７ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８８ （ｔ， ３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ５７０．３（Ｍ＋Ｈ）＋
（Ｓ）－Ｎ－（３－（７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド
実施例１Ｅ（３．５ｇ）及び（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシ－７，８－ジヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３，４－ｆ］インドリジン－３，６，１０（４Ｈ）－トリオン（２．６９ｇ）のトルエン（１４０ｍＬ）中懸濁液に、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（１．９４５ｇ）を加えた。混合物を１１５℃で１２時間攪拌した。追加の３つの反応物を設定し、記載されたように１１５℃で１２時間攪拌した。周囲温度に冷却後、４つ全ての反応物を組み合わせた。混合物をろ過し、収集した固体をアセトニトリル（２００ｍＬ）によって研和し、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ １０．２８ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．４７ （ｓ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄｄ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３６ （ｓ， ２Ｈ）， ２．８７ （ｓ， ６Ｈ）， １．９４ － １．７７ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８８ （ｔ， ３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ５７０．３（Ｍ＋Ｈ）＋
【0077】
【化27】
【0078】
［実施例１Ｇ］
（７Ｓ）－１４－（３－アミノビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－７－エチル－７－ヒドロキシ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－８，１１（７Ｈ，１３Ｈ）－ジオン
実施例１Ｆ（３ｇ）のメタノール（３０ｍＬ）中溶液に、ＨＣｌ（６０ｍＬ、メタノール中で４Ｍ）を加えた。混合物を６５℃で４時間攪拌した。追加の４つの反応物を設定し、上記のように６５℃で４時間攪拌した。周囲温度まで冷却後、５つ全ての反応物を組み合わせた。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をメタノール（２００ｍＬ）によって研和し、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ９．２３ （ｓ， ３Ｈ）， ７．５４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３９ － ５．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７９ （ｓ， ６Ｈ）， １．８７ （七重線， ２Ｈ）， ０．８８ （ｔ， ３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４７４．３（Ｍ＋Ｈ）＋
（７Ｓ）－１４－（３－アミノビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）－７－エチル－７－ヒドロキシ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－８，１１（７Ｈ，１３Ｈ）－ジオン
実施例１Ｆ（３ｇ）のメタノール（３０ｍＬ）中溶液に、ＨＣｌ（６０ｍＬ、メタノール中で４Ｍ）を加えた。混合物を６５℃で４時間攪拌した。追加の４つの反応物を設定し、上記のように６５℃で４時間攪拌した。周囲温度まで冷却後、５つ全ての反応物を組み合わせた。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をメタノール（２００ｍＬ）によって研和し、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ９．２３ （ｓ， ３Ｈ）， ７．５４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３９ － ５．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７９ （ｓ， ６Ｈ）， １．８７ （七重線， ２Ｈ）， ０．８８ （ｔ， ３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ４７４．３（Ｍ＋Ｈ）＋
【0079】
【化28】
【0080】
［実施例１Ｈ］
ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート
（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－メチルブタンアミド）プロパン酸（２．４９ｇ）、２－ヒドロキシピリジン１－オキシド（１．３１ｇ）、及びＮ１－（（エチルイミノ）メチレン）－Ｎ３，Ｎ３－ジメチルプロパン－１，３－ジアミン塩酸塩（２．２６ｇ）のアセトニトリル（４０ｍＬ）中懸濁液に、２，６－ルチジン（２．７４ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。別のフラスコに、実施例１Ｇ（４ｇ）及び２，６－ルチジン（２．７４ｍＬ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中で組み合わせ、上記の溶液を加えた。混合物を周囲温度で一晩攪拌した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）、塩水（１００ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、０～１０％メタノールのジクロロメタン中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ８．６５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８９ （ｄ， １Ｈ）， ７．６１ （ｓ， １Ｈ）， ７．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２ （ｓ， １Ｈ）， ６．７７ （ｄ， １Ｈ）， ６．４６ （ｓ， １Ｈ）， ６．２９ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２９ （ｑ， １Ｈ）， ３．８７ － ３．７７ （ｍ， １Ｈ）， ２．７６ （ｓ， ６Ｈ）， １．９９ （ｑ， １Ｈ）， １．９２ － １．８１ （ｍ， ２Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）， １．２５ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９２ － ０．８０ （ｍ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７４４．４（Ｍ＋Ｈ）＋
ｔｅｒｔ－ブチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート
（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－メチルブタンアミド）プロパン酸（２．４９ｇ）、２－ヒドロキシピリジン１－オキシド（１．３１ｇ）、及びＮ１－（（エチルイミノ）メチレン）－Ｎ３，Ｎ３－ジメチルプロパン－１，３－ジアミン塩酸塩（２．２６ｇ）のアセトニトリル（４０ｍＬ）中懸濁液に、２，６－ルチジン（２．７４ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。別のフラスコに、実施例１Ｇ（４ｇ）及び２，６－ルチジン（２．７４ｍＬ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中で組み合わせ、上記の溶液を加えた。混合物を周囲温度で一晩攪拌した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）、塩水（１００ｍＬ）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、０～１０％メタノールのジクロロメタン中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ８．６５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８９ （ｄ， １Ｈ）， ７．６１ （ｓ， １Ｈ）， ７．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２ （ｓ， １Ｈ）， ６．７７ （ｄ， １Ｈ）， ６．４６ （ｓ， １Ｈ）， ６．２９ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２９ （ｑ， １Ｈ）， ３．８７ － ３．７７ （ｍ， １Ｈ）， ２．７６ （ｓ， ６Ｈ）， １．９９ （ｑ， １Ｈ）， １．９２ － １．８１ （ｍ， ２Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）， １．２５ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９２ － ０．８０ （ｍ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７４４．４（Ｍ＋Ｈ）＋
【0081】
【化29】
【0082】
［実施例１Ｉ］
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）－３－メチルブタンアミド
実施例１Ｈ（５．５ｇ）をトリフルオロ酢酸（３０ｍＬ）によって周囲温度で３０分間処置した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣を５０％アセトニトリル水溶液（２００ｍＬ）に溶解した。溶液を凍結乾燥し、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ８．８０ （ｓ， １Ｈ）， ８．５９ （ｄ， １Ｈ）， ８．１０ （ｄ， ３Ｈ）， ７．６０ （ｓ， １Ｈ）， ７．４８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３ （ｓ， １Ｈ）， ６．３３ － ６．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｄ， ２Ｈ）， ５．３５ － ５．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３５ （ｐ， １Ｈ）， ３．６６ － ３．６３ （ｍ， １Ｈ）， ２．７７ （ｓ， ６Ｈ）， ２．１７ － ２．０６ （ｍ， １Ｈ）， １．９１ － １．８３ （ｍ， ２Ｈ）， １．３１ （ｄ， ３Ｈ）， １．０１ － ０．９６ （ｄｄ， ６Ｈ）， ０．８９ （ｔ， ３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ６４４．４（Ｍ＋Ｈ）＋
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）－３－メチルブタンアミド
実施例１Ｈ（５．５ｇ）をトリフルオロ酢酸（３０ｍＬ）によって周囲温度で３０分間処置した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣を５０％アセトニトリル水溶液（２００ｍＬ）に溶解した。溶液を凍結乾燥し、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ８．８０ （ｓ， １Ｈ）， ８．５９ （ｄ， １Ｈ）， ８．１０ （ｄ， ３Ｈ）， ７．６０ （ｓ， １Ｈ）， ７．４８ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３ （ｓ， １Ｈ）， ６．３３ － ６．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４１ （ｄ， ２Ｈ）， ５．３５ － ５．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３５ （ｐ， １Ｈ）， ３．６６ － ３．６３ （ｍ， １Ｈ）， ２．７７ （ｓ， ６Ｈ）， ２．１７ － ２．０６ （ｍ， １Ｈ）， １．９１ － １．８３ （ｍ， ２Ｈ）， １．３１ （ｄ， ３Ｈ）， １．０１ － ０．９６ （ｄｄ， ６Ｈ）， ０．８９ （ｔ， ３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ６４４．４（Ｍ＋Ｈ）＋
【0083】
【化30】
【0084】
［実施例１Ｊ］
（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド
２－ブロモ酢酸（１．４３５ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２６ｍＬ）中溶液に、エチル２－エトキシキノリン－１（２Ｈ）－カルボキシレート（２．５５ｇ）を加えた。混合物を周囲温度で１０分間攪拌した。別のフラスコにおいて、実施例１Ｉ（４．５ｇ）及び２，６－ルチジン（３．６１ｍＬ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２６ｍＬ）中で組み合わせ、上記の溶液を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。混合物をトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）によって酸性にし、Ｌｕｎａカラム（２５０×５０ｍｍ、１０ｍｍ）を使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏシステムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５～７５％アセトニトリル水溶液によって３０分間かけて溶出させることによって精製し、凍結乾燥後に表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ８．５７ （ｓ， １Ｈ）， ８．３２ （ｄ， １Ｈ）， ８．１６ （ｄ， １Ｈ）， ７．６７ （ｓ， １Ｈ）， ７．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄｄ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３８ （ｄ， ２Ｈ）， ４．２８ － ４．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０３ － ３．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７６ （ｓ， ６Ｈ）， ２．０２ （ｈ， １Ｈ）， １．８６ （ｄｄｐ， ２Ｈ）， １．２５ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９３ － ０．８４ （ｍ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７６４．４６（Ｍ＋Ｈ）＋
（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド
２－ブロモ酢酸（１．４３５ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２６ｍＬ）中溶液に、エチル２－エトキシキノリン－１（２Ｈ）－カルボキシレート（２．５５ｇ）を加えた。混合物を周囲温度で１０分間攪拌した。別のフラスコにおいて、実施例１Ｉ（４．５ｇ）及び２，６－ルチジン（３．６１ｍＬ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２６ｍＬ）中で組み合わせ、上記の溶液を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。混合物をトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）によって酸性にし、Ｌｕｎａカラム（２５０×５０ｍｍ、１０ｍｍ）を使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏシステムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５～７５％アセトニトリル水溶液によって３０分間かけて溶出させることによって精製し、凍結乾燥後に表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （６００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ８．５７ （ｓ， １Ｈ）， ８．３２ （ｄ， １Ｈ）， ８．１６ （ｄ， １Ｈ）， ７．６７ （ｓ， １Ｈ）， ７．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄｄ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３８ （ｄ， ２Ｈ）， ４．２８ － ４．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０３ － ３．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７６ （ｓ， ６Ｈ）， ２．０２ （ｈ， １Ｈ）， １．８６ （ｄｄｐ， ２Ｈ）， １．２５ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９３ － ０．８４ （ｍ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７６４．４６（Ｍ＋Ｈ）＋
【0085】
【化31】
【0086】
［実施例２］
（２Ｓ）－２－［２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセトアミド］－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド
実施例１Ｉ（２ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５４ｍＬ）中溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセテート（０．７ｇ）を加え、続いてＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．３ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。反応をトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）によってクエンチし、Ｌｕｎａカラム（２５０×５０ｍｍ、１０ｍｍ）を使用するＧｉｌｓｏｎ ＰＬＣ ２０２０システムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５～７５％アセトニトリル水溶液によって３０分間かけて溶出することによって精製し、凍結乾燥後に表題の化合物を提供した。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ８．５０ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９ （ｄ， １Ｈ）， ８．１３ （ｄ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３ （ｓ， １Ｈ）， ７．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．３０ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３６ （ｄ， ２Ｈ）， ４．２４ （ｐ， １Ｈ）， ４．２０ － ４．１４ （ｍ， ３Ｈ）， ２．７５ （ｓ， ６Ｈ）， ２．０１ （ｈ， １Ｈ）， １．８６ （ｄｐ， ２Ｈ）， １．２６ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９３ － ０．８３ （ｍ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７８１．１４（Ｍ＋Ｈ）＋
（２Ｓ）－２－［２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセトアミド］－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド
実施例１Ｉ（２ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５４ｍＬ）中溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセテート（０．７ｇ）を加え、続いてＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．３ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。反応をトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）によってクエンチし、Ｌｕｎａカラム（２５０×５０ｍｍ、１０ｍｍ）を使用するＧｉｌｓｏｎ ＰＬＣ ２０２０システムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５～７５％アセトニトリル水溶液によって３０分間かけて溶出することによって精製し、凍結乾燥後に表題の化合物を提供した。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ８．５０ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９ （ｄ， １Ｈ）， ８．１３ （ｄ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２３ （ｓ， １Ｈ）， ７．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．３０ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３６ （ｄ， ２Ｈ）， ４．２４ （ｐ， １Ｈ）， ４．２０ － ４．１４ （ｍ， ３Ｈ）， ２．７５ （ｓ， ６Ｈ）， ２．０１ （ｈ， １Ｈ）， １．８６ （ｄｐ， ２Ｈ）， １．２６ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９３ － ０．８３ （ｍ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ７８１．１４（Ｍ＋Ｈ）＋
【0087】
【化32】
【0088】
［実施例３］
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）－６－［２－（５－｛［（２Ｓ）－２－（｛（２Ｓ）－２－［２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセトアミド］－３－メチルブタノイル｝アミノ）プロパノイル］アミノ｝－２－｛［（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝カルバモイル）オキシ］メチル｝フェニル）エチル］－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）－６－［２－（５－｛［（２Ｓ）－２－（｛（２Ｓ）－２－［２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセトアミド］－３－メチルブタノイル｝アミノ）プロパノイル］アミノ｝－２－｛［（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝カルバモイル）オキシ］メチル｝フェニル）エチル］－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸
【0089】
【化33】
【0090】
［実施例３Ａ］
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－２－（５－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）－２－（（（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェネチル）－６－（メトキシカルボニル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリイルトリアセテート
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－２－（５－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）－２－（（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェネチル）－６－（メトキシカルボニル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリイルトリアセテート（国際公開第２０１６０９４５０９号に記載されたように調製、２．９９ｇ）、実施例１Ｇ（１．３５ｇ）及び１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（０．３６１ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２６．５ｍＬ）中混合物に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．３９ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で４時間攪拌した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、０～８％メタノールのジクロロメタン中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ８．４３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．７４ （ｄ， ２Ｈ）， ７．６１ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．５７ － ７．４６ （ｄ， ４Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １Ｈ）， ７．３８ （ｔ， ３Ｈ）， ７．３３ － ７．２７ （ｍ， ３Ｈ）， ６．４３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．１７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．８９ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ５．７２ （ｄ， １Ｈ）， ５．３７ － ５．０２ （ｍ， ８Ｈ）， ４．９４ （ｔ， １Ｈ）， ４．６７ － ４．５６ （ｍ， １Ｈ）， ４．５３ － ４．４４ （ｔ， ２Ｈ）， ４．１９ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．００ （ｄ， ２Ｈ）， ３．７７ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４８ （ｄｔ， １Ｈ）， ２．９４ （ｄ， １Ｈ）， ２．８８ － ２．６６ （ｍ， ６Ｈ）， ２．１６ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ２．０８ － １．９７ （ｍ， ９Ｈ）， １．９４ － １．８０ （ｄｄｔ， ４Ｈ）， １．４５ （ｄ， ３Ｈ）， １．０２ （ｔ， ３Ｈ）， ０．９８ － ０．９０ （ｍ， ６Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ １３５９．５（Ｍ＋Ｈ）＋
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－２－（５－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）－２－（（（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェネチル）－６－（メトキシカルボニル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリイルトリアセテート
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）－２－（５－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）－２－（（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェネチル）－６－（メトキシカルボニル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリイルトリアセテート（国際公開第２０１６０９４５０９号に記載されたように調製、２．９９ｇ）、実施例１Ｇ（１．３５ｇ）及び１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（０．３６１ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２６．５ｍＬ）中混合物に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．３９ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で４時間攪拌した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、０～８％メタノールのジクロロメタン中溶液によって溶出させ、表題の化合物を得た。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ｐｐｍ ８．４３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．７４ （ｄ， ２Ｈ）， ７．６１ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．５７ － ７．４６ （ｄ， ４Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １Ｈ）， ７．３８ （ｔ， ３Ｈ）， ７．３３ － ７．２７ （ｍ， ３Ｈ）， ６．４３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．１７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．８９ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ５．７２ （ｄ， １Ｈ）， ５．３７ － ５．０２ （ｍ， ８Ｈ）， ４．９４ （ｔ， １Ｈ）， ４．６７ － ４．５６ （ｍ， １Ｈ）， ４．５３ － ４．４４ （ｔ， ２Ｈ）， ４．１９ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．００ （ｄ， ２Ｈ）， ３．７７ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４８ （ｄｔ， １Ｈ）， ２．９４ （ｄ， １Ｈ）， ２．８８ － ２．６６ （ｍ， ６Ｈ）， ２．１６ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ２．０８ － １．９７ （ｍ， ９Ｈ）， １．９４ － １．８０ （ｄｄｔ， ４Ｈ）， １．４５ （ｄ， ３Ｈ）， １．０２ （ｔ， ３Ｈ）， ０．９８ － ０．９０ （ｍ， ６Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ １３５９．５（Ｍ＋Ｈ）＋
【0091】
【化34】
【0092】
［実施例３Ｂ］
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）－６－（５－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）－２－（（（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェネチル）－３，４，５－トリヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸
実施例３Ａ（３．２ｇ）のメタノール（２４ｍＬ）及びテトラヒドロフラン（２４ｍＬ）中溶液に、水酸化リチウム一水和物（８４６ｍｇ）水溶液（２４ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。反応をトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）によってクエンチし、ヘプタン（５×３０ｍＬ）によって抽出した。水層を、Ｌｕｎａカラム（２５０×５０ｍｍ、１０ｍｍ）を使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏシステムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５～７５％アセトニトリル水溶液によって３０分間かけて溶出することによって精製し、凍結乾燥後に表題の化合物を提供した。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ １０．０３ （ｓ， １Ｈ）， ８．６２ （ｄ， １Ｈ）， ８．０２ （ｂｒ ｓ， ４Ｈ）， ７．５５ （ｓ， １Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １Ｈ）， ７．４１ （ｄ， ２Ｈ）， ７．３５ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２ （ｄ， １Ｈ）， ７．１６ （ｓ， １Ｈ）， ６．４０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．２３ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４３ （ｐ， １Ｈ）， ３．６０ － ３．４７ （ｍ， ３Ｈ）， ３．１５ － ３．０１ （ｍ， ３Ｈ）， ２．９０ （ｔ， １Ｈ）， ２．６４ （ｓ， ６Ｈ）， ２．００ （ｔｑ， ２Ｈ）， １．７９ （七重線， ２Ｈ）， １．６０ － １．４６ （ｍ， １Ｈ）， １．２９ （ｄ， ３Ｈ）， ０．８９ （ｄｄ， ６Ｈ）， ０．８０ （ｔ， ３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ９９７．３（Ｍ＋Ｈ）＋
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）－６－（５－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）プロパンアミド）－２－（（（（３－（（Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－８，１０，１１，１３－テトラヒドロ－７Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル）ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェネチル）－３，４，５－トリヒドロキシテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－カルボン酸
実施例３Ａ（３．２ｇ）のメタノール（２４ｍＬ）及びテトラヒドロフラン（２４ｍＬ）中溶液に、水酸化リチウム一水和物（８４６ｍｇ）水溶液（２４ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。反応をトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）によってクエンチし、ヘプタン（５×３０ｍＬ）によって抽出した。水層を、Ｌｕｎａカラム（２５０×５０ｍｍ、１０ｍｍ）を使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏシステムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５～７５％アセトニトリル水溶液によって３０分間かけて溶出することによって精製し、凍結乾燥後に表題の化合物を提供した。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ １０．０３ （ｓ， １Ｈ）， ８．６２ （ｄ， １Ｈ）， ８．０２ （ｂｒ ｓ， ４Ｈ）， ７．５５ （ｓ， １Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １Ｈ）， ７．４１ （ｄ， ２Ｈ）， ７．３５ （ｓ， １Ｈ）， ７．２２ （ｄ， １Ｈ）， ７．１６ （ｓ， １Ｈ）， ６．４０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．２３ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４３ （ｐ， １Ｈ）， ３．６０ － ３．４７ （ｍ， ３Ｈ）， ３．１５ － ３．０１ （ｍ， ３Ｈ）， ２．９０ （ｔ， １Ｈ）， ２．６４ （ｓ， ６Ｈ）， ２．００ （ｔｑ， ２Ｈ）， １．７９ （七重線， ２Ｈ）， １．６０ － １．４６ （ｍ， １Ｈ）， １．２９ （ｄ， ３Ｈ）， ０．８９ （ｄｄ， ６Ｈ）， ０．８０ （ｔ， ３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ ９９７．３（Ｍ＋Ｈ）＋
【0093】
【化35】
【0094】
［実施例３Ｃ］
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）－６－［２－（５－｛［（２Ｓ）－２－（｛（２Ｓ）－２－［２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセトアミド］－３－メチルブタノイル｝アミノ）プロパノイル］アミノ｝－２－｛［（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝カルバモイル）オキシ］メチル｝フェニル）エチル］－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸
実施例３Ｂ（１．０２ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１６ｍＬ）中溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセテート（０．２８ｇ）を加え、続いてＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．８ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。反応を酢酸（０．８ｍＬ）によってクエンチし、Ｌｕｎａカラム（２５０×５０ｍｍ、１０ｍｍ）を使用するＧｉｌｓｏｎ ＰＬＣ ２０２０システムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５～７５％アセトニトリル水溶液によって３０分間かけて溶出することによって精製し、凍結乾燥後に表題の化合物を提供した。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ９．９０ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９ － ８．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ８．１１ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５１ （ｓ， １Ｈ）， ７．４７ （ｄ， １Ｈ）， ７．４２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２７ （ｄ， １Ｈ）， ７．２３ （ｓ， １Ｈ）， ７．０８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．３０ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３６ （ｓ， ２Ｈ）， ５．０３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．３８ （ｐ， １Ｈ）， ４．２２ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．１３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｄ， ２Ｈ）， ３．１５ （ｄ， ４Ｈ）， ２．９７ （ｔ， １Ｈ）， ２．７１ （ｓ， ６Ｈ）， ２．１０ － １．９３ （ｍ， ２Ｈ）， １．８６ （ｄｐ， ２Ｈ）， １．６４ － １．５２ （ｍ， １Ｈ）， １．３１ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９１ － ０．７９ （ｍ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ １１３４．３（Ｍ＋Ｈ）＋
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）－６－［２－（５－｛［（２Ｓ）－２－（｛（２Ｓ）－２－［２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセトアミド］－３－メチルブタノイル｝アミノ）プロパノイル］アミノ｝－２－｛［（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝カルバモイル）オキシ］メチル｝フェニル）エチル］－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸
実施例３Ｂ（１．０２ｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１６ｍＬ）中溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）アセテート（０．２８ｇ）を加え、続いてＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．８ｍＬ）を加えた。混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。反応を酢酸（０．８ｍＬ）によってクエンチし、Ｌｕｎａカラム（２５０×５０ｍｍ、１０ｍｍ）を使用するＧｉｌｓｏｎ ＰＬＣ ２０２０システムでの逆相ＨＰＬＣによって、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５～７５％アセトニトリル水溶液によって３０分間かけて溶出することによって精製し、凍結乾燥後に表題の化合物を提供した。１Ｈ ＮＭＲ （５０１ ＭＨｚ， ジメチルスルホキシド －ｄ６） δ ｐｐｍ ９．９０ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９ － ８．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ８．１１ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５１ （ｓ， １Ｈ）， ７．４７ （ｄ， １Ｈ）， ７．４２ （ｓ， １Ｈ）， ７．２７ （ｄ， １Ｈ）， ７．２３ （ｓ， １Ｈ）， ７．０８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．３０ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４２ （ｓ， ２Ｈ）， ５．３６ （ｓ， ２Ｈ）， ５．０３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．３８ （ｐ， １Ｈ）， ４．２２ （ｄｄ， １Ｈ）， ４．１３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｄ， ２Ｈ）， ３．１５ （ｄ， ４Ｈ）， ２．９７ （ｔ， １Ｈ）， ２．７１ （ｓ， ６Ｈ）， ２．１０ － １．９３ （ｍ， ２Ｈ）， １．８６ （ｄｐ， ２Ｈ）， １．６４ － １．５２ （ｍ， １Ｈ）， １．３１ （ｄ， ３Ｈ）， ０．９１ － ０．７９ （ｍ， ９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ＋） ｍ／ｚ １１３４．３（Ｍ＋Ｈ）＋
【0095】
［実施例４］
細胞増殖
ＴＯＰ１ｉ薬が細胞生存率に及ぼす効果は、代謝的に活性な細胞に関するＡＴＰの存在のモニタリングによって評価された。Ｃａｌｕ－６細胞（肺腺癌）及びＡ３７５細胞（悪性黒色腫）の増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光を使用して定量された。図２Ａ及び表１に示されるように、式Ｉ（実施例１Ｇ）の化合物は、増殖中のＣａｌｕ－６細胞（０．５７ｎＭ、図２Ａ）及びＡ３７５（０．５０ｎＭ、図２Ｂ）の生存率の低減に関してナノモル以下の効力を示した。このナノモル以下の効力は、同じアッセイにおいて６．５８ｎＭ（Ｃａｌｕ－６）及び２．３０ｎＭ（Ａ３７５）のＥＣ５０を実証したＴＯＰ１ｉ薬ＳＮ－３８の成績と比較して改善した。
細胞増殖
ＴＯＰ１ｉ薬が細胞生存率に及ぼす効果は、代謝的に活性な細胞に関するＡＴＰの存在のモニタリングによって評価された。Ｃａｌｕ－６細胞（肺腺癌）及びＡ３７５細胞（悪性黒色腫）の増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光を使用して定量された。図２Ａ及び表１に示されるように、式Ｉ（実施例１Ｇ）の化合物は、増殖中のＣａｌｕ－６細胞（０．５７ｎＭ、図２Ａ）及びＡ３７５（０．５０ｎＭ、図２Ｂ）の生存率の低減に関してナノモル以下の効力を示した。このナノモル以下の効力は、同じアッセイにおいて６．５８ｎＭ（Ｃａｌｕ－６）及び２．３０ｎＭ（Ａ３７５）のＥＣ５０を実証したＴＯＰ１ｉ薬ＳＮ－３８の成績と比較して改善した。
【0096】
【表1】
【0097】
【化36】
【0098】
［実施例５］
ＡｂＡの調製及び精製
配列番号９及び配列番号１０の重鎖及び軽鎖配列をそれぞれ有するＡｂＡを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させた。ＡｂＡは、コンジュゲーションの前に単離及び精製された。
ＡｂＡの調製及び精製
配列番号９及び配列番号１０の重鎖及び軽鎖配列をそれぞれ有するＡｂＡを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させた。ＡｂＡは、コンジュゲーションの前に単離及び精製された。
【0099】
［実施例６］
コンジュゲーションのための手順（ＡＤＣ－１）
コンジュゲーションのための手順（ＡＤＣ－１）
【0100】
コンジュゲーションステップ１
還元の前に、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体ＡｂＡの溶液を、４℃で少なくとも１２時間インキュベートした。次に、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、最終濃度５ｍＭで加えた。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１００ｍＭ、２．６７モル当量、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を、溶液（１×ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）中でおよそ１０ｍｇ／ｍＬ）に加え、プレートを５分間軽く攪拌して（２２５ｒｐｍ）混合した。４℃の冷蔵庫において１７時間インキュベートした後、プレートを２２５ｒｐｍで攪拌して混合し、溶液を２２℃にした。次に、１０容量／容量％のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）共溶媒を加え、続いて２０容量／容量％の調製された１Ｍホウ酸、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、次に６モル当量の５０ｍＭリンカー薬物ＬＤ１（構造式Ｖ、実施例１Ｊ）のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中溶液を滴下して加えた。混合を２０分後に中止し、溶液を２２℃で３．３時間インキュベートした。インキュベーション後、１×ＤＰＢＳ中で調製された２モル当量の５０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に加え、容器を手で攪拌することにより軽く混合した。２２℃で１時間インキュベーション後、溶液を、６９１ｍＬ Ｇ２５ Ｆｉｎｅ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（Ｃｙｔｉｖａ（商標））カラムを使用して、１×ＤＰＢＳ中で脱塩した。
還元の前に、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体ＡｂＡの溶液を、４℃で少なくとも１２時間インキュベートした。次に、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、最終濃度５ｍＭで加えた。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１００ｍＭ、２．６７モル当量、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を、溶液（１×ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）中でおよそ１０ｍｇ／ｍＬ）に加え、プレートを５分間軽く攪拌して（２２５ｒｐｍ）混合した。４℃の冷蔵庫において１７時間インキュベートした後、プレートを２２５ｒｐｍで攪拌して混合し、溶液を２２℃にした。次に、１０容量／容量％のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）共溶媒を加え、続いて２０容量／容量％の調製された１Ｍホウ酸、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、次に６モル当量の５０ｍＭリンカー薬物ＬＤ１（構造式Ｖ、実施例１Ｊ）のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中溶液を滴下して加えた。混合を２０分後に中止し、溶液を２２℃で３．３時間インキュベートした。インキュベーション後、１×ＤＰＢＳ中で調製された２モル当量の５０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に加え、容器を手で攪拌することにより軽く混合した。２２℃で１時間インキュベーション後、溶液を、６９１ｍＬ Ｇ２５ Ｆｉｎｅ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（Ｃｙｔｉｖａ（商標））カラムを使用して、１×ＤＰＢＳ中で脱塩した。
【0101】
コンジュゲーションステップ２
還元前、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体ＡｂＡの溶液を、４℃で少なくとも１２時間インキュベートした。次に、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、最終濃度５ｍＭで加えた。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１００ｍＭ、１．００モル当量、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を、抗体溶液（１×ＤＰＢＳ中でおよそ４ｍｇ／ｍＬ）に加え、プレートを軽く攪拌しながら（２２５ｒｐｍ）５分間混合した。４℃の冷蔵庫で１７時間インキュベートした後、プレートを２２５ｒｐｍで攪拌して混合し、溶液を２２℃にした。次に、１０容量／容量％のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）共溶媒を加え、続いて２０容量／容量％の１Ｍホウ酸、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、次にＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中の４モル当量の５０ｍＭリンカー薬物ＬＤ１（構造式Ｖ、実施例１Ｊ）を滴下して加えた。混合を２０分後に中止し、溶液を２２℃で２．１時間インキュベートした。インキュベーション後、１×ＤＰＢＳ中で調製された２モル当量の１０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に加え、容器を手で攪拌しながら軽く混合した。２２℃で５時間インキュベーション後、溶液を濃縮し、緩衝液を、限外ろ過ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を介して交換した。
還元前、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体ＡｂＡの溶液を、４℃で少なくとも１２時間インキュベートした。次に、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、最終濃度５ｍＭで加えた。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１００ｍＭ、１．００モル当量、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を、抗体溶液（１×ＤＰＢＳ中でおよそ４ｍｇ／ｍＬ）に加え、プレートを軽く攪拌しながら（２２５ｒｐｍ）５分間混合した。４℃の冷蔵庫で１７時間インキュベートした後、プレートを２２５ｒｐｍで攪拌して混合し、溶液を２２℃にした。次に、１０容量／容量％のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）共溶媒を加え、続いて２０容量／容量％の１Ｍホウ酸、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、次にＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中の４モル当量の５０ｍＭリンカー薬物ＬＤ１（構造式Ｖ、実施例１Ｊ）を滴下して加えた。混合を２０分後に中止し、溶液を２２℃で２．１時間インキュベートした。インキュベーション後、１×ＤＰＢＳ中で調製された２モル当量の１０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に加え、容器を手で攪拌しながら軽く混合した。２２℃で５時間インキュベーション後、溶液を濃縮し、緩衝液を、限外ろ過ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を介して交換した。
【0102】
ＵＦ／ＤＦステップ
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ０．２２ｍ２カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、滅菌水２Ｌを一度に流した後、製剤緩衝液０．５Ｌを流した。限外ろ過（ＵＦ）は、２５０ｍＬ／分の流速で実施され、膜間差圧（ＴＭＰ）は１２～１３ｐｓｉであり、開始容量は、１．３Ｌであった。最終的な透過容量は１．１Ｌであった。ダイアフィルトレーション（ＤＦ）は、最終製剤緩衝液の２５ダイア容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）（ＤＶ）で、ＵＦステップと同じ流速及びＴＭＰで実施された。ＤＦ後、第２のＵＦステップを実施して、ＡＤＣ溶液の容量を１００ｍＬへとさらに低減させた。ＡＤＣ溶液を除去し、カセットを、製剤緩衝液１２５ｍＬによって２回すすぎ、次に各２０ｍＬへと限外ろ過した。次に、これらのすすぎ液をバルクＡＤＣ溶液に加えた。最終的な溶液を、特性評価の前に０．２２μｍフィルターによってろ過滅菌した。
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ０．２２ｍ２カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、滅菌水２Ｌを一度に流した後、製剤緩衝液０．５Ｌを流した。限外ろ過（ＵＦ）は、２５０ｍＬ／分の流速で実施され、膜間差圧（ＴＭＰ）は１２～１３ｐｓｉであり、開始容量は、１．３Ｌであった。最終的な透過容量は１．１Ｌであった。ダイアフィルトレーション（ＤＦ）は、最終製剤緩衝液の２５ダイア容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）（ＤＶ）で、ＵＦステップと同じ流速及びＴＭＰで実施された。ＤＦ後、第２のＵＦステップを実施して、ＡＤＣ溶液の容量を１００ｍＬへとさらに低減させた。ＡＤＣ溶液を除去し、カセットを、製剤緩衝液１２５ｍＬによって２回すすぎ、次に各２０ｍＬへと限外ろ過した。次に、これらのすすぎ液をバルクＡＤＣ溶液に加えた。最終的な溶液を、特性評価の前に０．２２μｍフィルターによってろ過滅菌した。
【0103】
［実施例７］
コンジュゲーションのための手順（ＡＤＣ－２）
還元の前に、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体ＡｂＡの溶液を氷中で３５分間インキュベートした。次に、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、最終濃度５ｍＭで加えた。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、２５ｍＭ、３．５０モル当量、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を溶液に加え（１×ＤＰＢＳ中でおよそ１０ｍｇ／ｍＬ）、チューブを数回ゆっくり上下させて軽く混合した。次に、溶液を氷中に入れ、４℃の冷蔵庫に２４時間入れた。インキュベーション後、１０容量／容量％のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド共溶媒を加え、続いて１０モル当量の１０ｍＭリンカー薬物ＬＤ２（構造式ＶＩ、実施例２）のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中溶液を加え、チューブを数回ゆっくり上下させて軽く混合した。次に、溶液を氷中に３０分間入れ、２２℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳ中で調製した８モル当量の１０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に加え、チューブを数回ゆっくり上下させて軽く混合した。２２℃で６０分間インキュベーション後、溶液を、ＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０脱塩カラムによって１×ＤＰＢＳ（Ｃｙｔｉｖａ（商標））中で脱塩した。次に、脱塩されたＡＤＣを、１０容量／容量％の１Ｍホウ酸、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の調製された溶液を加えて２２℃で９６時間インキュベートすることによって加水分解した。加水分解されたＡＤＣを、アフィニティクロマトグラフィーと１×ＤＰＢＳの最終製剤中での脱塩クロマトグラフィーとのカップリング（２×１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０脱塩、Ｃｙｔｉｖａ（商標））を通して精製した。収集した分画をプールし、特性評価の前に０．２２μｍフィルターを通してろ過滅菌した。
コンジュゲーションのための手順（ＡＤＣ－２）
還元の前に、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体ＡｂＡの溶液を氷中で３５分間インキュベートした。次に、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、最終濃度５ｍＭで加えた。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、２５ｍＭ、３．５０モル当量、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を溶液に加え（１×ＤＰＢＳ中でおよそ１０ｍｇ／ｍＬ）、チューブを数回ゆっくり上下させて軽く混合した。次に、溶液を氷中に入れ、４℃の冷蔵庫に２４時間入れた。インキュベーション後、１０容量／容量％のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド共溶媒を加え、続いて１０モル当量の１０ｍＭリンカー薬物ＬＤ２（構造式ＶＩ、実施例２）のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中溶液を加え、チューブを数回ゆっくり上下させて軽く混合した。次に、溶液を氷中に３０分間入れ、２２℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳ中で調製した８モル当量の１０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶液に加え、チューブを数回ゆっくり上下させて軽く混合した。２２℃で６０分間インキュベーション後、溶液を、ＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０脱塩カラムによって１×ＤＰＢＳ（Ｃｙｔｉｖａ（商標））中で脱塩した。次に、脱塩されたＡＤＣを、１０容量／容量％の１Ｍホウ酸、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の調製された溶液を加えて２２℃で９６時間インキュベートすることによって加水分解した。加水分解されたＡＤＣを、アフィニティクロマトグラフィーと１×ＤＰＢＳの最終製剤中での脱塩クロマトグラフィーとのカップリング（２×１ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０脱塩、Ｃｙｔｉｖａ（商標））を通して精製した。収集した分画をプールし、特性評価の前に０．２２μｍフィルターを通してろ過滅菌した。
【0104】
［実施例８］
コンジュゲーションのための手順（ＡＤＣ－３）
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩水溶液（ＥＤＴＡ、０．５Ｍ、２１．３μＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体（ＡｂＡ、１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４中で１３．３４ｍｇ／ｍＬ）溶液５．３３７ｍＬに加えた。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１０ｍＭ、３．０モル当量、１４２．４μＬ、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を溶液に加え、軽く攪拌し、３７℃で７５分間維持した。溶液を周囲温度に冷却し、リンカー－薬物ＬＤ３（構造式ＶＩＩ、実施例３Ｃ）（１０当量、ＬＤ３（構造式ＶＩＩ、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中の実施例３Ｃ、９０％純度））の１０ｍＭ溶液５２７μＬ）を加えた。コンジュゲーション物を軽く攪拌し、周囲温度で１．２時間放置した。ＡＤＣ溶液を脱塩によって精製した。脱塩後、ＡＤＣ溶液を、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、得られた試料を４℃で保存した。得られたＡＤＣを、１０容量／容量％の１．０Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０を加え、周囲温度の暗所で７２時間インキュベートすることによって加水分解した。加水分解後、得られたＡＤＣ溶液を、プロテインＡ樹脂カラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に吸着させること；１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４の４カラム容量によって洗浄すること；ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））の５カラム容積によって樹脂から溶出させること；及び１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４中で脱塩することによって精製した。脱塩後、ＡＤＣ溶液を、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、得られた試料を４℃で保存した。
コンジュゲーションのための手順（ＡＤＣ－３）
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩水溶液（ＥＤＴＡ、０．５Ｍ、２１．３μＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体（ＡｂＡ、１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４中で１３．３４ｍｇ／ｍＬ）溶液５．３３７ｍＬに加えた。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１０ｍＭ、３．０モル当量、１４２．４μＬ、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を溶液に加え、軽く攪拌し、３７℃で７５分間維持した。溶液を周囲温度に冷却し、リンカー－薬物ＬＤ３（構造式ＶＩＩ、実施例３Ｃ）（１０当量、ＬＤ３（構造式ＶＩＩ、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中の実施例３Ｃ、９０％純度））の１０ｍＭ溶液５２７μＬ）を加えた。コンジュゲーション物を軽く攪拌し、周囲温度で１．２時間放置した。ＡＤＣ溶液を脱塩によって精製した。脱塩後、ＡＤＣ溶液を、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、得られた試料を４℃で保存した。得られたＡＤＣを、１０容量／容量％の１．０Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０を加え、周囲温度の暗所で７２時間インキュベートすることによって加水分解した。加水分解後、得られたＡＤＣ溶液を、プロテインＡ樹脂カラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に吸着させること；１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４の４カラム容量によって洗浄すること；ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））の５カラム容積によって樹脂から溶出させること；及び１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４中で脱塩することによって精製した。脱塩後、ＡＤＣ溶液を、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、得られた試料を４℃で保存した。
【0105】
［実施例９］
コンジュゲーションのための手順（ＡＤＣ－４）
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩水溶液（ＥＤＴＡ、０．５Ｍ、９７４μＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１抗体の精製溶液（２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４中で１２．３ｍｇ／ｍＬ）２４３．３ｍＬに加えた。ＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１は、ＣＭＶ糖タンパク質Ｈに結合するモノクローナル抗体である。ＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１は、配列番号１１として示される重鎖及び配列番号１２として示される軽鎖を含み、非標的化対照抗体として使用されている。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、５００ｍＭ、６．０モル当量、２４２．４μＬ、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１の溶液に加え、軽く攪拌し、４℃で２０時間維持した。４℃のトリス緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ８．０）を溶液（２４．５ｍＬ、１０容量／容量％）に加えた。リンカー－薬物ＬＤ１（実施例１Ｊ、（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド）を、還元された抗体（１０当量、１０ｍＭ ＬＤ１、構造式Ｖ、実施例１ＪのＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中溶液２２．５ｍＬ、９０％純度）にｐＨ８．０で加えた。コンジュゲーション物を軽く攪拌し、周囲温度の水浴中で１．５時間放置した。コンジュゲーション物を、４当量のＮ－アセチル－Ｌ－システイン水溶液（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１×ＤＰＢＳ中の１００ｍＭ溶液、０．８ｍＬ）を加えることによってクエンチした。混合物を軽く攪拌し、周囲温度で１時間放置した。トリス緩衝液（１５％、Ｓｉｇｍａ、１．０Ｍ、ｐＨ７．４、４４ｍＬ）を加えて、ＡＤＣ溶液をｐＨ７．５に調整した。ＡＤＣ溶液を４℃で一晩保存した。ＡＤＣ溶液を濃縮し、緩衝液を、限外ろ過ダイアフィルトレーション（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ０．２２ｍ２カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を介して交換した。最終的なＡＤＣ溶液を、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、得られたＡＤＣ試料を４℃で保存した。ＡＤＣの最終容量は１３８ｍＬであった。
コンジュゲーションのための手順（ＡＤＣ－４）
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩水溶液（ＥＤＴＡ、０．５Ｍ、９７４μＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１抗体の精製溶液（２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４中で１２．３ｍｇ／ｍＬ）２４３．３ｍＬに加えた。ＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１は、ＣＭＶ糖タンパク質Ｈに結合するモノクローナル抗体である。ＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１は、配列番号１１として示される重鎖及び配列番号１２として示される軽鎖を含み、非標的化対照抗体として使用されている。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、５００ｍＭ、６．０モル当量、２４２．４μＬ、Ｂｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１の溶液に加え、軽く攪拌し、４℃で２０時間維持した。４℃のトリス緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ８．０）を溶液（２４．５ｍＬ、１０容量／容量％）に加えた。リンカー－薬物ＬＤ１（実施例１Ｊ、（２Ｓ）－２－（２－ブロモアセトアミド）－Ｎ－［（２Ｓ）－１－（｛３－［（７Ｓ）－７－エチル－７－ヒドロキシ－８，１１－ジオキソ－７，８，１１，１３－テトラヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１４－イル］ビシクロ［１．１．１］ペンタン－１－イル｝アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル］－３－メチルブタンアミド）を、還元された抗体（１０当量、１０ｍＭ ＬＤ１、構造式Ｖ、実施例１ＪのＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド中溶液２２．５ｍＬ、９０％純度）にｐＨ８．０で加えた。コンジュゲーション物を軽く攪拌し、周囲温度の水浴中で１．５時間放置した。コンジュゲーション物を、４当量のＮ－アセチル－Ｌ－システイン水溶液（ＮＡＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１×ＤＰＢＳ中の１００ｍＭ溶液、０．８ｍＬ）を加えることによってクエンチした。混合物を軽く攪拌し、周囲温度で１時間放置した。トリス緩衝液（１５％、Ｓｉｇｍａ、１．０Ｍ、ｐＨ７．４、４４ｍＬ）を加えて、ＡＤＣ溶液をｐＨ７．５に調整した。ＡＤＣ溶液を４℃で一晩保存した。ＡＤＣ溶液を濃縮し、緩衝液を、限外ろ過ダイアフィルトレーション（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３ ０．２２ｍ２カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を介して交換した。最終的なＡＤＣ溶液を、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、得られたＡＤＣ試料を４℃で保存した。ＡＤＣの最終容量は１３８ｍＬであった。
【0106】
［実施例１０］
ＤＡＲ（薬物抗体比）の決定
ＤＡＲは、ＬＣ－ＭＳによって決定された。ＬＣ－ＭＳ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ ６２２０ ＥＳＩ質量分析計にインターフェースで接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムを使用して実施された。ＡＤＣは、５ｍＭ（最終濃度） Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）ＴＣＥＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって還元され、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｔｒａｐ（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）脱塩カートリッジにロードされ、１０％Ｂ～７５％Ｂの０．２分間の勾配によって周囲温度で溶出した。移動相Ａは、０．１％ギ酸（ＦＡ）を含むＨ２Ｏであり、移動相Ｂは、０．１％ＦＡを含むアセトニトリルであり、流速は０．２ｍＬ／分であった。同時に溶出する軽鎖及び重鎖のエレクトロスプレーイオン化飛行時間型マススペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（商標）獲得ソフトウェアを使用して獲得した。抽出された強度をｍ／ｚスペクトルに対して、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（商標）ソフトウェアの最大エントロピー特色を使用してデコンボリューションし、各還元された抗体断片の質量を決定した。ＤＡＲは、軽鎖及び重鎖に関する裸のピーク及び改変されたピークの強度を合計することによってデコンボリューションされたスペクトルから計算され、結合した薬物の数を強度に乗算することによって正規化された。合計した正規化された強度を、強度の合計で除算し、２つの軽鎖及び２つの重鎖の合計した結果は、完全なＡＤＣに関する最終の平均ＤＡＲ値を生じた。バイオコンジュゲートのチオスクシンイミド加水分解は、水をコンジュゲートに加えると、コンジュゲートの観察可能な分子量に対し１８ダルトンの増加をもたらすことから、エレクトロスプレー質量分析によってモニターされ得る。
ＤＡＲ（薬物抗体比）の決定
ＤＡＲは、ＬＣ－ＭＳによって決定された。ＬＣ－ＭＳ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ／ＭＳＤ ＴＯＦ ６２２０ ＥＳＩ質量分析計にインターフェースで接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムを使用して実施された。ＡＤＣは、５ｍＭ（最終濃度） Ｂｏｎｄ－Ｂｒｅａｋｅｒ（商標）ＴＣＥＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって還元され、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｔｒａｐ（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）脱塩カートリッジにロードされ、１０％Ｂ～７５％Ｂの０．２分間の勾配によって周囲温度で溶出した。移動相Ａは、０．１％ギ酸（ＦＡ）を含むＨ２Ｏであり、移動相Ｂは、０．１％ＦＡを含むアセトニトリルであり、流速は０．２ｍＬ／分であった。同時に溶出する軽鎖及び重鎖のエレクトロスプレーイオン化飛行時間型マススペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（商標）獲得ソフトウェアを使用して獲得した。抽出された強度をｍ／ｚスペクトルに対して、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（商標）ソフトウェアの最大エントロピー特色を使用してデコンボリューションし、各還元された抗体断片の質量を決定した。ＤＡＲは、軽鎖及び重鎖に関する裸のピーク及び改変されたピークの強度を合計することによってデコンボリューションされたスペクトルから計算され、結合した薬物の数を強度に乗算することによって正規化された。合計した正規化された強度を、強度の合計で除算し、２つの軽鎖及び２つの重鎖の合計した結果は、完全なＡＤＣに関する最終の平均ＤＡＲ値を生じた。バイオコンジュゲートのチオスクシンイミド加水分解は、水をコンジュゲートに加えると、コンジュゲートの観察可能な分子量に対し１８ダルトンの増加をもたらすことから、エレクトロスプレー質量分析によってモニターされ得る。
【0107】
［実施例１１］
インビトロでの細胞傷害アッセイ
腫瘍細胞を、９６ウェルプレートにおいて、１０％ＦＢＳ（仔ウシ胎児血清）を含有する増殖培地１８０μｌ中、２０００～５０００個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２の湿潤インキュベーターにおいて３７℃で培養した。１８～２４時間後、２０μＬ中の抗体又はＡＤＣの滴定量を加え、細胞を、ＨＣＣ８２７、ＮＣＩ－Ｈ８２０、及びＨＥＫ－２９３（５日間）及びＭＩＡ ＰａＣａ２（４日間）を除き、６日間インキュベートした。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造元の使用説明書に従って決定された。非結合の無関係な陰性対照ＡＤＣ（ＡＤＣ－４、構造式ＶＩＩＩ、ＡｂはＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１である）もまた、細胞の殺滅が抗原依存的であることを確認するために全てのアッセイに含めた。ＡＤＣは全て、およそ等価な平均ＤＡＲを有した。
インビトロでの細胞傷害アッセイ
腫瘍細胞を、９６ウェルプレートにおいて、１０％ＦＢＳ（仔ウシ胎児血清）を含有する増殖培地１８０μｌ中、２０００～５０００個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２の湿潤インキュベーターにおいて３７℃で培養した。１８～２４時間後、２０μＬ中の抗体又はＡＤＣの滴定量を加え、細胞を、ＨＣＣ８２７、ＮＣＩ－Ｈ８２０、及びＨＥＫ－２９３（５日間）及びＭＩＡ ＰａＣａ２（４日間）を除き、６日間インキュベートした。細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造元の使用説明書に従って決定された。非結合の無関係な陰性対照ＡＤＣ（ＡＤＣ－４、構造式ＶＩＩＩ、ＡｂはＭＳＬ１０９－Ｃ６ｖ１である）もまた、細胞の殺滅が抗原依存的であることを確認するために全てのアッセイに含めた。ＡＤＣは全て、およそ等価な平均ＤＡＲを有した。
【0108】
【表2】
【0109】
［実施例１２］
受容体密度の決定
ｃ－Ｍｅｔ細胞表面密度（細胞あたりの抗原結合能）は、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して培養細胞上の細胞表面抗原の間接的免疫蛍光染色によって決定された。簡単に説明すると、細胞を、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）解析のために、上記のように培養フラスコから採取し、９６ウェル丸底プレートに１００μＬ／ウェルで加え、３μｇ／ｍＬ ｃ－Ｍｅｔ抗体ｍ２２４Ｇ１１と共に４℃でインキュベートした。同じアイソタイプ（ｍＩｇＧ１）の無関係なマウスモノクローナル抗体３μｇ／ｍＬによって処置したウェルを対照として含めた。一次抗体と共に１時間インキュベーション後、細胞を、３００×ｇで３分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液によって２回洗浄した。ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）ビーズの間接的免疫蛍光染色のために、バイアル１（セットアップビーズ）及びバイアル２（較正ビーズ）からの再懸濁したビーズ１００μＬを、個別のウェルに加え、３００×ｇで３分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液によって１回洗浄した。全てのウェルを、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２５０に希釈した抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ａ－１１０２９）１００μＬと共に４℃で１時間インキュベートした。細胞を、３００×ｇで３分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液によって２回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１％ホルムアルデヒドのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中溶液によって固定した。データは、ＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩフローサイトメーター上で獲得し、５つのビーズ集団に関して幾何平均値を記録し、これを使用してビーズあたりのロット特異的抗体分子に基づいて標準曲線を作成した。標準曲線を使用して、ＡＢＣ（抗体結合能又は受容体の数）を、染色された細胞試料に割付した。
受容体密度の決定
ｃ－Ｍｅｔ細胞表面密度（細胞あたりの抗原結合能）は、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して培養細胞上の細胞表面抗原の間接的免疫蛍光染色によって決定された。簡単に説明すると、細胞を、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）解析のために、上記のように培養フラスコから採取し、９６ウェル丸底プレートに１００μＬ／ウェルで加え、３μｇ／ｍＬ ｃ－Ｍｅｔ抗体ｍ２２４Ｇ１１と共に４℃でインキュベートした。同じアイソタイプ（ｍＩｇＧ１）の無関係なマウスモノクローナル抗体３μｇ／ｍＬによって処置したウェルを対照として含めた。一次抗体と共に１時間インキュベーション後、細胞を、３００×ｇで３分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液によって２回洗浄した。ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）ビーズの間接的免疫蛍光染色のために、バイアル１（セットアップビーズ）及びバイアル２（較正ビーズ）からの再懸濁したビーズ１００μＬを、個別のウェルに加え、３００×ｇで３分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液によって１回洗浄した。全てのウェルを、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２５０に希釈した抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ａ－１１０２９）１００μＬと共に４℃で１時間インキュベートした。細胞を、３００×ｇで３分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液によって２回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１％ホルムアルデヒドのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中溶液によって固定した。データは、ＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩフローサイトメーター上で獲得し、５つのビーズ集団に関して幾何平均値を記録し、これを使用してビーズあたりのロット特異的抗体分子に基づいて標準曲線を作成した。標準曲線を使用して、ＡＢＣ（抗体結合能又は受容体の数）を、染色された細胞試料に割付した。
【0110】
結果
ｃ－Ｍｅｔ発現レベルとＡＤＣ－１に対する感受性との可能性がある相関を決定するために、９個の細胞株のパネルを、インビトロでの増殖アッセイにおいて試験した。ＦＡＣＳ解析は、これらの細胞株が、細胞表面のｃ－Ｍｅｔ分子数を表すｃ－Ｍｅｔ抗体結合能を介して定量された場合に、一定範囲のｃ－Ｍｅｔ発現レベルを保有することを実証した（表３）。細胞増殖アッセイにおけるＡＤＣ－１に対する感受性は、最大殺滅及びＩＣ５０として定量された（表３）。ＡＤＣ－１は、ＭＥＴ増幅細胞株を含む、ｃ－Ｍｅｔを過剰発現するがん細胞の増殖を阻害した（表３）。比較として、非コンジュゲートＡｂＡは、ＭＥＴ増幅を有する細胞、すなわちＨｓ ７４６Ｔ、ＳＮＵ－５、及びＥＢＣ－１（図３Ａ～Ｃ）の増殖を阻害したが、ＭＥＴ増幅を有しない細胞株、すなわちＮＣＩ－Ｈ４４１、ＮＣＩ－Ｈ１５７３、ＨＣＣ８２７、ＮＣＩ－Ｈ８２０、及びＣａｌｕ－３の増殖は阻害せず、ＡＤＣ－１は同様に活性であった（図３Ｄ～Ｈ）。非コンジュゲートＡｂＡもＡＤＣ－１も、低ｃ－Ｍｅｔ発現細胞であるＨＥＫ－２９３及びＭＩＡ ＰａＣａ２において活性ではなく（表３、図３Ｉ及び図３Ｊ）、ＡＤＣ－１による有意な殺滅のために、ｃ－Ｍｅｔ発現レベルの閾値が存在することを示唆した。
ｃ－Ｍｅｔ発現レベルとＡＤＣ－１に対する感受性との可能性がある相関を決定するために、９個の細胞株のパネルを、インビトロでの増殖アッセイにおいて試験した。ＦＡＣＳ解析は、これらの細胞株が、細胞表面のｃ－Ｍｅｔ分子数を表すｃ－Ｍｅｔ抗体結合能を介して定量された場合に、一定範囲のｃ－Ｍｅｔ発現レベルを保有することを実証した（表３）。細胞増殖アッセイにおけるＡＤＣ－１に対する感受性は、最大殺滅及びＩＣ５０として定量された（表３）。ＡＤＣ－１は、ＭＥＴ増幅細胞株を含む、ｃ－Ｍｅｔを過剰発現するがん細胞の増殖を阻害した（表３）。比較として、非コンジュゲートＡｂＡは、ＭＥＴ増幅を有する細胞、すなわちＨｓ ７４６Ｔ、ＳＮＵ－５、及びＥＢＣ－１（図３Ａ～Ｃ）の増殖を阻害したが、ＭＥＴ増幅を有しない細胞株、すなわちＮＣＩ－Ｈ４４１、ＮＣＩ－Ｈ１５７３、ＨＣＣ８２７、ＮＣＩ－Ｈ８２０、及びＣａｌｕ－３の増殖は阻害せず、ＡＤＣ－１は同様に活性であった（図３Ｄ～Ｈ）。非コンジュゲートＡｂＡもＡＤＣ－１も、低ｃ－Ｍｅｔ発現細胞であるＨＥＫ－２９３及びＭＩＡ ＰａＣａ２において活性ではなく（表３、図３Ｉ及び図３Ｊ）、ＡＤＣ－１による有意な殺滅のために、ｃ－Ｍｅｔ発現レベルの閾値が存在することを示唆した。
【0111】
【表3】
【0112】
［実施例１３］
ｃ－Ｍｅｔ標的化ＴＯＰ１ｉ ＡＤＣは、インビボでがん異種移植片の成長を阻害する
細胞株、Ｈｓ ７４６Ｔ及びＮＣＩ－Ｈ４４１は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られた。細胞は、供給元の推奨に従って３回以下の継代で単層培養として維持された。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と混合した培養培地（１：１、容量：容量）中の細胞２×１０６個の懸濁液を、雌性Ｃ．Ｂ－１７ ＳＣＩＤマウスの右脇腹に皮下注射し、胃癌細胞株Ｈｓ ７４６Ｔからの異種移植片を生成した。ＮＳＣＬＣ細胞株であるＮＣＩ－Ｈ４４１からの異種移植片を生成するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した培養培地（１：１、容量：容量）中の細胞５×１０６個の懸濁液を、雌性ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに皮下注射した。脇腹の腫瘍のサイズがおよそ２００ｍｍ３に達すると処置を開始した。
ｃ－Ｍｅｔ標的化ＴＯＰ１ｉ ＡＤＣは、インビボでがん異種移植片の成長を阻害する
細胞株、Ｈｓ ７４６Ｔ及びＮＣＩ－Ｈ４４１は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られた。細胞は、供給元の推奨に従って３回以下の継代で単層培養として維持された。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と混合した培養培地（１：１、容量：容量）中の細胞２×１０６個の懸濁液を、雌性Ｃ．Ｂ－１７ ＳＣＩＤマウスの右脇腹に皮下注射し、胃癌細胞株Ｈｓ ７４６Ｔからの異種移植片を生成した。ＮＳＣＬＣ細胞株であるＮＣＩ－Ｈ４４１からの異種移植片を生成するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した培養培地（１：１、容量：容量）中の細胞５×１０６個の懸濁液を、雌性ＳＣＩＤ／ｂｇマウスに皮下注射した。脇腹の腫瘍のサイズがおよそ２００ｍｍ３に達すると処置を開始した。
【0113】
ビヒクル（０ｍｇ／ｋｇ）及び４つの用量レベル（最も低い用量から最も高い用量まで、用量Ａ～Ｄ）が投与された。各動物は、１回用量を投与された。
【0114】
図４Ａ及び４Ｂは、ＡＤＣ－１が、免疫不全マウスにおける異種移植片として成長したヒトＮＳＣＬＣの成長を阻害したことを示している。強固な成長阻害が、ＡＤＣ－１の用量Ｃ及び用量Ｄの１回用量の投与後に示され、用量Ｂの投与後ではＨｓ ７４６Ｔ及びＮＣＩ－Ｈ４４１異種移植片の両方において中等度の腫瘍成長遅延が示されている。
【0115】
［実施例１４］
ｃ－ＭＥＴ処置ＴＯＰ１ｉ ＡＤＣは、インビボで患者由来がん細胞の成長を阻害する
ＮＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデル、ＬＵ４５０、ＬＵ１２０、ＬＵ５７２、ＬＵ１２３、及びＬＵ４１３は、雌性免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に患者の生検組織断片を皮下に植え込むことによって内部で確立された。腫瘍が確立された後、ＰＤＸ腫瘍細胞を、腫瘍を細胞懸濁液へと解離することによって増大させ、培養培地中の細胞５×１０４個を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と混合し（１：１、容量：容量）、雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪体領域に皮下注射した。有効性試験に関して、腫瘍を有するマウスを処置群に無作為化し、各群は、等しい平均腫瘍体積（１３０～２００ｍｍ３）を有した。ｃ－Ｍｅｔ－ＡＤＣは、６つの用量レベル（最も低い用量から最も高い用量まで、用量Ａ～Ｆ）で単一用量として腹腔内注射によって投与された。ｃ－Ｍｅｔ標的化有効性を、ビヒクルの類似の投与と比較した。腫瘍体積を週に１～２回測定し、有効性は、腫瘍体積（ｍｍ３）を時間に対してプロットし、腫瘍進行までの時間（ＴＴＰ）を計算することによって評価された。日数で表記されるＴＴＰは、腫瘍が再成長して処置前（無作為化時）のサイズを倍加させるまでの１回用量処置後の時間である。持続性の応答（治癒）に関するＴＴＰは、数の前に「＞」の印を有する試験期間として示される。
ｃ－ＭＥＴ処置ＴＯＰ１ｉ ＡＤＣは、インビボで患者由来がん細胞の成長を阻害する
ＮＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデル、ＬＵ４５０、ＬＵ１２０、ＬＵ５７２、ＬＵ１２３、及びＬＵ４１３は、雌性免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に患者の生検組織断片を皮下に植え込むことによって内部で確立された。腫瘍が確立された後、ＰＤＸ腫瘍細胞を、腫瘍を細胞懸濁液へと解離することによって増大させ、培養培地中の細胞５×１０４個を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と混合し（１：１、容量：容量）、雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪体領域に皮下注射した。有効性試験に関して、腫瘍を有するマウスを処置群に無作為化し、各群は、等しい平均腫瘍体積（１３０～２００ｍｍ３）を有した。ｃ－Ｍｅｔ－ＡＤＣは、６つの用量レベル（最も低い用量から最も高い用量まで、用量Ａ～Ｆ）で単一用量として腹腔内注射によって投与された。ｃ－Ｍｅｔ標的化有効性を、ビヒクルの類似の投与と比較した。腫瘍体積を週に１～２回測定し、有効性は、腫瘍体積（ｍｍ３）を時間に対してプロットし、腫瘍進行までの時間（ＴＴＰ）を計算することによって評価された。日数で表記されるＴＴＰは、腫瘍が再成長して処置前（無作為化時）のサイズを倍加させるまでの１回用量処置後の時間である。持続性の応答（治癒）に関するＴＴＰは、数の前に「＞」の印を有する試験期間として示される。
【0116】
【表4】
【0117】
構造式（ＶＩＩＩ）で表される構造を有するＡＤＣは、改善されたインビボ毒性を実証した。
【0118】
【表5】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図4A】
【図4B】
【配列表】
【国際調査報告】