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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-28
(54)【発明の名称】ＣＯＶＩＤ－１９の治療及びその方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/50 20060101AFI20230621BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230621BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230621BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230621BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230621BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20230621BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230621BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230621BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230621BHJP
A61K 36/064 20060101ALI20230621BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20230621BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230621BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20230621BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230621BHJP
C12N 15/81 20060101ALI20230621BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230621BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230621BHJP
【ＦＩ】
C12N15/50
A61P31/14 ZNA
A61P37/04
A61P11/00
A61K39/39
A61K39/215
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/761
A61K36/064
A61K9/127
A61K47/02
A61K9/51
C12N15/861 Z
C12N15/81 Z
C12N7/01
C12N1/19
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022554944
(86)(22)【出願日】2021-03-10
(85)【翻訳文提出日】2022-11-11
(86)【国際出願番号】 US2021021737
(87)【国際公開番号】W WO2021183665
(87)【国際公開日】2021-09-16
(31)【優先権主張番号】62/988,328
(32)【優先日】2020-03-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/009,960
(32)【優先日】2020-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/010,010
(32)【優先日】2020-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】16/883,263
(32)【優先日】2020-05-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/059,975
(32)【優先日】2020-08-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/064,157
(32)【優先日】2020-08-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/117,460
(32)【優先日】2020-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/117,922
(32)【優先日】2020-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/118,697
(32)【優先日】2020-11-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/135,380
(32)【優先日】2021-01-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/117,847
(32)【優先日】2020-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/198,164
(32)【優先日】2021-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
３．テフロン
(71)【出願人】
【識別番号】520393015
【氏名又は名称】イミュニティーバイオ、インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】パトリック、スン－シオン
(72)【発明者】
【氏名】ピーター、シーリング
(72)【発明者】
【氏名】アニー、シン
(72)【発明者】
【氏名】レナード、センダー
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー、サフリット
(72)【発明者】
【氏名】エイドリアン、ライス
(72)【発明者】
【氏名】シャールーズ、ラビザド
(72)【発明者】
【氏名】カイバン、ニアジ
(72)【発明者】
【氏名】リーゼ、ガイサート
(72)【発明者】
【氏名】エリザベス、ガビッチ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA72X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA45
4C076AA19
4C076AA65
4C076BB01
4C076BB16
4C076BB21
4C076CC06
4C076CC15
4C076DD25
4C076DD25A
4C076DD67
4C076DD67H
4C076FF01
4C076FF11
4C084AA13
4C084MA05
4C084MA24
4C084NA14
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB331
4C084ZB332
4C085AA03
4C085BA71
4C085CC08
4C085EE01
4C085EE05
4C085EE06
4C085FF13
4C085FF14
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG08
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC11
4C087BC12
4C087BC83
4C087CA09
4C087CA12
4C087MA05
4C087MA24
4C087NA14
4C087ZA59
4C087ZB09
4C087ZB33
(57)【要約】
対象におけるコロナウイルスに対する免疫を誘導するためのワクチン組成物は、Ｎ－ＥＴＳＤ、エンドソーム標的配列を含む修飾ヌクレオカプシドタンパク質をコードする、及び／又はＳ－融合物、改善された表面発現を有する修飾スパイクタンパク質をコードする組換え核酸を含む。ワクチンは、組換え核酸、組換え酵母、及び／又はアデノウイルスなどの組換えウイルスとして製剤化されてもよく、注射及び／又は粘膜送達を介して投与することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ．エンドソーム標的配列に融合された重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）（Ｎ－ＥＴＳＤ）をコードする第１の部分であって、Ｎ－ＥＴＳＤ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに機能的に結合されている、第１の部分と、ｂ．ＳＡＲＳウイルススパイクタンパク質（Ｓ）をコードする第２の部分であって、Ｓ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに機能的に結合されている、第２の部分と、
を含む組換え核酸。
【請求項2】
前記ＳＡＲＳウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項3】
前記Ｎ－ＥＴＳＤの前記エンドソーム標的配列が、前記第１の部分の５’末端にコードされる、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項4】
前記Ｎ－ＥＴＳＤの前記エンドソーム標的配列が、前記第１の部分の３’末端にコードされる、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項5】
前記第１及び第２の部分が、バイシストロン性配列で配列される、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項6】
前記Ｎ－ＥＴＳＤが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の組換え核酸。
【請求項7】
前記Ｎ－ＥＴＳＤが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の組換え核酸。
【請求項8】
前記第１の部分が、配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載の組換え核酸。
【請求項9】
前記Ｓタンパク質が、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の組換え核酸。
【請求項10】
前記Ｓタンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の組換え核酸。
【請求項11】
前記Ｓタンパク質が配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の組換え核酸。
【請求項12】
前記第２の部分が配列番号５のヌクレオチド配列を有する、請求項９に記載の組換え核酸。
【請求項13】
前記第２の部分が配列番号６のヌクレオチド配列を有する、請求項９に記載の組換え核酸。
【請求項14】
同時刺激性分子又は免疫刺激性サイトカインをコードする第３の部分をさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項15】
ウイルス又は酵母発現ベクターに組み込まれている、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項16】
前記ウイルス発現ベクターが、Ｅ１遺伝子領域欠失及びＥ２ｂ遺伝子領域欠失を有するアデノウイルス発現ベクターである、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項17】
前記酵母発現ベクターが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の発現ベクターである、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項18】
前記核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項19】
Ｅ１遺伝子欠失、Ｅ２ｂ遺伝子欠失、及びａ．ＳＡＲＳコロナウイルスＮ－ＥＴＳＤをコードする第１の部分であって、Ｎ－ＥＴＳＤ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに機能的に結合されている、第１の部分と、
ｂ．ＳＡＲＳ Ｓタンパク質をコードする第２の部分であって、Ｓ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに各々機能的に結合されている、第２の部分と、
を含む組換え核酸を含む組換え複製欠損アデノウイルス。
【請求項20】
前記ＳＡＲＳウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１９に記載のアデノウイルス。
【請求項21】
前記Ｎ－ＥＴＳＤのエンドソーム標的配列が、前記第１の部分の５’末端にコードされる、請求項２０に記載のアデノウイルス。
【請求項22】
前記Ｎ－ＥＴＳＤのエンドソーム標的配列が、前記第１の部分の３’末端にコードされる、請求項２０に記載のアデノウイルス。
【請求項23】
前記第１及び第２の部分が、バイシストロン性配列で配列される、請求項２２に記載のアデノウイルス。
【請求項24】
前記Ｎ－ＥＴＳＤが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のアデノウイルス。
【請求項25】
前記Ｎ－ＥＴＳＤが、配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載のアデノウイルス。
【請求項26】
前記第１の部分が配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項２４に記載のアデノウイルス。
【請求項27】
前記Ｓタンパク質が、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載のアデノウイルス。
【請求項28】
前記Ｓタンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載のアデノウイルス。
【請求項29】
前記Ｓタンパク質が配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載のアデノウイルス。
【請求項30】
前記第２の部分が配列番号５のヌクレオチド配列を有する、請求項２７に記載のアデノウイルス。
【請求項31】
前記第２の部分が配列番号６のヌクレオチド配列を有する、請求項２７に記載のアデノウイルス。
【請求項32】
同時刺激性分子又は免疫刺激性サイトカインをコードする第３の部分をさらに含む、請求項１９～３１のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項33】
前記組換えアデノウイルスがＥ３遺伝子領域欠失を有する、請求項１９～３２のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項34】
ａ．ＳＡＲＳコロナウイルスＮ－ＥＴＳＤをコードする第１の部分であって、Ｎ－ＥＴＳＤ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに機能的に結合されている、第１の部分と、ｂ．ＳＡＲＳ Ｓタンパク質をコードする第２の部分であって、Ｓ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに各々機能的に結合されている、第２の部分と、
を含む組換え核酸を含む組換え酵母。
【請求項35】
前記ＳＡＲＳウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項３４に記載の組換え酵母。
【請求項36】
前記Ｎ－ＥＴＳＤのエンドソーム標的配列が、ヌクレオカプシドタンパク質の５’末端にコードされる、請求項３５に記載の組換え酵母。
【請求項37】
前記Ｎ－ＥＴＳＤのエンドソーム標的配列が、ヌクレオカプシドタンパク質の３’末端にコードされる、請求項３５に記載の組換え酵母。
【請求項38】
前記第１及び第２の部分が、バイシストロン性配列で配列される、請求項３７に記載の組換え酵母。
【請求項39】
前記Ｎ－ＥＴＳＤが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３７に記載の組換え酵母。
【請求項40】
前記Ｎ－ＥＴＳＤが配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項４９に記載の組換え酵母。
【請求項41】
前記第１の部分が配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項４０に記載の組換え酵母。
【請求項42】
前記Ｓタンパク質が、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３９に記載の組換え酵母。
【請求項43】
前記Ｓタンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の組換え酵母。
【請求項44】
前記Ｓタンパク質が配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の組換え酵母。
【請求項45】
前記第１の部分が、配列番号５のヌクレオチド配列を有する、請求項４２に記載の組換え酵母。
【請求項46】
前記第１の部分が、配列番号６のヌクレオチド配列を有する、請求項４２に記載の組換え酵母。
【請求項47】
同時刺激性分子又は免疫刺激性サイトカインをコードする第３の部分をさらに含む、請求項３５～４６のいずれか１項に記載の組換え酵母。
【請求項48】
前記酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項３５～４７のいずれか１項に記載の組換え酵母。
【請求項49】
前記酵母が溶解酵母である、請求項４８に記載の組換え酵母。
【請求項50】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の組換え核酸を含むワクチン組成物。
【請求項51】
前記組換え核酸が、脂質ナノ粒子中にカプセル化される、請求項５０に記載のワクチン組成物。
【請求項52】
請求項１９～３３のいずれか１項に記載の組換え複製欠損アデノウイルスと混合されたアラゴナイト粒子を含むワクチン組成物であって、前記組換え複製欠損アデノウイルスが凍結乾燥される、ワクチン組成物。
【請求項53】
前記アラゴナイト粒子が、１００ｎｍ～１ｍｍの平均粒径を有する、請求項５２に記載のワクチン組成物。
【請求項54】
ＳＡＲＳウイルスに対するワクチンの生成に使用するための、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項55】
ＳＡＲＳウイルスに対する免疫の誘導に使用するための、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項56】
ＳＡＲＳウイルスに対する免疫の誘導に使用するための、請求項１９～３３のいずれか１項に記載の組換え複製欠損アデノウイルス。
【請求項57】
ＳＡＲＳウイルスに対する免疫の誘導に使用するための、請求項３４～４９のいずれか１項に記載の組換え酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、本発明者らの同時継続中の２０２０年３月１１日出願の米国仮特許出願第６２／９８８，３２８号、２０２０年４月１４に出願の第６３／００９，９６０号、２０２０年４月１４日出願の第６３／０１０，０１０号、２０２０年８月１日出願の第６３／０５９，９７５、２０２０年８月１１日出願の第６３／０６４，１５７号、２０２０年１１月２４日出願の第６３／１１７，４６０号、２０２０年１１月２４日出願の第６３／１１７，８４７号、２０２０年１１月２４日出願の第６３／１１７，９２２号、２０２０年１１月２６日出願の第６３／１１８，６９７号、２０２１年１月８日出願の第６３／１３５，３８０号、及び２０２０年５月２６日出願の米国仮特許出願第１６／８８３，２６３号、及び本明細書と同時に出願され、参照番号１０２５３８．００８０ＵＳ３を有する米国非仮特許出願、表題「Ａｎｔｉ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に対する優先権を主張し、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
１７２ＫＢのサイズを有する１０２６９０－００４１ＰＣＴ＿ＲＥＶ００３＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名された配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、２０２１年３月４日に作成され、本願と共にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、その全体が参照により組み込まれる。
１７２ＫＢのサイズを有する１０２６９０－００４１ＰＣＴ＿ＲＥＶ００３＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名された配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、２０２１年３月４日に作成され、本願と共にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、その全体が参照により組み込まれる。
【0003】
本開示の分野は、コロナウイルスに対する免疫を生成するためのワクチン組成物及び方法であり、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連する。
【背景技術】
【0004】
背景技術の説明は、本開示を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれも、先行技術であるか、又は現在特許請求されている発明に関連すること、又は具体的に若しくは暗示的に参照されるいずれの刊行物も、先行技術であることを認めるものではない。
【0005】
本明細書における全ての刊行物及び特許出願は、個々の各刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個々に示されているのと同程度に、参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義又は使用が、本明細書で提供されるその用語の定義と一致しないか又は反対である場合、本明細書で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。
【0006】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２診断試験は比較的短時間で利用可能となったが、疾患を治療するための多数の試みはこれまで、矛盾した又は決定的でない結果を示している。最も典型的には、重症症状を有する患者は、呼吸／血液酸素化を維持するために治療される。ＣＯＶＩＤ１９死亡率は、特に高齢者、免疫不全者、及び心疾患、肺疾患、又は糖尿病を有する個人において顕著である。急性期のケアの改善にもかかわらず、社会的距離及び他の公衆衛生緩和措置が中程度の緩和しか提供できないため、疾患の封じ込めが極めて重要であることが明らかになっている。
【0007】
そのために、多数の候補抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン組成物がウイルスの１つ以上のタンパク質を標的とする（例えば、ＦＩＭＭＵ ２０２０、１１：６０２２５６を参照されたい）。例えば、Ｓｉｎｏｖａｃ及びＳｉｎｏｐｈａｒｍは、現在、不活化ウイルスワクチン調製物を試験している。Ｃａｎｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、及びＧａｒｎａｌｅｙａは、１つ以上のウイルスタンパク質をコードする非複製アデノウイルスベクターに基づくワクチンを開発した。Ｎｏｖａｍａｘは、タンパク質サブユニットベースのワクチンを生産した。より最近では、Ｍｏｄｅｒｎａ及びＰｆｉｚｅｒからのＲＮＡベースのワクチンがいくつかの管轄区域において承認されている。これらのワクチンのほとんどは、疾患をもたらす感染に対して少なくともいくらかの（典型的には非無菌の）免疫を誘導するが、防御が数ヶ月にわたって有効であるかどうか、及び／又は十分な免疫記憶が長期間にわたって接種された個体を保護するかどうかは不明である。さらに、そのようなワクチンが臨床的に意味のあるＴ細胞ベースの応答を生じるかどうかは不明である。
【0008】
特定のワクチンが使用可能になったが、迅速且つ世界的な規模でのワクチンの流通及び投与は、かなりの困難に直面し、世界的な流通を遅らせている。さらに、ロジスティック要件及び医療専門家の必要性は、特定のワクチン接種基盤への管理を制限する。
【0009】
このような困難を克服するために、ワクチンの固体剤形が望まれる。しかしながら、そのような剤形（例えば、散剤、錠剤、カプセル剤）は、生理学的に関連する位置での活性成分の崩壊及び放出を必要とする。活性成分を負荷した剤形は、製造時から投与までの輸送及び保存中に安定でなければならない。ワクチンの粘膜又は経口送達は、そのような投与が粘膜又は腸感染に対する免疫に重要であるＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＭクラス抗体の生成を補助するので、非常に望ましいであろう。残念ながら、そのようなワクチンは入手できない。
【0010】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導するための様々なワクチン組成物及び方法が当技術分野において公知であるが、全てがいくつかの欠点に悩まされている。したがって、改善されたワクチン組成物及び方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0011】
様々なワクチン組成物及びそのための方法が本明細書に開示され、ここでコロナウイルスの組換え修飾ヌクレオカプシドタンパク質及び／又は修飾スパイクタンパク質が対象におけるコロナウイルスに対する免疫を誘導する。最も好ましくは、組換えタンパク質は、組換えウイルスの一部として、及び／又は組換え酵母若しくは酵母溶解物の一部として、脂質製剤中で送達することができる組換え核酸にコードされる。
【0012】
エンドソーム標的配列に融合した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）（Ｎ－ＥＴＳＤ）をコードする第１の部分であって、Ｎ－ＥＴＳＤ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに機能的に結合されている、第１の部分と、ＳＡＲＳウイルススパイクタンパク質（Ｓ）をコードする第２の部分であって、Ｓ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに各々機能的に結合されている、第２の部分とを含む組換え核酸も本明細書に開示される。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、及び／又はＮ－ＥＴＳＤのエンドソーム標的配列は、第１の部分の５’末端及び／又は３’末端にコードされている。さらなる実施形態では、第２の部分は、表面発現に最適化されたＳをコードする。第１及び第２の部分は、バイシストロン性配列に配列され得る。例えば、Ｎ－ＥＴＳＤは、アミノ酸配列配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。第１の部分は、特定の実施形態では、ヌクレオチド配列配列番号２を有し得る。別の例では、Ｓタンパク質又はＳ－融合タンパク質は、アミノ酸配列配列番号３（例えば、配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性、又は配列番号４（例えば、配列番号４）に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。第２の部分は、特定の実施形態では、ヌクレオチド配列配列番号５又は配列番号６を有し得る。
【0014】
尚さらなる実施形態では、組換え核酸はさらに、同時刺激性分子又は免疫刺激性サイトカインをコードする第３の部分を含むことができる。組換え核酸はまた、ウイルス又は酵母発現ベクター（例えば、Ｅ１遺伝子領域欠失及びＥ２ｂ遺伝子領域欠失を有するアデノウイルス発現ベクター、及び／又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵母発現ベクター）に組み込まれ得る。最も典型的には、必ずしもそうではないが、核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【0015】
Ｅ１遺伝子欠失、Ｅ２ｂ遺伝子欠失、及びＳＡＲＳコロナウイルスＮ－ＥＴＳＤをコードする第１の部分を含む組換え核酸を含む組換え複製欠損アデノウイルスが本明細書に記載される。第１の部分は、Ｎ－ＥＴＳＤ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに機能的に結合される。アデノウイルスはまた、ＳＡＲＳ Ｓタンパク質をコードする第２の部分を含む。第２の部分は、各々、Ｓ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに機能的に結合される。
【0016】
さらなる実施形態では、アデノウイルスはさらに、同時刺激性分子若しくは免疫刺激性サイトカインをコードする第３の部分を含むことができ、及び／又は組換えアデノウイルスは、Ｅ３及び／若しくはＥ４遺伝子領域欠失を有することができる。
【0017】
代替的又は追加的に、ＳＡＲＳコロナウイルスＮ－ＥＴＳＤをコードする第１の部分（第１の部分は、Ｎ－ＥＴＳＤ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに機能的に結合する）と、ＳＡＲＳ Ｓタンパク質をコードする第２の部分（第２の部分は、各々、Ｓ発現を可能にする１つ以上の調節エレメントに機能的に結合する）とを含む組換え核酸を含む組換え酵母が本明細書に開示される。酵母は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得る。特定の実施形態では、酵母は溶解され得る。
【0018】
またさらなる実施形態では、本明細書に提示した組換え核酸を含むワクチン組成物が本明細書に開示され、組換え核酸は、脂質ナノ粒子中にカプセル化され得る。
【0019】
さらに他の実施形態では、本明細書に提示した組換え複製欠損アデノウイルスと混合されたアラゴナイト粒子を含むワクチン組成物が本明細書に開示され、組換え複製欠損アデノウイルスは、凍結乾燥される。最も典型的には、アラゴナイト粒子は、１００ｎｍ～１ｍｍの平均粒径を有する。
【0020】
ＳＡＲＳウイルスに対するワクチンを生成するための、及び／又はＳＡＲＳウイルスに対する免疫を誘導するための組換え核酸が本明細書に提示される。同様に、ＳＡＲＳウイルスに対する免疫を誘導するための組換え複製欠損アデノウイルス又は組換え酵母が本明細書に開示される。
【0021】
本明細書に開示される主題の様々な目的、特徴、態様及び利点は、同様の番号が同様の構成要素を表す添付の図面と共に、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図2】図２は、０．１Ｍ塩酸（ＨＣＬ）中の非被覆アラゴナイトカプセル（サンプル＃６）中の二価ヒトアデノウイルス血清型５ ＣＯＶＩＤ－スパイク及びヌクレオカプシド抗原ワクチン（ｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎ）の３つの写真（右から左：１、２、３）を示し、示されるように、カプセル中で観察されたしわ、膨潤、又は穴を有する：１）：ＨＣＬ酸曝露の２分後；２）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後；及び３）ＨＣＬ酸曝露の２時間後、及び乾燥。
【図3】図３は、０．１Ｍ ＨＣＬ中の非被覆アラゴナイトカプセル（サンプル＃７又は＃８）中のｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎの３つの写真（右から左：１、２、３）を示し、示されるように、カプセル中で観察された膨潤、ねじれ、又は穴を有する：１）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃７；２）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃８；３）ＨＣＬ酸曝露の２時間後、及び乾燥。
【図4】図４は、０．１Ｍ ＨＣＬ中の非被覆ラクトースカプセル（サンプル＃３又は＃４）中のｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎの２つの写真（右から左：１、２）を示し、示されるように、観察されたカプセルの膨潤を有する：１）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃３；２）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃４。
【図5】図５は、０．１Ｍ ＨＣＬ中の被覆アラゴナイトカプセル（サンプル＃１又は＃５）中のｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎの２つの写真（右から左：１、２）を示し、示されるように、観察されたカプセルの膨潤を有する：１）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃１；２）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃５。
【図15】図１５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性を阻害する血清を示す。パネルＡは、インビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性を阻害するワクチン接種した１群アカゲザル由来の血清を示す。パネルＢは、ワクチン接種した２群アカゲザル由来の血清を示す。点線は、２０％阻害を示す。
【図16】図１６は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）鼻咽頭ウイルス負荷を経時的に示す。パネルＡは、ＳＣ＋ＳＣ＋経口ワクチン接種後のアカゲザルからの鼻腔スワブ中のウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示す。パネルＢは、ＳＣ＋経口＋経口ワクチン接種後の鼻腔スワブ中のウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示す。
【図17】図１７は、肺におけるＮＨＰ中の経時的なウイルス負荷を示す。パネルＡは、ＳＣ＋ＳＣ＋経口ワクチン接種後の群１アカゲザル由来のＢＡＬにおけるウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示し、パネルＢは、ＳＣ＋経口＋経口ワクチン接種後の群１アカゲザル由来のＢＡＬにおけるウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示す。
【図21】図２１は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種ＮＨＰ由来の血清の液性応答及び中和能力についての例示的な結果を示す。抗スパイクＩｇＧレベル（ＥＬＩＳＡ；ＯＤ ４５０ｎｍ）は、（Ｂ）幾何平均及び（Ｃ）代用アッセイにおける阻害と共に、（Ａ）個別ＳＣ経口－経口ＮＨＰについて示される。これらのデータは、ＳＣ－ＳＣ－抗ＮＨＰについても示されている：（Ｄ）個々の抗Ｓ ＩｇＧ、（Ｅ）幾何平均、及び（Ｆ）代理アッセイにおける阻害。１：３０の血清希釈での２０％を超える阻害（破線）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の中和と相関する。ＮＨＰは、０日目、１４日目、及び２８日目にワクチン接種を受けた（黒矢印）。
【図22】図２２は、チャレンジ後のＳＣ－経口－経口及びＳＣ－ＳＣ－経口ワクチン接種ＮＨＰの鼻腔及び肺におけるウイルス負荷（ｇＲＮＡ）を示す。鼻腔スワブサンプルの（Ａ）個々のウイルスｇＲＮＡ（ＲＴ ｑＰＣＲ）及び（Ｂ）幾何平均；並びにＳＣ－経口－経口 ＮＨＰからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）サンプルの（Ｃ）ｇＲＮＡ及び（Ｄ）幾何平均。鼻腔スワブサンプルの（Ｅ）個々のｇＲＮＡ及び（Ｆ）幾何平均；並びにＳＣ－ＳＣ－経口ＮＨＰからのＢＡＬサンプルの（Ｇ）ｇＲＮＡ及び（Ｈ）幾何平均。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジは、５６日目に行った（黒矢印）。検出レベル（ＬＯＤ；破線）は、ｇＲＮＡについては５４遺伝子コピー／ｍＬ（ＧＣ／ｍＬ）であり、ｓｇＲＮＡについては１１９ＧＣ／ｍＬであった。ＬＯＤ未満の値については、ＬＯＤ値の半分（又はｇＲＮＡについては２７ＧＣ／ｍＬ及びｓｇＲＮＡについては５９ＧＣ／ｍＬ）を、個々の値のグラフ化及び幾何平均の計算に使用した。
【図23】図２３は、チャレンジ後のＳＣ－経口－経口及びＳＣ－ＳＣ－経口ワクチン接種ＮＨＰの鼻腔及び肺におけるウイルス複製（ｓｇＲＮＡ）を示す。鼻腔スワブサンプルの（Ａ）個々のウイルスｓｇＲＮＡ（ＲＴ ｑＰＣＲ）及び（Ｂ）幾何平均；並びにＳＣ－経口－経口ＮＨＰからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）サンプルの（Ｃ）ｓｇＲＮＡ及び（Ｄ）幾何平均。鼻腔スワブサンプルの（Ｅ）個々のｓｇＲＮＡ及び（Ｆ）幾何平均；並びにＳＣ－ＳＣ－経口ＮＨＰからのＢＡＬサンプルの（Ｇ）ｓｇＲＮＡ及び（Ｈ）幾何平均。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジは、５６日目に行った（黒矢印）。ＬＯＤ（破線）は、ｇＲＮＡについては５４ＧＣ／ｍＬであり、ｓｇＲＮＡについては１１９ＧＣ／ｍＬであった。ＬＯＤ未満の値については、ＬＯＤ値の半分を、個々の値のグラフ化及び幾何平均の計算に使用した。
【図24】図２４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後の血清のワクチン接種に対するＴ細胞応答及び中和能力を示す。（Ａ）ＥＬＩＳｐｏｔによって決定される、スパイク（Ｓ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）ペプチドに応答したＳＣ－経口－経口ワクチン接種ＮＨＰからのＰＢＭＣ由来Ｔ細胞による（Ａ）インターフェロンｇ（ＩＦＮ－γ）及び（Ｂ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）分泌、並びに（Ｃ）比ＩＦＮ－γ／ＩＬ－４比を示す。検出不能なＩＬ－４による「無限大」の比は、白丸として表される。ＰＭＡ－イオノマイシンをパルスした細胞を陽性対照として使用した。平均及びＳＥＭでグラフ化したデータ。（Ｄ）試験期間を通してＭＮ５０（ベロＥ６細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が５０％阻害される希釈係数）が示されており、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて、７０日目にワクチン接種及びプラセボＮＨＰのＭＮ５０を比較した。５７、６３、及び７０日目の鼻腔のｇＲＮＡ（Ｅ）及びｓｇＲＮＡ（Ｆ）、並びに５７及び６３日目の肺ｇＲＮＡ（Ｇ）及びｓｇＲＮＡを提示する。Ｔ細胞応答（Ｉ～Ｊ）、ＭＮ５０（Ｌ）、鼻腔ｇＲＮＡ（Ｍ）及びｓｇＲＮＡ（Ｎ）、並びに肺ｇＲＮＡ（Ｏ）及びｓｇＲＮＡ（Ｐ）を含む、ＳＣ－ＳＣ－経口ＮＨＰについての同じデータを示す。ｇＲＮＡの検出レベルは５４ＧＣ／ｍＬであり、ｓｇＲＮＡの検出レベルは１１９ＧＣ／ｍＬであった。ＬＯＤの半分を、ＬＯＤ未満のデータのグラフ化に使用した。
【図25】図２５は、ｈＡｄ５プラットフォーム及びｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトを概略的に示す。パネルＡは、Ｅ１、Ｅ２ｂ、及びＥ３領域が欠失した（＊）ヒトアデノウイルス血清型５ワクチンプラットフォームを示す。ワクチンコンストラクトをＥ１領域に挿入する（矢印）。パネルＢは、二重抗原ワクチンが、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォームによって供給される、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下のＳ－融合物及びＮ－ＥＴＳＤの両方、並びにＣ末端ＳＶ４０ポリＡ配列を含むことを示す。
【図33】図３３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、スパイク、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクター及びワクチン候補コンストラクトを示す。（ａ）三量体Ｓタンパク質はウイルス表面に表示され、Ｎタンパク質はウイルスＲＮＡと会合している。（ｂ）ＲＢＤはＳ１領域内にあり、続いて、他の機能領域、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及びＣ末端（ＣＴ）があり、これは、ウイルス内にある。（ｃ）使用される第２世代ヒトアデノウイルス血清型５（ｈＡｄ５）ベクターは、Ｅ１、Ｅ２ｂ、及びＥ３領域が欠失している。（ｄ）Ｓ野生型（Ｓ－ＷＴ）、（ｅ）増強Ｔ細胞刺激ドメインを有するＳ－ＲＢＤ（Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ）、（ｆ）Ｓ－融合物、（ｇ）Ｎ－ＥＴＳＤ、及び（ｈ）二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ；ＬＰ－リーダーペプチドについてのコンストラクトを示す。
【図34】図３４は、増強されたＲＢＤ表面発現をもたらす、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ ＥＴＳＤによるＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクションを示す。コンストラクト－トランスフェクト細胞を用いた抗ＲＢＤ抗体のフローサイトメトリー分析は、Ｓ－ＷＴ又は（ｂ）Ｓ－ＷＴ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤトランスフェクト細胞のいずれにおいても、検出可能なＲＢＤ表面発現がないことを明らかにする。表面ＲＢＤ発現は、Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ及びＳ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ（ｃ、ｄ）で高かった。発現は、（ｅ）Ｓ－融合物トランスフェクト細胞において低かった。ＲＢＤの細胞表面発現は、（ｆ）Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤトランスフェクト細胞において、特に１日目及び２日目に高かった。（ｇ）Ｎ－ＥＴＳＤ陰性対照では発現が検出されなかった。Ｙ軸スケールは、モードに正規化されている（ＮＭ）。
【図35】図３５は、Ｓ発現の免疫ブロット分析を示す。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における（ａ）ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ－融合物、及び（ｃ）Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤを用いた細胞表面ＲＢＤ発現は、（ｄ）抗全長（Ｓ２）抗体を用いてプローブされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞溶解物の免疫ブロットにおけるＳの発現と高い相関を示した。Ｙ軸スケールは、モードに正規化されている（ＮＭ）。
【図36】図３６は、トランスフェクション後の組換えＡＣＥ２－Ｆｃ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞表面ＲＢＤの結合が、ナイーブタンパク質フォールディングを確認することを示す。組換えＡＣＥ２－Ｆｃ間の結合（これにより、スパイクＲＢＤがインビボで相互作用して感染を開始する）、及び（ａ）ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、（ｂ）ｈＡｄ５ Ｓ－融合物、（ｃ）ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、（ｄ）ｈＡｄ５ Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ、又は（ｅ）ｈＡｄ５ Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ ＥＴＳＤコンストラクトによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後に発現した細胞表面抗原のフローサイトメトリー分析は、２価Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤによるトランスフェクション後に、ＡＣＥ－Ｆｃ及び抗ＲＢＤ特異的抗原（ｆ－ｊ）の両方で最高の結合が見られることを明らかにしている。両方のＳ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ含有コンストラクトも結合を示した。Ｙ軸スケールは、モードに正規化されている（ＮＭ）。
【図37】図３７は、ｈＡｄ５ Ｎ－ＥＴＳＤから発現されるＮがエンドソーム／リソソームコンパートメントに局在化することを示す。Ｎ－ＥＴＳＤに感染したＨｅＬａ細胞において、（ａ）Ｎ（赤）は、（ｃ）の矢印によって示されるようにエンドソームマーカーＣＤ７１（ｂ）と共局在化する。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞において、（ｄ）Ｎ－ＥＴＳＤはまた、リソソームマーカーＬａｍｐ１と共局在化するが、（ｅ）Ｎ野生型（Ｎ－ＷＴ）はそうではなく、代わりに、拡散した細胞質分布を示す。
【図38】図３８は、ペプチドプールに応答した、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ接種２８日目ＣＤ－１マウスからのサイトカイン発現脾細胞のＩＣＳ検出を示す。（ａ）最も高いＣＤ８β＋脾細胞ＩＦＮ－γ応答は、Ｓペプチドプール１（Ｓ－ｐｅｐプール１）に曝露されたｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ接種マウス脾細胞においてであった；これらのマウス由来の脾細胞はまた、Ｎペプチドプール（Ｎ－ｐｅｐプール）に応答してＩＦＮ－γを発現した。（ｂ）ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ接種マウス由来のＣＤ４＋脾細胞は、Ｎペプチドプールに応答してＩＦＮ－γのみを発現した。（ｃ）ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ接種マウス由来のＣＤ８β＋脾細胞のＩＦＮ－γ ＴＮＦ－α応答は、（ａ）のものと非常に類似していた；（ｂ）に対する（ｄ）Ｎペプチドプールに対するＣＤ４＋脾細胞も同様であった。Ｎ＝１群当たり５匹のマウス。全てのデータセットを平均としてＳＥＭと共にグラフ化し、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて全ての統計を行った。＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、及び＊＊＊＊＜０．０００１。
【図39】図３９は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種マウス由来の血清における抗スパイク及び抗ヌクレオカプシド抗体応答を示す。吸光度に基づいて、（ａ）抗Ｓ抗体及び（ｃ）抗ヌクレオカプシド抗体の両方の有意な産生があった。（ｂ、ｄ）ｎｇ当量を示す。血清は、抗スパイクについては１：３０に、抗ヌクレオカプシド抗体については１：９０に希釈した。データを平均及びＳＥＭとしてグラフ化した。統計分析は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った。＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、及び＊＊＊＊＜０．０００１。
【図40】図４０は、ｃＰａｓｓ及びベロＥ６細胞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が抗体による中和を確認することを示す。（ａ）ｃＰａｓｓアッセイにおいて、ＡＣＥ２とのＳ ＲＢＤ相互作用の阻害は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種マウスからの血清の１：２０及び１：６０希釈の両方で有意であった。（ｂ）ＥＬＩＳＡによってＳ特異的抗体を示したマウスについてのベロＥ６細胞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染の結果もまた、マウスについて高い中和を示し、ＣＯＶＩＤ－１９回復期血清と比較しても、プールされた血清（Ｇ４プール、青線）について非常に高い中和を示した。Ｇ４プール－Ｓ特異的抗体を有するマウス；Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４－マウスＩＤ；＋Ｃ－回復期血清；及び培地－培地のみの陰性対照。
【図41】図４１は、抗スパイク抗体及び抗ヌクレオカプシド抗体のアイソタイプを示す。パネルＡ及びＣは、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂアイソタイプ抗スパイク及び抗ヌクレオカプシド抗体が、ｈＡｄ５ヌルマウスと比較してｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤマウスについて有意に増加したことを示す。パネルＢ及びＤは、抗体アイソタイプについてのｎｇ当量を示す。データを平均及びＳＥＭとしてグラフ化した。統計分析は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った。＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、及び＊＊＊＊＜０．０００１。
【図42】図４２は、分泌されたサイトカインのＥＬＩＳｐｏｔを示す。（ａ）ｈＡｄ５ Ｓ－融合物＋ Ｎ－ＥＴＳＤ脾細胞によるＩＦＮ－γ分泌は、Ｓペプチドプール１及びＮペプチドプールの両方に応答してｈＡｄ５ヌルよりも有意に高かったが、（ｂ）ＩＬ－４は、Ｎペプチドプールに応答してｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤでのみ分泌された（ｈＡｄ５ヌルにおける１つの高い外れ値が除去された）。Ｎ＝１群当たり５匹のマウス。全てのデータセットを平均としてＳＥＭと共にグラフ化し、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて全ての統計を行った。＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１。
【図43】図４３は、Ｔ細胞及び液性応答の比がＴｈ１優勢を明らかにすることを示す。（ａ）全Ｔｈ１（ＩＦＮ－γ）対Ｔｈ２（ＩＬ－４）スポット形成単位の比を、組み合わされたＳプール及びＮプールに対する応答について示す。（ｂ）Ｓ及びＮに対する抗体のＴｈ１／Ｔｈ２比を示す。（ａ）及び（ｂ）の両方について、破線は、１の比、又はＴｈ１及びＴｈ２のバランス（優勢なし）を示す。
【図44】図４４は、ｈＡｄ５ベクター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、スパイク、及びコンストラクトを概略的に示す。（Ａ）Ｅ１、Ｅ２ｂ、及びＥ３領域が欠失したヒトアデノウイルス血清型５（ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］）を示す。（Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、ウイルス表面上に三量体としてスパイク（Ｓ）タンパク質を表示する。Ｓタンパク質は、Ｎ末端（ＮＴ）、ＲＢＤを含むＳ１領域、Ｓ２及びＴＭ領域、並びにＣ末端（ＣＴ）；標識されていない他の機能領域を含む。（Ｃ）スパイク野生型（ＳＷＴ）、（Ｄ）スパイク融合物（Ｓ－融合物）、（Ｅ）ＥＴＳＤを有さず、主に細胞質局在化を有するヌクレオカプシド（Ｎ）；（Ｆ）増強Ｔ細胞刺激ドメインを有するＮ（Ｎ－ＥＴＳＤ）、並びに（Ｇ）二価Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトが示される。
【図45】図４５は、Ｎ－ＥＴＳＤがエンドソーム、リソソーム、及びオートファゴソームに局在化することを立証する顕微鏡写真を示す。ＭｏＤＣをＡｄ５ Ｎ－ＥＴＳＤ又はＥＴＳＤを含まないＮに感染させ、抗フラグ（Ｎ、Ｎ－ＥＴＳＤは、ここではフラグタグを有する）及び抗ＣＤ７１（エンドソームマーカー）、抗Ｌａｍｐ１（リソソームマーカー）、又は抗ＬＣ３ａ／ｂ抗体で共標識した。（Ａ）Ｎ－ＥＴＳＤ、（Ｂ）ＣＤ７１、及び（Ｃ）オーバーレイ。（Ｄ）Ｎ、（Ｅ）ＣＤ７１及び（Ｆ）オーバーレイ。（Ｇ）ＮＥＴＳＤ、（Ｈ）Ｌａｍｐ－１、及び（Ｉ）オーバーレイ。（Ｊ）Ｎ、（Ｋ）Ｌａｍｐ－１及び（Ｌ）オーバーレイ。（Ｍ）Ｎ－ＥＴＳＤ、（Ｎ）ＬＣ３ａ／ｂ、及び（Ｏ）オーバーレイ。Ｎ／Ｎ－ＥＴＳＤは赤色であり、他のマーカーは緑色であり、共局在化は黄色の矢印で示され、白色の矢印はリンパ球を示す。
【図46】図４６は、患者血漿抗体が、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ感染後にＭｏＤＣによって発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を認識することを実証する。（Ａ）２人の正常な個体由来のＭｏＤＣをｈＡｄ５ワクチンに一晩感染させ、次いで、単一の個体由来の以前に感染した患者血漿に曝露した；ＤＣ細胞表面への抗体結合を、フローサイトメトリーによって検出した。ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ－融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、及びヌルのフローヒストグラムは、２つの供給源（Ｂ）ＭｏＤＣ１及び（Ｃ）ＭｏＤＣ２からのＭｏＤＣについて示される。（Ｄ）ＤＭＦＩ（非感染細胞及び感染細胞への結合についてのＭＦＩの差異）を、ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ－融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ及びヌル感染ＭｏＤＣについてグラフ化する。
【図47】図４７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドでパルスしたＭｏＤＣに対するＴ細胞応答（以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染した患者及びウイルスナイーブＴ細胞の）の例示的な結果を示す。以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染した患者（Ｐｔ）の４人全てのＴ細胞は、「なし」と比較して、Ｓ１、Ｓ２、及びＮペプチドプールパルスＭｏＤＣに対して有意なＩＦＮ－γ応答を示す。ウイルスナイーブ（未曝露、ＵｎＥｘ）対照個体由来のＴ細胞は、はるかに低い応答を示した。統計分析は、各患者からのサンプルについて、一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの事後分析を用いて行い、「なし」のみと比較した（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。平均及びＳＥＭとしてグラフ化した；ｎ＝３～４。
【図48】図４８は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者由来のペプチドパルスＭｏＤＣがＩＦＮ－γを分泌するように自己患者Ｔ細胞を刺激することを立証する。（Ａ）以前に感染したＳＡＲＳＣｏＶ－２患者Ｐｔ４及びＰｔ３に由来するＭｏＤＣを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド混合物（Ｓ１、Ｓ２又はＮ）で一晩パルスし、次いで、自己ＣＤ４＋（Ａ、Ｂ）又はＣＤ８＋（Ｃ、Ｄ）Ｔ細胞と共にインキュベートした。ＩＦＮ－γレベルをＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの事後多重比較分析を用いて行って、各ペプチドプールをＶｅｈ（バーの上方に示す）と比較し、又はペプチドプール（線の上方）間で比較した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊ｐ＜０．００００１）。データは、平均及びＳＥＭとしてグラフ化した：ｎ＝３。
【図49】図４９は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染した患者からのＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌がＮと比較してＮ－ＥＴＳＤのＭｏＤＣ発現に応答してより大きいことを実証する。（Ａ）実験デザイン。（Ｂ～Ｄ）ｈＡｄ５－Ｎ－ＥＴＳＤ－及びｈＡｄ５ Ｎ発現ＭｏＤＣに応答した自己ＣＤ３＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を示す。（Ｅ～Ｇ）感染ＭｏＤＣに応答したＣＤ３＋細胞によるＩＬ－４の分泌は、各々について、ＩＦＮ－γと同じスケールで示される。ヌルと比較したｈＡｄ５－Ｎ－ＥＴＳＤに応答した（Ｈ～Ｊ）ＣＤ４＋及び（ＫＭ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を示す。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの事後多重比較分析を用いて行った（＊ｐ＜＝０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ヌルとの比較をバーの上方に示し、Ｎ－ＥＴＳＤ及びＮ間の比較を線の上方に示した。データは、平均及びＳＥＭとしてグラフ化した；ｎ＝３～４。
【図50】図５０は、二価ワクチン及びその個々の成分に対する、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染した患者のＴ細胞応答が、Ｔ細胞集団の異なる抗原特異性を明らかにすることを示す。（Ａ～Ｃ）３人の患者についてのＣＤ３＋ Ｔ細胞ＩＦＮ－γ応答。（Ｄ～Ｆ）ＣＤ３＋ Ｔ細胞ＩＬ－４応答。（Ｇ～Ｉ）ＣＤ４＋ ＩＦＮ－γ応答。（Ｊ～Ｌ）ＣＤ８＋ ＩＦＮ－γ応答。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙの事後多重比較分析を用いて行って、各抗原含有コンストラクトをヌルコンストラクトと比較した（＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊＊ｐ＜０．００００１）。ヌルとの比較はバーの上方のみ；抗原発現ワクチン間の比較は線の上方。データは、平均及びＳＥＭとしてグラフ化した：ｎ＝３～４。
【発明を実施するための形態】
【0023】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの密接に関連したウイルス及び突然変異体形態に対する免疫を誘導する様々なワクチン組成物及び方法は、治療的に有効な抗体の生成を促進するだけでなく、頑強なＴ細胞応答を誘発する。これらのワクチン組成物は、筋内、皮下、経口、及び粘膜経路（単独又は組み合わせで）を含む異なる経路を介して投与することができ、現在既知であるＲＮＡベースのワクチンの後に経口ブーストとしても使用され得る。
【0024】
特に企図される実施形態では、組換えコンストラクトは、修飾ヌクレオカプシドタンパク質及び／又は修飾スパイクタンパク質を含む。好ましくは、修飾ヌクレオカプシドタンパク質は、修飾ヌクレオカプシドタンパク質をエンドソーム／リソソーム細胞内コンパートメントに送る輸送配列を含み、それにより重要な抗原提示経路を利用してＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激し、これは次に樹状細胞にナイーブＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる。同様に、修飾スパイクタンパク質は、修飾スパイクタンパク質の表面発現を増強する修飾を有し、それによりスパイク抗原に対して免疫応答をより頑強にすることが好ましい。実際に、本明細書に開示されるワクチン（例えば、ｈＡｄ５［Ｅ１－，Ｅ２ｂ－］ワクチン）は、ＥＴＳＤペプチドでタグ付けされたＮ抗原の使用を例示するが、原則として任意の抗原がエンドソーム／リソソーム細胞内コンパートメントに有利に再指向され得る。アデノウイルス又は酵母ワクチンベクターにおいてこのように使用するためのＥＴＳＤでタグ付けされる例示的な抗原は、ＣＥＡ、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、葉酸受容体α、ＷＴ１、ｐ５３、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ－６、ＤＡＭ－１０、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７Ｂ、ＮＡ８８－Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ－１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＡＲＴ－４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＢＲＣＡ１、ブラキュリ、ブラキュリ（ＴＩＶＳ７－２、多型）、ブラキュリ（ＩＶＳ７ Ｔ／Ｃ 多型）、Ｔ ブラキュリ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１（ＶＮＴＲ 多型）、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ＡＦＰ、β－カテニン／ｍ、カスパーゼ－８／ｍ、ＣＤＫ－４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、７０７－ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ－ａｂｌ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、及びＴＥＬ／ＡＭＬ１を含む。
【0025】
「Ｎ－ＥＴＳＤ」は、エンドソーム標的配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの修飾ヌクレオカプシドタンパク質を指す。例示的なＮ－ＥＴＳＤは、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のヌクレオチド酸配列を有する。
【0026】
「Ｓ－ＨＡ」又は「スパイク」又は「Ｓ」は、ＨＡタグを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質を指す。例示的なＳ－ＨＡは、配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号５のヌクレオチド配列を有する。
【0027】
「Ｓ－融合物」又は「スパイク－融合物」は、表面発現の増大を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの修飾スパイクタンパク質を指す。例示的なＳ－融合物は、配列番号４のアミノ酸配列及び配列番号６のヌクレオチド酸配列を有する。
【0028】
「Ｎ」又は「Ｎ－ｗｔ」又は「ヌクレオカプシド」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質を指す。例示的なＮタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を有する。
【0029】
「ＥＴＳＤ」は、エンドソーム標的配列を指す。例示的なＥＴＳＤは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。
【0030】
「ＡＣＥ２」は、アンジオテンシン変換酵素２を指す。例示的な（ヒト）ＡＣＥ２は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。
【0031】
「可溶性ＡＣＥ２タンパク質」は、生理学的条件下で可溶性のＡＣＥの突然変異体及び切断形態を指す。例示的な可溶性ＡＣＥは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【0032】
修飾スパイク及びヌクレオカプシドコンストラクト並びに方法
組換えウイルス及び酵母が本明細書に開示される。本明細書に開示されるウイルス及び酵母は、多様な目的、例えばコロナウイルス疾患の治療及び／又は予防に有用であり得る。一態様では、複製欠損アデノウイルスが本明細書に開示され、ここでアデノウイルスは、Ｅ１遺伝子領域欠失；Ｅ２ｂ遺伝子領域欠失；Ｅ３遺伝子領域欠失、コロナウイルス２（ＣｏＶ２）ヌクレオカプシドタンパク質、エンドソーム標的配列に融合されたＣｏＶ２ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ－ＥＴＳＤ）をコードする核酸、及び細胞表面発現のために最適化されたＣｏＶ２スパイクタンパク質配列をコードする核酸（Ｓ－融合物）を含む。
組換えウイルス及び酵母が本明細書に開示される。本明細書に開示されるウイルス及び酵母は、多様な目的、例えばコロナウイルス疾患の治療及び／又は予防に有用であり得る。一態様では、複製欠損アデノウイルスが本明細書に開示され、ここでアデノウイルスは、Ｅ１遺伝子領域欠失；Ｅ２ｂ遺伝子領域欠失；Ｅ３遺伝子領域欠失、コロナウイルス２（ＣｏＶ２）ヌクレオカプシドタンパク質、エンドソーム標的配列に融合されたＣｏＶ２ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ－ＥＴＳＤ）をコードする核酸、及び細胞表面発現のために最適化されたＣｏＶ２スパイクタンパク質配列をコードする核酸（Ｓ－融合物）を含む。
【0033】
一実施形態では、Ｎ－ＥＴＳＤポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むことができる。他の実施形態では、同一性値は少なくとも８５％である。さらに他の実施形態では、同一性値は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、同一性値は１００％である。Ｎ－ＥＴＳＤ融合タンパク質がＮ－ＥＴＳＤドメインとヌクレオカプシドタンパク質との間にリンカーを含むこともさらに企図される。例えば、このリンカーは、配列（Ｇ３Ｓ）４を有する１６アミノ酸リンカーであり得る。特定の実施形態では、細胞内抗原の免疫原性を増強するための方法が本明細書に開示され、方法は、抗原をＥＴＳＤでタグ付けし、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）においてタグ付け抗原を発現させることを含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、Ｎ－ＥＴＳＤ及びＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質を含む融合タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、同一性値は１００％である。
【0035】
ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、配列番号３に対して少なくとも８５％の同一性を有することが企図される。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、同一性値は１００％である。ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする核酸は、配列番号５に対して少なくとも８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、同一性値は１００％である。
【0036】
ＣｏＶ－２スパイク融合タンパク質は、配列番号４に対して少なくとも８５％の同一性を有することが企図される。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、同一性値は１００％である。ＣｏＶ－２スパイク融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号６に対して少なくとも８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも８５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、同一性値は１００％である。
【0037】
本開示の第２の態様では、コロナウイルス２（ＣｏＶ－２）ヌクレオカプシドタンパク質、ＣｏＶ２ Ｎ－ＥＴＳＤタンパク質、ＣｏＶ２スパイクタンパク質、ＣｏＶ２スパイク－融合タンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸を含む組換え酵母が本明細書に提供される。さらに、これらのコードされたタンパク質の各々は、下記により詳細に記載されるように、さらに修飾され得る。好ましくは、組換え酵母はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【0038】
この第２の態様のいくつかの実施形態では、ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質又はその変異体は、配列番号１又は配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。他の実施形態では、同一性値は少なくとも８５％である。さらに他の実施形態では、同一性値は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、同一性値は１００％である。
【0039】
この第２の態様のいくつかの実施形態では、ＣｏＶ－２スパイクタンパク質又はスパイク融合タンパク質は、配列番号３又は配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。他の実施形態では、同一性値は少なくとも８５％である。さらに他の実施形態では、同一性値は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、同一性値は１００％である。
【0040】
いくつかの実施形態では、ＣｏＶ－２スパイクタンパク質又はスパイク融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号５又は配列番号６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。他の実施形態では、同一性値は少なくとも８５％である。さらに他の実施形態では、同一性値は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、同一性値は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、同一性値は１００％である。
【0041】
本明細書に開示されるアデノウイルス及び酵母はさらに、輸送配列、同時刺激性分子、及び／又は免疫刺激性サイトカインをコードする核酸を含むことができる。同時刺激性分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ－Ｌ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ－１、及びＬＦＡ３からなる群から選択される。免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ノガペンデキンα－インバキセプト（ｎｏｇａｐｅｎｄｅｋｉｎ ａｌｆａ－ｉｍｂａｋｉｃｅｐｔ）、ＩＬ－２１、ＩＰＳ１、及びＬＭＰ１からなる群から選択されてもよい。追加的又は代替的に、本明細書に開示されるワクチンは、ＥＴＳＤタグを有する又は有さないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍタンパク質もコードし得る。追加的又は代替的に、アデノウイルス及び／又は酵母は、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ノガペンデキンα－インバキセプト、ＩＬ－２１、ＩＰＳ１、＆ ＬＭＰ１）と組み合わせて投与され得る。この文脈における「組み合わせて」は、免疫刺激性サイトカインがアデノウイルス及び／又は酵母の２４時間以内に投与されることを意図する。即ち、アデノウイルス及び／又は酵母は、患者（例えば、５０歳を超える患者）に投与され得、次いで２４時間後以内に、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ノガペンデキンα－インバキセプト、ＩＬ－２１、ＩＰＳ１、＆ ＬＭＰ１）が同じ患者に投与され得る。追加的又は代替的に、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ノガペンデキンα－インバキセプト、ＩＬ－２１、ＩＰＳ１、＆ ＬＭＰ１）は、患者（例えば、５０歳を超える患者）に投与され得、次いで２４時間後以内に、アデノウイルス及び／又は酵母が同じ患者に投与され得る。
【0042】
４０歳を超えると、患者がワクチンに対するＴ細胞応答を開始する能力は徐々に低下する。したがって、本明細書に記載されるアデノウイルス及び／又は酵母を、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ノガペンデキンα－インバキセプト、ＩＬ－２１、ＩＰＳ１、＆ ＬＭＰ１）と組み合わせて投与することは、高齢患者に特に有用であり得る。本明細書で使用される場合、「高齢」は、５０歳超の患者、例えば、５５歳超、６０歳超、６５歳超、７０歳超、７５歳超、８０歳超、８５歳超、又は９０歳超の患者を包含する。
【0043】
最も好ましくは、組換えウイルスは、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）又は皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）注射を介して投与される。しかしながら、他の企図される態様では、投与は静脈内注射でもあり得る。代替的又は追加的に、抗原提示細胞は、患者の細胞から単離又は成長され、インビトロで感染され、次いで患者に注入され得る。
【0044】
本明細書において上記又は他の箇所で記載した実施形態のいずれかの一態様では、組成物は、対象への投与に適した薬学的に許容され得る賦形剤中で製剤化される。
【0045】
本明細書で企図される組換えウイルス及び酵母が、同時刺激性分子、免疫刺激性サイトカイン、及びチェックポイント阻害を妨害又は下方調節するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含み得ることが尚さらに企図される。例えば、適切な同時刺激性分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ－Ｌ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ－１、及び／又はＬＦＡ３を含む一方、適切な免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（Ｎ８０３）、ＩＬ－２１、ＩＰＳ１、及び／若しくはＬＭＰ１を含み、並びに／又は妨害する適切なタンパク質は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４、及び／又はＣＤ１６０の抗体アゴニスト又はアンタゴニストを含む。
【0046】
上記の同時刺激性遺伝子の全ては当技術分野において周知であり、これらの遺伝子、アイソフォーム、及び変異体の配列情報は、ＮＣＢＩ、ＥＭＢＬ、ジェンバンク、ＲｅｆＳｅｑなどにおいてアクセス可能な配列データベースを含む様々な公共リソースから検索することができることを理解するべきである。さらに、上記の例示的な刺激分子は、好ましくは、ヒトにおいて発現するように全長形態で発現されるが、修飾及び非ヒト形態も、そのような形態がＴ細胞の刺激又は活性化を補助する限り、適切であると考えられる。したがって、ムテイン、切断形態及びキメラ形態は、本明細書で明確に企図される。
【0047】
本明細書に開示される免疫治療組成物は、「予防的」又は「治療的」のいずれかであり得る。予防的に提供される場合、本開示の組成物は、コロナウイルス疾患の発生を予防、阻害若しくは遅延させることを目標として、コロナウイルス疾患の発生に先立って若しくは発生の検出時に提供され；並びに／又は一般に個体におけるコロナウイルス疾患の進行を予防若しくは阻害する。したがって、予防組成物は、コロナウイルス疾患を有さない（健康な、又は正常な個体）と思われる個体、又はコロナウイルスが未だ検出されていない個体に投与され得る。コロナウイルス疾患を発生するリスクが高い個体は、本開示の組成物を用いて予防的に治療され得る。
【0048】
治療的に提供される場合、免疫治療組成物は、コロナウイルス疾患の改善又は治癒；個体の生存率を増加させること；個体におけるコロナウイルス疾患の発生を予防、阻害、逆転又は遅延させることを目的として、コロナウイルス疾患と診断された個体に提供される。
【0049】
さらなる別の実施形態では、上記に開示したアデノウイルス又は酵母を含むワクチン組成物が本明細書に開示され、ここで組成物は注射用に製剤化される。ワクチン組成物は、患者にワクチン組成物を投与することによって、それを必要とする患者においてＣｏＶ－２に対する免疫を誘導するために使用され得る。
【0050】
コロナウイルス疾患、特にＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／又は治療するための方法も本明細書に開示される。好ましくは、方法は、コロナウイルスのヌクレオカプシドタンパク質の野生型若しくは修飾形態、及び／又はスパイクタンパク質の野生型若しくは修飾形態をコードするウイルス又は酵母ベクターを、対象個体に投与される免疫原性組成物中で使用することを含む。そのように投与されるウイルス及び／又は酵母ワクチンは、ＣｏＶ－２、ヌクレオカプシド又はスパイクタンパク質の野生型又は修飾形態で個体を感染させるであろう。それが整った状態で、個体は、それに対する免疫応答を有し、ワクチン接種されるであろう。特に、ヌクレオカプシドタンパク質及びスパイクタンパク質は比較的保存されたポリペプチドであるため、コロナウイルスファミリーの多様なメンバーに対して免疫応答が誘発され得る。
【0051】
組換えベクターがアデノウイルスである場合、アデノウイルスベクターは、ヌクレオカプシドタンパク質、及び／又はスパイクタンパク質の野生型又は修飾形態をコードするように修飾され得る。同様に、酵母の場合、酵母ベクターもヌクレオカプシドタンパク質、及び／又はスパイクタンパク質の野生型又は修飾形態をコードするように修飾され得る。下記により詳細に示すように、それを必要とする患者において、ウイルス及び／又は酵母ベクターを含む免疫原性組成物を投与した後、陽性免疫応答は、細胞媒介免疫に対して得られる。したがって、一実施形態では、本開示は、酵母表面上でのコロナウイルススパイクの発現を作り上げることを企図する。そのような実施形態では、酵母はアバターコロナウイルスとして機能してＢ細胞を刺激し、次いで液性免疫をもたらす。
【0052】
本明細書に開示されるように、既存のアデノウイルス免疫を有する患者において免疫を誘導することが可能な次世代二価ヒトアデノウイルス血清型５（ｈＡｄ５）ワクチンであり、これは、細胞表面発現について最適化されたＳ配列（Ｓ－融合物）及びエンドソーム細胞内コンパートメントに輸送されるように設計された保存されたヌクレオカプシド（Ｎ）抗原の両方を含み、耐久性のある免疫防御を生成する可能性を有する。本明細書にさらに記載されるように、そのような二価ワクチンは、以下の知見により証明されるように免疫原性について最適化されていることが見出されている：
１）最適化されたＳ－融合物は、表面発現が殆ど検出されないＳ－ＷＴと比較して、改善されたＳ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）細胞表面発現を示した；
２）Ｓ－融合物からの発現ＲＢＤは、立体構造の完全性及びＡＣＥ２－Ｆｃによる認識を保持した；
３）増強されたＴ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）で修飾されたウイルスＮタンパク質は、ＭＨＣ Ｉ／ＩＩ提示のためにエンドソーム／リソソーム細胞内コンパートメントに局在化した；並びに
４）これらのＳ及びＮ（Ｓ－融合物及びＮ－ＥＴＳＤ）への最適化は、抗原ネイティブ前臨床モデルにおいて、増強されたデノボ抗原特異的Ｂ細胞並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を生成した。
１）最適化されたＳ－融合物は、表面発現が殆ど検出されないＳ－ＷＴと比較して、改善されたＳ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）細胞表面発現を示した；
２）Ｓ－融合物からの発現ＲＢＤは、立体構造の完全性及びＡＣＥ２－Ｆｃによる認識を保持した；
３）増強されたＴ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）で修飾されたウイルスＮタンパク質は、ＭＨＣ Ｉ／ＩＩ提示のためにエンドソーム／リソソーム細胞内コンパートメントに局在化した；並びに
４）これらのＳ及びＮ（Ｓ－融合物及びＮ－ＥＴＳＤ）への最適化は、抗原ネイティブ前臨床モデルにおいて、増強されたデノボ抗原特異的Ｂ細胞並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を生成した。
【0053】
Ｓ及びＮ成分へのＴ細胞及び抗体免疫応答の両方は、Ｔ－ヘルパー１（Ｔｈ１）バイアスを示した。抗体応答は、独立ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイによって示されるように中和であった。したがって、一実施形態では、次世代二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して頑強で耐久性のある細胞媒介及び液性免疫を提供する。さらに、また下記により詳細にさらに記載されるように、ワクチンコンストラクトは、経口、鼻腔内又は舌下に投与され得る。したがって、一実施形態では、本開示はまた、注射用製剤（例えば、ＳＣ又はＩＭ）以外に、経口、鼻腔内、及び舌下製剤中のワクチンコンストラクトを提供して、細胞媒介及び液性免疫に加えて粘膜免疫を誘導する。別の視点から見ると、実質的な免疫は、注射、経口／粘膜投与の単独又は組み合わせにより生成され得る。一実施形態では、本明細書に開示されるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、長期Ｔ及びＢ細胞記憶を生成する。
【0054】
コロナウイルス及びそのためのワクチン
コロナウイルスは、鳥類及び哺乳動物種に見出される。それらは形態及び化学構造が互いに類似し：例えば、ヒト及び畜牛のコロナウイルスは、抗原的に関連する。しかしながら、ヒトコロナウイルスが物によって伝播し得る証拠は存在しない。動物では、様々なコロナウイルスが多くの異なる組織に侵入し、ヒトにおいて多様な疾患を生じる。そのような疾患の１つは、２００２後半／２００３前半にアジア、ヨーロッパ及び北アメリカのいくつかの国で広がった重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス疾患である。別のそのような疾患は、世界中のいくつかの国に広がった２０１９年の新型コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ １９）である。２０１９年の１２月に、中国の武漢から、ヒトからヒトへの伝染を示す高い罹患率及び死亡率１－３を有する新しい感染性呼吸器疾患に関する報告が現れた。原因因子は新型コロナウイルスであると迅速に特定され、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と命名された。これを原因とする疾患はＣＯＶＩＤ－１９と称され、急速に世界的なパンデミックとなり、これは社会経済生活を混乱させ、２０２０年１０月後半の時点で世界中で３，２００万人を超える感染と１，１００，０００人を超える死亡をもたらした。
コロナウイルスは、鳥類及び哺乳動物種に見出される。それらは形態及び化学構造が互いに類似し：例えば、ヒト及び畜牛のコロナウイルスは、抗原的に関連する。しかしながら、ヒトコロナウイルスが物によって伝播し得る証拠は存在しない。動物では、様々なコロナウイルスが多くの異なる組織に侵入し、ヒトにおいて多様な疾患を生じる。そのような疾患の１つは、２００２後半／２００３前半にアジア、ヨーロッパ及び北アメリカのいくつかの国で広がった重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス疾患である。別のそのような疾患は、世界中のいくつかの国に広がった２０１９年の新型コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ １９）である。２０１９年の１２月に、中国の武漢から、ヒトからヒトへの伝染を示す高い罹患率及び死亡率１－３を有する新しい感染性呼吸器疾患に関する報告が現れた。原因因子は新型コロナウイルスであると迅速に特定され、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と命名された。これを原因とする疾患はＣＯＶＩＤ－１９と称され、急速に世界的なパンデミックとなり、これは社会経済生活を混乱させ、２０２０年１０月後半の時点で世界中で３，２００万人を超える感染と１，１００，０００人を超える死亡をもたらした。
【0055】
ＣＯＶＩＤ １９は、通常、３８℃を超える熱から開始する。初期症状は、咳、のどの痛み、倦怠感及び軽度の呼吸器症状も含み得る。２日～１週間以内に、患者は呼吸困難となり得る。ＣＯＶＩＤ １９のより進行した段階の患者は、肺炎又は呼吸促迫症候群のいずれかを発症する。公衆衛生介入、例えば監視、旅行制限及び検疫を用いてＣＯＶＩＤ １９の広がりを封じ込めている。しかしながら、これらの厳格な封じ込め手段が、ヒトにおけるＣＯＶＩＤ １９の各出現を持ちこたえ得るか否かは分かっていない。さらに、バイオテロの脅威としての、この新たな且つ時折致死的なＣｏＶの可能性は明らかである。
【0056】
コロナウイルスビリオンは、球形から多形のエンベロープ化粒子である。エンベロープは、突出する糖タンパク質がちりばめられ、マトリクスタンパク質からなるコアを包囲し、その中にはヌクレオカプシドタンパク質に関連するプラスセンスＲＮＡ（Ｍｒ ６×１０６）の一本鎖が包み込まれている。その関連で、用語「ヌクレオカプシドタンパク質」、「核タンパク質」及び「ヌクレオカプシド」は、この開示全体を通して互換的に使用されることに留意するべきである。コロナウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）は、ＣＯＶＩＤ １９を含む全コロナウイルスで見出される構造タンパク質である。ヌクレオカプシドタンパク質は、ゲノムＲＮＡと複合体を形成し、ビリオン組立て中にウイルス膜タンパク質と相互作用し、ウイルス転写及び組立ての効率を向上させる上で重要な役割を果たす。
【0057】
全コロナウイルスビリオンを通して見出された別のタンパク質は、ウイルススパイク（Ｓ）タンパク質である。コロナウイルスは、典型的には広範な宿主範囲を有する大きいプラス鎖ＲＮＡウイルスである。他のエンベロープ化ウイルスと同様に、ＣｏＶは、ウイルスと細胞膜との融合によって標的細胞に侵入し、そのプロセスはウイルススパイク（Ｓ）タンパク質によって媒介される。
【0058】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、４つの構造タンパク質：スパイク（Ｓ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、膜（Ｍ）、及びエンベロープ、並びにウイルス膜及びゲノムＲＮＡから主に構成されるエンベロープ化プラスセンス、一本鎖ＲＮＡ βコロナウイルスである。これらのうち、Ｓは最も大きく、Ｎは最も優勢である。Ｓ糖タンパク質は、ウイルス表面上に三量体として表示されるが（図３３、パネルＡ）、Ｎはウイルス粒子中に位置する。Ｓの一次構造の概略を図３３、パネルＢに示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列は、掲載され、以前のコロナウイルスと比較された。この後すぐに、Ｓタンパク質の結晶構造が報告された。ウイルスはＳタンパク質を使用して、Ｓ受容体結合ドメイン（Ｓ ＲＢＤ）と、鼻、口腔、腸、及び肺、並びに他の器官内の多様な細胞タイプ上、及び重要なことには、感染が主に出現する肺の肺胞上皮細胞上に発現される酵素であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）との相互作用によって宿主細胞に侵入する。図３３、パネルＢに表すように、Ｓ ＲＢＤは、スパイクポリペプチドのＳ１領域内に見出される。
【0059】
本明細書に開示される方法及び組成物は、コロナウイルスの全タイプに保存されている核タンパク質及びスパイクタンパク質を標的とする。一実施形態では、本開示は、組換え体を含むワクチン製剤を提供し、ここで組換え体は、コロナウイルス２（ＣｏＶ２）のヌクレオカプシドタンパク質若しくはその修飾形態をコードする核酸を含み、及び／又は組換え体は、ＣｏＶ２のスパイクタンパク質若しくはその修飾形態をコードする。ワクチン製剤は、コロナウイルス媒介性疾患又は感染症などの疾患の治療に有用であり得る。したがって、別の実施形態ではそれを必要とする患者のためのコロナウイルス疾患の治療方法が企図される。そのような方法は、好ましくは、組換え体を含む免疫治療組成物を対象に投与する工程を含み、組換え体は、コロナウイルス２（ＣｏＶ２）のヌクレオカプシドタンパク質若しくはその修飾形態をコードする核酸、及び／又はコロナウイルス２（ＣｏＶ２）のスパイクタンパク質若しくはその修飾形態をコードする核酸を含むであろう。本明細書で企図されるコロナウイルスは、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）及び／又は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）であり得る。
【0060】
例えば、本開示は、それを必要とする患者におけるコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）及び／又は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を治療する方法を提供し、該方法は：組換えウイルスを含む第１の免疫治療組成物を対象に投与することであって、組換えウイルスは、コロナウイルス２（ＣｏＶ２）のヌクレオカプシドタンパク質又はその修飾形態をコードする核酸を含む、投与することと、組換え酵母を含む第２の免疫治療組成物を対象に投与することであって、組換え酵母は、ＣｏＶ２のスパイクタンパク質をコードする核酸を含む、投与することとを含む。第１及び第２の免疫治療組成物は、同時に又は連続して、患者に投与され得る。
【0061】
異なる視点から見れば、（ａ）少なくとも１つのヌクレオカプシドタンパク質又はその修飾形態；及び（ｂ）少なくとも１つのスパイクタンパク質又はその修飾形態をコードする核酸を含むウイルスベクター（例えば、組換えアデノウイルスゲノム、場合により欠失又は非機能性Ｅ２ｂ遺伝子を有する）が、本明細書で企図される。ウイルスベクターは、１つ以上の同時刺激性分子をさらにコードしてもよい。最も典型的には、核酸は、核酸によりコードされるペプチド産物を細胞質、エンドソームコンパートメント、又はリソソームコンパートメントに指向させる輸送シグナルも含み、ペプチド産物は、ペプチド産物の細胞内代謝回転を増強する配列部分も含むことができる。
【0062】
開発中の現在のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの大部分は、ＲＢＤに対する抗体の生成によって、ウイルスが宿主細胞に結合する能力を中和する可能性があるため、Ｓを標的とする。重要な抗原としてのＲＢＤについてのサポートが最近確認され、４４人の入院ＣＯＶＩＤ－１９患者において、ＲＢＤ特異的ＩｇＧ応答及び抗体力価の中和は、感染のＰＣＲ確認後６日までに全ての患者で検出可能であり、２つは相関することが報告された。液性応答に加えて、ＳエピトープはＣＯＶＩＤ－１９から回復した患者のＴ細胞の高頻度の標的でもあり、予防免疫化戦略にＳを含めることのさらなる正当化を提供する。
【0063】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの急速な開発の緊急の必要性にもかかわらず、開発中の一価ワクチンに生じる抗原カーゴ又は免疫学的経路の任意の１つへの信頼性は、リスクがないわけではない。ほぼ４０００のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列の評価により、Ｓにおいて多数の突然変異が同定され、元のウイルスの同定から６か月後に、Ｄ６１４Ｇ変異体が潜在的により感染性の高い株として最近出現した。
【0064】
本明細書に開示されるワクチンの設計においては、Ｓに突然変異を有するウイルスの新たな株の出現のリスクを克服し、追加の抗原（これに対する応答を誘発し得る）を提供するために、最適化されたＮ配列が追加された。Ｎタンパク質は、高度に保存され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに対するコロナウイルスワクチン設計における抗原として以前に研究された抗原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－関連タンパク質である。Ｎは、ウイルス内のウイルスＲＮＡに関連し、ウイルスＲＮＡ複製、ウイルス粒子組立て、及び放出に役割を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎは抗原性の高いタンパク質であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したほぼ全ての患者がＮに対する抗体応答を有する。さらに、別の研究は、試験した全員ではないが殆どのＣＯＶＩＤ－１９生存者が、Ｎ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を有することを示すことを報告した。
【0065】
現在、ワクチンに対する液性応答の生成に強い関心が寄せられており、おそらく、Ｔ細胞応答にはあまり注意が払われていない。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に自然史は、ワクチン接種に対する頑強なＴ細胞応答は、少なくとも抗体の産生と同じく重要であり、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン効力についての重大な考慮事項でなければならないことを示唆している。
【0066】
第１に、液性応答とＴ細胞応答は高く相関し、中和抗体の力価はＴ細胞レベルに比例し、有効な液性応答にはＴ応答が必要であることを示唆している。ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞の活性化が抗体のＢ細胞産生を増強することが十分に確立されている。第２に、ウイルス特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＯＶＩＤ－１９患者に広く検出されているだけでなく、密接に関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶから回復した患者からの知見に基づき、そのようなＴ細胞は少なくとも６～１７年間持続し、Ｔ細胞が長期免疫に重要な部分であり得ることを示唆している。これらのＴ細胞応答は、主にＮに対するものであり、それらの研究における３６人の回復期ＣＯＶＩＤ－１９患者の全員において、Ｎタンパク質の複数の領域を認識するＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の存在を実証できたことが報告されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶから回復した２３個体からの血液を検査し、１７年前に獲得した記憶Ｔ細胞もＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数のタンパク質を認識することが見出された。これらの知見は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に存在する高く保存されたヌクレオカプシドを用いてワクチンを設計することの重要性を強調している。第３に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露された回復した患者は、セロコンバージョンがなく、Ｔ細胞応答の証拠があることが見出された。Ｔ細胞ベースの応答は、少なくとも１つの研究において、中和抗体力価が約３ヵ月後にいくつかのＣＯＶＩＤ－１９患者で低下するという知見を考慮すると、より重要なものとなる。
【0067】
一実施形態では、本明細書に開示されるワクチンは、液性応答に加えてＴ細胞の産生をもたらす。多くの抗原、ＳＤ１、Ｓ１及びＳ２エピトープをＮと共に含む全長Ｓの包含により表示されるＳ ＲＢＤを含む二価ワクチンが企図され、ユニーク且つ保存されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性部位の両方を免疫系に提示することによって、いずれかの抗原単独を用いたコンストラクトよりも、Ｔ細胞及び抗体ベースの応答の両方の誘発により有効であることが示された。Ｓ及びＮの両方の重要性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスの先験的に潜在的なＢ及びＴ細胞エピトープとしてのＳ及びＮ抗原の両方が、Ｔ及びＢ細胞応答の両方を誘導すると予測されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に非常によく似ていることを特定することによって強調された。
【0068】
有効なワクチンの設計のための追加の考慮事項は、組換えタンパク質発現細胞の表面上の抗原提示の可能性、及び天然ウイルス感染を再現するコンフォメーションにおける発現の可能性である。第１に、野生型Ｎは、それをエンドソーム処理及び最終的にＣＤ４＋ Ｔ細胞へのＭＨＣクラスＩＩ複合体提示に導くシグナル伝達ドメインを有さないため、野生型Ｎ配列は、細胞媒介及びＢ細胞記憶の両方に必要な活発なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の誘導に最適ではない。この制限を克服するために、Ｎに対する増強Ｔ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）は、必要な処理及び提示を可能にする。１つの好ましいＥＴＳＤポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。勿論、この配列は、所望の活性を維持しながら修飾できることを理解するべきである。したがって、ＥＴＳＤ配列は、配列番号８に対して少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５、又は少なくとも９８％の同一性を有し得る。第２に、細胞表面上にＳの高い抗原性のＲＢＤを表示するために、野生型Ｓタンパク質の「Ｓ－融合物」配列への最適化は、天然の折り畳み、安定性の増大、及びＲＢＤの適切な細胞表面発現の可能性を増大させる。したがって、一実施形態では、ワクチンコンストラクトは、Ｓ－融合物配列及びＮ－ＥＴＳＤ配列を含む。
【0069】
本明細書で使用されるワクチンプラットフォームは、Ｅ１、Ｅ２ｂ、及びＥ３遺伝子領域における欠失（ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］）を有する次世代組換えヒトアデノウイルス血清型５（ｈＡｄ５）ベクターである。このｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクター（図３３、パネルＣ）は、主に、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）の発現を除去する初期遺伝子２ｂ（Ｅ２ｂ）領域に、及び前末端タンパク質（ｐＴＰ）遺伝子に追加の欠失を有すること、並びにＥ．Ｃ７ヒト細胞株におけるその増殖によって、他の第１世代［Ｅ１－、Ｅ３－］組換えＡｄ５プラットフォームから区別される。これらのＥ２ｂ領域の除去は、既存のアデノウイルス（Ａｄ）免疫を有する患者において、ウイルスファイバーなどのＡｄ５ウイルスタンパク質に対する免疫応答を最小限にし、それによって特定の抗原に対する強力な免疫応答を誘発することにより、有利な免疫特性を与える。これらの欠失のさらなる利益として、ベクターは、第１世代Ａｄ５［Ｅ１－、Ｅ３－］ベクターと比較して拡大された遺伝子保有／クローニング能力を有する。この次世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ワクチンプラットフォームは、Ａｄ５［Ｅ１－、Ｅ３－］ベースのプラットフォームとは対照的に、自然免疫シグナル伝達を抑制する活性を促進せず、それにより、以前のＡｄ免疫とは独立して、改善されたワクチン効力及び優れた安全性プロファイルを可能にする。これらの欠失は、ｈＡｄ５プラットフォームが既存のＡｄ免疫の存在下でも有効であることを可能にするため、このプラットフォームは、抗ベクター免疫の有意な減少を伴わずに比較的長期の抗原発現を可能にする。したがって、既存の及びワクチン誘導Ａｄ免疫の限界に直面する第１世代Ａｄプラットフォームとは異なり、同じベクター／コンストラクトを同種プライムブースト治療レジメンに使用することも可能である。重要なことに、この次世代Ａｄベクターは、固体腫瘍を有する１２５人を超える患者において安全性が証明されている。これらの第Ｉ／ＩＩ相試験では、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞は、既存のＡｄ免疫の存在下であっても、複数の体細胞抗原（ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ブラキュリ）の生成に成功した。
【0070】
本開示は、ＡＣＥ２－Ｆｃ結合によりＳ－融合物から発現されたＳ ＲＢＤの増強された細胞表面発現の確認、及び生理学的に関連するフォールディングの知見を提供する。Ｎ－ＥＴＳＤタンパク質は、ＭＨＣ提示のためにエンドソーム／リソソーム細胞内コンパートメントに首尾よく局在化し、その結果ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の両方を生成した。ｈＡｄ５ Ｓ融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンによるＣＤ－１マウスの免疫化は、ワクチン抗原に対する液性及び細胞媒介免疫応答の両方を誘発した。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、Ｓ及びＮの両方について認められた。Ｓ及びＮに対する抗体産生について統計的に有意なＩｇＧ応答が見られた。ｈＡｄ５ Ｓ融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ－免疫化マウスからの血清によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力な中和が、２つの独立したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイ：ＡＣＥ２，４４へのＲＢＤ結合の競合阻害を測定するｃＰａｓｓアッセイ、及び感染したベロＥ６細胞を用いた生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスアッセイによって確認された。Ｓ及びＮに対するＴ細胞応答の応答及び液性応答は、Ｔｈ１特異的応答に傾いた。
【0071】
総じて、これらの知見は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン組成物がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して特に有効であろうことを示している。
【0072】
組換えウイルス
組換えウイルスに関連して、組換えウイルスの既知の作製方法の全てが本明細書での使用に適していると考えられるが、特に好ましいウイルスは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどを含む、治療法において既に確立されたものであることが企図される。他の適切な選択肢の中でも、アデノウイルスが特に好ましい。
組換えウイルスに関連して、組換えウイルスの既知の作製方法の全てが本明細書での使用に適していると考えられるが、特に好ましいウイルスは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどを含む、治療法において既に確立されたものであることが企図される。他の適切な選択肢の中でも、アデノウイルスが特に好ましい。
【0073】
さらに、一般に、ウイルスは複製欠損及び非免疫原性ウイルスであることがさらに好ましい。例えば、適切なウイルスは、遺伝子組換えアルファウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどを含む。しかしながら、アデノウイルスが特に好ましい。例えば、複数のワクチン接種のみでなく、アデノウイルスに対する既存の免疫を有する個体のワクチン接種に適した遺伝子組換え複製欠損アデノウイルスが好ましい（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／００６４７９号パンフレット及び国際公開第２０１４／０３１１７８号パンフレット参照）。いくつかの実施形態では、複製欠損アデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルス５ベクターを含む。いくつかの実施形態では、複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ領域における欠失を含む。いくつかの実施形態では、複製欠損アデノウイルスベクターはさらに、Ｅｌ領域における欠失を含む。その点で、遺伝子組換え複製欠損アデノウイルスにおけるＥ２ｂ遺伝子の欠失及び他の後期タンパク質が免疫原性を低下させることに留意するべきである。さらに、これらの特異的欠失に起因して、そのような遺伝子組換えウイルスは複製欠損であり、比較的大きい組換えカーゴが可能である。
【0074】
例えば、国際公開第２０１４／０３１１７８号パンフレットは、結腸癌に対する免疫反応を提供するためにＣＥＡ（結腸直腸胚性抗原）を発現するそのような遺伝子組換えウイルスの使用を記載している。さらに、組換えウイルスの比較的高い力価は、報告されているように、遺伝子組換えヒト２９３細胞を使用して達成することができる（例えば、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９８ Ｆｅｂ；７２（２）：９２６－９３３）。
【0075】
Ｅｌ欠失アデノウイルスベクターＡｄ５［Ｅ１－］は、導入遺伝子が遺伝子のＥｌ領域のみを置き換えるように構築されている。典型的には、野生型Ａｄ５ゲノムの約９０％がベクター中に保持される。Ａｄ５［Ｅ１－］ベクターは複製能力が低下しており、Ａｄ５ Ｅｌ遺伝子を発現していない細胞の感染後に感染性ウイルスを生成することができない。組換えＡｄ５［Ｅ１－］ベクターはヒト細胞内で増殖し、Ａｄ５［Ｅ１－］ベクター複製及びパッケージングを可能にする。Ａｄ５［Ｅ１－］ベクターは、多くの正の特質を有し；そのうちの最も重要なものは、それらの規模拡大及びｃＧＭＰ生成が比較的容易であることである。現在、２２０を優に超えるヒト臨床試験がＡｄ５［Ｅ１－］ベクターを使用し、２０００人を超える対象がウイルスをｓｃ、ｉｍ、又はｉｖで付与されている。さらに、Ａｄ５ベクターは組み込まれず；それらのゲノムはエピソームのままである。一般に、宿主ゲノムに組み込まれないベクターの場合、挿入変異誘発及び／又は生殖細胞系の伝達のリスクが、あったとしても非常に低い。従来のＡｄ５［Ｅ１－］ベクターは、７ｋｂに近づく保有能力を有する。
【0076】
第１世代（Ｅｌ－欠失）Ａｄ５－ベースのベクターの使用に対する１つの障壁は、既存の抗アデノウイルスタイプ５中和抗体の高い頻度である。この免疫を克服する試みは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／０３１１７８号パンフレットに記載されている。詳細には、早期１（Ｅｌ）遺伝子領域における欠失と、早期２ｂ（Ｅ２ｂ）遺伝子領域における追加の欠失（Ａｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－］）を有する新規な組換えＡｄ５プラットフォームが記載されている。Ｅ２ｂ領域（ＤＮＡポリメラーゼ及び前末端タンパク質をコードする）の欠失は、ウイルスＤＮＡ複製の減少及び後期ウイルスタンパク質発現をもたらす。Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターは、第１世代アデノウイルスベクターよりも安全で、有効で、より多用途の改善されたＡｄ－ベースのベクターを提供する。
【0077】
さらなる実施形態では、他での使用に企図されるアデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域における欠失と、場合によりＥｌ、Ｅ３における欠失と、また場合により、Ｅ４領域の部分的又は完全な除去を有するアデノウイルスベクターを含む。さらなる実施形態では、本明細書で使用されるアデノウイルスベクターは、Ｅｌ及び／又はＥ２ｂ領域の前終端タンパク質機能の欠失を有する。いくつかの場合、そのようなベクターは、他の欠失を有さない。別の実施形態では、本明細書で使用されるアデノウイルスベクターは、Ｅｌ、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は前終端タンパク質機能の欠失を有する。
【0078】
本明細書で使用される用語「Ｅ２ｂ欠失」は、少なくとも１つのＥ２ｂ遺伝子産物の発現及び／又は機能を防止するよう突然変異された特定のＤＮＡ配列を指す。したがって、特定の実施形態では、「Ｅ２ｂ欠失」は、Ａｄゲノムから削除（除去）された特定のＤＮＡ配列に関して使用される。Ｅ２ｂ欠失又は「Ｅ２ｂ領域内に欠失を含む」は、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域内の少なくとも１つの塩基対の欠失を指す。したがって、特定の実施形態では、１つを超える塩基対が削除され、さらなる実施形態では、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、又は１５０塩基対が削除される。別の実施形態では、欠失は、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域内の１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、又は３００を超える塩基対のものである。Ｅ２ｂ欠失は、少なくとも１つのＥ２ｂ遺伝子産物の発現及び／又は機能を防止する欠失であってもよく、したがって、Ｅ２ｂ－特異的タンパク質のコード部分のエキソン内の欠失、並びにプロモーター及びリーダー配列内の欠失を包含する。特定の実施形態では、Ｅ２ｂ欠失は、ＤＮＡポリメラーゼ及びＥ２ｂ領域の前終端タンパク質の両方の発現及び／又は機能を防止する欠失である。さらなる実施形態では、「Ｅ２ｂ欠失」は、１つ以上のコード化タンパク質が非機能性であるような、Ａｄゲノムのこの領域のＤＮＡ配列における１つ以上の点突然変異を指す。そのような突然変異は、非機能性タンパク質をもたらすアミノ酸配列の変化に繋がる、異なる残基で置き換えられた残基を含む。
【0079】
容易に理解されるように、所望の核酸配列（ウイルス感染細胞からの発現のための）は、当技術分野で周知の適切な調節エレメントの制御下にある。上記に鑑みて、提示される組成物及び方法は、ウイルス発現抗原を１つ又は別の（又は両方の）ＭＨＣ系に特異的に導くのに適切だけではなく、様々な同時刺激性分子（例えば、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＬＦＡ－３（ＣＤ５８）並びにＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）の少なくとも１つ）の包含による、及びチェックポイント阻害剤の分泌又は膜結合提示による、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋細胞に対する刺激効果の増加も提供することを理解するべきである。
【0080】
ウイルス発現及びワクチン接種システムに関連して、全ての治療的組換えウイルス発現系が、そのようなウイルスが感染細胞における組換えペイロードの発現をもたらすことが可能である限り、本明細書での使用に適していると考えられることが企図される。
【0081】
組換えウイルスのタイプにかかわらず、ウイルスはエクスビボ又はインビボで患者（又は非患者）細胞を感染させるのに使用され得ることが企図される。例えば、ウイルスは、患者の細胞、特に抗原提示細胞を感染させるために、皮下又は静脈内に注射されてもよく、又は鼻腔内若しくは吸入を介して投与されてもよい。或いは、患者の（又は同種源からの）免疫コンピテント細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞など）をインビトロで感染させた後、患者に注入してもよい。或いは、免疫療法は、ウイルスに依存する必要はなく、所望の細胞、特に免疫コンピテント細胞においてネオエピトープ（例えば、単一ペプチド、タンデムミニ遺伝子など）の発現をもたらすＲＮＡ又はＤＮＡ、又は他の組換えベクターを使用する核酸トランスフェクション又はワクチン接種によって達成され得る。そのような核酸は、典型的には脂質製剤に関連して送達されて、核酸を分解から保護し、標的細胞への核酸の取り込みを促進する。
【0082】
上記のように、所望の核酸配列（ウイルス感染細胞からの発現のための）は、当技術分野で周知の適切な調節エレメントの制御下にある。例えば、適切なプロモーターエレメントは、構成的強力プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧＧプロモーター）を含むが、特に誘導条件が腫瘍微環境にとって典型的である場合、誘導性プロモーターも本発明での使用に適していると考えられる。例えば、誘導性プロモーターは、低酸素に敏感なもの、及びＴＧＦ－β又はＩＬ－８（例えば、ＴＲＡＦ、ＪＮＫ、Ｅｒｋ、又は他の応答エレメントプロモーターを介して）に敏感なプロモーターを含む。他の例では、適切な誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ミクソウイルス耐性１（Ｍｘ１）プロモーターなどを含む。
【0083】
本明細書に開示されるような、Ｅ１遺伝子領域欠失、Ｅ２ｂ遺伝子領域欠失、及びコロナウイルス２（ＣｏＶ２）ヌクレオカプシドタンパク質及び／又はＣｏＶ２スパイクタンパク質をコードする核酸を含む複製欠損アデノウイルスは、ＣｏＶ２に対する免疫を誘導する必要がある患者に投与され得る。本明細書に記載される治療組成物の投与経路及び頻度、並びに投与量は、個体間で異なり、また疾患の重症度で異なり得、標準的な技術を用いて容易に確立することができる。いくつかの実施形態では、投与は、４．８～５．２ｘ１０１１複製欠損アデノウイルス粒子、又は４．９～５．１ｘ１０１１複製欠損アデノウイルス粒子、又は４．９５～５．０５ｘ１０１１複製欠損アデノウイルス粒子、又は４．９９～５．０１ｘ１０１１複製欠損アデノウイルス粒子を送達することを含む。
【0084】
ウイルス粒子の投与は、送達用の多様な適切な経路を介することができる。本明細書で企図される１つの好ましい経路は、皮内注射、筋内注射、静脈内注射又は皮下注射などの注射による。いくつかの実施形態では、皮下送達が好ましい可能性がある。
【0085】
組換え酵母
酵母発現及びワクチン接種システムに関連して、全ての公知の酵母株が本明細書での使用に適切と見なされることが企図される。しかしながら、酵母は、コロナウイルス２（ＣｏＶ２）ヌクレオカプシドタンパク質、ＣｏＶ２スパイクタンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸コンストラクトで遺伝子改変された組換えサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株であることが好ましく、それによりＣｏＶ２ウイルス疾患に対する免疫応答を開始する。上記又は本明細書の他の箇所に記載した開示の実施形態の任意の一態様では、酵母ビヒクルは、酵母全体である。酵母全体は、一態様では殺傷される。一態様では、酵母全体は熱不活性化される。好ましい一実施形態では、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの熱不活性化酵母全体である。
酵母発現及びワクチン接種システムに関連して、全ての公知の酵母株が本明細書での使用に適切と見なされることが企図される。しかしながら、酵母は、コロナウイルス２（ＣｏＶ２）ヌクレオカプシドタンパク質、ＣｏＶ２スパイクタンパク質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸コンストラクトで遺伝子改変された組換えサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株であることが好ましく、それによりＣｏＶ２ウイルス疾患に対する免疫応答を開始する。上記又は本明細書の他の箇所に記載した開示の実施形態の任意の一態様では、酵母ビヒクルは、酵母全体である。酵母全体は、一態様では殺傷される。一態様では、酵母全体は熱不活性化される。好ましい一実施形態では、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの熱不活性化酵母全体である。
【0086】
酵母ベースの治療組成物の使用は当技術分野に開示されている。例えば、国際公開第２０１２／１０９４０４号パンフレットは、慢性Ｂ型肝炎感染の治療のための酵母組成物を開示している。
【0087】
任意の酵母株を使用して本開示の酵母ビヒクルを生成できることが注目される。酵母は、３つのクラスのうちの１つに属する単細胞微生物である：子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）及び不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）。免疫モジュレーターとして使用するための酵母のタイプの選択に関する１つの考慮事項は、酵母の病原性である。好ましい実施形態では、非病原性酵母株は酵母ビヒクルが投与される個体への任意の悪影響を最小にするため、酵母はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非病原性株である。しかしながら、酵母の病原性が薬学的介入を用いて否定できる場合、病原性酵母も使用され得る。
【0088】
例えば、酵母株の適切な属は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）を含む。一態様において、酵母属は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され、好ましい態様では、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が使用される。使用され得る酵母株の種は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・ラウレンティイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ハンセヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌスｖａｒ．ラクチス（（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む。
【0089】
これらの種の数は、前述した種に含まれることが意図される多様な亜種、タイプ、サブタイプなどを含むことをさらに理解するべきである。一態様では、本開示で使用される酵母種は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）を含む。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、操作が比較的容易であるため有用であり、食品添加物として使用するために「一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）」又は「ＧＲＡＳ」である（ＧＲＡＳ、ＦＤＡ提案規則６２ＦＲ１８９３８、Ａｐｒ．１７、１９９７）。したがって、プラスミドを特に高いコピー数に複製することができる酵母株、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｃｉｒ株が、本明細書で特に企図される。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、１つ以上の標的抗原及び／又は抗原融合タンパク質及び／又は他のタンパク質を高いレベルで発現させる発現ベクターを支持することができる株の１つである。さらに、Ｎ結合グリコシル化を延長する酵素の突然変異などの、発現した標的抗原又は他のタンパク質の翻訳後修飾の低下を示すものを含む、任意の突然変異体酵母株を使用することができる。
【0090】
酵母内での企図されるペプチド／タンパク質の発現は、当業者に公知の技術を用いて達成され得る。最も典型的には、少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸分子は、宿主酵母細胞内に形質転換された際に、核酸分子の発現の構成的又は調節された発現を達成することが可能なように、核酸分子が転写制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。容易に理解されるように、１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子は、１つ以上の発現制御配列に作動可能に連結された１つ以上の発現ベクター上に存在し得る。特に重要な発現制御配列は、転写開始を制御するものであり、例えばプロモーター及び上流活性化配列である。
【0091】
任意の適切な酵母プロモーターを本開示の方法及び組成物に使用することができ、多様なそのようなプロモーターは当業者に公知であり、上記に一般に論じられている。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのプロモーターは、以下の酵母タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターを含む：アルコールデヒドロゲナーゼ Ｉ（ＡＤＨ１）又はＩＩ（ＡＤＨ２）、ＣＵＰ１、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、翻訳伸長因子ＥＦ－１ α（ＴＥＦ２）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；トリオースリン酸デヒドロゲナーゼの場合、ＴＤＨ３とも称される）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、ガラクトース－１－リン酸ウリジル－トランスフェラーゼ（ＧＡＬ７）、ＵＤＰ－ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、シトクロムｃ１（ＣＹＣ１）、Ｓｅｃ７タンパク質（ＳＥＣ７）及び酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５）、（これはＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ及びＣＹＣ１／ＧＡＬ１０プロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含み、及びＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターを含み、これは細胞内のブドウ糖濃度が低い（例えば、約０．１～約０．２パーセント）場合に誘導される）、並びにＣＵＰ１プロモーター及びＴＥＦ２プロモーター。同様に、エンハンサーとも称される多数の上流活性化配列（ＵＡＳ）が公知である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のための上流活性化配列は、以下のタンパク質をコードする遺伝子のＵＡＳを含む：ＰＣＫ１、ＴＰＩ、ＴＤＨ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＳＵＣ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０、並びにＧＡＬ４遺伝子産物により活性化される他のＵＡＳ、ここでＡＤＨ２ ＵＡＳが一態様で使用される。ＡＤＨ２ ＵＡＳはＡＤＲ１遺伝子産物により活性化されるため、異種遺伝子がＡＤＨ２ ＵＡＳに作動可能に連結される場合、ＡＤＲ１遺伝子を過剰発現することが好ましい可能性がある。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のための転写終結配列は、α－因子、ＧＡＰＤＨ、及びＣＹＣ１遺伝子の終結配列を含む。メチル栄養性酵母において遺伝子を発現するための転写制御配列は、アルコールオキシダーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写制御領域を含む。
【0092】
同様に、本開示による酵母細胞内への核酸分子のトランスフェクションは、それによって核酸分子が細胞内に投与される任意の方法により達成することができ、核酸、能動輸送、浴超音波処理、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及びプロトプラスト融合を含む。トランスフェクトされた核酸分子は、酵母染色体に組み込まれ、又は当業者に公知の技術を用いて染色体外ベクター上に維持される。上記に論じたように、酵母細胞質体、酵母ゴースト、及び酵母膜粒子又は細胞壁製剤も、無傷酵母微生物又は酵母スフェロプラストに所望の核酸分子をトランスフェクトし、内部で抗原を生成し、次いで微生物又はスフェロプラストを当業者に公知の技術を用いてさらに操作して、所望の抗原又は他のタンパク質を含む細胞質体、ゴースト又は細胞内酵母膜抽出物若しくはその画分を生成することによって、組換え的に生成することができる。本発明での使用に適したさらなる例示的な酵母発現系、方法、及び条件は、米国特許出願公開第２０１００１９６４１１Ａ１号明細書、第２０１７／０２４６２７６号明細書、又は第２０１７／０２２４７９４号明細書、及び第２０１２／０１０７３４７号明細書に記載されている。
【0093】
そのように生成された組換えウイルス及び酵母は、次いで個々に又は組み合わせて、医薬組成物における治療的ワクチンとして使用され得、典型的には投与単位当たり１０４～１０１３ウイルス又は酵母粒子、又はより好ましくは投与単位当たり１０９～１０１２ウイルス又は酵母粒子のウイルスを有する無菌注射用組成物として製剤化される。或いは、ウイルス又は酵母は、エクスビボで患者細胞を感染させるように使用されてもよく、そのように感染した細胞は、次いで患者に注入される。しかしながら、代替的な製剤も本明細書での使用に適しているが考えられ、及び全ての公知の投与経路及びモードが本明細書で企図される。
【0094】
企図されるさらなる実施形態では、本明細書に開示される第２世代のｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベースのワクチンは、既存の抗Ａｄ５免疫を克服する。Ａｄ免疫化バリアを避け、第１世代Ａｄ５［Ｅ１－ Ｅ３－］ベクターに対する悪条件を回避するために、Ｅ２ｂ領域に２つの（２）追加の欠失を有し、ＤＮＡポリメラーゼ及び前終端タンパク質遺伝子を除去した高度な第２世代ヒトアデノウイルス（ｈＡｄ５）ベクターを構築した［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］。（アデノウイルスベクターの旧名は、Ａｄ５、文献ではＥＴＢＸであった）
【0095】
Ｅ２ｂ欠失ｈＡｄ５ベクターは、第１世代Ａｄ５［Ｅ１－］ベクターの７－ｋｂ容量と比較して、１２～１４ｋｂまでの遺伝子保有容量を有し、必要であれば多数の遺伝子のための空間を提供する。ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベースの組換えベクターは、ヒトＥ．Ｃ７細胞株を使用して生成される。Ｅ２ｂ領域の削除はまた、これらの新規なＡｄベクターに対して有利な免疫特性を付与し、特定の非ウイルス抗原に対する強力な免疫応答を誘発する一方、Ａｄウイルスタンパク質に対する免疫応答を最小限にする。
【0096】
ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターは、Ａｄ免疫の存在下であっても、強力な細胞媒介免疫（ＣＭＩ）応答、及びベクター化抗原に対するＡｂｓを誘導する。ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターはまた、Ａｄ５［Ｅ１－］ベクターと比較して、有害反応、特に肝毒性及び組織損傷の出現が低下されている。一実施形態では、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターウイルスタンパク質に対する炎症応答の低下、及び結果としての既存のＡｄ免疫の回避により、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターが樹状細胞（ＤＣ）を感染させる能力が増大し、ワクチンによる免疫力が高まる。さらに、他の細胞タイプの感染の増大は、強力なＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞応答に必要な抗原提示の高いレベルを提供し、記憶Ｔ細胞の発達をもたらす。一実施形態では、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターは、免疫原性及び安全性の点でＡｄ５［Ｅ１－］ベクターより優れており、迅速且つ効率的な方法でＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを開発するための最良のプラットフォームとなるであろう。一実施形態では、予防ワクチンは、他のＡｄ５系で見出されたバリアを克服するこの新しいｈＡｄ５ベクターシステムを利用することによりＣＯＶＩＤ－１９に対して試験され、以前にＡｄ５に曝露された人の免疫化を可能にする。
【0097】
パンデミック脅威中の第二世代ヒト（ｈＡｄ５）アデノウイルスプラットフォームを利用した急速ワクチン開発の実績：２００９年におけるＨ１Ｎ１経験。特にパンデミックの時代に、新たな病原体の脅威に対処するために、近代化されたワクチン技術を使用することが重要である。これらの技術は、高い免疫原性を有するコンストラクトを迅速に特定するために、ゲノム配列決定、確立されたワクチンベクターにおける迅速なトランスフェクションの力を利用するであろう。
【0098】
２００９ Ｈ１Ｎ１パンデミックウイルスのような新たな病原体に対するワクチンは、最も生物学的に関連するワクチンを構築するための、迅速なゲノム配列決定などの現代の技術から利益を受けることができる。新規なプラットフォーム（ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］）は、様々な抗原性標的に対する免疫応答を誘導するのに使用されている。このベクタープラットフォームは、２００９ Ｈ１Ｎ１パンデミックウイルスからヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を発現した。インサートは、ウイルス単離配列から設計されたコンセンサス配列であり、ワクチンは迅速に構築及び生産された。ワクチン接種はマウスにおいてＨ１Ｎ１免疫応答を誘導し、これは致命的なウイルスチャレンジからの保護を提供した。フェレットでは、ワクチン接種は疾患の発症を防御し、鼻洗浄液におけるウイルス力価を有意に低減した。Ｈ１Ｎ１細胞は、免疫並びに疾患症状の予防及びウイルス複製の減少と相関する抗体誘導を媒介した。したがって、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］は、感染性疾患に対する有効なワクチンの迅速な開発のための能力を示した。
【0099】
少なくともこれらの理由のために、企図されるワクチン組成物は、アデノウイルスベクターに基づく場合、組換えｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォームを使用して、ヒトでの治療的使用のための組換え核酸を生成することが一般に好ましい。
【実施例】
【0100】
実施例１：選択されたｈＡｄ５ワクチンコンストラクト及び結果
構築及び試験されたコンストラクト、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓ／Ｎ）タンパク質インサートを有するｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンコンストラクトＥ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－ｈＡｄ５ベクターが本明細書に開示される（図２６）。このコンストラクトは、インビトロ発現（図２７）及び小動物免疫原性を含む前臨床実験において試験された。複数のＣＯＶＩＤ－１９コンストラクトは、ＲＢＤ単独、Ｓ１単独、Ｓ１融合タンパク質、並びにＲＢＤ、Ｓ１及びＳ１融合物とＮとの組み合わせを含む。予備的なインビトロ研究は、これらのコンストラクト（図２８）が回復期血清抗体を認識し、代替ワクチンとして機能し得ることを実証する。
構築及び試験されたコンストラクト、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓ／Ｎ）タンパク質インサートを有するｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンコンストラクトＥ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－ｈＡｄ５ベクターが本明細書に開示される（図２６）。このコンストラクトは、インビトロ発現（図２７）及び小動物免疫原性を含む前臨床実験において試験された。複数のＣＯＶＩＤ－１９コンストラクトは、ＲＢＤ単独、Ｓ１単独、Ｓ１融合タンパク質、並びにＲＢＤ、Ｓ１及びＳ１融合物とＮとの組み合わせを含む。予備的なインビトロ研究は、これらのコンストラクト（図２８）が回復期血清抗体を認識し、代替ワクチンとして機能し得ることを実証する。
【0101】
ＣＯＶＩＤ－１９のためのｈＡｄ５コンストラクトにおけるヌクレオカプシド（Ｎ）の包含の理論的根拠：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質は、高度に保存され、高度に発現される。ＳＡＲＳを引き起こす関連コロナウイルスに関する以前の研究は、Ｎタンパク質が細胞内輸送コンストラクトと一体化された場合、免疫原性であることを実証した。今日まで、開発における全てのワクチン戦略は、スパイク（Ｓ）タンパク質に対する免疫原性の開発を含む。しかしながら、ＣＯＶＩＤ－１９から回復した患者における非常に最近の証拠は、ヌクレオカプシド（Ｎ）に対して生じたＴｈ１免疫を実証している。さらなる報告は、予測バイオインフォマティクスモデルにおいて、Ｔ及びＢ細胞エピトープがスパイク糖タンパク質及び核タンパク質の両方について最高であることをさらに確認した。本開示は、ＳをＮと組み合わせることによって、Ｔｈ１表現型を有する長期細胞媒介免疫が誘導され得ることを確認する。実際、Ｓにおける突然変異及び構造Ｎタンパク質がコロナウイルスファミリーにおいて高度に保存されているという知見に照らして、この組み合わせワクチンが長期の「普遍的」ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンとして役立つ有意な可能性が存在する。
【0102】
実施例２：免疫原性試験（小動物モデル）：
ＢＡＬＢ－ｃマウスにおける相同プライムブースト免疫原性。マウスを１、２又は３用量のｈＡｄ５ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンで処置し、血清及び脾細胞サンプルをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的免疫応答について試験する。血清をＥＬＩＳＡによって抗スパイク及び抗ヌクレオカプシド抗体応答について試験する。脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴ及び細胞内サイトカインシミュレーションアッセイによって、スパイク及びヌクレオカプシド特異的細胞媒介免疫応答について試験する。
ＢＡＬＢ－ｃマウスにおける相同プライムブースト免疫原性。マウスを１、２又は３用量のｈＡｄ５ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンで処置し、血清及び脾細胞サンプルをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的免疫応答について試験する。血清をＥＬＩＳＡによって抗スパイク及び抗ヌクレオカプシド抗体応答について試験する。脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴ及び細胞内サイトカインシミュレーションアッセイによって、スパイク及びヌクレオカプシド特異的細胞媒介免疫応答について試験する。
【0103】
結果は、有望な免疫原性活性を示す。一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド＋増強Ｔ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）を含むワクチンであるｈＡｄ５［Ｅ１－，Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］Ｎ－ＥＴＳＤは、ヌクレオカプシドに対するＴ細胞応答を変化させる。マウスを１０１０ＶＰの用量で７日間隔で２回皮下（ＳＣ）免疫した。いくつかの時点で血液を収集し、免疫原性実験を実施するために、屠殺時に脾臓を収集した。脾細胞を単離し、細胞媒介免疫（ＣＭＩ）応答について試験した。結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗原特異的ＣＭＩ応答がｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］Ｎ－ＥＴＳＤワクチンで免疫した全てのマウスの脾臓においてＥＬＩＳｐｏｔ及びフローサイトメトリー分析によって検出されるが、ベクター対照（ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ヌル）で免疫されたマウスでは検出されないことを示した。さらに、抗体応答は、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］－Ｎ－ＥＴＳＤワクチンで免疫した全てのマウスで検出されたが、ベクター対照（Ａｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］－ヌル）で免疫したマウスでは検出されなかった（図２９及び図３０）。
【0104】
実施例３：ＲＢＤ細胞表面発現の増強：
Ｓと組み合わせた場合のＮの潜在的な増強免疫原性値のさらなる証拠は、図３１に見られるように、Ｎ－ＥＴＳＤ＋Ｓコンストラクトでトランスフェクトされた２９３細胞におけるＲＢＤタンパク質の増強された表面発現の驚くべき発見であった。ＲＢＤの発現及び提示は、ＣＯＶＩＤ－１９感染から回復した試験対象の全ての個体において、強力な抗ウイルス活性を有する稀ではあるが再発するＲＢＤ特異的抗体が見出されることを示した他者による最近の報告によって証明されているように、非常に重要であると思われる。ＮがＳ－融合物と組み合わされた場合のＲＢＤの発現増強のこの知見は、ＣＯＶＩＤ－１９感染から回復した患者からの血漿を用いた研究において裏付けられた（図３２）。ＲＢＤ－ＥＴＳＤの代替コンストラクトは、代替ワクチンとして役立ち得る。
Ｓと組み合わせた場合のＮの潜在的な増強免疫原性値のさらなる証拠は、図３１に見られるように、Ｎ－ＥＴＳＤ＋Ｓコンストラクトでトランスフェクトされた２９３細胞におけるＲＢＤタンパク質の増強された表面発現の驚くべき発見であった。ＲＢＤの発現及び提示は、ＣＯＶＩＤ－１９感染から回復した試験対象の全ての個体において、強力な抗ウイルス活性を有する稀ではあるが再発するＲＢＤ特異的抗体が見出されることを示した他者による最近の報告によって証明されているように、非常に重要であると思われる。ＮがＳ－融合物と組み合わされた場合のＲＢＤの発現増強のこの知見は、ＣＯＶＩＤ－１９感染から回復した患者からの血漿を用いた研究において裏付けられた（図３２）。ＲＢＤ－ＥＴＳＤの代替コンストラクトは、代替ワクチンとして役立ち得る。
【0105】
要約すると、Ｓ融合物及びＳ融合物＋ＮコンストラクトによるＲＢＤタンパク質の発現及び曝露の増強に基づいて、両方をｈＡｄ５ベクターにおいて試験した。さらに、ＣＯＶＩＤ－１９から回復した患者からの最近の臨床データ、並びにＮコンストラクトが長期間持続するＣＤ４＋及びＴｈ１細胞媒介免疫を誘導するという裏付けとなる前臨床データに基づいて、Ｓ融合物＋Ｎコンストラクトのこの組み合わせは、短期中和抗体を超える長期間持続する免疫を提供し得る。
【0106】
実施例４：候補ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンコンストラクトの免疫原性試験
２つのアデノウイルスベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンコンストラクトを、インビトロ発現；小動物免疫原性、並びに非ヒト霊長類免疫原性及び有効性を含む前臨床実験において試験する。
２つのアデノウイルスベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンコンストラクトを、インビトロ発現；小動物免疫原性、並びに非ヒト霊長類免疫原性及び有効性を含む前臨床実験において試験する。
【0107】
コンストラクトの説明：２つの第２世代ｈＡｄ５ベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンコンストラクトを評価した。第１は、スパイクタンパク質インサートを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有するｈＡｄ５ベクターである（図２６参照）。第２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型スパイクタンパク質（Ｓ）インサート、及び同じベクター骨格中にエンドソーム標的化ドメイン配列（ＥＴＳＤ）を含むヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）インサートを有するＥ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３ｈＡｄ５ベクターである。
【0108】
免疫原性研究：マウスにおける相同プライム－ブースト免疫原性を、図２６に列挙したアデノウイルスワクチン候補の１、２又は３用量でマウスを処置することによって試験し、血清及び脾細胞サンプルをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的免疫応答について試験する。血清は、ＥＬＩＳＡによって抗スパイク及び抗ヌクレオカプシド抗体応答について試験されている。脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴ及び細胞内サイトカインシミュレーションアッセイによって、スパイク及びヌクレオカプシド特異的細胞媒介免疫応答について試験する。これらの研究からのデータは、本開示を通して開示される。
【0109】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス中和研究：上述した免疫原性研究の過程で免疫されたマウス由来の血清を使用し、それらのＡＢＳＬ－３施設で実施されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和研究のための試験研究室に送る。血清の様々な希釈物をＣＯＶＩＤ １９ウイルスと混合し、混合物をインキュベートし、次いで混合物をＶｅｒｏ細胞に曝露して細胞変性効果（ＣＰＥ）を検出することによって、ＣＯＶＩＤ １９ウイルス中和活性について血清を試験する。ＣＰＥを防止する最後の希釈は、終点中和力価とみなされる。
【0110】
非ヒト霊長類における免疫原性及び有効性評価：アカゲザルを、図２６に列挙したアデノウイルスワクチン候補の３用量で処置する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的免疫応答を、治療の過程を通して、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ及びＩＣＳによって血清及びＰＢＭＣにおいてモニターする。最終ワクチン接種の４週間後、動物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジし、疾患の特徴及びウイルスの排泄についてモニターする。
【0111】
実施例５：ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ＣｏＶ－２ワクチンの第Ｉｂ相臨床試験。
試験デザイン：これは、成人健康対象における第１ｂ相非盲検試験である。この臨床試験は、ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎワクチンの安全性、反応原性、及び免疫原性を評価するように設計されている。ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質を単独で、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質と一緒にコードするｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターベースの標的化ワクチンである。ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターは、これまで１２５人を超える癌患者において１用量当たり５×１０１１ウイルス粒子の高用量で安全性を実証している、標的ワクチンのためのプラットフォーム技術である。３つの異なるｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターベースのワクチンを同日に各々１用量当たり５×１０１１ウイルス粒子（１．５×１０１２の総ウイルス粒子）で同時投与することも安全であることが実証されている。
試験デザイン：これは、成人健康対象における第１ｂ相非盲検試験である。この臨床試験は、ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎワクチンの安全性、反応原性、及び免疫原性を評価するように設計されている。ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質を単独で、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質と一緒にコードするｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターベースの標的化ワクチンである。ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターは、これまで１２５人を超える癌患者において１用量当たり５×１０１１ウイルス粒子の高用量で安全性を実証している、標的ワクチンのためのプラットフォーム技術である。３つの異なるｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターベースのワクチンを同日に各々１用量当たり５×１０１１ウイルス粒子（１．５×１０１２の総ウイルス粒子）で同時投与することも安全であることが実証されている。
【0112】
ＣＯＶＩＤ－１９感染は、世界中の集団において著しい罹患率及び死亡率を引き起こす。ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎワクチンは、既存のアデノウイルス免疫を有する個体においてさえ、液性及び細胞性応答の両方を誘導するように設計される。したがって、ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎが健康な対象において抗ＣＯＶＩＤ－１９免疫を誘導し、ＣＯＶＩＤ－１９感染の健康への影響を予防又は低減する可能性が存在する。
【0113】
第１ｂ相安全性分析：第１ｂ相の最初の安全性分析では、合計４０人の健康な対象を４つの投与コホート（コホート１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ；各コホートについてｎ＝１０）に分ける：
・ コホート１Ａ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ ５×１０１０ウイルス粒子（ＶＰ）／用量（ｎ＝１０）、
・ コホート１Ｂ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ １×１０１１ＶＰ／用量（ｎ＝１０）、
・ コホート２Ａ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎ ５×１０１０ＶＰ／用量（ｎ＝１０）、
・ コホート２Ｂ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎ、１×１０１１ＶＰ／用量（ｎ＝１０）。
・ コホート１Ａ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ ５×１０１０ウイルス粒子（ＶＰ）／用量（ｎ＝１０）、
・ コホート１Ｂ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ １×１０１１ＶＰ／用量（ｎ＝１０）、
・ コホート２Ａ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎ ５×１０１０ＶＰ／用量（ｎ＝１０）、
・ コホート２Ｂ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎ、１×１０１１ＶＰ／用量（ｎ＝１０）。
【0114】
各対象は、１日目及び２２日目（即ち、２用量）にｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ又はｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎの皮下（ＳＣ）注射を受ける。この投与スケジュールは、現在臨床試験中のｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターベースのワクチンと一致する。コホート１～２は並行して登録され、治験薬の供給に応じて、同時に、又は時差的に開かれ得る。コホート１Ａ及び２Ａにおける対象は、最初に低用量ワクチン接種レジメンを完了する。コホート１Ａ及び２Ａの全ての対象が試験８日目までの毒性評価期間中に少なくとも単回投与及びフォローアップ評価を完了した後、治験依頼者及び治験とは無関係に、安全性審査委員会（ＳＲＣ）及び少なくとも１名の有資格の感染症医師が安全性の懸念がないことを確認した場合、登録を進める。次いで、対象を高用量コホート１Ｂ及び２Ｂに登録し、ワクチン接種する。全ての対象について、フォローアップ試験来院は、最終ワクチン接種後８、２２、２９、５２日目、並びに３、６、及び１２ヶ月目に行われる。安全性情報の追加フォローアップは、イベントのスケジュールに記載されているように、電話連絡により行われる。初期安全第１ｂ相の主な目的は、ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎワクチンの予備的安全性及び反応原性を評価することである。副次的目的は、ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎワクチンの長期安全性及び免疫原性を評価することである。
【0115】
実施例６：拡大第１ｂ相：コンストラクト選択のための安全性及び免疫原性
第１ｂ相の安全性評価からの安全性データのレビューに基づいて、ＳＲＣがそれを行うのに安全であると判断した場合、第１ｂ相の拡大に進む。第１ｂ相の拡大では、合計６０人の健康な対象を４つの投与コホート（コホート１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ；各コホートについてｎ＝１５）に分ける：
・ コホート１Ａ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ ５×１０１０ＶＰ／用量（ｎ＝１５）
・ コホート１Ｂ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ １×１０１１ＶＰ／用量（ｎ＝１５）
・ コホート２Ａ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎ ５×１０１０ＶＰ／用量（ｎ＝１５）
・ コホート２Ｂ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎ １×１０１１ＶＰ／用量（ｎ＝１５）
第１ｂ相の安全性評価からの安全性データのレビューに基づいて、ＳＲＣがそれを行うのに安全であると判断した場合、第１ｂ相の拡大に進む。第１ｂ相の拡大では、合計６０人の健康な対象を４つの投与コホート（コホート１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ；各コホートについてｎ＝１５）に分ける：
・ コホート１Ａ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ ５×１０１０ＶＰ／用量（ｎ＝１５）
・ コホート１Ｂ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ １×１０１１ＶＰ／用量（ｎ＝１５）
・ コホート２Ａ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎ ５×１０１０ＶＰ／用量（ｎ＝１５）
・ コホート２Ｂ － ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎ １×１０１１ＶＰ／用量（ｎ＝１５）
【0116】
各対象は、１日目及び２２日目（即ち、２用量）にｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ又はｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／ＮのＳＣ注射を受ける。全ての対象について、フォローアップ試験来院は、最終ワクチン接種後８、２２、２９、５２日目、並びに３、６、及び１２ヶ月目に行われる。安全性情報の追加フォローアップは、イベントのスケジュールに記載されているように、電話連絡により行われる。拡大第１ｂ相の主な目的は、ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎの間で最も免疫原性の高いコンストラクトと、液性及び細胞性免疫原性指数の変化によって決定される用量レベルとを選択することである。副次的目的は、ｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ及びｈＡｄ５－ＣＯＶＩＤ－１９－Ｓ／Ｎの安全性及び反応原性を評価することである。
【0117】
本開示の実施形態は、以下の実施例においてさらに説明される。実施例は単なる例示であり、特許請求される本発明の範囲を決して限定しない。
【0118】
実施例７：ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォーム及びコンストラクト
ここに示す実施例については、次世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターを使用して（図３３、パネルＣ）、ウイルスワクチン候補コンストラクトを作製した。図３３、パネルＤ～Ｈに示すように、多様なコンストラクトが作製された：図３３、パネルＤ：Ｓ ＷＴ：１２７３個のアミノ酸及び全てのＳドメインを含むＳタンパク質：細胞外（１～１２１３）、膜貫通（１２１４～１２３４）、及び細胞質（１２３５～１２７３）（Ｕｎｉｔｐｒｏｔ Ｐ０ＤＴＣ２）；図３３、パネルＥ：Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ：増強Ｔ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）を有するＳ受容体結合ドメイン；図３３、パネルＦ：Ｓ融合物：ＲＢＤの表面発現及び表示を増強するために最適化されたＳ；図３３、パネルＧ：Ｎ－ＥＴＳＤ：ＥＴＳＤを有するヌクレオカプシド（Ｎ）配列；並びに図３３、パネルＨ：二価Ｓ融合物＋Ｎ－ＥＴＳＤ；Ｓ－ＷＴ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ及びＳ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトも作製されたが、示されていない。
ここに示す実施例については、次世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターを使用して（図３３、パネルＣ）、ウイルスワクチン候補コンストラクトを作製した。図３３、パネルＤ～Ｈに示すように、多様なコンストラクトが作製された：図３３、パネルＤ：Ｓ ＷＴ：１２７３個のアミノ酸及び全てのＳドメインを含むＳタンパク質：細胞外（１～１２１３）、膜貫通（１２１４～１２３４）、及び細胞質（１２３５～１２７３）（Ｕｎｉｔｐｒｏｔ Ｐ０ＤＴＣ２）；図３３、パネルＥ：Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ：増強Ｔ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）を有するＳ受容体結合ドメイン；図３３、パネルＦ：Ｓ融合物：ＲＢＤの表面発現及び表示を増強するために最適化されたＳ；図３３、パネルＧ：Ｎ－ＥＴＳＤ：ＥＴＳＤを有するヌクレオカプシド（Ｎ）配列；並びに図３３、パネルＨ：二価Ｓ融合物＋Ｎ－ＥＴＳＤ；Ｓ－ＷＴ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ及びＳ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトも作製されたが、示されていない。
【0119】
実施例８：Ａｄ５ Ｓ融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤを用いたトランスフェクション後のＲＢＤのＨＥＫ ２９３Ｔ細胞表面表現の増強
図３４に示すように、抗ＲＢＤ特異的抗体は、ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ（図３４、パネルＡ）又はｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ（図９ｂ）コンストラクトでトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の表面上にＲＢＤを検出せず、一方、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物のみがわずかに高かった（図３４、パネルＥ）。予想通り、ＲＢＤ、ｈＡｄ５ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ及びＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤを有する両方のコンストラクトは、抗ＲＢＤ抗体の高い結合を示した（図３４、パネルＣ及びＤ）。特に、ＲＢＤの高い細胞表面発現は、二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤでのトランスフェクション後に検出された（図３４、パネルＦ）。これらの知見は、適切なフォールディングを有する全長の最適化されたＳとＮの両方によって提供される多数の多様な抗原を含有するｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトがワクチンコンストラクトにおけるＲＢＤの発現及び細胞表面表示の増強をもたらすという提案を支持する。
図３４に示すように、抗ＲＢＤ特異的抗体は、ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ（図３４、パネルＡ）又はｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ（図９ｂ）コンストラクトでトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の表面上にＲＢＤを検出せず、一方、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物のみがわずかに高かった（図３４、パネルＥ）。予想通り、ＲＢＤ、ｈＡｄ５ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ及びＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤを有する両方のコンストラクトは、抗ＲＢＤ抗体の高い結合を示した（図３４、パネルＣ及びＤ）。特に、ＲＢＤの高い細胞表面発現は、二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤでのトランスフェクション後に検出された（図３４、パネルＦ）。これらの知見は、適切なフォールディングを有する全長の最適化されたＳとＮの両方によって提供される多数の多様な抗原を含有するｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトがワクチンコンストラクトにおけるＲＢＤの発現及び細胞表面表示の増強をもたらすという提案を支持する。
【0120】
実施例９：Ｓ発現の増強とｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤとの免疫ブロット相関
Ｓ発現の免疫ブロット分析は、Ｓ発現の増強と相関し（図３５）、二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトがＳ－融合物単独と比較してＳの発現を増強することを再び示す。図３５は、Ｓ発現の免疫ブロット分析を示す。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における（ａ）ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ－融合物、及び（ｃ）Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤを用いた細胞表面ＲＢＤ発現は、抗全長（Ｓ２）抗体を用いてプローブされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞溶解物の免疫ブロットにおけるＳの発現（ｄ）と高い相関を示した。Ｙ軸スケールは、モードに正規化されている（ＮＭ）。
Ｓ発現の免疫ブロット分析は、Ｓ発現の増強と相関し（図３５）、二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトがＳ－融合物単独と比較してＳの発現を増強することを再び示す。図３５は、Ｓ発現の免疫ブロット分析を示す。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における（ａ）ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ－融合物、及び（ｃ）Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤを用いた細胞表面ＲＢＤ発現は、抗全長（Ｓ２）抗体を用いてプローブされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞溶解物の免疫ブロットにおけるＳの発現（ｄ）と高い相関を示した。Ｙ軸スケールは、モードに正規化されている（ＮＭ）。
【0121】
実施例１０：ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤトランスフェクション後の増強表面ＲＢＤのネイティブフォールディングの確認
組換えＡＣＥ２－Ｆｃの結合の決定を行って、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋Ｎ－ＥＴＳＤワクチン候補からの発現後のＳ ＲＢＤの天然の生理学的に関連するフォールディングを確認した。Ｓ ＲＢＤは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の経過中にＡＣＥ２に結合し、有効な中和抗体は、この相互作用、ひいては感染を防止する。このような中和抗体は、正しいコンフォメーションで提示されたＳに応答して産生された場合、より効果的である可能性が高い。細胞表面発現の増強に加えて、最適化されたＳは、適切なタンパク質フォールディングを可能にする。ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ又はｈＡｄ５ Ｓ－融合物のいずれかと比較して（各々図３６、パネルＡ及びＢ）、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤから発現されるＳ ＲＢＤへのＡＣＥ２－Ｆｃ結合が明らかに増強されたことが見出された（図３６、パネルＣ）。同じ実験で行った抗ＲＢＤ抗体結合試験（図３６、パネルＦ～Ｊ）は、ＡＣＥ２－Ｆｃ結合によって示される増強された表面発現所見を確認した。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン候補は、中和抗体の産生に重要である立体配座的に正確で増強されたＳ ＲＢＤ発現のこれらの知見に基づいて、臨床試験のために選択された。
組換えＡＣＥ２－Ｆｃの結合の決定を行って、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋Ｎ－ＥＴＳＤワクチン候補からの発現後のＳ ＲＢＤの天然の生理学的に関連するフォールディングを確認した。Ｓ ＲＢＤは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の経過中にＡＣＥ２に結合し、有効な中和抗体は、この相互作用、ひいては感染を防止する。このような中和抗体は、正しいコンフォメーションで提示されたＳに応答して産生された場合、より効果的である可能性が高い。細胞表面発現の増強に加えて、最適化されたＳは、適切なタンパク質フォールディングを可能にする。ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ又はｈＡｄ５ Ｓ－融合物のいずれかと比較して（各々図３６、パネルＡ及びＢ）、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤから発現されるＳ ＲＢＤへのＡＣＥ２－Ｆｃ結合が明らかに増強されたことが見出された（図３６、パネルＣ）。同じ実験で行った抗ＲＢＤ抗体結合試験（図３６、パネルＦ～Ｊ）は、ＡＣＥ２－Ｆｃ結合によって示される増強された表面発現所見を確認した。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン候補は、中和抗体の産生に重要である立体配座的に正確で増強されたＳ ＲＢＤ発現のこれらの知見に基づいて、臨床試験のために選択された。
【0122】
実施例１１：ｈＡｄ５ Ｎ－ＥＴＳＤは、Ｎをエンドソーム／リソソームコンパートメントに首尾よく導く
ＥＴＳＤ設計は、Ｎをエンドソームの細胞内コンパートメントに首尾よく転座させた。Ｎ－ＥＴＳＤによるＨｅＬａ細胞の感染後、Ｎは、図３７、パネルＣに示すように、エンドソームマーカー４５トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）と共局在化し、また、リソソームマーカーＬａｍｐ１と共局在化し（図３７、パネルＤ）、Ｎ－ＥＴＳＤは、エンドソーム経路を通してリソソームに転座し、ＭＨＣ ＩＩ提示のためのプロセシングを可能にすることを実証する。Ｎ－ＥＴＳＤと比較して、Ｎ－野生型（Ｎ－ＷＴ）は、拡散した細胞質分布を示し、リソソームマーカーと共局在化しない（図３７、パネルＥ）。これらの知見は、ＮによるＭＨＣ ＩＩ提示の増加及びＣＤ４＋活性化をもたらす、Ｎをエンドソーム／リソソームコンパートメントに導く際のＥＴＳＤの役割を確認する。
ＥＴＳＤ設計は、Ｎをエンドソームの細胞内コンパートメントに首尾よく転座させた。Ｎ－ＥＴＳＤによるＨｅＬａ細胞の感染後、Ｎは、図３７、パネルＣに示すように、エンドソームマーカー４５トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）と共局在化し、また、リソソームマーカーＬａｍｐ１と共局在化し（図３７、パネルＤ）、Ｎ－ＥＴＳＤは、エンドソーム経路を通してリソソームに転座し、ＭＨＣ ＩＩ提示のためのプロセシングを可能にすることを実証する。Ｎ－ＥＴＳＤと比較して、Ｎ－野生型（Ｎ－ＷＴ）は、拡散した細胞質分布を示し、リソソームマーカーと共局在化しない（図３７、パネルＥ）。これらの知見は、ＮによるＭＨＣ ＩＩ提示の増加及びＣＤ４＋活性化をもたらす、Ｎをエンドソーム／リソソームコンパートメントに導く際のＥＴＳＤの役割を確認する。
【0123】
実施例１２：インビボｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン免疫原性試験
Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤが、生理学的に関連するＲＢＤの発現の増強をもたらし、Ｎ－ＥＴＳＤがエンドソーム／リソソームコンパートメントに首尾よく転座したという証拠に基づいて、二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンを７週齢の雌ＣＤ－１マウスの接種のために選択した。このコンストラクトの独特の特性は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞応答及び中和抗体の両方の生成をもたらす。方法に記載されるように、マウスは０日目に初回注射を受け、２１日目に２回目の注射を受けた。抗体及び中和分析のために、血清を０日目及び２８日目の試験の終わりに収集した。脾細胞も、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びＥＬＩＳｐｏｔ分析のために２８日目に収集した。試験に割り付けられた全ての年齢及び性別をマッチさせた動物は、部位反応を有さず、投与全体を通して体重の減少が見られず、正常であると思われ、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォームでの以前の観察と一致した
Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤが、生理学的に関連するＲＢＤの発現の増強をもたらし、Ｎ－ＥＴＳＤがエンドソーム／リソソームコンパートメントに首尾よく転座したという証拠に基づいて、二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンを７週齢の雌ＣＤ－１マウスの接種のために選択した。このコンストラクトの独特の特性は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞応答及び中和抗体の両方の生成をもたらす。方法に記載されるように、マウスは０日目に初回注射を受け、２１日目に２回目の注射を受けた。抗体及び中和分析のために、血清を０日目及び２８日目の試験の終わりに収集した。脾細胞も、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びＥＬＩＳｐｏｔ分析のために２８日目に収集した。試験に割り付けられた全ての年齢及び性別をマッチさせた動物は、部位反応を有さず、投与全体を通して体重の減少が見られず、正常であると思われ、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォームでの以前の観察と一致した
【0124】
実施例１３：ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤは、ＣＤ８β＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の両方を生じる
Ｓ及びＮの両方によるＣＤ８＋活性化：Ｓペプチドプール１（ＲＢＤ及びＳ１を含有する）に曝露されたｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種マウス由来のＣＤ８β＋脾細胞は、ｈＡｄ５ヌルマウスと比較して有意に高いＩＦＮ－γ発現を示し（図３８、パネルＡ）；これらのマウス由来の脾細胞はまた、Ｎペプチドプールに応答して細胞内ＩＦＮ－γを発現した。ＣＤ８β＋脾細胞からの同時ＩＦＮ－γ／ＴＮＦ－α発現の評価（図３８、パネルＣ）は、ＩＦＮ－γ発現単独についてのものを反映した。これらの結果は、Ｓ及びＮの両方がＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化することを示す。
Ｓ及びＮの両方によるＣＤ８＋活性化：Ｓペプチドプール１（ＲＢＤ及びＳ１を含有する）に曝露されたｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種マウス由来のＣＤ８β＋脾細胞は、ｈＡｄ５ヌルマウスと比較して有意に高いＩＦＮ－γ発現を示し（図３８、パネルＡ）；これらのマウス由来の脾細胞はまた、Ｎペプチドプールに応答して細胞内ＩＦＮ－γを発現した。ＣＤ８β＋脾細胞からの同時ＩＦＮ－γ／ＴＮＦ－α発現の評価（図３８、パネルＣ）は、ＩＦＮ－γ発現単独についてのものを反映した。これらの結果は、Ｓ及びＮの両方がＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化することを示す。
【0125】
ＮによるＣＤ４＋活性化：ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞の死滅を媒介するが、持続的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性にはＣＤ４＋ Ｔ細胞が必要である。したがって、ワクチン接種した動物におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞を評価した。ＣＤ８β＋脾細胞とは対照的に、Ｎペプチドプールのみが、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ接種マウス由来のＣＤ４＋脾細胞を刺激して、ＩＦＮ－γ（図３８、パネルＢ）又はＩＦＮ－γ／ＴＮＦ－α（図３８、パネルＤ）を、ｈＡｄ５ヌル対照よりも実質的に高いレベルで発現させた。ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答のＮによる寄与は、候補ワクチンに対する有効な免疫応答に不可欠である。
【0126】
実施例１４：ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤは、Ｓ抗原及びＮ抗原の両方に対する抗体応答を生じる
現在開発中のコロナウイルスワクチンの主な目的は、スパイクに対する中和抗体である。二価ワクチンをワクチン接種したマウスでは、試験の２８日目にｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤをワクチン接種したＣＤ－１マウス由来の血清において、抗Ｓ（図３９、パネルＡ）及び抗Ｎ（図３９、パネルＣ）抗体の両方の有意な産生があった。抗Ｓ抗体と比較して、抗Ｎ抗体は、血清の希釈係数が抗Ｎ抗体分析について１：９０であり、抗Ｓ抗体分析について１：３０であるとすると、血清中でより高かった。
現在開発中のコロナウイルスワクチンの主な目的は、スパイクに対する中和抗体である。二価ワクチンをワクチン接種したマウスでは、試験の２８日目にｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤをワクチン接種したＣＤ－１マウス由来の血清において、抗Ｓ（図３９、パネルＡ）及び抗Ｎ（図３９、パネルＣ）抗体の両方の有意な産生があった。抗Ｓ抗体と比較して、抗Ｎ抗体は、血清の希釈係数が抗Ｎ抗体分析について１：９０であり、抗Ｓ抗体分析について１：３０であるとすると、血清中でより高かった。
【0127】
ＩｇＧの検量線を作成し、次いで、吸光度値を、抗Ｓ及び抗Ｎ抗体の両方についての質量当量に変換した（図３９、パネルＢ及びＤ）。これらの値を使用して、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ ＮＥＴＳＤワクチン接種が血清１ｍＬ当たり５．８μｇのＳ特異的ＩｇＧ及び４２μｇのＮ特異的ＩｇＧの幾何平均値を生じ、したがって抗Ｎ抗体の相対μｇ量が抗Ｓ抗体のそれよりも高く、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体産生に対するＮの強い寄与を反映することを計算した。
【0128】
実施例１５：ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンは、ｃＰａｓｓ及び生ウイルス中和アッセイの両方によって評価されるように、強力な中和抗体を生成する
中和抗体活性を、無細胞アッセイ（ｃＰａｓｓ）及びインビトロでの生ウイルス感染を用いて評価した。図４０、パネルＡに見られるように、ｃＰａｓｓアッセイは、１：２０及び１：６０の両方の希釈で、全てのマウスについてＳ ＲＢＤ：ＡＣＥ２結合の阻害、及び２匹のマウスについて約１００％阻害を示した。ベロＥ６中和アッセイの結果を、ＥＬＩＳＡによってＳ特異的抗体を示した４匹のマウスについて示す。高い希釈係数でさえ見られた高い持続的中和は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンによる二価多抗原多エピトープ生成が、ＲＢＤ－ＡＣＥ２結合に関連するものに加えて、エピトープで中和免疫応答の相乗作用をもたらし得るという興味深い可能性を示唆する（図４０、パネルＢ）。図４０、パネルＢに見られるように、５０％中和（ＩＣ５０）の値は、Ｓ特異的抗体を示したマウス由来の血清のＧ４プールについて１：１０，０００血清希釈で存在し、１：１，０００希釈の回復期血清より１０倍高い。２つのアッセイによって確認された強力な中和は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ ＥＴＳＤワクチン候補の予測される有効性及び臨床試験へのその進展を支持する。
中和抗体活性を、無細胞アッセイ（ｃＰａｓｓ）及びインビトロでの生ウイルス感染を用いて評価した。図４０、パネルＡに見られるように、ｃＰａｓｓアッセイは、１：２０及び１：６０の両方の希釈で、全てのマウスについてＳ ＲＢＤ：ＡＣＥ２結合の阻害、及び２匹のマウスについて約１００％阻害を示した。ベロＥ６中和アッセイの結果を、ＥＬＩＳＡによってＳ特異的抗体を示した４匹のマウスについて示す。高い希釈係数でさえ見られた高い持続的中和は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンによる二価多抗原多エピトープ生成が、ＲＢＤ－ＡＣＥ２結合に関連するものに加えて、エピトープで中和免疫応答の相乗作用をもたらし得るという興味深い可能性を示唆する（図４０、パネルＢ）。図４０、パネルＢに見られるように、５０％中和（ＩＣ５０）の値は、Ｓ特異的抗体を示したマウス由来の血清のＧ４プールについて１：１０，０００血清希釈で存在し、１：１，０００希釈の回復期血清より１０倍高い。２つのアッセイによって確認された強力な中和は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ ＥＴＳＤワクチン候補の予測される有効性及び臨床試験へのその進展を支持する。
【0129】
実施例１６：ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤは、液性免疫及びＴ細胞免疫の両方においてＴｈ１優位応答を生成する
Ｎ及びＳに応答した抗体Ｔｈ１優位：ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３は、Ｔｈ１優位を表し；一方、ＩｇＧ１は、Ｔｈ２優位を表す。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種マウス由来の血清中の抗Ｓ（図４１、パネルＡ）及び抗Ｎ（図４１、パネルＣ）抗体の両方について、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂアイソタイプは、ｈＡｄ５ ヌル対照と比較して優勢（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）であり、有意に高かった。これらのデータは、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンに応答した抗体産生のＴｈ１優位を示す。
Ｎ及びＳに応答した抗体Ｔｈ１優位：ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３は、Ｔｈ１優位を表し；一方、ＩｇＧ１は、Ｔｈ２優位を表す。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種マウス由来の血清中の抗Ｓ（図４１、パネルＡ）及び抗Ｎ（図４１、パネルＣ）抗体の両方について、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂアイソタイプは、ｈＡｄ５ ヌル対照と比較して優勢（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）であり、有意に高かった。これらのデータは、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンに応答した抗体産生のＴｈ１優位を示す。
【0130】
Ｎ及びＳに応答したＴ細胞Ｔｈ１優位：ＩＦＮ－γ産生は、ＣＴＬ活性４７（Ｔｈ１優位）と相関するが、ＩＬ－４は、遅延ウイルスクリアランス４８（Ｔｈ２優位）を引き起こす。１のＩＬ－４に対するＩＦＮ－γの比は、バランスがとれており、１を超える比はＴｈ１優位を示す。二価Ｓ＋Ｎワクチンで免疫した動物由来のＥＬＩＳｐｏｔは、ＩＦＮ－γ分泌がＳペプチドプール１及びＮペプチドプールの両方に応答して、ｈＡｄ５ヌル脾細胞よりもｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤについて有意に高いことを示したが（図４２、パネルＡ）、ＩＬ－４は、Ｎペプチドプールのみに応答して、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤについて有意に高いレベルで分泌された（図４２、パネルＢ）。
【0131】
Ｔｈ１タイプ優勢はまた、組み合わされたＳペプチドプール及びＮペプチドプールに応答するスポット形成単位に基づくＩＬ－４に対するＩＦＮ－γの比を考慮した場合にも見られる（図４３、パネルＡ）。Ｔｈ１優勢は液性応答において再度見られ、抗Ｓ及び抗Ｎ抗体の両方についてのＴｈ２関連抗体（ＩｇＧ１）に対するＴｈ１関連抗体（ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）のｎｇ当量に基づく比が全てのマウスにおいて１よりも大きい（図４３、パネルＢ）。
【0132】
ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン候補のこのＴｈ１優位プロファイルは、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤが臨床試験のリード候補となるさらなる正当性を提供する。
【0133】
ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンは、Ｓのみのワクチンのリスクを克服し、Ｔ細胞免疫及び中和抗体の両方を誘発するように設計されており、Ｔ細胞が長期持続性抗体応答の生成及び感染細胞の直接殺傷において果たす重要な役割を活用している。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、両方とも多機能性であり、ワクチンによるそのような多機能性Ｔ細胞の誘導は、感染に対するより良好な防御と相関した。表面表示のために最適化されたＳ抗原及びエンドソーム／リソソーム細胞内コンパートメント局在化のために最適化されたＮ抗原の発現、ひいてはＭＨＣ Ｉ及びＩＩ提示から生じる増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答及びＴｈ１優勢は、樹状細胞提示の増加、交差提示、Ｂ細胞活性化、及び最終的に高い中和能力をもたらした。さらに、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種マウスからのプールされた血清について見られた高希釈での強力な中和能力は、Ｓ抗原及びＮ抗原の両方に応答して生成された抗体のＴｈ１優位と組み合わさって、このワクチン設計の目的を支持する。
【0134】
抗原提示細胞による抗原の同時ＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ提示は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を同時に活性化し、記憶Ｂ及びＴ細胞の生成に最適である。コンストラクトの重要な発見は、Ｎ－ＥＴＳＤがエンドソーム／リソソームコンパートメントに導かれることである。Ｎ－ＥＴＳＤは、Ｂ細胞抗体産生のための記憶Ｔ細胞及びヘルパー細胞の誘導の必要性であるＣＤ４＋応答を誘発する。天然のＮ．５０、５１と比較して、最も強いＴ細胞ＩＦＮ－γ及びＣＴＬ応答を誘発するためのリソソーム局在化の重要性についても報告されている
【0135】
ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤによって発現されたＳ及びＮ抗原に対するＴ細胞応答は、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－ａを含むポリサイトカインであり、細菌及びウイルス感染における抗菌免疫の成功と一致していた。ワクチン接種後のポリサイトカインＴ細胞応答は、ウイルスベクターによるものを含むワクチン効力と相関することが示されている。ここで高く関連することは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質に対するポリサイトカインＴ細胞応答が、回復したＣＯＶＩＤ－１９患者と一致しており、二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するより大きな防御をワクチン対象に提供することを示唆している。
【0136】
Ｎとは対照的に、Ｓタンパク質は、ここではＳ融合として発現され、高いＡＣＥ２－Ｆｃ結合によって証明されるように、ＲＢＤ細胞表面発現及びコンフォメーション完全性の増強が確認され、主にＣＤ８＋ Ｔ細胞を生成した。本発明者らの結果は、ワクチン設計目標を確認し、Ｓ－融合物がＳ－ＷＴと比較してＳに対する抗原特異的Ｔ細胞応答のレベルの上昇を誘導したことを示した。ＭＨＣ Ｉ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化のため）及びＭＨＣ ＩＩ（ＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化のため）の両方へのＭＨＣ提示を確実にするために、この協調した応答を生じるように最適化されたＳ及びＮ抗原の両方をワクチン接種することが必要である。
【0137】
生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる中和データは、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤによるワクチン接種後に生じた抗体応答の効力を実証し、高い希釈係数であっても高い中和の証拠を有した。さらに、プールされた血清の顕著な相乗効果が明らかであり、≧１：１，０００希釈の対照回復期血清よりもさらに強力な中和を有した。
【0138】
上述したｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトは、次世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォームによって送達され、ここでＥ２ｂ欠失（ｐｏｌ）単独が、延長された導入遺伝子産生を可能にし、既存のアデノウイルス免疫の存在下で相同ワクチン接種（プライム及びブースト製剤は同じである）を可能にする。３８。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤの皮下注射による細胞性及び液性免疫の生成に加えて、経口又は舌下製剤中の同じワクチンはまた、ＩｇＡ粘膜免疫を誘導し得る。
【0139】
実施例１７：方法及びコンストラクト
ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォーム及びコンストラクト
本明細書における試験のために、第２世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターを使用して（図４４、パネルＡ）、ウイルスワクチン候補コンストラクトを作製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原発現インサート及びウイルス粒子を含有するｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］骨格を、以前に記載されたように作製した。簡単に述べると、Ｅ１－及びＥ２ｂ－発現Ｅ．Ｃ７パッケージング細胞株における連続増殖、続いてＣｓＣｌ２精製、及びＶｉｒａＱｕｅｓｔ Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ、ＩＡ）による保存緩衝液（２．５％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８、２５ｍＭ ＮａＣｌ）への透析によって、高力価アデノウイルスストックを作製した。ドデシル硫酸ナトリウム破壊と２６０及び２８０ｎｍでの分光光度法によってウイルス粒子数を決定し、Ａｄｅｎｏ－Ｘ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用してウイルス力価を決定した。作製されたコンストラクトは、以下を含んでいた：
ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォーム及びコンストラクト
本明細書における試験のために、第２世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターを使用して（図４４、パネルＡ）、ウイルスワクチン候補コンストラクトを作製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原発現インサート及びウイルス粒子を含有するｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］骨格を、以前に記載されたように作製した。簡単に述べると、Ｅ１－及びＥ２ｂ－発現Ｅ．Ｃ７パッケージング細胞株における連続増殖、続いてＣｓＣｌ２精製、及びＶｉｒａＱｕｅｓｔ Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ、ＩＡ）による保存緩衝液（２．５％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８、２５ｍＭ ＮａＣｌ）への透析によって、高力価アデノウイルスストックを作製した。ドデシル硫酸ナトリウム破壊と２６０及び２８０ｎｍでの分光光度法によってウイルス粒子数を決定し、Ａｄｅｎｏ－Ｘ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用してウイルス力価を決定した。作製されたコンストラクトは、以下を含んでいた：
【0140】
Ｓ－ＷＴ：１２７３個のアミノ酸及び全てのＳドメインを含むＳタンパク質：細胞外（１～１２１３）、膜貫通（１２１４～１２３４）、及び細胞質（１２３５～１２７３）（Ｕｎｉｔｐｒｏｔ Ｐ０ＤＴＣ２）；Ｓ－ＥＴＳＤ：ＥＴＳＤを有するＳ受容体結合ドメイン（Ｓ ＲＢＤ）（配列番号１１）；Ｎ－ＥＴＳＤ：ＥＴＳＤを有するヌクレオカプシド（Ｎ）；Ｓ－ＷＴ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ：増強Ｔ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）を有するＳ－ＷＴ；Ｓ－ＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ；Ｓ－融合物：ＲＢＤの表面発現及び表示を増強するように最適化されたＳ；並びに二価Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ；
【0141】
ｈＡｄ５コンストラクトによるＨＥＫ ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
ワクチン候補コンストラクトによるＲＢＤエピトープの表面表現を決定するために、本発明者らは、ｈＡｄ５コンストラクトＤＮＡによりＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、抗ＲＢＤ抗体を用いたフローサイトメトリー検出により、表面ＲＢＤを定量化した。試験した７つのコンストラクトが存在した：Ｓ－ＷＴ、Ｓ－ＷＴ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ、Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、Ｓ－融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、及びＮ－ＥＴＳＤ。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（２４ウェルプレート中２．５×１０５細胞／ウェル）を、１０％ ＦＢＳ及び１Ｘ ＰＳＡ（１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５ｕｇ／ｍＬアンホテリシンＢ）を有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １１９９５－０６５）中で３７℃で成長させた。製造業者の説明書にしたがって、ＪｅｔＰｒｉｍｅトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓカタログ＃ ８９１２９－９２４）を用いて、０．５μｇのｈＡｄ５プラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１、２、３、及び７日後に、細胞を培地中に穏やかにピペットで入れることによって細胞を回収し、抗ＲＢＤモノクローナル抗体（クローンＤ００３ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ４０１５０－Ｄ００３）、及びＲ－フィコエリトリンとコンジュゲートさせたＦ（ａｂ’）２－ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ｈ１０１０４）で標識した。標識された細胞を、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを用いて獲得し、Ｆｌｏｗｊｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
ワクチン候補コンストラクトによるＲＢＤエピトープの表面表現を決定するために、本発明者らは、ｈＡｄ５コンストラクトＤＮＡによりＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、抗ＲＢＤ抗体を用いたフローサイトメトリー検出により、表面ＲＢＤを定量化した。試験した７つのコンストラクトが存在した：Ｓ－ＷＴ、Ｓ－ＷＴ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ、Ｓ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、Ｓ－融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、及びＮ－ＥＴＳＤ。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（２４ウェルプレート中２．５×１０５細胞／ウェル）を、１０％ ＦＢＳ及び１Ｘ ＰＳＡ（１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５ｕｇ／ｍＬアンホテリシンＢ）を有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １１９９５－０６５）中で３７℃で成長させた。製造業者の説明書にしたがって、ＪｅｔＰｒｉｍｅトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓカタログ＃ ８９１２９－９２４）を用いて、０．５μｇのｈＡｄ５プラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１、２、３、及び７日後に、細胞を培地中に穏やかにピペットで入れることによって細胞を回収し、抗ＲＢＤモノクローナル抗体（クローンＤ００３ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ４０１５０－Ｄ００３）、及びＲ－フィコエリトリンとコンジュゲートさせたＦ（ａｂ’）２－ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔａｌｏｇ ＃ Ｈ１０１０４）で標識した。標識された細胞を、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを用いて獲得し、Ｆｌｏｗｊｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
【0142】
ｈＡｄ５感染ＨｅＬａ細胞の免疫細胞化学的標識
ＨｅＬａ細胞をｈＡｄ５ Ｎ－野生型（ＷＴ）又はｈＡｄ５ Ｎ－ＥＴＳＤ（各々、標識を可能にするフラグタグを有する）で感染又はトランスフェクトした後のＮの細胞内局在化を決定するために、感染又はトランスフェクションの４８時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ＰＢＳ中）で１５分間、室温で透過処理した。Ｎを標識するために、次いで細胞を抗フラグモノクローナル（マウスにおいて産生された抗Ｆｌａｇ Ｍ２、Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃ Ｆ１８０４）抗体と共に、３％ ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水中、１：１０００で４℃で一晩インキュベートし、続いてＰＢＳ中で洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度クロス吸着二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ５５５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡｔ＃ Ａ３２７２７）と共に１：５００で１時間インキュベートした。共局在化試験のために、細胞をまた、ヒツジ抗Ｌａｍｐ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－コンジュゲート（リソソームマーカー）抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ ＩＣ７９８５Ｇ）と共に１：１０で、又はウサギ抗ＣＤ７１（トランスフェリン受容体、エンドソームマーカー）抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ ＰＡ５－８３０２２）と共に１：２００で、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を除去し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、３％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中で３回洗浄した後、適用可能な場合、細胞を１：５００で蛍光コンジュゲート二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度クロス吸着二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ－１１０３４）と共に室温で１時間インキュベートした。短時間の洗浄後、ＤＡＰＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＣ９５２４６１２）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ封入剤で細胞をマウントし、Ｋｅｙｅｎｃｅ ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡カメラ及びＫｅｙｅｎｃｅソフトウェアを使用して直ちに画像化した。
ＨｅＬａ細胞をｈＡｄ５ Ｎ－野生型（ＷＴ）又はｈＡｄ５ Ｎ－ＥＴＳＤ（各々、標識を可能にするフラグタグを有する）で感染又はトランスフェクトした後のＮの細胞内局在化を決定するために、感染又はトランスフェクションの４８時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ＰＢＳ中）で１５分間、室温で透過処理した。Ｎを標識するために、次いで細胞を抗フラグモノクローナル（マウスにおいて産生された抗Ｆｌａｇ Ｍ２、Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃ Ｆ１８０４）抗体と共に、３％ ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水中、１：１０００で４℃で一晩インキュベートし、続いてＰＢＳ中で洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度クロス吸着二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ５５５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡｔ＃ Ａ３２７２７）と共に１：５００で１時間インキュベートした。共局在化試験のために、細胞をまた、ヒツジ抗Ｌａｍｐ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－コンジュゲート（リソソームマーカー）抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ ＩＣ７９８５Ｇ）と共に１：１０で、又はウサギ抗ＣＤ７１（トランスフェリン受容体、エンドソームマーカー）抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ ＰＡ５－８３０２２）と共に１：２００で、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を除去し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、３％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中で３回洗浄した後、適用可能な場合、細胞を１：５００で蛍光コンジュゲート二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度クロス吸着二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ－１１０３４）と共に室温で１時間インキュベートした。短時間の洗浄後、ＤＡＰＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＣ９５２４６１２）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ封入剤で細胞をマウントし、Ｋｅｙｅｎｃｅ ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡カメラ及びＫｅｙｅｎｃｅソフトウェアを使用して直ちに画像化した。
【0143】
Ｓ抗原発現の免疫ブロット分析
ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ－融合物、又はＳ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトでトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、本稿に記載の通り培養及びトランスフェクトされ、トランスフェクションの３日後に１Ｘ ｆｉｎａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を含む１５０ｍｌ ＲＩＰＡ溶解緩衝液中に回収された。タンパク質アッセイの後、等量の総タンパク質を４～１２％勾配ポリアクリルアミドゲル（タイプ）に充填し、流し込み、半乾燥転写装置を用いてニトロセルロース膜に転写した。抗スパイクＳ２（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｔ＃４０５９０－Ｔ６２）を一次抗体として、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉ－Ｃｏｒ，９２５－３２２１１）をＩｂｉｎｄ Ｆｌｅｘプラットフォームを用いた二次抗体として使用した。抗体特異的シグナルを赤外Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ機器で検出した。
ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ－融合物、又はＳ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトでトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、本稿に記載の通り培養及びトランスフェクトされ、トランスフェクションの３日後に１Ｘ ｆｉｎａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を含む１５０ｍｌ ＲＩＰＡ溶解緩衝液中に回収された。タンパク質アッセイの後、等量の総タンパク質を４～１２％勾配ポリアクリルアミドゲル（タイプ）に充填し、流し込み、半乾燥転写装置を用いてニトロセルロース膜に転写した。抗スパイクＳ２（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｔ＃４０５９０－Ｔ６２）を一次抗体として、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉ－Ｃｏｒ，９２５－３２２１１）をＩｂｉｎｄ Ｆｌｅｘプラットフォームを用いた二次抗体として使用した。抗体特異的シグナルを赤外Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ機器で検出した。
【0144】
ｈＡｄ５トランスフェクトＨＥＫ ２９３Ｔ細胞へのＡＣＥ２－ＩｇＧ１Ｆｃの結合
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ－融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳ、ＲＢＤ－ＥＴＳＤ又はＳ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤによるトランスフェクションのために、上述した条件下で３７℃で培養し、２日間インキュベートし、ＡＣＥ２－Ｆｃ結合分析のために回収した。組換えＡＣＥ２－ＩｇＧ１Ｆｃタンパク質を、１４日間培養したＣＨＯ－Ｓ細胞におけるＭａｘｃｙｔｅトランスフェクションを用いて生成した。次いで、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ上のＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティーカラムを用いてＡＣＥ２－ＩｇＧ１Ｆｃを精製した。
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ－融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳ、ＲＢＤ－ＥＴＳＤ又はＳ ＲＢＤ－ＥＴＳＤ ＋ Ｎ－ＥＴＳＤによるトランスフェクションのために、上述した条件下で３７℃で培養し、２日間インキュベートし、ＡＣＥ２－Ｆｃ結合分析のために回収した。組換えＡＣＥ２－ＩｇＧ１Ｆｃタンパク質を、１４日間培養したＣＨＯ－Ｓ細胞におけるＭａｘｃｙｔｅトランスフェクションを用いて生成した。次いで、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ上のＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティーカラムを用いてＡＣＥ２－ＩｇＧ１Ｆｃを精製した。
【0145】
精製ＡＣＥ２－ＩｇＧ１Ｆｃを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌに透析し、２．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。結合試験のために、ＡＣＥ２－ＩｇＧ１Ｆｃを、結合のために１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。細胞をＡＣＥ２－Ｆｃと共に２０分間インキュベートし、洗浄工程後、ＰＥコンジュゲートＦ（ａｂ’）２－ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ二次抗体で１：１００希釈で標識し、２０分間インキュベートし、洗浄し、フローサイトメーターで取得した。ヒストグラムは、細胞数の正規化モード（ＮＭ）－ＰＥチャネルにおけるシグナルについて陽性の細胞数－に基づく。
【0146】
ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン候補によるＣＤ－１マウスのワクチン接種
７週齢のＣＤ－１雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、Ｏｍｅｒｏｓ Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）のビバリウム施設で実施した免疫学的試験に使用した。最初の採血後、０日目にｈＡｄ５ヌル（陰性対照）又はワクチン候補ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤを１×１０１０ウイルス粒子（ＶＰ）の用量でマウスに注射した。１群当たり５匹のマウスが存在した。マウスは、２１日目及び２８日目に２回目のワクチン投与を受け、血清の単離のためにイソフルラン麻酔マウスから顎下静脈を介して血液を採取し、次いで、脾臓及び他の組織の採取のためにマウスを安楽死させた。
７週齢のＣＤ－１雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、Ｏｍｅｒｏｓ Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）のビバリウム施設で実施した免疫学的試験に使用した。最初の採血後、０日目にｈＡｄ５ヌル（陰性対照）又はワクチン候補ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤを１×１０１０ウイルス粒子（ＶＰ）の用量でマウスに注射した。１群当たり５匹のマウスが存在した。マウスは、２１日目及び２８日目に２回目のワクチン投与を受け、血清の単離のためにイソフルラン麻酔マウスから顎下静脈を介して血液を採取し、次いで、脾臓及び他の組織の採取のためにマウスを安楽死させた。
【0147】
脾細胞採取及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
脾臓を各マウスから取り出し、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ ２２４００１０５）、ＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃａｔ＃ ＳＨ３０２３７．０１）、１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １５１４０１２２）、及び１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １６１４０－０８９）の滅菌培地５ｍＬに入れた。脾細胞を採取から２時間以内に単離した。Ｓ及びＮペプチドプールによる刺激に応答したＣＤ８β＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞関連ＩＦＮ－γ及びＩＦＮ－γ／ＴＮＦα＋産生のフローサイトメトリー検出のためのＩＣＳ。
脾臓を各マウスから取り出し、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ ２２４００１０５）、ＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃａｔ＃ ＳＨ３０２３７．０１）、１Ｘ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １５１４０１２２）、及び１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １６１４０－０８９）の滅菌培地５ｍＬに入れた。脾細胞を採取から２時間以内に単離した。Ｓ及びＮペプチドプールによる刺激に応答したＣＤ８β＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞関連ＩＦＮ－γ及びＩＦＮ－γ／ＴＮＦα＋産生のフローサイトメトリー検出のためのＩＣＳ。
【0148】
刺激アッセイは、９６ウェルＵ底板においてウェル当たり１０６個の生脾細胞を用いて行った。１０％ ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地中の脾細胞を、ペプチドプールを２μｇ／ｍＬ／ペプチドで５％ ＣＯ２中３７℃で６時間添加することによって刺激し、タンパク質輸送阻害剤、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ）をインキュベーション開始の２時間後に添加した。次いで、刺激された脾細胞をリンパ球表面マーカーＣＤ８β及びＣＤ４について染色し、ＣｙｔｏＦｉｘ（ＢＤ）で固定し、透過処理し、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの細胞内蓄積について染色した。マウスＣＤ８β抗体（クローンＨ３５－１７．２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ４（クローンＲＭ４－５、ＢＤ）、ＩＦＮ－γ（クローンＸＭＧ１．２、ＢＤ）、及びＴＮＦ－α（クローンＭＰ６－ＸＴ２２、ＢＤ）に対する蛍光結合抗体、並びに染色を、非標識抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（クローン２．４Ｇ２）の存在下で行った。Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙｔｏｆｌｅｘ Ｓフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーを行い、Ｆｌｏｗｊｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
【0149】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、接種したマウスから脾細胞によって分泌されたサイトカインを検出した。新鮮脾細胞を、リンパ球を含む凍結保存脾細胞と同じ日に使用した。細胞（９６ウェルプレートのウェル当たり２～４×１０５個の細胞）を、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－４（ＢＤ）のいずれかに対する固定化一次抗体を含むＥＬＩＳｐｏｔプレートに添加し、２μｇ／ｍＬペプチドプール又は１０μｇ／ｍＬタンパク質を含む様々な刺激（例えば、対照ペプチド、標的ペプチドプール／タンパク質）に３６～４０時間曝露した。細胞及び培地を除去するための吸引及び洗浄の後、ビオチン（ＢＤ）にコンジュゲートしたサイトカインに対する二次抗体によって、細胞外サイトカインを検出した。ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して、ビオチンコンジュゲート二次抗体を検出した。ウェル当たり、又は２～４×１０５細胞当たりのスポット数を、ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーを用いてカウントした。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、接種したマウスから脾細胞によって分泌されたサイトカインを検出した。新鮮脾細胞を、リンパ球を含む凍結保存脾細胞と同じ日に使用した。細胞（９６ウェルプレートのウェル当たり２～４×１０５個の細胞）を、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－４（ＢＤ）のいずれかに対する固定化一次抗体を含むＥＬＩＳｐｏｔプレートに添加し、２μｇ／ｍＬペプチドプール又は１０μｇ／ｍＬタンパク質を含む様々な刺激（例えば、対照ペプチド、標的ペプチドプール／タンパク質）に３６～４０時間曝露した。細胞及び培地を除去するための吸引及び洗浄の後、ビオチン（ＢＤ）にコンジュゲートしたサイトカインに対する二次抗体によって、細胞外サイトカインを検出した。ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して、ビオチンコンジュゲート二次抗体を検出した。ウェル当たり、又は２～４×１０５細胞当たりのスポット数を、ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーを用いてカウントした。
【0150】
抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ
接種マウス由来の血清における抗体検出のために、スパイク及びヌクレオカプシド抗体、並びにＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）抗体に特異的なＥＬＩＳＡを使用した。マイクロタイタープレートを、１００μＬの被覆緩衝液（０．０５Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ ９．６）中の１００ｎｇの精製組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｓ－Ｓ－ＦＴＤ（フィブリチン三量体化ドメインを有する全長Ｓ、ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．、９９２０ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｂｌｖｄ、Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ ９０２３２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ；Ｃａｔ＃ ４０１５９１－Ｖ０８Ｂ１－１００）又は精製組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ；Ｃａｔ＃ ４０５８８－Ｖ０８Ｂ）のいずれかにより一晩被覆した。ウェルを１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含有する２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄して、未結合タンパク質を除去し、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴで室温で６０分間ブロックした。ブロック後、ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、１００μＬの希釈血清サンプルをウェルに添加し、サンプルを室温で６０分間インキュベートした。インキュベート後、ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、１００μＬの１／５０００希釈の抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ；Ｃａｔ＃ ＮＡ９３１０Ｖ）、又は抗マウスＩｇＧ１ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃ ＳＡＢ３７０１１７１）、又は抗マウスＩｇＧ２ａ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃ ＳＡＢ３７０１１７８）、又は抗マウスＩｇＧ２ｂ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃ ＳＡＢ３７０１１８５）、又は抗マウスＩｇＧ３ ＨＲＰコンジュゲート化抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃ ＳＡＢ３７０１１９２）をウェルに添加した。陽性対照については、１００μＬの１／５０００希釈のウサギ抗Ｎ ＩｇＧ Ａｂ又は１００μＬの１／２５希釈のマウス抗Ｓ血清（アジュバント中の精製Ｓ抗原で免疫したマウス由来）を適切なウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、２００μＬのｏ－フェニレンジアミン－二塩酸塩（ＯＰＤ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃ Ａ３４００６）と共に、適切な発色までインキュベートした。５０μＬの１０％リン酸溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ Ａ２６０－５００）を水に加えて発色反応を停止し、マイクロプレートリーダー（ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４９０ｎｍでの吸光度を決定した。
接種マウス由来の血清における抗体検出のために、スパイク及びヌクレオカプシド抗体、並びにＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）抗体に特異的なＥＬＩＳＡを使用した。マイクロタイタープレートを、１００μＬの被覆緩衝液（０．０５Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ ９．６）中の１００ｎｇの精製組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｓ－Ｓ－ＦＴＤ（フィブリチン三量体化ドメインを有する全長Ｓ、ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．、９９２０ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｂｌｖｄ、Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ ９０２３２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ；Ｃａｔ＃ ４０１５９１－Ｖ０８Ｂ１－１００）又は精製組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ；Ｃａｔ＃ ４０５８８－Ｖ０８Ｂ）のいずれかにより一晩被覆した。ウェルを１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含有する２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄して、未結合タンパク質を除去し、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴで室温で６０分間ブロックした。ブロック後、ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、１００μＬの希釈血清サンプルをウェルに添加し、サンプルを室温で６０分間インキュベートした。インキュベート後、ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、１００μＬの１／５０００希釈の抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ；Ｃａｔ＃ ＮＡ９３１０Ｖ）、又は抗マウスＩｇＧ１ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃ ＳＡＢ３７０１１７１）、又は抗マウスＩｇＧ２ａ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃ ＳＡＢ３７０１１７８）、又は抗マウスＩｇＧ２ｂ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃ ＳＡＢ３７０１１８５）、又は抗マウスＩｇＧ３ ＨＲＰコンジュゲート化抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃ ＳＡＢ３７０１１９２）をウェルに添加した。陽性対照については、１００μＬの１／５０００希釈のウサギ抗Ｎ ＩｇＧ Ａｂ又は１００μＬの１／２５希釈のマウス抗Ｓ血清（アジュバント中の精製Ｓ抗原で免疫したマウス由来）を適切なウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、２００μＬのｏ－フェニレンジアミン－二塩酸塩（ＯＰＤ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃ Ａ３４００６）と共に、適切な発色までインキュベートした。５０μＬの１０％リン酸溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ Ａ２６０－５００）を水に加えて発色反応を停止し、マイクロプレートリーダー（ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４９０ｎｍでの吸光度を決定した。
【0151】
抗体の相対μｇ量の計算
ＩｇＧの検量線を作成し、抗Ｓ抗体と抗Ｎ抗体の両方について吸光度値を質量当量に変換した。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種は、血清１ｍＬ当たり５．８μｇのＳ特異的ＩｇＧと４２μｇのＮ特異的ＩｇＧの幾何平均値を生じた。
ＩｇＧの検量線を作成し、抗Ｓ抗体と抗Ｎ抗体の両方について吸光度値を質量当量に変換した。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種は、血清１ｍＬ当たり５．８μｇのＳ特異的ＩｇＧと４２μｇのＮ特異的ＩｇＧの幾何平均値を生じた。
【0152】
ｃＰａｓｓ（商標）中和抗体検出
中和抗体の検出のためのＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ｃＰａｓｓ（商標）を、製造業者の説明書に従って使用した。４４キットは、Ｓ ＲＢＤとＡＣＥ２細胞表面受容体との間の相互作用を遮断するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する循環中和抗体を検出する。これは、全ての抗体アイソタイプに適しており、変更なしで動物モデルでの使用に適している。
中和抗体の検出のためのＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ｃＰａｓｓ（商標）を、製造業者の説明書に従って使用した。４４キットは、Ｓ ＲＢＤとＡＣＥ２細胞表面受容体との間の相互作用を遮断するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する循環中和抗体を検出する。これは、全ての抗体アイソタイプに適しており、変更なしで動物モデルでの使用に適している。
【0153】
ベロＥ６細胞中和アッセイ
ウイルスを使用するアッセイの全ての局面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２細胞培養試験のためのＩＳＭＭＳ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ＳＯＰにしたがって、ＢＳＬ３封じ込め施設において行った。サバンナモンキー（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８６）由来のベロｅ６腎上皮細胞を、９６ウェルフォーマットで２０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、２４時間後、２％ ＦＢＳ、１％ ＮＥＡＡ、及び１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ中で３倍段階で予め段階希釈した抗体又は熱不活化血清と共に細胞をインキュベートした；希釈したサンプルを、２％ ＦＢＳ、１％ ＮＥＡＡ、及び１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３７℃、５％ ＣＯ２で１時間、１０，０００ ＴＣＩＤ ５０／ｍＬで１：１混合した。このインキュベーションは、感染前に中和活性を生じさせるための細胞を含まなかった。試験のためのサンプルは、ｃＰａｓｓにおけるＡＣＥ２結合の＞２０％阻害を示した４匹のマウスからの血清、これら４匹のマウスからのプールされた血清、ＣＯＶＩＤ－１９回復期患者からの血清、及び培地のみを含んだ。中和の検出のために、１２０μＬのウイルス／サンプル混合物をベロＥ６細胞に移し、４８時間インキュベートした後、４％ ＰＦＡで固定した。各ウェルは、６０μＬのウイルス又は６００ ＴＣＩＤ５０の感染用量を受けた。ウイルスなし及びウイルスのみの対照について、各プレート上に６つのウェルを含む対照ウェルを使用した。パーセント中和は、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で画像化されたＣｏＶ－２ Ｎｐの染色を用いて、１００－（（目的のサンプル－［「ウイルスなし」の平均］）／［「ウイルスのみ」の平均］＊１００）として計算した。
ウイルスを使用するアッセイの全ての局面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２細胞培養試験のためのＩＳＭＭＳ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ＳＯＰにしたがって、ＢＳＬ３封じ込め施設において行った。サバンナモンキー（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８６）由来のベロｅ６腎上皮細胞を、９６ウェルフォーマットで２０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、２４時間後、２％ ＦＢＳ、１％ ＮＥＡＡ、及び１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ中で３倍段階で予め段階希釈した抗体又は熱不活化血清と共に細胞をインキュベートした；希釈したサンプルを、２％ ＦＢＳ、１％ ＮＥＡＡ、及び１％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と３７℃、５％ ＣＯ２で１時間、１０，０００ ＴＣＩＤ ５０／ｍＬで１：１混合した。このインキュベーションは、感染前に中和活性を生じさせるための細胞を含まなかった。試験のためのサンプルは、ｃＰａｓｓにおけるＡＣＥ２結合の＞２０％阻害を示した４匹のマウスからの血清、これら４匹のマウスからのプールされた血清、ＣＯＶＩＤ－１９回復期患者からの血清、及び培地のみを含んだ。中和の検出のために、１２０μＬのウイルス／サンプル混合物をベロＥ６細胞に移し、４８時間インキュベートした後、４％ ＰＦＡで固定した。各ウェルは、６０μＬのウイルス又は６００ ＴＣＩＤ５０の感染用量を受けた。ウイルスなし及びウイルスのみの対照について、各プレート上に６つのウェルを含む対照ウェルを使用した。パーセント中和は、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で画像化されたＣｏＶ－２ Ｎｐの染色を用いて、１００－（（目的のサンプル－［「ウイルスなし」の平均］）／［「ウイルスのみ」の平均］＊１００）として計算した。
【0154】
ワクチンの特徴付け
開発中の現在の予防的抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの大部分は、ウイルス曝露前にレシピエントにおいて中和抗体応答を生成することを目的として、ウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を標的とすることによって、さらなる疾患関連死亡及び罹患を予防するように設計されている。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＣＯＶＩＤ－１９患者免疫応答の最近の特徴付けは、Ｔ細胞などの他の免疫細胞が感染を除去し、コロナウイルス感染に対する長期免疫を生じるのに重要であることを示している。ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞のようなエフェクター細胞ではないが、抗体分泌形質細胞によってもたらされる強固で持続性の免疫の生成及び記憶細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞による感染細胞の排除に重要であるため、耐久性のある液性応答を支える。本開示の二重抗原候補ワクチンは、液性応答を刺激するための最適化Ｓタンパク質（Ｓ－融合物）と共に、強力なＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞標的である修飾ウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）抗原を含めることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と戦うために免疫系をより広く活性化する。
開発中の現在の予防的抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの大部分は、ウイルス曝露前にレシピエントにおいて中和抗体応答を生成することを目的として、ウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を標的とすることによって、さらなる疾患関連死亡及び罹患を予防するように設計されている。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＣＯＶＩＤ－１９患者免疫応答の最近の特徴付けは、Ｔ細胞などの他の免疫細胞が感染を除去し、コロナウイルス感染に対する長期免疫を生じるのに重要であることを示している。ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞のようなエフェクター細胞ではないが、抗体分泌形質細胞によってもたらされる強固で持続性の免疫の生成及び記憶細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞による感染細胞の排除に重要であるため、耐久性のある液性応答を支える。本開示の二重抗原候補ワクチンは、液性応答を刺激するための最適化Ｓタンパク質（Ｓ－融合物）と共に、強力なＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞標的である修飾ウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）抗原を含めることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と戦うために免疫系をより広く活性化する。
【0155】
ヒトアデノウイルス血清型５（ｈＡｄ５）Ｅ１、Ｅ２ｂ、及びＥ３領域欠失［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ワクチンプラットフォーム（図４４、パネルＡ）は、既存のアデノウイルス免疫の存在下で有効であり、ベクター標的化宿主免疫応答を生成する可能性が低く、したがってプライム及びブーストの両方として使用することができるため、現在臨床試験において他のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンで使用されているアデノウイルスプラットフォームよりも優れている。このプラットフォームを使用して、ワクチンは、細胞表面表示及び液性応答を増加させるための最適化されたＳ表面タンパク質、Ｓ－融合物；並びにウイルス粒子内に見出される高度に保存された抗原性Ｎタンパク質を含み、ここでは、増強された抗原提示のための細胞内コンパートメント標的化配列を有する。この戦略は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する液性及びＴ細胞応答の誘発において安全且つ堅牢である。Ｎの追加は、集団における経時的なＳの突然変異の出現に起因する、Ｓのみの一価ワクチンに対するワクチン有効性の喪失のリスクに対処する。対照的に、Ｎは高度に保存されており、変異のリスクはより低く、一方、高度に免疫原性である。これは、天然免疫の既知の標的抗原であり、Ｎに対する抗体及びＴ細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び類似のウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染から回復した大多数の人に見られる。本ワクチンにおいては、増強されたＴ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）は、翻訳後にＮタンパク質をエンドソーム－リソソーム細胞内コンパートメントに導いて、Ｔヘルパー細胞活性化のためのＭＨＣクラスＩＩ提示及び樹状細胞ライセンシングによるＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の促進を支持する。突然変異が出現するリスクにもかかわらず、Ｓは、感染におけるその役割のため、ワクチン接種のための重要な抗原のままである。ウイルス表面上に三量体として表示されるスパイク（図４４、パネルＢ）は、宿主アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と相互作用して宿主細胞への侵入及び増殖を促進する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を有し、したがって、Ｓに対する抗体は、感染の中和の鍵である。Ｓ ＲＢＤに対する抗体は、他のＳエピトープに対する抗体と同様に、ＣＯＶＩＤ１９ ５１から回復した患者において一般に見出される。二価ワクチンコンストラクトでは、Ｓ－融合物は、ウイルス中和である抗Ｓ ＲＢＤ抗体の生成を改善することを目的として、融合リンカーの追加によってＳを最適化し、細胞表面上に生理学的に関連する形態でＳ ＲＢＤを表示する。
【0156】
本開示の二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンは、優れたＴ細胞応答を生じる。現在臨床試験中のワクチンは、感染を中和する手段として液性応答を生成することに焦点を当てている。しかしながら、たとえ抗体がうまく生成され、十分に中和したとしても、時間が経つにつれて減少し得ることを考慮すると、Ｔ細胞応答は重要になる。ウイルス誘発性リンパ球減少症のためにＴ細胞応答がない場合、たとえ多量の中和抗体の存在下であっても、感染した人は、疾患の急性症状を発症するリスクがある。Ｓ（及び他のウイルスタンパク質）がＴ細胞応答を誘導し得ることを除外することはできないが、文献における証拠は、Ｎの重要な役割を支持する。Ｎに対するＴ細胞応答がＣＯＶＩＤ－１９から回復した患者の大多数において見出されただけでなく、非常に類似したウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶに曝露された患者におけるＮに対するこれらの応答は、著しく耐久性がある。天然Ｔ細胞におけるＮの重要性の有力な証拠がＦｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．の最近の報告に見出すことができ、Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞によって認識される正確なペプチド配列について、偏りのないゲノムワイドスクリーニングを用いて、２９の共有エピトープのうち３つのみがスパイクタンパク質由来であるのに対し、最高密度のエピトープは、ヌクレオカプシドタンパク質中に位置することを見出した。したがって、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンにおいて、Ｎは、液性応答を誘発するだけでなく、疾患を制限する自然免疫をより良好に再現するＴ細胞応答も誘発することが期待される。
【0157】
最初の報告において、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンは、ＡＣＥ２によって容易に認識されるＳ ＲＢＤの増強された細胞表面発現を提供し、そのコンフォメーション完全性を反映している。増強された抗原提示のためのエンドソーム／リソソーム局在化を有するＮ－ＥＴＳＤは、接種マウスにおいて中和抗体及びＴｈ１優勢を有するＣＤ４＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞媒介応答の両方を生じた。本開示は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者由来の血漿及び単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を用いて天然Ｓ抗原発現を確認して、これらの知見を拡張する。本発明者らは、抗原提示ＭｏＤＣにおけるＮ－ＥＴＳＤ局在化を解明し、それがエンドソーム、リソソーム、及びオートファゴソームに局在化することを示した。この細胞内経路を介するタンパク質プロセシングは、ＭＨＣクラスＩＩ提示を増強し、ペプチド再利用を増加させて、ＭＨＣクラスＩ提示も可能にする。ヌクレオカプシドタンパク質を後期リソソーム－オートファゴソームコンパートメントに局在化することによって、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的記憶Ｔ細胞の両方が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に以前に感染した患者からリコールされる。さらに、これらの免疫応答リコール試験において、インビトロで、Ｓ－融合物及びＮ－ＥＴＳＤを提示するｈＡｄ５感染ＭｏＤＣは、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染した患者の自己記憶Ｔ細胞から優勢なＴｈ１応答を誘発する。Ｎは特に、インビトロリコール試験においてＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を駆動する。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンによるワクチン接種によって達成できる程度までの自然感染及び免疫の再現は、それをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及びＣＯＶＩＤ－１９から個体を防御するその能力の臨床試験のための主要な候補とし、この第２世代ワクチンコンストラクトは、現在、第Ｉ相臨床試験に入っている。
【0158】
実施例１８：ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォーム及びコンストラクト
ここでの試験のために、次世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターを使用して（図４４、パネルＡ）、ウイルスワクチン候補コンストラクトを作製した。多様なコンストラクトを作製した：図４４、パネルＣ：Ｓ ＷＴ：１２７４個のアミノ酸及び全てのＳドメインを含むＳタンパク質：細胞外（１～１２１３）、膜貫通（１２１４～１２３４）、及び細胞質（１２３５～１２７３）（Ｕｎｉｔｐｒｏｔ Ｐ０ＤＴＣ２）；図４４、パネルＤ：Ｓ融合物：ＲＢＤの表面発現及び表示を増強するために最適化されたＳ；図４４、パネルＥ：Ｎ（ＥＴＳＤを含まないＮ）：免疫検出のためのタグを有するが、ＥＴＳＤ修飾を含まない、及び主に細胞質局在化を有するヌクレオカプシド（野生型）配列。図４４、パネルＦ。増強Ｔ細胞刺激ドメインを有するＮ（Ｎ－ＥＴＳＤ）：リソソーム／エンドソーム局在化を導くためのＥＴＳＤ及び免疫検出のためのタグを有するヌクレオカプシド（野生型）；並びに図４４、パネルＧ：二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン。
ここでの試験のために、次世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターを使用して（図４４、パネルＡ）、ウイルスワクチン候補コンストラクトを作製した。多様なコンストラクトを作製した：図４４、パネルＣ：Ｓ ＷＴ：１２７４個のアミノ酸及び全てのＳドメインを含むＳタンパク質：細胞外（１～１２１３）、膜貫通（１２１４～１２３４）、及び細胞質（１２３５～１２７３）（Ｕｎｉｔｐｒｏｔ Ｐ０ＤＴＣ２）；図４４、パネルＤ：Ｓ融合物：ＲＢＤの表面発現及び表示を増強するために最適化されたＳ；図４４、パネルＥ：Ｎ（ＥＴＳＤを含まないＮ）：免疫検出のためのタグを有するが、ＥＴＳＤ修飾を含まない、及び主に細胞質局在化を有するヌクレオカプシド（野生型）配列。図４４、パネルＦ。増強Ｔ細胞刺激ドメインを有するＮ（Ｎ－ＥＴＳＤ）：リソソーム／エンドソーム局在化を導くためのＥＴＳＤ及び免疫検出のためのタグを有するヌクレオカプシド（野生型）；並びに図４４、パネルＧ：二価ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン。
【0159】
増強Ｔ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）で操作されたヌクレオカプシド抗原は、ＭｏＤＣにおいてＮをエンドソーム、リソソーム及びオートファゴソームに導き、増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化を駆動する：
【0160】
ｈＡｄ５二価ワクチンコンストラクトは、ＮをＭＨＣクラスＩＩ抗原負荷コンパートメントに標的化するように設計された配列を含む。ＭｏＤＣにおける抗原提示に影響を及ぼす因子をさらに調査するために、健康な対象由来のＭｏＤＣをｈＡｄ５ Ｎ－ＥＴＳＤ又はｈＡｄ５ Ｎで感染させ、免疫細胞化学によって局在化を決定した。Ｎ－ＥＴＳＤは、リサイクリングエンドソームのマーカーであるＣＤ７１（図４５、パネルＡ～Ｃ）、及び後期エンドソーム／リソソームのマーカーであるＬＡＭＰ－１（図４５、パネルＧ～Ｉ）といくらか一致する、別個の小胞への局在化を示したが、Ｎは、細胞質全体にわたって拡散的且つ均一に発現された（図４５、パネルＤ～Ｆ及びＪ～Ｌ）。リソソームはオートファゴソームと融合して、ペプチドプロセシング及びＭＨＣクラスＩＩ提示を増強する。Ｎ－ＥＴＳＤはまた、オートファゴソームマーカーとのいくらかの共局在化を示した（図４５、パネルＭ～Ｏ）。オートファゴソームにおけるタンパク質プロセシングは、ＤＣにおけるＭＨＣ媒介性抗原提示において重要な役割を果たし、ワクチンコンストラクトにおいてＮ－ＥＴＳＤによって誘導される増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の潜在的機構を提供する。オートファゴソーム（そして、エンドソーム及びリソソームもまた想定される）に転座したＮ－ＥＴＳＤで感染したＭｏＤＣとのこのＴ細胞の相互作用の証拠は、Ｎ－ＥＴＳＤ及びＬＣ３ａ／ｂ共標識細胞のこの位相差顕微鏡検査で見られ、これは未分化リンパ球の球状形態とは対照的に、伸長したＤＣ形態を明らかにする。ｈＡｄ５ Ｎ－ＥＴＳＤによる感染の非存在によっても区別されるリンパ球も（リンパ球はｈＡｄ５受容体を欠く）、Ｎ－ＥＴＳＤ発現ＭｏＤＣと相互作用することが見られた。
【0161】
記憶Ｔ細胞リコール試験のための以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者及びウイルスナイーブ患者からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体及び細胞媒介免疫応答の検証：
【0162】
以下に記載される試験のために、以下に記載されるように抗体アッセイ及び患者の病歴によって確認されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から回復した４人の個体から血漿サンプルを収集した。ｃＰａｓｓ ６６及び生ウイルスアッセイの両方による抗スパイクＩｇＧの存在、及び中和抗体の存在は、全ての患者サンプルにおいて確認された。４人のウイルスナイーブ個体からもサンプルを収集し、対照として使用した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する免疫反応を検証するための追加試験では、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染した患者及びウイルスナイーブ対照個人の血漿の、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物単独又はｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤのいずれかによってトランスフェクトされたヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞への結合を評価した。この結合は、ｈＡｄ５ベクター化ワクチンによって発現される抗原を認識する、血漿中の抗体の存在を反映する。ヒストグラムの定量化は、いずれかのコンストラクトを発現する細胞へのウイルスナイーブ血漿抗体の結合がほとんど又は全くなく、二価Ｓ融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトを発現する細胞への以前にＳＡＲＳＣｏＶ－２に感染した患者からの血漿抗体の最高の結合を示した。これは、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物単独と比較して、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ感染ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で見出されるＳの増強された表面発現、又はＳ及びＮ抗原の両方の発現のいずれかによるものである。
【0163】
実施例１９：Ｎ－ＥＴＳＤは、スパイク抗原発現を最適化する：以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来の血漿抗体の結合は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物又はｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴと比較して、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ感染ＭｏＤＣについて増強される。
ここでの試験は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者由来のＴ細胞の、ｈＡｄ５ワクチンコンストラクトに感染した自己ＭｏＤＣに対する応答に焦点を当てている。ＤＣは、感染又は食作用を介して獲得された複合抗原を処理及び提示してＴ細胞応答を誘発するための強力な抗原提示細胞である。したがって、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を発現するｈＡｄ５ワクチンへの患者血漿抗体の結合の評価に加えて、２人の健康な個体からのＭｏＤＣをｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、又はｈＡｄ５ヌルで一晩感染させ、次いで、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者からの血漿を用いて遺伝子発現を評価した（図４６、パネルＡ）。両方のＭｏＤＣ供給源について、以前に感染した患者からの血漿抗体のＭｏＤＣへの最高の結合は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ感染後に見られ（図４６、パネルＢ～Ｄ）、抗原発現がｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ二価ワクチンにおいて最適化されるというさらなる証拠を提供した。ヒトＭｏＤＣと血漿のインビトロ系における非常に関連性の高いこの所見は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞及び市販の抗ＲＢＤ抗体を用いた試験の結果の重要な確認であるだけでなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原反応性について血漿をスクリーニングする潜在的な方法を示している。
ここでの試験は、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者由来のＴ細胞の、ｈＡｄ５ワクチンコンストラクトに感染した自己ＭｏＤＣに対する応答に焦点を当てている。ＤＣは、感染又は食作用を介して獲得された複合抗原を処理及び提示してＴ細胞応答を誘発するための強力な抗原提示細胞である。したがって、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を発現するｈＡｄ５ワクチンへの患者血漿抗体の結合の評価に加えて、２人の健康な個体からのＭｏＤＣをｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、又はｈＡｄ５ヌルで一晩感染させ、次いで、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者からの血漿を用いて遺伝子発現を評価した（図４６、パネルＡ）。両方のＭｏＤＣ供給源について、以前に感染した患者からの血漿抗体のＭｏＤＣへの最高の結合は、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ感染後に見られ（図４６、パネルＢ～Ｄ）、抗原発現がｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ二価ワクチンにおいて最適化されるというさらなる証拠を提供した。ヒトＭｏＤＣと血漿のインビトロ系における非常に関連性の高いこの所見は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞及び市販の抗ＲＢＤ抗体を用いた試験の結果の重要な確認であるだけでなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原反応性について血漿をスクリーニングする潜在的な方法を示している。
【0164】
実施例２０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドプール免疫反応：
以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＴ細胞は、ウイルスナイーブ対照由来のＴ細胞と比較して、Ｓ１、Ｓ２、及びＮ ＣｏＲＳＳＡＮ－２ペプチドプールに応答して有意なレベルのインターフェロン－ｇ（ＩＦＮ－γ）を分泌する。４人の以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＴ細胞と、４人の非曝露個体由来のウイルスナイーブＴ細胞との反応性を実証するために、各群由来のＴ細胞を、Ｎ及びＳタンパク質の配列にわたるペプチド混合物でパルスした自己ＭｏＤＣと共に培養した。以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＴ細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に応答してＩＦＮｇを分泌したが、未曝露の対象由来のＴ細胞は分泌せず（図４７）、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者由来のＴ細胞の選択的反応性を確認した。
以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＴ細胞は、ウイルスナイーブ対照由来のＴ細胞と比較して、Ｓ１、Ｓ２、及びＮ ＣｏＲＳＳＡＮ－２ペプチドプールに応答して有意なレベルのインターフェロン－ｇ（ＩＦＮ－γ）を分泌する。４人の以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＴ細胞と、４人の非曝露個体由来のウイルスナイーブＴ細胞との反応性を実証するために、各群由来のＴ細胞を、Ｎ及びＳタンパク質の配列にわたるペプチド混合物でパルスした自己ＭｏＤＣと共に培養した。以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＴ細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に応答してＩＦＮｇを分泌したが、未曝露の対象由来のＴ細胞は分泌せず（図４７）、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者由来のＴ細胞の選択的反応性を確認した。
【0165】
実施例２１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドプール免疫反応：以前に感染したＳＡＲＳＣｏＶ－２患者由来のＣＤ４＋ Ｔ細胞は、Ｓ及びＮペプチドプール抗原を認識するが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、Ｎペプチド抗原のより大きな認識を示す。
試験した２つの患者サンプルのＣＤ４＋ Ｔ細胞は、Ｓ及びＮペプチドプールの両方に応答し、Ｐｔ３によるＮに対するより高い応答を有した（図４８、パネルＢ）。対照的に、両方の患者由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞は、Ｎに高い有意性で応答したが、Ｓ１又はＳ２ペプチドプールには応答しなかった（図４８、パネルＣ及びＤ）。これらのデータは、以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者におけるＳ及びＮを含む複数の抗原に対するＴ細胞応答を実証する発表された試験と一致する。
試験した２つの患者サンプルのＣＤ４＋ Ｔ細胞は、Ｓ及びＮペプチドプールの両方に応答し、Ｐｔ３によるＮに対するより高い応答を有した（図４８、パネルＢ）。対照的に、両方の患者由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞は、Ｎに高い有意性で応答したが、Ｓ１又はＳ２ペプチドプールには応答しなかった（図４８、パネルＣ及びＤ）。これらのデータは、以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者におけるＳ及びＮを含む複数の抗原に対するＴ細胞応答を実証する発表された試験と一致する。
【0166】
実施例２２：エンド／リソソーム指向性ヌクレオカプシド－ＥＴＳＤに感染した自家ＭｏＤＣは、細胞質ヌクレオカプシドタンパク質（ｈＡｄ５ Ｎ）と比較して、以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者からのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞からのより高いレベルのＩＦＮ－γ分泌を誘発する。
エンド／リソソーム局在化Ｎ－ＥＴＳＤ対細胞質Ｎの免疫有意性を評価するために、ＭｏＤＣをｈＡｄ５コンストラクト（ヌル、Ｎ－ＥＴＳＤ又はＮ）に感染させ、次いで、自己ＣＤ３＋及びＣＤ４＋又はＣＤ８＋選択Ｔ細胞と共にインキュベートした（図４９、パネルＡ）。以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＣＤ３＋ Ｔ細胞は、Ｎ－ＥＴＳＤ及びＮを比較した２人の患者において、ヌル及び細胞質Ｎの両方よりもＮＥＴＳＤに応答して有意に大きいＩＦＮ－γ分泌を示した（図４９、パネルＣ及びＤ）。全ての患者について、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を分泌するインターロイキン－４（ＩＬ－４）は比較的少なかった（図４９、パネルＥ～Ｇ）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋選択Ｔ細胞集団の両方は、ヌルよりもＮ－ＥＴＳＤに対して有意に大きいＩＦＮ－γ応答を示し（図４９、パネルＨ～Ｍ）、３人の患者のうちの２人において、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、Ｎと比較してＮ－ＥＴＳＤのより大きい認識を示した。高いＩＦＮ－γ及び低いＩＬ４応答は、Ｎ／Ｎ－ＥＴＳＤに対する優勢なＴｈ１サイトカイン応答を示す。ＮＥＴＳＤ及びＮの細胞表現は、２９３Ｔ ＨＥＫ細胞で同等であり、Ｎ－ＥＴＳＤに対するＴ細胞応答の向上の理由は、エピトープのプロセシング及びＭＨＣ負荷である可能性が高いことを示唆した。
エンド／リソソーム局在化Ｎ－ＥＴＳＤ対細胞質Ｎの免疫有意性を評価するために、ＭｏＤＣをｈＡｄ５コンストラクト（ヌル、Ｎ－ＥＴＳＤ又はＮ）に感染させ、次いで、自己ＣＤ３＋及びＣＤ４＋又はＣＤ８＋選択Ｔ細胞と共にインキュベートした（図４９、パネルＡ）。以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＣＤ３＋ Ｔ細胞は、Ｎ－ＥＴＳＤ及びＮを比較した２人の患者において、ヌル及び細胞質Ｎの両方よりもＮＥＴＳＤに応答して有意に大きいＩＦＮ－γ分泌を示した（図４９、パネルＣ及びＤ）。全ての患者について、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を分泌するインターロイキン－４（ＩＬ－４）は比較的少なかった（図４９、パネルＥ～Ｇ）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋選択Ｔ細胞集団の両方は、ヌルよりもＮ－ＥＴＳＤに対して有意に大きいＩＦＮ－γ応答を示し（図４９、パネルＨ～Ｍ）、３人の患者のうちの２人において、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、Ｎと比較してＮ－ＥＴＳＤのより大きい認識を示した。高いＩＦＮ－γ及び低いＩＬ４応答は、Ｎ／Ｎ－ＥＴＳＤに対する優勢なＴｈ１サイトカイン応答を示す。ＮＥＴＳＤ及びＮの細胞表現は、２９３Ｔ ＨＥＫ細胞で同等であり、Ｎ－ＥＴＳＤに対するＴ細胞応答の向上の理由は、エピトープのプロセシング及びＭＨＣ負荷である可能性が高いことを示唆した。
【0167】
実施例２３：ヌクレオカプシド及びスパイク抗原に対するＴｈ１優位ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞リコールは、以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染した患者からの自己ＭｏＤＣのｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ感染によって誘導される。
Ｎ－ＥＴＳＤは、患者のＴ細胞サイトカイン応答の誘発においてＮよりも有効である。全Ｔ細胞（ＣＤ３＋）について、ＩＦＮ－γ応答は、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ及びＮ－ＥＴＳＤについて同様であり、Ｓ－融合物に対する応答は比較的低かった（図５０、パネルＡ～Ｃ）。ＩＬ－４分泌Ｔ細胞の数は、全てについて非常に低かった（図５０、パネルＤ～Ｆ）。一価Ｓ融合物と比較した二価ワクチンにおけるＳの発現の増加に基づいて、Ｔ細胞応答の増加は、Ｓの増加又はＮの存在を認識するＴ細胞のいずれかによって説明することができる。重要なことに、これらのＴ細胞応答は、ＩＬ－４（Ｔｈ２）と比較したＩＦＮ－γ（Ｔｈ１）の優勢によって特徴付けられた。３人の患者全員からのＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ヌルと比較して、３つのコンストラクト全ての有意に高い認識を示した（図５０、パネルＧ～Ｉ）。一部の個体では、特定のコンストラクトに対する応答が高かったが、Ｓ－融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ及びＮ－ＥＴＳＤに対する全体的な応答は類似していた。３人の患者全員からのＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ヌルよりも有意に高いレベルで二価及びＮ－ＥＴＳＤワクチンを認識した；３人の患者のうちの２人のみが、ヌルよりも有意に高い程度までＳ－融合物を認識した（図５０、パネルＪ～Ｌ）。これらのデータは、以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＴ細胞がワクチンベクター中のワクチン抗原（Ｓ及びＮ）の両方に対して反応性及び免疫記憶リコールを有することを示す。
Ｎ－ＥＴＳＤは、患者のＴ細胞サイトカイン応答の誘発においてＮよりも有効である。全Ｔ細胞（ＣＤ３＋）について、ＩＦＮ－γ応答は、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ及びＮ－ＥＴＳＤについて同様であり、Ｓ－融合物に対する応答は比較的低かった（図５０、パネルＡ～Ｃ）。ＩＬ－４分泌Ｔ細胞の数は、全てについて非常に低かった（図５０、パネルＤ～Ｆ）。一価Ｓ融合物と比較した二価ワクチンにおけるＳの発現の増加に基づいて、Ｔ細胞応答の増加は、Ｓの増加又はＮの存在を認識するＴ細胞のいずれかによって説明することができる。重要なことに、これらのＴ細胞応答は、ＩＬ－４（Ｔｈ２）と比較したＩＦＮ－γ（Ｔｈ１）の優勢によって特徴付けられた。３人の患者全員からのＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ヌルと比較して、３つのコンストラクト全ての有意に高い認識を示した（図５０、パネルＧ～Ｉ）。一部の個体では、特定のコンストラクトに対する応答が高かったが、Ｓ－融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ及びＮ－ＥＴＳＤに対する全体的な応答は類似していた。３人の患者全員からのＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ヌルよりも有意に高いレベルで二価及びＮ－ＥＴＳＤワクチンを認識した；３人の患者のうちの２人のみが、ヌルよりも有意に高い程度までＳ－融合物を認識した（図５０、パネルＪ～Ｌ）。これらのデータは、以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者由来のＴ細胞がワクチンベクター中のワクチン抗原（Ｓ及びＮ）の両方に対して反応性及び免疫記憶リコールを有することを示す。
【0168】
Ｓ－融合物の１つの特徴は、Ｓ－ＷＴと比較して高いＳ ＲＢＤの発現である。これは、ＲＢＤエピトープが免疫検出にほとんど利用できないことを示唆するＳ低温電子顕微鏡構造の初期の研究からの知見に基づくワクチン設計の目標であった。さらなる利点は、二価ワクチンにおいてＳをＮと組み合わせることから、一般に遺伝子発現に関して他者によって観察されている現象であるＳの免疫検出を増強するＮの能力を介して生じる。ワクチンにより発現されたＮタンパク質は、エンドソーム／リソソーム細胞内コンパートメント、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激するための重要な抗原提示経路に輸送され、その結果、それらは、樹状細胞をライセンスしてナイーブＣＤ８＋ ＣＴＬを活性化することができる。Ｎ－ＥＴＳＤは、ＭｏＤＣにおいてエンドソーム及びリソソーム、並びにオートファゴソームに局在化する。エンドソーム及びリソソームの両方の標的化は、抗原提示の増強及びＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化のために望ましい。リソソームは酸性オートファゴソームを融合させ、タンパク質プロセシングを促進することができる；これは、ＭＨＣクラスＩＩ提示の調節による効果的な免疫刺激に重要な意味を有する。以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者のＴ細胞は、ＮよりもＮ－ＥＴＳＤをより容易に認識した。本明細書に提示されたデータは、改変Ｎ－ＥＴＳＤを特異的に発現するワクチンコンストラクトの効力の増強の可能性を強く支持する。
【0169】
Ｔ細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染の排除に重要である。３６，７４－７８ ここで、ｈＡｄ５はＳ及びＮを発現し、強い抗原特異的ＩＦＮ－γを誘発したが、以前に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者のＴ細胞からのＩＬ－４分泌は実質的に誘発せず、Ｔｈ１優位を指摘した。抗ウイルス性Ｔｈ１サイトカイン応答は、ＳＡＲＳＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに密接に関連するウイルスを含む多様なウイルスを感染宿主７９から排除する。８０ これらのデータは、前臨床モデルにおける研究とも一致している。重要なことに、データは、Ｓ及びＮの両方がＢ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞記憶からの抗体産生の両方を助けるＣＤ４＋ Ｔ細胞の標的であり、これらが一緒になってウイルス感染標的を死滅させるように機能することを示唆する。Ｔ細胞サブセットによるこれらのワクチン抗原の認識は、病原体の免疫制御と一致する。興味深いことに、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ Ｔ細胞バイアスワクチンは、非感染患者を保護するだけでなく、Ｔ細胞を活性化してウイルス感染細胞を死滅させることによってウイルスの迅速なクリアランスを誘導し、それによってウイルス複製及び側方伝播を減少させるために、既に感染した患者のための治療薬としても利用される可能性を有する。重要なことに、Ｎ－ＥＴＳＤのＴ細胞リコールは、激しいインターフェロンｇ応答及び低いＩＬ－４応答によって示されるように、Ｔｈ１優位であることが示された。
【0170】
上記で使用した方法及びコンストラクト
実施例２５：ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォーム及びコンストラクト
本明細書における試験のために、第２世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターを使用して（図４４、パネルＡ）ウイルスワクチン候補コンストラクトを作製した。ＳＡＲＳＣｏＶ－２抗原発現インサート及びウイルス粒子を含有するｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］骨格を、以前に記載されたように作製した。簡単に述べると、Ｅ１及びＥ２ｂ発現Ｅ．Ｃ７パッケージング細胞株における連続増殖、続いてＣｓＣｌ２精製、及びＶｉｒａＱｕｅｓｔ Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ、ＩＡ）による保存緩衝液（２．５％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８、２５ｍＭ ＮａＣｌ）への透析によって、高力価アデノウイルスストックを作製した。ドデシル硫酸ナトリウム破壊及び２６０及び２８０ｎｍでの分光光度法により、ウイルス粒子数を決定した。ウイルス力価は、Ａｄｅｎｏ－Ｘ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて決定した。作製されたコンストラクトは：ｉ． Ｓ－ＷＴ：１２７３個のアミノ酸及び全てのＳドメインを含むＳタンパク質：細胞外（１～１２１３）、膜貫通（１２１４～１２３４）、及び細胞質（１２３５～１２７３）（Ｕｎｉｔｐｒｏｔ Ｐ０ＤＴＣ２）；ｉｉ． Ｓ融合物：ＲＢＤの表面発現及び提示を増強するように最適化されたＳ；ｉｉｉ． Ｎ：免疫検出のためのタグを含むヌクレオカプシド（Ｎ）野生型配列タンパク質；ｉｖ． Ｎ－ＥＴＳＤ：免疫検出のためのタグと共に増強Ｔ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）を有するＮ；並びにｖ． 二価Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ；
実施例２５：ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］プラットフォーム及びコンストラクト
本明細書における試験のために、第２世代ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターを使用して（図４４、パネルＡ）ウイルスワクチン候補コンストラクトを作製した。ＳＡＲＳＣｏＶ－２抗原発現インサート及びウイルス粒子を含有するｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］骨格を、以前に記載されたように作製した。簡単に述べると、Ｅ１及びＥ２ｂ発現Ｅ．Ｃ７パッケージング細胞株における連続増殖、続いてＣｓＣｌ２精製、及びＶｉｒａＱｕｅｓｔ Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ、ＩＡ）による保存緩衝液（２．５％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８、２５ｍＭ ＮａＣｌ）への透析によって、高力価アデノウイルスストックを作製した。ドデシル硫酸ナトリウム破壊及び２６０及び２８０ｎｍでの分光光度法により、ウイルス粒子数を決定した。ウイルス力価は、Ａｄｅｎｏ－Ｘ（商標）Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて決定した。作製されたコンストラクトは：ｉ． Ｓ－ＷＴ：１２７３個のアミノ酸及び全てのＳドメインを含むＳタンパク質：細胞外（１～１２１３）、膜貫通（１２１４～１２３４）、及び細胞質（１２３５～１２７３）（Ｕｎｉｔｐｒｏｔ Ｐ０ＤＴＣ２）；ｉｉ． Ｓ融合物：ＲＢＤの表面発現及び提示を増強するように最適化されたＳ；ｉｉｉ． Ｎ：免疫検出のためのタグを含むヌクレオカプシド（Ｎ）野生型配列タンパク質；ｉｖ． Ｎ－ＥＴＳＤ：免疫検出のためのタグと共に増強Ｔ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）を有するＮ；並びにｖ． 二価Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ；
【0171】
以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認された患者及びウイルスナイーブ志願者からの血漿及び末梢血単核細胞の収集：ＥＬＩＳＡによって確認されたようにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されていない（ＵＮＥＸ）志願者、及び複数の陰性ＳＡＲＳＣｏＶ－２試験によって確認された志願者、又は最近の病歴及び陽性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体試験によって示されたようにＣＯＶＩＤ－１９から回復した志願者（患者、Ｐｔ）からの静脈穿刺を介してインフォームドコンセントを得て血液を収集した。全血の第３の供給源は、商業的供給源（ＨｅｍａＣａｒｅ）からの健康な対象のアフェレーシスであった。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離によって全血から単離し、密度勾配遠心分離後に血漿を収集した。
【0172】
単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）は、前述したように８６、ＧＭ－ＣＳＦ（２００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ－４（１００Ｕ／ｍｌ）を使用してＰＢＭＣから分化された。簡単に述べると、単球をプラスチック上での接着によって濃縮した一方、非接着細胞を保存し、リンパ球、特にＴ細胞の供給源として凍結した。接着細胞を樹状細胞に分化させ（１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中３～５日）、次いで、後の使用のために液体窒素中で凍結した。Ｔ細胞を、ＭｏｊｏＳｏｒｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＣＤ３濃縮）を用いてＰＢＭＣの非接着性画分から濃縮した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を、同じ製造業者からの類似のキットを用いて濃縮した。細胞分離の効率をフローサイトメトリーによって評価した。
【0173】
ＭｏＤＣのｈＡｄ５ Ｎ－ＷＴ又はＮ－ＥＴＳＤによる感染、並びに抗Ｎ、抗ＣＤ７１、抗ＬＡＭＰ－１、及び抗ＬＣ３ａ／ｂ抗体による標識：解凍したてのＭｏＤＣを、４ウェルＬａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ ＣＣ２チャンバースライド上に、３×１０４細胞／ウェルを用いてプレーティングし、ｈＡｄ５ Ｎ－ＥＴＳＤ又はｈＡｄ５ Ｎを用いて、プレーティングの１時間後にＭＯＩ ５０００で形質導入を行った。スライドを３７℃でｏ／ｎでインキュベートし、４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、次いで１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ＰＢＳ中）で１５分間室温で透過処理した。Ｎを標識するために、次いで細胞を３％ ＢＳＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００及び０．０１％サポニンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、１：１０００で、４Ｃで一晩、抗フラグモノクローナル（マウスにおいて産生された抗Ｆｌａｇ Ｍ２）抗体と共にインキュベートし、続いて、ＰＢＳ中で３回洗浄し、１：５００で、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度クロス吸着二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ５５５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に１時間インキュベートした。共局在化試験のために、細胞をまた、１：２００で、ウサギ抗ＣＤ７１（トランスフェリン受容体、リサイクル／選別エンドソームマーカー）抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１：１０で、ヒツジ抗Ｌａｍｐ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート化（リソソームマーカー）抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、又は１：１００で使用されたウサギモノクローナル抗ヒトＬＣ３ａ／ｂ（Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ ３、オートファジーマーカー）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ ＃１２７４１Ｓ）を用いて、４Ｃで一晩インキュベートした。一次抗体を除去した後、ＰＢＳ中で２回洗浄し、３％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中で３回洗浄し、適用可能な場合、１：５００（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８；１：５００希釈）で細胞を蛍光コンジュゲート化二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。短時間の洗浄後、ＤＡＰＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ封入剤で細胞をマウントし、Ｋｅｙｅｎｃｅ ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡カメラ及びＫｅｙｅｎｃｅソフトウェアを使用して直ちに画像化した。
【0174】
以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者由来の血漿抗体の、ワクチン感染ＭｏＤＣによって発現された抗原への結合：以前に感染した対象由来の血漿抗体の、ＭｏＤＣの表面上に発現された抗原への結合を、ＭｏＤＣの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＤＣへの分化、ＭｏＤＣの感染、以前に感染した患者血漿とのインキュベーション、並びにフローサイトメトリーによる感染及び非感染ＭｏＤＣへの結合の検出によって決定した。
【0175】
ＭｏＤＣを、ｈＡｄ５ Ｓ－ＷＴ、Ｓ融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する「ヌル」コンストラクトを用いて、ＭＯＩ ５０００で感染させた（１２ウェルプレート中０．５ｘ１０６／ウェル）。感染の１日後、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を用いてＭｏＤＣを分離し、穏やかにピペットで移し、単一患者（Ｐｔ４）からの１：１００希釈の以前に感染した患者の血漿とのインキュベーションのために、（４℃）で３０分間移し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（フィコエリトリンコンジュゲート化）によってＭｏＤＣ表面上で血漿抗体を検出した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を上述したように取得した。データは、ＤＭＦＩ、即ち、感染ＭｏＤＣと非感染ＭｏＤＣとの間の結合の差としてグラフ化した。
【0176】
以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染した患者及びウイルスナイーブ個体のＴ細胞、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド抗原プールでパルスしたＭｏＤＣに応答したＩＦＮ－γの選択されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞分泌
【0177】
これらの試験で使用された以前に感染した患者由来のＴ細胞の、インビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を認識する能力を検証し、次いで、同様の分析を、選択されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞について実施した。簡単に述べると、ＭｏＤＣ（２×１０４）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド抗原（１μｇ／ｍｌ、Ｓ１及びＳ２プールＰＭ－ＷＣＰＶ－Ｓ－１を含むＰｅｐＭｉｘ Ｓ；並びにＮ ＰＭ－ＷＣＰＶＮＣＡＰ－１、両方ともＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でパルスし、次いでＭｏｊｏＳｏｒｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＣＤ３濃縮）を用いてＰＢＭＣの非接着性画分から濃縮した自己Ｔ細胞（１×１０５）を濃縮ＲＰＭＩ（１０％ヒトＡＢ血清）に加えた。細胞を、ＩＦＮ－γを標的とする固定化一次抗体を含むマイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で一晩（３７℃）培養し、次いで、ＩＦＮ－γスポット形成細胞をＥＬＩＳｐｏｔによって計数した。ＥＬＩＳｐｏｔ検出のために、細胞及び培地を除去するための吸引及び洗浄後に、ＩＦＮ－γを、ビオチンにコンジュゲートされたサイトカインに対する二次抗体によって検出した。ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して、ビオチンコンジュゲート化二次抗体を検出した。ウェル当たりのスポット数（１×１０５細胞）を、ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーを用いて計数した。ＩＬ－４は、抗ＩＬ－４抗体で予め被覆されたウェルを有するキット（ＭａｂＴｅｃｈ）を使用し、製造業者の説明書に従って、ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。ＩＬ－４検出のための残りの工程は、ＩＦＮ－γのためのものと同一であったが、ペルオキシダーゼではなくアルカリホスファターゼ検出であった。
【0178】
自己ｈＡｄ５ワクチン感染ＭｏＤＣに対する以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染した患者由来のＴ細胞反応性の決定：ＭｏＤＣをｈＡｄ５ Ｓ－融合物、Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ、Ｎ－ＥＴＳＤ、Ｎ又はＧＦＰ／ヌルコンストラクトで感染させ、３７℃で一晩インキュベートした。感染したＭｏＤＣを、同じ個体由来のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、又はＣＤ８＋ Ｔ細胞と共に一晩培養した。抗原特異的Ｔ細胞応答を、上述したようにＥＬＩＳｐｏｔを用いて計数した。
【0179】
ＡｄＶ／酵母組み合わせ及び酵母溶解物製剤
Ｎ－ＥＴＳＤ及び／又はＳ－融合物（又はＮ－ＥＴＳＤ及び／若しくはＳ－融合物と類似性を有するタンパク質）を発現するウイルスコンストラクトに加えて、Ｎ－ＥＴＳＤ及び／又はＳ－融合物（又はＮ－ＥＴＳＤ及び／若しくはＳ－融合物と類似性を有するタンパク質）はまた、以下でより詳細に議論されるように、抗原を提示する酵母細胞上、又は免疫原性をさらに高めるために溶解物として調製され得る酵母細胞内のいずれかで、酵母において発現され得る。
Ｎ－ＥＴＳＤ及び／又はＳ－融合物（又はＮ－ＥＴＳＤ及び／若しくはＳ－融合物と類似性を有するタンパク質）を発現するウイルスコンストラクトに加えて、Ｎ－ＥＴＳＤ及び／又はＳ－融合物（又はＮ－ＥＴＳＤ及び／若しくはＳ－融合物と類似性を有するタンパク質）はまた、以下でより詳細に議論されるように、抗原を提示する酵母細胞上、又は免疫原性をさらに高めるために溶解物として調製され得る酵母細胞内のいずれかで、酵母において発現され得る。
【0180】
図１２は、複数の経路にわたって耐久性があり、有効な免疫を誘発する理想的なワクチンの概念図を示す。容易に理解し得るように、ワクチン組成物は、好ましくは（必須ではないが）、酵母ワクチン組成物及びウイルスワクチン組成物から構成され、場合により、ＲＰ１８２などのマクロファージ分極剤及び免疫刺激性サイトカイン又はサイトカイン類似体（例えば、Ｎ－８０３）と合わせて構成される。
【0181】
酵母成分に関して、酵母は、組換え核酸１つ以上の目的の抗原、及びおそらくは、さらなるＤＡＭＰ又はＰＡＭＰ又はＳＴＩＮＧ経路シグナルから発現する組換え酵母であることが最も典型的に好ましい。そのように生成された組換え酵母は、典型的には、熱不活性化され、熱不活性化後に酵母は溶解される。最も好ましくは、酵母は圧力ホモジナイゼーションを用いて溶解され、次いで、ホモジネートは、好ましくは濾過によって清澄化される。しかしながら、細胞壁の酵素的又は化学的溶解、超音波処理、瞬間凍結／解凍などを含む、他の溶解方法も適切であると考えられることを理解するべきである。同様に、溶解物の清澄化はまた、遠心分離、沈降、凝集などを含み得る。
【0182】
容易に理解されるように、組換え抗原及び他の組換えタンパク質は、公知の発現カセットを用いて任意の適切なプロモーターから発現させることができる。例えば、図１３は、ＳＡＲＳ ＣｏＶヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において過剰発現される例示的な発現実験の結果を示す。図から分かるように、かなりの量の組換えタンパク質が酵母において発現された。
【0183】
マウスモデルを用いて、溶解したターモゲン（ｔａｒｍｏｇｅｎ）（組換え発現抗原を有する酵母）は、Ｔ細胞応答の誘導に関して、無傷ターモゲンよりも最大１５０倍高い免疫原性であった（数百匹のマウスにおける多数の抗原特異的Ｔ細胞活性化試験に基づく）。有利には、溶解された酵母は好ましい安全性プロファイルを有し、１０，０００の１０ ＹＵ用量を２時間のうちに１つの小規模圧力ホモジナイザーで調製することができる。無傷酵母は、Ｔｈ１－Ｔｈ１７を誘導し、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ６、ＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦを誘発するが、酵母溶解物は、強力なＴｈ１効果を明らかに誘導し、Ｔｈ１７を減少させた。したがって、無傷又は溶解酵母は、コロナウイルス特異的抗体を誘導する（例えば、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊａｕｔ．２００５．０１．００８、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１６／４１３１３２４、又はｓｆａｍｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／ｐｄｆ／１０．１１１１／ｌａｍ．１２１８８を参照されたい）。
【0184】
経口／粘膜投与のための製剤
さらなる実施形態では、保存中に安定であり、容易に投与され（例えば、経口投与）、ワクチンを受容した対象の胃を通過した後に溶解する（例えば、抗原性又はプレ抗原性ワクチン分子を放出する）固体剤形（例えば、粉末、錠剤、又はカプセル）を形成するためにアラゴナイトを使用するワクチン組成物の組成物及びワクチン組成物を製造するための方法が本明細書に開示される。
さらなる実施形態では、保存中に安定であり、容易に投与され（例えば、経口投与）、ワクチンを受容した対象の胃を通過した後に溶解する（例えば、抗原性又はプレ抗原性ワクチン分子を放出する）固体剤形（例えば、粉末、錠剤、又はカプセル）を形成するためにアラゴナイトを使用するワクチン組成物の組成物及びワクチン組成物を製造するための方法が本明細書に開示される。
【0185】
特に、本開示は、粉末、錠剤、又はカプセルの形態の固体投与ワクチンを与えるワクチン活性成分を負荷した複数のアラゴナイト粒子から作製されたアラゴナイト組成物に関する。より具体的には、ワクチン組成物は、複数のアラゴナイト粒子とブレンドされ、それによってその表面上に負荷された、関連する感染／疾患に対応する抗原を発現するための粉末形態（例えば、凍結乾燥された）組換え発現コンストラクトを含み得る。例示的な実施形態では、ワクチン組成物は、コロナウイルスに対して免疫する。好ましくは、組換え発現コンストラクトは、少なくとも１つの抗原性コロナウイルスタンパク質又はタンパク質断片を発現するアデノウイルスコンストラクトである。
【0186】
特に、現在企図されている固体剤形におけるアラゴナイトの使用は、費用効率の高い製造及び安定なワクチン組成物の容易な投与を可能にする。このように、現在企図されているワクチン錠剤又はカプセルは、大量生産され、容易に輸送され得る。さらに、固体剤形は、医療従事者を必要とせずにほとんどの人が自己投与することができる経口投与を可能にする。錠剤形態はまた、ロゼンジを形成するために、追加の賦形剤及び／又は添加剤（例えば、香料及びゼラチン）を用いて作製され得る。
【0187】
アラゴナイト（例えば、魚卵状アラゴナイト）は、天然に沈殿した炭酸カルシウムの最も純粋な形態の１つである。図１を参照すると、アラゴナイトは、斜方晶系、両錐体、特徴的な針状結晶の結晶形態を有し、したがってカルサイト及びバテライトとは区別される。アラゴナイトは、炭酸カルシウム鉱物の機械的及び化学的特性を利用する様々な目的のために使用することができるように、様々な形状に再結晶及び／又は再形成するために加工することができる。本明細書に開示されるようなアラゴナイト粒子は、規則的（例えば、球形、又は卵形）又は不規則な形状を有する固体物質である。本明細書で使用される場合、アラゴナイト粒子は、１００ｎｍ～１ｍｍの平均粒径を有する。アラゴナイト粒子を粉砕するための方法は、米国特許出願公開第２０２０／０３０８０１５号明細書に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、アラゴナイト粒子をきれいなトップサイズを有する２．０～３．５ミクロンサイズに粉砕する方法が開示されている。きれいなトップサイズとは、２．０～３．５ミクロン又は２．５～３．５ミクロンのサイズ範囲に設定した分級機を用いて、開示された粉砕方法を用いて製造された場合、非常に少ない粒子が３．５ミクロンサイズよりも大きいことを意味する。したがって、米国特許出願公開第２０２０／０３０８０１５号明細書の方法を使用する本明細書に開示されるようなアラゴナイト粒子は、従来のＧＣＣよりもきれいなトップサイズを有する。
【0188】
アラゴナイトの吸着容量は、３つのパラメータの関数である：（１）表面電荷（「ζ（ゼータ）電位」としても知られる）；（２）表面積／空隙比；及び（３）粒子溶解度。これらの３つのパラメータを正確に測定することによって、所与の条件下でどの材料がアラゴナイト粒子表面に吸着するかを決定することができる。特に、アラゴナイトのゼータ電位は、グリセロール及びソルビトールなどの界面活性剤の安定性を増加させる。
【0189】
さらに、アラゴナイトは、２ｎｍ未満の直径（即ち、高い「微孔性」）を有する粒子中に、天然で多数の測定可能な細孔を有する。例えば、欧州特許第２７１９３７３号明細書を参照されたい。したがって、アラゴナイトプラットフォームは、活性成分粒子を強力に一緒に把持し、充填されたアラゴナイトを固体剤形（例えば、粉末、錠剤、又はカプセル）に製剤化することを可能にする。
【0190】
有利には、未処理のアラゴナイトは、中性ｐＨ（７．８～８．２）、天然の親水性、電子電荷（ゼータ電位）を有し、アミノ酸及びタンパク質との窒素性対合を既に作り出している。任意の１つの理論に束縛されるものではないが、アラゴナイトのこれらの有利な特性は、アラゴナイトを周囲条件下で準安定にする。より具体的には、アラゴナイト粒子は、天然で約２～３％のアミノ酸含有量を含み、その大部分は、アラゴナイト表面を親水性にするアスパラギン酸（約２５～３０％）及びグルタミン酸（約８～１０％）である。例えば、Ｍｉｔｔｅｒｅｒ，１９７２，Ｇｅｏｃｈｉｍｉｃ ｅｔ Ｃｏｓｍｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，３６：１４０７－１４２２を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態では、ワクチン組成物（例えば、組換えアデノウイルス）は、アラゴナイト粒子の天然の未処理表面に直接結合される。
【0191】
現在、市場で利用される炭酸カルシウムは、粉砕炭酸カルシウム（ＧＣＣ）、沈降炭酸カルシウム（ＰＣＣ）（合成）、及び／若しくは石灰石生産物として、又はそれらから加工される。生産される生成物は、異なる属性を有する商品グレードである。きれいな粒径分布（ＰＳＤ）トップサイズ及び低い保持率を得るために、を得るために、ほとんどの企業は、ハイソリッド又はローソリッドのいずれかによる湿式粉砕プロセスを利用する。本明細書で使用される場合、アラゴナイトは、ＧＣＣ、ＰＣＣ及び石灰石とは区別される、斜方晶系、両錐体、及び特徴的な針状結晶の結晶形態を有する天然アラゴナイトを指す。例えば、米国特許出願公開第２０２０／０３０８０１５号明細書に開示されているシステム及び方法を用いてボールミル加工されたアラゴナイトは、きれいなトップサイズを有する２．０～３．５ミクロンサイズのアラゴナイト粒子を生成することができる。きれいなトップサイズとは、２．～３．５ミクロンサイズ範囲又は２．０～３．５ミクロンサイズ範囲に設定された分級機を用いて、このシステム及び方法を用いて製造された場合、非常に少ない粒子が３．５ミクロンサイズよりも大きいことを意味する。例えば、開示されたシステムを用いてこの設定範囲で生成されたアラゴナイトの場合、同じメジアン（Ｄ５０）粒径分布（ＰＳＤ）を有するＧＣＣ生成物と比較して、＜０．０００５％のみが３２５メッシュ上に保持され、＜０．０００７％のみが５００メッシュ上に保持される。したがって、企図されるシステム及び方法を用いて生成されるアラゴナイトは、従来のＧＣＣよりもきれいなトップサイズを有する。
【0192】
有利には、アラゴナイトから作製された固体剤形は、経口投与によって摂取することができる固体ワクチン形態を提供する。腸溶コーティングを有する本開示の固体形態は、摂取され、内側コアに負荷された抗原性分子は、胃を通過した後まで放出されず、それによって、血流中への抗原性又はプレ抗原性分子の吸収、及び免疫細胞への送達が可能になる。本明細書で使用される場合、抗原性分子とは、アラゴナイト粒子とブレンドされ、アラゴナイト粒子の表面上に負荷された所望のワクチン活性成分を指す。これらの抗原性分子は、アラゴナイト粒子上に負荷された形態で抗原性であり得るか、又はそれらは、少なくとも１つの抗原性タンパク質若しくは断片を産生（例えば、発現）することができる分子（例えば、発現ベクター）であり得る。このように、本明細書に開示される活性成分又はワクチン活性成分は、別段の指定がない限り、抗原性分子及びプレ抗原性分子の両方を含む抗原性分子と称される。
【0193】
例示的な実施形態では、アラゴナイトワクチン組成物は、ｉ）アラゴナイト及び特異的抗原性分子から作製される内側コアと、ｉｉ）内側コアの外面全体が外側コアのみと接触し、内側コアの表面が露出しないように、内側コアを完全に囲むアラゴナイトの外側コアと、ｉｉｉ）外側コアの外面全体を覆うコーティングとを含む。好ましくは、内側コアは、少なくとも２ｕｍ以上の直径を有するアラゴナイト粒子から作製され、それによって、その上に特異的抗原性分子を捕捉及び負荷するための表面積を提供する。好ましくは、外側コアは、いかなる抗原性分子も含まず、９０％～１００％のアラゴナイトから作製される。より好ましくは、外側コアは、１００％のアラゴナイトのみを含む。固体組成物の外側コーティングは、胃の高酸性、低ｐＨ環境（例えば、約３のｐＨ）で安定であり、小腸のより高いｐＨ（例えば、約７～９のｐＨ）で溶解する任意の適切なコーティング（例えば、腸溶コーティング）であり得る。腸溶コーティングの適切な例としては、メタクリル酸、アクリル酸エチル、及び／又は可塑剤／安定剤（例えば、クエン酸トリエチル（ＴＥＣ））などのバイオポリマー分散液が挙げられる。さらに、粘着防止剤（ａｎｔｉ－ｔａｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）もまた、腸溶コーティング（例えば、モノステアリン酸グリセロール）と組み合わされ得る。
【0194】
特定の実施形態では、内側コアは、抗原性分子の凍結乾燥粉末とブレンドされた、少なくとも２ｕｍ以上（例えば、２～３．５ｕｍ）の直径を有するアラゴナイト粒子から作製される。いくつかの実施形態では、さらなる賦形剤がアラゴナイト及び抗原性分子とブレンドされる。例えば、ジメチルグリシン及び／又はメチルスルホニルメタン（ＭＳＭ）を、抗原性分子の凍結乾燥粉末と組み合わせ、アラゴナイト粒子とブレンドすることができる。
【0195】
さらなる例示的な実施形態では、凍結乾燥された抗原性分子は、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＣｏＶ２）の少なくとも１つの抗原性タンパク質又は最適化されたタンパク質又はその断片に対応する（即ち、コードする）核酸を有する凍結乾燥された組換え発現ベクターを含む。例えば、本明細書に開示される企図される固体剤形ワクチン組成物は、コロナウイルス２ウイルス（ＣｏＶ２）の核タンパク質（Ｎ）タンパク質及びスパイク（Ｓ）タンパク質のうちの少なくとも１つの抗原をコードし得、その両方は、全てのタイプのコロナウイルスにおいて保存されている。一実施形態では、抗原コード分子は凍結乾燥された組換え体であり、組換え体は、ＣｏＶ２のヌクレオカプシドタンパク質若しくはその断片をコードする核酸を含み、及び／又は組換え体は、ＣｏＶ２のスパイクタンパク質若しくはその断片をコードする。ワクチン製剤は、コロナウイルス媒介疾患又は感染症などの疾患を治療するのに有用であり得る。したがって、別の実施形態では、それを必要とする患者におけるコロナウイルス疾患を治療するための方法が開示され、その方法は、少なくともＣｏＶ２ Ｎタンパク質又はその断片をコードし、好ましくは、ＣｏＶ２ Ｎタンパク質又はその断片とＣｏＶ２ Ｓタンパク質又はその断片の両方をコードする核酸を含む組換え体を含む固体剤形ワクチン組成物を対象に投与することを含む。本明細書において企図されるコロナウイルスは、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）及び／又は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）であり得る。
【0196】
さらなる例示的な実施形態では、本明細書に開示される企図される固体剤形ワクチン組成物は、二価ヒトアデノウイルス血清型５（ｈＡｄ５）発現ベクターで作製された凍結乾燥組換え体とブレンドされたアラゴナイトを含む。ｈＡｄ５は、既存のアデノウイルス免疫を有する患者において免疫を誘導することができ、コロナウイルス２スパイク（Ｓ）タンパク質及び／又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を標的とする抗体を産生するための抗原を発現する。例えば、ｈＡｄ５ ＣｏＶ２は、配列番号１に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する修飾ヌクレオカプシドタンパク質をコードし得る。より具体的な実施形態では、ｈＡｄ５は、細胞表面発現に最適化されたＳ配列（Ｓ－融合物）と、エンドソーム細胞内コンパートメントに輸送されるように設計された保存されたヌクレオカプシド（Ｎ）抗原との両方を含み、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１６／８８３，２６３号明細書に開示されているように、ＣｏＶ２に対する耐久性のある免疫防御を生じさせる可能性がある。例えば、ｈＡｄ５ ＣｏＶ２は、各々配列番号４又は配列番号３に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するＳ－融合物又はＳ－ＨＡタンパク質をコードし得る。
【0197】
有利には、二価ｈＡＤ５ワクチンは、以下を提供する：（ｉ）表面発現がほとんど検出されなかったＳ－ＷＴ（野生型）と比較して改善されたＳ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）細胞表面発現を有する最適化されたＳ－融合物；（ｉｉ）Ｓ－融合物からの発現されたＲＢＤは、ＡＣＥ２－Ｆｃによるコンフォメーションの完全性及び認識を保持した；（ｉｉｉ）増強Ｔ細胞刺激ドメイン（ＥＴＳＤ）で修飾されたウイルスＮタンパク質は、ＭＨＣ Ｉ／ＩＩ提示のためにエンドソーム／リソソーム細胞内コンパートメントに局在化された；並びに（ｉｖ）Ｓ及びＮに対するこれらの最適化（Ｓ－融合物及びＮ－ＥＴＳＤ）は、下記により詳細に示すように、抗原ナイーブ前臨床モデルにおいて増強されたデノボ抗原特異的Ｂ細胞並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を生じた。
【0198】
好ましい実施形態では、凍結乾燥二価ｈＡｄ５ワクチンは、エンドソーム標的化配列に融合されたコロナウイルス２（ＣｏＶ２）ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質をコードする核酸（Ｎ－ＥＴＳＤ）、及び細胞表面発現のために最適化されたＣｏＶ２スパイク（Ｓ）タンパク質配列をコードする核酸（Ｓ－融合物）と共に、Ｅ１、Ｅ２ｂ、及びＥ３遺伝子領域欠失を有する複製欠損アデノウイルスを含む。典型的には、ｈＡｄ５アデノウイルス中のＣｏＶ２ Ｎ－ＥＴＳＤタンパク質をコードする核酸は、配列番号２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。より典型的には、ｈＡｄ５アデノウイルスにおいてコードされるＣｏＶ２ Ｎ－ＥＴＳＤタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。典型的には、ｈＡｄ５アデノウイルス中のＣｏＶ２ Ｓ－ＨＡ又はＳ－融合物タンパク質をコードする核酸は、各々配列番号５又は配列番号６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。より典型的には、ｈＡｄ５アデノウイルスにおいてコードされるＣｏＶ２ Ｓ－ＨＡ又はＳ－融合物タンパク質は、配列番号３又は配列番号４に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。
【0199】
さらなる実施形態では、凍結乾燥二価ｈＡｄ５ワクチンはまた、輸送配列、同時刺激性分子、及び／又は免疫刺激性サイトカインをコードする核酸を含み得る。コードされた同時刺激性分子の例としては、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ－Ｌ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ－Ｌ、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ－１、及びＬＦＡ３のうちの１つ以上が挙げられる。免疫刺激性サイトカインの例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（Ｎ８０３）、ＩＬ－２１、ＩＰＳ１、及びＬＭＰ１のうちの１つ以上が挙げられる。
【0200】
異なる視点から見ると、（ａ）少なくとも野生型若しくは修飾ヌクレオカプシドタンパク質；及び／又は（ｂ）少なくとも１つの野生型若しくは修飾スパイクタンパク質をコードする核酸を含む、凍結乾燥形態のウイルスベクターとブレンドされたアラゴナイト粒子から作製されたコロナウイルスワクチン組成物（例えば、組換えアデノウイルスゲノムを含み、場合により欠失型又は非機能性Ｅ２ｂ遺伝子を含む凍結乾燥粉末組成物）の固体剤形が本明細書で企図される。ウイルスベクターは、同時刺激性分子をさらに含み得る。典型的には、核酸は、核酸によってコードされるペプチド生成物を細胞質、エンドソームコンパートメント、又はリソソームコンパートメントに導くための輸送シグナルをコードし、ペプチド生成物は、ペプチド生成物の細胞内代謝回転を増強する配列部分をさらに含むであろう。
【0201】
議論したように、アラゴナイトは凍結乾燥ワクチン活性成分の直接結合を可能にするので、固体投与ワクチン組成物の製造及び調製が可能である。したがって、開示される固体剤形ワクチンを作製するための企図される方法は、本明細書及び米国特許出願公開第２０２０／０３０８０１５号明細書（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、ワクチン活性成分を（例えば、混合によって）粉砕アラゴナイト粒子に負荷することによって、アラゴナイト及びワクチン活性成分の内側コアを形成することを含む。凍結乾燥ワクチン活性成分をアラゴナイト粒子とブレンドする任意の適切な方法を使用することができる。粉砕アラゴナイト粒子（例えば、２ｕｍ～３．５ｕｍのＤ５０ ＰＳＤを有する）の凍結乾燥ワクチン活性成分との負荷又は混合は、任意の従来の方法論によって行うことができる。アラゴナイトと活性成分との混合は、アラゴナイト及び凍結乾燥活性成分の両方の乾燥重量を、回転／反転に適した密閉容器内に混合することを含む。例えば、アラゴナイト及び活性成分の反転又は回転は、約５分間～３０分間まで行うことができる。例えば、ワクチン組成物は、ミキサー（例えば、タンブリングミキサー）又はブレンダー中で固体剤形上に負荷され得る。アラゴナイトの量は、凍結乾燥活性成分の量及び免疫応答を誘導するための活性成分の決定された力価に応じて変動し得る。例えば、本明細書に開示される凍結乾燥二価ｈＡｄ５ワクチンの有効用量は、１カプセル（又は錠剤）当たり約１×１０９ＩＵであり得る。したがって、２．２１×１０７ＩＵ／ｍｇの力価を有する凍結乾燥二価ｈＡｄ５ワクチン組成物は、カプセル当たり約４５．２５ｍｇの凍結乾燥二価ｈＡｄ５粉末を必要とする。いくつかの実施形態では、固体単一カプセルの重量は、約３００ｍｇ～６００ｍｇであり得る。特定の実施形態では、５５０ｍｇカプセルの場合、約４０～６０ｍｇの凍結乾燥活性成分（例えば、Ｎ及びＳ ＣｏＶ２タンパク質の両方の凍結乾燥二価ｈＡＤ５発現）を、４９０～５１０ｍｇのアラゴナイトと混合する。２．２１×１０７ＩＵ／ｍｇの力価を有する活性成分の場合、４５．２５ｍｇの凍結乾燥活性成分を約５０４．７５ｍｇのアラゴナイトとブレンドし得る。混合物の錠剤又はカプレット形成は、当技術分野で公知の任意の適切なカプセル化方法及び／又はキットを用いて実施することができる。たとえば、Ｃａｐｓｕｌｅ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｆｉｌｌｅｒ（Ｉｔｅｍ＃ ＣＰＭ１００１／２０８１６７７）。
【0202】
好ましい実施形態では、固体用量ワクチン錠剤又はカプセル剤を作製するための企図される方法はまた、内側コアを包含する（例えば、完全に包み込む）アラゴナイトの外側コアを作製することを含む。典型的には、外側コアは、ほとんど（例えば、少なくとも９０％の）アラゴナイトから作製され、より典型的には、外側コアは、少なくとも９９％のアラゴナイトから作製される。
【0203】
経口投与のために錠剤又はカプセル中で抗原性分子を血流に送達するために、抗原性分子は、胃を通過し、腸（例えば、小腸）中での吸収に利用可能になるまで、外側コアによって包含される内側コア中に残存しなければならない。したがって、外側コアは、胃の低ｐＨ（例えば、約３のｐＨ）で安定であり、腸のより高いｐＨ（例えば、約７～９のｐＨ）で溶解する腸溶コーティングで被覆される。固体組成物の外側コーティングは、任意の適切な腸溶コーティングであり得る。腸溶コーティングの例としては、トリエチルシトレート（ＴＥＣ）中のメタクリル酸及び／又はエチルアクリレートポリマーが挙げられる。腸溶コーティングを適用するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、被覆デバイス又は装置を使用することができる。被覆デバイスの具体例としては、ＰｒｏＣｏａｔｅｒ（Ｔｏｒｐａｃ製）が挙げられる。
【0204】
ｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎと混合したアラゴナイト粒子又はラクトースから作製した被覆（Ｃ）及び非被覆（ＮＣ）カプセルを酸（ＨＣｌ）に曝露して、様々なカプセルの酸透過性を決定した。例えば、図２は、０．１Ｍ塩酸（ＨＣＬ）中の非被覆アラゴナイトカプセル（サンプル＃６）中の二価ヒトアデノウイルス血清型５ ＣＯＶＩＤ－スパイク及びヌクレオカプシド抗原ワクチン（ｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎ）の３つの写真（右から左：１、２、３）を示し、示されるように、カプセル中で観察されたしわ、膨潤、又は穴を有する：１）：ＨＣＬ酸曝露の２分後；２）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後；並びに３）ＨＣＬ酸曝露の２時間後、及び乾燥。図３は、０．１Ｍ ＨＣＬ中の非被覆アラゴナイトカプセル（サンプル＃７又は＃８）中のｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎの３つの写真（右から左：１、２、３）を示し、示されるように、カプセル中で観察された膨潤、ねじれ、又は穴を有する：１）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃７；２）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃８；３）ＨＣＬ酸曝露の２時間後、及び乾燥。図４は、０．１Ｍ ＨＣＬ中の非被覆ラクトースカプセル（サンプル＃３又は＃４）中のｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎの２つの写真（右から左：１、２）を示し、示されるように、観察されたカプセルの膨潤を有する：１）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃３；２）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃４。図５は、０．１Ｍ ＨＣＬ中の被覆アラゴナイトカプセル（サンプル＃１又は＃５）中のｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎの２つの写真（右から左：１、２）を示し、示されるように、観察されたカプセルの膨潤を有する：１）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃１；２）：ＨＣＬ酸曝露の２時間後のサンプル＃５。明らかに、被覆されたカプセルは、酸中で安定であった。
【0205】
図６～１１に示すように、サンプルカプセルを、グラム当たりの感染単位（ＩＦＵ／グラム）及びウイルス回収率のパーセントについてさらにアッセイした。より具体的には、図６は、示されるように、示されたｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎカプセルタイプについてのグラム当たりの感染単位（ＩＦＵ／グラム）（ｙ軸）を示す。図７は、示されるように、各ｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎカプセルタイプについてのウイルス回収率の百分率（％）（ｙ軸）を示す。図８は、示されるように、各ｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／ＮカプセルタイプについてのＩＦＵ／グラム及び対応するｐＨを示す。図９は、示されるように、各ｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎカプセルタイプについてのウイルス回収率の百分率（％）を示す。図１０は、示されるように、各ｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎカプセルタイプについて回収されたウイルスのパーセントを示し、酸処理は陰影を有するものについて示される。図１１は、示されるように、各ｈＡＤ５－ＣＯＶＩＤ－Ｓ／Ｎカプセルタイプについての感染単位／グラムを示し、酸処理は陰影を有するものについて示される。結果を以下の表２にまとめる。
【0206】
【表1】
【0207】
代替的な実施形態では、企図される剤形は、ワクチン組成物の添加前に二酸化炭素（ＣＯ２）で含浸された（即ち、結合された）アラゴナイトの内側コアを含む。例えば、欧州特許第２７１９３７３号明細書及び米国特許出願公開第２０２０／０１５５４５８号明細書を参照されたい。さらなる実施形態では、企図される剤形は、ワクチン組成物の添加前に、アラゴナイトと混合及び処理した、生体適合性ポリマー及び／又は崩壊剤を有するアラゴナイトを含む。典型的には、ワクチン組成物を添加する前に、アラゴナイトにＣＯ２を含浸させ、生体適合性ポリマー及び崩壊剤の両方と混合する。より典型的には、ワクチン組成物を添加する前に、アラゴナイトにＣＯ２を含浸させ、生体適合性ポリマー及び崩壊剤と混合し、固体形態に形成する（例えば、圧縮する）。例えば、欧州特許第２７１９３７３号明細書及び米国特許出願公開第２０２０／０１５５４５８号明細書を参照されたい。
【0208】
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるように、アラゴナイトを二酸化炭素（ＣＯ２）と結合させ、少なくとも１つの生体適合性ポリマーと混合してもよい。典型的には、ＣＯ２結合アラゴナイトと生体適合性ポリマーとの重量比は、約９５：５～５：９５である。さらなる実施形態では、生体適合性ポリマーは、ホットメルト押出生体適合性ポリマーである。例示的な生体適合性ポリマーとしては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド６６（ナイロン）、ポリカプロラクタム、ポリカプロラクトン、アクリルポリマー、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリベンゾイミダゾール、ポリカーボネート、ポリフェニレンオキシド／スルフィド、ポリポピレン（ｐｏｌｙｐｏｐｙｌｅｎｅ）、テフロン、ポリ乳酸、脂肪族ポリエステル、例えばポリヒドロキシブチレート、ポリ－３－ヒドロキシブチレート（Ｐ３ＨＢ）、ポリヒドロキシバレレート、ポリヒドロキシブチレート－ポリヒドロキシバレレートコポリマー、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシバレレート）、ポリグリコネート、ポリ（ジオキサノン）及びそれらの混合物が挙げられる。好ましくは、生体適合性ポリマー樹脂は、ＰＬＡである。
【0209】
製造及び包装の必要性によって決定されるように、固体剤形の内側コア及び／又は外側コアに追加の賦形剤を加えてもよい。追加の賦形剤としては、イオン交換樹脂、ゴム、キチン、キトサン、粘土、ゲランゴム、架橋ポラクリリンコポリマー、寒天、ゼラチン、デキストリン、アクリル酸ポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム／カルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、セラック又はその混合物、潤滑剤、内相潤滑剤、外相潤滑剤、衝撃改質剤、可塑剤、ロウ、安定剤、顔料、着色剤、香味剤、矯味剤、香料、甘味剤、口当たり改善剤、結合剤、希釈剤、フィルム形成剤、接着剤、緩衝剤、吸着剤、臭気マスキング剤及びそれらの混合物が挙げられる。
【0210】
代替的な実施形態では、アラゴナイト粒子表面を処理して、結合表面を改質することができる。例えば、ステアリン酸（即ち、オクタデカン酸）による処理は、米国特許出願第１６／８５８，５４８号明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０／２９９４９号明細書に開示されているように、疎水性表面を提供する。タンパク質負荷のために、リン酸によるアラゴナイトの処理は、ラメラ構造を形成する。反応性基をアラゴナイトのアミノ酸表面に結合するためのさらなるコンジュゲーション技術は、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０１３に開示されているように、当技術分野において公知である。
【0211】
経口／粘膜ワクチン
上記の製剤に少なくとも部分的に基づいて、本開示はまた、ワクチンを投与、モニタリング、及びアッセイするための方法及び組成物を提供する。企図される方法は、患者においてウイルスに対する免疫を誘導すること、患者の鼻腔粘膜、口腔粘膜、及び／又は消化管（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ）粘膜への送達によって患者にワクチン組成物を投与することによって、患者にワクチン組成物を投与することを含む。好ましくは、ワクチンは、ＳＡＲＳ様コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を標的とする。本明細書に記載される経口ワクチン組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ又はＮタンパク質に対する任意の初期プライムワクチン接種に対するブースターワクチン接種としての役割を果たすことができる。
上記の製剤に少なくとも部分的に基づいて、本開示はまた、ワクチンを投与、モニタリング、及びアッセイするための方法及び組成物を提供する。企図される方法は、患者においてウイルスに対する免疫を誘導すること、患者の鼻腔粘膜、口腔粘膜、及び／又は消化管（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ）粘膜への送達によって患者にワクチン組成物を投与することによって、患者にワクチン組成物を投与することを含む。好ましくは、ワクチンは、ＳＡＲＳ様コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を標的とする。本明細書に記載される経口ワクチン組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ又はＮタンパク質に対する任意の初期プライムワクチン接種に対するブースターワクチン接種としての役割を果たすことができる。
【0212】
本明細書に記載される経口ワクチン組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）及び／又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質に対する任意の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンに対するブースターワクチンとして使用することができる。このブースターは、本明細書に記載されるもの以外の抗Ｓ又は抗Ｎワクチンで免疫された患者においてさえも機能し得る。特定の実施形態では、初期プライムワクチンは、Ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子ワクチン、例えば、Ｍｏｄｅｒｎａ及びＰｆｉｚｅｒによって現在試験されているワクチンであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるブーストは、初期プライムワクチン接種の少なくとも７日後に、例えば、少なくとも８日後、少なくとも９日後、少なくとも１０日後、少なくとも１１日後、少なくとも１２日後、少なくとも１３日後、少なくとも１４日後、少なくとも１５日後、少なくとも１６日後、少なくとも１７日後、少なくとも１８日後、少なくとも１９日後、少なくとも２０日後、少なくとも２１日後、少なくとも２８日後、少なくとも３５日後、又は少なくとも４２日後に投与される。本明細書に記載されるブーストは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体産生及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞媒介免疫の両方を効果的に改善することができる。
【0213】
好ましくは、患者の粘膜組織における免疫を誘導するために投与されるワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンである。例示的な実施形態では、ワクチンは、Ｅ１遺伝子領域欠失及びＥ２ｂ遺伝子領域欠失を含む複製欠損アデノウイルスコンストラクトである。特定の実施形態では、アデノウイルスは、配列番号４に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の一次配列同一性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク融合タンパク質抗原をコードする配列（例えば、配列番号１２）を含む。特定の実施形態では、アデノウイルスは、配列番号１１に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の一次配列同一性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２修飾スパイクタンパク質抗原をコードする配列（例えば、配列番号１３）を含む。特定の実施形態では、アデノウイルスは、米国特許出願第１６／８８０，８０４号明細書及び米国特許第６３／０１６，０４８号明細書（その両方の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、Ｊ鎖部分も含み得るＡＣＥ２－Ｆｃハイブリッドコンストラクトを形成する、免疫グロブリンＦｃ部分に結合した可溶性ＡＣＥ２タンパク質をコードする配列を含む。他の例示的な実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（例えば、アデノウイルスコンストラクト）は、組換え可溶性ＡＣＥ２タンパク質（例えば、配列番号１０）の突然変異体を含み、この突然変異体は、米国特許第６３／０２２，１４６号明細書（その両方の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤタンパク質ドメインに対するＡＣＥ２タンパク質の結合親和性の増大を付与する少なくとも１つの突然変異アミノ酸残基（例えば、置換による）を有する。別の例示的な実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（例えば、アデノウイルスコンストラクト）は、米国特許出願第１６／８８３，２６３号明細書及び米国特許第６３／００９，９６０号明細書（その両方の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、エンドソーム標的化配列（ＮＥＴＳＤ）に融合されたＣｏＶ２ヌクレオカプシドタンパク質又はＣｏＶ２スパイクタンパク質を含む。追加的又は代替的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、米国特許第６３／０１０，０１０号明細書に開示されているように、酵母細胞表面上にコロナウイルススパイクタンパク質を発現するように遺伝子操作された改変酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を含み、それによって、酵母提示細胞がＢ細胞を刺激する（例えば、液性免疫）。本明細書に記載される組成物及び方法の有利な特徴は、以下の実施例によってさらに例示される（ただし、これらに限定されない）。
【0214】
実施例２６：ＮＨＰワクチン接種
アカゲザルの２つの群（１群当たり５匹）を、上述したアデノウイルス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンで０日目に皮下免疫した。免疫化前に各アカゲザルから血液を採取した。１４日目に、アカゲザルの１つの群（群１）は、同じワクチンの別の皮下ブースター注射を受け、一方、別の群（群２）は、本明細書に記載される経口ワクチン（配列番号１２又は配列番号１３を有するＥ１－／Ｅ２ｂ－ Ａｄ５）を受けた。２８日目に、両群は、経口ワクチンブースター用量を受けた。２匹のアカゲザル（対照）に、示された時点でシャム（ｓｈａｍ）を用いてワクチン接種した。１４、２１、２８、３５及び４２日目に血液を採取した。
アカゲザルの２つの群（１群当たり５匹）を、上述したアデノウイルス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンで０日目に皮下免疫した。免疫化前に各アカゲザルから血液を採取した。１４日目に、アカゲザルの１つの群（群１）は、同じワクチンの別の皮下ブースター注射を受け、一方、別の群（群２）は、本明細書に記載される経口ワクチン（配列番号１２又は配列番号１３を有するＥ１－／Ｅ２ｂ－ Ａｄ５）を受けた。２８日目に、両群は、経口ワクチンブースター用量を受けた。２匹のアカゲザル（対照）に、示された時点でシャム（ｓｈａｍ）を用いてワクチン接種した。１４、２１、２８、３５及び４２日目に血液を採取した。
【0215】
次に、これらのアカゲザルから示された時点で採取された血清サンプルを、抗スパイクタンパク質ＩｇＧ及びＩｇＭ血清反応性についてＥＬＩＳＡによって評価した。簡単に述べると、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ＃０７－２００－６４２）を、被覆緩衝液（０．０５Ｍ炭酸塩－炭酸水素塩、ｐＨ ９．６）に懸濁した精製組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来スパイクタンパク質（Ｓ－融合物。ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．）の１μｇ／ｍＬ溶液５０μＬ／ウェルで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。個々の９６ウェルプレートを、各免疫グロブリン型（ＩｇＧ又はＩｇＭ）について、１５０μＬのＴＰＢＳ溶液（ＰＢＳ ＋ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で各ウェル当たり３回洗浄することによって調製した。次いで、１００μＬ／ウェルのブロッキング溶液（ＴＰＢＳ中の２％非脂肪乳）を添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。血漿及び血清サンプルを、使用前に５６℃で１時間熱不活性化した。血漿、血清又は抗体サンプルの段階希釈物を、ＴＰＢＳ中の１％非脂肪乳中で調製した。プレートを上述したように洗浄し、５０μＬ／ウェルの各段階希釈物をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを２００μＬのＴＰＢＳで３回洗浄した。各ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）クロス吸着、ＨＲＰ、ポリクローナル；又はヤギ抗ヒトＩｇＭ（重鎖）クロス吸着二次抗体、ＨＲＰ（各々ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ＃６２－８４２－０又はＡ１８８４１）の希釈物（１：６０００）を１％非脂肪乳／ＴＰＢＳ中で調製し、５０μＬ／ウェルのこれらの二次抗体を、免疫グロブリン型（ＩｇＧ又はＩｇＭ）ごとに別々の反応／プレートに加え、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを２００μＬのＴＰＢＳで３回洗浄した。１つの成分（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質、５０μＬ／ウェル、ＶＷＲ、Ｃａｔ＃１００３５９－１５６）を各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートし、次いで、５０μＬ／ウェルの１Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を添加することによって反応を停止した。４５０ｎｍにおける光学密度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）を用いて測定した。Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＬＬＣ）を用いてデータを分析し、免疫化アカゲザルから採取した血清サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに対するＩｇＧ血清反応性を検出するＥＬＩＳＡ結果を示す図１４に示した。
【0216】
実施例２７：ＮＨＰチャレンジ
５６日目に、アカゲザルをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスへの呼吸器曝露でチャレンジした。５６～６３日目に、これらのアカゲザルから毎日鼻腔スワブを収集した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を５７、５９、６１、及び６３日目に収集した。収集したサンプルからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性を阻害する血清の能力を図１５に示す。パネルＡは、ワクチン接種した１群アカゲザル由来の血清がインビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性を阻害する能力を示す。パネルＢは、ワクチン接種した群２アカゲザル由来の血清がインビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性を阻害する能力を示す。点線は、２０％阻害を示す。図から理解し得るように、群１及び群２のアカゲザルの両方からの血清は、感染性を阻害し、後に収集された血清は、早期に収集された血清よりも強力に阻害した。対照アカゲザル由来の血清は、試験したいずれの時点でも阻害効果を有さなかった。鼻咽頭における経時的なウイルス負荷を図１６に示す。パネルＡは、ＳＣ＋ＳＣ＋経口ワクチン接種後の群１のアカゲザルからの鼻腔スワブ中のウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示し、パネルＢは、ＳＣ＋経口＋経口ワクチン接種後の群１のアカゲザルからの鼻腔スワブ中のウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示す。肺（ＢＡＬ）における経時的なウイルス負荷を図１７に示す。図１７。パネルＡは、ＳＣ＋ＳＣ＋経口ワクチン接種後の群１のアカゲザル由来のＢＡＬにおけるウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示し、パネルＢは、ＳＣ＋経口＋経口ワクチン接種後の群１のアカゲザル由来のＢＡＬにおけるウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示す。
５６日目に、アカゲザルをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスへの呼吸器曝露でチャレンジした。５６～６３日目に、これらのアカゲザルから毎日鼻腔スワブを収集した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を５７、５９、６１、及び６３日目に収集した。収集したサンプルからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性を阻害する血清の能力を図１５に示す。パネルＡは、ワクチン接種した１群アカゲザル由来の血清がインビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性を阻害する能力を示す。パネルＢは、ワクチン接種した群２アカゲザル由来の血清がインビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性を阻害する能力を示す。点線は、２０％阻害を示す。図から理解し得るように、群１及び群２のアカゲザルの両方からの血清は、感染性を阻害し、後に収集された血清は、早期に収集された血清よりも強力に阻害した。対照アカゲザル由来の血清は、試験したいずれの時点でも阻害効果を有さなかった。鼻咽頭における経時的なウイルス負荷を図１６に示す。パネルＡは、ＳＣ＋ＳＣ＋経口ワクチン接種後の群１のアカゲザルからの鼻腔スワブ中のウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示し、パネルＢは、ＳＣ＋経口＋経口ワクチン接種後の群１のアカゲザルからの鼻腔スワブ中のウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示す。肺（ＢＡＬ）における経時的なウイルス負荷を図１７に示す。図１７。パネルＡは、ＳＣ＋ＳＣ＋経口ワクチン接種後の群１のアカゲザル由来のＢＡＬにおけるウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示し、パネルＢは、ＳＣ＋経口＋経口ワクチン接種後の群１のアカゲザル由来のＢＡＬにおけるウイルス負荷（ｑＰＣＲ）を示す。
【0217】
実施例２８：血清反応性
様々な実験的抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを受けた様々な志願者由来の血清サンプルを収集し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対するＩｇＧ及びＩｇＭ血清反応性について上述したようにＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果を図１８に示し、ＥＬＩＳＡ結果は、様々な実験的抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンで免疫したヒト患者から採取した血清サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに対するＩｇＧ及びＩｇＭ血清反応性を検出する。
様々な実験的抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを受けた様々な志願者由来の血清サンプルを収集し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対するＩｇＧ及びＩｇＭ血清反応性について上述したようにＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果を図１８に示し、ＥＬＩＳＡ結果は、様々な実験的抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンで免疫したヒト患者から採取した血清サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに対するＩｇＧ及びＩｇＭ血清反応性を検出する。
【0218】
実施例２９：ヒト免疫化
ヒト志願者を３つのコホートに分けた。コホート１（１０個体）を、本明細書に記載されるワクチンの５×１０１０ウイルス粒子（配列番号１２又は配列番号１３を含むＥ１－／Ｅ２ｂ－ Ａｄ５）を皮下注射することによって免疫した。コホート２（１０個体）を、本明細書に記載されるワクチンの１０１１ウイルス粒子を皮下注射することによって免疫した。コホート３（１５人の個体）を、本明細書に記載されるワクチンの１０１１ウイルス粒子（又は安全性の懸念がより低い投与量を示した場合、５×１０１０ウイルス粒子）を皮下注射することによって免疫した。初回プライムワクチン接種を投与した日と同じ日に各志願者から血液を採取した。８、１５、及び２２日目に再び血液を採取した。同じワクチンのブースター注射を２２日目に投与した。
ヒト志願者を３つのコホートに分けた。コホート１（１０個体）を、本明細書に記載されるワクチンの５×１０１０ウイルス粒子（配列番号１２又は配列番号１３を含むＥ１－／Ｅ２ｂ－ Ａｄ５）を皮下注射することによって免疫した。コホート２（１０個体）を、本明細書に記載されるワクチンの１０１１ウイルス粒子を皮下注射することによって免疫した。コホート３（１５人の個体）を、本明細書に記載されるワクチンの１０１１ウイルス粒子（又は安全性の懸念がより低い投与量を示した場合、５×１０１０ウイルス粒子）を皮下注射することによって免疫した。初回プライムワクチン接種を投与した日と同じ日に各志願者から血液を採取した。８、１５、及び２２日目に再び血液を採取した。同じワクチンのブースター注射を２２日目に投与した。
【0219】
１日目及び１５日目に採取した血液についてＥＬＩＳｐｏｔ試験を行って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞媒介免疫を評価した。各採血ウェルからの４００，０００の生存ＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２ｗ／ ＡＯ／ＰＩ生存率染色）を、空の培地、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２、及びＣＥＦＴで刺激した。刺激の４８時間後、上清を後の試験のために凍結した（－８０℃）。図１９は、Ｔｈ１ Ｎ応答性患者３、６、及び１１からのＥＬＩＳｐｏｔ試験の結果を示す。図２０は、患者４（Ｎ非応答性）及び患者１０（弱いＴｈ１ Ｎ応答性）からの結果を示す。これらの患者のいずれもＮに対するＴｈ２応答を示さなかった。
【0220】
気道保護
なおさらなる実験において、企図されるワクチン製剤及び使用方法は、非ヒト霊長類におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対する鼻腔及び肺気道の保護をもたらした。以下により詳細に示すように、改変ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ－融合物）タンパク質及び増強Ｔ細胞刺激ドメインを有するウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質（Ｎ－ＥＴＳＤ）の遺伝子を組み込んだ二重抗原ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、ＭＨＣクラスＩ／ＩＩ応答を増加させる。使用したアデノウイルス血清型５プラットフォーム、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］は、Ａｄ免疫の存在下で有効であることが以前に実証されており、コールドチェーンの制限を克服する経口製剤で送達することができる。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンをアカゲザルで評価したところ、皮下プライム後に経口チャレンジを行うと、Ｓ及びＮの両方に対する液性及びＴｈ１優位Ｔ細胞応答が誘発され、上気道及び下気道が高力価（１ｘ１０６ ＴＣＩＤ５０）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジから保護されることが示された。特に、ウイルス複製は、肺及び鼻腔の両方においてチャレンジの２４時間以内に阻害され、チャレンジ後７日以内に検出不能になった。図２５は、ｈＡｄ５プラットフォーム及びｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトを示す。（Ａ）Ｅ１、Ｅ２ｂ、及びＥ３領域が欠失した（＊）ヒトアデノウイルス血清型５ワクチンプラットフォームを示す。ワクチンコンストラクトをＥ１領域に挿入する（赤矢印）。（Ｂ）二重抗原ワクチンは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下のＳ－融合物及びＮ－ＥＴＳＤの両方を含み、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２Ｂ－、Ｅ３－］プラットフォームによって供給されるＣ末端ＳＶ４０ポリＡ配列を有する。
なおさらなる実験において、企図されるワクチン製剤及び使用方法は、非ヒト霊長類におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対する鼻腔及び肺気道の保護をもたらした。以下により詳細に示すように、改変ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ－融合物）タンパク質及び増強Ｔ細胞刺激ドメインを有するウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質（Ｎ－ＥＴＳＤ）の遺伝子を組み込んだ二重抗原ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、ＭＨＣクラスＩ／ＩＩ応答を増加させる。使用したアデノウイルス血清型５プラットフォーム、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］は、Ａｄ免疫の存在下で有効であることが以前に実証されており、コールドチェーンの制限を克服する経口製剤で送達することができる。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンをアカゲザルで評価したところ、皮下プライム後に経口チャレンジを行うと、Ｓ及びＮの両方に対する液性及びＴｈ１優位Ｔ細胞応答が誘発され、上気道及び下気道が高力価（１ｘ１０６ ＴＣＩＤ５０）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジから保護されることが示された。特に、ウイルス複製は、肺及び鼻腔の両方においてチャレンジの２４時間以内に阻害され、チャレンジ後７日以内に検出不能になった。図２５は、ｈＡｄ５プラットフォーム及びｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトを示す。（Ａ）Ｅ１、Ｅ２ｂ、及びＥ３領域が欠失した（＊）ヒトアデノウイルス血清型５ワクチンプラットフォームを示す。ワクチンコンストラクトをＥ１領域に挿入する（赤矢印）。（Ｂ）二重抗原ワクチンは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下のＳ－融合物及びＮ－ＥＴＳＤの両方を含み、ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２Ｂ－、Ｅ３－］プラットフォームによって供給されるＣ末端ＳＶ４０ポリＡ配列を有する。
【0221】
図２５の二重抗原ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンは、シグナル配列に融合したウイルススパイク（Ｓ）タンパク質（Ｓ－融合物）を発現し、これは、類似の配列についての報告に基づいて予測されるように、インビトロ研究において、Ｓ野生型と比較して、スパイク受容体結合ドメイン（Ｓ ＲＢＤ）の細胞表面発現を増強し、他のワクチンの大部分において使用される抗原が開発されている。このワクチンはまた、ＭＨＣクラスＩＩ応答を増強すると予測されるエンド／リソソーム細胞内コンパートメントにＮを導く増強Ｔ細胞刺激ドメイン（Ｎ－ＥＴＳＤ）を有するウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を発現する。
【0222】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン抗原は、組換えヒトアデノウイルス血清型５（ｈＡｄ５）［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクタープラットフォームによって送達され（図２５）、複数の薬剤に対するワクチンを迅速に生成することができ、最小の時間枠で多数の用量の生産を可能にする。ｈＡｄ５プラットフォームは、初期１（Ｅ１）、初期２（Ｅ２ｂ）及び初期３（Ｅ３）領域に独特な欠失を有し（ｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］）、これは、開発中の他のアデノウイルスワクチンプラットフォーム技術と区別され、既存のアデノウイルス免疫の存在下で有効であることを可能にする。このプラットフォームは、インフルエンザ、ＨＩＶ－１及びラッサ熱などのウイルス抗原に対するワクチンを生成し、抗体及び細胞媒介免疫の両方の誘導を示した。２００９年に、Ｈ１Ｎ１ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ遺伝子を発現するｈＡｄ５［Ｅ１－、Ｅ２ｂ－、Ｅ３－］ベクターをマウスにワクチン接種すると、致死的ウイルスチャレンジから動物を保護する細胞媒介免疫及び液性応答の両方が誘発された。
【0223】
開発中の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの圧倒的多数は、野生型Ｓ抗原のみを標的とし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体応答を誘発すると予想される。ワクチンの開発は、呼吸及び防御免疫応答の持続時間を増強するために活性化Ｔ細胞を優先し；特にＮの追加はＴ細胞応答のより大きな機会を与えると予測された。Ｔ細胞は、少なくとも抗体の産生と同じくらい重要な免疫防御を提供し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２回復期患者の試験において、ウイルス特異的Ｔ細胞は、検出不能な抗体応答を有する患者でさえも、無症候性個体を含むほとんどの患者において見られた。
【0224】
マウスモデルにおけるｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンの予備試験において、ワクチンは、Ｓ及びＮの両方に対するＴヘルパー細胞１（Ｔｈ１）優位抗体応答を誘発するだけでなく、Ｔ細胞を活性化する。ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２回復期個体由来のＭｏＤＣを二重抗原ワクチンで形質導入し、Ｓ－融合物及びＮ ＥＴＳＤ発現ＭｏＤＣをそれらの同じ個体由来のＴ細胞と共にインキュベートした。ワクチン抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方によるインターフェロン－ｇ（ＩＦＮ－γ）分泌を誘導する。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２回復期個体由来のＴ細胞が、形質導入ＭｏＤＣによって提示されたＳ－融合物及びＮ－ＥＴＳＤ抗原を、それらがウイルス自体に再曝露されたかのように「リコール」することを実証する。このワクチン抗原のＴ細胞リコールは、逆に、ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種がウイルス感染時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を認識し、ワクチン接種された個体を疾患から保護するＴ細胞を生成することを示唆する。
【0225】
Ｔ細胞応答の生成は、その出現が少なくとも部分的に、第一波ウイルス（２８）又は抗体ベースのワクチンのいずれかによって生成された抗体に対する逃避応答であり得る、多くの変異体に対して有効であるワクチンにとって重要な特徴であり得る。他のところで報告されているように、最も強力なｍＲＮＡワクチン誘発モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の１７のうちの１４による中和は、変異体Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ又はＫ４１７Ｎ：Ｅ４８４Ｋ：Ｎ５０１Ｙ組み合わせの減少又は消失のいずれかであった。また、組換え水疱性口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）／ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ ＳがこれらのｍＡｂの存在下で培養された場合に、これらの変異体が選択されることも見出され、これは、これらの抗体の存在が新しい変異体の出現を駆動する進化的な力として作用することを強く示唆している。Ｔ細胞は、そのような力に脆弱ではなく、ワクチン接種によって効果的に確立された場合、既存のウイルス株に対する防御を提供し、突然変異体を回避することができる。
【0226】
ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンの開発における次のステップにおいて、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）グレードの液体及び経口形態のワクチンを非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において試験した。ＮＨＰ試験デザインの重要な目的は、皮下（ＳＣ）プライムとその後の熱的に安定な経口ブーストの有効性を評価することであった。経口ブーストは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン接種においていくつかの利点を提供し、その利点は、特に感染の主要部位の１つである胃腸管において、粘膜免疫を生じさせる可能性がより大きいことを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、粘膜ウイルスであり、血液中ではまれにしか検出されず、したがって、粘膜免疫を特異的に標的とするワクチンが興味深い。熱的に安定な経口ブーストの説得力のあるさらなる利点は、特に発展途上国において、ワクチンの世界的な流通を変える可能性が高く、患者が家庭でブーストを自己投与できる可能性があることである。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤコンストラクトは、両方の抗原に対する液性応答及びＣＭＩ応答の両方を誘導するので、開発中の多数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンに対する「普遍的」異種ブースターワクチンとして機能する可能性も有する。
【0227】
ある研究では、アカゲザルにおけるｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンの有効性は、両方とも０日目のプライムと１４日目及び２８日目のブーストのレジメンを用いてＳＣプライムとＳＣ及び経口ブースト（ＳＣ－ＳＣ－経口；ｎ＝５）又はＳＣプライム及び２つの経口ブースト（ＳＣ－経口－経口；ｎ＝５）のいずれかとして送達された場合、Ｔ細胞応答を最大にすることが究明された。この研究の目的は、ＳＣ製剤及び経口製剤の両方における二重抗原ｈＡｄ５ワクチンの免疫原性、並びに単一のＳＣプライム後のブーストとして役立つ経口用量の可能性を評価することであった。チャレンジ後の細胞媒介Ｔ細胞応答、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染からの鼻腔及び肺の保護、並びにウイルスクリアランスの速度を評価した。
【0228】
臨床徴候、血液学及び臨床化学：ワクチン接種による毒性の臨床徴候についての１日２回の観察の間、臨床徴候は認められず、１×１０１１ワクチン粒子（ＶＰ）の１回の皮下免疫後の２週間、又は１×１０１０ＩＵのｈＡｄ５－Ｓ－融合物＋Ｎ ＥＴＳＤの経口ブースト後の１週間の間、動物は死亡しなかった。さらに、肉眼的病理学的影響又は有害事象は観察されず、体重に顕著な変化はなかった。最後に、血液学及び臨床化学は、ワクチン接種の結果として異常を示さなかった。
【0229】
経口ブーストによるＳＣプライムは、中和、抗スパイク抗体の生成を誘発する：図２１に示すように、全てのＳＣ－経口－経口ワクチン接種ＮＨＰは、１４日目及び２８日目の両方の経口ブースト（パネルＡ及びＢ）の後に増加する抗Ｓ ＩｇＧを産生した。５匹のＳＣ－経口－経口ＮＨＰのうちの４匹からの血清がベースラインで、及び１４日目から開始して４２日目まで毎週採取され、組換えアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）へのＳ ＲＢＤの結合の阻害を評価し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和する血清の能力と相関することが報告されている中和アッセイ（パネルＣ）において阻害を示した。抗Ｓ ＩｇＧ産生は、ＳＣ－ＳＣ－経口（最初のブーストはＳＣであった）ｈＡｄ５ Ｓ融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種ＮＨＰ（パネルＤ及びＥ）について同様であり、この群の５匹のＮＨＰ全てからの血清は、ウイルス中和のための代理アッセイにおいて阻害を示した（パネルＦ）。
【0230】
ＳＣプライム、経口ブーストワクチン接種は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２チャレンジ後の鼻腔及び肺におけるウイルス負荷を低減する：ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を、鼻腔スワブ及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）サンプルに対して行って、存在するウイルスの量を決定した。ＮＨＰのＳＣ－経口ワクチン接種は、チャレンジ後の最初の日である５７日目からのプラセボ対照ＮＨＰと比較して、鼻腔スワブサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｇＲＮＡを減少させた（図２２、パネルＡ及びＢ）。この群におけるウイルスｇＲＮＡは、チャレンジ７日後の６３日目までに、全てのワクチン接種動物において検出レベル（ＬＯＤ）よりも非常に低い又は低いレベルまで減少し続けた。プラセボ対照は、試験期間中、鼻腔スワブサンプル中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中等度～高レベル（範囲２Ｅ＋０９～８．４Ｅ＋０３遺伝子コピー／ｍＬ）を有していた。
【0231】
ＳＣ－経口－経口 ＮＨＰの肺（気管支肺胞洗浄、ＢＡＬ）において、ｇＲＮＡも急速に減少し、幾何平均は、チャレンジのちょうど１日後、５７日目にプラセボＮＨＰと比較して、約２ｌｏｇのワクチン接種ＮＨＰの減少を示した（図２２、パネルＣ及びＤ）。ＳＣ及び経口ブースト（ＳＣ－ＳＣ－経口）を受けた群では、鼻腔スワブサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｇＲＮＡも、ＳＣ－経口ワクチン接種霊長類において見られるものと同様に減少し、ウイルスｇＲＮＡは、６３日目までに全てのワクチン接種動物においてＬＯＤより非常に低い又は低いレベルまで減少した（図２２、パネルＥ及びＦ）。ＳＣ－ＳＣ－経口 ＮＨＰの肺では、ｇＲＮＡはまた、５７日目に約２ｌｏｇ減少を示した（図２２、パネルＧ及びＨ）。
【0232】
ＳＣプライム、経口ブーストワクチン接種は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後、鼻腔及び肺におけるウイルス複製１８８を直ちに阻害した：鼻腔スワブサンプルにおける複製ウイルスの存在を、サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のＲＴ ｑＰＣＲによって決定した。チャレンジの４日後の６０日目までに、ｓｇＲＮＡは２つのＳＣ－経口－経口霊長類についてＬＯＤ未満であり、６１日目に開始して、経口ブーストのみを受けた全ての霊長類についてＬＯＤ未満であった（図２３、パネルＡ及びＢ）。ＳＣ－経口－経口ＮＨＰの肺において、ｓｇＲＮＡも５７日目に開始するプラセボと比較して減少し、６３日目までに全てＬＯＤ未満であった（図２３、パネルＣ及びＤ）。鼻腔における複製ウイルスの証拠も、ＳＣ－ＳＣ－経口ＮＨＰにおいて急速に減少し、２匹の霊長類において５９日目までにＬＯＤ未満であり、６３日目までに全ての霊長類においてＬＯＤ未満であり（図２３、パネルＥ及びＦ）；この群の肺において、ｓｇＲＮＡは、チャレンジの１日後の５７日目にプラセボ対照と比較して約２ｌｏｇ減少し、ｓｇＲＮＡは５匹の霊長類の４匹において６３日目にＬＯＤ未満であり、５日目にＬＯＤの真上であった（図２３、パネルＧ及びＨ）。鼻腔及び肺におけるウイルス負荷及び複製ウイルスの両方の急速な減少があっただけでなく、チャレンジ後にウイルスの増殖がなかったことが注目される。これは、感染時にウイルスの迅速なクリアランスをもたらす既存の液性及び細胞性免疫の存在を意味する。
【0233】
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２チャレンジからのＮＨＰの即時防御は、Ｓ及びＮの両方に応答するＴ細胞の存在に起因する可能性があり、ｈＡｄ５ Ｓ融合物 ＋ Ｎ＋ＥＴＳＤワクチン、スパイク及びヌクレオカプシドによって送達される抗原に対する記憶Ｂ細胞末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来Ｔ細胞応答の活性化に対する迅速なウイルスクリアランスを、プライムワクチン接種前０日目、１４日目（ブースト前）及び２回目の２８日目のブーストの１週間後３５日目にＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。ＳＣ－経口－経口ワクチン接種霊長類由来のＴ細胞は、１４日目及び３５日目にＳ及びＮペプチドの両方に応答してインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）を分泌した（図２４、パネルＡ）。インターロイキン－４（ＩＬ－４）分泌は非常に低く（図２４、パネルＢ）、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－４比によって反映されるように、Ｔ細胞応答がヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１）優位であることを示した（図２４、パネルＣ）。
【0234】
チャレンジ後期間に収集された血清について、マイクロ中和アッセイ（方法を参照されたい）を使用して、「ＭＮ５０」によって反映されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和能力、即ち、無血清対照と比較してウイルス感染性の５０％減少と相関する血清希釈を評価した。経口ブーストのみを受けたＮＨＰについての血清の中和能力の急速な増加が、チャレンジ後２週間にわたって見られ、これは鼻腔ｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ（図２４、パネルＥ及びＦ、各々）並びに肺のｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ（図２４、パネルＧ及びＨ、各々）の減少を反映した（図２４、パネルＤ）。特に、プラセボ群霊長類由来の血清は、チャレンジ後の中和能力の増加を示さず（図２４、パネルＤ及びＬ）、ワクチン接種群における記憶Ｂ細胞の存在及び非ワクチン接種プラセボ群におけるそのような細胞の非存在を示唆した。この仮説を確認するには、さらなる研究が必要である。
【0235】
ＳＣ－ＳＣ－経口ワクチン接種ＮＨＰについて、所見は、チャレンジ前ワクチン接種期間中の反応性Ｔ細胞（図２４、パネルＩ～Ｋ）及びチャレンジ後期間中の中和能力（図２４、パネルＬ）について、鼻腔及び肺におけるｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの減少の反映を含めて、非常に類似していた（図２４、パネルＭ～Ｐ）。
【0236】
ワクチン接種による細胞傷害性Ｔ細胞の存在（図２４、パネルＡ～Ｃ及びＩ～Ｋ）は、チャレンジ後最初の２４時間以内にウイルス複製のほぼ即時の減少をもたらし（図２４、パネルＦ、Ｈ、Ｎ、及びＰ）、ワクチン接種されたがプラセボではないＮＨＰ由来の血清の中和能力の増加を反映する２週間にわたる継続的な減少は、抗Ｓ産生記憶Ｂ細胞の寄与を反映する（図２４、パネルＤ及びＬ）。
【0237】
本研究は、アカゲザルＮＨＰモデルにおいて、皮下プライム及び経口ブースト二重抗原ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対して鼻腔及び肺気道の両方を保護することを実証する。ウイルスチャレンジ後の最初の日のｓｇＲＮＡの減少によって証明されるような鼻腔におけるウイルス複製の阻害は顕著であり、全ての（１０／１０）動物においてチャレンジから７日以内に検出未満のレベルまでのウイルスの連続クリアランスであった（図２２及び２３）；そしてアカゲザルは伝播の評価のためのモデルではないが、鼻ウイルス複製のこれらの急速な減少は、今後の研究においてこのワクチンが伝播を予防する能力の研究を奨励し、支持している。
【0238】
ｈＡｄ５ Ｓ融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種がウイルス中和抗Ｓ抗体を誘発する能力（図２１）と、Ｓ及びＮの両方に応答するＴ細胞を誘発する能力（図２３）は、特に、記憶Ｂ細胞の存在を示す可能性が高い、チャレンジ後の血清の中和能力の急速な増加を伴って見られた場合、ワクチンが、重度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する広範な免疫を確立することを示唆する。
【0239】
細胞傷害性Ｔ細胞を生成するためのｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ ＳＣプライム、経口ブーストワクチンの可能性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｔ細胞が抗体応答の非存在下でも同定されたＣＯＶＩＤ－１９回復期患者における感染からの防御においてＴ細胞が重要な役割を果たすことを考えると、重要な特徴である。ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種によるウイルス複製の明らかなほぼ即時の減少は、他のアデノウイルスベクター化Ｓ－のみワクチンＮＨＰ研究で報告されている所見とは対照的であり、その研究では、チャレンジ後少なくとも１日間、一部の動物でウイルス複製が継続する証拠があった。他のいくつかのＮＨＰワクチン研究で用いられた力価と比較して、１×１０６ ２８１ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの比較的高力価でチャレンジされた場合でさえ、研究におけるワクチン接種された動物は、評価された最も早い時点から保護されるようであった。この迅速な保護及びクリアランスは、肺において特に明白であり、ウイルス負荷及びウイルス複製の両方が、チャレンジのちょうど１日後、両方のワクチン接種群においてプラセボよりも約１～２ｌｏｇ低かった。
【0240】
ＳＣ及び経口ブースト投与によるＮＨＰのｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチン接種によって付与される保護は、特に、抗体及び回復期血漿に耐性であり、現在世界中に急速に広がっている逃避変異体に照らして、このワクチンが世界中に流通するために開発される可能性を特に明らかにしている。経口ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤ製剤は、現在開発中の多くのＣＯＶＩＤワクチンのような超低温冷凍を必要としない。地理的に離れた地域又は未開発地域への流通のためのコールドチェーンへの依存は、出荷及び保存上の課題を引き起こし、ＲＮＡベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの接近性を低下させる可能性が高い。
【0241】
熱的に安定な経口ｈＡｄ５ Ｓ－融合物 ＋ Ｎ－ＥＴＳＤワクチンは、Ｓ及びＮの発現のため、Ｓ抗原のみを送達する他の以前に投与されたワクチンに対する「普遍的」ブーストとして作用する可能性も有する。この使用は、コールドチェーン独立性によっても促進されるであろう。
【0242】
唾液試験
さらに企図される態様では、ワクチンを投与、モニタリング、及びアッセイするための方法及び組成物が本明細書に開示される。企図される方法は、患者においてウイルスに対する免疫を誘導すること、患者の鼻腔粘膜、口腔粘膜、及び／又は消化管粘膜への送達によって患者にワクチン組成物を投与することによって、患者にワクチン組成物を投与することを含む。好ましくは、ワクチンは、ＳＡＲＳ様コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を標的とする。
さらに企図される態様では、ワクチンを投与、モニタリング、及びアッセイするための方法及び組成物が本明細書に開示される。企図される方法は、患者においてウイルスに対する免疫を誘導すること、患者の鼻腔粘膜、口腔粘膜、及び／又は消化管粘膜への送達によって患者にワクチン組成物を投与することによって、患者にワクチン組成物を投与することを含む。好ましくは、ワクチンは、ＳＡＲＳ様コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を標的とする。
【0243】
特に、開示される方法はまた、ワクチンを投与した後のある期間に、患者から唾液のサンプルを得ることを含む。典型的には、唾液のサンプルは、グルタルアルデヒド、安息香酸ナトリウム、クエン酸、没食子酸プロピル、ＥＤＴＡ、亜鉛、アクチン、キトサン、パラベン、アジ化ナトリウム、又はそれらの任意の組み合わせを含む安定化溶液中で保存される。より典型的には、安定化溶液は、０．１０～２．０重量／体積％（ｗ／ｖ）のグルタルアルデヒド、０．１０～１．０％ｗ／ｖの安息香酸ナトリウム、及び／又は０．０２５～０．２０％ｗ／ｖのクエン酸を含む。さらなる実施形態は、ウイルス又はウイルスに特異的なタンパク質を標的とする抗体から選択される少なくとも１つについて唾液のサンプルを分析することを含み、サンプル唾液中の抗体の非存在下で、方法は、ワクチンのブースターを患者に投与することをさらに含む。
【0244】
さらに、安定化溶液は、１００ｎｍ～１ｍｍの平均粒径を有するアラゴナイト粒子ビーズをさらに含む。アラゴナイト粒子ビーズは、免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質に結合することができる。例示的な実施形態では、アラゴナイト粒子ビーズは、組換えＡＣＥ２タンパク質又は組換えＡＣＥ２αヘリックスタンパク質に結合される。
【0245】
企図される主題はまた、免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体タンパク質、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質を結合するために製剤化されたアラゴナイト組成物を含む。アラゴナイト組成物は、１００ｎｍ～１ｍｍの平均粒径を有する複数のアラゴナイト粒子ビーズを含み、複数のアラゴナイト粒子ビーズは、免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体タンパク質及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質に結合することができる部分で官能化されている。
【0246】
特定の実施形態では、複数のアラゴナイト粒子ビーズは、組換えＡＣＥ２タンパク質を含む抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合することができる部分で官能化される。例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合可能な部分は、配列番号９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する組換えＡＣＥ２タンパク質、配列番号１０の組換えα－ヘリックスＡＣＥ２タンパク質、又はＴ２７Ｆ、Ｔ２７Ｗ、Ｔ２７Ｙ、Ｄ３０Ｅ、Ｈ３４Ｅ、Ｈ３４Ｆ、Ｈ３４Ｋ、Ｈ３４Ｍ、Ｈ３４Ｗ、Ｈ３４Ｙ、Ｄ３８Ｅ、Ｄ３８Ｍ、Ｄ３８Ｗ、Ｑ２４Ｌ、Ｄ３０Ｌ、Ｈ３４Ａ及び／Ｄ３５５Ｌから選択される少なくとも１つの突然変異を有する組換えα－ヘリックスＡＣＥ２タンパク質から選択され得る。
【0247】
企図される主題は、ワクチンに対する局所及び全身の両方の免疫応答を誘導するために、２つ以上の投与経路によって患者にワクチンを投与するための方法を含む。企図される主題はまた、患者サンプル（例えば、唾液、鼻腔粘膜、消化器粘膜、又は血清）中の関連抗体（例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体）の存在又は非存在をアッセイするための組成物及び方法を含む。患者のサンプル中の抗体状態は、追加のワクチン用量（例えば、ブースター用量／ショット）の必要性を評価するために使用され得る。
【0248】
ワクチン中に提示される要求される分子エピトープに加えて、ワクチンの投与経路、及びワクチンの追加の（即ち、ブースター）用量を投与するためのレジメンもまた、患者の免疫応答が保護を確立するのに十分に強固であるかどうかに影響を及ぼし得る。
【0249】
ＳＡＲＳ様コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などの新興ウイルスについて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から回復した患者における免疫の持続時間（液性及び細胞媒介の両方）はまだ完全には知られておらず、さらに、ワクチンプロトコルは、様々な集団にわたってまだ試験されていない。現在のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミック及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの高い伝播速度を考慮すると、強固なワクチン接種プロトコル及びウイルス又はウイルスに対する免疫（例えば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在）のための有効な試験が必要とされている。
【0250】
患者において免疫を誘導するための本明細書に開示される企図される方法は、少なくとも経口投与によって、好ましくは、経口投与によって及び血液供給への注射によってワクチンを投与することを含む。多くのワクチンは、筋肉内（ＩＭ）経路を介して与えられて、筋肉内の血液供給へのワクチンの直接送達を用いて免疫原性を最適化し、全身性免疫を誘導する。ＩＭ投与は、典型的には、ＩＭ注射よりも注射部位で有害反応を有する可能性が高い皮下（ＳＣ）注射よりも好ましい。
【0251】
ＩＭ注射に加えて、粘膜免疫の誘導は、病原性微生物のヒトからヒトへの伝播を阻止し、粘膜組織内でのそれらの増殖を制限するために不可欠であることが報告されている。さらに、粘膜病原体（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス）に対する防御免疫のために、粘膜恒常性を維持するための寛容のより一般的なアプローチの代わりに、粘膜組織における免疫活性化は、増強された粘膜免疫応答及びより良好な局所防御を可能にする。例えば、経鼻ワクチン接種（経鼻投与によるワクチンの送達）は、粘膜免疫及び全身免疫の両方を誘導する（例えば、Ｆｕｊｋｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１１：３６７－３７９及びＢｉｒｋｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７１：７２９－７３１を参照されたい）。
【0252】
患者において粘膜免疫及び全身免疫の両方を誘導するために、本開示の実施形態は、少なくとも患者の鼻腔粘膜、口腔粘膜、及び／又は消化器粘膜への投与によって、患者にワクチンを提供することを含む。いくつかの実施形態では、投与経路は、血液供給への注射（例えば、筋肉内（ＩＭ）、静脈内（ＩＶ）、又は皮下（ＳＣ））と一緒に、患者の鼻腔粘膜、口腔粘膜、及び／又は消化管粘膜にワクチンを投与することを含む。本明細書で使用される場合、ワクチン組成物の経口投与は、経鼻注射、経鼻吸入、経口摂取、及び消化管粘膜への投与（例えば、吸入、摂取、注射）を含む。好ましくは、ワクチンを投与する経路は、筋肉内（ＩＭ）注射による投与と一緒に、消化器粘膜への送達、鼻腔注射、鼻腔吸入、経口摂取、又は経口による吸入から選択される経口投与を含む。
【0253】
特に、患者の粘膜組織における免疫を誘導するために投与されるワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンである。例示的な実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（例えば、アデノウイルスコンストラクト）は、米国特許第１６／８８０，８０４号明細書及び米国特許第６３／０１６，０４８号明細書（その両方の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、Ｊ鎖部分も含み得るＡＣＥ２－Ｆｃハイブリッドコンストラクトを形成する、免疫グロブリンＦｃ部分に結合された可溶性ＡＣＥ２タンパク質を含む。他の例示的な実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（例えば、アデノウイルスコンストラクト）は、組換え可溶性ＡＣＥ２タンパク質（例えば、配列番号１０）の突然変異体を含み、この突然変異体は、米国特許第６３／０２２，１４６号明細書（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤタンパク質ドメインに対するＡＣＥ２タンパク質の結合親和性の増大を付与する少なくとも１つの突然変異アミノ酸残基（例えば、置換による）を有する。別の例示的な実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（例えば、アデノウイルスコンストラクト）は、米国特許出願第１６／８８３，２６３号明細書及び米国特許第６３／００９，９６０号明細書（その両方の全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、エンドソーム標的化配列（Ｎ－ＥＴＳＤ）に融合されたＣｏＶ２ヌクレオカプシドタンパク質又はＣｏＶ２スパイクタンパク質を含む。追加的又は代替的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、米国特許第６３／０１０，０１０号明細書に開示されているように、酵母細胞表面上にコロナウイルススパイクタンパク質を発現するように遺伝子操作された改変酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を含み、それによって酵母提示細胞がＢ細胞を刺激する（例えば、液性免疫）。
【0254】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される２つ以上のワクチン組成物がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫を誘導するために患者に投与され得る。例えば、患者は、コロナウイルススパイクタンパク質を発現する遺伝子改変酵母細胞を単一タイプのワクチンとして投与されてもよく、又は遺伝子改変酵母細胞は、本明細書に開示される１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アデノウイルスコンストラクトと一緒に若しくは同時に投与されてもよい。
【0255】
さらなる実施形態では、本明細書に開示されるように投与されるワクチン（例えば、経口投与及び血液供給への注射によって）又はウイルスによる感染のいずれかに対する患者の免疫応答をモニタリング又は評価することができる。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染後、又はＳＡＲコロナウイルスワクチンの投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する接種後に、患者の呼吸器及び消化器粘膜における抗体の継続的な存在を評価するための組成物及び方法が本明細書に開示される。
【0256】
病原性感染に対するワクチン（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的とする）を受けた、及び／又はウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に感染した患者からのサンプルをアッセイするために、病原体に対する抗体の存在は、多くの診断試験のいずれか１つを用いて実施され得る。いくつかの実施形態では、診断試験は、抗原の存在下での抗体の検出を可能にする細胞生存率アッセイである。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体検出のための細胞生存率アッセイを用いた診断試験は、米国特許第６２／０５３，６９１号明細書（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。細胞診断アッセイは、免疫エフェクター細胞株（例えば、キラーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、ＮＫ－９２細胞及びその誘導体など）の表面上の所与の病原体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のためのＡＣＥ２）の標的受容体の発現、及び代理細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞又はＳＵＰ－Ｂ１５細胞）の表面上の病原体リガンド（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のためのスパイクタンパク質）の発現に依存する。
【0257】
ＡＣＥ２タンパク質の組換えタンパク質変異体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質によって標的化されるヒト受容体）を使用するさらなる診断試験は、米国特許出願第１６／８８０，８０４号明細書（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【0258】
抗病原体抗体の存在について患者をより容易にモニタリングするために、患者からの唾液サンプルをアッセイすることは、迅速なサンプル収集、患者の参加の増加を可能にし、患者が自身のサンプルを入手し、サンプルを試験のために検査室に郵送又は輸送することを可能にし得る。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体の存在について唾液をアッセイするためには、試験前のサンプル収集後の輸送及び保存中の分解に対して唾液中のタンパク質を安定化させる必要があり得る。
【0259】
唾液サンプルを収集したら、唾液を保存溶液に入れて、その中の成分（例えば、抗ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２抗体又はウイルススパイクタンパク質）を安定化させる。生物学的サンプルのための保存剤は、例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ ａｌ．（２０１８）ｒｅｐｏｒｔ（“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｊｕｓｔｉｃｅ ｇｒａｎｔ ＃ ２０１０－ＤＮ－ＢＸ－Ｋ１９３）及び米国特許第６，１３３，０３６号明細書に開示されている。例えば、患者の唾液サンプルのための安定化保存剤溶液は、グルタルアルデヒド、安息香酸ナトリウム、クエン酸、没食子酸プロピル、ＥＤＴＡ、亜鉛、アクチン、キトサン、パラベン、アジ化ナトリウム、及びそれらの任意の組み合わせのうちの任意の１つを含み得る。
【0260】
特定の実施形態では、唾液サンプルをグルタルアルデヒドの安定化保存剤溶液と混合して、０．１％（ｗ／ｖ）～２．０％（ｗ／ｖ）、例えば約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．３％（ｗ／ｖ）、約０．４％（ｗ／ｖ）、約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．６％（ｗ／ｖ）、約０．７％（ｗ／ｖ）、約０．８％（ｗ／ｖ）、約１．０％（ｗ／ｖ）、約１．１％（ｗ／ｖ）、約１．２％（ｗ／ｖ）、約１．３％（ｗ／ｖ）、約１．４％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約１．６％（ｗ／ｖ）、１．７％（ｗ／ｖ）、約１．８％（ｗ／ｖ）、又は約１．９％（ｗ／ｖ）の最終グルタルアルデヒド濃度を達成してもよい。
【0261】
追加的又は代替的な実施形態において、唾液サンプルは、約０．１０％～約１．００％の安息香酸ナトリウム（サンプルの重量／体積）及び／又は約０．０２５％～約０．２０％のクエン酸（サンプルの重量／体積）の安定化保存剤溶液と混合され得る。例えば、唾液サンプルは、０．１０％、０．２０％、０．３０％、０．４０％、０．５０％、０．６０％、０．７０％、０．８０％、０．９０％、又は１．００％ｗ／ｖ安息香酸ナトリウムと混合され得る。さらなる実施形態では、唾液サンプルは、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４．５ｍｇ／ｍＬ、又はさらには５ｍｇ／ｍＬ）の安息香酸及び／又は少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．４０ｍｇ／ｍＬ、０．５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１．７５ｍｇ／ｍＬ、又はさらには２．０ｍｇ／ｍＬ）のクエン酸の安定化保存剤溶液と混合される。本明細書で使用される場合、「安息香酸」は、安息香酸塩（例えば、安息香酸ナトリウム）と交換可能であり、「クエン酸」は、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）と交換可能である。
【0262】
上述した保存剤を含む唾液サンプルは、１５℃～４０℃の温度で少なくとも１時間（例えば、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、又はさらには３６時間）保存するのに安定である。したがって、中和抗体試験のための唾液サンプルを保存する方法であって、唾液サンプルを、グルタルアルデヒド、安息香酸ナトリウム、クエン酸、没食子酸プロピル、ＥＤＴＡ、亜鉛、アクチン、キトサン、パラベン、及び／又はアジ化ナトリウムのうちの１つ以上から作製された安定化溶液と混合し、１５℃～２５℃で少なくとも１時間、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、又は４８時間まで保存することを含む方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、唾液サンプルは、０．１％（ｗ／ｖ）～２．０％（ｗ／ｖ）のグルタルアルデヒド濃度と混合され、グルタルアルデヒド－唾液は、１５℃～２５℃で保存される。特定の実施形態では、グルタルアルデヒド－唾液は、本明細書に開示される濃度のクエン酸及び／又は安息香酸をさらに含み得る。
【0263】
アラゴナイト：いくつかの実施形態では、任意の抗体タンパク質又は任意の特異的抗体タンパク質を、魚卵状アラゴナイト粒子を用いて唾液サンプルから捕捉することができる。例えば、本明細書に開示されるグルタルアルデヒド、安息香酸ナトリウム及びクエン酸、没食子酸プロピル、ＥＤＴＡ、亜鉛、アクチン、キトサン、パラベン、アジ化ナトリウム、及びそれらの任意の組み合わせの唾液保存溶液は、魚卵状アラゴナイト（炭酸カルシウム、ＣａＣＯ３）粒子も含むことができる。タンパク質への結合のためのアラゴナイト粒子の使用は、例えば、米国特許出願第１６／８５８，５４８号明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０／２９９４９号明細書に開示されており、その両方の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、アラゴナイト粒子は、唾液サンプル中に存在する任意の抗体を捕捉する（例えば、それに結合する）か、又は特定の抗原に対する抗体を特異的に捕捉するように修飾されているものに添加され得る。例えば、アラゴナイトは、免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質に結合することができる部分で官能化され得る。好ましくは、Ｉｇタンパク質は、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、又は免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）タンパク質である。より好ましくは、アラゴナイトは、ＩｇＡタンパク質に結合するように官能化される。最も好ましくは、アラゴナイト粒子は、特異的抗体に結合することができる部分で官能化される。例えば、アラゴナイト粒子は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体に特異的な部分と結合され得る。好ましくは、アラゴナイト粒子は、例えば、前出の米国特許出願第１６／８８０，８０４号明細書に開示されている組換えＡＣＥ２タンパク質と結合される。典型的な実施形態では、アラゴナイト粒子は、配列番号９に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する組換えヒトＡＣＥ２タンパク質と結合される。
【0264】
追加的又は代替的な実施形態では、アラゴナイト粒子は、組換え可溶性ＡＣＥ２タンパク質（例えば、配列番号１０）に官能化（例えば、結合）される。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体又はＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のより効率的な捕捉又は結合のために、組換え可溶性ＡＣＥ２を突然変異させて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（例えば、スパイクタンパク質のＲＢＤドメイン）に対してより高い結合親和性を有するＡＣＥ２変異体を形成することができる。組換え可溶性ＡＣＥ２タンパク質のこれらのＡＣＥ２突然変異体は、Ｔ２７Ｆ、Ｔ２７Ｗ、Ｔ２７Ｙ、Ｄ３０Ｅ、Ｈ３４Ｅ、Ｈ３４Ｆ、Ｈ３４Ｋ、Ｈ３４Ｍ、Ｈ３４Ｗ、Ｈ３４Ｙ、Ｄ３８Ｅ、Ｄ３８Ｍ、Ｄ３８Ｗ、Ｑ２４Ｌ、Ｄ３０Ｌ、Ｈ３４Ａ、及び／又はＤ３５５Ｌを含む。
【0265】
本明細書で使用される場合、用語「官能化された」は、アラゴナイト粒子への部分の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）又は結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）を指し、それによって、結合された部分の任意の機能をアラゴナイト粒子に付与する。例えば、アラゴナイト粒子は、タンパク質部分で官能化され得る。アラゴナイト粒子ビーズを調製及び使用するための方法は、米国特許出願第１６／８５８，５４８号明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０／２９９４９号明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、アラゴナイト組成物は、複数のアラゴナイト粒子ビーズを含む。好ましくは、複数のアラゴナイト粒子ビーズは、１００ｎｍ～１ｍｍの平均粒径を有する。
【0266】
いくつかの実施形態では、タンパク質部分はアラゴナイト粒子の天然の未処理表面に直接結合される。アラゴナイト粒子は、アラゴナイト表面を親水性にするアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む、約２～３％のアミノ酸含有量を有する。したがって、いくつかの実施形態では、タンパク質部分は、アラゴナイト粒子の表面に直接結合され得る。
【0267】
代替的な実施形態では、結合表面を改質するために、アラゴナイト粒子表面を処理することができる。例えば、米国特許出願第１６／８５８，５４８号明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０／２９９４９号明細書に開示されているように、ステアリン酸（即ち、オクタデカン酸）による処理は、疎水性表面を提供する。タンパク質負荷のために、リン酸によるアラゴナイトの処理は、ラメラ構造を形成する。反応性基をアラゴナイトのアミノ酸表面に結合するためのさらなるコンジュゲーション技術は、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０１３開示されているように、当技術分野において公知である。
【0268】
唾液中の中和抗体の十分な力価（例えば、存在）を示さない患者に、各々のワクチン（例えば、本明細書に開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン）の経口投与量を送ることができる。患者は、これらのワクチン投与量を吸入又は摂取し、次いで２週間後、上記と同じ様式で調製及び保存された別の唾液サンプルを試験施設に送って、経口ワクチン用量がその抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば、ＩｇＡ）力価を回復させたことを確認する。
【0269】
したがって、さらなる実施形態では、患者から唾液サンプルを収集するためのキットは、本明細書に開示される唾液保存剤溶液を有する収集容器を含む。例えば、キットは、グルタルアルデヒド、安息香酸ナトリウム及び／又はクエン酸、没食子酸プロピル、ＥＤＴＡ、亜鉛、アクチン、キトサン、パラベン、及びアジ化ナトリウムのうちのいずれか１つ又は組み合わせの溶液を含む収集容器を含む。キットはまた、輸送又は郵送のために、唾液サンプルを有する収集容器に固定するために、接着剤パッケージング及び／又は郵送供給物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットはまた、経口投与のための少なくとも１用量のワクチンを含んでもよい。
【0270】
免疫刺激
ワクチン接種に加えて、又はコロナウイルス感染、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である可能性が高いか又は実際に診断されている対象に対する代替治療としてさえも、１つ以上の免疫刺激性サイトカインによる免疫刺激は、ＣＯＶＩＤ－１９と頻繁に関連するリンパ球減少症を予防又は緩和し得る。他の免疫刺激性サイトカインの中でも、Ｎ－８０３が特に企図される。
ワクチン接種に加えて、又はコロナウイルス感染、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である可能性が高いか又は実際に診断されている対象に対する代替治療としてさえも、１つ以上の免疫刺激性サイトカインによる免疫刺激は、ＣＯＶＩＤ－１９と頻繁に関連するリンパ球減少症を予防又は緩和し得る。他の免疫刺激性サイトカインの中でも、Ｎ－８０３が特に企図される。
【0271】
ＣＯＶＩＤ－１９感染は、リンパ球減少症、特にＮＫ及びＣＤ８ Ｔ細胞の抑制を引き起こし、重症症例及びその後の死亡は、リンパ球のこの有意な減少と関連する。証拠はまた、ＣＯＶＩＤ－１９感染がマクロファージ死滅及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の減少をもたらすことを示唆する。中国全土の５５２病院の検査室で確認されたＣＯＶＩＤ－１９患者１０９９人のデータの分析により、入院時に患者の８３．２％にリンパ球減少症が認められることが明らかになった。平均して、重症疾患を有する患者は、非重症疾患を有する患者と比較して、より顕著な臨床検査異常、例えば、より低いリンパ球数を有した。同様に、別の研究グループは、ＩＣＵに入院した患者のリンパ球数中央値が、ＩＣＵケアを必要としない患者と比較して有意に低いことを示した。
【0272】
細胞レベルで、ＣＯＶＩＤ－１９は、ＮＫ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の減少によって免疫回避を誘導するように思われる。リンパ球減少症の機構は依然として不明であるが、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方の急速な減少は、有害な転帰と関連し得る。ＳＡＲＳの最初の１０日間におけるリンパ球減少及びウイルス負荷の増加は、ＳＡＲＳコロナウイルスによる免疫回避を示唆する。ＳＡＲＳ感染細胞におけるインターフェロン（ＩＦＮ）－γ応答の欠如は、ヒト初代骨髄由来樹状細胞及び上皮２９３細胞株を使用して、インビトロで報告されている。他の研究者らは、抗ウイルス性サイトカイン（ＴＦＮ－α、ＴＦＮ－β、ＴＦＮ－γ、及びＩＬ－１２ｐ４０）の低い発現、炎症性サイトカイン（腫瘍壊死因子α［ＴＮＦ－α］及びＩＬ－６）の中程度のアップレギュレーション、及び炎症性サイトカイン（ＭＩＰ－１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰＩ ０、及びＭＣＰ－１）の有意なアップレギュレーションの発見に基づいて、樹状細胞（ＤＣ）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶによる免疫回避の機構を提案した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の枯渇に加えて、不十分なＴ細胞多様性を介したＴ細胞反応性の欠如は、不十分な免疫応答に寄与し得る。これは、特に高齢者集団において起こる。
【0273】
Ｎ－８０３は、前臨床（マウス）及び臨床（乳癌、肺癌、及び膵臓癌）状況の両方において、広範なＴ細胞反応性の増加を誘導する有意な能力を実証した。Ｔ細胞多様性を活性化することにより、過去のコロナウイルス感染に対する交差反応性は、Ｔ細胞反応性のＮ－８０３増強後にＣＯＶＴＤ－１９に対する免疫を提供し得、免疫回避を克服することが可能である。Ｎ－８０３は、健康なマウス及びカニクイザル、並びに膀胱癌、肺癌、黒色腫、リンパ腫、多発性骨髄腫、結腸癌、乳癌及び神経膠芽腫を含む多様なマウス及びげっ歯類腫瘍モデルにおいて、ＮＫ細胞及びＣＤ８－ Ｔ細胞の増殖並びに末梢循環及びリンパ系器官の活性化を有意に促進する。マウス及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルを含む、Ｎ－８０３の抗ウイルス効果についてのさらなる前臨床証拠が存在する。
【0274】
初期相試験からの臨床的証拠はまた、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖及び活性化を示すこれらの前臨床試験を支持している。Ｎ－８０３は、パーフォリン及びグランザイムＢを含む活性化マーカーの発現のアップレギュレーションによって示されるように、これらの免疫細胞の細胞傷害性を増加させる。Ｎ－８０３によってＮＫ及びＣＤ８＋ Ｔ細胞において誘導された表現型の変化は、（抗体依存性細胞傷害性、直接的細胞傷害性、及び増強された腫瘍特異的細胞傷害性を介して）抗癌活性の増強及びインビボでの生存の延長をもたらした。
【0275】
健康な志願者において、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化が実証されている。１０μｇ／ｋｇ及び２０μｇ／ｋｇのＳＣの用量でＮ－８０３を投与された健康な志願者の試験では、Ｎ－８０３処置対象は、Ｋｉ－６７染色ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の２０倍を超える増加を示した。リンパ球減少反応の刺激におけるＮ－８０３の臨床的有効性は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳癌、肺癌、及び膵臓癌を有する患者において実証されている。
【0276】
したがって、前臨床インビトロ及びインビボ試験が臨床データと共に、Ｎ－８０３がＩＬ－１５受容体提示細胞に対してより高い親和性で結合し、リンパ球分布を増強し、半減期を延長し、エフェクターＮＫ細胞及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の増殖及び活性化を引き起こし、抗腫瘍活性をもたらすことを実証したので、Ｎ－８０３は、ＮＫ及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方を刺激するＮ－８０３と同様の様式でＣＯＶＩＤ－１９関連リンパ球減少症に対抗し、正常な健康な対象及び癌を有する患者におけるリンパ球減少症を救済するための治療選択肢として使用され得る。したがって、Ｎ－８０３は、ＣＯＶＩＤ－１９に感染した患者におけるリンパ球減少症の回復又は緩和のために、及び疾患転帰を改善するために使用され得る。例えば、感染した対象は、１日目、及び１５日目（必要であれば）に腹部にＮ－８０３の皮下（ＳＣ）注射を受けることによって治療され得る。最も典型的には、Ｎ－８０３は１０ｍｃｇ／ｋｇの投与量で液体注射可能形態で提供されるであろう。
【0277】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明し、特許請求するために使用される、成分の量、濃度、反応条件などの特性を表す数字は、いくつかの例では、「約」という用語によって修正されるものとして理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、記載された説明及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、特定の実施形態によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に入る各別個の値を個々に参照する簡潔な方法としての役割を果たすことを意図している。本明細書に別段の指示がない限り、各個々の値は、あたかも本明細書に個々に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。
【0278】
本明細書で使用される場合、医薬組成物又は薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物又は薬物の直接的及び間接的投与の両方を指し、医薬組成物又は薬物の直接的投与は、典型的には、医療専門家（例えば、医師、看護師など）によって行われ、間接的投与は、医薬組成物又は薬物を直接的投与（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などによる）のために医療専門家に提供又は利用可能にする工程を含む。状態、疾患の発症に対する感受性、又は意図される治療に対する応答を「予測する」又は「予測すること」という用語は、対象における状態の進行、改善、及び／又は持続の速度を含む、状態、感受性、及び／又は応答を予測する行為又は予測（治療又は診断ではない）をカバーすることを意図することにさらに留意するべきである。
【0279】
本明細書で記載した全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は、明らかに文脈に矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に、本明細書に開示される技術をより良く明示することを意図し、さもなければ特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる言語も、特許請求される発明の実施に不可欠な、特許請求されない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【0280】
本明細書の説明及び以下の特許請求の範囲全体で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の参照を含む。また、本明細書の説明で使用される場合、「ｉｎ」の意味は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。また、本明細書で使用されるように、文脈が別段の指示をしない限り、用語「～に結合される」は、直接結合（互いに結合される２つの要素が互いに接触する）及び間接結合（少なくとも１つの追加の要素が２つの要素の間に位置する）の両方を含むことが意図される。したがって、「～に結合される」及び「～と結合される」という用語は、同義的に使用される。
【0281】
当業者には、本明細書の発明概念から逸脱することなく、既に説明したもの以外のさらに多くの変更が可能であることが明らかであろう。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて、限定されるべきではない。さらに、明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈する際に、全ての用語は、文脈と矛盾しない可能な限り広い方法で解釈されるべきである。特に、用語「含む」及び「含むこと」は、非排他的な方法で要素、成分、又は工程を指すものとして解釈されるべきであり、参照された要素、成分、又は工程が明示的に参照されていない他の要素、成分、又は工程が存在し、利用され、又は組み合わされ得ることを示す。明細書又は特許請求の範囲がＡ、Ｂ、Ｃ．．．及びＮからなる群から選択されるものの少なくとも１つに言及している場合、文章は、Ａ＋Ｎ、又はＢ＋Ｎなどではなく、群からの１つの要素のみを必要とするとして解釈されるべきである。
【図1】
【図2】
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【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【配列表】
【国際調査報告】