特表 2023-527359 改変インターロイキン－１０ポリペプチド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-28

(54)【発明の名称】改変インターロイキン－１０ポリペプチド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/24 20060101AFI20230621BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20230621BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230621BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230621BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230621BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230621BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230621BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230621BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230621BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230621BHJP

   C07K 14/76 20060101ALI20230621BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230621BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230621BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20230621BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20230621BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230621BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230621BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230621BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230621BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20230621BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230621BHJP

   A61P 37/06 20060101ALN20230621BHJP

   A61P 29/00 20060101ALN20230621BHJP

   A61P 19/02 20060101ALN20230621BHJP

   A61P 3/10 20060101ALN20230621BHJP

   A61P 1/04 20060101ALN20230621BHJP

【ＦＩ】

C12N15/24 ZNA

C07K14/54

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 K

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/76

A61P35/00

A61K38/20

A61K47/60

A61K47/62

A61K47/68

A61K39/395 Y

A61K39/395 W

A61K48/00

A61P43/00 107

A61P43/00 105

A61K47/46

A61K35/76

A61P37/06

A61P29/00 101

A61P29/00

A61P19/02

A61P3/10

A61P1/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022572570

(86)(22)【出願日】2021-05-27

(85)【翻訳文提出日】2023-01-19

(86)【国際出願番号】 US2021034580

(87)【国際公開番号】W WO2021243057

(87)【国際公開日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】63/031,186

(32)【優先日】2020-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】ケナン クリストファー ガーシア

(72)【発明者】

【氏名】ロバート アンドリュー サクストン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG03

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064CE12

4B064DA05

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA94

4C076CC03

4C076CC04

4C076CC09

4C076CC16

4C076CC21

4C076CC26

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE57

4C076EE59

4C076EE59M

4C076FF02

4C076FF31

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA06

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA41

4C084BA42

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA12

4C084NA03

4C084NA12

4C084NA14

4C084ZA661

4C084ZA961

4C084ZB031

4C084ZB081

4C084ZB111

4C084ZB151

4C084ZB211

4C084ZB221

4C084ZB261

4C084ZC351

4C085AA35

4C085BB42

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA03

4C087NA12

4C087NA14

4C087ZA66

4C087ZA96

4C087ZB03

4C087ZB08

4C087ZB11

4C087ZB15

4C087ZB21

4C087ZB22

4C087ZB26

4C087ZC35

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA02

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA22

4H045GA26

(57)【要約】

本開示は概して、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）に媒介されるシグナル伝達を調節するための組成物及び方法に関する。本開示は特に、インターロイキン－１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ－１０Ｒｂ）に対して改変された結合親和性を有する、新規ＩＬ－１０ポリペプチドバリアントを提供する。また、このようなＩＬ－１０ポリペプチドバリアントを製造するために有用な組成物及び方法、並びに、ＩＬ－１０媒介シグナル伝達を調節するための、及び／又は、ＩＬ－１０に媒介されるシグナル伝達の撹乱と関連した状態の治療のための、方法も提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸配列を有するインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）ポリペプチドに対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２５、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ７４、Ｘ９０、Ｘ９２、Ｘ９６、Ｘ１００、及びＸ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、
組換えポリペプチド。

【請求項2】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号１又は配列番号１６のＸ２５及びＸ９６からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位のものである、請求項１に記載の組換えポリペプチド。

【請求項3】

前記アミノ酸配列が、さらに配列番号１又は配列番号１６のＸ２１、Ｘ２２、Ｘ３２、及びＸ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項4】

前記組換えポリペプチドが、前記１つ又は複数のアミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドの結合親和性と比べ、ＩＬ－１０受容体ベータ（ＩＬ－１０Ｒβ）に対する改変された結合親和性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項5】

前記組換えポリペプチドが、前記基準ＩＬ－１０ポリペプチドの結合親和性と比べ、ＩＬ－１０Ｒβに対する低下した結合親和性を有する、請求項４に記載の組換えポリペプチド。

【請求項6】

前記組換えポリペプチドが、前記基準ＩＬ－１０ポリペプチドと比べ、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を刺激する能力が低下している、請求項４～５のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項7】

前記組換えポリペプチドが、前記基準ＩＬ－１０ポリペプチドの結合親和性と比べ、ＩＬ－１０Ｒβに対する増加した結合親和性を有する、請求項４に記載の組換えポリペプチド。

【請求項8】

前記組換えポリペプチドが、前記基準ＩＬ－１０ポリペプチドとの比較において、ＩＬ－１０を介した下流シグナル伝達の細胞型偏向性シグナル伝達（cell-type biased signaling）をもたらす、請求項４～７のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項9】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、アラニン置換、アスパラギン酸置換、ヒスチジン置換、グルタミン酸置換、リジン置換、セリン置換、トリプトファン置換、チロシン置換、バリン置換、及びこれらのいずれかの組み合わせ、からなる群より独立に選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項10】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号１又は配列番号１６の、Ｄ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位のものである、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項11】

前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５及びＥ９６からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位のものである、請求項１０に記載の組換えポリペプチド。

【請求項12】

前記アミノ酸配列が、さらに配列番号１又は配列番号１６のＮ２１、Ｍ２２、Ｒ３２、及びＳ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項13】

配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：
ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；
ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；
ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；
ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；
ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び
ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；
に対応するアミノ酸置換を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項14】

配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：
ａ）Ｄ２５Ａ；
ｂ）Ｄ２５Ｋ；
ｃ）Ｅ９６Ａ；
ｄ）Ｅ９６Ｋ；
ｅ）Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；
ｆ）Ｎ２１Ａ／Ｒ１０４Ａ；
ｇ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ；
ｈ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；及び
ｉ）Ｎ２１Ａ／Ｍ２２Ａ／Ｄ２５Ａ；
に対応するアミノ酸置換を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。

【請求項15】

請求項１～１４及び２３のいずれか１項のポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んだポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え核酸分子。

【請求項16】

前記核酸配列が、異種核酸配列に作動可能に連結している、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項17】

前記核酸分子が、発現カセット又は発現ベクターに組み込まれている、請求項１５～１６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項18】

ａ）請求項１～１４及び２３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；及び／又は
ｂ）請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
を含む、組換え細胞。

【請求項19】

前記組換え細胞が真核細胞である、請求項１８に記載の組換え細胞。

【請求項20】

前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項１９に記載の組換え細胞。

【請求項21】

少なくとも１つの、請求項１８のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び
培地；を含む、細胞培養物。

【請求項22】

ａ）１つ又は複数の、請求項１８のいずれか１項に記載の組換え細胞を提供すること；及び
ｂ）前記１つ又は複数の組換え細胞を、培地中で、前記細胞が前記組換え核酸分子にコードされるポリペプチドを産生するように培養すること；
を含む、ポリペプチドの製造方法。

【請求項23】

製造された前記ポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

製造された前記ポリペプチドを構造的に改変することによって半減期を延長することをさらに含む、請求項２２～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記改変が、ヒトＦｃ抗体断片への融合、アルブミンへの融合、及びＰＥＧ化からなる群より選択される１つ又は複数の改変を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

請求項２２のいずれか１項に記載の方法によって製造される、組換えポリペプチド。

【請求項27】

薬理学的に許容される担体；並びに、
ａ）請求項１～１４及び２３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ）請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組換え核酸；及び／又は
ｃ）請求項１８のいずれか１項に記載の組換え細胞；
を含む、医薬組成物。

【請求項28】

前記組成物が、請求項１～１４及び２３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；及び、薬理学的に許容される担体；を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項29】

前記組成物が、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組換え核酸；及び、薬理学的に許容される担体；を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記組成物が、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び、薬理学的に許容される担体；を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項31】

対象におけるＩＬ－１０媒介シグナル伝達を調節する方法であって、前記対象に、
ａ）請求項１～１４及び２３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ）請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
ｃ）請求項１８～２０のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
ｄ）請求項２７～３０に記載の医薬組成物；
を含む組成物を投与することを含む、方法。

【請求項32】

健康状態の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、
ａ）請求項１～１４及び２３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ）請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
ｃ）請求項１８～２０のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
ｄ）請求項２７～３０のいずれか１項に記載の医薬組成物；
を含む組成物を投与することを含む、方法。

【請求項33】

前記投与組成物が、前記１つ又は複数のアミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドとの比較において、ＩＬ－１０を介した下流シグナル伝達の細胞型偏向性シグナル伝達をもたらす、請求項３１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ１又はＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の低下を含み、その一方で、単球及びマクロファージにおけるＳＴＡＴ３媒介抗炎症機能を実質的に保持する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達が、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナリング（phospho-flow signaling）アッセイ、及び酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）からなる群より選択されるアッセイにより測定される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能が、サイトカイン産生、ケモカイン産生、免疫細胞増殖、及び免疫細胞動員からなる群より選択される、請求項３４～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能が、約２０％～約１００％低下する、請求項３４～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記投与組成物が、前記対象における、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、グランザイムＡ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＭＩＰ１αから選択される炎症誘発性遺伝子の発現を誘導する能力を低下させる、請求項３２～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記投与組成物が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞内のインターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）の発現を刺激する、請求項３２に記載の方法。

【請求項40】

前記健康状態が癌である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

対象におけるＩＬ－１０媒介シグナル伝達を調節するための、又は、健康状態の治療を、それを必要とする対象において行うための、キットであって、系が、
ａ）請求項１～１４及び２３のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド；
ｂ）請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組換え核酸；
ｃ）請求項１８～２０のいずれか１項に記載の組換え細胞；及び／又は
ｄ）請求項２７～３０のいずれか１項に記載の医薬組成物；
を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された契約番号ＡＩ５１３２１の下で政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0002】

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０３１，１８６号に対する優先権の利益を主張するものである。上述の出願の開示は、いずれの図面も含め、その全体が参照により明示的に本明細書に援用されるものとする。

【0003】

配列表の援用
添付の配列表における材料は、参照により本願に援用されるものとする。078430_520001WO_Sequence_Listing.txtという名前の添付の配列表テキストファイルは、２０２１年５月２０日に生成された５３ＫＢのものである。

【0004】

本開示は概して、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）に媒介されるシグナル伝達を調節するための組成物及び方法に関する。本開示は特に、インターロイキン－１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ－１０Ｒβ）に対して改変された結合親和性を有する、新規ＩＬ－１０ポリペプチドバリアントを提供する。また、このようなＩＬ－１０ポリペプチドバリアントを製造するために有用な組成物及び方法、並びに、ＩＬ－１０媒介シグナル伝達を調節するための、及び／又は、ＩＬ－１０に媒介されるシグナル伝達の撹乱と関連した状態の治療のための、方法も提供する。

【背景技術】

【0005】

バイオ医薬、又は、健康状態及び疾患の治療のための治療用タンパク質を含む医薬製剤の利用は、製薬及びバイオテクノロジー企業の中核的な戦略の一つである。例えば、サイトカインファミリーのいくつかのメンバーは癌の治療に有効であることが報告されており、癌免疫療法の開発において主要な役割を担っている。したがって、サイトカインファミリーは、その投与とバイオアシミレーション（bio-assimilation）を改善するために多大な臨床研究と努力が投入されてきた。

【0006】

しかし、サイトカイン類を含む既存の治療アプローチの臨床的な成果は限定的である。これらのアプローチの制約は、サイトカインのオフターゲット毒性と無効性とに起因することが多い。その大きな原因は、サイトカイン類が望ましい応答細胞（responder cells）及び望ましくない応答細胞の両者に受容体を持ち、それら細胞が互いにバランスを取り合って望ましくない副作用をもたらすという事実にある。近年、有望な戦略としてサイトカインエンジニアリングが登場した。この戦略では、サイトカイン類の調整により、より望ましい活性と低下した毒性とを有する組換えサイトカインを実現するために、様々な試みが行われている。

【0007】

特に、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）は、癌及び自己免疫疾患などのヒトの疾患において調節不全となっていることが多い、重要な抗炎症性サイトカインであると考えられてきた。組換えＩＬ－１０の薬物としての使用は長年にわたって興味を持たれてきたが、ＩＬ－１０は高度な多面発現性を示し、多くの異なった免疫細胞サブタイプに作用し、互いに対立的である場合も多い種々の生物学的効果を生じさせる。自己免疫疾患に関しては、ＩＬ－１０治療は、マウスモデルにおいて高い効果をもたらすことができる。これは、ＩＬ－１０が単球及びマクロファージによる炎症誘発性サイトカイン産生及びＭＨＣクラスＩＩ発現を抑制する能力によるものである。しかし、ＩＬ－１０はまた、ＣＤ８＋ Ｔ細胞による、炎症誘発性サイトカインであるインターフェロン－ガンマ（ＩＮＦγ）の産生も刺激する。これは抗炎症効果を打ち消すため、ＩＬ－１０の治療的及び臨床的有用性は限定的である。

【0008】

したがって、治療薬として使用するためのＩＬ－１０の特性を改善する、さらなるアプローチに対する需要が存在する。特に、何らかの下流機能や作用を他のものよりも選択的に活性化しうるＩＬ－１０のバリアント、例えば、ＩＬ－１０の多くの有益な特性を保持しつつも、その公知の炎症誘発性副作用を持たず、抗腫瘍剤又は免疫調節剤として、癌、自己免疫疾患、及び炎症性疾患などの各種関連疾患の治療において改善された使用が可能なバリアント、に対する需要が存在する。

【発明の概要】

【0009】

本開示は概して、免疫学の分野、特に、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）に媒介されるシグナル伝達経路の調節を、それを必要とする対象において行うための、組成物及び方法に関する。理論に拘束されるものではないが、より詳細に以下に説明するように、ＩＬ－１０媒介シグナル伝達は、ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の部分的アゴニスト作用によって調節されうる。より具体的には、一部実施形態において、本開示は、インターロイキン－１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ－１０Ｒβ）などのＩＬ－１０の天然リガンドへの結合親和性を調節した、新しい種類のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達をもたらすＩＬ－１０部分アゴニストを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞機能を刺激することなく単球及びマクロファージの活性化／サイトカイン産生を抑制することにより、細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達をもたらすＩＬ－１０部分アゴニスト、例えば、ヒトＰＢＭＣにおいて強力な単球偏向性シグナル伝達効果を示すＩＬ－１０部分アゴニストを提供する。本明細書でより詳細に議論されるように、これらのＩＬ－１０部分アゴニスト性バリアントは、ＩＬ－１０の多面発現性を克服し、改善された治療可能性を有することができる。本開示は、また、このようなＩＬ－１０ポリペプチドバリアントを製造するために有用な組成物及び方法、対象におけるＩＬ－１０媒介シグナル伝達を調節するための方法、並びに、受容体ＩＬ－１０Ｒβの下流のシグナル伝達の撹乱と関連した状態の治療のための方法も提供する。

【0010】

一態様において、（ａ）配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸配列を有するインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；を含み、さらに、（ｂ）配列番号１のＸ２５、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ７４、Ｘ９０、Ｘ９２、Ｘ９６、Ｘ１００、及びＸ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位の、１つ又は複数のアミノ酸置換；を含む、組換えポリペプチドが本明細書において提供される。

【0011】

開示される組換えポリペプチドの非限定的な好ましい実施形態は、次の特徴のうちの１つ又は複数を含みうる。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、（ａ）配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；並びに、（ｂ）配列番号１又は配列番号１６のＸ２５及びＸ９６からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位における、１つ又は複数のアミノ酸置換；を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、さらに、配列番号１のＸ２１、Ｘ２２、Ｘ３２、及びＸ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２５、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ３２、Ｘ７４、Ｘ９０、Ｘ９２、Ｘ９３、Ｘ９６、Ｘ１００、及びＸ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、前記１つ又は複数のアミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドの結合親和性と比べ、ＩＬ－１０受容体ベータ（ＩＬ－１０Ｒβ）に対する改変された結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、基準ＩＬ－１０ポリペプチドの結合親和性と比べ、ＩＬ－１０Ｒβに対する低下した結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、基準ＩＬ－１０ポリペプチドと比べ、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を刺激する能力が低下している。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、基準ＩＬ－１０ポリペプチドの結合親和性と比べ、ＩＬ－１０Ｒβに対する増加した結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、基準ＩＬ－１０ポリペプチドとの比較において、ＩＬ－１０を介した下流シグナル伝達の細胞型偏向性シグナル伝達（cell-type biased signaling）をもたらす。

【0012】

いくつかの実施形態において、前記１つ又は複数のアミノ酸置換は、アラニン置換、アルギニン置換、アスパラギン酸置換、ヒスチジン置換、グルタミン酸置換、リジン置換、セリン置換、トリプトファン置換、及びそのいずれかの組み合わせ、からなる群より独立に選択される。

【0013】

いくつかの実施形態において、前記１つ又は複数のアミノ酸置換は、配列番号１又は配列番号１６の、Ｄ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位のものである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＮ２１、Ｍ２２、Ｒ３２、及びＳ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｄ２５Ａ；（ｂ）Ｄ２５Ｋ；（ｃ）Ｅ９６Ａ；（ｄ）Ｅ９６Ｋ；（ｅ）Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；（ｆ）Ｎ２１Ａ／Ｒ１０４Ａ；（ｇ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ；（ｈ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；及び（ｉ）Ｎ２１Ａ／Ｍ２２Ａ／Ｄ２５Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｍ２２、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｒ３２、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｓ９３、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換を含む。

【0015】

一態様において、本開示のいくつかの実施形態は組換え核酸分子に関し、核酸は、本開示のポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸配列は、異種核酸配列に作動可能に連結している。いくつかの実施形態において、核酸分子は、発現カセット又は発現ベクターに組み込まれている。

【0016】

他の一態様において、本開示のいくつかの実施形態は組換え細胞に関し、組換え細胞は、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；及び／又は（ｂ）本開示の組換え核酸；を含む。いくつかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、真核細胞は哺乳類（例えばヒト）細胞である。関連する一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つの本開示の組換え細胞及び培地を含む、細胞培養物に関する。

【0017】

他の一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、ポリペプチドを製造するための方法に関し、方法は、（ａ）１つ又は複数の本開示の組換え細胞を提供すること；及び（ｂ）前記１つ又は複数の組換え細胞を、培地中で、細胞が組換え核酸分子にコードされるポリペプチドを産生するように培養すること；を含む。いくつかの実施形態において、方法は、さらに、製造されたポリペプチドを単離及び／又は精製することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、さらに、製造されたポリペプチドを構造的に改変することによって半減期を延長することを含む。いくつかの実施形態において、改変は、ヒトＦｃ抗体断片への融合、アルブミンへの融合、及びＰＥＧ化からなる群より選択される１つ又は複数の改変を含む。

【0018】

他の一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、薬理学的に許容される担体と、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；及び（ｃ）本開示の組換え細胞；のうちの１つ又は複数と、を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換えポリペプチド及び薬理学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のポリペプチドをコードする核酸配列を含んだ組換えウイルスベクター、及び薬理学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のポリペプチドをコードする核酸を含んだ組換え細胞、及び薬理学的に許容される担体を含む。

【0019】

一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－１０媒介シグナル伝達の調整のための方法であって、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；（ｄ）本開示の核酸を含む組換えウイルス又は非ウイルスベクター；及び（ｅ）本開示の医薬組成物；のうちの１つ又は複数を含んだ組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。

【0020】

他の一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、健康状態の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；（ｄ）本開示の核酸を含む組換えウイルス又は非ウイルスベクター；及び（ｅ）本開示の医薬組成物；のうちの１つ又は複数を含んだ組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、投与組成物は、前記１つ又は複数のアミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドとの比較において、ＩＬ－１０を介した下流シグナル伝達の細胞型偏向性シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ１又はＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の低下を含み、その一方で、単球及びマクロファージにおけるＳＴＡＴ３媒介抗炎症機能を実質的に保持する。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナリング（phospho-flow signaling）アッセイ、及び酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）からなる群より選択されるアッセイにより測定される。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能は、サイトカイン産生、ケモカイン産生、免疫細胞増殖、及び免疫細胞動員からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能は、約２０％～約１００％低下する。いくつかの実施形態において、投与組成物は、対象における、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、グランザイムＡ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＭＩＰ１αから選択される炎症誘発性遺伝子の発現を誘導する能力を低下させる。いくつかの実施形態において、投与組成物は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞内のインターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）の発現を刺激する。いくつかの実施形態において、健康状態は癌である。いくつかの実施形態において、健康状態は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、健康状態は慢性感染症である。

【0021】

他の一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、対象におけるＩＬ－１０媒介シグナル応答を調節するための、又は、健康状態の治療を、それを必要とする対象において行うための、キットであって、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）本開示の組換え細胞；及び（ｄ）本開示の医薬組成物；のうちの１つ又は複数を含むキットに関する。

【0022】

上述の概要は単なる例証にすぎず、何らかの制限を意図したものではない。本明細書に記載の例証としての実施形態及び特徴以外にも、本開示のさらなる態様、実施形態、目的、及び特徴が、図面、詳細な説明、及び特許請求の範囲から充分に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１Ａは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒα、及びＩＬ－１０Ｒβを含む、ＩＬ－１０受容体複合体の分子モデルの上面図である。 図１Ｂは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒα、及びＩＬ－１０Ｒβを含む、ＩＬ－１０受容体複合体の分子モデルの側面図である。

【0024】

【図2A-B】図２Ａは、ＩＬ－１０による受容体結合のための構造的基盤を説明する実験結果の、模式的な概略である。ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒα、及びＩＬ－１０Ｒβを含む、ＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒα／ＩＬ－１０Ｒβ三元複合体の図。水素結合及び塩橋（salt-bridges）を黒い点線で示す。親和性成熟した（affinity matured）ＩＬ－１０（スーパー１０（super-10））における変異残基をイタリックで示す。 図２Ｂは、ＩＬ－１０による受容体結合のための構造的基盤を説明する実験結果の、模式的な概略である。ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒα、及びＩＬ－１０Ｒβを含む、ＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒα／ＩＬ－１０Ｒβ三元複合体の図。水素結合及び塩橋を黒い点線で示す。親和性成熟したＩＬ－１０（スーパー１０）における変異残基をイタリックで示す。

【図2C-E】図２Ｃは、ＩＬ－１０による受容体結合のための構造的基盤を説明する実験結果の、模式的な概略である。ＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒβ結合界面をクローズアップした図。水素結合及び塩橋を黒い点線で示す。親和性成熟したＩＬ－１０（スーパー１０）における変異残基をイタリックで示す。 図２Ｄは、ＩＬ－１０による受容体結合のための構造的基盤を説明する実験結果の、模式的な概略である。ＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒβ結合界面をクローズアップした図。水素結合及び塩橋を黒い点線で示す。親和性成熟したＩＬ－１０（スーパー１０）における変異残基をイタリックで示す。 図２Ｅは、ＩＬ－１０による受容体結合のための構造的基盤を説明する実験結果の、模式的な概略である。ＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒβ結合界面をクローズアップした図。水素結合及び塩橋を黒い点線で示す。親和性成熟したＩＬ－１０（スーパー１０）における変異残基をイタリックで示す。

【図2F】図２Ｆは、ＩＬ－１０による受容体結合のための構造的基盤を説明する実験結果の、模式的な概略である。ＩＬ－１０Ｒβ界面の変異はＩＬ－１０シグナル伝達活性を低下させる。ＷＴ ＩＬ－１０又は図示されたバリアントで２０分間刺激し、フローサイトメトリーによって分析された、Ｄａｕｄｉ細胞におけるホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３の用量反応曲線。データは２回の独立した反復における平均±ＳＤであり、ＷＴ ＩＬ－１０の極大シグナルに対する百分率として示す。

【0025】

【図3A】図３Ａは、ＩＬ－１０Ｒβ親和性のチューニングによって細胞型間で異なったＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性（signaling plasticity）が見られることを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。ＩＬ－１０Ｒβ結合変異体は、Ｄａｕｄｉ及びＴＨＰ－１細胞において異なったシグナル応答を示す。細胞株を１００ｎＭのＩＬ－１０又は図示された変異体で２０分間処理し、フローサイトメトリーで分析した。データは２回の独立した反復における平均±ＳＤである。

【図3B-C】図３Ｂは、ＩＬ－１０Ｒβ親和性のチューニングによって細胞型間で異なったＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性が見られることを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。ＩＬ－１０ヘリックスα１及びα３の図に、高親和性スーパー１０及び部分アゴニスト１０－ＤＥ（Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ二重変異体）における変異残基を示す。 図３Ｃは、ＩＬ－１０Ｒβ親和性のチューニングによって細胞型間で異なったＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性が見られることを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。図３Ｄに示すＳ字用量反応曲線から算出した、ホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３に対する、正規化したＥ_ｍａｘ値。データは、３回の反復における平均±ＳＤである。

【図3D】図３Ｄは、ＩＬ－１０Ｒβ親和性のチューニングによって細胞型間で異なったＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性が見られることを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。Ｌ－１０変異体「スーパー１０」及び「１０－ＤＥ」は、細胞型間で異なったシグナリングプロファイルを示す。ＷＴ ＩＬ－１０、スーパー１０、Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ変異体（１０－ＤＥ）で２０分間刺激し、フローサイトメトリーにより分析した、図示された細胞株におけるホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３の用量反応曲線。データは３回の反復における平均±ＳＤであり、その細胞株におけるＷＴ ＩＬ－１０の極大シグナルに対する百分率として示す。

【図3E】図３Ｅは、ＩＬ－１０Ｒβ親和性のチューニングによって細胞型間で異なったＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性が見られることを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。ＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性はＩＬ－１０Ｒβ発現と相関する。フローサイトメトリーにより分析した、図示された細胞株上での、表面染色されたＩＬ－１０Ｒα（左）及びＩＬ－１０Ｒβ（右）の蛍光強度を示すヒストグラム。

【0026】

【図4A】図４Ａは、例示された骨髄偏向性部分アゴニストがＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とを切り離すことを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。ＩＬ－１０Ｒβはヒト初代免疫細胞において異なった発現を示す。図６Ａに示すようなゲーティング戦略を用いてフローサイトメトリーにより分析された、ヒトＰＢＭＣにおける図示された細胞型上のＩＬ－１０Ｒβの蛍光強度を示すヒストグラム。

【図4B】図４Ｂは、例示された骨髄偏向性部分アゴニストがＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とを切り離すことを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。ＩＬ－１０バリアント１０－ＤＥは、ヒトＰＢＭＣにおいて単球偏向性シグナル伝達を生じさせる。１０ｎＭのＷＴ ＩＬ－１０又は図示したバリアントで処理したヒトＰＢＭＣの図示した細胞型における、正規化されたホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３シグナル応答を、フローサイトメトリーにより分析したもの。データは２回の反復における平均±ＳＤであり、異なるドナーのＰＢＭＣを用いて３回行われた代表的な実験のものである。

【図4C-D】図４Ｃは、例示された骨髄偏向性部分アゴニストがＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とを切り離すことを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。１０－ＤＥはバルク（bulk）ＰＢＭＣにおける炎症性サイトカイン産生を抑制する。ＰＢＭＣを１ｎＭのＬＰＳ単独で、又はさらに１０ｎＭのＷＴ ＩＬ－１０、１０－ＤＥ、もしくはスーパー１０を添加して、２４時間刺激した。上清におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及びＩＬ－８の濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。データは３回の独立した反復における平均±ＳＥＭである。 図４Ｄは、例示された骨髄偏向性部分アゴニストがＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とを切り離すことを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。１０－ＤＥは、活性化された単球上でＭＨＣ－ＩＩ表面発現を下方制御する。ＰＢＭＣを１ｎＭのＬＰＳ、及びＰＢＳ、１０ｎＭのＷＴ ＩＬ－１０、１０－ＤＥ、又はスーパー１０で２４時間刺激し、単球（ＣＤ１４＋）の表面ＨＬＡ－ＤＲ発現の分析をフローサイトメトリーによって行った。

【図4E】図４Ｅは、例示された骨髄偏向性部分アゴニストがＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とを切り離すことを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。１０－ＤＥは、ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性サイトカイン産生を抑制する。単離されたヒトマクロファージを、１ｎＭのＬＰＳ単独で、又はさらに１０ｎＭのＷＴ ＩＬ－１０、１０－ＤＥ、もしくはスーパー１０を添加して、２４時間刺激した。上清におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及びＩＬ－８の濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。データは３回の独立した反復における平均±ＳＥＭである。

【図4F】図４Ｆは、例示された骨髄偏向性部分アゴニストがＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とを切り離すことを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。１０－ＤＥは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ又はグランザイムＢ産生を増強しない。ヒトＰＢＭＣ由来の、あらかじめ活性化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体単独で、又はそれと１０ｎＭのＷＴ ＩＬ－１０、１０－ＤＥ、もしくはスーパー１０との組み合わせで、３時間刺激した。上清におけるＩＦＮ－γ及びグランザイムＢの濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。データは３回の独立した反復における平均±ＳＥＭである。

【図4G】図４Ｇは、例示された骨髄偏向性部分アゴニストがＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とを切り離すことを説明する実験結果を、模式的に概説したものである。ＩＬ－１０バリアント１０－ＤＥの細胞型偏向性シグナル伝達が、どのようにＩＬ－１０の免疫抑制機能と免疫賦活機能とを切り離すかを示すモデル。

【0027】

【図5A】図５Ａは、ランダム化の標的とした７つの残基、ライブラリー生成における各部位のコドン、並びに、クローン５．１、５．２、及び５．３（それぞれ配列番号２、３、及び４）のそれぞれの位置に存在するアミノ酸を示す表である。

【図5B-D】図５Ｂは、親和性成熟したＩＬ－１０バリアントが、ＩＬ－１０Ｒβに対して強化された結合を示すことを示す図である。ＳＡ－６４７－ＩＬ－１０Ｒβの、ＷＴ単量体ＩＬ－１０又は親和性成熟クローンを提示する酵母に対する結合力価測定。酵母は５００ｎＭの未標識ＩＬ－１０Ｒαとあらかじめ結合させた。 図５Ｃは、固相化された親和性成熟ＩＬ－１０クローン５．１単独（図５Ｆ）に対する可溶性ＩＬ－１０Ｒβの結合を示す表面プラズモン共鳴センソグラム（sensogram）である。Ｋ_Ｄ：解離定数。 図５Ｄは、飽和可溶性ＩＬ－１０Ｒαとあらかじめ結合させた（図５Ｄ）、固相化された親和性成熟ＩＬ－１０クローン５．１に対する、可溶性ＩＬ－１０Ｒβの結合を示す表面プラズモン共鳴センソグラムである。Ｋ_Ｄ：解離定数。

【0028】

【図6A】図６Ａは、図４Ａ～４ＢにおけるＰＢＭＣホスホ－フローサイトメトリーシグナリング実験のゲーティング戦略である。

【図6B】図６Ｂは、ＷＴ ＩＬ－１０又は１０－ＤＥで２０分間刺激したヒトＰＢＭＣにおける、ホスホ－Ｙ７０５－ＳＴＡＴ３の用量反応曲線である。分析はフローサイトメトリーで行った。データは２回の反復における平均±ＳＤであり、ＷＴ ＩＬ－１０の極大シグナルに対する百分率として示す。異なるドナーのＰＢＭＣで少なくとも３回行った代表的な実験を示す。

【0029】

【図7A-D】図７Ａは、ＬＰＳ及び図示したＩＬ－１０バリアントで処理したバルクヒトＰＢＭＣからの、ＩＬ－１βの濃度である。測定はＥＬＩＳＡによって行った（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、Ｎ＝２、^＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定）。 図７Ｂは、ＬＰＳ単独によって、又はそれと１０ｎＭの図示したＩＬ－１０バリアントとの組み合わせによって活性化した単球上の表面ＨＬＡ－ＤＲを、フローサイトメトリーによって分析したものである（平均±ＳＤ、ｎ＝４、Ｎ＝２）。 図７Ｃは、ＬＰＳ単独によって、又はそれと１０ｎＭの図示したＩＬ－１０バリアントとの組み合わせによって活性化した単球上のＣＤ８６表面発現を、フローサイトメトリーによって分析したものである（平均±ＳＤ、ｎ＝４、Ｎ＝２）。 図７Ｄは、抗ＣＤ３抗体単独で、又はそれと図示したＩＬ－１０バリアントとの組み合わせで、７２時間刺激したバルクＰＢＭＣからのＩＦＮ－γの濃度である。測定はＥＬＩＳＡによって行った（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、Ｎ＝３、^＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定）。

【図7E】図７Ｅは、ＬＰＳ（１５ｍｇ／ｋｇ）と、ＰＢＳ、ＷＴ ＩＬ－１０、又は１０－ＤＥとの組み合わせの腹腔内注射後の生存である（ｎ＝８マウス、Ｎ＝２、^＊＊Ｐ＜０．０１、ログランクＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。

【図7F-G】図７Ｆは、ＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ）及び図示したＩＬ－１０バリアントの注射後のマウス血清における、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６の濃度である。測定はＥＬＩＳＡによって行った（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、Ｎ＝２、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定）。 図７Ｇは、ＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ）及び図示したＩＬ－１０バリアントの注射後のマウス血清における、ハプトグロビンの濃度である。測定はＥＬＩＳＡによって行った（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、Ｎ＝２、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定）。

【0030】

【図8A-B】図８Ａは、１０ｎＭのＷＴ又は変異ＩＬ－１０で処理した初代免疫細胞におけるホスホ－ＳＴＡＴ１活性化を、フローサイトメトリーによって分析したものである（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、Ｎ＝２）。 図８Ｂは、１０ｎＭのＷＴ ＩＬ－１０、スーパー１０、又は１０－ＤＥで処理したＣＤ４^＋ Ｔ細胞からのホスホ－ＳＴＡＴ３に対する、正規化されたＭＦＩ値である。分析はフローサイトメトリーによって行った（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４、Ｎ＝２）。

【図8C】図８Ｃは、図示したＩＬ－１０バリアントで２４時間処理した活性化ＣＤ８^＋ Ｔ細胞における、ＩＬ－１０によって調節される選択された遺伝子の変化倍率である。分析はＲＮＡ－ｓｅｑによって行った（ｎ＝２ 生物学的反復）。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本開示は概して、対象における、インターロイキン－１０（ＩＬ１０）に媒介されるシグナル伝達経路を選択的に調節するための組成物及び方法に関する。より詳細に以下に説明するように、ＩＬ－１０媒介シグナル伝達は、ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の細胞型偏向性アゴニスト作用によって調節されうる。本開示のいくつかの実施形態は、ＩＬ－１０がどのように同族受容体（cognate receptors）、特にＩＬ－１０Ｒβと相互作用するかということに関する新たな見識に基づいて設計された、新規ＩＬ－１０ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態は、インターロイキン－１０の天然受容体、例えばインターロイキン－１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ－１０Ｒβ）に対する調節された結合親和性を有するＩＬ－１０ポリペプチドバリアントのクラスを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、細胞型選択的ＩＬ－１０シグナル伝達を有するＩＬ－１０部分アゴニスト、例えば、バルクＰＢＭＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の低下をもたらす一方で、単球及びマクロファージにおけるＳＴＡＴ３媒介機能を実質的に（例えば９０～１１０％）保持するＩＬ－１０部分アゴニストを提供する。本開示は、また、このようなＩＬ－１０ポリペプチドバリアントを製造するために有用な組成物及び方法、対象におけるＩＬ－１０媒介シグナル伝達を調節するための方法、並びに、ＩＬ－１０受容体の下流のシグナル伝達の撹乱と関連した状態の治療のための方法も提供する。

【0032】

より詳細に以下に説明するように、完全なＩＬ－１０受容体シグナリング複合体のクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）構造を決定することにより、構造に基づいたアプローチを用いてＩＬ－１０の作用を解析した。これにより、骨髄選択的アゴニストの設計が可能になる。ＩＬ－１０受容体シグナリング複合体の星形六量体構造は、どのようにＩＬ－１０とＩＬ－１０Ｒαとが複合表面を形成し、共有する受容体サブユニットＩＬ－１０Ｒβを結合するかを示すものであり、それによってＩＬ－１０部分アゴニストの設計が可能になる。様々なＩＬ－１０Ｒβ結合親和性を有するように設計された一連のＩＬ－１０変異体の特徴付けによって、ＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性が細胞型によってどのように異なるかが明らかになった。特に、本明細書に示した実験データは、ＩＬ－１０－Ｒβに対するＩＬ－１０の結合部位の変異により、炎症誘発機能及び／又はＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達を選択的に、細胞型に依存する様式で抑制する能力のある偏向性アゴニストが得られることを明らかにした。本明細書に開示されるいくつかのＩＬ－１０偏向性アゴニストは、バルクＰＢＭＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞においてＳＴＡＴ３媒介機能の低下をもたらしうる一方で、単球及びマクロファージにおけるＳＴＡＴ３媒介機能を実質的に保持する。このようなＩＬ－１０偏向性アゴニストの例として、炎症性マクロファージ活性化の抑制などの骨髄偏向活性を有するがインターフェロンγ産生は促進しないＩＬ－１０バリアントが、実施例５～６に示した実験結果に記載されている。

【0033】

これらの結果は、ＩＬ－１０の多面発現性のメカニズムに対する知見を提供し、また、ＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性をどのようにＩＬ－１０の機能の調整のために利用しうるかということを示すものである。

【0034】

定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語、表記及びその他の科学用語又は術語は、本開示と関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの例では、一般的に理解される意味の用語を、明確性のため及び／又は参照を容易に行うために本明細書において定義する。本明細書にそのような定義が含まれることが、必ずしも当該技術分野において一般に理解されるものとの実質的な相違を表すものと解釈されるべきではない。本明細書に記載されるか、又は参照される技術及び手順の多くは、当業者に充分に理解され、従来の方法論を使用して一般に利用されている。

【0035】

単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明らかに別のことを規定していない限り、複数形としての言及を含む。例えば、「細胞（a cell）」という語は、１つ又は複数の細胞を包含し、細胞の混合物も包含する。本明細書で用いられる「Ａ及び／又はＢ」は、次の選択肢のいずれをも含む：「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ又はＢ」、並びに「Ａ及びＢ」。

【0036】

本明細書で用いられる「約（about）」は、「およそ（approximately）」という、その通常の意味を有する。その概算の度合いが文脈から明らかでない場合、「約」は、提供された値のプラス又はマイナス１０％以内であるか、又は、最も近い有効数字に四捨五入されたものであることを意味し、いずれの場合においても、その提供された値を含む。範囲が提供される場合、それは境界値を含む。

【0037】

本明細書で用いられる「投与」及び「投与すること」という語は、口腔、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、筋肉内、及び局所投与、又はその組み合わせを含むがそれらに限定されない投与経路による、生物活性組成物又は製剤の送達のことを指す。この語は、医療専門家による投与及び自己投与を含むが、これらに限定されない。

【0038】

「細胞」、「細胞培養物」、及び「細胞株」の語は、特定の対象細胞、細胞培養物、又は細胞株だけではなく、このような細胞、細胞培養物、又は細胞株の子孫もしくは潜在的な子孫のことも指し、この場合、移植（transfers）や培養における継代の回数は問わない。全ての子孫が親細胞と完全に同一であるわけではないことを理解すべきである。これは、突然変異（例えば、意図的又は偶然の突然変異）又は環境の影響（例えば、メチル化又は他のエピジェネティックな修飾）のいずれかが原因で、後に続く世代において何らかの変化が生じ、子孫が実際には親細胞と同一ではなくなる可能性があるためである。しかし、子孫がもとの細胞、細胞培養物、又は細胞株と同一の機能性を保持する限り、本明細書で使用される語の範囲内に依然として含まれる。

【0039】

本開示の対象の組換えポリペプチドの「有効量」、「治療的有効量」、又は「医薬的有効量」という語は、概して、ある組成物が、その組成物無しの場合との比較において所定の目的を達成する（例えば、組成物投与の目的の効果を達成する、疾患を治療する、シグナル伝達経路を弱める、又は、疾患もしくは健康状態の１つもしくは複数の症状を低減させる）のに充分な量のことを意味する。「有効量」の一例は、疾患の１つ又は複数の症状の、治療、予防、又は低減に寄与するのに充分な量であり、それは「治療的有効量」と呼ぶこともできる。症状の「低減」とは、症状の重症度又は頻度を低下させること、又は症状を無くすことを意味する。「治療的有効量」を含む組成物の正確な量は治療の目的によって異なりうるが、当業者はそれを公知の技術を用いて確認することができるであろう（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar, Dosage Calculations (1999)；及び、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参照のこと）。

【0040】

本明細書で用いられるＩＬ－１０ポリペプチドの「バリアント」という語は、野生型ＩＬ－１０ポリペプチドなどの基準ＩＬ－１０ポリペプチドのアミノ酸配列と比較した際に、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入が存在するポリペプチドのことを指す。したがって、「ＩＬ－１０ポリペプチドバリアント」という語は、ＩＬ－１０ポリペプチドの天然のアレルバリアント又は選択的スプライシングバリアントを含む。例えば、あるポリペプチドバリアントは、親ＩＬ－１０ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸の、類似もしくは相同アミノ酸又は非類似アミノ酸への置換を含む。

【0041】

本明細書で用いられる「作動可能に連結された」という語は、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列などの２つ以上のエレメントが、意図された通りの様式で作用できるように、互いに物理的又は機能的に連結されることを意味する。例えば、目的とするポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との間の作動可能な連結は、目的とするポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な結合である。作動可能に連結されたエレメントは、連続するものであっても、不連続なものであってもよいことを理解すべきである。ポリペプチドに関しては、「作動可能に連結された」という語は、ポリペプチドの記載された活性を提供するための、アミノ酸配列間（例えば異なるドメイン間）の物理的な連結（例えば、直接又は間接的な結合）のことを指す。本開示では、本開示の組換えポリペプチドの各種ドメインを、細胞内における組換えポリペプチドの適切なフォールディング、プロセッシング、ターゲティング、発現、結合などの機能的な特性が保持されるように作動可能に連結することができる。本開示の組換えポリペプチドの作動可能に連結したドメインは、連続するものであっても、不連続な（例えば、互いにリンカーを介して結合した）ものであってもよい。

【0042】

本明細書で２つ以上の核酸又はタンパク質と関連して用いられる「パーセント同一性」という語は、同一の２つ以上の配列又は部分配列（subsequences）のことを指すか、あるいは、ＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて下記のデフォルトパラメータで測定した場合に、又は手作業によるアラインメントと目視で測定した場合に、同じヌクレオチドもしくはアミノ酸を特定の割合（比較ウィンドウ又は指定された領域において最大の一致となるように比較及びアラインメントを行った場合に、特定領域において、例えば約６０％の配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれよりも高い同一性）で有する２つ以上の配列又は部分配列のことを指す。例えば、ncbi.nlm.nih.gov/BLASTのＮＣＢＩウェブサイトを参照のこと。そして、このような配列を「実質的に同一」と言う。この定義は相補配列のことも指し、定義を相補配列へ適用してもよい。この定義にはまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに、置換を有する配列も含まれる。配列同一性は、公開済の技術、及び、広く利用可能なコンピュータプログラム、例えばＧＣＳプログラムパッケージ（Devereux et al, Nucleic Acids Res. 12:387, 1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990）などを用いて計算することができる。配列同一性は、配列分析ソフトウェア、例えばSequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group at the University of Wisconsin Biotechnology Center (1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）などをデフォルトパラメータで用いて測定することができる。

【0043】

本明細書で用いられる「薬理学的に許容される賦形剤」という語は、対象に目的の化合物を投与するための薬理学的に許容される担体、添加剤、又は希釈剤を提供する任意の適した物質のことを指す。したがって、「薬理学的に許容される賦形剤」は、薬理学的に許容される希釈剤、薬理学的に許容される添加剤、及び薬理学的に許容される担体と呼ばれる物質を含みうる。本明細書で用いられる「薬理学的に許容される担体」という語は、医薬の投与に適合した生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤（absorption delaying agents）、及び同種のものを含むが、それらに限定されない。補助的な活性化合物（例えば、抗生物質及び追加的な治療剤など）も組成物の中に組み込むことができる。

【0044】

本明細書で用いられる「組換え」もしくは「改変」核酸分子又はポリペプチドという語は、ヒトの介在によって変えられた核酸分子又はポリペプチドのことを指す。非限定的な例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって生成した任意の核酸分子、リンカー配列を取り付けた核酸分子、又は、クローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた核酸分子も同様に組換えＤＮＡ分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は、１）化学的もしくは酵素的な技術などを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで合成もしくは改変された組換え核酸分子；２）天然では結合していないヌクレオチド配列が結合している組換え核酸分子；３）天然の核酸分子配列と比べて１つもしくは複数のヌクレオチドを欠くように、分子クローニング技術を用いて改変された組換え核酸分子；及び／又は、４）天然の核酸分子配列と比べて１つもしくは複数の配列変化もしくは再構成を有するように、分子クローニング技術を用いて操作された組換え核酸分子；でありうる。非限定的な例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって生成した任意の核酸分子、リンカー配列を取り付けた核酸分子、又は、クローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた核酸分子も同様に組換えＤＮＡ分子である。組換え核酸及び組換えタンパク質の他の非限定的な例として、本明細書に開示のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントが挙げられる。

【0045】

本明細書で用いられる「個体」又は「対象」には、動物、例えば、ヒト（例えば、ヒト個体）及び非ヒト動物が含まれる。いくつかの実施形態において、「個体」又は「対象」は、医師による治療を受けている患者である。したがって、対象は、目的の疾患（癌など）、及び／又は疾患の１つもしくは複数の症状を有する、有するリスクのある、又は有する疑いのある、ヒト患者又は個体でありうる。対象は、目的の状態のリスクがあると診断された、診断時又は診断後の、個体であってもよい。「非ヒト動物」という語には、あらゆる脊椎動物が含まれ、例として、哺乳類、例えば齧歯類、例えばマウス；非ヒト霊長類；ヒツジ、イヌ、ウシ、及びニワトリなどの他の哺乳類；並びに、両生類及び爬虫類などの非哺乳類；などが含まれる。

【0046】

本明細書で用いられる「ベクター」という語は、他の核酸分子を導入又は輸送することのできる、核酸分子又は配列のことを指す。導入核酸分子は一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入、される。一般に、ベクターは、適切な制御エレメントと関連付けられた場合に複製が可能である。「ベクター」という語には、クローニングベクター及び発現ベクター、並びに、ウイルスベクター及び組み込みベクター（integrating vectors）が含まれる。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターであり、この調節領域によってＤＮＡ配列及び断片をｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで発現することができる。ベクターは、細胞内で自律的な複製を指示する配列を含んでいてよく、あるいは、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに充分な配列を含んでいてよい。有用なベクターの例として、プラスミド（ＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミドなど）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターの例としては、複製欠損レトロウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは遺伝子送達ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは遺伝子を細胞内に導入するための遺伝子送達媒体として用いられる。

【0047】

本明細書に記載される開示の態様及び実施形態には、態様及び実施形態を「含む」場合と、態様及び実施形態「からなる」場合と、態様及び実施形態「から主になる」場合とが含まれると理解される。

【0048】

本明細書で用いられる「含む」は、「包含する」、「含有する」、又は「特徴とする」の同義語であり、包括的又は範囲を設定しないものであって、記載の無いさらなる要素又は方法の工程を排除するものではない。本明細書で用いられる「からなる」は、権利を請求する組成物又は方法において特定されていないあらゆる要素、工程、又は成分を除外するものである。本明細書で用いられる「から主になる」は、権利を請求する組成物又は方法の、基礎的かつ新規な特徴に実質的に影響しない材料又は工程を、排除しないものである。本明細書において「含む」という語が記述される場合には、いずれも、特に組成物の成分の記述又は方法の工程の記述における場合には、記載された成分又は方法から主になる組成物及び方法、並びに、その成分又は方法からなる組成物及び方法、が包含されると理解される。

【0049】

（ａ）、（ｂ）、及び（ｉ）などの見出し記号は、単に明細書及び請求項を読みやすくするために示されている。明細書又は特許請求の範囲における見出し記号の使用によって、工程又は要素が英字又は数字の順番で行われたり、表示された順番でそれらが行われたりすることが必要となるわけではない。

【0050】

当業者が理解するであろうように、書面の提供などに関するあらゆる目的において、本明細書に開示される全ての範囲には、ありうる全ての部分範囲、及び部分範囲の組み合わせも含まれる。記載のいずれの範囲についても、それが充分な記述であることや、その同じ範囲を少なくとも同等な半分、１／３、１／４、１／５、１／１０などに分割できることを容易に認識できる。非限定的な一例として、本明細書で論じられている各範囲は、下位の１／３、中央の１／３、及び上位の１／３などに容易に分割できる。当業者が理解するであろうように、「まで」、「少なくとも」、「超」、「未満」及び同種のあらゆる語は、記載されている数字を含み、そして、上述のように引き続き部分範囲に分割できる範囲のことを指す。そして、当業者が理解するであろうように、１つの範囲には個々の要素それぞれが含まれる。したがって、例えば、１～３個の要素を有する群は、１個、２個、又は３個の要素を有する群を意味する。同様に、１～５個の要素を有する群は、１個、２個、３個、４個、又は５個の要素を有する群を意味し、以下同様である。

【0051】

ある範囲は、「約」という語の後に続く数値を用いて本明細書に示されている。本明細書において、「約」という語は、その語に続く数字そのものに対して、及び、その語に続く数字に近い又は近似的である数字に対して、字義通りの支持を提供するために用いられる。ある数字が、ある具体的に記載された数字に近い又は近似的であるかどうかを決定する際、その近い又は近似的である記載されていない数字は、それが提示された文脈において、具体的に記載された数字の実質的な等価物を提供する数字でありうる。

【0052】

明確化のために複数の実施形態によって記載される本開示のいくつかの特徴は、単一の実施形態において組み合わされて提供されてもよいことが理解される。一方、簡潔さのために単一の実施形態によって記載される本開示の各種特徴は、別々に提供されてもよいし、あるいは任意の適切な部分的組み合わせ（sub-combination）で提供されてもよい。本開示に関連する実施形態のあらゆる組み合わせは、１つ１つの組み合わせが個々に、かつ明示的に開示された場合と同等に、本開示に具体的に包含され、本明細書に開示される。さらに、各種実施形態及びその要素のあらゆる部分的組み合わせも、１つ１つのこのような部分的組み合わせが個々に、かつ明示的に本明細書に開示された場合と同等に、本開示に具体的に包含され、本明細書に開示される。

【0053】

インターロイキン－１０及び炎症性免疫応答
サイトカインであるインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）は、抗炎症特性及び免疫賦活特性の両者を有しており、ヒトの疾患において調節不全となっていることが多い。これは、約３７ｋＤａの非共有結合ホモダイマーとして発現する多面発現性サイトカインであり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する作用を通じて複数の免疫応答を制御している。主にその抗炎症特性が広く報告されている。ＩＬ－１０は、活性化された単球及び活性化されたマクロファージにおいて、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦの発現を阻害することによって免疫応答を抑制することが報告されている。ＩＬ－１０は主にマクロファージで発現しているが、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、及び単球においても発現が検出されている。免疫応答を抑制することに加え、ＩＬ－１０は、ＩＬ－２及びＩＬ－４で処理された胸腺細胞の増殖を刺激することや、Ｂ細胞の生存率を増加させることや、ＭＨＣクラスＩＩの発現を刺激することなど、免疫賦活特性を示す。

【0054】

ＩＬ－１０の様々な免疫賦活特性が報告されている。ＩＬ－１０は、Ｂ細胞活性化を共刺激し、Ｂ細胞の生存を伸ばし、Ｂ細胞におけるクラススイッチに貢献することができる。さらに、ＩＬ－１０は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖とサイトカイン生成とを共刺激することができ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞のいくつかのサブセットの増殖を刺激する増殖因子として作用する。ＩＬ－１０をヒトにおいて高用量で用いると、ＩＮＦγの産生が増加しうることが報告されている。ＩＬ－１０は、ＩＬ－１０受容体１（ＩＬ－１０Ｒα）及びＩＬ－１０Ｒβのそれぞれ２コピーからなる二受容体複合体を介してシグナル伝達を行う。ＩＬ－１０ＲαはＩＬ－１０と比較的高い親和性（約３５～２００ｐＭ）で結合し、ＩＬ－１０Ｒβの受容体複合体へのリクルートはリガンドの結合に対してほとんど貢献しない。しかし、複合体へのＩＬ－１０Ｒβの結合は、リガンド結合に続くシグナル伝達を可能にする。したがって、機能的な受容体は、ＩＬ－１０Ｒα及びＩＬ－１０Ｒβのヘテロダイマーの二量体からなる。ほとんどの造血細胞は恒常的に低濃度のＩＬ－１０Ｒαを発現しており、受容体発現は各種刺激によって劇的に上方制御されることが多い。一方、ＩＬ－１０Ｒβはほとんどの細胞上に発現している。ＩＬ－１０が受容体複合体に結合すると、ＩＬ－１０Ｒα及びＩＬ－１０Ｒβとそれぞれ関連したヤヌスチロシンキナーゼ（Janus tyrosine kinase）ＪＡＫ１及びＴｙｋ２が活性化され、受容体の細胞質テール（cytoplasmic tails）がリン酸化される。その結果、ＳＴＡＴ３がＩＬ－１０Ｒαにリクルートされる。ＳＴＡＴ３のホモダイマー化の結果、それが受容体から放出され、リン酸化されたＳＴＡＴホモダイマーが核内へと移動して、そこで各種遺伝子のプロモーター内のＳＴＡＴ３結合エレメントへと結合する。これら遺伝子の１つがＩＬ－１０自身であり、ＳＴＡＴ３によって正の調節を受ける。ＳＴＡＴ３はまた、サイトカインシグナリング３（ＳＯＣＳ３）のサプレッサーを活性化する。これにより、ＳＴＡＴ活性化の質と量が調節される。ＳＯＣＳ３はＩＬ－１０によって誘導され、各種サイトカイン遺伝子に対して負の制御効果をもたらす。

【0055】

ＩＬ－１０は、その多面発現活性の結果、広範な疾患、障害、及び状態と関連があり、その中には炎症状態、免疫関連障害、線維性障害、及び癌が含まれる。ＩＬ－１０関連疾患、障害及び状態の有病率と重症度の観点から、新規ＩＬ－１０薬剤及びその改変物は、ＩＬ－１０関連疾患、障害、及び状態の治療及び予防において、極めて大きな価値を持つと考えられる。

【0056】

ＩＬ－１０受容体シグナリング複合体は、アルファ及びベータサブユニットからなり、これらはそれぞれ、ＩＬ－１０Ｒ１及びＩＬ－１０Ｒ２、又は、ＩＬ－１０Ｒα及びＩＬ－１０Ｒβとも呼ばれる。受容体の活性化には、アルファ及びベータの両者への結合が必要である。より詳細に以下に記載するように、構造に基づいたアプローチを用いて、多面発現性などのＩＬ－１０の作用を、ＩＬ－１０受容体シグナリング複合体の３．５Åクライオ電子顕微鏡構造を決定することによって解析した。本明細書に記載する放射状（例えば星形）六量体構造は、どのようにＩＬ－１０とＩＬ－１０Ｒαとが複合表面を形成し、共有する受容体サブユニットＩＬ－１０Ｒβを結合するかを示すものであり、それによってＩＬ－１０部分アゴニストの設計が可能になる。より詳細に以下に記載するように、広範なＩＬ－１０Ｒβ結合親和性（例えば強度）を有する、一連の設計されたＩＬ－１０バリアントの特徴を明らかにすることにより、ＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性が細胞型によってどのように異なるかを明らかにし、シグナル伝達及び遺伝子発現応答の閾値に免疫細胞集団間でかなりの違いがあることを発見した。これは、ＩＬ－１０細胞型選択性を操作する手段を提供することにつながる。いくつかのバリアントは骨髄偏向性の活性を示し、炎症性ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の機能を刺激することなく単球及びマクロファージの活性化を抑制し、それによって、ＩＬ－１０の主要な対立する機能を切り離すことが分かった。これらの結果は、ＩＬ－１０の多面発現性のメカニズムに対する知見を提供し、また、ＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性をどのようにＩＬ－１０の機能の調整のために利用しうるかということを示すと同時に、ＩＬ－１０の多面発現作用の調整のための構造的及び機構的な青写真を提供するものである。

【0057】

ＩＬ－１０又はＩＬ－１０ポリペプチドという語は、それが天然のものであるか組換えのものであるかに関わらず野生型ＩＬ－１０のことを指し、そのホモログ、オルソログ、バリアント、及び断片、並びに、例えばリーダー配列（シグナルペプチドなど）などを有するＩＬ－１０ポリペプチドも包含する。したがって、限定されるものではないが、ＩＬ－１０ポリペプチドには、組換えによって製造されたＩＬ－１０ポリペプチド、合成によって製造されたＩＬ－１０ポリペプチド、及び細胞又は組織から抽出されたＩＬ－１０－ポリペプチドが含まれる。本開示のＩＬ－１０ポリペプチドの非限定的な例として、成熟ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列を配列番号１に示す。他の哺乳類の種由来のＩＬ－１０ホモログ及びその改変型の例としては、ラット（アクセッション番号ＮＰ＿０３６９８６．２；ＧＩ １４８７４７３８２）、ウシ（アクセッション番号ＮＰ＿７７６５１３．１；ＧＩ ４１３８６７７２）、ヒツジ（アクセッション番号ＮＰ＿ＯＯ １００９３２７．１；ＧＩ ５７１６４３４７）、イヌ（アクセッション番号ＡＢＹ８６６１９．１；ＧＩ １６６２４４５９８）、及びウサギ（アクセッション番号ＡＡＣ２３８３９．１；ＧＩ ３２４２８９６）由来のＩＬ－１０ポリペプチドが挙げられる。本明細書に記載のアミノ酸置換の導入に適したＩＬ－１０ポリペプチドのさらなる例としては、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、リンホクリプトウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）、マカウイルス（Ｍａｃａｖｉｒｕｓ）、ペルカウイルス（Ｐｅｒｃａｖｉｒｕｓ）、パラポウイルス（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ）、カプリポックスウイルス（Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、及びアビポックスウイルス（Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）の各属に由来するＩＬ－１０ポリペプチドなどの、ウイルスにコードされたＩＬ－１０ホモログが挙げられる。サイトメガロウイルスＩＬ－１０ポリペプチドの非限定的な例としては、ヒトサイトメガロウイルス（アクセッション番号ＡＡＲ３１６５６及びＡＣＲ４９２１７）、ミドリザルサイトメガロウイルス（アクセッション番号ＡＥＶ８０４５９）、アカゲザルサイトメガロウイルス（ＡＡＦ５９９０７）、ヒヒサイトメガロウイルス（アクセッション番号ＡＡＦ６３４３６）、ヨザルサイトメガロウイルス（アクセッション番号ＡＥＶ８０８００）、及びリスザルサイトメガロウイルス（アクセッション番号ＡＥＶ８０９５５）に由来するものが挙げられる。リンホクリプトウイルスＩＬ－１０ポリペプチドの例としては、エプスタイン－バーウイルス（アクセッション番号ＣＡＤ５３３８５）、ボノボヘルペスウイルス（アクセッション番号ＸＰ＿００３８０４２０６．１）、アカゲザルリンホクリプトウイルス（アクセッション番号ＡＡＫ９５４１２）、及びヒヒリンホクリプトウイルス（アクセッション番号ＡＡＦ２３９４９）に由来するものが挙げられる。ウイルスＩＬ－１０ポリペプチド、及びそれらの宿主免疫機能の制御に関するさらなる情報については、例えばSlobedman B. et al., J. Virol. Oct. 2009, p. 9618-9629；及びOuyang P. et al., J. Gen. Virol. (2014), 95, 245-262を参照することができる。

【0058】

野生型ヒトＩＬ－１０前駆体ポリペプチド（例としてシグナルペプチドを有するプレタンパク質）のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。これは１７８アミノ酸残基のタンパク質であり、Ｎ末端の１８アミノ酸のシグナルペプチドが除去されることにより配列番号１の１６０アミノ酸の成熟タンパク質を生成することができる。しかし、成熟タンパク質が組換えポリペプチドコンストラクトを生成するために用いられることが多い。したがって、本開示の目的において、全てのアミノ酸番号は配列番号１に記載のＩＬ－１０タンパク質の成熟ポリペプチド配列に基づく。

【0059】

炎症は、感染から生物を保護し、組織の恒常性を促進するために不可欠である。しかし、免疫細胞の活性化が過剰になると、バイスタンダー組織（bystander tissues）に損傷を与え、結果として臓器不全、慢性炎症、及び自己免疫疾患を引き起こす。ＩＬ－１０は、炎症反応の制御や停止に中心的な役割を担う重要な抗炎症性サイトカインである。いくつかの例において、ＩＬ－１０は自己免疫疾患、癌、及び慢性感染症において調節不全となっている。炎症中には各種免疫細胞がＩＬ－１０を産生する。これにより、主に、活性化された骨髄性細胞によるサイトカイン産生及び抗原提示が阻害されることで、強力な抗炎症効果が発揮される。この役割と一致して、ＩＬ－１０又はＩＬ－１０受容体のいずれかの遺伝子の喪失は、マウス及びヒトの両者において、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの深刻な炎症及び自己免疫疾患を引き起こす。さらに、ＩＬ－１０機能の調節不全は癌及び慢性炎症とも関連している。

【0060】

これらの重要な抗炎症機能にも関わらず、ＩＬ－１０は高度に多面発現的でもあり、多様な、一見して互いに正反対に見える生物学的効果を引き起こす。特に注目すべきことに、ＩＬ－１０はＴＣＲ刺激ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性も増強し、炎症誘発性サイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、及びグランザイムＢなどの細胞溶解因子の産生を強化する。実際、ヒトの臨床試験においては、外因性ＩＬ－１０の投与によって血清ＩＦＮ－γ濃度が上昇し、おそらくＩＬ－１０の抗炎症効果を弱めたであろうことが示されている。

【0061】

ＩＬ－１０は分泌型ホモダイマーとして機能し、高親和性の固有受容体サブユニットＩＬ－１０Ｒαと、低親和性の共有受容体サブユニットＩＬ－１０Ｒβとからなるヘテロダイマー受容体複合体を２コピー結合することにより、受容細胞においてシグナル伝達を開始させる。ＩＬ－１０はＩＬ－１０ＲαとＩＬ－１０Ｒβとの二量体化を促進し、結果として転写因子ＳＴＡＴ３（シグナル伝達兼転写活性化因子３）の、そしてＳＴＡＴ１に対してもある程度、リン酸化及び活性化を引き起こし、これによってＩＬ－１０の多様な機能的な効果が媒介される。

【0062】

下流シグナル応答を切り離す、機能的に選択的な、すなわち「偏向性の」アゴニストが、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）に対して広く特徴づけられている。最近の研究では、このようなアゴニストがサイトカイン受容体についてもありうることが示唆されている。しかし、これらのアプローチは大規模な構造情報に基づいており、そういった情報は現時点でＩＬ－１０受容体複合体には無い。ＩＬ－１０Ｒβを含む完全なＩＬ－１０受容体シグナリング複合体の構造情報があれば、設計されたバリアントを用いてこれを軸に分析を行うことができるが、その情報は欠如している。この構造情報の欠如は、ＩＬ－１０が、その共有受容体サブユニットＩＬ－１０Ｒβに対して極めて親和性が低く、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体の集合が妨げられることに主に起因している。

【0063】

以下の実施例に記載のように、指向性進化法（directed evolution approach）を用いて、ＩＬ－１０Ｒβに対する増強された親和性を有するＩＬ－１０バリアントを作出し、これによって、六量体のＩＬ－１０／ＩＬ１０Ｒ１／ＩＬ－１０Ｒβ複合体のクライオ電子顕微鏡構造を３．５Åの解像度で解明することが可能になった。ＩＬ－１０における、ＩＬ－１０Ｒβ界面を標的とした、構造に基づく変異（structure-guided mutations）の結果、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞型選択的シグナル応答を引き起こす偏向性ＩＬ－１０バリアントが得られた。特に、ＩＬ－１０バリアント１０－ＤＥは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞におけるＩＬ－１０シグナル伝達を低下させ、その一方で、単球及びマクロファージにおけるＩＬ－１０シグナル伝達を実質的に保持し、それによってｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－１０の免疫抑制機能と免疫賦活機能とを切り離すことができる。

【0064】

サイトカイン類は宿主免疫応答の制御及び組織恒常性の促進における重要な役割を多数担っている。しかし同時に、それらの治療薬としての使用を限定しうる、多面発現的な、又は逆の効果も発揮することが多い。結果として、サイトカイン及びサイトカイン受容体アンタゴニストは臨床的に大きな成功を納めたのに対し、サイトカイン受容体アゴニストについてはこのような例は極めて少ない。サイトカインＩＬ－１０は、組織及び疾患の状況によって有益な機能と有害な機能との両者を発揮しうるサイトカインの良い例である。より詳細に以下に記載するように、構造に基づくアプローチを用いて、ＩＬ－１０の機能的に選択的なバリアントが開発さた。このバリアントはＩＬ－１０の免疫抑制機能と免疫賦活機能とを効果的に切り離し、ＩＬ－１０がどのようにこれらの異なった機能を発揮するのかについて新たな知見を明らかにするとともに、サイトカインをベースとする改善された治療薬の開発のための道筋を示した。

【0065】

以前のＩＬ－１０受容体複合体の構造的特徴づけを阻んでいた主な障壁は、サブユニット間、特にＩＬ－１０とＩＬ－１０Ｒβとの間の、極めて低い親和性相互作用の存在であった。この障壁は、リガンドエンジニアリング法を用いて三元受容体複合体へのアクセスが可能になったことで克服された。

【0066】

より詳細に以下に記載するように、ＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒβ結合部位の分析により、細胞型偏向性アゴニスト作用をもたらすアミノ酸置換をＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβ結合界面に有する一連のＩＬ－１０バリアントの生成が可能になった。偏向活性を有する改変サイトカイン受容体リガンドは、以前の例では受容体のトポロジーの改変に依存していたが、以下に示す実験結果によれば、偏向性アゴニスト作用を生成するためには、天然サイトカインの、その受容体に対する親和性の調節を行うだけでも充分でありうることが示唆された。

【0067】

いずれの特定の理論にも拘束されるものではないが、本明細書に記載する実験データは、ＩＬ－１０Ｒβに対する親和性とＩＬ－１０Ｒβの発現量との組み合わせが、任意の細胞上でＩＬ－１０によって誘導されるシグナル伝達の種類を決定するというモデルを支持している。ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３に対して、異なる免疫細胞集団において異なる活性化を行うことにより、本明細書に記載する改変ＩＬ－１０バリアントは、Ｔ細胞の機能を刺激することなく単球及びマクロファージの活性化を抑制する能力を保持し、それによってＩＬ－１０の免疫抑制機能と免疫賦活機能とを切り離す。

【0068】

ＩＬ－１０による受容体結合の構造的基盤は、ＩＬ－１０のシグナル伝達の可塑性及び機能的多面発現性のメカニズムに関する重要な知見を提供する。特に注目すべきことに、この構造は、詳細な分子的観点から、ＩＬ－１０がその共有の低親和性受容体サブユニットＩＬ－１０Ｒβとどのように相互作用するかについて示し、この界面を撹乱する変異を構造に基づいて設計することを可能にする。これらの改変ＩＬ－１０アゴニストの分析により、（ｉ）ＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性は細胞型によって異なること；（ｉｉ）ＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβに対する親和性を調節することにより、これらの相違を利用することができ、その結果、細胞型特異性の改変が可能なこと；及び、（ｉｉｉ）これらの細胞型偏向性アゴニストによって、ＩＬ－１０機能の重要な特徴を切り離すことが可能であること；が明らかになった。本開示の一態様において、免疫細胞集団間でＩＬ－１０Ｒβ発現が異なっていることは、さもなくば多面発現的であるＩＬ－１０媒介応答に機能的な特異性を提供するための天然のメカニズムを意味している可能性があり、この特徴は本明細書に示すように改変アゴニストを用いて利用することが可能である。部分アゴニスト１０－ＤＥがＣＤ８＋ Ｔ細胞を刺激することなく炎症性マクロファージ活性化を抑制できる能力は、自己免疫及び炎症性疾患などの関連のある健康状態の治療において、ＩＬ－１０受容体を標的とすることに重要な意味があることを示している。

【0069】

本開示の組成物
より詳細に以下に記載するように、本開示の一態様は、ＩＬ－１０受容体の下流のＳＴＡＴ３シグナル伝達を調節するように改変された新規ＩＬ－１０ポリペプチドバリアントに関する。また、（ｉ）このようなＩＬ－１０ポリペプチドバリアントをコードする組換え核酸；及び、（ｉｉ）ＩＬ－１０ポリペプチドバリアントを発現するように改変された組換え細胞；も、本明細書に開示のように提供される。

【0070】

Ａ． 組換えＩＬ－１０ポリペプチド
概要を上で述べたように、本開示のいくつかの実施形態は、ＩＬ－１０受容体の下流のＳＴＡＴ３シグナル伝達を調節するように改変された、例えば、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞機能を刺激することなく単球及びマクロファージの活性化／サイトカイン産生を強力に抑制することによって、ヒトＰＢＭＣにおいて強力な単球偏向性シグナル伝達効果を示すことが可能な、新たな種類のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントに関する。これらのＩＬ－１０バリアントは、したがって、ＩＬ－１０の多面発現性を克服し、改善された治療能力を有する。他のいくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントは、ＩＬ－１０受容体の下流の細胞型偏向性ＳＴＡＴ３シグナル伝達をもたらす。

【0071】

一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、（ａ）配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸配列を有するインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；を含み、さらに、（ｂ）配列番号１又は配列番号１６の配列における１つ又は複数のアミノ酸置換；を含む、組換えポリペプチドに関する。

【0072】

本明細書に開示される組換えポリペプチドの限定されない好ましい実施形態は、次の特徴のうちの１つ又は複数を含みうる。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６の配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６の配列に対して、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0073】

いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６の配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２５、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ３２、Ｘ７４、Ｘ９０、Ｘ９２、Ｘ９３、Ｘ９６、Ｘ１００、及びＸ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６の配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２５、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ７４、Ｘ９０、Ｘ９２、Ｘ９６、Ｘ１００、及びＸ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、（ａ）配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；を含み、（ｂ）配列番号１又は配列番号１６のＸ２５及びＸ９６からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位における１つ又は複数のアミノ酸置換；を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、（ａ）配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び、（ｂ）配列番号１又は配列番号１６の部位Ｘ２５におけるアミノ酸置換；を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、（ａ）配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び、（ｂ）配列番号１又は配列番号１６の部位Ｘ９６におけるアミノ酸置換；を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２１、Ｘ２２、Ｘ３２、及びＸ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を含む。この態様によるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントの例においては、配列番号１又は配列番号１６の配列中に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれよりも多いアミノ酸の置換を含みうる。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２５、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ７４、Ｘ９０、Ｘ９２、Ｘ９６、Ｘ１００、及びＸ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸置換を含む。

【0074】

いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２１、Ｘ２２、Ｘ３２、及びＸ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、１つ又は複数の追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２１からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、１つの追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２２からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、１つの追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１のＸ３２からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、１つの追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、１つの追加のアミノ酸置換を含む。

【0075】

いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１又は配列番号１６の、Ｘ２５、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ３２、Ｘ７４、Ｘ９０、Ｘ９２、Ｘ９３、Ｘ９６、Ｘ１００、及びＸ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位のものである。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、さらに、配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸残基Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ３２、及びＸ９３に対応する部位におけるアミノ酸置換の組み合わせを含む。

【0076】

本開示によると、ＩＬ－１０ポリペプチドにおけるこのような置換は、いずれも、ＩＬ－１０Ｒβ及び／又はＩＬ－１０αに対する結合親和性が、これらの置換の無い親ＩＬ－１０ポリペプチドの結合親和性と比較して改変されたＩＬ－１０バリアントを生ずる。例えば、本明細書に開示されるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントは、ＩＬ－１０Ｒα及び／又はＩＬ－１０Ｒβに対して増加した親和性又は低下した親和性を有しうるか、あるいは、これら受容体に対して、対応する野生型ＩＬ－１０と同じ又は類似の親和性を有しうる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントは、ＩＬ－１０の他の部位に、保存的改変及び置換（例えば、ＩＬ－１０バリアントの二次構造又は三次構造に対して、ごくわずかな効果を有するもの）を含んでいてよい。このような保存的置換としては、The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978)においてDayhoffによって記載されたものと、EMBO J, 8:779-785 (1989)においてArgosによって記載されたものが挙げられる。例えば、次の群のうちの１つに属するアミノ酸は保存的な変化を示す：グループＩ：Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；グループＩＩ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；グループＩＩＩ：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；グループＩＶ：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；グループＶ：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び、グループＶＩ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ。

【0077】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１０ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、アラニン置換、アルギニン置換、アスパラギン酸置換、ヒスチジン置換、グルタミン酸置換、リジン置換、セリン置換、トリプトファン置換、及びそのいずれかの組み合わせ、からなる群より独立に選択される。本明細書に開示される組換えＩＬ－１０ポリペプチドにおけるアミノ酸置換の限定されない例を、以下の表１に提供する。

【表1】

【0078】

したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載するＩＬ－１０部分アゴニストポリペプチドは、ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴ（Ｈ／Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｖ）ＦＰＧ（Ｎ／Ｆ／Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｖ／Ｓ／Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｈ）ＬＰ（Ｎ／Ａ／Ｒ／Ｑ／Ｈ／ＫＳＶＩＬ／Ｍ／Ｔ）（Ｍ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ）Ｌ（Ｒ／Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ａ／Ｓ／Ｔ）（Ｄ／Ａ／Ｎ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｖ）ＬＲ（Ｄ／Ａ／Ｅ／Ｌ／Ｖ／Ｓ／Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｈ／Ｋ／Ｒ）ＡＦＳ（Ｒ／Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｖ／Ｓ／Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｈ）ＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬ（Ｅ／Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ／Ｓ／Ｔ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｈ／Ｋ／Ｒ）ＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡ（Ｈ／Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｖ）Ｖ（Ｎ／Ｑ／Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｔ／Ａ）（Ｓ／Ｅ／Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｖ）ＬＧ（Ｅ／Ａ／Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｈ／Ｋ／Ｓ）ＮＬＫ（Ｔ／Ｖ／Ｅ／Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｑ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｋ／Ｍ／Ｓ）ＬＲＬ（Ｒ／Ａ／Ｗ／Ｙ／Ｆ／Ｈ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ）ＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号３２）を含んでいてよく、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、又はそれよりも多い個数）の可変部位については、配列番号１の対応する部位にある野生型アミノ酸ではない。各部位における選択肢を括弧内に示す。

【0079】

いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６の配列に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｍ２２、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｒ３２、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｓ９３、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１又は配列番号１６の、Ｄ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位のものである。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１又は配列番号１６の、Ｄ２５及びＥ９６からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位のものである。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１又は配列番号１６の、Ｄ２５の部位のものである。いくつかの実施形態において、配列番号１又は配列番号１６の部位Ｄ２５のアミノ酸置換は、Ｄ２５Ａ置換である。いくつかの実施形態において、配列番号１又は配列番号１６の部位Ｄ２５のアミノ酸置換は、Ｄ２５Ｋ置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１又は配列番号１６の、Ｅ９６の部位のものである。いくつかの実施形態において、配列番号１又は配列番号１６の部位Ｅ９６のアミノ酸置換は、Ｅ９６Ａ置換である。いくつかの実施形態において、配列番号１又は配列番号１６の部位Ｅ９６のアミノ酸置換は、Ｅ９６Ｋ置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１又は配列番号１６のＮ２１、Ｍ２２、Ｒ３２、及びＳ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位のものである。

【0080】

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ又はＤ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ１２Ａ又はＤ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；及び、（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ又はＤ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。

【0082】

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び（ｂ）Ｎ２１Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；及び（ｂ）Ｎ２１Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗと；（ｂ）Ｄ２５Ａ、Ｄ２５Ｋ、及びＤ２５Ａ／Ｅ９６Ａからなる群より選択される１つ又は複数の変異と；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａと；（ｂ）Ｄ２５Ａ、Ｄ２５Ｋ、及びＤ２５Ａ／Ｅ９６Ａからなる群より選択される１つ又は複数の変異と；に対応するアミノ酸置換を含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び、（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；及び、（ｂ）Ｎ２１Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗと；（ｂ）Ｄ２５Ａ、Ｄ２５Ｋ、及びＤ２５Ａ／Ｅ９６Ａからなる群より選択される１つ又は複数の変異と；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；及び、（ｂ）Ｎ２１Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａと；（ｂ）Ｄ２５Ａ、Ｄ２５Ｋ、及びＤ２５Ａ／Ｅ９６Ａからなる群より選択される１つ又は複数の変異と；に対応するアミノ酸置換を含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｄ２５Ａ；（ｂ）Ｄ２５Ｋ；（ｃ）Ｅ９６Ａ；（ｄ）Ｅ９６Ｋ；（ｅ）Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；（ｆ）Ｎ２１Ａ／Ｒ１０４Ａ；（ｇ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ；（ｈ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；及び（ｉ）Ｎ２１Ａ／Ｍ２２Ａ／Ｄ２５Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｄ２５Ａ；（ｂ）Ｄ２５Ｋ；（ｃ）Ｅ９６Ａ；（ｄ）Ｅ９６Ｋ；（ｅ）Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；（ｆ）Ｎ２１Ａ／Ｒ１０４Ａ；（ｇ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ；（ｈ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；及び（ｉ）Ｎ２１Ａ／Ｍ２２Ａ／Ｄ２５Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｄ２５Ａ；（ｂ）Ｄ２５Ｋ；（ｃ）Ｅ９６Ａ；（ｄ）Ｅ９６Ｋ；（ｅ）Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；（ｆ）Ｎ２１Ａ／Ｒ１０４Ａ；（ｇ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ；（ｈ）Ｎ２１Ａ／Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ；及び（ｉ）Ｎ２１Ａ／Ｍ２２Ａ／Ｄ２５Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６の配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｍ２２、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｒ３２、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｓ９３、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６の配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｍ２２、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｒ３２、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｓ９３、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｍ２２、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｒ３２、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｓ９３、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸置換を含む。

【0086】

いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６の配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｍ２２、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｒ３２、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｓ９３、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１６の配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｍ２２、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｒ３２、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｓ９３、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｍ２２、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｒ３２、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｓ９３、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＮ２１、Ｍ２２、Ｒ３２、及びＳ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列に１つ又は複数の（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の）ミスセンス突然変異（例えば、保存的置換）、ナンセンス変異、欠失、又は挿入などの変異を有するものを含みうる。本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号２～１５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0088】

いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１０ポリペプチドの配列におけるアミノ酸置換は、ＩＬ－１０Ｒβに対する組換えＩＬ－１０ポリペプチドの結合親和性の調節をもたらす。ＩＬ－１０ポリペプチドの結合活性との関連において、「調節」という語は、ＩＬ－１０Ｒβに対するポリペプチドの結合親和性の変化のことを指す。調節には、増加（例えば、誘導や刺激）及び減少（例えば、低下や阻害）、あるいは、ポリペプチドの結合親和性に対するそれ以外の影響、が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１０ポリペプチドの配列におけるアミノ酸置換は、組換えＩＬ－１０ポリペプチドのＩＬ－１０Ｒβ結合親和性を、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドと比べて低下させる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、組換えＩＬ－１０ポリペプチドのＩＬ－１０Ｒβ結合親和性を、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドと比べて増加させる。

【0089】

本明細書に記載のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントを含め、本開示の組換えポリペプチドの結合活性は、当該分野において公知の任意の適した方法によって測定することができる。例えば、本明細書に開示されるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントとその受容体（例えば、ＩＬ－１０Ｒα及び／又はＩＬ－１０Ｒβ）の結合活性は、スキャッチャード分析（Munsen et al. Analyt. Biochem. 107:220-239, 1980）によって測定できる。特異的な結合も、競合ＥＬＩＳＡ、Biacore（登録商標）アッセイ、及び／又はKinExA（登録商標）アッセイを含むがそれらに限定されない、当該分野で公知の技術を用いて測定することができる。標的タンパク質に優先的に結合する、又は特異的に結合するポリペプチドは、当該分野でよく理解されている概念であり、このような特異的又は優先的結合を測定するための方法も当該分野で公知である。

【0090】

各種アッセイ様式を用いて、目的のリガンド（例えば、ＩＬ－１０Ｒα及び／又はＩＬ－１０Ｒβ）と特異的に結合する組換えＩＬ－１０ポリペプチドを選択することができる。例えば、同族リガンド（cognate ligand）又は結合パートナーと特異的に結合する受容体又はそのリガンド結合部位に対して特異的に反応するポリペプチドを同定するのに用いることができる数多くの測定法の中には、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法、免疫沈降法、Biacore（商標）（GE Healthcare, Piscataway, NJ）、KinExA、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Octet（商標）（ForteBio, Inc., Menlo Park, CA）、及びウェスタンブロット分析が含まれる。一般に、特異的又は選択的結合反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍であり、より典型的にはバックグラウンドの１０倍超、バックグラウンドの２０倍超、さらに典型的にはバックグラウンドの５０倍超、バックグラウンドの７５倍超、バックグラウンドの１００倍超、さらに典型的にはバックグラウンドの５００倍超、さらに典型的にはバックグラウンドの１０００倍超、さらに典型的にはバックグラウンドの１０，０００倍超であってよい。

【0091】

当業者は、結合親和性を、２つの分子、例えばＩＬ－１０ポリペプチドとＩＬ－１０Ｒβ受容体との間の、非共有相互作用の強さの尺度としても用いることができることを理解するであろう。いくつかの例においては、結合親和性を用いて１価の相互作用（固有活性）が記述される。２個の分子の間の結合親和性は、解離定数（Ｋ_Ｄ）を求めることで定量できる。そして、Ｋ_Ｄは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（Biacore）を利用して、複合体の形成及び解離の速度を測定することによって求めることができる。１価複合体の会合及び解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋ_ａ（又はｋ_ｏｎ）及び解離速度定数ｋ_ｄ（又はｋ_ｏｆｆ）と呼ばれる。Ｋ_Ｄは、式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａによってｋ_ａ及びｋ_ｄと関連している。解離定数の値は、周知の方法によって直接求めることができ、複合体混合物に対しても、Caceci et al.（Byte 9:340-362, 1984）に記載の方法などによって計算することができる。例えば、Ｋ_Ｄは、Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5428- 5432)に開示されているような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを利用して定めることができる。標的受容体に対する本開示のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントの結合能を評価するための他の標準的なアッセイが当該分野において公知であり、その例として、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、フローサイトメトリー分析、及び、実施例に例示されている他のアッセイが挙げられる。ＩＬ－１０ポリペプチドバリアントの結合速度と結合親和性は、当該分野で公知の標準的なアッセイ、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などにより、例えばBiacore（商標）システム又はKinExAなどを用いて、評価することもできる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０Ｒα及び／又はＩＬ－１０Ｒβに対する本開示のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントの結合親和性は、固相受容体結合アッセイ（Matrosovich MN et al., Methods Mol Biol. 865:71-94, 2012）によって求められる。いくつかの実施形態においては、ＩＬ－１０Ｒα及び／又はＩＬ－１０Ｒβに対する本開示のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって求められる。

【0092】

いくつかの実施形態においては、本明細書に開示される組換えＩＬ－１０ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換の結果、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドとの比較において、細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達がもたらされる。より詳細に以下に記載するように、本開示のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントの一例である１０－ＤＥは、ヒトＰＢＭＣにおいて単球偏向性シグナル伝達を示す一方で、バルクＰＢＭＣにおける炎症性サイトカイン産生を抑制し、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞型偏向性シグナル応答をもたらす。１０－ＤＥバリアントはまた、ＬＰＳ刺激単球上での表面ＭＨＣクラスＩＩの発現を、強力に下方制御することが分かった（例えば以下の実施例６及び図４を参照のこと）。重要なことに、１０－ＤＥバリアントはまた、単離された単球由来マクロファージにおいて、自己免疫及び自己炎症性疾患におけるＩＬ－１０のキーターゲットである、ＬＰＳ誘導ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及びＩＬ－８産生を完全に抑制した（図４Ｅ）。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１０ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＬ－１０シグナル伝達を低下させる一方で、単球及びマクロファージにおけるＩＬ－１０シグナル伝達を実質的に保持する、細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達をもたらす。

【0093】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換の結果、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドとの比較において、例えばＳＴＡＴ３のリン酸化によって判断される、細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達がもたらされる。いくつかの実施形態において、偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞などの１つ又は複数の細胞型におけるＳＴＡＴ３のリン酸化が、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドと比べて少なくとも１０％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％低下することを含む。いくつかの実施形態において、投与組成物は、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性を増強しない。いくつかの実施形態において、投与組成物は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生及び／又はグランザイムＢ産生を増強しない。

【0094】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、１つ又は複数の細胞型において、１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の低下をもたらす。アッセイに適したＳＴＡＴ３媒介機能は特に限定されない。適したＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の非限定的な例としては、サイトカイン産生、ケモカイン産生、及び免疫細胞動員が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞において、約２０％～約１００％低下する。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３シグナル伝達は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナリングアッセイ、及び酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）からなる群より選択されるアッセイにより測定される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の低下をもたらし、これは、ポリペプチドが炎症誘発性遺伝子の発現及び／又はＭＨＣクラスＩＩの発現を誘導する能力に基づき判断される。炎症誘発性遺伝子の非限定的な例として、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、グランザイムＡ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＭＩＰ１αが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能は、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０と比較して、約２０％～約１００％、例えば、約２０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約４０％～約８０％、約３０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、又は約３０％～約１００％低下する。

【0095】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及びＮＫ細胞から選択される細胞型におけるＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能を低下させる一方で、単球及び／又はマクロファージにおけるそのＳＴＡＴ３媒介機能を実質的に保持する。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３シグナル伝達は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナリングアッセイ、及び酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）からなる群より選択されるアッセイにより測定される。

【0096】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、基準ＩＬ－１０ポリペプチド（例えば野生型ＩＬ－１０）の結合親和性と比べ、ＩＬ－１０Ｒβに対する増加した親和性をもたらす。より詳細に以下に記載するように、このようなＩＬ－１０ポリペプチドバリアント（例えば「スーパー１０」バリアント）の、ＩＬ－１０Ｒβに対する増加した結合親和性は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＩＮＦγ発現の刺激を引き起こす。いずれの特定の理論にも拘束されるものではないが、増加した結合親和性を有するこのようなＩＬ－１０バリアントは、関連のある増殖性疾患、例えば癌などの治療方法において有用でありうる。

【0097】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＩＬ－１０ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、基準ＩＬ－１０ポリペプチド（例えば野生型ＩＬ－１０）の結合親和性と比べ、ＩＬ－１０Ｒβに対する低下した親和性をもたらす。より詳細に以下に記載するように、このようなＩＬ－１０ポリペプチドバリアント（例えば部分アゴニスト１０－ＤＥ）の、ＩＬ－１０Ｒβに対する低下した結合親和性は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を刺激する能力の低下、及び／又は、炎症性マクロファージの抑制をもたらす一方で、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を刺激しない。いずれの特定の理論にも拘束されるものではないが、低下した結合親和性を有するこのようなＩＬ－１０バリアントは、関連のある健康状態、例えば自己免疫及び炎症性疾患などの方法において有用でありうる。

【0098】

Ｂ． 核酸
一態様において、本開示の組換えＩＬ－１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む各種核酸分子が本明細書において提供され、その例として、組換えＩＬ－１０ポリペプチドの発現をｉｎ ｖｉｖｏで宿主細胞内において、又はｅｘ ｖｉｖｏ無細胞発現系において可能にする制御配列などの異種核酸配列に作動可能に連結したこれらの核酸分子を含む、発現カセットや発現ベクターが挙げられる。

【0099】

「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という語は、本明細書において互換的に用いられ、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の両者のことを指し、例として、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は、核酸類似体を含んだＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、を含む核酸分子などが挙げられる。核酸分子は二本鎖又は一本鎖（センス鎖又はアンチセンス鎖など）であってよい。核酸分子は、通常とは異なる、又は修飾されたヌクレオチドを含んでいてよい。本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という語は、互換的に、ポリヌクレオチド分子の配列のことを指す。本明細書に開示されるポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）、付表２、表１～６を参照により援用している、３７ ＣＦＲ §１．８２に記載のヌクレオチド塩基とアミノ酸に対する標準的な略号を用いて示されている。

【0100】

本開示の核酸分子は任意の長さの核酸分子であってよく、例として、一般的に、約０．５Ｋｂ～約２０Ｋｂの間、例えば約０．５Ｋｂ～約２０Ｋｂの間、約１Ｋｂ～約１５Ｋｂの間、約２Ｋｂ～約１０Ｋｂの間、又は、約５Ｋｂ～約２５Ｋｂの間、例えば約１０Ｋｂ～１５Ｋｂの間、約１５Ｋｂ～約２０Ｋｂの間、約５Ｋｂ～約２０Ｋｂの間、約５Ｋｂ～約１０Ｋｂの間、又は約１０Ｋｂ～約２５Ｋｂの間の核酸分子が挙げられる。

【0101】

本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、本明細書に開示される組換えポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、（ａ）配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸配列を有するＩＬ－１０ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；を含み、さらに、（ｂ）配列番号１又は配列番号１６のＸ２５、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ３２、Ｘ７４、Ｘ９０、Ｘ９２、Ｘ９３、Ｘ９６、Ｘ１００、及びＸ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位の、１つ又は複数のアミノ酸置換；を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、（ａ）配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸配列を有するＩＬ－１０ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；を含み、さらに、（ｂ）配列番号１又は配列番号１６のＸ２５、Ｘ１４、Ｘ１８、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ７４、Ｘ９０、Ｘ９２、Ｘ９６、Ｘ１００、及びＸ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位の、１つ又は複数のアミノ酸置換；を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＸ２１、Ｘ２２、Ｘ３２、及びＸ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｎ２１、Ｍ２２、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｒ３２、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｓ９３、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＤ２５、Ｈ１４、Ｎ１８、Ｒ２４、Ｄ２８、Ｅ７４、Ｈ９０、Ｎ９２、Ｅ９６、Ｔ１００、及びＲ１０４からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１又は配列番号１６のＮ２１、Ｍ２２、Ｒ３２、及びＳ９３からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する部位に、１つ又は複数の追加のアミノ酸置換を含む。

【0102】

いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ又はＤ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ１２Ａ又はＤ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａ；及び、（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ又はＤ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ又はＲ１０４Ａに対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0103】

いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び（ｂ）Ｎ２１Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；及び（ｂ）Ｎ２１Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗと；（ｂ）Ｄ２５Ａ、Ｄ２５Ｋ、及びＤ２５Ａ／Ｅ９６Ａからなる群より選択される１つ又は複数の変異と；に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａと；（ｂ）Ｄ２５Ａ、Ｄ２５Ｋ、及びＤ２５Ａ／Ｅ９６Ａからなる群より選択される１つ又は複数の変異と；に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ａ；に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに次のアミノ酸置換：（ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｂ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｃ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｅ９６Ｈ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；（ｄ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；（ｅ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ｋ／Ｎ９２Ｑ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；及び（ｆ）Ｎ１８Ｙ／Ｄ２５Ａ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ａ／Ｔ１００Ｄ／Ｒ１０４Ｗ；に対応するアミノ酸置換を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、アミノ酸置換：ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗ；及び（ｂ）Ｎ２１Ａ；を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、アミノ酸置換：ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ｗと；（ｂ）Ｄ２５Ａ、Ｄ２５Ｋ、及びＤ２５Ａ／Ｅ９６Ａからなる群より選択される１つ又は複数の変異と；を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、アミノ酸置換：ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａ；及び（ｂ）Ｎ２１Ａ；を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号１又は配列番号１６に対して１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに、アミノ酸置換：ａ）Ｎ１８Ｙ／Ｎ２１Ｈ／Ｎ９２Ｑ／Ｅ９６Ｄ／Ｔ１００Ｖ／Ｒ１０４Ａと；（ｂ）Ｄ２５Ａ、Ｄ２５Ｋ、及びＤ２５Ａ／Ｅ９６Ａからなる群より選択される１つ又は複数の変異と；を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0105】

本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号２～１５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号２又は配列番号１７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号３又は配列番号１８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号４又は配列番号１９のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号５又は配列番号２０のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号６又は配列番号２１のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号７又は配列番号２２のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。

【0106】

いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、配列番号８又は配列番号２３のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号９又は配列番号２４のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１０又は配列番号２５のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１１又は配列番号２６のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１２又は配列番号２７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１３又は配列番号２８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１４又は配列番号２９のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１５又は配列番号３０のアミノ酸配列に対して、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。

【0107】

配列番号１～１５に対する、対応する前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列表の配列番号１６～３０に提供する。

【0108】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、発現カセット又は発現ベクターに組み込まれている。発現カセットは、コード配列と、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏで受容細胞においてコード配列の適切な転写及び／又は翻訳を指示するのに充分な制御情報と、を含む遺伝物質の構築物を一般的に含むと理解される。一般に、発現カセットは、所望の宿主細胞及び／又は個体を標的とするベクターに挿入されてよい。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の発現カセットは、プロモーターなどの発現制御エレメントに作動可能に連結した、本明細書に開示される組換えポリペプチドのコード配列と、任意に、コード配列の転写又は翻訳に影響する他の核酸配列のいずれか又は組み合わせと、を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は発現ベクターに組み込まれている。「ベクター」という語は一般に、宿主細胞間の運搬のために設計された組換えポリヌクレオチド構築物のことを指し、宿主細胞への異種ＤＮＡの導入などの形質転換の目的のために使用されうることが、当業者に理解される。したがって、いくつかの実施形態において、ベクターは、他のＤＮＡ断片を挿入して挿入断片の複製を行わせるための、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどのレプリコンであってよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは組み込みベクターであってよい。

【0110】

いくつかの実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターであってよい。当業者が理解するであろうように、「ウイルスベクター」という語は、典型的には核酸分子の運搬又は細胞のゲノム中への組み込みを促進するウイルス由来核酸エレメントを含んだ核酸分子（例えば運搬プラスミド（transfer plasmid））、又は、核酸の運搬を媒介するウイルス粒子、のいずれかを指すのに広く用いられる。ウイルス粒子は典型的には、核酸に加え、各種ウイルス成分と、場合により宿主細胞成分とを含む。ウイルスベクターという語は、核酸を細胞内へ導入することができるウイルス又はウイルス粒子、あるいは、導入された核酸そのもの、のいずれかを指す場合がある。ウイルスベクター及び運搬プラスミドは、ウイルスに主に由来する構造的及び／又は機能的遺伝因子を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターである。「レトロウイルスベクター」という語は、レトロウイルスに主に由来する構造的及び機能的遺伝因子又はその一部を含んだ、ウイルスベクター又はプラスミドのことを指す。「レンチウイルスベクター」という語は、レトロウイルスの一属であるレンチウイルスに主に由来する構造的及び機能的遺伝因子、又はＬＴＲなどのその一部、を含んだ、ウイルスベクター又はプラスミドのことを指す。

【0111】

したがって、本明細書に開示される任意の組換えポリペプチド又はＩＬ－１０ポリペプチドバリアントをコードする核酸分子を１つ又は複数含む、ベクター、プラスミド、又はウイルスも本明細書において提供される。核酸分子は、例えばベクターによって形質転換／形質導入された細胞などにおいてその発現を指示することが可能な、ベクター内に含まれていてよい。真核及び原核細胞において使用するのに適したベクターが当該分野において公知であり、市販されており、また、当業者によっても容易に調製される。

【0112】

ＤＮＡベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって真核細胞内に導入することができる。宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションのための適した方法を、Sambrook et al.（2012、上記）などの標準的な分子生物学実験マニュアルにおいて見いだすことができる。その例として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（scrape loading）、バリスティック導入（ballistic introduction）、ヌクレオポレーション（nucleoporation）、ハイドロダイナミックショック（hydrodynamic shock）、及び感染などが挙げられる。

【0113】

本開示で使用できるウイルスベクターの例として、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ関連ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、及びウシパピローマウイルスベクターが挙げられる（例えば、Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと）。

【0114】

発現系の正確な成分は重要ではない。例えば、本明細書に開示される組換えポリペプチドは、哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、又はＨｅＬａ細胞）などの真核生物宿主において産生することができる。これらの細胞は多くのソースから入手可能であり、その例として、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection; Manassas, VA）が挙げられる。発現系を選択するにあたっては、成分同士が互いに適合したものであるように注意を払う必要がある。当業者は、このような判断を行うことが可能である。また、発現系を選択するにあたって手引きが必要な場合、当業者は、P. Jones, “Vectors: Cloning Applications”, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 2009を参考にしてよい。

【0115】

提供される核酸分子は、天然の配列、又は、天然の配列とは異なっていても、遺伝暗号の縮重により同一のポリペプチド、例えば抗体、をコードする配列を含んでいてよい。これら核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは、ホスホロアミダイトを用いた合成などによって作製される合成ＤＮＡ）からなっていてよく、又は、これらの種類の核酸のうちのヌクレオチドの組み合わせもしくは修飾からなっていてもよい。それに加え、核酸分子は二本鎖又は一本鎖（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか）であってよい。

【0116】

核酸分子は、ポリペプチド（例えば、ＩＬ－１０ポリペプチドバリアント）をコードする配列に限定されず、コード配列（例えば、ＩＬ－１０ポリペプチドバリアントのコード配列）の上流又は下流にある非コード配列の一部又は全部も含まれていてよい。分子生物学分野の当業者は、核酸分子を単離するための所定の手順を熟知している。核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで処理することによって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することによって生成することができる。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、分子は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって作製することができる。

【0117】

他の一態様において、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞、及び培地、を含んだ細胞培養物が提供される。一般に、培地は、本明細書に記載の細胞の培養に適した任意の培地であってよい。幅広い種類の上述の宿主細胞及び種を形質転換するための技術が当該分野で公知であり、技術的、及び科学的文献に記載されている。したがって、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含んだ細胞培養物も、本出願の範囲に含まれる。細胞培養物を生成及び維持するのに適した方法及び系が、当該分野において公知である。

【0118】

Ｃ． 組換え細胞及び細胞培養物
本開示の組換え核酸を、例えばヒトＴリンパ球などの宿主細胞に導入し、核酸分子を含んだ組換え細胞を製造することができる。細胞への本開示の核酸分子の導入は、ウイルス感染、トランスフェクション、接合（conjugation）、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション（nucleofection）、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション（direct micro-injection）、ナノ粒子媒介核酸送達、及び同種の方法などの、当業者に公知の方法によって達成することができる。

【0119】

したがって、いくつかの実施形態においては、核酸分子を公知のウイルス又は非ウイルス送達媒体によって送達することができる。例えば、核酸分子は、安定に宿主ゲノム内に組み込むことができ、又は、エピソーム的に複製することができ、又は、一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞中に存在することができる。したがって、いくつかの実施形態において、核酸分子は、エピソーム単位として組換え宿主細胞内に維持及び複製される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、組換え細胞のゲノム内に安定に組み込まれる。安定した組込みは、古典的なランダムゲノム組換え技術を使用するか、又は、ガイドＲＮＡ主導（guide RNA-directed）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集、もしくはＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）を用いたＤＮＡガイド（DNA-guided）エンドヌクレアーゼゲノム編集、もしくはＴＡＬＥＮｓゲノム編集（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector nucleases））などの、より正確な技術を用いて達成することができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞中に存在する。

【0120】

核酸分子は、ウイルスキャプシド又は脂質ナノ粒子中に封入してもよく、あるいは、ウイルス又は非ウイルス送達手段及び当該分野で公知の方法、例えばエレクトロポレーションなどによって、送達してもよい。例えば、核酸の細胞への導入は、ウイルス形質導入によって達成されてもよい。非限定的な一例においては、バキュロウイルス又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を改変し、ウイルス形質導入によって核酸を標的細胞に送達してもよい。いくつかのＡＡＶ血清型が記載されているが、全ての公知の血清型は、複数の様々な組織型に由来する細胞に感染することができる。ＡＡＶは、明らかな毒性を伴わずに広範な種及び組織にｉｎ ｖｉｖｏで形質導入することができ、比較的穏やかな自然及び適応免疫応答を生成する。

【0121】

レンチウイルス由来ベクター系も、ウイルス形質導入による核酸送達及び遺伝子治療に対して有用である。レンチウイルスベクターは、遺伝子送達媒体として、いくつかの魅力的な特性を提供する。その例として、（ｉ）宿主ゲノムへの安定したベクターの組み込みによる持続的な遺伝子送達；（ｉｉ）分裂中の細胞と分裂していない細胞の両方に感染する能力；（ｉｉｉ）遺伝子治療及び細胞治療の重要な標的細胞型を包含する幅広い組織親和性；（ｉｖ）ベクター形質導入後にウイルスタンパク質が発現しないこと；（ｖ）ポリシストロニック配列又はイントロン含有配列などの複合的な遺伝因子を送達する能力；（ｖｉ）組み込み部位のプロファイルの潜在的な安全性が高いこと；及び、（ｖｉｉ）ベクターの操作と作成のための系が比較的容易であること；が挙げられる。

【0122】

いくつかの実施形態においては、本願のベクター構築物などを用いて宿主細胞を遺伝的に改変（例えば、形質導入、形質転換、又はトランスフェクション）することができ、このベクター構築物は、例えば、ウイルスベクター、もしくは宿主細胞のゲノムの一部と相同な核酸配列を含んだ相同組換え用ベクターであってもよく、又は、目的のポリペプチドの発現のための発現ベクターであってもよい。宿主細胞は、形質転換されていない細胞、又は、すでに少なくとも１つの核酸分子でトランスフェクトされた細胞、のいずれであってもよい。

【0123】

いくつかの実施形態において、組換え細胞は原核細胞又は真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はｉｎ ｖｉｖｏである。いくつかの実施形態において、細胞はｅｘ ｖｉｖｏである。いくつかの実施形態において、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏある。いくつかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞）又は樹状細胞などの免疫系細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好塩基球、好酸球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔ_ＣＴＬ）、又は他のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫系細胞はＴリンパ球である。いくつかの実施形態において、細胞は、対象から得られた試料に対して白血球除去を行うことで得ることができる。いくつかの実施形態において、対象はヒト患者である。適した細胞株の非限定的な例として、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉ５）細胞、Ｅｘｐｉ－２９３Ｆ細胞、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞、及びＨＥＫ－２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）が挙げられる。

【0124】

他の一態様において、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞、及び培地、を含んだ細胞培養物が提供される。一般に、培地は、本明細書に記載の細胞の培養に適した任意の培地であってよい。幅広い種類の上述の宿主細胞及び種を形質転換するための技術が当該分野で公知であり、技術的、及び科学的文献に記載されている。したがって、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含んだ細胞培養物も、本出願の範囲に含まれる。細胞培養物を生成及び維持するのに適した方法及び系が、当該分野において公知である。

【0125】

Ｄ． ＩＬ－１０ポリペプチドを製造するための方法
他の一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、本開示の組換えポリペプチドを製造するための各種方法に関し、方法は、（ａ）１つ又は複数の本開示の組換え細胞を提供すること；及び、組換え細胞を培地中で、細胞が組換え核酸分子にコードされるポリペプチドを産生するように培養すること；を含む。したがって、本明細書に開示される方法によって製造される組換えポリペプチドも、本開示の範囲に含まれる。

【0126】

組換えポリペプチドを製造するための、開示される方法の非限定的な好ましい実施形態は、次の特徴のうちの１つ又は複数を含みうる。いくつかの実施形態において、方法は、さらに、製造されたポリペプチドを単離及び／又は精製することを含む。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドの製造方法は、さらに、製造されたポリペプチドを単離及び／又は精製することを含む。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドの製造方法は、さらに、製造されたポリペプチドを構造的に改変することによって半減期を延長することを含む。

【0127】

いくつかの実施形態において、改変は、ヒトＦｃ抗体断片への融合、アルブミンへの融合、及びＰＥＧ化からなる群より選択される１つ又は複数の改変を含む。例えば、本明細書に開示される組換えポリペプチドはいずれも、組換えポリペプチドと異種ポリペプチド（例えば、ＩＬ－１０又はそのバリアントではない、ポリペプチド）とを含んだ、融合物又はキメラポリペプチドとして作成することができる。異種ポリペプチドは、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける組換えポリペプチドの循環半減期（circulating half-life）を延長することができ、したがって、本開示の組換えポリペプチドの特性をさらに増強することができる。各種実施形態において、循環半減期を延長する異種ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、又は、ＩｇＧ重鎖可変領域を欠く抗体のＩｇＧサブクラスのＦｃ領域であってよい。Ｆｃ領域は、例えば、補体結合及びＦｃ受容体結合を阻害する変異を含んでいてもよい。あるいは、Ｆｃ領域は溶解性（lytic）であってもよく、例えば、補体に結合することができてもよく、抗体依存性補体溶解（antibody-dependent complement lysis）（ADCC）などの他のメカニズムで細胞を溶解できてもよい。

【0128】

いくつかの実施形態において、「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧをパパインで消化することで産生される、ＩｇＧのＣ末端ドメインに相同な天然又は合成ポリペプチドであってよい。ＩｇＧのＦｃは、約５０ｋＤａの分子量を有する。本開示の組換え融合ポリペプチドは、Ｆｃ領域全体を含んでいてもよく、あるいは、その小部分であって、それが含まれる融合ポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持する部分を含んでいてもよい。さらに、完全長又は断片化したＦｃ領域は、野生型分子のバリアントであってもよい。すなわち、それらはポリペプチドの機能に影響する、又は影響しないであろう変異を含んでいてもよい。さらに、以下に記載するように、あらゆる場合に本来の活性が必要とされる又は所望されるわけではない。いくつかの実施形態において、組換え融合タンパク質（例えば、本明細書に記載されるＩＬ－１０部分アゴニスト又はアンタゴニスト）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。

【0129】

Ｆｃ領域は、「溶解性」又は「非溶解性」であってよいが、典型的には非溶解性である。非溶解性Ｆｃ領域は、典型的には、高親和性Ｆｃ受容体結合部位及びＣ’１ｑ結合部位を欠く。マウスのＩｇＧ Ｆｃの高親和性Ｆｃ受容体結合部位は、Ｌｅｕ残基をＩｇＧ Ｆｃの２３５位に有する。したがって、このＦｃ受容体結合部位は、Ｌｅｕ２３５を変異又は欠失させることで破壊することができる。例えば、Ｌｅｕ２３５のＧｌｕへの置換は、Ｆｃ領域が高親和性Ｆｃ受容体に結合する能力を阻害する。マウスのＣ’１ｑ結合部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２残基を変異又は欠失させることで、機能的に破壊することができる。例えば、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２のＡｌａ残基への置換により、ＩｇＧ１ Ｆｃが抗体依存性補体溶解を指示できなくなる。一方、溶解性ＩｇＧ Ｆｃ領域は、高親和性Ｆｃ受容体結合部位及びＣ’１ｑ結合部位を有する。高親和性Ｆｃ受容体結合部位はＩｇＧ Ｆｃの２３５位にＬｅｕ残基を含み、Ｃ’１ｑ結合部位はＩｇＧ１のＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２残基を含む。溶解性ＩｇＧ Ｆｃは、これらの部位に野生型残基又は保存的アミノ酸置換を有する。溶解性ＩｇＧ Ｆｃは、細胞を、抗体依存細胞傷害性又は補体主導細胞溶解（complement directed cytolysis）（ＣＤＣ）の標的にすることができる。ヒトＩｇＧに適した変異も当該分野において公知である。

【0130】

他の実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、本開示の組換えＩＬ－１０ポリペプチドと、ＦＬＡＧ配列などの、抗原タグとして機能するポリペプチドとを含んでいてよい。ＦＬＡＧ配列は、ビオチン化された、高度に特異的な、抗ＦＬＡＧ抗体によって認識される。いくつかの実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、さらに、Ｃ末端ｃ－ｍｙｃエピトープタグを含む。

【0131】

他の実施形態において、組換え融合ポリペプチドは、本開示の組換えＩＬ－１０ポリペプチドと、ＩＬ－１０ポリペプチドの発現を増強する、又は細胞局在を指示するように機能する、Ａｇａ２ｐアグルチニンサブユニットなどの異種ポリペプチドとを含む。

【0132】

他の実施形態において、本開示の組換えＩＬ－１０ポリペプチドと、抗体又はその抗原結合部位とを含む、融合ポリペプチドが生成されてもよい。融合組換えＩＬ－１０ポリペプチドの抗体又は抗原結合部位は、ターゲティング部分としての役割を果たしうる。例えば、それは、組換えＩＬ－１０ポリペプチドを細胞の特定のサブセット、又は標的分子に局在化させるのに使用することができる。サイトカイン－抗体キメラポリペプチドを生成する方法も当該分野において公知である。

【0133】

いくつかの実施形態において、本開示の組換えＩＬ－１０ポリペプチドを１つ又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子で修飾し、その半減期を延長することができる。本明細書で用いられる「ＰＥＧ」という語は、ポリエチレングリコール分子のことを意味する。ＰＥＧの典型的な形態は、末端ヒドロキシル基を有する直鎖ポリマーであり、ＨＯ－ＣＨ_２ＣＨ_２－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＯＨの式を有する（式中、ｎは約８～約４０００である）。

【0134】

一般に、ｎは離散値ではないが、平均値周辺でほぼガウス分布を有する範囲を構成する。末端水素はアルキル又はアルカノール基などのキャッピング基に置換してもよい。ＰＥＧは少なくとも１つのヒドロキシ基を有していてよく、それは、より好ましくは末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基を、ペプチドと反応して共有結合を形成するリンカー部分に付加してもよい。当該分野において、ＰＥＧには多数の誘導体が存在する。本開示の組換えＩＬ－１０ポリペプチドに共有結合によって付加されるＰＥＧ分子は、約１０，０００、２０，０００、３０，０００、又は４０，０００ダルトンの平均分子量のものであってよい。ＰＥＧ化試薬は直鎖又は分岐鎖の分子であってよく、それが単独で、又は縦列に存在するものであってよい。ＰＥＧ化された本開示のＩＬ－１０ポリペプチドは、ペプチドのＣ末端及び／又はＮ末端に付加された縦列ＰＥＧ分子を有していてよい。本明細書で用いられる「ＰＥＧ化」という語は、上記のように、１つ又は複数のＰＥＧ分子を、本開示のＩＬ－１０ポリペプチドなどの分子に、共有結合によって付加することを意味する。

【0135】

Ｅ． 医薬組成物
本開示の組換えポリペプチド、核酸、組換え細胞、及び／又は細胞培養物を、医薬組成物などの組成物に組み込むことができる。このような組成物は一般に、本明細書に記載の組換えポリペプチド、核酸、組換え細胞、及び／又は細胞培養物と、担体などの薬理学的に許容される賦形剤とを含む。

【0136】

したがって、本開示の一態様は、薬理学的に許容される担体と、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；及び（ｃ）薬理学的に許容される担体；のうちの１つ又は複数と、を含む医薬組成物に関する。

【0137】

いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、癌などの疾患を治療、予防、緩和するために、又は、疾患の発症を減少もしくは遅延させるために、製剤化される。

【0138】

開示される医薬組成物の非限定的な好ましい実施形態は、次の特徴のうちの１つ又は複数を含みうる。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換えポリペプチド及び薬理学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え細胞及び薬理学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、組換え細胞は、本開示の組換えポリペプチドを発現する。新たな治療方法として、インターロイキンを発現及び分泌するように遺伝的に改変された組換え細胞の例が、これまでに、例えば、Steidler L. et al., Nature Biotechnology, Vol. 21, No. 7, July 2003及びOh J.H et al., mSphere, Vol. 5, Issue 3, May/June 2020に記載されている。

【0139】

いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の組換え核酸及び薬理学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ウイルスキャプシド又は脂質ナノ粒子中に封入されている。

【0140】

注射用途に適した医薬組成物として、滅菌済水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び、滅菌済注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌済粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、適した担体としては、生理食塩水、静菌水、及びCremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合においても、組成物は無菌であり、また、容易な針通過性（syringability）が存在する程度にまで流動性を持つ必要がある。組成物は、製造及び保管条件下で安定である必要があり、また、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用が及ばないように保管される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、及び同種のもの）、並びにそれらの好適な混合物などを含有する、溶媒又は分散媒であってよい。適度な流動性を保つことは、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合に必要とされる粒径を維持すること、及び、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を使用することなどによって可能である。微生物の作用の防止は、各種抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、及び同種のものによって達成できる。多くの場合は、組成物中に、等張剤、例えば、糖；マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール；及び／又は、塩化ナトリウム；を含むことが一般に好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収をもたらすため、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどを、組成物中に含有させてもよい。

【0141】

滅菌済注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせとともに、適切な溶媒中に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製できる。一般に、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒体と、上記で列挙した成分のうちの必要な他の成分とを含有する、滅菌済媒体に組み込むことにより調製される。滅菌済注射用溶液を調製するための滅菌済粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これによって、活性成分に任意のさらなる所望の成分を加えた粉末が、予め滅菌濾過されたそれら溶液から生成される。

【0142】

本開示の対象組換えポリペプチドの全身投与は、経粘膜又は経皮手段によるものであってもよい。経粘膜又は経皮投与の場合、浸透の対象となる障壁に適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当該分野において一般に知られており、例として、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、経鼻スプレー又は坐剤の使用によって達成できる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該分野で一般に知られているように軟膏（ointments）、軟膏剤（salves）、ゲル剤、又はクリーム剤に製剤化される。

【0143】

いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、当該分野で公知の方法を用いてトランスフェクション又は感染によって投与されてもよく、その方法の例としては、限定されるものではないが、McCaffrey et al. (Nature 418:6893, 2002)、Xia et al. (Nature Biotechnol. 20:1006-1010, 2002)、又はPutnam (Am. J. Health Syst. Pharm. 53:151-160, 1996, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53:325, 1996)に記載の方法が挙げられる。

【0144】

いくつかの実施形態において、本開示の対象組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドが急速に身体から排除されないように保護する担体と共に調製され、その例として、インプラント及びマイクロカプセル化された送達系などの放出制御製剤が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用してもよい。このような製剤は、標準的な技術を使用して調製することができる。材料は、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から市販のものを入手することもできる。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを含む）を、薬理学的に許容される担体として用いてもよい。これらを、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されるように、当業者に公知の方法にしたがって調製してよい。より詳細に以下に記載するように、本開示の組換えポリペプチドを、作用期間の延長を達成するために、ＰＥＧ化、アシル化、Ｆｃ融合、アルブミンなどの分子への結合などによって改変してもよい。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドを、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏにおけるその半減期を延長するように、さらに改変してもよい。本開示の組換えポリペプチドを改変するのに適した公知の戦略と方法の非限定的な例として、（１）組換えポリペプチドがプロテアーゼに接触することを阻止する、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの高度に可溶性な高分子を用いて、本明細書に記載の組換えポリペプチドを化学的に修飾すること；及び、（２）本明細書に記載の組換えポリペプチドを、アルブミンなどの安定なタンパク質と共有結合又は複合体化すること；が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、アルブミンなどの安定なタンパク質に融合させてもよい。例えば、ヒトアルブミンは、それが融合したポリペプチドの安定性を増大させる最も効果的なタンパク質の１つであることが知られており、このような融合タンパク質が多数報告されている。

【0145】

いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、１つ又は複数のペグ化試薬を含む。本明細書で用いられる「ＰＥＧ化」という語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に共有結合的に付加することによって、そのタンパク質を改変することを指し、「ＰＥＧ化された」という語は、ＰＥＧを付加したタンパク質のことを指す。約１０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトンの任意の範囲のサイズのＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体を、各種化学的性質を利用して本開示の組換えポリペプチドに付加してよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体の平均分子量は、約１ｋＤ～約２００ｋＤ、例えば、約１０ｋＤ～約１５０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約５ｋＤ～約１００ｋＤ、約２０ｋＤ～約８０ｋＤ、約３０ｋＤ～約７０ｋＤ、約４０ｋＤ～約６０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約１００ｋＤ～約２００ｋＤ、又は約１５０ｋＤ～約２００ｋＤである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体の平均分子量は、約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、又は約８０ｋＤである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体の平均分子量は、約４０ｋＤである。いくつかの実施形態において、ペグ化試薬は、メトキシポリエチレングリコール－スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ－ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ－スクシンイミジルブチレート（ｍＰＥＧ－ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ－スクシンイミジルスクシネート（ｍＰＥＧ－ＳＳ）、ｍＰＥＧ－スクシンイミジルカーボネート（ｍＰＥＧ－ＳＣ）、ｍＰＥＧ－スクシンイミジルグルタレート（ｍＰＥＧ－ＳＧ）、ｍＰＥＧ－Ｎ－ヒドロキシル－スクシンイミド（ｍＰＥＧ－ＮＨＳ）、ｍＰＥＧ－トレシレート（tresylate）、及びｍＰＥＧ－アルデヒドから選択される。いくつかの実施形態において、ペグ化試薬は、ポリエチレングリコールである。例えば、ペグ化試薬は、本開示の組換えポリペプチドのＮ末端メチオニン残基に共有結合した、平均分子量２０，０００ダルトンのポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、ペグ化試薬は、本開示の組換えポリペプチドのＮ末端メチオニン残基に共有結合した、平均分子量約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、又は約８０ｋＤのポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、ペグ化試薬は、本開示の組換えポリペプチドのＮ末端メチオニン残基に共有結合した、平均分子量約４０ｋＤのポリエチレングリコールである。

【0146】

したがって、いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、１つ又は複数のポリエチレングリコール部分によって化学的な改変、例えばＰＥＧ化、がなされているか、又は類似の改変、例えばＰＡＳ化（PASylated）、がなされている。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ分子又はＰＡＳ分子は、開示される組換えポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸側鎖に結合している。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化又はＰＡＳ化されたポリペプチドは、１つのアミノ酸上にのみ、ＰＥＧ又はＰＡＳ部分を有している。他の実施形態において、ＰＥＧ化又はＰＡＳ化されたポリペプチドは、２個以上のアミノ酸上にＰＥＧ又はＰＡＳ部分を有している。例えば、２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、又は２０個以上の異なるアミノ酸残基にＰＥＧ又はＰＡＳ部分が付加されている。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＡＳ鎖は、２０００Ｄａ、２０００Ｄａ超、５０００Ｄａ、５０００Ｄａ超、１０，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ超、１０，０００Ｄａ超、２０，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ超、及び３０，０００Ｄａである。ＰＡＳ化されたポリペプチドは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を介してＰＥＧ又はＰＡＳに（例えば、連結基なしで）直接連結させてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、約１ｋＤ～約２００ｋＤ、例えば、約１０ｋＤ～約１５０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約５ｋＤ～約１００ｋＤ、約２０ｋＤ～約８０ｋＤ、約３０ｋＤ～約７０ｋＤ、約４０ｋＤ～約６０ｋＤ、約５０ｋＤ～約１００ｋＤ、約１００ｋＤ～約２００ｋＤ、又は約１５０ｋＤ～約２００ｋＤの範囲の平均分子量を有するポリエチレングリコールに共有結合している。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、又は約８０ｋＤの平均分子量を有するポリエチレングリコールに共有結合している。いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、約４０ｋＤの平均分子量を有するポリエチレングリコールに共有結合している。

【0147】

部位特異的ＰＥＧ化部位の組み込み
いくつかの実施形態において、本開示の組換えポリペプチド（例えば、ＩＬ－１０バリアント）を、例えば米国特許第７，０４５，３３７号明細書及び第７，９１５，０２５号明細書；Dieters, et al. (2004) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 14(23):5743-5745；並びに、Best, M (2009) Biochemistry 48(28):6571-6584に記載にように、非天然アミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸の組み込みによって改変し、それによって部位特異的結合（例えば、ＰＥＧ化）を促進してもよい。いくつかの実施形態において、例えば、Dozier and Distefano (2015) International Journal of Molecular Science 16(10):25831-25864に記載のように、本開示の組換えポリペプチド内の様々な部位にシステイン残基を組み込み、そのシステイン側鎖を介して部位特異的ＰＥＧ化を促進してもよい。

【0148】

ある実施形態において、本開示は、本開示の部位特異的ＰＥＧ化を可能にする１つ又は複数のアミノ酸（例えば、システイン又は非天然アミノ酸）の組み込みを有するＩＬ－１０バリアントポリペプチドを提供し、この部位特異的ＰＥＧ化部位のためのアミノ酸置換は、ＩＬ－１０と、ＩＬ－１０Ｒα又はＩＬ－１０ＲβなどのＩＬ－１０受容体シグナリング複合体の成分との間の界面には位置しない。これらの例において、部位特異的アミノ酸改変の組み込みは、本明細書に記載される結晶構造で示されるＩＬ－１０Ｒβ結合界面を包含する配列番号１又は配列番号１６のアミノ酸残基３４～６９、７８～８７、及び１０８～１６０、以外のＩＬ－１０アミノ酸部位における組み込みである。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１又は配列番号１６の次のアミノ酸部位：３４～６９、７８～８７、及び１０８～１６０の１つ又は複数における部位特異的結合（例えばＰＥＧ化）を可能にするための部位特異的アミノ酸置換を有するＩＬ－１０バリアントポリペプチドを提供する。

【0149】

部位特異的ＰＥＧ化部位の組み込み
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０タンパク質のＩＬ－１０Ｒβタンパク質との相互作用を、本明細書に記載の、ＩＬ－１０界面におけるアミノ酸位置での部位特異的ペグ化の組み込みによって調節してもよい。配列番号１の１３～３３、７０～７７、及び８８～１０７（言い換えると、シグナルペプチドを有するプレタンパク質のヒトＩＬ－１０タンパク質、すなわち配列番号１６の配列、に従った番号付けによる残基３１～５１、８８～９５、及び１０６～１２５）からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する１つ又は複数の位置の部位特異的ＰＥＧ化を促進する非天然アミノ酸（又はシステイン残基）の組み込みにより、ＩＬ－１０Ｒβタンパク質に対する結合が調節されたＩＬ－１０バリアントポリペプチドが提供され、その結果、部分アゴニスト活性を有するＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒα／ＩＬ－１０Ｒβ受容体複合体が形成される。ＰＥＧ分子が界面に組み込まれるこれらの例において、ＩＬ－１０バリアントポリペプチドのＩＬ－１０Ｒβ又はＩＬ－１０Ｒ１タンパク質との結合を完全に妨げて活性を排除することがないように、ＰＥＧは、典型的には、約１ｋＤａ、あるいは約２ｋＤａ、あるいは約３ｋＤａ、あるいは約４ｋＤａ、あるいは約５ｋＤａ、あるいは約６ｋＤａ、あるいは約７ｋＤａ、あるいは約８ｋＤａ、あるいは約９ｋＤａ、あるいは約１０ｋＤａ、あるいは約１２ｋＤａ、あるいは約１５ｋＤａ、又は、あるいは約２０ｋＤａからの低分子量ＰＥＧ種である。

【0150】

製剤
本開示のＩＬ－１０バリアントポリペプチドは、その治療に有効な量を単独で、又は１つもしくは複数のさらなる治療剤と組み合わせて、炎症性及び／又は自己免疫疾患に罹患した対象哺乳類に投与することで、対象におけるそれら疾患の治療及び／又は予防に対して有用となる。さらに、本開示は、治療に有効な量のこのようなＩＬ－１０バリアントポリペプチドを単独で、又は１つもしくは複数のさらなる治療剤と組み合わせて、炎症性疾患に罹患した対象哺乳類に投与することによって、対象におけるその疾患を治療及び／又は予防するための方法を提供する。

【0151】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、消化管（gastrointestinal (GI) tract）の炎症性疾患の治療において有用であり、その疾患の例としては、限定されるものではないが、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、及び、腸管の慢性炎症によって特徴づけられる他の形態の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が挙げられる。クローン病は口から肛門までの腸管の領域に影響する可能性がある一方で、潰瘍性大腸炎は典型的には大腸及び直腸の炎症と関連する。

【0152】

このような腸の炎症状態のための従来の第１選択の治療として、５－アミノサリチル酸を、任意にコルチコステロイドと組み合わせたものが挙げられる。より最近開発された治療用タンパク質としては、抗ＴＮＦアルファ抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、及びゴリムマブ）、インテグリン受容体アンタゴニスト（例えば、ナタリズマブ及びベドリズマブ）、及びＩＬ２３アンタゴニスト（例えば、ウステキヌマブ）が挙げられる。慢性炎症性疾患の治療において有意な有効性を提供する一方で、このようなポリペプチドの従来の非経口（ＩＭ、ＩＶ、又はＳＱ）投与では、治療に対して比較的少ない割合の薬剤による全身曝露となる。これらの薬剤は炎症経路の特異的な阻害を提供する一方で、このような薬剤の非経口投与による全身曝露は、免疫抑制などの重大な全身性副作用と関連し、結核、真菌感染症、尿路感染症、及びリンパ腫などの深刻な、生命を脅かす可能性のある感染症に対する脆弱性を高める。このような重大な全身毒性により、投与される薬剤の用量は限定的なものとなり、患部組織の生物学的薬剤への曝露は最適を下回ることとなる。

【0153】

本開示のＩＬ－１０バリアントポリペプチドの選択的な特性は、非経口投与の際にこのような全身副作用を緩和するが、いくつかの例においては、ＩＬ－１０バリアントポリペプチドの腸管への直接投与を提供することが望ましい場合がある。

【0154】

ＩＬ－１０バリアントポリペプチドの経口投与のための製剤
本開示はさらに、対象哺乳類における消化管の炎症性疾患の治療及び／又は予防の方法であって、治療又は予防に有効な量の、本開示のＩＬ－１０バリアントポリペプチドを含む組成物を単独で、又は１つもしくは複数のさらなる治療剤と組み合わせて、対象哺乳類に投与することを含む、方法を提供する。本開示はさらに、本開示のＩＬ－１０バリアントポリペプチドを含む腸溶性組成物を提供する。いくつかの実施形態において、腸溶性組成物は、ＩＬ－１０バリアントポリペプチドの薬理学的に許容される製剤を含み、このような製剤は、ＩＬ－１０バリアントポリペプチドの上部消化管における分解に抵抗性であり、下部消化管において崩壊して、小腸、大腸、直腸、及び肛門を含む下部消化管へのＩＬ－１０バリアントポリペプチドの投与と、潰瘍性大腸炎を含むが限定されない下部消化管の炎症性疾患の治療とを促進する。経口投与に適したポリペプチド製剤の例が当該分野において公知であり、例として、Hamman, et al “Oral Delivery of Peptide Drugs” (2005). BioDrugs 19, 165-177及びBlichmann, P. “Oral Delivery of Peptide Drugs for Mitigation of Crohn’s Disease” (2012). All Theses. 1486や、Anselmo, et al “Non-invasive delivery strategies for biologics” (2019) Nat Rev Drug Discov 18, 19-40の総説の製剤が挙げられる。

【0155】

改変された原核細胞の送達
他の一実施形態において、本開示は、ＩＬ－１０バリアントを対象哺乳類の消化管に投与するための方法を提供する。この方法は、組換えによって改変された原核細胞を含む、薬理学的に許容される組成物を、対象に投与する工程を含み、原核細胞は、ＩＬ－１０バリアントが組換え原核細胞内で発現され、ＩＬ－１０バリアントが組換えで改変された原核細胞からの分泌により、もしくは前記細胞の溶解により、消化管に放出されるように、又は、原核細胞の表面に提示されるように、１つ又は複数の発現制御配列に作動可能に連結された本開示のＩＬ－１０バリアントをコードする核酸配列を含む。ＩＬ－１０の投与のための、組換えにより改変された細菌細胞の例が、当該分野で公知である（Steidler, et al. 2003（上記））。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０バリアントを発現する改変細菌細胞を経口で、典型的には水性懸濁液の形態で投与してもよく、又は直腸投与（例えば注腸）してもよい。

【0156】

腸内細菌叢への原核生物ウイルス送達
一実施形態において、本開示は、ＩＬ－１０バリアントポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換えにより改変された原核生物ウイルス（バクテリオファージなど）を提供する。他の一実施形態において、本開示は、対象哺乳類の腸管の炎症性疾患を治療する方法を提供し、この方法は、ＩＬ－１０バリアントポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換えにより改変された原核生物ウイルス（バクテリオファージなど）の薬理学的に許容される製剤を、治療に有効な量で対象に投与することを含み、核酸配列は、原核細胞が原核生物ウイルスに感染した際に、ＩＬ－１０バリアントが宿主細胞内で発現するように、ウイルスの宿主原核細胞内で機能的する１つ又は複数の発現制御配列に、作動可能に連結している。一実施形態において、バクテリオファージは溶菌性ファージであり、それにより、感染後にバクテリオファージが細菌細胞の溶菌経路を誘導し、ＩＬ－１０バリアントの局所的放出と、ＩＬ－１０バリアントの腸粘膜への送達とがもたらされる。

【0157】

本明細書で用いられる「原核細胞ウイルス」、「バクテリオファージ」、及び「ファージ」という語は、本明細書において互換的に用いられ、細菌に感染してその中で複製する任意の各種細菌ウイルスのことを表す。広範な細菌細胞を選択することのできる広範な種類のバクテリオファージが同定されており、科学論文において広く特徴づけられている。バクテリオファージは感染対象の細菌細胞に有意な選択性を示すため、バクテリオファージの選択は、典型的には、発現させるための腸内細菌叢の標的細菌を考慮して行われる。広範な細菌細胞の任意のものに対する、組換えによって改変されたバクテリオファージの生成のための出発材料として適したバクテリオファージの試料が、American Type Culture Collection（Manassas, VA）から入手可能である。ファージゲノムの操作は、当業者に周知の、組換え核酸の操作のための標準的な方法に従って行われる。その例として、Molecular Cloning:A Laboratory Manual (available from Cold Spring Harbor Press)に記載の方法と、各種実験用品業者から入手可能な従来の試薬が挙げられる。

【0158】

ＩＬ－１０バリアントの、感染部位への送達は、対象の腸内細菌叢の原核細胞に感染できるバクテリオファージによって達成される。このバクテリオファージは、ＩＬ－１０バリアントをコードする核酸配列に作動可能に連結した、標的原核細胞内で活性のあるプロモーターを含んだ発現カセットを、組換え技術を用いて導入することによって改変され、この発現カセットは、組換えによって改変されたバクテリオファージによる標的細菌細胞のトランスフェクションに続いて、ＩＬ－１０バリアントポリペプチドが標的細菌細胞内で発現されるように、バクテリオファージゲノムの非必須領域中に挿入される。例えば、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ細胞を標的とするバクテリオファージの場合、この発現カセットには、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージの非必須領域中に挿入されたＩＬ－１０バリアントの発現を促進する、Ｓ． ａｕｒｅｕｓプロモーターを用いる。バクテリオファージゲノムの非必須領域は、このようなファージの公知のゲノム構成及びコード配列によって容易に同定できる。広範な種類の細菌において活性のある原核生物プロモーター配列が、当該分野において周知である。プロモーター配列は天然配列から切り出して得てもよく、又は、標的細菌細胞の天然の原核生物プロモーター配列に対応する核酸配列の配列決定及び合成によって得てもよい。例えば、Estrem, et al. (1999) Bacterial promoter architecture: Subsite structure of UP elements and interactions with the carboxy-terminal domain of the RNA polymerase alpha subunit; Genes & Development 13(16):2134-2147を参照のこと。

【0159】

コドンの最適化
ＩＬ－１０バリアントのアミノ酸配列及び対応するコード核酸配列を本明細書に提供する。また、当業者は、遺伝暗号の縮重に基づいて核酸配列を生成することができる。一実施形態においては、発現のために最適化されたコドンを使用することにより、ＩＬ－１０バリアントの哺乳類配列を、細菌細胞での標的環境における発現に対して最適化する。細菌細胞での発現に最適化された好ましいコドンを用いてＩＬ－１０バリアントをコードする合成核酸配列を構築するための技術については、バクテリオファージゲノムの、本来のタンパク質をコードするためのコドン使用頻度の共通性と、その相対的な存在量とを、当該分野で周知の技術によって分析する計算法により決定することができる。コドン使用頻度データベース（www.kazusa.or.jp/codon）を用いて、細菌環境におけるコドン最適化配列を生成することができる。さらには、１つの生物由来の配列を別の宿主生物のための最適化コドン使用頻度に変換するために、各種ソフトウェアツールが利用可能であり、その例として、JCat Codon Optimization Tool (www.jcat.de)、Integrated DNA technologies Codon Optimization Tool (www.idtdna.com/CodonOpt)、又はthe Optimizer online codon optimization tool (genomes.urv.es/OPTIMIZER)などが挙げられる。このような合成配列は、合成核酸分子の構築のための当該分野で周知の技術により構築することができ、様々な販売業者から入手することもできる。

【0160】

ファージベクターのＰＡＭモチーフの削除
いくつかの実施形態において、腸内細菌叢での組換えベクターからのＩＬ－１０ポリペプチドの発現を促進するため、細菌宿主細胞の防御機構を回避又は阻害するように、本発明の組換え原核生物ベクターを改変してもよい。細菌宿主は、二本鎖ＤＮＡ切断を導入してファージを不活性化するＣａｓ９エンドヌクレアーゼなどの、バクテリオファージ感染に対抗する防御機構を発達させている。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはゲノムをサーベイし、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡに結合するために必須であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を識別する。ＰＡＭ配列はＣａｓ９の機能に必須であるため、Ｃａｓ９配列を原核細胞ウイルスから排除することで、対象の腸内細菌叢の内因性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＩＬ－１０バリアントをコードする侵入ファージを無力化する能力が、最小限に抑えられる。

【0161】

ＩＬ－１０バリアントポリペプチドを発現する改変制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）
いくつかの実施形態において、本開示は、さらに、組換えによって改変されたＴｒｅｇ細胞を提供する。このＴｒｅｇは、シグナルペプチドを任意に含むＩＬ－１０バリアントをコードする核酸配列を含んだ発現カセットを含み、核酸配列は、ＩＬ－１０バリアントをコードする核酸配列の転写と翻訳を指示することができる、Ｔｒｅｇ細胞において機能する発現制御配列と作動可能に連結しており、ＩＬ－１０バリアントは、シグナルペプチドと結合している場合には任意に分泌型となる。当業者は、「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ細胞」という語が、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を含むがそれに限定されない他のＴ細胞の応答を抑制しうる、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の一種を表すことを理解するであろう。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４、ＩＬ－２受容体のα－サブユニット（ＣＤ２５）、及び転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現によって特徴づけられる。改変されたＴｒｅｇ細胞及びその調製方法は、当該分野において周知である。例えば、McGovern, et al. Engineering Specificity and Function of Therapeutic Regulatory T Cells (2017). Front. Immunol. 8:1517及びScott, D. Genetic Engineering of T Cells for Immune Tolerance (2020) Molecular Therapy: Methods & Clinical Development 16:103を参照のこと。Zhang, et al (2018) Frontiers in Immunology 12(9):235に記載のＣＡＲ Ｔｒｅｇも挙げられる。

【0162】

ウイルスベクターによるＩＬ－１０の投与
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０バリアントをコードする核酸配列を含んだ発現ベクターに対象哺乳類を接触させることにより、ＩＬ－１０バリアントを対象に投与してもよい。発現ベクターはウイルスベクター又は非ウイルスベクターであってもよい。「非ウイルスベクター」という語は、自律的に複製する染色体外の環状ＤＮＡ分子であって、通常のゲノムとは別個のものであり、非選択的な条件下で細胞の生存に必須ではなく、標的細胞内でコード配列を発現させることが可能な分子のことを指す。プラスミドは非ウイルスベクターの例である。標的細胞のトランスフェクションを促進するため、標的細胞を、非ウイルスベクターの取り込みを促進する条件下で、非ウイルスベクターに直接曝露してもよい。哺乳類細胞による外来核酸の取り込みを促進する条件の例は、当該分野において周知であり、その例としては、限定されるものではないが、化学的手段（例えばLipofectamine（登録商標）、Thermo-Fisher Scientific）、高塩濃度、及び磁場（エレクトロポレーション）が挙げられる。

【0163】

一実施形態において、非ウイルスベクターは、非ウイルス送達系において提供されてもよい。非ウイルス送達系は、典型的には、標的細胞への核酸カーゴ（nucleic acid cargo）の形質導入を促進する複合体であり、核酸は、カチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ）、界面活性剤、生物製剤（ゼラチン、キトサン）、金属（金、磁鉄）、合成ポリマー（ＰＬＧ、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ）などの薬剤と複合体化される。非ウイルス送達系の多くの実施形態が当該分野において公知であり、それらの例として、脂質ベクター系（Lee et al. (1997) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 14:173-206）、ポリマー被覆リポソーム（米国特許第５，２１３，８０４号明細書；米国特許第５，０１３，５５６号明細書）；及び、カチオン性リポソーム（米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，５７８，４７５号明細書；米国特許第５，２７９，８３３号明細書；米国特許第５，３３４，７６１号明細書）が挙げられる。

【0164】

他の一実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターであってよい。本明細書において用いられるウイルスベクターという語は、その従来の意味で使用され、タンパク質合成又はエネルギー生成機構を持たない任意の細胞内絶対寄生体（obligate intracellular parasites）のことを指し、一般に、哺乳類細胞に外来導入遺伝子を送達するために用いられることの多い、エンベロープを持った、又は持たない、任意の動物ウイルスのことを指す。ウイルスベクターは、複製可能（例えば、実質的に野生型）であってもよく、条件的複製可能（特定条件下で複製するように組換えによって改変したもの）であってもよく、又は複製欠損性（ウイルスの欠失した機能を補足することができる細胞株が無ければ実質的に複製できないもの）であってもよい。ウイルスベクターは、それが「選択的複製可能」となるような、すなわち、特定の細胞型、又は、例えば癌状態などの表現系細胞状態（phenotypic cell states）においてウイルスベクターが優先的に複製するような、特定の改変を有していてもよい。本発明の実施において有用なウイルスベクター系の例として、天然又は組換えのウイルスベクター系が挙げられる。本発明の実施において有用なウイルスの例として、組換えによって改変された、エンベロープを持った、又は持たない、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられる。例えば、ウイルスベクターは、ヒト又はウシのアデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス）、シンドビスウイルス、（ラウス肉腫ウイルスを含むがそれに限定されない）レトロウイルス、及びＢ型肝炎ウイルスのゲノムから得られたものであってよい。典型的には、目的の遺伝子をこのようなベクターに挿入することで、典型的にはウイルスゲノム配列を伴った遺伝子構築物のパッケージングを可能にし、その後、感受性宿主細胞を感染させて目的の遺伝子を発現させる。

【0165】

追加のペプチド治療剤との併用療法を促進するため、発現ベクターは、１つ又は複数のポリペプチドを、ＩＬ－１０バリアントポリペプチドに加えてコードしていてもよい。本発明の実施におけるように複数のポリペプチドを発現させる場合、各ポリペプチドを発現制御配列に作動可能に連結するか（モノシストロニック）、又は、複数のポリペプチドをポリシストロニックな構築物によってコードし、複数のポリペプチドが単一の発現制御配列の制御下で発現されるようにしてもよい。一実施形態において、ターゲティング抗原（targeting antigen）をコードする発現ベクターは、１つ又は複数の免疫調節因子をさらにコードしていてもよい。本発明の実施に有用な免疫調節因子の例としては、限定されるものではないが、サイトカイン類が挙げられる。発現したサイトカイン類は細胞内で発現するように指示してもよく、シグナル配列とともに発現させて細胞外提示又は分泌させてもよい。

【0166】

発現ベクターは、任意に、「レスキュー」遺伝子（例えば、その発現により、外部因子による死滅に対して細胞が感受性となるか、又は細胞が死滅するように細胞内が毒性状態となる、核酸配列）をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供してもよい。レスキュー遺伝子を提供することで、形質導入細胞を選択的に死滅させることが可能となる。したがって、レスキュー遺伝子は、前記構築物が対象哺乳類の細胞内に組み込まれた際に、形質導入細胞の望ましくない拡散や複製可能ベクター系の効果を妨げる、さらなる安全対策を提供する。一実施形態において、レスキュー遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子であり（米国特許第５，６３１，２３６号明細書及び米国特許第５，６０１，８１８号明細書を参照のこと）、この場合、ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞はガンシクロビル投与による選択的死滅に対して感受性となる。

【0167】

本開示の方法
本明細書に記載される治療組成物、例えば、組換えポリペプチド、ＩＬ－１０ポリペプチドバリアント、核酸、組換え細胞、及び医薬組成物などのいずれか１つの投与を用いて、関連のある健康状態及び疾患、例えば癌、自己免疫疾患、及び慢性感染症などの治療において、患者を治療することができる。一実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ＩＬ－１０ポリペプチドバリアント、核酸、組換え細胞、及び医薬組成物を治療薬に組み込み、ＩＬ－１０シグナル伝達と関連した１つもしくは複数の自己免疫疾患もしくは状態を有する、又は有する疑いのある、又は発症するリスクが高い可能性がある、個体を治療する方法において使用することができる。自己免疫疾患又は状態の例としては、限定されるものではないが、癌、免疫疾患、及び慢性感染症が挙げられる。いくつかの実施形態において、個体は、医師による治療を受けている患者である。

【0168】

したがって、一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）組換え細胞；及び、（ｄ）本開示の医薬組成物；のうちの１つ又は複数を含んだ組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＩＬ－１０媒介シグナル伝達の調整のための方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、治療に有効な量の本開示の組換えポリペプチドを投与することを含む。

【0169】

他の一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、健康状態の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、（ａ）本開示の組換えポリペプチド；（ｂ）本開示の組換え核酸；（ｃ）組換え細胞；及び、（ｄ）本開示の医薬組成物；のうちの１つ又は複数を含んだ組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、治療に有効な量の本開示の組換えポリペプチドを投与することを含む。

【0170】

いくつかの実施形態において、開示される医薬組成物は、意図される投与経路に適合するように製剤される。本開示の組換えポリペプチドは経口又は吸入によって投与してもよいが、非経口経路で投与されることのほうが多いであろう。非経口経路の投与の例として、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口適用のために用いられる溶液又は懸濁液は、次の成分を含みうる：注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝液；並びに、塩化ナトリウム又はデキストロースなどの、張性を調整するための薬剤。ｐＨは、一塩基性及び／又は二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸、又は水酸化ナトリウムなどの、酸又は塩基で（例えば、約７．２～７．８、例えば７．５のｐＨに）調整してよい。非経口製剤は、ガラスもしくはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器、又は複数回用量バイアル（multiple dose vials）に封入してよい。

【0171】

本開示のこのような対象組換えポリペプチドの用量、毒性、及び治療効果は、細胞培養物又は実験動物における標準的な製薬上の手順、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％にとって致死的な用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％で治療に有効な用量）を求めるための手順により、求めることができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これを比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表わすことができる。高い治療指数を示す化合物が一般に適切である。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、未感染細胞に対する潜在的な損傷を最少にすることで副作用を減少させるため、このような化合物を患部組織の位置に向かわせる送達系の設計を注意深く行う必要がある。

【0172】

細胞培養アッセイと動物研究から得られたデータを利用して、ヒトで用いるための用量の範囲を定めることができる。このような化合物の用量は、毒性がほとんど無いか又は無毒性でＥＤ_５０を含む、循環濃度の範囲内であることが好ましい。用量は、用いる剤形と利用する投与経路に応じて、この範囲内で変えてもよい。本開示の方法において用いるいずれの化合物についても、治療に有効な用量は、まず細胞培養アッセイから見積もることができる。動物モデルにおいて、細胞培養で求めたＩＣ_５０（例えば、症状の５０％抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように用量を定めてもよい。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量を、より正確に決めることができる。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。

【0173】

本開示の対象組換えポリペプチドの治療に有効な量（例えば、有効量）は、選択されるポリペプチドによって異なる。例えば、１回量として、患者の体重１ｋｇあたり約０．００１～０．１ｍｇの範囲で投与してもよく、いくつかの実施形態においては、約０．００５、０．０１、又は０．０５ｍｇ／ｋｇを投与してもよい。いくつかの実施形態においては、６００，０００ＩＵ／ｋｇが投与される（ＩＵはリンパ球増殖バイオアッセイで求めることができ、国際単位（ＩＵ）で表される）。組成物は、１日あたり１回以上～週あたり１回以上、例えば１日おきに、投与してよい。当業者は、いくつかの因子が、対象を効果的に治療するために必要な用量とタイミングに影響を与える可能性があることを理解するであろう。それら因子の例としては、限定されるものではないが、疾患の重症度、これまでの治療、対象の全体的な健康状態及び／又は年齢、並びに、他の疾患の存在が挙げられる。さらに、治療に有効な量の本開示の対象組換えポリペプチドを用いた対象の治療には、単回治療が含まれてよく、また、連続した治療も含まれてよい。いくつかの実施形態において、組成物は、５日間にわたって８時間ごとに投与された後、２～１４日間、例えば９日間の休止期間をおいて、その後、さらに５日間にわたって８時間ごとに投与される。

【0174】

対象におけるＩＬ－１０媒介シグナル伝達を調整するための、及び／又は、健康状態の治療を、それを必要とする対象において行うための、本開示の方法の非限定的な好ましい実施形態は、次の特徴の１つ又は複数を含んでいてよい。いくつかの実施形態において、投与組成物は、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドとの比較において、細胞型が偏向したＩＬー１０シグナル伝達を対象にもたらす。より詳細に実施例に記載するように、本開示のＩＬ－１０ポリペプチドバリアントの一例である１０－ＤＥは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞型偏向性シグナル応答をもたらし、単球及びマクロファージにおいて完全ＳＴＡＴ３アゴニストとして作用する一方で、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞においては弱いＳＴＡＴ３アゴニストとして作用する。特に、ＩＬ－１０バリアントである１０－ＤＥは、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞などのバルクＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の低下をもたらす一方で、単球及びマクロファージにおけるＳＴＡＴ３抗炎症媒介機能を実質的に保持し、それによってｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とを切り離す。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＩＬ－１０ポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸置換は、バルクＰＢＭＣ、Ｂ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞におけるＩＬ－１０シグナル伝達を低下させる一方で、単球及びマクロファージにおけるＩＬ－１０シグナル伝達を実質的に保持する、細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達をもたらす。

【0175】

したがって、いくつかの実施形態において、投与組成物は、バルクＰＢＭＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞におけるＩＬ－１０シグナル伝達を低下させる一方で、単球におけるＩＬ－１０シグナル伝達を実質的に保持する、細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、細胞型偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達は、バルクＰＢＭＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞におけるＩＬ－１０シグナル伝達の低下を含む一方で、マクロファージにおけるＩＬ－１０シグナル伝達を実質的に保持する。いくつかの実施形態において、投与組成物は、対象内のバルクＰＢＭＣにおける炎症性サイトカイン産生を抑制する。いくつかの実施形態において、投与組成物は、活性化された単球上のＭＨＣ－ＩＩを下方制御する。いくつかの実施形態において、投与組成物は、ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性サイトカイン産生を抑制する。いくつかの実施形態において、投与組成物は、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性を増強しない。いくつかの実施形態において、投与組成物は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ及び／又はグランザイムＢ産生を増強しない。

【0176】

いくつかの実施形態において、投与組成物は、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドを含む組成物との比較において、例えばＳＴＡＴ３のリン酸化によって判断される、偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達をもたらす。いくつかの実施形態において、偏向性ＩＬ－１０シグナル伝達は、ＳＴＡＴ３のリン酸化が、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０ポリペプチドと比べて少なくとも１０％、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％低下することを含む。

【0177】

いくつかの実施形態において、投与組成物は、１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の低下をもたらす。ＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の非限定的な例としては、サイトカイン産生、ケモカイン産生、免疫細胞増殖、及び免疫細胞動員が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介炎症誘導機能は、遺伝子発現アッセイ、ホスホフローシグナリングアッセイ、及び／又は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による測定に基づくと、約２０％～約１００％低下する。いくつかの実施形態において、投与組成物は１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能の低下をもたらし、これは、ポリペプチドが炎症誘発性遺伝子の発現を誘導する能力に基づいて判断される。炎症誘発性遺伝子の非限定的な例として、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、グランザイムＡ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＭＩＰ１αが挙げられる。

【0178】

いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴ３媒介炎症誘発機能は（例えば、Ｄａｕｄｉ、Ｊｕｒｋａｔ、又はＹＴ－１細胞において測定した場合に）、アミノ酸置換の無い基準ＩＬ－１０と比較して、約２０％～約１００％、例えば、約２０％～約５０％、約３０％～約６０％、約４０％～約７０％、約５０％～約８０％、約４０％～約９０％、約５０％～約１００％、約４０％～約８０％、約３０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、又は約３０％～約１００％低下し、いくつかの実施形態においては、初代単球におけるＳＴＡＴ３媒介機能を有意に変化させない。

【0179】

いくつかの実施形態において、投与組成物は、１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介機能を実質的に保持する。ＳＴＡＴ３媒介機能の例としては、限定されるものではないが、単球及びマクロファージの活性化の抑制、サイトカイン産生、ケモカイン産生、及びＭＨＣ発現が挙げられる。いくつかの実施形態において、投与組成物は、実質的に、１つ又は複数のＳＴＡＴ３媒介機能を保持し、これは、ポリペプチドがＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、及びＨＬＡ－ＤＲなどのバイオマーカーの発現を抑制する能力に基づいて判断される。

【0180】

いくつかの実施形態において、投与組成物は、前記対象における、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、グランザイムＡ、パーフォリン、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＭＩＰ１αから選択される炎症誘発性遺伝子の発現を誘導する能力の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、投与組成物は、その、対象におけるＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、及びＨＬＡ－ＤＲから選択される遺伝子の発現を低下させる能力を実質的に保持する。いくつかの実施形態において、医薬組成物の投与は、対象におけるＴ細胞活性を活性化しない。

【0181】

いくつかの実施形態において、投与組成物は、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫を増強する。いくつかの実施形態において、投与組成物は、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫、上皮保護、及び再生を増強する。いくつかの実施形態において、状態は、癌、免疫疾患、自己免疫疾患、又は慢性感染症である。

【0182】

いくつかの実施形態において、健康状態の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、その健康状態が癌である方法が本明細書に提供される。癌という語は、一般に、制御されない増殖、不死、転移能、速い成長及び増殖速度、及び、特定の形態的特徴などの、癌を引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在のことを指す。癌細胞は集合して腫瘍を形成しているのが観察されることが多いが、このような細胞は動物対象内で個々に存在している場合もあり、また、白血病細胞などの非腫瘍形成性の癌細胞である場合もある。したがって、「癌」という語が表すものには、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、又は転移巣が包含される場合がある。本明細書で用いられる「癌」という語には、前癌状態や悪性癌も含まれる。いくつかの実施形態において、癌は固形腫瘍、軟部組織腫瘍、又は転移巣である。

【0183】

いくつかの実施形態において、癌の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、癌が、急性骨髄性白血病、未分化リンパ腫、星状細胞腫、Ｂ細胞癌、乳癌、結腸癌、上衣腫、食道癌、神経膠芽腫、神経膠腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、マントル細胞リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、乏突起膠腫、卵巣癌、膵臓癌、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、腎臓癌、肉腫、胃癌、癌腫、中皮腫、及び肉腫からなる群より選択される方法が、本明細書において提供される。

【0184】

いくつかの実施形態において、免疫疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、甲状腺炎、クローン病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、円形脱毛症、乾癬、白斑、栄養障害性表皮水疱症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、乾癬性関節炎、及び糖尿病性足潰瘍からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、対象は哺乳類である。いくつかの実施形態において、哺乳類はヒトである。いくつかの実施形態において、対象はＩＬ－１０媒介シグナル伝達と関連した状態を有するか、又は有する疑いがある。

【0185】

いくつかの実施形態において、健康状態の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、健康状態が、細菌、微少菌類、又はウイルスなどの微生物による慢性感染症などの慢性炎症状態と関連した悪性疾患である方法が、本明細書に提供される。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、敗血症などの細菌感染と関連した悪性疾患を治療するための方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、慢性ウイルス感染症と関連した悪性疾患を治療するための方法に関する。慢性ウイルス感染症と関連した悪性疾患の非限定的な例として、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）及びサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ウイルス感染症は呼吸器感染症である。いくつかの実施形態において、感染症は、ヒトＯｒｔｈｏｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属の種、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ科の種、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科の種、又はＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のサブタイプに属するウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態において、オルソミクソウイルスはインフルエンザＡウイルス又はパラインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態において、インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２，Ｈ２Ｎ２，Ｈ３Ｎ１，Ｈ３Ｎ２，Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、及びＨ１０Ｎ７からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、パラインフルエンザウイルスは、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及びＨＰＩＶ－４のサブタイプからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、感染症はコロナウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態において、コロナウイルスはβ－ＣｏＶ重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）又は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。いくつかの実施形態において、コロナウイルスβ－ＣｏＶ感染症は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルスＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びコウモリＳＬ－ＣｏＶ－ＷＩＶ１などの、その全ての系統を含む）からなる群より選択されるＳａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ亜属、並びに、ＴｙｌｏｎｙｃｔｅｒｉｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ４（ＢｔＣｏＶ－ＨＫＵ４）、ＰｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ５（ＢｔＣｏＶ－ＨＫＵ５）、及び中東呼吸器症候群関連コロナウイルスＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の種を含む）からなるＭｅｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ亜属のうち、１つ又は複数と関連したものである。いくつかの実施形態において、ヒトオルソミクソウイルスはヒトＲＳウイルス（ＨＲＳＶ）である。いくつかの実施形態において、ＨＲＳＶはサブタイプＡ及び／又はサブタイプＢと関連したものである。

【0186】

追加の治療法
上記で議論するように、本明細書に記載の組換えポリペプチド、核酸、組換え細胞、細胞培養物、及び／又は医薬組成物のいずれか１つを、化学療法薬、抗癌剤、免疫抑制剤（immunosuppressive agents）、免疫抑制薬（immunosuppressants）、又は抗炎症薬などの、１つ又は複数の治療薬と組み合わせて投与してもよい。１つ又は複数の追加の治療薬と「組み合わせて」投与することには、同時（並行）投与、及び、任意の順番での連続投与が含まれる。いくつかの実施形態において、前記の１つ又は複数の追加の治療薬、化学療法薬、抗癌剤、免疫抑制薬、又は抗炎症薬は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、トキシン療法、手術、及び疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）からなる群より選択される。様々な種類の抗炎症薬を使用することができる。非限定的な例として、サイトカインアンタゴニスト、サイトカイン受容体アンタゴニスト、可溶性受容体、インテグリンアンタゴニスト、コルチコステロイド、キナーゼ阻害剤、Ｓ１Ｐアゴニスト、及びＰＤＥ４アンタゴニストが挙げられる。

【0187】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療法は、さらに、炎症性免疫応答を抑制する組成物、例えば抗炎症薬、の投与を含む。適した抗炎症薬の例としては、限定されるものではないが、ＴＮＦアンタゴニスト（アダリムマブ及びインフリキシマブなど）、ＩＬ－２３アンタゴニスト（ウステキヌマブなど）、ＩＬ－１７アンタゴニスト（セクキヌマブなど）、ＩＬ－１アンタゴニスト（アナキンラなど）、ＩＬ－６アンタゴニスト（トシリズマブなど）、ＩＬ－１２アンタゴニスト（ウステキヌマブなど）、ＩＬ－２アンタゴニスト（ダクリズマブなど）、インテグリンアンタゴニスト（ベドリズマブなど）、コルチコステロイド（プレドニゾンなど）、アミノサリチル酸（メサラミン、バルサアジド、及びオルサラジンなど）、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、クロロキン、カルシニューリン阻害薬（シクロスポリン及びタクロリムス）、アバタセプト、リツキシマブ、ＪＡＫ阻害薬（トファシチニブなど）、ＰＤＥ４阻害薬（アプレミラストなど）、ｍＴＯＲ阻害薬（シロリムスなど）、及びＳ１Ｐ受容体アゴニスト（オザニモドなど）などが挙げられる。

【0188】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療法は、さらに、Ｗｎｔアゴニスト又はＮｏｔｃｈアゴニストなどの組織再生因子を含んだ組成物の投与を含む。

【0189】

「化学療法」及び「抗癌剤」は、本明細書で互換的に用いられる。様々な種類の抗癌剤を使用することができる。非限定的な例として、アルキル化剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ポドフィロトキシン、抗体（例えばモノクローナル又はポリクローナル）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばメシル酸イマチニブ（Gleevec（登録商標）又はGlivec（登録商標）））、ホルモン治療薬、可溶性受容体、及び他の抗腫瘍薬が挙げられる。

【0190】

トポイソメラーゼ阻害剤も、本明細書において使用できる他の種類の抗癌剤である。トポイソメラーゼは、ＤＮＡのトポロジーを維持するために必須の酵素である。Ｉ型又はＩＩ型トポイソメラーゼの阻害により、ＤＮＡの適切なスーパーコイル形成が乱され、ＤＮＡの転写と複製の両者が妨げられる。Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤の例として、イリノテカンやトポテカンなどのカンプトテシン類が挙げられる。ＩＩ型阻害剤の例としては、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、及びテニポシドなどが挙げられる。これらは、アメリカハッカクレン（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ）の根に天然に存在するアルカロイドである、エピポドフィロトキシンの半合成誘導体である。

【0191】

抗腫瘍薬としては、免疫抑制剤のダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、及びイホスファミドなどが挙げられる。抗腫瘍薬は、一般に、細胞のＤＮＡを化学的に修飾することによって作用する。

【0192】

アルキル化剤は、細胞内に存在する条件で、多くの求核性官能基をアルキル化することができる。シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンはアルキル化剤である。これらは生物学的に重要な分子のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、及びリン酸基と共有結合を形成することにより、細胞機能を損なわせる。

【0193】

ビンカアルカロイドは、チューブリンの特定の部位に結合し、チューブリンが微小管に集合するのを阻害する（細胞周期のＭ期）。ビンカアルカロイドとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、及びビンデシンなどが挙げられる。

【0194】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される治療法は、さらに、１つ又は複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物の投与を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ又は複数の免疫チェックポイント分子としては、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、及びＴＩＭ３、並びに、それらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記１つ又は複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物は、アンタゴニスト抗体を含む。いくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗体は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、トレメリムマブ、又はアベルマブである。

【0195】

代謝拮抗薬は、プリン（アザチオプリン、メルカプトプリン）又はピリミジンに類似しており、細胞周期の「Ｓ」期にこれらの物質がＤＮＡに組み込まれるのを妨げ、正常な成長と分裂を停止させる。代謝拮抗薬はＲＮＡ合成にも影響を与える。

【0196】

植物アルカロイド及びテルペノイドは植物から得られ、微小管の機能を妨げることで細胞分裂をブロックする。微小管は細胞分裂に不可欠なものであるため、それ無しには細胞分裂は起こらない。主な例としては、ビンカアルカロイド類及びタキサン類が挙げられる。ポドフィロトキシンは植物由来の化合物であり、消化を助けることが報告されているほか、エトポシド及びテニポシドという２種類の他の細胞増殖抑制剤を製造するのにも使用されている。これらは、細胞がＧ１期（ＤＮＡ複製の開始）に入るのを妨げ、ＤＮＡの複製（Ｓ期）を妨げる。

【0197】

タキサン類のグループには、パクリタキセル及びドセタキセルが含まれる。パクリタキセルは天然の産物であり、元々はタキソールとして知られ、タイヘイヨウイチイ（Pacific Yew tree）の樹皮から初めて得られた。ドセタキセルは、パクリタキセルの半合成類似体である。タキサン類は、微小管の安定性を高め、後期における染色体の分離を妨げる。

【0198】

いくつかの実施形態において、抗癌剤は、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン（Decadron（登録商標））、ステロイド類、ゲムシタビン、シスプラチン、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、グリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキサート、ゲフィチニブ（Iressa（登録商標））、タキソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、ＣＰＴ－１１、インターフェロンアルファ、ペグインターフェロンアルファ（例えば、PEG INTRON-A）、カペシタビン、シスプラチン、チオテパ、フルダラビン、カルボプラチン、リポソーマルダウノルビシン、シタラビン、ドキセタキソール、パクリタキセル、ビンブラスチン、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート、ビアキシン、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））、ビスホスホネート、三酸化ヒ素、ビンクリスチン、ドキソルビシン（Doxil（登録商標））、パクリタキセル、ガンシクロビル、アドリアマイシン、リン酸エストラムスチンナトリウム（Emcyt（登録商標））、スリンダク、エトポシド、及びそれらの任意の組み合わせから選択してよい。

【0199】

他の実施形態において、抗癌剤は、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、インターフェロンアルファ、レナリドミド、メルファラン、ペグインターフェロンアルファ、プレドニゾン、サリドマイド、又はビンクリスチンから選択してよい。

【0200】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療法は、免疫療法をさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫療法は、１つ又は複数のチェックポイント阻害剤の投与を含む。したがって、本明細書に記載の治療法のいくつかの実施形態は、１つ又は複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物の投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記１つ又は複数の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物は、アンタゴニスト抗体を含む。いくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗体は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、トレメリムマブ、又はアベルマブである。

【0201】

いくつかの態様において、前記１つ又は複数の抗癌治療には、放射線療法が含まれる。いくつかの実施形態において、放射線療法は、癌細胞を死滅させるための放射線の適用を含んでいてよい。放射線は、ＤＮＡなどの細胞内の分子と相互作用して、細胞死を誘導する。放射線は、また、細胞膜及び核膜、並びに他の細胞小器官を損傷しうる。放射線の種類によってＤＮＡ損傷のメカニズムが異なる場合があり、生物学的効果比についても同様である。例えば、重粒子（すなわち、陽子及び中性子）はＤＮＡに直接損傷を与え、より高い生物学的効果比を有する。電磁放射は、主に細胞内の水のイオン化によって生成される短命のヒドロキシルフリーラジカルを介して作用する、間接的なイオン化をもたらす。放射線の臨床応用には、（外部線源からの）外部照射法と、（患者の体内に埋め込まれた、又は挿入された線源を用いる）近接照射療法がある。外部照射法はＸ線及び／又はガンマ線を用い、一方、近接照射療法は、崩壊によってガンマ線以外にアルファ粒子又はベータ粒子を放出する放射性原子核を用いる。本明細書で意図する放射線療法には、例えば、放射性同位元素を癌細胞に向けて送達することも含まれる。マイクロ波及びＵＶ照射など、他の形態のＤＮＡ損傷因子も本明細書において意図される。

【0202】

放射線は、１回の適用でもよいし、線量を分割するスケジュールによって、低放射線量を連続して適用してもよい。本明細書が意図する放射線量は、約１～約１００Ｇｙの範囲であり、例えば、約５～約８０、約１０～約５０Ｇｙ、又は約１０Ｇｙなどである。総線量を、分割した様式で適用してもよい。例えば、その様式には、分割された個別の線量として、２Ｇｙが含まれていてもよい。放射性同位体の線量の範囲は、同位体の半減期、及び放出される放射線の強度と種類によって大きく異なる。放射線療法が放射性同位体の使用を含む場合、同位体を、放射性ヌクレオチドを標的組織（例えば、腫瘍組織）に運ぶ治療抗体などのターゲティング剤に結合してもよい。

【0203】

本明細書に記載される手術には、癌組織の全部又は一部を物理的に除去、切断、及び／又は破壊する切除術が含まれる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍の切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡下手術（モース手術）が含まれる。前癌又は正常組織の除去も本明細書において意図される。

【0204】

したがって、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、組成物を、第一治療として対象に個別に投与するか、又は、第二治療を組み合わせて行う。いくつかの実施形態において、第二治療は、化学療法、放射線療法、ＤＭＡＲＤｓ、免疫療法、ホルモン療法、トキシン療法、及び手術からなる群より選択される。いくつかの実施形態においては、第一治療と第二治療とを併用する。いくつかの実施形態においては、第一治療を第二治療と同時に適用する。いくつかの実施形態においては、第一治療と第二治療とを順次適用する。いくつかの実施形態においては、第一治療を第二治療の前に適用する。いくつかの実施形態においては、第一治療を第二治療の後に適用する。いくつかの実施形態においては、第一治療を第二治療の前及び／又は後に適用する。いくつかの実施形態においては、第一治療と第二治療とをローテーションで適用する。いくつかの実施形態においては、第一治療と第二治療とを、単一の製剤でまとめて適用する。

【0205】

キット
本明細書に提供され、記載される、ＩＬ－１０部分アゴニスト、組換え核酸、組換え細胞、又は医薬組成物を含んだキットも、それらの製造及び使用のための説明書とともに、本明細書において提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリペプチド、本開示のＩＬ－１０部分アゴニスト、本開示の組換え核酸、本開示の組換え細胞、又は本開示の医薬組成物；及び、その使用のための説明書；のうちの１つ又は複数を含んだキットが、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本開示のキットは、さらに、提供された組換え核酸、組換え細胞、又は医薬組成物のいずれか１つを個体に投与するのに用いる、１つ又は複数の注射器（充填済注射器を含む）及び／又はカテーテル（充填済注射器を含む）；並びに、その使用のための説明書；を含む。いくつかの実施形態において、キットは、所期の目的、例えば、細胞の活性の調整、標的癌細胞の阻害、又は疾患の治療を、それを必要とする個体において行う目的のために、キットの他の成分と同時に又は順次投与してよい、１つ又は複数の治療薬を有していてよい。

【0206】

上に記載したキットのいずれも、１つ又は複数の追加の試薬をさらに含んでいてよく、このような追加の試薬は、希釈バッファー、懸濁溶液（reconstitution solutions）、洗浄バッファー、コントロール試薬、コントロール発現ベクター、ネガティブコントロールポリペプチド、ポジティブコントロールポリペプチド、及び、組換えポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成のための試薬から選択してもよい。

【0207】

いくつかの実施形態において、キットの各構成要素を別々の容器で提供してよい。他のいくつかの実施形態において、キットの構成要素を単一の容器にまとめてもよい。例えば、本開示のいくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の組換えＩＬ－１０ポリペプチド、組換え核酸、組換え細胞、又は医薬組成物の１つ又は複数を、１つの容器に（例えば、滅菌済ガラス又はプラスチックバイアル中に）含み、さらなる治療薬を他の容器に（例えば、滅菌済ガラス又はプラスチックバイアル中に）含む。

【0208】

いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法を実施するためにキットの構成要素を用いるための、説明書をさらに含んでいてよい。例えば、キットは、キット内の医薬組成物及び剤形に関する情報を含む、添付文書を含んでいてよい。一般に、このような情報は、患者や医師が、同封の医薬組成物及び剤形を、効果的かつ安全に使用するための手助けとなる。例えば、添付文書には、本開示の組み合わせに関する次の情報が提供されてもよい：薬物動態、薬力学、臨床試験、有効性パラメーター、適応症と用法、禁忌、警告、注意事項、有害反応、過量、適切な用法・用量、供給方法、適切な保管条件、参考文献、製造業者／販売業者の情報、及び、知的財産情報。

【0209】

いくつかの実施形態において、キットは、さらに、方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書を含んでいてよい。方法を実施するための説明書は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙又はプラスチックなどの基材に印刷してもよい。説明書は、例えば、添付文書としてキット内に存在してもよく、キットの容器又はその構成要素の（例えば、パッケージ又はサブパッケージ関連の）ラベル内に存在してもよい。説明書は、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存在してもよい。いくつかの例においては、実際の説明書はキット内に存在しないが、遠隔ソースから（例えば、インターネット経由で）説明書を取得する手段を提供してもよい。この実施形態の一例として、説明書を閲覧することができる、及び／又は説明書をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含むキットが挙げられる。説明書と同様に、この説明書を得るための手段も、適した基材上に記録されていてよい。

【0210】

本開示で言及される全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が具体的かつ個別に参照によって援用されることが明示された場合と同程度に、参照によって本明細書に援用されるものとする。

【0211】

本明細書で引用されているどの参考文献も、先行技術を構成すると認めるものではない。参考文献に関する議論は、その著者が何を主張しているかを述べているのであり、出願人は、引用されている文献の正確さと妥当性に異議を申し立てる権利を有する。本明細書では、学術誌の論文、特許文献、及び教科書などの多数の情報源に言及しているが、この言及は、これら文献のいずれについても、当該分野に共通の一般的知識の部分を形成していると認めるものではないことが明確に理解されるであろう。

【0212】

本明細書に示す一般的な方法に関する議論は、単に説明を目的としたものである。他の代替法又は代替物も、本開示を読んだ当業者にとっては明らかであろう。したがって、それらも本出願の趣旨と範囲内に含まれる。

【実施例】

【0213】

本発明の実施においては、特に断りのない限り、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学における、当業者に周知の、従来の技術が利用される。このような技術は，例えば、Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning:A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning:A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory (本明細書では、まとめて“Sambrook”と呼ぶ)；Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY:Wiley (including supplements through 2014)；Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY:Wiley-Liss；Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego:Academic Press；Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors:Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA:Academic Press；Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA:Academic Press；Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY:Wiley；Mullis, K. B., Ferre, F. & Gibbs, R. (1994). PCR:The Polymerase Chain Reaction. Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield, E. A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press；Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY:Wiley, (including supplements through 2014)；及び、Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.などの文献に充分に説明されており、これら文献の開示は参照により本明細書に援用されるものとする。

【0214】

以下の実施例に、さらなる実施形態をより詳細に開示する。これは説明の目的で提供されるものであり、本開示又は特許請求の範囲を限定することを何ら意図するものではない。

【0215】

実施例１
全体的な実験手順
タンパク質の製造及び精製
酵母結合分析及びＳＰＲのため、ヒトＩＬ－１０Ｒα（２－２３５）及びＩＬ－１０Ｒβ（２０－２２０）のＥＣＤを、Ｎ末端ＧＰ６４シグナルペプチド、Ｃ末端３Ｃ切断部位とそれに続くビオチンアクセプターペプチドタグ（ＢＡＰタグ、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷ、配列番号３１）、及び６×Ｈｉｓタグとともに、ｐＡｃＧＰ６７ａバキュロウイルスベクターにクローニングした。バキュロウイルスのストックは、BestBac（商標）ＤＮＡ（Expression Systems）及びｐＡｃＧＰ６７－Ａ ＤＮＡをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）にコトランスフェクトすることによって調製した。次いで、ウイルスを用いてＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉ５）細胞を感染させた。感染から７２時間後、バキュロウイルスに感染したＨｉ５細胞の上清からタンパク質を精製し、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Qiagen）を用いて精製を行い、次いで、Superdex 200カラム（GE）上でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。タンパク質は、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）中で維持した。ＩＬ－１０ＲβＥＣＤを、ＢｉｒＡリガーゼを用いて、Ｃ末端ＢＡＰタグにおいて部位特異的にビオチン化し、サイズ排除クロマトグラフィーによって再精製した。

【0216】

クライオ電子顕微鏡構造分析のため、ＩＬ－１０Ｒβ ＥＣＤの糖変異体（glyco-mutant）バージョン（図６Ａ）を、Ｎ末端ＧＰ６４シグナルペプチド及びＣ末端６×ＨｉｓタグとともにｐＡｃＧＰ６７ａバキュロウイルスベクターにクローニングし、上記のように発現及び精製を行った後、Superdex 200カラム（GE）上でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。親和性成熟したＩＬ－１０（「スーパー１０」、クローン５．１）及びＩＬ－１０Ｒα ＥＣＤを、Ｎ末端ＨＡシグナルペプチド及びＣ末端６×Ｈｉｓタグを含むｐＤ６４９哺乳類発現ベクターにクローニングした。ＤＮＡの、Ｅｘｐｉ－２９３Ｆ細胞（Thermo Fisher Scientific）への一過性トランスフェクションを、Expifectamineトランスフェクション試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。トランスフェクションのおよそ７２～９６時間後、細胞上清を回収し、タンパク質をＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Qiagen）を用いて精製した後、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）中において、Superdex 200カラム（GE）上でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。ＳＥＣの後、個々のタンパク質を、１：１：１．２のモル比のＩＬ－１０：ＩＬ－１０Ｒα：ＩＬ－１０Ｒβで一晩インキュベートし、ＳＥＣによりS200カラム（GE）上で再精製した。

【0217】

シグナル伝達及び機能実験のため、ＩＬ－１０バリアントを、Ｎ末端ＨＡシグナルペプチド及びＣ末端６×Ｈｉｓタグを含むｐＤ６４９哺乳類発現ベクターにクローニングした。ＤＮＡの、Ｅｘｐｉ－２９３Ｆ細胞（Thermo Fisher Scientific）への一過性トランスフェクションを、Expifectamineトランスフェクション試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。トランスフェクションのおよそ７２～９６時間後、細胞上清を回収し、タンパク質をＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Qiagen）を用いて精製した後、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）中において、Superdex 200カラム（GE）上でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。

【0218】

表面プラズモン共鳴
親和性成熟したＩＬ－１０クローン５．１を単独で用いた際の、又は、可溶性ＩＬ－１０Ｒαにあらかじめ結合した際の、ＩＬ－１０Ｒβ結合の解離定数（Ｋ_Ｄ）を、BIAcore T100装置（GE Healthcare）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって求めた。まず、ビオチン化ＩＬ－１０Ｒβを、ストレプトアビジン被覆（ＳＡ）センサーチップ（GE Healthcare）上に、１００レゾナンスユニット（ＲＵ）の範囲の固定化密度でキャプチャーした。同様に、リファレンス減算（reference subtraction）用に、コントロールフローセルをオフターゲットタンパク質（EpoR）で作成した。結合速度を、２５℃において、５０μｌ／分の流速で測定した。ＩＬ－１０又はＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒα複合体を、０．００５％ P20界面活性剤（GE Healthcare）を添加したＨＢＳ緩衝液中で段階希釈し、ＳＡチップ上に注入した。解離速度を、リガンド親和性に基づき、必要に応じて１００～５００秒間測定した。定常状態親和性（steady state affinity）を、BIAcore T100評価ソフトウェアを用いて求めた。動的結合曲線（kinetic binding curves）を、Prism 8（GraphPad）で時間依存反応単位（time-dependent response units）をプロットすることにより、生成した。

【0219】

細胞培養
ＴＨＰ－１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－２０２）、ＹＴ－１（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿ＥＪ０５）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）、及びＤａｕｄｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２１３）細胞を、いずれも、１０容量％のウシ胎児血清、ペニシリンーストレプトマイシン、及び、２ｍＭのGlutaMAX（商標）（Gibco）を添加した、ＲＰＭＩ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で増殖させた。細胞を３７℃にて、５％ＣＯ_２中で維持した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、無血清Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Thermo Fisher Scientific）中で増殖させ、３７℃にて、５％ＣＯ_２中で維持した。

【0220】

細胞株におけるホスホフローシグナリングアッセイ
ＴＨＰ－１、ＹＴ－１、Ｊｕｒｋａｔ、及びＤａｕｄｉ細胞を９６穴プレートにプレーティングし、ＷＴ又は変異型ＩＬ－１０で２０分間、３７℃にて刺激した後、パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciences）で１０分間、室温にて固定した。細胞内染色のための、細胞の透過処理を、氷冷メタノール（Fisher）を用いて３０分間、－２０℃にて行った。その後、細胞を、１：５０希釈のAlexa Fluor 647結合抗Ｓｔａｔ３（ｐＹ７０５）抗体（BD Biosciences）とともに、autoMACS緩衝液（Miltenyi）中で１時間、室温にてインキュベートした。非刺激試料のバックグラウンド蛍光を、全ての試料から減算した。データは、CytoFlexフローサイトメーター装置（Beckman Coulter）を用いて取得した。ＭＦＩ値を、各実験における極大のＷＴ ＩＬ－１０値に対して正規化し、Prism 8（GraphPad）でプロットした。用量反応曲線を「シグモイド用量反応」分析を用いて生成した。

【0221】

autoMACS緩衝液中に生細胞を再懸濁し、Human TruStain FcX（Biolegend）とともにインキュベートした後、抗ヒトIL-10Rα AlexaFluor 647（BD Biosciences）及び抗ヒトIL-10Rβ AlexaFluor 488（R&D）抗体とともに３０分間、４℃にてインキュベートすることにより、受容体の表面発現を分析した。蛍光強度を、フローサイトメトリーによってAccuri C6サイトメーター（BD Biosciences）上で測定し、データをFlowJoソフトウェア（BD Biosciences）を用いて分析した。

【0222】

ヒトＰＢＭＣにおけるホスホフローシグナリングアッセイ
加温した培地内でＰＢＭＣを融かし、０．５×１０^６生細胞／ｍＬで再懸濁した。９６穴のディープウェルプレート内に、細胞をウェルあたり２００μｌプレーティングした。３７℃で２時間静置後、細胞を各種濃度のＷＴ又は変異型ＩＬ－１０で刺激し、３７℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＭＣをパラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciences）で１０分間室温にて固定し、細胞内染色のための透過処理を、氷冷メタノール（Fisher）を用いて－２０℃で３０分間行った。細胞を、autoMACS緩衝液(Miltenyi）を用いて洗浄し、ヒトTruStain FcX（Biolegend）とともにインキュベートし、その後、次の抗体で染色した：CD3 Pacific Blue（BD）、CD4 PerCP-Cy5.5（BD）、CD20 PerCp-Cy5.5（BD）、CD33 PE-Cy7（BD）、pSTAT-3(Y705) AlexaFluor 647（BD）、及びIL-10Rβ AlexaFluor 488（R&D）。その後、試料を洗浄し、autoMACS緩衝液中に再懸濁した。データをCytoFlexフローサイトメーター装置（Beckman Coulter）を用いて取得し、FlowJoソフトウェア（BD Biosciences）を用いて分析した。ＭＦＩ値を、各細胞型における極大のＷＴ ＩＬ－１０値に対して正規化し、Prism 8（GraphPad）でプロットした。用量反応曲線を「シグモイド用量反応」分析を用いて生成した。細胞を、前方対側方散乱（forward versus side scatter）プロファイルに基づいて生細胞に対してゲーティングし、次いで、先に記載のように細胞サブセット特異的ゲーティングを行った。

【0223】

ヒトＰＢＭＣ、単球、及びマクロファージのＬＰＳ刺激
バルクＰＢＭＣの刺激のため、加温した培地内でＰＢＭＣを融かし、２回洗浄して、１×１０^７細胞／ｍｌで完全ＲＰＭＩ内に再懸濁した。細胞を、２４穴培養皿に、５００μｌ／ウェルでプレーティングし、３７℃で２時間静置した。その後、細胞を、１ｎＭのＬＰＳ（Sigma）単独とともに、又はさらに１０ｎＭのＩＬ－１０（ＷＴ又は変異型）を加えて、２４時間インキュベートした。サイトカイン測定のため、細胞上清を単離し、ＴＮＦ－α（Thermo Fisher Scientific）、ＩＬ－６（R&D）、及びＣＸＣＬ８（R&D）の濃度を、ＥＬＩＳＡによって使用説明書に従い測定した。

【0224】

単球のＨＬＡ－ＤＲ発現については、細胞を洗浄してautoMACS緩衝液中に再懸濁し、ヒトTruStain FcX（Biolegend）とともにインキュベートし、CD14 PE-Cy7（BD）及び抗HLA-DR BV605抗体で４℃で３０分間染色した。蛍光強度をCytoFlexフローサイトメーター装置（Beckman Coulter）を用いて測定し、FlowJoソフトウェア（BD Biosciences）を用いて分析した。細胞を、前方対側方散乱プロファイルに基づいて生細胞に対してゲーティングし、次いで、単球特異的ゲーティング（ＣＤ１４^＋）を行った。

【0225】

初代ヒトマクロファージの分析のため、加温した培地内でＰＢＭＣを融かし、２回洗浄して、完全ＲＰＭＩ内に再懸濁し、６穴組織培養皿に１×１０^７細胞／ウェルでプレーティングし、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＭ－ＣＳＦ内でインキュベートした。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、単球をプレートに付着させた。培地を吸引して非接着細胞を除去し、細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを含んだ新鮮な培地中で、３７℃にて６日間インキュベートした。その時点で目視により、大部分の接着細胞が明確にマクロファージの形態を有していることが認められた。その後、細胞を、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ単独により、又はさらに１０ｎＭのＩＬ－１０（ＷＴ又は変異型）を加えて、２４時間刺激した。細胞上清を単離し、ＴＮＦ－α（Ｔhermo Fisher Scientific）、ＩＬ－６（R&D）、及びＣＸＣＬ８（R&D）の濃度を、ＥＬＩＳＡによって使用説明書に従い測定した。

【0226】

ＣＤ８＋ Ｔ細胞による、ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢ誘導
MACS LSカラム（Miltenyi）を用いた磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）と、ヒトＣＤ８＋単離キット（Miltenyi）とを組み合わせて、ヒトＰＢＭＣからのＣＤ８＋ Ｔ細胞の単離を使用説明書に従って行った。ＩＬ－１０によるＩＦＮ－γ及びグランザイムＢ産生の増強を、先の記載のように行った。簡単に述べると、単離されたＣＤ８＋ Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ１）であらかじめ被覆された６穴組織培養皿に、２×１０^６細胞／ｍｌで播種し、可溶性抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ）とともに３日間インキュベートした。その後、細胞を回収し、１０ｎＭ組換えＩＬ－１０（ＷＴ又は変異型）を添加した、又は添加しない、２４穴組織培養皿の新鮮な培地中に、１×１０^６細胞／ｍｌで再播種し、さらに３日間インキュベートした。その後、細胞を、可溶性抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ１、１μｇ／ｍｌ）で４時間再刺激した。その後、上清を単離し、ＩＦＮ－γ（Thermo）及びグランザイムＢ（R&D）の濃度を、ＥＬＩＳＡによって使用説明書に従い測定した。

【0227】

実施例２
六量体ＩＬ－１０／ＩＬ１０Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβ複合体のクライオ電子顕微鏡構造
この実施例には、六量体受容体複合体ＩＬ－１０／ＩＬ１０Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβの結晶構造を決定するために行った実験の結果を記載する。これは、ヘテロマー受容体複合体の、それぞれのサイトカイン－受容体相互作用が、どのように化学的に駆動されているのかを解明する手助けとなる。

【0228】

ＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒβ結合界面の詳細な観察によって明らかになったところによると、中心接触（central contact）がループＬ３の１０Ｒβ－Ｔｙｒ^８２によって形成され、これは、ＩＬ－１０ヘリックスα１及びα３の間に挿入されて、主に、ＩＬ－１０のヘリックスα１のＭｅｔ^２２とのファンデルワールス接触を促進する（図２Ｄ）。以前の変異誘発及びモデリング研究においても、１０Ｒβ－Ｔｙｒ^８２が、ＩＬ－１０ＲβとＩＬ－１０との間の相互作用に必要であることが示唆されていた。この鍵となる疎水性接触は極性及び静電相互作用のネットワークによって囲まれており、これは１０Ｒβ－Ｇｌｎ^６３及び１０Ｒβ－Ｌｙｓ^８１をそれぞれ結合する、ヘリックスα１のＩＬ－１０残基Ａｓｎ^２１及びＡｓｐ^２５によって部分的に媒介されている（図２Ｄ及び２Ｅ）。Ｌ３の直上では、ＩＬ－１０ＲβのループＬ２の１０Ｒβ－Ｔｙｒ^５９が、同様にＩＬ－１０ヘリックスα２及びα３間に挿入されて、α２のいくつかの残基を結合しており、一方、ＩＬ－１０のα３のＧｌｕ^９６は１０Ｒβ－Ｌｙｓ^６５を結合している（図２Ｅ）。ＩＬ－１０の先端においては、ＩＬ－１０ＲβのＤ２のループＬ５が「親指」様突起を形成してＩＬ－１０ヘリックスα１の前面に沿って伸長しており、１０Ｒβ－Ｔｙｒ^１４０とＩＬ－１０残基Ａｒｇ^３２との間の見掛け上のパイスタッキング接触、及び、１０Ｒβ－Ａｓｎ^１４７とＩＬ－１０のＡｓｎ^２１との間の水素結合接触を促進している（図２Ｃ及び２Ｄ）。

【0229】

スーパー１０の、ＩＬ－１０Ｒβに対する増加した親和性は、主に、Ｎ１８Ｙ及びＲ１０４Ｗ変異の結果であることが分かった。これらの変異は両者ともＭｅｔ^２２に隣接しており、１０Ｒβ－Ｔｙｒ^８２が存在するこの中心接触部位の疎水性を増強している（図２Ｄ）。一方、Ｎ９２Ｑ及びＴ１００Ｄ変異はそれぞれ、１０Ｒβ－Ｇｌｎ^６３及び１０Ｒβ－Ｓｅｒ^８０との水素結合接触を促進し、ＷＴ ＩＬ－１０複合体中に存在する接触を増強していると思われる（図２Ｄ及び２Ｅ）。

【0230】

いずれの特定の理論にも拘束されるものではないが、全体として、スーパー１０における親和性増強変異は、新たな接触部位を生成するのではなく、主に、ＷＴ ＩＬ－１０とＩＬ－１０Ｒβとの間にある既存の極性及び非極性接触を向上させているようである。

【0231】

実施例３
ＩＬ－１０受容体部分アゴニストの、構造に基づく設計
この実施例には、上記実施例３に記載のヘテロマーＩＬ－１０／ＩＬ１０Ｒ１／ＩＬ１０Ｒβ複合体のクライオ電子顕微鏡構造に基づいてＩＬ－１０受容体部分アゴニストを設計するために行われた実験を記載する。

【0232】

ＩＬ－１０シグナル伝達における、上記したＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒβ接触の重要性を評価するため、ＩＬ－１０Ｒβとの相互作用を弱めると予想されるＷＴ ＩＬ－１０内の一連の変異を設計し、ＳＴＡＴ３のリン酸化を介したシグナル伝達を開始する能力についてそれらを評価した。Ａｓｐ^２５の、アラニン（Ｄ２５Ａ）又はリジン（Ｄ２５Ｋ）への変異は、Ｂ細胞由来Ｄａｕｄｉ細胞において、ＷＴ ＩＬ－１０と比べ、ＳＴＡＴ３活性化のかなりの低下をもたらすことが観察された（図２Ｆ）。同様に、Ｅ９６Ｋ、Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａ、Ｎ２１Ａ／Ｒ１０４Ａ、及びＤ２５Ａ／Ｎ２１Ａ／Ｒ１０４Ａをそれぞれ含むＩＬ－１０バリアントは、いずれも、これらの細胞上で、わずかなＳＴＡＴ３リン酸化しか引き起こさなかった（図２Ｆ）。しかし注目すべきことに、Ｅ９６Ｋ以外のこれらのバリアントは、いずれも、単球由来ＴＨＰ－１細胞において強力なＳＴＡＴ３活性化を誘発し、Ｄ２５Ａ／Ｅ９６Ａバリアント（すなわち「１０－ＤＥ」）及びＤ２５Ｋバリアントは、ＴＨＰ－１及びＤａｕｄｉ細胞株の間で最大の活性の違いを示した（図３Ａ）。

【0233】

実施例４
ＩＬ－１０バリアント１０－ＤＥ及びスーパー１０は細胞型選択的シグナル伝達を引き起こす
この実施例には、本開示のいくつかの限定されない実施形態による偏向性ＩＬ－１０バリアントの一例（１０－ＤＥ）が、細胞型選択的シグナル伝達活性を引き起こすことを証明するために行った実験を記載する。

【0234】

ＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒβ相互作用の安定性を変化させることが、細胞型間でどのようにＩＬ－１０シグナル伝達活性に影響するのかについて、より完全な全体像を描くことを目的として、さらなる実験を行い、（ｉ）ＷＴ ＩＬ－１０、（ｉｉ）高親和性アゴニストスーパー１０、並びに、（ｉｉｉ）低親和性部分アゴニスト１０－ＤＥ及びＤ２５Ｋについて、免疫細胞の異なるクラスを代表する４つのＩＬ－１０応答細胞株のパネルで活性の比較を行った（図３Ｂ）。１０－ＤＥバリアント及びＤ２５Ｋバリアントは、Ｂ細胞由来Ｄａｕｄｉ細胞又はＴ細胞由来Ｊｕｒｋａｔ細胞のいずれにおいても活性を引き起こさなかったが、約５０％の活性を、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞由来ＹＴ－１細胞で誘発し、完全に近いＳＴＡＴ３活性化を骨髄ＴＨＰ－１細胞で誘発した（図３Ａ～３Ｄ）。一方、スーパー１０は、Ｄａｕｄｉ及びＪｕｒｋａｔ細胞の両者において、ＷＴ ＩＬ－１０と比較してかなり高いＥ_ｍａｘを示したが、ＹＴ－１及びＴＨＰ－１細胞においてはＷＴ ＩＬ－１０と類似のシグナル伝達を示した（図３Ａ～３Ｄ）。したがって、スーパー１０の、１０－ＤＥに対する比率では、ＳＴＡＴ３のＥ_ｍａｘは、ＴＨＰ－１細胞における約１：１からＤａｕｄｉ細胞における２０：１超まで大幅に変化し、これら細胞株間でシグナル伝達の可塑性が大きく異なることが明らかになった。

【0235】

これらの多様な細胞株間でＩＬ－１０ＲαとＩＬ－１０Ｒβの表面発現を比較したところ、ＩＬ－１０ＲαとＩＬ－１０Ｒβの濃度は、改変ＩＬ－１０バリアントによって誘導されたＳＴＡＴ３シグナル伝達の相対強度とよく相関していることが明らかになった（図３Ｅ）。いくつかの細胞株上で、スーパー１０が、ＷＴ ＩＬ－１０と比べてシグナル伝達のＥ_ｍａｘを増加させることができるという発見は、これら細胞上におけるＩＬ－１０シグナリング複合体の集合が、低いＩＬ－１０Ｒ発現によって制限されており、それがＩＬ－１０－ＩＬ－１０Ｒβ相互作用の親和性の増強によって補われうるということを示唆している。逆に、他の細胞型は、ＩＬ－１０Ｒ発現が上昇していることから、１０－ＤＥ及びＤ２５Ｋなどの低親和性ＩＬ－１０部分アゴニストに対しても強いＳＴＡＴ３応答を維持することができる（図３Ｃ）。この観察は、狭いＩＬ－１０細胞型特異性を達成するために、改変されたアゴニストを用いて活用することのできる、機能的な手段が存在することを示唆している。

【0236】

これらの多様な細胞株間でＩＬ－１０ＲαとＩＬ－１０Ｒβの表面発現を比較したところ、ＩＬ－１０ＲαとＩＬ－１０Ｒβの濃度は、改変ＩＬ－１０バリアントによって誘導されたＳＴＡＴ３シグナル伝達の相対強度とよく相関していることが明らかになった（図Ｓ６、Ｄ及びＥ）。したがって、ＩＬ－１０濃度が飽和している場合のＳＴＡＴ３活性化の程度は、受容体の発現とリガンドの親和性との組み合わせによって調節することができる（図３Ｃ）。いくつかの細胞株上で、スーパー１０が、ＷＴ ＩＬ－１０と比べてシグナル伝達のＥ_ｍａｘを増加させることができるという発見は、これら細胞上におけるＩＬ－１０シグナリング複合体の集合が、低いＩＬ－１０Ｒ発現によって制限されており、それがＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒβ相互作用の親和性の増強によって補われうるということを示唆している。逆に、他の細胞型は、ＩＬ－１０Ｒ発現が上昇していることから、１０－ＤＥ及びＤ２５Ｋなどの低親和性ＩＬ－１０部分アゴニストに対しても強いＳＴＡＴ３応答を維持することができる（図３Ｃ）。この観察は、狭いＩＬ－１０細胞型特異性を達成するために、改変されたアゴニストを用いて活用することのできる、機能的な手段が存在することを示唆している。

【0237】

実施例５
ＩＬ－１０バリアント１０－ＤＥ及びＤ２５Ｋは、ＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とをｅｘ ｖｉｖｏにおいて切り離す
この実施例には、偏向性ＩＬ－１０バリアント１０－ＤＥ及びスーパー１０がＩＬ－１０の抗炎症機能と免疫賦活機能とを切り離すことを証明するために行った実験の結果を記載する。これらの実験は、ＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性の天然の違いを利用して、初代免疫細胞集団内のＩＬ－１０の機能的多面発現性を「調整」することができるかという問題に取り組むために設計された。

【0238】

上記で説明した通り、ＩＬ－１０は多くの免疫細胞型においてシグナル伝達を開始する能力を有することから、ｉｎ ｖｉｖｏで抗炎症効果及び免疫賦活効果の両者を誘発する。ＩＬ－１０の抗炎症効果は、主に単球及びマクロファージ活性の抑制によるものである。一方、ＩＬ－１０は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激により、炎症誘発性ＩＦＮ－γ産生を促進する。下記の実験は、ＩＬ－１０シグナル伝達の可塑性の天然の違いを利用して、初代免疫細胞集団内のＩＬ－１０の機能的多面発現性を「調整」することができるかという問題に取り組むために行われた。

【0239】

フローサイトメトリーによるヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）の分析によって、ＩＬ－１０Ｒβが初代単球に高度に発現していること、そして一方で、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞においては極めて低発現であることが明らかになり、単球はより強いＩＬ－１０シグナル応答を示す可能性があることが示唆された（図４Ａ）。実際、ＩＬ－１０Ｒβに対する親和性の大きな違いにも関わらず、１０－ＤＥ及びスーパー１０バリアントは、初代単球においてＷＴ ＩＬ－１０と同等のＳＴＡＴ３活性化水準を示すことが明らかになった（図４Ｂ及び６Ｂ）。対照的に、１０－ＤＥバリアントは、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞において有意に低下したシグナル伝達を示し、これらの集団においては、ＷＴ ＩＬ－１０と比較して、３５％から５０％の間のＳＴＡＴ３活性化の誘発が見られた（図４Ｂ及び６Ｂ）。しかし、スーパー１０はＮＫ細胞において増強されたＳＴＡＴ３活性化を誘発することが分かったが、Ｂ及びＴ細胞においてはわずかに上昇したシグナル伝達しか示さず、それら細胞型においては、別の因子もＳＴＡＴ３活性化のさらなる増強を制限している可能性が示唆された（図４Ｂ）。全体として、これらのデータは、初代ヒト細胞において、スーパー１０が中程度のＮＫ細胞偏向活性を示す一方で、部分アゴニスト１０－ＤＥは、顕著な単球偏向性シグナル伝達を示すことを示している。

【0240】

単球における１０－ＤＥ及びＤ２５ＫバリアントによるＳＴＡＴ３活性化の水準がＩＬ－１０の抗炎症機能を駆動するのに充分であったかどうかを試験するため、これらのバリアントの存在下又は非存在下で、ヒトのバルクＰＢＭＣを細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激する実験をさらに行った。注目すべきことに、１０－ＤＥバリアント及びＤ２５Ｋバリアントは両者とも、ＷＴ ＩＬ－１０及びスーパー１０バリアントと同程度に、炎症誘発性サイトカインＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－６、並びにケモカインＩＬ－８の産生を阻害した（図４Ｃ及び７Ａ）。さらには、１０－ＤＥ及びＤ２５Ｋは、抗ＣＤ３抗体で活性化されたバルクＰＢＭＣにおけるＩＦＮ－γ産生を抑制し（図７Ｄ）、また、末梢血単球上のＭＨＣクラスＩＩと共刺激リガンドＣＤ８６の表面発現を下方制御する（図４Ｄ、７Ｄ、及び７Ｃ）能力を保持していた。重要なことに、１０－ＤＥバリアント及びＤ２５Ｋはまた、単離された単球由来マクロファージにおいて、自己免疫及び自己炎症性疾患におけるＩＬ－１０のキーターゲットである、ＬＰＳ誘導ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及びＩＬ－８産生を強力に抑制した（図４Ｅ）。

【0241】

１０－ＤＥバリアントの骨髄偏向活性がＬＰＳ誘発敗血症のマウスモデルにおける全身性炎症を抑制するのに充分であるかを評価するために、さらなる実験を行った。重要なことに、１０－ＤＥバリアントの単回投与により、このモデルにおける生存がＷＴ ＩＬ－１０と同程度に有意に促進されることが観察された（図７Ｅ）。さらには、１０－ＤＥバリアントが、全身性炎症のキーマーカーであるＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及びハプトグロビンの上昇を抑えたことも観察された（図７Ｆ及び７Ｇ）。

【0242】

骨髄偏向性ＩＬ－１０バリアントは、炎症性Ｔ細胞機能を促進する能力が低下している
ＩＬ－１０は炎症誘発性ＩＦＮ－γ産生を誘導することが知られており、近年の研究では、これが主にＣＤ８＋ Ｔ細胞活性の増強によって起こることが示唆されている。本明細書に記載される改変ＩＬ－１０バリアントの、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞に対する効果を分析するため、ＷＴ ＩＬ－１０、スーパー１０、又は１０－ＤＥとともに２４時間培養したＴＣＲ刺激ＣＤ８^＋ Ｔ細胞に対して、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を行った（図８Ｃ）。

【0243】

スーパー１０によって誘導された発現の変化は、ＷＴ ＩＬ－１０によって観察されたパターンと大部分が一致した。ただし、いくつかのＩＬ－１０標的遺伝子、例えばＧＺＭＢ、ＩＬ２２、及びＳＯＣＳ３については上方制御が弱まり、ＩＦＮＧ及びＩＬ１８ＲＡＰなど他のものについては誘導が強化された（ＦＩＧ．８Ｃ）。このことは、これらの細胞において、ＷＴ ＩＬ－１０と比べ、スーパー１０によって、より強いＳＴＡＴ１活性化が引き起こされたことを反映している可能性がある（図８Ａ）。一方、部分アゴニスト１０－ＤＥは、上方制御及び下方制御されるＩＬ－１０標的遺伝子の両者において、大幅に弱い転写の変化パターンをもたらした。その例として、ＧＺＭＢなどの炎症誘発性遺伝子の発現の低下が挙げられる（図８Ｃ）。このことと一致して、１０－ＤＥ及びＤ２５Ｋは、活性化されたＣＤ８＋ Ｔ細胞によるグランザイムＢ、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－９の産生を増強しなかった。これは、ＷＴ ＩＬ－１０及びスーパー１０とは対照的である（図４Ｆ）。したがって、骨髄偏向性ＩＬ－１０バリアントは、単球及びマクロファージ活性化を抑制する能力を保持しつつも、炎症性Ｔ細胞活性を増強する能力の顕著な減少を示し、それによって、ＩＬ－１０の主要な抗炎症性機能と炎症誘発機能とが切り離された（図４Ｇ）。

【0244】

本明細書に記載された実験データは、改変ＩＬ－１０部分アゴニストによって誘導される骨髄偏向性シグナル伝達が、ＩＬ－１０機能の重要な特徴を切り離しうることを示した。骨髄とリンパ球集団との間の異なるＩＬ－１０受容体発現は、したがって、さもなくば多面発現的であるＩＬ－１０応答に機能的な特異性を提供するための天然のメカニズムを意味している可能性があり、この特徴は本明細書に示すように改変アゴニストを用いて利用することが可能である。例えば、部分アゴニスト１０－ＤＥ及びＤ２５ＫはＩＬ－１０の抗炎症機能を保持しており、このことは、それらが骨髄細胞においてＷＴ ＩＬ－１０と同程度にＳＴＡＴ３を活性化する能力を有することと矛盾がない（図４Ｂ～４Ｅ及び７Ａ～７Ｇ）。一方、これらバリアントでは、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ Ｔ細胞の両者における炎症性ＩＦＮ－γ産生を増強する能力が有意に減少しており、このことは、これらバリアントが、これらの細胞においてＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ１の両者を活性化する能力が減少していることと矛盾がない（図４Ｂ、４Ｆ、６Ｂ、及び８Ａ）。それに対し、スーパー１０は、ＷＴ ＩＬ－１０と比べ、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ Ｔ細胞の両者によるＩＦＮ－γのより強い誘導を引き起こしたが、その一方で、ＳＴＡＴ３応答については類似したものであった（図４Ｆ、６Ｂ、及び８Ｃ）。この発見は、スーパー１０がこれら細胞において顕著に強いＳＴＡＴ１活性化を引き起こす（図８Ａ）という観察によって説明可能であり、ＳＴＡＴ１がＩＬ－１０のＩＦＮ－γ誘導効果を媒介することが示唆されていることと矛盾がない。

【0245】

より詳細に以下に議論するように、ＩＬ－１０は、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αなどの炎症誘発性サイトカインの産生をｉｎ ｖｉｖｏで強力に阻害するという天然の能力により、いくつかの自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、及び１型糖尿病などの治療のための好適な医薬候補となる。ＩＬ－１０の投与によってヒトにおいてＩＦＮ－γ濃度が上昇するという観察が、ＩＬ－１０をこれらの状況で用いるための障壁となっていたとみられる。したがって、改変ＩＬ－１０部分アゴニストが、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生を刺激することなく、炎症性単球及びマクロファージの活性化を抑制する能力は、ＩＬ－１０をこれらの状況で臨床的に用いるための重要な意義を持っており、ＩＬ－１０による治療可能性を余すことなく活用するための青写真を提供するものである。

【0246】

本開示の特定の選択肢が開示されているが、様々な改変及び組み合わせが可能であり、それらは添付の特許請求の範囲の真の趣旨及び範囲内で企図されることを理解すべきである。したがって、本明細書に提示される要約及び開示に厳密に限定することを意図するものではない。

【0247】

【図1】

【図2A-B】

【図2C-E】

【図2F】

【図3A】

【図3B-C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C-D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図5A】

【図5B-D】

【図6A】

【図6B】

【図7A-D】

【図7E】

【図7F-G】

【図8A-B】

【図8C】

【配列表】

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【国際調査報告】