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特表2023-527422ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防および治療するための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-28
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防および治療するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20230621BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230621BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230621BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230621BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20230621BHJP
A61K 31/4706 20060101ALI20230621BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230621BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230621BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230621BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20230621BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20230621BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
A61P31/12
A61P31/14
A61P43/00 121
A61K31/675
A61K31/4706
A61P11/00
A61K45/00
A61P1/00
C12N5/071
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022573297
(86)(22)【出願日】2021-05-26
(85)【翻訳文提出日】2023-01-25
(86)【国際出願番号】 US2021034234
(87)【国際公開番号】W WO2021242850
(87)【国際公開日】2021-12-02
(31)【優先権主張番号】63/031,310
(32)【優先日】2020-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＭｙＳＱＬ
４．Ｌｉｎｕｘ
５．ＵＢＵＮＴＵ
(71)【出願人】
【識別番号】507238218
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】セックストン，ジョナサン ゼット．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BB19
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA19
4C084CA17
4C084CA53
4C084DC50
4C084MA16
4C084MA52
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC28
4C086DA38
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZB33
4C086ZC75
4H045AA10
4H045AA30
4H045CA43
4H045EA29
(57)【要約】
本発明は、医薬薬理学の分野に属する。特に、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善することができる医薬組成物に関する。本発明はさらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善する方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビル（単独または追加の薬剤とともに）を含む医薬組成物を、対象（例えば、ヒト患者）に投与する工程を含む、方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるウイルス感染に関連する状態を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項2】
前記ウイルス感染に関連する状態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記投与する工程は、経口、局所、または静脈内である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは組換えラクトフェリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および、前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合を阻害することによる前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項13】
前記対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ラクトフェリンを含む前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記投与する工程は、経口、局所、または静脈内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは組換えラクトフェリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項１２に記載の方法。
【請求項19】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項１２に記載の方法。
【請求項20】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項21】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および、前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合を阻害することによる前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項22】
対象におけるウイルス感染に関連する症状を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルを含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項23】
対象におけるウイルス感染に関連する前記症状は、発熱、倦怠感、乾性咳嗽、筋肉痛、呼吸困難、急性呼吸促進症候群、および肺炎のうちの１つ以上である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項２２に記載の方法。
【請求項26】
前記医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項27】
前記投与する工程は、経口、静脈内、または局所である、請求項２２に記載の方法。
【請求項28】
前記医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは組換えラクトフェリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項29】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項２２に記載の方法。
【請求項30】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項２２に記載の方法。
【請求項31】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項32】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および、前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合を阻害することによる前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項２２に記載の方法。
【請求項33】
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する症状を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項34】
対象におけるウイルス感染に関連する前記症状は、発熱、倦怠感、乾性咳嗽、筋肉痛、呼吸困難、急性呼吸促進症候群、および肺炎のうちの１つ以上である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項37】
前記投与する工程は、経口、静脈内、または局所である、請求項３３に記載の方法。
【請求項38】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは組換えラクトフェリンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項39】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項３３に記載の方法。
【請求項40】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項３３に記載の方法。
【請求項41】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項42】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および、前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合を阻害することによる前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項３３に記載の方法。
【請求項43】
対象における急性呼吸窮迫症候群を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項44】
前記急性呼吸窮迫症候群は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である、請求項４３に記載の方法。
【請求項46】
ラクトフェリンを含む前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項４３に記載の方法。
【請求項47】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項48】
前記投与する工程は、経口、静脈内、または局所である、請求項４３に記載の方法。
【請求項49】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは組換えラクトフェリンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項50】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項４３に記載の方法。
【請求項51】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項４３に記載の方法。
【請求項52】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項53】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合を阻害することによる前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項４３に記載の方法。
【請求項54】
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する急性呼吸窮迫症候群を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項55】
前記対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
ラクトフェリンを含む前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項５４に記載の方法。
【請求項57】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項58】
前記投与する工程は、経口、静脈内、または局所である、請求項５４に記載の方法。
【請求項59】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは組換えラクトフェリンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項60】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項５４に記載の方法。
【請求項61】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項５４に記載の方法。
【請求項62】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項63】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合を阻害することによる前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項５４に記載の方法。
【請求項64】
対象における肺炎を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロスアミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項65】
前記肺炎は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である、請求項６４に記載の方法。
【請求項67】
ラクトフェリンを含む前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項６４に記載の方法。
【請求項68】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンである、請求項６４に記載の方法。
【請求項69】
前記投与する工程は、経口、静脈内、または局所である、請求項６４に記載の方法。
【請求項70】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは組換えラクトフェリンである、請求項６４に記載の方法。
【請求項71】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項６４に記載の方法。
【請求項72】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項６４に記載の方法。
【請求項73】
肺炎を治療するための追加の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項74】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項75】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合を阻害することによる前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項６４に記載の方法。
【請求項76】
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する肺炎を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項77】
前記対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
ラクトフェリンを含む前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項７６に記載の方法。
【請求項79】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンである、請求項７６に記載の方法。
【請求項80】
前記投与する工程は、経口、静脈内、または局所である、請求項７６に記載の方法。
【請求項81】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは組換えラクトフェリンである、請求項７６に記載の方法。
【請求項82】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項７６に記載の方法。
【請求項83】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項７６に記載の方法。
【請求項84】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項85】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合を阻害することによる前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項７６に記載の方法。
【請求項86】
対象における１つ以上の胃腸の状態を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項87】
前記１つ以上の胃腸の状態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する、請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
前記対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である、請求項８６に記載の方法。
【請求項89】
ラクトフェリンを含む前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項８６に記載の方法。
【請求項90】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンまたは組換えラクトフェリンである、請求項８６に記載の方法。
【請求項91】
前記投与する工程は、経口、静脈内、または局所である、請求項８６に記載の方法。
【請求項92】
前記１つ以上の胃腸の状態は、便秘、過敏性腸症候群、痔核、裂肛、肛門周囲膿瘍、肛門瘻、肛門周囲感染症、憩室疾患、大腸炎、および下痢から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項93】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項８６に記載の方法。
【請求項94】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項８６に記載の方法。
【請求項95】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項96】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合の阻害による前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項８７に記載の方法。
【請求項97】
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する肺炎を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項98】
前記対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である、請求項９７に記載の方法。
【請求項99】
ラクトフェリンを含む前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に分散される、請求項９７に記載の方法。
【請求項100】
医薬組成物はラクトフェリンを含み、前記ラクトフェリンは哺乳類ラクトフェリンまたは組換えラクトフェリンである、請求項９７に記載の方法。
【請求項101】
前記投与する工程は、経口、静脈内、または局所である、請求項１００に記載の方法。
【請求項102】
前記１つ以上の胃腸の状態は、便秘、過敏性腸症候群、痔核、裂肛、肛門周囲膿瘍、肛門瘻、肛門周囲感染症、憩室疾患、大腸炎、および下痢から選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項103】
投与される前記医薬組成物の量は、約１ｍｇ～約１０ｇ／日である、請求項９７に記載の方法。
【請求項104】
投与される前記医薬組成物の量は、約１０ｍｇ～約１ｇ／日である、請求項９７に記載の方法。
【請求項105】
レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項106】
前記医薬組成物の投与は、前記対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記対象内のＮＫ細胞活性の増強、前記対象内の好中球活性の増強、および前記ウイルスと当該細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合の阻害による前記対象の細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項９７に記載の方法。
【請求項107】
細胞におけるウイルス侵入を阻害するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロスアミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を前記細胞に曝露する工程を含む、方法。
【請求項108】
細胞は、ウイルス感染の危険性がある（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の危険性がある細胞）、請求項１０７に記載の方法。
【請求項109】
前記細胞は、ウイルスに曝露されている（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に現在曝露されている細胞）、請求項１０７に記載の方法。
【請求項110】
前記細胞は培養中である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項111】
前記細胞は、対象（例えば、ヒト対象）（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に罹患しているヒト対象）（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に罹患している危険性があるヒト対象）における生存細胞である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項112】
前記細胞の前記医薬組成物への曝露は、前記細胞内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の阻害、前記細胞内のＮＫ細胞活性の増強、前記細胞内の好中球活性の増強、および前記ウイルスと前記細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合の阻害による前記細胞へのウイルス侵入の阻害のうちの１つ以上をもたらす、請求項１０７に記載の方法。
【請求項113】
以下（１）～（３）を含む、キット。（１）ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロスアミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物；
（２）容器、包装、またはディスペンサー；および
（３）投与のための指示書。
【請求項114】
キットは、レムデシビル（前記医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンをさらに含む、請求項１１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔関連出願の相互参照〕
本願は、２０２０年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０３１，３１０号の優先権を主張する。前記出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２０年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０３１，３１０号の優先権を主張する。前記出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
〔発明の分野〕
本発明は、医薬薬理学の分野に属する。特に、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善することができる医薬組成物に関する。本発明はさらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善する方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビル（単独または追加の薬剤とともに）を含む医薬組成物を、対象（例えば、ヒト患者）に投与する工程を含む方法に関する。
本発明は、医薬薬理学の分野に属する。特に、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善することができる医薬組成物に関する。本発明はさらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善する方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビル（単独または追加の薬剤とともに）を含む医薬組成物を、対象（例えば、ヒト患者）に投与する工程を含む方法に関する。
【0003】
〔導入〕
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、２０１９年１１月に武漢で出現し、世界的なパンデミックへと急速に発展した被覆された一本鎖陽方向鎖ＲＮＡβ－コロナウイルスである。関連疾患であるＣＯＶＩＤ－１９は、インフルエンザ様疾患および胃腸障害（Ｘｉａｏら、２０２０；Ｌｉｎら、２０２０）から急性呼吸窮迫症候群、心臓の不整脈、脳卒中、および死亡（Ａｖｕｌａら、２０２０；Ｋｏｃｈｉら、２０２０）に及ぶ一連の症状を有する。薬物の再利用は、ＣＯＶＩＤ－１９治療法の探索において重要な役割を果たしてきた。最近、ＦＤＡは、ＣＯＶＩＤ－１９を有する重症患者に対してエボラウイルス治療のために開発されたヌクレオシド阻害剤のモノホスホロアミド化プロドラッグ（Ｍｕｌａｎｇｕら、２０１９）であるレムデシビル（ＧＳ－５７３４）、および１９４０年代にマラリア治療のために最初に開発されたアミノキノリン誘導体であるヒドロキシクロロキンの緊急承認を発した。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を制限し、関連疾患のＣＯＶＩＤ－１９を予防／治療するために利用可能な確立された予防計画または直接的な抗ウイルス治療は存在しない。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、２０１９年１１月に武漢で出現し、世界的なパンデミックへと急速に発展した被覆された一本鎖陽方向鎖ＲＮＡβ－コロナウイルスである。関連疾患であるＣＯＶＩＤ－１９は、インフルエンザ様疾患および胃腸障害（Ｘｉａｏら、２０２０；Ｌｉｎら、２０２０）から急性呼吸窮迫症候群、心臓の不整脈、脳卒中、および死亡（Ａｖｕｌａら、２０２０；Ｋｏｃｈｉら、２０２０）に及ぶ一連の症状を有する。薬物の再利用は、ＣＯＶＩＤ－１９治療法の探索において重要な役割を果たしてきた。最近、ＦＤＡは、ＣＯＶＩＤ－１９を有する重症患者に対してエボラウイルス治療のために開発されたヌクレオシド阻害剤のモノホスホロアミド化プロドラッグ（Ｍｕｌａｎｇｕら、２０１９）であるレムデシビル（ＧＳ－５７３４）、および１９４０年代にマラリア治療のために最初に開発されたアミノキノリン誘導体であるヒドロキシクロロキンの緊急承認を発した。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を制限し、関連疾患のＣＯＶＩＤ－１９を予防／治療するために利用可能な確立された予防計画または直接的な抗ウイルス治療は存在しない。
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＣＯＶＩＤ－１９の症状を、予防、治療、および改善するための予防計画、および／または直接的な抗ウイルス治療が必然的に必要とされる。
【0005】
本発明はこの必要性に取り組む。
【0006】
〔要約〕
ＦＤＡに承認された薬物を再利用することは、ＣＯＶＩＤ－１９のための迅速に活用可能な治療を同定するための有望な計画である。再利用することの利点には、公知の安全性プロファイル、強固なサプライチェーン、および開発に必要な短い期間が含まれる（Ｏｐｒｅａら、２０１１）。さらに、承認された薬物はウイルス感染の生態を理解するための化学的探索としての役割を果たし、ＣＯＶＩＤ－１９と疾病の病因に影響を及ぼす分子標的／分子経路との間の新たな関連を作り出すことができる。通常のインビトロ抗ウイルスアッセイに対する補足的な手法は、ハイコンテンツの画像化に基づく形態学的プロファイリングである。形態学的プロファイリングを用いて、感染の根底にある経路および新規な生態を同定することが可能である。したがって、特定の生物学的プロセスの周辺の標的スクリーニングまたはウイルス感染を制限する宿主プロセスを標的にすることを可能にする。これは複数の抗ウイルス機構の同定を可能にし、薬物の組み合わせの合理的なデザインを可能にするか、あるいは逆に、感染性を悪化させ、または細胞障害性に関連する薬物を明らかにする。
ＦＤＡに承認された薬物を再利用することは、ＣＯＶＩＤ－１９のための迅速に活用可能な治療を同定するための有望な計画である。再利用することの利点には、公知の安全性プロファイル、強固なサプライチェーン、および開発に必要な短い期間が含まれる（Ｏｐｒｅａら、２０１１）。さらに、承認された薬物はウイルス感染の生態を理解するための化学的探索としての役割を果たし、ＣＯＶＩＤ－１９と疾病の病因に影響を及ぼす分子標的／分子経路との間の新たな関連を作り出すことができる。通常のインビトロ抗ウイルスアッセイに対する補足的な手法は、ハイコンテンツの画像化に基づく形態学的プロファイリングである。形態学的プロファイリングを用いて、感染の根底にある経路および新規な生態を同定することが可能である。したがって、特定の生物学的プロセスの周辺の標的スクリーニングまたはウイルス感染を制限する宿主プロセスを標的にすることを可能にする。これは複数の抗ウイルス機構の同定を可能にし、薬物の組み合わせの合理的なデザインを可能にするか、あるいは逆に、感染性を悪化させ、または細胞障害性に関連する薬物を明らかにする。
【0007】
本発明のための実施形態を同定する過程で行われた実験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の定量的ハイスループット画像に基づくスクリーニングのためのパイプラインの開発をもたらした。機械学習手法を活用して、抗ウイルスの有効性および作用機構を予測する特徴を正確かつ確固とて同定するアッセイ指標を作成した。いくつかのＦＤＡに承認された薬物および臨床候補が独自の抗ウイルス活性で同定された。そのような実験は、ラクトフェリンがウイルス侵入およびウイルス複製を阻害し、抗ウイルス宿主細胞応答を増強し、レムデシビルおよびヒドロキシクロロキンの効果を増強することをさらに実証した。さらに、そのような実験は、ウイルス感染性を悪化させる現在処方されている薬物の同定をもたらした。まとめると、本発明は、形態学的プロファイリングがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する新規の潜在的な治療薬、ならびにＣＯＶＩＤ－１９転帰を潜在的に悪化させる薬物を確実に同定することができるというエビデンスを表す。
【0008】
したがって、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善することができる医薬組成物に関する。本発明はさらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善する方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビル（単独または追加の薬剤とともに）を含む医薬組成物を、対象（例えば、ヒト患者）に投与する工程を含む方法に関する。
【0009】
特定の実施形態では、本発明は、ウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９））の症状を、治療、予防、および／または改善するために、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、対象（例えば、ヒト対象）（例えば、ヒト対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性がある）に投与するための方法を提供する。
【0010】
そのような実施形態では、該方法が、特定の型またはウイルス感染の種類の症状を、治療、予防、および／または改善することに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連したウイルス感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、薬物耐性ＨＩＶ、ジュニンウイルス、チクングニアウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ピンデウイルス、ラッサウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、パンタトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、リフトバレーウイルス、ＲＨＤＶ、ＳＡＲＳコロナウイルス、タカリベウイルス、および西ナイルウイルスに関連する任意の感染である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染はＭｐｒｏプロテアーゼ活性および／またはＭｐｒｏプロテアーゼ発現を有する任意のウイルスに関連する。
【0011】
そのような実施形態では、医薬組成物の投与は、対象内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の抑制をもたらす。いくつかの実施形態では、医薬組成物の投与は、対象内のＮＫ細胞活性の増強をもたらす。いくつかの実施形態では、医薬組成物の投与は、対象内の好中球活性の増強をもたらす。いくつかの実施形態では、医薬組成物の投与は、ウイルスと当該細胞内でのヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合の阻害を介して、対象の細胞へのウイルス侵入の阻害をもたらす。
【0012】
いくつかの実施形態では、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロスアミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、レムデシビル（医薬組成物中にない場合）またはヒドロキシクロロキンと組み合わせて投与する。
【0013】
そのような実施形態では、医薬組成物はラクトフェリンを含み、ラクトフェリンは、天然源（例えば、哺乳動物乳などが挙げられるが、これに限定されない）からの単離および精製によって得られる。ラクトフェリンは、好ましくは哺乳類ラクトフェリン（例えば、ウシラクトフェリンまたはヒトラクトフェリン）である。いくつかの実施形態では、ラクトフェリンは、当技術分野で公知であり使用されている遺伝子操作技術（例えば、遺伝子改変された動物、植物、または真核生物における組換えの発現または直接的な製造、もしくは化学合成）を用いて、組換えにより製造されるヒトラクトフェリンである（例えば、米国特許第５，５７１，８９６号；同第５，５７１，６９７号、および同第５，５７１，６９１号を参照のこと）。
【0014】
特定の実施形態では、本発明は対象におけるウイルス感染に関連する状態を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、任意の投与様式（例えば、経口、静脈内、局所）に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染である。
【0015】
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ラクトフェリンを含む医薬組成物は、経口投与に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。
【0016】
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるウイルス感染に関連する症状を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリンを含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、任意の投与様式（例えば、経口、静脈内、局所）に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に罹患しているヒト対象である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染に関連する１つ以上の症状には、発熱、倦怠感、乾性咳嗽、筋肉痛、呼吸困難、急性呼吸窮迫症候群、および肺炎が含まれるが、これらに限定されない。
【0017】
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する症状を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、任意の投与様式（例えば、経口、静脈内、局所）に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染に関連する１つ以上の症状には、発熱、倦怠感、乾性咳嗽、筋肉痛、呼吸困難、急性呼吸窮迫症候群、および肺炎が含まれるが、これらに限定されない。
【0018】
特定の実施形態では、本発明は、対象における急性呼吸窮迫症候群を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、任意の投与様式（例えば、経口、静脈内、局所）に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に罹患しているヒト対象である。
【0019】
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する急性呼吸窮迫症候群を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、任意の投与様式（例えば、経口、静脈内、局所）に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に罹患しているヒト対象である。
【0020】
特定の実施形態では、本発明は、対象における肺炎を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、任意の投与様式（例えば、経口、静脈内、局所）に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に罹患しているヒト対象である。
【0021】
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する肺炎を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、任意の投与様式（例えば、経口、静脈内、局所）に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に罹患しているヒト対象である。
【0022】
急性呼吸窮迫症候群および／または肺炎の治療を含むいくつかの実施形態では、医薬組成物は呼吸器疾患を治療するための公知の薬剤と組み合わせて投与される。呼吸器疾患を治療するために使用される公知のまたは標準的な薬剤または治療法には、抗喘息剤／治療法、抗鼻炎剤／治療法、抗副鼻腔炎剤／治療法、抗肺気腫剤／治療法、抗気管支炎剤／治療法、または抗慢性閉塞性肺疾患剤／治療法が含まれる。抗喘息剤／治療法には、肥満細胞脱顆粒剤、ロイコトリエン阻害剤、コルチコステロイド、β－拮抗薬、ＩｇＥ結合阻害剤、抗ＣＤ２３抗体、トリプターゼ阻害剤、およびＶＩＰ作用薬が含まれる。抗アレルギー性鼻炎剤／治療法には、Ｈ１抗ヒスタミン剤、α－アドレナリン剤、およびグルココルチコイドが含まれる。抗慢性副鼻腔炎治療法には、手術、コルチコステロイド、抗生物質、抗真菌剤、塩水鼻洗浄または塩水鼻スプレー、抗炎症剤、充血除去剤、グアイフェネシン、ヨウ化カリウム、ルエコトリエン阻害剤、肥満細胞脱顆粒剤、局所湿潤剤、熱風吸入、機械的呼吸装置、酵素洗浄剤、および抗ヒスタミンスプレーが含まれるが、これらに限定されない。抗肺気腫、抗気管支炎、または抗慢性閉塞性肺疾患の剤／治療法は、酸素、気管支拡張剤、真菌溶解剤、ステロイド、抗生物質、抗真菌剤、噴霧による湿潤化、鎮咳剤、呼吸刺激剤、手術、およびα１アンチトリプシンを含むが、これらに限定されない。
【0023】
特定の実施形態では、本発明は、対象における胃腸の状態を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、任意の投与様式（例えば、経口、静脈内、局所）に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に罹患しているヒト対象である。いくつかの実施形態では、胃腸の状態は下痢である。いくつかの実施形態では、胃腸の状態は、便秘、過敏性腸症候群、痔核、裂肛、肛門周囲膿瘍、肛門瘻、肛門周囲感染症、憩室疾患、大腸炎、および下痢から選択される。
【0024】
特定の実施形態では、本発明は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する胃腸の状態を、治療、改善、および／または予防するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、任意の投与様式（例えば、経口、静脈内、局所）に適するように構成される。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する状態に罹患しているか、または罹患する危険性があるヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に罹患しているヒト対象である。いくつかの実施形態では、胃腸の状態は下痢である。いくつかの実施形態では、胃腸の状態は、便秘、過敏性腸症候群、痔核、裂肛、肛門周囲膿瘍、肛門瘻、肛門周囲感染症、憩室疾患、大腸炎、および下痢から選択される。
【0025】
特定の実施形態では、本発明は、細胞でのウイルス侵入を阻害するための方法であって、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物を細胞に曝露する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞はウイルス感染の危険性がある（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の危険性がある細胞）。いくつかの実施形態では、細胞はウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に現在曝露されている細胞）に曝露されている。いくつかの実施形態では、細胞は培養中である。いくつかの実施形態では、細胞は対象（例えば、ヒト対象）（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に罹患しているヒト対象）（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に罹患している危険性があるヒト対象）における生存細胞である。いくつかの実施形態では、ラクトフェリンを含む医薬組成物への細胞の曝露は、細胞内のプロ炎症性サイトカイン活性（例えば、ＩＬ－６活性）の抑制をもたらす。いくつかの実施形態では、ラクトフェリンを含む医薬組成物への細胞の曝露は、細胞内のＮＫ細胞活性の増強をもたらす。いくつかの実施形態では、ラクトフェリンを含む医薬組成物への細胞の曝露は、細胞内の好中球活性の増強をもたらす。いくつかの実施形態では、ラクトフェリンを含む医薬組成物への細胞の曝露は、ウイルスと細胞内のヘパリン硫酸プロテオグリカンとの結合を阻害することによる細胞へのウイルス侵入の阻害をもたらす。
【0026】
特定の実施形態では、本発明は、（１）ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物、（２）容器、包装、またはディスペンサー、および（３）投与のための指示書、を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットはさらにレムデシビル（医薬組成物中にない場合）またはヒドロキシクロロキンを含む。
【0027】
〔図面の簡単な説明〕
図．１Ａ－Ｃ：Ａ）ＶｅｒｏＥ６細胞、Ｈｕｈ－７細胞、およびＣａｃｏ－２細胞の増殖動態。細胞を４８のウェルプレート中にて、０．２のＭＯＩで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、０日目（吸着後１時間）、１日目、２日目、および３日目に採取した。ＴＣＩＤ５０を、上清および細胞画分について決定した。グラフは中央値を表し、Ｎ＝２の生物学的複製のＳＤであり、それぞれｎ＝３の技術的複製を有する。Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏＥ６細胞（左）およびＣａｃｏ２細胞（右）に対するＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（シアン）および抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ抗体（マゼンタ）での染色における合胞体の形成（マゼンタ、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ抗体）。Ｃ）アッセイ検出の限界。Ｈｕｈ－７細胞を、指示されたＭＯＩで感染させ、感染４８時間後（ｐ．ｉ．）に画像化させた。ＭＯＩの増加と相関して、進行性でより多機能な合胞体の形成が観察された。検出は０．００４のＭＯＩの低さの感染で可能であった。
図．１Ａ－Ｃ：Ａ）ＶｅｒｏＥ６細胞、Ｈｕｈ－７細胞、およびＣａｃｏ－２細胞の増殖動態。細胞を４８のウェルプレート中にて、０．２のＭＯＩで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、０日目（吸着後１時間）、１日目、２日目、および３日目に採取した。ＴＣＩＤ５０を、上清および細胞画分について決定した。グラフは中央値を表し、Ｎ＝２の生物学的複製のＳＤであり、それぞれｎ＝３の技術的複製を有する。Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏＥ６細胞（左）およびＣａｃｏ２細胞（右）に対するＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（シアン）および抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ抗体（マゼンタ）での染色における合胞体の形成（マゼンタ、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ抗体）。Ｃ）アッセイ検出の限界。Ｈｕｈ－７細胞を、指示されたＭＯＩで感染させ、感染４８時間後（ｐ．ｉ．）に画像化させた。ＭＯＩの増加と相関して、進行性でより多機能な合胞体の形成が観察された。検出は０．００４のＭＯＩの低さの感染で可能であった。
【0028】
図．２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＨｕｈ－７細胞の形態学的プロファイリング（４８時間、０．２のＭＯＩ）。中心像：核（シアン）、中性脂質（緑色）、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰタンパク質（マゼンタ）を有する代表的な照射野。特徴抽出を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の重要な特質は、ＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ チャネルからの多核合胞体（左上）および豊富な核小体（左下）で特徴付けられた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ チャネルからの細胞質突起（右下）を有する細胞ウイルス区画化（右上）。Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＱ１ ハイコンテンツ撮像装置で代表的な画像を取得し、Ｆｉｊｉ ＩｍａｇｅＪ パッケージで分析した。
【0029】
図．３Ａ－Ｂ：Ａ）ｑＨＴＳスクリーニングからの１３２ヒットの用量－反応曲線。ＸＸ Ｂ）複製プレート間で抗ウイルスの有効性に強い相関を示す複製プロット。
【0030】
図．４Ａ－Ｂ：ａ）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療法の発見への取り組みの概略図。１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した３８４のウェルプレート上にて培養された細胞に、化合物が投与される。それぞれのプレートは、プレート間の変動をコントロールするために、２４の陰性（感染）コントロールウェルおよび２４の陽性（非感染）コントロールウェルを含む。２）細胞は固定され、染色され、画像化される。これらの細胞区画の特徴を抽出しながら、核の含有量、細胞境の含有量、中性脂質の含有量、およびウイルス合胞体の形成を区分するＣｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒに基づくパイプラインによって、画像は分析される。３）画像ごとにウイルス感染性を定義するために、多変量解析によって用量－反応曲線が算出される。４）抽出された特徴に基づいて、陽性コントロールウェルおよび陰性コントロールウェルの周りに機械学習モデルが構築され、それぞれの薬物状態に適用される。５）得られた特徴を通して、モデルは抗ウイルス作用の個々の化合物モードを知らせる。６）確認された抗ウイルスヒット；ｂ）薬物スクリーニングの１５ヒットの用量－反応曲線。グラフは、Ｎ＝３の生物学的複製について、一連の選択された化合物の、１０点の１：２希釈の中央値ＳＥＭを表す。ＩＣ５０は、コントロールに対する正規化に基づき、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムに適合させた後に計算された。
【0031】
図．５Ａ－Ｃ：それらの形態学的特徴による細胞の埋め込みは、細胞の状態および感染の状態によるクラスター化を示す。ａ）非感染の（ＰＣ）、感染した（ＮＣ）、または感染し、かつＦＤＡに承認され、臨床候補である１２の薬物のスクリーニングヒットを用いて１０用量にわたり処置されることからなる、３７９の形態学的特徴による２００万の個々の細胞の２次元ＵＭＡＰ埋め込み。ｂ）ＵＭＡＰ中のクラスター関心領域（ＲＯＩ）は、感染した合胞体（ＲＯＩ ３）および単離された（ＲＯＩ ４）細胞および非感染の有糸分裂（ＲＯＩ ６）、正常（ＲＯＩ １０）、散在性脂質（ＲＯＩ １１）、および細胞質点状物（ＲＯＩ １２）細胞を含めて強調される。ｃ）６つのＲＯＩについて、代表的な細胞は、核（左上）、細胞境界（右上）、中性脂質（左下）、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（右下）のチャネルによって示される。以下では、それぞれの処置および用量にわたる細胞数がヒートマップとして示される。ここで、ＲＯＩ ３およびＲＯＩ ４の用量－反応の挙動を見ることができる。
【0032】
図．６Ａ－Ｈ：ラクトフェリンはウイルス周期の様々な段階で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を遮断する。ａ）Ｈｕｈ－７細胞をラクトフェリン（０～２．３μＭ）で処置し、３８４のウェルプレート中にてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（０．２のＭＯＩ）に感染させた。自動蛍光顕微鏡法を用いてプレートは画像化され、本発明者らの画像分析パイプラインを用いて処理され、ウイルスの阻害割合を決定した。グラフは用量－反応（ＲＥＤ、ＩＣ５０＝３０８μＭ）を示す。細胞生存率は黒色で示される。ｂ）Ｈｕｈ－７をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（１のＭＯＩ、５のＭＯＩ、および１０のＭＯＩ；０のＭＯＩは非感染の細胞を示す）に感染させ、２．３μＭのラクトフェリンを用いて、１時間ｐ．ｉ．および２４時間ｐ．ｉ．で処置させた。バーは、様々な状態における感染した細胞の割合を示す。データは、８回の複製の平均である。統計学的有意性は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ－Ｄｕｎｎ法による多重Ｔ検定を用いて、α＝０．０５で測定した。０のＭＯＩを除いて、全ての状態（未処置対ラクトフェリン、１時間、もしくは、未処置対ラクトフェリン、２４時間）は、ｐ値＜０．０００１を有する。ｃ－ｄ）２．５×１０４Ｈｕｈ－７細胞を、４８時間ｐ．ｉ．、０．２のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。細胞が採取され、ＲＮＡが抽出された。ウイルスゲノムコピーは、絶対定量法（標準曲線）（ｃ）を用いて計算され、細胞のＩＦＮβ、ＭＸ１、ＩＳＧ１５、およびＩＦＩＴＭ３（ｄ）のｍＲＮＡレベルは、非感染のＨｕｈ－７に対するΔΔＣｔを用いて計算された。データは平均であり、Ｎ＝２の生物学的複製のＳＤであり、それぞれｎ＝３の技術的複製を有する。統計学的有意性は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ－Ｄｕｎｎ法による多重Ｔ検定を用いて、α＝０．０５、＊ｐ値＜０．００１で測定した。ｅ）２．３μＭの濃度で、アポラクトフェリン、ホロラクトフェリン、およびトランスフェリンを用いる治療の際の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＨｕｈ－７細胞の割合。ｆ）レムデシビル（５０ｎＭ）、ラクトフェリン（１．２μＭ）、およびレムデシビル／ラクトフェリン（２５ｎＭ／６００ｎＭ）の組み合わせ処置を用いた処置の際の、１０のＭＯＩでの４８時間ｐ．ｉ．、感染した細胞の割合。ｇ）およびｈ）レムデシビルとヒドロキシクロロキンとを組み合わせたラクトフェリンの２次元用量反応ヒートマップ。レムデシビルの組み合わせは０．２のＭＯＩで評価され、ＨＣＱはラクトフェリンの効能において関連する変化をもたらす１０のＭＯＩで評価される。
【0033】
図．７Ａ－Ｂ：Ａ）レムデシビル単独、ならびに、有効性の増強を示すレムデシビルと２８０ｎＭラクトフェリンとの組み合わせ、およびレムデシビルと１μＭラクトフェリンとの組み合わせについての用量－反応曲線。Ｂ）ヒドロキシクロロキン単独、ならびに、有効性の増強を示すヒドロキシクロロキンと２８０ｎＭのラクトフェリンとの組み合わせ、およびヒドロキシクロロキンと１μＭラクトフェリンとの組み合わせについての用量－反応曲線。
【0034】
〔発明の詳細な説明〕
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）および関連疾患ＣＯＶＩＤ－１９の世界的な広がりは、臨床ケアに迅速に転換することができる治療的介入を必要とする。残念なことに、従来の製薬方法は、＞９０％の失敗率を有し、標的の同定から臨床的な使用まで、１０～１５年間かかることがある。薬物の再利用、すなわち、以前に開発され、試験された様々な疾患の状態のための薬剤の使用は、変換を著しく加速する可能性がある。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）および関連疾患ＣＯＶＩＤ－１９の世界的な広がりは、臨床ケアに迅速に転換することができる治療的介入を必要とする。残念なことに、従来の製薬方法は、＞９０％の失敗率を有し、標的の同定から臨床的な使用まで、１０～１５年間かかることがある。薬物の再利用、すなわち、以前に開発され、試験された様々な疾患の状態のための薬剤の使用は、変換を著しく加速する可能性がある。
【0035】
本発明のための実施形態の開発中に行われた実験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効な単剤および組み合わせ治療法を同定するための定量的ハイスループットスクリーニングの開発をもたらした。定量的ハイコンテンツの形態学的プロファイリングをＡＩに基づく機械学習計画と組み合わせて、細胞の特徴を感染およびストレスに対して陽性または陰性として分類した。このアッセイは、ウイルス侵入の阻害、増殖、および宿主細胞応答の調節を含む、多数の抗ウイルス作用機構を検出した。１，４４１のＦＤＡに承認された化合物および臨床候補のライブラリーから、抗ウイルス効果を有する１５の用量－反応化合物が同定された（例えば、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビル）。特に、ラクトフェリンは、３０８ｎＭのＩＣ５０を用いるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の効果的な阻害剤であり、レムデシビルおよびヒドロキシクロロキンの両方の有効性を増強することが発見された。ラクトフェリンはまた、抗ウイルス宿主細胞応答を刺激し、ｉＰＳＣ由来の肺胞上皮細胞における阻害活性を保持することが示された。ヒトにおけるその安全性プロファイルを考慮すると、これらの前臨床データは、ラクトフェリンがＣｏｖｉｄ－１９のための容易に変換可能な治療補助剤であることを示す。さらに、いくつかの一般的に処方される薬物は、ウイルス感染を悪化させ、より悪い患者転帰の臨床調査に値することが見出された。
【0036】
したがって、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善することができる医薬組成物に関する。本発明はさらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる状態に関連する症状を、予防、治療、および／または改善する方法であって、
【0037】
【化1】
【0038】
を含む医薬組成物を、対象（例えば、ヒト対象）に投与する工程を含む方法に関する。
【0039】
本発明の重要な態様は、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物が、ウイルス感染（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）およびそのようなウイルス感染に関連する症状（例えば、発熱、疲労、乾性咳嗽、筋肉痛、呼吸困難、急性呼吸窮迫症候群、および肺炎）の処置に有用であることである。
【0040】
本発明のいくつかの実施形態では、ラクトフェリンおよび少なくとも１つの追加の治療剤（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、および／またはそのようなウイルス感染に関連する症状（例えば、発熱、疲労、乾性咳嗽、筋肉痛、呼吸困難、急性呼吸窮迫症候群、および肺炎）を処置するのに役立つ任意の医薬品を含むが、これらに限定されない）を含む医薬組成物の有効量を投与するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、追加の薬剤はレムデシビル（医薬組成物中にない場合）および／またはヒドロキシクロロキンである。
【0041】
本発明の範囲内の組成物は、その意図された目的を達成するのに効果的な量で含まれる全ての医薬組成物を含む。個々の必要性は様々であるが、それぞれの構成要素の有効量の最適範囲の決定は、当業者の範囲内である。典型的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス侵入の阻害剤として機能する医薬品は、経口的に、０．００２５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの用量、または薬学的に許容されるその塩の同等量で、処置される哺乳類の身体体重の日ごとに、哺乳類（例えば、ヒト）に投与され得る。一実施形態では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇが経口的に投与され、そのような障害を、治療、改善、または予防する。筋肉内注射の場合、用量は一般に経口用量の約半分である。例えば、適切な筋肉内への用量は、約０．００２５ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇであろう。
【0042】
単回経口用量は、約０．０１ｍｇ～約１０００ｍｇ（例えば、約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ）の阻害剤を含み得る。単回用量は、それぞれ約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ、好ましくは約０．２５ｍｇ～５０ｍｇの薬剤（例えば、模倣ペプチド、小分子）またはその溶媒和物を含む１つ以上の錠剤またはカプセル剤として、１日１回以上投与され得る。
【0043】
局所製剤物中にて、ラクトフェリンは、キャリア１ｇ当たり、約０．０１ｍｇ～１００ｍｇの濃度で存在し得る。一実施形態では、ラクトフェリンは、約０．０７ｍｇ／ｍｌ～１．０ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．１ｍｇ／ｍｌ～０．５ｍｇ／ｍｌ）、一実施形態では約０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【0044】
ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を生化学物質として投与する工程に加えて、ラクトフェリンの製剤への処理を容易にする賦形剤および助剤を含む、好適な薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬製剤の一部として、任意のものが投与され得る。製剤、特に、経口的または局所的に投与することができ、１つの型の投与に使用することができる製剤（例えば、錠剤、糖衣錠、緩効性のロゼンジおよびカプセル、口腔リンス剤および含嗽剤、ジェル、液体懸濁液、毛髪リンス剤、毛髪ジェル、シャンプーなど）、ならびに、直腸に投与することができる製剤（例えば、坐剤、同様に、静脈内注入、注射、局所または経口による投与に適した溶液など）は、約０．０１％～９９％、一実施形態では、約０．２５％～７５％の活性模倣ペプチドを賦形剤と共に含有する。
【0045】
本発明の医薬組成物は、ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上の有益な効果を経験し得る任意の患者に投与され得る。主要な該患者は哺乳類（例えば、ヒト）であるが、本発明はそのように限定されるものではない。他の患者には、獣医学的な動物（ウシ、ヒツジ，ブタ，ウマ，イヌ，ネコなど）が含まれる。
【0046】
ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ、アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン、ニクロサミド、およびレムデシビルのうちの１つ以上を含む医薬組成物は、それらの意図される目的を達成する任意の手段によって、投与され得る。例えば、投与は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、頬側、くも膜下腔内、頭蓋内、鼻腔内、または局所経路によるものであり得る。あるいは、または同時に、投与は経口経路によるものであり得る。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康および体重、併用治療の種類、もしあれば、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存する。
【0047】
本発明の医薬製剤は、それ自身公知の方法で製造される（例えば、従来の、混合、造粒、糖衣錠製造、溶解、または凍結乾燥のプロセスの手段による）。したがって、経口使用のための医薬製剤は、好適な助剤を添加した後に、活性模倣ペプチドを固体賦形剤と組み合わせること、場合により、得られた混合物を粉砕すること、および顆粒の混合物を処理すること、任意にまたは必要であれば、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって獲得することができる。
【0048】
好適な賦形剤は、特に、充填剤（サッカリド（例えば、ラクトースまたはスクロース、マンニトールまたはソルビトール、セルロース製剤および／またはリン酸カルシウム（例えば、リン酸３カルシウムまたはリン酸水素カルシウム））など）、ならびに結合剤（デンプンペースト（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンを使用する）など）である。所望であれば、崩壊剤（例えば、前述のデンプンおよびカルボキシメチルデンプン、交差結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど））が添加され得る。助剤はとりわけ、流動調節剤および滑沢剤（例えば、ケイ酸、タルク、ステアリン酸、またはその塩（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコール））である。糖衣錠コアは、所望であれば、胃液に耐性のある適切な被覆剤を使用して提供される。この目的のために、濃縮糖溶液が使用され得る。濃縮糖溶液は、任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。胃液に耐性のある被覆剤を製造するために、適切なセルロース製剤の溶液（例えば、フタル酸アセチルセルロースまたはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）が使用される。例えば、識別のために、または活性模倣ペプチド投与の組合せを特徴付けるために、染料または色素は錠剤または糖衣錠被覆剤に添加され得る。
【0049】
経口的に使用することができる他の医薬製剤としては、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチン製および可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）製の軟質の密封カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、および／または滑沢剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および、任意に、安定剤と混合され得る顆粒形態の活性模倣ペプチドを含有することができる。一実施形態では、軟質カプセル中にて、活性模倣ペプチドは、適切な液体（例えば、脂肪油または流動パラフィンなど）に溶解または懸濁される。さらに、安定剤が添加され得る。
【0050】
直腸に使用することができると考えられる医薬製剤としては、例えば、１つ以上の活性模倣ペプチドと坐剤基剤との組合せからなる坐剤が挙げられる。好適な坐剤基剤は、例えば、天然トリグリセリドもしくは合成トリグリセリド、またはパラフィン炭化水素である。さらに、活性模倣ペプチドと基材との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。可能性のある基材としては、例えば、液状トリグリセリド、ポリエチレングリコール、パラフィン炭化水素が挙げられる。
【0051】
非経口投与に適した製剤物としては、水溶性形態の活性模倣ペプチドの水溶液（例えば、水溶性塩類およびアルカリ性溶液）が挙げられる。さらに、好適な油性注射懸濁液として、活性模倣ペプチドの懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル、またはトリグリセリド、またはポリエチレングリコール－４００）が挙げられる。水溶性注射用懸濁液は、懸濁液（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む）の粘性を高める物質を含み得る。任意に、懸濁液物は安定剤を含有し得る。
【0052】
一実施形態では、本発明の局所組成物は、適切なキャリアの選択によって、油、クリーム、ローション、軟膏などとして製剤化される。好適なキャリアとしては、植物油または鉱油、白色ワセリン（白色軟質パラフィン）、分枝鎖脂肪または分岐鎖油、動物脂肪および高分子量アルコール（Ｃ１２より大きい）が挙げられる。キャリアは、活性成分が可溶性であるものであり得る。乳化剤、安定剤、保湿剤および抗酸化剤、ならびに、所望であれば、色または芳香を付与する薬剤が含まれ得る。さらに、経皮浸透促進剤をこれらの局所製剤物に使用することができる。そのような促進剤の例は、米国特許番号３，９８９，８１６および米国特許番号４，４４４，７６２に見いだすことができる。
【0053】
軟膏は、植物油（例えば、アーモンド油）中の活性成分の溶液を加温軟質パラフィンと混合し、混合物を冷却させることによって製剤化し得る。そのような軟膏の典型的な例は、重量当たり約３０％のアーモンド油および重量当たり約７０％の白色軟質パラフィンを含むものである。ローションは、適切な高分子量アルコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）中に活性成分を溶解することによって好適に調製され得る。
【0054】
通常の当業者のうちの１人であれば、前述のことが本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明を単に表すことを容易に理解するであろう。前述の組成物および方法の様々な修正および変更は、当技術分野で利用可能な専門知識を用いて容易に達成することができ、これらは本発明の範囲内である。
【0055】
〔実験〕
形態学的プロファイリングは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関連する特有の特徴を明らかにする。
形態学的プロファイリングは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関連する特有の特徴を明らかにする。
【0056】
抗ウイルス薬スクリーニングのための最適な細胞系および適切なエンドポイントを決定するために、以前に報告された許容細胞系、すなわち、Ｖｅｒｏ－Ｅ６、Ｃａｃｏ－２、およびＨｕｈ－７におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性を評価する実験を行った（Ｃｈｕら、２０２０）。０．２の感染多重度（ＭＯＩ）でのウイルス増殖動態から、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞、Ｃａｃｏ２細胞、およびＨｕｈ－７細胞は、感染４８時間後（時間ｐ．ｉ．）にウイルス価の最高値を伴うウイルス感染を支持することが明らかになった（図１Ａ／Ｂ）。ウイルス量はＶｅｒｏ－Ｅ６細胞で高かったが、Ｈｕｈ‐７はＡＣＥ２およびＴＭＰＲＳＳ２の両方を発現するヒト細胞株であるため、形態学的薬物スクリーニングのためにＨｕｈ‐７が選択された。これらは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の主要な侵入因子である（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２０２０）。興味深いことに、Ｈｕｈ－７細胞は、４８時間ｐ．ｉ．で、０．００４という低いＭＯＩで検出可能な感染を支持した（図１Ｃ）。図１Ｃは、画像に基づくスクリーニングの高い感度を強調している。感染を阻害または悪化させる化合物を同定するために、０．２のＭＯＩが選択され、２０％の基準感染率を導いた。
【0057】
細胞レベルの形態学的プロファイリングは、多重染色および自動化されたハイコンテンツの蛍光顕微鏡法によって可能であった。多重化色素集合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質、核（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）、中性脂質（ＨＣＳ ＬｉｐｉｄＴｏｘ Ｇｒｅｅｎ）、および細胞境（ＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ）についてのマーカーを含んだ。これらの蛍光プローブは、核形態、核組織、細胞質および細胞骨格の特徴、ならびに細胞の健全性の指標および機能の指標を含む、ウイルス感染性に関連する多種多様な細胞の特徴を捕えるように選択された。最初のプロファイリングから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関連する３つの顕著な形態学的特徴、すなわち、合胞体の形成、核小体数の増加、細胞質突起の形成が観察された（図２）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の重要な指標であるこれらの特徴を用いて、抗ウイルス薬スクリーニングのための機械学習パイプラインを作成した。
【0058】
機械学習は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス活性を有するＦＤＡに承認された分子を同定する。
【0059】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス活性を有する化合物を同定するために、１，４４１のＦＤＡに承認された化合物および合理的に含まれる臨床候補のカスタムライブラリーが、Ｈｕｈ－７細胞中にてスクリーニングされた。初回通過定量的ハイスループットスクリーニング（ｑＨＴＳ）手法により、５０ｎＭ～２μＭの間の中等度の投与反応性抗ウイルス挙動を有する１３２種の化合物が同定され、有意な活性を示さないか、または細胞数の厳しい低下をもたらす化合物を首尾よく排除した（図３Ａ）。感染した細胞を同定し、その形態学的特性を定量化するために、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒに基づく画像解析およびフォローアップランダムフォレスト分類アルゴリズムを用いて、化合物のライブラリーはその抗ウイルス活性について効率的に評価された（図４Ａ）。このランダムフォレスト分類器は、それぞれの蛍光チャネル（核、細胞質、脂質、ウイルス）についての強度、組織、および放射状分布の測定を含む６６０の独特の細胞特徴の定量化を活用した。一次ｑＨＴＳスクリーニングから、ヒットは試験された濃度の少なくとも３つにおけるウイルス感染性の一貫した減少、ならびに最小の細胞障害性を有する化合物として定義された。ヒット同定のためのこの手法は、偽陰性を最小限に抑え、後に洗練されるであろう有効な化合物の本発明者らのリストを最大限にするために、意図的に広く設計された。一次ｑＨＴＳスクリーニングの再現性を検証するために、化合物のサブセット（３２０）が選択され、元のスクリーニングとの相関を示す生物学的複製実験を行った（図３Ｂ）。
【0060】
予備的な１３２のｑＨＴＳヒットについて、フォローアップ１０点、２倍希釈用量反応実験が３連で実施され、１５の化合物について用量反応の有効性を検証した（表１および図４Ｂ）。これらのヒットは、インビトロ観察では新規である９つ（ラクトフェリン、Ｓ１ＲＡ、エンテカビル、ロミタピド、メトクロプラミド、ボスチニブ、チオグアニン、フェドラチニブ、Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ）、および抗ウイルス活性を有することが以前に同定された６つ（アミオダロン、ベラパミル、ギルテリチニブ、クロファジミン（Ｒｉｖａら、２０２０；Ｈｅｉｓｅｒら、２０２０）、ニクロサミド（Ｊｅｏｎら）、およびレムデシビル）を含み、本発明者らのスクリーニング結果の実現性を実証する。抗ウイルス薬ヒットに加えて、乳癌を治療するために使用される抗エストロゲン薬であるアナストロゾール、およびパーキンソン病を治療するために使用されるカルビドパを含むＨｕｈ－７細胞中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を悪化させると思われるいくつかの化合物も同定された（表３）。
【0061】
【表1】
【0062】
細胞レベル特徴クラスタリングは、リード化合物の潜在的な作用機構を明らかにする。
【0063】
単一アウトプットを用いた標準的なインビトロアッセイとは対照的に、形態学的プロファイリングは、ウイルス感染および細胞障害性の固有の生物学的特性の効率的な可視化および定量化を可能にする。これは、治療時に測定された宿主－細胞変動を通して、抗ウイルス化合物の潜在的な作用機構の同定を容易にする。したがって、以前に同定されたヒットについてさえ、抗ウイルス機構は、従来のスクリーニングアッセイを通して捉えることができないことを特徴付けることができた。例えば、侵入阻害剤は、ウイルスチャネルにおけるシグナルの完全な欠如によって同定されることができる。対照的に、複製阻害剤はしばしばウイルスチャネルに核周囲のスポットをもたらし、これらの点は不全感染のレムナントであると仮定された。測定された６６０の細胞特徴にわたる潜在的な作用機構のヒットをより良く分析するために、均一多様体近似および投影（ＵＭＡＰ）埋め込みを用いた次元減少が使用され、細胞特徴ベクトルを２次元プロットに投影し、それらの異なる形態学的特徴に基づく細胞のクラスター化を観察した（ＭｃＩｎｎｅｓら、２０１８）（図５Ａ）。
【0064】
高い細胞密度を有する１５の関心領域（ＲＯＩ）が同定された（図５Ｂ）。広域密度（ＲＯＩ ９、ＲＯＩ １０）は、細胞分裂（ＲＯＩ ６）、散在性脂質（ＲＯＩ １１）、および点状細胞質（ＲＯＩ １２）を含む、特有な形態を有する付随体集団を有する非感染の細胞を含んでいた。大きな非接続密度（ＲＯＩ １－４）は、個々に感染した細胞（ＲＯＩ ４）、合胞体中にて感染した細胞（ＲＯＩ ４）、および感染した細胞に近接した細胞（ＲＯＩ １、ＲＯＩ ２）を含む（図５Ｃ）。それぞれのＲＯＩについて、それぞれの化合物治療用量にわたる細胞の数が数えられた。抗ウイルスヒットについては、細胞数計算における用量反応の低下が、感染した細胞（ＲＯＩ １－４）を有する領域においてのみ観察された。さらに、感染した細胞集団を単離し、ウイルスヌクレオカプシド染色画像から測定した特徴を除外した後、ＵＭＡＰ座標空間に再び埋め込み、感染した細胞が均質な濃度分布を有する主なクラスター本体中に存在することを観察した。これは、Ｈｕｈ－７細胞内の特異的細胞表現型／クラスター化について、ウイルス感染に対する感受性に実質的な偏りがないことを示している。
【0065】
ラクトフェリンは、ウイルスサイクルの異なる段階でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を遮断する。
【0066】
形態学的スクリーニングから同定された最も有効なヒットの１つは、乳および他の分泌液中に見出されるタンパク質、ラクトフェリンであった（Ｌａｎｇら、２０１１）。ラクトフェリンは、用量依存性（３ｎＭ～２．３μＭ）およびＭＯＩ依存性（０．２～１０）の抗ウイルス活性を有することが確認された（図６Ａおよび６Ｂ）。関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１による感染との関連において、ラクトフェリンに関する以前の研究は、ラクトフェリンが早期のウイルス付着に重要であるヘパラン硫酸プロテオグリカンを結合することによってウイルス侵入を遮断することを示唆している（Ｌａｎｇら、２０１１）。これらの研究は、ラクトフェリンが１時間ｐ．ｉ．または２４時間ｐ．ｉ．で、添加される際に、抗ウイルス活性を保持するので、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を侵入レベルで、さらなる作用機構を用いて遮断することを示した（図６Ｂ）。ラクトフェリンは、宿主細胞内のウイルス複製を制限するために、先天性インターフェロン反応を調節することが提案されている（Ｓｉｑｕｅｉｒｏｓ－Ｃｅｎｄｏｎら、２０１４）。治療により、ウイルス複製の用量依存的減少が観察された（図６Ｃ）。これは、ラクトフェリンで処置されたＨｕｈ－７細胞におけるＩＦＮβおよびインターフェロン刺激遺伝子ＩＳＧ１５、ＭＸ１、ビペリン、およびＩＦＩＴＭ３の上昇と一致していた（図６Ｄ）。興味深いことに、ホロおよびアポラクトフェリンの両方によって、強力な抗ウイルス効果が検出された。後者は、広く利用可能な栄養補助食品の構成要素である。全身的な鉄欠乏機構を含む作用モードを除外するために、タンパク質トランスフェリンが見出された。タンパク質トランスフェリンは、２．３μＭの濃度で抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を欠くことが見出された（図６Ｅ）。最後に、生理学的に関連する誘導肺胞上皮細胞２型（ｉＡＥＣ）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するラクトフェリンの有効性を試験した（Ｊａｃｏｂら、２０１７；Ｊａｃｏｂら、２０１９；Ｈｕｒｌｅｙら、２０２０）。Ｈｕｈ－７細胞での本発明者らの知見と一致して、ラクトフェリン（１．１５μＭ）を使用したｉＡＥＣの前処置は、１０のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞の比率の２倍の減少をもたらした（表６Ｆ）。
【0067】
抗ウイルス療法のための臨床的に効果的な計画は、組み合わせ（または「薬物カクテル」）手法を使用する。組み合わせ手法では、ウイルスのライフサイクルの様々な段階を標的とし、単剤選択圧から獲得される薬物耐性のリスクを最小限にするために、様々な作用機構を有する化合物が同時に使用される。これは、特にＲＮＡウイルスに当てはまる。それらは非常に多様であり、薬剤耐性を迅速に発達させることができる（Ｐａｌｌｅｌａら）。ラクトフェリンの高い単剤の有効性を考慮して、ヒドロキシクロロキンまたはレムデシビルとの組み合わせが、全体的な抗ウイルス活性を改善し得るかどうかが試験された。ラクトフェリンは、レムデシビル（図６Ｇ）およびヒドロキシクロロキン（図６Ｈ）の両方の有効性を増強することがわかった。それらは、現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療法を探索している（図７）。ラクトフェリンとの組み合わせ療法は、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの治療において、中毒を減らすこと（例えば、ヒドロキシコルキン）または摂取を減らすこと（例えば、レムデシビル）によって有益であり得る。
【0068】
〔考察〕
本発明のための実施形態を展開する過程で行われた実験では、ＦＤＡに承認された化合物の迅速なスクリーニングを可能にするハイコンテンツの画像化および形態学的プロファイリングに基づいて、機械学習を活用して潜在的な作用機構を決定する実験的ワークフローが開発された。インビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を制限する１５のＦＤＡに承認された化合物が同定された。これらのうち、６つは以前に報告されており、本発明者らのエンドポイントおよび実験的手法のベンチマーク検証として役立っており、９つはこれまで知られていなかった。この手法は多用途（すなわち、形質転換された、およびより生理学的に関連する非形質転換細胞株の両方に適用させることができる）として実証され、感染の出現特性、ならびに化学的阻害を通して変動させることができる新規の表現型を同定することができる。
本発明のための実施形態を展開する過程で行われた実験では、ＦＤＡに承認された化合物の迅速なスクリーニングを可能にするハイコンテンツの画像化および形態学的プロファイリングに基づいて、機械学習を活用して潜在的な作用機構を決定する実験的ワークフローが開発された。インビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を制限する１５のＦＤＡに承認された化合物が同定された。これらのうち、６つは以前に報告されており、本発明者らのエンドポイントおよび実験的手法のベンチマーク検証として役立っており、９つはこれまで知られていなかった。この手法は多用途（すなわち、形質転換された、およびより生理学的に関連する非形質転換細胞株の両方に適用させることができる）として実証され、感染の出現特性、ならびに化学的阻害を通して変動させることができる新規の表現型を同定することができる。
【0069】
ハイコンテンツの形態学的プロファイリング手法は、再利用のための薬物を選択し、優先順位を付けるための画像細胞計算（陽性率を表にする）およびプレートリーダーアッセイよりも優れている。ウイルス染色は、単なるウイルス感染（または阻害）の絶対的な尺度ではなく、感染歴の詳細な調査、ならびに、合胞体の形成の阻害、ウイルス侵入、またはウイルス複製、および宿主細胞の調節を含む多数の表現型標的の観察の出発点である。Ｓｃｒｉｐｐｓ／Ｒｅｆｒａｍｅｄｂ（Ｒｉｖａら、２０２０）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｋｏｒｅａ（Ｊｅｏｎら）、および、Ｒｅｃｕｒｓｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ（Ｈｅｉｓｅｒら、２０２０）の研究を含む様々なアッセイ技術および細胞モデルを用いた他の薬物再利用スクリーニングとは対照的に、本研究者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する真正の抗ウイルス活性を有する化合物のみではなく、関連する作用機構もまた報告する。
【0070】
ＵＭＡＰの可視化は、細胞塗布スタイルアッセイからの細胞表現型の調査において重要な進歩であり（Ｂｒａｙら、２０１６）、薬理学的変動を特徴付けるための計画である。本明細書に記載される実験では、ＵＭＡＰの埋め込みは１細胞当たり６６０の測定を行う。それらは特徴ベクトルを含み、表現型の天然クラスター化を視覚化するために、それらを２次元グラフに投影する。この非線形データ低減技術は、天然の表現型クラスターを同定するのに優れている。再利用スクリーニングでは、ウイルスに感染した細胞集団の同定に非常に効果的であり、ウェル内部のウイルス感染歴の進行が明確に見られた。非感染の状態では、細胞は正常な細胞表現型を反映して主なクラスター本体に投影する。Ｈｕｈ７細胞株では、脂質蓄積および核サイズ／核形状／核組織に顕著な差異があり、細胞の約１０％が細胞分裂を受けている。これらの生物学的プロセスは、クラスターエリア内の個々の細胞を観察することによって明確に見ることができる。図５では、ＲＯＩ ６細胞は有糸分裂的に活性であり、主なクラスター本体とＲＯＩ ６との間に弱い結合を見ることができ、主なクラスター本体で始まり、ＲＯＩ ６に進み、主なクラスター本体に戻る細胞サイクル歴を表す。同様に、細胞が主なクラスター本体で始まり、遠くの北東クラスター本体を横断し（ＲＯＩ １－４）するウイルス感染プロセスとの関連において、疑似時間が観察され得る。ここで、点状のウイルスシグナルで始まり、単離された感染した細胞に進行し、周囲の細胞の感染および合胞体の形成で終わる（ＲＯＩ ３）ウイルス感染の進行を観察することができる。有効性（ＲＯＩ １－４の密度低下）ならびに主な細胞本体の薬理学的変動を効果的に特徴付けるために、ＵＭＡＰ分析を用いた。例えば、細胞障害性薬剤／細胞増殖抑制薬剤によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の有効性に関する多数の報告がある。これらの薬物処置されたウェルがＵＭＡＰ座標系に埋め込まれると、有糸分裂クラスターは消失し、主なクラスター本体の主要な移動が感染した細胞クラスターの減少と共に存在する。これは、非感染の細胞が著しく変動し、ウイルス複製の阻害要因が転写／翻訳の全体的な停止に起因することを示す。これは、ＵＭＡＰの埋め込みがレムデシビルを使用して観察されるように、非感染集団において最小の変動で有効な化合物の優先順位付けを助けることができることを実証する。
【0071】
重要なことに、本明細書に記載される実験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の病因に新しい分子標的／分子経路を関与させ、臨床的に試験可能かつ容易に変換可能な仮説を生み出す薬物を同定した。例えば、胃食道逆流症を治療し、悪心および嘔吐を含む他の胃腸症状を予防するために使用される強力なＤ２受容体拮抗薬であるメトクロプラミドの用量依存性抗ウイルス活性が観察された（ＨｉｂｂｓおよびＬｏｒｃｈ、２００６）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者の半数以上で胃腸症状の報告が増加している（Ｌｉｎら、２０２０）。特に、ヒドロキシクロロキン、ロピナビル－リトナビル、トシリズマブなどの治験薬は、胃腸および肝臓の有害事象と関連する可能性があり、したがって、すでに重篤な胃腸症状を経験している患者には理想的ではない（Ｈａｊｉｆａｔｈａｌｉａｎら、２０２０）。したがって、メトクロプラミドは、ＣＯＶＩＤ－１９患者にとって興味深い二標的治療の選択肢である。
【0072】
たいていのＦＤＡに承認された薬物はヒト分子標的を対象とするため、スクリーニングはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関与する重要な宿主因子の同定に役立った。カテプシンＢ、カテプシンＬ、およびカテプシンＳを含むシステインプロテアーゼの不可逆的阻害剤であるＺ－ＦＡ－ＦＭＫは、強力な抗ウイルス活性を示した（Ｒｏｓｃｏｗら、２０１８）。偽ウイルスを用いた最近の報告では、カテプシンＬがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の重要な侵入因子であることを示した（Ｏｕら、２０２０）。Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫの抗ウイルス効果は、カテプシンＬがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染との関連においてもまた必要条件であることを示唆し、この分子がウイルス侵入を研究するための有用な調査ツールであり得ることを示唆する。同様に、フェドラチニブは凝固および線維症を引き起こす稀な血液癌である骨髄増殖性新生物について、２０１９年にＦＤＡによって承認された経口的に生物学的に利用可能な半選択的ＪＡＫ２阻害剤である（Ｐａｒｄａｎａｎｉら、２００７）。ＪＡＫ－阻害剤は、ＴＨ１７媒介炎症反応を特異的に阻害するためにＣＯＶＩＤ－１９について提案されている（ＷｕおよびＹａｎｇ ２０２０；Ｚｈａｎｇら、２０２０）。加えて、ＪＡＫ－阻害剤は、クラスリン媒介ウイルスエンドサイトーシスに関与する麻痺関連キナーゼ（ＮＡＫ）を遮断することが提唱されている（Ｓｔｅｂｂｉｎｇら、２０２０）。現在、バリシチニブ（中等度から重度のコロナの治療）、ジャコチニブ（ＣｈｉＣＴＲ２００００３０１７０）、およびルキソリチニブ（ＣｈｉＣＴＲ２００００２９５８０）を含むいくつかのＪＡＫ阻害剤が、ＣＯＶＩＤ－１９管理のための治験において評価されている。ＦＤＡに承認された４つのＪＡＫ阻害剤、すなわち、バリシチニブ、ルキソリチニブ、トファシチニブ、およびフェドラチニブのうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して活性を示したのは最後のみであり、ＩＣ５０は２５ｎＭであった。しかしながら、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を阻害することが保護的インターフェロン反応を制限する可能性があるという多少の懸念がある（Ｆａｖａｌｌｉら、２０２０）。
【0073】
シグマ受容体（ＳｉｇｍａＲ１／Ｒ２）は、小胞体ストレス反応および脂質ホメオスタシス（Ｄｅｌｐｒａｔら、２０２０）、Ｈｕｈ－７細胞におけるＣ型肝炎ウイルス感染の初期段階に関与しているプロセス（Ｆｒｉｅｓｌａｎｄら、２０１３）、およびコロナウイルス病因（ＦｕｎｇおよびＬｉｕ ２０１４）、を媒介する許容シャペロンである。２つのシグマ受容体モジュレーター、すなわち、強力な抗ウイルス活性を有するアミオダロン（ＳｉｇｍａＲ１ ＩＣ５０：１．４ｎＭ、ＳｉｇｍａＲ２ ＩＣ５０：１ｎＭ）（Ｍｏｅｂｉｕｓら、１９９７）、およびＳ１ＲＡ（Ｅ－５２８６２；ＳｉｇｍａＲ１ ＩＣ５０：１７ｎＭ拮抗薬、ＳｉｇｍａＲ２ ＩＣ５０：＞１μＭ）（Ｄｉａｚら、２０１２）が同定され、限定された細胞毒性を有する５２ｎＭのＩＣ５０および２２２ｎＭのＩＣ５０をそれぞれ実証した。アミオダロンは不整脈の治療のために承認されているが、ヒドロキシクロロキンと同様に、その治療の可能性を制限するｈＥＲＧイオンチャネルの阻害による強力な心毒性副作用を有する（Ｔｏｒｒｅｓら、１９８６）。Ｓ１ＲＡは神経因性疼痛の治療のための第２相治験を完了している（Ｖｉｄａｌ－Ｔｏｒｒｅｓら、２０１４；Ｇｒｉｓら、２０１６）。Ｇｏｒｄｏｎらは、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞中にてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害するいくつかの他のシグマＲ１／Ｒ２モジュレーターを同定したが、Ｓ１ＲＡに対する抗ウイルス活性は観察されなかった（Ｇｏｒｄｏｎら、２０２０）。このことは、Ｓ１ＲＡ活性がそれぞれの細胞株に特異的な宿主細胞因子に依存しており、ヒト細胞がこの化合物に対してより敏感に反応し得ることを示唆している。
【0074】
最も注目すべきことに、スクリーニングは、多様な有効性を用いて、インビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害剤としてラクトフェリンを実証する。有効性は、気道上皮の非形質転換および気道上皮の臨床的に関連するｉＰＳＣ由来モデルを含む複数の細胞型において示された。ラクトフェリン遺伝子発現は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染に反応して高度にアップレギュレートされることが以前に示されている（Ｒｅｇｈｕｎａｔｈａｎら、２００５）。ナチュラルキラー細胞および好中球活性の増強に加えて、ラクトフェリンは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を介してウイルス侵入を遮断する。興味深いことに、ラクトフェリンは、最大２４時間ｐ．ｉ．まで抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を保持する。このことは、単純な侵入阻害以外のさらなる作用機構を示唆する。決定的かつ完全な作用機構には依存しないが、記載された結果はラクトフェリンでの治療の際に、いくつかのインターフェロン刺激遺伝子の発現の増加を介して有意な宿主細胞調節を示した。さらに、ラクトフェリンはＩＬ－６の産生を低下させることが以前に示されている（Ｃｕｔｏｎｅら、２０１４）。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって産生される「サイトカインストーム」の重要なプレーヤーのうちの１つである（Ｃｏｎｔｉら、２０２０；Ｌａｇｕｎａｓ－ＲａｎｇｅｌおよびＣｈａｖｅｚ－Ｖａｌｅｎｃｉａ、２０２０）。重要なことに、本発明者らは、ラクトフェリンがホロ形態およびアポ形態の両方で活性を保持し、後者が経口的に利用可能なラクトフェリンサプリメントの構成要素であることを見出した。経口的に利用可能なラクトフェリンは、ＣＯＶＩＤ－１９患者に存在する胃腸症状を軽減するのに特に効果的であり得る（Ｈａｎら、２０２０）。機構はラクトフェリンが先天性免疫反応の誘発を介してヒトノロウイルス感染をどのように減少させるかに類似し得（Ｏｄａら、２０２０）、特に、ラクトフェリン遺伝子多型は感染性下痢に対する感受性の増加に関連している（Ｍｏｈａｍｅｄら、２００７）。ラクトフェリンが胃腸管におけるウイルス量を減少させると、ＣＯＶＩＤ－１９の糞口伝播を減少させることができる（Ｇｕら、２０２０）。
【0075】
組み合わせ療法はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を効果的に治療するために必要とされる可能性が高く、この手法はいくつかの有望性を既に示している。例えば、インターフェロンβ－１ｂと、ロピナビル－リトナビルと、リバビリンとの組み合わせ療法は、前向き非盲検無作為化第２相試験にて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する有効性を示した（Ｈｕｎｇら、２０２０）。本明細書に記載される結果は、ラクトフェリンが、レムデシビルおよびヒドロキシクロロキンの両方の抗ウイルス活性を増強し、これら薬物との組み合わせ療法として使用され得ることを実証した。それらは、現在、ＣＯＶＩＤ－１９の治療のために使用または研究されている。その広い利用可能性、わずかなコスト、および副作用が存在しないことの理由から、ラクトフェリンはＣＯＶＩＤ－１９の予防および管理の両方のための迅速に展開可能な選択であり得る。
【0076】
細胞およびウイルス
ＶｅｒｏＥ６細胞、Ｃａｃｏ２細胞、およびＨｕｈ７細胞は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、Ｌ‐グルタミン、および１Ｘ抗生物質－抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ）を使用したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）中、５％のＣＯ２を用いて、３７℃に維持された。ｉＰＳＣ由来気道上皮細胞株（ｉＡＥＣ）を、以前に記載された分化プロセスに基づいて培養させた（Ｈｕｒｌｅｙら、２０２０）。簡単に述べると、ｉＰＳＣは、二次元細胞培養において、ＮＫＸ２．１陽性肺内胚葉に分化される。ＮＫＸ２．１陽性細胞はフロー選別され、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に埋め込まれ、「ＣＫ＋ＤＣＩ＋Ｙ」培地中で培養され、肺胞分化を促した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＡ１菌株を、ＶｅｒｏＥ６細胞中で培養させた。ウイルス力価は、顕微鏡スコアリングによって、ＶｅｒｏＥ６細胞中にて、ＴＣＩＤ５０アッセイ（リード・アンド・ミュンヒ法）によって決定された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いた全ての試験は、ミシガン大学の研究所バイオセーフティー委員会（ＩＢＣ）および環境安全衛生委員会（ＥＨＳ）によって使用が承認された研究室でのコンテインメント手順に従って、バイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ３）プロトコールの下、ミシガン大学において実施された。
ＶｅｒｏＥ６細胞、Ｃａｃｏ２細胞、およびＨｕｈ７細胞は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、Ｌ‐グルタミン、および１Ｘ抗生物質－抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ）を使用したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）中、５％のＣＯ２を用いて、３７℃に維持された。ｉＰＳＣ由来気道上皮細胞株（ｉＡＥＣ）を、以前に記載された分化プロセスに基づいて培養させた（Ｈｕｒｌｅｙら、２０２０）。簡単に述べると、ｉＰＳＣは、二次元細胞培養において、ＮＫＸ２．１陽性肺内胚葉に分化される。ＮＫＸ２．１陽性細胞はフロー選別され、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に埋め込まれ、「ＣＫ＋ＤＣＩ＋Ｙ」培地中で培養され、肺胞分化を促した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＡ１菌株を、ＶｅｒｏＥ６細胞中で培養させた。ウイルス力価は、顕微鏡スコアリングによって、ＶｅｒｏＥ６細胞中にて、ＴＣＩＤ５０アッセイ（リード・アンド・ミュンヒ法）によって決定された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いた全ての試験は、ミシガン大学の研究所バイオセーフティー委員会（ＩＢＣ）および環境安全衛生委員会（ＥＨＳ）によって使用が承認された研究室でのコンテインメント手順に従って、バイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ３）プロトコールの下、ミシガン大学において実施された。
【0077】
ウイルス定量：増殖動態およびＲＴ－ｑＰＣＲアッセイ
ＶｅｒｏＥ６細胞、Ｃａｃｏ２細胞、およびＨｕｈ７細胞は、一晩培養された２×１０＾４細胞／ウェルで４８のウェルプレート中、５％のＣＯ２を用いて３７℃で播種した。次いで、細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＡ１を０．２の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染から１時間後、細胞は採取されるか（感染０日目）、または３７℃で１日間ｐ．ｉ．、２日間ｐ．ｉ．、および３日間ｐ．ｉ．保たれた。ウイルス力価の決定は、全てのウイルスのＶｅｒｏＥ６細胞（上清および細胞内画分）について、ＴＣＩＤ５０アッセイによって実施された。あるいは、細胞はトリゾールで採取され、全ての細胞およびウイルスＲＮＡはＺｙｍｏＧｅｎ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ抽出キットで抽出された。ウイルスＲＮＡは、２０１９－ｎＣｏＶ ＣＤＣ ｑＰＣＲプローブアッセイおよびプローブセットＮ１（ＩＤＴ技術）を用いて、ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量された。ＩＦＮβ、ビペリン、ＭＸ１、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ３、およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルは、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、特異的プライマー（ＩＦＮβ：Ｆ－ＴＴＧＡＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＴＴＡＡＧＣ（配列番号：１）、Ｒ－ＴＣＣＣＡＣＧＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡ（配列番号：２）；ＭＸ１：Ｆ－ＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣ（配列番号：３）、Ｒ－ＡＧＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：４）；ＩＳＧ１５：Ｆ－ＴＧＧＣＧＧＧＣＡＡＣＧＡＡＴＴ（配列番号：５）、Ｒ－ＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＧＣＣＴＴＣＡ（配列番号：６）；ＩＦＩＴＭ３：Ｆ－ＴＣＣＣＡＣＧＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡ（配列番号：７）、Ｒ－ＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＴＧＣＡＣＴ（配列番号：８）；ＧＡＰＤＨ：Ｆ－ＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣ（配列番号：９）、Ｒ－ＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡ（配列番号：１０））を用いて、ｑＰＣＲによって定量された。非感染の未処置Ｈｕｈ－７に対するΔΔＣｔ方法を使用することによって、倍率の増加が計算された。
ＶｅｒｏＥ６細胞、Ｃａｃｏ２細胞、およびＨｕｈ７細胞は、一晩培養された２×１０＾４細胞／ウェルで４８のウェルプレート中、５％のＣＯ２を用いて３７℃で播種した。次いで、細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＡ１を０．２の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染から１時間後、細胞は採取されるか（感染０日目）、または３７℃で１日間ｐ．ｉ．、２日間ｐ．ｉ．、および３日間ｐ．ｉ．保たれた。ウイルス力価の決定は、全てのウイルスのＶｅｒｏＥ６細胞（上清および細胞内画分）について、ＴＣＩＤ５０アッセイによって実施された。あるいは、細胞はトリゾールで採取され、全ての細胞およびウイルスＲＮＡはＺｙｍｏＧｅｎ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ抽出キットで抽出された。ウイルスＲＮＡは、２０１９－ｎＣｏＶ ＣＤＣ ｑＰＣＲプローブアッセイおよびプローブセットＮ１（ＩＤＴ技術）を用いて、ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量された。ＩＦＮβ、ビペリン、ＭＸ１、ＩＳＧ１５、ＩＦＩＴＭ３、およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルは、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、特異的プライマー（ＩＦＮβ：Ｆ－ＴＴＧＡＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＴＴＡＡＧＣ（配列番号：１）、Ｒ－ＴＣＣＣＡＣＧＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡ（配列番号：２）；ＭＸ１：Ｆ－ＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣ（配列番号：３）、Ｒ－ＡＧＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号：４）；ＩＳＧ１５：Ｆ－ＴＧＧＣＧＧＧＣＡＡＣＧＡＡＴＴ（配列番号：５）、Ｒ－ＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＧＣＣＴＴＣＡ（配列番号：６）；ＩＦＩＴＭ３：Ｆ－ＴＣＣＣＡＣＧＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡ（配列番号：７）、Ｒ－ＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＴＧＣＡＣＴ（配列番号：８）；ＧＡＰＤＨ：Ｆ－ＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣ（配列番号：９）、Ｒ－ＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡ（配列番号：１０））を用いて、ｑＰＣＲによって定量された。非感染の未処置Ｈｕｈ－７に対するΔΔＣｔ方法を使用することによって、倍率の増加が計算された。
【0078】
ウイルス感染性アッセイ
３８４のウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６０５７３００）は、Ｈｕｈ－７細胞を用いて３０００細胞／ウェルで播種され、一晩接着させた。次いで、化合物が細胞に添加され、４時間培養された。その後、プレートはＢＳＬ３コンテインメントに移された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＡ１を使用して、１０μＬの添加にて、０．２の感染多重度（ＭＯＩ）で振盪しながらウイルスを分散させ、感染させた。吸収の１時間後、ウイルス接種材料は除去され、培地は新鮮な化合物と交換された。非感染の細胞およびビヒクル処置された細胞を、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとして含めた。感染後２日間、細胞は４％のＰＦＡで、室温で、３０分間固定され、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理され、抗体緩衝剤（１．５％のＢＳＡ、１％のヤギ血清、および０．００２５％のＴｗｅｅｎ２０）でブロックされた。次いで、最適化された蛍光色素セット、すなわち、４Ｃで一晩処置された抗ヌクレオカプシドＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ， Ｃａｔ＃ ＡＢＩＮ６９５２４３２）を用いて染色し、続いて二次抗体Ａｌｅｘａ－６４７（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ ＦＩｓｈｅｒ、Ａ２１２３５）、核染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈ１３９８）のためのＨｏｅｃｈｓｔ－３３３４２ Ｐｅｎｔａｈｙｄｒａｔｅ（ｂｉｓ－Ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）、ＨＣＳ ＬｉｐｉｄＴＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｌｉｐｉｄ染色（Ｔｈｅｒｍｏ ＦＩｓｈｅｒ、Ｈ３４４７５）、および細胞描写のためのＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｏｒａｎｇｅを用いて染色するために、プレートは密封され、表面を除染され、ＢＳＬ２に移された。３Ｄ培養にて維持されたｉＰＳＣ（ボストン大学 ＳＰＣ２－ＳＴ－Ｂ２）由来肺胞上皮細胞（ｉＡＥＣ）は、単一細胞に分離され、８０００細胞／ウェルの播種密度で、コラーゲンで被覆された３８４ウェルプレート中に播種され、７２時間にわたって増殖させた。以下の感染、化合物処置、および固定は、Ｈｕｈ－７のものと同一であった。ｉＰＳＣ由来の肺胞上皮細胞の染色プロトコールは、ＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅの代わりに、抗アセチル化チューブリン一次抗体（細胞シグナル伝達、５３３５）の追加、およびさらなる二次Ａｌｅｘａ４８８（ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７１１－５４５－１５２）の使用により、わずかに異なった。
３８４のウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６０５７３００）は、Ｈｕｈ－７細胞を用いて３０００細胞／ウェルで播種され、一晩接着させた。次いで、化合物が細胞に添加され、４時間培養された。その後、プレートはＢＳＬ３コンテインメントに移された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＡ１を使用して、１０μＬの添加にて、０．２の感染多重度（ＭＯＩ）で振盪しながらウイルスを分散させ、感染させた。吸収の１時間後、ウイルス接種材料は除去され、培地は新鮮な化合物と交換された。非感染の細胞およびビヒクル処置された細胞を、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとして含めた。感染後２日間、細胞は４％のＰＦＡで、室温で、３０分間固定され、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理され、抗体緩衝剤（１．５％のＢＳＡ、１％のヤギ血清、および０．００２５％のＴｗｅｅｎ２０）でブロックされた。次いで、最適化された蛍光色素セット、すなわち、４Ｃで一晩処置された抗ヌクレオカプシドＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ， Ｃａｔ＃ ＡＢＩＮ６９５２４３２）を用いて染色し、続いて二次抗体Ａｌｅｘａ－６４７（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ ＦＩｓｈｅｒ、Ａ２１２３５）、核染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈ１３９８）のためのＨｏｅｃｈｓｔ－３３３４２ Ｐｅｎｔａｈｙｄｒａｔｅ（ｂｉｓ－Ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）、ＨＣＳ ＬｉｐｉｄＴＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｌｉｐｉｄ染色（Ｔｈｅｒｍｏ ＦＩｓｈｅｒ、Ｈ３４４７５）、および細胞描写のためのＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｏｒａｎｇｅを用いて染色するために、プレートは密封され、表面を除染され、ＢＳＬ２に移された。３Ｄ培養にて維持されたｉＰＳＣ（ボストン大学 ＳＰＣ２－ＳＴ－Ｂ２）由来肺胞上皮細胞（ｉＡＥＣ）は、単一細胞に分離され、８０００細胞／ウェルの播種密度で、コラーゲンで被覆された３８４ウェルプレート中に播種され、７２時間にわたって増殖させた。以下の感染、化合物処置、および固定は、Ｈｕｈ－７のものと同一であった。ｉＰＳＣ由来の肺胞上皮細胞の染色プロトコールは、ＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅの代わりに、抗アセチル化チューブリン一次抗体（細胞シグナル伝達、５３３５）の追加、およびさらなる二次Ａｌｅｘａ４８８（ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７１１－５４５－１５２）の使用により、わずかに異なった。
【0079】
化合物ライブラリー
薬物スクリーニングのために展開された化合物ライブラリーは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙからのＦＤＡに承認された薬物スクリーニングライブラリー（アイテム番号．２３５３８）を用いて作製された。８７５種の化合物のこのライブラリーにはさらなるＦＤＡに承認された薬物が補給され、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＴｏｃｒｉｓを含む他のベンダーからの臨床候補が合理的に含まれた。ライブラリーは５つの３８４ウェル化合物プレートにフォーマットされ、１０ｍＭでＤＭＳＯに溶解した。ホロラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌ４７６５）、アポラクトフェリン（Ｊａｒｒｏｗ Ｆｏｒｍｕｌａｓ、１２１０１１）およびトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ２０３６）は別々に取り扱われ、細胞培養培地に手作業で加えられた。希釈プレートは、２ｍＭ、１ｍＭ、５００μＭ、２５０μＭ、および５０μＭの濃度のｑＨＴＳについて作製された。
薬物スクリーニングのために展開された化合物ライブラリーは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙからのＦＤＡに承認された薬物スクリーニングライブラリー（アイテム番号．２３５３８）を用いて作製された。８７５種の化合物のこのライブラリーにはさらなるＦＤＡに承認された薬物が補給され、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＴｏｃｒｉｓを含む他のベンダーからの臨床候補が合理的に含まれた。ライブラリーは５つの３８４ウェル化合物プレートにフォーマットされ、１０ｍＭでＤＭＳＯに溶解した。ホロラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌ４７６５）、アポラクトフェリン（Ｊａｒｒｏｗ Ｆｏｒｍｕｌａｓ、１２１０１１）およびトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ２０３６）は別々に取り扱われ、細胞培養培地に手作業で加えられた。希釈プレートは、２ｍＭ、１ｍＭ、５００μＭ、２５０μＭ、および５０μＭの濃度のｑＨＴＳについて作製された。
【0080】
ｑＨＴＳ一次スクリーニングおよび用量反応確認
ｑＨＴＳスクリーニングのために、５０ｎＬのpin tool Caliper Life Sciences Sciclone ALH 3000 Advanced Liquid Handling systemを用いて、ミシガン大学の化学ゲノミクスセンター（ＣＣＧ）にて、化合物が細胞に添加された。２μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、および５０ｎＭの濃度が、一次スクリーニングに含まれた。ｑＨＴＳスクリーニング後、全ての化合物がＨＰ Ｄ３００ｅデジタル化合物ディスペンサー（HP D300e Digital Compound Dispenser）を用いて分配され、０．１％ＤＭＳＯの最終ＤＭＳＯ濃度に正規化された。確認用量反応は、３回で、かつ１０点：２倍希釈で実施された。
ｑＨＴＳスクリーニングのために、５０ｎＬのpin tool Caliper Life Sciences Sciclone ALH 3000 Advanced Liquid Handling systemを用いて、ミシガン大学の化学ゲノミクスセンター（ＣＣＧ）にて、化合物が細胞に添加された。２μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、および５０ｎＭの濃度が、一次スクリーニングに含まれた。ｑＨＴＳスクリーニング後、全ての化合物がＨＰ Ｄ３００ｅデジタル化合物ディスペンサー（HP D300e Digital Compound Dispenser）を用いて分配され、０．１％ＤＭＳＯの最終ＤＭＳＯ濃度に正規化された。確認用量反応は、３回で、かつ１０点：２倍希釈で実施された。
【0081】
画像化
染色された細胞板は、２０Ｘ／０．４５ＮＡ ＬＵＣＰｌａｎ ＦＬＮ対物レンズを用いて、Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＱ１およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＣＸ５ハイコンテンツ顕微鏡の両方について画像化された。Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＱ１画像化は、４つの励起レーザ線（４０５ｎｍ／４８８ｎｍ／５６１ｎｍ／６４０ｎｍ）を用いて、回転ディスク共焦点および１００ｍｓの露光時間で行われた。レーザ出力を調整し、それぞれのチャネルについて最適なシグナル対ノイズ比を得た。最大強度投影画像は、３ミクロンステップサイズを有する５つの共焦点面から収集された。レーザーオートフォーカスが実施され、ウェル面積の約８０％をカバーする１ウェル当たり９照射野が画像化された。ＬＥＤ励起（３８６／２３ｎｍ、４８５／２０ｎｍ、５６０／２５ｎｍ、６５０／１３ｎｍ）を有するＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＣＸ５もまた使用され、シグナル／バックグラウンドを最大にするように露光時間が最適化された。Ｈｏｅｃｈｓｔチャネル上の画像に基づくオートフォーカスによって決定されるように、９照射野が単一のＺ面で収集された。一次ｑＨＴＳスクリーニングはＣＸ５画像を用いて実施され、全ての用量反応プレートはＣＱ１を用いて画像化された。
染色された細胞板は、２０Ｘ／０．４５ＮＡ ＬＵＣＰｌａｎ ＦＬＮ対物レンズを用いて、Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＱ１およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＣＸ５ハイコンテンツ顕微鏡の両方について画像化された。Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＱ１画像化は、４つの励起レーザ線（４０５ｎｍ／４８８ｎｍ／５６１ｎｍ／６４０ｎｍ）を用いて、回転ディスク共焦点および１００ｍｓの露光時間で行われた。レーザ出力を調整し、それぞれのチャネルについて最適なシグナル対ノイズ比を得た。最大強度投影画像は、３ミクロンステップサイズを有する５つの共焦点面から収集された。レーザーオートフォーカスが実施され、ウェル面積の約８０％をカバーする１ウェル当たり９照射野が画像化された。ＬＥＤ励起（３８６／２３ｎｍ、４８５／２０ｎｍ、５６０／２５ｎｍ、６５０／１３ｎｍ）を有するＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＣＸ５もまた使用され、シグナル／バックグラウンドを最大にするように露光時間が最適化された。Ｈｏｅｃｈｓｔチャネル上の画像に基づくオートフォーカスによって決定されるように、９照射野が単一のＺ面で収集された。一次ｑＨＴＳスクリーニングはＣＸ５画像を用いて実施され、全ての用量反応プレートはＣＱ１を用いて画像化された。
【0082】
画像分割および特徴抽出
オープンソースのＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアは、分割、特徴抽出、およびＭｙＳＱＬを使用するＡｍａｚｏｎ ＲＤＳリレーショナルデータベースに記録される結果のために、Ｕｂｕｎｔｕ Ｌｉｎｕｘに基づく分散型Ａｍａｚｏｎ ＡＷＳクラウド実装にて使用された。特徴抽出のために、核、細胞、細胞質、核小体、中性脂質滴、および合胞体を自動的に同定するためのパイプラインが開発された。複数強度特徴および半径方向分布は、それぞれの物体についてそれぞれのチャネルで測定され、細胞サイズおよび形状特徴が測定された。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ－３３３４２画像を用いて分割され、核マスクをＣｅｌｌ Ｍａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ画像の縁部に拡張することによって、全ての細胞マスクが生成された。
オープンソースのＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアは、分割、特徴抽出、およびＭｙＳＱＬを使用するＡｍａｚｏｎ ＲＤＳリレーショナルデータベースに記録される結果のために、Ｕｂｕｎｔｕ Ｌｉｎｕｘに基づく分散型Ａｍａｚｏｎ ＡＷＳクラウド実装にて使用された。特徴抽出のために、核、細胞、細胞質、核小体、中性脂質滴、および合胞体を自動的に同定するためのパイプラインが開発された。複数強度特徴および半径方向分布は、それぞれの物体についてそれぞれのチャネルで測定され、細胞サイズおよび形状特徴が測定された。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ－３３３４２画像を用いて分割され、核マスクをＣｅｌｌ Ｍａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ画像の縁部に拡張することによって、全ての細胞マスクが生成された。
【0083】
データ前処理
細胞レベルのデータは前処理され、オープンソースＫｎｉｍｅ分析プラットホーム（Ｂｅｒｔｈｏｌｄら、２００９）で分析された。細胞レベルのデータはＭｙＳＱＬからＫｎｉｍｅにインポートされ、薬物治療メタデータは結合され、特徴は中心付けられてスケーリングされた。特徴は、低分散（＜５％）および高相関（＞９５％）について取り除かれ、１細胞当たり６６０の特徴をもたらした。
細胞レベルのデータは前処理され、オープンソースＫｎｉｍｅ分析プラットホーム（Ｂｅｒｔｈｏｌｄら、２００９）で分析された。細胞レベルのデータはＭｙＳＱＬからＫｎｉｍｅにインポートされ、薬物治療メタデータは結合され、特徴は中心付けられてスケーリングされた。特徴は、低分散（＜５％）および高相関（＞９５％）について取り除かれ、１細胞当たり６６０の特徴をもたらした。
【0084】
機械学習－感染性スコアおよび照射野レベルスコアリング
統計的言語および環境Ｒで実施された多重ロジスティック回帰を用いて、感染したウェル内の細胞に特徴的な特性を同定した。定量的ハイスループットスクリーニングの最初の５つのプレートシリーズにて、感染コントロールウェルおよび非感染コントロールウェルからの細胞にモデルを適合させた。独立した基準として、これらのロジスティック回帰モデルが手動で選択された個々の感染した細胞および非感染の細胞のセットに対して検証され、基準上の性能を低下させた特徴はモデルから除外された。最終モデルには、細胞および細胞質のＲＯＩにおけるウイルスチャネル強度の特徴のみが含まれた。最初の分類基準として、基準におけるウイルス感染した細胞の最小値が用いられた。最終的な判定基準を式．１に示す。
統計的言語および環境Ｒで実施された多重ロジスティック回帰を用いて、感染したウェル内の細胞に特徴的な特性を同定した。定量的ハイスループットスクリーニングの最初の５つのプレートシリーズにて、感染コントロールウェルおよび非感染コントロールウェルからの細胞にモデルを適合させた。独立した基準として、これらのロジスティック回帰モデルが手動で選択された個々の感染した細胞および非感染の細胞のセットに対して検証され、基準上の性能を低下させた特徴はモデルから除外された。最終モデルには、細胞および細胞質のＲＯＩにおけるウイルスチャネル強度の特徴のみが含まれた。最初の分類基準として、基準におけるウイルス感染した細胞の最小値が用いられた。最終的な判定基準を式．１に示す。
【0085】
（式．１）：細胞が感染している場合（Ｃｅｌｌｓ＿Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ＿ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙＥｄｇｅ＿Ｖｉｒｕｓ×０．１４８７０２５＋Ｃｅｌｌｓ＿Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ＿ＭｅａｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙＥｄｇｅ＿Ｖｉｒｕｓ×－３８．４０１９６＋Ｃｅｌｌｓ＿Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ＿ＭａｘＩｎｔｅｎｓｉｔｙＥｄｇｅ＿Ｖｉｒｕｓ×４２．７０２６９＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ＿Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ＿ＳｔｄＩｎｔｅｎｓｉｔｙ＿Ｖｉｒｕｓ×４２．５４８４９）≧１．５２５２８５。
【0086】
次いで、感染したコントロールからの個々の照射野画像は、照射野内の全ての細胞にわたる平均特徴値が式１の基準を上回った場合に、感染が確認されたと分類された。それぞれの照射野における全ての６６０の細胞プロファイラーの特徴の平均値を用いて、ランダムフォレスト分類器が仕立てられ、感染が確認された照射野に対する非感染コントロール照射野のカテゴリーに属する可能性を予測した。このランダムフォレスト分類器のアウトプットは、全体を通して「Ｐｒｏｂｐｏｓ」（陽性、非感染コントロールについて）として報告される。８０／２０交差検証を用いて、照射野レベルの平均特徴値／中央特徴値が計算され、ランダムフォレストモデルを陽性コントロール（３２の非感染ウェル）と陰性コントロール（３２の感染ウェル、０．１％のＤＭＳＯビヒクルで処置された）との間に適合させた。化合物で処理されたウェルはＲＦモデルでスコア化され、有効性スコアは個々のプレートに対して正規化された。
【0087】
ＵＭＡＰ埋め込み
ＭＰＬｅａｒｎ（v0.1.0、https://github.com/momeara/MPLearn）のｅｍｂｅｄ＿ｕｍａｐの適用を使用して、ＵＭＡＰ埋め込みを生成した。簡潔に述べると、それぞれ１組の細胞、それぞれの特徴がプレートごとに標準化され、ｓｋｌｅａｒｎ．ＩｎｃｒｅｍｅｎｔａｌＰＣＡ（ｎ＿ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ＝３７９、ｂａｔｃｈ＿ｓｉｚｅ＝１０００）を使用して共同直交化された。次に、ｕｍａｐ－ｌｅａｒｎ（ｖ０．４．１）（ＭｃＩｎｎｅｓら、２０１８）、および、ｕｍａｐＵＭＡＰ（ｎ＿ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ＝２、ｎ＿ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ＝１５、ｍｉｎ＿ｄｉｓｔ＝０、ｉｎｉｔ＝’ｓｐｅｃｔｒａｌ’、ｌｏｗ＿ｍｅｍｏｒｙ＝Ｔｒｕｅ、ｖｅｒｂｏｓｅ＝Ｔｒｕｅ）を使用して、特徴が２次元に埋め込まれた。Ｈｏｌｏｖｉｅｓ Ｄａｔａｓｈａｄｅｒ（ｖ１．１２．７）（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２０１５）を使用して、ヒストグラム同等化およびビリジスカラーマップを用いて埋め込みを視覚化した。
ＭＰＬｅａｒｎ（v0.1.0、https://github.com/momeara/MPLearn）のｅｍｂｅｄ＿ｕｍａｐの適用を使用して、ＵＭＡＰ埋め込みを生成した。簡潔に述べると、それぞれ１組の細胞、それぞれの特徴がプレートごとに標準化され、ｓｋｌｅａｒｎ．ＩｎｃｒｅｍｅｎｔａｌＰＣＡ（ｎ＿ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ＝３７９、ｂａｔｃｈ＿ｓｉｚｅ＝１０００）を使用して共同直交化された。次に、ｕｍａｐ－ｌｅａｒｎ（ｖ０．４．１）（ＭｃＩｎｎｅｓら、２０１８）、および、ｕｍａｐＵＭＡＰ（ｎ＿ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ＝２、ｎ＿ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ＝１５、ｍｉｎ＿ｄｉｓｔ＝０、ｉｎｉｔ＝’ｓｐｅｃｔｒａｌ’、ｌｏｗ＿ｍｅｍｏｒｙ＝Ｔｒｕｅ、ｖｅｒｂｏｓｅ＝Ｔｒｕｅ）を使用して、特徴が２次元に埋め込まれた。Ｈｏｌｏｖｉｅｓ Ｄａｔａｓｈａｄｅｒ（ｖ１．１２．７）（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２０１５）を使用して、ヒストグラム同等化およびビリジスカラーマップを用いて埋め込みを視覚化した。
【0088】
ＨＣ Ｓｔｒａｔｏｍｉｎｅｒ
ヒットコールのための独立方法として、ＨＣ Ｓｔｒａｔｏｍｉｎｅｒ（Ｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ ＮＬ）（Ｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ ＮＬ）が用いられ、完全に自動化された／合理化された細胞レベルのデータ前処理およびスコア生成を行う。ＩＣ Ｓｔｒａｔｏｍｉｎｅｒはまた、ｑＨＴＳの用量反応曲線に適合するために使用された。
ヒットコールのための独立方法として、ＨＣ Ｓｔｒａｔｏｍｉｎｅｒ（Ｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ ＮＬ）（Ｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｕｔｒｅｃｈｔ ＮＬ）が用いられ、完全に自動化された／合理化された細胞レベルのデータ前処理およびスコア生成を行う。ＩＣ Ｓｔｒａｔｏｍｉｎｅｒはまた、ｑＨＴＳの用量反応曲線に適合するために使用された。
【0089】
ＡＣＡＳ
化合物の登録およびアッセイデータの登録は、オープンソースＡＣＡＳプラットフォーム（Refactor BioSciences github https://github.com/RefactorBio/acas）を用いて行われた。
化合物の登録およびアッセイデータの登録は、オープンソースＡＣＡＳプラットフォーム（Refactor BioSciences github https://github.com/RefactorBio/acas）を用いて行われた。
【0090】
用量反応分析および化合物選択－全ての予定外の小分子のＦＤＡに承認された薬物を含む最初のスクリーニングにおいて
ｑＨＴＳスクリーニングでは、以下の基準のうちの１つを満たす場合に、化合物が全ての用量反応確認に持ち越されるように選択された：１）照射野あたりの細胞数が陽性コントロールの少なくとも６０％であり、ウェル内の照射野にわたるＰｒｏｂｐｏｓにて観察された標準偏差が０．４以上ではない、少なくとも３つの濃度での中央値照射野について０．７５を超えるＰｒｏｂｐｏｓ、２）２つの最高濃度で０．９０を超えるＰｒｏｂｐｏｓを有する化合物を含む試験された５つの濃度にわたり、Ｐｒｏｂｐｏｓとの用量反応関係が観察された（検査によって）、あるいは、３）文献で陽性が報告された場合には、またはＣＯＶＩＤ－１９の治験で評価されている場合には、この基準を満たさない対象化合物は持ち越された。
ｑＨＴＳスクリーニングでは、以下の基準のうちの１つを満たす場合に、化合物が全ての用量反応確認に持ち越されるように選択された：１）照射野あたりの細胞数が陽性コントロールの少なくとも６０％であり、ウェル内の照射野にわたるＰｒｏｂｐｏｓにて観察された標準偏差が０．４以上ではない、少なくとも３つの濃度での中央値照射野について０．７５を超えるＰｒｏｂｐｏｓ、２）２つの最高濃度で０．９０を超えるＰｒｏｂｐｏｓを有する化合物を含む試験された５つの濃度にわたり、Ｐｒｏｂｐｏｓとの用量反応関係が観察された（検査によって）、あるいは、３）文献で陽性が報告された場合には、またはＣＯＶＩＤ－１９の治験で評価されている場合には、この基準を満たさない対象化合物は持ち越された。
【0091】
確認スクリーニングおよび組み合わせスクリーニングにおける用量反応分析
単一ウェルにわたる感染した細胞の空間的不均一性のために、照射野の約半分は不飽和であり、試験されたそれぞれの濃度ごとに２７のランク順照射野（９照射野および３つのウェルから）のうちの上位３分の１で飽和するＰｒｏｂｐｏｓにて、一貫した分配をもたらした。化合物の濃度に関するＰｒｏｂｐｏｓ効果は、ランク順照射野の上位３分の１を平均することによって表に示された。高いＰｒｏｂｐｏｓ値を有する外れ値照射野は視覚的に検査され、アーチファクト（分割エラーまたはデブリ）が観察された場合には除去された。クロファジミンを含む公知の蛍光薬で処置された細胞は、スペクトル障害を有さないことが確認された。用量－反応曲線は、半対数４パラメーター可変勾配モデルを用いて、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍに適合された。
単一ウェルにわたる感染した細胞の空間的不均一性のために、照射野の約半分は不飽和であり、試験されたそれぞれの濃度ごとに２７のランク順照射野（９照射野および３つのウェルから）のうちの上位３分の１で飽和するＰｒｏｂｐｏｓにて、一貫した分配をもたらした。化合物の濃度に関するＰｒｏｂｐｏｓ効果は、ランク順照射野の上位３分の１を平均することによって表に示された。高いＰｒｏｂｐｏｓ値を有する外れ値照射野は視覚的に検査され、アーチファクト（分割エラーまたはデブリ）が観察された場合には除去された。クロファジミンを含む公知の蛍光薬で処置された細胞は、スペクトル障害を有さないことが確認された。用量－反応曲線は、半対数４パラメーター可変勾配モデルを用いて、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍに適合された。
【0092】
ここで本発明は十分に記載されたが、当業者であれば本発明の範囲またはその任意の実施形態に影響を与えることなく、広範かつ同等な状態、製剤物、および他のパラメーターの範囲内で同じことを行うことができることを理解するのであろう。本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【0093】
同等物
本発明は、その精神または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態にて実施され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を限定するのではなく、全ての点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は前述の記載によってではなく、むしろ添付された特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の同等物の意味および範囲の内に入る全ての変更は、特許請求の範囲の中に包含されることが意図される。
本発明は、その精神または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態にて実施され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を限定するのではなく、全ての点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は前述の記載によってではなく、むしろ添付された特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の同等物の意味および範囲の内に入る全ての変更は、特許請求の範囲の中に包含されることが意図される。
【0094】
参照による組み込み
本明細書で言及される特許文書および科学論文のそれぞれの全開示は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。加えて、本明細書で参照される以下の参照文献は、その全体が参照により組み込まれる：
1．Xiao, F. et al. Evidence for Gastrointestinal Infection of SARS-CoV-2. Gastroenterology (2020). doi:10.1053/j.gastro.2020.02.055
2．Lin, L. et al. Gastrointestinal symptoms of 95 cases with SARS-CoV-2 infection. Gut (2020). doi:10.1136/gutjnl-2020-321013
3．Avula, A. et al. COVID-19 presenting as stroke. Brain. Behav. Immun. (2020). doi:10.1016/j.bbi.2020.04.077
4．Kochi, A. N., Tagliari, A. P., Forleo, G. B., Fassini, G. M. & Tondo, C. Cardiac and arrhythmic complications in patients with COVID-19. Journal of Cardiovascular Electrophysiology (2020). doi:10.1111/jce.14479
5．Mulangu, S. et al. A randomized, controlled trial of Ebola virus disease therapeutics. N. Engl. J. Med. (2019). doi:10.1056/NEJMoa1910993
6．Oprea, T. I. et al. Drug repurposing from an academic perspective. Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies (2011). doi:10.1016/j.ddstr.2011.10.002
7．Chu, H. et al. Comparative tropism, replication kinetics, and cell damage profiling of SARS-CoV-2 and SARS-CoV with implications for clinical manifestations, transmissibility, and laboratory studies of COVID-19: an observational study. The Lancet Microbe (2020). doi:10.1016/s2666-5247(20)30004-5
8．Hoffmann, M. et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell (2020). doi:10.1016/j.cell.2020.02.052
9．Riva, L. et al. A Large-scale Drug Repositioning Survey for SARS-CoV-2 Antivirals. bioRxiv (2020). doi:10.1101/2020.04.16.044016
10．Katie Heiser et al. Identification of potential treatments for COVID-19 through artificial intelligence enabled phenomic analysis of human cells infected with SARS-CoV-2. bioRxiv (2020). doi:10.1101/2020.04.21.054387
11．Jeon, S. et al. Identification of antiviral drug candidates against SARS-CoV-2 from FDA- approved drugs. Antimicrob. Agents Chemother. (2020). doi:10.1128/AAC.00819-20
12．McInnes, L., Healy, J., Saul, N. & Groβberger, L. UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection. J. Open Source Softw. (2018). doi:10.21105/joss.00861
13．Lang, J. et al. Inhibition of SARS pseudovirus cell entry by lactoferrin binding to heparan sulfate proteoglycans. PLoS One (2011). doi:10.1371/journal.pone.0023710
14．Siqueiros-Cendon, T. et al. Immunomodulatory effects of lactoferrin. Acta Pharmacologica Sinica (2014). doi:10.1038/aps.2013.200
15．Jacob, A. et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. (2019). doi:10.1038/s41596-019-0220-0
16．Hurley, K. et al. Reconstructed Single-Cell Fate Trajectories Define Lineage Plasticity Windows during Differentiation of Human PSC-Derived Distal Lung Progenitors. Cell Stem Cell (2020). doi:10.1016/j.stem.2019.12.009
17．Yeni, P. Update on HAART in HIV. in Journal of Hepatology (2006). doi:10.1016/j.jhep.2005.11.021
18．Evans, W. E. Pharmacogenetics of Thiopurine S-Methyltransferase and Thiopurine Therapy. in Therapeutic Drug Monitoring (2004). doi:10.1097/00007691-200404000-00018
19．Arbiser, J. L. & Moschella, S. L. Clofazimine: A review of its medical uses and mechanisms of action. Journal of the American Academy of Dermatology (1995). doi:10.1016/0190-9622(95)90134-5
20．Alghamdi, S., Leoncikas, V., Plant, K. E. & Plant, N. J. Synergistic interaction between lipid-loading and doxorubicin exposure in Huh7 hepatoma cells results in enhanced cytotoxicity and cellular oxidative stress: Implications for acute and chronic care of obese cancer patients. Toxicol. Res. (Camb). (2015). doi:10.1039/c5tx00173k
21．Hibbs, A. M. & Lorch, S. A. Metoclopramide for the treatment of gastroesophageal reflux disease in infants: A systematic review. Pediatrics (2006). doi:10.1542/peds.2005-2664
22．Hajifathalian, K. et al. SARS-COV-2 infection (coronavirus disease 2019) for the gastrointestinal consultant. World J. Gastroenterol. (2020). doi:10.3748/wjg.v26.i14.1546
23．Roscow, O., Ganassin, R., Garver, K. & Polinski, M. Z-FA-FMK demonstrates differential inhibition of aquatic orthoreovirus (PRV), aquareovirus (CSRV), and rhabdovirus (IHNV) replication. Virus Res. (2018). doi:10.1016/j.virusres.2017.11.024
24．Ou, X. et al. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nat. Commun. (2020). doi:10.1038/s41467-020-15562-9
25．Pardanani, A. et al. TG101209, a small molecule JAK2-selective kinase inhibitor potently inhibits myeloproliferative disorder-associated JAK2V617F and MPLW515L/K mutations. Leukemia (2007). doi:10.1038/sj.leu.2404750
26．Wu, D. & Yang, X. O. TH17 responses in cytokine storm of COVID-19: An emerging target of JAK2 inhibitor Fedratinib. J. Microbiol. Immunol. Infect. (2020). doi:10.1016/j.jmii.2020.03.005
27．Zhang, W. et al. The use of anti-inflammatory drugs in the treatment of people with severe coronavirus disease 2019 (COVID-19): The experience of clinical immunologists from China. Clinical Immunology (2020). doi:10.1016/j.clim.2020.108393
28．Stebbing, J. et al. COVID-19: combining antiviral and anti-inflammatory treatments. The Lancet Infectious Diseases (2020). doi:10.1016/S1473-3099(20)30132-8
29．Treatment of Moderate to Severe Coronavirus Disease (COVID-19) in Hospitalized Patients. (2020). Available at: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04321993.
30．Delprat, B., Crouzier, L., Su, T. P. & Maurice, T. At the Crossing of ER Stress and MAMs: A Key Role of Sigma-1 Receptor? in Advances in Experimental Medicine and Biology (2020). doi:10.1007/978-3-030-12457-1_28
31．Friesland, M., Mingorance, L., Chung, J., Chisari, F. V. & Gastaminza, P. Sigma-1 Receptor Regulates Early Steps of Viral RNA Replication at the Onset of Hepatitis C Virus Infection. J. Virol. (2013). doi:10.1128/jvi.03557-12
32．Fung, T. S. & Liu, D. X. Coronavirus infection, ER stress, apoptosis and innate immunity. Frontiers in Microbiology (2014). doi:10.3389/fmicb.2014.00296
33．Moebius, F. F., Reiter, R. J., Hanner, M. & Glossmann, H. High affinity of sigma1-binding sites for sterol isomerization inhibitors: Evidence for a pharmacological relationship with the yeast sterol C8-C7 isomerase. Br. J. Pharmacol. (1997). doi:10.1038/sj.bjp.0701079
34．Diaz, J. L. et al. Synthesis and biological evaluation of the 1-arylpyrazole class of σ1 receptor antagonists: Identification of 4-{2-[5-methyl-1- (naphthalen-2-yl)-1H-pyrazol-3-yloxy]ethyl}morpholine (S1RA, E-52862). J. Med. Chem. (2012). doi:10.1021/jm3007323
35．Torres, V. et al. QT prolongation and the antiarrhythmic efficacy of amiodarone. J. Am. Coll. Cardiol. (1986). doi:10.1016/S0735-1097(86)80272-8
36．Vidal-Torres, A. et al. Effects of the selective sigma-1 receptor antagonist S1RA on formalin-induced pain behavior and neurotransmitter release in the spinal cord in rats. J. Neurochem. (2014). doi:10.1111/jnc.12648
37．Gris, G. et al. The selective sigma-1 receptor antagonist E-52862 attenuates neuropathic pain of different aetiology in rats. Sci. Rep. (2016). doi:10.1038/srep24591
38．Gordon, D. E. et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature (2020). doi:10.1038/s41586-020-2286-9
39．Reghunathan, R. et al. Expression profile of immune response genes in patients with severe acute respiratory syndrome. BMC Immunol. (2005). doi:10.1186/1471-2172-6-2
40．Cutone, A. et al. Lactoferrin prevents LPS-induced decrease of the iron exporter ferroportin in human monocytes/macrophages. BioMetals (2014). doi:10.1007/s10534-014-9742-7
41．Conti, P. et al. Induction of pro-inflammatory cytokines (IL-1 and IL-6) and lung inflammation by COVID-19: anti-inflammatory strategies. Journal of biological regulators and homeostatic agents (2020). doi:10.23812/CONTI-E.
42．Lagunas-Rangel, F. A. & Chavez-Valencia, V. High IL-6/IFN-γ ratio could be associated with severe disease in COVID-19 patients. Journal of Medical Virology (2020). doi:10.1002/jmv.25900
43．Han, C. et al. Digestive Symptoms in COVID-19 Patients With Mild Disease Severity: Clinical Presentation, Stool Viral RNA Testing, and Outcomes. Am. J. Gastroenterol. (2020). doi:10.14309/ajg.0000000000000664
44．Oda, H. et al. Antiviral Effects of Bovine Lactoferrin on Human Norovirus. Biochem. Cell Biol. (2020). doi:10.1139/bcb-2020-0035
45．Mohamed, J. A. et al. A Novel Single-Nucleotide Polymorphism in the Lactoferrin Gene Is Associated with Susceptibility to Diarrhea in North American Travelers to Mexico. Clin. Infect. Dis. (2007). doi:10.1086/512199
46．Gu, J., Han, B. & Wang, J. COVID-19: Gastrointestinal Manifestations and Potential Fecal-Oral Transmission. Gastroenterology (2020). doi:10.1053/j.gastro.2020.02.054
47．Hung, I. F.-N. et al. Triple combination of interferon beta-1b, lopinavir-ritonavir, and ribavirin in the treatment of patients admitted to hospital with COVID-19: an open-label, randomised, phase 2 trial. Lancet (2020). doi:10.1016/s0140-6736(20)31042-4
48．Berthold, M. R. et al. KNIME: The konstanz information miner. in 4th International Industrial Simulation Conference 2006, ISC 2006 (2006). doi:10.1007/978-3-540-78246-9_38
49．Stevens, J.-L., Rudiger, P. & Bednar, J. HoloViews: Building Complex Visualizations Easily for Reproducible Science. in Proceedings of the 14th Python in Science Conference (2015). doi:10.25080/majora-7b98e3ed-00a
本明細書で言及される特許文書および科学論文のそれぞれの全開示は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。加えて、本明細書で参照される以下の参照文献は、その全体が参照により組み込まれる：
1．Xiao, F. et al. Evidence for Gastrointestinal Infection of SARS-CoV-2. Gastroenterology (2020). doi:10.1053/j.gastro.2020.02.055
2．Lin, L. et al. Gastrointestinal symptoms of 95 cases with SARS-CoV-2 infection. Gut (2020). doi:10.1136/gutjnl-2020-321013
3．Avula, A. et al. COVID-19 presenting as stroke. Brain. Behav. Immun. (2020). doi:10.1016/j.bbi.2020.04.077
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6．Oprea, T. I. et al. Drug repurposing from an academic perspective. Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies (2011). doi:10.1016/j.ddstr.2011.10.002
7．Chu, H. et al. Comparative tropism, replication kinetics, and cell damage profiling of SARS-CoV-2 and SARS-CoV with implications for clinical manifestations, transmissibility, and laboratory studies of COVID-19: an observational study. The Lancet Microbe (2020). doi:10.1016/s2666-5247(20)30004-5
8．Hoffmann, M. et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell (2020). doi:10.1016/j.cell.2020.02.052
9．Riva, L. et al. A Large-scale Drug Repositioning Survey for SARS-CoV-2 Antivirals. bioRxiv (2020). doi:10.1101/2020.04.16.044016
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13．Lang, J. et al. Inhibition of SARS pseudovirus cell entry by lactoferrin binding to heparan sulfate proteoglycans. PLoS One (2011). doi:10.1371/journal.pone.0023710
14．Siqueiros-Cendon, T. et al. Immunomodulatory effects of lactoferrin. Acta Pharmacologica Sinica (2014). doi:10.1038/aps.2013.200
15．Jacob, A. et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. (2019). doi:10.1038/s41596-019-0220-0
16．Hurley, K. et al. Reconstructed Single-Cell Fate Trajectories Define Lineage Plasticity Windows during Differentiation of Human PSC-Derived Distal Lung Progenitors. Cell Stem Cell (2020). doi:10.1016/j.stem.2019.12.009
17．Yeni, P. Update on HAART in HIV. in Journal of Hepatology (2006). doi:10.1016/j.jhep.2005.11.021
18．Evans, W. E. Pharmacogenetics of Thiopurine S-Methyltransferase and Thiopurine Therapy. in Therapeutic Drug Monitoring (2004). doi:10.1097/00007691-200404000-00018
19．Arbiser, J. L. & Moschella, S. L. Clofazimine: A review of its medical uses and mechanisms of action. Journal of the American Academy of Dermatology (1995). doi:10.1016/0190-9622(95)90134-5
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21．Hibbs, A. M. & Lorch, S. A. Metoclopramide for the treatment of gastroesophageal reflux disease in infants: A systematic review. Pediatrics (2006). doi:10.1542/peds.2005-2664
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23．Roscow, O., Ganassin, R., Garver, K. & Polinski, M. Z-FA-FMK demonstrates differential inhibition of aquatic orthoreovirus (PRV), aquareovirus (CSRV), and rhabdovirus (IHNV) replication. Virus Res. (2018). doi:10.1016/j.virusres.2017.11.024
24．Ou, X. et al. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nat. Commun. (2020). doi:10.1038/s41467-020-15562-9
25．Pardanani, A. et al. TG101209, a small molecule JAK2-selective kinase inhibitor potently inhibits myeloproliferative disorder-associated JAK2V617F and MPLW515L/K mutations. Leukemia (2007). doi:10.1038/sj.leu.2404750
26．Wu, D. & Yang, X. O. TH17 responses in cytokine storm of COVID-19: An emerging target of JAK2 inhibitor Fedratinib. J. Microbiol. Immunol. Infect. (2020). doi:10.1016/j.jmii.2020.03.005
27．Zhang, W. et al. The use of anti-inflammatory drugs in the treatment of people with severe coronavirus disease 2019 (COVID-19): The experience of clinical immunologists from China. Clinical Immunology (2020). doi:10.1016/j.clim.2020.108393
28．Stebbing, J. et al. COVID-19: combining antiviral and anti-inflammatory treatments. The Lancet Infectious Diseases (2020). doi:10.1016/S1473-3099(20)30132-8
29．Treatment of Moderate to Severe Coronavirus Disease (COVID-19) in Hospitalized Patients. (2020). Available at: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04321993.
30．Delprat, B., Crouzier, L., Su, T. P. & Maurice, T. At the Crossing of ER Stress and MAMs: A Key Role of Sigma-1 Receptor? in Advances in Experimental Medicine and Biology (2020). doi:10.1007/978-3-030-12457-1_28
31．Friesland, M., Mingorance, L., Chung, J., Chisari, F. V. & Gastaminza, P. Sigma-1 Receptor Regulates Early Steps of Viral RNA Replication at the Onset of Hepatitis C Virus Infection. J. Virol. (2013). doi:10.1128/jvi.03557-12
32．Fung, T. S. & Liu, D. X. Coronavirus infection, ER stress, apoptosis and innate immunity. Frontiers in Microbiology (2014). doi:10.3389/fmicb.2014.00296
33．Moebius, F. F., Reiter, R. J., Hanner, M. & Glossmann, H. High affinity of sigma1-binding sites for sterol isomerization inhibitors: Evidence for a pharmacological relationship with the yeast sterol C8-C7 isomerase. Br. J. Pharmacol. (1997). doi:10.1038/sj.bjp.0701079
34．Diaz, J. L. et al. Synthesis and biological evaluation of the 1-arylpyrazole class of σ1 receptor antagonists: Identification of 4-{2-[5-methyl-1- (naphthalen-2-yl)-1H-pyrazol-3-yloxy]ethyl}morpholine (S1RA, E-52862). J. Med. Chem. (2012). doi:10.1021/jm3007323
35．Torres, V. et al. QT prolongation and the antiarrhythmic efficacy of amiodarone. J. Am. Coll. Cardiol. (1986). doi:10.1016/S0735-1097(86)80272-8
36．Vidal-Torres, A. et al. Effects of the selective sigma-1 receptor antagonist S1RA on formalin-induced pain behavior and neurotransmitter release in the spinal cord in rats. J. Neurochem. (2014). doi:10.1111/jnc.12648
37．Gris, G. et al. The selective sigma-1 receptor antagonist E-52862 attenuates neuropathic pain of different aetiology in rats. Sci. Rep. (2016). doi:10.1038/srep24591
38．Gordon, D. E. et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature (2020). doi:10.1038/s41586-020-2286-9
39．Reghunathan, R. et al. Expression profile of immune response genes in patients with severe acute respiratory syndrome. BMC Immunol. (2005). doi:10.1186/1471-2172-6-2
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41．Conti, P. et al. Induction of pro-inflammatory cytokines (IL-1 and IL-6) and lung inflammation by COVID-19: anti-inflammatory strategies. Journal of biological regulators and homeostatic agents (2020). doi:10.23812/CONTI-E.
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【図面の簡単な説明】
【0095】
【図1】Ａ）ＶｅｒｏＥ６細胞、Ｈｕｈ－７細胞、およびＣａｃｏ－２細胞の増殖動態。細胞を４８のウェルプレート中にて、０．２のＭＯＩで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、０日目（吸着後１時間）、１日目、２日目、および３日目に採取した。ＴＣＩＤ５０を、上清および細胞画分について決定した。グラフは中央値を表し、Ｎ＝２の生物学的複製のＳＤであり、それぞれｎ＝３の技術的複製を有する。Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏＥ６細胞（左）およびＣａｃｏ２細胞（右）に対するＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（シアン）および抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ抗体（マゼンタ）での染色における合胞体の形成（マゼンタ、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ抗体）。Ｃ）アッセイ検出の限界。Ｈｕｈ－７細胞を、指示されたＭＯＩで感染させ、感染後４８時間後（ｐ．ｉ．）に画像化させた。ＭＯＩの増加と相関して、進行性でより多機能な合胞体の形成が観察された。検出は０．００４のＭＯＩの低さの感染で可能であった。
【図2】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＨｕｈ－７細胞の形態学的プロファイリング（４８時間、０．２のＭＯＩ）。中心像：核（シアン）、中性脂質（緑色）、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰタンパク質（マゼンタ）を有する代表的な照射野。特徴抽出を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の重要な特質は、ＨＣＳ ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ チャネルからの多核合胞体（左上）および豊富な核小体（左下）で特徴付けられた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ チャネルからの細胞質突起（右下）を有する細胞ウイルス区画化（右上）。Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＱ１ ハイコンテンツ撮像装置で代表的な画像を取得し、Ｆｉｊｉ ＩｍａｇｅＪ パッケージで分析した。
【図3】Ａ）ｑＨＴＳスクリーニングからの１３２ヒットの用量－反応曲線。ＸＸ Ｂ）複製プレート間で抗ウイルスの有効性に強い相関を示す複製プロット。
【図4】ａ）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療法の発見への取り組みの概略図。１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した３８４のウェルプレート上にて培養された細胞に、化合物が投与される。それぞれのプレートは、プレート間の変動をコントロールするために、２４の陰性（感染）コントロールウェルおよび２４の陽性（非感染）コントロールウェルを含む。２）細胞は固定され、染色され、画像化される。これらの細胞区画の特徴を抽出しながら、核の含有量、細胞境の含有量、中性脂質の含有量、およびウイルス合胞体の形成を区分するＣｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒに基づくパイプラインによって、画像は分析される。３）画像ごとにウイルス感染性を定義するために、多変量解析によって用量－反応曲線が算出される。４）抽出された特徴に基づいて、陽性コントロールウェルおよび陰性コントロールウェルの周りに機械学習モデルが構築され、それぞれの薬物状態に適用される。５）得られた特徴を通して、モデルは抗ウイルス作用の個々の化合物モードを知らせる。６）確認された抗ウイルスヒット；ｂ）薬物スクリーニングの１５ヒットの用量－反応曲線。グラフは、Ｎ＝３の生物学的複製について、一連の選択された化合物の、１０点の１：２希釈の中央値ＳＥＭを表す。ＩＣ５０は、コントロールに対する正規化に基づき、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムに適合させた後に計算された。
【図5】それらの形態学的特徴による細胞の埋め込みは、細胞の状態および感染の状態によるクラスター化を示す。ａ）非感染の（ＰＣ）、感染した（ＮＣ）、または感染し、かつＦＤＡに承認され、臨床候補である１２の薬物のスクリーニングヒットを用いて１０用量にわたり処置されることからなる、３７９の形態学的特徴による２００万の個々の細胞の２次元ＵＭＡＰ埋め込み。ｂ）ＵＭＡＰ中のクラスター関心領域（ＲＯＩ）は、感染した合胞体（ＲＯＩ ３）および単離された（ＲＯＩ ４）細胞および非感染の有糸分裂（ＲＯＩ ６）、正常（ＲＯＩ １０）、散在性脂質（ＲＯＩ １１）、および細胞質点状物（ＲＯＩ １２）細胞を含めて強調される。ｃ）６つのＲＯＩについて、代表的な細胞は、核（左上）、細胞境界（右上）、中性脂質（左下）、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（右下）のチャネルによって示される。以下では、それぞれの処置および用量にわたる細胞数がヒートマップとして示される。ここで、ＲＯＩ ３およびＲＯＩ ４の用量－反応の挙動を見ることができる。
【図6】ラクトフェリンはウイルス周期の様々な段階で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を遮断する。ａ）Ｈｕｈ－７細胞をラクトフェリン（０～２．３μＭ）で処置し、３８４のウェルプレート中にてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（０．２のＭＯＩ）に感染させた。自動蛍光顕微鏡法を用いてプレートは画像化され、本発明者らの画像分析パイプラインを用いて処理され、ウイルスの阻害割合を決定した。グラフは用量－反応（ＲＥＤ、ＩＣ５０＝３０８μＭ）を示す。細胞生存率は黒色で示される。ｂ）Ｈｕｈ－７をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（１のＭＯＩ、５のＭＯＩ、および１０のＭＯＩ；０のＭＯＩは非感染の細胞を示す）に感染させ、２．３μＭのラクトフェリンを用いて、１時間ｐ．ｉ．および２４時間ｐ．ｉ．で処置させた。バーは、様々な状態における感染した細胞の割合を示す。データは、８回の複製の平均である。統計学的有意性は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ－Ｄｕｎｎ法による多重Ｔ検定を用いて、α＝０．０５で測定した。０のＭＯＩを除いて、全ての状態（未処置対ラクトフェリン、１時間、もしくは、未処置対ラクトフェリン、２４時間）は、ｐ値＜０．０００１を有する。ｃ－ｄ）２．５×１０４Ｈｕｈ－７細胞を、４８時間ｐ．ｉ．、０．２のＭＯＩで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。細胞が採取され、ＲＮＡが抽出された。ウイルスゲノムコピーは、絶対定量法（標準曲線）（ｃ）を用いて計算され、細胞のＩＦＮβ、ＭＸ１、ＩＳＧ１５、およびＩＦＩＴＭ３（ｄ）のｍＲＮＡレベルは、非感染のＨｕｈ－７に対するΔΔＣｔを用いて計算された。データは平均であり、Ｎ＝２の生物学的複製のＳＤであり、それぞれｎ＝３の技術的複製を有する。統計学的有意性は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ－Ｄｕｎｎ法による多重Ｔ検定を用いて、α＝０．０５、＊ｐ値＜０．００１で測定した。ｅ）２．３μＭの濃度で、アポラクトフェリン、ホロラクトフェリン、およびトランスフェリンを用いる治療の際の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＨｕｈ－７細胞の割合。ｆ）レムデシビル（５０ｎＭ）、ラクトフェリン（１．２μＭ）、およびレムデシビル／ラクトフェリン（２５ｎＭ／６００ｎＭ）の組み合わせ処置を用いた処置の際の、１０のＭＯＩでの４８時間ｐ．ｉ．感染した細胞の割合。ｇ）およびｈ）レムデシビルとヒドロキシクロロキンとを組み合わせたラクトフェリンの２次元用量反応ヒートマップ。レムデシビルの組み合わせは０．２のＭＯＩで評価され、ＨＣＱはラクトフェリンの効能において関連する変化をもたらす１０のＭＯＩで評価される。
【図7】Ａ）レムデシビル単独、ならびに、有効性の増強を示すレムデシビルと２８０ｎＭラクトフェリンとの組み合わせ、およびレムデシビルと１μＭラクトフェリンとの組み合わせについての用量－反応曲線。Ｂ）ヒドロキシクロロキン単独、ならびに、有効性の増強を示すヒドロキシクロロキンと２８０ｎＭのラクトフェリンとの組み合わせ、およびヒドロキシクロロキンと１μＭラクトフェリンとの組み合わせについての用量－反応曲線。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図7A】
【図7B】
【配列表】
【国際調査報告】