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▶ ガンマデルタ セラピューティクス リミティッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-29
(54)【発明の名称】骨髄性悪性病変の治療のためのＶデルタ１＋Ｔ細胞
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20230622BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230622BHJP
A61K 31/7076 20060101ALI20230622BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20230622BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230622BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20230622BHJP
C07H 19/19 20060101ALN20230622BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17
A61P35/02
A61K31/7076
A61K31/675
A61P43/00 121
C12N5/0783
C07H19/19
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022556264
(86)(22)【出願日】2020-03-20
(85)【翻訳文提出日】2022-11-01
(86)【国際出願番号】 GB2020050763
(87)【国際公開番号】W WO2021186137
(87)【国際公開日】2021-09-23
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519391608
【氏名又は名称】ガンマデルタ セラピューティクス リミティッド
【氏名又は名称原語表記】ＧＡＭＭＡＤＥＬＴＡ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】１ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｗ２ ６ＢＤ Ｌｏｎｄｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】シモエス、アンドレ ゴンサロ ド エスピリト サント
(72)【発明者】
【氏名】ディ ロレンツォ、ビアージョ
(72)【発明者】
【氏名】コスロフスキー、マイケル
(72)【発明者】
【氏名】シルヴァ－サントス、ブルノ ミゲル デ カルヴァーリョ エ
(72)【発明者】
【氏名】ハットン、アンドリュー ジョン
(72)【発明者】
【氏名】リカルディン、ティモシー ジョエル
(72)【発明者】
【氏名】フォウラー、ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】ブロムリー、アリス
(72)【発明者】
【氏名】ヌスバウマー、オリヴァー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C057
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA94X
4B065BB19
4B065BB25
4B065BB31
4B065BB32
4B065BB34
4B065CA44
4C057CC03
4C057DD01
4C057LL34
4C057LL43
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA35
4C086EA18
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA07
4C086NA05
4C086ZB27
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087MA02
4C087NA05
4C087ZB27
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、骨髄性悪性病変の治療における使用のための、Ｖδ１＋Ｔ細胞を含む組成物に関する。本発明は、当該組成物を使用する治療方法にも関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨髄性悪性病変を有する患者の治療における使用のためのＶδ１＋Ｔ細胞を含む同種異系組成物。
【請求項2】
前記骨髄性悪性病変が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から選択される、請求項１に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項3】
前記患者が微小残存病変に陽性（ＭＲＤ＋）である、請求項１または請求項２に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項4】
前記ＭＲＤ＋患者が完全寛解にあり、検出可能な白血病性芽球を末梢血中に含まず、５％未満の白血病性芽球を骨髄中に含む、請求項３に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項5】
前記患者が化学療法で以前に治療されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項6】
前記患者が、前記同種異系組成物の投与の少なくとも３日前に化学療法で治療されている、請求項５に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項7】
前記化学療法が、フルダラビン及びシクロホスファミドから選択される、請求項５または請求項６に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項8】
全生細胞に対して少なくとも約９０％のＣＤ４５＋細胞を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項9】
全生細胞に対して少なくとも約６０％のγδＴ細胞を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項10】
全生細胞に対して少なくとも約５０％のＶδ１＋Ｔ細胞を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項11】
約１×１０１０個未満の全生細胞を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項12】
約１×１０９個未満の全生細胞を含む、請求項１１に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項13】
約１×１０８個未満の全生細胞を含む、請求項１２に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項14】
前記同種異系組成物が、約８×１０９個、約４×１０９個、約２．４×１０９個、約１．２×１０９個、約８×１０８個、約４×１０８個、約８×１０７個、または約４×１０７個の全生細胞を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物を含む用量。
【請求項16】
約１×１０５個未満細胞／ｋｇを含む、請求項１５に記載の用量。
【請求項17】
約１×１０６個未満細胞／ｋｇを含む、請求項１５に記載の用量。
【請求項18】
約１×１０７個未満細胞／ｋｇを含む、請求項１５に記載の用量。
【請求項19】
約３×１０７個未満細胞／ｋｇを含む、請求項１５に記載の用量。
【請求項20】
約１×１０８個未満細胞／ｋｇを含む、請求項１５に記載の用量。
【請求項21】
約５×１０４個未満αβＴ細胞／ｋｇを含む、請求項１５に記載の用量。
【請求項22】
約１×１０４個未満αβＴ細胞／ｋｇを含む、請求項２１に記載の用量。
【請求項23】
Ｔ細胞マイトジェンとインターロイキン－４様活性を有する増殖因子とを含む培地において、インターロイキン－１５様活性を有する増殖因子の非存在下で試料を培養することを含む方法によって前記試料から前記Ｖδ１＋Ｔ細胞が得られる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項24】
Ｔ細胞マイトジェンとインターロイキン－１５様活性を有する増殖因子とを含む培地において、インターロイキン－４様活性を有する増殖因子の非存在下で試料を培養することを含む方法によって前記試料から前記Ｖδ１＋Ｔ細胞が得られる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項25】
前記Ｖδ１＋Ｔ細胞が、培養することを少なくとも１１日間行った後に収集される、請求項２３または請求項２４に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項26】
前記培養することが、気体透過性材料を含む容器において実施される、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項27】
前記容器が、気体透過性材料を含むことで気体交換を可能にする液体密封入れ物を含む、請求項２６に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項28】
前記容器の下部が、前記容器の前記下部からの気体交換が可能になるように構成される、請求項２６または請求項２７に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項29】
前記試料が無血清において培養される、請求項２３～２８のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項30】
前記試料が、血清または血清代替物を含む培地において培養される、請求項２３～２８のいずれか１項に記載の使用のための同種異系組成物。
【請求項31】
骨髄性悪性病変を治療する方法であって、前記方法が、前記骨髄性悪性病変を有する患者に対してＶδ１＋Ｔ細胞を含む同種異系組成物を治療的に有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項32】
前記骨髄性悪性病変が、ＡＭＬ及びＭＤＳから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記患者が微小残存病変に陽性（ＭＲＤ＋）である、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記ＭＲＤ＋患者が完全寛解にあり、検出可能な白血病性芽球を末梢血中に含まず、５％未満の白血病性芽球を骨髄中に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
化学療法を施すことをさらに含む、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記患者が、前記同種異系組成物の投与の少なくとも３日前に化学療法で治療される、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記化学療法が、フルダラビン及びシクロホスファミドから選択される、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記治療的に有効な量が、約８×１０９個、約４×１０９個、約２．４×１０９個、約１．２×１０９個、約８×１０８個、約４×１０８個、約８×１０７個、または約４×１０７個の全生細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項39】
前記治療的に有効な量が、約１×１０１０個未満の全生細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項40】
前記治療的に有効な量が、約１×１０９個未満の全生細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項41】
前記治療的に有効な量が、約１×１０８個未満の全生細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項42】
前記治療的に有効な量が、約５×１０４個未満αβＴ細胞／ｋｇを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項43】
前記治療的に有効な量が、約１×１０４個未満αβＴ細胞／ｋｇを含む、請求項４２に記載の用量。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、骨髄性悪性病変の治療における使用のための、Ｖδ１＋Ｔ細胞を含む組成物に関する。本発明は、当該組成物を使用する治療方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、化学療法抵抗性が生じる頻度が高く、再発が致命的であることから、依然として臨床的な課題である。高齢者（６５歳以上）でのＡＭＬの生存率は低く（１０％）、この原因は主に、標準的な治療に対して抵抗性が生じることにある。利用可能な治療は、シタラビンとアントラサイクリン薬とを併用することからなるものである。この治療は完全寛解の誘導には有効ではあるが、不応性の再発を引き起こす化学療法抵抗性クローンを最終的に選択するものである。化学療法に代わる有望な治療は、標的療法、及びＢ細胞悪性病変に対して成功している来たるべき免疫療法である。
【0003】
測定可能残存病変（ＭＲＤ）はＡＭＬ及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の独立した診断後予後指標であり、ＭＲＤ＋患者は、形態学的に完全寛解が生じた場合でさえ再発傾向が高く、生存率も低いことから、この指標はリスク層別化及び治療計画に重要である。ＡＭＬ及びＭＤＳにおけるＭＲＤを除去することは、強いアンメットニーズが存在する領域であるが、白血病性芽球上に発現する特異的な抗原を欠いていることから困難なことである。
【0004】
γδＴ細胞の存在は、いくつかの固形癌及び血液癌の予後と正の相関を有することが示されている（Ｄｅｎｉｇｅｒ ａｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（２２）：５７０８－５７１９、Ｇｅｎｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５）２１（８）：９３８－９４５）。そのような治療においてＶδ２＋Ｔ細胞を使用することは探求されている一方で、Ｖδ１＋Ｔ細胞を臨床的に操作することは、末梢血リンパ球中のその存在量が比較的少ないこと（＜０．５％）によって阻まれている。一方で、ＷＯ２０１６／１９８４８０に記載のものなどの方法によって、臨床使用に適し得るＶδ１＋Ｔ細胞の収量が最近改善されたことで、本明細書に記載の初めての骨髄性悪性病変の治療に対する要求が満たされている。
【発明の概要】
【0005】
本発明の第１の態様によれば、骨髄性悪性病変を有する患者の治療における使用のためのＶδ１＋Ｔ細胞を含む同種異系組成物が提供される。
【0006】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の使用のための同種異系組成物を含む用量が提供される。
【0007】
本発明の別の態様によれば、骨髄性悪性病変を治療する方法が提供され、この方法は、当該骨髄性悪性病変を有する患者に対してＶδ１＋Ｔ細胞を含む同種異系組成物を治療的に有効な量で投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A】γδＴ細胞組成物は、エクスビボＶδ１Ｔ細胞よりも高いクローン多様性を示す。４人の健康な個別ドナー（ＨＤ＃Ａ～Ｄ）から得られた末梢血／ＰＢまたはＤＯＴ細胞産物に由来するＦＡＣＳ選別Ｖδ１＋Ｔ細胞のＴＲＧＶ及びＴＲＤＶレパートリーならびにＣＤＲ３長（ヌクレオチド数）分布を図式的に表したものである。各四角形は、異なるクローン型（異なるヌクレオチド配列を有する）を表し、その面積は試料中の相対存在量に比例する。色は、鎖によるクローン型の分類を表す。
【図1B】γδＴ細胞組成物は、エクスビボＶδ１Ｔ細胞よりも高いクローン多様性を示す。４人の健康な個別ドナー（ＨＤ＃Ａ～Ｄ）から得られた末梢血／ＰＢまたはＤＯＴ細胞産物に由来するＦＡＣＳ選別Ｖδ１＋Ｔ細胞のＴＲＧＶ及びＴＲＤＶレパートリーならびにＣＤＲ３長（ヌクレオチド数）分布を図式的に表したものである。各四角形は、異なるクローン型（異なるヌクレオチド配列を有する）を表し、その面積は試料中の相対存在量に比例する。色は、鎖によるクローン型の分類を表す。
【図1C】γδＴ細胞組成物は、エクスビボＶδ１Ｔ細胞よりも高いクローン多様性を示す。４人の健康な個別ドナー（ＨＤ＃Ａ～Ｄ）から得られた末梢血／ＰＢまたはＤＯＴ細胞産物に由来するＦＡＣＳ選別Ｖδ１＋Ｔ細胞のＴＲＧＶ及びＴＲＤＶレパートリーならびにＣＤＲ３長（ヌクレオチド数）分布を図式的に表したものである。各四角形は、異なるクローン型（異なるヌクレオチド配列を有する）を表し、その面積は試料中の相対存在量に比例する。色は、鎖によるクローン型の分類を表す。
【図1D】γδＴ細胞組成物は、エクスビボＶδ１Ｔ細胞よりも高いクローン多様性を示す。４人の健康な個別ドナー（ＨＤ＃Ａ～Ｄ）から得られた末梢血／ＰＢまたはＤＯＴ細胞産物に由来するＦＡＣＳ選別Ｖδ１＋Ｔ細胞のＴＲＧＶ及びＴＲＤＶレパートリーならびにＣＤＲ３長（ヌクレオチド数）分布を図式的に表したものである。各四角形は、異なるクローン型（異なるヌクレオチド配列を有する）を表し、その面積は試料中の相対存在量に比例する。色は、鎖によるクローン型の分類を表す。
【図2】γδＴ細胞組成物のＴＣＲレパートリー多様性及びＡＭＬ反応性に対するＣＤ２７発現表現型の影響。（Ａ）事前に選別したＣＤ２７＋Ｖδ１＋Ｔ細胞またはＣＤ２７－Ｖδ１＋Ｔ細胞（２１日間培養したもの）から得られたＤＯＴ細胞によるインビトロでのＡＭＬ ＫＧ－１細胞の死滅。細胞を１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした後、アネキシンＶ染色によって分析した（事前に標識したＫＧ－１細胞の中での陽性事象のパーセント）。データは、各ドナーについて２回の技術的反復実験の平均値を示す。（Ｂ）ＤＯＴ細胞を増殖させた後のＣＤ２７＋細胞（黒色）及びＣＤ２７－細胞（白色）におけるＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４の発現。技術的反復実験の平均値が示される。
【図3】ＡＭＬ細胞に対するクローン性γδＴ細胞組成物の反応性。（Ａ）及び（Ｂ）は、健康なドナーから選別した単一Ｖδ１Ｔ細胞から生じたＤＯＴ細胞クローンによるインビトロでのＡＭＬ ＫＧ－１細胞の死滅を示す。細胞を１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした後、アネキシンＶ染色によって分析した（事前に標識したＫＧ－１細胞の中での陽性事象のパーセント）。各棒は、個々のクローンとの共インキュベート時のＫＧ－１細胞の死滅を表す。水平の破線は、ベースの腫瘍細胞死（ＤＯＴ細胞なし）の平均値を表す。Ｂでは、抗Ｖδ１ ＴＣＲ特異的ｍＡｂまたはアイソタイプ対照のいずれかを培養物に添加した。遮断によってＫＧ－１の標的化がより明確に減少したクローンが示される。データは２回の技術的反復実験の平均値を表し、４人の健康な個別ドナー（ＨＤ）から得られたものである。
【図4A】γδＴ細胞組成物は複数のＡＭＬ細胞型を標的とするが、健康な白血球は標的としない。インビトロ死滅アッセイにおいて、３～４人の健康なドナーから生成させたＤＯＴ細胞を、示されるＡＭＬ細胞株（Ａ）、初代ＡＭＬ試料（Ｂ）、または末梢血からＦＡＣＳ選別した正常白血球集団（Ｃ）と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。Ａでは、水平の破線はベースの腫瘍細胞死の平均値を表し、Ｂでは、ＣＴＲもまた、腫瘍細胞単独（ＤＯＴ細胞なし）を表す。実験は技術的に３回反復実施した。（Ｄ）インビトロ死滅アッセイにおいて、３人の健康なドナーから収集した非増殖新鮮（「エクスビボ」）Ｖδ１＋Ｔ細胞を、示されるＨＥＬ細胞株またはＫＧ－１細胞株と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。ＨＤ＃１から生成させたＤＯＴ細胞は陽性対照として示される。（Ｅ）ＤＯＴ細胞でのグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を細胞内フローサイトメトリーによって評価したものである。（Ｆ）ＡＭＬ腫瘍標的と共に共インキュベートした後、またはＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激時（陽性対照）、または無添加の場合（陰性対照）のＣＤ１０７ａ＋ＤＯＴ細胞のパーセント。結果は２人の健康なドナーから得られたものであり、２連で試験したものである。
【図4B】γδＴ細胞組成物は複数のＡＭＬ細胞型を標的とするが、健康な白血球は標的としない。インビトロ死滅アッセイにおいて、３～４人の健康なドナーから生成させたＤＯＴ細胞を、示されるＡＭＬ細胞株（Ａ）、初代ＡＭＬ試料（Ｂ）、または末梢血からＦＡＣＳ選別した正常白血球集団（Ｃ）と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。Ａでは、水平の破線はベースの腫瘍細胞死の平均値を表し、Ｂでは、ＣＴＲもまた、腫瘍細胞単独（ＤＯＴ細胞なし）を表す。実験は技術的に３回反復実施した。（Ｄ）インビトロ死滅アッセイにおいて、３人の健康なドナーから収集した非増殖新鮮（「エクスビボ」）Ｖδ１＋Ｔ細胞を、示されるＨＥＬ細胞株またはＫＧ－１細胞株と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。ＨＤ＃１から生成させたＤＯＴ細胞は陽性対照として示される。（Ｅ）ＤＯＴ細胞でのグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を細胞内フローサイトメトリーによって評価したものである。（Ｆ）ＡＭＬ腫瘍標的と共に共インキュベートした後、またはＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激時（陽性対照）、または無添加の場合（陰性対照）のＣＤ１０７ａ＋ＤＯＴ細胞のパーセント。結果は２人の健康なドナーから得られたものであり、２連で試験したものである。
【図4C】γδＴ細胞組成物は複数のＡＭＬ細胞型を標的とするが、健康な白血球は標的としない。インビトロ死滅アッセイにおいて、３～４人の健康なドナーから生成させたＤＯＴ細胞を、示されるＡＭＬ細胞株（Ａ）、初代ＡＭＬ試料（Ｂ）、または末梢血からＦＡＣＳ選別した正常白血球集団（Ｃ）と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。Ａでは、水平の破線はベースの腫瘍細胞死の平均値を表し、Ｂでは、ＣＴＲもまた、腫瘍細胞単独（ＤＯＴ細胞なし）を表す。実験は技術的に３回反復実施した。（Ｄ）インビトロ死滅アッセイにおいて、３人の健康なドナーから収集した非増殖新鮮（「エクスビボ」）Ｖδ１＋Ｔ細胞を、示されるＨＥＬ細胞株またはＫＧ－１細胞株と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。ＨＤ＃１から生成させたＤＯＴ細胞は陽性対照として示される。（Ｅ）ＤＯＴ細胞でのグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を細胞内フローサイトメトリーによって評価したものである。（Ｆ）ＡＭＬ腫瘍標的と共に共インキュベートした後、またはＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激時（陽性対照）、または無添加の場合（陰性対照）のＣＤ１０７ａ＋ＤＯＴ細胞のパーセント。結果は２人の健康なドナーから得られたものであり、２連で試験したものである。
【図4D】γδＴ細胞組成物は複数のＡＭＬ細胞型を標的とするが、健康な白血球は標的としない。インビトロ死滅アッセイにおいて、３～４人の健康なドナーから生成させたＤＯＴ細胞を、示されるＡＭＬ細胞株（Ａ）、初代ＡＭＬ試料（Ｂ）、または末梢血からＦＡＣＳ選別した正常白血球集団（Ｃ）と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。Ａでは、水平の破線はベースの腫瘍細胞死の平均値を表し、Ｂでは、ＣＴＲもまた、腫瘍細胞単独（ＤＯＴ細胞なし）を表す。実験は技術的に３回反復実施した。（Ｄ）インビトロ死滅アッセイにおいて、３人の健康なドナーから収集した非増殖新鮮（「エクスビボ」）Ｖδ１＋Ｔ細胞を、示されるＨＥＬ細胞株またはＫＧ－１細胞株と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。ＨＤ＃１から生成させたＤＯＴ細胞は陽性対照として示される。（Ｅ）ＤＯＴ細胞でのグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を細胞内フローサイトメトリーによって評価したものである。（Ｆ）ＡＭＬ腫瘍標的と共に共インキュベートした後、またはＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激時（陽性対照）、または無添加の場合（陰性対照）のＣＤ１０７ａ＋ＤＯＴ細胞のパーセント。結果は２人の健康なドナーから得られたものであり、２連で試験したものである。
【図4E】γδＴ細胞組成物は複数のＡＭＬ細胞型を標的とするが、健康な白血球は標的としない。インビトロ死滅アッセイにおいて、３～４人の健康なドナーから生成させたＤＯＴ細胞を、示されるＡＭＬ細胞株（Ａ）、初代ＡＭＬ試料（Ｂ）、または末梢血からＦＡＣＳ選別した正常白血球集団（Ｃ）と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。Ａでは、水平の破線はベースの腫瘍細胞死の平均値を表し、Ｂでは、ＣＴＲもまた、腫瘍細胞単独（ＤＯＴ細胞なし）を表す。実験は技術的に３回反復実施した。（Ｄ）インビトロ死滅アッセイにおいて、３人の健康なドナーから収集した非増殖新鮮（「エクスビボ」）Ｖδ１＋Ｔ細胞を、示されるＨＥＬ細胞株またはＫＧ－１細胞株と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。ＨＤ＃１から生成させたＤＯＴ細胞は陽性対照として示される。（Ｅ）ＤＯＴ細胞でのグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を細胞内フローサイトメトリーによって評価したものである。（Ｆ）ＡＭＬ腫瘍標的と共に共インキュベートした後、またはＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激時（陽性対照）、または無添加の場合（陰性対照）のＣＤ１０７ａ＋ＤＯＴ細胞のパーセント。結果は２人の健康なドナーから得られたものであり、２連で試験したものである。
【図4F】γδＴ細胞組成物は複数のＡＭＬ細胞型を標的とするが、健康な白血球は標的としない。インビトロ死滅アッセイにおいて、３～４人の健康なドナーから生成させたＤＯＴ細胞を、示されるＡＭＬ細胞株（Ａ）、初代ＡＭＬ試料（Ｂ）、または末梢血からＦＡＣＳ選別した正常白血球集団（Ｃ）と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。Ａでは、水平の破線はベースの腫瘍細胞死の平均値を表し、Ｂでは、ＣＴＲもまた、腫瘍細胞単独（ＤＯＴ細胞なし）を表す。実験は技術的に３回反復実施した。（Ｄ）インビトロ死滅アッセイにおいて、３人の健康なドナーから収集した非増殖新鮮（「エクスビボ」）Ｖδ１＋Ｔ細胞を、示されるＨＥＬ細胞株またはＫＧ－１細胞株と共に１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。ＨＤ＃１から生成させたＤＯＴ細胞は陽性対照として示される。（Ｅ）ＤＯＴ細胞でのグランザイムＢ及びパーフォリンの発現を細胞内フローサイトメトリーによって評価したものである。（Ｆ）ＡＭＬ腫瘍標的と共に共インキュベートした後、またはＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激時（陽性対照）、または無添加の場合（陰性対照）のＣＤ１０７ａ＋ＤＯＴ細胞のパーセント。結果は２人の健康なドナーから得られたものであり、２連で試験したものである。
【図5】血液腫瘍株に対するＶδ１＋Ｔ細胞の細胞傷害活性、及び健康なＰＢＭＣの温存。さまざまなＡＭＬ（ＭＶ４－１１、Ｋａｓｕｍｉ－１、ＨＬ－６０）腫瘍標的、ＮＨＬ（Ｒａｊｉ）腫瘍標的、及びＡＬＬ（ＮＡＬＭ－６）腫瘍標的、ならびに健康な同種異系ＰＢＭＣに対するＶδ１＋Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイを、さまざまなエフェクター：標的比で２０時間行った。標的細胞溶解のパーセントが示される。Ｎ＝２。
【図6A】γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化。（Ａ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（骨髄内－ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０６個の初代ヒトＡＭＬ細胞を移植した。（Ｂ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－（ＮＳＧ）マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に２×１０６個のヒトＫＧ－１細胞を注射した。（Ｃ）照射処理（２２５～２５０ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ．Ｒａｇ１－γｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０４個のヒトＨＥＬ細胞を移植した。（Ａ）及び（Ｃ）では、腫瘍細胞の注射から１週間後に血中に少なくとも１００個の腫瘍細胞（腫瘍トリガー）を検出すること＊によって腫瘍の生着を評価した。マウスの血中に１００個の腫瘍細胞が検出された時点（腫瘍トリガー）ですぐに処理を開始した。（Ｂ）では、腫瘍細胞の静脈内注射から１０日後にＰＢＳまたはＤＯＴ細胞のいずれかでの処理を開始した。ＰＢＳまたは２×１０７個のＤＯＴ細胞を動物に静脈内注射した。この静脈内注射は、５日の間隔を空けて３回実施した。ＨＥＬを有するＮＲＧＳ宿主についての生存曲線（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝４）；ｐ＜０．０５）。ＤＯＴ細胞（２×１０７個細胞の３回の注射）を、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞を事前に注射したＮＳＧマウス（ＣＴＲ（ｎ＝６）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝７））（Ｄ～Ｅ）または初代ＡＭＬ細胞を有するＮＳＧＳマウス（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））（Ｆ～Ｇ；患者由来異種移植（ＰＤＸ））に移入した。最後のＤＯＴ細胞移入から１週間後に血中及び肝臓中の腫瘍量を評価した（Ｄ）。または１週間に１回の採血によって腫瘍量を評価した（Ｆ）。生存曲線は、パネルＥ（Ｐ＜０．０５）及びパネルＧ（Ｐ＜０．０１）に示される。（Ｈ～Ｉ）第２の初代ＡＭＬモデルを開発した。（Ｈ）血液増悪における腫瘍量。（Ｉ）初代ＡＭＬを有するＮＳＧＳ宿主（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））の生存曲線。疾患症状の進行（後足の麻痺など）が観察された場合は動物を屠殺した。平均値±ＳＥＭが示される；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図6B】γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化。（Ａ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（骨髄内－ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０６個の初代ヒトＡＭＬ細胞を移植した。（Ｂ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－（ＮＳＧ）マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に２×１０６個のヒトＫＧ－１細胞を注射した。（Ｃ）照射処理（２２５～２５０ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ．Ｒａｇ１－γｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０４個のヒトＨＥＬ細胞を移植した。（Ａ）及び（Ｃ）では、腫瘍細胞の注射から１週間後に血中に少なくとも１００個の腫瘍細胞（腫瘍トリガー）を検出すること＊によって腫瘍の生着を評価した。マウスの血中に１００個の腫瘍細胞が検出された時点（腫瘍トリガー）ですぐに処理を開始した。（Ｂ）では、腫瘍細胞の静脈内注射から１０日後にＰＢＳまたはＤＯＴ細胞のいずれかでの処理を開始した。ＰＢＳまたは２×１０７個のＤＯＴ細胞を動物に静脈内注射した。この静脈内注射は、５日の間隔を空けて３回実施した。ＨＥＬを有するＮＲＧＳ宿主についての生存曲線（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝４）；ｐ＜０．０５）。ＤＯＴ細胞（２×１０７個細胞の３回の注射）を、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞を事前に注射したＮＳＧマウス（ＣＴＲ（ｎ＝６）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝７））（Ｄ～Ｅ）または初代ＡＭＬ細胞を有するＮＳＧＳマウス（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））（Ｆ～Ｇ；患者由来異種移植（ＰＤＸ））に移入した。最後のＤＯＴ細胞移入から１週間後に血中及び肝臓中の腫瘍量を評価した（Ｄ）。または１週間に１回の採血によって腫瘍量を評価した（Ｆ）。生存曲線は、パネルＥ（Ｐ＜０．０５）及びパネルＧ（Ｐ＜０．０１）に示される。（Ｈ～Ｉ）第２の初代ＡＭＬモデルを開発した。（Ｈ）血液増悪における腫瘍量。（Ｉ）初代ＡＭＬを有するＮＳＧＳ宿主（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））の生存曲線。疾患症状の進行（後足の麻痺など）が観察された場合は動物を屠殺した。平均値±ＳＥＭが示される；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図6C】γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化。（Ａ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（骨髄内－ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０６個の初代ヒトＡＭＬ細胞を移植した。（Ｂ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－（ＮＳＧ）マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に２×１０６個のヒトＫＧ－１細胞を注射した。（Ｃ）照射処理（２２５～２５０ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ．Ｒａｇ１－γｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０４個のヒトＨＥＬ細胞を移植した。（Ａ）及び（Ｃ）では、腫瘍細胞の注射から１週間後に血中に少なくとも１００個の腫瘍細胞（腫瘍トリガー）を検出すること＊によって腫瘍の生着を評価した。マウスの血中に１００個の腫瘍細胞が検出された時点（腫瘍トリガー）ですぐに処理を開始した。（Ｂ）では、腫瘍細胞の静脈内注射から１０日後にＰＢＳまたはＤＯＴ細胞のいずれかでの処理を開始した。ＰＢＳまたは２×１０７個のＤＯＴ細胞を動物に静脈内注射した。この静脈内注射は、５日の間隔を空けて３回実施した。ＨＥＬを有するＮＲＧＳ宿主についての生存曲線（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝４）；ｐ＜０．０５）。ＤＯＴ細胞（２×１０７個細胞の３回の注射）を、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞を事前に注射したＮＳＧマウス（ＣＴＲ（ｎ＝６）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝７））（Ｄ～Ｅ）または初代ＡＭＬ細胞を有するＮＳＧＳマウス（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））（Ｆ～Ｇ；患者由来異種移植（ＰＤＸ））に移入した。最後のＤＯＴ細胞移入から１週間後に血中及び肝臓中の腫瘍量を評価した（Ｄ）。または１週間に１回の採血によって腫瘍量を評価した（Ｆ）。生存曲線は、パネルＥ（Ｐ＜０．０５）及びパネルＧ（Ｐ＜０．０１）に示される。（Ｈ～Ｉ）第２の初代ＡＭＬモデルを開発した。（Ｈ）血液増悪における腫瘍量。（Ｉ）初代ＡＭＬを有するＮＳＧＳ宿主（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））の生存曲線。疾患症状の進行（後足の麻痺など）が観察された場合は動物を屠殺した。平均値±ＳＥＭが示される；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図6D】γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化。（Ａ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（骨髄内－ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０６個の初代ヒトＡＭＬ細胞を移植した。（Ｂ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－（ＮＳＧ）マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に２×１０６個のヒトＫＧ－１細胞を注射した。（Ｃ）照射処理（２２５～２５０ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ．Ｒａｇ１－γｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０４個のヒトＨＥＬ細胞を移植した。（Ａ）及び（Ｃ）では、腫瘍細胞の注射から１週間後に血中に少なくとも１００個の腫瘍細胞（腫瘍トリガー）を検出すること＊によって腫瘍の生着を評価した。マウスの血中に１００個の腫瘍細胞が検出された時点（腫瘍トリガー）ですぐに処理を開始した。（Ｂ）では、腫瘍細胞の静脈内注射から１０日後にＰＢＳまたはＤＯＴ細胞のいずれかでの処理を開始した。ＰＢＳまたは２×１０７個のＤＯＴ細胞を動物に静脈内注射した。この静脈内注射は、５日の間隔を空けて３回実施した。ＨＥＬを有するＮＲＧＳ宿主についての生存曲線（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝４）；ｐ＜０．０５）。ＤＯＴ細胞（２×１０７個細胞の３回の注射）を、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞を事前に注射したＮＳＧマウス（ＣＴＲ（ｎ＝６）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝７））（Ｄ～Ｅ）または初代ＡＭＬ細胞を有するＮＳＧＳマウス（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））（Ｆ～Ｇ；患者由来異種移植（ＰＤＸ））に移入した。最後のＤＯＴ細胞移入から１週間後に血中及び肝臓中の腫瘍量を評価した（Ｄ）。または１週間に１回の採血によって腫瘍量を評価した（Ｆ）。生存曲線は、パネルＥ（Ｐ＜０．０５）及びパネルＧ（Ｐ＜０．０１）に示される。（Ｈ～Ｉ）第２の初代ＡＭＬモデルを開発した。（Ｈ）血液増悪における腫瘍量。（Ｉ）初代ＡＭＬを有するＮＳＧＳ宿主（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））の生存曲線。疾患症状の進行（後足の麻痺など）が観察された場合は動物を屠殺した。平均値±ＳＥＭが示される；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図6E】γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化。（Ａ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（骨髄内－ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０６個の初代ヒトＡＭＬ細胞を移植した。（Ｂ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－（ＮＳＧ）マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に２×１０６個のヒトＫＧ－１細胞を注射した。（Ｃ）照射処理（２２５～２５０ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ．Ｒａｇ１－γｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０４個のヒトＨＥＬ細胞を移植した。（Ａ）及び（Ｃ）では、腫瘍細胞の注射から１週間後に血中に少なくとも１００個の腫瘍細胞（腫瘍トリガー）を検出すること＊によって腫瘍の生着を評価した。マウスの血中に１００個の腫瘍細胞が検出された時点（腫瘍トリガー）ですぐに処理を開始した。（Ｂ）では、腫瘍細胞の静脈内注射から１０日後にＰＢＳまたはＤＯＴ細胞のいずれかでの処理を開始した。ＰＢＳまたは２×１０７個のＤＯＴ細胞を動物に静脈内注射した。この静脈内注射は、５日の間隔を空けて３回実施した。ＨＥＬを有するＮＲＧＳ宿主についての生存曲線（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝４）；ｐ＜０．０５）。ＤＯＴ細胞（２×１０７個細胞の３回の注射）を、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞を事前に注射したＮＳＧマウス（ＣＴＲ（ｎ＝６）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝７））（Ｄ～Ｅ）または初代ＡＭＬ細胞を有するＮＳＧＳマウス（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））（Ｆ～Ｇ；患者由来異種移植（ＰＤＸ））に移入した。最後のＤＯＴ細胞移入から１週間後に血中及び肝臓中の腫瘍量を評価した（Ｄ）。または１週間に１回の採血によって腫瘍量を評価した（Ｆ）。生存曲線は、パネルＥ（Ｐ＜０．０５）及びパネルＧ（Ｐ＜０．０１）に示される。（Ｈ～Ｉ）第２の初代ＡＭＬモデルを開発した。（Ｈ）血液増悪における腫瘍量。（Ｉ）初代ＡＭＬを有するＮＳＧＳ宿主（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））の生存曲線。疾患症状の進行（後足の麻痺など）が観察された場合は動物を屠殺した。平均値±ＳＥＭが示される；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図6F】γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化。（Ａ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（骨髄内－ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０６個の初代ヒトＡＭＬ細胞を移植した。（Ｂ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－（ＮＳＧ）マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に２×１０６個のヒトＫＧ－１細胞を注射した。（Ｃ）照射処理（２２５～２５０ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ．Ｒａｇ１－γｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０４個のヒトＨＥＬ細胞を移植した。（Ａ）及び（Ｃ）では、腫瘍細胞の注射から１週間後に血中に少なくとも１００個の腫瘍細胞（腫瘍トリガー）を検出すること＊によって腫瘍の生着を評価した。マウスの血中に１００個の腫瘍細胞が検出された時点（腫瘍トリガー）ですぐに処理を開始した。（Ｂ）では、腫瘍細胞の静脈内注射から１０日後にＰＢＳまたはＤＯＴ細胞のいずれかでの処理を開始した。ＰＢＳまたは２×１０７個のＤＯＴ細胞を動物に静脈内注射した。この静脈内注射は、５日の間隔を空けて３回実施した。ＨＥＬを有するＮＲＧＳ宿主についての生存曲線（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝４）；ｐ＜０．０５）。ＤＯＴ細胞（２×１０７個細胞の３回の注射）を、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞を事前に注射したＮＳＧマウス（ＣＴＲ（ｎ＝６）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝７））（Ｄ～Ｅ）または初代ＡＭＬ細胞を有するＮＳＧＳマウス（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））（Ｆ～Ｇ；患者由来異種移植（ＰＤＸ））に移入した。最後のＤＯＴ細胞移入から１週間後に血中及び肝臓中の腫瘍量を評価した（Ｄ）。または１週間に１回の採血によって腫瘍量を評価した（Ｆ）。生存曲線は、パネルＥ（Ｐ＜０．０５）及びパネルＧ（Ｐ＜０．０１）に示される。（Ｈ～Ｉ）第２の初代ＡＭＬモデルを開発した。（Ｈ）血液増悪における腫瘍量。（Ｉ）初代ＡＭＬを有するＮＳＧＳ宿主（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））の生存曲線。疾患症状の進行（後足の麻痺など）が観察された場合は動物を屠殺した。平均値±ＳＥＭが示される；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図6G】γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化。（Ａ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（骨髄内－ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０６個の初代ヒトＡＭＬ細胞を移植した。（Ｂ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－（ＮＳＧ）マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に２×１０６個のヒトＫＧ－１細胞を注射した。（Ｃ）照射処理（２２５～２５０ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ．Ｒａｇ１－γｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０４個のヒトＨＥＬ細胞を移植した。（Ａ）及び（Ｃ）では、腫瘍細胞の注射から１週間後に血中に少なくとも１００個の腫瘍細胞（腫瘍トリガー）を検出すること＊によって腫瘍の生着を評価した。マウスの血中に１００個の腫瘍細胞が検出された時点（腫瘍トリガー）ですぐに処理を開始した。（Ｂ）では、腫瘍細胞の静脈内注射から１０日後にＰＢＳまたはＤＯＴ細胞のいずれかでの処理を開始した。ＰＢＳまたは２×１０７個のＤＯＴ細胞を動物に静脈内注射した。この静脈内注射は、５日の間隔を空けて３回実施した。ＨＥＬを有するＮＲＧＳ宿主についての生存曲線（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝４）；ｐ＜０．０５）。ＤＯＴ細胞（２×１０７個細胞の３回の注射）を、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞を事前に注射したＮＳＧマウス（ＣＴＲ（ｎ＝６）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝７））（Ｄ～Ｅ）または初代ＡＭＬ細胞を有するＮＳＧＳマウス（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））（Ｆ～Ｇ；患者由来異種移植（ＰＤＸ））に移入した。最後のＤＯＴ細胞移入から１週間後に血中及び肝臓中の腫瘍量を評価した（Ｄ）。または１週間に１回の採血によって腫瘍量を評価した（Ｆ）。生存曲線は、パネルＥ（Ｐ＜０．０５）及びパネルＧ（Ｐ＜０．０１）に示される。（Ｈ～Ｉ）第２の初代ＡＭＬモデルを開発した。（Ｈ）血液増悪における腫瘍量。（Ｉ）初代ＡＭＬを有するＮＳＧＳ宿主（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））の生存曲線。疾患症状の進行（後足の麻痺など）が観察された場合は動物を屠殺した。平均値±ＳＥＭが示される；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図6H】γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化。（Ａ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（骨髄内－ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０６個の初代ヒトＡＭＬ細胞を移植した。（Ｂ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－（ＮＳＧ）マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に２×１０６個のヒトＫＧ－１細胞を注射した。（Ｃ）照射処理（２２５～２５０ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ．Ｒａｇ１－γｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０４個のヒトＨＥＬ細胞を移植した。（Ａ）及び（Ｃ）では、腫瘍細胞の注射から１週間後に血中に少なくとも１００個の腫瘍細胞（腫瘍トリガー）を検出すること＊によって腫瘍の生着を評価した。マウスの血中に１００個の腫瘍細胞が検出された時点（腫瘍トリガー）ですぐに処理を開始した。（Ｂ）では、腫瘍細胞の静脈内注射から１０日後にＰＢＳまたはＤＯＴ細胞のいずれかでの処理を開始した。ＰＢＳまたは２×１０７個のＤＯＴ細胞を動物に静脈内注射した。この静脈内注射は、５日の間隔を空けて３回実施した。ＨＥＬを有するＮＲＧＳ宿主についての生存曲線（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝４）；ｐ＜０．０５）。ＤＯＴ細胞（２×１０７個細胞の３回の注射）を、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞を事前に注射したＮＳＧマウス（ＣＴＲ（ｎ＝６）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝７））（Ｄ～Ｅ）または初代ＡＭＬ細胞を有するＮＳＧＳマウス（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））（Ｆ～Ｇ；患者由来異種移植（ＰＤＸ））に移入した。最後のＤＯＴ細胞移入から１週間後に血中及び肝臓中の腫瘍量を評価した（Ｄ）。または１週間に１回の採血によって腫瘍量を評価した（Ｆ）。生存曲線は、パネルＥ（Ｐ＜０．０５）及びパネルＧ（Ｐ＜０．０１）に示される。（Ｈ～Ｉ）第２の初代ＡＭＬモデルを開発した。（Ｈ）血液増悪における腫瘍量。（Ｉ）初代ＡＭＬを有するＮＳＧＳ宿主（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））の生存曲線。疾患症状の進行（後足の麻痺など）が観察された場合は動物を屠殺した。平均値±ＳＥＭが示される；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図6I】γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化。（Ａ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（骨髄内－ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０６個の初代ヒトＡＭＬ細胞を移植した。（Ｂ）照射処理（２００～２２５ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤγｃ－／－（ＮＳＧ）マウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に２×１０６個のヒトＫＧ－１細胞を注射した。（Ｃ）照射処理（２２５～２５０ｒａｄ）を行った８～１２週齢のＮＯＤ．Ｒａｇ１－γｃ－／－－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスを麻酔下に置いた後、その右脛骨内（ｉ．ｂ．ｍ．）に１×１０４個のヒトＨＥＬ細胞を移植した。（Ａ）及び（Ｃ）では、腫瘍細胞の注射から１週間後に血中に少なくとも１００個の腫瘍細胞（腫瘍トリガー）を検出すること＊によって腫瘍の生着を評価した。マウスの血中に１００個の腫瘍細胞が検出された時点（腫瘍トリガー）ですぐに処理を開始した。（Ｂ）では、腫瘍細胞の静脈内注射から１０日後にＰＢＳまたはＤＯＴ細胞のいずれかでの処理を開始した。ＰＢＳまたは２×１０７個のＤＯＴ細胞を動物に静脈内注射した。この静脈内注射は、５日の間隔を空けて３回実施した。ＨＥＬを有するＮＲＧＳ宿主についての生存曲線（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝４）；ｐ＜０．０５）。ＤＯＴ細胞（２×１０７個細胞の３回の注射）を、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞を事前に注射したＮＳＧマウス（ＣＴＲ（ｎ＝６）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝７））（Ｄ～Ｅ）または初代ＡＭＬ細胞を有するＮＳＧＳマウス（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））（Ｆ～Ｇ；患者由来異種移植（ＰＤＸ））に移入した。最後のＤＯＴ細胞移入から１週間後に血中及び肝臓中の腫瘍量を評価した（Ｄ）。または１週間に１回の採血によって腫瘍量を評価した（Ｆ）。生存曲線は、パネルＥ（Ｐ＜０．０５）及びパネルＧ（Ｐ＜０．０１）に示される。（Ｈ～Ｉ）第２の初代ＡＭＬモデルを開発した。（Ｈ）血液増悪における腫瘍量。（Ｉ）初代ＡＭＬを有するＮＳＧＳ宿主（ＣＴＲ（ｎ＝５）、ＤＯＴ処理マウス（ｎ＝５））の生存曲線。疾患症状の進行（後足の麻痺など）が観察された場合は動物を屠殺した。平均値±ＳＥＭが示される；＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図7A】γδＴ細胞組成物は、化学療法抵抗性のＡＭＬを（再び）標的とする。ＤＯＴ細胞及び標準的な化学療法のインビトロでの抗ＡＭＬ活性の比較。（Ａ）化学療法ナイーブ（野生型（ｗｔ））ＡＭＬ細胞または化学療法再発（ＣＲ、９９％超のＨＥＬ細胞が除去された後の再増殖）ＡＭＬ細胞に対して、ＤＯＴ細胞及び標準的なＡＭＬ化学療法（ドキソルビシン＋シタラビン）プロトコールを試験した。処理から３時間後のアネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｂ）ＤＯＴ細胞での処理（Ｅ：Ｔ比５：１で実施）の前または７２時間後のＡＭＬ ＨＥＬ細胞の数。生存細胞（＜１％）を再選別し、再増殖させることによって、（Ｃ～Ｅ）のＤＯＴ処理（ＤＴ）試料を得た。（Ｃ）ＤＯＴ細胞を、非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞または既にＤＯＴ処理した（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞と共に５：１または１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。アネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｄ）非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、化学療法処理（ＣＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、またはＤＯＴ処理（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞におけるバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の数。（Ｅ）異なる処理の間のバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の分布に対するピアソン相関。破線は、それぞれ低度相関（０．２）、中度相関（０．４）、及び高度相関（０．８）を表す。平均値±ＳＥＭ（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）が示される。
【図7B】γδＴ細胞組成物は、化学療法抵抗性のＡＭＬを（再び）標的とする。ＤＯＴ細胞及び標準的な化学療法のインビトロでの抗ＡＭＬ活性の比較。（Ａ）化学療法ナイーブ（野生型（ｗｔ））ＡＭＬ細胞または化学療法再発（ＣＲ、９９％超のＨＥＬ細胞が除去された後の再増殖）ＡＭＬ細胞に対して、ＤＯＴ細胞及び標準的なＡＭＬ化学療法（ドキソルビシン＋シタラビン）プロトコールを試験した。処理から３時間後のアネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｂ）ＤＯＴ細胞での処理（Ｅ：Ｔ比５：１で実施）の前または７２時間後のＡＭＬ ＨＥＬ細胞の数。生存細胞（＜１％）を再選別し、再増殖させることによって、（Ｃ～Ｅ）のＤＯＴ処理（ＤＴ）試料を得た。（Ｃ）ＤＯＴ細胞を、非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞または既にＤＯＴ処理した（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞と共に５：１または１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。アネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｄ）非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、化学療法処理（ＣＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、またはＤＯＴ処理（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞におけるバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の数。（Ｅ）異なる処理の間のバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の分布に対するピアソン相関。破線は、それぞれ低度相関（０．２）、中度相関（０．４）、及び高度相関（０．８）を表す。平均値±ＳＥＭ（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）が示される。
【図7C】γδＴ細胞組成物は、化学療法抵抗性のＡＭＬを（再び）標的とする。ＤＯＴ細胞及び標準的な化学療法のインビトロでの抗ＡＭＬ活性の比較。（Ａ）化学療法ナイーブ（野生型（ｗｔ））ＡＭＬ細胞または化学療法再発（ＣＲ、９９％超のＨＥＬ細胞が除去された後の再増殖）ＡＭＬ細胞に対して、ＤＯＴ細胞及び標準的なＡＭＬ化学療法（ドキソルビシン＋シタラビン）プロトコールを試験した。処理から３時間後のアネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｂ）ＤＯＴ細胞での処理（Ｅ：Ｔ比５：１で実施）の前または７２時間後のＡＭＬ ＨＥＬ細胞の数。生存細胞（＜１％）を再選別し、再増殖させることによって、（Ｃ～Ｅ）のＤＯＴ処理（ＤＴ）試料を得た。（Ｃ）ＤＯＴ細胞を、非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞または既にＤＯＴ処理した（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞と共に５：１または１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。アネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｄ）非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、化学療法処理（ＣＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、またはＤＯＴ処理（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞におけるバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の数。（Ｅ）異なる処理の間のバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の分布に対するピアソン相関。破線は、それぞれ低度相関（０．２）、中度相関（０．４）、及び高度相関（０．８）を表す。平均値±ＳＥＭ（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）が示される。
【図7D】γδＴ細胞組成物は、化学療法抵抗性のＡＭＬを（再び）標的とする。ＤＯＴ細胞及び標準的な化学療法のインビトロでの抗ＡＭＬ活性の比較。（Ａ）化学療法ナイーブ（野生型（ｗｔ））ＡＭＬ細胞または化学療法再発（ＣＲ、９９％超のＨＥＬ細胞が除去された後の再増殖）ＡＭＬ細胞に対して、ＤＯＴ細胞及び標準的なＡＭＬ化学療法（ドキソルビシン＋シタラビン）プロトコールを試験した。処理から３時間後のアネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｂ）ＤＯＴ細胞での処理（Ｅ：Ｔ比５：１で実施）の前または７２時間後のＡＭＬ ＨＥＬ細胞の数。生存細胞（＜１％）を再選別し、再増殖させることによって、（Ｃ～Ｅ）のＤＯＴ処理（ＤＴ）試料を得た。（Ｃ）ＤＯＴ細胞を、非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞または既にＤＯＴ処理した（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞と共に５：１または１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。アネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｄ）非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、化学療法処理（ＣＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、またはＤＯＴ処理（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞におけるバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の数。（Ｅ）異なる処理の間のバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の分布に対するピアソン相関。破線は、それぞれ低度相関（０．２）、中度相関（０．４）、及び高度相関（０．８）を表す。平均値±ＳＥＭ（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）が示される。
【図7E】γδＴ細胞組成物は、化学療法抵抗性のＡＭＬを（再び）標的とする。ＤＯＴ細胞及び標準的な化学療法のインビトロでの抗ＡＭＬ活性の比較。（Ａ）化学療法ナイーブ（野生型（ｗｔ））ＡＭＬ細胞または化学療法再発（ＣＲ、９９％超のＨＥＬ細胞が除去された後の再増殖）ＡＭＬ細胞に対して、ＤＯＴ細胞及び標準的なＡＭＬ化学療法（ドキソルビシン＋シタラビン）プロトコールを試験した。処理から３時間後のアネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｂ）ＤＯＴ細胞での処理（Ｅ：Ｔ比５：１で実施）の前または７２時間後のＡＭＬ ＨＥＬ細胞の数。生存細胞（＜１％）を再選別し、再増殖させることによって、（Ｃ～Ｅ）のＤＯＴ処理（ＤＴ）試料を得た。（Ｃ）ＤＯＴ細胞を、非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞または既にＤＯＴ処理した（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞と共に５：１または１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で３時間共インキュベートした。アネキシンＶ＋ＨＥＬ細胞のパーセントが示される。（Ｄ）非処理（ＮＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、化学療法処理（ＣＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞、またはＤＯＴ処理（ＤＴ）ＡＭＬ ＨＥＬ細胞におけるバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の数。（Ｅ）異なる処理の間のバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の分布に対するピアソン相関。破線は、それぞれ低度相関（０．２）、中度相関（０．４）、及び高度相関（０．８）を表す。平均値±ＳＥＭ（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）が示される。
【図8】血液腫瘍株に対する増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞集団の反復細胞傷害性。グラフの左側は、負荷１の間にＳｙｔｏｘ＋ｖｅであったＣＴＶ＋ｖｅ事象（ＨＬ－６０腫瘍標的）のパーセントを示し、グラフの右側は、負荷２の間にＳｙｔｏｘ＋ｖｅであったＣＴＶ＋ｖｅ事象のパーセントを示す。２人のドナーの標準偏差を伴う平均値。
【図9A】刺激したＶδ１増殖細胞によるサイトカイン産生。ＴＣＲ刺激時のＶδ１増殖細胞のサイトカイン産生（ｐｇ／百万個細胞／時間）（Ａ）。生理学的レベルのＯＫＴ３及びＩＬ－１５によって刺激したＶδ１増殖細胞によって産生された上位サイトカイン（Ｂ）またはＩＬ－１５での超生理学的な刺激によってＶδ１増殖細胞によって産生された上位サイトカイン（Ｃ）を円グラフで表したもの。血液試料（ＰＢＭＣまたはバフィーコート）とＶδ１増殖細胞との共培養時のＩＬ－６及びＴＮＦαの産生（Ｄ）。
【図9B】刺激したＶδ１増殖細胞によるサイトカイン産生。ＴＣＲ刺激時のＶδ１増殖細胞のサイトカイン産生（ｐｇ／百万個細胞／時間）（Ａ）。生理学的レベルのＯＫＴ３及びＩＬ－１５によって刺激したＶδ１増殖細胞によって産生された上位サイトカイン（Ｂ）またはＩＬ－１５での超生理学的な刺激によってＶδ１増殖細胞によって産生された上位サイトカイン（Ｃ）を円グラフで表したもの。血液試料（ＰＢＭＣまたはバフィーコート）とＶδ１増殖細胞との共培養時のＩＬ－６及びＴＮＦαの産生（Ｄ）。
【図9C】刺激したＶδ１増殖細胞によるサイトカイン産生。ＴＣＲ刺激時のＶδ１増殖細胞のサイトカイン産生（ｐｇ／百万個細胞／時間）（Ａ）。生理学的レベルのＯＫＴ３及びＩＬ－１５によって刺激したＶδ１増殖細胞によって産生された上位サイトカイン（Ｂ）またはＩＬ－１５での超生理学的な刺激によってＶδ１増殖細胞によって産生された上位サイトカイン（Ｃ）を円グラフで表したもの。血液試料（ＰＢＭＣまたはバフィーコート）とＶδ１増殖細胞との共培養時のＩＬ－６及びＴＮＦαの産生（Ｄ）。
【図9D】刺激したＶδ１増殖細胞によるサイトカイン産生。ＴＣＲ刺激時のＶδ１増殖細胞のサイトカイン産生（ｐｇ／百万個細胞／時間）（Ａ）。生理学的レベルのＯＫＴ３及びＩＬ－１５によって刺激したＶδ１増殖細胞によって産生された上位サイトカイン（Ｂ）またはＩＬ－１５での超生理学的な刺激によってＶδ１増殖細胞によって産生された上位サイトカイン（Ｃ）を円グラフで表したもの。血液試料（ＰＢＭＣまたはバフィーコート）とＶδ１増殖細胞との共培養時のＩＬ－６及びＴＮＦαの産生（Ｄ）。
【図10】ＮＡＬＭ－６細胞及び健康なＢ細胞に対する増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞集団の選択的細胞傷害活性。グラフは、さまざまなＥ：Ｔ比での、Ｓｙｔｏｘ＋ｖｅであったＣＴＶ＋ｖｅ事象（健康なＢ細胞）のパーセント及びＳｙｔｏｘ＋ｖｅであったＣＦＳＥ＋ｖｅ事象（ＮＡＬＭ－６腫瘍細胞）のパーセントを共に示す。平均値及びＳＤ（２回の技術的反復実験）。３人の生物学的ドナーを代表する１実験。
【図11】（Ａ）バフィーコート血液調製物から単離し、照射処理して細胞分裂潜在力を抑止したＰＢＬを、ＣＴＶ染色した同種異系血液Ｔ細胞集団または自己血液Ｔ細胞集団と共に１：１の比でサイトカインによる支援なしに５日間共培養した。その後、照射処理ＰＢＬとの共培養に反応して生じる細胞分裂を、ＣＴＶ色素の希釈をフローサイトメトリーによって分析することで評価した。分裂したαβＴ細胞の総％が示される。Ｎ＝３。（Ｂ）バフィーコート血液調製物から単離し、照射処理して細胞分裂潜在力を抑止したＰＢＬを、２人の異なるドナー（ＬＫ００８、ＬＫ００９）から調製したＣＴＶ染色した血液Ｔ細胞またはＧＤＸ０１２細胞のいずれかと共に１：１の比で共培養した。血液Ｔ細胞及びＧＤＸ０１２細胞は、同じドナー由来のものとした。サイトカインによる支援なしに共培養物を５日間インキュベートした。その後、照射処理ＰＢＬとの共培養に反応して生じる細胞分裂を、ＣＴＶ色素の希釈をフローサイトメトリーによって分析することで評価した。（血液Ｔ細胞については）αβＴ細胞の総％、または分裂した生存ＧＤＸ０２３細胞の総％が示される。データは、３回の技術的反復実験で得たものが示される。Ｎ．Ｄ＝非検出。
【図12】ＧＤＸ０１２の単回静脈内投与後のインビボモデルにおける腫瘍制御。０．５×１０６個のＮＡＬＭ－６－ＦＬｕｃ／ＧＦＰ細胞を静脈内注射して接種した後、翌日に２０×１０６個のＧＤＸ０１２細胞の単回の静脈内注射処理を行ったまたは行わなかったＮＳＧマウスにおいて全身ＢＬＩによって腫瘍増殖を追跡した。すべての対照マウス及び処理マウスに組換えヒトＩＬ－１５を腹腔内注射した（試験期間中、３日ごとに１μｇ／マウスで実施）。１４日目～２８日目の平均値±ＳＥＭ（ｎ＝８）が示され、１７日目及び２８日目の時点については個々のデータ点及び腹側全身ＢＬＩ画像も示される。
【図13】ＧＤＸ０１２の単回静脈内投与後のインビボモデルにおける骨髄ホーミング。０．５×１０６個または１×１０６個のＮＡＬＭ－６－ＦＬｕｃ／ＧＦＰ細胞を静脈内注射して接種したＮＳＧマウスに対して、２４時間後または６日後のいずれかに２０×１０６個のＧＤＸ０１２細胞の単回の静脈内注射処理を行ったまたは行わなかった。すべての対照マウス及び処理マウスに組換えヒトＩＬ－１５を腹腔内注射した（試験期間中、２～３日ごとに１μｇ／マウスで実施）。４週間後に試験を終了して骨髄におけるＧＤＸ０１２の生体内分布及び腫瘍量を評価した。後足長骨から得た骨髄に対してフローサイトメトリーを実施し、生存単一細胞集団内のＴＣＲγδ＋細胞（ＧＤＸ０１２）及びＣＤ１９＋細胞（ＮＡＬＭ－６細胞）のパーセントを評価した。代表的なフローサイトメトリープロット及び個々のデータ点が示される。
【発明を実施するための形態】
【0009】
第１の態様によれば、骨髄性悪性病変を有する患者の治療における使用のためのＶδ１＋Ｔ細胞を含む同種異系組成物が提供される。本明細書に示されるデータは、同種異系ドナーから増殖させたＶδ１＋Ｔ細胞が高度に多クローン性であり、ドミナントクローンを欠いていることを示しており、これによって、当該Ｖδ１＋Ｔ細胞が幅広いドナーにおいて使用するための治療として適したものとなっている。そのような組成物はサイトカイン放出症候群を引き起こす可能性が限られたものであり、混合リンパ球反応を媒介しないことも追加の実験から示されており、こうしたことは、養子細胞療法を考慮した場合に重要な安全面である。さらに、本発明のＶδ１＋Ｔ細胞は、骨髄性の細胞株及び初代細胞に対して高度に選択的かつ細胞傷害性である一方で、同じ型の非悪性の「健康な」細胞を温存する。
【0010】
骨髄性悪性病変
骨髄性悪性病変は、造血幹細胞または前駆細胞に生じるクローン性疾患である。骨髄性悪性病変は、異常な骨髄性前駆細胞の無制御増殖及び／または分化遮断によって特徴付けられ得る。こうした悪性病変と関連する変異がいくつか同定されており、これらの変異は主に５つのクラスに属する：シグナル伝達経路タンパク質（例えば、ＣＢＬ、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＲＡＳ）、転写因子（例えば、ＣＥＢＰＡ、ＥＴＶ６、ＲＵＮＸ１）、エピジェネティック制御因子（例えば、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＳＵＺ１２、ＴＥＴ２、ＵＴＸ）、腫瘍抑制因子（例えば、ＴＰ５３）、及びスプライソソームの成分（例えば、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２）（Ｍｕｒａｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １２：３０４）。
骨髄性悪性病変は、造血幹細胞または前駆細胞に生じるクローン性疾患である。骨髄性悪性病変は、異常な骨髄性前駆細胞の無制御増殖及び／または分化遮断によって特徴付けられ得る。こうした悪性病変と関連する変異がいくつか同定されており、これらの変異は主に５つのクラスに属する：シグナル伝達経路タンパク質（例えば、ＣＢＬ、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＲＡＳ）、転写因子（例えば、ＣＥＢＰＡ、ＥＴＶ６、ＲＵＮＸ１）、エピジェネティック制御因子（例えば、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＳＵＺ１２、ＴＥＴ２、ＵＴＸ）、腫瘍抑制因子（例えば、ＴＰ５３）、及びスプライソソームの成分（例えば、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２）（Ｍｕｒａｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １２：３０４）。
【0011】
骨髄性悪性病変は、慢性ステージ（骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、及び慢性骨髄単球性白血病を含む）ならびに急性ステージ（急性骨髄性白血病）を含み得る。
【0012】
骨髄性障害の形態、細胞化学、免疫表現型、遺伝学、及び臨床的特徴に基づいて、世界保健機関（ＷＨＯ）は骨髄性悪性病変を５つの主要型に分類している：（１）急性骨髄性白血病、（２）骨髄異形成症候群、（３）骨髄増殖性新生物、（４）骨髄異形成及び骨髄増殖性新生物、ならびに（５）好酸球増多症及び血小板または線維芽細胞に由来する増殖因子受容体の異常性を伴う骨髄性新生物。分類については、Ｔｅｆｆｅｒｉ ａｎｄ Ｖａｒｄｉｍａｎ（２００８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２２：１４－２２にさらに記載されている。
【0013】
したがって、一実施形態では、骨髄性悪性病変は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、骨髄異形成及び骨髄増殖性（ＭＤＳ／ＭＰＮ）新生物、ならびに好酸球増多症及び血小板または線維芽細胞に由来する増殖因子受容体の異常性を伴う骨髄性新生物、から選択される。別の実施形態では、骨髄性悪性病変はＡＭＬ、ＭＤＳ、またはＭＰＮであり、特に、ＡＭＬまたはＭＤＳである。
【0014】
一実施形態では、骨髄性悪性病変はＡＭＬである。ＡＭＬは、末梢血、骨髄、または他の組織において骨髄性芽球がクローン性に増殖することで生じる。ＡＭＬは、健康な白血球にならない異常な骨髄芽球が骨髄性幹細胞から生じるか、または異常な赤血球もしくは血小板になる骨髄性幹細胞が多すぎる場合に引き起こされる。結果として、白血病性芽球または未熟細胞形態が骨髄中、末梢血中、及び時には他の組織中に蓄積し、正常な赤血球、血小板、及び成熟顆粒球の生成が減少する。
【0015】
代替の実施形態では、骨髄性悪性病変はＭＤＳである。ＭＤＳ及びＭＰＮは骨髄性悪性病変（ＡＭＬなど）の前段階であると考えられることが多い。血液細胞数が少ないこと（「血球減少症」とも称される）はＭＤＳの顕著な特徴であり、ＭＤＳと関連する症状（感染症、貧血、特発性出血、またはあざのできやすさなど）の多くの原因である。
【0016】
ＭＤＳ型には、単一血球系統の異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＵＤ）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ－１及びＲＡＥＢ－２）、単独欠失（５ｑ）を伴う骨髄異形成症候群、ならびに分類不能型骨髄異形成症候群（ＭＤＳ－Ｕ）が含まれる。ＲＣＵＤは、単一の血液細胞型に影響を及ぼすものであり、３つの亜型に分類され得る：不応性貧血（赤血球数の低下）、不応性好中球減少症（白血球数の低下）、及び不応性血小板減少症（血小板数の低下）。ＲＡＲＳは不応性貧血と類似しているが、鉄の環を中に有する初期赤血球（環状鉄芽球）の数が骨髄中で増加する。ＲＣＭＤは、複数の血液細胞型に影響を及ぼすものであり、血中の未熟細胞（芽球）が非常に少ないか、または全く存在せず、骨髄中の芽球数が少ないことによって特徴付けられる。ＲＡＥＢについては、１つ以上の血液細胞のレベルが低く、骨髄においてこうした細胞の多くが異常に見える。ＲＡＥＢ－２では、血中及び骨髄中の芽細胞がＲＡＥＢ－１よりも多く存在する。
【0017】
一実施形態では、患者は微小残存病変に陽性（ＭＲＤ＋）である。
【0018】
微小残存病変（ＭＲＤ）は、がん治療後に体内に少数のがん細胞が存在することを指す。ＭＲＤは、ＡＭＬ及びＭＤＳの独立した診断後予後指標であり、この指標はリスク層別化及び治療計画に重要である。
【0019】
ＭＲＤでは、細胞レベルが低いことから、高感度検査を使用して検査を行うことが必要になる。最も広く使用される検査は、骨髄細胞及び／または末梢血細胞の試料に対するフローサイトメトリー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び次世代シークエンシング（ＮＧＳ）である。当該技術分野で知られる方法を使用することでＭＲＤ患者の診断を行うことができる。一実施形態では、ＭＲＤ＋患者は完全寛解にあり、検出可能な白血病性芽球を末梢血中に含まず、及び／または５％未満の白血病性芽球を骨髄中に含む。
【0020】
治療すべき患者または対象は、好ましくは、ヒトがん患者（例えば、血液癌の治療中のヒトがん患者）である。
【0021】
一実施形態では、患者は化学療法で以前に治療されている。例えば、患者は、同種異系組成物の投与の少なくとも３日前に化学療法で治療されている可能性がある。
【0022】
一実施形態では、化学療法は、フルダラビン及びシクロホスファミドから選択される。
【0023】
同種異系組成物
一実施形態では、同種異系組成物は、全生細胞に対して少なくとも約９０％のＣＤ４５＋細胞を含む。別の実施形態では、同種異系組成物は、全生細胞に対して少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％のＣＤ４５＋細胞を含む。
一実施形態では、同種異系組成物は、全生細胞に対して少なくとも約９０％のＣＤ４５＋細胞を含む。別の実施形態では、同種異系組成物は、全生細胞に対して少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％のＣＤ４５＋細胞を含む。
【0024】
一実施形態では、同種異系組成物は、全生細胞に対して少なくとも約６０％のγδＴ細胞を含む。別の実施形態では、同種異系組成物は、全生細胞に対して少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％のγδＴ細胞を含む。
【0025】
一実施形態では、同種異系組成物は、非増殖出発細胞集団と比較してＶδ１＋Ｔ細胞が濃縮されたエクスビボ増殖細胞集団を含む。一実施形態では、同種異系組成物は、全生細胞に対して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％のＶδ１＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、同種異系組成物は、全生細胞に対して３０％超（例えば、少なくとも３３％）のＶδ１＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、同種異系組成物の全γδＴ細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する。別の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、同種異系組成物の全γδＴ細胞の少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％を構成する。
【0026】
一実施形態では、同種異系組成物は、全生細胞に対して０．１％未満のαβＴ細胞を含む。好ましくは、同種異系組成物は、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、または０．０１％未満のαβＴ細胞を含む。
【0027】
同種異系組成物は、患者への投与に適した用量を含み得る。別の態様によれば、骨髄性悪性病変を有する患者の治療における使用のためのＶδ１＋Ｔ細胞を含む同種異系組成物の用量が提供される。
【0028】
一実施形態では、同種異系組成物の用量は、約１×１０１０個未満の全生細胞（約９×１０９個未満、約８×１０９個未満、約７×１０９個未満、約６×１０９個未満、約５×１０９個未満、約４×１０９個未満、約３×１０９個未満、約２×１０９個未満、約１×１０９個未満、約５×１０８個未満、約３×１０８個未満、約１×１０８個未満、約５×１０７個未満、約３×１０７個未満、約１×１０７個未満、約５×１０６個未満、約３×１０６個未満、または約１×１０６個未満の全生細胞など）を含む。一実施形態では、同種異系組成物の用量は、約１×１０８個未満の全生細胞を含む。一実施形態では、同種異系組成物の用量は、約１×１０４個超の全生細胞（約３×１０４個超、約５×１０４個超、約１×１０５個超、約３×１０５個超、約５×１０５個超、約１×１０６個超、約３×１０６個超、約５×１０６個超、約１×１０７個超、約３×１０７個超、または約５×１０７個超の全生細胞など）を含む。一実施形態では、同種異系組成物の用量は、約１×１０６個超の全生細胞を含む。一実施形態では、同種異系組成物の用量は、約１×１０４個の細胞～約１×１０１０個の全生細胞（約１×１０５個の全生細胞～約１×１０９個の細胞、具体的には、約１×１０６個の細胞～約１×１０８個の全生細胞など）を含む。一実施形態では、同種異系組成物の用量は、約４×１０７個～８×１０９個（例えば、４×１０７個、８×１０７個、４×１０８個、８×１０８個、１．２×１０９個、２．４×１０９個、４×１０９個、または８×１０９個）の全生細胞を含む。
【0029】
同種異系組成物は、患者への投与のための用量（治療的に有効な用量など）を含み得る。一実施形態では、患者の体重ｋｇ当たりで計算されたＶδ１＋Ｔ細胞の用量が患者に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＶδ１＋Ｔ細胞の用量は、約１×１０５個細胞／ｋｇ、約５×１０５個細胞／ｋｇ、約１×１０６個細胞／ｋｇ、約１．５×１０６個細胞／ｋｇ、約２×１０６個細胞／ｋｇ、約３×１０６個細胞／ｋｇ、約５×１０６個細胞／ｋｇ、約１×１０７個細胞／ｋｇ、約１．５×１０７個細胞／ｋｇ、約２×１０７個細胞／ｋｇ、約３×１０７個細胞／ｋｇ、約５×１０７個細胞／ｋｇ、約１×１０８個細胞／ｋｇ、約２×１０８個細胞／ｋｇ、または約５×１０８個細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞の用量は、少なくとも約１×１０５個細胞／ｋｇ、約５×１０５個細胞／ｋｇ、約１×１０６個細胞／ｋｇ、約１．５×１０６個細胞／ｋｇ、約２×１０６個細胞／ｋｇ、約３×１０６個細胞／ｋｇ、約５×１０６個細胞／ｋｇ、約１×１０７個細胞／ｋｇ、約１．５×１０７個細胞／ｋｇ、約２×１０７個細胞／ｋｇ、約３×１０７個細胞／ｋｇ、約５×１０７個細胞／ｋｇ、約１×１０８個細胞／ｋｇ、約２×１０８個細胞／ｋｇ、または約５×１０８個細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞の用量は、最大で約１×１０６個細胞／ｋｇ、約１．５×１０６個細胞／ｋｇ、約２×１０６個細胞／ｋｇ、約３×１０６個細胞／ｋｇ、約５×１０６個細胞／ｋｇ、約１×１０７個細胞／ｋｇ、約１．５×１０７個細胞／ｋｇ、約２×１０７個細胞／ｋｇ、約３×１０７個細胞／ｋｇ、約５×１０７個細胞／ｋｇ、約１×１０８個細胞／ｋｇ、約２×１０８個細胞／ｋｇ、または約５×１０８個細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞の用量は、約１×１０６～１×１０８個細胞／ｋｇを含む。
【0030】
同種異系組成物の用量は、５×１０４個以下αβＴ細胞／ｋｇ（約１０４個以下αβＴ細胞／ｋｇ、約１０３個以下αβＴ細胞／ｋｇ、または約１０２個以下αβＴ細胞／ｋｇなど）を含み得る。したがって、一実施形態では、用量は、約５×１０４個未満αβＴ細胞／ｋｇを含む。別の実施形態では、用量は、約１×１０４個未満αβＴ細胞／ｋｇを含む。
【0031】
一実施形態では、同種異系組成物は凍結された後、投与前に解凍される。別の実施形態では、同種異系組成物の用量は凍結前に計算される。別の実施形態では、用量は凍結後に計算される。別の実施形態では、同種異系組成物は凍結されない。
【0032】
本明細書で使用される「約」という用語は、本明細書で使用される場合、上振れ範囲が明記値の１０％まで（１０％を含む）であり、かつ下振れ範囲が明記値の１０％まで（１０％を含む）であることを含み、適切には、上振れ範囲が明記値の５％まで（５％を含む）であり、かつ下振れ範囲が明記値の５％まで（５％を含む）であることを含み、とりわけ、明記値を含む。「～」という用語は、明記境界の値を含む。
【0033】
医薬組成物は、本明細書に記載の増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞組成物を、１つ以上の医薬的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤、または医薬品添加物と併せて含み得る。そのような組成物は、緩衝剤（中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、及び同様のものなど）、糖質（グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなど）、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸（グリシンなど）、抗酸化剤、キレート剤（ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、ならびに保存剤を含み得る。本発明の医薬組成物に使用され得る凍結保存溶液には、例えば、ＤＭＳＯが含まれる。組成物は、任意の適切な投与（例えば、静脈内投与）用に製剤化され得る。
【0034】
一実施形態では、医薬組成物は、混入物（例えば、エンドトキシンまたはマイコプラズマ）を実質的に含まない（例えば、混入物が検出可能なレベルで存在しない）。
【0035】
ガンマデルタＴ細胞
好ましい一実施形態では、γδＴ細胞は、Ｖδ１＋Ｔ細胞の集団を含む。
好ましい一実施形態では、γδＴ細胞は、Ｖδ１＋Ｔ細胞の集団を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞はＣＤ２７を発現する。例えば、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超のＣＤ２７＋細胞の頻度を有し得る。代替的には、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％のＣＤ２７＋細胞の頻度を有し得る。ある特定の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、１０％超のＣＤ２７＋細胞の頻度を有する。したがって、一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、約２０％のＣＤ２７＋細胞の頻度を有する。別の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、２０％超のＣＤ２７＋細胞の頻度を有する。一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、約２０％のＣＤ２７＋細胞の頻度を有する。
【0037】
いくつかの実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、低いＴＩＧＩＴ発現細胞の比率を有する。例えば、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満のＴＩＧＩＴ＋細胞の頻度を有し得る。代替的には、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％のＴＩＧＩＴ＋細胞の頻度を有し得る。ある特定の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、８０％未満のＴＩＧＩＴ＋細胞の頻度を有する。したがって、一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、約７０％のＴＩＧＩＴ＋細胞の頻度を有する。別の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、６０％未満のＴＩＧＩＴ＋細胞の頻度を有する。さらに別の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、約３０％のＴＩＧＩＴ＋細胞の頻度を有する。したがって、一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、ＴＩＧＩＴを実質的に発現しない。
【0038】
別の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞はＣＤ２７を発現し、及び／またはＴＩＧＩＴを実質的に発現しない。
【0039】
Ｖδ１＋Ｔ細胞濃縮組成物を得る方法
Ｖδ１＋Ｔ細胞は、当該技術分野で知られる方法を使用して得ることができる。例えば、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、ＷＯ２０１６／１９８４８０、ＷＯ２０１７／０７２３６７、またはＷＯ２０１８／２０２８０８に記載の方法を使用して得ることができ、これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。これらの方法は、培養でＶδ１＋Ｔ細胞（具体的には、Ｖδ２－ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞）を選択的に増殖させ得るものである。これらの方法は、試料に対して実施され、この試料は「出発試料」とも称され得る。これらの方法では、非分画試料か、またはＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が濃縮されている試料のいずれかが使用され得る。
Ｖδ１＋Ｔ細胞は、当該技術分野で知られる方法を使用して得ることができる。例えば、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、ＷＯ２０１６／１９８４８０、ＷＯ２０１７／０７２３６７、またはＷＯ２０１８／２０２８０８に記載の方法を使用して得ることができ、これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。これらの方法は、培養でＶδ１＋Ｔ細胞（具体的には、Ｖδ２－ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞）を選択的に増殖させ得るものである。これらの方法は、試料に対して実施され、この試料は「出発試料」とも称され得る。これらの方法では、非分画試料か、またはＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が濃縮されている試料のいずれかが使用され得る。
【0040】
本明細書の実施例において提供されるデータは、外来性増殖因子を使用して増殖させたＶδ１＋Ｔ細胞組成物が、単に末梢血から得たＦＡＣＳ選別非増殖Ｖδ１Ｔ細胞（すなわち、エクスビボＶδ１Ｔ細胞）と比較して多クローン性が改善されたものであることを示している。したがって、一実施形態では、同種異系組成物は、増殖方法を使用して得られるＶδ１＋Ｔ細胞を含み、具体的には、当該増殖方法は、外来性増殖因子の存在下でＶδ１＋Ｔ細胞を培養することを含む。
【0041】
試料は、γδＴ細胞またはその前駆細胞を含む任意の試料であり得、こうした試料には、限定されないが、血液、骨髄、リンパ系組織、上皮、胸腺、肝臓、脾臓、がん組織、リンパ節組織、感染組織、胎児組織、及びその画分または濃縮部分が含まれる。本発明の組成物及び方法は、血液学的試料から得られるＶδ１＋Ｔ細胞を用いると特に有用である。したがって、一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は血液試料から得られる。
【0042】
試料は、好ましくは、末梢血もしくは臍帯血またはその画分を含む血液であり、こうした画分には、バフィーコート細胞、白血球アフェレーシス産物、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及び低密度単核細胞（ＬＤＭＣ）が含まれる。一実施形態では、血液試料は、末梢血またはその画分である。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト血液またはその画分である。細胞は、当該技術分野で知られる手法（密度勾配遠心分離法など）を使用して血液の試料から得ることができる。例えば、全血を等体積のＦＩＣＯＬＬ－ＨＹＰＡＱＵＥ上に重層した後、室温、４００×ｇでの遠心分離に１５～３０分間供すことができる。界面物質は低密度単核細胞を含むことになり、この低密度単核細胞を培養培地に収集し、培養培地で洗浄し、室温、２００×ｇでの遠心分離に１０分間供すことができる。試料は新鮮なものとするか、または凍結することができる。
【0043】
一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、ヒト試料から得られる。
【0044】
本明細書に記載のように、本発明の組成物及び方法は、同種異系由来のＶδ１＋Ｔ細胞、すなわち、別のドナーから得られる試料に由来する細胞と共に使用され得る。一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、健康なドナーから得られる。
【0045】
試料またはその画分（ＰＢＭＣなど）を培養する前に、そうした試料またはその画分は、ある特定の細胞型が濃縮され、及び／または他の細胞型が枯渇され得る。一実施形態では、試料は、Ｔ細胞が濃縮される。試料は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が濃縮され得る。例えば、試料は、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞、非ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が枯渇され、及び／またはＣＤ３＋細胞が濃縮され得る。一実施形態では、試料は、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞が最初に枯渇された後、ＣＤ３＋細胞が濃縮される。
【0046】
試料は、当該技術分野で知られる手法を使用してある特定の細胞型が濃縮または枯渇され得る。一実施形態では、枯渇対象の細胞上の特定の分子に結合する抗体を含む抗体カクテルと共に試料またはその画分を培養することによって特定の表現型の細胞が枯渇され得る。好ましくは、カクテル中の抗体は、標的細胞が強制的に磁気カラムに通されるときにこうした細胞の磁気的な枯渇または濃縮に使用可能な磁気マイクロビーズと結合されている。一実施形態では、試料は、αβＴ細胞が枯渇される。
【0047】
Ｖδ１＋Ｔ細胞の収集には、培養物からのＶδ１＋Ｔ細胞の物理的な収集、他のリンパ球（例えば、αβＴ細胞、γδＴ細胞、及び／またはＮＫ細胞）からのＶδ１＋Ｔ細胞の単離、あるいは間質細胞（例えば、線維芽細胞）からのＶδ１＋Ｔ細胞の単離及び／または分離が含まれ得る。一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、機械的な手段（例えば、ピぺッティング）によって収集される。別の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、磁気分離及び／または標識化によって収集される。さらに別の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、フローサイトメトリー手法（ＦＡＣＳなど）によって収集される。したがって、ある特定の実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、Ｖδ１＋Ｔ細胞を特異的に標識化することによって収集される。Ｖδ１＋Ｔ細胞のそのような収集は、培養物からの物理的取り出し、別の培養容器への移送、または別の培養条件もしくは異なる培養条件への移行を含み得ることが理解されよう。
【0048】
試料からの単離時には、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、一般に、リンパ球の大集団の一部であり、この大集団は、例えば、αβＴ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。いくつかの実施形態では、単離されたリンパ球集団の０．１％～１０％はＶδ１＋Ｔ細胞であり、例えば、単離されたリンパ球集団の１～１０％はＶδ１＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞のパーセントは、ＣＤ４５＋細胞（白血球共通抗原）の比率で測定される。いくつかの実施形態では、単離された集団は、他の細胞型が枯渇される（例えば、αβＴ細胞が枯渇される）。いくつかの実施形態では、αβＴ細胞が枯渇された、単離されたＣＤ４５＋細胞集団は、少なくとも０．１％のＶδ１＋Ｔ細胞（少なくとも０．５％のＶδ１＋Ｔ細胞など）を含む。多くの場合、γδＴ細胞集団（例えば、血液由来のγδＴ細胞集団）は、Ｖδ１Ｔ細胞の大集団を含むことになる。場合によっては、γδＴ細胞の１０％未満はＶδ２＋Ｔ細胞である（例えば、γδＴ細胞の１０％未満はＶδ２＋Ｔ細胞である）。
【0049】
試料中の細胞が分画及び濃縮された時点で、望まれる場合は、細胞が培養され得る。
【0050】
ある特定の実施形態では、本発明は、Ｖδ１＋Ｔ細胞を増殖させる方法を特徴とする。こうした方法は、インビトロで実施され得る。いくつかの実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、本明細書に記載の試料から単離されたγδＴ細胞の集団から増殖される。
【0051】
本明細書で使用されるように、「増殖」または「Ｖδ１＋Ｔ細胞の増殖集団」への言及は、非増殖集団と比較して細胞集団が大きいか、または多くの数の細胞を含むことを含む。そのような集団は、当該集団内での特定の細胞型の比率の増加に伴って数が多いか、数が少ないか、または混合集団であり得る。「増殖ステップ」という用語は、増殖または増殖集団が生じるプロセスを指すことが理解されよう。したがって、増殖または増殖集団は、実施される増殖ステップを経ていない集団または任意の増殖ステップの前の集団と比較して数が多いか、または多くの数の細胞を含み得る。増殖を示すために本明細書に示される数（例えば、増加倍率または増殖倍率）はいずれも、細胞集団の数もしくはサイズまたは細胞の数の増加を例示するものであると共に、増加の量を示すものであることがさらに理解されよう。
【0052】
一実施形態では、Ｔ細胞マイトジェンとインターロイキン－４様活性を有する増殖因子とを含む培地において、インターロイキン－１５様活性を有する増殖因子の非存在下で試料を培養することを含む方法によって試料からＶδ１＋Ｔ細胞が得られる。
【0053】
一実施形態では、Ｔ細胞マイトジェンとインターロイキン－１５様活性を有する増殖因子とを含む培地において、インターロイキン－４様活性を有する増殖因子の非存在下で試料を培養することを含む方法によって試料からＶδ１＋Ｔ細胞が得られる。
【0054】
一実施形態では、
（１）Ｔ細胞マイトジェンとインターロイキン－４様活性を有する増殖因子とを含む第１の培養培地において、インターロイキン－１５様活性を有する増殖因子の非存在下で試料中の細胞を培養すること、ならびに
（２）Ｔ細胞マイトジェンとインターロイキン－１５様活性を有する増殖因子とを含む第２の培養培地において、インターロイキン－４様活性を有する増殖因子の非存在下で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること、
を含む方法によって試料からＶδ１＋Ｔ細胞が得られる。
（１）Ｔ細胞マイトジェンとインターロイキン－４様活性を有する増殖因子とを含む第１の培養培地において、インターロイキン－１５様活性を有する増殖因子の非存在下で試料中の細胞を培養すること、ならびに
（２）Ｔ細胞マイトジェンとインターロイキン－１５様活性を有する増殖因子とを含む第２の培養培地において、インターロイキン－４様活性を有する増殖因子の非存在下で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること、
を含む方法によって試料からＶδ１＋Ｔ細胞が得られる。
【0055】
「インターロイキン－１５、インターロイキン－２、及びインターロイキン－７の非存在下で」及び「インターロイキン－４の非存在下で」という用語は、培養培地中にこれらのサイトカインが完全に存在しないことを指すだけなく、標的細胞において測定可能な応答または生理学的作用を生じさせることが不可能なほど低いが故に実用目的では不在と見なすことができる濃度レベルでそのようなサイトカインを使用することも含む。さらに、「標的細胞における測定可能な生理学的作用」は、標準的な定義による細胞の生理学的状態の任意の測定可能な変化を指す。例えば、細胞の生理学的状態の変化は、そのようなサイトカインとの接触から数時間後または数日後に、その活性化状態の変化（初期活性化細胞マーカーＣＤ６９の発現レベルの上方制御もしくは下方制御によって認識される）によって検出されるか、またはその分化状態の変化（ＮＫＧ２ＤもしくはＮＣＲの上方制御もしくは下方制御によって認識される）によって検出され得る。測定可能な生理学的作用は、ＣＦＳＥ染色または当該技術分野で知られる他の手法によって測定される細胞の増殖率変化でもあり得る。第１の培養培地において培養される細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５または機能的に類似する増殖因子による機能的に関連する刺激を受けてはならないことが当業者には明らかであろう。さらに、第２の培養培地中の細胞は、ＩＬ－４または機能的に類似する増殖因子による機能的に関連する刺激を受けてはならない。好ましくは、これらのサイトカインは、２ｎｇ／ｍｌを超える最終濃度で細胞培養培地中に存在してはならず、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌを超えてはならず、より好ましくは、０．１ｎｇ／ｍｌを超えてはならず、より好ましくは、存在すべきではない。
【0056】
「インターロイキン－１５様活性を有する増殖因子」という用語は、培養においてγδＴ細胞に対する同様の生理学的作用を促進する能力に関してＩＬ－１５と同じ活性を有する任意の化合物を意味し、限定されないが、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５模倣物、またはＩＬ－２及びＩＬ－７を含む、ＩＬ－１５の任意の機能的均等物を含む。ＩＬ－１５、ＩＬ－２、及びＩＬ－７によって促進される培養γδＴ細胞に対する生理学的作用には、より細胞傷害性の表現型への細胞分化の誘導（ＮＫＧ２ＤならびにＮＣＲ（ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４）の発現レベルの上方制御など）、抗腫瘍細胞傷害機能の増加、ならびに炎症促進性サイトカイン（ＩＦＮ－γなど）の産生増加が含まれる。
【0057】
一実施形態では、インターロイキン－１５様活性を有する増殖因子は、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、またはインターロイキン－７（ＩＬ－７）のいずれかであり、好ましくは、ＩＬ－１５である。
【0058】
本明細書で使用される「ＩＬ－１５」は、天然もしくは組換えのＩＬ－１５、または１つ以上のＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）サブユニットに対するアゴニストとして作用するそのバリアント（例えば、その変異体、変異タンパク質、類似体、サブユニット、受容体複合体、断片、アイソフォーム、及びペプチド模倣物）を指す。ＩＬ－１５は、ＩＬ－２のように、ＩＬ－２依存性細胞株ＣＴＬＬ－２の増殖を支援し得る既知のＴ細胞増殖因子である。
【0059】
ＩＬ－１５は、さまざまな哺乳類種に由来するＩＬ－１５も指し得、こうした哺乳類種には、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、及びマウスが含まれる。本明細書で言及されるＩＬ－１５「変異タンパク質」またはＩＬ－１５「バリアント」は、天然の哺乳類ＩＬ－１５の配列と実質的に相同的であるが、アミノ酸の欠失、挿入、または置換が理由で天然の哺乳類ＩＬ－１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントは保存的に置換された配列を含み得、このことは、所与のアミノ酸残基が同様の生理化学的特徴を有する残基によって置き換えられていることを意味し得る。保存的置換の例としては、１つの脂肪族残基を別の残基へと置換するもの（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａを別の残基へと置換するものなど）、または１つの極性残基を別の残基へと置換するもの（ＬｙｓとＡｒｇとの置換、ＧｌｕとＡｓｐとの置換、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの置換など）が挙げられる。そのような保存的置換は他にもよく知られており、例えば、同様の疎水性特徴を有する領域全体を置換するものである。天然起源のＩＬ－１５バリアントもまた、本発明によって包含される。そのようなバリアントの例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象から生じるタンパク質、またはＩＬ－１５タンパク質がタンパク質分解性に切断されることで生じるタンパク質であり、ＩＬ－１５の結合特性は保持される。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、短縮されているが、生物学的に活性なＩＬ－１５タンパク質を与え得る。タンパク質分解に起因し得るバリエーションには、例えば、異なる型の宿主細胞での発現時にＩＬ－１５タンパク質から１つ以上の末端アミノ酸（一般には、１～１０個のアミノ酸）がタンパク質分解性に除去されることに起因するＮ末端またはＣ末端の差異が含まれる。
【0060】
本明細書で使用される「ＩＬ－２」は、天然もしくは組換えのＩＬ－２、または１つ以上のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）サブユニットに対するアゴニストとして作用するそのバリアント（例えば、その変異体、変異タンパク質、類似体、サブユニット、受容体複合体、断片、アイソフォーム、及びペプチド模倣物）を指す。そのような物質は、ＩＬ－２依存性細胞株ＣＴＬＬ－２（３３；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））ＴＩＢ ２１４）の増殖を支援し得る。
【0061】
ＩＬ－２は、さまざまな哺乳類種に由来するＩＬ－２も指し得、こうした哺乳類種には、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、及びマウスが含まれる。バリアントは保存的に置換された配列を含み得、このことは、所与のアミノ酸残基が同様の生理化学的特徴を有する残基によって置き換えられていることを意味し得る。保存的置換の例としては、１つの脂肪族残基を別の残基へと置換するもの（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａを別の残基へと置換するものなど）、または１つの極性残基を別の残基へと置換するもの（ＬｙｓとＡｒｇとの置換、ＧｌｕとＡｓｐとの置換、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの置換など）が挙げられる。そのような保存的置換は他にもよく知られており、例えば、同様の疎水性特徴を有する領域全体を置換するものである。天然起源のＩＬ－２バリアントもまた、本発明によって包含される。そのようなバリアントの例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象から生じるタンパク質、またはＩＬ－２タンパク質がタンパク質分解性に切断されることで生じるタンパク質であり、ＩＬ－２の結合特性は保持される。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、短縮されているが、生物学的に活性なＩＬ－２タンパク質を与え得る。タンパク質分解に起因し得るバリエーションには、例えば、異なる型の宿主細胞での発現時にＩＬ－２タンパク質から１つ以上の末端アミノ酸（一般には、１～１０個のアミノ酸）がタンパク質分解性に除去されることに起因するＮ末端またはＣ末端の差異が含まれる。
【0062】
本明細書で使用される「ＩＬ－７」は、天然もしくは組換えのＩＬ－７、または１つ以上のＩＬ－７受容体（ＩＬ－７Ｒ）サブユニットに対するアゴニストとして作用するそのバリアント（例えば、その変異体、変異タンパク質、類似体、サブユニット、受容体複合体、断片、アイソフォーム、及びペプチド模倣物）を指す。成熟ヒトＩＬ－７は、１５２個のアミノ酸の配列（追加の２５個のＮ－末端アミノ酸からなるシグナルペプチドが除かれたもの）として生じる。
【0063】
ＩＬ－７は、さまざまな哺乳類種に由来するＩＬ－７も指し得、こうした哺乳類種には、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、及びマウスが含まれる。バリアントは保存的に置換された配列を含み得、このことは、所与のアミノ酸残基が同様の生理化学的特徴を有する残基によって置き換えられていることを意味し得る。保存的置換の例としては、１つの脂肪族残基を別の残基へと置換するもの（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａを別の残基へと置換するものなど）、または１つの極性残基を別の残基へと置換するもの（ＬｙｓとＡｒｇとの置換、ＧｌｕとＡｓｐとの置換、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの置換など）が挙げられる。そのような保存的置換は他にもよく知られており、例えば、同様の疎水性特徴を有する領域全体を置換するものである。天然起源のＩＬ－７バリアントもまた、本発明によって包含される。そのようなバリアントの例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象から生じるタンパク質、またはＩＬ－７タンパク質がタンパク質分解性に切断されることで生じるタンパク質であり、ＩＬ－７の結合特性は保持される。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、短縮されているが、生物学的に活性なＩＬ－７タンパク質を与え得る。タンパク質分解に起因し得るバリエーションには、例えば、異なる型の宿主細胞での発現時にＩＬ－７タンパク質から１つ以上の末端アミノ酸（一般には、１～１０個のアミノ酸）がタンパク質分解性に除去されることに起因するＮ末端またはＣ末端の差異が含まれる。
【0064】
「インターロイキン－４様活性を有する増殖因子」という用語は、培養においてγδＴ細胞に対する同様の生理学的作用を促進する能力に関してＩＬ－４と同じ活性を有する任意の化合物を意味し、限定されないが、ＩＬ－４及びＩＬ－４模倣物、またはＩＬ－４の任意の機能的均等物を含む。ＩＬ－４によって促進されるγδＴ細胞に対する生理学的作用には、ＮＫＧ２Ｄ及びＮＣＲの発現レベルの低減、細胞傷害機能の抑制、ならびに選択的生存の改善が含まれることが示されている。ＩＬ－４は、活性化ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞からの炎症促進性サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αを含む）の分泌を顕著に抑制することも示されている。
【0065】
一実施形態では、インターロイキン－４様活性を有する増殖因子はインターロイキン－４（ＩＬ－４）である。
【0066】
本明細書で使用される「ＩＬ－４」は、天然もしくは組換えのＩＬ－４、または１つ以上のＩＬ－４受容体（ＩＬ－４Ｒ）サブユニットに対するアゴニストとして作用するそのバリアント（例えば、その変異体、変異タンパク質、類似体、サブユニット、受容体複合体、断片、アイソフォーム、及びペプチド模倣物）を指す。そのような物質は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）からＴｈ２細胞への分化を支援し得る。成熟ヒトＩＬ－４は、１２９個のアミノ酸の配列（追加の２４個のＮ－末端アミノ酸からなるシグナルペプチドが除かれたもの）として生じる。
【0067】
ＩＬ－４は、さまざまな哺乳類種に由来するＩＬ－４も指し得、こうした哺乳類種には、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、及びマウスが含まれる。バリアントは保存的に置換された配列を含み得、このことは、所与のアミノ酸残基が同様の生理化学的特徴を有する残基によって置き換えられていることを意味し得る。保存的置換の例としては、１つの脂肪族残基を別の残基へと置換するもの（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａを別の残基へと置換するものなど）、または１つの極性残基を別の残基へと置換するもの（ＬｙｓとＡｒｇとの置換、ＧｌｕとＡｓｐとの置換、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの置換など）が挙げられる。そのような保存的置換は他にもよく知られており、例えば、同様の疎水性特徴を有する領域全体を置換するものである。天然起源のＩＬ－４バリアントもまた、本発明によって包含される。そのようなバリアントの例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象から生じるタンパク質、またはＩＬ－４タンパク質がタンパク質分解性に切断されることで生じるタンパク質であり、ＩＬ－４の結合特性は保持される。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、短縮されているが、生物学的に活性なＩＬ－４タンパク質を与え得る。タンパク質分解に起因し得るバリエーションには、例えば、異なる型の宿主細胞での発現時にＩＬ－４タンパク質から１つ以上の末端アミノ酸（一般には、１～１０個のアミノ酸）がタンパク質分解性に除去されることに起因するＮ末端またはＣ末端の差異が含まれる。
【0068】
一実施形態では、
（１）Ｔ細胞マイトジェン及びインターロイキン－４を含む第１の培養培地において、インターロイキン－１５、インターロイキン－２、及びインターロイキン－７の非存在下で試料中の細胞を培養すること、ならびに
（２）Ｔ細胞マイトジェン及びインターロイキン－１５を含む第２の培養培地において、インターロイキン－４の非存在下で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること、
を含む方法によって試料からＶδ１＋Ｔ細胞が得られる。
（１）Ｔ細胞マイトジェン及びインターロイキン－４を含む第１の培養培地において、インターロイキン－１５、インターロイキン－２、及びインターロイキン－７の非存在下で試料中の細胞を培養すること、ならびに
（２）Ｔ細胞マイトジェン及びインターロイキン－１５を含む第２の培養培地において、インターロイキン－４の非存在下で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること、
を含む方法によって試料からＶδ１＋Ｔ細胞が得られる。
【0069】
試料からＶδ１＋Ｔ細胞を得る方法は、追加の増殖因子を含み得る。したがって、一実施形態では、第１の培養培地もしくは第２の培養培地または両方の培養培地は、１つ以上の追加の増殖因子をさらに含む。当該追加の増殖因子は、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、及びそれらの組み合わせ、から選択され得る。好ましくは、追加の増殖因子はＩＦＮ－γである。これらの増殖因子は、一方または両方の培養培地に添加されることで培養Ｖδ１＋Ｔ細胞の増殖及び純度レベルをさらに増加させる。追加の増殖因子には、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３、ＩＧＦ－１、ヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）、及び間質細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１）が含まれ得る。一実施形態では、そのような因子は、Ｖδ１＋Ｔ細胞の増殖を選択的に促進する増殖において使用される。
【0070】
「Ｔ細胞マイトジェン」という用語は、ＴＣＲシグナル伝達を介してＴ細胞を刺激し得る任意の物質を意味し、こうした物質には、限定されないが、植物レクチン（フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）など）ならびに非植物起源のレクチン、Ｔ細胞を活性化する抗体、ならびに他の非レクチン／非抗体マイトジェンが含まれる。好ましい抗体クローンには、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３クローン及びＵＣＨＴ－１クローンなど）、抗γδ抗体（Ｂ１及びＩＭＭＵ５１０など）、または抗Ｖδ１抗体が含まれる。本発明との関連では、抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２）、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ならびに組換えで生成される結合パートナーを含むものと理解される。一実施形態では、抗体は抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。別の実施形態では、抗体は抗Ｖδ１抗体である。他のマイトジェンには、ホルボール１２－ミリステート－１３－アセテート（ＴＰＡ）及びその関連化合物（メゼレインなど）、または細菌化合物（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）及び連鎖球菌プロテインＡ）が含まれる。Ｔ細胞マイトジェンは、可溶性のものまたは固定化されたものであり得、方法においては複数のＴ細胞マイトジェンが使用され得る。
【0071】
一実施形態では、Ｔ細胞マイトジェンは、抗体またはその断片である。抗体またはその断片は、抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）であり得る。代替的または付加的には、抗体またはその断片は、抗ＴＣＲγδ抗体（ｐａｎ－γδＴＣＲ抗体など）または抗ＴＣＲＶδ１抗体であり得る。
【0072】
本明細書での「培養すること」への言及は、細胞を培地に添加することを含み、当該培地は、そうした細胞及び／または非造血組織試料に必要な及び／または好ましい増殖因子及び／または必須栄養素を含む。培養することは、選択的増殖によるものであり得、こうした選択的増殖は、試料に存在する他の細胞型を上回ってＶδ１＋Ｔ細胞が優先的に増殖する培養条件を選択することによるものなどである。代替的には、増殖条件は非選択的であり、培養することの後に非標的細胞（例えば、Ｖδ１＋Ｔ細胞以外の細胞（αβＴ細胞など））の枯渇が行われ得る。代替的には、増殖条件は非選択的であり、培養することの前に非標的細胞（例えば、Ｖδ１＋Ｔ細胞以外の細胞（αβＴ細胞など））の枯渇が行われる。
【0073】
一実施形態では、培養することは、フィーダー細胞の非存在下で実施される。
【0074】
一実施形態では、培養することは、間質細胞との実質的な接触の非存在下で実施される。別の実施形態では、培養することは、線維芽細胞との実質的な接触の非存在下で実施される。
【0075】
一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、培養することを少なくとも１１日間（培養することを少なくとも１４日間など）行った後に収集される。ある特定の実施形態では、本明細書で定義される方法による培養の期間は、少なくとも１４日である。ある特定の実施形態では、本明細書で定義される方法による培養の期間は、４５日未満（３０日未満（２５日未満など）など）である。別の実施形態では、本明細書で定義される方法による培養の期間は、１４日～３５日（１４日～２１日など）である。さらに別の実施形態では、本明細書で定義される方法による培養の期間は、約２１日である。
【0076】
別の実施形態では、培養することは、Ｖδ１＋Ｔ細胞の増殖集団の生成に有効な量で、ある期間（例えば、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、またはそれより長い期間、例えば、５日～４０日間、７日～３５日間、１４日～２８日間、または約２１日間）実施される。いくつかの実施形態では、培養することは、数時間（例えば、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１５時間、約１８時間、または約２１時間）～約３５日間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、または３５日間）行われる。一実施形態では、培養することは、１４日～２１日間行われる。
【0077】
２つの培養培地が使用される場合、各培地において培養することの期間の長さは異なり得ることが理解されよう。例えば、細胞は、第１の培養培地において約２日～約２１日間、より好ましくは、約３日～約１４日間、より好ましくは、約４日～８日間培養され得る。細胞は、第２の培養培地において約２日～約３０日間、より好ましくは、約５日～約２１日間、より好ましくは、約１０日～１５日間培養され得る。
【0078】
一実施形態では、培養することは、気体透過性材料を含む容器において実施される。そのような材料は、気体（酸素、二酸化炭素、及び／または窒素など）を透過させることで容器の内容物と周囲の外気との間の気体交換を可能にする。本明細書での「容器」への言及は培養皿、培養プレート、シングルウェルディッシュ、マルチウェルディッシュ、マルチウェルプレート、フラスコ、多層フラスコ、ボトル（ローラーボトルなど）、バイオリアクター、バッグ、管、及び同様のものを含むことが理解されよう。非接着細胞及び他のリンパ球の増殖を伴う方法において使用するためのそのような容器は当該技術分野で知られている。気体透過性材料を含む容器は、単離されるＶδ１＋Ｔ細胞の収量を増加させることが明らかとなっている。そのような容器は、線維芽細胞及び他の間質細胞（例えば、上皮細胞）（接着細胞型を含む）を上回ってＶδ１＋Ｔ細胞及び他のリンパ球を優先的に支援することも明らかになった。別の実施形態では、気体透過性材料を含む容器において実施される培養物には、線維芽細胞及び／または他の間質細胞（例えば、上皮細胞）は存在しない。
【0079】
気体透過性材料を含むそのような容器は、非多孔性の気体透過性材料をさらに含み得る。したがって、一実施形態では、気体透過性材料は非多孔性である。いくつかの実施形態では、気体透過性材料は、膜フィルム（シリコーン、フルオロエチレンポリプロピレン、ポリオレフィン、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなど）である。さらに、そのような容器は、その一部のみに気体透過性材料、気体透過性膜フィルム、または非多孔性気体透過性材料を含み得る。したがって、さらに別の実施形態によれば、容器は、上部、下部、及び少なくとも１つの側壁を含み、当該容器下部の少なくとも一部は、当該上部が当該下部の上にくる場合に実質的に水平な面になる気体透過性材料を含む。一実施形態では、容器は、上部、下部、及び少なくとも１つの側壁を含み、当該下部の少なくとも一部は、当該上部が当該下部の上にくる場合に水平面となる気体透過性材料を含む。別の実施形態では、容器は、上部、下部、及び少なくとも１つの側壁を含み、当該少なくとも１つの側壁は、当該上部が当該下部の上にくる場合に垂直面となり得る気体透過性材料、または当該上部が当該下部の上にこない場合に水平面となり得る気体透過性材料を含む。そのような実施形態では、当該下部または当該側壁の一部のみが気体透過性材料が含み得ることが理解されよう。代替的には、当該下部の全体または当該側壁の全体が気体透過性材料を含み得る。さらに別の実施形態では、気体透過性材料を含む当該容器の当該上部は、例えばＯリングを利用することによって、密封され得る。そのような実施形態は、容器内容物の漏出阻止または蒸発低減を行うものであることが理解されよう。したがって、ある特定の実施形態では、容器は、気体透過性材料を含むことで気体交換を可能にする液体密封入れ物を含む。代替の実施形態では、気体透過性材料を含む当該容器の当該上部は水平面であり、当該下部の上に位置し、密封されない。したがって、ある特定の実施形態では、当該上部は、容器の上部からの気体交換が可能になるように構成される。別の実施形態では、気体透過性入れ物の当該下部は、当該容器の下部からの気体交換が可能になるように構成される。さらに別の実施形態では、気体透過性材料を含む当該容器は液体密封入れ物であり得、注入ポート及び排出ポートまたは注入管及び排出管をさらに含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、気体透過性材料を含む容器は、上部、下部、及び任意選択で少なくとも１つの側壁を含み、当該上部及び当該下部の少なくとも一部は気体透過性材料を含み、少なくとも１つの側壁が存在する場合はその少なくとも一部が気体透過性材料を含む。容器の例はＷＯ２００５／０３５７２８及びＵＳ９２５５２４３に記載されており、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。こうした容器は商業的にも利用可能であり、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇによって供給されるＧ－ＲＥＸ（登録商標）細胞培養デバイス（Ｇ－ＲＥＸ６ウェル－プレート、Ｇ－ＲＥＸ２４ウェル－プレート、及びＧ－ＲＥＸ１０容器など）などである。
【0080】
ある特定の実施形態では、試料は、実質的に血清を含まない培地（例えば、無血清培地または血清代替物（ＳＲ）を含む培地）において培養される。したがって、一実施形態では、試料は、無血清培地において培養される。そのような無血清培地には血清代替物培地も含まれ得、血清代替物は、ヒトまたは動物に由来する血清の使用を回避するために化学的に規定された成分に基づくものである。代替の実施形態では、試料は、血清（例えば、ヒトＡＢ血清またはウシ胎仔血清（ＦＢＳ））を含む培地において培養される。一実施形態では、試料は、血清代替物を含む培地において培養される。一実施形態では、試料は、動物由来の産物を含まない培地において培養される。
【0081】
無血清培地において試料が培養される実施形態は、血清のろ過、沈降処理、混入、及び供給に伴う問題が回避されるという利点を有することが理解されよう。さらに、動物由来の産物は、ヒト用治療薬の臨床グレード製造での使用には好ましくない。
【0082】
γδＴ細胞の増殖における使用に適した基本培養培地は多くのものが利用可能であり、具体的には、ＡＩＭ－Ｖ、イスコフ培地、及びＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などである。培地には、本明細書で定義される他の培地因子（血清、血清タンパク質、及び選択薬剤（抗生物質など）など）も添加され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＰＭＩ－１６４０培地は、２ｍＭのグルタミン、１０％のＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、非必須アミノ酸（例えば、１００μＭのＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、及びＳｅｒ；１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ならびに１０μｌ／Ｌのβ－メルカプトエタノールを含む。代替の実施形態では、ＡＩＭ－Ｖ培地にはＣＴＳ免疫血清代替物及びアムホテリシンＢが添加され得る。好都合には、細胞は、単離及び／または増殖の間、適切な培養培地において、ＣＯ２を５％含む加湿雰囲気の下、３７℃で培養される。
【0083】
培養培地に添加され得る他の成分の例としては、限定されないが、血漿または血清、精製タンパク質（アルブミンなど）、脂質源（低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）など）、ビタミン、アミノ酸、ステロイド、ならびに細胞の増殖及び／または生存を支援または促進する任意の他の添加物が挙げられる。
【0084】
記載の方法に従って得られるＶδ１＋Ｔ細胞は、当該技術分野で知られる手法を使用して、最終培養物に存在し得る他の細胞から分離され得る。こうした手法には、蛍光活性化細胞選別、免疫磁気分離法、親和性カラムクロマトグラフィー、密度勾配遠心分離法、及び細胞パニングが含まれる。
【0085】
得られるＶδ１＋Ｔ細胞は、本明細書に記載の治療用途、実験用途、もしくは商業用途に迅速に使用され得るか、または当該細胞は、後日に使用するために凍結保存され得る。
【0086】
治療方法
本発明の別の態様によれば、骨髄性悪性病変を治療する方法が提供され、この方法は、Ｖδ１＋Ｔ細胞を含む同種異系組成物を治療的に有効な量で当該骨髄性悪性病変を有する患者に投与することを含む。
本発明の別の態様によれば、骨髄性悪性病変を治療する方法が提供され、この方法は、Ｖδ１＋Ｔ細胞を含む同種異系組成物を治療的に有効な量で当該骨髄性悪性病変を有する患者に投与することを含む。
【0087】
本明細書で使用される「治療的に有効な量」という用語は、所望の結果の達成に必要な用量及び期間で、所望の結果の達成に有効な量を意味する。
【0088】
本明細書に前述されるように、骨髄性悪性病変は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から選択され得る。本発明は、微小残存病変に陽性（ＭＲＤ＋）である患者に特に有用である。
【0089】
一実施形態では、方法は、化学療法を施すことをさらに含む。
【0090】
一実施形態では、患者は、同種異系組成物の投与の少なくとも３日前に化学療法で治療される。化学療法は、例えば、フルダラビン及びシクロホスファミドから選択され得る。
【0091】
一実施形態では、患者の体重ｋｇ当たりで計算されたＶδ１＋Ｔ細胞の用量が患者に投与される。いくつかの実施形態では、治療的に有効な量は、約１×１０５個細胞／ｋｇ、約５×１０５個細胞／ｋｇ、約１×１０６個細胞／ｋｇ、約１．５×１０６個細胞／ｋｇ、約２×１０６個細胞／ｋｇ、約３×１０６個細胞／ｋｇ、約５×１０６個細胞／ｋｇ、約１×１０７個細胞／ｋｇ、約１．５×１０７個細胞／ｋｇ、約２×１０７個細胞／ｋｇ、約３×１０７個細胞／ｋｇ、約５×１０７個細胞／ｋｇ、約１×１０８個細胞／ｋｇ、約２×１０８個細胞／ｋｇ、または約５×１０８個細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、治療的に有効な量は、約１×１０６個細胞／ｋｇ、約１．５×１０６個細胞／ｋｇ、約２×１０６個細胞／ｋｇ、約３×１０６個細胞／ｋｇ、約５×１０６個細胞／ｋｇ、約１×１０７個細胞／ｋｇ、約１．５×１０７個細胞／ｋｇ、約２×１０７個細胞／ｋｇ、約３×１０７個細胞／ｋｇ、約５×１０７個細胞／ｋｇ、約１×１０８個細胞／ｋｇ、約２×１０８個細胞／ｋｇ、または約５×１０８個細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、治療的に有効な量は、最大で約１×１０６個細胞／ｋｇ、約１．５×１０６個細胞／ｋｇ、約２×１０６個細胞／ｋｇ、約３×１０６個細胞／ｋｇ、約５×１０６個細胞／ｋｇ、約１×１０７個細胞／ｋｇ、約１．５×１０７個細胞／ｋｇ、約２×１０７個細胞／ｋｇ、約３×１０７個細胞／ｋｇ、約５×１０７個細胞／ｋｇ、約１×１０８個細胞／ｋｇ、約２×１０８個細胞／ｋｇ、または約５×１０８個細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、治療的に有効な量は、約１×１０６～１×１０８個細胞／ｋｇを含む。一実施形態では、治療的に有効な量は、約１×１０８個未満細胞／ｋｇを含む。
【0092】
いくつかの実施形態では、治療的に有効な量は、約１×１０１０個未満の全生細胞（約１×１０９個未満の全生細胞または約１×１０８個未満の全生細胞など）を含む。いくつかの実施形態では、治療的に有効な量は、約８×１０９個、約４×１０９個、約２．４×１０９個、約１．２×１０９個、約８×１０８個、約４×１０８個、約８×１０７個、または約４×１０７個の全生細胞を含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、治療的に有効な量は、約５×１０４個未満αβＴ細胞／ｋｇを含む。別の実施形態では、治療的に有効な量は、約１×１０４個未満αβＴ細胞／ｋｇを含む。
【0094】
一実施形態では、Ｖδ１＋Ｔ細胞（例えば、対象の体重ｋｇ当たり１０６～１０８個のＶδ１＋Ｔ細胞、例えば、対象の体重ｋｇ当たり１０６～１０７個のＶδ１＋Ｔ細胞）が対象に初回投与され、Ｖδ１＋Ｔ細胞が１回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）後続投与される。一実施形態では、１回以上の後続投与は、前回投与から１５日（例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、または２日）が経過する前に（例えば、前回投与から４日、３日、または２日が経過する前に）実施される。
【0095】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤が対象に投与され得る。追加の治療剤は、免疫治療剤、細胞傷害剤、増殖抑制剤、放射線治療剤、抗血管新生剤、またはそれらの２つ以上の薬剤の組み合わせ、からなる群から選択され得る。追加の治療剤は、増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞の投与と同時、投与前、または投与後に投与され得る。追加の治療剤は免疫治療剤であり得、当該免疫治療剤は、対象の体内の標的（例えば、対象自身の免疫系）及び／または移入Ｖδ１＋Ｔ細胞に作用し得る。
【0096】
組成物の投与は、任意の好都合な様式で実施され得る。患者への本明細書に記載の組成物の投与は、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射によって、または腹腔内に行うことができ、例えば、皮内注射または皮下注射によって行われる。具体的には、組成物は、静脈内注入物として投与される。
【0097】
本明細書に記載の実施形態はすべて、本発明のすべての態様に適用され得ることが理解されよう。
【0098】
ここでは、上述の図を参照して、本発明のある特定の態様及び実施形態が例として示されることになる。
【実施例】
【0099】
材料及び方法
倫理に関する記述
初代急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞は、インフォームドコンセント及び施設内倫理委員会の承認の後に、病変が初回である患者の末梢血から得た。試験はヘルシンキ宣言に従って実施した。
倫理に関する記述
初代急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞は、インフォームドコンセント及び施設内倫理委員会の承認の後に、病変が初回である患者の末梢血から得た。試験はヘルシンキ宣言に従って実施した。
【0100】
マウス
ＮＯＤ ＳＣＩＤγｃ －／－（ＮＳＧ）マウス、ＮＯＤ ＳＣＩＤγｃ －／－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウス、及びＮＯＤ Ｒａｇ１－／－γｃ －／－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。週齢及び性別を一致させたマウスを、異なる群に無作為に割り付けた。（骨髄内モデルにおいて）週に１回の採血によって疾患発症を追跡した。後足の運動性低下が最初に示された時点で疾患エンドポイントとする。動物手順はすべて、Ｄｉｒｅｃａｏ Ｇｅｒａｌ ｄｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａの基本指針に従って実施し、Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｏａｏ Ｌｏｂｏ Ａｎｔｕｎｅｓ（Ｌｉｓｂｏａ，Ｐｏｒｔｕｇａｌ）によって承認されたものである。
ＮＯＤ ＳＣＩＤγｃ －／－（ＮＳＧ）マウス、ＮＯＤ ＳＣＩＤγｃ －／－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウス、及びＮＯＤ Ｒａｇ１－／－γｃ －／－ＳＧＭ３（ＮＲＧＳ）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。週齢及び性別を一致させたマウスを、異なる群に無作為に割り付けた。（骨髄内モデルにおいて）週に１回の採血によって疾患発症を追跡した。後足の運動性低下が最初に示された時点で疾患エンドポイントとする。動物手順はすべて、Ｄｉｒｅｃａｏ Ｇｅｒａｌ ｄｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａの基本指針に従って実施し、Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｏａｏ Ｌｏｂｏ Ａｎｔｕｎｅｓ（Ｌｉｓｂｏａ，Ｐｏｒｔｕｇａｌ）によって承認されたものである。
【0101】
γδＴ細胞組成物及びＴＣＲレパートリー分析
γδＴ細胞組成物は、ＷＯ２０１６／１９８４８０に記載の方法を使用して生成させた。具体的には、「デルタ１Ｔ（Ｄｅｌｔａ Ｏｎｅ Ｔ）」（ＤＯＴ）細胞プロトコールは、Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２：５７９５－８０４に記載の研究スケールバージョンの増殖プロトコールを指し、「ＧＤＸ０１２」は、使用容器（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ容器）を大きくしてスケールを大きくしたバージョンの増殖プロトコールを指す。簡潔に記載すると、５％の自己血漿及び２ｍｍｏｌ／ＬのＬ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加された無血清培養培地（ＯｐＴｍｉｚｅｒ－ＣＴＳ）にＭＡＣＳ選別γδＴ細胞を再浮遊させた。動物産物を含まないヒトサイトカイン（組換えＩＬ－４［ｒＩＬ４］（１００ｎｇ／ｍＬ）、組換えインターフェロン－γ［ｒＩＦＮγ］（７０ｎｇ／ｍＬ）、組換えＩＬ－２１［ｒＩＬ２１］（７ｎｇ／ｍＬ）、及び組換えＩＬ－１β［ｒＩＬ１β］（１５ｎｇ／ｍＬ））ならびに可溶性の抗ＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＯＫＴ－３、７０ｎｇ／ｍＬ）を培地に添加した。５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で細胞をインキュベートし、組換えＩＬ－１５［ｒＩＬ１５］（７０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（３０ｎｇ／ｍＬ）、及び抗ＣＤ３（１ｍｇ／ｍＬ）を含む新鮮な培地を一定間隔で細胞に供給した。細胞は、任意選択で、増殖後に凍結し、使用前に解凍する。
γδＴ細胞組成物は、ＷＯ２０１６／１９８４８０に記載の方法を使用して生成させた。具体的には、「デルタ１Ｔ（Ｄｅｌｔａ Ｏｎｅ Ｔ）」（ＤＯＴ）細胞プロトコールは、Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２：５７９５－８０４に記載の研究スケールバージョンの増殖プロトコールを指し、「ＧＤＸ０１２」は、使用容器（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ容器）を大きくしてスケールを大きくしたバージョンの増殖プロトコールを指す。簡潔に記載すると、５％の自己血漿及び２ｍｍｏｌ／ＬのＬ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加された無血清培養培地（ＯｐＴｍｉｚｅｒ－ＣＴＳ）にＭＡＣＳ選別γδＴ細胞を再浮遊させた。動物産物を含まないヒトサイトカイン（組換えＩＬ－４［ｒＩＬ４］（１００ｎｇ／ｍＬ）、組換えインターフェロン－γ［ｒＩＦＮγ］（７０ｎｇ／ｍＬ）、組換えＩＬ－２１［ｒＩＬ２１］（７ｎｇ／ｍＬ）、及び組換えＩＬ－１β［ｒＩＬ１β］（１５ｎｇ／ｍＬ））ならびに可溶性の抗ＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＯＫＴ－３、７０ｎｇ／ｍＬ）を培地に添加した。５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で細胞をインキュベートし、組換えＩＬ－１５［ｒＩＬ１５］（７０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（３０ｎｇ／ｍＬ）、及び抗ＣＤ３（１ｍｇ／ｍＬ）を含む新鮮な培地を一定間隔で細胞に供給した。細胞は、任意選択で、増殖後に凍結し、使用前に解凍する。
【0102】
ＴＲＧＶ及びＴＲＤＶレパートリー分析については、最初の血液試料（エクスビボ）、または上記のように生成させた最終的なＤＯＴ細胞産物、のいずれかからＦＡＣＳによってＶδ１＋Ｔ細胞を選別した。次世代シークエンシングについては、以前の説明のように実施した（Ｖｅｒｓｔｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：ｅａａｈ４２３２、Ｒａｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３９３－４０１、Ｄｉ Ｌｏｒｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉ Ｄａｔａ ６：１１５）。ＤＯＴ細胞クローンの生成については、ＦＡＣＳによって選別したＣＤ３＋ＴＣＲＶδ１＋ＴＣＲＶδ２－単一細胞を９６ウェル／プレートに移し、１０４個の照射処理した自己末梢血単核細胞（フィーダー）（１週間に１回交換した）の存在下で上記のＤＯＴ細胞プロトコールを使用して２１日間培養した。
【0103】
インビトロ及びインビボでのＡＭＬ細胞の標的化
Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ）によって認証されたＡＭＬ細胞株（ＴＨＰ－１、ＨＥＬ、ＡＭＬ－１９３、ＭＶ４－１１、ＨＬ－６０、Ｕ－９３７、ＯＣＩ－ＡＭＬ３、Ｋａｓｕｍｉ－１、及びＫＧ－１）をＤＳＭＺから入手し、継代数ｐ３～ｐ８の時点で使用した。レンチウイルスによるＡＭＬ細胞へのバーコード付加については、以前に詳述されたように実施及び分析した（Ｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ４９６：２２９－２３２）。インビトロでの標的化については、ＡＭＬ細胞株または初代試料をＤＯＴ細胞と共に３時間共インキュベートし、以前に詳述されたようにアネキシンＶで染色した（Ｎｏｂｒｅｇａ－Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７８：７３１－７４１）。インビボでの標的化については、図６Ａ～Ｃに表されるように３つの異種移植ｈＡＭＬモデルを確立した。患者由来の異種移植（脛骨内注射）については以前に記載されている（１２）。腫瘍量の評価は、抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０）及び抗ヒトＣＤ３３（Ｐ６７．６）を用いて染色することによって行った。フローサイトメトリーによるデータの取得はＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、ＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いてデータを解析した。
Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ）によって認証されたＡＭＬ細胞株（ＴＨＰ－１、ＨＥＬ、ＡＭＬ－１９３、ＭＶ４－１１、ＨＬ－６０、Ｕ－９３７、ＯＣＩ－ＡＭＬ３、Ｋａｓｕｍｉ－１、及びＫＧ－１）をＤＳＭＺから入手し、継代数ｐ３～ｐ８の時点で使用した。レンチウイルスによるＡＭＬ細胞へのバーコード付加については、以前に詳述されたように実施及び分析した（Ｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ４９６：２２９－２３２）。インビトロでの標的化については、ＡＭＬ細胞株または初代試料をＤＯＴ細胞と共に３時間共インキュベートし、以前に詳述されたようにアネキシンＶで染色した（Ｎｏｂｒｅｇａ－Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７８：７３１－７４１）。インビボでの標的化については、図６Ａ～Ｃに表されるように３つの異種移植ｈＡＭＬモデルを確立した。患者由来の異種移植（脛骨内注射）については以前に記載されている（１２）。腫瘍量の評価は、抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０）及び抗ヒトＣＤ３３（Ｐ６７．６）を用いて染色することによって行った。フローサイトメトリーによるデータの取得はＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、ＦｌｏｗＪｏ Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いてデータを解析した。
【0104】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。データはすべて平均値±ＳＥＭとして表した。２群の比較はスチューデントｔ検定によって実施し、３群以上の比較は、ＡＮＯＶＡ検定をＤｕｎｎｅｔ事後検定と組み合わせることによって実施した。動物の生存比較は、ログ・ランク（コックス・マンテル）検定を使用して実施した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。データはすべて平均値±ＳＥＭとして表した。２群の比較はスチューデントｔ検定によって実施し、３群以上の比較は、ＡＮＯＶＡ検定をＤｕｎｎｅｔ事後検定と組み合わせることによって実施した。動物の生存比較は、ログ・ランク（コックス・マンテル）検定を使用して実施した。
【0105】
実施例１：γδＴ細胞組成物は、エクスビボＶδ１＋Ｔ細胞よりも高いクローン多様性を示す。
材料及び方法セクションに記載のＤＯＴ細胞プロトコールを用いたαβ枯渇末梢血単核細胞の増殖に際してγδＴ細胞産物を最初に特徴付けた。成人末梢血Ｖδ１＋Ｔ細胞レパートリーのクローン性の増殖及び多様性低下が一般的な病原体（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）など）によって導かれる可能性があるとする報告が存在することから、ＴＣＲレパートリーに対する増殖の影響を分析した。細胞を三週間培養する前及び後に、ＴＲＧＶ遺伝子及びＴＲＤＶ遺伝子のＣＤＲ３領域の次世代シークエンシングを実施した。すべての分析ドナーから得た新鮮な非増殖エクスビボＶδ１Ｔ細胞とは対照的に、増殖Ｖδ１＋細胞は高度に多クローン性であり、ドミナントクローンを欠いていることが明らかとなった（図１Ａ～Ｄ）。
材料及び方法セクションに記載のＤＯＴ細胞プロトコールを用いたαβ枯渇末梢血単核細胞の増殖に際してγδＴ細胞産物を最初に特徴付けた。成人末梢血Ｖδ１＋Ｔ細胞レパートリーのクローン性の増殖及び多様性低下が一般的な病原体（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）など）によって導かれる可能性があるとする報告が存在することから、ＴＣＲレパートリーに対する増殖の影響を分析した。細胞を三週間培養する前及び後に、ＴＲＧＶ遺伝子及びＴＲＤＶ遺伝子のＣＤＲ３領域の次世代シークエンシングを実施した。すべての分析ドナーから得た新鮮な非増殖エクスビボＶδ１Ｔ細胞とは対照的に、増殖Ｖδ１＋細胞は高度に多クローン性であり、ドミナントクローンを欠いていることが明らかとなった（図１Ａ～Ｄ）。
【0106】
このことは、全Ｖδ１ＴＣＲレパートリーに対する上位２０の増殖クローンの寄与によって示された。これら２０のクローンは末梢血では６０％超を占めていたが、Ｖδ１＋Ｔ細胞産物でのその構成率は１０％未満であった。さらに、非増殖エクスビボ細胞で同定されたクローン型と増殖Ｖδ１＋細胞で同定されたクローン型との間で共有されているクローン型は、（特にＴＲＤＶについては）ほとんど存在しなかった（表１）。
【0107】
【表1】
【0108】
増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞レパートリーの多様化の基礎を調べた。増殖前／分化Ｖδ１＋Ｔ細胞にはＣＤ２７の下方制御が事前に関与することを考慮し、事前に選別したＣＤ２７－サブセット及びＣＤ２７＋サブセットから生成させた増殖細胞のＴＣＲクローン性を比較したところ、Ｖδ１＋Ｔ細胞増殖プロトコールの下で示される増殖能力が異なることが示された。増殖後の多様なＶδ１＋Ｔ細胞の生成はＣＤ２７＋前駆細胞に限られることが明らかとなった。さらに、Ｖδ１＋Ｔ細胞集団（バルクＶδ１Ｔ細胞から生成させたもの）は、その大半がＣＤ２７＋細胞から構成されることが示された。事前に選別したＣＤ２７＋細胞を起源とするＶδ１＋Ｔ細胞産物はＮＫｐ３０を発現し、ＫＧ－１ ＡＭＬ細胞に対して高度に細胞傷害性であった（図２Ａ～Ｂ）。
【0109】
実施例２：ＡＭＬ細胞に対するγδＴ細胞組成物の反応性
Ｖδ１＋Ｔ細胞の多クローン性の機能的関連性を評価するために、単一細胞選別Ｖδ１＋Ｔ細胞からクローンを生成させ、フィーダー細胞を添加することを含む適合ＤＯＴ細胞増殖プロトコールを使用して増殖／分化させた。ＡＭＬ細胞株ＫＧ－１に対するこうした細胞の細胞傷害性を試験した（図３Ａ）。ほとんどのクローン（異なるドナーに由来するもの）がインビトロでの短時間（３時間）の共インキュベート時にＫＧ－１細胞のアポトーシスを効率的に誘導することが明らかとなった（図３Ａ）。こうした結果は、増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞集団が、ＡＭＬ細胞を標的とする固有能力を有する複数のクローンから構成されるものであることを示す。この反応性にＴＣＲが関与するかどうかを機能的に試験するために、Ｖδ１ＴＣＲを特異的に遮断するｍＡｂ（またはアイソタイプ対照）の存在下で死滅アッセイを実施したところ、異なるドナーに由来するいくつかのクローンにわたってＫＧ－１細胞の標的化が軽度に低下することのみが観察された（図３Ｂ）。
Ｖδ１＋Ｔ細胞の多クローン性の機能的関連性を評価するために、単一細胞選別Ｖδ１＋Ｔ細胞からクローンを生成させ、フィーダー細胞を添加することを含む適合ＤＯＴ細胞増殖プロトコールを使用して増殖／分化させた。ＡＭＬ細胞株ＫＧ－１に対するこうした細胞の細胞傷害性を試験した（図３Ａ）。ほとんどのクローン（異なるドナーに由来するもの）がインビトロでの短時間（３時間）の共インキュベート時にＫＧ－１細胞のアポトーシスを効率的に誘導することが明らかとなった（図３Ａ）。こうした結果は、増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞集団が、ＡＭＬ細胞を標的とする固有能力を有する複数のクローンから構成されるものであることを示す。この反応性にＴＣＲが関与するかどうかを機能的に試験するために、Ｖδ１ＴＣＲを特異的に遮断するｍＡｂ（またはアイソタイプ対照）の存在下で死滅アッセイを実施したところ、異なるドナーに由来するいくつかのクローンにわたってＫＧ－１細胞の標的化が軽度に低下することのみが観察された（図３Ｂ）。
【0110】
抗ＡＭＬ活性をさらに評価するために、複数のドナーに由来するバルクＤＯＴ細胞産物を、さまざまな他のＡＭＬ細胞株ならびに診断時の患者から得た初代試料に対して試験した。すべての場合において、増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞集団はインビトロでＡＭＬ細胞を直ちに（３時間以内）に死滅させた（図４Ａ～Ｂ）。この様式は、ＣＡＲ－Ｔ細胞について報告されたもの（Ｍａｒｄｉｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２２：３１３８－３１４８、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ １２３：２３４３－２３５４、Ｐｅｔｒｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３２：１３１７－１３２６）と同様であり、増殖させていない新鮮なエクスビボＶδ１Ｔ細胞とは異なるものであった（図４Ｄ）。細胞傷害性は、腫瘍細胞認識時のパーフォリン及びグランザイムＢの脱顆粒及び発現の増加と関連していた（図４Ｅ～Ｆ）。増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞は、ＣＤ３３＋及びＣＤ１２３＋骨髄性前駆細胞を含めて、健康なボランティアの末梢血に由来するいずれの正常白血球集団（骨髄性またはリンパ性）も標的とすることはなかった（図４Ｃ）。こうした正常白血球集団がそれぞれのＣＡＲ－Ｔ細胞によるオンターゲット枯渇を受けることは、望ましくないの骨髄破壊の原因となることが知られている。
【0111】
他の血液腫瘍細胞株に対しても同種異系γδＴ細胞組成物を試験した。
【0112】
バフィーコートからのＰＢＭＣの生成
血液を１部、ＰＢＳを３部としてバフィーコートを希釈し、Ｌｅｕｃｏｓｅｐ管（管当たり２０ｍｌのバフィーコート－ＰＢＳ混合物）に重層した。遠心分離ブレーキを１に設定して２０００ｒｐｍ（約８００ｇ）、室温でＬｅｕｃｏｓｅｐ管を２０分間遠沈した。界面を収集し、１つの管に統合し、ＰＢＳでさらに１回洗浄した後、下流アッセイに使用した。
血液を１部、ＰＢＳを３部としてバフィーコートを希釈し、Ｌｅｕｃｏｓｅｐ管（管当たり２０ｍｌのバフィーコート－ＰＢＳ混合物）に重層した。遠心分離ブレーキを１に設定して２０００ｒｐｍ（約８００ｇ）、室温でＬｅｕｃｏｓｅｐ管を２０分間遠沈した。界面を収集し、１つの管に統合し、ＰＢＳでさらに１回洗浄した後、下流アッセイに使用した。
【0113】
下記の腫瘍株及び健康な株（「標的」）に対するフローサイトメトリー細胞傷害性アッセイにおいて、２人のドナーに由来するＧＤＸ０１２細胞（「エフェクター」）を分析した。
－ＮＡＬＭ－６
－Ｒａｊｉ
－ＭＶ４－１１
－Ｋａｓｕｍｉ
－ＨＬ－６０
－健康な同種異系末梢血単核細胞
－ＮＡＬＭ－６
－Ｒａｊｉ
－ＭＶ４－１１
－Ｋａｓｕｍｉ
－ＨＬ－６０
－健康な同種異系末梢血単核細胞
【0114】
標的細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）を用いて室温で２０分間染色した。２０分後、少なくとも１０％の血清を含む培地で細胞を洗浄し、サイトカインを含まない標的細胞培地（ＲＰＭＩ）に再浮遊させた。その後、標的細胞をエフェクター細胞と共に、１０：１、５：１、２：１、及び１：１（エフェクター：標的）の比で３７℃、２連または３連で２０時間共培養した。このアッセイはサイトカインの非存在下で実施した。
【0115】
２０時間後、ＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄを培養培地に添加することによって死細胞を室温で１０分間染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０で直ちに分析した。下記の式を使用して溶解パーセントを算出した。
【0116】
【数1】
【0117】
全体として、腫瘍株はすべて、Ｖδ１＋Ｔ細胞介在性の標的化に感受性であった。Ｅ：Ｔ比を高めると細胞傷害性のレベルが上昇した。逆に、健康なＰＢＭＣは、Ｅ：Ｔ比とは無関係に完全に温存された。したがって、増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞は幅広い範囲の血液腫瘍標的を標的とする能力を有する一方で、健康な同種異系細胞は温存する。結果は図５に示される。
【0118】
実施例３：γδＴ細胞組成物によるインビボでのＡＭＬの標的化のための異種移植モデル
インビボでＡＭＬに対してＤＯＴ増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を試験するために、ＡＭＬのさまざまな独立した異種移植モデルを確立した（図６Ａ～Ｃ）。ＡＭＬ細胞株モデル（図６Ｃ～Ｅ）及び２人の患者由来の異種移植（図６Ｆ～Ｉ）の両方において、ＤＯＴ増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を投与すると、顕著な毒性を伴うことなく腫瘍量が減少し、宿主生存率が上昇した。ＣＡＲ－Ｔ細胞はＡＭＬ異種移植においてより大きな生存効果を与えることが報告されているが（Ｍａｒｄｉｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｐｅｔｒｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１８））、こうしたモデルは、標的抗原を一様に発現するＡＭＬ細胞株に偏ったものであった。その一方で、患者において骨髄破壊を誘導することが予測される方針の毒性を、異種移植を使用して評価することは不可能である。このデータは、ＶＤ１＋濃縮γδＴ細胞組成物の安全性プロファイル及び効力プロファイルが組み合わさることで、この組成物がＡＭＬの養子細胞療法の候補となることを裏付けるものである。
インビボでＡＭＬに対してＤＯＴ増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を試験するために、ＡＭＬのさまざまな独立した異種移植モデルを確立した（図６Ａ～Ｃ）。ＡＭＬ細胞株モデル（図６Ｃ～Ｅ）及び２人の患者由来の異種移植（図６Ｆ～Ｉ）の両方において、ＤＯＴ増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を投与すると、顕著な毒性を伴うことなく腫瘍量が減少し、宿主生存率が上昇した。ＣＡＲ－Ｔ細胞はＡＭＬ異種移植においてより大きな生存効果を与えることが報告されているが（Ｍａｒｄｉｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、Ｐｅｔｒｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１８））、こうしたモデルは、標的抗原を一様に発現するＡＭＬ細胞株に偏ったものであった。その一方で、患者において骨髄破壊を誘導することが予測される方針の毒性を、異種移植を使用して評価することは不可能である。このデータは、ＶＤ１＋濃縮γδＴ細胞組成物の安全性プロファイル及び効力プロファイルが組み合わさることで、この組成物がＡＭＬの養子細胞療法の候補となることを裏付けるものである。
【0119】
実施例４：γδＴ細胞組成物は、化学療法抵抗性ＡＭＬを標的とする。
化学療法抵抗性は、ＡＭＬ治療の状況では致命的な再発を誘導することから、ＤＯＴ増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を、化学療法抵抗性ＡＭＬ細胞の標的化について評価した。この目的については、シタラビン＋ドキソルビシンでＡＭＬ細胞を７２時間処理し、これによって９９％超の腫瘍細胞を除去し、その後に生存細胞を再増殖させた後、化学療法またはＶδ１＋Ｔ細胞を用いて培養物を処理した。化学療法の細胞傷害性効力は減少したが、Ｖδ１＋Ｔ細胞の標的化効力は影響を受けなかった（図７Ａ）。このことは、Ｖδ１＋Ｔ細胞が化学療法抵抗性ＡＭＬ細胞を標的とする能力に優れていることを実証するものである。
化学療法抵抗性は、ＡＭＬ治療の状況では致命的な再発を誘導することから、ＤＯＴ増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を、化学療法抵抗性ＡＭＬ細胞の標的化について評価した。この目的については、シタラビン＋ドキソルビシンでＡＭＬ細胞を７２時間処理し、これによって９９％超の腫瘍細胞を除去し、その後に生存細胞を再増殖させた後、化学療法またはＶδ１＋Ｔ細胞を用いて培養物を処理した。化学療法の細胞傷害性効力は減少したが、Ｖδ１＋Ｔ細胞の標的化効力は影響を受けなかった（図７Ａ）。このことは、Ｖδ１＋Ｔ細胞が化学療法抵抗性ＡＭＬ細胞を標的とする能力に優れていることを実証するものである。
【0120】
この観点に加えて、Ｖδ１＋Ｔ細胞レパートリーが多クローン性かつ多反応性であること（図１に示される）を考慮して、本発明者らは、７２時間で９９％超の腫瘍細胞が除去された最初のＶδ１＋Ｔ細胞処理（図７Ｂ）の後にＶδ１＋Ｔ細胞がＡＭＬ細胞を再度標的とする能力について調べた。７２時間の時点で存在した残りの約０．１％のＡＭＬ細胞をＦＡＣＳによって選別し、再増殖させてからＶδ１＋Ｔ細胞で再処理した。Ｖδ１＋Ｔ細胞は、事前に処理したＡＭＬ細胞を非処理対照と同じ効率で死滅させた（図７Ｃ）。このことは、Ｖδ１＋Ｔ細胞での処理によってＶδ１＋Ｔ抵抗性ＡＭＬ細胞の特定サブセットが選択されなかったことを示唆している。治療（Ｖδ１＋Ｔ細胞または化学療法）圧力時のＡＭＬクローン動態を追跡するために、細胞バーコード（ＮＧＳによって追跡可能な非コードＤＮＡ配列）を用いて単一ＡＭＬ細胞のタグ付けを行った。化学療法は、すべてのバーコード付きＡＭＬ単一細胞系譜の約半分を選択的に標的としたが、Ｖδ１＋Ｔ細胞はＡＭＬ集団のクローンアーキテクチャを保った（図７Ｄ～Ｅ）。
【0121】
まとめると、こうしたデータは、増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞によって標的にされるＡＭＬに幅があることで、抵抗性系譜が選択されることが回避され、効率的な再治療が可能になることを示唆している。化学療法後に不応性の再発が生じることは阻止される必要がある。このように、この研究は、ＡＭＬ治療にγδＴ細胞組成物を臨床的に適用する上での証拠を与えるものである。
【0122】
実施例５：Ｖδ１＋Ｔ細胞集団の反復細胞傷害性
反復負荷細胞傷害性アッセイ
適切な腫瘍細胞株に対する反復細胞傷害性についてのＶδ１＋Ｔ細胞の能力を決定するために、２人のドナー由来のＧＤＸ０１２増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を、ＡＭＬ ＨＬ－６０標的細胞に対するフローサイトメトリー細胞傷害性アッセイにおいて分析した。簡潔に記載すると、ＨＬ－６０標的細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）を用いて室温で２０分間染色した。２０分後、少なくとも１０％の血清を含む培地で細胞を洗浄し、サイトカインを含まない標的細胞培地（ＲＰＭＩ）に再浮遊させた。その後、標的細胞をエフェクター細胞と共に１０：１（エフェクター：標的）の比で３７℃、２連または３連で４８時間共培養した。２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５の存在下でアッセイを実施した。４８時間後、ＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄを培養培地に添加することによって死細胞を室温で１０分間染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０で直ちに分析した。ＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄ色素に陽性であったＣＴＶ＋ｖｅ細胞のパーセントを定量化することによってＳｙｔｏｘ＋ｖｅのパーセントを計算した。
反復負荷細胞傷害性アッセイ
適切な腫瘍細胞株に対する反復細胞傷害性についてのＶδ１＋Ｔ細胞の能力を決定するために、２人のドナー由来のＧＤＸ０１２増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を、ＡＭＬ ＨＬ－６０標的細胞に対するフローサイトメトリー細胞傷害性アッセイにおいて分析した。簡潔に記載すると、ＨＬ－６０標的細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）を用いて室温で２０分間染色した。２０分後、少なくとも１０％の血清を含む培地で細胞を洗浄し、サイトカインを含まない標的細胞培地（ＲＰＭＩ）に再浮遊させた。その後、標的細胞をエフェクター細胞と共に１０：１（エフェクター：標的）の比で３７℃、２連または３連で４８時間共培養した。２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５の存在下でアッセイを実施した。４８時間後、ＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄを培養培地に添加することによって死細胞を室温で１０分間染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０で直ちに分析した。ＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄ色素に陽性であったＣＴＶ＋ｖｅ細胞のパーセントを定量化することによってＳｙｔｏｘ＋ｖｅのパーセントを計算した。
【0123】
第２の死滅アッセイ、すなわち反復死滅アッセイについては、第１の死滅アッセイ由来の未使用ウェルから、激しくピぺッティングすることによって細胞を収集し、沈降処理（３００ｇ、５分）に供し、上清を除去し、新鮮な標的細胞培養培地に再浮遊させた。細胞の数を数え、細胞を新たなウェルに添加した。前述同様にＣＴＶで染色した新鮮なＨＬ－６０細胞を再浮遊させ、再び１０：１のエフェクター：標的比で、上記の新たに播種したエフェクター細胞に添加した。新鮮な２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５をウェルに再添加し、ウェルをさらに７２時間静置した。上記のようにＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄを使用して標的細胞の死滅を定量化した。結果は図８に示される。
【0124】
全体として、ＩＬ－１５サイトカインが添加された状況の下で５日にわたる２回のＶｄ１細胞介在性の標的化に対してＨＬ－６０腫瘍株は感受性であった。したがって、増殖Ｖｄ１細胞は、腫瘍細胞の標的化能力を長期的に提供する能力を有する。
【0125】
実施例６：γδＴ細胞組成物がサイトカイン放出症候群を引き起こす可能性は限られる
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、他の免疫療法（αβＴ細胞療法など）では重要な安全性の問題である。本発明者らの生産物がサイトカインバーストを引き起こす潜在的なリスクを評価するために、凍結保存ＧＤＸ０１２細胞を解凍し、いくつかの異なる条件の下で２１時間培養したものの上清中のサイトカインレベルを測定した。実際、ＴＣＲ（図９Ａ）またはＩＬ－１５（Ｖδ１＋Ｔ細胞による強力な応答を誘導することが知られる）（図９Ｂ）のいずれかによるＧＤＸ０１２細胞の生理学的刺激は、主にＴｈ１関連サイトカインの放出を誘導し、ＣＲＳの原因となる主要なサイトカインを検出可能なレベルで誘導することはほぼない。ＩＬ－１５での超生理学的刺激の下でさえ（図９Ｃ）、本発明者らのアッセイの過程でＩＬ－６のレベルは検出不可能である一方で、ＴＮＦαについては、いくらかのレベルで見られ始める。この挙動は、請求される組成物に有利な安全性プロファイルが存在することを示している。さらに、ＧＤＸ０１２細胞を同種異系血液由来の試料（ＰＢＭＣ及びバフィーコート）と共培養したときにサイトカイン放出バーストが生じるリスクは非常に限られていることが追加の試験によって実証され（図９Ｄ）、共培養の２１時間後のＩＬ－６及びＴＮＦαのレベルは実質的に検出不可能なものであった。
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、他の免疫療法（αβＴ細胞療法など）では重要な安全性の問題である。本発明者らの生産物がサイトカインバーストを引き起こす潜在的なリスクを評価するために、凍結保存ＧＤＸ０１２細胞を解凍し、いくつかの異なる条件の下で２１時間培養したものの上清中のサイトカインレベルを測定した。実際、ＴＣＲ（図９Ａ）またはＩＬ－１５（Ｖδ１＋Ｔ細胞による強力な応答を誘導することが知られる）（図９Ｂ）のいずれかによるＧＤＸ０１２細胞の生理学的刺激は、主にＴｈ１関連サイトカインの放出を誘導し、ＣＲＳの原因となる主要なサイトカインを検出可能なレベルで誘導することはほぼない。ＩＬ－１５での超生理学的刺激の下でさえ（図９Ｃ）、本発明者らのアッセイの過程でＩＬ－６のレベルは検出不可能である一方で、ＴＮＦαについては、いくらかのレベルで見られ始める。この挙動は、請求される組成物に有利な安全性プロファイルが存在することを示している。さらに、ＧＤＸ０１２細胞を同種異系血液由来の試料（ＰＢＭＣ及びバフィーコート）と共培養したときにサイトカイン放出バーストが生じるリスクは非常に限られていることが追加の試験によって実証され（図９Ｄ）、共培養の２１時間後のＩＬ－６及びＴＮＦαのレベルは実質的に検出不可能なものであった。
【0126】
実施例７：γδＴ細胞組成物は同種異系Ｂ細胞を温存する
細胞の選択性を決定するために、３人のドナーに由来するＧＤＸ０１２増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ標識ＮＡＬＭ－６細胞（腫瘍形成Ｂ細胞）とＣＴＶ標識Ｂ細胞（非腫瘍形成初代Ｂ細胞）との混合物に対するフローサイトメトリー細胞傷害性アッセイにおいて分析した。
細胞の選択性を決定するために、３人のドナーに由来するＧＤＸ０１２増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ標識ＮＡＬＭ－６細胞（腫瘍形成Ｂ細胞）とＣＴＶ標識Ｂ細胞（非腫瘍形成初代Ｂ細胞）との混合物に対するフローサイトメトリー細胞傷害性アッセイにおいて分析した。
【0127】
初代Ｂ細胞の単離
新鮮に取得したバフィーコートから１００Ｅ６個のＰＢＭＣを取得し、３００ｇで７分間遠心分離した。上清を除去し、１０７個の細胞当たり４０μｌのＭＡＣＳ緩衝液／１０μｌのＰａｎ Ｂ細胞ビオチン－抗体カクテルに細胞を再浮遊させた。細胞浮遊液を冷蔵庫中で５分間静置した。１０７個の細胞当たり３０μｌのＭＡＣＳ緩衝液／２０μｌの抗ビオチンマイクロビーズを細胞浮遊液に添加し、冷蔵庫中で１０分間静置した。その間、磁気スタンド上のｑｕａｄｒｏＭＡＣＳに挿入したＬＳカラムを、３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を当該カラムに通液することによって平衡化した。細胞浮遊液をカラムに供し、流出液を収集した。洗浄液（３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液）をカラムに供し、収集した。これは、負に濃縮されたＢ細胞画分に相当するものであった。
新鮮に取得したバフィーコートから１００Ｅ６個のＰＢＭＣを取得し、３００ｇで７分間遠心分離した。上清を除去し、１０７個の細胞当たり４０μｌのＭＡＣＳ緩衝液／１０μｌのＰａｎ Ｂ細胞ビオチン－抗体カクテルに細胞を再浮遊させた。細胞浮遊液を冷蔵庫中で５分間静置した。１０７個の細胞当たり３０μｌのＭＡＣＳ緩衝液／２０μｌの抗ビオチンマイクロビーズを細胞浮遊液に添加し、冷蔵庫中で１０分間静置した。その間、磁気スタンド上のｑｕａｄｒｏＭＡＣＳに挿入したＬＳカラムを、３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を当該カラムに通液することによって平衡化した。細胞浮遊液をカラムに供し、流出液を収集した。洗浄液（３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液）をカラムに供し、収集した。これは、負に濃縮されたＢ細胞画分に相当するものであった。
【0128】
細胞傷害性アッセイ
Ｂ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）を用いて室温で２０分間染色した。ＮＡＬＭ－６細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＦＳＥを用いて室温で２０分間染色した。２０分後、少なくとも１０％の血清を含む培地で細胞を洗浄し、サイトカインを含まない標的細胞培地（ＲＰＭＩ）に再浮遊させた。その後、標的細胞をエフェクター細胞と共に、１０：１：１、５：１：１、２：１：１、及び１：１：１（エフェクター：ＮＡＬＭ－６：Ｂ細胞）の比で３７℃、２連または３連で２０時間共培養した。このアッセイはサイトカインの非存在下で実施した。２０時間後、ＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄを培養培地に添加することによって死細胞を室温で１０分間染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０で直ちに分析した。ＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄ色素に陽性であったＣＴＶ＋ｖｅ細胞またはＣＦＳＥ＋ｖｅ細胞のパーセントを定量化することによってＳｙｔｏｘ＋ｖｅのパーセントを計算した。結果は図１０に示される。
Ｂ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）を用いて室温で２０分間染色した。ＮＡＬＭ－６細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＦＳＥを用いて室温で２０分間染色した。２０分後、少なくとも１０％の血清を含む培地で細胞を洗浄し、サイトカインを含まない標的細胞培地（ＲＰＭＩ）に再浮遊させた。その後、標的細胞をエフェクター細胞と共に、１０：１：１、５：１：１、２：１：１、及び１：１：１（エフェクター：ＮＡＬＭ－６：Ｂ細胞）の比で３７℃、２連または３連で２０時間共培養した。このアッセイはサイトカインの非存在下で実施した。２０時間後、ＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄを培養培地に添加することによって死細胞を室温で１０分間染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０で直ちに分析した。ＳｙｔｏｘＡＡＤｖａｎｃｅｄ色素に陽性であったＣＴＶ＋ｖｅ細胞またはＣＦＳＥ＋ｖｅ細胞のパーセントを定量化することによってＳｙｔｏｘ＋ｖｅのパーセントを計算した。結果は図１０に示される。
【0129】
全体として、ＮＡＬＭ－６細胞は、はっきりと標的になった一方で、健康なＢ細胞は完全に温存された。ＮＡＬＭ－６細胞の標的化はＥ：Ｔ比に依存的であった。Ｅ：Ｔ比を高めると細胞傷害性のレベルが上昇した。逆に、健康なＢ細胞は、Ｅ：Ｔ比とは無関係に完全に温存された。したがって、増殖Ｖｄ１＋Ｔ細胞は、同じプレートで培養した健康なＢ細胞に対してはいずれの損傷も副次的に与えることなくＢ細胞腫瘍を特異的に標的とする。
【0130】
実施例８：γδＴ細胞組成物は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を媒介しない
同種異系応答の検出に培養系が適することを実証するために、ドナー血液Ｔ細胞を単離し、ＣＴＶ染色し、自己源または同種異系源のいずれかに由来する照射処理した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と共に培養した。培養を５日間実施した後、ＣＴＶ色素の希釈をフローサイトメトリーによって分析することでαβＴ細胞の分裂を評価した。方法はここに示される。
同種異系応答の検出に培養系が適することを実証するために、ドナー血液Ｔ細胞を単離し、ＣＴＶ染色し、自己源または同種異系源のいずれかに由来する照射処理した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と共に培養した。培養を５日間実施した後、ＣＴＶ色素の希釈をフローサイトメトリーによって分析することでαβＴ細胞の分裂を評価した。方法はここに示される。
【0131】
この実験から得られた結果（図１１Ａに示される）は、照射処理ＰＢＬが混合リンパ球応答培養系において血液Ｔ細胞由来の強固な同種異系応答を誘発し得る一方で、自己適合培養物で示されたＴ細胞増殖のレベルが大幅に低いものであったことを明確に示す。このことは、所与のＴ細胞集団が同種異形反応を引き起こす可能性を突き止める上でこの培養系が適していることを示す。
【0132】
増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞が同種異形反応を引き起こす可能性を突き止めるために、同種異系ドナー由来の照射処理ＰＢＬと共にＧＤＸ０１２細胞を培養した。対照として、ＧＤＸ０１２産物の由来元と同じ個人に由来する適合血液Ｔ細胞をＣＴＶ染色し、同じ同種異系ドナーに由来する照射処理ＰＢＬに対して培養した。培養を５日間実施した後、フローサイトメトリーによって細胞分裂を評価した。
【0133】
図１１Ｂに示される結果は、血液αβＴ細胞は同種異系ＰＢＬの存在下で明確に分裂する一方で、ＧＤＸ０１２細胞（増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞）は、培養においていずれの有意義な数でも存続できないことを示すものであった。同種異系ＰＢＬに対して誘発されたαβ応答は、混合リンパ球反応に典型的なＴ細胞増殖を示すものである。このミスマッチにもかかわらず、同じ照射処理ＰＢＬの存在下でＧＤＸ０１２細胞は増殖しなかった。このことは、ＧＤＸ０１２細胞がαβＴ細胞と同じ様式で同種異系応答を開始することは不可能であることを示すものである。まとめると、こうした結果は、ＧＤＸ０１２がαβＴ細胞と同じ様式でＧｖＨＤを媒介することは不可能であることを示す。
【0134】
バフィーコートの調製、ＣＤ１４事象の枯渇、及び得られる末梢血リンパ球の照射処理
バフィーコート血液を密度勾配分離に供してＰＢＭＣ画分を単離した。こうして得られたＰＢＭＣのごく一部を１０％のＣｒｙｏｓｔｏｒ１０凍結保存媒体中で凍結させ、－８０℃で凍結させた。残りのＰＢＭＣを洗浄し、ヒトＣＤ１４に対する標識を施し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ ＬＳカラムを使用してＣＤ１４の枯渇を実施した。その後、得られたＰＢＬ画分を完全ＲＰＭＩ培地（１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のＨＥＰＥＳ、１％の非必須アミノ酸、及び１％のピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ培地）において５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。
バフィーコート血液を密度勾配分離に供してＰＢＭＣ画分を単離した。こうして得られたＰＢＭＣのごく一部を１０％のＣｒｙｏｓｔｏｒ１０凍結保存媒体中で凍結させ、－８０℃で凍結させた。残りのＰＢＭＣを洗浄し、ヒトＣＤ１４に対する標識を施し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ ＬＳカラムを使用してＣＤ１４の枯渇を実施した。その後、得られたＰＢＬ画分を完全ＲＰＭＩ培地（１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％のＨＥＰＥＳ、１％の非必須アミノ酸、及び１％のピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ培地）において５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩培養した。
【0135】
翌日、ピぺッティングによってＰＬＢを収集し、４０Ｇｙのｘ線照射に曝露して細胞増殖潜在力を抑止した。こうした細胞は、ＭＬＲアッセイにおいて「刺激」細胞画分となる。
【0136】
血液Ｔ細胞の単離及びＭＬＲプレートの準備
バフィーコート源または再凍結ｌｅｕｋｏｐａｋ材料のいずれかに由来するＰＢＭＣを凍結保管から取り出し、解凍した。その後、ＰＢＭＣを洗浄し、ｐａｎ Ｔ細胞単離ビーズで標識し、ＭＡＣＳ ＬＳカラムによって血液Ｔ細胞を単離した。次に、得られた血液Ｔ細胞画分を洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色した。次に、ＣＴＶ＋血液Ｔ細胞を照射処理した刺激ＰＢＬと共培養した。平行して、凍結バイアル中のＧＤＸ１２を解凍し、洗浄し、直ちにＣＴＶで染色した。次に、ＣＴＶ＋ＧＤＸ０１２細胞を、照射処理した刺激ＰＢＬと共培養した。すべての場合において、ウェル当たりのエフェクター－刺激細胞比を１：１とした。共培養は完全ＲＰＭＩ培地において実施した。その後、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養物を５日間インキュベートした。この最初の段取りの後は、追加の培地を培養物に供給することはしなかった。
バフィーコート源または再凍結ｌｅｕｋｏｐａｋ材料のいずれかに由来するＰＢＭＣを凍結保管から取り出し、解凍した。その後、ＰＢＭＣを洗浄し、ｐａｎ Ｔ細胞単離ビーズで標識し、ＭＡＣＳ ＬＳカラムによって血液Ｔ細胞を単離した。次に、得られた血液Ｔ細胞画分を洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色した。次に、ＣＴＶ＋血液Ｔ細胞を照射処理した刺激ＰＢＬと共培養した。平行して、凍結バイアル中のＧＤＸ１２を解凍し、洗浄し、直ちにＣＴＶで染色した。次に、ＣＴＶ＋ＧＤＸ０１２細胞を、照射処理した刺激ＰＢＬと共培養した。すべての場合において、ウェル当たりのエフェクター－刺激細胞比を１：１とした。共培養は完全ＲＰＭＩ培地において実施した。その後、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養物を５日間インキュベートした。この最初の段取りの後は、追加の培地を培養物に供給することはしなかった。
【0137】
実施例８：増殖Ｖδ１＋Ｔ細胞組成物はインビボで腫瘍増殖を阻止する
細胞株由来の異種移植モデルを使用してインビボでのＧＤＸ０１２の生体内分布及び効力を評価した。ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子が発現するように安定的に形質導入されているヒトＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株（ＮＡＬＭ－６）の細胞を、尾静脈を介する静脈内注射によって免疫不全ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスに０．５×１０６個または１×１０６個接種した。その後、腫瘍接種から２４時間後または６日後に２０×１０６個のＧＤＸ０１２細胞の尾静脈を介する単回の静脈内注射にマウスを供したまたは供さなかった。すべての対照マウス及び処理マウスに対して組換えヒトＩＬ－１５を腹腔内注射（試験期間中、２～３日ごとに１μｇ／マウスで実施）してＧＤＸ０１２の生存を支援した。ルシフェリンの皮下投与及び生存状態での全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）を行って腫瘍量の評価を１週間に２回実施した。４週間後、マウスを屠殺し、後足長骨を取り出した。ＲＰＭＩ－１６４０を使用して後足長骨から骨髄を押し出し、フローサイトメトリー分析用として収集した。簡潔に記載すると、ｅＦｌｕｏｒ７８０固定化可能生／死判別色素で細胞を染色した後、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＣＤ４５、ＰＥ結合型抗ヒトＣＤ１９、及びＡＰＣ結合型抗ヒトＴＣＲγδ抗体で染色した。最終的に細胞を４％のパラホルムアルデヒド中で固定化し、ＭＡＣＳＱＵＡＮＴ１０フローサイトメーターで分析した。
細胞株由来の異種移植モデルを使用してインビボでのＧＤＸ０１２の生体内分布及び効力を評価した。ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子が発現するように安定的に形質導入されているヒトＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株（ＮＡＬＭ－６）の細胞を、尾静脈を介する静脈内注射によって免疫不全ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスに０．５×１０６個または１×１０６個接種した。その後、腫瘍接種から２４時間後または６日後に２０×１０６個のＧＤＸ０１２細胞の尾静脈を介する単回の静脈内注射にマウスを供したまたは供さなかった。すべての対照マウス及び処理マウスに対して組換えヒトＩＬ－１５を腹腔内注射（試験期間中、２～３日ごとに１μｇ／マウスで実施）してＧＤＸ０１２の生存を支援した。ルシフェリンの皮下投与及び生存状態での全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）を行って腫瘍量の評価を１週間に２回実施した。４週間後、マウスを屠殺し、後足長骨を取り出した。ＲＰＭＩ－１６４０を使用して後足長骨から骨髄を押し出し、フローサイトメトリー分析用として収集した。簡潔に記載すると、ｅＦｌｕｏｒ７８０固定化可能生／死判別色素で細胞を染色した後、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＣＤ４５、ＰＥ結合型抗ヒトＣＤ１９、及びＡＰＣ結合型抗ヒトＴＣＲγδ抗体で染色した。最終的に細胞を４％のパラホルムアルデヒド中で固定化し、ＭＡＣＳＱＵＡＮＴ１０フローサイトメーターで分析した。
【0138】
全身ＡＬＬインビボモデルにＧＤＸ０１２を単回投与することで、対照と比較して播種性腫瘍の増殖を低減することが可能であった（図１２）。さらに、ＧＤＸ０１２細胞は骨髄にホーミングし、特に骨髄内の腫瘍量を優先的に制御することが可能であった（図１３）。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【国際調査報告】