特表2023-527504ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２流行性変異株に対するモノクローナル抗体２０Ｄ８
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-29
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２流行性変異株に対するモノクローナル抗体２０Ｄ８
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230622BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20230622BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230622BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230622BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20230622BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230622BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/10
A61K39/395 S
A61P31/14
G01N33/569 L
G01N33/53 D
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022558431
(86)(22)【出願日】2022-03-23
(85)【翻訳文提出日】2022-09-23
(86)【国際出願番号】 CN2022082375
(87)【国際公開番号】W WO2022252770
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】202110625569.7
(32)【優先日】2021-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522377963
【氏名又は名称】武漢生物制品研究所有限責任公司
(74)【代理人】
【識別番号】100216471
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬戸 麻希
(72)【発明者】
【氏名】楊暁明
(72)【発明者】
【氏名】申碩
(72)【発明者】
【氏名】段凱
(72)【発明者】
【氏名】李新国
(72)【発明者】
【氏名】王澤▲ゆぇん▼
(72)【発明者】
【氏名】潘勇兵
(72)【発明者】
【氏名】盧佳
(72)【発明者】
【氏名】万▲しん▼
(72)【発明者】
【氏名】郭靖
(72)【発明者】
【氏名】王文輝
(72)【発明者】
【氏名】楊東升
(72)【発明者】
【氏名】林鳳傑
(72)【発明者】
【氏名】李茜
(72)【発明者】
【氏名】施金栄
(72)【発明者】
【氏名】孟勝利
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BA71
4C085BB36
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、野生型ＳＡＲＳＣｏＶ－２と、Ｐ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．
７株を含む複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を中和できる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２流行
性変異株に対するモノクローナル抗体２０Ｄ８に関する。
【選択図】図４
７株を含む複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を中和できる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２流行
性変異株に対するモノクローナル抗体２０Ｄ８に関する。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
６つのＣＤＲ領域が、（１）配列番号１のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ１（ＶＨＣＤＲ１）と、
（２）配列番号２のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ２（ＶＨＣＤＲ２）と、
（３）配列番号３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ３（ＶＨＣＤＲ３）と、
（４）配列番号４のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬＣＤＲ１）と、
（５）配列番号５のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ２（ＶＬＣＤＲ２）と、
（６）配列番号６のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ３（ＶＬＣＤＲ３）とであることを特徴
とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するモノクローナル抗体２０Ｄ８。
【請求項2】
前記モノクローナル抗体２０Ｄ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７であり、前記モノクローナル抗体２０Ｄ８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８であるこ
とを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記モノクローナル抗体２０Ｄ８はＩｇＧ型抗体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項4】
前記モノクローナル抗体２０Ｄ８は野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、Ｐ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株を含む複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を中和すること
ができることを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項5】
前記モノクローナル抗体２０Ｄ８の結合する抗原構造領域が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質Ｓ１であり、且つ、Ｄ６１４Ｇ、Ｋ４１７Ｔ／Ｎ、Ｅ４８４
Ｋ、Ｎ５０１Ｙのいずれか１つ又は複数の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタ
ンパク質Ｓ１に結合することができることを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸フラグメント。
【請求項7】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出する試薬の製造における請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体２０Ｄ８の使用。
【請求項8】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＰ．１株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＢ．１．３５１株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＢ．１．１．
７株であることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項9】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを阻害する試薬の製造における請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体２０Ｄ８の使用。
【請求項10】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＰ．１株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＢ．１．３５１株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＢ．１．１．
７株であることを特徴とする請求項９に記載の使用。
【請求項11】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスへの感染に起因する疾患を予防及び／又は治療する医薬品の製造における請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体２０Ｄ８の使
用。
【請求項12】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＰ．１株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＢ．１．３５１株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＢ．１．１．
７株であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬品技術の分野に属し、詳しく言えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２流行
性変異株に対するモノクローナル抗体２０Ｄ８に関する。
性変異株に対するモノクローナル抗体２０Ｄ８に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、感染率と致死率がどちらも高い新型のコロナウイルスで、そ
の感染が発生して以来、既に世界的な大流行を引き起こしており、世界的に深刻な公共健
康問題が起きている。ワクチンは感染症を効果的に予防でき、現在、一部の新型コロナワ
クチンが使用承認されているが、主に健康な集団を対象としている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－
２に対する中和抗体はウイルスの細胞との結合を効果的にブロックすることができ、臨床
試験では良好な結果が得られている。
の感染が発生して以来、既に世界的な大流行を引き起こしており、世界的に深刻な公共健
康問題が起きている。ワクチンは感染症を効果的に予防でき、現在、一部の新型コロナワ
クチンが使用承認されているが、主に健康な集団を対象としている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－
２に対する中和抗体はウイルスの細胞との結合を効果的にブロックすることができ、臨床
試験では良好な結果が得られている。
【0003】
現在、一部のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するモノクローナル抗体は緊急使用が承認され
ており、開発中のものも多い。しかし、既存の抗体の殆どは主に変異前のＳＡＲＳ－Ｃｏ
Ｖ－２野生株（Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ、ＷＴ）を対象としている。Ｐ．１株（Ｋ４１７Ｔ、
Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙなどの変異を含む）、Ｂ．１．３５１（５０１Ｙ．Ｖ２とも呼ば
れ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙなどの変異を含む）、Ｂ．１．１．７（Ｅ４８
４Ｋ、Ｎ５０１Ｙなどの変異を含む）などの新たに出現した変異株は、スパイクタンパク
質（ＲＢＤ及びＮＴＤ領域を含む）アミノ酸配列における複数の点変異が変異株の伝播速
度、病原性に影響を与えるだけでなく、モノクローナル抗体の中和活性にも大きな影響を
与えるため、ウイルスの免疫回避が起こり得る。そのために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生
株及び変異株に広域な中和能を有するモノクローナル抗体の開発が急務となり、ＳＡＲＳ
－ＣｏＶ－２の野生株及び変異株などの検出と治療におけるその大幅な使用が見込まれる
。
ており、開発中のものも多い。しかし、既存の抗体の殆どは主に変異前のＳＡＲＳ－Ｃｏ
Ｖ－２野生株（Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ、ＷＴ）を対象としている。Ｐ．１株（Ｋ４１７Ｔ、
Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙなどの変異を含む）、Ｂ．１．３５１（５０１Ｙ．Ｖ２とも呼ば
れ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙなどの変異を含む）、Ｂ．１．１．７（Ｅ４８
４Ｋ、Ｎ５０１Ｙなどの変異を含む）などの新たに出現した変異株は、スパイクタンパク
質（ＲＢＤ及びＮＴＤ領域を含む）アミノ酸配列における複数の点変異が変異株の伝播速
度、病原性に影響を与えるだけでなく、モノクローナル抗体の中和活性にも大きな影響を
与えるため、ウイルスの免疫回避が起こり得る。そのために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生
株及び変異株に広域な中和能を有するモノクローナル抗体の開発が急務となり、ＳＡＲＳ
－ＣｏＶ－２の野生株及び変異株などの検出と治療におけるその大幅な使用が見込まれる
。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、６つのＣＤＲ領域が、
（１）配列番号１のアミノ酸配列ＥＹＴＭＹを含む重鎖ＣＤＲ１（ＶＨＣＤＲ１）と、
（２）配列番号２のアミノ酸配列ＧＩＮＰＮＩＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＧを含む重鎖ＣＤ
Ｒ２（ＶＨＣＤＲ２）と、
（３）配列番号３のアミノ酸配列ＤＴＧＮＹＰＦＤＹを含む重鎖ＣＤＲ３（ＶＨＣＤＲ
３）と、
（４）配列番号４のアミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡを含む軽鎖ＣＤ
Ｒ１（ＶＬＣＤＲ１）と、
（５）配列番号５のアミノ酸配列ＷＡＳＴＲＥＳを含む軽鎖ＣＤＲ２（ＶＬＣＤＲ２）
と、
（６）配列番号６のアミノ酸配列ＱＱＹＹＳＹＰＬＴを含む軽鎖ＣＤＲ３（ＶＬＣＤＲ
３）とであることを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するモノクローナル抗
体２０Ｄ８に関する。
（１）配列番号１のアミノ酸配列ＥＹＴＭＹを含む重鎖ＣＤＲ１（ＶＨＣＤＲ１）と、
（２）配列番号２のアミノ酸配列ＧＩＮＰＮＩＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＧを含む重鎖ＣＤ
Ｒ２（ＶＨＣＤＲ２）と、
（３）配列番号３のアミノ酸配列ＤＴＧＮＹＰＦＤＹを含む重鎖ＣＤＲ３（ＶＨＣＤＲ
３）と、
（４）配列番号４のアミノ酸配列ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡを含む軽鎖ＣＤ
Ｒ１（ＶＬＣＤＲ１）と、
（５）配列番号５のアミノ酸配列ＷＡＳＴＲＥＳを含む軽鎖ＣＤＲ２（ＶＬＣＤＲ２）
と、
（６）配列番号６のアミノ酸配列ＱＱＹＹＳＹＰＬＴを含む軽鎖ＣＤＲ３（ＶＬＣＤＲ
３）とであることを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するモノクローナル抗
体２０Ｄ８に関する。
【0005】
さらに、前記モノクローナル抗体２０Ｄ８の重鎖可変領域の全長は配列番号７のアミノ
酸配列ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＹＷＶ
ＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＧＩＮＰＮＩＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳ
ＴＡＹＭＥＩＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＤＴＧＮＹＰＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳ
Ｓを含み、
前記モノクローナル抗体２０Ｄ８の軽鎖可変領域の全長は配列番号８のアミノ酸配列Ｄ
ＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷ
ＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＶＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩ
ＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫを含む。
酸配列ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＹＷＶ
ＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＧＩＮＰＮＩＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳ
ＴＡＹＭＥＩＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＤＴＧＮＹＰＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳ
Ｓを含み、
前記モノクローナル抗体２０Ｄ８の軽鎖可変領域の全長は配列番号８のアミノ酸配列Ｄ
ＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷ
ＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＶＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩ
ＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫを含む。
【0006】
さらに、前記モノクローナル抗体２０Ｄ８はＩｇＧ型抗体である。
【0007】
さらに、前記モノクローナル抗体２０Ｄ８は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、Ｐ．１
株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株を含む複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を中
和することができる。
株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株を含む複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を中
和することができる。
【0008】
具体的には、前記モノクローナル抗体２０Ｄ８が結合する抗原構造領域はＳＡＲＳ－Ｃ
ｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質Ｓ１のＲＢＤドメインであり、且つ、Ｄ６１４Ｇ
、Ｋ４１７Ｔ／Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙなどの変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のス
パイクタンパク質Ｓ１に結合することができる。
ｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質Ｓ１のＲＢＤドメインであり、且つ、Ｄ６１４Ｇ
、Ｋ４１７Ｔ／Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙなどの変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のス
パイクタンパク質Ｓ１に結合することができる。
【0009】
本発明は、さらに、前記モノクローナル抗体２０Ｄ８をコードする核酸フラグメントに
関する。
関する。
【0010】
本発明は、さらに、
軽鎖が、
（１）配列番号８のアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加され
て形成された同じ機能を有する配列であり、
又は、（２）配列番号８のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で
あり、
重鎖が、
（１）配列番号７のアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加され
て形成された同じ機能を有する配列であり、
又は、（２）配列番号７のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で
ある、抗体に関する。
軽鎖が、
（１）配列番号８のアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加され
て形成された同じ機能を有する配列であり、
又は、（２）配列番号８のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で
あり、
重鎖が、
（１）配列番号７のアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加され
て形成された同じ機能を有する配列であり、
又は、（２）配列番号７のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で
ある、抗体に関する。
【0011】
本発明は、さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出する試薬の製造における前記
モノクローナル抗体２０Ｄ８の使用を含み、好ましくは、前記試薬はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－
２ウイルスＰ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株を検出する試薬である。
モノクローナル抗体２０Ｄ８の使用を含み、好ましくは、前記試薬はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－
２ウイルスＰ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株を検出する試薬である。
【0012】
本発明は、さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを阻害する試薬の製造における前記
モノクローナル抗体２０Ｄ８の使用を含み、好ましくは、前記試薬はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－
２ウイルスＰ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株を阻害する試薬である。
モノクローナル抗体２０Ｄ８の使用を含み、好ましくは、前記試薬はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－
２ウイルスＰ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株を阻害する試薬である。
【0013】
本発明は、さらに、医薬品の製造におけるモノクローナル抗体２０Ｄ８の使用を含み、
前記医薬品はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスへの感染に起因する疾患を予防及び／又は
治療する医薬品であり、好ましくは、前記医薬品はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＰ．１
株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株への感染に起因する疾患を予防及び／又は治療
する医薬品である。
前記医薬品はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスへの感染に起因する疾患を予防及び／又は
治療する医薬品であり、好ましくは、前記医薬品はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＰ．１
株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株への感染に起因する疾患を予防及び／又は治療
する医薬品である。
【発明の効果】
【0014】
本発明の有益な効果は次のとおりである。現在開発されているワクチン及び緊急使用が
承認された一部の抗体は、主に変異前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株を対象としている。
Ｐ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、
程度の差があるが、開発中の一部の抗体や、回復期患者の血漿、ワクチン免疫化後の血漿
に耐性を示している。本発明の２０Ｄ８モノクローナル抗体に関する実験結果から、当該
抗体２０Ｄ８はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株と、Ｐ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．
１．７株などの変異株に強い中和活性を有することが示されている。そのため、本発明か
ら得られる、広域な中和活性を有するモノクローナル抗体２０Ｄ８はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－
２野生株及びその変異株に起因する疾患の特異的な予防、治療及び診断のための研究と使
用に大きな価値があるだろう。
承認された一部の抗体は、主に変異前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株を対象としている。
Ｐ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株は、
程度の差があるが、開発中の一部の抗体や、回復期患者の血漿、ワクチン免疫化後の血漿
に耐性を示している。本発明の２０Ｄ８モノクローナル抗体に関する実験結果から、当該
抗体２０Ｄ８はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株と、Ｐ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．
１．７株などの変異株に強い中和活性を有することが示されている。そのため、本発明か
ら得られる、広域な中和活性を有するモノクローナル抗体２０Ｄ８はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－
２野生株及びその変異株に起因する疾患の特異的な予防、治療及び診断のための研究と使
用に大きな価値があるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
特段の説明がない限り、下記の実施例で用いられる技術的手段はいずれも当業者に熟知
される通常の手段で、全ての試薬が市販品である。
される通常の手段で、全ての試薬が市販品である。
【0017】
実施例１：モノクローナル抗体２０Ｄ８の製造及び精製
１．製造：
７日前にフロイント不完全アジュバントを注射した後、２０Ｄ８抗体を安定的に分泌す
るモノクローナルハイブリドーマ細胞株（０．５ｍＬ、３×１０６細胞／ｍＬ）をマウス
の腹腔に注射して、引き続き７～１０日間培養した。
１．製造：
７日前にフロイント不完全アジュバントを注射した後、２０Ｄ８抗体を安定的に分泌す
るモノクローナルハイブリドーマ細胞株（０．５ｍＬ、３×１０６細胞／ｍＬ）をマウス
の腹腔に注射して、引き続き７～１０日間培養した。
【0018】
２．精製：
腹水を採取し、３７℃下で２時間静置した後、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、
中間部の上清を回収して濾過し、続いてプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。精製ステップを要約すると次のとおりであった。
ｐＨが７．０で０．１ＭのＴｒｉｓバッファーで平衡化させた。
サンプルを注入した後に、ｐＨが７．０で０．１ＭのＴｒｉｓバッファーで溶出した。
続いて、ｐＨが８．０で１．０ＭのＴｒｉｓバッファーで溶出した。
腹水を採取し、３７℃下で２時間静置した後、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、
中間部の上清を回収して濾過し、続いてプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー
により精製した。精製ステップを要約すると次のとおりであった。
ｐＨが７．０で０．１ＭのＴｒｉｓバッファーで平衡化させた。
サンプルを注入した後に、ｐＨが７．０で０．１ＭのＴｒｉｓバッファーで溶出した。
続いて、ｐＨが８．０で１．０ＭのＴｒｉｓバッファーで溶出した。
【0019】
溶出液を回収してＰＢＳバッファーにおいて透析した。精製後の抗体に対し、ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによる検出と解析を行った。
ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによる検出と解析を行った。
【0020】
３．結果分析：
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である図１に示されるとおり、非還元条件では、２０Ｄ８抗体が
、分子量が約１５０ｋＤａのバンドとして現われた。還元条件では、分子量が約５０ｋＤ
ａと２５ｋＤａの２つのバンドとして現われ、それぞれが抗体の重鎖及び軽鎖に対応する
。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果である図２からは、精製後のモノクローナル抗体の純度が９９％
以上に達していることが示されていた。精製後のモノクローナル抗体に対しペプチドマッ
プ法で解析したアミノ酸配列が想定したアミノ酸配列に一致した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である図１に示されるとおり、非還元条件では、２０Ｄ８抗体が
、分子量が約１５０ｋＤａのバンドとして現われた。還元条件では、分子量が約５０ｋＤ
ａと２５ｋＤａの２つのバンドとして現われ、それぞれが抗体の重鎖及び軽鎖に対応する
。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果である図２からは、精製後のモノクローナル抗体の純度が９９％
以上に達していることが示されていた。精製後のモノクローナル抗体に対しペプチドマッ
プ法で解析したアミノ酸配列が想定したアミノ酸配列に一致した。
【0021】
具体的には、前記２０Ｄ８抗体の６つのＣＤＲ領域の配列構造は、
配列番号１のＥＹＴＭＹである重鎖ＣＤＲ１（ＶＨＣＤＲ１）と、
配列番号２のＧＩＮＰＮＩＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＧである重鎖ＣＤＲ２（ＶＨＣＤＲ２
）と、
配列番号３のＤＴＧＮＹＰＦＤＹである重鎖ＣＤＲ３（ＶＨＣＤＲ３）と、
配列番号４のＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡである軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬＣＤＲ１
）と、
配列番号５のＷＡＳＴＲＥＳである軽鎖ＣＤＲ２（ＶＬＣＤＲ２）と、
配列番号６のＱＱＹＹＳＹＰＬＴである軽鎖ＣＤＲ３（ＶＬＣＤＲ３）とである。
配列番号１のＥＹＴＭＹである重鎖ＣＤＲ１（ＶＨＣＤＲ１）と、
配列番号２のＧＩＮＰＮＩＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＧである重鎖ＣＤＲ２（ＶＨＣＤＲ２
）と、
配列番号３のＤＴＧＮＹＰＦＤＹである重鎖ＣＤＲ３（ＶＨＣＤＲ３）と、
配列番号４のＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡである軽鎖ＣＤＲ１（ＶＬＣＤＲ１
）と、
配列番号５のＷＡＳＴＲＥＳである軽鎖ＣＤＲ２（ＶＬＣＤＲ２）と、
配列番号６のＱＱＹＹＳＹＰＬＴである軽鎖ＣＤＲ３（ＶＬＣＤＲ３）とである。
【0022】
前記２０Ｄ８抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列は、それぞれ、配列番号８、
配列番号７である。
配列番号７：ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＴ
ＭＹＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＧＩＮＰＮＩＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤ
ＫＳＳＳＴＡＹＭＥＩＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＤＴＧＮＹＰＦＤＹＷＧＱＧＴＴ
ＬＴＶＳＳ。
配列番号８：ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳ
ＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＶＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳ
ＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
。
配列番号７である。
配列番号７：ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＴ
ＭＹＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＧＩＮＰＮＩＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤ
ＫＳＳＳＴＡＹＭＥＩＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＤＴＧＮＹＰＦＤＹＷＧＱＧＴＴ
ＬＴＶＳＳ。
配列番号８：ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳ
ＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＶＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳ
ＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
。
【0023】
実施例２：抗体の機能分析
１． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するモノクローナル抗体２０Ｄ８の抗原結合活性の検
出
ＥＬＩＳＡ法で２０Ｄ８抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質Ｓ
１に対する結合能を測定した。ステップを要約すると次のとおりであった。
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１－Ｈｉｓ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ社、カ
タログ番号：４０５９１－Ｖ０８Ｈ）をコーティング抗原として、マイクロプレートに炭
酸塩バッファーを使用して２．０μｇ／ｍＬの抗原をコーティングし、３７℃下で２時間
インキュベートした。
（２）カゼインバッファーを使用して３７℃下で２時間ブロックし、段階的に希釈した
被検抗体を加えて、３７℃下で１時間インキュベートした。
（３）１：１００００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｂｉｏｄｒａｇｏｎ社
、カタログ番号：ＢＦ０３００１Ｘ）を加えて、３７℃下で１時間インキュベートした。
（４）発色溶液で発色させて、２Ｍ ＨＣｌで反応を停止させた。マイクロプレートリ
ーダーにおいて４５０ｎｍの吸光度を検出した。
１． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するモノクローナル抗体２０Ｄ８の抗原結合活性の検
出
ＥＬＩＳＡ法で２０Ｄ８抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質Ｓ
１に対する結合能を測定した。ステップを要約すると次のとおりであった。
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１－Ｈｉｓ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ社、カ
タログ番号：４０５９１－Ｖ０８Ｈ）をコーティング抗原として、マイクロプレートに炭
酸塩バッファーを使用して２．０μｇ／ｍＬの抗原をコーティングし、３７℃下で２時間
インキュベートした。
（２）カゼインバッファーを使用して３７℃下で２時間ブロックし、段階的に希釈した
被検抗体を加えて、３７℃下で１時間インキュベートした。
（３）１：１００００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｂｉｏｄｒａｇｏｎ社
、カタログ番号：ＢＦ０３００１Ｘ）を加えて、３７℃下で１時間インキュベートした。
（４）発色溶液で発色させて、２Ｍ ＨＣｌで反応を停止させた。マイクロプレートリ
ーダーにおいて４５０ｎｍの吸光度を検出した。
【0024】
【0025】
２． ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するモノクローナル抗体２０Ｄ８の（変異型）シュー
ドウイルスに対する中和試験
シュードウイルス検出系を使用して２０Ｄ８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株（ＷＴ）及
びその変異株に対する中和活性として（シュードウイルスは全て北京天薬物生物技術開発
会社から購入した）、野生株（カタログ番号：８００３３）、Ｐ．１株（カタログ番号：
８００４５）、Ｂ．１．３５１株（カタログ番号：８００４４）及びＢ．１．１．７株（
カタログ番号：８００４３）に対応するシュードウイルスへの中和活性を検出した。ステ
ップを要約すると次のとおりであった。段階的に希釈した抗体２０Ｄ８とシュードウイル
スを混合させて３７℃下で１時間インキュベートし、対照群は抗体又はウイルスを加えな
かった。その後、予め用意したＨｕｈ７単層細胞を含む検出プレートに加えて２４時間培
養し、続いて、１００μＬの培養上清を等量の蛍光基質と交換して、室温下で２分間イン
キュベートして１５０μＬのライセートを新しい９６ウェルプレートに移して蛍光値を測
定し、シュードウイルスの中和活性を計算した（ＩＣ５０で示した）。
ドウイルスに対する中和試験
シュードウイルス検出系を使用して２０Ｄ８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株（ＷＴ）及
びその変異株に対する中和活性として（シュードウイルスは全て北京天薬物生物技術開発
会社から購入した）、野生株（カタログ番号：８００３３）、Ｐ．１株（カタログ番号：
８００４５）、Ｂ．１．３５１株（カタログ番号：８００４４）及びＢ．１．１．７株（
カタログ番号：８００４３）に対応するシュードウイルスへの中和活性を検出した。ステ
ップを要約すると次のとおりであった。段階的に希釈した抗体２０Ｄ８とシュードウイル
スを混合させて３７℃下で１時間インキュベートし、対照群は抗体又はウイルスを加えな
かった。その後、予め用意したＨｕｈ７単層細胞を含む検出プレートに加えて２４時間培
養し、続いて、１００μＬの培養上清を等量の蛍光基質と交換して、室温下で２分間イン
キュベートして１５０μＬのライセートを新しい９６ウェルプレートに移して蛍光値を測
定し、シュードウイルスの中和活性を計算した（ＩＣ５０で示した）。
【0026】
結果：
抗体２０Ｄ８のシュードウイルスに対する中和試験の検出結果は図４であり、野生株（
ＷＴ）と、変異株Ｐ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株シュードウイルスに対
する中和活性のＩＣ５０はそれぞれ次のとおりであった。
野生株（ＷＴ）：１．３７ｎｇ／ｍＬ（図４のＡ）、
変異株Ｐ．１株：０．５６ｎｇ／ｍＬ（図４のＡ）、
変異株Ｂ．１．３５１株：０．４７ｎｇ／ｍＬ（図４のＢ）、
変異株Ｂ．１．１．７株：０．９５ｎｇ／ｍＬ（図４のＣ）。
抗体２０Ｄ８のシュードウイルスに対する中和試験の検出結果は図４であり、野生株（
ＷＴ）と、変異株Ｐ．１株、Ｂ．１．３５１株、Ｂ．１．１．７株シュードウイルスに対
する中和活性のＩＣ５０はそれぞれ次のとおりであった。
野生株（ＷＴ）：１．３７ｎｇ／ｍＬ（図４のＡ）、
変異株Ｐ．１株：０．５６ｎｇ／ｍＬ（図４のＡ）、
変異株Ｂ．１．３５１株：０．４７ｎｇ／ｍＬ（図４のＢ）、
変異株Ｂ．１．１．７株：０．９５ｎｇ／ｍＬ（図４のＣ）。
【0027】
したがって、当該モノクローナル抗体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株、変異株にいずれ
も中和活性を有している。
も中和活性を有している。
【0028】
なお、上記の実施例は当業者が本発明の趣旨に対する理解を促すためのものに過ぎず、
本発明の保護範囲を限定するものではない。
本発明の保護範囲を限定するものではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】