特表 2023-527530 同種異系移植のための操作された免疫細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-29

(54)【発明の名称】同種異系移植のための操作された免疫細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20230622BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230622BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20230622BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230622BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230622BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230622BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20230622BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20230622BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61K35/17

A61K35/15

A61P35/00

A61P31/00

A61P37/06

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/113 140

C12N5/0783

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022572636

(86)(22)【出願日】2021-07-14

(85)【翻訳文提出日】2022-11-24

(86)【国際出願番号】 CN2021106259

(87)【国際公開番号】W WO2022012591

(87)【国際公開日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】202010679530.9

(32)【優先日】2020-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202011534699.1

(32)【優先日】2020-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522329098

【氏名又は名称】南京北恒生物科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100146374

【弁理士】

【氏名又は名称】有馬 百子

(72)【発明者】

【氏名】周 亜麗

(72)【発明者】

【氏名】陳 功

(72)【発明者】

【氏名】姜 小燕

(72)【発明者】

【氏名】任 江涛

(72)【発明者】

【氏名】賀 小宏

(72)【発明者】

【氏名】王 延賓

(72)【発明者】

【氏名】韓 露

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065BC37

4B065CA23

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087CA12

4C087NA05

4C087ZB08

4C087ZB26

4C087ZB31

(57)【要約】

本発明は、少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされ、ＮＫ細胞による前記操作された免疫細胞に対する殺傷を阻害する、操作された免疫細胞を提供する。本発明は、前記操作された免疫細胞を含む医薬組成物、並びに、癌、感染症または自己免疫疾患の治療のための薬物の製造における前記操作された免疫細胞の用途をさらに提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作された免疫細胞であって、
少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされ、ＮＫ細胞による前記操作された免疫細胞に対する殺傷を阻害することを特徴とする操作された免疫細胞。

【請求項2】

前記ＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項3】

前記ＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項２に記載の操作された免疫細胞。

【請求項4】

前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ２及びＬＦＡ－１から選択されるＮＫ活性化受容体に結合することを特徴とする請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項5】

前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、Ｒａｅ－１、Ｈ６０、ＭＵＬＴ１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＧ６、ＰｆＥＭＰ１、ＨＳＰＧＳ、ＡＩＣＬ、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、ＳＴＡＴ１、ＪＡＫ１、ＩＦＮＧＲ２、ＪＡＫ２及びＩＦＮＧＲ１から選択されることを特徴とする請求項１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項6】

前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＤ５８、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３から選択されることを特徴とする請求項５に記載の操作された免疫細胞。

【請求項7】

前記操作された免疫細胞は、少なくとも１つのＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされるものをさらに含み、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ及びそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項8】

前記操作された免疫細胞の少なくとも１つのＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子、少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされており、ここで、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ及びそれらの組み合わせから選択されており、前記ＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択されており、前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＤ５８、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３及びそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項７に記載の操作された免疫細胞。

【請求項9】

前記操作された免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３から選択される１つ以上の遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされるものをさらに含むことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項10】

前記操作された細胞は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む免疫認識受容体をさらに発現することを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項11】

前記免疫認識受容体は、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体であることを特徴とする請求項１０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項12】

前記免疫認識受容体は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体であることを特徴とする請求項１１に記載の操作された免疫細胞。

【請求項13】

前記免疫認識受容体は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択される標的と結合することを特徴とする請求項１０に記載の操作された免疫細胞。

【請求項14】

前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞から選択されることを特徴とする請求項１～１３のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項15】

前記免疫細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞またはαβ－Ｔ細胞から選択されるＴ細胞であることを特徴とする請求項１～１３のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項16】

前記免疫細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞に由来することを特徴とする請求項１～１５のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項18】

癌、感染症または自己免疫疾患の治療のための薬物の製造における請求項１～１６のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞の用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫療法の分野に属する。より具体的に、本発明は、少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子及び少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされ、ＮＫ細胞による殺傷を阻害する、操作された免疫細胞（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ）に関するものである。

【背景技術】

【0002】

近年、がん免疫療法の技術は急速に発展しており、特にキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）関連の免疫療法は、血液腫瘍の治療において優れた臨床効果を達成している。ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法は、腫瘍抗原を認識できるようにｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を遺伝子改変し、一定数に増幅した後、患者に再注入してがん細胞を殺傷させ、腫瘍治療の目的を達成する。

【0003】

２０１７年に、２種の自家ＣＡＲ－Ｔ療法が、米国でＦＤＡの承認を取得して市販した。一種は、Ｂ細胞急性白血病用で、もう一種はびまん性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫用である。これら２種のＣＡＲ－Ｔ細胞は優れた臨床治療効果を持っているが、非常に高価で、製造期間が長いため、大規模な普及が非常に困難である。したがって、上記の問題を解決するためには、同種異系移植のためのユニバーサルＣＡＲ－Ｔ製品を開発する必要がある。ユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、健康なドナーの末梢血から分離されたＴ細胞を利用して製造できるため、同種異系の再注入が実現し、患者の治療待ち時間が大幅に短縮される。また、健康なドナーから得られたＴ細胞の生存率及び機能は、患者由来のＴ細胞よりも優れており、ＣＡＲ感染率を高め、治療効果を高めることができる。

【0004】

しかし、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の開発は、依然として次の２つの問題に直面している。（１）操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞が患者に進入し、ある程度増殖した後、患者の正常な細胞または組織を攻撃し、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす可能性がある。（２）患者体内の正常な免疫系は、異系由来のＣＡＲ－Ｔ細胞を拒絶し、宿主対移植片反応（ＨｖＧＤ）を引き起こす可能性がある。現在、移植リスクは、主にＴＣＲ、ＭＨＣクラスＩ分子及び／又はクラスＩＩ分子（例えば、ＨＬＡ、Ｂ２Ｍなど）をノックアウトすることにより、低減している。しかし、ＭＨＣクラス分子は、ＮＫ細胞が「自家細胞」を認識するための重要な分子であるため、Ｂ２ＭのようなＭＨＣクラスＩ分子を完全に不活化すると、ＮＫ細胞が再注入された操作された免疫細胞を「異系」と見なして殺傷させ、最終的に再注入された細胞の生存と持続性に影響を与え、それによって治療効果に影響を与える。

【0005】

従って、レシピエント体内のＮＫ細胞による殺傷効果を低減または阻害し、それによって同種異系移植によって引き起こされる免疫拒絶のリスクを低減または回避できる、新規の操作された免疫細胞を開発する必要がある。

【発明の概要】

【0006】

第１の形態において、本発明は、操作された免疫細胞であって、少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされ、ＮＫ細胞による前記操作された免疫細胞に対する殺傷を阻害する、操作された免疫細胞を提供する。

【0007】

一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択される。

【0008】

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ２及びＬＦＡ－１から選択されるＮＫ活性化受容体に結合する。好ましくは、前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ２及びＬＦＡ－１から選択されるＮＫ活性化受容体に結合する。

【0009】

一実施形態において、前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、Ｒａｅ－１、Ｈ６０、ＭＵＬＴ１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＧ６、ＰｆＥＭＰ１、ＨＳＰＧＳ、ＡＩＣＬ、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、ＳＴＡＴ１、ＪＡＫ１、ＩＦＮＧＲ２、ＪＡＫ２及びＩＦＮＧＲ１から選択される。好ましくは、前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＤ５８、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３から選択される。

【0010】

一実施形態において、前記操作された免疫細胞は、少なくとも１つのＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされるものをさらに含み、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ及びそれらの組み合わせから選択される。

【0011】

一好ましい実施形態において、前記操作された免疫細胞の少なくとも１つのＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子、少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされており、ここで、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及びそれらの組み合わせから選択されており、前記ＭＨＣ関連遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択されており、前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＣＤ５８、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３から選択される。一実施形態において、前記操作された免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされる。一実施形態において、前記操作された免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、ＣＩＩＴＡ及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされる。一好ましい実施形態において、前記操作された免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされる。一好ましい実施形態において、前記操作された免疫細胞のＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされる。

【0012】

一実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ及びＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３のような免疫チェックポイント遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされるものをさらに含む。好ましくは、前記操作された免疫細胞のＣＤ５２、ｄＣＫ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴまたはそれらの組み合わせが阻害またはサイレンシングされる。

【0013】

一実施形態において、前記操作された細胞は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む免疫認識受容体をさらに発現する。好ましくは、前記免疫認識受容体は、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体である。より好ましくは、前記免疫認識受容体は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体である。

【0014】

一実施形態において、前記免疫認識受容体は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択される標的と結合する。好ましくは、前記標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＭＵＣ１、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＣＥＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＧＤ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、メソテリン及びそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0015】

一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のタンパク質の膜貫通ドメインから選択される。好ましくは、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ２７８の膜貫通ドメインから選択される。

【0016】

一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄのタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択される。好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインである。

【0017】

一実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０及びそれらの組み合わせから選択される１つ以上のタンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインである。好ましくは、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ２７８の共刺激シグナル伝達ドメインまたはそれらの組み合わせである。

【0018】

一実施形態において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞から選択される。好ましくは、前記免疫細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞またはαβ－Ｔ細胞から選択されるＴ細胞である。
第２の形態において、本発明は、本発明に記載の操作された免疫細胞及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。

【0019】

第３の形態において、本発明は、がん、感染症または自己免疫疾患に罹患している被験者を治療する方法であって、前記被験者に有効量の本発明に記載の操作された免疫細胞または医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。したがって、本発明は、がん、感染症または自己免疫疾患の治療のための薬物の製造における本発明に記載の操作された免疫細胞または医薬組成物の用途をさらに提供する。

【0020】

発明の詳細な説明
特に断りがない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。

【0021】

ＮＫ細胞は、表面にさまざまな活性化受容体と抑制性受容体を発現しており、ＮＫ細胞の殺傷機能は、これら２種類の受容体によって提供される正のシグナルと負のシグナルとのバランスによって調節・制御される。正常的な場合、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子を認識する抑制性受容体が、シグナル伝達のバランスを支配している。しかし、ＭＨＣクラスＩ分子が、人為的に阻害またはノックアウトされることのように、異常に発現すると、対応する活性化受容体が支配的になり、ＮＫ細胞が活性化され、それによって細胞毒性作用が発揮され、サイトカインが放出される。操作された免疫細胞を同種異系移植する場合、ＮＫ細胞のこの細胞毒性効果は、注入された治療用細胞を殺し、それによって治療効果を低下させる可能性がある。したがって、操作された免疫細胞を改造して、患者の体内に再注入する際に、ＮＫ細胞によって殺傷されるリスクを低減または回避できるようにすることで、治療用免疫細胞の生存期間を延長し、治療効果を向上させる必要がある。

【0022】

したがって、第１の形態において、本発明は、操作された免疫細胞であって、少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされ、ＮＫ細胞による前記操作された免疫細胞に対する殺傷を阻害する、操作された免疫細胞を提供する。
ＮＫ活性化受容体結合分子

【0023】

本明細書で使用される「ＮＫ活性化受容体結合分子」という用語は、ＮＫ活性化受容体に結合して、ＮＫ細胞機能（例えば、殺傷機能）を活性化することができる分子を指す。ＮＫ活性化受容体の非限定的な例示には、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）を有するか、或いは、それに結合するＮＫ細胞表面受容体が含まれる。このような受容体は、分子構造に従ってＩｇスーパーファミリー及びＣ型レクチンスーパーファミリーに分けることができ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ２、ＬＦＡ－１などを含むが、これらに限定されない。

【0024】

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＮＫＧ２Ｄに結合する分子である。ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ及びＮＫＧ２ＤはすべてＮＫＧ２ファミリーに属し、膜貫通ドメインのアミノ酸を介して調節分子に結合し、それによって下流のシグナル伝達経路を活性化する。ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｅの発現には、ＣＤ９４とのヘテロ二量体の形成する必要があり、ＩＴＡＭを含むＤＡＰ１２分子に結合することにより、ＩＴＡＭの２つのチロシン残基が急速にリン酸化され、ＺＡＰ－７０とＳｙｋが動員され、ＮＫ細胞が活性化される。ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｅは、ヒトではリガンド ＨＬＡ－Ｅを認識し、マウスではリガンドＱａ１ｂを認識する。ＮＫＧ２Ｄは、ヒトのすべてのＮＫ細胞だけでなく、大多数のγδＴ細胞及び活性化ＣＤ８＋αβＴ細胞にも広く発現しており、マウスではすべてのＮＫ細胞、一部のγδＴ細胞及び一部のマクロファージにも発現している。ＮＫＧ２Ｄは、ホモダイマーの形で発現し、２つの異なるアダプタータンパク質ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に結合し、２つのシグナル伝達経路を介して異なる機能を媒介する。一方では、ＮＫＧ２Ｄは、膜貫通ドメインの正電荷を帯びたアルギニン残基を介してＤＡＰ１０に結合し、ＤＡＰ１０をリン酸化し、したがって、ＮＫ細胞は、ＰＩ３Ｋ依存性Ｒａｓ非依存性シグナル伝達経路を介して細胞毒性作用を発揮するように活性化される。他方では、ＮＫＧ２ＤはＩＴＡＭを含むＤＡＰ１２にも結合し、チロシン残基のリン酸化を介してＳｙｋ及びＺＡＰ－７０のようなチロシンキナーゼを動員し、下流のシグナル伝達を引き起こし、サイトカイン及びケモカインの放出を誘導する。ヒトにおけるＮＫＧ２ＤのリガンドはＭＩＣ遺伝子（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢを含む）及びＵＬＢＰ遺伝子（ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５及びＵＬＢＰ６を含む）であり、マウスにおけるリガンドはＲａｅ－１、Ｈ６０及びＭＵＬＴ１である。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢはＭＨＣ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ｂ遺伝子座側に位置し、相同性は９１％と高い。ＵＬＢＰ遺伝子は構造的にＭＨＣクラスＩ分子と類似し、両方ともα１ドメインとα２ドメインを含むが、α３機能ドメインとβ２ミクログロブリンは含まない。したがって、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＨＬＡ－Ｅ、Ｑａ１ｂ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、Ｒａｅ－１、Ｈ６０及びＭＵＬＴ１から選択される。より好ましくは、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１及びＵＬＢＰ２から選択される。

【0025】

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ８０に結合する分子である。ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＮＫｐ８０はすべて天然細胞毒性受容体（Ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＮＣＲ）ファミリーに属し、細胞表面でのそれらの発現程度はＮＫ細胞の機能と密接に関連している。ＮＫｐ３０は、ＮＫ細胞の殺傷活性の重要な要因の１つであり、その発現レベルは、さまざまな腫瘍やウイルスの感染において不均衡であり、腫瘍やウイルスの免疫逃避に関与している可能性がある。ＮＫｐ３０の細胞外セグメントは、Ｖ型免疫グロブリン様ドメインであり、疎水性アミノ酸配列によってアルギニンに富む膜貫通ドメインに結合している。ＮＫｐ３０はＣＤ３ζに結合し、後者のＩＴＡＭを介して細胞内に活性化シグナルを伝達する。ＮＫｐ３０の活性化リガンドには、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＧ６（ＢＡＴ３としても呼ばれる）、ＰｆＥＭＰ１、ＨＳＰＧＳなどが含まれる。ＮＫｐ４４の細胞外領域にはＶ型ドメインが含まれ、膜貫通ドメインにはＫＡＰＡＰ／ＤＡＰ１２に結合する帯電したリジンがある。ＮＫｐ４４の細胞内ドメインにはＩＴＩＭが含まれているが、抑制機能の欠如して、ＤＡＰ１２によって伝達される活性化シグナルを弱めることはない。研究では、ＮＫｐ４４がウイルスのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）と結合して、ＮＫ細胞の抗ウイルス効果を発揮できることを示している。ＮＫｐ４６の細胞外領域には２つのＣ２型Ｉｇ様ドメインがあり、膜貫通ドメインには正電荷を帯びたアルギニン残基が含まれ、細胞内領域にはＩＴＡＭモチーフが含まれていないため、ＮＫｐ３０と同様に、細胞内セグメントでＩＴＡＭを含むＣＤ３ζ及び／又はＦｃεＲＩγなどの分子と複合体を形成して、活性化シグナルを細胞内に伝達する必要がある。ＮＫｐ４６はすべての成熟ＮＫ細胞の表面に発現し、ＮＫ細胞の殺傷機能を開始するための重要な受容体である。ＮＫｐ４６はウイルスのヘマグルチニンにも結合して、ＮＫ細胞の抗ウイルス効果を発揮する。また、ＮＫｐ４６はＨＳＰＧＳにも結合できる。ＮＫｐ８０は、ほぼすべてのＮＫ細胞の表面にホモダイマーの形で発現し、そのリガンド活性化誘導のＣ型レクチン（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ、ＡＩＣＬ）に結合した後、ＮＫ細胞を迅速に活性化し、ＮＫ細胞の細胞毒性と炎症性サイトカインを分泌する能力を高める。したがって、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＧ６、ＰｆＥＭＰ１、ＨＳＰＧＳ、ＡＩＣＬから選択され、好ましくはＢ７－Ｈ６、ＢＡＧ６及びＡＩＣＬから選択される。

【0026】

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、２Ｂ４に結合する分子である。２Ｂ４はＣＤ２４４とも呼ばれ、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球、顆粒球の表面に広く発現する膜タンパク質である。２Ｂ４の細胞外領域には、Ｖ型免疫グロブリンドメイン及びＣ２型免疫グロブリン様ドメインがあり、膜貫通ドメインには荷電アミノ酸は含まれず、細胞内領域には免疫受容体チロシンスイッチングモチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＳＭ）を含有し、該当モチーフは、アダプタータンパク質ＳＡＰ、ＥＡＴ－２、ＤＲＴなどの細胞質ＳＨ２領域によって認識される。２Ｂ４架橋はＩＴＳＭのチロシンをリン酸化し、アダプタータンパク質を動員し、ここで、２Ｂ４がＳＡＰと形成された複合体は、ＮＫ細胞を活性化することができる。２Ｂ４は独立した受容体ではなく、ＮＫ細胞のヘルパー活性化受容体として、その開始は他のＮＣＲ受容体との共同作用に依存する。２Ｂ４のリガンドはＣＤ４８であり、造血細胞株及び一部のＢリンパ球で高度に発現する。したがって、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子はＣＤ４８である。

【0027】

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＤＮＡＭ－１に結合する分子である。ＣＤ２２６とも呼ばれるＤＮＡＭ－１は、ＮＫ細胞機能を開始する主要な共活性化受容体である。ＤＮＡＭ－１には、２つの免疫グロブリンＶ様ドメインの細胞外ドメイン、１つの膜貫通ドメイン及びチロシンとセリン残基の潜在的なリン酸化部位を含む細胞質ドメインが含まれる。ＤＮＡＭ－１は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、顆粒球及び血小板を含むさまざまな血液細胞に発現する。ＤＮＡＭ－１は、ＣＤ１５５及びＣＤ１１２の共通の受容体である。ＣＤ１１２は、ヒトネクチン（ｎｅｃｔｉｎ）ファミリーに属する単純ヘルペスウイルス受容体であり、Ｃａ^２＋非依存性ＩｇＳＦ接着分子であり、そのファミリーメンバーは同種または異種の形態を介して相互作用し、細胞間接着を引き起こす。ＣＤ１５５は、ネクチン様分子５（ｎｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５、（ＮＥＣＬ５）とも呼ばれるネクチンと構造が似ている。したがって、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＣＤ１１２及びＣＤ１５５から選択される。

【0028】

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＣＤ２に結合する分子である。ＬＦＡ－２とも呼ばれるＣＤ２は、３２７個アミノ酸から構成される単鎖糖タンパク質であり、成熟Ｔ細胞、ほとんどの胸腺細胞及び一部のＮＫ細胞の表面に発現する。ＣＤ２のリガンドには、ＣＤ５８（ＬＦＡ－３とも呼ばれる）及びＣＤ５９が含まれる。ＣＤ５８は、非造血細胞及び造血細胞の表面に広く発現し、ＣＤ２分子との特異的認識により、イノシトール三リン酸及びジアシルグリセロールの産生を媒介するホスホリパーゼＣγ１を活性化し、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させ、さらにＩＬ－２の転写を相乗的に活性化し、Ｔ細胞の増殖とサイトカインの分泌を促進する。また、ＣＤ５８とＣＤ２分子の相互作用により、ＴＣＲ－ポリペプチド－ＭＨＣ三重複合体の形成も促進され、抗原伝達作用をさらに強化する。研究によると、ＣＤ５８分子の発現が欠如している場合、ＮＫ細胞及びＴ細胞は効果的に活性化されない。ＣＤ５９は分子量が２０ＫＤ程度であって、ＧＰＩによって細胞膜に固定される糖タンパク質である。ＣＤ５９はＣＤ２のＧｌｙ９５付近に結合し、ＣＤ２分子がＴ細胞に結合することで、Ｔ細胞と標的細胞との接着に関与する。研究によると、ＣＤ２上のＣＤ５８とＣＤ５９の結合部位は部分的に重複し、これらは共同でＣＤ２分子の活性化に関与し、相乗的にリンパ球の増殖を促進する。したがって、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＣＤ５８及びＣＤ５９から選択される。

【0029】

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＬＦＡ－１に結合する分子である。ＬＦＡ－１は、非共有結合によって連結された２つのポリペプチド鎖で構成される：αサブユニット（ＣＤ１１ａ）とβサブユニット（ＣＤ１８）。ＬＦＡ－１のリガンドには、免疫グロブリンスーパーファミリーＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３のメンバーが含まれ、これらは細胞間の接着分子であり、白血球を損傷部位の上皮細胞に位置決定及び接着することに重要な役割を果たす。ＩＣＡＭ１は、リンパ球、内皮細胞、単球、腫瘍細胞のようなさまざまな細胞で発現することができ、サイトカインによって誘導されて調節・制御される。ＩＣＡＭ２は白血球、内皮細胞、血小板に発現し、ＩＣＡＭ３は白血球にのみ発現し、どちらもサイトカイン誘導によって調節・制御されない。３つのリガンドはそれぞれ、ＬＦＡ－１のαサブユニット内の異なる領域に結合する。ＩＣＡＭ分子とＬＦＡ－１との相互結合は、細胞毒性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を介した免疫殺傷に必要な共刺激シグナルを提供し、それによって免疫応答を活性化する。その中で、ＩＣＡＭ－１は二量体の形で発現し、ＬＦＡ－１との親和性が最も高い。研究によると、ＩＣＡＭ－１は結腸直腸がん細胞に対するＮＫＧ２Ｄを介したＮＫ細胞の殺傷効果を高めることができる。したがって、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３から選択される。

【0030】

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＩＦＮγシグナル伝達経路に関連する分子である。ＩＦＮγは、マクロファージの活性化、ＮＫ細胞の活性化、Ｂ細胞及びＴ細胞の分化、さまざまな細胞型におけるＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子の発現のアップレギュレーションを含む、免疫応答の開始及びエフェクター段階で重要な役割を果たす。ＩＦＮγ受容体には、α（ＩＦＮＧＲ１）とβ（ＩＦＮＧＲ２）の２つのサブユニットが含まれ、どちらもクラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーに属し、それぞれ２つの細胞外フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む。ＩＦＮＧＲ１の細胞内ドメインには、キナーゼＪＡＫ１とシグナル伝達及び転写調節因子ＳＴＡＴ１に結合するドメインが含まれているが、ＩＦＮＧＲ２の細胞内ドメインには、キナーゼＪＡＫ２に結合してシグナル伝達に関与するドメインが含まれる。ＮＫ細胞殺傷過程中に大量のＩＦＮγが放出され、それは腫瘍細胞の表面のＩＦＮγＲに結合してＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を活性化し、それによってＮＫ細胞を活性化し、さらに腫瘍細胞の殺傷を誘導する。したがって、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＳＴＡＴ１、ＪＡＫ１、ＩＦＮＧＲ２、ＪＡＫ２及びＩＦＮＧＲ１から選択される。

【0031】

したがって、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ２及びＬＦＡ－１から選択されるＮＫ活性化受容体に結合する。好ましくは、前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ２及びＬＦＡ－１から選択されるＮＫ活性化受容体に結合する。別の実施形態において、ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＩＦＮγシグナル伝達経路に関連する分子である。したがって、一実施形態において、前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、Ｒａｅ－１、Ｈ６０、ＭＵＬＴ１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＧ６、ＰｆＥＭＰ１、ＨＳＰＧＳ、ＡＩＣＬ、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、ＳＴＡＴ１、ＪＡＫ１、ＩＦＮＧＲ２、ＪＡＫ２及びＩＦＮＧＲ１から選択される。好ましくは、前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＤ５８、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３から選択される。

【0032】

一実施形態において、前記ＮＫ活性化受容体結合分子はまた、例えば、ＣＤ１１１、ＣＤ１１３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ７、ＳＭＡＰ２、ＩＬ２３Ｒ、ＰＣＧＦ５、ＤＥＴ１、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＤ８４、ＣＡＤＭ１、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＢＴＮ３Ａ３、ＣＤ４７、ＣＴＳＳ、ＮＴＲＫ２、ＲＴＰ４、ＴＬＲ３／ＣＤ２８３、ＴＭＥＭ１４０、ＴＭＰＲＳＳ３、ＢＳＴ２／ＣＤ３１７、ＢＴＮ３Ａ１、ＣＤ４０、ＥＰＳＴ１１、ＥＲＡＰ１、ＥＲＡＰ２、ＧＪＤ３、ＨＣＰ５、ＩＦＩ６、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｃ１ＱＢＰ、ＣＤ２４、ＣＤ５５、ＣＤ９、ＧＪＡ１、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＭＭＲ、ＩＧＳＦ５、ＳＹＮＧＲ３、ＴＦＲＣ／ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＴＭＥＭ６８、ＴＭＥＭ９７、ＡＮＫＲＤ２７などを含むが、これらに限定されない他の既知のＮＫ活性化リガンドであってもよい。
ＭＨＣ関連遺伝子

【0033】

主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）は元々、移植反応において主要な役割を果たすタンパク質として特徴づけられ、すべての高等脊椎動物の表面に発現し、マウスではＨ－２と呼ばれ、ヒト細胞ではＨＬＡと呼ばれる。ＭＨＣは主にクラスＩとクラスＩＩの２種類がある。クラスＩ ＭＨＣタンパク質は、２種のタンパク質のヘテロダイマーであり、一種はＭＨＣＩ遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質α鎖であり、もう一種はＭＨＣ遺伝子クラスター内にない遺伝子によってコードされる細胞外タンパク質のβ２ミクロスフェアタンパク質鎖である。α鎖は３つのドメインを含み、外来ペプチドが２つのＮ末端の最も変化しやすいドメインα１、α２に結合する。クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質もヘテロダイマーであり、ＭＨＣ複合体内の遺伝子によってコードされる２つの膜貫通タンパク質を含む。クラスＩ ＭＨＣ／抗原複合体は細胞毒性Ｔ細胞と相互作用し、クラスＩＩ ＭＨＣはヘルパーＴ細胞に抗原を伝達する。また、クラスＩ ＭＨＣタンパク質は、ほぼすべての有核細胞と血小板（及びマウスの赤血球）で発現する傾向があるが、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質はより選択的に発現する。一般的に、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質は、Ｂ細胞、一部のマクロファージと単球、ランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌ）、樹状細胞に発現する。

【0034】

ヒトクラスＩ ＨＬＡ遺伝子クラスターは、３つの主要遺伝子座Ｂ、Ｃ及びＡを含む。クラスＩ分子はＭＨＣα重鎖（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃによってコードされる）及び軽鎖（β－２微球タンパク質、Ｂ２Ｍによってコードされる）で構成されるヘテロダイマーである。重鎖は膜に固定されており、約４５ｋＤａであり、８つのエクソンを含む。エクソン１はリーダーペプチドをコードし、エクソン２及び３はα１及びα２ドメインをコードし、両方ともペプチドに結合し、エクソン４はα３ドメインをコードし、エクソン５は膜貫通領域をコードし、エクソン６及び７は細胞質尾部をコードする。エクソン２及びエクソン３内の多型は、各クラスの分子のペプチド結合特異性をもたらす。したがって、一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされるとは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＢ２Ｍから選択される１つ以上の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを指す。

【0035】

ヒトクラスＩＩ ＨＬＡクラスターも、ＤＰ、ＤＱ、ＤＲの３つの主要な遺伝子座を含み、クラスＩクラスター及びクラスＩＩクラスターの両方とも多型である。クラスＩＩ分子は、外因性ペプチドを伝達することにより免疫系で主要な役割を果たし、主に抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、樹状細胞、マクロファージ）で発現する。クラスＩＩ分子は、いずれも膜に固定されているα鎖とベータ鎖からなるヘテロダイマーであり、α鎖は約３３～３５ｋＤａで、５つのエクソンを含む。エクソン１はリーダーペプチドをコードし、エクソン２及び３は２つの細胞外領域をコードし、エクソン４は膜貫通ドメインをコードし、エクソン５は細胞質尾部をコードする。したがって、一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされるとは、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲＡから選択される１つ以上の遺伝子の発現が阻害されまたはサイレンシングされることを指す。

【0036】

クラスＩ及びＩＩ ＭＨＣの発現は、多種の補助タンパク質にも依存する。例えば、Ｔａｐ１及びＴａｐ２サブユニットは、ペプチド抗原をクラスＩ ＨＬＡ複合体にロードするために必要なＴＡＰトランスポーター複合体の一部である。ＬＭＰ２及びＬＭＰ７プロテアソームサブユニットは、抗原タンパク質をペプチドに加水分解してＨＬＡで表示する役割を果たす。ＬＭＰ７を減少させると、細胞表面でのＩクラスＭＨＣの発現量が減少することが示された。ＩＩクラスＭＨＣの発現は、ＲＦＸ複合体、ＣＩＩＴＡなどのいくつかの陽性モジュレーターによって誘導及び発現される。ＲＦＸ複合体は、ＲＦＸＡＮＫ（ＲＦＸＢとも呼ばれる）、ＲＦＸ５及びＲＦＸアクセサリタンパク質（ＲＦＸＡＰとも呼ばれる）の３つのサブユニットで構成されている。ＲＦＸ複合体は、他の転写因子とＭＨＣクラスＩＩ分子のプロモーターとの結合を促進し、プロモーター結合の特異性を高めることにより、ＩＩクラスＭＨＣ分子の発現を促進する。ＣＩＩＴＡは、ＩＩクラスＭＨＣ発現のマスターコントローラーである。ＣＩＩＴＡは、酸性アミノ酸に富むＮ末端と、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒに富むＰＳＴ領域と、中央のＧＴＰ結合領域と、Ｌｅｕリピート配列（ＬＲＲ）に富むＣ末端とを含み、Ｎ端酸性領域とＰＳＴ領域は転写活性化領域である。したがって、一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされるとは、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ及びＣＩＩＴＡから選択される１つ以上の遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされることを指す。

【0037】

したがって、一実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２ＭのようなＭＨＣクラスＩ分子；ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡのようなＭＨＣクラスＩＩ分子；及びＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡのようなＭＨＣ補助タンパク質から選択され、好ましくは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択される。別の好ましい実施形態において、ＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡのようなＭＨＣ ＩＩクラス分子及びＭＨＣ補助タンパク質から選択される。
操作された免疫細胞

【0038】

本明細書で使用される用語「免疫細胞」とは、免疫系の１種以上のエフェクター機能（例えば、細胞毒性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する任意の細胞を指す。例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞または幹細胞由来（例えば、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞）から由来の免疫細胞であることができる。好ましくは、免疫細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞であって、例えば、インビトロで培養されたＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞またはインビトロで培養されたＴ細胞株から由来のＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１などのＴ細胞または被験者から得られたＴ細胞であってもよい。被験者の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織及び腫瘍のような多種の供給源から入手できる。Ｔ細胞は濃縮されまたは精製されることもできる。Ｔ細胞はすべての発育段階にあり得、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞などを含むが、これらに限定されない。一好ましい実施形態において、免疫細胞は、ヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ分離などの当業者で既知の様々な技術を使用して被験者の血液から得ることができる。

【0039】

本発明の操作された免疫細胞が免疫認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体）を発現する場合、当技術分野で知られている従来の方法（例えば、形質導入、トランスフェクション、形質転換など）によって前記免疫認識受容体を免疫細胞に導入することができる。「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に導入するプロセスである。例えば、ＲＮＡトランスフェクションの場合、ＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入するプロセスである。該当用語は、主に真核細胞での非ウイルス法に使用される。「形質導入」という用語は、通常、ウイルスを介した核酸分子又はポリヌクレオチドの転移を説明するために使用される。動物細胞のトランスフェクションは、通常、細胞膜に一過性の細孔又は「穴」を開いて、物質の取り込みを可能にすることに関するものである。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを使用して、エレクトロポレーションにより、細胞を圧搾することにより、或いは、カチオン性脂質を材料と混合してリポソーム（細胞膜と融合し、その運搬物を内部に沈着させる）を製造することにより、実施することができる。真核生物宿主細胞をトランスフェクトするための例示的な技術には、脂質小胞媒介取り込み、熱ショック媒介取り込み、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿）、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーション穿孔が含まれる。「形質転換」という用語は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）の、細菌への、又は非動物の真核細胞（植物細胞を含む）への、非ウイルス性転写を説明するために使用される。したがって、形質転換とは、細菌又は非動物の真核細胞の、その周囲からの細胞膜を介した直接取り込み、それに続く外因性遺伝物質（核酸分子）の取り込みから生じる遺伝学的変化である。形質転換は、人工的手段で実現される。形質転換が起こるためには、細胞又は細菌がコンピテンスの状態になければならない。原核生物の形質転換の技術に、熱ショック媒介取り込み、傷細胞との細菌プロトプラストと無融合、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含み得る。

【0040】

一実施形態において、少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子の発現が阻害またはサイレンシングされることに加えて、本発明の操作された免疫細胞は、少なくとも１つのＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされるものをさらに含むことができる。

【0041】

Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）は、すべてのＴ細胞の表面にある特徴的なマーカーであり、非共有結合によってＣＤ３に結合してＴＣＲ／ＣＤ３複合体を形成し、抗原提示細胞の表面にある特異性のＭＨＣ－抗原ペプチド複合体と結合することにより、特異性抗原刺激シグナルが発生し、Ｔ細胞が活性化され、殺傷効果が発揮される。ＴＣＲは２つの異なるペプチド鎖で構成されるヘテロダイマーであり、通常はα／β型とγ／δ型の２つのカテゴリーに分けられ、末梢Ｔリンパ球の９５％以上がＴＣＲα／βを発現する。ＴＣＲα鎖はＴＲＡＣ遺伝子によってコードされ、β鎖はＴＲＢＣ遺伝子によってコードされる。ＴＣＲの各ペプチド鎖は、可変領域（Ｖ領域）、定常領域（Ｃ領域）、膜貫通領域及び細胞質領域を含み、細胞質領域が非常に短く、抗原刺激シグナルを伝達する能力をもたない。ＴＣＲ分子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、その抗原特異性がＶ領域に存在する。Ｖ領域には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つの超可変領域があり、そのうち、ＣＤＲ３は、ＴＣＲの抗原結合特異性を直接決定できるように変異が最も大きい。ＴＣＲがＭＨＣ－抗原ペプチド複合体を認識するとき、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２はＭＨＣ分子を認識してそれと結合し、ＣＤＲ３は抗原ペプチドに直接結合する。ＣＤ３は、γ、δ、ε及びζの４種のサブユニットを含み、通常、ダイマーεγ、εδ及びζζの形で存在する。この４種のサブユニットは、いずれも保守的な免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）を含み、そのうちの２つのチロシン残基がチロシンプロテインキナーゼによってリン酸化されてＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。したがって、一実施形態において、ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ及びそれらの組み合わせから選択される。

【0042】

一好ましい実施形態において、本発明の操作された免疫細胞の少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子、少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子及び少なくとも１つのＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされ、ここでＭＨＣ関連遺伝子、ＮＫ活性化受容体結合分子及びＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は上記のように定義される。一好ましい実施形態において、本発明の操作された免疫細胞の少なくとも１つのＭＨＣ関連遺伝子、少なくとも１つのＮＫ活性化受容体結合分子及び少なくとも１つのＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされ、ここでＭＨＣ関連遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択され、前記ＮＫ活性化受容体結合分子は、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ４８、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＤ５８、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３及びそれらの組み合わせから選択され、ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ及びそれらの組み合わせから選択される。

【0043】

一実施形態において、本発明の操作された免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ及び免疫チェックポイント遺伝子（例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が阻害またはサイレンシングされるものをさらに含む。

【0044】

遺伝子の発現を阻害または遺伝子をサイレンシングする方法は、当業者に周知である。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ケモカインリガンド、抗感染細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖｓ）、ヌクレオシドアナログ（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ジヌクレオチド（ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及び化学剤）及びプロテアーゼ阻害剤を使用して遺伝子発現を阻害することができる。さらに、遺伝子サイレンシングはまた、例えば、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＣａｓ酵素媒介によるＤＮＡフラグメント化によって、行われる。

【0045】

一実施形態において、前記操作された細胞は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む免疫認識受容体をさらに発現する。好ましくは、前記免疫認識受容体は、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体である。より好ましくは、前記免疫認識受容体は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体である。

【0046】

Ｔ細胞受容体またはＴＣＲは上記のように定義される。本発明において、ＴＣＲは、異種リガンド結合ドメイン（例えば、抗体）を含み得る組換えＴＣＲである。

【0047】

本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、人工的に構築されたハイブリッドポリペプチドを指し、ハイブリッドポリペプチドは一般的に１つ以上のリガンド結合ドメイン（例えば、抗体の抗原結合部分）、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、各ドメインはリンカーによって連結されている。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、Ｔ細胞及び他の免疫細胞の特異性と反応性を非ＭＨＣ制限的な方法で選択された標的に再指定することができる。非ＭＨＣ制限抗原認識は、ＣＡＲを発現する細胞が抗原治療とは無関係に抗原を認識する能力を提供し、腫瘍逃避の主要なメカニズムを回避できる。また、Ｔ細胞内で発現される場合、ＣＡＲは有利に内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖とβ鎖と二量体化されない。

【0048】

本明細書で使用される「リガンド結合ドメイン」は、リガンド（例えば、抗原）に結合できる任意の構造またはその機能的変異体を指す。リガンド結合ドメインは抗体構造であり得、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体及びそれらの機能的フラグメントを含むが、これらに限定されない。例えば、リガンド結合ドメインは、抗体全体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＨまたはＶＬ）、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｎｂ）、組換えフィブロネクチンドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎ及びＤＡＲＰＩＮなどを含むが、これらに限定されない。好ましくは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びナノ抗体から選択される。本発明において、リガンド結合ドメインは、一価または二価であり得、そして単一特異性、二重特異性または多重特異性の抗体であり得る。

【0049】

「Ｆａｂ」は、パパインによる免疫グロブリン分子の切断時に生成される２つの同じのフラグメントのいずれかを指し、ジスルフィド結合によって連結された完全な軽鎖及び重鎖のＮ末端部分からなり、ここで重鎖のＮ末端部分は、重鎖可変領域とＣＨ１を含む。完全なＩｇＧと比較して、ＦａｂにはＦｃフラグメントがなく、移動度と組織浸透性が高く、抗体効果を媒介することなく抗原に一価で結合できる。

【0050】

「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、リンカーによって連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）から構成される抗体である。リンカーの最適な長さ及び／又はアミノ酸組成を選択することができる。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域折り畳みと相互作用に大きく影響する。実際、比較的に短いリンカー（例えば、５～１０個アミノ酸）を使用すれば、鎖内の折り畳みを防ぐことができる。リンカーのサイズと組成の選択については、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、米国特許出願公開２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４及びＰＣＴ出願公開ＷＯ２００６／０２０２５８及びＷＯ２００７／０２４７１５を参照でき、そのすべての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ｓｃＦｖは、任意の順でリンクされたＶＨ及びＶＬを含み、例えば、ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨを含むことができる。

【0051】

「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」は、１つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）及び２つの従来のＣＨ２及びＣＨ３領域のみを含む軽鎖が天然に欠損している抗体を指し、「重鎖抗体」とも呼ばれる。

【0052】

「ナノ抗体」または「Ｎｂ」は、元の重鎖抗体と同じ構造安定性及び抗原結合活性を有し、標的抗原に結合できる既知の最小単位である、単一にクローンし及び発現されたＶＨＨ構造を指す。

【0053】

用語「機能的変異体」または「機能的フラグメント」は、基本的に親アミノ酸配列を含むが、該親アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾（即ち、置換、欠失または挿入）を含む変異体を指す。前記変異体が親アミノ酸配列の生物学的活性を保持することを条件とする。例えば、抗体の場合、その機能的フラグメントはその抗原結合部分である。一実施形態において、好ましくは、前記アミノ酸修飾は、保存的修飾である。

【0054】

本明細書で使用される用語「保存的修飾」は、該アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に顕著に影響を与えたり、変更したりしないアミノ酸修飾を指す。これらの保存的修飾は、アミノ酸の置換、追加及び欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発のような当分野で既知の標準的な技術によって、本発明のキメラ抗原受容体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。保存的修飾は、例えば、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は関与する残基の両親媒性の類似性に基づいて選択することができる。

【0055】

したがって、「機能的変異体」または「機能的フラグメント」は、親アミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、親アミノ酸の生物学的活性、例えば、結合活性を保持する。

【0056】

本明細書で使用される用語「配列同一性」は、２つの（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列がアラインメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する度合いを指し、通常、パーセンテージで表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全長にわたって決定される。したがって、まったく同じ配列の２つのコピーは、１００％の同一性を有する。当業者は、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷのようにいくつかのアルゴリズムが標準的なパラメータを使用して配列の同一性を決定するために使用され得ることを認識した。

【0057】

リガンド結合ドメインの選択は、認識する、具体的な病状に関連する標的細胞における細胞表面マーカー、例えば、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原によって決まる。したがって、一実施形態において、本発明のリガンド結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の標的に結合される。好ましくは、前記標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＡＰ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＡＩＸ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＣ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択される。標的化される抗原に応じて、本発明のＣＡＲは、抗原に特異的なリガンド結合ドメインを含むように設計することができる。例えば、ＣＤ１９が標的化される抗原である場合、ＣＤ１９抗体は本発明のリガンド結合ドメインとして使用されることができる。

【0058】

本明細書で使用される用語「膜貫通ドメイン」は、免疫細胞（例えば、リンパ球、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞）の表面でキメラ抗原受容体の発現を可能にし、標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指示するポリペプチド構造を指す。膜貫通ドメインは、天然のものまたは合成のものであり得、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、キメラ抗原受容体が標的抗原に結合するときにシグナル伝達を行うことができる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及び機能的フラグメントに由来し得る。或いは、膜貫通ドメインは合成のものであり得、ロイシン及びバリンのような疎水性残基を主に含み得る。好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖に由来する。

【0059】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含み得る。本明細書で使用される用語「ヒンジ領域」は、一般的に、膜貫通ドメインをリガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。具体的には、ヒンジ領域は、リガンド結合ドメインにより高い柔軟性とアクセス可能性を提供するためのものである。ヒンジ領域は、最大３００アミノ酸含み得、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含む。ヒンジ領域は、全部または一部が天然分子に由来し得、例えば、全部または一部がＣＤ８、ＣＤ４またはＣＤ２８の細胞外領域に由来し、或いは、全部または一部が抗体定常領域に由来する。或いは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、或いは、合成されたヒンジ配列であってもよい。好ましい実施形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８α鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のヒンジ領域部分を含み、より好ましくは、ＣＤ８αヒンジを含む。

【0060】

本明細書で使用される用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能的シグナルを伝達し、細胞に特定の機能を実行することを指示するタンパク質部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、リガンド結合ドメインが抗原に結合した後の一次細胞内シグナル伝達に関与し、免疫細胞と免疫応答の活性化をもたらす。言い換えれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化することに関与する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。

【0061】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体に含まれる細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原受容体結合後に一緒に作用して一次シグナル伝達を開始する、Ｔ細胞受容体及び共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体及び同じまたは類似の機能を有する任意の合成配列であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、多数の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆｓ、ＩＴＡＭ）を含むことができる。本発明の細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例として、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものを含む。好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。

【0062】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、１つ以上の共刺激ドメインを含む。共刺激ドメインは、共刺激分子からの細胞内機能的シグナル伝達ドメインであり得、前記共刺激分子の細胞内部分全体またはその機能的フラグメントを含む。「共刺激分子」は、Ｔ細胞において共刺激リガンドに特異的に結合することによりＴ細胞の共刺激応答（例えば、増殖）を媒介する同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、クラス１ ＭＨＣ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、これらに限定されない。本発明の共刺激ドメインの非限定的な例として、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ及びＺＡＰ７０のタンパク質に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明ＣＡＲの共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０またはその組み合わせに由来するものである。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８または４－１ＢＢ＋ＣＤ２８共刺激ドメインを含む。

【0063】

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含み得、これにより、Ｔ細胞のような細胞で発現される場合、新生タンパク質が小胞体にガイドされ、続いて細胞表面にガイドされる。シグナルペプチドのコアは、長い疎水性アミノ酸セグメントを含むことができ、単一のα－ヘリックスを形成する傾向がある。シグナルペプチドの末端には、一般的に、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸セグメントがある。シグナルペプチダーゼは、転座中または転座後に切断して、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質を生成することができる。そして、遊離シグナルペプチドは特定のプロテアーゼによって消化される。本発明において有用なシグナルペプチドは、当業者で周知のものを用い、例えば、ＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＧＭ－ＣＳＦＲαなどに由来するシグナルペプチドが挙げられる。

【0064】

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲの発現時間を調節・制御するためのスイッチ構造をさらに含むことができる。例えば、スイッチ構造は、ダイマー化ドメインの形をとることができ、それと対応するリガンドに結合することによってコンフォメーション変化を誘発し、細胞外結合ドメインを露出させて標的抗原に結合させ、それによってシグナル伝達経路を活性化する。或いは、スイッチドメインを使用して、それぞれ結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインと接続してもよく、スイッチドメインが互いに結合する場合だけ（例えば、誘導化合物の存在下で）、結合ドメインとシグナル伝達ドメインとがダイマーによって連結され、シグナル伝達経路を活性化することができる。スイッチ構造は、マスキングペプチドの形態であり得る。マスキングペプチドは、細胞外結合ドメインをマスクして、標的抗原への結合を阻止することができ、マスキングペプチドが、例えば、プロテアーゼによって切断されると、細胞外結合ドメインが露出され、「通常」のＣＡＲ構造となることができる。当業者に知られている各種のスイッチ構造も本発明に使用することができる。

【0065】

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、自殺遺伝子を含み得、即ち、外因性物質によって誘導され得る細胞死シグナルを発現させ、必要な場合（例えば、重度の毒性副作用が発生した場合）に、ＣＡＲ細胞を除去する。例えば、自殺遺伝子は、ＣＤ２０エピトープ、ＲＱＲ８などの挿入されたエピトープの形をとることができ、必要に応じて、これらのエピトープを標的とする抗体または試薬を加えることによりＣＡＲ細胞を排除することができる。自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）であってもよく、この遺伝子により、ガンシクロビル治療によって誘発されて細胞死を引き起こすことが可能である。自殺遺伝子はｉＣａｓｐａｓｅ－９であってもよく、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７などの化学誘導薬によってダイマー化するように誘導して、下流のＣａｓｐａｓｅ３分子を活性化してアポトーシスを引き起こすことが可能である。当業者に知られている各種の自殺遺伝子を本発明に使用することができる。
医薬組成物

【0066】

本発明は、活性剤とする本発明に記載の操作された免疫細胞及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。したがって、本発明は、医薬組成物または薬物の製造における前記操作された免疫細胞の用途をさらに包含する。

【0067】

本明細書で使用される用語「薬学的に許容される賦形剤」は、被験者及び有効成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合（即ち、望ましくない局所効果または全身効果を引き起こすことなく所望の治療効果を引き出すことができる）する担体及び／又は賦形剤を指し、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照）。薬学的に許容される賦形剤の例として、充填剤、結合剤、崩壊剤、被覆剤、吸着剤、付着防止剤、流動促進剤、抗酸化剤、香味剤、着色剤、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、防腐剤、乳化剤、コーティング剤、等張化剤、吸収遅延剤、安定剤および張性調整剤が含まれるが、これに限定されない。本発明の所望の医薬組成物を製造するために適切な賦形剤を選択することは当業者で周知のことである。本発明の医薬組成物に使用する例示的な賦形剤として、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース及び水が含まれる。一般に、適切な賦形剤の選択は、使用される活性剤、治療される疾患及び医薬組成物の所望の剤形に特に依存する。

【0068】

本発明による医薬組成物は、多種の経路による投与に適する。通常、投与は非経口的に行われる。非経口送達方法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、心室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下または鼻腔内の投与を含む。

【0069】

本発明による医薬組成物は、固体、液体、気体または凍結乾燥の形態のような各種の形態に製造することができる。特に、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉末、錠剤、溶液、エアロゾル、顆粒、丸剤、懸濁液、乳濁液、カプセル、シロップ、エリキシル剤、エキス剤（ｅｘｔｒａｃｔ）、チンキ剤または液体エキス抽出物の形態または必要な投与方法に特に適するの形態である。本発明の既知の、医薬品を製造するためのプロセスは、例えば、通常の混合、溶解、造粒、糖衣製造、研磨、乳化、カプセル化、包埋または凍結乾燥のプロセスを含む。本明細書に記載される免疫細胞を含む医薬組成物は、通常、溶液の形態で提供され、好ましくは、薬学的に許容される緩衝剤を含む。

【0070】

本発明による医薬組成物は、疾患の治療及び／又は予防に適する１種以上の他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。組み合わせに適する薬剤の好ましい例として、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラチェルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムフォトフリンＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ビンクリスチンおよびドキソルビシン；リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅのようなペプチド細胞毒素；ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イリジウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５及びアスタチン２１３のような放射性核種；抗体指向酵素プロドラッグのようなプロドラッグ；血小板第４因子、黒色腫成長刺激タンパク質のような免疫刺激剤；抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントのような抗体またはそのフラグメント、補体活性化因子、異種タンパク質ドメイン、相同タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメインおよびウイルス／細菌ペプチドのような既知の抗がん剤が含まれる。また、本発明の医薬組成物は、化学療法、放射線療法のような１種以上の他の治療方法と組み合わせて使用することもできる。
治療への応用

【0071】

本発明は、有効量の本発明に記載の操作された免疫細胞または医薬組成物を前記被験者に投与することを含む、がん、感染症または自己免疫疾患に罹患している被験者を治療する方法をさらに提供する。したがって、本発明は、がん、感染症または自己免疫疾患を治療するための薬物の製造における前記操作された免疫細胞または医薬組成物の用途をさらに包含する。
一実施形態において、有効量の本発明の免疫細胞及び／又は医薬組成物を被験者に直接投与する。

【0072】

他の一実施形態において、本発明の治療方法は、エクスビボ治療である。具体的には、この方法は、（ａ）免疫細胞を含むサンプルを提供するステップ；（ｂ）前記免疫細胞の少なくとも１種のＮＫ活性化受容体結合分子及び少なくとも１種のＭＨＣ関連遺伝子（及び任意のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子及び／又は他の遺伝子）の発現を、インビトロで阻害またはサイレンシングし、任意の免疫認識受容体（好ましくはキメラ抗原受容体）を前記免疫細胞に導入し、改変された免疫細胞を取得するステップ；及び（ｃ）前記改変された免疫細胞を被験者に投与するステップを含む。好ましくは、ステップ（ａ）で提供される免疫細胞は、マクロファージ、樹状細胞、単球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞から選択される。そして、前記免疫細胞は、当分野で既知の通常の方法によって、被験者のサンプル（特に血液サンプル）から得ることができる。また、免疫細胞は、一般に、被験者の免疫系に適合するものを選択し、即ち、前記免疫細胞は、免疫原性応答を誘発しないものが好ましい。例えば、「汎用レシピエント細胞」を使用でき、即ち、所望の生物学的エフェクター機能的を実行する、普遍的に適合し、インビトロで成長及び増幅できるリンパ球を使用することができる。このような細胞の使用は、被験者自身のリンパ球を取得及び／又は提供することが不要である。ステップ（ｃ）のエクスビボ導入は、エレクトロポレーションを介して本明細書に記載の核酸またはベクターを免疫細胞に導入し、或いは、免疫細胞をウイルスベクターで感染させることによって実施することができる。前記ウイルスベクターは、前述のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。他の方法として、トランスフェクション試薬（例えば、リポソーム）または一過性ＲＮＡトランスフェクションの使用もある。

【0073】

一実施形態において、前記免疫細胞は、同種異系細胞であり、好ましくはＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、または、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞であり、より好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。

【0074】

本明細書において、「同種異系」という用語は、任意の材料が、該材料を導入する個体と同じ種で異なる動物または異なる患者に由来するものであることを指す。１つ以上の遺伝子座における遺伝子が異なる場合、２つ以上の個体は互いに同種異系のものであると見なされる。場合によっては、同じ種の各個体からの同種異系材料の遺伝子上の異なりは、抗原相互作用を発生させるのに十分である。

【0075】

本明細書で使用される用語「被験者」は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例示に限定されない。ヒト以外の哺乳動物を、がんの動物モデルである被験者として有利に使用することができる。好ましくは、前記被験者は、ヒトである。

【0076】

一実施形態において、前記がんは、リガンド結合ドメインと結合する標的の発現に関連するがんである。例えば、前記がんは、脳神経膠腫、芽細胞腫、肉腫、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳及びＣＮＳがん、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、絨毛膜がん、結腸がん及び直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん（胃腸がんを含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、肝臓がん、肝細胞腫瘍、上皮内腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、肝臓腫瘍、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、扁平上皮がん）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん（例えば、唇、舌、口、咽頭）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、中皮腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん、呼吸器系のがん、唾液腺がん、皮膚がん、扁平細胞がん、胃がん、睾丸がん、甲状腺がん、子宮がんまたは子宮内膜がん、泌尿器系の悪性腫瘍、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、リンパ腫（ホジキンリンパ腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等度／濾胞性ＮＨＬ、中等度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小非切断細胞ＮＨＬ、バルキーＮＨＬを含む）のような非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍など）を含む）、白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（未分化及び部分分化を含む）のような急性非リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、赤白血病、急性巨核球性白血病のような急性白血病と、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性単球性白血病のような慢性白血病と及び有毛細胞白血病、前リンパ性白血病細胞性白血病、形質細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病、好酸球性白血病、好塩基性白血病のような他の特殊なタイプの白血病とを含む）、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍、悪性リンパ増殖性疾患、骨髄形成異常、多発性骨髄腫、骨髄異形成、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）及びその他の標的発現に関連する疾患を含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の操作された免疫細胞または医薬組成物で治療することができる疾患は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成、脳神経膠腫、膵臓がん、卵巣がん、中皮腫、乳がん、肺がん、前立腺がん、黒色腫、骨髄腫、肉腫、胃がんなどから選択される。

【0077】

一実施形態において、前記感染は、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫によって引き起こされる感染症を含むが、これらに限定されない。

【0078】

一実施形態において、前記自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、セリアック病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎症、悪性貧血及び全身性エリテマトーデスなどを含むが、これらに限定されない。

【0079】

一実施形態において、前記方法は、１種以上の追加の化学療法剤、生物学的薬剤、薬物または治療を前記被験者に投与することをさらに含む。この実施形態において、化学療法剤、生物学的薬剤、薬物または治療は、放射線療法、外科手術、抗体剤及び／又は小分子、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0080】

以下、図面を参照しながら例を挙げて本発明を詳細に説明する。なお、当業者は、添付の図面及び実施例は、例示的なものにすぎず、本発明を限定するものではない。本出願の実施例及び実施例の特徴は、矛盾がない限り、互いに組み合わせることができる。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1】Ｔ細胞表面のＮＫ活性化受容体結合分子の発現レベルを示す。

【図2】ＮＫ細胞殺傷効果に対する本発明のＤＫＯ－Ｔ細胞の阻害効果を示す。

【図3】ＮＫ細胞殺傷効果に対する本発明のＱＫＯ－Ｔ細胞の阻害効果を示す。

【図4】本発明のＣＡＲ－ｄＫＯ及びＣＡＲ－ｓＫＯ Ｔ細胞のｓｃＦｖ発現レベルを示す。

【図5】標的細胞に対する本発明のＣＡＲ－ｄＫＯ及びＣＡＲ－ｓＫＯ Ｔ細胞の殺傷効果を示す。

【図6】本発明のＣＡＲ－ｄＫＯ及びＣＡＲ－ｓＫＯ Ｔ細胞と標的細胞との共培養後のサイトカインの放出レベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0082】

本発明のすべての実施例で使用されたＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、アイテム番号 １７－５４４２－０２）による白血球アフェレーシスを利用して健康なドナーから単離された初代ヒトＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であった。
実施例１．ＮＫ活性化受容体結合分子の発現レベル

【0083】

ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、アイテム番号 ４０２０３Ｄ）でＴ細胞を活性化し、３７℃及び５％ＣＯ_２条件下で、培養した。異なる培養時点でＴ細胞を収集し、さまざまなＮＫ活性化受容体結合分子の発現レベルをフローサイトメトリー法で検出した。結果は、図１に示したとおりである。

【0084】

図１から分かるように、ＮＫ活性化受容体結合分子ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ４８、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＤ５８は、Ｔ細胞上で構成的または誘導的に発現する。
実施例２．ＭＨＣ関連遺伝子及びＮＫ活性化受容体結合分子をノックアウトしたＤＫＯ－Ｔ細胞の構築

【0085】

ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、アイテム番号 ４０２０３Ｄ）でＴ細胞を活性化し、３７℃及び５％ＣＯ_２条件下で、３日間培養した。その後、ＢＴＸ Ａｇｉｌｅ Ｐｕｌｓｅ Ｍａｘ エレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）を使用して、４００Ｖ、０．７ｍｓの条件下で、Ｃａｓ９タンパク質１０μｇ、Ｂ２Ｍ ｓｇＲＮＡ ５μｇ及びＮＫ活性化受容体結合分子を標的とするｓｇＲＮＡ ５μｇを、活性化したＴ細胞にエレクトロトランスフェクトして、Ｂ２Ｍ及びＮＫ活性化受容体結合分子がダブルノックアウトされたＤＫＯ－Ｔ細胞を得た。Ｂ２ＭのみのノックアウトＴ細胞（ＫＯ－Ｔ）及びノックアウトなしの野生型Ｔ細胞（ＮＴ）をコントロールとして使用した。本発明で使用されるｓｇＲＮＡ配列を表１に示す。

【0086】

ＤＫＯ－Ｔ、Ｂ２Ｍ－ＫＯ－Ｔ及びＮＴ細胞を３７℃及び５％ＣＯ_２で１１日間培養した後、対応する抗体（表２を参照）を使用して、フローサイトメトリー装置により、Ｂ２Ｍ及びさまざまなＮＫ活性化受容体結合分子の遺伝子ノックアウト効率を検出した。結果は、表３に示したとおりである。

【0087】

表１ 本発明で使用されるｓｇＲＮＡ配列

【0088】

注：ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ遺伝子の高い相同性を考慮して、本実施例で設計されたｓｇＲＮＡはＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ遺伝子の両方を同時にノックアウトできる。

【0089】

表２ フローサイトメトリー法で使用される抗体情報

【0090】

表３ ＤＫＯ－Ｔ細胞における遺伝子ノックアウト効率

実施例３．ＮＫ細胞殺傷効果に対する本発明のＤＫＯ－Ｔ細胞の阻害効果

【0091】

以下の方法に従って、本発明により製造されたＤＫＯ－Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷効果に対する阻害効果を検出した：Ｆａｒ－Ｒｅｄ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アイテム番号 Ｃ３４５６４）で本発明により製造されたＤＫＯ－Ｔ細胞及びＫＯ－Ｔ細胞を標識した。その後、標識されたＤＫＯ－Ｔ細胞及びＫＯ－Ｔ細胞を、１×１０^４個細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートにプレーティングし、２：１のエフェクター－標的比（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔａｒｇｅｔ ｒａｔｉｏ）でＮＫ９２細胞を添加して、共培養した。１６～１８時間後、培養液中のＴ細胞の割合をフローサイトメトリー装置で検出し、ＮＫ細胞の殺傷率を計算した。結果は、図２に示したとおりである。

【0092】

ＨＬＡ（例えば、Ｂ２Ｍ）のみをノックアウトした場合、Ｔ細胞に対するＮＫ細胞の殺傷率が８０％に達することが分かる。これに対して、ＮＫ活性化受容体結合分子（すなわち、本発明のＤＫＯ－Ｔ細胞）のさらなるノックアウトは、この殺傷効果を顕著に阻害することができる。
実施例４．ＴＣＲ、ＭＨＣ関連遺伝子及びＮＫ活性化受容体結合分子がノックアウトされたＱＫＯ－Ｔ細胞の構築

【0093】

ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、アイテム番号 ４０２０３Ｄ）でＴ細胞を活性化し、３７℃及び５％ＣＯ_２条件下で、３日間持続的に培養した。その後、ＢＴＸ Ａｇｉｌｅ Ｐｕｌｓｅ Ｍａｘ エレクトロポレーター（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）を使用して、４００Ｖ、０．７ｍｓの条件下で、Ｃａｓ９タンパク質 １０μｇ、Ｂ２Ｍ ｓｇＲＮＡ ２．５μｇ、ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ ２．５μｇ、ＲＦＸ５ ｓｇＲＮＡ ２．５μｇ及びＣＤ１５５ ｓｇＲＮＡ ２．５μｇを、活性化したＴ細胞にエレクトロトランスフェクトして、Ｂ２Ｍ、ＴＣＲ、ＲＦＸ５、ＣＤ１５５の４つをノックアウトしたＱＫＯ－Ｔ細胞を得た。同様の方法で、Ｂ２ＭをシングルノックアウトしたＫＯ－Ｔ細胞と、Ｂ２Ｍ／ＣＤ１５５をダブルノックアウトしたＤＫＯ－Ｔ細胞を得た。フローサイトメトリー法でこれらの細胞における遺伝子ノックアウト効率を検出した。結果は、以下の表４に示したとおりである。

【0094】

表４ ＱＫＯ－Ｔ細胞における遺伝子ノックアウト効率

【0095】

本発明により製造されたＫＯ－Ｔ細胞及びＱＫＯ－Ｔ細胞における対応する遺伝子が効果的にノックアウトされていることが分かる。その後、実施例３に記載の方法に従って、ＫＯ－Ｔ細胞及び上記で製造したＱＫＯ－Ｔ細胞のＮＫ細胞殺傷効果に対する阻害効果を検出した。結果は、図３に示したとおりである。

【0096】

ＮＫ活性化受容体結合分子、ＴＣＲ遺伝子及び複数のＭＨＣ関連遺伝子を同時にノックアウトされたＱＫＯ－Ｔ細胞も、ＮＫ細胞の殺傷効果を顕著に阻害できることが分かる。
実施例５．ＣＡＲ－ｄＫＯ Ｔ細胞の構築及びその機能の検証
５．１ ＣＡＲ－ｓＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ－ｄＫＯ Ｔ細胞の構築

【0097】

下記タンパク質をコードする配列を合成し、ｐＬＶＸベクターにクローニングした（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ）、アイテム番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）：ＣＤ８α シグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、ＣＤ８αヒンジ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、４－１ＢＢ細胞内領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）であり、シーケンシングにより標的配列が正しく挿入されていることを確認した。

【0098】

Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、アイテム番号 ３１９８５－０７０）３ｍＬを滅菌チューブに加えて上記のプラスミドを希釈し、プラスミド：ウイルスパッケージングベクター：ウイルスエンベロープベクター＝４：２：１の比率に従って、パッケージングベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、アイテム番号 １２２６０）及びエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、アイテム番号 １２２５９）を追加した。その後、１２０μＬ Ｘ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、アイテム番号 ０６３６６２３６００１）を加え、すぐに均一に混合し、室温で１５分間インキュベートしてから、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試薬混合物を２９３Ｔ細胞の培養フラスコに滴下した。ウイルスを２４時間及び４８時間で収集し、合併し、超遠心分離（２５０００ｇ、４℃、２．５時間）して濃縮レンチウイルスを得た。

【0099】

濃縮レンチウイルスをｓＫＯ－Ｔ細胞（Ｂ２Ｍシングルノックアウト）及びｄＫＯ－Ｔ細胞（Ｂ２Ｍ／ＩＣＡＭ３ダブルノックアウト）にトランスフェクトして、それぞれＣＡＲ－ｓＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ－ｄＫＯ Ｔ細胞を得た。未修飾の野生型Ｔ細胞は、ネガティブコントロール（ＮＴ）として使用した。

【0100】

３７℃及び５％ＣＯ_２条件下で、１１日間培養した後、一次抗体としてＢｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、アイテム番号 １１５－０６５－０７２）を用い、二次抗体としてＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、アイテム番号 ５５４０６７）又はＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、アイテム番号 ５５４０６１）を用い、ＣＡＲ－Ｔ細胞でのｓｃＦｖの発現レベルをフローサイトメトリー法で検出した。結果は、図４に示されたとおりである。
本発明により製造されたＣＡＲ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖが効率的に発現されていることが分かる。
５．２ 標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力の検出

【0101】

まず、フルオレセイン遺伝子を運ぶＮａｌｍ６標的細胞を１×１０^４／ウェルの濃度で９６ウェルプレートにプレーティングした後、２：１のエフェクター－標的比（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔａｒｇｅｔ ｒａｔｉｏ）（即ち、標的細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率）でＮＴ細胞、ＣＡＲ－ｓＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ－ｄＫＯ Ｔ細胞を９６ウェルプレートにプレーティングして共培養し、１６～１８時間後にマイクロプレートリーダーで蛍光値を測定した。計算式：（標的細胞の蛍光平均値－サンプルの蛍光平均値）／標的細胞の蛍光平均値×１００％により、殺傷効率を計算した。結果は、図５に示したとおりである。

【0102】

ここから分かるように、ＣＡＲ－ｓＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ－ｄＫＯ Ｔ細胞は、両方とも標的細胞に対して特異的に殺傷することができ、ＮＫ活性化受容体ＩＣＡＭ３をさらにノックアウトしても、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力に悪影響を及ぼさない。
５．３ ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカインの放出レベルの検出

【0103】

標的細胞Ｎａｌｍ６を１×１０^５／ウェルの濃度で９６ウェルプレートにプレーティングし、１：１の比率で本発明のＮＴ細胞、ＣＡＲ－ｓＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ－ｄＫＯ Ｔ細胞を標的細胞と共培養し、１８－２４時間後に細胞共培養上清液を収集した。

【0104】

捕捉抗体Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＬ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、アイテム番号 ５００３０２）又はＰｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、アイテム番号 ５０６５０２）を用いて９６ウェルプレートをコーティングし、４℃で一晩インキュベートした後、抗体溶液を除去し、２％ ＢＳＡ（ｓｉｇｍａ、アイテム番号 Ｖ９００９３３－１ｋｇ）を含むＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）溶液２５０μＬを加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）で３回洗浄した。５０μＬの細胞共培養上清液または標準品を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、５０μＬの検出抗Ａｎｔｉ－Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ γ抗体［ＭＤ－１］（Ｂｉｏｔｉｎ）（ａｂｃａｍ、アイテム番号 ａｂ２５０１７）を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）で３回洗浄した。ＨＲＰストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、アイテム番号 ４０５２１０）をさらに加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、上清液を捨て、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）を加えて５回洗浄した。５０μＬのＴＭＢ基質溶液を各ウェルに添加した。室温、暗所で３０分間反応させた後、各ウェルに５０μＬの１ｍｏｌ／ＬのＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。反応停止後の３０分以内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を検出し、標準曲線（標準品の読み取り値及び濃度に従って作成されたもの）によって、サイトカインの含有量を算出した。結果は、図６に示されたとおりである。

【0105】

ここから分かるように、ＣＡＲ－ｓＫＯ Ｔ細胞とＣＡＲ－ｄＫＯ Ｔ細胞の両方とも標的細胞に対してＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカインの放出レベルを顕著に増加させることができ、ＮＫ活性化受容体ＩＣＡＭ３をさらにノックアウトしても、ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカインの放出レベルに悪影響はなかった。

【0106】

なお、上記は本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するものではなく、当業者にとって、本発明は様々な変更及び変化を有していてもよい。当業者にとって、本発明の思想及び原理内で行われる任意の変更、等価置換、改良などが、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきであることが理解できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】