▶ アルベルト・アインシュタイン・カレッジ・オブ・メディシンの特許一覧
特表2023-527546ＨＳＶ－２単周期ウイルスデルタ－ｇＤおよびＨＳＶ－２組換え糖タンパク質の使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-29
(54)【発明の名称】ＨＳＶ－２単周期ウイルスデルタ－ｇＤおよびＨＳＶ－２組換え糖タンパク質の使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/245 20060101AFI20230622BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230622BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20230622BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230622BHJP
【ＦＩ】
A61K39/245
A61K39/39
A61P31/22
A61P37/04 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022573260
(86)(22)【出願日】2021-06-01
(85)【翻訳文提出日】2022-12-15
(86)【国際出願番号】 US2021035168
(87)【国際公開番号】W WO2021243328
(87)【国際公開日】2021-12-02
(31)【優先権主張番号】63/031,816
(32)【優先日】2020-05-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520426357
【氏名又は名称】アルベルト・アインシュタイン・カレッジ・オブ・メディシン
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＢＥＲＴ ＥＩＮＳＴＥＩＮ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ヘロルド，ベッツィ シー
(72)【発明者】
【氏名】アシュナー，クレア バーン
【テーマコード（参考）】
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085BA78
4C085CC08
4C085DD62
4C085EE03
4C085EE06
4C085FF24
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG10
(57)【要約】
単純ヘルペスウイルス感染症または単純ヘルペスウイルス感染症によって引き起こされる疾患に対して対象をワクチン接種、免疫、および／または治療する方法は、有効量のＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを対象に投与することを含み、ＨＳＶ－２単周期ウイルスは、ゲノム中の糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有するＨＳＶ－２を含み、ＨＳＶ－２は、ＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄにて表現型的に補完されている。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象に有効量の単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを投与して、ＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病に関して対象にワクチン接種することを含む、ＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病に対して対象にワクチン接種する方法であって、ＨＳＶ－２単周期ウイルスがゲノム中の糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有し、ＨＳＶ－２がにＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的補完されている方法。
【請求項2】
対象に有効量の単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを投与して、ＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病に関して対象を免疫することを含む、ＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病に対して対象を免疫するする方法であって、ＨＳＶ－２単周期ウイルスがゲノム中の糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有し、ＨＳＶ－２がＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完されている方法。
【請求項3】
対象に有効量の単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを投与して、対象におけるＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病を治療または予防することを含む、対象におけるＨＳＶ－２感染を治療または予防する、あるいは対象おけるＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病を治療または予防する方法であって、ＨＳＶ－２単周期ウイルスがゲノム中の糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有し、ＨＳＶ－２がＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完されている方法。
【請求項4】
ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄの投与が実質的に同時に行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄが対象に別々に投与するために処方される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄが対象に別々に投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
組換えＨＳＶ－２がアジュバント添加された組換えＨＳＶ－２ ｇＤである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＨＳＶ－２単周期ウイルスの投与が、組換え糖タンパク質Ｄの投与の１秒～６０分前に行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ＨＳＶ－２単周期ウイルスの投与が、組換え糖タンパク質Ｄの投与の１秒～６０分前に行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＨＳＶ－２単周期ウイルスが、皮下、筋肉内、皮内、または膣内投与用に処方される、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
【請求項11】
組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄが、皮下、筋肉内、皮内、または膣内投与用に処方される、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項12】
ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄが、対象の同じ肢に注射によって投与される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄが組換えＨＳＶ－２ゲノムによってコードされておらず、ＨＳＶ－２が、ＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄを発現する補完細胞の中でＨＳＶ－２を増殖させることによってＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月２９日に出願された米国仮出願第６３／０３１，８１６号の利益を主張し、その全体が本明細書に組み込まれる。
連邦研究声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＡＩＤ）によって授与された助成金番号Ｒ０１ ＡＩ１７３２１－０１およびＡＩ０５７５５２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本出願は、２０２０年５月２９日に出願された米国仮出願第６３／０３１，８１６号の利益を主張し、その全体が本明細書に組み込まれる。
連邦研究声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＡＩＤ）によって授与された助成金番号Ｒ０１ ＡＩ１７３２１－０１およびＡＩ０５７５５２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【0002】
単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）および単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ－２）は、一般的なヒト病原体である。先進国では、ＨＳＶ－１は、４９歳までに人口の約６７％に感染し、口腔および眼の疾患の主な原因であり、感染性角膜失明および致命的な感染性脳炎の主な原因であり、生殖器疾患のより一般的な原因として浮上している（Looker, KJ et al., PLoS ONE 2015, 10, e114989-23; Lafferty, WE et al, Journal of Infectious Diseases 2000, 181, 1454-1457; Roberts, CM et al, Sexually Transmitted Diseases 2003, 30, 797-800; Xu, F. et al., JAMA 2006, 296, 964-973）。ＨＳＶ－２感染者は、世界中で４億人を超えると推定されており、発展途上国における生殖器疾患の主な原因であり、ＨＩＶの獲得と感染の主要な危険因子である（Looker, KJ et al., PLoS ONE 2015, 10, e114989-23）。
【0003】
これら２つの関連ウイルスの巨大な世界的健康負担は、免疫保護の相関物としてウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）を標的とする中和抗体（ｎＡｂ）の生成に主に焦点を当てた広範なワクチン開発努力をもたらした。そのようなワクチンの１つは、水酸化アルミニウム（alum, アラム）およびモノホスホリルリピドＡアジュバントとともに処方された組換えｇＤ－２タンパク質ワクチン、ｇＤ－２－ＡＳ０４（GlaxoSmithKline）であった。有望な前臨床研究ならびにＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２二重血清陰性の女性（男性ではない）における保護を示す血清不一致カップルの第３相臨床試験にもかかわらず、その後の実地試験では、二重血清陰性の女性におけるＨＳＶ－２感染または疾患に対する保護は見出されなかった（Stanberry, L. R, et al., N Engl J Med 2002, 347, 1652-1661; Belshe, RB, et al., N Engl J Med 2012, 366, 34-43）。該ワクチンは、０、１、および６か月目に筋肉内投与された。最近、第Ｉ相臨床試験を完了した別のワクチンは、ウイルス複製に関与する２つの遺伝子（ＵＬ５およびＵＬ２９）が欠失した複製欠損ＨＳＶ－２株であり、ｄｌ５－２９（ＨＳＶ５２９、Sanofi Pasteur）と命名された（Dropulic, LK, et al. Journal of Infectious Diseases 2019、220、990-1000）。前臨床試験では、該ワクチンは安全で、ｎＡｂおよびＴ細胞応答を誘発し、末梢神経における潜伏の確立を減少させた(Da Costa, XJEA, et al., J. Virol. 2000, 74, 7963-7971; Da Costa, XJEA, et al., Virology 2001, 288, 256-263; Hoshino, Y., et al., Vaccine 2008, 26, 4034-4040; Hoshino, Y., et al., J. Virol. 2004, 79, 410-418; Hoshino, Y., et al. Journal of Infectious Diseases 2009, 200, 1088-1095; Bernard, M.-C., et al., PLoS ONE 2015, 10, e0121518-21）。第Ｉ相試験では、ワクチンが安全であり、ＨＳＶ血清陰性の参加者では、ｎＡｂ応答が４倍以上増加したが、血清陽性の参加者ではｎＡｂ応答が持続的に増加しなかったこともわかった。さらに、参加者のサブセットのみが有意なＣＤ４Ｔ細胞応答を誘発し、さらに少ないＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発した（Dropulic, LK, et al., Journal of Infectious Diseases 2019, 220, 990-1000）。
【0004】
ΔｇＤ－２と命名された単周期候補ＨＳＶ－２ワクチン株を得るために、糖タンパク質Ｄが欠失した単周期ＨＳＶ－２株（ΔＧＤ－２）が開発された。前臨床マウス研究では、このワクチン株ΔｇＤ－２は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲｓ）を活性化して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する、高力価の非中和抗体を誘発した。皮下投与された２回の用量は、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２の臨床分離株による致死的な膣または皮膚攻撃からメスおよび／またはオスのマウスを完全に保護し、潜伏期の確立を防いだ（Petro, C., et al., eLife 2015; Petro, CD, et al., JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5; Kao, CM, et al., Journal of Infectious Diseases 2019, 42, 47-10）。さらに、メスのマウスにワクチンを接種すると、生後１週間以内にその後のＨＳＶチャレンジから子マウスを保護できた（Kao, CM, et al., Journal of Infectious Diseases 2019, 42, 47-10）。アジュバント添加組換えｇＤとは対照的に、ΔｇＤ－２は、ＨＳＶ－１ 血清反応陽性マウスの総応答とＡＤＣＣ Ａｂ応答を増強し、その後の致命的なＨＳＶ－２重複感染を防止した（Burn Aschner, C., et al., npj Vaccines 2020, 1-33）。
【0005】
ＨＳＶ－１および／またはＨＳＶ－２によって引き起こされる感染症および疾患を予防および治療するためのさらなる戦略が有益であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Looker, KJ et al., PLoS ONE 2015, 10, e114989-23
【非特許文献2】Lafferty, WE et al, Journal of Infectious Diseases 2000, 181, 1454-1457
【非特許文献3】Roberts, CM et al, Sexually Transmitted Diseases 2003, 30, 797-800
【非特許文献4】Xu, F. et al., JAMA 2006, 296, 964-973
【非特許文献5】Stanberry, L. R, et al., N Engl J Med 2002, 347, 1652-1661
【非特許文献6】Belshe, RB, et al., N Engl J Med 2012, 366, 34-43
【非特許文献7】Dropulic, LK, et al. Journal of Infectious Diseases 2019、220、990-1000
【非特許文献8】Da Costa, XJEA, et al., J. Virol. 2000, 74, 7963-7971
【非特許文献9】Da Costa, XJEA, et al., Virology 2001, 288, 256-263
【非特許文献10】Hoshino, Y., et al., Vaccine 2008, 26, 4034-4040
【非特許文献11】Hoshino, Y., et al., J. Virol. 2004, 79, 410-418
【非特許文献12】Hoshino, Y., et al. Journal of Infectious Diseases 2009, 200, 1088-1095
【非特許文献13】Bernard, M.-C., et al., PLoS ONE 2015, 10, e0121518-21
【非特許文献14】Petro, C., et al., eLife 2015; Petro, CD, et al., JCI Insight 2016, 1, 1-15
【非特許文献15】Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5
【非特許文献16】Kao, CM, et al., Journal of Infectious Diseases 2019, 42, 47-10
【非特許文献17】Burn Aschner, C., et al., npj Vaccines 2020, 1-33
【発明の概要】
【0007】
対象に有効量のＨＳＶ－２単周期ウイルス（HSV-2 single cycle virus）および有効量の組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを投与して、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病に関して対象にワクチン接種することを含む、ＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病に対して対象にワクチン接種する方法であって、ＨＳＶ－２単周期ウイルスがゲノム中の糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有し、ＨＳＶ－２がＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完されている（complemented）方法。
【0008】
対象に有効量のＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを投与して、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病に関して対象を免疫することを含む、ＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病に対して対象を免疫するする方法であって、ＨＳＶ－２単周期ウイルスがゲノム中の糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有し、ＨＳＶ－２がＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完されている方法。
【0009】
対象に有効量の単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを投与して、対象におけるＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病を治療または予防することを含む、対象におけるＨＳＶ－２感染を治療または予防する、あるいは対象おけるＨＳＶ－２感染により引き起こされる疾病を治療または予防する方法であって、ＨＳＶ－２単周期ウイルスがゲノム中の糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有し、ＨＳＶ－２がＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完されている方法。
【0010】
上記および他の特徴は、以下の図面および詳細な説明によって例示される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
以下の図面は例示的な実施形態であり、同様の要素には同様の番号が付けられている。
[図１]ウイルスおよびアジュバント添加サブユニットＨＳＶワクチンの免疫原性は、ワクチン接種経路によって調節される。メスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、５ｘ１０４、５ｘ１０５、または５ｘ１０６ｐｆｕ／マウスのｄｌ５－２９またはΔｇＤ－２、または５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬを３週間間隔で２回、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）または皮内（ｉｄ）にワクチン接種した。２回目の免疫の１週間後、マウスの眼窩後採血を行い、ＥＬＩＳＡによる総ＨＳＶ特異的ＩｇＧ（図１Ａ～Ｃ）、中和力価（図１Ｄ～Ｆ）、およびＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターアッセイによるＦｃγＲＩＶ活性化（図１Ｇ～Ｉ）について血清を試験した。ｇＤ－２－アラム／ＭＰＬおよびｄｌ５－２９については１つの実験でグループあたり５匹のマウス（Ｎ＝５）、ΔｇＤ－２については２つの独立した実験でグループあたり５匹のマウス（ｎ＝５）。アスタリスクは、ＡＮＯＶＡによる有意性を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
[図１]ウイルスおよびアジュバント添加サブユニットＨＳＶワクチンの免疫原性は、ワクチン接種経路によって調節される。メスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、５ｘ１０４、５ｘ１０５、または５ｘ１０６ｐｆｕ／マウスのｄｌ５－２９またはΔｇＤ－２、または５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬを３週間間隔で２回、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）または皮内（ｉｄ）にワクチン接種した。２回目の免疫の１週間後、マウスの眼窩後採血を行い、ＥＬＩＳＡによる総ＨＳＶ特異的ＩｇＧ（図１Ａ～Ｃ）、中和力価（図１Ｄ～Ｆ）、およびＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターアッセイによるＦｃγＲＩＶ活性化（図１Ｇ～Ｉ）について血清を試験した。ｇＤ－２－アラム／ＭＰＬおよびｄｌ５－２９については１つの実験でグループあたり５匹のマウス（Ｎ＝５）、ΔｇＤ－２については２つの独立した実験でグループあたり５匹のマウス（ｎ＝５）。アスタリスクは、ＡＮＯＶＡによる有意性を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【0012】
[図２]ワクチンの投与量と経路に基づく免疫原性の違いは防御の違いを説明する。メスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、５ｘ１０４、５ｘ１０５、または５ｘ１０６ｐｆｕ／マウスのｄｌ５－２９またはΔｇＤ－２、または５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬを３週間間隔で２回、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）または皮内（ｉｄ）にワクチン接種した。２回目のワクチン接種の３週間後、マウスの皮膚に１０ｘＬＤ９０ ＨＳＶ－２ ＳＤ９０を接種した。ｇＤ－２－アラム／ＭＰＬ（図２Ａ）、ｄｌ５－２９（図２Ｂ）、ΔｇＤ－２（図２Ｃ）の経時的な疾患スコアを示す。生存率を図２Ｄ～２Ｊに示す。ｇＤ－２－アラム／ＭＰＬよびｄｌ５－２９については１回の実験でグループあたり５匹のマウス（Ｎ＝５）、ΔｇＤ－２については２つの独立した実験でグループあたり５匹のマウス（ｎ＝５）。生存曲線については、＊＊Gehan Breslow Wilcoxon検定によりｐ＜０．０１。
【0013】
[図３]仙骨神経におけるＨＳＶ ＤＮＡ検出は、生存データとパラレルである。５μｇのｒｇＤ－２－アラム／ＭＰＬ、または５ｘ１０５ｐｆｕ／マウスのｄｌ５－２９、またはΔｇＤ－２を、ｓｃ、ｉｍ、またはｉｄ 経路でワクチン接種したメスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、１０ｘＬＤ９０ ＨＳＶ－２ ＳＤ９０を皮膚にチャレンジした。チャレンジ後、マウスを１４日間毎日モニターし、チャレンジに屈したマウスについては死亡時に、あるいは生き残った動物についてはチャレンジ後１４日目に仙骨神経組織を採取した。仙骨神経節のＨＳＶ ＤＮＡをｑＰＣＲで評価し、ＤＮＡ１０ｎｇあたりのＨＳＶ－２ ＤＮＡのコピー数を、ｒｇＤ－２－アラム／ＭＰＬ（図３Ｂ）、ｄｌ５－２９（図３Ａ）、ΔｇＤ－２（図３Ｃ）について示す。チャレンジに屈したマウスは、十字の記号で示される。ワクチンの投与経路に基づく有意差はなかった（ＡＮＯＶＡ）。
【0014】
[図４]ＨＳＶワクチン接種後のＴ細胞応答の動態。５ｘ１０５ｐｆｕ／マウスのΔｇＤ－２または５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬを、メスのＣ５７ＢＬ／６マウスに３週間間隔で２回筋肉内ワクチン接種した。ワクチン接種前（－１日目）と初回刺激および追加免疫後の１週目と２週目に、マウスを後眼窩採血し、ＣＤ１１ａ＋ＣＤ４９ｄ＋活性化ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞について評価した（図４Ｃ－Ｄ）。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞活性化の評価のためのゲーティング戦略を示す（図４Ａ－Ｂ）。Mixed Effects Analysisによってデータを分析した。＊ｐ＜０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。グループあたり５匹のマウス（ｎ＝５）。
【0015】
[図５]ΔｇＤ－２ワクチン接種は、ＨＳＶ－２刺激に応答してＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、およびＩＬ－２を産生する多機能ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を誘導する。メスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、５ｘ１０５ｐｆｕ／マウスのΔｇＤ－２および５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬを３週間間隔で２回筋肉内ワクチン接種した。ワクチン接種されたマウスからの脾細胞を、ブーストワクチン接種の２週間後に収集し、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、およびＩＬ－２の産生に関する染色およびフローサイトメトリー分析の前に、ブレフェルジンＡ処理を伴うＰＨＡまたはＵＶ不活化ＨＳＶ－２ ＳＤ９０で１８時間刺激した。ゲーティング戦略を（図５Ａ）に示し、ＣＤ４（図５Ｂ－Ｄ）およびＣＤ８（図５Ｅ－Ｇ）Ｔ細胞に対するサイトカイン応答を示す。Mixed Effects Analysisによってデータを分析した。＊ｐ＜０．５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。グループあたり５匹のマウス（ｎ＝５）。
【0016】
[図６]中和抗体の生成により、低用量のΔｇＤ－２による保護が強化される。メスのＣ５７ＢＬ／６マウスに５ｘ１０４ｐｆｕ／マウスのΔｇＤ－２、５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬ、または両方のワクチンの組み合わせを３週間間隔で２回、反対側の側面(opposite)または同じ部位(same)に皮下ワクチン接種した。２回目のワクチン接種の１週間後、マウスの眼窩後採血を行い、血清をＥＬＩＳＡ（図６Ａ）、中和力価（図６Ｂ）、およびＦｃγＲＩＶ活性化（図６Ｃ）によって総ＨＳＶ特異的ＩｇＧについて評価した。２回目のワクチン接種の３週間後、マウスの皮膚に１０ｘＬＤ９０用量のＨＳＶ－２（ＳＤ９０）を接種した。生存率％を示す（図６Ｄ）。２つの独立した実験でグループあたり５匹のマウス（Ｎ＝５）。（Ａ－Ｃ）＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによる。生存曲線については、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、Gehan Breslow Wilcoxon検定による。
【発明を実施するための形態】
【0017】
ワクチンの免疫原性は、ウイルス抗原がワクチンによってどのように提示されるか（弱毒化、複製欠損、単周期、不活化ウイルス、またはアジュバント添加サブユニットタンパク質）、ならびに投与量および投与経路によって影響を受ける。予防接種のルートは、多くの場合、免疫学的な考慮事項ではなく、実際的な考慮事項に基づいている。
【0018】
異なる経路およびワクチン用量を使用して、ゲノム中の糖タンパク質Ｄの欠失（ΔｇＤ－２）を有する遺伝子改変された単周期の単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）の免疫原性および有効性が研究され、ｄｌ５－２９ならびにアラムおよびモノホスホリルリピドＡにてアジュバント添加組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄ（ｒｇＤ－２）（ｇＤ－２－ＡＳ０４ワクチン（GlaxoSmithKline）と同様のもの）と比較された。ΔｇＤ－２とｒｇＤ－２の同時投与の免疫原性と有効性も評価された。驚くべきことに、ΔｇＤ－２と組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄ（ｒｇＤ－２）の同時投与は、どちらのワクチンの免疫原性にも干渉しないことが発見された。特に、アジュバント添加ｒｇＤ－２と比較的低用量のΔｇＤ－２を同じ側腹または反対側の側腹部に同時に送達すると、どちらのワクチンの免疫原性も妨げられず、アジュバント添加ｒｇＤ－２単独よりも防御力が高くなる。さらに、低用量のΔｇＤ－２とｒｇＤ－２の組み合わせが相加的な保護を提供することが示された。
【0019】
本明細書で使用される「治療有効量」または「有効な量」または「有効量」は、対象において所望の効果を達成するのに十分な特定の物質の量を指す。
【0020】
「治療する」または「治療」は、本開示のワクチンまたは本開示の製品を、１つまたは複数の疾患症状を有する、または疾患を有する疑いのある対象または患者に投与することを意味し、そのことに関してワクチンまたは製品は治療活性または予防活性を有する。ワクチンまたは製品は、臨床的に測定可能な程度で、そのような症状の退縮を誘導するか、またはその進行を阻害することによって、治療対象の１つまたは複数の疾患症状を緩和するのに有効な量で投与され得る。この用語は、障害に関連する症状の発症の遅延および／またはそのような障害の症状の重症度の低下をさらに含む。これらの用語は、すでに存在している制御されていないまたは望ましくない症状を改善すること、追加の症状を予防すること、およびそのような症状の根底にある原因を改善または予防することをさらに含む。
【0021】
「予防する」とは、疾患の素因があるかもしれないが疾患を有していない対象において、疾患が発生する可能性を有意に低減するのに十分な量の本開示のワクチンまたは本開示の製品を投与することを意味する。ウイルス感染の文脈において、「予防」には、ワクチンまたはウイルス感染のリスクが高いことが知られている対象へのワクチンの投与から生じる免疫産物の投与が含まれる。
【0022】
本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、ワクチンに添加され、抗原に対する免疫応答を増強、増強および／またはブーストする任意の成分を意味するが、それが単独で投与された場合は免疫応答が生じない。
【0023】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染に対して対象をワクチン接種、免疫および／または治療する方法が本明細書に開示される。また、本明細書において、ＨＳＶ感染によって引き起こされる疾患に対して対象をワクチン接種、免疫、および／または治療する方法も開示される。ＨＳＶ感染は、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ－２）感染、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染である。一態様では、ＨＳＶ感染は、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）感染である。ＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染によって引き起こされる疾患には、ヘルペス、口唇ヘルペス、白癬、性器ヘルペス（性器潰瘍）、ヘルペス湿疹、剣状ヘルペス、ＨＳＶ角膜炎、ＨＳＶ網膜炎、ＨＳＶ脳炎またはＨＳＶ髄膜炎が含まれる。一態様では、ＨＳＶ感染によって引き起こされる疾患は性器潰瘍である。
【0024】
本明細書に開示される方法は、対象に有効量のＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄ（ｒｇＤ－２）を投与することを含む。ＨＳＶ－２単周期ウイルスは、ゲノムにおいてＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子が欠失しているＨＳＶ－２であり、ＨＳＶ－２は脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完されている。ＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子は、ＨＳＶ－２のＵｓ６遺伝子であり、ＨＳＶ－２ゲノムにおいて完全にまたは部分的に欠失されている。一態様では、ＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子は、ＨＳＶ－２ゲノムにおいて完全に欠失されている。
【0025】
ＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄは、ＨＳＶ－２ゲノムによってコードされていない。特に、ＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄの欠失を有するＨＳＶ－２は、ＨＳＶ－１ ｇＤを発現するようにトランスフェクトされた細胞中でＨＳＶ－２糖タンパク質をコードする遺伝子の欠失を有するＨＳＶ－２を増殖させることによって、ＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄにて表現形的に補完される。ＨＳＶ－２単周期ウイルスの完全な説明は、ＷＯ２０１５／１３４３６８に見出され、参照により本明細書に組み込まれる。
【0026】
ＨＳＶ－２のゲノム中にＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有し、ＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄを発現する補完細胞においてＨＳＶ－２を増殖させることによってＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄにて表現形的に補完されているＨＳＶ－２単周期ウイルスは、本明細書において「ＨＳＶ－２ΔｇＤ－２」または「ΔｇＤ－２」または「ＨＳＶ－２単周期ウイルス」と互換的に称される。
【0027】
組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄは、本明細書において「ｒｇＤ－２」または「組換えＨＳＶ－２ ｇＤ」または「組換えｇＤ－２」と互換的に称される。
【0028】
態様（複数）では、組換えＨＳＶ－２ ｇＤをアジュバントと組み合わせ、アジュバント添加組換えＨＳＶ－２ ｇＤを対象に投与する。
【0029】
アジュバントのタイプは限定されず、アジュバント添加されていない組換えＨＳＶ－２（例えば、可溶性組換えＨＳＶ－２ ｇＤ）の投与と比較して、組換えＨＳＶ－２ ｇＤに対する対象の免疫応答を増強、増強、および／または促進することができる任意のアジュバントであり得る。アジュバントの非限定的な例は、アラム、硫酸カリウムアルミニウム、水酸化アルミニウム、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム（ＡＡＨＳ）、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、スクアレン、Ｑｕｉｌｌａｊａ由来の植物サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ ＡＴＭ）、大豆、またはＰｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａが挙げられる。モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、フロイントアジュバント（完全または不完全）、非代謝性油を含む水中油エマルジョン、パラフィン油（例えば、EMULSIGENTM、MVP Laboratories、ネブラスカ州ラルストン）、鉱油、植物油または植物油、スクアランまたはスクアレン（例えばＭＦ５９ＴＭ）、および／または動物油、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＱＳ－２１、またはそれらの組み合わせを含む。アジュバントは、３－ＤＭＰ、ポリグルタミン酸またはポリリジンなどの高分子または単量体アミノ酸、または他の免疫増強剤などの他の特異的な免疫刺激剤とともに、あるいはそれらを伴わずに用いることができる。
【0030】
単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）感染、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ－２）感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染に対して対象にワクチン接種する方法が本明細書に開示される。また、ＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染によって引き起こされる疾患に対して対象にワクチン接種する方法も開示される。ＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染、またはＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染によって引き起こされる疾患に対して対象にワクチン接種する方法は、有効量の組換えＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを対象に投与して、ＨＳＶ－２感染、ＨＳＶ－１感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染に関して対象にワクチン接種することを含む。ＨＳＶ－２単周期ウイルスは、ゲノムにおいて糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有するＨＳＶ－２を含み、ＨＳＶ－２は、ＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完される。
【0031】
一態様では、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）感染またはＨＳＶ－２感染によって引き起こされる疾患に対して対象にワクチン接種する方法は、有効量のＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２ ｇＤを対象に投与して、ＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染によって引き起こされる疾患に関して対象にワクチン接種することを含む。
【0032】
一態様では、ＨＳＶ－１感染またはＨＳＶ－１感染によって引き起こされる疾患に対して対象にワクチン接種する方法は、有効量のＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２ ｇＤを対象に投与して、ＨＳＶ－１感染またはＨＳＶ－１感染によって引き起こされる疾患について対象にワクチン接種することを含む。
【0033】
一態様では、ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２の同時感染またはＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２の同時感染によって引き起こされる疾患に対して対象にワクチン接種する方法は、有効量のＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効な量の組換えＨＳＶ－２ ｇＤを対象に投与して、およびＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２の同時感染またはＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２の同時感染によって引き起こされる疾患について対象にワクチン接種することを含む。
【0034】
単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）感染、単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）感染、またはＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２の同時感染に対して被験体を免疫する方法、ならびにＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染によって引き起こされる疾患に対して対象を免疫する方法も本明細書に開示される。ＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染、あるいはＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染によって引き起こされる疾病に対して対象を免疫する方法は、有効量の組換えＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２ ｇＤを対象に投与して、ＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染、あるいはＨＳＶ－１感染、ＨＳＶ－２感染、またはＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の同時感染によって引き起こされる疾病に関して対象を免疫することを含む。ＨＳＶ－２単周期ウイルスは、ゲノムにおいて糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有するＨＳＶ－２を含み、ＨＳＶ－２は、ＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完される。
【0035】
一態様では、ＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染によって引き起こされる疾患に対して対象を免疫する方法は、対象に有効量の組換えＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを対象に投与して、ＨＳＶ－２感染またはＨＳＶ－２感染によって引き起こされる疾患に関して対象を免疫することを含む。
【0036】
対象におけるＨＳＶ－２感染、ＨＳＶ－１感染、またはＨＳＶ－２とＨＳＶ－１の同時感染を予防または治療する方法も本明細書に開示される。対象におけるＨＳＶ－２感染、ＨＳＶ－１感染、またはＨＳＶ－２とＨＳＶ－１の同時感染によって引き起こされる疾患を予防または治療する方法も開示される。
【0037】
対象におけるＨＳＶ－２感染、ＨＳＶ－１感染、またはＨＳＶ－２とＨＳＶ－１の同時感染を予防または治療する方法は、対象に有効量の組換えＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを対象に投与して、ＨＳＶ－２感染、ＨＳＶ－１感染、またはＨＳＶ－２とＨＳＶ－１の同時感染に関して対象を治療することを含む。対象におけるＨＳＶ－２感染、ＨＳＶ－１感染、またはＨＳＶ－２とＨＳＶ－１の同時感染によって引き起こされる疾患を予防または治療する方法は、対象に有効量の組換えＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを対象に投与して、ＨＳＶ－２感染、ＨＳＶ－１感染、またはＨＳＶ－２とＨＳＶ－１の同時感染によって引き起こされる疾患に関して対象を治療することを含む。ＨＳＶ－２単周期ウイルスは、ゲノムにおいて糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有するＨＳＶ－２を含み、ＨＳＶ－２は、ＨＳＶ－２の脂質二重層上のＨＳＶ－１糖タンパク質Ｄで表現型的に補完される。
【0038】
一態様では、対象における単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ－２）感染を治療または予防する方法、あるいは対象におけるＨＳＶ－２感染によって引き起こされる疾患を治療する方法は、有効量の組換えＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび有効量の組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄを対象に投与して、ＨＳＶ－２感染に関して対象を治療することを含む。
【0039】
態様（複数）では、対象にワクチン接種、免疫、および／または治療する開示された方法は、ＨＳＶ－２単周期ウイルスを含む有効量の組成物、医薬組成物、またはワクチンを投与すること、ならびに組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む有効量の組成物、医薬組成物、またはワクチンを投与することを含む。
【0040】
態様（複数）では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２糖タンパク質Ｄの投与は、実質的に同時に行われる。本明細書で使用する場合、「実質的に同時に」とは、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤを互いに短い時間のうちに、例えば、１秒～２４時間、１秒から１２時間、１秒から８時間、１秒から４時間、１秒から２時間（１２０分）、１秒から１時間（６０分）、または１秒から３０分以内に投与することを指す。
【0041】
一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスの投与は、組換え糖タンパク質Ｄの投与の１秒～６０分前に行われる。
【0042】
一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスの投与は、組換え糖タンパク質Ｄの投与の１秒～６０分後に行われる。
【0043】
一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤの投与は、同時に、例えば同じ時刻に行われる。本明細書で使用する場合、同時投与または同時に投与するとは、ＨＳＶ－２単周期ウイルスと組換えＨＳＶ－２ ｇＤの投与の間に識別可能な時間がない場合を指す。
【0044】
ＨＳＶ－２単周期ウイルスを含む組成物または薬学的処方物またはワクチン、および組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物または薬学的処方物またはワクチンを対象に投与することができる。ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび／または組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物または薬学的組成物またはワクチンは、対象への投与のために処方される。
【0045】
一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤは、対象への別々の投与のために、異なる組成物、薬学的処方物またはワクチン中に存在する。換言すれば、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤは、同じ組成物、薬学的処方またはワクチン中に存在しない。しかしながら、本開示は必ずしもそれに限定されず、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤの両方を含む組成物、薬学的処方またはワクチンは、その中に存在する物質によってＨＳＶ－２単周期ウイルスの生存能力が損なわれない限り、使用されうる。
【0046】
本開示の一態様において、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤは、対象への別々の投与のために処方され、実質的に同時に対象に投与される。一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスの投与は、組換えｇＤの投与の１秒～６０分前に行われる。一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスの投与は、組換えｇＤの投与の１秒～６０分後に行われる。
【0047】
一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤは、対象への別々の投与のために処方され、同時に対象に投与される。例えば、ＨＳＶ－２単周期ウイルスを含む組成物、薬学的処方物またはワクチンと、組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物、薬学的処方物またはワクチンとを、対象への投与前に一緒に組み合わせ、同時に投与することができる。あるいは、例えば、ＨＳＶ－２単周期ウイルスを含む組成物、薬学的処方物またはワクチンと、組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物、薬学的処方物またはワクチンとを、別々の手段（例えば、異なる注射器）によって同時に対象に投与することができる。
【0048】
態様（複数）において、ＨＳＶ－２単周期ウイルスまたは組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物、薬学的処方物またはワクチンは、ヒト対象への投与に適するように処方される。特に、組成物または薬学的処方物またはワクチンは、対象への意図された投与経路に適するように処方される。ＨＳＶ－２単周期ウイルスを含む組成物、薬学的処方物またはワクチンの意図される投与経路は、組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物、薬学的処方物またはワクチンの意図される投与経路と同じであっても異なっていてもよい。一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤは、同じ投与経路のために独立して処方される。一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤは、異なる投与経路のために処方される。
【0049】
一態様では、組成物、薬学的処方またはワクチンは、対象への皮下、筋肉内、皮内、または膣内投与に適するように処方される。本明細書に開示される方法、および本明細書に開示される組成物または薬学的処方またはワクチンにおいて、投与は、耳介、口腔、結膜、皮膚、皮下、子宮頸管内、洞内、気管内、経腸、硬膜外、血液透析、間質、腹腔内、羊膜内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、尾部内、海綿体内、腔内、脳内、槽内、角膜内、冠動脈内、皮内、椎間板内、管内、表皮内、食道内、胃内、膣内、歯肉内、回腸内、管腔内、病巣内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心外膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、副鼻腔内、脊髄内、滑膜内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、脳室内、膀胱内、硝子体内、喉頭、鼻、経鼻胃、眼、経口、口腔咽頭、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、直腸、吸入、球後、くも膜下、結膜下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、尿管、尿道、または膣にて行われ得る。前述の投与経路の少なくとも１つを含む組合せも使用することができる。
【0050】
一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスを含む組成物、薬学的処方またはワクチン、および組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物、薬学的処方またはワクチンは、注射による皮下、筋肉内または皮内投与用に処方される。ＨＳＶ－２単周期ウイルスを含む組成物、薬学的処方またはワクチンは、組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物、薬学的処方またはワクチンと同じ領域または異なる領域に投与することができる。例えば、ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤはそれぞれ、同じまたは異なる手足に投与することができる。
【0051】
本明細書に開示される組成物、薬学的処方、またはワクチンは、アジュバントを含むことができる。一態様では、ＨＳＶ－２単周期ウイルスまたは組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物、薬学的処方、またはワクチンは、アジュバントを含む。本明細書に開示される組成物、薬学的処方、またはワクチンはまた、薬学的に許容される担体を含むことができる。
【0052】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって承認された物質、または米国薬局方、他の一般に認められた薬局方に加えて、動物、より具体的には、ヒトおよび／またはヒト以外の哺乳動物における使用に安全な他の処方にリストされている物質を意味する。「薬学的に許容される担体」という用語は、本抗体またはフラグメントとともに投与される賦形剤、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント（免疫学的アジュバントとも呼ばれる）、および／またはビヒクルを指す。薬学的に許容される担体の例としては、リン酸緩衝生理食塩水、滅菌水（ＵＳＰ注射用水を含む）、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、およびさまざまなタイプの湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水または通常の（０．９％）生理食塩水、例えばＵＳＰ０．９％塩化ナトリウム溶液が挙げられる。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって処方される（例えば、Remington‘s Pharmaceutical Sciences、第 18 版、A. Gennaro 編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1990 を参照;および Remington、The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000参照（それぞれの内容全体を本明細書に組み込む））。非限定的な例において、担体は、二塩基性リン酸ナトリウム、塩化カリウム、一塩基性リン酸カリウム、ポリソルベート８０（例えば、２－［２－［３，５－ビス（２－ヒドロキシエトキシ）オキソラン－２－イル］－２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチル（Ｅ）－オクタデカ－９－エノエート）、エデト酸二ナトリウム二水和物、スクロース、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、および二塩基性リン酸ナトリウム二水和物のうちの１つまたはそれ以上を含む。薬学的に許容される担体は、ＨＳＶ－２単周期ウイルスの生存能力または組換えＨＳＶ－２ ｇＤの安定性および／またはコンフォメーションに不適合でない限り、限定されない。
【0053】
一態様では、組換えＨＳＶ－２ ｇＤを含む組成物、薬学的処方、またはワクチンは、使用前の保管および輸送中の一定期間にわたる変性、酸化、または凝集の影響によるタンパク質の活性または構造的完全性の喪失を防止するための安定剤を含むことができる。組成物、薬学的処方たはワクチンは、塩、界面活性剤、ｐＨおよび／または等張化剤、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【0054】
組成物、薬学的処方、またはワクチンが注射剤として使用される場合、ｐＨ値はほぼ中性のｐＨ範囲（ｐＨまたは６．８～７．４）である。一態様では、組成物、薬学的処方、またはワクチンは液体形態である。一態様では、組成物または薬学的組成物は等張性である。
【0055】
本開示において、対象は、ＨＳＶ－２感染、ＨＳＶ－１感染、またはＨＳＶ－２およびＨＳＶ－１の同時感染の治療または予防を必要とする対象である。対象はまた、ＨＳＶ－２感染、ＨＳＶ－１感染、またはＨＳＶ－２およびＨＳＶ－１の同時感染によって引き起こされる疾患の治療または予防を必要とする対象であり得る。対象は哺乳類の対象である。例えば、対象はヒト対象である。ＨＳＶ－２単周期ウイルスおよび組換えＨＳＶ－２ ｇＤは、ヒト対象への投与のために処方することができる。
【0056】
本明細書に開示される方法は、対象における免疫応答を誘導し、該免疫応答は、対象におけるウイルス播種および／またはウイルス感染を最小化および／または防止する抗体、細胞性免疫応答、および／または他の免疫因子（例えば、補体）を誘発する。特に、免疫応答は、Ｆｃ受容体を活性化して抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）応答を媒介する抗体（ＦｃＲ活性化抗体）の産生を含む。一態様では、有効量のＨＳＶ－２単周期ウイルスの投与は、ＦｃＲ活性化抗体（抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）抗体とも呼ばれる）の産生を誘発する。ＨＳＶ－２単周期ウイルスの有効量は、記載された目的を達成するＨＳＶ－２単周期ウイルスの一定量のプラーク形成単位（ｐｆｕ）である。
【0057】
本開示は、非限定的である以下の実施例によってさらに説明される。
【0058】
実施例
材料および方法
年齢が一致した雌のＣ５７ＢＬ／６（ＢＬ／６）マウスは、Jackson Laboratory(JAX、Bar Harbor、ME)から購入した。
材料および方法
年齢が一致した雌のＣ５７ＢＬ／６（ＢＬ／６）マウスは、Jackson Laboratory(JAX、Bar Harbor、ME)から購入した。
【0059】
Ｖｅｒｏ細胞（ミドリザル腎臓細胞株、ＡＴＣＣ）、ＶＤ６０細胞（Ligas,M.W.ら、J.Virol.1988,62,1486-1494）およびＶ５－２９細胞（Da Costa,X.J.E.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999, 96, 6994-6998)を、１０％ＦＢＳ（Hyclone, Logan, UT）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Invitrogen）を添加したＤＭＥＭ（Invitrogen, Carlsbad, CA）にて増殖させた。ウイルス攻撃に使用された臨床分離株は、ＨＳＶ－２（ＳＤ９０）（Dudek, T. E., et al., Journal of Infectious Diseases 2011, 203, 1434-1441）およびＨＳＶ－２（４６７４）を含んでいた。ＨＳＶ－２株４６７４は、Montefiore Clinical Virology Labから入手した（Petro, C. D., et al, JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al, Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。ウイルス分離株をＶｅｒｏ細胞で増殖させ、力価を測定した（Petro, C. D., et al., JCI Insight 2016, 1, 1-15）。
【0060】
補完的なＶＤ６０細胞中でΔｇＤ－２を増殖させ、ＶＤ６０細胞とＶｅｒｏ細胞の両方にて力価測定した（Petro, C., et al., eLife 2015; Petro, C. D., et al., JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5; Kao, C. M., et al., Journal of Infectious Diseases 2019, 42, 47-10）。補完的なＶ５－２９細胞にてＤｌ５－２９を増殖させ（Da Costa, X. J. E. A., et al., J. Virol. 2000, 74, 7963-7971）、補完的および非補完的なＶｅｒｏ細胞にて力価測定した。組換えｇＤ－２タンパク質（５μｇ）は、Einstein Macromolecular Therapeutics Development Facilityから提供され、１５０μｇのアラム（Imject Alum、Pierce Biotechnology、ロックランド、イリノイ州）および１２．５μｇのＭＰＬ（Invivogen、カリフォルニア州サンディエゴ）にてアジュバント添加された（rgD- 2/Alum-MPL) (Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。組換えｇＤ－２は、ＡＳ０４ワクチン（GlaxoSmithKline）において使用される組換えｇＤ－２と実質的に同じである。
【0061】
ワクチン接種とチャレンジプロトコル
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０４、５×１０５、または５×１０６ｐｆｕ（補完的細胞系によるウイルス力価に基づく）のγｇＤ－２またはｄｌ５－２９；５μｇのｒｇＤ－２／アラムＭＰＬ；または５ｘ１０４ｐｆｕのΔｇＤ－２と５μｇのｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬの組み合わせを皮下、筋肉内、または皮内（３週間間隔で２回投与）でワクチン接種した。皮内ワクチン接種には、マウス用に設計された専門の皮内マイクロニードルを使用した（Nanopass、Nes Ziona、ISR）。２回目のワクチン投与の３週間後、９０％の動物に対する致死量（ＬＤ９０）の１０倍のＨＳＶ－２ ＳＤ９０にてマウスの皮膚を攻撃した（Petro, C., et al., eLife 2015）。上皮および神経疾患についてマウスを毎日モニターし、記載されているように採点した。皮膚病の場合：１）接種部位の紅斑。２）遠隔転移、帯状疱疹、浮腫。３）潰瘍、表皮の広がり、四肢麻痺；４）後肢麻痺、５）死亡。マウスをスコア４で安楽死させ、翌日スコア５を割り当てた。
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０４、５×１０５、または５×１０６ｐｆｕ（補完的細胞系によるウイルス力価に基づく）のγｇＤ－２またはｄｌ５－２９；５μｇのｒｇＤ－２／アラムＭＰＬ；または５ｘ１０４ｐｆｕのΔｇＤ－２と５μｇのｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬの組み合わせを皮下、筋肉内、または皮内（３週間間隔で２回投与）でワクチン接種した。皮内ワクチン接種には、マウス用に設計された専門の皮内マイクロニードルを使用した（Nanopass、Nes Ziona、ISR）。２回目のワクチン投与の３週間後、９０％の動物に対する致死量（ＬＤ９０）の１０倍のＨＳＶ－２ ＳＤ９０にてマウスの皮膚を攻撃した（Petro, C., et al., eLife 2015）。上皮および神経疾患についてマウスを毎日モニターし、記載されているように採点した。皮膚病の場合：１）接種部位の紅斑。２）遠隔転移、帯状疱疹、浮腫。３）潰瘍、表皮の広がり、四肢麻痺；４）後肢麻痺、５）死亡。マウスをスコア４で安楽死させ、翌日スコア５を割り当てた。
【0062】
ＨＳＶ特異的抗体についてのＥＬＩＳＡ
総ＨＳＶ結合ＩｇＧまたはアイソタイプ特異的ＨＳＶ結合ＩｇＧを、組換えモノクローナル抗体またはワクチンの２回目の投与の１週間後に収集した血清を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１のＭＯＩで２４時間ＨＳＶ－２（Ｇ）に感染させたＶｅｒｏ細胞の溶解物、または対照として感染していないＶｅｒｏ細胞溶解物でコーティングした。血清の連続希釈物を２連で、コーティングしたプレートとともに４℃で一晩インキュベートし、ビオチン標識二次抗体（BD Pharmingen, CA）を使用して結合したＩｇＧを定量した。非感染ベロ細胞溶解物へのバックグラウンド結合を、ＨＳＶ感染ベロ細胞溶解物への結合から差し引いて、ＨＳＶ特異的結合を定量化した。
総ＨＳＶ結合ＩｇＧまたはアイソタイプ特異的ＨＳＶ結合ＩｇＧを、組換えモノクローナル抗体またはワクチンの２回目の投与の１週間後に収集した血清を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡプレートを、０．１のＭＯＩで２４時間ＨＳＶ－２（Ｇ）に感染させたＶｅｒｏ細胞の溶解物、または対照として感染していないＶｅｒｏ細胞溶解物でコーティングした。血清の連続希釈物を２連で、コーティングしたプレートとともに４℃で一晩インキュベートし、ビオチン標識二次抗体（BD Pharmingen, CA）を使用して結合したＩｇＧを定量した。非感染ベロ細胞溶解物へのバックグラウンド結合を、ＨＳＶ感染ベロ細胞溶解物への結合から差し引いて、ＨＳＶ特異的結合を定量化した。
【0063】
ＦｃγＲ活性化アッセイ
Ｆｃ受容体活性化、より具体的にはＦｃγＲＩＶ活性化は、マウスＦｃγＲＩＶ ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Promega、Madison、WI）を用いて決定した（Petro、C.D.ら、JCI Insight 2016、1、1-15; Burn、 C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。標的ベロ細胞を、０．１のＭＯＩで１２時間、ＨＳＶ－２（ＳＤ９０）に感染させた。感染または非感染の対照細胞を白色の平底９６ウェルプレートに移し、ワクチン接種または対照免疫マウスからの熱不活化血清またはヒト血清サンプル（下記参照）（ＤＭＥＭで１：５希釈）とともに室温で１５分間インキュベートした。マウスＦｃγＲＩＶを３７℃、５％ＣＯ２にて６時間添加し、ルシフェリン基質の添加によりＦｃγＲＩＶ活性化を検出した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ（Molecular Devices）でプレートを読み取った。誘導倍率を、血清の非存在下でのルシフェラーゼ活性と比較して計算した。
Ｆｃ受容体活性化、より具体的にはＦｃγＲＩＶ活性化は、マウスＦｃγＲＩＶ ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Promega、Madison、WI）を用いて決定した（Petro、C.D.ら、JCI Insight 2016、1、1-15; Burn、 C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。標的ベロ細胞を、０．１のＭＯＩで１２時間、ＨＳＶ－２（ＳＤ９０）に感染させた。感染または非感染の対照細胞を白色の平底９６ウェルプレートに移し、ワクチン接種または対照免疫マウスからの熱不活化血清またはヒト血清サンプル（下記参照）（ＤＭＥＭで１：５希釈）とともに室温で１５分間インキュベートした。マウスＦｃγＲＩＶを３７℃、５％ＣＯ２にて６時間添加し、ルシフェリン基質の添加によりＦｃγＲＩＶ活性化を検出した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ（Molecular Devices）でプレートを読み取った。誘導倍率を、血清の非存在下でのルシフェラーゼ活性と比較して計算した。
【0064】
中和アッセイ
中和力価をプラーク減少アッセイによって決定した（Petro, C., et al., eLife 2015; Petro, C. D., et al, JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。熱不活化血清の連続２倍希釈液を２連でウイルス（５０ｐｆｕ／ウェル）とともに３７℃で１時間インキュベートし、Ｖｅｒｏ細胞単層に３７℃で１時間適用した。細胞をメタノールで固定し、４８時間のインキュベーション後にギムザ染色した。プラークを計数し、中和力価を、プラーク数が５０％減少する最高希釈率として定義した。
中和力価をプラーク減少アッセイによって決定した（Petro, C., et al., eLife 2015; Petro, C. D., et al, JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。熱不活化血清の連続２倍希釈液を２連でウイルス（５０ｐｆｕ／ウェル）とともに３７℃で１時間インキュベートし、Ｖｅｒｏ細胞単層に３７℃で１時間適用した。細胞をメタノールで固定し、４８時間のインキュベーション後にギムザ染色した。プラークを計数し、中和力価を、プラーク数が５０％減少する最高希釈率として定義した。
【0065】
定量的ＰＣＲによる神経組織中のウイルスＤＮＡの定量
安楽死時（マウスが病気に屈したとき、またはＨＳＶ－２チャレンジ後１４日目）に、仙骨神経組織を抽出し、Qiagen Blood and Tissue DNA分離キット（Qiagen）を使用してＤＮＡを分離した。サンプルあたり１０ｎｇのＤＮＡをロードし、ＨＳＶ－２ ｇＢに特異的なプライマーとプローブを使用して、ＨＳＶ ＤＮＡを定量化した（ＨＳＶ－２フォワードプライマー（配列番号：１）配列 ５’-ＴＧＣＡＧＴＴＴＡＣＧＴＡＴＡＡＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧＣ－３’（配列番号：１）；ＨＳＶ－２リバースプライマー配列 ５’－ＡＧＣＴＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＧＴＴ－３’（配列番号：２）；ＨＳＶ－２プローブ配列 ５’－ＣＧＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＡＣＧＴ－３’（配列番号：３）（Namvar, L., et al. , Journal of Clinical Microbiology 2005, 43, 2058-2064）。マウスβアクチンをローディングコントロールとして使用し（Applied Biosystems, Foster City, CA）、ｑＰＣＲをApplied Biosystems QuantStudio 7 Flexで実行した。標準曲線に基づけば、このアッセイは一貫して４以上のコピー数を検出した。検出されたコピー数が４未満のサンプルを陰性と見なした（Petro, C., et al, eLife 2015; Petro, C. D., et al, JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。
安楽死時（マウスが病気に屈したとき、またはＨＳＶ－２チャレンジ後１４日目）に、仙骨神経組織を抽出し、Qiagen Blood and Tissue DNA分離キット（Qiagen）を使用してＤＮＡを分離した。サンプルあたり１０ｎｇのＤＮＡをロードし、ＨＳＶ－２ ｇＢに特異的なプライマーとプローブを使用して、ＨＳＶ ＤＮＡを定量化した（ＨＳＶ－２フォワードプライマー（配列番号：１）配列 ５’-ＴＧＣＡＧＴＴＴＡＣＧＴＡＴＡＡＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧＣ－３’（配列番号：１）；ＨＳＶ－２リバースプライマー配列 ５’－ＡＧＣＴＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＧＴＴ－３’（配列番号：２）；ＨＳＶ－２プローブ配列 ５’－ＣＧＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＡＣＧＴ－３’（配列番号：３）（Namvar, L., et al. , Journal of Clinical Microbiology 2005, 43, 2058-2064）。マウスβアクチンをローディングコントロールとして使用し（Applied Biosystems, Foster City, CA）、ｑＰＣＲをApplied Biosystems QuantStudio 7 Flexで実行した。標準曲線に基づけば、このアッセイは一貫して４以上のコピー数を検出した。検出されたコピー数が４未満のサンプルを陰性と見なした（Petro, C., et al, eLife 2015; Petro, C. D., et al, JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。
【0066】
細胞分離とフローサイトメトリー
末梢血を後眼窩採血により採取し、５ｍｌの予熱したＡＣＫ溶解緩衝液（Lonza BioWhittaker）にピペットで移し、３７℃で７分間インキュベートした。溶解後、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳで細胞を２回洗浄した。脾細胞の分離のために、ワクチン接種した動物から脾臓を分離し、７０μｍセルストレーナーに押し付けて機械的に消化した。遠心分離によって細胞をペレット化し、２ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液に再懸濁した。３７℃で７分後、ＲＰＭＩを添加し、遠心分離により細胞をペレット化した。その後、細胞を洗浄し、さらなる処理のためにＲＰＭＩに再懸濁した。
末梢血を後眼窩採血により採取し、５ｍｌの予熱したＡＣＫ溶解緩衝液（Lonza BioWhittaker）にピペットで移し、３７℃で７分間インキュベートした。溶解後、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳで細胞を２回洗浄した。脾細胞の分離のために、ワクチン接種した動物から脾臓を分離し、７０μｍセルストレーナーに押し付けて機械的に消化した。遠心分離によって細胞をペレット化し、２ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液に再懸濁した。３７℃で７分後、ＲＰＭＩを添加し、遠心分離により細胞をペレット化した。その後、細胞を洗浄し、さらなる処理のためにＲＰＭＩに再懸濁した。
【0067】
ｅｘ ｖｉｖｏでの刺激のために、２００μＬのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳあたり２ｘ１０６個の脾細胞をＵ底９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞をＰＨＡ（５μｇ／ｍＬ）または１ｘ１０６ＰＦＵ ＵＶ不活化ＨＳＶ－２ ＳＤ９０で処理し、３７℃で１８時間インキュベートした。ブレフェルジンＡ（BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ）を刺激の最後の５時間に加えた。ウイルスのＵＶ不活性化のために、ＨＳＶ－２ ＳＤ９０を２４ウェルディッシュ中のＲＰＭＩで希釈し、プレートの４インチ上に配置したハンドヘルド（hand-held）ＵＶライトに３０分間曝露した。次いで、フローサイトメトリーのために、細胞外および細胞内染色のために細胞を処理した。
【0068】
フローサイトメトリー分析のために、１００μＬあたり１ｘ１０６から２×１０６個の細胞を、Zombie Near-IR fixable viability dyeおよびTruStain FcX（抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２）抗体と共に室温で１０分間インキュベートした。表面染色のために、FACS BufferとBrilliant Stain Buffer（BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ）の混合物中、製造元の指示に従って室温で３０分間、抗ＣＤ９０．２－ＢＶ５１０、ＣＤ４－ＢＶ７８５、ＣＤ８－ＢＶ７１１、ＣＤ１１ａ－ＡＰＣ、ＣＤ４９ｄ－ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７５０、ＫＬＲＧ１－ＢＶ６０５、およびＣＤ６２Ｌ－ＢＶ５７０（すべてBioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ）にて細胞を染色した。次いで、細胞を洗浄し、室温で２００ｍｌの２％ＰＦＡ中で２０分間インキュベートすることによって固定し、続いて０．３％トリトンＸ－１００中で７分間インキュベートすることによって透過処理した。細胞内染色のために、抗ＩＦＮ－γ－ＰＥ、ＴＮＦ－ＢＶ５７０、およびＩＬ－２－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ）のカクテル１００μＬ中で細胞を４℃で３０分間インキュベートした。染色後、細胞を洗浄し、４０μｍセルストレーナーに通し、次いで、５－レーザーＣｙｔｅｋ Ａｕｒｏｒａフローサイトメーターにて分析した。サンプルごとに５０，０００個の生ＣＤ９０．２＋細胞を収集し、ＦｌｏｗＪｏ（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）を使用してデータ分析を実施した。
【0069】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．２．１ソフトウェア（GraphPad Software Inc.San Diego,CA）を使用して分析を行った。０．０５のＰ値を統計的に有意であると見なした。Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して生存曲線を比較した。他の結果を、説明書に従ってＡＮＯＶＡまたは混合効果分析を使用して比較した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．２．１ソフトウェア（GraphPad Software Inc.San Diego,CA）を使用して分析を行った。０．０５のＰ値を統計的に有意であると見なした。Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して生存曲線を比較した。他の結果を、説明書に従ってＡＮＯＶＡまたは混合効果分析を使用して比較した。
【0070】
結果
用量と送達経路は ＨＳＶ ワクチンの免疫原性に影響を与える
投与量および／または送達経路が免疫原性に影響を与えるかどうかを決定するために、γｇＤ－２またはｄｌ５－２９の漸増用量（５×１０４、５×１０５、または５×１０６ｐｆｕ／投与量、補完的細胞株での力価に基づく）またはアラムおよびＭＰＬにてアジュバント添加した５μｇのｇＤタンパク質にて、マウスをｓｃ、ｉｍ、またはｉｄ経路を介してプライムブースト免疫した。総ＨＳＶ特異的（ＥＬＩＳＡ）、中和およびＡＤＣＣ応答（代理としてマウスＦｃγＲＩＶ活性化を使用して測定）を、ブースト後１週間で取得した血清中で定量した。アジュバント添加ｇＤタンパク質ワクチンは、ｉｍまたはｓｃと比較して、ｉｄにて送達された場合、有意に高い総ＨＳＶ ＥＬＩＳＡ抗体応答を誘導した（ｐ＜０．００１）。ｄｌ５－２９およびΔｇＤ－２に対する総ＨＳＶ特異的Ａｂ応答は、用量の増加に伴い増加したが、各用量での投与経路を比較するとほとんど差はなかった。ｄｌ５－２９については、５ｘ１０４ｐｆｕ／マウスの用量で、ｉｍ経路はｓｃと比較して有意に高い応答を誘発し（ｐ＜０．０５）、ΔｇＤ－２については、５ｘ１０６ｐｆｕ／マウスの用量で、ｉｄ経路はｉｍと比較してより高いＡｂ応答を誘発した（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）（図１Ａ－Ｃ）。
用量と送達経路は ＨＳＶ ワクチンの免疫原性に影響を与える
投与量および／または送達経路が免疫原性に影響を与えるかどうかを決定するために、γｇＤ－２またはｄｌ５－２９の漸増用量（５×１０４、５×１０５、または５×１０６ｐｆｕ／投与量、補完的細胞株での力価に基づく）またはアラムおよびＭＰＬにてアジュバント添加した５μｇのｇＤタンパク質にて、マウスをｓｃ、ｉｍ、またはｉｄ経路を介してプライムブースト免疫した。総ＨＳＶ特異的（ＥＬＩＳＡ）、中和およびＡＤＣＣ応答（代理としてマウスＦｃγＲＩＶ活性化を使用して測定）を、ブースト後１週間で取得した血清中で定量した。アジュバント添加ｇＤタンパク質ワクチンは、ｉｍまたはｓｃと比較して、ｉｄにて送達された場合、有意に高い総ＨＳＶ ＥＬＩＳＡ抗体応答を誘導した（ｐ＜０．００１）。ｄｌ５－２９およびΔｇＤ－２に対する総ＨＳＶ特異的Ａｂ応答は、用量の増加に伴い増加したが、各用量での投与経路を比較するとほとんど差はなかった。ｄｌ５－２９については、５ｘ１０４ｐｆｕ／マウスの用量で、ｉｍ経路はｓｃと比較して有意に高い応答を誘発し（ｐ＜０．０５）、ΔｇＤ－２については、５ｘ１０６ｐｆｕ／マウスの用量で、ｉｄ経路はｉｍと比較してより高いＡｂ応答を誘発した（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）（図１Ａ－Ｃ）。
【0071】
総ＨＳＶ特異的Ａｂの増加と矛盾せずに、ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬのｉｄ投与後の中和力価の有意でない増加が見られた（図１Ｄ－Ｆ）。ｄｌ５－２９ に対する中和応答は用量とともに増加したが、投与経路を比較した場合には増加しなかった。ΔｇＤ－２は、以前の研究から予想されるように、用量または投与経路に関係なく、中和Ａｂ応答をほとんど、またはまったく誘導しなかった。対照的に、ΔｇＤ－２は、他のワクチンと比較して最も強力なＡＤＣＣ応答を誘発し、これは用量とともに増加し、ｉｄまたはｉｍ投与をｓｃ投与と比較した場合に、５ｘ１０６用量で有意に大きかった。アジュバントを添加したｇＤタンパク質ワクチンは、投与経路に関係なく、対照血清と比較してＡＤＣＣ応答を誘発しなかった。ｄｌ５－２９ワクチンは中間的なＡＤＣＣ応答を誘導した。これは、５ｘ１０６ｐｆｕのΔｇＤ－２のｉｍまたはｉｄ投与によって誘発された３０倍のＦｃγＲＩＶ活性化と比較して、５ｘ１０６ｐｆｕのｉｄ投与後に最高であった（中央値で１５倍）（図１Ｇ－Ｉ）。
【0072】
免疫原性の違いは、致死的な皮膚攻撃後の防御の違いにつながる
プライムブーストワクチンを接種したマウスに、マウスモデル（Dudek,T.E.,et al., Journal of Infectious Diseases 2011, 203, 1434-1441）において一貫して致死的であることが以前に示されているＨＳＶ－２臨床単離物のＬＤ９０の１０倍用量、ＳＤ９０でマウスの皮膚を攻撃した。疾患の徴候についてマウスを２週間モニターし、重度の皮膚疾患または神経疾患の徴候が以前に記載されているように観察された場合は安楽死させた（図２Ａ－Ｊ）（Petro, C., et al, eLife 2015; Petro, C. D., et al, JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。ｉｍまたはｓｃ投与と比較して、ｉｄ投与した場合、アジュバント添加タンパク質ワクチンによってもたらされる防御の中庸ではあるが有意ではない増加があり（図２Ａ～Ｃ）、これは増加したＥＬＩＳＡおよびｎＡｂ応答（図１Ａ、１Ｄ）に対応する。投与経路は、ｄｌ５－２９の５ｘ１０４投与後の生存率に有意な影響を及ぼさず（図２Ｅ）、これは防御的ではなかったが、ｉｍとｉｄ経路の両方が、ｄｌ５－２９の５ｘ１０５投与後においてｓｃ経路よりも優れた保護を提供し（８０％対２０％）（図２Ｆ）、ＡＤＣＣの有意な増加（図１Ｈ）に対応していた。３つの経路はすべて、最高のワクチン用量で完全に保護的であった（図２Ｇ）。ΔｇＤ－２による生存率の唯一のブレークスルーは、ｓｃにて投与された５ｘ１０４の用量で観察された（図２Ｈ）。致死に対する完全な保護は、他のすべての用量および経路で観察された（図２Ｉ～Ｊ）。用量、投与経路、またはワクチンに関係なく、総集団全体でＡＤＣＣと生存率との関連を調べると（ｎ＝１４５）、４９匹中１４匹のマウスにおいてｍＦｃγＲＩＶ活性化が４．５倍未満であったことと比較して、９６匹中９３匹のマウスにおいてｍＦｃγＲＩＶ活性化が４．５倍増加しており、これらのマウスは生存していた（ｐ＜０．０００１、カイ二乗）。
プライムブーストワクチンを接種したマウスに、マウスモデル（Dudek,T.E.,et al., Journal of Infectious Diseases 2011, 203, 1434-1441）において一貫して致死的であることが以前に示されているＨＳＶ－２臨床単離物のＬＤ９０の１０倍用量、ＳＤ９０でマウスの皮膚を攻撃した。疾患の徴候についてマウスを２週間モニターし、重度の皮膚疾患または神経疾患の徴候が以前に記載されているように観察された場合は安楽死させた（図２Ａ－Ｊ）（Petro, C., et al, eLife 2015; Petro, C. D., et al, JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5）。ｉｍまたはｓｃ投与と比較して、ｉｄ投与した場合、アジュバント添加タンパク質ワクチンによってもたらされる防御の中庸ではあるが有意ではない増加があり（図２Ａ～Ｃ）、これは増加したＥＬＩＳＡおよびｎＡｂ応答（図１Ａ、１Ｄ）に対応する。投与経路は、ｄｌ５－２９の５ｘ１０４投与後の生存率に有意な影響を及ぼさず（図２Ｅ）、これは防御的ではなかったが、ｉｍとｉｄ経路の両方が、ｄｌ５－２９の５ｘ１０５投与後においてｓｃ経路よりも優れた保護を提供し（８０％対２０％）（図２Ｆ）、ＡＤＣＣの有意な増加（図１Ｈ）に対応していた。３つの経路はすべて、最高のワクチン用量で完全に保護的であった（図２Ｇ）。ΔｇＤ－２による生存率の唯一のブレークスルーは、ｓｃにて投与された５ｘ１０４の用量で観察された（図２Ｈ）。致死に対する完全な保護は、他のすべての用量および経路で観察された（図２Ｉ～Ｊ）。用量、投与経路、またはワクチンに関係なく、総集団全体でＡＤＣＣと生存率との関連を調べると（ｎ＝１４５）、４９匹中１４匹のマウスにおいてｍＦｃγＲＩＶ活性化が４．５倍未満であったことと比較して、９６匹中９３匹のマウスにおいてｍＦｃγＲＩＶ活性化が４．５倍増加しており、これらのマウスは生存していた（ｐ＜０．０００１、カイ二乗）。
【0073】
ワクチン接種の経路が潜伏の確立を防止するワクチンの能力に影響を与えたかどうかを評価するために、死亡時または攻撃後１４日目に神経節内のＨＳＶウイルスＤＮＡを定量した。アジュバント添加ｇＤタンパク質によるｉｄワクチン接種後のＡｂ応答の増加にもかかわらず、いずれの経路の免疫でも神経節から回収されたウイルスＤＮＡは減少しなかった。５ｘ１０５用量のｄｌ５－２９およびΔｇＤ－２での結果は、疾患スコアおよび生存データとパラレルであった。ｄｌ５－２９でｓｃ免疫した５匹中４匹のマウスが神経節内のＨＳＶ ＤＮＡを有していたことと比較して、ｉｍまたはｉｄで免疫した場合、５匹中わずか１匹のマウスにおいて神経節内のＨＳＶ ＤＮＡが検出された。同用量のΔｇＤ－２を任意の経路でワクチン接種したマウスでは、ウイルスＤＮＡは回収されなかった（図３Ａ～Ｃ）。
【0074】
ΔｇＤ－２ワクチン接種は、強力なＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞記憶応答を誘導する
機能的に異なるＡｂ応答を誘発する、γｇＤ－２およびｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬに対する免疫応答をさらに表現型決定するために、マウスに、５×１０５ｐｆｕ／マウスのΔｇＤ－２または５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬを、３週間間隔でｉｍにてプライム－ブーストワクチン接種し、ワクチン接種前（－１日目）ならびにプライムおよびブースト両方のワクチン接種後の指示された時間に末梢血において評価した。ＣＤ１１ａ＋ＣＤ４９＋ ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を定量化することによって測定されるように、ΔｇＤ－２は、プライムおよびブーストワクチン接種の両方の後に、活性化されたＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を誘導した。対照的に、アジュバント添加タンパク質ワクチンに対する検出可能なＴ細胞応答はほとんどなかった（図４Ｃ～Ｄ）。これらのマウスから脾細胞を４２日目に採取し、サイトカイン応答を評価するための生存率コントロールとして、ＵＶ不活性化ＳＤ９０またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激した。ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬワクチンを接種したマウスではなく、ΔｇＤ－２を接種したマウスから単離した脾細胞を不活化ウイルスで刺激した場合、刺激していない細胞と比較して有意に多くのＩＦＮ－γ、ＴＮＦおよびＩＬ－２産生ＣＤ４＋Ｔ細胞が観察された（図５Ｂ－Ｄ）。応答は、ＰＨＡマイトジェンで観察されたものよりも大きかった。刺激されていない細胞と比較して、ΔｇＤ－２ワクチンに対するサイトカイン産生ＣＤ８ Ｔ細胞応答の有意でない増加もあった（図５Ｅ～Ｇ）。
機能的に異なるＡｂ応答を誘発する、γｇＤ－２およびｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬに対する免疫応答をさらに表現型決定するために、マウスに、５×１０５ｐｆｕ／マウスのΔｇＤ－２または５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬを、３週間間隔でｉｍにてプライム－ブーストワクチン接種し、ワクチン接種前（－１日目）ならびにプライムおよびブースト両方のワクチン接種後の指示された時間に末梢血において評価した。ＣＤ１１ａ＋ＣＤ４９＋ ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を定量化することによって測定されるように、ΔｇＤ－２は、プライムおよびブーストワクチン接種の両方の後に、活性化されたＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を誘導した。対照的に、アジュバント添加タンパク質ワクチンに対する検出可能なＴ細胞応答はほとんどなかった（図４Ｃ～Ｄ）。これらのマウスから脾細胞を４２日目に採取し、サイトカイン応答を評価するための生存率コントロールとして、ＵＶ不活性化ＳＤ９０またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激した。ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬワクチンを接種したマウスではなく、ΔｇＤ－２を接種したマウスから単離した脾細胞を不活化ウイルスで刺激した場合、刺激していない細胞と比較して有意に多くのＩＦＮ－γ、ＴＮＦおよびＩＬ－２産生ＣＤ４＋Ｔ細胞が観察された（図５Ｂ－Ｄ）。応答は、ＰＨＡマイトジェンで観察されたものよりも大きかった。刺激されていない細胞と比較して、ΔｇＤ－２ワクチンに対するサイトカイン産生ＣＤ８ Ｔ細胞応答の有意でない増加もあった（図５Ｅ～Ｇ）。
【0075】
低用量ΔｇＤ－２とｒｇＤ－２の組み合わせにより、付加的な保護が提供される
γｇＤ－２とｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬとの組合せが有益であるか、または拮抗的であるかを決定するために、マウスに、完全には防御しない用量のΔｇＤ－２（５×１０４ｐｆｕ／マウス）でｓｃにてワクチン接種した。５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬ、または両方のワクチンの組み合わせを、反対側または同じ側腹部に送達した。潜在的な有益な効果を強調するために、効率の低いワクチン接種経路を使用した。両方の組み合わせは、いずれかのワクチン単独と比較して、総ＨＳＶ特異的抗体応答を大幅に増加させた（図６Ａ）。これらの組み合わせは、ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬまたはΔｇＤ－２の投与で観察されたそれぞれ２０％および６０％の保護（図６Ｄ）と比較して、ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬに対するｎＡｂ応答（図６Ｂ）またはΔｇＤ－２に対するＡＤＣＣ応答（図６Ｃ）に対して相加効果または拮抗効果を示さず、ＨＳＶ－２でのＬＤ９０の１０倍量（ＳＤ９０）の皮膚攻撃に対して１００％の保護をもたらした。組み合わせを反対側または同じ側腹部に投与しても違いはなかった。
γｇＤ－２とｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬとの組合せが有益であるか、または拮抗的であるかを決定するために、マウスに、完全には防御しない用量のΔｇＤ－２（５×１０４ｐｆｕ／マウス）でｓｃにてワクチン接種した。５μｇのｇＤ－２－アラム／ＭＰＬ、または両方のワクチンの組み合わせを、反対側または同じ側腹部に送達した。潜在的な有益な効果を強調するために、効率の低いワクチン接種経路を使用した。両方の組み合わせは、いずれかのワクチン単独と比較して、総ＨＳＶ特異的抗体応答を大幅に増加させた（図６Ａ）。これらの組み合わせは、ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬまたはΔｇＤ－２の投与で観察されたそれぞれ２０％および６０％の保護（図６Ｄ）と比較して、ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬに対するｎＡｂ応答（図６Ｂ）またはΔｇＤ－２に対するＡＤＣＣ応答（図６Ｃ）に対して相加効果または拮抗効果を示さず、ＨＳＶ－２でのＬＤ９０の１０倍量（ＳＤ９０）の皮膚攻撃に対して１００％の保護をもたらした。組み合わせを反対側または同じ側腹部に投与しても違いはなかった。
【0076】
議論
主にｇＤを標的とする中和抗体応答を誘発するように設計されたワクチンを用いた有望な前臨床データにもかかわらず、ＨＳＶワクチン候補を用いた臨床研究は期待外れであることが証明された。ΔｇＤ－２を用いた前臨床研究は、中和抗体への依存に挑戦し、ΔｇＤ－２の１０５（またはそれ以上の）ｐｆｕによる皮下ワクチン接種が、ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２の臨床分離株による致死的な皮膚、膣または眼の攻撃に対して再現性よく完全な保護を提供することを実証した（Petro, C., et al., eLife 2015; Petro, C. D., et al., JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5; Ramsey, N. L. M., et al., J. Virol. 2020）。受動伝達研究で証明されているように、保護は、中和ＡｂｓではなくＡＤＣＣによって媒介される。ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬワクチンを接種したマウスではなくΔｇＤ－２接種マウスからの免疫血清は、ナイーブな野生型を完全に保護したが、ＦｃγＲＩＶノックアウトマウスを致死攻撃から完全には保護しなかった（Petro, C., et al, eLife 2015; Petro, C. D., et al., JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5; Kao, C. M., et al., Journal of Infectious Diseases 2019, 42, 47-10; Burn Aschner, C., et al, npj Vaccines 2020, 1-33）。
主にｇＤを標的とする中和抗体応答を誘発するように設計されたワクチンを用いた有望な前臨床データにもかかわらず、ＨＳＶワクチン候補を用いた臨床研究は期待外れであることが証明された。ΔｇＤ－２を用いた前臨床研究は、中和抗体への依存に挑戦し、ΔｇＤ－２の１０５（またはそれ以上の）ｐｆｕによる皮下ワクチン接種が、ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２の臨床分離株による致死的な皮膚、膣または眼の攻撃に対して再現性よく完全な保護を提供することを実証した（Petro, C., et al., eLife 2015; Petro, C. D., et al., JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5; Ramsey, N. L. M., et al., J. Virol. 2020）。受動伝達研究で証明されているように、保護は、中和ＡｂｓではなくＡＤＣＣによって媒介される。ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬワクチンを接種したマウスではなくΔｇＤ－２接種マウスからの免疫血清は、ナイーブな野生型を完全に保護したが、ＦｃγＲＩＶノックアウトマウスを致死攻撃から完全には保護しなかった（Petro, C., et al, eLife 2015; Petro, C. D., et al., JCI Insight 2016, 1, 1-15; Burn, C., et al., Journal of Infectious Diseases 2017, 1-5; Kao, C. M., et al., Journal of Infectious Diseases 2019, 42, 47-10; Burn Aschner, C., et al, npj Vaccines 2020, 1-33）。
【0077】
今回の研究は、マウスにおける中和応答と比較して、ＡＤＣＣが免疫防御のより予測的な相関を提供するというさらなる証拠を提供する。ｄｌ５－２９の投与量および送達経路を増加させることによって観察された保護の増加は、ＡＤＣＣの有意な増加と関連していたが、中和応答とは関連していなかった。さらに、ＳＤ９０での１０ｘＬＤ９０チャレンジに対して１００％の防御を提供しなかったΔｇＤ－２によるワクチン接種の唯一の用量および経路、すなわち１０４ｐｆｕによるｓｃ経路免疫は、２．８倍の（ＦｃγＲＩＶ）活性化という平均ＡＤＣＣ応答を誘発した。ワクチンの投与量や送達経路に関係なく、ＦｃγＲＩＶ倍増が４．５を超える９６匹のマウスのうち３匹のみが、高用量致死攻撃に屈した。
【0078】
ワクチン接種のｉｍおよびｉｄ経路は両方とも、ｓｃ経路と比較して有意に高い総応答および／またはＡＤＣＣ応答を誘導した。ｉｍおよびｉｄがｓｃよりも免疫原性が高いという観察結果は、他のワクチンを使用した研究と矛盾しないが、投与経路とＡｂ機能（ＡＤＣＣと中和）の間の関連性はこれまでに説明されていなかった。ｉｍまたはｉｄ経路による免疫原性の改善は、より長い抗原保持、真皮に存在する抗原提示細胞への差別的曝露、および／またはリンパ排出へのより大きなアクセスを映し出すことができた（Wahl, M., et al., Scand. J. Infect. Dis. 1987, 19, 617-621; Bryan, J. P., et al., Clin. Infect. Dis. 1992, 14, 697-707; Rahman, F., et al., Hepatology 2000, 31, 521-527; Belshe, R. B., et al., N Engl J Med 2004, 351, 2286-2294; Van Damme, P., et al., Vaccine 2009, 27, 454-459）。例えば、三価不活化インフルエンザワクチンの筋肉内投与は、高齢者の皮下ワクチン接種よりも高い抗体応答をもたらした（Gillet, Y., et al., BMC Med 2009, 7, 16）。しかしながら、同様のＡｂおよびＴ細胞応答が、弱毒化された麻疹、おたふくかぜ、および風疹ワクチンのｓｃまたはｉｍ投与で報告された（Laurent, P. E., et al, Vaccine 2010, 28, 5850-5856）。皮内経路を介して一貫した用量を送達することは技術的に困難であるにもかかわらず、皮内狂犬病ワクチン接種は、１９９２年の世界保健機関の勧告以来、標準となっている（Dubois, B., et al, Journal of Leukocyte Biology 1999, 66, 224-230）。皮内ワクチン接種は、より強力な樹状細胞媒介性応答を活性化すると推定されるため、必要な抗原投与量はより少なくなる（Peng, S. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 5545-5550）。しかしながら、ｄｌ５－２９またはΔｇＤ－２の任意の用量においてｉｄまたはｉｍ免疫経路を比較したところ、ＡＤＣＣ応答またはワクチン防御に有意差を我々は観察せず、ｉｄ経路がこれらのワクチンに用量の利点を提供しないことが示唆された。しかしながら、ｉｄ経路での投与により、サブユニットワクチンに対する総ＨＳＶ特異的Ａｂ応答の統計的に有意な増加が観察され、そのことが中和力価とワクチン保護の有意でない増加を生じさせたことを我々は観察した。
【0079】
用量および送達経路に加えて、ｇＤサブユニットワクチンに対する排他的中和応答、非中和的でＦｃγＲにより媒介されるγｇＤ－２に対する応答、ならびにｄｌ５－２９によって誘発される中和応答および非中和応答の両方によって明らかなように、ワクチン組成物もまた免疫原性に影響する。ΔｇＤ－２免疫後に中和抗体が存在しないことは、マウスにｎＡｂｓの主要な標的が存在しないことを反映している可能性がある。他の研究において、ｄｌ５－２９免疫血清からｇＤ特異的Ａｂを枯渇させると、ＡＤＣＣの力価ではなく中和が大幅に減少することを我々は見出し、ｇＤがＡＤＣＣ応答の標的ではないことが示された（Burn Aschner and Herold mspt. submitted）。ｍＦｃγＲＩＶに対して最も強い親和性を持ち、マウスのＡＤＣＣに関連する、ＩｇＧ２へのＩｇＧサブクラスの切り替えには、抗原提示細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞間の胚中心内での相互作用が必要である（Sattentau, Q, et al, Nat Rev Micro 2008, 6, 815-826）。強力なＡＤＣＣ応答の生成におけるＴ細胞の要件と矛盾せずに、プライムおよびブーストワクチン接種後のＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の強力な活性化を我々は記録したが、ｇＤ－２－アラム／ＭＰＬはほとんどＴ細胞の活性化を誘発しなかった。ｒｇＤ－２／アラム－ＭＰＬワクチンを接種したマウスではなくΔｇＤ－２接種マウスから採取したメモリーＴ細胞を不活化ウイルスで刺激すると、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、およびＩＬ－２が産生され、これはＣＤ４＋Ｔ細胞に関して特に強力であった。これらの違いは、活発なＴ細胞応答がＡＤＣＣ応答の生成に寄与するという考えを支持する。
【0080】
アジュバント添加ｒｇＤ－２と低用量のγｇＤ－２とを同じまたは反対側の側腹部に同時に送達した組み合わせは、いずれのワクチンの免疫原性にも干渉せず、ｒｇＤ－２－アラム／ＭＰＬ単独よりも防御的であった。これは、既存のｇＤ中和ＡｂがΔｇＤ－２の免疫原性に干渉しないことを示した重複感染マウス研究と矛盾しない。ＨＳＶ－１血清反応陽性マウスにΔｇＤ－２をワクチン接種すると、ＡＤＣＣ（中和反応ではない）Ａｂ応答が増加し、その後マウスが致死量のＨＳＶ－２で攻撃された場合、完全な保護が得られた（Burn Aschner, C., et al, npj Vaccines 2020, 1-33）。したがって、ｇＤに対するｎＡｂｓだけではマウス（またはこれまでのところヒト）を保護するには不十分であるが、両方のタイプの応答の組み合わせが有益である可能性がある。理論に拘束されるわけではないが、ｎＡｂｓによって媒介される不完全な保護の１つの理由は、ＨＳＶが細胞から細胞へ直接広がることによって中和を回避する能力であるかもしれない。しかしながら、ΔｇＤ－２と同時に組換えｇＤタンパク質を送達することは、ｇＤをウイルスエンベロープ中に存在させることとは異なることに注意することが重要である。他の研究において、エンベロープｇＤが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４としても知られるヘルペスウイルスエントリメディエーター（ＨＶＥＭ）との相互作用を介して、ＩｇＧ２サブクラススイッチされたＡｂｓの生成を妨げることを我々は見出した（Burn Aschner および Herold、mspt under review）。このことが、今回の研究で示されているように、ｄｌ５－２９によって生成されるＡＤＣＣのレベルがより低いこと、ならびに亜致死感染に応答して生成されるレベルが低いことに寄与している可能性が高い（Kao, C. M., et al, Journal of Infectious Diseases 2019, 42, 47-10; Burn Aschner, C., et al, npj Vaccines 2020, 1-33）。
【0081】
まとめると、今回の研究は、ＡＤＣＣが免疫防御の重要な関連事項であるというさらなる証拠を提供する。我々は当初、３つすべてのワクチンに関して皮内送達経路がより免疫原性であることがわかると仮定したが、このことはｇＤタンパク質サブユニットワクチンでのみ観察された。ΔｇＤ－２およびｄｌ５－２９を用いると、ｉｍ経路とｉｄ経路の両方が同様の抗体応答と保護を提供した。全体として、ΔｇＤ－２は、最高のＡＤＣＣ応答ならびに致死的なチャレンジと潜伏に対する最も強力な防御を誘導した。
【0082】
組成物、方法および物品は、代替的に、本明細書に開示される任意の適切な材料、工程または構成要素を含む、からなる、あるいは本質的にそれらからなることができる。組成物、方法および物品は、組成物、方法および物品の機能または目的の達成に不必要な材料（種）、工程または成分を回避する、あるいは実質的にそれらがないように、付加的にあるいは代替的に処方されうる。
【0083】
「第１」、「第２」などの用語は、順序、量、または重要性を示すものではなく、ある要素を別の要素と区別するために使用される。「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、量の限定を意味するものではなく、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。「または」は、特に明記されていない限り、「および／または」を意味する。本明細書全体にわたる「いくつかの実施形態」、「一の実施形態」などへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の要素が、本明細書に説明される少なくとも１つの実施形態に含まれ、他の実施形態に存在する場合も存在しない場合もあるということを意味する。さらに、説明した要素は、さまざまな実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができることを理解されるべきである。「それらの組み合わせ」は自由であり、列挙された構成要素または特性のうちの少なくとも１つを、場合により列挙されていない類似または同等の構成要素または特性と共に含む任意の組み合わせを含む。
【0084】
本明細書に別段の定めがない限り、すべての試験基準は、本出願の出願日時点で有効な最近の基準であり、優先権が主張されている場合は、試験基準が記載されている最先の優先権出願の出願日である。
【0085】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本願が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。引用されたすべての特許、特許出願、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。しかし、本出願の用語が組み込まれた参考文献の用語と矛盾または矛盾する場合、本願の用語が、組み込まれた参考文献の矛盾する用語よりも優先される。
【0086】
特定の実施形態について説明してきたが、現在予見できないまたは予見できない可能性のある代替物、修正物、変形物、改良物、および実質的な等価物が出願人または当業者に対して生じる可能性がある。したがって、提出され、補正されるかもしれない添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての代替、修正、変形、改良、および実質的な均等物を包含することを意図している。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【配列表】
【国際調査報告】