(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-30
(54)【発明の名称】カルプロテクチンアッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20230623BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230623BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230623BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20230623BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D ZNA
G01N33/574 A
C07K16/18
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022568548
(86)(22)【出願日】2021-05-12
(85)【翻訳文提出日】2022-12-02
(86)【国際出願番号】 EP2021062753
(87)【国際公開番号】W WO2021229016
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】2007087.6
(32)【優先日】2020-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2100902.2
(32)【優先日】2021-01-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522403778
【氏名又は名称】ノルディック バイオサイエンス エー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】モーテンセン，ヨアヒム，ホグ
(72)【発明者】
【氏名】シンケビシュート，ドビル
(72)【発明者】
【氏名】マノン－ジェンセン，ティナ
(72)【発明者】
【氏名】カースダル，モーテン，アッサー
(72)【発明者】
【氏名】ベイ－ジェンセン，アン－クリスティン
(72)【発明者】
【氏名】ニールセン，シグネ，ホルム
(72)【発明者】
【氏名】ハンセン，アニカ，ハマースガード
(72)【発明者】
【氏名】サンド，ジャニー，マリー，ビュロー
(72)【発明者】
【氏名】リーミング，ダイアナ，ジュリー
(72)【発明者】
【氏名】ウィルムセン，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】ジェンセン，クリスティーナ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA30
4H045CA50
4H045DA76
4H045DA86
4H045EA50
4H045FA71
(57)【要約】
生体液試料中のカルプロテクチンのヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）生成断片を検出及び定量するためのイムノアッセイ法；並びにそのような方法で使用するためのモノクローナル抗体及びアッセイキットが本明細書に開示される。本方法は、患者における炎症を特徴とするか、又は炎症を呈する疾患を検出し、モニターし、及び／又はその状態若しくは重症度を決定するために使用され得る。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片を検出するためのイムノアッセイ法であって、ヒト生体液試料を、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープを特異的に認識してこれに結合するモノクローナル抗体と接触させること、及び前記モノクローナル抗体と前記試料中のペプチドとの間の結合を検出することを含む方法。
【請求項2】
前記検出が定量的であり、前記方法が、前記モノクローナル抗体と前記試料中のペプチドとの間の結合量を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記方法が、患者における疾患を検出し、及び／又はその進行をモニターし、及び／又は疾患の状態若しくは重症度を決定するためのイムノアッセイ法であって、前記疾患が、炎症を特徴とするか又は炎症を呈する疾患であり、前記患者から得られた生体液試料を前記モノクローナル抗体と接触させること、前記モノクローナル抗体と前記試料中のペプチドとの間の結合量を検出及び決定すること、並びに前記結合量を、正常な健康な対象に関連する値及び／又は疾患の既知の状態若しくは重症度に関連する値及び／又は以前の時点で前記患者から得られた値及び／又は所定のカットオフ値と相関させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記疾患が炎症によって促進される疾患である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、変形性関節炎である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）又は特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記疾患ががんである、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記疾患が、転移性黒色腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）又は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記モノクローナル抗体が、前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含む合成ペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記モノクローナル抗体が、以下のＨＮＥ生成カルプロテクチン断片：ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（配列番号１）
ＲＫＤＬＱＮＦＬＫＫＥＮＫＮＥＫＶ（配列番号２）
ＲＫＤＬＱＮＦＬＫＫＥＮＫＮＥＫＶＩ（配列番号３）
ＥＨＩＭＥＤＬＤＴＮＡＤＫＱＬ（配列番号４）
ＳＨＥＫＭＨＥＧＤＥＧＰＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥＧＴＰ（配列番号５）
ＹＲＤＤＬＫＫＬＬＥＴ（配列番号６）
ＷＦＫＥＬＤＩＮＴＤＧＡＶ（配列番号７）
のうちの１つから選択されるペプチドのＮ末端又はＣ末端の配列を特異的に認識してこれに結合する、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
前記前記モノクローナル抗体が、前記ペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（配列番号１）のＮ末端又はＣ末端の配列を特異的に認識してこれに結合する、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
前記モノクローナル抗体が、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片の前記Ｎ末端配列を特異的に認識してこれに結合し、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ伸長延長型又は前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮型を特異的に認識せず、結合しない、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
前記生体液試料が血漿又は血清である、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
前記イムノアッセイが競合イムノアッセイである、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
前記イムノアッセイが酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
【請求項16】
ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープを特異的に認識してこれに結合するモノクローナル抗体。
【請求項17】
前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含む合成ペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体である、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項18】
以下のＨＮＥ生成カルプロテクチン断片：ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（配列番号１）
ＲＫＤＬＱＮＦＬＫＫＥＮＫＮＥＫＶ（配列番号２）
ＲＫＤＬＱＮＦＬＫＫＥＮＫＮＥＫＶＩ（配列番号３）
ＥＨＩＭＥＤＬＤＴＮＡＤＫＱＬ（配列番号４）
ＳＨＥＫＭＨＥＧＤＥＧＰＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥＧＴＰ（配列番号５）
ＹＲＤＤＬＫＫＬＬＥＴ（配列番号６）
ＷＦＫＥＬＤＩＮＴＤＧＡＶ（配列番号７）
のうちの１つから選択されるペプチドのＮ末端又はＣ末端の配列を特異的に認識してこれに結合する、請求項１６又は１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項19】
前記ペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（配列番号１）のＮ末端又はＣ末端の配列を特異的に認識してこれに結合する、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項20】
ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片の前記Ｎ末端配列を特異的に認識してこれに結合し、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ伸長延長型又は前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮型を特異的に認識せず、結合しない、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項21】
請求項１６～２０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体と、－ストレプトアビジンコーティングウェルプレート
－ビオチンに連結された前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むビオチン化ペプチド
－サンドイッチイムノアッセイで使用するための二次抗体
－前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むキャリブレータペプチド
－抗体ビオチン化キット
－抗体ＨＲＰ標識キット
－抗体放射性標識キット
のうちの少なくとも１つとを含むイムノアッセイキット。
【請求項22】
請求項１６～２０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体と、－ストレプトアビジンコーティングウェルプレート
－ビオチンに連結された前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むビオチン化ペプチド
－前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むキャリブレータペプチド
のうちの１つ、２つ又は全てとを含む、請求項２１に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、生体液試料中のヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）によって生成されるカルプロテクチン断片を検出し、好ましくは定量するためのイムノアッセイ方法、並びに限定されないが、患者の炎症によって促進される疾患などの炎症を特徴とするか、若しくは炎症を呈する疾患を検出し、モニターし、及び／又はその状態若しくは重症度を決定するためのそのような方法の使用に関する。本発明はまた、そのような方法に使用するためのモノクローナル抗体及びアッセイキットにも関する。
本発明は、生体液試料中のヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）によって生成されるカルプロテクチン断片を検出し、好ましくは定量するためのイムノアッセイ方法、並びに限定されないが、患者の炎症によって促進される疾患などの炎症を特徴とするか、若しくは炎症を呈する疾患を検出し、モニターし、及び／又はその状態若しくは重症度を決定するためのそのような方法の使用に関する。本発明はまた、そのような方法に使用するためのモノクローナル抗体及びアッセイキットにも関する。
【背景技術】
【0002】
背景
カルプロテクチンは、細胞内、特に好中球顆粒球において発現され、好中球顆粒球の全サイトゾル物質の約６０％を占めている１。カルプロテクチンは、ＴＬＲ受容体のリガンドであり、比較的プロテアーゼ耐性がある２。好中球顆粒球は、骨髄系細胞系列からの特殊な造血細胞であり、自然免疫系からの細胞のサブグループである。好中球顆粒球は、病原体及び細菌の侵入に対する最初の防御線としての役目を果たし、そのため炎症組織でも高度に発現する３～５。
カルプロテクチンは、細胞内、特に好中球顆粒球において発現され、好中球顆粒球の全サイトゾル物質の約６０％を占めている１。カルプロテクチンは、ＴＬＲ受容体のリガンドであり、比較的プロテアーゼ耐性がある２。好中球顆粒球は、骨髄系細胞系列からの特殊な造血細胞であり、自然免疫系からの細胞のサブグループである。好中球顆粒球は、病原体及び細菌の侵入に対する最初の防御線としての役目を果たし、そのため炎症組織でも高度に発現する３～５。
【0003】
カルプロテクチンは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者の便中で測定でき（便中カルプロテクチン）１、便中カルプロテクチンは、ＩＢＤ患者と過敏性腸症候群の患者とを区別するためのロバストなサンドイッチＥＬＩＳＡバイオマーカーであることが証明されている６～８。血清／血漿試料は便試料よりもはるかに取り扱いが簡単であり、便の軟度が、日々の、さらには便間の変動が大きい便中カルプロテクチンレベルにも影響を与えることが証明されているため、便中カルプロテクチンアッセイの多くが、血清／血漿試料にも適用できるかどうかを調べるために試験されている。しかし、カルプロテクチンは、血漿中の半減期が非常に短く（５時間）９、血清／血漿カルプロテクチン及びＩＢＤに適用可能なバイオマーカーとしてのその有用性に関しての現在入手可能なデータは、議論の余地がある１０～１５。
【0004】
好中球顆粒球の活性化は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を生成し、ここで細胞は、例えば、侵入細菌を捕捉し、損傷を与えようとして、全ての核及びサイトゾル物質を分泌する１６。カルプロテクチン及びヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）は、ＮＥＴ形成の結果として炎症組織に分泌される１７。その結果、組織及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び他の分泌タンパク質がＨＮＥによって分解され、その結果、ネオエピトープ含有タンパク質断片が生成される１８
'
１９。加えて、ＨＮＥは、ＩＢＤの組織炎症に関連していることも証明されている２０。コラーゲンの分解及び形成時のネオエピトープ含有タンパク質断片は、ＩＢＤ患者及び前臨床モデルからの血清中で測定されることが実証されており、臨床疾患パラメータと関連付けられる１８
'
２１～２５。
【0005】
カルプロテクチン及びＨＮＥの炎症誘発放出は、他の疾患においても起こる。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、広範な炎症及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のリモデリングを特徴とし、これは潜在的に時間の経過とともに肺機能の深刻な低下につながる３４
'
３５。好中球は、ＣＯＰＤに罹患した肺に非常に豊富であり、持続的な組織損傷を引き起こす３６。ＩＰＦ患者は線維性変化による同様の持続的な損傷を経験し、ＩＰＦ患者の気管支肺胞洗浄液中にＨＮＥ放出の増加が認められている３７。好中球は炎症に対する細胞応答因子であり、プロテアーゼＮＥとタンパク質カルプロテクチンの両方を放出することができる３８。
【0006】
炎症はまた、がんの発症の素因でもあり、腫瘍形成の全ての段階を促進する。がん細胞ならびに周囲の間質細胞及び炎症細胞は、良好に組織化された相互作用に関与し、炎症性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を形成す３９。限定されないが、抗ＰＤ－１療法などの免疫チェックポイント阻害剤は、転移性黒色腫などのがんを処置するために使用されるクラスの薬物である。しかし、転移性黒色腫患者における抗ＰＤ－１療法及び他のそのような免疫チェックポイント阻害剤に対する応答及び耐性に関連する末梢バイオマーカーは、アンメットメディカルニーズを表す。高い好中球活性はまた、細胞傷害性攻撃から腫瘍細胞を保護することが示されているＮＥＴの放出に部分的に起因する免疫チェックポイント阻害剤の機能不全にも関連する。上記のように、ＨＮＥ及びカルプロテクチンは主要なＮＥＴ構成成分である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ＨＮＥによって生成されるカルプロテクチンのネオエピトープ含有断片が、全身炎症又は循環中の白血球ではなく、活動性局所組織炎症及び好中球を含む活性な白血球の尺度であり得るという理論を立てた。さらに、本発明者らは、血清及び血漿などの生体液中のカルプロテクチンのＨＮＥ生成ネオエピトープ含有断片を検出及び定量するためのロバストで信頼性の高いイムノアッセイを開発し、ＩＢＤ、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ、転移性黒色腫、ＳＣＬＣ ＮＳＣＬＣ、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎及び変形性関節炎などの疾患における炎症及び疾患活動性の評価における前記イムノアッセイの使用を実証した。
【発明の効果】
【0008】
したがって、第１の態様では、本発明は、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片を検出するためのイムノアッセイ方法であって、ヒト生体液試料を、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープを特異的に認識してこれに結合するモノクローナル抗体と接触させること、及びモノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合を検出することを含む方法に関する。
【0009】
好ましくは、検出は定量的であり、本方法は、前記モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を決定することをさらに含む。
【0010】
好ましい実施形態では、本方法は、患者における疾患を検出し、及び／又はその進行をモニターし、及び／又はその状態若しくは重症度を決定するためのイムノアッセイ法であって、疾患が炎症を特徴とするか、又は炎症を呈する疾患であり、前記患者から得られた生体液試料を前記モノクローナル抗体と接触させること、モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出及び決定すること、正常な健康な対象に関連する値及び／又疾患の既知の状態若しくは重症度に関連する値及び／又は以前の時点で前記患者から得られた値及び／又は既定のカットオフ値と前記結合量を相関させることを含む方法である。
【0011】
疾患は、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、変形性関節炎、シェーグレン症候群、又は狼瘡などの炎症によって促進される疾患であり得る。
【0012】
好ましい実施形態では、疾患は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。特に、イムノアッセイ法は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及び／又はクローン病（ＣＤ）などの複数の種類の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を検出し、及び／又はその進行をモニターし、及び／又はその状態若しくは重症度を決定する方法であり得る。
【0013】
別の好ましい実施形態では、疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎又は変形性関節炎である。
【0014】
他の好ましい実施形態では、疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）又は喘息であり得る。
【0015】
さらに他の実施形態では、疾患はがんであり得る。がんは、例えば、乳がん、前立腺がん、肺がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、黒色腫、卵巣がん、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がんであり得る。がんは、例えば、転移性がんであり得る。特定の実施形態では、がんは、例えば、転移性黒色腫、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）又は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）であり得る。
【0016】
本方法が疾患の状態又は重症度を決定する方法である場合、本方法は、例えば、疾患が活動性であるか若しくは寛解中であるかを評価するため、又は可能性がある患者の生存期間若しくは無増悪生存期間を評価するため、又は１以上の薬物（１以上の化学療法剤（すなわち、細胞毒性剤）及び／若しくは免疫チェックポイント阻害剤など）による処置による可能性がある患者の生存期間若しくは無増悪生存期間などの可能性がある医学的介入に対する反応を評価するためのものであり得る。
【0017】
モノクローナル抗体は、後述の表２に列挙したペプチドのいずれかなどの、任意のＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープを特異的に認識してこれに結合し得る。しかし、ある好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、以下のＨＮＥ生成カルプロテクチン断片：
ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（本明細書では「ＮＢＨ－２２２」とも呼ばれる）（配列番号１）
ＲＫＤＬＱＮＦＬＫＫＥＮＫＮＥＫＶ（「ＮＢＨ－２２３」）（配列番号２）
ＲＫＤＬＱＮＦＬＫＫＥＮＫＮＥＫＶＩ（配列番号３）
ＥＨＩＭＥＤＬＤＴＮＡＤＫＱＬ（配列番号４）
ＳＨＥＫＭＨＥＧＤＥＧＰＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥＧＴＰ（「ＮＢＨ－２２４」）（配列番号５）
ＹＲＤＤＬＫＫＬＬＥＴ（「ＮＢＨ－２２５」）（配列番号６）
ＷＦＫＥＬＤＩＮＴＤＧＡＶ（「ＮＢＨ－２２６」）（配列番号７）
のうちの１つから選択されるペプチドのＮ末端又はＣ末端の配列を特異的に認識してこれに結合する。
ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（本明細書では「ＮＢＨ－２２２」とも呼ばれる）（配列番号１）
ＲＫＤＬＱＮＦＬＫＫＥＮＫＮＥＫＶ（「ＮＢＨ－２２３」）（配列番号２）
ＲＫＤＬＱＮＦＬＫＫＥＮＫＮＥＫＶＩ（配列番号３）
ＥＨＩＭＥＤＬＤＴＮＡＤＫＱＬ（配列番号４）
ＳＨＥＫＭＨＥＧＤＥＧＰＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥＧＴＰ（「ＮＢＨ－２２４」）（配列番号５）
ＹＲＤＤＬＫＫＬＬＥＴ（「ＮＢＨ－２２５」）（配列番号６）
ＷＦＫＥＬＤＩＮＴＤＧＡＶ（「ＮＢＨ－２２６」）（配列番号７）
のうちの１つから選択されるペプチドのＮ末端又はＣ末端の配列を特異的に認識してこれに結合する。
【0018】
特に好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、ペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（「ＮＢＨ－２２２」）（配列番号１）のＮ末端又はＣ末端の配列を特異的に認識してこれに結合する。
【0019】
ある好ましい実施形態では、モノクローナル抗体は、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片の前記Ｎ末端配列を特異的に認識してこれに結合する。好ましくは、前記モノクローナル抗体は、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ伸長延長型又は前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮型を特異的に認識せず、これに結合しない。これに関して、「前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ伸長延長型」は、配列のＮ末端を超えて１以上のアミノ酸が伸長していることを意味する。同様に、「前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮型」は、配列のＮ末端から１以上のアミノ酸が除去されたことを意味する。そのため、例えば、モノクローナル抗体がペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ「ＮＢＨ－２２２」（配列番号１）のＮ末端配列を特異的に認識してこれに結合する場合、「Ｎ伸長延長型」はＶＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱ．．．（配列番号８）であり、「Ｎ切断短縮型」はＬＧＨＰＤＴＬＮＱ．．．（配列番号９）である。
【0020】
ある他の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片の前記Ｃ末端配列を特異的に認識してこれに結合し、好ましくは、前記モノクローナル抗体は、前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ伸長延長型又は前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ切断短縮型を特異的に認識せず、これに結合しない。これに関して、「前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ伸長延長型」は、配列のＣ末端を超えて１以上のアミノ酸が伸長していることを意味する。同様に、「前記Ｃ末端アミノ酸配列のＣ切断短縮型」は、配列のＣ末端から１以上のアミノ酸が除去されたことを意味する。そのため、例えば、モノクローナル抗体がペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ「ＮＢＨ－２２２」（配列番号１）のＣ末端配列を特異的に認識してこれに結合する場合、「Ｃ伸長延長型」は．．．ＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶＲ（配列番号１０）であり、「Ｃ切断短縮型」は．．．ＬＮＱＧＥＦＫＥＬ（配列番号１１）である。
【0021】
モノクローナル抗体は、好ましくは、前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含む合成ペプチドに対して作製したモノクローナル抗体である。そのため、例えば、モノクローナル抗体が、ペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（「ＮＢＨ－２２２」）（配列番号１）のＮ末端配列を特異的に認識してこれに結合する場合、モノクローナル抗体は、ペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（配列番号１）のＮ末端配列を特異的に認識してこれに結合するように、配列ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱ（配列番号１２）を有する合成ペプチドに対して作製したモノクローナル抗体であり得る。合成ペプチドに対するモノクローナル抗体を作製するための適切な例示的なプロトコルは、後述の実施例に記載されている。
【0022】
ある例示的な実施形態では、モノクローナル抗体は、ペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ「ＮＢＨ－２２２」（配列番号１）のＮ末端配列を特異的に認識してこれに結合し、好ましくは前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ伸長延長型又は前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮型を特異的に認識せず、これに結合せず、モノクローナル抗体は、好ましくは、
ＣＤＲ－Ｌ１：ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１３）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号１４）
ＣＤＲ－Ｌ３：ＬＮＤＨＳＹＰＹＴ（配列番号１５）
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＶＩＮ（配列番号１６）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１７）
ＣＤＲ－Ｈ３：ＦＡＹ（配列番号１８）
から選択される１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
ＣＤＲ－Ｌ１：ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１３）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号１４）
ＣＤＲ－Ｌ３：ＬＮＤＨＳＹＰＹＴ（配列番号１５）
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＶＩＮ（配列番号１６）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１７）
ＣＤＲ－Ｈ３：ＦＡＹ（配列番号１８）
から選択される１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
【0023】
好ましくは、モノクローナル抗体は、上記に列挙したＣＤＲ配列のうちの少なくとも２、３、４、５又は６つを含む。
【0024】
好ましくは、モノクローナル抗体は、ＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域：
ＣＤＲ－Ｌ１：ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１３）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号１４）及び
ＣＤＲ－Ｌ３：ＬＮＤＨＳＹＰＹＴ（配列番号１５）
を有する。
ＣＤＲ－Ｌ１：ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号１３）
ＣＤＲ－Ｌ２：ＧＡＳＴＲＥＳ（配列番号１４）及び
ＣＤＲ－Ｌ３：ＬＮＤＨＳＹＰＹＴ（配列番号１５）
を有する。
【0025】
好ましくは、モノクローナル抗体は、ＣＤＲ間にフレームワーク配列を含む軽鎖を有し、前記フレームワーク配列は、下記の軽鎖配列中のＣＤＲの間のフレームワーク配列と実質的に同一であるか又は実質的に類似している（その中のＣＤＲは太字で下線付きで示され、フレームワーク配列はイタリック体で示されている）。
ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＬＮＤＨＳＹＰＹＴ（配列番号１９）
ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＬＮＤＨＳＹＰＹＴ（配列番号１９）
【0026】
好ましくは、モノクローナル抗体は、ＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域：
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＶＩＮ（配列番号１６）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１７）及び
ＣＤＲ－Ｈ３：ＦＡＹ（配列番号１８）
を有する。
ＣＤＲ－Ｈ１：ＤＨＶＩＮ（配列番号１６）
ＣＤＲ－Ｈ２：ＥＩＹＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１７）及び
ＣＤＲ－Ｈ３：ＦＡＹ（配列番号１８）
を有する。
【0027】
好ましくは、モノクローナル抗体は、ＣＤＲ間にフレームワーク配列を含む重鎖を有し、前記フレームワーク配列は、下記の重鎖配列中のＣＤＲの間のフレームワーク配列と実質的に同一であるか又は実質的に類似している（その中のＣＤＲは太字で下線付きで示され、フレームワーク配列はイタリック体で示されている）。
ＤＨＶＩＮＷＶＲＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＷＦＡＹ（配列番号２０）
ＤＨＶＩＮＷＶＲＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＷＦＡＹ（配列番号２０）
【0028】
好ましくは、モノクローナル抗体は、軽鎖可変領域配列：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＬＮＤＨＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２１）
（ＣＤＲは太字で下線付き；フレームワーク配列はイタリック体）
及び／又は重鎖可変領域配列：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＨＶＩＮＷＶＲＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２２）
（ＣＤＲは太字で下線付き；フレームワーク配列はイタリック体）
を含む。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＬＮＤＨＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２１）
（ＣＤＲは太字で下線付き；フレームワーク配列はイタリック体）
及び／又は重鎖可変領域配列：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＨＶＩＮＷＶＲＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＧＳＧＳＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２２）
（ＣＤＲは太字で下線付き；フレームワーク配列はイタリック体）
を含む。
【0029】
生体液試料は、例えば、血液、尿、滑液、血清、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、又は血漿などの任意の種類の生体液であり得る。しかし、好ましい実施形態では、生体液試料は血漿又は血清である。
【0030】
イムノアッセイは、限定されないが、競合アッセイ又はサンドイッチアッセイであり得る。同様に、イムノアッセイは、限定されないが、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又はラジオイムノアッセイであり得る。好ましくは、イムノアッセイは競合アッセイである。好ましくは、イムノアッセイは、特に競合ＥＬＩＳＡなどの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。
【0031】
第２の態様では、本発明は、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープを特異的に認識してこれに結合するモノクローナル抗体に関する。モノクローナル抗体は、本発明の第１の態様によるイムノアッセイでの使用に適しており、本発明の第２の態様によるモノクローナル抗体の好ましい及び他の任意の実施形態は、本発明の第１の態様及びその好ましい他の任意の実施形態での使用のためのモノクローナル抗体に関する前述の考察から明らかである。
【0032】
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様によるモノクローナル抗体と、
－ストレプトアビジンコーティングウェルプレート;
－ビオチンに連結された前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むビオチン化ペプチド;
－サンドイッチイムノアッセイで使用するための二次抗体；
－前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むキャリブレータペプチド;
－抗体ビオチン化キット;
－抗体ＨＲＰ標識キット;及び
－抗体放射性標識キット
のうちの少なくとも１つとを含むイムノアッセイキットに関する。
－ストレプトアビジンコーティングウェルプレート;
－ビオチンに連結された前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むビオチン化ペプチド;
－サンドイッチイムノアッセイで使用するための二次抗体；
－前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むキャリブレータペプチド;
－抗体ビオチン化キット;
－抗体ＨＲＰ標識キット;及び
－抗体放射性標識キット
のうちの少なくとも１つとを含むイムノアッセイキットに関する。
【0033】
好ましい実施形態では、イムノアッセイキットは、本発明の第２の態様によるモノクローナル抗体と、
－ストレプトアビジンコーティングウェルプレート;
－ビオチンに連結された前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むビオチン化ペプチド;
－前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むキャリブレータペプチド
のうちの１つ、２つ又は全てを含む。
－ストレプトアビジンコーティングウェルプレート;
－ビオチンに連結された前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むビオチン化ペプチド;
－前記Ｎ末端又はＣ末端の配列を含むキャリブレータペプチド
のうちの１つ、２つ又は全てを含む。
【0034】
例えば、モノクローナル抗体がペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（「ＮＢＨ－２２２」）（配列番号１）のＮ末端配列に結合する場合、適切なビオチン化ペプチドは、配列ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱ－Ｌ－ビオチン（配列番号２３）を有するペプチドであり得、Ｌは任意のリンカーである。同様に、モノクローナル抗体が、ペプチドＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（「ＮＢＨ－２２２」）（配列番号１）のＮ末端配列に結合する場合、適切なキャリブレータペプチドは、配列ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱ（配列番号１２）を有するペプチドであり得る。
【0035】
定義
本明細書で使用される用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」は同義的に使用される。
本明細書で使用される用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」は同義的に使用される。
【0036】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、抗体全体と、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、又は当業者に公知の他のそのような断片などの抗体全体の結合特異性を保持するその断片の両方を指す。同じ結合特異性を保持する抗体は、同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔら３３によって記載されるものなどの、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。
【0037】
抗体は、実施例に記載のＢ細胞クローンから生成することができる。抗体のアイソタイプは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ若しくはＩｇＡアイソタイプ、又はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４サブクラスに特異的なＥＬＩＳＡによって決定することができる。他の適切な方法を用いて、アイソタイプを特定することができる。
【0038】
生成された抗体のアミノ酸配列は、標準的な技術を用いて決定することができる。例えば、ＲＮＡを細胞から単離し、これを使用して逆転写によってｃＤＮＡを生成することができる。次いで、ｃＤＮＡを、抗体の重鎖及び軽鎖を増幅するプライマーを用いてＰＣＲに供する。例えば、全てのＶＨ（可変重鎖）配列のリーダー配列に特異的なプライマーを、以前に決定されているアイソタイプの定常領域に位置する配列に結合するプライマーと共に使用することができる。軽鎖は、Ｖカッパ又はＶラムダリーダー配列にアニールするプライマーとともに、カッパ鎖又はラムダ鎖の３'末端に結合するプライマーを用いて増幅することができる。全長の重鎖及び軽鎖を生成し、配列決定することができる。
【0039】
本明細書で使用される場合、抗体のＣＤＲの間のフレームワークアミノ酸配列は、それらが少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは少なくとも９５％の類似性又は同一性を有する場合に、別の抗体のＣＤＲの間のフレームワークアミノ酸配列と「実質的に同一」又は「実質的に類似」である。類似又は同一のアミノ酸は、連続していても、又は連続していなくてもよい。フレームワーク配列は、１以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。アミノ酸置換は保存的であってよく、このことは置換されたアミノ酸が元のアミノ酸と類似の化学的性質を有することを意味する。当業者なら、どのアミノ酸が類似の化学的性質を共有しているかを理解している。例えば、以下のアミノ酸のグループは、サイズ、電荷及び極性などの類似の化学的性質を共有している：グループ１ Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；グループ２ Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；グループ３ Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；グループ４ Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；グループ５ Ｐｈｅ、Ｔｈｙ、Ｔｒｐ。
【0040】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを用いて、アミノ酸配列を比較することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、必要に応じていずれかの配列にスペースを挿入することにより、最適なアラインメントを見つける。最適なアラインメントのために、アミノ酸の同一性又は類似性（同一性に加えてアミノ酸種類の保存）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似配列の最も長いストレッチを整列させ、そのフィットに値を割り当てる。このようにして、それぞれが異なるスコアを有するいくつかの類似領域が見出される比較を得ることが可能である。両方の種類の分析が本発明において企図される。同一性又は類似性は、好ましくは、フレームワーク配列の全長にわたって計算される。
【0041】
本明細書で使用される用語「Ｎ末端」は、ポリペプチドの末端、すなわちポリペプチドのＮ末端を指し、その一般的な方向における意味として解釈されるべきではない。同様に、用語「Ｃ末端」は、ポリペプチドの末端、すなわちポリペプチドのＣ末端を指し、その一般的な方向における意味として解釈されるべきではない。
【0042】
本明細書で使用される用語「競合的イムノアッセイ」は、試料中に存在する標的ペプチド（もしあれば）が、抗体への結合について既知量のペプチドの標的（例えば、固定基質に結合されるか、又は標識される）と競合するイムノアッセイを指し、これは当業者に公知の技術である。
【0043】
本明細書で使用される用語「標的ペプチド」は、モノクローナル抗体が特異的に認識してこれに結合する、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープを含むか又はそれからなるペプチドを指す。
【0044】
本明細書で使用される用語「サンドイッチイムノアッセイ」は、試料中の抗原の検出のために少なくとも２つの抗体を使用するイムノアッセイを指し、当業者に公知の技術である。
【0045】
本明細書で使用される用語「ＥＬＩＳＡ」（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、試料中に存在する標的ペプチド（もしあれば）が、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素に結合した抗体を用いて検出されるイムノアッセイを指す。次いで、酵素の活性は、測定可能な生成物を生成する基質とのインキュベーションによって評価される。それにより、試料中の標的ペプチドの存在及び／又は量を検出及び／又は定量することができる。ＥＬＩＳＡは、当業者に公知の技術である。
【0046】
本明細書で使用される用語「結合量」は、モノクローナル抗体と標的ペプチドとの間の結合の定量を指し、前記定量が、生体液試料中の標的ペプチドの測定値を検量線と比較することによって決定され、検量線は、標的ペプチドの既知の濃度の標準試料を用いて作成される。ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片：ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱＧＥＦＫＥＬＶ（「ＮＢＨ－２２２」）（配列番号１）のＮ末端配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープを有する標的ペプチドを生体液中で測定する、後に開示する特異的アッセイでは、検量線は、Ｎ末端アミノ酸配列ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱ（配列番号１２）を有する（及び特にアミノ酸配列ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱ（配列番号１２）からなり得る）既知濃度の検量ペプチドの標準試料を用いて作成される。生体液試料中で測定された値を検量線と比較して、試料中の標的ペプチドの実際の量を決定する。
【0047】
本明細書で使用される場合、「既定のカットオフ値」は、統計学的カットオフ値以上である患者試料中の標的ペプチドの測定値が、前記疾患の存在又はその前記特定の状態若しくは重症度の少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも７５％の確率、より好ましくは少なくとも８０％の確率、より好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、及び最も好ましくは少なくとも９５％の確率に相当するという意味において、患者における疾患（すなわち、例えば、炎症によって促進される疾患などの炎症を特徴とするか、若しくは炎症を呈する疾患）又はその特定の状態若しくは重症度（活動性疾患状態又は疾患予後など）の高い可能性を示すと統計学的に決定される結合量を意味する。
【0048】
本明細書で使用される用語「正常な健康な対象に関連する値及び／又は既知の疾患の状態若しくは重症度に関連する値」は、健康であると考えられる、すなわち疾患（すなわち、例えば、炎症によって促進される疾患などの炎症を特徴とするか、又は炎症を呈する疾患）を有しない対象についてイムノアッセイ法によって決定された標的ペプチドの標準化された量、及び／又は既知の状態若しくは重症度の疾患（すなわち、例えば、炎症によって促進される疾患などの炎症を特徴とするか、又は炎症を呈する疾患）を有することが既知である対象についてイムノアッセイ法によって決定された標的ペプチドの標準化された量を意味する。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】図１：カルプロテクチンタンパク質Ｓ１００Ａ９及びＳ１００Ａ８（Ａ及びＢ）の配列、並びにヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）によって生成されるその断片の概要。ＨＮＥ切断点を下向き矢印（↓）で示し、結果として生じるＨＮＥ生成断片の一部を灰色で強調し、ＮＢＨ－２２２、ＮＢＨ－２２３、ＮＢＨ－２２４、ＮＢＨ－２２５及びＮＢＨ－２２６と命名した断片のＮ末端ネオエピトープの全て又は最初を形成するＮ末端配列をより暗い灰色の影付きで強調する。
【図2】図２：質量分析計で試験した、ＨＮＥ切断カルプロテクチン、全長カルプロテクチン又はＨＮＥを含む試料中のＣＰａ９－ＨＮＥ（ＮＢＨ－２２２のＮ末端ネオエピトープ）の相対的存在量（Ａ）；選択ペプチド、伸長ペプチド、切断ペプチド及びナンセンスペプチドに対して試験したＣＰａ９－ＨＮＥ抗体及びアッセイの反応性（Ｂ）;並びにＣＰａ９－ＨＮＥ抗体及びアッセイによって検出した、ＨＮＥ切断カルプロテクチン、全長カルプロテクチン又はＨＮＥを含む試料中のＣＰａ９－ＨＮＥの存在量（Ｃ）。
【図4】図４：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）の患者並びに健康な対象（Ａ及びＣ）からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥの測定レベル、並びに関連するＲＯＣ曲線（Ｂ、Ｄ及びＥ）。データを平均と平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。アスタリスク（＊）は有意差を示す：＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１、＊＊＊Ｐ＜０.００１、＊＊＊＊Ｐ＜０.０００１。
【図5】図５：潰瘍性大腸炎（ＭＥＳ）及びクローン病（ＳＥＳ－ＣＤ）の内視鏡スコアに対するＣＰａ９－ＨＮＥ及び便中カルプロテクチン（便中ＣＰ）の相関（Ａ～Ｄ）。Ｒ＝相関係数、Ｐ＝Ｐ値、ＳＥＳ－ＣＤ＝クローン病の単純内視鏡スコア、ＭＥＳ＝Ｍａｙｏ内視鏡スコア。
【図6】図６：健康な対象、臨床的寛解期のＵＣ患者、及び活動性疾患を有するＵＣ患者におけるＣＰａ９－ＨＮＥの測定レベル並びに関連するＲＯＣ曲線（Ａ～Ｃ）；臨床的寛解期のＵＣ患者、及び活動性疾患を有するＵＣ患者における便中ＣＰの測定レベル並びに関連するＲＯＣ曲線（Ｄ及びＥ）；並びにＣＰａ９－ＨＮＥと、部分的Ｍａｙｏスコア（ｐＭａｙｏ）並びにＴｒｕｌｏｖｅ及びＷｉｔｔｓスコア（ＴＷ－スコア）との相関（Ｆ及びＧ）。
【図7】図７：（Ａ）ＣＯＰＤ患者及び健康な対照におけるＣＰａ９－ＨＮＥの血清バイオマーカーレベル。テューキーの箱ひげ図としてデータを示し、下限測定範囲（ＬＬＭＲ）を破線で示す。有意性が両側マン・ホイットニー検定で見出された。（Ｂ）ＣＯＰＤ患者におけるＣＰａ９－ＨＮＥの診断能を示すＲＯＣ曲線。ＡＵＣ：０.９９９６。
【図8】図８：（Ａ）ＩＰＦ患者及び健康な対照におけるＣＰａ９－ＨＮＥの血清バイオマーカーレベル。データをテューキーの箱ひげ図として示し、ＬＬＭＲを破線で示す。有意性が両側マン・ホイットニー検定で見出された。（Ｂ）ＩＰＦ患者におけるＣＰａ９－ＨＮＥの診断能を示すＲＯＣ曲線。ＡＵＣ：０.９８１３。
【図9】図９：ベースライン時にＣＰａ９－ＨＮＥに関連するＰＤ－１阻害剤によって処置した転移性黒色腫患者の無増悪生存期間と全生存期間を、７５パーセンタイル（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３対Ｑ４）でグループ化（二分）することにより評価するためのカプランマイヤープロット。
【発明を実施するための形態】
【0050】
実施例
以下の実施例に記載の本開示の実施形態は、開示の理解を助けるために記載されており、その後に続く特許請求の範囲に定義される開示の範囲を決して限定すると解釈されるべきではない。以下の実施例は、記載の実施形態を作製及び使用する方法の完全な開示並びに説明を当業者に提供するために提示され、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にするための努力がなされているが、何らかの実験誤差及び偏差を考慮する必要がある。特に断らない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。以下の実施例では、以下の材料及び方法を用いた。
以下の実施例に記載の本開示の実施形態は、開示の理解を助けるために記載されており、その後に続く特許請求の範囲に定義される開示の範囲を決して限定すると解釈されるべきではない。以下の実施例は、記載の実施形態を作製及び使用する方法の完全な開示並びに説明を当業者に提供するために提示され、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にするための努力がなされているが、何らかの実験誤差及び偏差を考慮する必要がある。特に断らない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。以下の実施例では、以下の材料及び方法を用いた。
【0051】
方法
カルプロテクチンのインビトロ切断
タンパク質Ｓ１００Ａ９及びＳ１００Ａ８で構成されるヘテロダイマーである精製カルプロテクチンをエッペンドルフチューブに添加し、タンパク質：プロテアーゼ比１００：１（０．１μｇのＨＮＥあたり１０μｇのカルプロテクチン）でヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）を添加することによって、カルプロテクチン断片をインビトロで生成した。２４時間後に、５ｍＭのＥＤＴＡ停止緩衝液を添加することにより、タンパク質分解反応を阻害した。プロテアーゼ緩衝液のみを含むエッペンドルフチューブ、又はＨＮＥを含まないカルプロテクチン、又はカルプロテクチンを含まないＨＮＥは、実験対照としての役目を果たした。
カルプロテクチンのインビトロ切断
タンパク質Ｓ１００Ａ９及びＳ１００Ａ８で構成されるヘテロダイマーである精製カルプロテクチンをエッペンドルフチューブに添加し、タンパク質：プロテアーゼ比１００：１（０．１μｇのＨＮＥあたり１０μｇのカルプロテクチン）でヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）を添加することによって、カルプロテクチン断片をインビトロで生成した。２４時間後に、５ｍＭのＥＤＴＡ停止緩衝液を添加することにより、タンパク質分解反応を阻害した。プロテアーゼ緩衝液のみを含むエッペンドルフチューブ、又はＨＮＥを含まないカルプロテクチン、又はカルプロテクチンを含まないＨＮＥは、実験対照としての役目を果たした。
【0052】
質量分析
１００μｌの切断された試料又は対照を、製造業者の指示に従って、逆相Ｖｙｄａｃ ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｃ１８カラム（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，カタログ番号７４－７２０６）で脱塩した。非標的質量分析を、Ｅａｓｙ ｎａｎｏ－ＬＣ １０００ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を搭載した四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐベンチトップ質量分析計ＱＥｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。分離を、２μｍ粒子を充填した７５μｍ×２５ｃｍ、Ａｃｃｌａｉｍ Ｐｅｐｍａｐ（商標）ＲＳＬＣ Ｃ１８キャピラリーカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。脱溶媒のために、＋２０００Ｖの噴霧電圧を２７５℃の加熱イオントランスファー設定で使用した。オンライン逆相分離を、３００ｎｌ／分の流速を用いて行い、８５分のリニアバイナリグラディエントを用いた。グラディエントを３％溶媒Ｂで４分から始め、次いで、６４分で３５％溶媒Ｂにし、その後５分で４５％溶媒Ｂにした。最後に、有機溶媒濃度を５分間で９０％まで増加させ、７分間９０％に保った。２００ｍ／ｚで７０,０００の分解能、１×１０６自動ゲインコントロール（ＡＧＣ）ターゲット、及び１００ｍｓ最大イオン注入時間（４４）に設定したＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計でＭＳスキャン（４００～１２００ｍ／ｚ）を記録した。ＭＳに続いて、１５の最も強力な多価イオンで１７,５００の分解能、２×１０４の強度閾値、２ｍ／ｚの分離幅及び３０秒間有効のダイナミックエクスクルージョンでデータ依存的衝突誘発性解離ＭＳ／ＭＳスキャンを行った。
１００μｌの切断された試料又は対照を、製造業者の指示に従って、逆相Ｖｙｄａｃ ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｃ１８カラム（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，カタログ番号７４－７２０６）で脱塩した。非標的質量分析を、Ｅａｓｙ ｎａｎｏ－ＬＣ １０００ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を搭載した四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐベンチトップ質量分析計ＱＥｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。分離を、２μｍ粒子を充填した７５μｍ×２５ｃｍ、Ａｃｃｌａｉｍ Ｐｅｐｍａｐ（商標）ＲＳＬＣ Ｃ１８キャピラリーカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。脱溶媒のために、＋２０００Ｖの噴霧電圧を２７５℃の加熱イオントランスファー設定で使用した。オンライン逆相分離を、３００ｎｌ／分の流速を用いて行い、８５分のリニアバイナリグラディエントを用いた。グラディエントを３％溶媒Ｂで４分から始め、次いで、６４分で３５％溶媒Ｂにし、その後５分で４５％溶媒Ｂにした。最後に、有機溶媒濃度を５分間で９０％まで増加させ、７分間９０％に保った。２００ｍ／ｚで７０,０００の分解能、１×１０６自動ゲインコントロール（ＡＧＣ）ターゲット、及び１００ｍｓ最大イオン注入時間（４４）に設定したＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計でＭＳスキャン（４００～１２００ｍ／ｚ）を記録した。ＭＳに続いて、１５の最も強力な多価イオンで１７,５００の分解能、２×１０４の強度閾値、２ｍ／ｚの分離幅及び３０秒間有効のダイナミックエクスクルージョンでデータ依存的衝突誘発性解離ＭＳ／ＭＳスキャンを行った。
【0053】
カルプロテクチン断片特定
ディスカバリーデータからの特定を、ホモサピエンスプロテオーム（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．１ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２０１５年１２月６日にダウンロードしたＵｎｉＰｒｏｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ＩＤ ＵＰ０００００５６４０，ｎ２０２００）を用いて行った。処理ワークフローは、次のノードからなった：スペクトル前処理用のスペクトルセレクター（前駆体質量範囲：１００～１００００Ｄａ；Ｓ／Ｎ閾値：１.５）、Ｓｅｑｕｅｓｔ－ＨＴ検索エンジン（タンパク質データベース：上記を参照;酵素：酵素なし;Ｍａｘ．ｍｉｓｓｅｄ切断部位：２;ペプチド長範囲６～１４４アミノ酸;前駆体質量公差：１０ｐｐｍ；断片質量公差：０.０２Ｄａ；動的修飾：酸化；静的修飾：システインカルバミドメチル化；及びペプチド検証用のパーコレーター（ペプチドｑ値に基づいてＦＤＲ＜０.０１）。ペプチド強度を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ２.１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で開発された独自のアルゴリズムを用いて定量した。
ディスカバリーデータからの特定を、ホモサピエンスプロテオーム（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．１ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２０１５年１２月６日にダウンロードしたＵｎｉＰｒｏｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ＩＤ ＵＰ０００００５６４０，ｎ２０２００）を用いて行った。処理ワークフローは、次のノードからなった：スペクトル前処理用のスペクトルセレクター（前駆体質量範囲：１００～１００００Ｄａ；Ｓ／Ｎ閾値：１.５）、Ｓｅｑｕｅｓｔ－ＨＴ検索エンジン（タンパク質データベース：上記を参照;酵素：酵素なし;Ｍａｘ．ｍｉｓｓｅｄ切断部位：２;ペプチド長範囲６～１４４アミノ酸;前駆体質量公差：１０ｐｐｍ；断片質量公差：０.０２Ｄａ；動的修飾：酸化；静的修飾：システインカルバミドメチル化；及びペプチド検証用のパーコレーター（ペプチドｑ値に基づいてＦＤＲ＜０.０１）。ペプチド強度を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ２.１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で開発された独自のアルゴリズムを用いて定量した。
【0054】
モノクローナル抗体の生成とクローンの特徴付け
簡単に説明すると、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープを標的とする（より具体的には、「ＮＢＨ－２２２」と称されるＨＮＥ生成カルプロテクチン断片の、本明細書では「ＣＰａ９－ＨＮＥ」とも称されるＮ末端ネオエピトープを標的とする）モノクローナル抗体の生成を以下のように行った。
簡単に説明すると、ＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープを標的とする（より具体的には、「ＮＢＨ－２２２」と称されるＨＮＥ生成カルプロテクチン断片の、本明細書では「ＣＰａ９－ＨＮＥ」とも称されるＮ末端ネオエピトープを標的とする）モノクローナル抗体の生成を以下のように行った。
【0055】
４～６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに、フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、２００μＬの乳化抗原及び５０μｇの免疫原性ペプチド（ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱ－ＧＧＣ－キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（配列番号２４））を皮下免疫した。安定した血清力価レベルに達するまで、マウスを２週間間隔で免疫した。血清力価が最も高いマウスをモノクローナル抗体生成のために選択した。マウスを１ヶ月間安静にした後、１００μＬの０.９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液中の５０μｇの免疫原性ペプチドの静脈内投与によって免疫した。３日後、脾細胞を細胞融合のために単離した。簡単に説明すると、脾細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を生成し、次いで半固形培地法を用いて培養皿内でクローン化した。クローンを９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、限界希釈を用いてモノクローン性の増殖を確実にした。上清を、ストレプトアビジンコーティングプレート（Ｒｏｃｈｅ，Ｈｖｉｄｏｖｒｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ，カタログ番号１１９４０２７９）を用いる間接競合的ＥＬＩＳＡにおいて、選択ペプチド（ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱ（配列番号１２））及び天然物質（血清及び切断物質）に対する反応性についてスクリーニングした。最高の反応性を有するクローンを、製造業者の指示に従ってプロテインＧカラムを用いて精製した（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）。これらのクローンを、選択ペプチド及び伸長ペプチド、切断ペプチド及びナンセンスペプチドに対する反応性について試験し（表１参照）、選択ペプチドに対して最も高い選択性を示すクローンをモノクローナル抗体生成及びアッセイ開発のために選択した。最適なインキュベーション緩衝液、時間、温度、及びビオチン化ペプチドと抗体との間の最適な比率を決定した。
【0056】
【表1】
【0057】
生成及びアッセイ開発のために選択したモノクローナル抗体も配列決定し、ＣＤＲ及びアイソタイプを決定した。鎖の配列は以下のとおりである（ＣＤＲは下線付きで太字。Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端定常領域はイタリック体）：
重鎖配列（マウスＩｇＧ１アイソタイプ）
MEWRIFLFILSGTAGVHSQVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDHVINWVRQRTGQGLEWIGEIYPGSGSTYYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（配列番号２５）
軽鎖配列（マウスカッパアイソタイプ）
MESQTQVLISLLFWVSGACGDIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCLNDHSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（配列番号２６）
重鎖配列（マウスＩｇＧ１アイソタイプ）
MEWRIFLFILSGTAGVHSQVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDHVINWVRQRTGQGLEWIGEIYPGSGSTYYNEKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（配列番号２５）
軽鎖配列（マウスカッパアイソタイプ）
MESQTQVLISLLFWVSGACGDIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCLNDHSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（配列番号２６）
【0058】
イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）プロトコル
試料中のＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープのレベル（より具体的には、ＣＰａ９－ＨＮＥ、すなわち、カルプロテクチンＮＢＨ－２２２のＨＮＥ生成断片のＮ末端ネオエピトープのレベル）を、以下のように実施する固相競合的酵素結合免疫吸着アッセイによって評価した。
試料中のＨＮＥ生成カルプロテクチン断片のＮ末端又はＣ末端の配列からなるＨＮＥ生成ネオエピトープのレベル（より具体的には、ＣＰａ９－ＨＮＥ、すなわち、カルプロテクチンＮＢＨ－２２２のＨＮＥ生成断片のＮ末端ネオエピトープのレベル）を、以下のように実施する固相競合的酵素結合免疫吸着アッセイによって評価した。
【0059】
ストレプトアビジンで事前にコーティングした９６ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃのカタログ番号１１９４０２７９，Ｈｖｉｄｏｖｒｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をビオチン化抗原（ＫＬＧＨＰＤＴＬＮＱ－Ｋ－ビオチン（配列番号２７））でコーティングし、ビオチン化抗原と室温で３０分間インキュベートした。未結合のビオチン化コーティング用抗原を廃棄し、標準化したＥＬＩＳＡプレート洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ（登録登録）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ，ＥＬｘ４０５ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＷ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＵＳＡ）を用いて、ウェルを洗浄緩衝液（２５ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０３６％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ Ｌ５，０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。タンパク質の安定性を維持し、ブロッキングするために、試料を１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号ａ－７９０６、純度９８以上）を含むインキュベーション緩衝液で希釈した。試料及び対照をウェルに加え、ＨＮＥ生成ネオエピトープ（ＣＰａ９－ＨＮＥ）に対する一次モノクローナル抗体と共に２０℃で１時間インキュベートし、３００ｒｐｍで攪拌した。未結合の一次抗体及び試料を廃棄し、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。続いて、ＨＲＰコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅウサギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ カタログ番号３１５－０３５－０４５）をウェルに添加し、２０℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で洗浄することによって、未結合の二次抗体を廃棄した。化学発光基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃのカタログ番号１１５８２９５０００１）をウェル（１００μｌ／ウェル）に添加し、プレートを室温で３分間インキュベートして、プレートを読み取った。最後に、ＥＬＩＳＡリーダー（ＶｅｒｓａＭＡＸ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、４４０ｎｍ及び６５０ｎｍでプレートから放出された相対光単位（ＲＬＵ）を定量化した。標準曲線を、４パラメトリック数学的適合モデルを用いてプロットした。
【0060】
イムノアッセイ開発
上記のアッセイのロバストネスを試験するために、希釈回収率、血清中のペプチド、分析物の安定性、凍結／解凍、抗体特異性（健全性試験）、干渉（溶血、ビオチン、及び血清中に添加された脂質）、アッセイ間変動／アッセイ内変動、及び生物学的関連性（切断材料、血清及び血漿）を試験した。
上記のアッセイのロバストネスを試験するために、希釈回収率、血清中のペプチド、分析物の安定性、凍結／解凍、抗体特異性（健全性試験）、干渉（溶血、ビオチン、及び血清中に添加された脂質）、アッセイ間変動／アッセイ内変動、及び生物学的関連性（切断材料、血清及び血漿）を試験した。
【0061】
ＩＢＤ患者における生物学的検証
患者の人口統計
合計２９人のＵＣ患者と７２人のＣＤ患者からなる患者コホートからの血清試料を試験した。人口統計学的データ、病歴及び治療法を、医療用電子カルテ及び質問票から得た。人体測定パラメータを組み入れ時に測定した。利用可能な場合、患者の内視鏡疾患活動性は、ＣＤ（ＳＥＳ－ＣＤ）の単純内視鏡スコア、及びＵＣのＭａｙｏ内視鏡スコア（ＭＥＳ）に基づいた。ＭＥＳスコアを、疾患の拡大に関する情報を追加するために使用した２６。炎症活性はまた、クローン病活動性指数（ＣＤＡＩ）、部分Ｍａｙｏスコア（ｐＭａｙｏ）及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を用いて、臨床的疾患活動性と生化学的疾患活動性の組み合わせとしても定義された。内視鏡スコアに基づく患者の層別化を以下のように行った：ＳＥＳ－ＣＤ（寛解＝０～２、軽度＝３～６、中等度＝７～１５、重度＞１５）、ＭＥＳ（寛解＝０～２、軽度＝３～６、中等度＝７～１５、重度＞１５）。臨床的及び生化学的活動性を、ＣＤについてはＣＤＡＩ≧１５０又はＣＲＰ＞５、ＵＣについてはｐＭａｙｏ＞１又はＣＲＰ＞５と定義した。疾患の重症度及び拡大はモントリオール分類によって評価した。
患者の人口統計
合計２９人のＵＣ患者と７２人のＣＤ患者からなる患者コホートからの血清試料を試験した。人口統計学的データ、病歴及び治療法を、医療用電子カルテ及び質問票から得た。人体測定パラメータを組み入れ時に測定した。利用可能な場合、患者の内視鏡疾患活動性は、ＣＤ（ＳＥＳ－ＣＤ）の単純内視鏡スコア、及びＵＣのＭａｙｏ内視鏡スコア（ＭＥＳ）に基づいた。ＭＥＳスコアを、疾患の拡大に関する情報を追加するために使用した２６。炎症活性はまた、クローン病活動性指数（ＣＤＡＩ）、部分Ｍａｙｏスコア（ｐＭａｙｏ）及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を用いて、臨床的疾患活動性と生化学的疾患活動性の組み合わせとしても定義された。内視鏡スコアに基づく患者の層別化を以下のように行った：ＳＥＳ－ＣＤ（寛解＝０～２、軽度＝３～６、中等度＝７～１５、重度＞１５）、ＭＥＳ（寛解＝０～２、軽度＝３～６、中等度＝７～１５、重度＞１５）。臨床的及び生化学的活動性を、ＣＤについてはＣＤＡＩ≧１５０又はＣＲＰ＞５、ＵＣについてはｐＭａｙｏ＞１又はＣＲＰ＞５と定義した。疾患の重症度及び拡大はモントリオール分類によって評価した。
【0062】
統計分析
正規分布を達成するために、統計分析の前にデータの対数変換を適用した。正規分布データに関してスチューデントｔ検定及び一元配置ＡＮＯＶＡを適用して統計学的差異を分析した。対数変換によって正規分布が達成されなかった場合には、マン・ホイットニーＵ検定及びクラスカル・ウォリスを適用した。多重比較の補正には偽発見率法（ＦＤＲ＝５％）を用いた。標的ペプチドレベルを、平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）で非対数変換データとして提示する。
正規分布を達成するために、統計分析の前にデータの対数変換を適用した。正規分布データに関してスチューデントｔ検定及び一元配置ＡＮＯＶＡを適用して統計学的差異を分析した。対数変換によって正規分布が達成されなかった場合には、マン・ホイットニーＵ検定及びクラスカル・ウォリスを適用した。多重比較の補正には偽発見率法（ＦＤＲ＝５％）を用いた。標的ペプチドレベルを、平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）で非対数変換データとして提示する。
【0063】
標的ペプチドの診断力を評価する目的で、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を計算した。０.０５以下のＰ値を統計学的に有意であるとみなした。統計解析を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３及びＭｅｄＣａｌｃを用いて行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ型７.０３を用いて図を作成した。
【0064】
ＣＯＰＤ及びＩＰＦ患者における生物学的検証
ＣＯＰＤ患者（ｎ＝６８）及び健康な対照（ｎ＝３６）、及びＩＰＦ患者（ｎ＝１６）及び健康な対照（ｎ＝１０）からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。
ＣＯＰＤ患者（ｎ＝６８）及び健康な対照（ｎ＝３６）、及びＩＰＦ患者（ｎ＝１６）及び健康な対照（ｎ＝１０）からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。
【0065】
転移性黒色腫患者における生物学的検証
抗ＰＤ－１療法（ペムブロリズマブ）によって処置した転移性黒色腫患者の治療前血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した（ｎ＝３５）。インフォームドコンセントを得て、１９７５年のヘルシンキ宣言に準拠したデンマーク首都圏の倫理委員会による承認後に、ヘレウのコペンハーゲン大学病院で標準治療としてペムブロリズマブによって患者を処置した。血清試料を盲検で測定した。ＣＰａ９－ＨＮＥレベルと無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）との関連を、カプランマイヤー分析及びＣｏｘ回帰分析によって、単独で、及びＰＤＬ１発現（１％以上）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＢＲＡＦ変異状態、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）に関して補正した後に評価した。
抗ＰＤ－１療法（ペムブロリズマブ）によって処置した転移性黒色腫患者の治療前血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した（ｎ＝３５）。インフォームドコンセントを得て、１９７５年のヘルシンキ宣言に準拠したデンマーク首都圏の倫理委員会による承認後に、ヘレウのコペンハーゲン大学病院で標準治療としてペムブロリズマブによって患者を処置した。血清試料を盲検で測定した。ＣＰａ９－ＨＮＥレベルと無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）との関連を、カプランマイヤー分析及びＣｏｘ回帰分析によって、単独で、及びＰＤＬ１発現（１％以上）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＢＲＡＦ変異状態、及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）に関して補正した後に評価した。
【0066】
ＳＣＬＣ及びＮＳＣＬＣ患者における生物学的検証
小細胞肺がん患者（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん患者（ＮＳＣＬＣ）、及び健康な対照からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。
小細胞肺がん患者（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん患者（ＮＳＣＬＣ）、及び健康な対照からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。
【0067】
関節疾患患者における生物学的検証
関節リウマチ（ｎ＝１５、年齢［範囲：３９～４７］）、乾癬性関節炎（ｎ＝１１、年齢［範囲：３１～６４］）、乾癬（ｎ＝１２、年齢［範囲：２７～５２］）、強直性脊椎炎（ｎ＝１１、年齢［範囲：３５～５３］）、若年変形性関節炎（ｎ＝１３、年齢＜５１［範囲：４１～５０］）、高齢変形性関節炎ｎ＝１０、年齢＞５０）の患者及び健康な対照（ｎ＝３３）からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。患者のうち４１人は女性であった。
関節リウマチ（ｎ＝１５、年齢［範囲：３９～４７］）、乾癬性関節炎（ｎ＝１１、年齢［範囲：３１～６４］）、乾癬（ｎ＝１２、年齢［範囲：２７～５２］）、強直性脊椎炎（ｎ＝１１、年齢［範囲：３５～５３］）、若年変形性関節炎（ｎ＝１３、年齢＜５１［範囲：４１～５０］）、高齢変形性関節炎ｎ＝１０、年齢＞５０）の患者及び健康な対照（ｎ＝３３）からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。患者のうち４１人は女性であった。
【0068】
結果
カルプロテクチンネオエピトープの生成及び特定
ＵｎｉＰｒｏｔプロテオームＩＤ ＵＰ０００００５６４０を適用するノンターゲット質量分析及びその後のカルプロテクチン断片特定により、Ｓ１００Ａ９とＳ１００Ａ８タンパク質の両方から、いくつかのネオエピトープ含有カルプロテクチン断片がＨＮＥによって生成されたことが明らかになった（表２、及び図１）。５つのＨＮＥ生成カルプロテクチン断片（ＮＢＨ－２２２、ＮＢＨ－２２３、ＮＢＨ－２２４、ＮＢＨ－２２５、ＮＢＨ－２２６）を、そのＰＳＭ、品質ｑ値、及び品質ＰＥＰスコアに基づいて、アッセイ開発の候補物質と見なした。これらのうち、そのＰＳＭ数（表２）及びそのＮ末端ネオエピトープ配列の独自性により、ＮＢＨ－２２２を、この断片のＨＮＥ生成Ｎ末端ネオエピトープ（ＣＰａ９－ＨＮＥ）を標的とするイムノアッセイの開発のためのカルプロテクチン（Ｓ１００Ａ９）断片として選択した。
カルプロテクチンネオエピトープの生成及び特定
ＵｎｉＰｒｏｔプロテオームＩＤ ＵＰ０００００５６４０を適用するノンターゲット質量分析及びその後のカルプロテクチン断片特定により、Ｓ１００Ａ９とＳ１００Ａ８タンパク質の両方から、いくつかのネオエピトープ含有カルプロテクチン断片がＨＮＥによって生成されたことが明らかになった（表２、及び図１）。５つのＨＮＥ生成カルプロテクチン断片（ＮＢＨ－２２２、ＮＢＨ－２２３、ＮＢＨ－２２４、ＮＢＨ－２２５、ＮＢＨ－２２６）を、そのＰＳＭ、品質ｑ値、及び品質ＰＥＰスコアに基づいて、アッセイ開発の候補物質と見なした。これらのうち、そのＰＳＭ数（表２）及びそのＮ末端ネオエピトープ配列の独自性により、ＮＢＨ－２２２を、この断片のＨＮＥ生成Ｎ末端ネオエピトープ（ＣＰａ９－ＨＮＥ）を標的とするイムノアッセイの開発のためのカルプロテクチン（Ｓ１００Ａ９）断片として選択した。
【0069】
【表2】
【0070】
ＣＰａ９－ＨＮＥのイムノアッセイ開発
特異性、正確さ及び精度
質量分析データから、ＮＢＨ－２２２が全長ヒトカルプロテクチン＋ヒト好中球エラスターゼを含む試料にのみ存在し、全長ヒトカルプロテクチン又はヒト好中球エラスターゼのみを含む対照試料には存在しないことが実証された（図２Ａ）。ＣＰａ９－ＨＮＥ（ＮＢＨ－２２２のＨＮＥ生成Ｎ末端ネオエピトープ）を標的とするモノクローナル抗体（本明細書ではＣＰａ９－ＨＮＥ抗体ともいう）を開発し、上記のＥＬＩＳＡプロトコル（以下でＣＰａ９－ＨＮＥアッセイともいう）で使用し、このイムノアッセイに用いた場合のこの抗体の特異性を、選択ペプチド及び伸長ペプチド、切断ペプチド及びナンセンスペプチド（表１に記載の配列を有する）に対して試験した。ＣＰａ９－ＨＮＥ抗体は、ＣＰａ９－ＨＮＥネオエピトープ配列に対する反応性のみを実証した（図２Ｂ）。ＨＮＥ切断カルプロテクチン、又はインタクトな全長ヒトカルプロテクチンのみ、又はヒト好中球エラスターゼのみを含む試料では、ＣＰａ９－ＨＮＥ抗体は、ヒト好中球エラスターゼによって切断されたカルプロテクチンが存在した場合にのみ、標的ネオエピトープ配列を特定することができた（図２Ｃ）。ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイの最終仕様は表３に記載のとおりである。
特異性、正確さ及び精度
質量分析データから、ＮＢＨ－２２２が全長ヒトカルプロテクチン＋ヒト好中球エラスターゼを含む試料にのみ存在し、全長ヒトカルプロテクチン又はヒト好中球エラスターゼのみを含む対照試料には存在しないことが実証された（図２Ａ）。ＣＰａ９－ＨＮＥ（ＮＢＨ－２２２のＨＮＥ生成Ｎ末端ネオエピトープ）を標的とするモノクローナル抗体（本明細書ではＣＰａ９－ＨＮＥ抗体ともいう）を開発し、上記のＥＬＩＳＡプロトコル（以下でＣＰａ９－ＨＮＥアッセイともいう）で使用し、このイムノアッセイに用いた場合のこの抗体の特異性を、選択ペプチド及び伸長ペプチド、切断ペプチド及びナンセンスペプチド（表１に記載の配列を有する）に対して試験した。ＣＰａ９－ＨＮＥ抗体は、ＣＰａ９－ＨＮＥネオエピトープ配列に対する反応性のみを実証した（図２Ｂ）。ＨＮＥ切断カルプロテクチン、又はインタクトな全長ヒトカルプロテクチンのみ、又はヒト好中球エラスターゼのみを含む試料では、ＣＰａ９－ＨＮＥ抗体は、ヒト好中球エラスターゼによって切断されたカルプロテクチンが存在した場合にのみ、標的ネオエピトープ配列を特定することができた（図２Ｃ）。ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイの最終仕様は表３に記載のとおりである。
【0071】
【表3】
【0072】
ＩＢＤ患者の患者人口統計
ＩＢＤ患者からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥレベルは、ＵＣ患者の便中カルプロテクチンレベル（すなわち、便中のインタクトなカルプロテクチンのレベル）及び好中球数と相関することが実証された（図３Ａ及びＢ）。
ＩＢＤ患者からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥレベルは、ＵＣ患者の便中カルプロテクチンレベル（すなわち、便中のインタクトなカルプロテクチンのレベル）及び好中球数と相関することが実証された（図３Ａ及びＢ）。
【0073】
ＩＢＤにおけるＣＰａ９－ＨＮＥ血清レベル
ＣＰａ９－ＨＮＥは、健康な対照と比較してＩＢＤの血清中で上昇している
ＵＣ、ＣＤ及び健康な対象からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥの血清レベルを測定した。ＣＰａ９－ＨＮＥは、健康な対象と比較してＩＢＤ患者の血清において約４倍高いことが実証された（ＡＵＣ：０.９２、Ｐ＜０.０００１）（図４Ａ及びＢ）。患者をＣＤとＵＣに分けると、血清ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＵＣ患者とＣＤ患者で同等に上昇し、健康な対象と比較してＣＤ患者（ＡＵＣ：０.９２、Ｐ＜０.０００１）及びＵＣ患者（ＡＵＣ：０.９４、Ｐ＜０.０００１）において約４倍高かった（図４Ｃ、Ｄ及びＥ）。
ＣＰａ９－ＨＮＥは、健康な対照と比較してＩＢＤの血清中で上昇している
ＵＣ、ＣＤ及び健康な対象からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥの血清レベルを測定した。ＣＰａ９－ＨＮＥは、健康な対象と比較してＩＢＤ患者の血清において約４倍高いことが実証された（ＡＵＣ：０.９２、Ｐ＜０.０００１）（図４Ａ及びＢ）。患者をＣＤとＵＣに分けると、血清ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＵＣ患者とＣＤ患者で同等に上昇し、健康な対象と比較してＣＤ患者（ＡＵＣ：０.９２、Ｐ＜０.０００１）及びＵＣ患者（ＡＵＣ：０.９４、Ｐ＜０.０００１）において約４倍高かった（図４Ｃ、Ｄ及びＥ）。
【0074】
ＣＰａ９－ＨＮＥはＵＣ及びＣＤの内視鏡的疾患活動性に関連する
ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＣＤ（ＳＥＳ－ＣＤ：ｒ＝０.０５７、Ｐ＜０.０００１）及びＵＣ（ＭＥＳ：ｒ＝０.７１、Ｐ＝０.０００３）についての内視鏡的疾患活動性とよく相関した（図５Ａ及びＢ）。便中ＣＰは、ＣＤについての内視鏡的疾患活動性と相関した（ＳＥＳ－ＣＤ：ｒ＝０.３９、Ｐ＝０.００５）が、ＵＣについては相関しなかった（ＭＥＳ：ｒ＝０.３１、Ｐ＝０.０９）（図５Ｃ及びＤ）。
ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＣＤ（ＳＥＳ－ＣＤ：ｒ＝０.０５７、Ｐ＜０.０００１）及びＵＣ（ＭＥＳ：ｒ＝０.７１、Ｐ＝０.０００３）についての内視鏡的疾患活動性とよく相関した（図５Ａ及びＢ）。便中ＣＰは、ＣＤについての内視鏡的疾患活動性と相関した（ＳＥＳ－ＣＤ：ｒ＝０.３９、Ｐ＝０.００５）が、ＵＣについては相関しなかった（ＭＥＳ：ｒ＝０.３１、Ｐ＝０.０９）（図５Ｃ及びＤ）。
【0075】
ＣＰａ９－ＨＮＥはＵＣの臨床的疾患活動性に関連する
部分Ｍａｙｏスコアに基づいて、ＵＣ患者を臨床的寛解と臨床的活動性疾患に分けると、ＣＰａ９－ＨＮＥは、寛解期のＵＣ患者（ＡＵＣ：０.８８、Ｐ＜０.０００１）及び健康なドナー（ＡＵＣ：０.９３、Ｐ＜０.０００１）と比較して、臨床的活動性疾患のＵＣ患者で有意に上昇した（図６Ａ、Ｂ及びＣ）。ＣＰａ９－ＨＮＥの性能を便中カルプロテクチンと比較すると、ＣＰａ９－ＨＮＥは、便中カルプロテクチンと同等であるか又はわずかに優れており、ＡＵＣ及び感度が増加したことが実証された（図６Ａ～Ｅ）。ＣＰａ９－ＨＮＥはまた、ＵＣに関して部分的Ｍａｙｏスコア（ｒ＝０.５１、Ｐ＝０.００８）並びにＴｒｕｌｏｖｅ及びＷｉｔｔｓスコア（ｒ＝０.６４、Ｐ＝０.０００５）と相関することも実証された（図６Ｆ及びＧ）。
部分Ｍａｙｏスコアに基づいて、ＵＣ患者を臨床的寛解と臨床的活動性疾患に分けると、ＣＰａ９－ＨＮＥは、寛解期のＵＣ患者（ＡＵＣ：０.８８、Ｐ＜０.０００１）及び健康なドナー（ＡＵＣ：０.９３、Ｐ＜０.０００１）と比較して、臨床的活動性疾患のＵＣ患者で有意に上昇した（図６Ａ、Ｂ及びＣ）。ＣＰａ９－ＨＮＥの性能を便中カルプロテクチンと比較すると、ＣＰａ９－ＨＮＥは、便中カルプロテクチンと同等であるか又はわずかに優れており、ＡＵＣ及び感度が増加したことが実証された（図６Ａ～Ｅ）。ＣＰａ９－ＨＮＥはまた、ＵＣに関して部分的Ｍａｙｏスコア（ｒ＝０.５１、Ｐ＝０.００８）並びにＴｒｕｌｏｖｅ及びＷｉｔｔｓスコア（ｒ＝０.６４、Ｐ＝０.０００５）と相関することも実証された（図６Ｆ及びＧ）。
【0076】
ＣＰａ９－ＨＮＥは健康な対照と比較してＣＯＰＤ患者で上昇している
ＣＯＰＤ患者及び健康な対照の血清試料中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。図７Ａは、健康な対照（ｎ＝３６）とＣＯＰＤ患者（ｎ＝６８）の間の本発明の差（Ｐ＜０.０００１）を示す。さらに、診断能力を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線において計算し、曲線下面積（ＡＵＣ）は０.９９９６であると決定された、図７Ｂ。測定値は、患者のＢＭＩ、年齢、及び性別の影響を受けなかった。
ＣＯＰＤ患者及び健康な対照の血清試料中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。図７Ａは、健康な対照（ｎ＝３６）とＣＯＰＤ患者（ｎ＝６８）の間の本発明の差（Ｐ＜０.０００１）を示す。さらに、診断能力を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線において計算し、曲線下面積（ＡＵＣ）は０.９９９６であると決定された、図７Ｂ。測定値は、患者のＢＭＩ、年齢、及び性別の影響を受けなかった。
【0077】
ＣＰａ９－ＨＮＥは健康な対照と比較してＩＰＦ患者で上昇している
ＩＰＦ患者（ｎ＝１６）及び健康な対照（ｎ＝１０）の血清試料中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。図８Ａは、健康な対照とＩＰＦ患者の間の本発明の差（Ｐ＜０.０００１）を示す。さらに、ＲＯＣ曲線において診断能力を計算し、ＡＵＣは０.９８１３であると決定された、図８Ｂ。
ＩＰＦ患者（ｎ＝１６）及び健康な対照（ｎ＝１０）の血清試料中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。図８Ａは、健康な対照とＩＰＦ患者の間の本発明の差（Ｐ＜０.０００１）を示す。さらに、ＲＯＣ曲線において診断能力を計算し、ＡＵＣは０.９８１３であると決定された、図８Ｂ。
【0078】
高ＣＰａ９－ＨＮＥは転移性黒色腫の予後不良に関連する
転移性黒色腫患者におけるＣＰａ９－ＨＮＥと生存転帰との関連を、カプランマイヤー分析によって評価した。７５パーセンタイルカットポイントを用いると、ＣＰａ９－ＨＮＥレベルが高い患者（＞７５パーセンタイル）は、ＣＰａ９－ＨＮＥレベルが低い患者と比較して、ＰＦＳ（Ｐ＝０.０１１）及びＯＳ（Ｐ＝０.０００２）が有意に劣ることが判明した（図９）。裏付けとして、単変量Ｃｏｘ回帰により、低いＣＰａ９－ＨＮＥと比較して不良なＰＦＳ（ＨＲ＝３.３２、９５％ＣＩ＝１.２５～８.８２、ｐ＝０.０１６）及びＯＳ（ＨＲ＝１１.３１、９５％ＣＩ＝２.２７～５６.３３、ｐ＝０.００３）の予測因子として、高い（＞７５パーセンタイル）処置前のＣＰａ９－ＨＮＥが同定された（表４）。多変量Ｃｏｘ回帰により、ＰＤＬ１発現、ＬＤＨ、ＢＲＡＦ変異、及びＣＲＰに関して補正した場合、高いＣＰａ９－ＨＮＥは、不良なＰＦＳ（ＨＲ＝８.２２、９５％ＣＩ＝１.３０～５２.１４、ｐ＝０.０２５）及びＯＳ（ＨＲ＝７６.８７、９５％ＣＩ＝４.７３～１２４８.５７、ｐ＝０.００２）の独立予測因子であることが判明した（表４）。
転移性黒色腫患者におけるＣＰａ９－ＨＮＥと生存転帰との関連を、カプランマイヤー分析によって評価した。７５パーセンタイルカットポイントを用いると、ＣＰａ９－ＨＮＥレベルが高い患者（＞７５パーセンタイル）は、ＣＰａ９－ＨＮＥレベルが低い患者と比較して、ＰＦＳ（Ｐ＝０.０１１）及びＯＳ（Ｐ＝０.０００２）が有意に劣ることが判明した（図９）。裏付けとして、単変量Ｃｏｘ回帰により、低いＣＰａ９－ＨＮＥと比較して不良なＰＦＳ（ＨＲ＝３.３２、９５％ＣＩ＝１.２５～８.８２、ｐ＝０.０１６）及びＯＳ（ＨＲ＝１１.３１、９５％ＣＩ＝２.２７～５６.３３、ｐ＝０.００３）の予測因子として、高い（＞７５パーセンタイル）処置前のＣＰａ９－ＨＮＥが同定された（表４）。多変量Ｃｏｘ回帰により、ＰＤＬ１発現、ＬＤＨ、ＢＲＡＦ変異、及びＣＲＰに関して補正した場合、高いＣＰａ９－ＨＮＥは、不良なＰＦＳ（ＨＲ＝８.２２、９５％ＣＩ＝１.３０～５２.１４、ｐ＝０.０２５）及びＯＳ（ＨＲ＝７６.８７、９５％ＣＩ＝４.７３～１２４８.５７、ｐ＝０.００２）の独立予測因子であることが判明した（表４）。
【0079】
【表4】
【0080】
ＣＰａ９－ＨＮＥは健康な対照と比較してＳＣＬＣ及びＮＳＣＬＣ患者で上昇している
小細胞肺がん患者（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん患者（ＮＳＣＬＣ）、及び健康な対照からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）（ｐ＝０.０４３５、ｎ＝１０、中央値＝２１２.１［ＩＱＲ １６４．０－４０７．１］）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（ｐ＝０.０４６７、ｎ＝１０、中央値＝２８１.３［ＩＱＲ １８６．８－３８５．８］）の両方を調べたところ、肺がん患者は、ＣＰａ９－ＨＮＥ血清レベルの統計学的に有意な増加を経験した（図１０）。
小細胞肺がん患者（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん患者（ＮＳＣＬＣ）、及び健康な対照からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）（ｐ＝０.０４３５、ｎ＝１０、中央値＝２１２.１［ＩＱＲ １６４．０－４０７．１］）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（ｐ＝０.０４６７、ｎ＝１０、中央値＝２８１.３［ＩＱＲ １８６．８－３８５．８］）の両方を調べたところ、肺がん患者は、ＣＰａ９－ＨＮＥ血清レベルの統計学的に有意な増加を経験した（図１０）。
【0081】
ＣＰａ９－ＨＮＥは健康なドナーと比較して関節疾患で上昇している
関節リウマチ（ｎ＝１５、年齢［範囲：３９～４７］）、乾癬性関節炎（ｎ＝１１、年齢［範囲：３１～６４］）、乾癬（ｎ＝１２、年齢［範囲：２７～５２］）、強直性脊椎炎（ｎ＝１１、年齢［範囲：３５～５３］）、若年変形性関節炎（ｎ＝１３、年齢＜５１［範囲：４１～５０］）、高齢変形性関節炎（ｎ＝１０、年齢＞５０）の患者及び健康な対照（ｎ＝３３）からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。ＣＰａ９－ＨＮＥバイオマーカーは、健康な対照と比較して全ての関節疾患で有意に上昇し、強直性脊椎炎（Ｐ＜０.００１）、乾癬性関節炎（Ｐ＜０.００１）、若年変形性関節炎（Ｐ＜０.００１）、及び関節リウマチ（Ｐ＜０.０１）患者では健康な対照と比較して最大の差が観察された（図１１）。
関節リウマチ（ｎ＝１５、年齢［範囲：３９～４７］）、乾癬性関節炎（ｎ＝１１、年齢［範囲：３１～６４］）、乾癬（ｎ＝１２、年齢［範囲：２７～５２］）、強直性脊椎炎（ｎ＝１１、年齢［範囲：３５～５３］）、若年変形性関節炎（ｎ＝１３、年齢＜５１［範囲：４１～５０］）、高齢変形性関節炎（ｎ＝１０、年齢＞５０）の患者及び健康な対照（ｎ＝３３）からの血清中のＣＰａ９－ＨＮＥを測定した。ＣＰａ９－ＨＮＥバイオマーカーは、健康な対照と比較して全ての関節疾患で有意に上昇し、強直性脊椎炎（Ｐ＜０.００１）、乾癬性関節炎（Ｐ＜０.００１）、若年変形性関節炎（Ｐ＜０.００１）、及び関節リウマチ（Ｐ＜０.０１）患者では健康な対照と比較して最大の差が観察された（図１１）。
【0082】
考察
この研究において、本発明者らは、ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイが、とりわけ、ＩＢＤ、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ、ＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎及び変形性関節炎を検出し、疾患活動性を評価するための血清ベースのアッセイとして生物学的及び臨床的に妥当で技術的にロバストであることを実証した。さらに、本発明者らは、ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイが転移性黒色腫の患者の予後判定において価値があることを実証した。
この研究において、本発明者らは、ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイが、とりわけ、ＩＢＤ、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ、ＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎及び変形性関節炎を検出し、疾患活動性を評価するための血清ベースのアッセイとして生物学的及び臨床的に妥当で技術的にロバストであることを実証した。さらに、本発明者らは、ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイが転移性黒色腫の患者の予後判定において価値があることを実証した。
【0083】
表３に示すように、カルプロテクチン断片（ＮＢＨ－２２２）を含むＣＰａ９－ＨＮＥは、血清中で最低４８時間、４℃で安定であり、これはまた、このネオエピトープ含有断片が血清及び血漿中のインタクトなカルプロテクチンよりもはるかに長い半減期を有することを意味し、インタクトなカルプロテクチンは、便中では７日間安定していることが証明されている１にもかかわらず、血漿中では５時間の半減期しかない。これは、アッセイの性能がＣＲＰと同様である１０～１２便中カルプロテクチンアッセイを血清／血漿に適用した場合の臨床適用性が不良であることを説明し得る。血清中でＣＰａ９－ＨＮＥ断片の安定性が高い（摂氏４度で最低４８時間）ことは、それがカルプロテクチンの分解産物／代謝産物であり、断片がさらなる分解に対してより抵抗性であるという事実によって説明できる。加えて、ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイは、マイクログラム／グラムではなくナノグラム／ｍＬで測定するため、便中カルプロテクチンアッセイよりも感度が高い２７。
【0084】
メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は活性化のために亜鉛イオンを必要とするため、カルプロテクチンが金属イオン、例えば、カルシウムイオン及び亜鉛イオンに結合できることにより、カルプロテクチンはＭＭＰによる分解に対して非常に抵抗性となる。ＨＮＥは、セリンプロテアーゼであり、金属イオンによる活性化を必要としないため、カルプロテクチンを分解し、ＨＮＥ由来のネオエピトープ含有カルプロテクチン断片を生成することができる５
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２８～３０。したがって、ＣＰａ９－ＨＮＥ含有断片が、活性化好中球顆粒球及び他の活性化白血球、並びにＨＮＥの存在のみによって生成されるため、ＣＰａ９－ＨＮＥレベルは局所組織炎症を表し得る。これは、非活性化循環中白血球によって、及びある程度はカルプロテクチンも発現する上皮細胞によって、循環中及び便中にランダムに放出され得るインタクトなカルプロテクチンとは対照的である１０，３１、３２。
【0085】
ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＣＤ及びＵＣ患者の血清中で非常に豊富であることが実証され、ＩＢＤの診断を助ける代理バイオマーカーとしての高い可能性が示された。これは、このバイオマーカーがＩＢＳ患者とＩＢＤ患者を信頼可能に区別できるため、便中カルプロテクチンと一致している６～８。さらに、ＣＰａ９－ＨＮＥはまた、ＣＤ及びＵＣに関して便中カルプロテクチン、好中球顆粒球数及び疾患活動性とも相関しており、ＣＰａ９－ＨＮＥが疾患活動性をモニターするために使用でき、ＣＤ及びＵＣの内視鏡的評価の代理バイオマーカーとなり得ることが示された。
【0086】
ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイはまた、健康な対照と比較して、肺疾患ＣＯＰＤとＩＰＦに罹患した患者間の有意差を解明した。ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイは、好中球エラスターゼによって生成されるカルプロテクチン上の特異的切断部位を測定する。したがって、これらの結果は、これらの肺疾患においてＮＥの活性がより高いことを示す。
【0087】
ＣＰａ９－ＨＮＥアッセイは、血清ＣＰａ９－ＨＮＥのベースライン（処置前）濃度に基づいて、抗ＰＤ－１療法によって処置した転移性黒色腫患者の全生存率及び無増悪生存率を予測することも実証された。
【0088】
最後に、ＣＰａ９－ＨＮＥは、健康な対照と比較して肺がん患者（ＳＣＬＣとＮＳＣＬＣの両方）の血清において、並びに健康な対照と比較して関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎及び変形性関節炎の患者の血清において有意に上昇していることも示された。
【0089】
結論
ＣＰａ９－ＨＮＥ ＥＬＩＳＡは、カルプロテクチンのＨＮＥ媒介分解の新規血清バイオマーカーとして、インビトロ切断試料及びヒトＩＢＤ血清試料の両方でネオエピトープに対して高い特異性を有することが証明された。ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＣＤ及びＵＣ患者との関連性が高く、ＩＢＤ患者と健康なドナーを区別する高い診断精度を実証した。さらに、ＣＰａ９－ＨＮＥはまた、ＣＤ及びＵＣ、ＳＥＳ－ＣＤ及びＭＥＳに関してそれぞれ、内視鏡的疾患活動性とも相関した。ＣＰａ９－ＨＮＥはまた、ＵＣの臨床的疾患活動性スコア（部分メイヨースコア並びにＴｒｕｌｏｖｅ及びＷｉｔｔｓスコア）とも相関した。したがって、ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＣＤ及びＵＣの疾患活動性の代理バイオマーカーであり、便中ＣＰと少なくとも同等又はわずかに優れた性能を発揮した。したがって、ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＩＢＤの診断及び疾患活動性のモニタリング、並びに関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、変形性関節炎、シェーグレン症候群、及び狼瘡を含む他の炎症によって促進される疾患のための新規臨床関連バイオマーカーである。これはまた、例えば、ＴＮＦ－アルファ、ベドリズマブ及びウステキヌマブの前向き研究において治療有効性を予測又はモニターするためにも使用され得る。
ＣＰａ９－ＨＮＥ ＥＬＩＳＡは、カルプロテクチンのＨＮＥ媒介分解の新規血清バイオマーカーとして、インビトロ切断試料及びヒトＩＢＤ血清試料の両方でネオエピトープに対して高い特異性を有することが証明された。ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＣＤ及びＵＣ患者との関連性が高く、ＩＢＤ患者と健康なドナーを区別する高い診断精度を実証した。さらに、ＣＰａ９－ＨＮＥはまた、ＣＤ及びＵＣ、ＳＥＳ－ＣＤ及びＭＥＳに関してそれぞれ、内視鏡的疾患活動性とも相関した。ＣＰａ９－ＨＮＥはまた、ＵＣの臨床的疾患活動性スコア（部分メイヨースコア並びにＴｒｕｌｏｖｅ及びＷｉｔｔｓスコア）とも相関した。したがって、ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＣＤ及びＵＣの疾患活動性の代理バイオマーカーであり、便中ＣＰと少なくとも同等又はわずかに優れた性能を発揮した。したがって、ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＩＢＤの診断及び疾患活動性のモニタリング、並びに関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、変形性関節炎、シェーグレン症候群、及び狼瘡を含む他の炎症によって促進される疾患のための新規臨床関連バイオマーカーである。これはまた、例えば、ＴＮＦ－アルファ、ベドリズマブ及びウステキヌマブの前向き研究において治療有効性を予測又はモニターするためにも使用され得る。
【0090】
さらに、ＣＰａ９－ＨＮＥは、ＣＯＰＤ及びＩＰＦなどの肺疾患、転移性黒色腫などの転移性疾患、並びにＳＣＬＣ及びＮＳＣＬＣなどの肺がんにおける臨床関連バイオマーカーであることが示されている。
【0091】
本明細書では、特に明示的に示さない限り、「又は」という言葉は、条件の１つだけが満たされることを要求する演算子「排他的又は」とは対照的に、述べられた条件のいずれか又は両方が満たされたときに真の値を答える演算子の意味で使用される。本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、「含む(ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ)」又は「からなる」を意味する。本明細書で受け入れた全ての先行教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】