特表 2023-527766 エキソソーム由来のＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡおよびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-30

(54)【発明の名称】エキソソーム由来のＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡおよびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20230623BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230623BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20230623BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230623BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230623BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230623BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20230623BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230623BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7105 ZNA

A61K48/00

A61P9/10

A61P43/00 105

A61P21/00

A61P11/00

A61K35/12

A61K9/127

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022570643

(86)(22)【出願日】2021-05-17

(85)【翻訳文提出日】2023-01-16

(86)【国際出願番号】 US2021070568

(87)【国際公開番号】W WO2021237238

(87)【国際公開日】2021-11-25

(31)【優先権主張番号】63/027,191

(32)【優先日】2020-05-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513268380

【氏名又は名称】シーダーズ―シナイ メディカル センター

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】マーバン，エドアルド

(72)【発明者】

【氏名】キウロ，アレッサンドラ

(72)【発明者】

【氏名】イブラヒム，アフマド，ジー．

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB14

4C076BB15

4C076BB21

4C076CC11

4C076CC15

4C076FF70

4C084AA13

4C084MA24

4C084MA56

4C084MA65

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4C084NA14

4C084ZA36

4C084ZA59

4C084ZA96

4C084ZB21

4C086AA01

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4C086MA56

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA36

4C086ZA59

4C086ZA96

4C086ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB55

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4C087CA04

4C087MA24

4C087MA56

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA36

4C087ZA59

4C087ZA96

4C087ZB21

(57)【要約】

本明細書において、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置するための治療用エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）およびその使用方法が提供される。エキソソーム由来のｐｉＲＮＡおよび／または同物質を担持するエキソソームにより処置される状態は、一部の実施形態では、虚血性外傷および／または組織線維症を含む。また、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡと、薬学的に許容される賦形剤とを含む治療用組成物が提供される。
【選択図】図２Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

虚血性心筋外傷を処置するエキソソームフリーの方法であって、
虚血性心筋外傷の処置を必要とする対象を同定するステップと、
ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９（配列番号１）のヌクレオチド配列を含むｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の治療上有効量を前記対象に投与することにより、虚血性心筋外傷を処置するステップと
を含む、方法。

【請求項2】

ｐｉＲＮＡが、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

虚血性心筋外傷が、虚血性／再灌流外傷を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

虚血性心筋外傷が、心筋線維症を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記対象が、心筋梗塞を罹患したことがある、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記ｐｉＲＮＡの治療上有効量が、虚血性心筋外傷から約１０分～約２時間後に投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記治療上有効量が、約８０ｎｇ～約５ｍｇのｐｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

ｐｉＲＮＡが、１つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

虚血性心筋外傷を処置するエキソソームフリーの方法であって、
虚血性心筋外傷の処置を必要とする対象を同定するステップと、
エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の治療上有効量を前記対象に投与することにより、虚血性心筋外傷を処置するステップであって、前記治療上有効量が、約８０ｎｇ～約５ｍｇのｐｉＲＮＡを含む、ステップと
を含む、方法。

【請求項10】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来細胞）由来のエキソソームｐｉＲＮＡを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９（配列番号１）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８（配列番号２）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０（配列番号３）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４（配列番号４）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８（配列番号５）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２（配列番号６）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４（配列番号７）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４（配列番号８）、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８（配列番号９）のうちの１つ以上を含む、請求項１０に記載の方法

【請求項12】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

虚血性心筋外傷が、虚血性／再灌流外傷を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

虚血性心筋外傷が、心筋線維症を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項15】

前記対象が、心筋梗塞を罹患したことがある、請求項１０に記載の方法。

【請求項16】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの治療上有効量が、虚血性心筋外傷から約１０分～約２時間後に投与される、請求項１０に記載の方法。

【請求項17】

組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置するエキソソームフリーの方法であって、
組織の修復および／または再生を必要とする状態を有する対象を同定するステップと、
エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の治療上有効量を前記対象に投与することにより、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置するステップであって、前記治療上有効量が、約８０ｎｇ～約５ｍｇのｐｉＲＮＡを含む、ステップと
を含む、方法。

【請求項18】

前記組織の修復および／または再生を必要とする状態が、筋肉または肺組織に対する外傷を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記筋肉組織が、心筋または骨格筋を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記状態が、組織線維症を引き起こす状態である、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記状態が、虚血性心筋外傷または肺線維症を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来細胞）由来のエキソソームｐｉＲＮＡまたは線維芽細胞由来のエキソソームｐｉＲＮＡを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８のうちの１つ以上を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置する細胞フリーの方法であって、
組織の修復および／または再生を必要とする状態を有する対象を同定するステップと、
エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の治療上有効量を前記対象に投与することにより、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置するステップと
を含み、
前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９（配列番号１）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８（配列番号２）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０（配列番号３）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４（配列番号４）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８（配列番号５）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２（配列番号６）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４（配列番号７）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４（配列番号８）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８（配列番号９）、ｐｉＲ－２０４５０（配列番号１０）、ｐｉＲ－１６７３５（配列番号１１）、ｐｉＲ－０１１８４（配列番号１２）、ｐｉＲ－２０７８６（配列番号１３）、ｐｉＲ－００８０５（配列番号１４）、ｐｉＲ－０４１５３（配列番号１５）、ｐｉＲ－１８５７０（配列番号１６）、ｐｉＲ－１６６７７（配列番号１７）、およびｐｉＲ－１７７１６（配列番号１８）のうちの１つ以上を含む、
方法。

【請求項26】

投与するステップが、前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡを多く含む、前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡを含むエキソソーム、細胞外ベシクル、またはリポソームの治療上有効量を投与するステップを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記治療上有効量が、約８０ｎｇ～約５ｍｇのエキソソーム由来のｐｉＲＮＡを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記組織の修復および／または再生を必要とする状態が、筋肉または肺組織に対する外傷を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記状態が、組織線維症を引き起こす状態である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、線維芽細胞由来のエキソソームｐｉＲＮＡまたはＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来の細胞）由来のエキソソームｐｉＲＮＡを含む、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、１つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む、請求項９～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

ｐｉＲＮＡが、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、心筋内、または気管内に投与される、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

肺線維症を処置する細胞フリーの方法であって、
肺線維症を有する対象を同定するステップと、
エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）、治療用エキソソーム、および／またはエキソソーム由来のｍｉＲＮＡの治療上有効量を前記対象に投与することにより肺線維症を処置するステップであって、前記エキソソームが、操作された線維芽細胞に由来する、ステップと
を含む、方法。

【請求項34】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ、治療用エキソソーム、および／またはエキソソーム由来のｍｉＲＮＡの治療上有効量が、気管内に投与される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記治療用エキソソームの治療上有効量が、約１０^６～約１０^１２個の粒子を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

組織の修復を調節する方法であって、分化転換している線維芽細胞の集団をエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）、エキソソーム、および／またはエキソソーム由来のｍｉＲＮＡの治療上有効量と接触させることにより、前記線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換を抑制するステップを含み、前記エキソソームが、操作された線維芽細胞に由来する、方法。

【請求項37】

前記エキソソームの治療上有効量が、約１０^６～約１０^１２個の粒子を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記分化転換が、ＴＧＦβが介在する分化転換である、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記接触するステップを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行う、請求項３６に記載の方法。

【請求項40】

ｐｉＲＮＡの治療上有効量が、約１ｎＭ～約２００ｎＭを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記接触するステップが、エキソソームを対象に投与するステップを含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項42】

前記分化転換している線維芽細胞が、肺線維芽細胞である、請求項３６に記載の方法。

【請求項43】

前記接触するステップが、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ、エキソソーム、および／またはエキソソーム由来のｍｉＲＮＡを、対象へ気管内投与するステップを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記対象が、肺線維症を有する、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記接触するステップが、前記分化転換している線維芽細胞の集団をエキソソーム由来のｍｉＲＮＡの治療上有効量と接触させるステップを含み、前記エキソソーム由来のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－１８３－５ｐ（配列番号１９）、ｍｉＲ－１８２－５ｐ（配列番号２０）、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ（配列番号２１）、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号２２）、ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号２３）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号２４）、およびｍｉＲ－５１０－３ｐ（配列番号２５）のうちの１つ以上を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項46】

前記接触するステップが、前記分化転換している線維芽細胞の集団をエキソソーム由来のｐｉＲＮＡの治療上有効量と接触させるステップを含み、前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｐｉＲ－２０４５０（配列番号１０）、ｐｉＲ－２０５４８（配列番号９）、ｐｉＲ－１６７３５（配列番号１１）、ｐｉＲ－０１１８４（配列番号１２）、ｐｉＲ－２０７８６（配列番号１３）、ｐｉＲ－００８０５（配列番号１４）、ｐｉＲ－０４１５３（配列番号１５）、ｐｉＲ－１８５７０（配列番号１６）、ｐｉＲ－１６６７７（配列番号１７）、およびｐｉＲ－１７７１６（配列番号１８）のうちの１つ以上を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項47】

前記ｐｉＲＮＡを治療用エキソソームから単離するステップを含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

前記治療用エキソソームが、ＣＤＣ由来のエキソソームまたは線維芽細胞由来のエキソソームである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記治療用エキソソームを、治療用細胞の集団から単離するステップを含む、請求項３３～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記治療用細胞の集団を、非治療用細胞から作製するステップを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記非治療用細胞が、線維芽細胞またはＣＤＣを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記ＣＤＣが、不死化したＣＤＣである、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記治療用細胞が、同種である、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの治療上有効量が、約８０ｎｇ～約５００μｇである、請求項３３～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの治療上有効量が、約１００ｎｇ～約１０μｇである、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記ｐｉＲＮＡの治療上有効量が、約１０^９～約１０^１２個の不死化したＣＤＣ由来のエキソソームを投与する治療効果と同等の治療効果を有する量である、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

それを必要とする対象の虚血性心外傷を処置するためのエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の使用。

【請求項58】

それを必要とする対象の虚血性心外傷を処置するための医薬の調製のためのエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の使用。

【請求項59】

前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８のうちの１つ以上を含む、請求項５７および５８に記載のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡの使用。

【請求項60】

それを必要とする対象の肺線維症を処置するための治療用エキソソームおよび／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の使用。

【請求項61】

それを必要とする対象の肺線維症を処置するための医薬の調製のための治療用エキソソームおよび／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の使用。

【請求項62】

前記治療用エキソソームおよび／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｐｉＲ－２０４５０、ｐｉＲ－２０５４８、ｐｉＲ－１６７３５、ｐｉＲ－０１１８４、ｐｉＲ－２０７８６、ｐｉＲ－００８０５、ｐｉＲ－０４１５３、ｐｉＲ－１８５７０、ｐｉＲ－１６６７７、およびｐｉＲ－１７７１６のうちの１つ以上を含む、請求項６０または６１に記載の治療用エキソソームおよび／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡの使用。

【請求項63】

組織の修復および／または再生を必要とする状態の処置のためのエキソソームフリーの治療用組成物であって、
ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８から選択される１つ以上のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡと、
薬学的に許容される賦形剤と
を含む、組成物。

【請求項64】

１つ以上のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡと、薬学的に許容される賦形剤とから本質的になる、請求項６３に記載の組成物。

【請求項65】

前記１つ以上のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９である、請求項６３に記載の組成物。

【請求項66】

前記状態が、組織線維症を引き起こす状態である、請求項６３に記載の組成物。

【請求項67】

前記状態が、虚血性心筋外傷または肺線維症を含む、請求項６３に記載の組成物。

【請求項68】

前記１つ以上のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、線維芽細胞由来のエキソソームｐｉＲＮＡまたはＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来の細胞）由来のエキソソームｐｉＲＮＡを含む、請求項６３～６７のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する言及
本出願は、全体が本明細書中参照により組み込まれている２０２０年５月１９日に出願された米国特許仮出願番号第６３／０２７１９１号に対する優先権を主張する。

【0002】

連邦政府により支援されたＲ＆Ｄに関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によりＥｄｕａｒｄｏ Ｍａｒｂａｎ博士に授与されたグラント番号第Ｒ０１ ＨＬ１２４０７４号の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。

【0003】

配列リストに対する言及
本出願は、電子形式の配列リストと共に出願されている。配列リストは、３．８５ＫＢの大きさで、２０２１年５月１６日に作成された標題ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＣＳＭＣ０１４ＷＯ．ｔｘｔのファイルとして提供されている。配列リストの電子形式での情報の全体は、本明細書中参照により組み込まれている。

【背景技術】

【0004】

本開示は、全般的に、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置するためのエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）およびその使用方法に関する。

【0005】

ｐｉＲＮＡは、ＰＩＷＩタンパク質と結合する小分子ノンコーディングＲＮＡのグループであり、遺伝子サイレンシングのレトロトランスポゾンおよびの生殖細胞株における他の遺伝要素で機能することが知られている。細胞質ＰＩＷＩタンパク質は、トランスポゾンの標的のヌクレオチド鎖切断を導く小分子ＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼ（スライサー）であり、核ＰＩＷＩタンパク質は、転写サイレンシングに介在するために標的のゲノム座にサイレンシング複合体をアセンブリする。

【0006】

ＣＤＣ（Ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来の細胞）は、前臨床および臨床の背景において治療効果を示した心臓由来の前駆細胞の集団である。ＣＤＣは、生理活性分子を搭載した脂質二重層のナノ粒子である細胞外ベシクル（ＥＶ）を分泌することにより機能する。治療可能性を保持する不死化したＣＤＣ（ｉｍＣＤＣ）が作製でき、これらの分泌したＥＶを介して高いＣＤＣの機能を提供することができる。

【発明の概要】

【0007】

本明細書において、虚血性心筋外傷を処置するエキソソームフリーの方法および任意選択で細胞フリーの方法であって、虚血性心筋外傷を有するかまたはそれを処置する必要がある対象を同定するステップと、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）有効（または治療上有効）量を対象に投与するステップを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、有効（治療上有効）量は、約８０ｎｇ～約５ｍｇのｐｉＲＮＡを含み、これにより、虚血性心筋外傷を処置する。任意選択で、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、ＣＤＣ（Ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来の細胞）由来のエキソソームｐｉＲＮＡを含む。任意選択で、虚血性心筋外傷は、虚血性／再灌流外傷を含む。一部の実施形態では、虚血性心筋外傷は、心筋線維症を含む。一部の実施形態では、対象は心筋梗塞を罹患したことがある。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量が、虚血性心筋外傷から約１０分～約２時間後に投与される。

【0008】

また、虚血性心筋外傷を処置するエキソソームフリーの方法および任意選択で細胞フリーの方法であって、虚血性心筋外傷を処置する必要がある対象を同定するステップと、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９のヌクレオチド配列を含むｐｉＲＮＡの有効（治療上有効）量を前記対象に投与することにより、虚血性心筋外傷を処置するステップとを含む、方法が提供される。さらに、本明細書において、筋肉外傷（たとえば心筋外傷）を処置するエキソソームフリーの方法であって、ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）の有効（治療上有効）量を前記対象に投与することにより、外傷を処置するステップを含む、方法が提供される。任意選択で、ｐｉＲＮＡは、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９のヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態では、虚血性心筋外傷は、虚血性／再灌流外傷を含む。一部の実施形態では、虚血性心筋外傷は、心筋線維症を含む。一部の実施形態では、対象は、心筋梗塞を罹患したことがある。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡの治療上有効量が、虚血性心筋外傷から約１０分～約２時間後に投与される。一部の実施形態では、治療上有効量は、約８０ｎｇ～約５ｍｇのｐｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、１つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。

【0009】

また本明細書において、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置するエキソソームフリーの方法であって、組織の修復および／または再生を必要とする状態を有する対象を同定するステップと、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の有効（治療上有効）量を前記対象に投与することにより、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置するステップであって、前記治療上有効量が、約８０ｎｇ～約５ｍｇのｐｉＲＮＡを含む、ステップとを含む方法が提供される。任意選択で、組織の修復および／または再生を必要とする状態は、筋肉または肺組織に対する外傷を含む。任意選択で、筋肉組織は、骨格筋または心筋を含む。一部の実施形態では、状態は、組織線維症を引き起こす状態を含むかまたは当該状態である。一部の実施形態では、状態は、虚血性心筋外傷または肺線維症を含む。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、線維芽細胞由来のエキソソームｐｉＲＮＡまたはＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来の細胞）由来のエキソソームｐｉＲＮＡを含む。

【0010】

虚血性心筋外傷を処置する方法または組織の修復および／もしくは再生を必要とする状態を処置する方法のいくつかの実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９（配列番号１）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８（配列番号２）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０（配列番号３）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４（配列番号４）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８（配列番号５）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２（配列番号６）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４（配列番号７）、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４（配列番号８）、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８（配列番号９）のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、そのバリアント、および／またはそのフラグメントである。

【0011】

また、本明細書において、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置する細胞フリーの方法であって、組織の修復および／または再生を必要とする状態を有する対象を同定するステップと、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の有効（または治療上有効）量を対象に投与することにより、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置するステップとを含み、前記エキソソーム由来のｐｉＲＮＡが、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８、ｐｉＲ－２０４５０、ｐｉＲ－１６７３５、ｐｉＲ－０１１８４、ｐｉＲ－２０７８６、ｐｉＲ－００８０５、ｐｉＲ－０４１５３、ｐｉＲ－１８５７０、ｐｉＲ－１６６７７、およびｐｉＲ－１７７１６のうちの１つ以上を含む、方法が提供される。任意選択で、投与するステップが、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡを多く含む、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡを含むエキソソーム、細胞外ベシクル、またはリポソームの有効（治療上有効）量を投与するステップを含む。一部の実施形態では、有効（治療上有効）量は、約８０ｎｇ～約５ｍｇのエキソソーム由来のｐｉＲＮＡを含む。実施形態に応じて、組織の修復および／または再生を必要とする状態は、筋肉および／または肺組織に対する外傷を含む。一部の実施形態では、状態は、組織線維症を引き起こす状態を含むかまたは当該状態である。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、線維芽細胞由来のエキソソームｐｉＲＮＡまたはＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来の細胞）由来のエキソソームｐｉＲＮＡを含む。

【0012】

一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡ、たとえばエキソソーム由来のｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量が、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、心筋内、または気管内に投与される。

【0013】

一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、１つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。

【0014】

また、本明細書において、肺線維症を処置する細胞フリーの方法であって、肺線維症を有する対象を同定するステップと、治療用エキソソーム、エキソソーム由来のｍｉＲＮＡ、および／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の有効（または治療上有効）量を前記対象に投与することにより、肺線維症を処置するステップであって、エキソソームが、操作された線維芽細胞に由来する、ステップとを含む、方法が提供される。任意選択で、治療用エキソソーム、エキソソーム由来のｍｉＲＮＡ、および／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量が、気管内投与される。一部の実施形態では、治療用エキソソームの有効（または治療上有効）量は、約１０^６～約１０^１２個の粒子を含む。

【0015】

また本明細書において、組織の修復を調節する方法であって、分化転換している線維芽細胞の集団を、エキソソーム、エキソソーム由来のｍｉＲＮＡ、および／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の有効（または治療上有効）量と接触させることにより、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換を抑制するステップを含み、前記エキソソームが操作された線維芽細胞に由来する、方法が提供される。任意選択で、エキソソームの有効（または治療上有効）量は、約１０^６～約１０^１２個の粒子を含む。一部の実施形態では、分化転換は、ＴＧＦβが介在する分化転換である。一部の実施形態では、接触するステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。任意選択で、ｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約１ｎＭ～約２００ｎｍを含む。

【0016】

一部の実施形態では、接触するステップは、エキソソームを対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、線維芽細胞は、肺線維芽細胞である。任意選択で、接触するステップは、エキソソーム、エキソソーム由来のｍｉＲＮＡ、および／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡを対象に気管内投与するステップを含む。一部の実施形態では、対象は、肺線維症を有する。

【0017】

一部の実施形態では、エキソソーム由来のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１８３－５ｐ（配列番号１９）、ｍｉＲ－１８２－５ｐ（配列番号２０）、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ（配列番号２１）、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ（配列番号２２）、ｍｉＲ－１７－５ｐ（配列番号２３）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号２４）、およびｍｉＲ－５１０－３ｐ（配列番号２５）のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、ｐｉＲ－２０４５０（配列番号１０）、ｐｉＲ－２０５４８（配列番号９）、ｐｉＲ－１６７３５（配列番号１１）、ｐｉＲ－０１１８４（配列番号１２）、ｐｉＲ－２０７８６（配列番号１３）、ｐｉＲ－００８０５（配列番号１４）、ｐｉＲ－０４１５３（配列番号１５）、ｐｉＲ－１８５７０（配列番号１６）、ｐｉＲ－１６６７７（配列番号１７）、およびｐｉＲ－１７７１６（配列番号１８）、それらのバリアント、および／またはそれらのフラグメントのうちの１つ以上を含む。

【0018】

一部の実施形態では、本方法は、治療用エキソソームから、ｐｉＲＮＡ、たとえばエキソソーム由来のｐｉＲＮＡを単離するステップを含む。任意選択で、治療用エキソソームは、ＣＤＣ由来のエキソソームまたは線維芽細胞由来のエキソソームである。

【0019】

一部の実施形態では、本方法は、治療用細胞の集団から治療用エキソソームを単離するステップを含む。任意選択で、本方法は、非治療用細胞から治療用細胞の集団を作製するステップを含む。一部の実施形態では、非治療用細胞は、線維芽細胞またはＣＤＣを含む。任意選択で、ＣＤＣは、不死化したＣＤＣである。

【0020】

一部の実施形態では、治療用細胞は、同種である。いくつかの実施形態では、治療用細胞は、ｐｉＲＮＡを投与する前、当該投与と同時、または当該投与の後に、投与される。

【0021】

一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約８０ｎｇ～約５００μｇである。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約１００ｎｇ～約１０μｇ（たとえば、約１００ｎｇ、約２００ｎｇ、約３００ｎｇ、約４００ｎｇ、約５００ｎｇ、約６００ｎｇ、約７００ｎｇ、約８００ｎｇ、約９００ｎｇ、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、およびそれらの間のいずれかの量）である。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡ、たとえば、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約１０^９～約１０^１２個の不死化したＣＤＣ由来のエキソソームを投与する治療効果と同等の治療効果を有する量である。

【0022】

また、本明細書において、それを必要とする対象の虚血性心外傷を処置するためのエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の使用が提供される。また、それを必要とする対象の虚血性心外傷を処置するための医薬の調製のためのエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の使用が提供される。本明細書において、それを必要とする対象の肺線維症を処置するための治療用エキソソームおよび／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の使用が提供される。また、本明細書において、それを必要とする対象の肺線維症を処置するための医薬の調製のための治療用エキソソームおよび／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の使用が提供される。

【0023】

また、本明細書において、組織の修復および／または再生を必要とする状態の処置のためのエキソソームフリーの治療用組成物であって、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８から選択される１つ以上のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡと、薬学的に許容される賦形剤とを含む治療用組成物が提供される。任意選択で、本組成物は、１つ以上のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡと薬学的に許容される賦形剤とから本質的になる。一部の実施形態では、１つ以上のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９である。一部の実施形態では、状態は、組織線維症を引き起こす状態を含むか当該状態である。一部の実施形態では、状態は、虚血性心筋外傷または肺線維症を含む。一部の実施形態では、１つ以上のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、線維芽細胞由来のエキソソームｐｉＲＮＡまたはＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来の細胞）由来のエキソソームｐｉＲＮＡを含む。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A】図１Ａは、ｉｍＣＤＣ（不死化したｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来細胞）由来のエキソソーム（ＩＭＥＸ）の単離のための概略的なプロトコルを示す。

【図1B】図１Ｂは、初代ＣＤＣ（ｐＣＤＣ）、ｉｍＣＤＣ、ならびにｐＣＤＣ由来の細胞外ベシクル／エキソソーム（ＥＶ）（ｐＣＤＣ－ＥＶ）およびｉｍＣＤＣ由来の細胞外ベシクル／エキソソーム（ＥＶ）（ｉｍＣＤＣ－ＥＶ）におけるＩＭＥＸ ｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）を示す。

【図1C】図１Ｃは、異なる濃度のｉｍＣＤＣ－ＥＶにおけるＩｍＥＶ－ｐｉＲＮＡのｑＰＣＲによる検出を示す。

【図2A】図２Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏでの虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）モデルの概略的なプロトコルを示す。

【図2B】図２Ｂは、Ｉ／Ｒから４８時間後の心臓のトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色を示す。

【図3A-3B】図３Ａおよび３Ｂは、Ｉ／Ｒから２４時間後および４８時間後の心筋トロポニンＩのレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。

【図4A-4B】図４Ａおよび４Ｂは、Ｉ／Ｒ後の末梢血における単球のパーセンテージに及ぼすＩｍＥＶ－ｐｉＲＮＡの効果を示す。図４Ａは、Ｉ／Ｒから２４時間後および４８時間後での単球のパーセンテージを示す。図４Ｂは、Ｉ／Ｒから２４時間～４８時間後までの単球のパーセンテージの変化を示す。

【図5A-5B】図５Ａおよび５Ｂは、Ｉ／Ｒから２４時間後および４８時間後の末梢血における単球のパーセンテージを示す。

【図6A-6C】図６Ａ－６Ｃは、ナイーブな（Ｍ０）ＢＭＤＭ（骨髄由来のマクロファージ）の増殖活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価を示す。図６Ａは、２４時間の間記載されるように処置されたＢＭＤＭ由来のＭ０の画像を示す。図６Ｂは、８時間および２４時間での細胞の代謝活性を検出するＣＣＫ－アッセイを示す（ＦＣ（倍差）ｖｓビヒクル）。図６Ｃは、２４時間でのＢｒＤｕ陽性細胞を示す（ＦＣｖｓビヒクル）。

【図7A-7B】図７Ａおよび７Ｂは、一晩の処置後のＢＭＤＭ由来のＭ０の遊走のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価を示す。図７Ａは、記載される条件での一晩の処置の後にクリスタルバイオレットで染色したポリカーボネートインサート中のＢＭＤＭ由来のＭ０の画像を示す。図７Ｂは、ＢＭＤＭ由来のＭ０の遊走の計算を示す。

【図8A-8D】図８Ａ－８Ｄは、ＡＳＴＥＸ（ＡＳＴＥＣ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ－Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ）由来の細胞外ベシクル／エキソソーム）のシーケンシングがいくつかの抗線維性メディエーターを明らかにしていることを示している。図８Ａおよび８Ｂは、修飾されていない正常なヒト真皮線維芽細胞におけるＥＶと比較したＡＳＴＥＸにおけるｍｉＲの差次的な発現を示す。図８Ｃは、顕著な抗線維性ＭｉＲのＱＰＣＲのバリデーションを示す。図８Ｄは、線維芽細胞ＥＶと比較したＡＳＴＥＸにおけるｐｉＲＮＡ（Ｐｉｗｉ ＲＮＡ）の多さおよび存在量を示す。

【図9A-9C】図９Ａ－９Ｃは、ＡＳＴＥＸの気管内投与の耐用量試験を示す。図９Ａは、耐用量試験の試験概略を示す。ＡＳＴＥＸは、動物の体重の保持（図９Ｂ）および浮腫の欠如（体重に対する肺の重量比）（図９Ｃ）により示されるように健常な動物の肺において良好に認容される。

【図10A-10D】図１０Ａ－１０Ｄは、ＡＳＴＥＸが、線維症の不存在（ヒドロキシプロリン、図１０Ａ）、Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア（図１０Ｂ）、浸潤する白血球の欠如を示すＨ＆Ｅ染色（図１０Ｃ）、および肺胞組織におけるマッソントリクローム染色（図１０Ｄ）により示されるように健常な動物の肺において良好に認容されることを示している。

【図11A-11C】図１１Ａ－１１Ｃは、気管内に滴下したＡＳＴＥＸがマウスのブレオマイシンモデルにおいて生存を改善し肺線維症を減弱することを示している。図１１Ａは、動物試験の試験概略を示す。図１１Ｂは、ビヒクルで処置した損傷した動物と比較した、ＡＳＴＥＸを滴下した動物の生存の増大を示すカプランマイヤープロットを示す。図１１Ｃは、肺組織におけるヒドロキシプロリンの減少により見られる肺の線維症の低減を示す。

【図12A-12D】図１２Ａ－１２Ｄは、ＡＳＴＥＸがｉｎ ｖｉｔｒｏでの肺線維芽細胞の分化転換を低減できることを示す。図１２Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験の試験概略を示す。ＡＳＴＥＸで処置したＴＧＦｂ（外傷）に曝露したヒト肺線維芽細胞でのα平滑筋の発現のレベルの低下が、フローサイトメトリー（図１２Ｂ）およびウェスタンブロット（図１２Ｃおよび１２Ｄ）により観察された。

【図13】図１３は、本開示の実施形態による、虚血性心筋外傷を処置する方法の非限定的な例のフローチャートを示す。

【図14】図１４は、本開示の実施形態による、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置する方法の非限定的な例のフローチャートを示す。

【図15】図１５は、本開示の実施形態による、肺線維症を処置する方法の非限定的な例のフローチャートを示す。

【図16】図１６は、ヒトｐｉＲＮＡ配列のｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８、ｐｉＲ－２０４５０、ｐｉＲ－１６７３５、ｐｉＲ－０１１８４、ｐｉＲ－２０７８６、ｐｉＲ－００８０５、ｐｉＲ－０４１５３、ｐｉＲ－１８５７０、ｐｉＲ－１６６７７、およびｐｉＲ－１７７１６のヌクレオチド配列を示す。

【図17A-17B】図１７Ａおよび１７Ｂは、初代マクロファージの細胞質と核との間のｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡシャトリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）を示すグラフの集合である。

【図18A-18B】図１８Ａおよび１８Ｂは、初代マクロファージの全体的なメチル化を増大させるｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ処置を示すグラフの集合である。

【図19】図１９は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよび／またはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果をまとめた概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本明細書中開示されるように、ＣＤＣにより産生されるエキソソームおよび細胞外ベシクル（ＥＶ）の治療効果は、エキソソームまたはＥＶの１つ以上の生理活性ペイロード分子に起因し得る。たとえば、ｉｍＣＤＣは、初代ＣＤＣと比較して異なるＲＮＡの中身（ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｐｉＲＮＡ）を示し得る。特に、ｐｉｗｉタンパク質により結合した小分子ＲＮＡのＰｉｗｉ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）は、エピゲノムおよびトランスクリプトームの両方の重要な調節因子である。ＩｍＣＤＣ－ＥＶ（ｉｍＥＶ－Ｐｉ）は、ｐｉＲＮＡを著しく多く含み得る。

【0026】

本明細書において、それを必要とする対象にエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）を投与することにより組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置する方法が提供される。本明細書中に開示されるように、治療用細胞、たとえばｉｍＣＤＣ（不死化したｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来細胞）および操作された線維芽細胞により産生されるエキソソーム／ＥＶは、ｐｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどの生理活性生体分子を含み得、よってエキソソームおよび／または細胞の治療効果を介在し得る。一部の実施形態では、状態、たとえば虚血性外傷、線維症などを罹患した対象にエキソソーム由来のｐｉＲＮＡを投与することは、当該状態を処置し得る。一部の実施形態では、状態、たとえば虚血性外傷、線維症などを罹患した対象にｐｉＲＮＡを含む治療用エキソソームを投与することは、当該状態を処置し得る。

【0027】

本明細書中使用される場合、「エキソソーム」は、本開示の技術および観点において当業者が理解する通常の意味を有する。また、エキソソームは、マイクロベシクル、エピディディモソーム（ｅｐｉｄｉｄｉｍｏｓｏｍｅ）、アルゴソーム（ａｒｇｏｓｏｍｅ）、エキソソーム様ベシクル、微粒子、プロミニノソーム（ｐｒｏｍｉｎｉｎｏｓｏｍｅ）、ｐｒｏｓｔａｓｏｍｅ、ｄｅｘｏｓｏｍｅ、ｔｅｘｏｓｏｍｅ、ｄｅｘ、ｔｅｘ、アーケオソーム（ａｒｃｈｅｏｓｏｍｅ）、およびｏｎｃｏｓｏｍｅを含み得る。エキソソームおよび細胞外ベシクル（ＥＶ）は、他の意味が記載されない限り、本明細書中互換可能に使用される。他の意味が本明細書中に記載されない限り、上記用語はそれぞれ、操作された高効力の、様々な、膜に結合したベシクルの各種を含むように理解すべきである。

【0028】

「ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ」および「ｐｉＲＮＡ」は、約２４～約３ヌクレオチド長、たとえば約２６～約３２ヌクレオチド長の小分子のノンコーディングＲＮＡを表すように本明細書中互換可能に使用される。内因性ｐｉＲＮＡは、ＰＩＷＩタンパク質（たとえばＰｉｗｉ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（たとえばＡｇｏ３）、およびＡｕｂｅｒｇｉｎｅ）に結合し得る。内因性ｐｉＲＮＡは、宿主の転位性エレメントに相補的であり得る。

【0029】

Ｗｎｔシグナリング経路は、細胞表面受容体を介して細胞にシグナルを渡すタンパク質で開始するシグナル伝達経路の一グループである。古典的Ｗｎｔシグナリング経路および非古典的Ｗｎｔシグナリング経路が知られている。古典的Ｗｎｔシグナリング経路および非古典的Ｗｎｔシグナリング経路は、両方とも、Ｗｎｔタンパク質リガンドのＦｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体への結合により活性化され、生物学的シグナルが、細胞の中のディシブルドタンパク質へと入る。たとえば、古典的なＷｎｔ経路は、遺伝子転写の調節をもたらし、非古典的経路は、細胞骨格および細胞内カルシウムを調節する。古典的Ｗｎｔシグナリング経路は、βカテニンを含む。対照的に、非古典的Ｗｎｔシグナリングは、βカテニンとは無関係に機能する。

【0030】

「対象」は、本明細書中使用される場合、哺乳類および非哺乳類を含む全ての脊椎動物を表す。対象は、ヒトを含む霊長類、およびげっ歯類、家畜動物、または狩猟動物などの非霊長類の哺乳類を含み得る。非霊長類の哺乳類は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、キツネ、オオカミ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、シカ、バッファロー、バイソンなどを含み得る。非哺乳類は、トリ（たとえばニワトリ、ダチョウ、エミュー、ハト）、爬虫類（たとえばヘビ、トカゲ、カメ）、両生類（たとえばカエル、サンショウウオ）、サカナ（たとえばシャケ、タラ、フグ、マグロ）などを含み得る。用語「個体」、「患者」、および「対象」は、本明細書中互換可能に使用される。

【0031】

本明細書中使用される場合、「～を処置する（ｔｒｅａｔ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患、その状態および／または症状の治癒、改善、寛解、その重症度の低減、予防、進行の遅延、および／または出現の遅延を含む。

【0032】

処置は、本明細書中に記載される状態の兆候または症状のうちの１つ以上が有益な方法で変えられるか、他の臨床的に認められた症状が改善するか、もしくはさらには寛解するか、または望ましい応答が本明細書中に記載の方法に係る処置の後にたとえば少なくとも２％、３％、４％、５％、１０％、またはそれ以上誘導される場合、処置は本明細書中使用される場合「有効」または「治療上有効」とみなされ得る。効力は、たとえば本明細書中に記載の方法により処置した状態のマーカー、指標、症状、および／もしくは頻度、または他のいずれかの適切な測定可能なパラメータ、たとえば心臓の電気的活性を測定することにより評価され得る。また効力は、入院により評価される個体が悪化する失敗、または医療行為の必要性（たとえば疾患の進行が停止すること）により測定され得る。処置は、個体または動物（一部の非限定的な例はヒトまたは動物を含む）の疾患のいずれかの処置を含み、（１）疾患の阻害、たとえば症状（たとえば疼痛もしくは炎症）の悪化の予防；または（２）疾患の重症度の軽減、たとえば症状の後退をもたらすことを含む。疾患の処置に有効な量は、それを必要とする対象に投与される場合に、当該量が、当該疾患に対し用語が本明細書中定義されるように有効な処置をもたらすために十分であることを意味する。作用物質の効力は、状態または望ましい応答（たとえば心臓の活動）の物理的な指標を評価することにより決定され得る。当業者は、当該パラメータのうちのいずれか１つまたはパラメータのいずれかの組み合わせを測定することにより投与および／または処置の効力をモニタリングし得る。

【0033】

用語「有効量」または「治療上有効量」は、本明細書中使用される場合、疾患または障害の少なくとも１つ以上の症状を軽減するために必要とされる組成物または作用物質の量を表し、望ましい効果を提供するために十分な治療用組成物の量に関連する。「有効量」または「治療上有効量」は、典型的な対象に投与する場合に、特定の修復効果および／または再生効果を提供するために十分である組成物または治療用作用物質の量を表し得る。治療上有効量は、様々な文脈で本明細書中使用される場合、疾患の症状の発症を遅延するか、疾患の症状の過程を変える（たとえば限定するものではないが疾患の症状の進行を遅らせる）か、または疾患の症状を反転させるために十分な量を含み得る。治療上有効量は、１つ以上の用量の治療用作用物質で投与され得る。治療上有効量は、単一の投与で投与されてもよく、または複数の用量で一定期間にわたり投与されてもよい。

【0034】

「～を投与すること（Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、本明細書中使用される場合、本明細書中開示される治療用作用物質または組成物を投与するいずれかの適切な経路を含み得る。適切な投与経路として、限定するものではないが、経口投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気道（エアロゾル）投与、肺投与、皮膚投与、注射、または局所投与が挙げられる。投与は、局所的または全身性であり得る。

【0035】

本明細書中使用される場合、用語「医薬組成物」は、薬学的に許容される担体、たとえば製薬業界で一般に使用される担体と組み合わせられた有効な作用物質を表す。「薬学的に許容される」との文言は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内にて、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的なリスク・ベネフィット比と釣り合い、ヒトおよび動物の組織との接触での使用に適切である化合物、物質、組成物、および／または剤形を表すために使用される。

【0036】

本明細書中使用される場合、用語「核酸」は、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基、および置換されたピリミジン（たとえばシトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ））または置換されたプリン（たとえばアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））である交換可能な有機塩基に結合した糖（たとえばリボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を表す。またこの用語は、ポリヌクレオシド（すなわちポリヌクレオチド－リン酸塩）および他のいずれかの有機塩基含有ポリマーを含む。プリンおよびピリミジンとして、限定するものではないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、イノシン、５－メチルシトシン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，６－ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在するヌクレオ塩基および天然に存在しないヌクレオ塩基、置換された芳香族部分および置換されていない芳香族部分が挙げられる。全ての適切な修飾が企図される。よって、用語核酸はまた、塩基および／または糖などの置換または修飾を伴う核酸を包有する。

【0037】

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他の意味を明記しない限り複数形を含む。同様に、用語「または（ｏｒ）」は、文脈が他の意味を明記しない限り「および（ａｎｄ）」を含むように意図されている。本明細書中に記載される方法および物質と類似または同等の方法および材料が本開示の実務または試験で使用され得るが、適切な方法および材料が後述される。略語「ｅ．ｇ．」は、非限定的な例を表すように本明細書中使用される。よって、略語「ｅ．ｇ．」は、用語「たとえば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。

【0038】

細胞生物学および分子生物学において一般的な用語の定義は、“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ”， １９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより出版， ２００６ （ＩＳＢＮ ０－９１ １９１０－１９－０）；Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ． Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版， １９９４ （ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｘ，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより出版， ２００９ （ＩＳＢＮ－１０： ０７６３７６６３２１）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．により出版， １９９５ （ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓにより見出され得る。

【0039】

方法
本明細書において、それを必要とする対象にエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）を投与することにより、状態、たとえば組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置する方法が提供される。様々な状態が本方法により処置され得る。状態として、限定するものではないが、虚血性外傷（たとえば筋肉に対する虚血性外傷）、虚血／再灌流後の組織（たとえば筋肉組織）に対する損傷、および組織線維症が挙げられる。一部の実施形態では、状態は、たとえば処置されないままの場合に、組織線維症を引き起こす状態である。

【0040】

本明細書において、特定の実施形態では、虚血性心筋外傷を処置する細胞フリーおよびエキソソームフリーの方法が提供される。図１３を参照すると、虚血性心筋外傷を処置する方法の一実施形態の非限定的な例が記載されている。方法１３００は、虚血性心筋外傷を有するかまたは虚血性心筋外傷の処置を必要とする対象を同定するステップ１３１０と、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）、たとえばＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来の細胞）由来のエキソソームｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量を対象に投与するステップ１３２０とを含む。投与されるｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約８０ｎｇ～約５ｍｇの範囲、たとえば約８０ｎｇ～約５００μｇの範囲にあり得る。

【0041】

また、虚血性心筋外傷を有するかまたは虚血性心筋外傷の処置を必要とする対象を同定するステップと、ＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９などのｐｉＲＮＡ）の治療上有効量を対象に投与することにより、虚血性心筋外傷を処置するステップとを含む、虚血性心筋外傷を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示されるｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９のヌクレオチド配列（配列番号１）、またはそのバリアントもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、投与されるｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約８０ｎｇ～約５ｍｇの範囲、たとえば約８０ｎｇ～約５００μｇの範囲にある。

【0042】

様々な虚血性心筋外傷が、本方法により処置され得る。一部の実施形態では、虚血性心筋外傷は、虚血による心筋に対する損傷を含む。一部の実施形態では、虚血性心筋外傷は、虚血性／再灌流外傷、たとえば虚血後の再灌流からの心筋に対する損傷を含む。一部の実施形態では、虚血性心筋外傷は、心筋線維症を含む。一部の実施形態では、対象は、心筋梗塞を罹患したことがある。

【0043】

ｐｉＲＮＡは、いずれかの適切な時間に投与され得る。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、対象が虚血性心筋外傷を罹患してから約１０分、約２０分、約３０分、約４５分、約６０分、約９０分、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、またはそれ以上、または先行する値のうちいずれか２つにより定義される範囲の時間間隔の後に、投与される。いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば予兆となる症状を呈するかまたは虚血性イベントに関して非常にリスクの高い対象へ、防止的に投与され得る。

【0044】

本明細書において、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置するエキソソームフリーの方法が提供される。図１４を参照すると、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置する方法の一実施形態の非限定的な例が記載されている。方法１４００は、組織の修復および／または再生を必要とする状態を有する対象を同定するステップ１４１０と、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の有効（または治療上有効）量を対象に投与するステップ１４２０とを含む。投与されるｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約８０ｎｇ～約５ｍｇの範囲、たとえば約８０ｎｇ～約５００μｇの範囲にあり得る。

【0045】

様々な組織の修復および／または再生を必要とする状態が、本方法により処置され得る。一部の実施形態では、状態は、筋肉または肺組織に対する外傷または損傷を含む。一部の実施形態では、状態は、骨格筋または心筋に対する外傷または損傷を含む。一部の実施形態では、状態は、組織線維症、たとえば心筋線維症または肺線維症をもたらす状態を含むか、または当該状態である。一部の実施形態では、状態は、たとえば本明細書中に記載の、虚血性心筋外傷を含む。一部の実施形態では、状態は、肺線維症、たとえば特発性肺線維症を含む。

【0046】

ｐｉＲＮＡのいずれかの適切な量が投与され得る。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約８０ｎｇ、約１００ｎｇ、約１２０ｎｇ、約１４０ｎｇ、約１６０ｎｇ、約１８０ｎｇ、約２００ｎｇ、約２５０ｎｇ、約３００ｎｇ、約３５０ｎｇ、約４００ｎｇ、約５００ｎｇ、約６００ｎｇ、約７００ｎｇ、約８００ｎｇ、約９００ｎｇ、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約２０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約５００μｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約５ｍｇ、またはそれ以上、または先行する値のうちいずれか２つにより定義される範囲の量である。特定の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、キログラム単位にて、たとえば約１００ｎｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、たとえば約１μｇ／ｋｇ～約１００μｇ／ｋｇを含む約１μｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇで投与される。さらなる実施形態では、エキソソームは、標的組織（たとえば心臓または肺）の質量に基づく量、たとえば約１μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ標的組織、たとえば約１０μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ標的組織を含む）で送達される。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約１０^９、約２×１０^９、約５×１０^９、約１０^１０、約２×１０^１０、約５×１０^１０、約１０^１１、約２×１０^１１、約５×１０^１２、約１０^１２、またはそれ以上、または先行する値のうちいずれか２つにより定義される範囲の数の不死化したＣＤＣ由来のエキソソームを投与する治療効果と同等の治療効果を有する量である。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９である。

【0047】

エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、いずれかの適切な投与経路を介して投与され得る。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、全身に投与される。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、局所的に投与される。局所投与は、処置される組織に応じて、一部の実施形態において、組織への直接的な投与（たとえば心筋内注射などの直接的な注射）により達成され得る。また局所投与は、たとえば特定組織の洗浄（たとえば気管内洗浄）により達成され得る。一部の実施形態では、エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡは、噴霧または吸入される。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、非経口的に投与される。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、または気管内に投与される。

【0048】

一般的に、本方法のｐｉＲＮＡは、エキソソーム、たとえば本明細書中に記載される治療用細胞に由来するエキソソームに由来するか、かつ／またはエキソソームから単離される。一部の実施形態では、本開示の方法は、エキソソームフリーの方法である。一部の実施形態では、エキソソームの実質的な量がｐｉＲＮＡと共に対象へ投与されない。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、エキソソームを本質的に含まずに投与される。一部の実施形態では、実質的に全ての投与されるｐｉＲＮＡは、エキソソームに関連していない。一部の実施形態では、投与されるｐｉＲＮＡの約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下、約０．２％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下、約０．０２％以下、約０．０１％以下、約０．００１％以下、約０．０００１％以下、約０．００００１％以下、または先行する値のうちのいずれか２つにより定義される範囲のパーセンテージが、エキソソームに関連する。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡを含み対象へ投与される組成物は、エキソソームを実質的に含まない。

【0049】

一部の実施形態では、本方法は、組織の修復および／または再生を必要とする状態を処置する細胞フリーの方法である。一部の実施形態では、細胞フリーの方法は、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡを含むエキソソーム、細胞外ベシクル、および／またはリポソーム（たとえば合成リポソーム）の投与を介して、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量を投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、エキソソーム、細胞外ベシクル、および／またはリポソームは、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡを多く含む。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、治療用細胞（たとえば不死化したＣＤＣ、操作された線維芽細胞（ＡＳＴＥＣ））由来のエキソソーム中のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡの量と比較して多い。

【0050】

また、本明細書において、肺線維症を処置する細胞フリーの方法が提供される。図１５を参照すると、肺線維症を処置する方法の一実施形態の非限定的な例が記載されている。方法１５００は、肺線維症を有する対象を同定するステップ１５１０と、治療用エキソソームおよび／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の有効（または治療上有効）量を対象に投与するステップ１５２０とを含む。投与されるｐｉＲＮＡの有効（または治療上有効）量は、約８０ｎｇ～約５ｍｇの範囲、たとえば約８０ｎｇ～約５００μｇの範囲にあり得る。投与される治療用エキソソームの有効（または治療上有効）量は、約１０^６～約１０^１２個の粒子であり得る。

【0051】

適切な量の治療用エキソソームが対象に投与され得る。一部の実施形態では、本方法は、約１０^６～約２×１０^６個の粒子、約２×１０^６～約５×１０^６個の粒子、約１０^７～約２×１０^７個の粒子、約２×１０^７～約５×１０^７個の粒子、約５×１０^７～約１０^８個の粒子、約１０^８～約２×１０^８個の粒子、約２×１０^８～約５×１０^８個の粒子、約５×１０^８～約１０^９個の粒子、約１０^９～約２×１０^９個の粒子、約２×１０^９～約５×１０^９個の粒子、約５×１０^９～約１０^１０個の粒子、約１０^１０～約２×１０^１０個の粒子、約２×１０^１０～約５×１０^１０個の粒子、約５×１０^１０～約１０^１１個の粒子、約１０^１１～約２×１０^１１個の粒子、約２×１０^１１～約５×１０^１１個の粒子、または約５×１０^１１～約１０^１２個の粒子の治療用エキソソームを投与するステップを含む。

【0052】

特定の実施形態では、エキソソーム用量はキログラム単位で、たとえば約１．０×１０^５個のエキソソーム／ｋｇ～約１．０×１０^９個のエキソソーム／ｋｇで投与される。さらなる実施形態では、エキソソームは、標的組織の質量に基づく量、たとえば約１．０×１０^５個のエキソソーム／グラム標的組織～約１．０×１０^９個のエキソソーム／グラム標的組織で送達される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、特定の標的組織の細胞の数に対するエキソソームの数の比率に基づき、たとえば約１０^８：１、約１０^７：１、約１０^６：１、約１０^５：１、約１０^４：１、約１０^３：１、約１０^２：１、約１０：１、およびこれら比率の間の比率を含む約１０^９：１～約１：１の範囲のエキソソーム：標的細胞の比率で投与される。さらなる実施形態では、エキソソームは、標的組織における細胞の数よりも約１０倍多い量～約１，０００，０００倍多い量（約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１０，０００倍、約１００，０００倍、約５００，０００倍、約７５０，０００倍を含む）で投与される。エキソソームが併用療法（たとえば依然としてエキソソームを流し得る細胞、薬学的療法、核酸療法など）と併用して投与される場合、投与されるエキソソームの用量は、適切に調整され得る（たとえば望ましい治療効果を達成するために必要に応じて増大または減少し得る）。

【0053】

治療用エキソソームおよび／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、いずれかの適切な投与経路を介して投与され得る。一部の実施形態では、エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡは、全身に投与される。一部の実施形態では、エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡは、局所的に投与される。一部の実施形態では、エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡは、非経口的に投与される。一部の実施形態では、エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡは、気管内、たとえば気管内洗浄により投与される。一部の実施形態では、エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡは、噴霧または吸入される。

【0054】

いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームは、単一のボーラス用量で送達される。しかしながら、一部の実施形態では、複数の用量のｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームが送達され得る。特定の実施形態では、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームは、経時的に特定の比率で注入（または他の方法で送達）され得る。いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームが有害事象（外傷もしくは損傷イベント、または有害な生理学的イベント、たとえばＭＩ）の後に比較的短い時間枠の中で投与される場合、それらの投与は、標的組織に対する損傷の作製または進行を予防する。たとえば、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームが、有害事象から約２０～約３０分以内、約３０～約４０分以内、約４０～約５０分以内、約５０～約６０分以内に投与される場合、組織に及ぼす損傷または有害な影響は、（このように早期の時点で処置されなかった組織と比較して）低減される。一部の実施形態では、投与は、有害事象の後限りなく早く可能である。一部の実施形態では、投与は、有害事象の後限りなく早く（たとえば対象が他の観点で安定した後）実行可能である。いくつかの実施形態では、投与は、約１～約２時間以内、約２～約３時間以内、約３～約４時間以内、約４～約５時間以内、約５～約６時間以内、約６～約８時間以内、約８～約１０時間以内、約１０～約１２時間以内、およびそれらの重複する範囲内にある。有害事象の後に起こるより長い時点での投与は、特定のさらなる実施形態において、組織に対する損傷の予防に有効である。上述されるように、いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームは、防止的に投与され得る。

【0055】

いくつかの実施形態では、エキソソームは、損傷した組織または疾患状態の組織を特異的に標的とする。一部のこのような実施形態では、エキソソームは、それらを特定の標的組織に導くように（たとえば遺伝子的にまたは他の方法で）修飾されている。たとえば、修飾は、一部の実施形態では、エキソソーム上での特異的な細胞表面マーカーの発現の誘導を含み、これにより望ましい標的組織での受容体との特異的な相互作用がもたらされる。一実施形態では、エキソソームのネイティブな中身が除去され、望ましい外因性タンパク質または核酸と交換される。一実施形態では、エキソソームのネイティブな中身に、望ましい外因性タンパク質または核酸が補充される。しかしながら、一部の実施形態では、エキソソームの標的化は行われない。いくつかの実施形態では、エキソソームは、特に標的化、精製、追跡などのために使用され得る、特異的な核酸またはタンパク質を発現するように修飾されている。しかしながら、いくつかの実施形態では、エキソソームの修飾は行われない。一部の実施形態では、エキソソームは、キメラ分子を含まない。

【0056】

一般的に、本方法の治療用エキソソームは、本明細書中に記載されるように、治療用細胞に由来するか、かつ／または治療用細胞から単離される。一部の実施形態では、本開示の方法は、細胞フリーの方法である。一部の実施形態では、実質的な量の細胞は、治療用エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡと共に対象に投与されない。一部の実施形態では、治療用エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡは、細胞を本質的に含まずに投与される。一部の実施形態では、実質的に全ての投与される治療用エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡは、細胞に関連しない。一部の実施形態では、投与される治療用エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡの約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下、約０．２％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下、約０．０２％以下、約０．０１％以下、約０．００１％以下、約０．０００１％以下、約０．００００１％以下、または先行する値のうちいずれか２つにより定義される範囲のパーセンテージが、細胞に関連する。一部の実施形態では、治療用エキソソームおよび／またはｐｉＲＮＡを含み対象に投与される組成物は、細胞を実質的に含まない。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、核酸合成に適切ないずれかの選択肢を使用して作製した合成ＲＮＡである。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、化学的に合成されている。一部の実施形態では、合成のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、天然のヌクレオチドおよび／または非天然のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、合成のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、ヌクレオチドの類縁体および誘導体を含む。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、組み換え技術を使用して産生される。

【0057】

様々なｐｉＲＮＡ、たとえばエキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、本明細書中に記載されるように、本方法で使用され得る。一部の実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、線維芽細胞由来のエキソソームｐｉＲＮＡ、たとえば本明細書中に記載される操作された線維芽細胞またはＡＳＴＥＸ由来の治療用エキソソームに由来するｐｉＲＮＡである。一部の実施形態では、本方法は、線維芽細胞由来のエキソソームｐｉＲＮＡを投与することにより肺線維症を処置するステップを含む。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示される、ｐｉＲ－２０４５０、ｐｉＲ－２０５４８、ｐｉＲ－１６７３５、ｐｉＲ－０１１８４、ｐｉＲ－２０７８６、ｐｉＲ－００８０５、ｐｉＲ－０４１５３、ｐｉＲ－１８５７０、ｐｉＲ－１６６７７、およびｐｉＲ－１７７１６のうちの１つ以上を含む。

【0058】

一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡ、たとえばエキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、ＣＤＣ由来のエキソソームｐｉＲＮＡ、たとえば、本明細書中に記載の不死化したＣＤＣ（ｉｍＣＤＣ）由来の治療用エキソソームに由来するｐｉＲＮＡ、または当該治療用エキソソームに多く含まれるｐｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示されるｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示されるｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８のうちの１つ以上と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、またはそれ以上同一である配列を含む。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示されるｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８のうちの１つ以上と１以下、２以下、３以下、４以下、または５以下のヌクレオチドだけ異なる配列を含む。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示されるｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９である。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示されるｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、またはそれ以上同一である配列を含む。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示されるｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９１と１以下、２以下、３以下、４以下、または５以下のヌクレオチドだけ異なる配列を含む。

【0059】

一部の実施形態では、本方法は、治療用エキソソームからエキソソーム由来のｐｉＲＮＡを単離するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、治療用細胞、たとえば操作された線維芽細胞または不死化したＣＤＣ（ｉｍＣＤＣ）の集団から治療用エキソソームを単離するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、非治療用細胞から治療用細胞の集団を、たとえば正常なヒト真皮線維芽細胞から操作された線維芽細胞を、または低効力のｉｍＣＤＣから高効力のｉｍＣＤＣを作製するステップを含む。非治療用細胞から治療用細胞の集団を作製するためのいずれかの適切な選択肢が使用され得る。一部の実施形態では、治療用細胞の集団は、非治療用細胞、たとえば低効力のｉｍＣＤＣでＷｎｔ／βカテニンシグナリングを活性化することにより高効力の治療用ｉｍＣＤＣを作製することにより、産生され得る。本明細書中使用される場合、「不死化したＣＤＣ」および「ｉｍＣＤＣ」は、他の意味が記載されない限り、高効力の治療用ｉｍＣＤＣを表すように互換可能に使用され得る。一部の実施形態では、治療用細胞の集団は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナリングを活性化し、線維芽細胞、たとえば正常なヒト真皮線維芽細胞でｇａｔａ４を過剰発現させることにより操作された線維芽細胞を作製することにより操作された線維芽細胞を作製することにより、産生される。本明細書中使用される場合、「ＡＳＴＥＸ」は、操作された線維芽細胞由来の細胞外のベシクル／エキソソームを表す。非治療用細胞から治療用細胞の集団を作製するための適切な選択肢は、たとえば、開示全体が本明細書中参照により組み込まれている国際特許公開公報第２０／３１８０８号およびＩｂｒａｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ． ２０１９ Ｓｅｐ；３（９）：６９５－７０５，に記載されている。

【0060】

いくつかの実施形態では、エキソソーム（たとえば高効力のため操作されたエキソソーム）が自身の潜在的な免疫原性を低減するために、たとえばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および／またはＴＡＬＥＮを使用した遺伝子編集を介して操作され得る。好適には、エキソソームは、実施形態に応じて、エキソソームの最終的なレシピエントに関して同種、自家性、異種、または同系である供給源から得た細胞に由来し得る。さらに、特定のｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはタンパク質の発現に関して性質決定されているエキソソームのマスターバンクが作製され得、「市販」ベースで定義された対象でのその後の使用のため長期間保存され得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、エキソソームは、単離された後、長期間または短期間保存することなく使用される（それらは作製された後可能な限り早く使用される）。

【0061】

一部の実施形態では、エキソソームは、本明細書中に記載されるように回収され、それらの核酸の中身、たとえばｐｉＲＮＡを遊離および回収するための方法に供される。いくつかの実施形態では、核酸は、エキソソームのカオトロピックな破壊（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）およびその後の核酸の単離を使用して単離される。他の確立した核酸単離のための方法もまた、カオトロピックな破壊に加えて、またはカオトロピックな破壊の代わりに使用され得る。単離される核酸は、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＤＮＡフラグメント、およびＤＮＡプラスミド、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、調節ＲＮＡ（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡおよびコーディングＲＮＡなどを含み得る。ＲＮＡが単離されるいくつかの実施形態では、ＲＮＡは、目的のＲＮＡの（ＤＮＡ形態の）多数のコピーを作製するためのＲＴ－ＰＣＲベース（または他の増幅）方法のテンプレートとして使用され得る。このような例では、特定のＲＮＡまたはフラグメントが特に重要である場合、エキソソームの単離およびＲＮＡの調製は、任意選択で、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成および望ましい配列の共投与により補完され得る。

【0062】

いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームは、１つ以上のさらなる作用物質と組み合わせて投与される。たとえば、いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームは、（たとえばエキソソームの中身を補完するために）エキソソーム由来の１つ以上のタンパク質または核酸と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームが単離される細胞が、エキソソームと組み合わせて投与される。

【0063】

いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームは、より伝統的な治療、たとえば外科的療法または薬学的療法と組み合わせて送達される。いくつかの実施形態では、このような手法の組み合わせは、標的組織のバイアビリティおよび／または機能において相乗的な改善をもたらす。一部の実施形態では、エキソソームは、遺伝子療法ベクター（または複数のベクター）、核酸（たとえばｓｉＲＮＡとして使用される核酸またはＲＮＡ干渉を達成するための核酸）、および／または他の細胞種由来のエキソソームの組み合わせと組み合わせて送達され得る。

【0064】

よって、一部の実施形態では、（単独または核酸などの補助的な作用物質と組み合わせた）ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームの送達は、組織の修復、機能の改善、バイアビリティの増大、またはそれらの組み合わせを促進するように機能する特定の効果（たとえばパラクリン作用）を提供する。一部の実施形態では、送達されるエキソソームのｐｉＲＮＡの中身は、標的組織の修復または再生の少なくとも一部に寄与する。いくつかの実施形態では、エキソソームによるｍｉＲＮＡ送達は、全体的または部分的に、損傷した組織の修復および／または再生に寄与する。上記で論述されるように、ｍｉＲＮＡ送達は、特定のメッセンジャーＲＮＡ（たとえばプログラム細胞死に関与するメッセンジャーＲＮＡ）の翻訳を阻止するように作動し得、またはメッセンジャーＲＮＡの切断をもたらし得る。いずれかの場合および組み合わされた一部の実施形態において、これらの効果は、標的組織の細胞のシグナリング経路を変え、本明細書中開示されるデータにより示されるように、細胞のバイアビリティの改善、細胞の複製の増大、有用な解剖学的効果、および／または細胞機能の改善をもたらし得る。よってこれらはそれぞれ、全体として、損傷した組織または疾患状態の組織の修復、再生、および／または機能的な改善に寄与する。

【0065】

ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソーム（またはこれらの中身）の有用な効果は、直接損傷したかまたは傷害を受けた細胞に対してのみである必要はない。一部の実施形態では、たとえば、開示される方法の影響を受ける損傷した組織の細胞は、健常な細胞である。しかしながら、いくつかの実施形態では、開示される方法の影響を受ける損傷した組織の細胞は、損傷した細胞である。

【0066】

いくつかの実施形態では、再生は、組織の機能を改善することを含む。たとえば、心臓組織が損傷する特定の実施形態では、機能的な改善は、心拍出、収縮力、心室機能の増大、および／または不整脈の低減（特に機能的な改善）を含み得る。また他の組織では、神経の損傷に応答した認知の亢進、肺組織の処置に応答した血中酸素移動の改善、損傷した免疫学的関連組織の処置に応答した免疫機能の改善などの機能に改善が実現され得る。

【0067】

いくつかの実施形態では、再生ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームは、起源が哺乳類である。いくつかの実施形態では、再生ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームは、起源がヒトである。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡおよび／またはエキソソームは、非胚性ヒト再生細胞および／またはエキソソームに由来する。いくつかの実施形態では、再生エキソソームは、個体に対し自家性であり、いくつかの他の実施形態では、再生エキソソームは、個体に対し同種である。他の特定の実施形態では、異種性または合成エキソソームが使用される。

【0068】

また、本明細書において、組織修復を調節する方法であって、分化転換している線維芽細胞の集団を、エキソソーム、エキソソーム由来のｍｉＲＮＡ、および／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の有効（または治療上有効）量と接触させることにより、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換を抑制するステップを含み、前記エキソソームが操作された線維芽細胞に由来する、方法が提供される。一部の実施形態では、分化転換は、ＴＧＦβが介在する分化転換、たとえばＴＧＦβシグナリングにより誘導される分化転換である。一部の実施形態では、ＴＧＦβシグナリングは、組織の外傷または損傷により活性化される。一部の実施形態では、線維芽細胞は、肺線維芽細胞である。

【0069】

一部の実施形態では、接触するステップは、エキソソーム、エキソソーム由来のｍｉＲＮＡ、および／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡを対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、対象は、肺線維症、たとえば特発性肺線維症を有する。一部の実施形態では、接触するステップは、エキソソーム、エキソソーム由来のｍｉＲＮＡ、および／またはエキソソーム由来のｐｉＲＮＡを対象に、たとえば気管内洗浄、吸入、または吸入投与により気管内投与するステップを含む。いずれかの適切な量のエキソソームは、本明細書中に記載されるように、分化転換している線維芽細胞と接触され得るか、または対象に投与され得る。一部の実施形態では、エキソソームの有効（または治療上有効）量は、約１０^６～約１０^１２個の粒子を含む。

【0070】

治療用細胞、それに由来するエキソソーム、およびｐｉｗｉＲＮＡ
本方法に使用するためのｐｉＲＮＡは、一般に、細胞外ベシクル（ＥＶ）、たとえば治療用細胞に由来するエキソソームである。ｐｉＲＮＡが由来し得る適切なＥＶまたはエキソソームは、ＣＤＣ、たとえば不死化したＣＤＣ由来のエキソソーム、および操作された線維芽細胞、たとえばＡＳＴＥＸ由来のエキソソームを含む。

【0071】

特定の種類の核酸が、膜に結合した粒子と結合し得る。このような膜に結合した粒子は、大部分の細胞種から来ており、細胞膜のフラグメントからなり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびタンパク質を含む。これら粒子は、多くの場合、由来する細胞の組成を反映する。エキソソームは、このような膜に結合した粒子の１種であり、通常、直径約１５ｎｍ～約９５ｎｍの範囲（約１５ｎｍ～約２０ｎｍ、２０ｎｍ～約３０ｎｍ、約３０ｎｍ～約４０ｎｍ、約４０ｎｍ～約５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約９０ｎｍ～約９５ｎｍ、およびそれらの重複した範囲を含む）にある。いくつかの実施形態では、エキソソームは、より大きい（たとえば約１４０～約２１０ｒｕｎ（約１４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、１５０ｎｍ～約１６０ ｒｕｎ、１６０ｎｍ～約１７０ ｒｕｎ、１７０ｎｍ～約１８０ｎｍ、１８０ｎｍ～約１９０ ｒｕｎ、１９０ｎｍ～約２００ ｒｕｎ、２００ｎｍ～約２１０ｎｍ、およびそれらの重複した範囲を含む）。一部の実施形態では、元の細胞体から作製したエキソソームは、元の細胞体よりも少なくとも１つの次元（たとえば直径において）１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００、１０，０００倍小さい。

【0072】

また、多くの場合、エキソソームを表すための代わりの術語が使用される。よって、本明細書中使用される場合、用語「エキソソーム」は、通常の意味で提供されるが、同様に、マイクロベシクル、エピディディモソーム（ｅｐｉｄｉｄｉｍｏｓｏｍｅ）、アルゴソーム（ａｒｇｏｓｏｍｅ）、エキソソーム様ベシクル、微粒子、プロミニノソーム（ｐｒｏｍｉｎｉｎｏｓｏｍｅ）、ｐｒｏｓｔａｓｏｍｅ、ｄｅｘｏｓｏｍｅ、ｔｅｘｏｓｏｍｅ、ｄｅｘ、ｔｅｘ、アーケオソーム（ａｒｃｈｅｏｓｏｍｅ）、およびｏｎｃｏｓｏｍｅｓを含む用語をも含み得る。本明細書中他の意味が記載されない限り、上記用語はそれぞれ、操作された高効力の様々なエキソソームの各種を同様に含むことを理解されたい。エキソソームは、幅広い範囲の哺乳類細胞により分泌され、正常な条件および病理学的な条件の両方の下で分泌される。エキソソームは、一部の実施形態では、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、または他の中身を第１の細胞を別の細胞（もしくは複数の細胞）へ運ぶ性質により、細胞内メッセンジャーとして機能する。

【0073】

エキソソームは、いくつかの実施形態では、ろ過、遠心分離、抗原ベースの捕捉などのうちの１つ以上を含む方法により細胞調製物から単離される。たとえば、いくつかの実施形態では、培養物で増殖した細胞の集団が、回収および貯蔵される。いくつかの実施形態では、細胞の単層が使用され、この場合任意選択で、細胞の収率を改善するために貯蔵より前に細胞を処置する（たとえばディッシュをこするか、かつ／またはトリプシンなどの酵素を用いて酵素により処置して細胞を遊離する）。一部の実施形態では、細胞を、約１０日以上、約１２日以上、または約１５日以上の間血清飢餓下で培養し、エキソソームを条件付け培地から回収する。一部の実施形態では、標準的な細胞培養条件下の培養物で増殖した細胞を、低酸素条件下で一晩血清フリー培地に曝露し、エキソソームを含む条件付け培地を回収する。一部の実施形態では、低酸素条件は、約１５％、約１２％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％のＯ_２またはそれ以下、または先行する値のうちいずれか２つにより定義される範囲のＯ_２のパーセンテージを含む。一部の実施形態では、低酸素条件は、３７℃での２％のＯ_２／５％のＣＯ_２を含む。一部の実施形態では、低酸素条件に曝露した細胞は、約２４、約３６、約４８、約６０、約７２時間以上、または先行する値のうちいずれか２つにより定義される範囲の時間間隔で、３７℃で標準的な酸素下にて完全な血清に回復し、その後、条件培地を作製するために低酸素条件に再曝露される。標準的な酸素は、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％またはそれ以上のＯ_２、または先行する値のうちいずれか２つにより定義される範囲のＯ_２のパーセンテージを含む。一部の実施形態では、細胞は、低酸素培地および標準的な酸素培地の間を、１回、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上の回数を循環する。いくつかの実施形態では、懸濁液で増殖した細胞が使用される。その後、貯蔵した集団は、１ラウンド以上の遠心分離（いくつかの実施形態では、超遠心分離法および／または密度遠心分離が使用される）に供されることにより、細胞の集団由来の細胞の中身の残りおよびデブリから、エキソソームフラクションを分離する。一部の実施形態では、遠心分離は、エキソソームを回収するために行う必要がない。いくつかの実施形態では、エキソソームの捕捉の効率を改善するために、細胞の前処置が使用される。たとえば、いくつかの実施形態では、細胞からのエキソソームの分泌の速度を増大させる作用物質が、エキソソームの総合的な収率を改善するために使用される。一部の実施形態では、エキソソーム分泌の増大は行われない。一部の実施形態では、分子ふるいろ過が、特定の粒径（たとえば直径）のエキソソームを回収するために、遠心分離と組み合わせてまたは遠心分離の代わりに使用される。一部の実施形態では、エキソソームは、１００ＫＤａの分子量のカットオフフィルターを用いた遠心限外ろ過を使用して精製される。いくつかの実施形態では、ろ過は使用する必要はない。さらなる実施形態では、エキソソーム（またはエキソソームの下位集団）は、エキソソーム上のまたは中の固有のマーカー（たとえば膜貫通タンパク質）の選択的な同定により捕捉される。このような実施形態では、固有のマーカーは、特定のエキソソームの集団を選択的に強化するために使用され得る。一部の実施形態では、特定のマーカーまたはエキソソームの特徴に基づく強化、選択、またはろ過は行われない。

【0074】

さらに、エキソソーム、特に高効力のため操作されたエキソソームの作製を促進するための方法が提供される。いくつかのこのような実施形態では、ヒドロラーゼが、細胞からのエキソソームの遊離（たとえば分泌）を促進するために使用される。特定の実施形態では、エステル結合、糖（たとえばＤＮＡ）、エーテル結合、ペプチド結合、炭素－窒素結合、酸無水物、炭素間結合、ハロゲン化物結合、リン－窒素結合、硫黄－窒素結合、炭素－リン結合、硫黄間結合、および／または炭素－硫黄結合のうちの１つ以上を切断するヒドロラーゼが使用される。一部の実施形態では、ヒドロラーゼは、ＤＮＡｓｅである（たとえば糖を切断する）。特定の実施形態は、特定のヒドロラーゼ、たとえばリソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼ、分泌性亜鉛依存性酸性スフィンゴミエリナーゼ、中性スフィンゴミエリナーゼ、およびアルカリ性スフィンゴミエリナーゼのうちの１つ以上などを使用する。

【0075】

特定の実施形態では、エキソソームは、細胞または組織の修復または再生を惹起するために対象へ投与される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、非胚性幹細胞である。一部の実施形態では、非胚性幹細胞は、成年の幹細胞である。しかしながら、特定の実施形態では、任意選択で、胚性幹細胞が、エキソソームの供給源として使用される。一部の実施形態では、体細胞（非限定的な例として線維芽細胞）が、エキソソームの供給源として使用される。さらなる実施形態では、生殖細胞が、エキソソームの供給源として使用される。

【0076】

一部の実施形態では、高い治療効力を有する細胞が、本明細書中に記載されるように作製される。一部の実施形態では、細胞は、高い治療効力のエキソソームを産生するように操作される。高い治療効力を有する細胞を作製するため、かつ／または高い治療効力のエキソソームを産生するいずれかの細胞種が使用される。たとえば、ＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｈｐｅｒｅ由来細胞）または線維芽細胞が使用され得る。

【0077】

エキソソーム供給源として幹細胞を使用するいくつかの実施形態では、幹細胞由来のエキソソームの核酸および／またはタンパク質の内容物は、損傷した細胞または疾患状態にある細胞の修復または再生をもたらすために特に適している。いくつかの実施形態では、エキソソームは、処置される組織に由来する幹細胞から単離される。たとえば、心臓組織が修復される一部の実施形態では、エキソソームは、心臓幹細胞に由来する。心臓幹細胞は、いくつかの実施形態において、限定するものではないが、心房、中隔、心室、心房部（ａｕｒｉｃｏｌａ）、およびそれらの組み合わせを含む心臓の様々な領域から得られる（たとえば、部分的または全体的な心臓が、一部の実施形態において心臓幹細胞を得るために使用され得る）。いくつかの実施形態では、エキソソームは、心臓幹細胞を含むかまたは心臓幹細胞を生じさせるように培養物にて操作され得る細胞（または細胞のグループ）（たとえばｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅおよび／またはＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来細胞））に由来する。Ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅの単離に関するさらなる情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている２０１２年９月１８日に発行された米国特許第８，２６８，６１９号で見出され得る。いくつかの実施形態では、心臓幹細胞は、ＣＤＣ（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ由来細胞）に由来する。ＣＤＣの単離のための方法に関するさらなる情報は、２００８年に出願された米国特許公開公報第１１／６６６，６８５号および２０１２年３月５日に出願された同第１３／４１２，０５１号で見出され得る（両文献の全体は参照により本明細書に組み込まれている）。また、限定するものではないが、骨髄幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、および神経幹細胞を含む他の様々な幹細胞もまた、実施形態に応じて使用され得る。

【0078】

いくつかの実施形態では、エキソソームは、たとえば翻訳を阻止および／またはｍＲＮＡを切断することにより遺伝子発現の変更を誘導する。一部の実施形態では、遺伝子発現の変更は、望ましくないタンパク質または他の分子、たとえば細胞死経路に関与するかまたは周辺細胞にさらなる損傷を誘導するもの（たとえばフリーラジカル）の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子発現の変更は、直接または間接的に、望ましいタンパク質または分子（たとえば有用な効果を有するもの）の作製をもたらす。このタンパク質または分子自体は、自身が望ましいものである必要はない（たとえばタンパク質または分子は、組織の損傷の状況で総合的な有用な効果を有し得るが、他の状況では有用な効果をもたらさない）。一部の実施形態では、遺伝子発現の変更は、望ましくないタンパク質、分子、または経路の阻止（たとえば有害な経路の阻害）を引き起こす。いくつかの実施形態では、遺伝子発現の変更は、１つ以上の炎症性作用物質および／または当該作用物質に対する感受性の発現を低減する。好適には、いくつかの実施形態では、エキソソーム、ｍｉＲＮＡ、またはｐｉＲＮＡの投与は、炎症経路に関与する特定の炎症性分子および／または複数の分子のダウンレギュレーションをもたらす。よって、いくつかの実施形態では、エキソソーム、ｍｉＲＮＡ、またはｐｉＲＮＡと接触した細胞は、外傷後炎症または疾患による炎症のイベントであっても、高いバイアビリティを享受する。

【0079】

いくつかの実施形態では、エキソソームは、損傷した組織の１つ以上のレシピエント細胞と融合する。いくつかの実施形態では、エキソソームは、マイクロＲＮＡおよび／またはｐｉＲＮＡを、損傷した組織の１つ以上のレシピエント細胞に放出し、これにより損傷した組織の１つ以上の細胞の少なくとも１つの経路を変える。一部の実施形態では、エキソソームは、損傷した組織の細胞の周りの環境を変えることにより損傷した組織の細胞へそれらの影響を行使する。一部の実施形態では、エキソソームの中身もしくは特徴により作製されるかまたは中身もしくは特徴の結果としてのシグナルは、特定の細胞経路の増大または減少をもたらす。たとえば、エキソソーム（またはそれらの中身／特徴）は、タンパク質および／または脂質のプロファイルを変えることにより細胞の環境を変えることができ、これにより、この環境での細胞の挙動の変更をもたらし得る。さらに、いくつかの実施形態では、エキソソームのｍｉＲＮＡおよび／またはｐｉＲＮＡは、レシピエント細胞の遺伝子発現を変えることができ、これにより、遺伝子が関与する経路を変更し、その後、細胞の環境をさらに変えることができる。いくつかの実施形態では、エキソソームの影響は、血管新生を直接的または間接的に刺激する。いくつかの実施形態では、エキソソームの影響は、細胞の複製に直接または間接的に影響する。いくつかの実施形態では、エキソソームの影響は、細胞のアポトーシスを直接または間接的に阻害する。同様に、いくつかの実施形態では、エキソソーム由来のｐｉＲＮＡは、これらおよび／または他の効果を誘導する。

【0080】

治療用組成物
いくつかの実施形態では、１つ以上のｐｉＲＮＡ、たとえばエキソソーム由来のｐｉＲＮＡと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物、たとえば治療用組成物が提供される。本組成物は、組織の修復および／または再生を必要とする状態の処置、たとえば虚血性外傷および／または組織線維症の処置での使用を見出されている。一部の実施形態では、本組成物は、細胞フリーかつ／またはエキソソームフリーの組成物である。一部の実施形態では、エキソソームフリーの組成物は、エキソソームまたは細胞外ベシクルを実質的にまたは本質的に含まない。一部の実施形態では、エキソソームフリーの組成物は、いずれのエキソソームもしくは細胞外ベシクルをも含まないか、または（たとえば本組成物を本明細書中提供されるように対象に投与する場合に）検出可能な機能的な効果を提供するために不十分な量のエキソソームもしくは細胞外ベシクルを含む。一部の実施形態では、細胞フリーの組成物は、細胞を実質的にまたは本質的に含まない。一部の実施形態では、細胞フリーの組成物は、いずれの細胞をも含まないか、または（たとえば本組成物を本明細書中提供されるように対象に投与する場合に）検出可能な機能的な効果を提供するために不十分な量の細胞を含む。いくつかの実施形態では、本組成物は、１つ以上のエキソソーム由来のＲＮＡ（たとえばｐｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ）および薬学的に許容される賦形剤を含むか、またはからなるか、またはから本質的になる。一部の実施形態では、本組成物は、核酸、タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、エキソソーム由来のＲＮＡは、線維芽細胞由来のエキソソームｐｉＲＮＡ、たとえば操作された線維芽細胞由来のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、エキソソーム由来のＲＮＡは、ＣＤＣ由来のエキソソームｐｉＲＮＡ、たとえば不死化したＣＤＣ由来のエキソソームに由来するｐｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示されるｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９である。いくつかの実施形態では、ｐｉＲＮＡは、ｐｉＲ－２０４５０、ｐｉＲ－２０５４８、ｐｉＲ－１６７３５、ｐｉＲ－０１１８４、ｐｉＲ－２０７８６、ｐｉＲ－００８０５、ｐｉＲ－０４１５３、ｐｉＲ－１８５７０、ｐｉＲ－１６６７７、およびｐｉＲ－１７７１６のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、本組成物は、合成ｐｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含むか、からなるか、またはから本質的になる。一部のこのような実施形態では、合成ｐｉＲＮＡは、たとえば図１６に示されるｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００１０４０、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００７４２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿００８４８８、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１８２９２、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１３６２４、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１９３２４、およびｈｓａ＿ｐｉＲ＿０２０５４８のうちの１つ以上を含む。一部のこのような実施形態では、合成ｐｉＲＮＡは、ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９である。いくつかの実施形態では、本組成物は、合成ｐｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含むか、からなるか、またはから本質的になる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、たとえば以下の表１に示されるｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、およびｍｉＲ－５１０－３ｐのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－９２ａ、ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ２７－ａ、ｌｅｔ－７ｅ、ｍｉｒ－１９ｂ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉｒ－２７ｂ、ｌｅｔ－７ａ、ｌｅｔ－７ｃ、ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉｒ－２１０、ｌｅｔ－７ｂ、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２、ｌｅｔ－７ｆ、ｍｉＲ－１４６ａ、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。

【表1】

【0081】

いくつかの実施形態では、本組成物は、様々な細胞種に由来する複数のｐｉＲＮＡ（たとえば第１種および第２種の「親細胞」に由来するエキソソームの集団から単離したｐｉＲＮＡ）を含む。上記で論述されるように、いくつかの実施形態では、本明細書中開示される組成物は、単独でか、または１つ以上の補助的な治療形式（たとえば薬学的、細胞療法、遺伝子療法、タンパク質療法、外科手術など）と併用して使用され得る。

【0082】

本開示のＲＮＡ（たとえばｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）は、核酸に沿った１つ以上の位置で化学的に修飾され得る。一部の実施形態では、ｐｉＲＮＡは、１つ以上の位置で化学的に修飾されている。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、１つ以上の位置で化学的に修飾されている。一部の実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは、いずれかの適切な化学的修飾を含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ（たとえばｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）の化学的修飾は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡの安定性を増大させる。一部の実施形態では、ＲＮＡ（たとえばｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）の化学的な修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡの活性を増大させる。

【0083】

一部の実施形態では、ＲＮＡ、たとえばｐｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、約１％～約１００％修飾されたヌクレオチド（全体のヌクレオチド含有量に関連または１種以上のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つ以上に関連）、または間のいずれかのパーセンテージ（たとえば１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、および９５％～１００％）だけ修飾されたヌクレオチドを含む。全ての残りのパーセンテージは、修飾されていないＡ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在から構成されることが理解されるであろう。

【0084】

一部の実施形態では、ＲＮＡ、たとえばｐｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、最小１％および最大１００％の修飾されたヌクレオチド、またはいずれかの間のパーセンテージ、たとえば少なくとも５％修飾されたヌクレオチド、少なくとも１０％修飾されたヌクレオチド、少なくとも２５％修飾されたヌクレオチド、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチド、少なくとも８０％修飾されたヌクレオチド、または少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む。たとえば、ＲＮＡは、修飾されたピリミジン、たとえば修飾されたウラシルまたはシトシンを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドにおけるウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾されたウラシル（たとえば５－置換されたウラシル）と置き換えられている。一部の実施形態では、核酸におけるシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾されたシトシン（たとえば５－置換されたシトシン）と置き換えられている。

【0085】

薬学的に許容される賦形剤として、限定するものではないが、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒体が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤として機能し得る物質のいくつかの非限定的な例として、（１）糖、たとえばラクトース、グルコース、およびスクロース；（２）スターチ、たとえばコーンスターチおよびポテトスターチ、（３）セルロースおよびその誘導体、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロース、および酢酸セルロース；（４）トラガント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク；（８）ココアバターおよび座薬用ワックス；（９）油、たとえばピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、およびダイズ油；（１０）グリコール、たとえばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、たとえばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、たとえばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）アガー；（１４）緩衝剤、たとえば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ無水物；（２２）増量剤、たとえばポリペプチドおよびアミノ酸（２３）血清成分、たとえば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２２）Ｃ２－Ｃ１２アルコール、たとえばエタノール；ならびに（２３）薬学的製剤で使用される他の非毒性の適合可能な物質が挙げられる。一部の実施形態では、賦形剤は、有効な作用物質、たとえばｐｉＲＮＡの分解を阻害する。

【0086】

一部の実施形態では、本組成物は、非経口的な剤形にある。一部の実施形態では、非経口的な剤形は、無菌性であるか、または患者に投与する前に無菌にすることができる。非経口的な剤形の例として、限定するものではないが、注射が容易な液剤、注射のため薬学的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁することが容易な乾燥した生成物、注射が容易な懸濁物、およびエマルジョンが挙げられる。さらに、徐放非経口剤形が、対象への投与のために調製され得る。エキソソーム由来のｐｉＲＮＡの非経口的な剤形を提供するために使用され得る適切な賦形剤として、限定するものではないが、滅菌水；注射用水、ＵＳＰ；生理食塩水；グルコース溶液；水性ビヒクル、たとえば限定するものではないが、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、およびラクトリンゲル注射液；水と混和するビヒクル。たとえば限定するものではないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール；ならびに非水性ビヒクル、たとえば限定するものではないが、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルが挙げられる。

【0087】

いくつかの実施形態では、エキソソームは、対象への投与、たとえば対象への気管内投与に適した剤形で製剤化されている。一部の実施形態では、エキソソームは、本明細書中に記載される薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化されている。一部の実施形態では、エキソソームは、いずれかの適切な選択肢を使用して吸入または吸入投与のために製剤化されている。一部の実施形態では、エキソソームは、エアロゾル化されている。

【0088】

好適には、いくつかの実施形態では、エキソソームは、実施形態に応じて特定の範囲の直径に構成されている、合成の膜に結合した粒子（たとえばエキソソームサロゲート）を含む。このような実施形態では、エキソソームサロゲートの直径は、特定の適用（たとえば標的部位または送達経路）に対して調整されている。さらなる実施形態では、エキソソームサロゲートは、投与後の特定の部位または領域への輸送を高めるように標識または修飾されている。

【0089】

いくつかの実施形態では、エキソソームは、再生細胞の遠心分離を介して得られる。いくつかの実施形態では、超遠心分離が使用される。しかしながら、いくつかの実施形態では、超遠心分離は使用されない。いくつかの実施形態では、エキソソームは、再生細胞の分子ふるいろ過を介して得られる。上記に開示されるように、一部の実施形態では、上記のものと同様の機構により単離され得る合成エキソソームが作製される。

【0090】

また、本明細書において、組織の修復および／または再生を必要とする状態（たとえば心臓虚血性外傷、肺線維症）を処置するためのキットであって、本明細書中に記載の１つ以上のエキソソーム由来のｐｉＲＮＡ種または本開示の組成物を含む、キットが提供される。一部の実施形態では、本キットは、本明細書中に記載の薬学的に許容される賦形剤を含む。キットは、キットの１つ以上の成分を保持するための１つ以上の容器（たとえばバイアル、アンプル、試験管、フラスコ、またはビン）を含み得る。本キットは、組織の修復および／または再生を必要とする状態（たとえば心臓虚血性外傷、肺線維症）を処置するためのキットを使用するための説明書をさらに含み得る。この情報および説明書は、言葉、写真、またはその両方などの形態であり得る。

【0091】

上記の実施形態のいずれかの具体的な要素は、他の実施形態の要素と組み合わせることができ、またはこれと置き換えることができる。さらに、本開示の特定の実施形態に関連する利点は、これら実施形態の文脈で説明されているが、他の実施形態もまた、当該利点を呈し得、全ての実施形態が、本開示の範囲内に入るために当該利点を必ずしも呈する必要はない。

【0092】

本明細書中に記載の技術は、さらなる限定と全く解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに示される。

【0093】

実施例
実施例１
この非限定的な実施例は、不死化したＣＤＣ（ｉｍＣＤＣ）およびｉｍＣＤＣ由来の細胞外ベシクル（ＥＶ）／エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の検出および単離を示す。

【0094】

細胞外ベシクル（ＥＶ）は、以前に使用され図１に記載されている低酸素サイクリング法を使用してＣＤＣから回収した。簡潔に述べると、細胞を、３７℃、２０％のＯ_２／５％のＣＯ_２でコンフルエンスとなるまで増殖させ、次に、細胞を、２４時間、２％のＯ_２／５％のＣＯ_２、３７℃で血清フリーにした。条件培地を回収し、０．４５μｍのフィルターを介してろ過し、アポトーシス体および細胞のデブリを除去し、後に使用するため－８０℃で凍結した。これら細胞を、２％のＯ_２／５％のＣＯ_２条件に３回通し、低酸素条件への曝露の間に４８時間、完全な血清を用いて２０％のＯ_２／５％のＣＯ_２で回復させた。ＥＶを、１０００ｋＤａの分子量カットオフフィルターを用いて遠心限外ろ過を使用して精製した。フラクションを、粒径、数、および濃度、ならびにｐｉＲＮＡ含有量の観点から分析した。

【0095】

初代のＣＤＣ（ｐＣＤＣ）、ｉｍＣＤＣ、ｐＣＤＣ－ＥＶ、およびｉｍＣＤＣ－ＥＶのｐｉＲＮＡ含有量を、小分子ＲＮＡ配列分析を使用して分析した。図１Ｂは、ｐｉＲＮＡが、それらが由来する細胞と比較してＥＶに多く含まれていたことを示している。さらに、不死化したＣＤＣおよびそれから単離したＥＶは、不死化していないＣＤＣおよびそれに由来するＥＶはと比較してｐｉＲＮＡを多く含んでいた。よって、ｉｍＣＤＣは、初代ＣＤＣと比較して異なるｐｉＲＮＡ組成を示している。ＩｍＥＶ－Ｐｉ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）は、最も多く発現されたノンコーディングＲＮＡの１つとして同定された（ｉｍＣＤＣ－ＥＶにおいて読み取りの数は、ＣＤＣ－ＥＶと比較して３５倍多かった）（図１Ｂ）。図１Ｃに示されるように、ｐｉＲＮＡの量はＥＶの量と相関していた。

【0096】

これらの結果は、ｉｍＣＤＣが、初代ＣＤＣと比較してｐｉＲＮＡを多く含んでいることを示している。一部の実施形態では、ＥＶは、ｐｉＲＮＡを多く含んでいる。一部の実施形態では、ｉｍＣＤＣ－ＥＶは、ｐＣＤＣ－ＥＶと比較してｐｉＲＮＡを多く含んでいる。

【0097】

実施例２
この非限定的な実施例は、心筋の虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）外傷におけるｉｍＣＤＣ－ＥＶ由来のｐｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの心保護効果を示す。

【0098】

ｉｍＣＤＣ－ＥＶ由来のｐｉＲＮＡの役割を調査するために、心筋の虚血／再灌流のラットモデルを使用した。図２Ａは、実験プロトコルの概略図を示す。０日目に、心筋梗塞を、８～１０週齢の雌性のＷｉｓｔａｒ－Ｋｙｏｔｏラットに外科的に４５分間誘導し、この後再灌流を行った。再灌流から２０分後に、ビヒクル、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ（１０^１０個の粒子）、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９；４００ｎｇ）、またはスクランブルＲＮＡを、クランプ注射を用いて心筋内に投与した。虚血／再灌流から２４時間後に、尾静脈の血液を、血液細胞計測のため回収し、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）のレベルを測定した。４８時間後に、血液細胞計測のため動物を屠殺し、ｃＴｎＩの測定およびトリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色を行い、瘢痕の大きさを測定した。

【0099】

ｉｍＣＤＣ－ＥＶを投与した動物は、ＴＴＣ染色に基づき、ビヒクルと比較して小さな瘢痕の大きさ（梗塞の大きさ）を示した（図２）。また、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡの投与は、ビヒクルと比較して小さな梗塞の大きさを示した。ｉｍＣＤＣ－ＥＶで処置した動物の梗塞の大きさは、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した動物と比較して小さかった。対照的に、スクランブルＲＮＡを投与した動物は、ビヒクルで処置した動物と比較して梗塞の大きさは変化しなかったが、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡを投与した動物では、スクランブルＲＮＡを投与した動物と比較して梗塞の大きさが小さい傾向があった。

【0100】

末梢血における心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は、心筋の虚血／灌流後のｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡの治療効果を測定するために使用した。２４時間目で、ｃＴｎＩのレベルは、全ての処置グループで低かった（図３Ａ）。４８時間目では、ｃＴｎＩのレベルは、ビヒクルで処置した動物およびスクランブルＲＮＡで処置した動物において増大した（図３Ｂ）。ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡを投与された動物は、ビヒクルで処置した動物と比較して低いレベルのｃＴｎＩを示した。ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した動物におけるｃＴｎＩのレベルは、ｉｍＣＤＣ－ＥＶを投与した動物のレベルと同様であった。ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した動物のｃＴｎＩのレベルは、スクランブルＲＮＡで処置した動物と比較して低い傾向を示した。

【0101】

これらの結果は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡが、心筋の虚血／再灌流の外傷の後のｉｍＣＤＣ－ＥＶの治療効果を再現したことを示している。一部の実施形態では、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）を投与することは、心外傷の後の心筋梗塞の大きさを低減するために有効である。一部の実施形態では、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）を投与することは、心外傷の後の血中ｃＴｎＩレベルを低減する。

【0102】

実施例３
この非限定的な実施例は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよびｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡが、心筋の虚血／再灌流外傷の後に末梢単球集団の動態を変えることを示している。

【0103】

心筋の虚血／再灌流外傷後の動物の末梢血における単球のフラクションの変化に及ぼすｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）の投与の効果を試験した。心筋の虚血／再灌流から２４時間後に、ビヒクルで処置した動物およびスクランブルＲＮＡで処置した動物は、偽手術された動物と比較して単球の増大を示した（図５Ａ）。対照的に、ｉｍＣＤＣ－ＥＶで処置した動物は、ビヒクルで処置した動物およびスクランブルＲＮＡで処置した動物と比較して低い単球のパーセンテージを有していた。ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した動物は、ビヒクルで処置した動物およびスクランブルＲＮＡで処置した動物と比較して同様の低い単球のパーセンテージの傾向を示した。

【0104】

末梢血中の単球のパーセンテージは、次の２４時間にわたり変化した。ビヒクルまたはスクランブルＲＮＡで処置した動物では、単球のパーセンテージは、心筋の虚血／再灌流から２４時間～４８時間後まで減少した（図４Ａ、４Ｂ）。対照的に、ｉｍＣＤＣ－ＥＶで処置した動物およびｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した動物では、単球のパーセンテージは増大した。

【0105】

心筋の虚血／再灌流から４８時間後に、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した動物は、ビヒクルで処置した動物およびスクランブルＲＮＡで処置した動物よりも高い単球のパーセンテージを有していた（図５Ｂ）。ＩｍＣＤＣ－ＥＶで処置した動物は、ビヒクルで処置した動物およびスクランブルＲＮＡで処置した動物と比較して高い単球のパーセンテージの傾向を示した。対照的に、ｉｍＣＤＣ ＥＶ ｐｉＲＮＡは、血中の好中球計数プロファイルにおいて最小限の効果のみを有していた。

【0106】

これらの結果は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよびｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡの投与が、心筋の虚血／再灌流の外傷の後に末梢血における単球集団の動態を変えることができることを示している。単球は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよびｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡの標的であり得る。一部の実施形態では、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよびｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）は、末梢血中の単球の組成を変える。一部の実施形態では、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）の投与は、心筋の虚血／再灌流の外傷から２４時間後に末梢血中の単球の増加を抑制する。一部の実施形態では、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）の投与は、心筋の虚血／再灌流の外傷後２４時間～４８時間末梢血中の単球の増加を遅延する。

【0107】

実施例４
この非限定的な実施例は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよびｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡの存在下で培養した初代マクロファージのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生存、増殖、および遊走の増大を示している。

【0108】

単球に及ぼすｉｍＣＤＣ－ＥＶおよびｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）の効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）由来のナイーブな（Ｍ０）マクロファージを、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ、またはスクランブルＲＮＡの存在下で２４時間培養し、細胞のバイアビリティおよび増殖に関して試験した。図６Ａは、２４時間の培養後のＢＭＤＭ由来のＭ０マクロファージの画像を示す。ＩｍＣＤＣ－ＥＶで処置した細胞は、８時間および２４時間の培養で、ビヒクル対照と比較して２倍超の細胞のバイアビリティの増加を示し（図６Ｂ）、２４時間で３倍超の増殖の増加を呈した（図６Ｃ）。またｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡと培養した細胞は、２４時間で、ビヒクル対照と比較して高いバイアビリティおよび増殖を示した。対照的に、スクランブルＲＮＡと培養した細胞は、ビヒクル対照の値と同等の細胞増殖を示した。スクランブルＲＮＡで処置した細胞は、２４時間でビヒクルと比較して高い生存を示したが、これはｉｍＣＤＣ－ＥＶまたはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した細胞と比較して低いレベルであった。

【0109】

ｉｍＣＤＣ－ＥＶ、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ、またはスクランブルＲＮＡで処置したマクロファージの遊走を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。図７Ａは、クリスタルバイオレットで染色したポリカーボネートのインサートにおけるＢＭＤＭ由来のＭ０マクロファージの画像を示す。ｉｍＣＤＣ－ＥＶまたはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡと増殖したマクロファージは、ビヒクルで処置した細胞およびスクランブルＲＮＡで処置した細胞と比較して大きな遊走を示した（図７Ｂ）。

【0110】

これらの結果は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよび／またはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡが、細胞の生存、増殖、および遊走を促進するように単球に直接作用し得ることを示している。

【0111】

実施例５
この非限定的な実施例は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡにより誘導されるマクロファージのトランスクリプトームの変化を示している。

【0112】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、実施例４のようにｉｍＣＤＣ－ＥＶ、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）、および対照に曝露させた。次に、トランスクリプトームのプロファイルおよび活性化した経路を評価した。ＩｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ－条件付けＢＭＤＭは、対照と比較して異なるトランスクリプトームプロファイルを呈し、経路のアップレギュレーションは、炎症応答、細胞死、および細胞間シグナリングに関与していた。

【0113】

これらの結果は、マクロファージが、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよびｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡの標的であり得ることを示している。一部の実施形態では、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよび／またはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）は、マクロファージのｍＲＮＡ発現プロファイルを変える。

【0114】

実施例６
この非限定的な実施例は、ＡＳＴＥＸ（ＡＳＴＥＣ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ－Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ）由来の細胞外ベシクル／エキソソーム）における抗線維性メディエーターの同定を示す。

【0115】

ＲＮＡを、１５日間の血清飢餓方法を使用して培養したＡＳＴＥＣにより産生された細胞外ベシクル（ＥＶ）から単離した。単離したＲＮＡのシーケンシングは、修飾されていない正常なヒト真皮線維芽細胞由来のＥＶと比較して、抗線維性メディエーターとして関与するものを含む、ｍｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ種の高い発現を明らかにした（図８Ａ、８Ｄ）。特に、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の病理学的な駆動因子を標的とし阻害することが知られている、ｍｉＲＮＡのｍｉＲ－１８３ファミリーおよびｍｉＲ－１７－９２ファミリーが多く含まれていた。ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－１８３、およびｍｉＲ－９２ａが多く含まれていることは、ｑＰＣＲにより確認された（図８Ｃ）。対照的に、ＡＳＴＥＸは、修飾されていない正常なヒト真皮線維芽細胞由来のＥＶと比較してｍｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡが枯渇していた（図８Ｂ）。

【0116】

これらの結果は、ＡＳＴＥＸが、ＩＰＦの病理学的な駆動因子を標的とするｍｉＲＮＡ種を含む抗線維性メディエーターを多く含み得ることを示している。一部の実施形態では、ＡＳＴＥＸは、ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－１８３、およびｍｉＲ－９２ａを多く含む。一部の実施形態では、ＡＳＴＥＸは、ｐｉＲ－２０４５０を多く含む。

【0117】

実施例７
この非限定的な実施例は、特発性肺線維症におけるＡＳＴＥＸの治療効果を示す。

【0118】

特発性肺線維症のマウスモデルを使用して、ＡＳＴＥＸの治療効果を試験した。第１に、ＡＳＴＥＸの耐用量試験を、図９Ａに概略的に示されるように行った。試験開始時に、５０μＬの生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ）を、１００μｌの空気と共に髄腔内投与した。７日後に、ＡＳＴＥＸを、１０^７、１０^８、および１０^９個の粒子の用量で髄腔内投与した。ＡＳＴＥＸの投与から２１日後に、体重、肺の質量、および肺中ヒドロキシプロリンのレベル（ＨｙＰ）を測定し、肺胞組織の組織学的な染色を行った。各用量のＡＳＴＥＸを投与された動物は、ビヒクル対照と比較して体重を保持し、肺浮腫を示さず（図９Ｂ）、ＡＳＴＥＣが良好に許容されたことを示している。肺中ヒドロキシプロリンのレベルは、全ての用量でビヒクル対照と同等であり（図１０Ａ）、ＡＳＴＥＸを投与された動物に線維症がないことを表している。また、肺胞組織の組織学的な性質決定により、１０^９個のＡＳＴＥＸを投与された動物において線維症がないことが示された。ＡＳＴＥＸを投与された動物由来の肺胞組織のＡｓｈｃｒｏｆｔスコアは、ビヒクル対照と同等であった（図１０Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色により、ＡＳＴＥＸを投与した動物由来の肺胞組織において浸潤する白血球は示されず（図１０Ｃ）、またマッソントリクローム染色に基づく線維症のエビデンスも存在しなかった（図１０Ｄ）。

【0119】

ＡＳＴＥＸが健常な動物により良好に許容されたことを確認した後、ＥＶを、肺線維症をブレオマイシンにより誘導した動物に投与した（図１１Ａ）。動物にブレオマイシンを投与してから５日後に、１×１０^８個の粒子のＡＳＴＥＸ（１０００ｋＤａ）を髄腔内投与した。

【0120】

ＡＳＴＥＸを投与したブレオマイシンで処置した動物は、ビヒクルで処置した動物と比較して改善された生存を示した（図１１Ｂ）。さらに、ＡＳＴＥＸ投与は、ビヒクルで処置した動物と比較して肺中ヒドロキシプロリンのレベルを低減した（図１１Ｃ）。

【0121】

これらの結果は、ＡＳＴＥＸが特発性肺線維症（ＩＰＦ）の処置において治療効果を有することを示している。一部の実施形態では、ＡＳＴＥＸは、ＩＰＦ由来の死亡率を低減または死亡を遅延する。一部の実施形態では、ＡＳＴＥＸは、ＩＰＦの肺線維症を低減または遅延する。

【0122】

実施例８
この非限定的な例は、ｉｎ ｖｉｖｏでの肺線維芽細胞の分化転換に及ぼすＡＳＴＥＸの効果を示している。

【0123】

ＩＰＦでのＡＳＴＥＸの治療効果の根底にある機構を理解するために、初代ヒト肺線維芽細胞に及ぼすＡＳＴＥＸの効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換を促進する外傷を模倣するように、細胞をＴＧＦβで処置した（図１２Ａ）。同時に、細胞をＡＳＴＥＸまたはビヒクル溶液で処置した。ＡＳＴＥＸ処置は、ビヒクルで処置した細胞と比較してＴＧＦβにより誘導されるα平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）のアップレギュレーションを減弱した（図１２Ｂ－１２Ｄ）。

【0124】

これらの結果は、ＡＳＴＥＸが、肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への外傷により誘導される分化転換を低減し得ることを示している。一部の実施形態では、ＡＳＴＥＸは、肺線維芽細胞におけるＴＧＦβにより誘導されるα－ＳＭＡのアップレギュレーションを減弱する。

【0125】

実施例９
この非限定的な実施例は、ＡＳＴＥＸ由来のｐｉＲＮＡを投与することにより特発性肺線維症を処置する方法を示す。

【0126】

ｐｉＲＮＡは、ＡＳＴＥＸから単離される。動物は、肺線維症を誘導するために、動物は、気管内にてブレオマイシンに曝露される。ＡＳＴＥＸ由来のｐｉＲＮＡを、ブレオマイシン曝露から５日後に動物に気管内投与する。動物を生存について観察し、体重を、ｐｉＲＮＡの投与から２１日にわたり測定する。肺組織中のヒドロキシプロリンのレベルを測定し、肺線維症のレベルを推定する。

【0127】

実施例１０
この非限定的な実施例は、細胞質と核との間のｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡのシャトリングを示す。

【0128】

ＢＭＤＭ由来のＭ０マクロファージを、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）またはビヒクル対照の存在下で増殖させ、対照のレベルと比較した倍差としてのｐｉＲＮＡの細胞内の局在を、異なる時点で測定した（実施例４参照）。最初に、ｐｉＲＮＡは、培養の開始から５分後から、核よりも細胞質でより多く存在し、４５分目では主に細胞質に存在する（図１７Ａ）。１８時間目に、ｐｉＲＮＡは、細胞質および核の区画で見出され、２４時間までに、ｐｉＲＮＡは主に核に存在するようになり、細胞質にはほとんど残らなかった（図１７Ａ）。４８時間目までに、ｐｉＲＮＡは、細胞質または核の中に有意なレベルで見出されなかった（図１７Ａ）。対照的に、スクランブルＲＮＡは、５時間目、１８時間目、および２４時間目に細胞質および核に存在し、４８時間目までに両区画においてほとんどが排除された（図１７Ｂ）。この結果は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）が核に優先的に蓄積し、遺伝子発現を調節し得ることを示している。

【0129】

実施例１１
この非限定的な実施例は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した初代マクロファージにおける全体的なメチル化の増大を示す。

【0130】

ＢＭＤＭ由来のＭ０マクロファージを、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）、スクランブルＲＮＡ、またはビヒクル対照の存在下で増殖させ、全体的なメチル化のレベルを、２４時間目および４８時間目に測定した（実施例４参照）。２４時間目に、ｉｍＣＤＣ－ＥＶで処置した細胞およびｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した細胞は、ビヒクル対照またはスクランブルＲＮＡと比較して全体的なメチル化の増大を示した（図１８Ａ）。４８時間目に、ｉｍＣＤＣ－ＥＶで処置した細胞は、ビヒクル対照と同等のメチル化レベルを有していた（図１８Ｂ）。対照的に、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡで処置した初代マクロファージは、ビヒクル対照またはスクランブルＲＮＡと比較して高いレベルの全体的なメチル化を維持していた（図１８Ｂ）。

【0131】

この結果は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）が、ＤＮＡメチル化を増大し得、遺伝子発現の調節に寄与し得ることを示している。

【0132】

一部の実施形態では、初代マクロファージをｉｍＣＤＣ－ＥＶおよび／またはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）と接触させることは、初代マクロファージの全体的なメチル化を増大させる。一部の実施形態では、初代マクロファージをｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）と接触させることにより誘導される全体的なメチル化レベルの変化は、ｉｍＣＤＣ－ＥＶにより誘導される全体的なメチル化の変化よりも長く続いている。

【0133】

実施例１１
この非限定的な実施例は、実施例１～５、１０、および１１に示される、初代マクロファージに及ぼすｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（たとえばｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）の効果をまとめた概略図を示している。

【0134】

実施例１～５、１０、および１１に開示されたデータは、ＢＭＤＭ由来のＭ０マクロファージへの作用を介した、心筋の虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）の外傷におけるｉｍＣＤＣ－ＥＶおよび／またはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）の心保護のモデルを裏付けている（図１９、上部のパネル）。ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよび／またはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）と共に培養したＢＭＤＭは、炎症応答、細胞死、および細胞間シグナリングに関与する経路のアップレギュレーションを示した転写プロファイルの変更を呈した（実施例５、図１９、左下のパネル）。ｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）は、核へと優先的にシャトリングされ、全体的なＤＮＡメチル化を増大させた（実施例１０、図１９、右下のパネル）。心筋の虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）の外傷のモデルの動物に投与する場合、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよび／またはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）は、梗塞の大きさを低減し、末梢血におけるｃＴｎＩのレベルを低減した（実施例２、図１９、中央下部のパネル）。心筋の虚血／再灌流外傷後の末梢の単球集団の動態もまた、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよび／またはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡの投与により変化した（実施例３、図１９、中央下部のパネル）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ｉｍＣＤＣ－ＥＶおよび／またはｉｍＣＤＣ－ＥＶ ｐｉＲＮＡ（ｈｓａ＿ｐｉＲ＿０１６６５９）は、初代マクロファージの生存、増殖、および遊走を増大させた（実施例４、図１９、中央下部のパネル）。

【0135】

上記を、明確性および理解のため例示および実施例により一部を詳細に説明してきたが、本開示の趣旨から逸脱することなく修正がなされ得ることを当業者は理解するものである。よって、本明細書中開示される形態は、単なる例であり、本開示の範囲を限定するようには意図されておらず、むしろ、本開示の実施形態の真の範囲および趣旨と一致する全ての修正および代替を包有するように意図されていることを理解されたい。

【0136】

上記に開示される実施形態の特定の性質および態様の様々な組み合わせまたは下位の組み合わせがなされ得ることが企図されている。さらに、一実施形態と組み合わせたいずれかの特定の性質、態様、方法、特性、特徴、質、特質、要素などの本明細書中の開示は、本明細書中に記載の他の全ての実施形態で使用され得る。よって、開示される実施形態の様々な性質および態様は、開示される主題の様々な様式を形成するために互いに組み合わせることができ、置き換えることができることを理解されたい。よって、本開示の範囲は上述の特定の開示された実施形態により限定されるべきではないことが意図されている。さらに。開示した主題は、様々な修正および別の形態の影響を受けやすいが、その具体的な実施例が図面に示されており、本明細書中詳細に記載されている。しかしながら、本開示は、開示した特定の形態または方法に限定されるべきではなく、記載される様々な実施形態および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内にある全ての修正、均等物、および代替物を包有することを理解されたい。本明細書中開示される全ての方法は、記載された順序で行われる必要はない。本明細書中開示される方法は、実務者に行われる特定の行為を含むが、これらはまた、明示的または暗示的に、これら行為の第三者の説明をも含み得る。たとえば、「エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の有効（または治療上有効）量を投与すること」は、「エキソソーム由来のｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ）の有効（または治療上有効）量の投与を説明すること」を含む。さらに、本開示の性質または態様がマーカッシュグループの観点で記載される場合、当業者は、本開示がこれにより、マーカッシュグループのいずれかの個別のメンバーまたは下位グループの観点で記載されることを認識している。

【0137】

また、本明細書中開示される範囲は、そのあらゆる重複、下位範囲、および組み合わせを包有する。「最大（ｕｐ ｔｏ）」、「少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ）」、「～超（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）」、「～未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）」、「間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」などの言語は、記載される数を含む。「約（ａｂｏｕｔまたはａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの用語が先行する数は、記載される数字を含む。たとえば、「約９０％」は、「９０％」を含む。一部の実施形態では、少なくとも９５％相同は、参照配列に対し９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％相同であることを含む。さらに、配列が、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と開示される場合、当該言及はまた、他の意味が記載されない限り、当該配列が記載した配列「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」か、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」か、または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことを含む。

【0138】

本出願で、特に添付の特許請求の範囲において使用される用語および文言、ならびにそれらの変形は、他の意味が明記されない限り、限定とは反対の、オープンエンドとして解釈すべきである。上記の例として、用語「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「限定するものではないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ， ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）」、「限定するものではないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」などを意味するように読まれるべきである。

【0139】

不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、複数を排除するものではない。用語「約」は、本明細書中使用される場合、たとえば分子量の値および範囲を定義するために、記載された値および／または範囲の限界が、±２０％以内、たとえば±５％以内を含む±１０％以内で変動し得ることを意味する。数の前に「約」を使用することは、その数自体を含む。たとえば、「約５」は、「５」の支持を提供する。範囲に提供される数は、その間の重複する範囲および整数を含み、たとえば、１～４および５～７の範囲は、たとえば、１－７、１－６、１－５、２－５、２－７、４－７、１、２、３、４、５、６、および７を含む。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【手続補正書】

【提出日】2023-01-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2023527766000001.app

【国際調査報告】