▶ シェンチェン イミュノウセラピー バイオテック カンパニー リミテッドの特許一覧
特表2023-527927新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）スパイクタンパク質結合分子及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-30
(54)【発明の名称】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）スパイクタンパク質結合分子及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230623BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20230623BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230623BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230623BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230623BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230623BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230623BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230623BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230623BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230623BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230623BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230623BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230623BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20230623BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/10 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C12P21/02 C
A61K39/395 S
A61K39/395 D
A61K39/395 Y
A61P31/14
A61P11/00
A61K47/68
G01N33/569 L
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022574538
(86)(22)【出願日】2021-03-08
(85)【翻訳文提出日】2022-12-07
(86)【国際出願番号】 CN2021079568
(87)【国際公開番号】W WO2021244089
(87)【国際公開日】2021-12-09
(31)【優先権主張番号】202010491549.0
(32)【優先日】2020-06-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522470264
【氏名又は名称】シェンチェン イミュノウセラピー バイオテック カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100175477
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 林太郎
(72)【発明者】
【氏名】チャン ジュンファン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA26X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC35
4C076EE41
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA21
4C085AA33
4C085BA71
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC01
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA29
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）スパイクタンパク質結合分子及びその使用を提供する。該結合分子はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のスパイクタンパク質に特異的に結合することができ、少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含み、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質とヒト細胞ＡＣＥ２受容体との結合を効果的に遮断することで、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２による細胞感染を遮断し、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の伝染及び増幅を抑制することができる。
【選択図】図６
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合し、少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含み、前記免疫グロブリンの単一可変ドメイン中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が以下の組み合わせから選ばれるいずれか１群であることを特徴とするＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子：１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＣＤＲ３；
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＣＤＲ３；
３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＣＤＲ３；
４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示される ＣＤＲ３；
５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示される ＣＤＲ３；
６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示される ＣＤＲ３；
７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示される ＣＤＲ３；
８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示される ＣＤＲ３；
９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示される ＣＤＲ３；
１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示される ＣＤＲ３；
１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３に示される ＣＤＲ３；
１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６に示される ＣＤＲ３；
１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９に示される ＣＤＲ３；
１４）ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２に示される ＣＤＲ３；
１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５に示される ＣＤＲ３；
１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８に示される ＣＤＲ３；
１７）ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１に示される ＣＤＲ３；
１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４に示される ＣＤＲ３；
１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７に示される ＣＤＲ３；
２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０に示される ＣＤＲ３；
２１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３に示される ＣＤＲ３；
２２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６に示される ＣＤＲ３；
２３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６９に示される ＣＤＲ３；
２４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７２に示される ＣＤＲ３；
２５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７５に示される ＣＤＲ３；
２６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７８に示される ＣＤＲ３；
２７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８１に示される ＣＤＲ３。
【請求項2】
前記免疫グロブリンの単一可変ドメインは単一ドメイン抗体であることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項3】
前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２～１０８のいずれかの配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項4】
前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２－１０８のいずれかの配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項5】
前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２－１０８のいずれかの配列と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項6】
前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２～１０８のいずれかのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項7】
免疫グロブリンＦｃ領域をさらに含むことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項8】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒト免疫グロブリンＦｃ領域であることを特徴とする請求項７に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項9】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ１のＦｃ領域であることを特徴とする請求項８に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項10】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０９であることを特徴とする請求項９に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項11】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１０～１３６のうちの少なくとも１種のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項12】
以下の特徴のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする請求項１～６、８～１１のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。ａ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合するＫＤ値が１×１０－８Ｍ未満であること
ｂ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２とヒト細胞受容体ＡＣＥ２との結合を遮断すること
ｃ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の伝染及び増幅を抑制すること
【請求項13】
以下の特徴のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする請求項７に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。ａ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合するＫＤ値が１×１０－８Ｍ未満であること
ｂ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質とヒト細胞受容体ＡＣＥ２との結合を遮断すること
ｃ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の伝染及び増幅を抑制すること
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子をコードする核酸分子。
【請求項15】
請求項１４に記載の核酸分子及びその発現調節エレメントを含む発現ベクター。
【請求項16】
請求項１４に記載の核酸分子を含み、この核酸分子を発現させる宿主細胞。
【請求項17】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子の取得方法であって、前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子の発現を可能にする条件で請求項１６に記載の宿主細胞を培養するステップａと、
ステップａの培養物から前記宿主細胞で発現させたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を収集するステップｂと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項18】
治療的部分にコンジュゲートする請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を含むことを特徴とする免疫コンジュゲート。
【請求項19】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子及び／又は請求項１８に記載の免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項20】
新型コロナウイルス肺炎を治療又は予防する医薬品の製造における請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項21】
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２を検出するキットであって、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を含むことを特徴とするキット。
【請求項22】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子とＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質とが複合体を形成し得る条件下で、検出サンプルと対照サンプルとを請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子に接触させ、複合体の形成を検出し、前記検出サンプルと対照サンプルとの複合体の形成の違いによってサンプル中のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の存在を判断することを特徴とする請求項２１に記載のキットの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は２０２０年０６月０２日に提出された中国特許出願ＣＮ２０２０１０４９１５４９．０の優先権を主張している。先行出願の開示内容は全体として本願に組み込まれている。
【0002】
本願は新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）スパイクタンパク質結合分子及びその使用に関し、医薬生物の技術分野に属する。
【背景技術】
【0003】
新型コロナウイルス肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）は全世界で合計４００数万人以上に感染し、しかも感染者数は依然として急速に増加しており、現在、臨床ではＣＯＶＩＤ－１９に対する特異的で有効な治療手段がない。中国の感染症は全面的に抑制されているが、海外の感染症は爆発的に発生しており、しかも急速に増加している。そのほか、ますます多くの研究により、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）感染は慢性キャリア状態が存在する可能性があることが示され、退院した再陽性患者の一部もウィルスが長期的に人体に存在する可能性を示唆している。長期的にウィルスをキャリアするメカニズムや時期などの重要な要素は不明で、将来、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の再発を防ぐことが重要である。ＣＯＶＩＤ－１９の影響により、中国及び世界各国ではこれにより発生した経済的損失、社会的負担、その他のマイナス影響は計り知れない。
【0004】
現在、ＣＯＶＩＤ－１９に対する特効薬はなく、効果的な薬の迅速な開発が急務となっている。中国の国内外の多くの研究開発機関は、ＣＯＶＩＤ－１９に対する治療戦略の研究に積極的に取り込んでいる。すでに開発されたレムデシビル、ファビピラビルなどの広スペクトル小分子抗ウィルス薬はＣＯＶＩＤ－１９に対して一定の治療効果を持つが、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する特異性がないため、治療効果が限られ、ＣＯＶＩＤ－１９の特効薬として期待されにくい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
新型コロナウイルスに対する特異性がなく、治療効果が限られ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の特効薬として期待されにくいという従来の抗ウィルス薬の問題に対して、本願は新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）スパイクタンパク質結合分子及びその使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本願の第１態様は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合し、少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含み、前記免疫グロブリンの単一可変ドメイン中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が以下の組み合わせから選ばれるいずれか１群である新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）スパイクタンパク質結合分子を提供する。
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：３に示される ＣＤＲ３；
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される ＣＤＲ３；
３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される ＣＤＲ３；
４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示されるＣＤＲ３；
５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＣＤＲ３；
６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるＣＤＲ３；
７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＣＤＲ３；
８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＣＤＲ３；
９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＣＤＲ３；
１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＣＤＲ３；
１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＣＤＲ３；
１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＣＤＲ１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＣＤＲ３；
１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＣＤＲ３；
１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＣＤＲ３；
１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＣＤＲ３；
１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＣＤＲ３；
１７）ＳＥＱ ＩＤＮＯ：４９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＣＤＲ３；
１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５３に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＣＤＲ３；
１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示されるＣＤＲ３；
２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるＣＤＲ３；
２１）ＳＥＱ ＩＤＮＯ：６１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示されるＣＤＲ３；
２２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるＣＤＲ３；
２３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９に示されるＣＤＲ３；
２４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示されるＣＤＲ３；
２５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５に示されるＣＤＲ３；
２６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に示されるＣＤＲ３；
２７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１に示される ＣＤＲ３。
本願の一実施例として、前記免疫グロブリンの単一可変ドメインは単一ドメイン抗体である。
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：３に示される ＣＤＲ３；
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される ＣＤＲ３；
３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される ＣＤＲ３；
４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示されるＣＤＲ３；
５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＣＤＲ３；
６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるＣＤＲ３；
７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるＣＤＲ３；
８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるＣＤＲ３；
９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるＣＤＲ３；
１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるＣＤＲ３；
１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＣＤＲ３；
１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＣＤＲ１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＣＤＲ３；
１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＣＤＲ３；
１４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＣＤＲ３；
１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＣＤＲ３；
１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＣＤＲ３；
１７）ＳＥＱ ＩＤＮＯ：４９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示されるＣＤＲ３；
１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ５３に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるＣＤＲ３；
１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示されるＣＤＲ３；
２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるＣＤＲ３；
２１）ＳＥＱ ＩＤＮＯ：６１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示されるＣＤＲ３；
２２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるＣＤＲ３；
２３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９に示されるＣＤＲ３；
２４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示されるＣＤＲ３；
２５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５に示されるＣＤＲ３；
２６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に示されるＣＤＲ３；
２７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１に示される ＣＤＲ３。
本願の一実施例として、前記免疫グロブリンの単一可変ドメインは単一ドメイン抗体である。
【0007】
本願の一実施例として、前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２～１０８のいずれかの配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0008】
本願の一実施例として、前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２～１０８のいずれかの配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0009】
本願の一実施例として、前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２～１０８のいずれかの配列と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0010】
本願の一実施例として、前記単一ドメイン抗体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２～１０８の何れかに比べ１つ又は複数のアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換を含む。
本願の一実施例として、前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２～１０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
本願の一実施例として、前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子は免疫グロブリンＦｃ領域をさらに含む。
本願の一実施例として、前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２～１０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
本願の一実施例として、前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子は免疫グロブリンＦｃ領域をさらに含む。
【0011】
本願のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子では、免疫グロブリンＦｃ領域を含むことにより、前記結合分子は二量体となり、また、前記分子の生体内半減期がさらに長くなる。本願に用いられ得るＦｃ領域は異なるサブタイプの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ 又はＩｇＭに由来してもよい。
本願の一実施例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒト免疫グロブリンＦｃ領域である。
本願の一実施例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。
本願の一実施例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９である。
本願の一実施例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０～１３６の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
上記Ｆｃ領域に融合した結合分子は、安定性と生物学的活性がさらに向上し、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合するＫＤ値がさらに低下する。
本願の一実施例として、前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子は以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する。
ａ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合するＫＤ値が１×１０－８Ｍ未満であること
ｂ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２とヒト細胞受容体ＡＣＥ２との結合を遮断すること
ｃ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の伝染及び増幅を抑制すること
本願の一実施例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒト免疫グロブリンＦｃ領域である。
本願の一実施例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。
本願の一実施例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９である。
本願の一実施例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０～１３６の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
上記Ｆｃ領域に融合した結合分子は、安定性と生物学的活性がさらに向上し、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合するＫＤ値がさらに低下する。
本願の一実施例として、前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子は以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する。
ａ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合するＫＤ値が１×１０－８Ｍ未満であること
ｂ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２とヒト細胞受容体ＡＣＥ２との結合を遮断すること
ｃ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の伝染及び増幅を抑制すること
【0012】
本願の第２態様は、前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子をコードする核酸分子を提供し、前記核酸分子はＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであり、人工合成により得られてもよいし、適切な天然由来から単離されてもよい。
【0013】
本願の第３態様は、前記核酸分子とその発現調節エレメントを含む発現ベクターを提供する。該発現ベクターは通常少なくとも１つの本願による核酸分子を含み、この核酸分子は１つ又は複数の適切な発現調節エレメント（プロモータ、エンハンサターミネータ、インテグレート因子、選択マーカー、プリアンブル配列、レポーター遺伝子など）に作動可能に連結される。特定宿主細胞での発現について前記エレメント及びその配列を選択することは当業者にとって常識である。
【0014】
本願の第４態様は、前記核酸分子を含み、この核酸分子を発現させる宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は異種タンパク質を発現させる細胞であり、細菌細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞を含む。
本願の第５態様は、
前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子の発現を可能にする条件で上記宿主細胞を培養するステップａと、
本願の第５態様は、
前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子の発現を可能にする条件で上記宿主細胞を培養するステップａと、
【0015】
ステップａの培養物から前記宿主細胞で発現させたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を収集するステップｂと、を含む前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子の取得方法を提供する。
【0016】
特定の核酸分子を発現ベクターに組み換え、形質転換又はトランスフェクション方法によって宿主細胞に入れて発現させ、マーカーを選択して、タンパク質の発現を誘導する方法、培養条件などは本分野で公知のことである。また、タンパク質結合分子の単離及び精製技術は当業者に公知のことである。
本願によるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子は本分野で公知の別のタンパク質産生方法、例えば化学合成によって得られてもよい。
本願によるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子は本分野で公知の別のタンパク質産生方法、例えば化学合成によって得られてもよい。
【0017】
本願の第６態様は、治療的部分にコンジュゲートする上記のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を含む免疫コンジュゲートを提供する。
【0018】
本願の第７態様は、上記のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子及び／又は前記免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【0019】
本願の前記「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。この担体は、静脈内、筋内、皮下、胃腸外、脊柱又は表皮への投与（例えば、注射又は輸注による）に適している。投与経路によれば、活性化合物、すなわち結合分子、免疫コンジュゲートは、当該化合物を不活性化することができる酸及びその他の自然条件の作用から当該化合物を保護するための材料に被覆してもよく、これは当業者には周知のことである。
本願の前記医薬組成物は必要に応じて他のアジュバントや補助材料などを含んでもよい。
本願の第８態様は、新型コロナウイルス肺炎を治療又は予防する医薬品の製造における前記医薬組成物の使用を提供する。
本願の第９態様は、上記のいずれか１つに記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を含むＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２を検出するキットを提供する。
本願の前記医薬組成物は必要に応じて他のアジュバントや補助材料などを含んでもよい。
本願の第８態様は、新型コロナウイルス肺炎を治療又は予防する医薬品の製造における前記医薬組成物の使用を提供する。
本願の第９態様は、上記のいずれか１つに記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を含むＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２を検出するキットを提供する。
【0020】
本願の第１０態様は、上記いずれか１つに記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子とＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質とが複合体を形成し得る条件下で、検出サンプルと対照サンプルを上記のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子に接触させ、複合体の形成を検出し、前記検出サンプルと対照サンプルとの複合体の形成の違いによってサンプル中のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の存在を判断する前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２を検出するキットの使用方法を提供する。
【発明の効果】
【0021】
本願によるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質）結合分子はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質に特異的に結合し、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質とヒト細胞ＡＣＥ２受容体との結合を効果的に遮断することで、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２による細胞の感染を遮断し、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の伝染及び増幅を抑制することができる。しかも、本願によるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質結合分子はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質に結合する特異性に優れ、生物学的活性及び安定性が高く、毒性や副作用がないなどの特徴を有する。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】本願の実施例１において抽出された全ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動図であり、Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ２０００、レーン１：全ＲＮＡである。
【図2】本願の実施例１においてネストＰＣＲにより単一ドメイン抗体遺伝子を増幅させたＳｔｅｐｌ－ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動図であり、Ｍ： ＤＮＡｍａｒｋｅｒ ２０００、レーン１：増幅産物である。
【図3】本願の実施例１においてネストＰＣＲにより単一ドメイン抗体遺伝子を増幅させたＳｔｅｐ２－ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動図であり、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ２０００、レーン１及び２：増幅産物である。
【図4】本願の実施例１において目的単一ドメイン抗体遺伝子とベクターｐＨＥＮ１ のＳｆｉＩ／Ｎｏｔ１二重酵素切断による産物のアガロースゲル電気泳動図であり、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ２０００、レーン１： ｐＨＥＮ１；レーン２： ｓｆｉｌ／ｎｏｔＩ酵素切断後のｐＨＥＮ１；レーン３： ｓｆｉｌ／ｎｏｔＩ酵素切断後の単一ドメイン抗体遺伝子である。
【図5】本願の実施例１においてライブラリ挿入率を測定するコロニーのＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動図であり、Ｍ：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ２０００；レーン１－４８：選択された４８個のコロニーである。
【図6】本願の実施例２における治療群及び対照群のアカゲザルのウィルス量の経時的な変化図である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
定義
【0024】
別段の指示又は定義がない限り、使用される用語は全て当該分野における通常の意味であり、この意味は当業者にとって周知である。さらに、詳細に記載されていない全ての方法、ステップ、技術、及び動作は、特に断らない限り、周知の方法で行われてもよく、このような方法は当業者に周知である。
【0025】
特に断らない限り、交換可能に使用される用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、本明細書では、重鎖抗体又は従来の４鎖抗体を指すか否かにかかわらず、全長抗体、その単一鎖、及びその全ての部分、ドメイン又はフラグメント（抗原結合ドメイン又はフラグメントを含むが、これに限定されない）を含む一般用語として使用される。さらに、本明細書で使用される用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「単一可変ドメイン配列」、「単一ドメイン抗体配列」、又は「タンパク質配列」などの用語）は、本明細書でより限定された解釈が必要でない限り、関連するアミノ酸配列と、当該配列をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列とを含むものとして一般的に理解されるべきである。
【0026】
本明細書で使用される用語「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、当該領域と、以下でそれぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と呼ばれる４つの「フレームワーク領域」とから実質的に構成される免疫グロブリンドメインを意味し、ここで、前記フレームワーク領域は、当該領域と、以下でそれぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と呼ばれる３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」によって間隔をあけて配置される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４として表され得る。免疫グロブリン可変ドメインは、抗原結合部位を有することにより、抗体に抗原に対する特異性を付与する。
【0027】
従来のＩｇＧ抗体分子は一般に、１つの可変領域（ＶＬ）と１つの定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖と、１つの可変領域（ＶＨ）と３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含む重鎖とから構成される。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ：Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは、抗体の軽鎖が欠損して重鎖の可変領域しかない抗体であり、分子量が小さいことからナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）とも呼ばれる。単一ドメイン抗体は、他の抗原結合ドメインを必要とせずにエピトープに特異的に結合する。単一ドメイン抗体は免疫グロブリン単一ドメインから形成された小型で安定かつ高効率な抗原認識ユニットである。
この分野のように単一ドメイン抗体中の各ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の総数は異なる可能性がある。
この分野のように単一ドメイン抗体中の各ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の総数は異なる可能性がある。
【0028】
単一ドメイン抗体中のアミノ酸残基の総数は、通常１１０から１２０の範囲内であり、１１２から１１５の間である場合が多い。ただし、より短い配列及びより長い配列も、本明細書に記載された目的にも適用できる。
単一ドメイン抗体及びそれを含むポリペプチドの他の構造的特性と機能的特性は以下のようにまとめる。
単一ドメイン抗体及びそれを含むポリペプチドの他の構造的特性と機能的特性は以下のようにまとめる。
【0029】
単一ドメイン抗体（軽鎖可変ドメインが存在せず、かつ軽鎖可変ドメインと相互作用せずに、抗原に機能的に結合するように自然に「設計」されている）は、単一の比較的小さな機能的抗原結合構造ユニット、ドメインやポリペプチドとして使用することができる。これは単一ドメイン抗体と通常の４本鎖抗体のＶＨ及びＶＬドメインとを区別し、これらのＶＨ及びＶＬドメイン自体は通常、単一抗原結合タンパク質又は免疫グロブリンの単一可変ドメインとしての実用化には適さないが、機能的抗原結合ユニット（例えば、Ｆａｂフラグメントのような従来の抗体フラグメントのような形、又は、ＶＬドメインと共有結合したＶＨドメインからなるｓｃＦｖの形で）を提供するために、何らかの形又は別の形で組み合わされる必要がある。
【0030】
このような独特の性質のために、単一ドメイン抗体の使用又はより大きなポリペプチドの一部としての使用は、従来のＶＨ及びＶＬドメイン、ｓｃＦｖ又は従来の抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ－又はＦ（ａｂ’）２－フラグメント）の使用よりも優れた多くの顕著な利点を提供し、例えば、単一ドメイン抗体は、抗原に高親和性及び高選択性で結合するために単一ドメインのみを必要とするので、２つの個別ドメインが存在する必要も、この２つのドメインが適切な空間的配座及び配置で存在することを保証する必要もない（例えば、ｓｃＦｖは一般的に特別に設計されたリンカーを使用する必要がある）。単一ドメイン抗体は単一遺伝子から発現可能であり、翻訳後の折り畳み又は修飾を必要としない。単一ドメイン抗体は多価及び多特異的フォーマットに容易に改変することができる。単一ドメイン抗体は高度に可溶化し、しかも凝集傾向がない。単一ドメイン抗体は、熱、ｐＨ、プロテアーゼ及び他の変性剤又は条件に対して高度に安定であり、したがって、製造、貯蔵又は輸送において冷凍装置を使用しなくてもよく、これにより、コスト、時間及び環境の節約を達成することができる。単一ドメイン抗体は、製造が容易で比較的安価であり、製造に必要な規模においても同様である。単一ドメイン抗体は、従来の４本鎖抗体及びその抗原結合フラグメントと比較して小さい（約１５ｋＤａ又は従来のＩｇＧの１／１０の大きさ）ため、従来の４本鎖抗体及びその抗原結合フラグメントと比較して、より高い組織透過性を示し、より高い用量を投与することができる。単一ドメイン抗体はいわゆる腔内結合性を示すことができ（特に従来のＶＨドメインと比べて延長されたＣＤＲ３環のため）、それによって、従来の４鎖抗体及びその抗原結合フラグメントが到達できない標的及びエピトープに到達することができる。
【0031】
特定の抗原又はエピトープに結合する単一ドメイン抗体を得る方法は、次の文献に開示されている。R. van derLinden et al. , Journal of Immunological Methods, 240（2000） 185 - 195； Li et al., JBiol Chem .，287 （2012） 13713 - 13721 ； Deffar et al .，African Journal of Biotechnology Vol. 8 （12），pp. 2645-2652，17June, 2009とW094/04678。
【0032】
さらに、上記のＣＤＲの１つ又は複数が、他の「ステント」（ヒトステント又は非免疫グロブリンステントを含むがこれに限定されない）に「移植」される可能性があることも当業者には理解される。前記ＣＤＲ移植に適したステント及び技術は当該分野で公知のことである。
【0033】
一般に、「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば、本願の免疫グロブリンの単一可変ドメイン）分子が結合し得る異なるタイプの抗原又はエピトープの数を意味する。抗原結合分子の特異性は、その親和性及び／又は親和性に基づいて決定することができる。抗原と抗原結合タンパク質の平衡解離定数（ＫＤ）で表される親和性は、エピトープと抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との結合強度の尺度であり、ＫＤ値が小さいほどエピトープと抗原結合分子との結合強度が強い（あるいは、親和性は結合定数（ＫＡ）としても表されてもよく、１／ＫＤである）。当業者が理解するように、親和性は、具体的に関心のある抗原にもよるが、既知の方法で測定されてもよい。親和性は、抗原結合分子（例えば、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンの単一可変ドメイン、又はそれらを含むポリペプチド）と関連抗原との間の結合強度の尺度である。親和性は、その抗原結合分子上の抗原結合部位との親和性と、抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数とに関係する。
【0034】
本発明に使用される「ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２Ｓｐｉｋｅタンパク質結合分子）」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合し得る任意の分子を意味する。ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スタンドプシン結合分子は、本願で定義されるようにＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スタンドプシンに対する単一ドメイン抗体又はそのコンジュゲートを含むことができる。ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子はまた、いわゆる「ＳＭＩＰ」（「小モジュール免疫薬」）、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体（ＩｇＳＦ）又はＣＤＲ移植分子を含む。
【0035】
本願の「ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子」は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合する少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、例えば、単一ドメイン抗体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本願の「ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子」は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合する２つの免疫グロブリンの単一可変ドメイン、例えば、単一ドメイン抗体を含んでもよい。免疫グロブリンの単一可変ドメインを１つ以上含むＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子は、「フォーマットされた」ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子とも呼ばれる。フォーマットされたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合する免疫グロブリンの単一の可変ドメインに加えて、リンカー及び／又はエフェクター機能を有する部分、例えば半減期延長部分（例えば、血清アルブミンに結合する免疫グロブリンの単一可変ドメイン）、及び／又は融合配偶体（例えば、血清アルブミン）及び／又はコンジュゲートポリマー（例えば、ＰＥＧ）及び／又はＦｃ領域を含んでもよい。本願の「ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子」はまた、異なる抗原に結合する免疫グロブリンの単一可変ドメインを含む二重特異性抗体を含む。
【0036】
一般に、本願のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子は、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡアッセイで測定されるような好ましい１０－８～１０－１２モル／リットル（Ｍ）、より好ましくは１０－９～１０－１１モル／リットル、さらに好ましくは１０－１０～１０－１２、さらに好ましい１０－１１～１０－１２の解離定数（ＫＤ）以下である。１０－４Ｍより大きいＫＤ値は一般に非特異的結合を示すものとみなされる。抗原結合タンパク質の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、本明細書に記載された表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）アッセイ、及び／又は競合的結合アッセイ（例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ）を含む、公知の任意の適切な方法で測定することができる。
【0037】
アミノ酸残基は、当該分野で公知であり、かつ合意した３文字又は１文字のアミノ酸コードで表される。前記保存的アミノ酸置換は当該分野において公知であり、例えば、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、以下の群（１）～（５）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基によって置換されたものである。（１）小さい脂肪族の非極性又は弱極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；（２）極性負帯電残基及びその（帯電していない）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；（３）極性帯正電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；（４）大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ；及び（５）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。特に好ましい保存的アミノ酸置換は、ＡｌａがＧｌｙ又はＳｅｒで置換されたもの；ＡｒｇがＬｙｓで置換されたもの；ＡｓｎがＧｌｎ又はＨｉｓで置換されたもの；ＡｓｐがＧｌｕで置換されたもの；ＣｙｓがＳｅｒで置換されたもの；ＧｌｎがＡｓｎで置換されたもの；ＧｌｕがＡｓｐで置換されたもの；ＧｌｙがＡｌａ又はＰｒｏで置換されたもの；ＨｉｓがＡｓｎ又はＧｌｎで置換されたもの；ＩｌｅがＬｅｕ又はＶａｌで置換されたもの；ＬｅｕがＩｌｅ又はＶａｌで置換されたもの；ＬｙｓがＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕで置換されたもの；ＭｅｔがＬｅｕ、Ｔｙｒ又はＩｌｅで置換されたもの；ＰｈｅがＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒで置換されたもの；ＳｅｒがＴｈｒで置換されたもの；ＴｈｒがＳｅｒで置換されたもの；ＴｒｐがＴｙｒで置換されたもの；ＴｙｒがＴｒｐ又はＰｈｅで置換されたもの；ＶａｌがＩｌｅ又はＬｅｕで置換されたものである。
【0038】
２つのポリペプチド配列間の「配列の相同性」は、配列間の同一アミノ酸の割合を示す。アミノ酸又はヌクレオチド間の配列の相同性の程度を評価する方法は、当業者には公知である。例えば、アミノ酸配列の相同性は、通常配列解析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴプログラムを使用して、相同性を判定することができる。配列の相同性の判定については、例えば、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987 と Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds. , M Stockton Press, NewYork, 1991を参照してもよい。
【0039】
その天然生物由来の、及び／又は該ポリペプチド又は核酸分子を得るための反応媒体又は培地と比較して、その由来又は媒体（培地）中で一般的にそれに関連する少なくとも１つの他の成分（例えば、別のタンパク質／ポリペプチド、別の核酸、別の生体成分又は大分子、又は少なくとも１つの汚染物質、不純物又は微量成分）から単離された場合、ポリペプチド又は核酸分子は、「実質的に単離された」とみなされる。特に、ポリペプチド又は核酸分子は、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特に少なくとも１００倍、１０００倍以上、又は１０００倍以上精製された場、「実質的に単離された」ものとみなされる。「実質的に単離された」ポリペプチド又は核酸分子は、好適な技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動のようなクロマトグラフィー技術）によって決定され、実質的に均質であることが好ましい。
実施例１
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質に対する単一ドメイン抗体のスクリーニング
１．１ ライブラリの構築
１．１．１ 免疫
新型コロナウイルスのＳｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質でアルパカを免疫し、それぞれ１、２、４、６週目に、１回ずつ２００μｇの免疫量で計４回免疫した。
１．１．２ 全ＲＮＡの抽出
実施例１
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質に対する単一ドメイン抗体のスクリーニング
１．１ ライブラリの構築
１．１．１ 免疫
新型コロナウイルスのＳｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質でアルパカを免疫し、それぞれ１、２、４、６週目に、１回ずつ２００μｇの免疫量で計４回免疫した。
１．１．２ 全ＲＮＡの抽出
【0040】
免疫６週間後のアルパカ末梢血５０ｍｌからリンパ球を単離し、Ｔｒｉｚｏｌを用いてリンパ球の全ＲＮＡを抽出し、紫外分光光度計によって抽出されたＲＮＡを検出した結果、０Ｄ２６０／２８０＝１．９９、０Ｄ２６０／２３０＝１．４３であり、抽出されたＲＮＡは顕著に分解されておらず、純度が高いことが示され、全ＲＮＡの濃度は８０９．３ｎｇ／μＬである。抽出された全ＲＮＡを用いてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果、図１に示すように、２８Ｓと１８Ｓの２本のバンドが見られた。
１．１．３ ＲＮＡ逆転写
ＲＮＡ逆転写系：
Ｓｔｅｐ １ （表１）：
均一に混合した後、６５℃で５ｍｉｎ保温し、迅速に氷浴処理した。
Ｓｔｅｐ ２ （表２）：
均一に混合した後、逆転写してｃＤＮＡを得て、逆転写条件は、４２℃、３０ ｍｉｎ； ５０℃、１５ ｍｉｎ ； ７０℃、１５ ｍｉｎとした。
１．１．４ 単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）遺伝子の増幅
ネストＰＣＲによってＶＨＨ遺伝子を以下のように増幅した。
Ｓｔｅｐｌ （表３）：
１．１．３ ＲＮＡ逆転写
ＲＮＡ逆転写系：
Ｓｔｅｐ １ （表１）：
【表1】
Ｓｔｅｐ ２ （表２）：
【表2】
１．１．４ 単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）遺伝子の増幅
ネストＰＣＲによってＶＨＨ遺伝子を以下のように増幅した。
Ｓｔｅｐｌ （表３）：
【0041】
【表3】
【0042】
ＰＣＲ産物をＤＮＡ精製キットで精製濃縮した後、アガロースゲル電気泳動を行い、得たアガロースゲル電気泳動図を図２に示し、ＤＮＡ産物ゲル回収キットを用いて７５０ ｂｐバンドを回収し、紫外分光光度計で定量した。
Ｓｔｅｐ ２ （表４）：
Ｓｔｅｐ ２ （表４）：
【表4】
【0043】
均一に混合した後、ＰＣＲ反応を行い、反応条件は、９８℃ １０ ｓ、５５℃ ３０ ｓ、７２℃ ３０ｓとし、合計２０サイクルとした。増幅プライマーの配列：Primer For-2: 5'- CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3' (SEQ ID NO:140) ; Primer Rev-2: 5'- GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG -3' (SEQ ID NO:141)。
【0044】
得たＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、アガロースゲル電気泳動図を図３に示し、ＤＮＡ産物ゲル回収キットを用いて回収し、紫外分光光度計で定量した。最終的には、濃度４００ｎｇ／μＬの約５００ ｂｐの目的遺伝子（ＶＨＨ）２００μＬを得た。
１．１．５ ライブラリの形質転換
１．１．５ ライブラリの形質転換
【0045】
得た目的遺伝子とベクターｐＨＥＮ１をＳｆｉＩとＮｏｔ１で二重酵素切断し、酵素切断産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図４に示し、酵素切断後の目的遺伝子とｐＨＥＮ１をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌エレクトロポレーションコンピテント細胞ＴＧ１に形質転換し、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質に対する単一ドメイン抗体遺伝子ライブラリを構築し、Ｊ２－Ｌｉｂと命名した。合計１５回形質転換し、混合後、６個のΦ１５０ ｍｍ培養皿（アンピシリンを含むＬＢ固体培地）に均一に塗布した。
【0046】
０．１μＬ、０．０１μＬ、０．００１μＬ及び０．０００１μＬをそれぞれ混合した形質転換液をΦ９０ｍｍ培養皿（アンピシリンを含むＬＢ固体培地）に均一に塗布し、ライブラリ容量の計算（コロニー数３０～３００のプレートを基準に計数）に用い、表５に示すように、算出したライブラリ容量は１．３９５×１０８ ｃｆｕである。
【表5】
【0047】
上記ライブラリ容量の計算用の培養皿から４８個のコロニーをランダムに選択し、コロニーＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、ライブラリの目的遺伝子挿入率を測定し、アガロースゲル電気泳動を図５に示し、ライブラリ挿入率は１００％、ライブラリの実際ライブラリ容量は１．３９５×１０８ ｃｆｕであることが示された。
コロニーＰＣＲ系（表６）：
コロニーＰＣＲ反応条件：９８℃ １０ ｓ、 ５０℃ ３０ ｓ、７２℃ １ｍｉｎ、合計３０サイクル。
１．１．６ ライブラリレスキュー
コロニーＰＣＲ系（表６）：
【表6】
１．１．６ ライブラリレスキュー
【0048】
上記Ｊ２－Ｌｉｂ遺伝子ライブラリからライブラリ容量に対して１０～１００倍の生細胞を取って接種して培養し、対数成長期まで培養した後、Ｍ１３Ｋ０７ファージを用いてレスキューを行い、レスキュー培養後、遠心分離によりファージを収集し、ＰＥＧ－ＮａＣｌを用いてファージを精製すると、ファージディスプレイライブラリを得て、Ｊ２－ＰＤＬと命名し、その力価は３．４×１０１３ ｃｆｕ／ｍＬである。後の特異的ファージの親和性スクリーニングにそのまま用いてもよい。
１．２ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体に対するスクリーニング
１．２ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体に対するスクリーニング
【0049】
Ｓｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質（Ｓｐｉｋｅタンパク質受容体結合領域タンパク質）を３μｇ／ウェルでプレートに被覆し、４℃で一晩放置し、１ｗｔ％脱脂粉乳を用いて室温で２ｈブロックし、ファージ（８×１０１１ｔｆｕ、１．１．６で構築されたファージディスプレイライブラリＪ２－ＰＤＬ由来）１００μｌを加え、室温で１ｈ作用させた。その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳに０．０５ｖｔ％トウェイン２０含有）で５回溶離し、結合していないファージを洗い落とし、トリエチルアミン（１００ｍＭ）を用いてＳｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質に特異的に結合したファージを解離し、対数成長期の大腸菌ＴＧ１に感染し、ファージを産生して精製し、次のスクリーニングに用いた。同じスクリーニングを３～４回繰り返した。これによって、陽性クローンが濃縮され、ファージディスプレイライブラリを用いた抗体ライブラリ中のＳｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質特異抗体を選別する目的が達成された。取得した陽性ファージについて配列決定を行い、抗体遺伝子配列を得た。
【0050】
得た抗体遺伝子配列をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４ベクターに構築し、ＨＥＫ－２９３細胞を用いて抗体を発現させ、ｐｒｏｔｅｉｎＡ媒体を用いて精製し、培地上清中の抗体を収集した。精製後の抗体をＳｐｉｋｅ－ＲＢＤを被覆したプレートとともにインキュベートし、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。Ｓｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質に特異的に結合し得る抗体を得た。
【0051】
配列照合ソフトウェアＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩによって、得た抗体配列を分析した。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列が全て同じクローンを同一抗体株、ＣＤＲ配列が異なるクローンを異なる抗体株とした。計２７個の異なる単一ドメイン抗体株が得られ、単一ドメイン抗体配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２～１０８、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～８１の２７群のＣＤＲ１－３配列を持ち、具体的には、表７に示される。
１．３ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体の評価及び同定
１．３．１ 単一ドメイン抗体の宿主菌としての大腸菌での発現、精製
【表7】
１．３．１ 単一ドメイン抗体の宿主菌としての大腸菌での発現、精製
【0052】
得たＣＤＲ１－３が異なる２７個の単一ドメイン抗体の遺伝子コード配列をそれぞれ発現ベクターＰＥＴ３２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、品番：６９０１６－３）に組み換え、配列決定により正しいものとして同定された組み換えプラスミドをそれぞれ発現型宿主菌ＢＬ１（ＤＥ３）（ＴＩＡＮＧＥＮ社、品番：ＣＢ１０５－０２）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩放置した。単一コロニーを選択して接種し、一晩培養し、翌日、一晩培養した菌種を移して増幅させ、３７℃で０Ｄ値が０．５～１となるまで振とう培養し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを加えて誘導し、２８℃で一晩振とう培養した。翌日、遠心分離して菌体を収集し、収集した菌体を破砕して抗体粗抽出液を得た。次に、２７株の単一ドメイン抗体タンパク質を精製し、その純度を９０％以上にした。
【0053】
１．３．２ 競合ＥＬＩＳＡによるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体のＳｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質と受容体ＡＣＥ２との結合への遮断効果の調査
【0054】
まず、ＨＥＫ２９３細胞（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｖ８６２２０）で発現させてＳｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質とＡＣＥ２タンパク質を得た。次に、Ｔｈｅｒｍｏ社製のＢｉｏｔｉｎｌｙｔｉｏｎキットを利用して、ビオチン化ＡＣＥ２タンパク質を得た。
【0055】
Ｓｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質０．５μｇ／ウェルを用いて４℃でプレートを被覆して一晩放置し、次に、ウェルごとに１．３．１で精製された単一ドメイン抗体１００ｎｇ及びビオチン化ＡＣＥ２タンパク質５μｇを加え、対照群を設置し、対照群１のウェルには単一ドメイン抗体を加えず、対照群２のウェルにはビオチン化ＡＣＥ２タンパク質を加えず、室温で２ｈ反応させた。その後、ＳＡ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ社より購入）を加え、室温で１時間反応後、発色液を加え、４５０ｎｍ波長で吸収値を読み取った。サンプルの０Ｄ値が対照の０Ｄ値よりも０．８小さい場合、単一ドメイン抗体には遮断効果がないとした。
その結果、表８に示すように、２７個の異なる単一ドメイン抗体株はＳｐｉｋｅタンパク質／ＡＣＥ２タンパク質の相互作用に対する遮断効果を示す。
その結果、表８に示すように、２７個の異なる単一ドメイン抗体株はＳｐｉｋｅタンパク質／ＡＣＥ２タンパク質の相互作用に対する遮断効果を示す。
【表8】
【0056】
バイオセキュリティレベルがＰ３の実験室にて、ウィルスを用いてＶＥＲＯ細胞モデルに感染し、精製した２７個の単一ドメイン抗体をそれぞれ培養系に加え、具体的には、ＶＥＲＯ細胞を１０４／ウェルで９６ウェルプレートに加え、２４時間後、ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、２７個の単一ドメイン抗体をそれぞれウィルスと混合して、９６ウェルプレートに加え、抗体初期濃度を１００μｇ／ｍＬとし、次に、それぞれ１０個の勾配で２倍希釈し、重複ウェルを５個設置し、３７℃で２時間インキュベートし、５日目にＶＥＲＯ細胞に病変が生じたか否かを検出した。単一ドメイン抗体処理後の細胞に病変が生じていない場合、単一ドメイン抗体はウィルスを中和し、ＶＥＲＯ細胞のウィルス感染を遮断する効果を有することが示唆された。
【0057】
検出の結果、上記２７個の単一ドメイン抗体で処理されたＶＥＲＯ細胞のいずれにおいても病変が生じておらず、一方、ウィルスだけを加え、単一ドメイン抗体を加えていなかったＶＥＲＯ細胞のほとんどは病変、死亡し、これは、得た２７個の単一ドメイン抗体は全てウィルスの細胞感染を遮断し、抗体を効果的に中和することを示した。
実施例２
１．１ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の製造
実施例２
１．１ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の製造
【0058】
タンパク質データライブラリＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ１）の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０９）を得た。逆転写ＰＣＲによって、ヒトＰＢＭＣ全ＲＮＡからヒトＩｇＧｌ－Ｆｃをコードする核酸フラグメント（核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３７）を得て、次に、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲによってＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸フラグメントを得て、ベクターｐＣＤＮＡ４ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｖ８６２２０）に組み換えた。
【0059】
構築したＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の核酸フラグメントを含有するＰＣＤＮＡ４プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして発現させた。具体的には、組み換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ （Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）溶液を加え、プラスミド／ＰＥＩ混合物をそれぞれＨＥＫ２９３細胞懸濁液に加え、３７℃、１０％のＣＯ２、１００ｒｐｍのシェーカーに入れて培養し、５０μｇ／Ｌ ＩＧＦ－１を添加した。４ｈ後、ＥＸ２９３培地、２ｍＭ グルタミン及び ５０μｇ／Ｌ ＩＧＦ－１を添加して、１２０ｒｐｍで振とう培養した。２４ｈ後、３．８ｍＭ ＶＰＡを加えた。５日間培養後、発現培養上清液を収集し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質を得た。
【0060】
得た２７個のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０～１３６に示される。
１．２ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の機能の同定
１．２ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の機能の同定
【0061】
ＳＰＲ法によりＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅ タンパク質への結合能を同定した。具体的には、得た２７個のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質のｓｐｉｋｅ－ＲＢＤへの結合動力学を、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）方法により、ＢＩＡｃｏｒｅＸ１００器具を用いて測定し、ｓｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質をＣＭ５バイオセンサチップに直接被覆して、約１０００応答ユニット（ＲＵ：ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）を得た。動力学的測定においては、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質をＨＢＳ－ＥＰ＋１×緩衝液（ＧＥ、ｃａｔ＃ＢＲ－１００６－６９）で３倍連続希釈し（１．６２ｎｍ～１０００ｎｍ）、２５℃で１２０ｓ注入し、解離時間を３０ｍｉｎとし、１０ｍＭグリシン－ＨＣ１（ｐＨ２．０）を加えて１２０ｓ再生した。１対１対応する簡単なＬａｎｇｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２）を用いて、融合タンパク質のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質への結合速度（ｋｏｎ）、解離速度（ｋｏｆｆ）及び平衡解離定数（ｋＤ）（比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎで計算）を算出した。計算結果を表９に示す。
【表9】
【0062】
表９から分かるように、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質への結合速度が速く、解離速度が遅く、平衡解離定数ＫＤが１．０５Ｅ－９未満であり、融合タンパク質はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質により迅速に結合し、解離し難いことを示し、また、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質は遮断型抗体として優れた遮断効果を有することを示した。
【0063】
１．３ 競合ＥＬＩＳＡ法によるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の、Ｓｐｉｋｅ タンパク質／ＡＣＥ２の相互作用への遮断能の同定
【0064】
ＨＥＫ２９３細胞で発現させてＡＣＥ２タンパク質を得た。Ｔｈｅｒｍｏ社製のＢｉｏｔｉｎｌｙｔｉｏｎキットを用いて、ビオチン化タンパク質ＡＣＥ２－Ｂｉｏｔｉｎを得た。
【0065】
Ｓｐｉｋｅ－ＲＢＤタンパク質０．５μｇ／ウェルを用いて４℃でプレートを被覆して一晩放置し、その後、ウェルごとに得た２７個のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質２００ｎｇとＡＣＥ２－Ｂｉｏｔｉｎ ５μｇを加え、対照群１には融合タンパク質を加えず、対照群２にはＡＣＥ２－Ｂｉｏｔｉｎを加えず、室温で２ｈ反応させた。洗浄後、ＳＡ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ社寄り購入）を加え、室温で１時間反応させ、洗浄後、発色液を加え、４５０ｎｍ波長で吸収値を読み取った。結果を表１０に示す。
【表10】
【0066】
その結果から明らかなように、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｓｐｉｋｅタンパク質とＡＣＥ２との相互作用を効果的に遮断できる。
１．４ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の、Ｓｐｉｋｅタンパク質に対する結合特異性の分析
１．４ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の、Ｓｐｉｋｅタンパク質に対する結合特異性の分析
【0067】
ヒトＨＥＫ２９３細胞を用いて、瞬時トランスフェクションにより、現在知られている７種類のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅタンパク質全長遺伝子を持つプラスミド（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｖ８６２２０）を得て、膜上でＳｐｉｋｅタンパク質を瞬時発現させた。該プラスミドによってＳｐｉｋｅタンパク質Ｃ末端にＥＧＦＰタンパク質を融合し、緑色蛍光強度によって膜上のＳｐｉｋｅタンパク質の発現レベルを調査できるようにした。構築した細胞を０．５％のＰＢＳ－ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁させ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅ タンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質を加え、また陰性対照を設置し、氷上で２０ｍｉｎインキュベートした。洗浄後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ二次抗体ａｎｔｉ－ｈＩｇ－ＰＥを加えて、氷上で２０ｍｉｎインキュベートした。洗浄後、細胞を０．５％ＰＢＳ－ＢＳＡＢｕｆｆｅｒ ５００μｌに再懸濁させ、フローサイトメータによって検出した。その結果、２７個のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質のみに特異的に結合し、他のコロナウイルスのＳｐｉｋｅタンパク質に結合しなかった。
１．５ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質によるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２細胞感染の遮断
１．５ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質によるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２細胞感染の遮断
【0068】
（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質１００μｇ／匹アカゲザル）を予め投与した健全なアカゲザル１５匹と、予め投与していなかった健全なアカゲザル１５匹を、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染アカゲザル２匹とともに、同じ環境にて１０日間飼育した。１０日間後に観察した結果、予め投与した健全なアカゲザル１５匹のいずれにおいても異常が見られず、ウィルス核酸検出の結果、全て陰性であり、一方、予め投与していなかった健全なアカゲザル１５匹のうち、１２匹は感染症状が見られ、ウィルス核酸検出の結果、全て陽性であった。
【0069】
上記試験の結果は、本願によるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体がコロナウイルス感染を効果的に遮断することができ、優れた予防作用を有することを示した。
【0070】
上記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウィルスに感染しており、症状が見られたアカゲザル１２匹のうち、６匹（治療群）は本願によるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質１００μｇ／匹アカゲザル）を投与して治療し、残りの６匹（対照群）は投与治療が行われなかった。治療後６日間内、毎日ウィルス量を１回検出した。検出したところ、治療群の６匹のアカゲザルでは、図６に示すように血液１ｍｌあたりコロナウイルスの平均量は対照群よりも有意に低下した。コロナウイルス量の検出は以下の通りである。投与治療を受けたアカゲザル（治療群）と投与治療を受けなかったアカゲザル（対照群）の血液をそれぞれ採取し、ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて取扱書に従って操作し、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のＲＮＡを抽出し、得たＲＮＡを溶離ｂｕｆｆｅｒ５０μＬに溶解してテンプレートとし、ＲＴ－ＰＣＲ増幅を行うことにより血液中のウィルスの核酸を抽出して検出した。ＲＴ－ＰＣＲ産物をテンプレートとして、プライマーＲＢＤ－ｑＦ１ （５'－ＣＡＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧ－３'，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２）とＲＢＤ－ｑＲｌ（５'－ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＧ－３'，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４３）を用いて、ウィルスのＳ領域の遺伝子を増幅した。ＨｉＳｃｒｉｐｔＲ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ ＳＹＢＲＲＧｒｅｅｎ Ｋｉｔ （Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ． ， Ｌｔｄ）キットを用いて、キットの取扱書に従って操作し、ＰＣＲ増幅条件として５０℃ ３ｍｉｎ、 ９５℃ １０ｓ、６０℃ ３０ｓ、４０サイクルとし、使用したＰＣＲ増幅装置はＡＢＩ定量ＰＣＲ装置である。
【0071】
上記生体内実験の結果、本願のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２を感染したアカゲザルの体内で、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２が細胞に感染して増幅することを抑制する有意な効果を示す。
１．６ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の安定性の検討
５００ｍＭ炭酸水素アンモニウムをアルカリ破壊試薬として、３７℃で４８ｈ処理した。１％過酸化水素を酸化剤として、室温で１０ｈ処理した。
１．６ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の安定性の検討
５００ｍＭ炭酸水素アンモニウムをアルカリ破壊試薬として、３７℃で４８ｈ処理した。１％過酸化水素を酸化剤として、室温で１０ｈ処理した。
【0072】
競合ＥＬＩＳＡ法によって、処理前後の上記２７個のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質の生物学的活性の変化を検出した。４８ｈアルカリ処理後の競合ＥＬＩＳＡによる活性は、アルカリ処理０時間に対して平均に１０７％であり、酸化１０ｈ後の競合ＥＬＩＳＡによる活性は、０ｈ酸化に対して平均に１１１％である。
本願による２７個のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質は高い安定定性を有することが示された。
本願による２７個のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－Ｓｐｉｋｅタンパク質の単一ドメイン抗体－Ｆｃ融合タンパク質は高い安定定性を有することが示された。
【0073】
以上は本願の好適な実施例に過ぎず、本願を制限するものではなく、本願の主旨及び原則を逸脱することなく行われる全ての修正、等同置換や改良などは全て本願の特許範囲に含まれるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-12-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合し、少なくとも１つの免疫グロブリンの単一可変ドメインを含み、前記免疫グロブリンの単一可変ドメイン中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が以下の組み合わせから選ばれるいずれか１群であることを特徴とするＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子：１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３に示される ＣＤＲ３；
２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるＣＤＲ３；
３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＣＤＲ３；
４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＣＤＲ３；
５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示される ＣＤＲ３；
６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示される ＣＤＲ３；
７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示される ＣＤＲ３；
８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示される ＣＤＲ３；
９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示される ＣＤＲ３；
１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示される ＣＤＲ３；
１１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示される ＣＤＲ３；
１２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６に示される ＣＤＲ３；
１３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９に示される ＣＤＲ３；
１４）ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２に示される ＣＤＲ３；
１５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５に示される ＣＤＲ３；
１６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８に示される ＣＤＲ３；
１７）ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１に示される ＣＤＲ３；
１８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４に示される ＣＤＲ３；
１９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７に示される ＣＤＲ３；
２０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０に示される ＣＤＲ３；
２１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３に示される ＣＤＲ３；
２２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６に示される ＣＤＲ３；
２３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６９に示される ＣＤＲ３；
２４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７２に示される ＣＤＲ３；
２５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７５に示される ＣＤＲ３；
２６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７８に示される ＣＤＲ３；
２７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０に示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８１に示される ＣＤＲ３。
【請求項2】
前記免疫グロブリンの単一可変ドメインは単一ドメイン抗体であることを特徴とする請求項１に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項3】
前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２～９１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９３～１０８のいずれかの配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項4】
前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２－１０８のいずれかの配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項5】
前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８２－１０８のいずれかの配列と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項6】
前記単一ドメイン抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２～１０８のいずれかのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項7】
免疫グロブリンＦｃ領域をさらに含むことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項8】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒト免疫グロブリンＦｃ領域であることを特徴とする請求項７に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項9】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ１のＦｃ領域であることを特徴とする請求項８に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項10】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０９であることを特徴とする請求項９に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項11】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１０～１１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１～１３６のうちの少なくとも１種のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。
【請求項12】
以下の特徴のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする請求項１～６、８～１１のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。ａ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合するＫＤ値が１×１０－８Ｍ未満であること
ｂ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２とヒト細胞受容体ＡＣＥ２との結合を遮断すること
ｃ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の伝染及び増幅を抑制すること
【請求項13】
以下の特徴のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする請求項７に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子。ａ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に結合するＫＤ値が１×１０－８Ｍ未満であること
ｂ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質とヒト細胞受容体ＡＣＥ２との結合を遮断すること
ｃ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の伝染及び増幅を抑制すること
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子をコードする核酸分子。
【請求項15】
請求項１４に記載の核酸分子及びその発現調節エレメントを含む発現ベクター。
【請求項16】
請求項１４に記載の核酸分子を含み、この核酸分子を発現させる宿主細胞。
【請求項17】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子の取得方法であって、前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子の発現を可能にする条件で請求項１６に記載の宿主細胞を培養するステップａと、
ステップａの培養物から前記宿主細胞で発現させたＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を収集するステップｂと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項18】
治療的部分にコンジュゲートする請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を含むことを特徴とする免疫コンジュゲート。
【請求項19】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子及び／又は請求項１８に記載の免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項20】
新型コロナウイルス肺炎を治療又は予防する医薬品の製造における請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項21】
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２を検出するキットであって、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子を含むことを特徴とするキット。
【請求項22】
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子とＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質とが複合体を形成し得る条件下で、検出サンプルと対照サンプルとを請求項１～１３のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質結合分子に接触させ、複合体の形成を検出し、前記検出サンプルと対照サンプルとの複合体の形成の違いによってサンプル中のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の存在を判断することを特徴とする請求項２１に記載のキットの使用方法。
【国際調査報告】