特表 2023-527935 ＩＦＮコンピテント細胞においてＲＮＡｉ又はＩ型ＩＦＮを誘導する組成物及び方法並びにそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-30

(54)【発明の名称】ＩＦＮコンピテント細胞においてＲＮＡｉ又はＩ型ＩＦＮを誘導する組成物及び方法並びにそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20230623BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230623BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230623BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230623BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230623BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230623BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20230623BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230623BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230623BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230623BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230623BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230623BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20230623BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20230623BHJP

   C12N 15/44 20060101ALN20230623BHJP

   C12N 15/50 20060101ALN20230623BHJP

   C12N 15/47 20060101ALN20230623BHJP

   C12N 15/46 20060101ALN20230623BHJP

   C12N 15/40 20060101ALN20230623BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/867 Z

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C07K16/00

C07K19/00

C12N5/071

C12N5/10

A61K31/7105

A61K35/12

A61K35/76

A61K39/395 D

A61K48/00

A61K9/127

A61K9/14

A61P35/00

A61P35/02

A61P31/00

A61K9/08

A61K9/12

A61K9/06

A61K9/10

A61K9/107

C12N15/44

C12N15/50

C12N15/47

C12N15/46

C12N15/40

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023515225

(86)(22)【出願日】2021-05-25

(85)【翻訳文提出日】2023-01-19

(86)【国際出願番号】 CA2021050703

(87)【国際公開番号】W WO2021237344

(87)【国際公開日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】63/029,632

(32)【優先日】2020-05-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522457014

【氏名又は名称】ウィルフリッド ローリエ ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】デウィット－オア，ステファニー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA06

4C076AA09

4C076AA11

4C076AA17

4C076AA19

4C076AA22

4C076AA24

4C076AA30

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB15

4C076BB21

4C076BB24

4C076BB25

4C076CC27

4C076CC31

4C076FF01

4C076FF11

4C076FF68

4C084AA13

4C084MA13

4C084MA17

4C084MA22

4C084MA23

4C084MA24

4C084MA28

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZB32

4C085AA13

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG03

4C085GG06

4C085GG08

4C085GG10

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA17

4C086MA22

4C086MA23

4C086MA24

4C086MA28

4C086MA43

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA58

4C086MA59

4C086MA60

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZB32

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087CA20

4C087MA13

4C087MA17

4C087MA22

4C087MA23

4C087MA24

4C087MA28

4C087MA43

4C087MA52

4C087MA55

4C087MA58

4C087MA59

4C087MA60

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZB32

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA01

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

ガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）複合体であって、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々が、少なくとも３００塩基対（ｂｐ）の長さを有し、ガイド鎖は、標的遺伝子転写物の標的核酸配列に相補的なセグメントを含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）複合体が、提供される。脊椎動物細胞又は対象における標的遺伝子転写物をサイレンシングする方法、対象における病原体感染症を治療する方法、及び脊椎動物細胞若しくは対象における病原体の複製又は病原体感染の感染性をそれぞれ低下させる方法であって、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物を対象又は細胞に投与することを含む、方法も提供される。
【選択図】図２Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）複合体であって、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々が少なくとも３００塩基対（ｂｐ）の長さを有し、前記ガイド鎖が標的遺伝子転写物の標的核酸配列に相補的なセグメントを含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）複合体。

【請求項2】

前記ガイド鎖が、３００ｂｐ～１０００ｂｐ、例えば約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ又は約９００ｂｐ、又は３００～９００ｂｐ、３００～８００ｂｐ、４００～９００ｂｐ、４００～８００ｂｐ又は４００～７００ｂｐの長さを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項3】

前記標的核酸配列に相補的なセグメントが、２０ｂｐ～９００ｂｐ、例えば約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７５ｂｐ、約８０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約４００ｂｐ又は約５００ｂｐ、又は２０～８００ｂｐ、４０～７００ｂｐ、６０～６００ｂｐ、８０～５００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～５００ｂｐ又は３００～５００ｂｐの長さを有する、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項4】

前記標的核酸配列に相補的なセグメントが、前記ガイド鎖の３'末端の近位又は３'末端にある、請求項１～３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項5】

前記標的核酸配列に相補的なセグメントが、前記ガイド鎖の５'末端の近位又は５'末端にある、請求項１～３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項6】

前記ガイド鎖が、同じ標的遺伝子転写物の異なる標的核酸配列に各々相補的な１以上のさらに異なるセグメントを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項7】

前記ガイド鎖が、異なる標的遺伝子転写物の異なる標的核酸配列に各々相補的な１以上のさらなるセグメントを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項8】

第１のセグメントが、前記ガイド鎖の３'末端の近位又は３'末端にありかつ第２のセグメントが、前記ガイド鎖の５'末端の近位又は５'末端にある、請求項６又は７に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項9】

前記ガイド鎖が、前記標的核酸配列に非天然の１以上のミスマッチ配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項10】

前記ガイド鎖が、オーバーハングを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項11】

前記パッセンジャー鎖が、オーバーハングを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項12】

前記オーバーハングが、前記標的核酸配列又は標的遺伝子転写物に対し相補的である又はそれに対応する、請求項１０又は１１に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項13】

前記ｄｓＲＮＡ複合体が、１以上の化学的に修飾された塩基を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項14】

前記化学修飾が、２'Ｏメチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’Ｏ－ＭＯＥ）、２'フルオロ（２'Ｆ）及びロック核酸モノマー（ＬＮＡＭ）から選択される、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項15】

前記ＲＮＡ複合体が、非修飾ＲＮＡを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項16】

前記ガイド鎖及び／又は前記パッセンジャー鎖が、５'－三リン酸末端を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項17】

前記ガイド鎖及び／又は前記パッセンジャー鎖が、５'－二リン酸末端を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項18】

前記ガイド鎖及び／又は前記パッセンジャー鎖が、５'－一リン酸末端を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項19】

前記ｄｓＲＮＡ複合体が、複製遺伝子、任意選択でウイルス複製遺伝子を含まない、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項20】

前記標的遺伝子転写物が、ウイルス遺伝子転写物などの病原体遺伝子転写物に対応する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項21】

前記ウイルス遺伝子転写物が、任意選択でスパイク（Ｓ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質転写物をコードする、構造ウイルス遺伝子転写物である、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項22】

前記ウイルス遺伝子転写物が、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、ロタウイルス又はラブドウイルス遺伝子転写物である、請求項２０又は２１に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項23】

前記コロナウイルス遺伝子転写物が、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳｒ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１遺伝子転写物などの、ヒトコロナウイルス遺伝子転写物である、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項24】

前記標的遺伝子転写物が、疾患遺伝子転写物、任意選択で癌遺伝子転写物である、請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項25】

前記疾患が、癌又は形質細胞増殖性障害などのリンパ増殖性障害である、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項26】

前記標的核酸配列を含む脊椎動物細胞又は対象における標的遺伝子転写物をサイレンシングすることにおける使用のための、及び／又はそれぞれ、脊椎動物細胞又は対象における病原体の複製又は病原体感染の感染性を低下させることにおける使用のための、請求項１～２５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項27】

前記標的核酸配列を含む第１の脊椎動物細胞型において標的遺伝子転写物をサイレンシングすることおよび第２の脊椎動物細胞型においてＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を誘導することにより混合細胞集団を標的化することにおける使用のための、請求項１～２５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体であって、任意選択で前記細胞集団が、脊椎動物対象中にある、ｄｓＲＮＡ複合体。

【請求項28】

請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体を形成できる１以上の転写物（複数可）をコードする発現カセットを含むベクター。

【請求項29】

前記発現カセットが、前記ガイド鎖及び前記パッセンジャー鎖を生成するための、ポリメラーゼプロモーター、任意選択でＴ７ポリメラーゼプロモーターを含む、請求項２８に記載のベクター。

【請求項30】

前記ベクターが、プラスミド、ウイルスコンストラクト又はウイルスである、請求項２８又は２９に記載のベクター。

【請求項31】

前記ウイルスが、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスである、請求項３０に記載のベクター。

【請求項32】

請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体、抗体、任意選択で一本鎖抗体又は結合断片などの、１以上のポリペプチド、又は標識を含むコンジュゲート。

【請求項33】

医薬的に許容される担体を任意選択でさらに含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体、請求項２８～３１のいずれか一項に記載のベクター又は請求項３２に記載のコンジュゲートを含む組成物。

【請求項34】

前記組成物が、細胞培養培地、任意選択で無血清細胞培養培地をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

前記組成物が、任意選択でリポソーム、ナノ粒子又はナノソームから選択される、脂質輸送粒子をさらに含む、請求項３３又は３４に記載の組成物。

【請求項36】

前記組成物が、送達機構、任意選択で輸送粒子を欠く、請求項３３又は３４に記載の組成物。

【請求項37】

ｄｓＲＮＡ複合体の濃度が、選択されたＩＦＮ誘導閾値を下回る投与量内にある、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

脊椎動物細胞又は対象における標的遺伝子転写物をサイレンシングする方法であって、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体の量、請求項２８～３１のいずれか一項に記載のベクター、請求項３２に記載のコンジュゲート又は請求項３３～３８のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞又は対象に投与することを含む、方法。

【請求項39】

投与されるｄｓＲＮＡ、ベクター、コンジュゲート又は組成物の量が、所定のＩＦＮ誘導閾値を下回る、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記所定のＩＦＮ誘導閾値が、細胞の比較集団を使用して決定され、前記細胞の比較集団が、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物とインキュベートされかつ所定のＩＦＮ誘導閾値が、それらから決定される、請求項３８又は３９に記載の方法。

【請求項41】

前記細胞が、癌細胞などの、疾患細胞である、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

それぞれ、前記脊椎動物細胞又は対象において病原体の複製又は病原体感染の感染性を低下させるための、又はそれを必要とする対象における病原体感染症を治療するための請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法であって、前記標的核酸配列が、ウイルス遺伝子転写物配列などの、病原体遺伝子転写物配列に対応する、方法。

【請求項43】

前記投与が、前記病原体への曝露前である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記投与が、前記病原体への曝露中である、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

前記対象が、前記病原体感染症の治療を必要としている、請求項４２に記載の方法。

【請求項46】

前記病原体感染症が、感染の部位を有しかつ前記量が、前記感染の部位に投与される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記感染の部位に投与される量が、ＩＦＮ誘導閾値を上回る、請求項４５又は４６に記載の方法。

【請求項48】

前記量が、全身的に投与されかつ前記量が、ＩＦＮ誘導閾値を下回る、請求項４６又は４７に記載の方法。

【請求項49】

前記ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物が、経鼻で、局所で、経口で、眼で、経腸で、経膣で、浸すことにより（ｂｙ ｂａｔｈ）、皮下で、静脈内で、腹腔内で、胸腔内で、筋肉内で投与される、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物が、経鼻投与されかつエアロゾルの形態である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物が、局所投与されかつクリーム、ゲル、軟膏、ペースト、コロイド又は懸濁液の形態である、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

前記細胞又は対象が、ＩＦＮコンピテントである、請求項３８～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記細胞又は対象が、それぞれ、魚の細胞又は魚などの水生脊椎動物細胞又は対象である、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記魚が、真骨魚である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記細胞又は対象が、地上脊椎動物細胞又は鳥などの対象である、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記細胞又は対象が、哺乳動物の細胞又は対象である、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記哺乳動物の細胞又は対象が、ヒト、牛、豚、馬若しくは羊の細胞又は対象である、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記細胞が、癌細胞である又は前記対象が、癌を有する、請求項３８～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記細胞が、免疫特権部位由来である、請求項３８～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

脊椎動物細胞又は対象における標的遺伝子転写物をサイレンシングする、脊椎動物細胞又は対象における病原体の複製又はウイルス感染などの病原体感染の感染性を低下さるための、それを必要とする対象における病原体感染を治療するための及び／又は薬剤の調製のための請求項１～３７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０２０年５月２５日出願の米国仮特許出願第６３／０２９，６３２号の優先権に基づいて、米国特許法第１１９条の利益を請求する特許協力条約出願である。

【0002】

配列表の組み込み
２０２１年５月２５日に作成し、ＥＦＳ－ＷＥＢを介して提出した配列表「Ｐ５８５４４ＰＣ００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」（８，３９９バイト）のコンピュータ読み取り可能な形態は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、リボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）を使用して標的遺伝子又は複数の標的遺伝子の発現を減少させるための組成物及び方法に関する。本開示はまた特に、細胞又は宿主におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を回避又は誘導するように調節され得る組成物及び方法に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
長い二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ（４０ｂｐ又はそれより大きい）は、健常細胞には見出されず、ほとんど全てのウイルスによりそれらの複製サイクル中に作製されることがある（Ｊａｃｏｂｓ－１９９６）。これらの長いｄｓＲＮＡ複合体は、細胞の表面（クラスＡスカベンジャー受容体）、エンドソーム（Ｔｏｌｌ様受容体３）及び細胞質（ＲＩＧ－Ｉ様受容体及び細胞質ＤＮＡセンサー）上のパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって感知される（ＤｅＷｉｔｔｅ－Ｏｒｒ－２０１０ｂ）。いったん活性化されると、ＰＲＲは、アダプタータンパク質を動員し、それは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の増加された発現をもたらすシグナル伝達カスケードを活性化する。これらのＩＦＮは、それらの同族受容体及び下流シグナル伝達カスケードを介して自己分泌及びパラ分泌様式で作用して、ＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現を誘導する（ＤｅＷｉｔｔｅ－Ｏｒｒ－２０１０ｂ）。ＩＳＧは、感染細胞及び隣接する非感染細胞に蓄積して、細胞がウイルス感染に対して抵抗性である「抗ウイルス状態」を確立する。ＩＦＮ経路は、Ｉ型ＩＦＮを生成する能力を有する、脊椎動物に存在する。

【0005】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）はまず、抗ウイルス自然免疫応答として無脊椎動物及び植物において特徴付けられた。それは、ウイルス誘導遺伝子サイレンシングによりウイルスＲＮＡを分解するための天然抗ウイルス防御機構である（Ａｂｅｄｉｎｉら、２０１８）。複数の研究は、合成二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導し、遺伝子サイレンシングをもたらすことを示した（Ｆｉｒｅら、１９９８）。植物及び無脊椎動物において、長いｄｓＲＮＡ（＞４０ｂｐ）は、
ＲＮＡｉ経路を介して特異的遺伝子発現をシャットダウンする（Ｂｕｃｈｏｎ－２００５）。ＩＩＩ型リボヌクレアーゼのダイサーは、長いｄｓＲＮＡ複合体を結合し、それを小さなｄｓＲＮＡ複合体（低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ）へと切断し、それらはＲＩＳＣに積み込まれ、結合する、およびまた立体干渉により又はｍＲＮＡ分解によりその翻訳を阻害する相補的ｍＲＮＡ配列を見出すために使用される（Ｍｅｉｓｔｅｒ－２００４）。植物及び無脊椎動物は、ＩＦＮ生成を有しない。

【0006】

ＩＦＮは、転写と翻訳の両方のグローバルシャットダウンを誘導し、それは、ＲＮＡｉの配列特異的効果をマスク又は阻害する（Ｍａｉｌｌａｒｄ－２０１６）。長いｄｓＲＮＡ（少なくとも３０ｂｐ）はＩＦＮ欠損である哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを誘発できることが示されている（Ｍａｉｌｌａｒｄ－２０１６）。

【0007】

ｄｓＲＮＡの長さはＩＦＮ生成に影響を及ぼし、より長い分子はより強いＩＦＮ応答を誘導する（ＤｅＷｉｔｔｅ－Ｏｒｒら、２０１０）。

【0008】

米国特許公開第２０１３０３３０８２４号は、細菌を使用して哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのために長いｄｓＲＮＡを使用する方法であって、長いｄｓＲＮＡで細菌を形質転換すること、長いｄｓＲＮＡをより小さいＲＮＡ二本鎖の混合物にプロセスさせ標的細胞の細胞質内に放出させることを含む、方法を開示する。

【0009】

ＷＯ２０１７１３６８９５は、ＩＦＮ応答を有しない、植物においてウイルスを標的とする４００塩基対超の長さのｄｓＲＮＡを生成するコンストラクトを開示する。

【0010】

米国特許公開第２０１７０２５３８８１号は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーターから長い二本鎖ＲＮＡを発現するために、ｐＤＥＣＡＰと命名されたベクターを使用する、細胞における遺伝子サイレンシングのための長いｄｓＲＮＡ（３０塩基対超）の導入を開示する。

【0011】

ＷＯ２０１８１４６５５７は、２つの異なる標的ｍＲＮＡ配列の発現を阻害できる、細胞中にトランスフェクトされる長いｄｓＲＮＡ二本鎖を開示する。

【0012】

米国特許第８２９９０４２号は、標的核酸と実質的な配列同一性を有する第１のｄｓＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡ媒介毒性を阻害する短い第２のｄｓＲＮＡの使用を伴う転写後遺伝子サイレンシングの方法を開示する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

様々な態様で本明細書において提供されるのは、３００塩基対超のｄｓＲＮＡ複合体を含む組成物、及び標的遺伝子転写物をサイレンシングするためのそれらの使用方法である。いくつかの実施形態では、組成物及び方法は、標的細胞におけるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を回避又は誘導するために使用できる。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本明細書で実証されるように、本発明者らは、例えば、ＲＮＡ干渉を除去するＩ型ＩＦＮを誘導することなく、標的遺伝子発現を減少させるための長いｄｓＲＮＡを含む方法及び組成物を決定した。本明細書に記載されるように、ＩＦＮコンピテントである脊椎動物細胞においてＲＮＡｉを介して標的遺伝子転写物をサイレンシングできる長いｄｓＲＮＡ複合体及び方法が開発されてきた。例えば、長いｄｓＲＮＡ複合体の投与量及び／又は長さを調節することによって、Ｉ型ＩＦＮの誘導を回避又は誘導できることを発明者らは見出した。

【発明の効果】

【0015】

第１の態様は、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）複合体を含み、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々が少なくとも３００塩基対（ｂｐ）の長さを有し、ガイド鎖が標的遺伝子転写物の標的核酸配列に相補的なセグメントを含む。

【0016】

別の態様は、標的核酸配列を含む脊椎動物細胞又は対象における標的遺伝子転写物をサイレンシングすることにおける使用のための、かつ／又はそれぞれ、脊椎動物細胞若しくは対象における病原体の複製又は病原体感染の感染性を低下させることにおける使用のための本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体に関する。

【0017】

別の態様は、標的核酸配列を含む第１の脊椎動物細胞型における標的遺伝子転写物をサイレンシングすること、および第２の脊椎動物細胞型においてＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を誘導することにより混合された細胞集団を標的化することにおける使用のための本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体の使用に関し、任意選択で細胞集団は、脊椎動物細胞中にある。

【0018】

別の態様は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、抗体、任意選択で一本鎖抗体若しくは結合断片などの、1以上のポリペプチド、又は標識を含むコンジュゲートである。

【0019】

別の態様は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体を形成できる１以上の転写物（複数可）をコードする発現カセットを含むベクターを含む。

【0020】

別の態様は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、コンジュゲート、又はベクターを含む組成物を含む。

【0021】

別の態様は、脊椎動物細胞又は対象における標的遺伝子転写物をサイレンシングする方法であって、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート、又は組成物のある量を細胞又は対象に投与することを含む、方法を含む。標的遺伝子転写物は例えば、癌を促進する遺伝子転写物であり得る。また提供されるのは、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物のある量を、それを必要とする対象に投与することを含む癌を治療する方法であって、標的遺伝子転写物が、癌に関与する遺伝子の産物（例えば、遺伝子転写物）である、方法である。

【0022】

別の態様は、それぞれ、脊椎動物細胞又は対象における病原体の複製又は病原体感染の感染性を低下させるための方法を含み、標的核酸配列は、ウイルス遺伝子転写物配列などの、病原体遺伝子転写物配列に対応する。

【0023】

別の態様は、病原体感染症を治療する方法であって、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物のある量をそれを必要とする対象に投与することを含み、標的遺伝子転写物が、ウイルス遺伝子転写物などの病原体遺伝子転写物である、方法を含む。

【0024】

別の態様は、脊椎動物細胞又は対象において標的遺伝子転写物をサイレンシングするための、細胞又は対象におけるウイルス感染などの病原体の複製又は病原体感染の感染性を低下させる、それを必要とする対象において病原体感染症を治療するための、かつ／又は薬剤の調製のための、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の使用である。

【0025】

本開示の実施形態を、以下の図面に関連してこれから説明する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１Ａ～Ｆは、長いｄｓＲＮＡ（７００ｂｐ）で処理したときの細胞株の生存率を評価する一連のグラフである。ｄｓＲＮＡへの曝露が減少された細胞の生存をもたらさないことを確実にするために、５つの細胞株を、複数の濃度（３．１３～８００ｎｇ／ｍＬの範囲）のｄｓＲＮＡで処理し、生存率を、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）／ＣＦＤＡ－ＡＭアッセイを使用して３０時間後に評価した。生存は処理により負の影響を受けなかったが、より高い濃度のｄｓＲＮＡは、代謝活性を増強した（アラマーブルーにより示されるように）。評価された細胞株は、ＴＨＦ細胞（図１Ａ、ｎ＝３）、Ｍ１４メラノーマ細胞株（図１Ｂ、ｎ＝３）、ＭＲＣ５肺線維芽細胞株（図１Ｃ、ｎ＝３）、ＳＮＢ７５膠芽腫細胞株（図１Ｄ、ｎ＝３）、ＢＴ５４９乳癌細胞株（図１Ｅ、ｎ＝３）、及びＨｅｐＧ２肝芽腫細胞株（図１Ｆ、ｎ＝３）を含んだ。

【図2】異なる長さのｄｓＲＮＡの効果を示す、図２Ａは画像であり、図２Ｂ及び２Ｃはグラフである。（図２Ａ）ｄｓＲＮＡは、異なる長さを有して生成でき、ここでは７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ及び１００ｂｐの長さが示される。（図２Ｂ）テロメラーゼ不死化ヒト線維芽細胞（ＴＨＦ）細胞（５０，０００細胞／ウェル）と（図２Ｃ）ＳＮＢ７５細胞（５０，０００細胞／ウェル）の両方を、５００ｎｇ／ｍＬの７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ又は２００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡに２時間曝露し、次いで、ＶＳＶ－ＧＦＰ（感染多重度（ＭＯＩ）＝０．１）に感染させた。感染の２４時間後に、上清を、収集し、ＴＣＩＤ_５０を、ＨＥＬ－２９９細胞を使用して計算した（両細胞型についてｎ＝６）。４００ｂｐ、５００ｂｐ及び６００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡは、ＴＨＦ細胞中で一致配列（ＧＦＰ）を使用した場合、ＶＳＶ－ＧＦＰを制限するための７００ｂｐの長さとちょうど同じ程度に有効であった。ＳＮＢ７５細胞では、５００ｂｐ及び６００ｂｐの長さは、７００ｂｐの長さと同等であり、４００及び３００ｂｐは、対照と統計的有意差はなかった。ｍＣｈｅｒｒｙとベータ－ｌａｃの両方は、ミスマッチの対照配列である。

【図3-1】図３Ａ～３Ｃは、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）を誘導しない用量でのＨＥＬ ２９９細胞におけるｄｓＲＮＡｉを示す一連のグラフである。（図３Ａ～３Ｂ）ヒト胚性肺細胞（ＨＥＬ－２９９；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１３７）を、無血清培地中で５００、１０００、又は１５００ｎｇ／ｍｌのｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）、又はｅＧＦＰ（一致）配列特異的二本鎖ＲＮＡ（長さ７００ｂｐ）、又はポリＩ：Ｃ（５００ｎｇ／ｍＬ）のいずれかで２時間前処理した。総ＲＮＡを、処理後２４時間の時点でＴＲＩｚｏｌ（商標）により抽出し、逆転写に供した。インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）ベータアクチン、ＣＸＣＬ１０（図３Ｂ）、及びＩＳＧ１５（図３Ａ）の発現を、ｑＰＣＲにより測定した。ＩＳＧ１５及びＣＸＣＬ１０の発現を、アクチンに正規化した。ポリＩ：Ｃ（５００ｎｇ／ｍｌ）での処理はＩＳＧの顕著な発現をもたらしたが、最大で１５００ｎｇ／ｍｌの、一致した又はミスマッチのｄｓＲＮＡによる処理は、ベースラインを超えるＩＳＧの誘導をもたらさなかった。（図３Ｃ）ヒト胚性肺細胞（ＨＥＬ－２９９；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１３７）を、無血清培地中で１０００ｎｇ／ｍｌのベータ－ラクタマーゼ（ミスマッチ）、又はｅＧＦＰ（一致）配列特異的二本鎖ＲＮＡのいずれかで２時間前処理した。単層をその後、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰ（Ｉｎｄｉａｎａ）に感染させた。ＧＦＰ蛍光を、モック処理細胞の感染が８０％に達したとき（通常、感染後１６～２４時間）、プレートリーダーにより測定した。全ての処理した試料を、モック処理した細胞に対する倍数変化として計算した。提示される結果は、実験ごとに少なくとも４回技術的に反復した４つの生物学的複製物からプールしたデータである。保護が、ウイルスによりコードされる配列に一致するｄｓＲＮＡで見られた。

【図3-2】図３Ｄ～３Ｇは、長い７００ｂｐのｄｓＲＮＡで処理したＴＨＦ及びＳＮＢ７５細胞がＩ型インターフェロン又はインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）を誘導しないことを示す一連のグラフである。細胞を、ｄｓＲＮＡ（０．５、１０μｇ／ｍＬ）又はポリＩＣ（１０μｇ／ｍＬ）で２６時間処理し、その後ＲＮＡを、製造業者の指示に従いＴＲＩｚｏｌ（商標）により抽出した。混入したゲノムＤＮＡを除去するために、ＲＮＡ試料を、製造業者により概説されるように、ターボＤＮａｓｅ（商標）キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＤＮａｓｅ処理した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、製造業者の指示に従いｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成ミックス（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して５００ｎｇの全ＲＮＡから合成した。β－アクチン、ＩＦＮ－β及びＣＸＣＬ１０の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。ＩＦＮβ及びＣＸＣＬ１０発現を、β－アクチンに正規化した。

【図4】図４Ａ～４Ｃは、ｄｓＲＮＡｉがウイルス遺伝子のｄｓＲＮＡを使用してウイルス増殖を抑制できることを示す一連のグラフである。テロメラーゼ不死化ヒト線維芽細胞（ＴＨＦ）（図４Ａ）とＳＮＢ７５（図４Ｂ）細胞の両方を、５００ｎｇ／ｍＬのＧＦＰ（陽性対照）、ＶＳＶ Ｎタンパク質、ＶＳＶ Ｍタンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ及びベータ－ｌａｃの７００ｂｐ ｄｓＲＮＡに２時間曝露し、その後、ＶＳＶ－ＧＦＰ（ＭＯＩ＝０．１）に２４時間感染させた。細胞をまた、２５０ｎｇ／ｍＬのＶＳＶ Ｎタンパク質と２５０ｎｇ／ｍＬのＶＳＶ Ｍタンパク質を含有する混合物にも曝露し、５００ｎｇ／ｍＬの総濃度をもたらした。ｍＣｈｅｒｒｙとベータ－ｌａｃの両方は、ミスマッチ配列陰性対照として機能した。ウイルス遺伝子（Ｎ及びＭタンパク質）のｄｓＲＮＡ複合体は、ＶＳＶ－ＧＦＰの有意な阻害を誘導できたが、２つのｄｓＲＮＡ配列の５００ｎｇ／ｍＬの混合物は、相加効果を有するようには見えなかった。（図４Ｃ）ＭＲＣ５細胞を、７００ｂｐのＨＣｏＶ－２２９Ｅ遺伝子のＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）、Ｍタンパク質、Ｎタンパク質、スパイクタンパク質、及びミスマッチ陰性対照ｍＣｈｅｒｒｙのｄｓＲＮＡで２時間処理した。細胞を次いで、ＨＣｏＶ－２２９Ｅに２４時間感染させ、上清を、回収してＴＣＩＤ_５０を決定した。ＨＣｏＣ－２２９ＥのＭタンパク質、Ｎタンパク質及びスパイクタンパク質のｄｓＲＮＡでの処理は、ウイルス数を顕著に減少できたが、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＲｄＲｐは、保護効果を有しなかった。

【図5】図５Ａ～５Ｃは、ｄｓＲＮＡｉによる初代気管支上皮細胞（ｐＢＥＣ）のウイルス増殖阻害を示す一連のグラフである。７００ｂｐの配列特異的ｄｓＲＮＡ（Ｎタンパク質）又は７００ｂｐのミスマッチ配列（ｍＣｈｅｒｒｙ）に２時間曝露した後、ｐＢＥＣ（健常ドナーから得られた）を、ＶＳＶ－ＧＦＰ（ＭＯＩ＝０．１）に２４時間感染させ、上清を、回収して、ＴＣＩＤ_５０の定量を完了した（ｎ＝２）。ＶＳＶ Ｎタンパク質の一致したｄｓＲＮＡ配列は、ＶＳＶ－ＧＦＰ力価の大きな低下を刺激した（図５Ａ）。ｐＢＥＣ細胞を、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ Ｍタンパク質（０．５μｇ／ｍＬ）、ミスマッチｍＣｈｅｒｒｙ配列（０．５μｇ／ｍＬ）の７００ｂｐのｄｓＲＮＡ又はポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ、５０μｇ／ｍＬ）で２時間前処理した。ポリＩ：Ｃは、強力なインターフェロン誘導剤であり、ウイルス感染からの保護を提供すると予想される（陽性対照）。前処理後に、ｐＢＥＣを、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ（ＭＯＩ＝０．１）に２４時間感染させ、上清を、収集し、ＴＣＩＤ_５０の定量に使用した。Ｍタンパク質ｄｓＲＮＡ（０．５μｇ／ｍＬ）とポリＩ：Ｃ（５０μｇ／ｍＬ）の両方は、ウイルス数の減少を刺激した（ｎ＝６）（図５Ｂ）。ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬を使用して、ｄｓＲＮＡを、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ Ｍタンパク質配列（０．５μｇ／ｍＬ）又はミスマッチｍＣｈｅｒｒｙ配列（０．５μｇ／ｍＬ）の７００ｂｐのｄｓＲＮＡでｐＢＥＣ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を次いで、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ（ＭＯＩ＝０．１）に２４時間感染させ、上清を、収集し、ＴＣＩＤ_５０の定量に使用した。Ｍタンパク質は、トランスフェクション試薬を使用しなかった図５Ｂにおいて観察されたものと同様に、ウイルス数の減少を刺激した（ｎ＝２）（図５Ｃ）。

【図6】図６は、感染の１～５時間前及び感染時にウイルスＶＳＶ－ＧＦＰ複製を制限するのに有効なｄｓＲＮＡを示すグラフである。Ｍ１４細胞（７５，０００細胞／ウェル）を、ＶＳＶ－ＧＦＰ（ＭＯＩ＝１）の感染前の様々な時点で５００ｎｇ／ｍＬの各ｄｓＲＮＡ（各々７００ｂｐ；ＧＦＰ（一致）又はｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）をコードするｄｓＲＮＡ）に曝露した。感染の２４時間後に、上清を、収集し、ＴＣＩＤ_５０を、ＨＥＬ－２９９細胞（ｎ＝３）を使用して計算した。有意差を、各個々の時点でｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＰの間で評価した。

【図7】図７Ａ～７Ｄは、ウイルス増殖阻害が、哺乳動物細胞をトランスフェクトしたときにｓｉＲＮＡでのみ観察できることを示す一連のグラフである。ＴＨＦ（図７Ａ）及びＳＮＢ７５（図７Ｂ）細胞を、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ、長いＧＦＰ ｄｓＲＮＡ（一致）又は長いｍＣｈｅｒｒｙ ｄｓＲＮＡ（ミスマッチ）で２時間処理（「浸漬」）し、上清収集の前にＶＳＶ－ＧＦＰ（ＭＯＩ＝０．１）に２４時間感染させた。ウイルス増殖の阻害は、長い一致配列（ＧＦＰ ｄｓＲＮＡ）曝露条件においてのみ観察された（両細胞株についてｎ＝６）。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを、リポフェクタミンを使用してＴＨＦ（図７Ｃ）及びＳＮＢ７５（図７Ｄ）細胞にトランスフェクトしたときに、ＶＳＶ－ＧＦＰウイルス力価における有意な低下が観察された（両細胞株についてｎ＝４）。これらの結果は、長いｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとは異なり、ウイルス阻害を誘導するのにトランスフェクションを必要としないことを示す。

【図8】図８Ａ及び８Ｂは、８００ｂｐのＧＦＰが分子の３'末端又は５'末端のいずれかに見出され、かつ残りの１００ｂｐがミスマッチのプラスミド配列である、９００ｂｐのｄｓＲＮＡ複合体を使用するウイルス増殖阻害を示す一連のグラフである。ＴＨＦ（図８Ａ）とＳＮＢ７５（図８Ｂ）の両方の細胞を、このｄｓＲＮＡ複合体の両配向に２時間暴露し、次いで、ＶＳＶ－ＧＦＰ（ＭＯＩ＝０．１）に２４時間曝露し、その後上清を、ＴＣＩＤ_５０の定量のために収集した（両方の細胞株についてｎ＝６）。有意なノックダウンが、ＧＦＰがｄｓＲＮＡ複合体の３'末端にあるとき両方の細胞株で観察された。ＧＦＰが５'末端にある場合、ＶＳＶ－ＧＦＰの顕著な阻害がＴＨＦ細胞においてのみ観察された。

【図9】図９Ａ及び９Ｂは、配列一致ｄｓＲＮＡが魚の細胞において誘導性発光を減少させることを示す一連のグラフである。ＲＴＧ－Ｐ１ニジマス性腺細胞は、ＩＳＲＥ（インターフェロン応答エレメント）の制御下でルシフェラーゼを安定的に発現し、したがってＩＦＮの存在はルシフェラーゼ生成を活性化する。（図９Ａ）ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）（一致）又はＧＦＰ（ミスマッチ）をコードするｄｓＲＮＡ（７００ｂｐ）を使用して、２４時間様々な濃度（１～２５ｎｇ／ｍＬ）でＲＴＧ－Ｐ１細胞を処理した。ルシフェラーゼ又はＧＦＰをコードする１ｎｇ／ｍＬの７００ｂｐ ｄｓＲＮＡは両方ともＩＦＮを誘導しなかった。（図９Ｂ）ＲＴＧ－Ｐ１細胞を、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び２５ｎｇ／ｍＬのｄｓＲＮＡ（Ｌｕｃ（一致）又はＧＦＰ（ミスマッチ）のいずれか）で４時間処理し、その後３２ｎｇ／ｍＬのポリＩＣで２４時間処理した。１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬの用量は、ルシフェラーゼの配列依存性ノックダウンを示し、一方で２５ｎｇ／ｍＬの用量は傾向を示すが、統計的に有意ではない。これは、ｄｓＲＮＡｉ効果は、ＩＦＮ生成が増加すると減少することを示唆する。ＩＦＮ生成がかなり多い１００ｎｇ／ｍＬのｄｓＲＮＡ及び上記の用量は、配列特異的なノックダウンをほとんど全く示さなかった（データ示さず）。

【図10】図１０は、一致したｄｓＲＮＡ配列がＲＴＧ－２においてＣＳＶウイルス力価を低下させることを示すグラフである。ニジマス性腺細胞のＲＴＧ－２を、無血清培地中で、長さが全て７００ｂｐである、１ｎｇ／ｍＬのＧＦＰ（ミスマッチ）、又はＣＳＶセグメント７（一致）又はＣＳＶセグメント１０（一致）配列特異的二本鎖ＲＮＡで４時間前処理した。単層をその後、１のＭＯＩでＣＳＶに４時間感染させ、次いで、２％ＦＢＳ培地と置換した。細胞上清を、感染後７日目に収集し、ＴＣＩＤ_５０アッセイにより滴定した。データ（平均＋ＳＥＭ）は、４つの独立した反復の平均を表し、スチューデントのｔ検定によって統計的に分析され、アルファ＝０．０５。Ｐ値＜０．０５は有意：ｐ≦０．０５（^＊）であるとみなされ、Ｐ値＞０．０５は有意でないとみなされる（ｎｓ）。

【図11】図１１は、ｄｓＲＮＡｉ効果がＲＮＡｉ経路を介することを示す画像である。ヒト胚性肺細胞（ＨＥＬ－２９９；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１３７）を、１２．５μＭのアウリントリカルボン酸（ＤＩＣＥＲ阻害剤）の存在下又は非存在下の無血清培地中で、５００ｎｇ／ｍｌのｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）、又はｅＧＦＰ（一致）配列特異的二本鎖ＲＮＡのいずれかで２時間前処理した。単層をその後、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰ（Ｉｎｄｉａｎａ）に感染させた。プレートを、蛍光顕微鏡によりスキャンした。以前のデータと一致して、ｅＧＦＰ ｄｓＲＮＡは、ｍＣｈｅｒｒｙ ｄｓＲＮＡに対して優れた保護を提供した（第３列と第５列を比較）。ＤＩＣＥＲ阻害剤の存在は、保護効果を無効にした（第３列と第４列を比較）。

【図12】図１２Ａは、複数の一致配列を含有する７００ｂｐのｄｓＲＮＡ複合体の構造の概略図であり、図１２Ｂ及び１２Ｃは、それぞれ複数の一致ｄｓＲＮＡ配列を含有する５００ｎｇ／ｍＬ又は１０００ｎｇ／ｍＬのいずれかの７００ｂｐ ｄｓＲＮで処理したＴＨＦ細胞を示す一連のグラフである。（ＴＨＦ）細胞（５０，０００細胞／ウェル）を、複数の一致配列を含有する５００ｎｇ／ｍＬ（図１２Ｂ）又は１０００ｎｇ／ｍＬ（図１２Ｃ）の７００ｂｐのｄｓＲＮＡに２時間曝露し、次いで、ＶＳＶ－ＧＦＰ（感染多重度（ＭＯＩ）＝０．１）に感染させた。感染の２４時間後に、上清を、収集し、ＴＣＩＤ_５０を、ＨＥＬ－２９９細胞を使用して計算した。ｄｓＲＮＡ複合体を、共に５'から３'方向（５'Ｎ－Ｍ－３'）で３５０ｂｐ ＶＳＶ Ｎ遺伝子配列と３５０ｂｐ ＶＳＶ Ｍ遺伝子配列、又は共に５'から３'方向（５'－Ｍ－Ｎ－３'）で３５０ｂｐ ＶＳＶ Ｍ遺伝子配列と３５０ｂｐ ＶＳＶ Ｎ遺伝子配列、又はＮとＭの５０ｂｐ断片が交互に並んだ全７００ｂｐのいずれかを有して設計した。Ｎ－Ｍ Ａｌｔ配列では、各断片は、Ｎ及びＭ遺伝子の異なる部分であり、すなわちｄｓＲＮＡ複合体に沿って繰り返される配列はなかった（図１２Ａ）。複数の一致配列を含有する７００ｂｐ ｄｓＲＮＡはウイルス増殖を効果的に抑制することが、見出された。

【発明を実施するための形態】

【0027】

詳細な説明
特に定義しない限り、本開示に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、特に文脈によって要求されない限り、単数用語は複数用語を含み、複数用語は単数用語を含むものとする。例えば、「細胞」という用語は、単一細胞、並びに複数細胞又は細胞の集団を含む。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、及びタンパク質及びオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションと関連して利用される命名法並びにそれらの技術は、当技術分野で周知の一般的に使用されるものである（例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２０１２参照）。

【0028】

本明細書で使用する場合、「二本鎖ＲＮＡ複合体」又は「ｄｓＲＮＡ複合体」は、２つの相補的な核酸鎖のガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む二重構造を指す。ガイド鎖は、標的核酸配列に相補的なセグメントを含む。ｄｓＲＮＡ複合体はまた、１以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。

【0029】

使用される「標的核酸配列」は、それに対しガイド鎖が相補的である、標的遺伝子転写物の一部又は全部を指す。標的核酸配列は、少なくとも２０ｂｐである。

【0030】

本明細書で使用する「標的遺伝子転写物」は、サイレンシングされることが望まれる標的遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子を指す。

【0031】

本明細書で使用する「相補的な」又は「相補性」は、ガイド鎖がパッセンジャー鎖にハイブリダイズする能力、又はガイド鎖のセグメントが標的核酸配列にハイブリダイズする能力を意味する。セグメントと標的核酸配列の間の相補性は、完全（１００％相補）であり得るが、いくつかのミスマッチが許容される。例えば、セグメントは、標的核酸配列に対して７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％相補的であり得る、または１０モノマーストレッチ中に最大で１、２又は３個のミスマッチを含み得る。

【0032】

本明細書で使用する「ガイド鎖」は、ＲＮＡ干渉を引き起こすために標的核酸配列に十分に相補的なセグメントを有する二本鎖核酸分子又は二本鎖核酸含有分子の一本鎖核酸分子を指す。

【0033】

本明細書で使用する「パッセンジャー鎖」は、ガイド鎖のセグメントに相補的な配列を有する二本鎖核酸分子又は二本鎖核酸含有分子の一本鎖核酸分子を指す。

【0034】

本明細書で使用する「平滑末端」は、オーバーハングヌクレオチドを有しないｄｓＲＮＡ複合体の末端を指す。本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体は例えば、二重構造の一方又は両方の末端に平滑末端を含み得る。

【0035】

本明細書で使用する「オーバーハング」は、二本鎖核酸の５'末端又は３'末端のいずれかに２つ、３つ又は４つのフリー端を有する二本鎖の状況における不対ヌクレオチドを指す。オーバーハングは例えば、ガイド鎖又はパッセンジャー鎖又はその両方における３'又は５'オーバーハングであり得、かつ天然又は非天然であり得る。

【0036】

ガイド及びパッセンジャー鎖及びオーバーハング配列を含む、ｄｓＲＮＡ複合体の状況において、本明細書で使用する「非天然」は、標的核酸配列又は標的遺伝子転写物に含まれないか、又はそれに対応しない（例えば、相補的でない）ヌクレオチド配列又は残基を指す。

【0037】

本明細書で使用する「化学修飾」は、例えば、ロック核酸（ＬＮＡ）中で見出されるものであり得るか、又は６員モルホリン環が糖部分又はホスホロチオエート（ＰＳ）結合と置き換わり、硫黄がリン酸基中の非架橋酸素原子の１つと置き換わっているリボース部分若しくはモルホリノモノマーの２’位置での修飾である、２'－フルオロ（２'－Ｆ）、２'－Ｏ－メトキシエチル（２'－ＭＯＥ）又は２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）であり得る。そのような修飾は、ヌクレアーゼの存在下で安定性を増強し得る。

【0038】

本明細書で使用する「コンジュゲート」は、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ複合体に、例えばリンカーを介して、連結された例えば抗体又は標識に共有結合される２以上の分子を含む複合体を意味する。

【0039】

本明細書で使用する「インターフェロン誘導閾値」又は「ＩＦＮ誘導閾値」は、インターフェロンコンピテント細胞又は対象への投与の際に、細胞中のインターフェロン応答を誘発する、ｄｓＲＮＡ複合体の濃度及び／又はｄｓＲＮＡ複合体の長さを指す。

【0040】

本明細書で使用する「インターフェロンコンピテント細胞」又は「ＩＦＮコンピテント細胞」は、Ｉ型ＩＦＮを生成できる細胞を指す。

【0041】

本明細書で使用する「インターフェロン刺激遺伝子」は、その発現がＩ型インターフェロンによって刺激される遺伝子を指し、例えば、ＩＳＧ１５、ＣＸＣＬ１０などを含む。

【0042】

対象の文脈における「治療する」という用語は、臨床結果を含む、有益な又は所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益な又は所望の臨床結果は、検出可能であろうとなかろうと、感染性の低下、ウイルスの成長の阻害、１以上の症状若しくは状態の緩和又は改善、疾患の程度の低減、疾患の安定した（すなわち、悪化していない）状態、疾患の拡散の防止、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、疾患の再発の減少、及び寛解（部分的又は完全）を含み得るが、これらに限定されない。「治療すること」及び「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを意味し得る。本明細書で使用する「治療すること」及び「治療」はまた、予防的治療を含む。例えば、感染症にかかりやすい対象、例えば感染が存在する、又は感染時期中の農場の湖若しくは池の中の魚は、病原体感染性を予防又は低減するために、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物を投与することにより予防的に治療できる。細胞の文脈における「処理すること」という用語は、細胞を溶液に浸漬することによるなどの、細胞に投与する又は接触させることを意味する。細胞は、本明細書で実証されるようなトランスフェクション試薬を必要とせずに処理できる。

【0043】

本明細書で使用する「投与」という用語は、有効な経路を使用して、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート及び／若しくは組成物などの薬剤を細胞若しくは対象に提供する又は与えることを意味する。例えば、ｄｓＲＮＡ複合体は、経鼻（例えば、エアゾールスプレー）、局所、経口、経腸、経膣、浸すことにより（ｂｙ ｂａｔｈ）及び／又は静脈内などで対象に投与できる。投与はまた、例えば、培地に懸濁されたｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート及び／若しくは組成物を含有する溶液中に細胞若しくは対象をおくことにより、又はｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート及び／又は組成物を含有する溶液を細胞若しくは対象の既存の環境に（例えば、魚類又は他の水生脊椎動物を収容する細胞培地又は液体に）添加することにより、対象（例えば、魚）又は細胞を治療することにより実施され得る。

【0044】

本明細書で使用する「医薬的に許容される担体」という用語は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、及び／又は組成物などの薬剤の投与に適する担体を意味し、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせを含む。

【0045】

本明細書で使用する「サイレンシング」という用語は、例えば本明細書に記載の条件を使用する、例えばＲＴ－ＰＣＲにより検出可能な標的遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルを、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれより多く減少させることを意味する。ＲＴ－ＰＣＲ条件は、例えば３５サイクルを含み、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体で治療されていない対照において増幅されたｃＤＮＡのレベルと比較されてよい。

【0046】

本明細書で使用する「抗体」という用語は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体及び他のキメラ抗体を含むことが意図される。抗体は、組換え源由来であってよく、かつ／又はトランスジェニック動物において生成されてもよい。実施形態の抗体は、重鎖可変領域又は重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２及び重鎖相補性決定領域３を含む重鎖、並びに軽鎖可変領域又は軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２及び軽鎖相補性決定領域３を含む軽鎖を含む。本明細書で使用する「抗体」はまた、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、それらの二量体（例えば、Ｆｃ二量体）、ミニボディ、ダイアボディ、及び多量体、多重特異的抗体断片及びドメイン抗体を含む、抗体結合断片を指す。抗体は、従来技術を使用して断片化できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで処理することにより作製できる。得られたＦ（ａｂ’）２断片を処理して、ジスルフィド架橋を減らし、Ｆａｂ’断片を生成できる。パパイン消化はＦａｂ断片の形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片及び他の断片もまた、組換え技術により合成できる。

【0047】

本明細書で使用する「対象」は、脊椎動物哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、ヒト、魚類及び他の水生脊椎動物、牛、豚、馬、鳥（例えば、家禽類）、両生類、爬虫類などを含む全ての脊椎動物を含む。

【0048】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「その」は、特に内容が明確に示さない限り、複数参照を含む。そのため、例えば、「複合体」を含有する組成物は、２以上の複合体の混合物を含む。用語「又は」は、特に内容が明確に示さない限り、「及び／又は」を含む意味で一般的に採用されることにも留意されたい。

【0049】

この出願及び請求項（複数可）において使用される単語「からなる」及びその派生語は、述べられる特徴、要素、構成要素、グループ、整数、及び／又は工程の存在を特定するクローズドエンド用語であることを意図しており、また、他の述べられていない特徴、要素、構成要素、グループ、整数及び／又は工程の存在を除外する。

【0050】

本明細書で使用する「約」、「実質的」及び「おおよそ」という用語は、最終結果が顕著に変化しないように、修飾された用語の妥当な量の逸脱を意味する。程度のこれらの用語は、この偏差が修飾する単語の意味を否定しない場合、修飾用語の少なくとも±５％又は少なくとも±１０％の偏差を含むものとして解釈されるべきである。

【0051】

特定の節に記載される定義及び実施形態は、当業者に理解されるように、それらが適する本明細書に記載の他の実施形態に適用可能であることが意図される。

【0052】

本明細書におけるエンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される全ての数及び少数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、及び５を含む）。全ての数及びそれらの少数は、用語「約」によって修飾されると推定されることも理解されるべきである。

【0053】

さらに、特定の節に記載される定義及び実施形態は、当業者に理解されるように、それらが適する本明細書に記載の他の実施形態に適用可能であると意図される。例えば、以下の節では、本開示の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義される各態様は、反対のことが明示されない限り、任意の他の態様又は複数の態様と組み合わされ得る。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴は、好ましい又は有利であると示される任意の他の特徴又は複数の特徴と組み合わされ得る。表に列挙される任意の特徴は、別の表に列挙される任意の他の特徴と組み合わされ得る。

【0054】

本発明者らは、Ｉ型ＩＦＮを誘導することなく、長い二本鎖ＲＮＡを使用して脊椎動物の細胞又は脊椎動物対象における標的遺伝子又は複数の遺伝子の発現を減少させ（すなわち、発現をサイレンシングし）、それによりＲＮＡｉを防止するネガティブフィードバックループを遮断するための組成物及び方法を開発した。組成物及び方法は、堅牢であり、効率的なノックダウンを保証する複数の遺伝子転写物又は遺伝子転写物中の複数のセグメントを効果的に標的化するために使用され得る。

【0055】

したがって、第１の態様は、各々少なくとも３００塩基対（ｂｐ）の長さを有する、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含み、ガイド鎖は、標的遺伝子転写物の標的核酸配列に相補的なセグメントを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）複合体（例えば、天然に存在しない組換えコンストラクト）を含む。

【0056】

一実施形態では、ガイド鎖又はそのセグメントは、標的核酸配列と約７０％、約８０％、又は約９０％相補的であり得る。ガイド鎖又はそのセグメントは、標的核酸配列と完全に相補的（１００％相補的）であり得る。一実施形態では、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖は、キメラであり、例えば２以上の化学的に別々の領域を含有する。例えば、キメラ鎖は、有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性の増加、細胞への取り込みの増加）を与える修飾ヌクレオチドの１以上の領域を含有し得る。

【0057】

ＩＦＮ応答のみを誘導する他のｄｓＲＮＡ分子と比較して、標的核酸配列に対するガイド鎖の相補性は、ｄｓＲＮＡ複合体が標的ｍＲＮＡ配列の分解又はｍＲＮＡ標的配列の翻訳の阻害を促進することを可能にする。

【0058】

標的核酸配列は例えば、宿主遺伝子転写物配列（すなわち、宿主遺伝子転写物の一部）又は病原体又は非宿主遺伝子転写物配列であり得る。単一のｄｓＲＮＡ複合体は、例えば特定の標的遺伝子転写物に沿って連続的に異なる標的核酸配列に各々が相補的な複数のセグメントをそのガイド鎖中に含有するか、又は単一ｄｓＲＮＡ複合体がＲＮＡｉを介して複数の遺伝子転写物を標的とすることを可能にする異なる遺伝子転写物中に見出され得る。一実施形態では、ガイド鎖は、同じ標的遺伝子転写物の異なる標的核酸配列に各々が相補的な１以上のさらなるセグメントを含む。別の実施形態では、１以上のさらなる異なるセグメントは、異なる標的遺伝子転写物の異なる標的核酸配列に相補的であり、任意選択で、標的核酸配列に相補的ではないバッファー配列（若しくはミスマッチ配列）、例えば、約５０ｂｐ～約５００ｂｐの配列、又はそれ以上により分離される。一実施形態では、ガイド鎖は、標的核酸配列に各々が相補的な１以上のさらなるセグメントを含む。例えば、ｄｓＲＮＡ複合体は、２つの異なる標的遺伝子転写物からの標的核酸配列を交互に含有してよい。標的核酸配列に相補的な各セグメントの長さは、例えば、約２０ｂｐ～約８００ｂｐである、又はそれより長くてよい。ｄｓＲＮＡ複合体全体の長さは、約３００ｂｐ～約５０００ｂｐ、又はそれより長い、任意選択で約３０００ｂｐであり得る。

【0059】

いくつかの実施形態では、標的核酸配列に相補的なセグメントは、２０ｂｐ～８５０ｂｐ、例えば、約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７５ｂｐ、約８０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ又は約８００ｂｐ、又は２０～８００ｂｐ、４０～７００ｂｐ、６０～６００ｂｐ、８０～５００ｂｐ、１００～５００ｂｐ、２００～５００ｂｐ、３００～５００ｂｐ又は４００～５００ｂｐの長さを有する。

【0060】

一実施形態では、標的核酸配列に相補的なガイド鎖のセグメントは、ガイド鎖の５'末端の近位（例えば、５０塩基未満）であるか、又は５'末端にある。本明細書で使用する「５'末端の近位」は、３'末端よりも５'末端に近い、例えば、少なくとも３ヌクレオチド近いことを意味する。別の実施形態では、セグメントは、ガイド鎖の３'末端の近位であるか、又は３'末端にある。本明細書で使用する「３'末端の近位」は、例えば、５'末端より３'末端に近い、例えば、少なくとも３ヌクレオチド近いことを意味する。ｄｓＲＮＡ複合体が複数のセグメントを含む実施形態では、１つのセグメントは、５'末端の近位又は５'末端にあり得、別のセグメントは、３'末端の近位又は３'末端にあり得る。ｄｓＲＮＡ複合体に含まれる他のセグメントは、任意選択でバッファー配列によって分離されるガイド鎖の末端の近位のセグメント又は末端にあるセグメント間に配置される。

【0061】

一実施形態では、ガイド鎖は、同じ標的遺伝子転写物の異なる標的核酸配列に各々相補的な２つの異なるセグメントを含み、第１のセグメントは、ガイド鎖の３’末端の近位であるか又は３’末端にあり、第２のセグメントは、ガイド鎖の５'の近位であるか又は５'にある。別の実施形態では、ガイド鎖は、異なる標的遺伝子転写物の標的核酸配列に各々が相補的な２つの異なるセグメントを含み、第１のセグメントは、ガイド鎖の３’末端の近位であるか又は３’末端にあり、第２のセグメントは、ガイド鎖の５'の近位であるか又は５'にある。

【0062】

いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、１以上の非天然配列を含む。例えば、非天然配列は、非天然ＲＮＡ配列、例えばバッファー配列であり得る。

【0063】

ｄｓＲＮＡ複合体は、一緒にアニールされた、相補配列－パッセンジャー鎖及びガイド鎖の２つの一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ分子を含む。

【0064】

ｄｓＲＮＡ複合体は、任意の所望の手順で合成されてよい。例えば、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）、細菌、大規模発酵プロセスなどを使用するインビトロ転写を含む、様々な手順が当技術分野で周知である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体は、ポリメラーゼプロモーターを含有するＤＮＡ鋳型、およびポリメラーゼにより作製された相補配列からのガイド鎖及びパッセンジャー鎖で合成されてよく、ポリメラーゼにより作製された相補配列がアニールして、ｄｓＲＮＡ複合体を作製する。一実施形態では、ポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターである。一実施形態では、ポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。

【0065】

いくつかの実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、３００ｂｐ～５０００ｂｐ、例えば、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ又は約８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ又は３００～９００ｂｐ、４００～９００ｂｐ、５００～９００ｂｐ、６００～９００ｂｐ、７００～９００ｂｐ、３００～８００ｂｐ、４００～８００ｂｐ、５００～８００ｂｐ、６００～８００ｂｐ、７００～８００ｂｐ、３００～３０００ｂｐ、４００～３０００ｂｐ、３００～２０００ｂｐ又は４００～２０００ｂｐの長さを有する。最小の長さは、３００～４００ｂｐの任意の整数であり得る。長さは、３００と３０００を含む３００～３０００ｂｐの任意の整数であり得る。より長い配列を使用してもよい。

【0066】

一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、少なくとも３００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、少なくとも４００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、少なくとも５００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、少なくとも６００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、少なくとも７００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、少なくとも８００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、少なくとも９００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、少なくとも１０００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、それぞれ最大で２０００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、最大で１５００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、それぞれ最大で２０００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、最大で１５００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、最大で１３００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、最大で１２００ｂｐの長さを有する。一実施形態では、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各々は、最大で１１００ｂｐの長さを有する。

【0067】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体は、少なくとも１つの平滑末端、任意選択で２つの平滑末端を含む。いくつかの実施形態では、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖は、オーバーハングを含む。一実施形態では、オーバーハングは、標的核酸配列と相補的である。別の実施形態では、オーバーハングは、非天然である。

【0068】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体は、１以上の化学的に修飾された塩基を含む。一実施形態では、化学修飾は、２'Ｏメチル（２'－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２'Ｏ－ＭＯＥ）、２'フルオロ（２’Ｆ）、及びロック核酸モノマー（ＬＮＡＭ）から選択される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体は、キメラである。

【0069】

別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体は、非修飾ＲＮＡを含む。

【0070】

一実施形態では、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖は、５’－三リン酸末端を含む。一実施形態では、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖は、５’－二リン酸末端を含む。一実施形態では、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖は、５’－一リン酸末端を含む。一実施形態では、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖は、５'－三リン酸末端を欠く。

【0071】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体は、複製遺伝子、任意選択でウイルス複製遺伝子を含まない。

【0072】

いくつかの実施形態では、標的遺伝子転写物は、ウイルス遺伝子転写物などの病原体遺伝子転写物である。特定の関心のあるウイルス遺伝子は、構造タンパク質、非構造タンパク質、免疫回避タンパク質、及びポリメラーゼをコードする遺伝子を含む。ウイルス遺伝子は、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、ロタウイルスを含むがこれらに限定されない任意のウイルス由来であり得る。別の実施形態では、ウイルス遺伝子は、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株ウイルス（ＶＳＶ）遺伝子である。さらなる実施形態では、ウイルス遺伝子転写物は、膜（Ｍ）タンパク質遺伝子転写物である。さらなる実施形態では、ウイルス遺伝子はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質遺伝子転写物である。さらなる実施形態では、ウイルス遺伝子はスパイク（Ｓ）タンパク質遺伝子転写物である。一実施形態では、ウイルス遺伝子転写物は、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、ロタウイルス又はラブドウイルス転写物である。例えば、コロナウイルス転写物は、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳｒ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１転写物などの、ヒトコロナウイルス転写物である。

【0073】

ＲＮＡｉサイレンシングのための標的遺伝子転写物は、特に限定されない。標的とされる核酸（例えば、遺伝子転写物）は、想定される治療の種類に依存する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子転写物は、疾患遺伝子転写物、任意選択で癌遺伝子転写物である。一実施形態では、疾患は、癌である。別の実施形態では、疾患は、形質細胞増殖性障害などのリンパ増殖性障害である。

【0074】

標的遺伝子転写物のいくつかの非限定的な例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる２０１４年４月１５日発行の米国特許第８，６９７，３５９号に開示される標的遺伝子転写物を含む。標的遺伝子転写物の具体例は、例えば、発生遺伝子の転写物（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、サイトカイン／リンホカイン及びそれらの受容体、増殖／分化因子及びそれらの受容体、神経伝達物質及びそれらの受容体）；癌遺伝子（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＯＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、及びＹＥＳ）；腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ４、ＭＣＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ １、ＴＰ５３、及びＷＴＩ）；酵素をコードする遺伝子（例えば、ＡＣＣ合成酵素及び酸化酵素、ＡＣＰ不飽和酵素、及び水酸化酵素、ＡＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼ、ＡＴＰａｓｅ、アルコール脱水素酵素、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコン合成酵素、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、脱炭酸酵素、デキストリナーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合型澱粉合成酵素、ＧＴＰａｓｅ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、転化酵素、イソメラーゼ、キナーゼ、乳糖分解酵素、ウパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調節因子合成酵素、ポリガラクツロナーゼ、タンパク分解酵素及びペプチダーゼ、プラナーゼ（ｐｕｌａｎａｓｅ）、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯＳ、トポイソメラーゼ、及びキシラナーゼ）；及びケモカインをコードする遺伝子（例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）、テロメラーゼのＲＮＡ成分、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体、腫瘍壊死因子核因子カッパＢ、転写因子、細胞接着分子、インスリン様成長因子、形質転換増殖因子ベータファミリーメンバー、細胞表面受容体、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、核小体低分子ＲＮＡ、ＲＮＡ輸送因子）、翻訳因子、テロメラーゼ逆転写酵素）などの転写物を含む。

【0075】

別の態様は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、抗体、任意選択で一本鎖抗体又は結合断片などの１以上のポリペプチド、又は標識を含むコンジュゲートである。

【0076】

一実施形態では、コンジュゲートは、ｄｓＲＮＡ複合体及び抗体を含む。

【0077】

一実施形態では、コンジュゲートは、ｄｓＲＮＡ複合体及び検出可能な標識などの標識を含む。

【0078】

核酸は、検出又は精製を可能にするための検出可能な標識で修飾され得る。標識の例は、放射性リン酸塩、ビオチン、フルオロフォア及び酵素を含む。核酸はまた、例えば、標的化送達又は固定化を促進するためのコンジュゲートの一部であり得る。例えば、核酸分子は、合成中にタグ又は他の修飾で標識できる。核酸分子はまた、合成後に標識できる。酵素的及び化学的方法は、クリック化学試薬と同様に利用可能である。

【0079】

抗体又はペプチドは、様々な方法を使用して本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体にコンジュゲートできる。例えば、１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩であるＥＤＣ（ＥＤＡＣとも呼ばれる）を、使用できる。５'－リン酸基を含有する核酸分子は、任意選択でイミダゾールと組み合わせてＥＤＣと反応させて、ヌクレオチドホスホルアミデートコンジュゲートを作製できる。抗体はまた、ビオチンアビジンをベースとしたクリック化学コンジュゲーションを使用してコンジュゲートされてもよい。メタ過ヨウ素酸ナトリウムを、
化学コンジュゲーション手順のための反応性アルデヒド基を生成するために、タンパク質炭水化物の酸化剤として使用できる。ＲＮＡヌクレオチド中のリボースのビシナルジオールもまた、過ヨウ素酸で切断でき、ＲＮＡに単一の３'末端タンパク質を付加するためにこの方法が使用されることを可能にする。本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体をコンジュゲートするための他の方法は、Ｎａｎｎａ，ＡＲら ２０２０（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８巻，１０号，０４ Ｊｕｎｅ ２０２０，ページ５２８１～５２９３）に記載されるように、ベータ－ラクタムリンカー官能化ｓｉＲＮＡへの部位特異的コンジュゲーションに適する反応性リジン残基を含有する二重可変ドメイン抗体を使用することを含む。ｄｓＲＮＡ複合体はまた、Ｄｏｖｇａｎ Ｉら ２０２０（Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０，７６９１）に記載されているように、抗体－薬物コンジュゲートを形成する、薬物化合物などの他のペプチドに抗体を非共有結合で連結するリンカーとして使用されてもよい。

【0080】

別の態様は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体を形成する（例えば、自己アニールする）ことができる１以上の転写物（複数可）をコードする発現カセットを含むベクターを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖を生成するためのＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７ポリメラーゼプロモーターを含む。別の実施形態では、発現カセットは、ｄｓＲＮＡ複合体を形成するために自己アニールできる転写物用のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７ポリメラーゼプロモーターを含む。別の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスコンストラクト又はウイルスである。さらなる実施形態では、ウイルスは、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスである。ベクターがインビボでの使用のためである実施形態では、強力発現プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが、使用され得る。

【0081】

別の態様は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、コンジュゲート、又はベクターを含む組成物を含む。

【0082】

別の実施形態では、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。

【0083】

別の実施形態では、組成物は、脂質輸送粒子をさらに含む。さらなる実施形態では、脂質輸送粒子は、リポソームである。さらなる実施形態では、脂質輸送粒子は、ナノ粒子である。さらなる実施形態では、脂質輸送粒子は、ナノソームである。

【0084】

一実施形態では、組成物は、細胞培養培地、任意選択で無血清細胞培養培地を含む。

【0085】

一実施形態では、組成物は、脂質輸送粒子などの送達機構を欠く。

【0086】

別の実施形態では、組成物中のｄｓＲＮＡ複合体の濃度（例えば、体積当たりの重量）は、選択されたＩＦＮ誘導閾値を下回る投与量である。ＩＦＮ誘導閾値は、投与の用途又は経路に応じて選択でき、細胞群の平均、中央値又は平均閾値に基づいてよい。ＩＦＮ誘導閾値未満の濃度は、細胞及び対象の種類、並びに投与の経路に依存し得る。一実施形態では、濃度は、最高で５０００ｎｇ／ｍＬである。一実施形態では、濃度は、最高で１５００ｎｇ／ｍＬである。別の実施形態では、濃度は、１ｎｇ／ｍＬ～５０００ｎｇ／ｍＬである。別の実施形態では、濃度は、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２５０ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、１７５０ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２２５０ｎｇ／ｍＬ、２５００ｎｇ／ｍＬ、２７５０ｎｇ／ｍＬ、３０００ｎｇ／ｍＬ、３５００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、４５００ｎｇ／ｍＬ又は５０００ｎｇ／ｍＬである。別の実施形態では、濃度は、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、又は１５００ｎｇ／ｍＬである。一実施形態では、１００ｎｇ／ｍＬのｄｓＲＮＡが細胞に送達される場合、細胞当たりのｄｓＲＮＡ分子の数は、細胞当たり約５５，８００個のｄｓＲＮＡ分子である。

【0087】

様々な用途は、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート及び組成物から作製できる。例えば、上記のものは、病原体配列をコードする長いｄｓＲＮＡ複合体が、（１）ＩＦＮ関連経路を誘導して病原体複製を遮断し、かつ感染部位における自然免疫細胞及び適応免疫細胞の動員並びに活性化を誘導し、かつ（２）ＲＮＡｉを誘導して複製に必要な病原体遺伝子の発現を遮断する、抗病原体療法に用いることができる。ある濃度で細胞に投与されるｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物は、ＩＦＮを誘導し得るが、異なる、例えばより低い濃度で同じ細胞に同じｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物を投与することは、ＲＮＡｉを誘導し得る。２つの異なる細胞型に同じ濃度で同じｄｓＲＮＡ複合体を投与することは、一方の細胞型でＩＦＮを誘導し、他方の細胞型でＲＮＡｉを誘導し得る。この治療は、予防的治療と感染治療の投与計画の両方に使用できる。

【0088】

別の例は、長いｄｓＲＮＡ複合体が、１以上の癌遺伝子転写物を標的とするように、および（１）ＩＦＮコンピテント腫瘍細胞又は腫瘍細胞の周りの細胞内でＩＦＮ関連経路を誘導し、腫瘍内又は腫瘍の周りに自然免疫細胞及び適応免疫細胞を動員し、活性化し、（２）ＲＮＡｉを誘導して、ＩＦＮインコンピテント腫瘍細胞において癌遺伝子発現を遮断するように、設計され得る、抗癌療法である。

【0089】

また、本明細書に記載の複合体、ベクター、コンジュゲート及び組成物は、例えばＩＦＮ誘導閾値を特定すること、および所望の応答、ＩＦＮ又はＲＮＡｉに基づき投与するためのｄｓＲＮＡ複合体の濃度を選択するために誘導閾値を使用することにより、調節可能なインターフェロン調節機構を提供する方法において使用できる。この出願は、例えば必要に応じてＩＦＮ又はＲＮＡｉに対する応答を後押しするために、抗病原体又は抗癌療法と組み合わされてよい。

【0090】

したがって、別の態様は、標的核酸配列を含む脊椎動物細胞又は対象において標的遺伝子転写物をサイレンシングする際に、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート及び組成物を使用して、脊椎動物細胞又は対象における病原体の複製又は病原体感染の感染性を低下させることを含む。

【0091】

別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体は、バクテリオファージを使用して細胞内に送達される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体は、ベクター、任意選択でプラスミド、ウイルスコンストラクト又はウイルスベクターを使用して細胞内に送達される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体は、ナノ粒子、ペプチド、リポソーム、又はウイルス様粒子を使用して細胞内に送達される。

【0092】

別の態様は、脊椎動物細胞又は対象における病原体の複製又は病原体感染の感染性を低下させるための、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の使用である。

【0093】

別の態様は、それを必要とする対象における病原体感染症を治療するための、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の使用である。

【0094】

別の態様は、薬剤の調製のための、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の使用である。

【0095】

一実施形態では、薬剤は、ウイルス感染などの病原体感染の治療のためである。一実施形態では、薬剤は、癌の治療のためである。

【0096】

一実施形態では、薬剤は、ＲＮＡｉサイレンシングを標的とする、本明細書に記載の標的遺伝子転写物に関連するか、又は関与する疾患の治療のためである。前述したように、ＲＮＡｉサイレンシングのための標的遺伝子転写物は、特に限定されない。標的とされる遺伝子転写物は、想定される治療の種類に依存する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子転写物は、疾患遺伝子転写物、任意選択で癌遺伝子転写物である。一実施形態では、疾患は、癌である。別の実施形態では、疾患は、形質細胞増殖性障害などのリンパ増殖性障害である。

【0097】

別の態様は、脊椎動物細胞又は対象において標的遺伝子転写物をサイレンシングする方法であって、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート、又は組成物の量を細胞又は対象に投与することを含む、方法を含む。脊椎動物は、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、ヒト、牛、豚、馬、魚、鳥（例えば、家禽類）、両生類、爬虫類などを含む。

【0098】

本方法は、病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫又は他の寄生虫（例えば、多細胞寄生虫（例えば、蠕虫）により損傷を受けている細胞を治療するために特に有用である。

【0099】

細胞型は、例えば、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、血球、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、及び内分泌腺又は外分泌腺の細胞を含む。特に留意すべきは、幹細胞、癌細胞、腫瘍細胞、肺の細胞、皮膚の細胞、椎間板の細胞、眼の細胞、脳の細胞などである。

【0100】

本方法は、複数の異なるセグメントを含有するｄｓＲＮＡ複合体の使用を伴い、異なるセグメントの各々は、異なる標的遺伝子転写物をサイレンシングし得る。このようにして、単一ｄｓＲＮＡ複合体を、より効果的な治療効果のために異なる遺伝子転写物を標的化し、かつ／又は個々の患者のニーズに対して治療を個別化するために使用できる。

【0101】

一実施形態では、投与されるｄｓＲＮＡ、ベクター、コンジュゲート、又は組成物の量は、所定のＩＦＮ誘導閾値を下回る。一実施形態では、投与されるｄｓＲＮＡ、ベクター、コンジュゲート、又は組成物の量は、所定のＩＦＮ誘導閾値を上回る。

【0102】

所定のＩＦＮ誘導閾値は、比較の細胞、対象、細胞の集団又は対象の集団に基づいて決定できる。一実施形態では、所定のＩＦＮ誘導閾値は、細胞の比較集団を使用して決定され、細胞の比較集団は、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物とインキュベートされ、所定のＩＦＮ誘導閾値が、それらから決定される。一実施形態では、細胞は、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物と約２時間インキュベートされる。他の時間も使用できる。ＩＦＮ誘導閾値は、用途に応じて決定できる。例えば誘導閾値は、感染時、感染後又は感染前に、ｄｓＲＮＡ複合体を細胞とインキュベートすることにより決定できる。別の実施形態では、細胞は、感染前に最大で約４８時間、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物とインキュベートされる。別の実施形態では、細胞は、感染前に最大で約２４時間、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物とインキュベートされる。さらなる実施形態では、細胞は、感染前に約１時間～５時間、任意選択で感染前に２時間、３時間、４時間、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、又は組成物とインキュベートされる。別の実施形態では、細胞は、感染時にｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物とインキュベートされる。

【0103】

本方法が対象を治療するためである実施形態では、所定のＩＦＮ誘導閾値は、対象（例えば、特定の感染症又は癌を有する）の比較集団に、異なる濃度及び／又は長さのｄｓＲＮＡ複合体を投与して、ＩＦＮ応答を誘導できない投与量及び／又は長さ並びにＩＦＮ応答を誘導する投与量及び／又は長さを決定することによって得ることができる。対象の集団におけるＩＦＮ誘導閾値を決定することに、ＩＦＮを誘導しないがＲＮＡｉを誘導する投与量を決定するために、例えば、前臨床評価、例えば、前臨床動物試験が先行してよい。

【0104】

別の実施形態では、所定のＩＦＮ誘導閾値を決定する方法は、ｄｓＲＮＡ複合体、若しくはベクター、３００ｂｐ～９００ｂｐ、例えば、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ若しくは約８００ｂｐ、若しくは３００～９００ｂｐ、４００～９００ｂｐ、３００～８００ｂｐ若しくは４００～８００ｂｐのｄｓＲＮＡ複合体を含む組成物と細胞の比較集団をインキュベートすること、又はそれらを対象の比較集団に投与すること、および細胞又は対象の比較集団においてＩＦＮ応答が生じるかどうかを特定することを含む。

【0105】

別の実施形態では、所定のＩＦＮ誘導閾値を決定するための方法は、ＩＦＮ応答を誘導できないｄｓＲＮＡ複合体の投与量及び／又は長さ並びにＩＦＮ応答を誘導するｄｓＲＮＡ複合体の投与量及び／又は長さを決定するために、異なる濃度及び／又は長さのｄｓＲＮＡ複合体を細胞の比較集団に送達すること又は対象の比較集団に投与することを含む。比較集団は、細胞株、初代細胞培養物、初代組織培養物若しくは曝露動物、又は疾患若しくは病原体感染症を有する対象又はその危険性を有する対象のグループであり得る。

【0106】

投与量は、１以上の送達方法、例えば、使用される意図された送達方法を使用して決定され得る。一実施形態では、異なる濃度及び／又は長さのｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、又は組成物が、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、又は組成物中の比較集団をインキュベートすることにより送達される。他の実施形態では、送達方法は、ｄｓＲＮＡ複合体を含むか若しくは発現できるバクテリオファージ、ベクター、任意選択でプラスミド、ウイルスコンストラクト、又はウイルス、ナノ粒子、ペプチド、リポソーム、又はウイルス様粒子を含み得る。

【0107】

細胞の比較集団は典型的には、脊椎動物細胞、例えば、ｄｓＲＮＡ複合体で治療される細胞と同じ細胞型である。対象の比較集団は、ｄｓＲＮＡ複合体で治療される対象と同じ疾患若しくは感染症を有するか、又はその危険性がある。

【0108】

異なる細胞型は、本明細書に記載の複合体で同時に治療できる。各細胞型は、利用可能な異なるＩＦＮ誘導閾値を有し得る。例えば、第１の細胞は、ｄｓＲＮＡ複合体のための第１の閾値濃度を有してよく、第２の細胞は、ｄｓＲＮＡ複合体のための第２の閾値濃度を有してよく、ここで第１の閾値濃度は、例えば腫瘍微小環境又は混合細胞型の任意の組織において、第２の閾値濃度よりも低い。ｄｓＲＮＡ複合体の濃度は、第１の閾値を上回りかつ第２の閾値未満であるように滴定でき、例えば腫瘍微小環境において、第１の細胞中でＩＦＮ応答を誘導しかつ第２の細胞中で遺伝子転写のサイレンシングを誘導することが、例えば望ましい。

【0109】

別の実施形態では、細胞の比較集団又は対象の比較集団におけるＩＦＮ誘導閾値を特定することは、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現レベルを測定することを含む。一実施形態では、ＩＳＧの発現レベルは、ｑＰＣＲを使用して測定される。別の実施形態では、ＩＳＧの発現レベルは、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ、及び／又は蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して測定される。別の実施形態では、ＩＳＧの発現レベルは、ｄｓＲＮＡ複合体とのインキュベーション又はｄｓＲＮＡ複合体での処理後約２４時間の時点で測定される。

【0110】

一実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞であり、癌細胞などの、疾患細胞である。

【0111】

別の態様は、標的核酸配列を含む第１の脊椎動物細胞型における標的遺伝子転写物をサイレンシングすること、および第２の脊椎動物細胞型においてＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を誘導することにより混合細胞集団を標的化する方法であって、任意選択で細胞集団が、脊椎動物対象中にある、方法を含む。

【0112】

別の態様は、脊椎動物細胞又は対象における病原体の複製又は病原体感染の感染性をそれぞれ低下させる、又はそれを必要とする対象における病原体感染症を治療する方法であって、標的核酸配列が、ウイルス遺伝子転写物配列などの、病原体遺伝子転写物配列に対応する、方法を含む。

【0113】

一実施形態では、投与は、病原体への曝露前である。別の実施形態では、投与は、病原体への曝露中である。

【0114】

別の態様は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の量を、それを必要とする対象に投与することを含む病原体感染症を治療する方法であって、標的遺伝子転写物が、ウイルス遺伝子転写物などの、病原体遺伝子転写物である、方法を含む。一実施形態では、病原体遺伝子（複数可）は、任意選択で、ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳｒ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１などの、ヒトコロナウイルスからの１以上のヒトコロナウイルス遺伝子（複数可）であり得る。さらなる実施形態では、１以上のコロナウイルス遺伝子（複数可）は、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質及び／又はスパイクタンパク質をコードする遺伝子（複数可）であり得る。

【0115】

ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物は例えば、感染前、感染時、及び／又は感染後に投与できる。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物は、予防的治療として使用でき、例えば、その場合ファミリーメンバーが、感染したと特定され、かつファミリーメンバーは、徴候を示す前に予防剤としてそれを摂取する。

【0116】

別の実施形態では、病原体感染症は、感染の部位を有し、量が、感染部位に投与される（例えば、局所的に）。いくつかの実施形態では、量は、鼻腔内、経口、局所、眼、経腸、経膣、浸すことにより、皮下、静脈内、腹腔内、胸膜内又は筋肉内で投与される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物は、鼻腔内投与され、エアロゾル形態である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物は、局所投与され、クリーム、ゲル、軟膏、ペースト、コロイド又は懸濁液の形態である。

【0117】

別の実施形態では、感染の部位に投与される量は、ＩＦＮ誘導閾値を上回る。

【0118】

別の実施形態では、量は、全身投与され、量は、ＩＦＮ誘導閾値未満である。いくつかの実施形態では、投与は、局所的に及び／又は静脈内注射を介して及び／又は腫瘍内に行われる。

【0119】

別の実施形態では、細胞は、水棲脊椎動物細胞である。一実施形態では、対象は、水棲脊椎動物である。

【0120】

別の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。

【0121】

別の実施形態では、細胞は、癌細胞又は免疫特権部位の細胞である。「免疫特権部位」は、外来物質、限定されないが、例えば、眼、胎盤、胎児、精巣、中枢神経系、及び／又は毛包などの導入を許容できる部位を意味する。

【0122】

別の実施形態では、対象は、水棲脊椎動物である。一実施形態では、水棲脊椎動物は、真骨魚などの魚である。

【0123】

別の実施形態では、対象は、地上脊椎動物であり、一実施形態では、地上脊椎動物は、鳥である。

【0124】

さらなる実施形態では、対象は、哺乳動物、任意選択でヒトである。他の哺乳動物は、鳥、牛、豚又は羊の種などの任意の農業用種を含む。家畜もまた、企図される。別の実施形態では、哺乳動物は、牛、豚、馬又は羊である。

【0125】

一実施形態では、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物は、トランスフェクション試薬などの送達機構の存在下で投与されない。

【0126】

別の態様は、脊椎動物細胞又は対象における標的遺伝子転写物をサイレンシングするための本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の使用である。

【0127】

別の態様は、脊椎動物細胞又は対象における病原体の複製又は病原体感染の感染性を低下させるための本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の使用である。

【0128】

別の態様は、それを必要とする対象における病原体感染症を治療するための本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の使用である。

【0129】

別の態様は、薬剤の調製のための本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の使用である。一実施形態では、薬剤は、標的遺伝子転写物、任意選択で、本明細書に記載の標的遺伝子転写物に関連する又は関与する病原体感染症又は疾患の治療での使用のためである。

【0130】

上に列挙されていない、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物によって誘導されるＩＦＮ及び／又はＲＮＡｉの誘導を必要とする適用もまた、適切であり、ｄｓＲＮＡ複合体、ベクター、コンジュゲート又は組成物の潜在的な適用に含まれる。

【0131】

上記の開示は一般的に、本願を説明する。以下の具体例を参照して、より完全な理解を得ることができる。これらの例は、説明のためにのみ記載されており、本願の範囲を限定することは意図していない。形態の変更及び等価物の置換は、状況が示唆するか、又は都合がよくなる可能性があるので企図される。本明細書では具体的な用語が採用されているが、そのような用語は、限定を目的とせず、説明的な意味で意図される。

【0132】

以下の非限定的な例は、本開示の例示である。

【0133】

実施例
方法
細胞株の維持
哺乳動物細胞株
哺乳動物細胞を使用する全ての手順は、５％ＣＯ_２で、３７℃で行われた。日常的な細胞の維持は、通気したＴ７５フラスコ（ＢＤ Ｆａｌｃｏn）中で行った。

【0134】

ヒト胚性肺細胞（ＨＥＬ－２９９）及びテロメラーゼ不死化ヒト線維芽細胞（ＴＨＦ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）中で日常的に維持した。特に断りのない限り、これらの細胞株を含む全ての手順は、この培地配合を使用する。細胞を、０．２５％トリプシン（ＶＷＲ）を使用して２～３日毎に１：６の比で継代して、細胞を解離した。

【0135】

ヒトメラノーマ細胞（Ｍ１４）、ヒト乳癌細胞（ＢＴ５４９）及びヒト神経膠芽腫細胞（ＳＮＢ７５）を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）－１６４０培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で日常的に維持した。特に断りのない限り、これらの細胞株を含む全ての手順は、この培地配合を使用する。細胞を、０．２５％トリプシンを使用して２～３日毎に１：４の比で継代して、細胞を解離した。

【0136】

ヒト肺線維芽細胞ＭＲＣ５とヒト肝上皮細胞ＨｅｐＧ２の両方を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したイーグル最小必須培地中で日常的に維持した。特に断りのない限り、これらの細胞株を含む全ての手順は、この培地配合を使用する。細胞を、０．２５％トリプシンを使用して２～３日毎に１：４の比で継代して、細胞を解離した。

【0137】

真骨魚細胞株
ＲＴＧ－Ｐ１は、インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）の制御下でルシフェラーゼを安定的に発現するニジマス性腺細胞株であり、そのためインターフェロン（ＩＦＮ）の存在は、ルシフェラーゼ生成を活性化する。ＲＴＧ－２は、ＲＴＧ－Ｐ１の遺伝子改変されていない供給源細胞株である。両方の細胞株を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したライボビッツ－１５培地（Ｌ－１５，Ｇｉｂｃｏ）中で日常的に維持した。特に断りのない限り、これらの細胞株を含む全ての手順は、この培地配合を使用する。細胞を２０℃に維持し、日常的細胞維持は、栓をしたＴ７５フラスコ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）中で行った。ＲＴＧ－Ｐ１及びＲＴＧ－２細胞を、０．２５％トリプシンを使用して隔週ベースで１：２の比で継代して、細胞を解離した。

【0138】

ウイルス増殖
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－ＧＦＰ）のインディアナ血清型は、ウイルスのＧ遺伝子とＬ遺伝子の間に組み込まれたＧＦＰ遺伝子を含有する。結果として、細胞を、ＶＳＶ－ＧＦＰ蛍光緑にを感染させた。ＶＳＶ－ＧＦＰを、ＨＥＬ－２９９細胞の単層上で増殖させた。ウイルス感染を、３７℃で、５％ＣＯ_２で、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で実施した。ウイルス含有培地を、４分間の４０００×ｇでの遠心分離により細胞デブリを除去した後、０．４５μｍフィルターを介して濾過滅菌した。ウイルスストックの５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）値を、以下に記載のように定量した。

【0139】

組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）
ウイルス含有培地を、４０００×ｇで４分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。ＶＳＶ－ＧＦＰ生成を、９６ウェルプレートに播種したＨＥＬ－２９９細胞上でＴＣＩＤ５０／ｍＬにより測定した（１．５×１０^４細胞／ウェル）。感染後２４～３６時間の時点でウェルを、蛍光顕微鏡によりスコア化した（ｅＧＦＰ蛍光の存在を陽性感染と見なした）。得られたＴＣＩＤ５０／ｍＬの値を、リードとミュンヒの方法を使用して計算した。

【0140】

ｄｓＲＮＡ複合体の合成
ｄｓＲＮＡ複合体を、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターを含有するＤＮＡ鋳型からのセンス鎖及びアンチセンス鎖で合成し、相補配列を、Ｔ７ポリメラーゼによって作製し、それらをアニールして、ｄｓＲＮＡ複合体を作製する。この技術でのｄｓＲＮＡ複合体は、上記の合成方法に限定されないが、特異的配列を含有する長い（＞１００ｂｐ）のｄｓＲＮＡ複合体を合成する任意の方法を含み得る。

【0141】

目的の遺伝子を、Ｔ７プロモーターを含有するフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して増幅した。プライマーセット及びそれらの関連する鋳型を、表１で概説する。ＤＮＡ産物を、１０ｎｇの適切な鋳型（表１）、２×ＧＯＴａｑ無色マスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．５μＭのフォワードとリバースの両方のプライマー（表１、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、及び５０μＬの最終体積にするヌクレアーゼを含まない水を使用するＰＣＲにより増幅した。以下のプロトコル：９８℃－５分、９８℃－１０秒、５０℃－１０秒、７２℃－５０秒の３４サイクル、続いて７２℃－５分を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｔ１００サーマルサイクラーで実行した。両方のＤＮＡ鎖上にＴ７プロモーターを有する得られたＤＮＡアンプリコンを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製した生成物を次いで、ｄｓＲＮＡ複合体を生成するために、製造業者の指示に従いＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ ＲＮＡｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）で使用した。プライマー特異性を確認するために、１００ｎｇの全てのＰＣＲアンプリコン及び最終ｄｓＲＮＡ複合体を、１％ ＧｅｌＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）を含有する１％アガロースゲルで分離した。

【0142】

表１：目的遺伝子の増幅のために使用されたＴ７プロモーター配列を有するプライマー。得られたＤＮＡアンプリコンを次いで、ｄｓＲＮＡ複合体合成のために使用した。各プライマーセットに使用される鋳型ＤＮＡもまた、概説する。

【表1】

【0143】

細胞生存率に対するｄｓＲＮＡ曝露の影響
ＴＨＦ（１．０×１０^４細胞／ウェル）、Ｍ１４（１．５×１０^４細胞／ウェル）、ＭＲＣ５（１．５×１０^４細胞／ウェル）、ＳＮＢ７５（１．５×１０^４細胞／ウェル）、ＢＴ５４９（１．５×１０^４細胞／ウェル）を、９６ウェル組織培養プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に播種し、一晩付着させた。細胞を次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ,Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で希釈した様々な濃度（８００、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３ｎｇ／ｍＬ）の７００ｂｐ ｄｓＲＮＡ複合体で処理し、対照ウェルを、ＰＢＳのみに曝露した。１００ｎｇ／ｍＬの濃度のｄｓＲＮＡ複合体で処理した細胞について、細胞あたりのｄｓＲＮＡ複合体分子の数は、５５，８００分子である。各希釈物について、８つの反復ウェルを使用した。３０時間の曝露後に、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで１回洗浄し、その後２つの蛍光細胞生存率色素、アラマーブルー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び５－カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル（ＣＦＤＡ－ＡＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、添加した。アラマーブルーは、ミトコンドリア代謝活性を測定し、ＣＦＤＡ－ＡＭは、細胞膜の完全性を測定する。暗所での１時間のインキュベーション後に、蛍光を、ＢｉｏＴｅｋ ＨＴ Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーを使用して測定した。プレートを、アラマーブルーについては５３０ｎｍの励起と５９０ｎｍの放出、及びＣＦＤＡ－ＡＭについては４８５ｎｍの励起と５２８ｎｍの放出で読み取った。全ての相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、ＰＢＳ対照に正規化し、各細胞型のＲＦＵを、パーセント対照として報告した。記載した６つの細胞株について、この実験手順を、３回繰り返した。結果を、図１Ａ～１Ｆに示す。

【0144】

ｄｓＲＮＡｉ経路によるＶＳＶ－ＧＦＰの阻害
プレートリーダーアッセイにより測定されるＶＳＶ－ＧＦＰ阻害
ＨＥＬ－２９９細胞を、７．５×１０^４細胞／ｍＬの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、単層を、無血清培地中１０００ｎｇ／ｍＬのβ－ラクタマーゼ（ミスマッチ）、又はｅＧＦＰ（一致）配列特異的ｄｓＲＮＡ複合体のいずれかで２時間前処理した。単層をその後、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰ（Ｉｎｄｉａｎａ）に感染させた。ＧＦＰ蛍光を、モック処理細胞の感染が８０％に達したとき（通常、感染後１６～２４時間）に、プレートリーダーにより測定した。全処理試料を、モック処理細胞に対する倍数変化として計算した。この実験を、３回繰り返した。

【0145】

ＴＣＩＤ５０／ｍＬにより測定されるＶＳＶ－ＧＦＰ阻害
ＶＳＶ－ＧＦＰのｄｓＲＮＡｉ阻害に対する異なる曝露時間でのｄｓＲＮＡの影響
Ｍ１４細胞を、７．５×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。一晩の付着の後で、全てのウェル中の培地を、新鮮な培地と交換した。単層を次いで、１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰに感染させる前に、５００ｎｇ／ｍＬのｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）又はｅＧＦＰ（一致）配列特異的ｄｓＲＮＡ複合体（各々７００ｂｐ）のいずれかで５時間、４時間、３時間、２時間、１時間及び０時間処理した。ウイルス感染の２４時間後に、各ウェルからの上清を、収集し、上記のＴＣＩＤ５０アッセイにより滴定した。この実験を、３回繰り返した。結果を、図６に示す。

【0146】

ＶＳＶ－ＧＦＰのｄｓＲＮＡｉ阻害に対するｄｓＲＮＡの長さの影響
ＴＨＦ及びＳＮＢ７５細胞を、５．０×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、全てのウェル中の培地を、新鮮な培地と交換した。単層を次いで、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰを感染させる前に、５００ｎｇ／ｍＬの７００ｂｐ ｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）、７００ｂｐ β－ｌａｃ（ミスマッチ）、７００ｂｐ ｅＧＦＰ（一致）、６００ｂｐ ｅＧＦＰ（一致）、５００ｂｐ ｅＧＦＰ（一致）、４００ｂｐ ｅＧＦＰ（一致）、３００ｂｐ ｅＧＦＰ（一致）又は２００ｂｐ ｅＧＦＰ（一致）のいずれかで２時間処理した。ウイルス感染の２４時間後に、各ウェルからの上清を、収集し、上記のようにＴＣＩＤ５０アッセイにより滴定した。この実験を、２回繰り返した。結果を、図２Ｂ及び２Ｃに示す。

【0147】

ＶＳＶ－ＧＦＰのｄｓＲＮＡｉ阻害に対するウイルス遺伝子をコードするｄｓＲＮＡの影響
ｅＧＦＰはＶＳＶ中に天然には存在しないため、ウイルスのＭタンパク質及びＮタンパク質からのｄｓＲＮＡ複合体をまた用いて、天然ウイルス特異的遺伝子をコードするｄｓＲＮＡ複合体がｄｓＲＮＡｉウイルス阻害をもたらし得るかどうかを試験した。ＴＨＦ及びＳＮＢ７５細胞を、５．０×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、単層を、無血清培地中５００ｎｇ／ｍＬのｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）、β－ラクタマーゼ（ミスマッチ）、Ｍ ＶＳＶ遺伝子（一致）、Ｎ ＶＳＶ遺伝子（一致）、Ｎ ＶＳＶ遺伝子（一致）とＭ ＶＳＶ遺伝子（一致）の混合、ＧＦＰ（一致）配列特異的ｄｓＲＮＡ複合体で２時間前処理した。単層をその後、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰ（Ｉｎｄｉａｎａ）に感染させた。細胞上清を、感染後２４時間の時点で収集し、上記のようにＴＣＩＤ_５０アッセイにより滴定した。結果を、図４Ａ及び４Ｂに示す。

【0148】

ｐＢＥＣ中の配列一致ｄｓＲＮＡによるＶＳＶ及びＨＣｏＶ－２２９Ｅのウイルス阻害
健康なドナーからの初代気管支上皮細胞（ｐＢＥＣ）を、２４ウェルコンパニオンプレート中で１ミクロンのインサートを使用して培養した。ｐＢＥＣを、３日ごとに定期的な培地交換を行いながら、それらが約７．５×１０^４細胞／インサートのコンフルエントに到達するまで増殖させた。コンフルエントになったら（おおよそ３０日）、細胞を、５００ｎｇ／ｍＬのｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）ｄｓＲＮＡ複合体又はＮ ＶＳＶ遺伝子（一致）ｄｓＲＮＡ複合体のいずれかで２時間前処理した。細胞を次いで、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰ（Ｉｎｄｉａｎａ）に感染させた。ウイルス感染の２４時間後に、上清を、上記のように各ウェルから収集し、ＴＣＩＤ_５０アッセイにより滴定した（ｎ＝２）。ｄｓＲＮＡ複合体がまたｐＢＥＣ上でＨＣｏＶ－２２９Ｅを阻害できるかどうかを試験するために、細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）ｄｓＲＮＡ複合体、又はＭ ＨＣｏＶ－２２９Ｅ遺伝子（一致）ｄｓＲＮＡ複合体又はポリＩ：Ｃ（５０μｇ／ｍＬ）のいずれかで２時間前処理した。細胞を次いで、０．１のＭＯＩでＨＣｏＶ－２２９Ｅに感染させた。ウイルス感染の２４時間後に、上清を、上記のように各ウェルから収集し、ＴＣＩＤ_５０により滴定した（ｎ＝３）。結果を、図５Ａ及び５Ｂに示す。

【0149】

長いｄｓＲＮＡ複合体のトランスフェクションがまたｐＢＥＣにおいてウイルス阻害を誘導できるかどうかを決定するために、５００ｎｇ／ｍＬのＨＣｏＶ－２２９Ｅ Ｍタンパク質ｄｓＲＮＡ配列（一致）又はｍＣｈｅｒｒｙ ｄｓＲＮＡ配列（ミスマッチ）のいずれかを、ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬を使用してｐＢＥＣ細胞に直接トランスフェクトした（ｎ＝２）。２４時間のインキュベーション後、トランスフェクト細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ（ＭＯＩ＝０．１）に２４時間感染させた後、上清を、収集し、ＴＣＩＤ_５０の定量に使用した。結果を、図５Ｃに示す。

【0150】

長いｄｓＲＮＡ複合体はノックダウンを誘導するためにトランスフェクションを必要としないが、ｓｉＲＮＡ分子は必要とする
ＴＨＦ及びＳＮＢ７５細胞を、５．０×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、全てのウェル中の培地を、新鮮な培地と交換した。単層を次いで、２ｎＭの７００ｂｐ ｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）ｄｓＲＮＡ複合体、７００ｂｐ ｅＧＦＰ（一致）ｄｓＲＮＡ複合体、又はＧＦＰ ｓｉＲＮＡ（一致、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標））のいずれかで２時間前処理した。細胞を次いで、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰ（Ｉｎｄｉａｎａ）に感染させた。ウイルス感染の２４時間後に、各ウェルからの上清を、上記のように、収集し、ＴＣＩＤ_５０アッセイにより滴定した（ｎ＝６）。結果を、図７Ａ及び図７Ｂに示す。

【0151】

使用したｓｉＲＮＡ分子がノックダウンできるが、細胞に入るためにトランスフェクションを必要とすることを確認するために、ＴＨＦ及びＳＮＢ７５細胞を、５．０×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、全てのウェル中の培地を、新鮮な培地と交換した。ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡと対照ｓｉＲＮＡ（ミスマッチ、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標））の両方を、リポフェクタミンを使用してＴＨＦ及びＳＮＢ７５細胞に直接トランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、トランスフェクト細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＶＳＶ－２２９（ＭＯＩ＝０．１）に２４時間感染させた後、各ウェルからの上清を、収集し、ＴＣＩＤ_５０の定量に使用した。結果を、図７Ｃ及び７Ｄに示す。

【0152】

長いｄｓＲＮＡが誘導するウイルスノックダウンに対する配列の方向の影響
長いｄｓＲＮＡｉが分子の５'末端又は３'末端の選好を有するかどうかを試験するために、分子の５'末端又は３'末端のいずれかに８００ｂｐのｅＧＦＰ配列がある、長さ９００ｂｐの長いｄｓＲＮＡ複合体を、作製した。ＴＨＦ及びＳＮＢ７５細胞を、５．０×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、全てのウェル中の培地を、新鮮な培地と交換した。単層を次いで、５００ｎｇ／ｍＬの５'末端上にＧＦＰを有する９００ｂｐ ｄｓＲＮＡ複合体（５'ＧＦＰ）又は３’末端上にＧＦＰを有する９００ｂｐのｄｓＲＮＡ複合体（３'ＧＦＰ）のいずれかで２時間前処理した。対照として、追加のウェルを、７００ｂｐ ｅＧＦＰ （陽性対照）及び７００ｂｐ ｍＣｈｅｒｒｙ（陰性対照）で２時間処理した。２時間の前処理後に、細胞を、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰ（Ｉｎｄｉａｎａ）に感染させた。ウイルス感染の２４時間後に、各ウェルからの上清を、上記のように、収集し、ＴＣＩＤ_５０アッセイにより滴定した（ｎ＝６）。結果を、図８Ａ及び図８Ｂに示す。

【0153】

ＩＦＮ誘導性発光に対する配列一致ｄｓＲＮＡの影響
所望のｄｓＲＮＡ複合体の用量がＩＦＮ応答を刺激しそれによりルシフェラーゼ生成をもたらすかどうかを決定するために、ＲＴＧ－Ｐ１ニジマス性腺細胞を、２．５×１０^５細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、単層を、２４時間様々な濃度（１～２５ｎｇ／ｍＬ）で、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、一致）又はｅＧＦＰ（ミスマッチ）のいずれかをコードする７００ｂｐのｄｓＲＮＡ複合体で処理した。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、化学発光を、ＢｉｏＴｅｋ ＨＴ Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーにて測定した。いかなるルシフェラーゼ活性もＩＦＮ経路の刺激を示す。結果を、図９Ａに示す。

【0154】

上述の用量のｄｓＲＮＡ複合体を次いで使用して、それらが、ポリＩＣ（強力なＩＦＮ誘導剤）で刺激したときにＩＦＮにより誘導されるルシフェラーゼ生成を抑制できるかどうかを明らかにした。ＲＴＧ－Ｐ１細胞を、上記のように播種した。一晩の付着の後で、単層を１、１０及び２５ｎｇ／ｍＬのＬｕｃ（一致）又はｅＧＦＰ（ミスマッチ）のいずれかのｄｓＲＮＡ複合体で４時間処理した後、３２ｎｇ／ｍＬのポリＩＣで処理して、ルシフェラーゼ生成を刺激した。ポリＩＣへの曝露後２４時間の時点で、ルシフェラーゼ生成を、上記のように測定した。結果を、図９Ｂに示す。

【0155】

配列一致ｄｓＲＮＡを使用するＲＴＧ－２における水生ウイルス病原体ＣＳＶの阻害
ＲＴＧ－２ニジマス細胞を、２．５×１０^５細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、単層を、無血清培地中で１ｎｇ／ｍＬのｅＧＦＰ（ミスマッチ）、ＣＳＶセグメント７（一致）、又はＣＳＶセグメント１０（一致）のｄｓＲＮＡ複合体で４時間前処理した。全てのｄｓＲＮＡ複合体は、長さが７００ｂｐであった。単層をその後、１のＭＯＩで４時間ＣＳＶに感染させ、次いで、２％ＦＢＳ培地と交換した。細胞上清を、感染後７日目に収集し、ＴＣＩＤ_５０アッセイにより滴定した（ｎ＝４）。結果を、図１０に示す。

【0156】

ｄｓＲＮＡへの曝露の後のＩＳＧの転写物レベルの評価
ＩＦＮ経路が選択した用量のｄｓＲＮＡ複合体によって刺激されていないことを確認するために、ＩＳＧの転写レベルを、曝露後に分析した。ＨＥＬ－２９９細胞を、７．５×１０^４細胞／ｍＬの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、単層を、無血清培地中で５００、１０００又は１５００ｎｇ／ｍＬのｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）又はｅＧＦＰ（一致）配列特異的ｄｓＲＮＡ複合体、又はポリＩＣ（５００ｎｇ／ｍＬ）で２時間前処理した。処理後２４時間の時点で、総ＲＮＡを、製造業者の指示に従いＴＲＩｚｏｌ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により試験ウェルから抽出した。混入ゲノムＤＮＡを除去するために、ＲＮＡ試料を、製造業者により概説されるように、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＤＮａｓｅ処理した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、製造業者の指示に従いｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成Ｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して５００ｎｇの全ＲＮＡから合成した。β－アクチン、ＣＸＣＬ１０及びＩＳＧ１５の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。ＩＳＧ１５及びＣＸＣＬ１０発現を、β－アクチンに正規化した。結果を、図３Ａ及び３Ｂに示す。

【0157】

観察されるノックダウンがＲＮＡｉを介するということの確認
ＨＥＬ－２９９細胞を、１．５×１０^４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、細胞を、１２．５μＭアウリントリカルボン酸（ＤＩＣＥＲ阻害剤）の存在下又は非存在下で無血清培地中５００ｎｇ／ｍＬのｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）、又はｅＧＦＰ（一致）配列特異的ｄｓＲＮＡ複合体のいずれかで２時間前処理した。ウェルを次いで、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰ（Ｉｎｄｉａｎａ）に感染させた。感染の２４時間後に、プレートを、蛍光顕微鏡により可視化した。結果を、図１１に示す。

【0158】

ウイルス阻害を誘導するための、合成されたｄｓＲＮＡ複合体組合せの使用
１を超える単一のＶＳＶウイルス遺伝子を含有するｄｓＲＮＡ複合体を合成するために、異なる標的配列を含有する７００ｂｐのｄｓＲＮＡ複合体を生成するために使用された３つのｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡ鋳型を、生成した。生成された第１の分子は、５’Ｎ－３’Ｍであり、最初の３５０ｂｐが、Ｎ ＶＳＶ遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１５２１３．１）であり、最後の３５０ｂｐが、Ｍ ＶＳＶ遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０４４５２．１）であった。生成された第２の分子は、５’Ｍ－３’Ｎであり、最初の３５０ｂｐが、Ｍ ＶＳＶ遺伝子配列であり、最後の３５０ｂｐが、Ｎ ＶＳＶ遺伝子配列であった。第３の分子は、Ｎ－Ｍ Ａｌｔと呼ばれ、７００ｂｐ ｄｓＲＮＡ配列全体に各遺伝子の５０ｂｐストレッチを交互（最初にＮ、次いでＭなど）に含有した。これらの分子の代表的な画像を、図１２Ａに示す。ｄｓＲＮＡ複合体配列を、以下の表２に示す。ｄｓＲＮＡ複合体配列はＤＮＡとして表されるが、チミジン（Ｔ）は、配列中でウラシル（Ｕ）に置き換えられることが理解されるであろう。

【0159】

表２：複数の一致配列を含むｄｓＲＮＡ複合体

【表2】

【0160】

ＴＨＦ細胞を、５．０×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩の付着の後で、全てのウェル中の培地を、新鮮な培地と交換した。単層を次いで、５００ｎｇ／ｍＬ又は１０００ｎｇ／ｍＬの７００ｂｐ ｍＣｈｅｒｒｙ（ミスマッチ）、７００ｂｐ ５’Ｎ－３’Ｍ（一致）、７００ｂｐ ５’Ｍ－３’Ｎ（一致）、又は７００ｂｐのＮ－Ｍ Ａｌｔ ｄｓＲＮＡ複合体のいずれかで２時間前処理した。細胞を次いで、０．１のＭＯＩでＶＳＶ－ＧＦＰに感染させた。ウイルス感染の２４時間後に、各ウェルからの上清を、上記のように収集し、ＴＣＩＤ_５０アッセイにより滴定した（ｎ＝３）。結果を、図１２Ｂ及び１２Ｃに示す。

【0161】

結果
ｄｓＲＮＡ配列はＩＦＮ生成レベルに影響を与えず、したがって、センス及びアンチセンスＲＮＡ分子を構成する配列は、ＲＮＡｉによりシャットダウンされる必要があるものをみなコードできることが見出された。これは、宿主配列と非宿主配列の両方を含んでよい。ＲＮＡｉ対ＩＦＮに対するｄｓＲＮＡ媒介応答を促すために、少なくとも約１００ｂｐのｄｓＲＮＡ複合体を、使用する。エンドソーム及び細胞質中のＤｓＲＮＡ複合体は、ＩＦＮを誘導する。細胞質中のＤｓＲＮＡ複合体は、ダイサーにより切断され、ＲＮＡｉ用のＲＩＳＣに積み込まれる。

【0162】

長いｄｓＲＮＡは、７００塩基対の長いｄｓＲＮＡ複合体で処理した正常細胞株又は癌細胞株の生存率を評価すると、生存期間は治療により悪影響を受けなかったことを考慮すると、毒性でないが、より高い濃度のｄｓＲＮＡが、代謝活性を増強した（図１Ａ～Ｆ）。４００、５００及び６００塩基対のｄｓＲＮＡ複合体もまた、一致した配列（ＧＦＰ）を使用した場合にＶＳＶ－ＧＦＰを制限するのに有効であり、異なる長さのｄｓＲＮＡ複合体が正常（ＴＨＦ）細胞株と癌（ＳＮＢ７５）細胞株の両方においてＲＮＡｉへと進むことができることを示す（図２Ａ～２Ｃ）。

【0163】

ポリＩ：Ｃ（５００ｎｇ／ｍｌ）での処理はインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の顕著な発現をもたらした一方で、ＨＥＬ－２９９細胞において最大で１５００ｎｇ／ｍｌの、一致する又はミスマッチのｄｓＲＮＡ複合体での処理は、ベースラインを超えるＩＳＧの誘導をもたらさず、ｄｓＲＮＡｉがＩＳＧ又はＩ型インターフェロンを誘導しない用量で生じ得ることを実証した（図３Ａ、３Ｂ及び３Ｄ～３Ｇ）。一致する配列（ＧＦＰ、Ｎ又はＭ）を含有するｄｓＲＮＡ複合体は、ウイルス力価を低下させなかった対照のミスマッチ配列（ｍＣｈｅｒｒｙ、ベータｌａｃ）と比較してウイルス力価を低下させ、ｄｓＲＮＡｉはＧＦＰ以外のウイルス遺伝子をノックダウンできることを実証した（図４Ａ～４Ｃ）。ｄｓＲＮＡｉは、分極し、分化したヒト気道上皮細胞であるヒト初代気管支上皮細胞（ｐＢＥＣ）においてウイルスをノックダウンできる。抗ウイルス保護は、ラブドウイルス（ＶＳＶ）とコロナウイルス（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）の両方で、ポリＩＣ（ＩＦＮ誘導剤）と同等である（図５Ａ～５Ｃ）。ｄｓＲＮＡｉは、ウイルス感染前又はウイルス感染中に導入されると、ウイルスをノックダウンできる（図６）。

【0164】

図７Ａ～７Ｄに示されるように、ＧＦＰ－ｄｓＲＮＡ複合体はトランスフェクションを必要とせずに細胞に入ることができるが、ＧＦＰ－ｓｉＲＮＡはノックダウンを媒介するためにトランスフェクションを必要とする。ＶＳＶ－ＧＦＰのノックダウンは、正常細胞株と癌細胞株の両方においてトランスフェクション試薬を使用しないＧＦＰ ｄｓＲＮＡ複合体投与とＧＦＰ－ｓｉＲＮＡトランスフェクションの間で同等である。

【0165】

図８Ａ及び８Ｂに示すように、長い（７００ｂｐ）ｄｓＲＮＡｉは、一致配列がｄｓＲＮＡ複合体の３'末端にあろうと又は５'末端にあろうとウイルス阻害を誘導する。ある細胞型、例えばＳＮＶ７５では、ｄｓＲＮＡ複合体の３'末端の一致配列が好ましい場合がある。ｄｓＲＮＡｉノックダウンがＲＮＡｉ経路を介することも、実証された（図１１）。複数の一致配列を含有する７００ｂｐのｄｓＲＮＡ複合体がウイルス増殖を効果的に阻害することが、さらに見出された（図１２Ａ及び１２Ｂ）。

【0166】

本明細書に記載のｄｓＲＮＡ複合体を使用するノックダウンは、魚の細胞においても観察された。図９Ａ及び９Ｂに示されるように、魚の細胞では、ｄｓＲＮＡｉは、低レベルのＩＦＮの存在下であっても、誘導可能な内因性転写物をノックダウンできる。７００ｂｐ ｄｓＲＮＡ複合体の１ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬの用量は、ルシフェラーゼの配列依存性ノックダウンを示す一方で、２５ｎｇ／ｍＬは傾向を示すが統計的に有意でなく、ｄｓＲＮＡｉ効果はＩＦＮ生成が増加すると減少することを示唆する。図１０に示すように、一致したｄｓＲＮＡ複合体（ＣＳＶ ｓｅｇ７－ｄｓＲＮＡ及びＣＳＶ ｓｅｇ１０－ｄｓＲＮＡ）は、ＲＴＧ－２細胞においてウイルス力価を実質的にノックダウンするが、ミスマッチ配列（ＧＦＰ ｄｓＲＮＡ）は、ノックダウンしなかった。ノックダウンは、ヒト細胞において観察される程度よりも魚の細胞において大きいことが見出された。
参考文献

【表3】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【手続補正書】

【提出日】2023-01-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2023527935000001.app

【国際調査報告】