特表 2023-528049 形質移入デバイス及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-03

(54)【発明の名称】形質移入デバイス及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/87 20060101AFI20230626BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230626BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230626BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230626BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 15/02 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 25/20 20060101ALI20230626BHJP

【ＦＩ】

C12N15/87 Z

C12M1/00 A

C12M1/34 D

C12N5/10

C12N5/0783

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/55

C12N15/54

A61K35/17

A61P7/06

A61P37/02

A61P7/04

A61P21/04

A61P3/06

A61P43/00 105

A61P27/02

A61P13/02

A61P17/00

A61P25/14

A61P25/00

A61P7/00

A61P15/00

A61P35/00

A61P9/00

A61P3/10

A61P25/18

A61P25/28

A61P25/16

A61P19/00

A61P13/12

A61P1/16 101

A61P1/04

A61P7/02

A61P29/00

A61P35/02

A61P1/00

A61P1/16

A61P1/18

A61P13/08

A61P13/10

A61P15/02

A61P1/02

A61P11/02

A61P31/12

A61P31/04

A61P33/00

A61P31/18

A61P33/06

A61P31/22

A61P25/08

A61P25/20

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022573657

(86)(22)【出願日】2021-05-26

(85)【翻訳文提出日】2023-01-27

(86)【国際出願番号】 US2021034251

(87)【国際公開番号】W WO2021242857

(87)【国際公開日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】63/030,025

(32)【優先日】2020-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522464311

【氏名又は名称】トランスサイトス，リミテッド ライアビリティ カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＴＲＡＮＳＣＹＴＯＳ， ＬＬＣ

【住所又は居所原語表記】２１ Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓｕｉｔｅ ２， Ｓｔｕｒｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０１５６６，Ｕ．Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100169904

【弁理士】

【氏名又は名称】村井 康司

(74)【代理人】

【識別番号】100130443

【弁理士】

【氏名又は名称】遠藤 真治

(72)【発明者】

【氏名】オットー ジェイ． プロハスカ

(72)【発明者】

【氏名】ライナー ファッシング

(72)【発明者】

【氏名】フィティ アイ． オルジャイトゥグ

(72)【発明者】

【氏名】テレサ エル． オケーフェ

(72)【発明者】

【氏名】スリニヴァス シャンカラ

(72)【発明者】

【氏名】アルムガム ラグナタン

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド ボノー

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B029AA23

4B029BB11

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA04

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA02

4C087ZA03

4C087ZA05

4C087ZA06

4C087ZA07

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZA18

4C087ZA33

4C087ZA36

4C087ZA51

4C087ZA53

4C087ZA54

4C087ZA55

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZA68

4C087ZA75

4C087ZA76

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZA94

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB11

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZB37

4C087ZB38

4C087ZC33

4C087ZC35

4C087ZC55

(57)【要約】

本明細書に開示されるのは、分子又は組成物を細胞又は細胞様体に導入する方法、組立体、システム、キット、及びデバイスである。溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する組立体は、その基端部において第１の内径又は断面積を有し、遠端部と基端部との間に延在する内壁及び外壁を有する剛性容器と、基端部において容器に挿入可能なプランジャと、遠端部近傍の内壁のみの少なくとも１つの狭窄部又は遠端部近傍の内壁及び外壁の少なくとも１つの狭窄部とを備え、少なくとも１つの狭窄部は、容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有し、プランジャは容器に沿って軸方向に移動可能である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する組立体であって、
その基端部において第１の内径又は断面積を有し、遠端部と基端部との間に延在する内壁及び外壁を有する剛性容器と、
前記基端部において前記容器に挿入可能なプランジャと、
前記遠端部近傍の前記内壁のみの少なくとも１つの狭窄部又は前記遠端部近傍の前記内壁及び前記外壁の少なくとも１つの狭窄部と、
を備え、
前記少なくとも１つの狭窄部は、前記容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有し、前記プランジャは前記容器に沿って軸方向に移動可能である、組立体。

【請求項2】

前記容器は、前記容器の内壁から突出するリップルを含む、請求項１に記載の組立体。

【請求項3】

前記狭窄部は、前記細胞又は前記細胞様体の直径の１．２倍～１００倍の直径を有する、請求項１に記載の組立体。

【請求項4】

前記狭窄部は、前記細胞又は前記細胞様体の直径の２倍～１０倍の直径を有する、請求項１に記載の組立体。

【請求項5】

前記プランジャは、遠端部及び基端部を有するロッドを備え、前記プランジャの前記遠端部は円錐形又は円柱形先端部を備え、前記プランジャの前記基端部は、前記プランジャを電動アームに取り付けるように構成される、請求項１に記載の組立体。

【請求項6】

前記容器の内壁の平均粗度は１０ｎｍ～１μｍである、請求項１に記載の組立体。

【請求項7】

前記粗度は、細胞断片を前記容器の前記内壁に吸収させることによって作成される、請求項６に記載の組立体。

【請求項8】

前記容器は複数の狭窄部を備える、請求項１に記載の組立体。

【請求項9】

前記狭窄部は、長さ０．２～１０ｍｍを有する流路を形成する、請求項１に記載の組立体。

【請求項10】

前記容器は、複数の狭窄部を備えた着脱可能なインサートを備える、請求項１に記載の組立体。

【請求項11】

前記複数の狭窄部は、同じ内径若しくは断面積、異なる内径若しくは断面積、又はそれらの組合せを有する、請求項８に記載の組立体。

【請求項12】

前記複数の凶作部は、同じ内径もしくは断面積、異なる内径もしくは断面積、またはそれらの組み合わせを有する、請求項１０に記載の組立体。

【請求項13】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する組立体であって、
遠端部と基端部との間に延在する内壁及び外壁を有する剛性容器であって、前記外壁及び前記内壁は、前記遠端部と前記基端部との間の前記容器の前記中央部分において狭まって狭窄部を形成する、剛性容器と、
前記基端部近傍において前記容器に移動可能に配置されたプランジャと、
前記細胞又は前記細胞様体の直径の１．２倍～１００倍の直径を有する前記狭窄部と、
を備えた、組立体。

【請求項14】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する組立体であって、
第１の内径又は断面積、第１の端部、及び第２の端部を有する可撓性容器と、
前記可撓性容器の少なくとも１つの断面を圧縮することによって形成される少なくとも１つの狭窄部と、
前記第１若しくは第２の端部の少なくとも一方に位置決めされた着脱可能なプランジャ又は前記第１の端部及び前記第２の端部の各々に位置決めされた着脱可能なプランジャと、
を備え、
前記少なくとも１つの狭窄部は、前記容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する、組立体。

【請求項15】

前記狭窄部は、前記細胞又は前記細胞様体の直径の１．２倍～１００倍の直径を有する、請求項１４に記載の組立体。

【請求項16】

前記プランジャは、前記容器に沿って軸方向に移動可能である、請求項１４に記載の組立体。

【請求項17】

前記少なくとも１つの狭窄セクションは、少なくとも１つの可動式ウェッジ又は少なくとも１つの可動式ローラによって形成される、請求項１４に記載の組立体。

【請求項18】

前記容器は複数の狭窄部を備える、請求項１４に記載の組立体。

【請求項19】

前記容器は、複数の狭窄部を備えた着脱可能なインサートを備える、請求項１４に記載の組立体。

【請求項20】

前記複数の狭窄部は、同じ内径若しくは断面積、異なる内径若しくは断面積、又はそれらの組合せを有する、請求項１８に記載の組立体。

【請求項21】

前記複数の狭窄部は、同じ内径若しくは断面積、異なる内径若しくは断面積、又はそれらの組合せを有する、請求項１９に記載の組立体。

【請求項22】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する組立体であって、
第１の内径又は断面積、第１の端部、及び第２の端部を有する可撓性容器と、
前記容器を圧縮して狭窄部を形成する、前記容器に沿って移動可能な少なくとも１つの移動可能なウェッジと、
前記容器の前記第１の端部及び前記第２の端部に固定された静止キャップと、
を備え、
前記少なくとも１つの狭窄部は、前記容器の前記第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する、組立体。

【請求項23】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するマイクロ流体デバイスであって、
第１の内径又は断面積を有する少なくとも１つのチャネルと、
前記チャネルと連続した少なくとも１つの狭窄セクションと、
少なくとも部分的に前記チャネルに入るように構成された少なくとも１つの構造と、
を備え、
前記少なくとも１つの狭窄セクションは、前記チャネルの第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有し、前記狭窄部は、前記細胞又は前記細胞様体の直径の１．２倍～１００倍の直径を有する、マイクロ流体デバイス。

【請求項24】

前記少なくとも１つの構造は、プランジャ又は可撓性シートである、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項25】

前記デバイスは複数のチャネルを備え、前記チャネルの各々は狭窄部又は複数の狭窄部を備える、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項26】

前記複数の狭窄部は、同じ内径若しくは断面積、異なる内径若しくは断面積、又はそれらの組合せを有する、請求項２５に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項27】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するシステムであって、
モータに取り付けられた少なくとも１つのアームを備えた器具であって、前記モータは前記少なくとも１つのアームを軸方向に移動させるように構成される、器具と、
少なくとも１つの、請求項１に記載の組立体と、
を備えた、システム。

【請求項28】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するシステムであって、
モータに取り付けられた少なくとも１つのアームを備えた器具であって、前記モータは前記少なくとも１つのアームを軸方向に移動させるように構成される、器具と、
少なくとも１つの、請求項１４に記載の組立体と、
を備えた、システム。

【請求項29】

前記システムは、複数の、請求項１に記載の組立体を備える、請求項２７に記載のシステム。

【請求項30】

前記システムは、複数の、請求項１４に記載の組立体を備える、請求項２８に記載のシステム。

【請求項31】

前記プランジャは前記アームに取り付けられる、請求項２７に記載のシステム。

【請求項32】

複数のプランジャは、前記アーム又は複数のアームに取り付けられる、請求項２９に記載のシステム。

【請求項33】

前記少なくとも１つの狭窄セクションは、少なくとも１つの可動式ウェッジ又は少なくとも１つの可動式ローラによって形成され、前記可動式ウェッジ又は前記可動式ローラは少なくとも１つのアームに取り付けられる、請求項２７に記載のシステム。

【請求項34】

前記少なくとも１つの狭窄セクションは、複数の可動式ウェッジ又は複数の可動式ローラによって形成され、前記複数の可動式ウェッジ又は前記複数の可動式ローラは、前記アーム又は複数のアームに取り付けられる、請求項２９に記載のシステム。

【請求項35】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するシステムであって、
モータに取り付けられた少なくとも１つのアームを備えた器具であって、前記モータは前記少なくとも１つのアームを軸方向に移動させるように構成される、器具と、
前記構造は前記アームに取り付けられたプランジャである、少なくとも１つの、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイスと、
を備えた、システム。

【請求項36】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するシステムであって、
少なくとも１つの圧電積層を備えた器具と、
前記構造は前記圧電積層と接触する可撓性シートである、少なくとも１つの、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイスと、
を備えた、システム。

【請求項37】

少なくとも１つの光学センサを更に備える請求項２７に記載のシステム。

【請求項38】

少なくとも１つの光学センサを更に備える請求項２９に記載のシステム。

【請求項39】

少なくとも１つの光学センサを更に備える請求項３５に記載のシステム。

【請求項40】

少なくとも１つの光学センサを更に備える請求項３６に記載のシステム。

【請求項41】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するキットであって、
少なくとも１つの、請求項１に記載の組立体と、
前記容器内に含まれる少なくとも１つの形質移入溶液及び／又は別個のバイアル内の少なくとも１つの形質移入溶液と、
を備えた、キット。

【請求項42】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するキットであって、
少なくとも１つの、請求項１４に記載の組立体と、
前記容器内に含まれる少なくとも１つの形質移入溶液及び／又は別個のバイアル内の少なくとも１つの形質移入溶液と、
を備えた、キット。

【請求項43】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するキットであって、
少なくとも１つの、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイスと、
前記少なくとも１つのチャネル内に含まれる少なくとも１つの形質移入溶液及び／又は別個のバイアル内の少なくとも１つの形質移入溶液と、
を備えた、キット。

【請求項44】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する方法であって、
ａ）細胞又は細胞様体及び形質移入材料を含み、少なくとも１つの可動構造と接触している溶液を提供することと、
ｂ）前記可動構造を移動させることにより、前記細胞又は前記細胞様体の直径の１．２倍～１００倍の直径を有する少なくとも１つの狭窄部に少なくとも１回、前記溶液を通すことと、
を含む、方法。

【請求項45】

前記試料溶液はガス材料又は固体材料を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記可動構造は、剛性容器に挿入可能であり、前記容器に沿って軸方向に移動可能なプランジャである、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

前記可動構造は、少なくとも１つの可動式ウェッジ又はローラによって圧縮可能な可撓性容器である、請求項４４に記載の方法。

【請求項48】

前記可動式ウェッジ又はローラの形状、サイズ、及び位置の少なくとも１つは、前記狭窄部の前記サイズを調整するように選択される、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

前記可動構造は、マイクロ流体デバイスのチャネルに少なくとも部分的に挿入可能なプランジャである、請求項４４に記載の方法。

【請求項50】

前記可動構造は、マイクロ流体デバイスのチャネルに少なくとも部分的に挿入可能な可撓性シートである、請求項４４に記載の方法。

【請求項51】

前記溶液は、２回以上、前記少なくとも１つの狭窄部を通る、請求項４４に記載の方法。

【請求項52】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する方法であって、
ａ）細胞又は細胞様体及び形質移入材料を含む溶液を提供することと、
ｂ）請求項１に記載の組立体による少なくとも１つの剛性容器に前記溶液を装填することであって、前記溶液は前記プランジャと接触する、前記装填することと、
ｃ）前記プランジャを前記容器内で軸方向に移動させて、前記溶液を少なくとも１回、前記少なくとも１つの狭窄部に通すことと、
を含む、方法。

【請求項53】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する方法であって、
ａ）細胞又は細胞様体及び形質移入材料を含む溶液を提供することと、
ｂ）請求項１４に記載の組立体による少なくとも１つの可撓性容器に前記溶液を装填することであって、前記溶液は前記可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、
ｃ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを前記容器に沿って軸方向に移動させて、前記試料溶液を少なくとも１回、前記少なくとも１つの狭窄部に通すことと、
を含む、方法。

【請求項54】

溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する方法であって、
ａ）細胞又は細胞様体及び形質移入材料を含む溶液を提供することと、
ｂ）少なくとも１つの、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイスに前記溶液を装填することであって、前記溶液は前記構造と接触する、前記装填することと、
ｃ）前記少なくとも１つのチャネル内で前記構造を移動させて、前記溶液を少なくとも１回、前記少なくとも１つの狭窄部に通すことと、
を含む、方法。

【請求項55】

前記形質移入材料は、遺伝材料、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、無機化合物、合成ポリマー、薬物、医薬組成物、又はそれらの混合物を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項56】

前記遺伝材料は、抗体、抗体断片、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクターを含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記形質移入材料は、ＣＲＩＳＰＲ構成要素、ＴＡＬＥＮタンパク質、ＺＦＮタンパク質、メガヌクレアーゼ、又はＣｒｅリコンビナーゼを含む遺伝子編集成分を含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

前記細胞は、原核細胞、真核細胞、又は細胞様体を含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記原核細胞は、細菌、シアノバクテリア、又は古細菌である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記真核細胞は、動物細胞、植物細胞、原生生物、酵母、又は真菌である、請求項５８に記載の方法。

【請求項61】

前記細胞様体は、エクソソーム、小胞、細胞小器官、膜結合細胞内小胞、細胞由来若しくは合成由来膜結合小胞、又は細胞由来若しくは合成由来細胞内小胞である、請求項５８に記載の方法。

【請求項62】

前記真核細胞は、上皮細胞、造血細胞、幹細胞、脾臓細胞、腎細胞、膵細胞、肝細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞、心臓細胞、肺細胞、眼細胞、骨髄細胞、配偶子、胎児臍帯血細胞、前駆細胞、腫瘍細胞、末梢血単核球、及び免疫細胞からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。

【請求項63】

前記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、白血球、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、顆粒球、自然リンパ球、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、及び好中球からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記免疫細胞はヒトＴ細胞である、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

感染因子から対象を保護する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、前記感染因子又は前記感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）請求項１に記載の組立体による少なくとも１つの剛性容器に前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記プランジャと接触する、前記装填することと、
ｄ）前記プランジャを前記容器内で軸方向に移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通して、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
ｅ）前記形質移入された細胞又は細胞様体を前記対象に投与することと、
を含む、方法。

【請求項66】

感染因子から対象を保護する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、前記感染因子又は前記感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）請求項１４に記載の組立体による少なくとも１つの可撓性容器に前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、
ｄ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを前記容器に沿って軸方向に移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通し、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
ｅ）前記形質移入された細胞又は細胞様体を前記対象に投与することと、
を含む、方法。

【請求項67】

感染因子から対象を保護する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、前記感染因子又は前記感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）少なくとも１つの、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイスに前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記構造と接触する、前記装填することと、
ｄ）前記構造を前記少なくとも１つのチャネル内で移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通し、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
ｅ）前記形質移入された細胞又は細胞様体を前記対象に投与することと、
を含む、方法。

【請求項68】

感染因子又は前記感染因子によって産生される有毒物質によって生じる感染を防ぐに当たり使用される細胞又は細胞様体を調製する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、前記感染因子又は前記感染因子によって産生される前記有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）請求項１、１４、又は２３の何れか一項に記載の組立体による少なくとも１つの剛性容器に前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記プランジャと接触する、前記装填することと、
ｄ）前記プランジャを前記容器内で軸方向に移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通して、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
を含み、
それにより、感染因子又は前記感染因子によって産生される有毒物質によって生じる感染を防ぐに当たり使用される細胞又は細胞様体を調製する、
方法。

【請求項69】

感染因子から対象を保護する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、前記感染因子又は前記感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）少なくとも１つの、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイスに前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記構造と接触する、前記装填することと、
ｄ）前記構造を前記少なくとも１つのチャネル内で移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通し、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
を含み、
前記対象に前記形質移入した細胞又は細胞様体が投与される、
方法。

【請求項70】

哺乳類から細胞を単離するステップを更に含む請求項６５～６９の何れか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすステップを更に含む請求項６５～７０の何れか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記感染因子は細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、又はプリオンである、請求項６５～７０の何れか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記有毒物質は毒素又はアレルゲンである、請求項６５～７０の何れか一項に記載の方法。

【請求項74】

ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法であって、
ａ）自己Ｔ細胞又は同種Ｔ細胞を提供することと、
ｂ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液と前記Ｔ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）請求項１に記載の組立体による少なくとも１つの剛性容器に前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記プランジャと接触する、前記装填することと、
ｄ）前記プランジャを前記容器内で軸方向に移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通して、前記Ｔ細胞に形質移入することと、
を含む、方法。

【請求項75】

ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法であって、
ａ）自己Ｔ細胞又は同種Ｔ細胞を提供することと、
ｂ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液と前記Ｔ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）請求項１４に記載の組立体による少なくとも１つの可撓性容器に前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、
ｄ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを前記容器に沿って軸方向に移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通し、前記Ｔ細胞に形質移入することと、
を含む、方法。

【請求項76】

ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法であって、
ａ）自己Ｔ細胞又は同種Ｔ細胞を提供することと、
ｂ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液と前記Ｔ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）少なくとも１つの、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイスに前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記構造と接触する、前記装填することと、
ｄ）前記構造を前記少なくとも１つのチャネル内で移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通し、前記Ｔ細胞に形質移入することと、
を含む、方法。

【請求項77】

疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液とＴ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）少なくとも１つの、請求項１、１４、又は２３の何れか一項に記載のマイクロ流体デバイスに前記試料溶液を装填することであって、前記試料は構造と接触する、前記装填することと、
ｄ）前記構造を前記少なくとも１つのチャネル内で移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通して、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
ｅ）前記形質移入された細胞又は細胞様体を前記対象に投与することと、
を含む、方法。

【請求項78】

疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液とＴ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）少なくとも１つの、請求項１、１４、又は２３の何れか一項に記載のマイクロ流体デバイスに前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記構造と接触する、前記装填することと、
ｄ）前記構造を前記少なくとも１つのチャネル内で移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を少なくとも１つの狭窄部に通して、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
ｅ）前記対象に、前記形質移入された細胞又は細胞様体が投与されることと、
を含む、方法。

【請求項79】

哺乳類から細胞を単離するステップを更に含む請求項７４～７８の何れか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記疾患又は障害は、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ／Ｘ－ＳＣＩＤ）、嚢胞性繊維症、血友病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、家族性高脂血症、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肉芽腫、ファンコニー貧血、ゴーシェ病、レーバー先天性黒内障、フェニルケトン尿症、地中海貧血症、眼皮膚白皮症、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、低リン血症性くる病、レット症候群、非閉塞性精子産生不全、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ失調症、脊髄小脳失調症、ファン・デル・ウンデ症候群、がん、心疾患、糖尿病、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、２２ｑ１１．２欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、色盲、ネコ鳴き症候群、ダウン症、血色素症、クラインフェルター症候群、プラダー・ウィリー症候群、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス病及びターナー症候群、１ｐ３６欠失症候群、１８ｐ欠失症候群、２１水酸化酵素欠損症、２２ｑ１１．２欠失症候群、α１アンチトリプシン欠損症、ＡＡＡ症候群（アカラシア・アジソン病・無涙症候群）、アースコグ・スコット症候群、ＡＢＣＤ症候群、無セルロプラスミン血症、無手足症、軟骨無発生症２型、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アラジール症候群、ＡＤＵＬＴ症候群、エカルディ・グティエール症候群、白化症、アレキサンダー病、アルカプトン尿症、アルポート症候群、小児交互性片麻痺、筋萎縮性側索硬化症－前頭側頭型認知症、アルストローム症候群、アルツハイマー病、遺伝性エナメル質形成不全症、アミノレブリン酸脱水酵素欠損ポルフィリン症、アンドロゲン不応症、アンジェルマン症候群、アペール症候群、関節拘縮・腎機能不全・胆汁うっ滞症候群、毛細血管拡張性運動失調症、アクセンフェルト症候群、ベーレ・スティーブンソン脳回状頭皮症候群、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、ベンジャミン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、ブヨルンスタッド症候群、ブルーム症候群、バート・ホッグ・デュベ症候群、ブロディーミオパシー、ブルンナー症候群、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、ＣＡＲＡＳＩＬ症候群、慢性肉芽腫、屈曲肢異形成症、カナバン病、カーペンター症候群、大脳形成異常・神経障害・魚鱗癬・角皮症症候群（ＳＥＤＮＩＫ）、嚢胞性繊維症、シャルコ・マリ・ツース病、ＣＨＡＲＧＥ症候群、チェディアック・東症候群、鎖骨頭蓋異骨症、コケイン症候群、コフィン・ローリー症候群、コーエン症候群、コラーゲン異常症（２型及び１１型）、色盲、先天性無痛無汗症（ＣＩＰＡ）、先天性筋ジストロフィー、コルネリア・デ・ランゲ症候群（ＣＤＬＳ）、カウデン病、ＣＰＯ欠損症（コプロポルフィリン症）、頭蓋・水晶体・縫合異形成症、ネコ鳴き症候群、クローン病、クルーゾン症候群、クルーゾン皮膚骨格症候群（黒色表皮腫を伴うクルーゾン症候群）、ダリエー病、デント病（遺伝性高カルシウム尿症）、デニス・ドラッシュ症候群、ド・グルーシー症候群、ダウン症、ディジョージ症候群、遠位型遺伝性運動性ニューロパチー、遠位型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ドラベ症候群、エドワーズ症候群、エーラス・ダンロス症候群、エメリー・ドレイフス症候群、表皮水疱症、骨髄性プロトポルフィリン症、ファンコニー貧血（ＦＡ）、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、致死性家族性不眠症、家族性大腸腺腫症、家族性自律神経失調症、家族性クロイツフェルトヤコブ病、ファインゴールド症候群、ＦＧ症候群、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、Ｇ６ＰＤ欠乏症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ギレスピー症候群、グルタル酸尿症（１型及び２型）、ＧＲＡＣＩＬＥ症候群、慢性肉芽腫、グリシェリ症候群、ヘイリー・ヘイリー病、道化師様魚鱗癬、遺伝性ヘモクロマトーシス、血友病、骨髄肝性ポルフィリン症、遺伝性コプロポルフィリン症、遺伝性出血性末梢血管拡張症（オスラー・ウェーバー・レンドゥ症候群）、遺伝性封入体ミオパチー、遺伝性多発性外骨腫症、遺伝性痙性対まひ（乳児期発症上行性遺伝性痙性対麻痺）、ヘルマンスキー・パドラック症候群、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）、内臓転位、ホモシスチン尿症、ハンチントン病、ハンター症候群、ハーラー症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、家族性高コレステロール血症、高リジン血症、原発性高シュウ酸尿症、高フェニルアラニン血症、低αリポ蛋白血症（タンジール病）、軟骨低発生症、軟骨低形成症、低リン血症性くる病、免疫不全・セントロメア不安定・顔面異常症候群（ＩＣＦ症候群）、色素失調症、坐骨膝蓋骨異形成症、アイソダイセントリック（Ｉｓｏｄｉｃｅｎｔｒｉｃ）１５、ジャクソン・ワイス症候群、ジュベール症候群、若年性原発性側索硬化症（ＪＰＬＳ）、ケロイド障害、クラインフェルター症候群、クニースト骨異形成症、小崎過成長症候群、クラッベ病、クフォー・ラケブ症候群、ＬＣＡＴ欠損症、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リー・フラウメニ症候群、肢帯型筋ジストロフィー、リンチ症候群、リポタンパクリパーゼ欠損症、悪性高熱症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、マロトー・ラミー症候群、マキューン・オルブライト症候群、マクラウド症候群、ＭＥＤＮＩＫ症候群、家族性地中海熱、メンケス病、メトヘモグロビン血症、メチルマロン酸血症、ミクロ症候群、小頭症、モルキオ症候群、モワット・ウィルソン症候群、ムエンケ症候群、多発性内分泌腫瘍症１型（ウェルマー症候群）、多発性内分泌腫瘍症２型、筋ジストロフィー、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型及びベッカー型）、ミオスタチン関連筋肥大、筋緊張性ジストロフィー、ナトビッチ（Ｎａｔｏｗｉｃｚ）症候群、神経線維腫症Ｉ型、神経線維腫症ＩＩ型、ニーマン・ピック病、非ケトーシス型高グリシン血症、非閉塞性（Ｎｏｎｏｂｓｔｒｕｃｔｕｉｖｅ）精子産生不全、非症候性難聴、ヌーナン症候群、ノーマン・ロバーツ症候群、眼皮膚白皮症、オグデン症候群、オーメン症候群、骨形成不全症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、パトー症候群（１３トリソミー）、ＰＣＣ欠乏症（プロピオン酸血症）、晩発性皮膚ポルフィリン症（ＰＣＴ）、ペンドレッド症候群、ポイツ・イェガース症候群、パイフェル症候群、フェニルケトン尿症、ピペコリン酸血、ピット・ホプキンス症候群、多発性嚢胞腎疾患、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、原発性線毛機能不全（ＰＣＤ）、原発性肺高血圧症、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、疑似ゴーシェ病、弾性線維性仮性黄色腫、網膜色素変性症、レット症候群、ローベルト症候群、ルビンスタイン・テイビ症候群（ＲＳＴＳ）、サンドホフ病、サンフィリポ症候群、シュワルツ・ヤンペル症候群、シェーグレン・ラルソン症候群、先天性脊椎骨端骨異形成症（ＳＥＤ）、シュプリンツェン・ゴールドバーグ症候群、鎌状赤血球貧血、シデリウス型Ｘ連鎖精神遅滞症候群、鉄芽球性貧血、スライ症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、スミス・マギニス症候群、シュナイダー・ロビンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（１－２９型）、ＳＳＢ症候群（ＳＡＤＤＡＮ）、シュタルガルト病（黄斑変性症）、スティックラー症候群（多形）、ストラドウィック症候群（脊椎骨端骨幹端異形成、ストラドウィック型）、テイ・サックス病、ビオプテリン代謝異常症、地中海貧血症、致死性骨異形成症、トリーチャーコリンズ症候群、結節性硬化症（ＴＳＣ）、ターナー症候群、アッシャー症候群、ファン・デル・ウンデ症候群、異型ポルフィリン症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ヴァイセンバッハー・ツヴェイミューラー症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウッドハウス・サカティ症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、色素性乾皮症、Ｘ連鎖知的障害及び巨精巣症（脆弱Ｘ症候群）、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症（球脊髄性筋萎縮症）、Ｘｐ１１．２重複症候群、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、４７ＸＸＸ（別名トリプルＸ症候群）、ＸＸＸＸ症候群（別名４８ＸＸＸＸ）、ＸＸＸＸＸ症候群（別名４９ＸＸＸＸＸ）、ＸＹＹ症候群（別名４７ＸＹＹ）、ツェルウェーガー症候群、がん、心疾患、糖尿病、統合失調症、上皮細胞由来のがん種（乳房、前立腺、肺、膵臓、及び結腸で発症するがんを含む）、結合組織（即ち骨組織、軟骨組織、脂肪組織、及び神経組織）から生じる肉腫、造血細胞から生じるリンパ腫及び白血病、多能性細胞由来であり、殆どの場合、精巣及び卵巣に存在する胚細胞性腫瘍、未熟な「前駆細胞」又は胚組織由来の芽細胞腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、心臓がん、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、毛様細胞性星状細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、グリオーマ、髄芽腫、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、松果体星状細胞腫、下垂体腺腫、視経路及び視床下部膠腫、乳がん、湿潤性小葉がん、管状がん、湿潤性篩状癌、髄様がん、男性乳がん、葉状腫瘍、炎症性乳がん、副腎皮質がん、膵島細胞がん（膵島）、多発性内分泌腫瘍症候群、副甲状腺がん、褐色細胞腫、甲状腺がん、メルケル細胞癌、ブドウ膜黒色腫、網膜芽細胞腫、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、大腸がん、肝外胆管がん、胆嚢がん、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、肝細胞がん、膵がん（島細胞）、直腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣がん、上皮性卵巣がん（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、陰茎がん、腎細胞がん、腎盂尿管（移行上皮がん）、前立腺がん、精巣がん、妊娠性絨毛腫瘍、腎盂尿管（移行上皮がん）、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ウィルムス腫瘍、食道がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん、上咽頭がん、口腔がん、中咽頭がん、副鼻腔がん及び鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、下咽頭がん、急性混合白血病、急性好酸球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、大顆粒リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、肥満細胞性白血病、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、菌状息肉腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚濾胞性リンパ腫、原発性皮膚免疫細胞腫、原発性体液性リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、セザリー症候群、脾臓周辺帯リンパ腫、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、基底細胞がん、メラノーマ、皮膚がん（非メラノーマ）、気管支腺腫／カルチノイド、肺小細胞がん、中皮腫、非小細胞肺がん、胸膜肺芽腫、喉頭がん、胸腺腫及び胸腺がん、ＡＩＤＳ関連のがん、カポジ肉腫、類上皮血管内皮種（ＥＨＥ）、線維形成性小円形細胞腫瘍、並びに脂肪肉腫からなる群から選択される、請求項７４～７９の何れか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記試料溶液は、トランスポザーゼ酵素、エンドヌクレアーゼ酵素、トランスポザーゼ酵素をコードする遺伝材料、又はエンドヌクレアーゼ酵素をコードする遺伝材料を更に含む、請求項７４～８０の何れか一項に記載の方法。

【請求項82】

がんを治療する方法であって、
ａ）請求項７４～８０の何れか一項に記載の方法によって調製されたＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことと、
ｂ）それを必要とする対象に前記形質移入されたＴ細胞を投与することと、
を含む、方法。

【請求項83】

がんを治療する方法であって、
ａ）請求項７４～８０の何れか一項に記載の方法によって調製されたＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすこと
を含み、対象に、前記形質移入された細胞又は細胞様体が投与される、方法。

【請求項84】

前記がんは血液がんである、請求項８２又は８３に記載の方法。

【請求項85】

前記血液がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ性白血病である、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）少なくとも１つの、請求項１に記載の剛性容器に前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記プランジャと接触する、前記装填することと、
ｄ）前記プランジャを前記容器内で軸方向に移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通し、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
ｅ）前記形質移入された細胞又は細胞様体を前記対象に投与することと、
を含む、方法。

【請求項87】

遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）少なくとも１つの、請求項１４に記載の可撓性容器に前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、
ｄ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを前記容器に沿って軸方向に移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通し、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
ｅ）前記形質移入された細胞又は細胞様体を前記対象に投与することと、
を含む、方法。

【請求項88】

遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）少なくとも１つの、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイスに前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記構造と接触する、前記装填することと、
ｄ）前記構造を前記少なくとも１つのチャネル内で移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通し、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
ｅ）前記形質移入された細胞又は細胞様体を前記対象に投与することと、
を含む、方法。

【請求項89】

遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療するに当たり使用される細胞を調製する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）請求項１、１４、又は２３の何れか一項に記載の組立体による少なくとも１つの剛性容器に前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記プランジャと接触する、前記装填することと、
ｄ）前記プランジャを前記容器内で軸方向に移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通して、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
を含み、
それにより、遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する患者を治療するに当たり使用される細胞を調製する、
方法。

【請求項90】

遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法であって、
ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、
ｂ）前記細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、
ｃ）少なくとも１つの、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイスに前記試料溶液を装填することであって、前記試料は前記構造と接触する、前記装填することと、
ｄ）前記構造を前記少なくとも１つのチャネル内で移動させて、少なくとも１回、前記試料溶液を前記少なくとも１つの狭窄部に通し、前記細胞又は細胞様体に形質移入することと、
を含み、
前記対象に前記形質移入された細胞又は細胞様体が投与される、
方法。

【請求項91】

哺乳類から細胞を単離するステップを更に含む請求項８６～９０の何れか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすステップを更に含む請求項８６～９１の何れか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記疾患又は症状は、単一遺伝子障害、多遺伝子障害、神経疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん疾患、眼疾患、又は感染疾患であり、前記遺伝子治療は、欠陥遺伝子若しくは不適応遺伝子の置換、異常細胞の変性若しくは死滅、又は治療タンパク質の産生誘導を含む、請求項８６～９２の何れか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記疾患又は症状は単一遺伝子障害又は多遺伝子障害であり、前記単一遺伝子障害又は前記多遺伝子障害は、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ／Ｘ－ＳＣＩＤ）、嚢胞性繊維症、血友病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、家族性高脂血症、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肉芽腫、ファンコニー貧血、ゴーシェ病、レーバー先天性黒内障、フェニルケトン尿症、地中海貧血症、眼皮膚白皮症、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、低リン血症性くる病、レット症候群、非閉塞性精子産生不全、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ失調症、脊髄小脳失調症、ファン・デル・ウンデ症候群、がん、心疾患、糖尿病、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、２２ｑ１１．２欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、色盲、ネコ鳴き症候群、ダウン症、血色素症、クラインフェルター症候群、プラダー・ウィリー症候群、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス病、及びターナー症候群からなる群から選択される、請求項８６～９３の何れか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記感染疾患は、慢性ウイルス感染、マイコバクテリア感染、細菌感染、又は寄生虫感染から生じる、請求項９３に記載の方法。

【請求項96】

前記感染疾患は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、肝炎、マラリア、ヘルペス、バークホルデリア、クロイツフェルトヤコブ、及びヒトパピローマウイルスからなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。

【請求項97】

前記がん疾患は、頭部がん、頸部がん、前立腺がん、脾臓がん、脳腫瘍、皮膚がん、肝臓がん、結腸がん、乳がん、腎臓がん、及び中皮腫からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２０２０年５月２６日付けで出願された米国仮特許出願第６３／０３０，０２５号の優先権を主張する。上記優先権出願の内容は全体的に参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

形質移入－生細胞への分子又は組成物、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質の導入－は、生物医学的研究、創薬、及び遺伝子治療における基本の重要な遺伝子工学プロセスである。世界中の科学者により、がん、肥満、心疾患、糖尿病、関節炎、物質乱用、パーキンソン病、アルツハイマー病等の疾患並びに不安及び老化に関連するテーマを研究するために使用されている。形質移入は、ホルモン（例えばインスリン）、抗体、及びワクチン等の組み換えヒトタンパク質の産生を可能にするとともに、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡを用いる治療に基づく疾患治療を可能にする。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

形質移入プロセス自体は何十年も前に発見されたが、今まで大抵、特定の細胞種類との併用に制限されてきた。既存の技術は３つの群に広く分類することができる：化学、生物、及び物理。カチオン性脂質形質移入、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン形質移入、及び他のカチオンポリマーによる送達（例えばポリブレン、ＰＥＩ、デンドリマー）等の化学的方法は、担体分子を使用して、形質移入中の負荷電核酸を中和又は正電荷付与する。生物学的方法は、遺伝子操作されたウイルスに頼って遺伝子を細胞に移入する（形質導入としても知られている）。電気穿孔、微粒子銃粒子送達（粒子衝撃）、直接顕微注入、及びレーザ媒介形質移入（フォトトランスフェクション）等の物理的方法は、分子を細胞の細胞質又は核に直接送達する。全ての種類の細胞に適用することができる方法又は全ての種類の分子の送達に使用することができる方法はない。さらに、そのような技法は、効率が低く（形質移入される細胞数が少ない）、生存率が低く（生き残る細胞数が少ない）、ばらつきが大きく、細胞毒性が高く、且つ免疫細胞及び幹細胞を含む主要な疾患に関連する最も重要な種類の細胞の多くに材料を導入することができないため、研究及び疾患治療における大きなボトルネックを示す。

【課題を解決するための手段】

【0004】

本明細書に開示されるのは、形質移入を実行するデバイス、システム、キット、及び方法である。

【0005】

効率が高く（形質移入される細胞数が多い）、生存率が高く（生き残る細胞数が多い）、ばらつきが小さく、細胞毒性が低く、細胞回復が速く、且つ多くのサイズ及び種類の細胞を形質転換することが可能な形質移システム及び方法が依然として必要とされている。

【0006】

少なくとも１つの実施形態の一態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する組立体が提供され、本組立体は、基端部において第１の内径又は断面積を有し、遠端部と基端部との間に延在する内壁及び外壁を有する剛性容器と、基端部において容器に挿入可能なプランジャと、遠端部近傍の内壁のみの少なくとも１つの狭窄部又は遠端部近傍の内壁及び外壁の少なくとも１つの狭窄部とを含み、少なくとも１つの狭窄部は、容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有し、プランジャは容器に沿って軸方向に移動可能である。

【0007】

本組立体の幾つかの実施形態において、容器は、容器の内壁から突出するリップルを含む。

【0008】

本組立体の幾つかの実施形態において、狭窄部は、細胞又は細胞様体の直径の１．２倍～１００倍の直径を有する。

【0009】

本組立体の幾つかの実施形態において、狭窄部は、細胞又は細胞様体の直径の２倍～１０倍の直径を有する。

【0010】

本組立体の幾つかの実施形態において、プランジャは、遠端部及び基端部を有するロッドを含み、プランジャの遠端部は円錐形又は円柱形先端部であり、プランジャの基端部は、プランジャを電動アームに取り付けるように構成される。

【0011】

本組立体の幾つかの実施形態において、容器の内壁の平均粗度は１０ｎｍ～１μｍである。

【0012】

本組立体の幾つかの実施形態において、粗度は、細胞断片を容器の内壁に吸収させることによって作成される。

【0013】

別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する組立体が提供され、本組立体は、第１の内径又は断面積、第１の端部、及び第２の端部を有する可撓性容器と、可撓性容器の少なくとも１つの断面を圧縮することによって形成される少なくとも１つの狭窄部と、任意に、第１若しくは第２の端部の少なくとも一方に位置決めされた着脱可能なプランジャ又は第１の端部及び第２の端部の各々に位置決めされた着脱可能なプランジャとを含み、少なくとも１つの狭窄セクションは、容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する。

【0014】

本組立体の幾つかの実施形態において、プランジャは、容器に沿って軸方向に移動可能であり、又は容器の両端部における静止キャップで置換される。

【0015】

本組立体の幾つかの実施形態において、少なくとも１つの狭窄セクションは、少なくとも１つの可動式ウェッジ又は少なくとも１つの可動式ローラによって形成される。

【0016】

上述した本組立体の幾つかの実施形態において、容器は複数の狭窄部を含む。複数の狭窄部の各々は、同じ内径若しくは断面積、異なる内径若しくは断面積、又はそれらの組合せを有することができる。幾つかの実施形態において、狭窄部は、長さ０．２～１０ｍｍを有する流路を形成する。上述した本組立体の幾つかの実施形態において、容器は、複数の狭窄部を有する着脱可能なインサートを含む。

【0017】

少なくとも１つの実施形態の一態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する組立体が提供され、本組立体は、遠端部と基端部との間に延在する内壁及び外壁を有する剛性容器であって、外壁及び内壁は、遠端部と基端部との間の容器の中央部分において狭まって狭窄部を形成する、剛性容器と、基端部近傍において容器に移動可能に配置されたプランジャと、細胞又は細胞様体の直径の１．２倍～１００倍の直径を有する狭窄部とを含む。

【0018】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するマイクロ流体デバイスが提供され、本マイクロ流体デバイスは、第１の内径又は断面積、第１の端部、及び第２の端部を有する可撓性容器と、容器に沿って移動可能であり、容器を圧縮して狭窄部を形成する少なくとも１つの可動式ウェッジと、容器の第１及び第２の端部に固定される静止キャップとを含み、少なくとも１つの狭窄部は、容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有し、狭窄部は、細胞又は細胞様体の直径の１．２倍～１００倍の直径を有する。

【0019】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するマイクロ流体デバイスが提供され、本マイクロ流体デバイスは、第１の内径又は断面積を有する少なくとも１つのチャネルと、チャネルと連続した少なくとも１つの狭窄セクションと、少なくとも部分的にチャネルに入るように構成された少なくとも１つの構造とを含み、少なくとも１つの狭窄セクションは、チャネルの第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する。

【0020】

本マイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態において、少なくとも１つの構造は、プランジャ又は可撓性シートである。

【0021】

本マイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態において、本デバイスは複数のチャネルを含む。本マイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態において、１つ又は複数のチャネルは複数の狭窄部を含む。複数の狭窄部の各々は、同じ内径若しくは断面積、異なる内径若しくは断面積、又はそれらの組合せを有する。

【0022】

本明細書に記載の組立体及びマイクロ流体デバイスの少なくとも幾つかの実施形態において（単独であれ、後述するようにシステムの一部としてであれ関係なく）、狭窄セクションの内径は、形質移入されている細胞又は細胞様体の直径の約１．２倍～１００倍であり、狭窄セクションの内側断面積は、形質移入されている細胞又は細胞様体の断面積の約１．５倍～１０，０００倍である。

【0023】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するシステムが提供され、本システムは、モータに取り付けられた少なくとも１つのアームを備えた器具であって、モータは少なくとも１つのアームを軸方向に移動させるように構成される、器具と、少なくとも１つの組立体とを含み、少なくとも１つの組立体は、第１の内径又は断面積、遠端部と基端部との間延びる内壁及び外壁を含む剛性容器と、基端部において容器に挿入可能なプランジャと、遠端部における内壁のみの少なくとも１つの狭窄部又は遠端部近傍の内壁及びが壁の少なくとも１つの狭窄部とを含み、少なくとも１つの狭窄部は、容器の第１の内径又は断面積よりも小さい第２の内径又は断面積を有し、プランジャは容器に沿って軸方向に移動可能である。

【0024】

本システムの幾つかの実施形態において、プランジャは少なくとも１つのアームに取り付けられる。幾つかの実施形態において、複数のプランジャがアームに取り付けられ、又は複数のプランジャが複数のアームに取り付けられる。

【0025】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するシステムが提供され、本システムは、モータに取り付けられた少なくとも１つのアームを備えた器具であって、モータは少なくとも１つのアームを軸方向に移動させるように構成される、器具と、少なくとも１つの組立体とを含み、少なくとも１つの組立体は、第１の内径又は断面積、第１の端部、及び第２の端部を有する可撓性容器と、可撓性容器の少なくとも１つの断面を圧縮することによって形成される少なくとも１つの狭窄部と、任意に、第１若しくは第２の端部の少なくとも一方に位置決めされた着脱可能なプランジャ又は第１の端部及び第２の端部の各々に位置決めされた着脱可能なプランジャとを含み、少なくとも１つの狭窄部は、容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する。

【0026】

本システムの幾つかの実施形態において、少なくとも１つの狭窄セクションは、少なくとも１つの可動式ウェッジ又は少なくとも１つの可動式ローラによって形成される。特定の実施形態において、ウェッジ又はローラは少なくとも１つのアームに取り付けられる。他の実施形態において、複数のウェッジ又はローラがアームに取り付けられ、又は複数のウェッジ又はローラが複数のアームに取り付けられる。

【0027】

上述したシステムの幾つかの実施形態において、システムは複数の組立体を含む。

【0028】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するシステムが提供され、本システムは、モータに取り付けられた少なくとも１つのアームを含む器具であって、前記モータは前記少なくとも１つのアームを軸方向に移動させるように構成される、器具と、少なくとも１つのマイクロ流体デバイスとを含み、少なくとも１つのマイクロ流体デバイスは、第１の内径又は断面積を有する少なくとも１つのチャネルと、チャネルと連続した少なくとも１つの狭窄セクションと、少なくとも部分的にチャネルに入るように構成された少なくとも１つの構造とを含み、少なくとも１つの狭窄セクションは、チャネルの第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有し、少なくとも１つの構造は、少なくとも１つのアームに取り付けられた少なくとも１つのプランジャである。

【0029】

本システムの幾つかの実施形態において、複数のプランジャがアームに取り付けられ、又は複数のプランジャが複数のアームに取り付けられる。

【0030】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するシステムが提供され、本システムは、少なくとも１つの圧電積層を含む器具と、少なくとも１つのマイクロ流体デバイスとを含み、少なくとも１つのマイクロ流体デバイスは、第１の内径又は断面積を有する少なくとも１つのチャネルと、チャネルと連続した少なくとも１つの狭窄セクションと、少なくとも部分的にチャネルに入るように構成された少なくとも１つの構造とを含み、少なくとも１つの狭窄セクションは、チャネルの第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有し、少なくとも１つの構造は、少なくとも１つの圧電スタックと接触する少なくとも１つの可撓性シートである。

【0031】

本システムの幾つかの実施形態において、複数の可撓性シートが圧電スタックと接触し、又は複数の可撓性シートが複数の圧電スタックと接触する。

【0032】

上述したシステムの何れか１つの幾つかの実施形態において、１つ又は複数のチャネルは複数の狭窄部を含む。複数の狭窄部の各々は、同じ内径若しくは断面積、異なる内径若しくは断面積、又はそれらの組合せを有する。

【0033】

上述したシステムの何れか１つの幾つかの実施形態において、本システムは少なくとも１つの光学センサを更に含む。

【0034】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するキットが提供され、本キットは、第１の内径又は断面積、遠端部と基端部との間延びる内壁及び外壁を含む剛性容器と、基端部において容器に挿入可能なプランジャと、遠端部における内壁のみの少なくとも１つの狭窄部又は遠端部近傍の内壁及びが壁の少なくとも１つの狭窄部と、少なくとも１つの容器内に含まれる少なくとも１つの形質移入溶液及び／又は別個のバイアル内の少なくとも１つの形質移入溶液とを含み、少なくとも１つの狭窄部は、容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有し、プランジャは容器に沿って軸方向に移動可能である。

【0035】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するキットが提供され、本キットは、第１の内径又は断面積、第１の端部、及び第２の端部を含む可撓性容器と、可撓性容器の少なくとも１つの断面を圧縮することによって形成される少なくとも１つの狭窄部と、任意に、第１若しくは第２の端部の少なくとも一方に位置決めされた着脱可能なプランジャ又は第１の端部及び第２の端部の各々に位置決めされた着脱可能なプランジャと、少なくとも１つの容器内に含まれる少なくとも１つの形質移入溶液及び／又は別個のバイアル内の少なくとも１つの形質移入溶液とを含み、少なくとも１つの狭窄セクションは、容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する。

【0036】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入するキットが提供され、本キットは、第１の内径又は断面積を有する少なくとも１つのチャネルを含む少なくとも１つのマイクロ流体デバイスと、チャネルと連続した少なくとも１つの狭窄セクションと、少なくとも１つのチャネルに少なくとも部分的に入るように構成された少なくとも１つの構造と、少なくとも１つのチャネル内に含まれる少なくとも１つの形質移入溶液及び／又は少なくとも１つの別個のバイアル内の少なくとも１つの形質移入溶液とを含み、少なくとも１つの狭窄セクションは、チャネルの第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する。

【0037】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する方法が提供され、本方法は、ａ）細胞又は細胞様体及び形質移入材料を含み、少なくとも１つの可動構造と接触している溶液を提供することと、ｂ）可動構造を移動させることにより、細胞又は細胞様体の直径の１．２倍～１００倍の直径を有す少なくとも１つの狭窄部に少なくとも１回、試料溶液を通すことを含む。

【0038】

本方法の幾つかの実施形態において、可動構造は、剛性容器に挿入可能であり、容器に沿って軸方向に移動可能なプランジャである。容器は、第１の内径又は断面積、遠端部と基端部との間に延在する内壁及び外壁と、遠端部における内壁のみの少なくとも１つの狭窄部又は遠端部近傍の内壁及びが壁の少なくとも１つの狭窄部とを含み、少なくとも１つの狭窄部は、容器の第１の内径又は断面積よりも小さい第２の内径又は断面積を有する。したがって、本方法は、上述した適切な組立体及びシステムを使用して実行される。

【0039】

本方法の幾つかの実施形態において、可動構造は、少なくとも１つの可動式ウェッジ又はローラによって圧縮可能な可撓性容器である。可撓性容器は、内面と、第１の内径又は断面積、第１の端部、及び第２の端部と、任意に、第１又は第２の端部の少なくとも一方に位置決めされた着脱可能なプランジャ又は第１及び第２の端部の各々に位置決めされた着脱可能なプランジャとを含み、可撓性容器を圧縮することによって形成される少なくとも１つの狭窄部は、容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する。したがって、本方法は、上述した適切な組立体及びシステムを使用して実行される。幾つかの実施形態において、可動式ウェッジ又はローラの形状、サイズ、及び位置の少なくとも１つは、狭窄部のサイズを調整するように選択される。

【0040】

本方法の幾つかの実施形態において、可動構造は、マイクロ流体デバイスのチャネルに少なくとも部分的に挿入可能なプランジャである。マイクロ流体デバイスは、第１の内径又は断面積を有する少なくとも１つのチャネルと、チャネルと連続した少なくとも１つの狭窄セクションとを含み、少なくとも１つの狭窄セクションは、チャネルの第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する。したがって、本方法は、上述した適切な組立体及びシステムを使用して実行される。

【0041】

本方法の幾つかの実施形態において、可動構造は、マイクロ流体デバイスのチャネルに少なくとも部分的に挿入可能な可撓性シートである。マイクロ流体デバイスは、第１の内径又は断面積を有する少なくとも１つのチャネルと、チャネルと連続した少なくとも１つの狭窄セクションとを含み、少なくとも１つの狭窄セクションは、チャネルの第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する。したがって、本方法は、上述した適切な組立体及びシステムを使用して実行される。

【0042】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する方法が提供され、本方法は、ａ）細胞又は細胞様体及び形質移入材料を含む溶液を提供することと、ｂ）第１の内径又は断面積を含む少なくとも１つの剛性容器であって、容器の第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積と、プランジャとを有する少なくとも１つの剛性容器に溶液を装填することであって、溶液はプランジャと接触する、前記装填することと、ｃ）プランジャを容器内で軸方向に移動させて、溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通すこととを含む。

【0043】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する方法が提供され、本方法は、ａ）細胞又は細胞様体及び形質移入材料を含む溶液を提供することと、ｂ）少なくとも１つの可撓性容器に溶液を装填することであって、少なくとも１つの可撓性容器は、内面と、第１の内径又は断面積と、第１及び第２の端部とを含むとともに、容器の第１の内径又は断面よりも小さな第２の内径又は断面積を有する、可撓性容器の少なくとも１つの断面を圧縮することによって形成される少なくとも１つの狭窄部と、任意に、第１若しくは第２の端部の少なくとも一方に位置決めされた着脱可能なプランジャ又は第１の端部及び第２の端部の各々に位置決めされた着脱可能なプランジャとを含み、溶液は可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、ｃ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを容器に沿って移動させて、溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通すこととを含む。

【0044】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、溶液中の分子を細胞又は細胞様体に導入する方法が提供され、ａ）細胞又は細胞様体及び形質移入材料を含む溶液を提供することと、ｂ）溶液を少なくとも１つのマイクロ流体デバイスに装填することであって、少なくとも１つのマイクロ流体デバイスは、第１の内径又は断面積を有する少なくとも１つのチャネルと、チャネルの第１の内径又は断面積よりも小さな第２の内径又は断面積を有する、チャネルと連続した少なくとも１つの狭窄部と、チャネルに少なくとも部分的に入るように構成された少なくとも１つの構造とを含み、試料は構造と接触する、前記装填することと、ｃ）構造をチャネル内で移動させて、溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通すこととを含む。幾つかの実施形態において、構造は少なくとも１つのプランジャ又は可撓性シートである。

【0045】

本方法の幾つかの実施形態において、形質移入材料は、遺伝材料、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、無機化合物、合成ポリマー、薬物、医薬組成物、又はそれらの混合物を含む。特定の実施形態において、形質移入材料は、抗体又は抗体の断片であるタンパク質である。他の実施形態において、遺伝材料は、抗体、抗体断片、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現ベクターを含む。更に他の実施形態において、形質移入材料は、遺伝子編集成分又は遺伝子編集複合体を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）等のタンパク質と遺伝材料との混合物である。特定の実施形態において、遺伝子編集成分又は遺伝子編集複合体は、Ｃａｓタンパク質又はＣｐｆ１タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ドナーＤＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）等のＣＲＩＳＰＲ成分を含む。更に他の実施形態において、遺伝子編集成分又は遺伝子編集複合体は、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、又はＣｒｅリコンビナーゼを含む。

【0046】

本方法の幾つかの実施形態において、細胞は原核細胞又は真核細胞を含む。特定の実施形態において、原核細胞は、細菌、シアノバクテリア、又は古細菌である。特定の実施形態において、真核細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母、原生生物、又は真菌である。本方法の幾つかの実施形態において、細胞様体は、エクソソーム、小胞、細胞小器官、膜結合細胞内小胞、細胞由来若しくは合成由来膜結合小胞、又は細胞由来若しくは合成由来細胞内小胞である。

【0047】

更に他の実施形態において、真核細胞は、上皮細胞、造血細胞、幹細胞、脾臓細胞、腎細胞、膵細胞、肝細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞、心臓細胞、肺細胞、眼細胞、骨髄細胞、配偶子（卵母細胞及び精子細胞）、胎児臍帯血細胞、前駆細胞、腫瘍細胞、末梢血単核球、及び免疫細胞を含み、免疫細胞は、白血球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、又は好中球を含む。更に他の実施形態において、真核細胞は、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、藻類、ＣＨＯ細胞、Ｃｏｓ－７細胞、上皮細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＴ－２９細胞、Ｂ細胞、ヒト胚性幹細胞、ＨＵＶＥＣ、ジャーカット細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＣＦ７細胞、ＭＤＣＫ細胞、マウス胚性幹細胞、間葉幹細胞、ＰＢＭＣ、ＰＣ１２細胞、初代星状細胞、ラット全血細胞、ラット後根神経節細胞、赤血球、ラット神経幹細胞、ＳＦ９細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、脾臓細胞、Ｕ２６６細胞、Ｕ８７ヒトグリオブラストーマ細胞、Ｐ．パストリス細胞、Ｓ．セレビシエ細胞、又はヒト卵母細胞である。特定の実施形態において、免疫細胞はヒトＴ細胞である。

【0048】

本方法の幾つかの実施形態において、試料溶液は２回以上、狭窄部に通される。特定の実施形態において、試料溶液は約１～１００回、好ましくは約３０回、狭窄部に通される。他の実施形態において、試料溶液は約１０～９０回、狭窄部に通される。他の実施形態において、試料溶液は約１５～５０回、狭窄部に通される。幾つかの実施形態において、試料溶液は約１５回、狭窄部に通される。幾つかの実施形態において、試料溶液は約２０回、狭窄部に通される。

【0049】

本方法の幾つかの実施形態において、試料溶液は平均流量約１０μｌ／ｓｅｃ～約１０００μｌ／ｓｅｃで狭窄部に通される。

【0050】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、感染因子から対象を保護する方法が提供され、本方法は、ａ）任意に、細胞を哺乳類から単離することと、ｂ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｃ）細胞又は細胞様体を、感染因子又は感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｄ）試料溶液を本明細書に記載される組立体による少なくとも１つの剛性容器に装填することであって、試料はプランジャと接触する、前記装填することと、ｅ）プランジャを容器内で軸方向に移動させて、少なくとも１回、試料溶液を少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｆ）任意に、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことと、ｇ）上記形質移入された細胞又は細胞様体を対象に注入することとを含む。

【0051】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、感染因子から対象を保護する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｂ）細胞又は細胞様体を、感染因子又は感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）本明細書に記載の組立体による少なくとも１つの剛性容器に試料溶液を装填することであって、試料はプランジャと接触する、前記装填することと、ｄ）プランジャを容器内で軸方向に移動させて、少なくとも１回、試料溶液を少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｅ）上記形質移入された細胞又は細胞様体を対象に注入することとを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞を哺乳類から単離することを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含む。

【0052】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、感染因子から対象を保護する方法が提供され、本方法は、ａ）任意に、細胞を哺乳類から単離することと、ｂ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｃ）細胞又は細胞様体を、感染因子又は感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｄ）試料溶液を本明細書に記載される組立体による少なくとも１つの可撓性容器に装填することであって、試料は可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、ｅ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを容器に沿って軸方向に移動させて、試料を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｆ）任意に、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことと、ｇ）上記形質移入された細胞又は細胞様体を対象に注入することとを含む。

【0053】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、感染因子から対象を保護する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｂ）細胞又は細胞様体を、感染因子又は感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）試料溶液を本明細書に記載される組立体による少なくとも１つの可撓性容器に装填することであって、試料は可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、ｄ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを容器に沿って軸方向に移動させて、試料を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｅ）上記形質移入された細胞又は細胞様体を対象に注入することとを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞を哺乳類から単離することを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含む。

【0054】

少なくとも１つの実施形態の更に別の態様において、感染因子から対象を保護する方法が提供され、本方法は、ａ）任意に、細胞を哺乳類から単離することと、ｂ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｃ）細胞又は細胞様体を、感染因子又は感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｄ）少なくとも１つの、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスに上記試料溶液を装填することであって、試料は構造と接触する、前記装填することと、ｅ）構造を少なくとも１つのチャネル内で移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｆ）任意に、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことと、ｇ）上記形質移入された細胞又は細胞様体を対象に注入することとを含む。

【0055】

感染因子から対象を保護する方法の幾つかの実施形態において、感染因子は細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、又はプリオンであり、上記有毒物質は毒素又はアレルゲンである。

【0056】

少なくとも１つの実施形態の更に別の態様において、感染因子から対象を保護する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｂ）細胞又は細胞様体を、感染因子又は感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）少なくとも１つの、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスに上記試料溶液を装填することであって、試料は構造と接触する、前記装填することと、ｄ）構造を少なくとも１つのチャネル内で移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｅ）上記形質移入された細胞又は細胞様体を対象に注入することとを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞を哺乳類から単離することを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含む。

【0057】

感染因子から対象を保護する方法の幾つかの実施形態において、感染因子は細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、又はプリオンであり、上記有毒物質は毒素又はアレルゲンである。

【0058】

少なくとも１つの実施形態の更に別の態様において、感染因子から対象を保護する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供（又は取得）することと、ｂ）細胞又は細胞様体を、感染因子又は感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）少なくとも１つの、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスに上記試料溶液を装填することであって、試料は構造と接触する、前記装填することと、ｄ）構造を少なくとも１つのチャネル内で移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することとを含み、それにより、感染因子又は感染因子によって産生された有毒物質によって生じた感染を防止するに当たり使用される細胞又は細胞様体を調製する。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞を哺乳類から単離することを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含む。

【0059】

感染因子から対象を保護する方法の幾つかの実施形態において、感染因子は細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、又はプリオンであり、上記有毒物質は毒素又はアレルゲンである。

【0060】

少なくとも１つの実施形態の更に別の態様において、感染因子から対象を保護する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供（又は取得）することと、ｂ）細胞又は細胞様体を、感染因子又は感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターを含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）少なくとも１つの、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスに上記試料溶液を装填することであって、試料は構造と接触する、前記装填することであって、上記対象に上記形質移入された細胞又は細胞様体が問うよされる、前記装填することとを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞を哺乳類から単離することを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含む。

【0061】

感染因子から対象を保護する方法の幾つかの実施形態において、感染因子は細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、又はプリオンであり、上記有毒物質は毒素又はアレルゲンである。

【0062】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法が提供され、本方法は、ａ）任意に、哺乳類からＴ細胞を単離することと、ｂ）自己Ｔ細胞又は同種Ｔ細胞を提供することと、ｃ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液とＴ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、ｄ）本明細書に記載される組立体による少なくとも１つの剛性容器に試料溶液を装填することであって、試料はプランジャと接触する、前記装填することと、ｅ）プランジャを容器内で軸方向に移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、Ｔ細胞に形質移入することとを含む。

【0063】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法が提供され、本方法は、ａ）任意に、哺乳類からＴ細胞を単離することと、ｂ）自己Ｔ細胞又は同種Ｔ細胞を提供することと、ｃ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液とＴ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、ｄ）本明細書に記載される組立体による少なくとも１つの可撓性容器に試料溶液を装填することであって、試料は可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、ｅ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを容器に沿って軸方向に移動させて、少なくとも１回、試料溶液を少なくとも１つの狭窄部に通し、Ｔ細胞に形質移入することとを含む。

【0064】

少なくとも１つの実施形態の更に別の態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法が提供され、本方法は、ａ）任意に、哺乳類からＴ細胞を単離することと、ｂ）自己Ｔ細胞又は同種Ｔ細胞を提供することと、ｃ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液とＴ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、ｄ）少なくとも１つの、請求項１４に記載のマイクロ流体デバイスに試料溶液を装填することであって、試料は構造と接触する、前記装填することと、ｅ）構造を少なくとも１つのチャネル内で移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、Ｔ細胞に形質移入することとを含む。

【0065】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法が提供され、本方法は、ａ）自己Ｔ細胞又は同種Ｔ細胞を提供（又は取得）することと、ｂ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液とＴ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）本明細書に記載の組立体による少なくとも１つの剛性容器に試料溶液を装填することであって、試料はプランジャと接触する、前記装填することと、ｄ）プランジャを容器内で軸方向に移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、Ｔ細胞に形質移入することとを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞を哺乳類から単離することを含む。

【0066】

ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法の幾つかの実施形態において、試料溶液は、トランスポザーゼ酵素、エンドヌクレアーゼ酵素、トランスポザーゼ酵素をコードする遺伝材料、又はエンドヌクレアーゼ酵素をコードする遺伝材料を更に含む。

【0067】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、疾患又は障害を有する対象を治療する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供（又は取得）することと、ｂ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液とＴ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）本明細書に記載される少なくとも１つのマイクロ流体デバイスに上記試料溶液を装填することであって、試料は構造と接触する、前記装填することと、ｄ）構造を少なくとも１つのチャネル内で移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｅ）形質移入された細胞又は細胞様体を上記対象に投与することとを含む。幾つかの実施形態において、疾患又は障害は、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ／Ｘ－ＳＣＩＤ）、嚢胞性繊維症、血友病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、家族性高脂血症、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肉芽腫、ファンコニー貧血、ゴーシェ病、レーバー先天性黒内障、フェニルケトン尿症、地中海貧血症、眼皮膚白皮症、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、低リン血症性くる病、レット症候群、非閉塞性精子産生不全、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ失調症、脊髄小脳失調症、ファン・デル・ウンデ症候群、がん、心疾患、糖尿病、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、２２ｑ１１．２欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、色盲、ネコ鳴き症候群、ダウン症、血色素症、クラインフェルター症候群、プラダー・ウィリー症候群、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス病及びターナー症候群、１ｐ３６欠失症候群、１８ｐ欠失症候群、２１水酸化酵素欠損症、２２ｑ１１．２欠失症候群、α１アンチトリプシン欠損症、ＡＡＡ症候群（アカラシア・アジソン病・無涙症候群）、アースコグ・スコット症候群、ＡＢＣＤ症候群、無セルロプラスミン血症、無手足症、軟骨無発生症２型、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アラジール症候群、ＡＤＵＬＴ症候群、エカルディ・グティエール症候群、白化症、アレキサンダー病、アルカプトン尿症、アルポート症候群、小児交互性片麻痺、筋萎縮性側索硬化症－前頭側頭型認知症、アルストローム症候群、アルツハイマー病、遺伝性エナメル質形成不全症、アミノレブリン酸脱水酵素欠損ポルフィリン症、アンドロゲン不応症、アンジェルマン症候群、アペール症候群、関節拘縮・腎機能不全・胆汁うっ滞症候群、毛細血管拡張性運動失調症、アクセンフェルト症候群、ベーレ・スティーブンソン脳回状頭皮症候群、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、ベンジャミン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、ブヨルンスタッド症候群、ブルーム症候群、バート・ホッグ・デュベ症候群、ブロディーミオパシー、ブルンナー症候群、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、ＣＡＲＡＳＩＬ症候群、慢性肉芽腫、屈曲肢異形成症、カナバン病、カーペンター症候群、大脳形成異常・神経障害・魚鱗癬・角皮症症候群（ＳＥＤＮＩＫ）、嚢胞性繊維症、シャルコ・マリ・ツース病、ＣＨＡＲＧＥ症候群、チェディアック・東症候群、鎖骨頭蓋異骨症、コケイン症候群、コフィン・ローリー症候群、コーエン症候群、コラーゲン異常症（２型及び１１型）、色盲、先天性無痛無汗症（ＣＩＰＡ）、先天性筋ジストロフィー、コルネリア・デ・ランゲ症候群（ＣＤＬＳ）、カウデン病、ＣＰＯ欠損症（コプロポルフィリン症）、頭蓋・水晶体・縫合異形成症、ネコ鳴き症候群、クローン病、クルーゾン症候群、クルーゾン皮膚骨格症候群（黒色表皮腫を伴うクルーゾン症候群）、ダリエー病、デント病（遺伝性高カルシウム尿症）、デニス・ドラッシュ症候群、ド・グルーシー症候群、ダウン症、ディジョージ症候群、遠位型遺伝性運動性ニューロパチー、遠位型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ドラベ症候群、エドワーズ症候群、エーラス・ダンロス症候群、エメリー・ドレイフス症候群、表皮水疱症、骨髄性プロトポルフィリン症、ファンコニー貧血（ＦＡ）、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、致死性家族性不眠症、家族性大腸腺腫症、家族性自律神経失調症、家族性クロイツフェルトヤコブ病、ファインゴールド症候群、ＦＧ症候群、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、Ｇ６ＰＤ欠乏症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ギレスピー症候群、グルタル酸尿症（１型及び２型）、ＧＲＡＣＩＬＥ症候群、慢性肉芽腫、グリシェリ症候群、ヘイリー・ヘイリー病、道化師様魚鱗癬、遺伝性ヘモクロマトーシス、血友病、骨髄肝性ポルフィリン症、遺伝性コプロポルフィリン症、遺伝性出血性末梢血管拡張症（オスラー・ウェーバー・レンドゥ症候群）、遺伝性封入体ミオパチー、遺伝性多発性外骨腫症、遺伝性痙性対まひ（乳児期発症上行性遺伝性痙性対麻痺）、ヘルマンスキー・パドラック症候群、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）、内臓転位、ホモシスチン尿症、ハンチントン病、ハンター症候群、ハーラー症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、家族性高コレステロール血症、高リジン血症、原発性高シュウ酸尿症、高フェニルアラニン血症、低αリポ蛋白血症（タンジール病）、軟骨低発生症、軟骨低形成症、低リン血症性くる病、免疫不全・セントロメア不安定・顔面異常症候群（ＩＣＦ症候群）、色素失調症、坐骨膝蓋骨異形成症、アイソダイセントリック（Ｉｓｏｄｉｃｅｎｔｒｉｃ）１５、ジャクソン・ワイス症候群、ジュベール症候群、若年性原発性側索硬化症（ＪＰＬＳ）、ケロイド障害、クラインフェルター症候群、クニースト骨異形成症、小崎過成長症候群、クラッベ病、クフォー・ラケブ症候群、ＬＣＡＴ欠損症、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リー・フラウメニ症候群、肢帯型筋ジストロフィー、リンチ症候群、リポタンパクリパーゼ欠損症、悪性高熱症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、マロトー・ラミー症候群、マキューン・オルブライト症候群、マクラウド症候群、ＭＥＤＮＩＫ症候群、家族性地中海熱、メンケス病、メトヘモグロビン血症、メチルマロン酸血症、ミクロ症候群、小頭症、モルキオ症候群、モワット・ウィルソン症候群、ムエンケ症候群、多発性内分泌腫瘍症１型（ウェルマー症候群）、多発性内分泌腫瘍症２型、筋ジストロフィー、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型及びベッカー型）、ミオスタチン関連筋肥大、筋緊張性ジストロフィー、ナトビッチ（Ｎａｔｏｗｉｃｚ）症候群、神経線維腫症Ｉ型、神経線維腫症ＩＩ型、ニーマン・ピック病、非ケトーシス型高グリシン血症、非閉塞性（Ｎｏｎｏｂｓｔｒｕｃｔｕｉｖｅ）精子産生不全、非症候性難聴、ヌーナン症候群、ノーマン・ロバーツ症候群、眼皮膚白皮症、オグデン症候群、オーメン症候群、骨形成不全症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、パトー症候群（１３トリソミー）、ＰＣＣ欠乏症（プロピオン酸血症）、晩発性皮膚ポルフィリン症（ＰＣＴ）、ペンドレッド症候群、ポイツ・イェガース症候群、パイフェル症候群、フェニルケトン尿症、ピペコリン酸血、ピット・ホプキンス症候群、多発性嚢胞腎疾患、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、原発性線毛機能不全（ＰＣＤ）、原発性肺高血圧症、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、疑似ゴーシェ病、弾性線維性仮性黄色腫、網膜色素変性症、レット症候群、ローベルト症候群、ルビンスタイン・テイビ症候群（ＲＳＴＳ）、サンドホフ病、サンフィリポ症候群、シュワルツ・ヤンペル症候群、シェーグレン・ラルソン症候群、先天性脊椎骨端骨異形成症（ＳＥＤ）、シュプリンツェン・ゴールドバーグ症候群、鎌状赤血球貧血、シデリウス型Ｘ連鎖精神遅滞症候群、鉄芽球性貧血、スライ症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、スミス・マギニス症候群、シュナイダー・ロビンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（１－２９型）、ＳＳＢ症候群（ＳＡＤＤＡＮ）、シュタルガルト病（黄斑変性症）、スティックラー症候群（多形）、ストラドウィック症候群（脊椎骨端骨幹端異形成、ストラドウィック型）、テイ・サックス病、ビオプテリン代謝異常症、地中海貧血症、致死性骨異形成症、トリーチャーコリンズ症候群、結節性硬化症（ＴＳＣ）、ターナー症候群、アッシャー症候群、ファン・デル・ウンデ症候群、異型ポルフィリン症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ヴァイセンバッハー・ツヴェイミューラー症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウッドハウス・サカティ症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、色素性乾皮症、Ｘ連鎖知的障害及び巨精巣症（脆弱Ｘ症候群）、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症（球脊髄性筋萎縮症）、Ｘｐ１１．２重複症候群、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、４７ＸＸＸ（別名トリプルＸ症候群）、ＸＸＸＸ症候群（別名４８ＸＸＸＸ）、ＸＸＸＸＸ症候群（別名４９ＸＸＸＸＸ）、ＸＹＹ症候群（別名４７ＸＹＹ）、ツェルウェーガー症候群、がん、心疾患、糖尿病、統合失調症、上皮細胞由来のがん種（乳房、前立腺、肺、膵臓、及び結腸で発症するがんを含む）、結合組織（即ち骨組織、軟骨組織、脂肪組織、及び神経組織）から生じる肉腫、造血細胞から生じるリンパ腫及び白血病、多能性細胞由来であり、殆どの場合、精巣及び卵巣に存在する胚細胞性腫瘍、未熟な「前駆細胞」又は胚組織由来の芽細胞腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、心臓がん、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、毛様細胞性星状細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、グリオーマ、髄芽腫、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、松果体星状細胞腫、下垂体腺腫、視経路及び視床下部膠腫、乳がん、湿潤性小葉がん、管状がん、湿潤性篩状癌、髄様がん、男性乳がん、葉状腫瘍、炎症性乳がん、副腎皮質がん、膵島細胞がん（膵島）、多発性内分泌腫瘍症候群、副甲状腺がん、褐色細胞腫、甲状腺がん、メルケル細胞癌、ブドウ膜黒色腫、網膜芽細胞腫、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、大腸がん、肝外胆管がん、胆嚢がん、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、肝細胞がん、膵がん（島細胞）、直腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣がん、上皮性卵巣がん（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、陰茎がん、腎細胞がん、腎盂尿管（移行上皮がん）、前立腺がん、精巣がん、妊娠性絨毛腫瘍、腎盂尿管（移行上皮がん）、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ウィルムス腫瘍、食道がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん、上咽頭がん、口腔がん、中咽頭がん、副鼻腔がん及び鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、下咽頭がん、急性混合白血病、急性好酸球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、大顆粒リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、肥満細胞性白血病、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、菌状息肉腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚濾胞性リンパ腫、原発性皮膚免疫細胞腫、原発性体液性リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、セザリー症候群、脾臓周辺帯リンパ腫、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、基底細胞がん、メラノーマ、皮膚がん（非メラノーマ）、気管支腺腫／

カルチノイド、肺小細胞がん、中皮腫、非小細胞肺がん、胸膜肺芽腫、喉頭がん、胸腺腫及び胸腺がん、ＡＩＤＳ関連のがん、カポジ肉腫、類上皮血管内皮種（ＥＨＥ）、線維形成性小円形細胞腫瘍、並びに脂肪肉腫からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、溶液は、トランスポザーゼ酵素、エンドヌクレアーゼ酵素、トランスポザーゼ酵素をコードする遺伝材料、又はエンドヌクレアーゼ酵素をコードする遺伝材料を更に含む。

【0068】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、疾患又は障害を有する対象を治療する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｂ）少なくとも、キメラ抗原受容体をコードする遺伝材料を含む溶液とＴ細胞を混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）本明細書に記載される少なくとも１つのマイクロ流体デバイスに上記溶液を装填することであって、溶液は構造と接触する、前記装填することと、ｄ）構造を少なくとも１つのチャネル内で移動させて、溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｅ）形質移入された細胞又は細胞様体を上記対象に投与することとを含む。幾つかの実施形態において、疾患又は障害は、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ／Ｘ－ＳＣＩＤ）、嚢胞性繊維症、血友病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、家族性高脂血症、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肉芽腫、ファンコニー貧血、ゴーシェ病、レーバー先天性黒内障、フェニルケトン尿症、地中海貧血症、眼皮膚白皮症、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、低リン血症性くる病、レット症候群、非閉塞性精子産生不全、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ失調症、脊髄小脳失調症、ファン・デル・ウンデ症候群、がん、心疾患、糖尿病、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、２２ｑ１１．２欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、色盲、ネコ鳴き症候群、ダウン症、血色素症、クラインフェルター症候群、プラダー・ウィリー症候群、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス病、ターナー症候群、１ｐ３６欠失症候群、１８ｐ欠失症候群、２１水酸化酵素欠損症、２２ｑ１１．２欠失症候群、α１アンチトリプシン欠損症、ＡＡＡ症候群（アカラシア・アジソン病・無涙症候群）、アースコグ・スコット症候群、ＡＢＣＤ症候群、無セルロプラスミン血症、無手足症、軟骨無発生症２型、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アラジール症候群、ＡＤＵＬＴ症候群、エカルディ・グティエール症候群、白化症、アレキサンダー病、アルカプトン尿症、アルポート症候群、小児交互性片麻痺、筋萎縮性側索硬化症－前頭側頭型認知症、アルストローム症候群、アルツハイマー病、遺伝性エナメル質形成不全症、アミノレブリン酸脱水酵素欠損ポルフィリン症、アンドロゲン不応症、アンジェルマン症候群、アペール症候群、関節拘縮・腎機能不全・胆汁うっ滞症候群、毛細血管拡張性運動失調症、アクセンフェルト症候群、ベーレ・スティーブンソン脳回状頭皮症候群、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、ベンジャミン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、ブヨルンスタッド症候群、ブルーム症候群、バート・ホッグ・デュベ症候群、ブロディーミオパシー、ブルンナー症候群、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、ＣＡＲＡＳＩＬ症候群、慢性肉芽腫、屈曲肢異形成症、カナバン病、カーペンター症候群、大脳形成異常・神経障害・魚鱗癬・角皮症症候群（ＳＥＤＮＩＫ）、嚢胞性繊維症、シャルコ・マリ・ツース病、ＣＨＡＲＧＥ症候群、チェディアック・東症候群、鎖骨頭蓋異骨症、コケイン症候群、コフィン・ローリー症候群、コーエン症候群、コラーゲン異常症（２型及び１１型）、色盲、先天性無痛無汗症（ＣＩＰＡ）、先天性筋ジストロフィー、コルネリア・デ・ランゲ症候群（ＣＤＬＳ）、カウデン病、ＣＰＯ欠損症（コプロポルフィリン症）、頭蓋・水晶体・縫合異形成症、ネコ鳴き症候群、クローン病、クルーゾン症候群、クルーゾン皮膚骨格症候群（黒色表皮腫を伴うクルーゾン症候群）、ダリエー病、デント病（遺伝性高カルシウム尿症）、デニス・ドラッシュ症候群、ド・グルーシー症候群、ダウン症、ディジョージ症候群、遠位型遺伝性運動性ニューロパチー、遠位型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ドラベ症候群、エドワーズ症候群、エーラス・ダンロス症候群、エメリー・ドレイフス症候群、表皮水疱症、骨髄性プロトポルフィリン症、ファンコニー貧血（ＦＡ）、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、致死性家族性不眠症、家族性大腸腺腫症、家族性自律神経失調症、家族性クロイツフェルトヤコブ病、ファインゴールド症候群、ＦＧ症候群、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、Ｇ６ＰＤ欠乏症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ギレスピー症候群、グルタル酸尿症（１型及び２型）、ＧＲＡＣＩＬＥ症候群、慢性肉芽腫、グリシェリ症候群、ヘイリー・ヘイリー病、道化師様魚鱗癬、遺伝性ヘモクロマトーシス、血友病、骨髄肝性ポルフィリン症、遺伝性コプロポルフィリン症、遺伝性出血性末梢血管拡張症（オスラー・ウェーバー・レンドゥ症候群）、遺伝性封入体ミオパチー、遺伝性多発性外骨腫症、遺伝性痙性対まひ（乳児期発症上行性遺伝性痙性対麻痺）、ヘルマンスキー・パドラック症候群、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）、内臓転位、ホモシスチン尿症、ハンチントン病、ハンター症候群、ハーラー症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、家族性高コレステロール血症、高リジン血症、原発性高シュウ酸尿症、高フェニルアラニン血症、低αリポ蛋白血症（タンジール病）、軟骨低発生症、軟骨低形成症、低リン血症性くる病、免疫不全・セントロメア不安定・顔面異常症候群（ＩＣＦ症候群）、色素失調症、坐骨膝蓋骨異形成症、アイソダイセントリック（Ｉｓｏｄｉｃｅｎｔｒｉｃ）１５、ジャクソン・ワイス症候群、ジュベール症候群、若年性原発性側索硬化症（ＪＰＬＳ）、ケロイド障害、クラインフェルター症候群、クニースト骨異形成症、小崎過成長症候群、クラッベ病、クフォー・ラケブ症候群、ＬＣＡＴ欠損症、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リー・フラウメニ症候群、肢帯型筋ジストロフィー、リンチ症候群、リポタンパクリパーゼ欠損症、悪性高熱症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、マロトー・ラミー症候群、マキューン・オルブライト症候群、マクラウド症候群、ＭＥＤＮＩＫ症候群、家族性地中海熱、メンケス病、メトヘモグロビン血症、メチルマロン酸血症、ミクロ症候群、小頭症、モルキオ症候群、モワット・ウィルソン症候群、ムエンケ症候群、多発性内分泌腫瘍症１型（ウェルマー症候群）、多発性内分泌腫瘍症２型、筋ジストロフィー、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型及びベッカー型）、ミオスタチン関連筋肥大、筋緊張性ジストロフィー、ナトビッチ（Ｎａｔｏｗｉｃｚ）症候群、神経線維腫症Ｉ型、神経線維腫症ＩＩ型、ニーマン・ピック病、非ケトーシス型高グリシン血症、非閉塞性（Ｎｏｎｏｂｓｔｒｕｃｔｕｉｖｅ）精子産生不全、非症候性難聴、ヌーナン症候群、ノーマン・ロバーツ症候群、眼皮膚白皮症、オグデン症候群、オーメン症候群、骨形成不全症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、パトー症候群（１３トリソミー）、ＰＣＣ欠乏症（プロピオン酸血症）、晩発性皮膚ポルフィリン症（ＰＣＴ）、ペンドレッド症候群、ポイツ・イェガース症候群、パイフェル症候群、フェニルケトン尿症、ピペコリン酸血、ピット・ホプキンス症候群、多発性嚢胞腎疾患、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、原発性線毛機能不全（ＰＣＤ）、原発性肺高血圧症、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、疑似ゴーシェ病、弾性線維性仮性黄色腫、網膜色素変性症、レット症候群、ローベルト症候群、ルビンスタイン・テイビ症候群（ＲＳＴＳ）、サンドホフ病、サンフィリポ症候群、シュワルツ・ヤンペル症候群、シェーグレン・ラルソン症候群、先天性脊椎骨端骨異形成症（ＳＥＤ）、シュプリンツェン・ゴールドバーグ症候群、鎌状赤血球貧血、シデリウス型Ｘ連鎖精神遅滞症候群、鉄芽球性貧血、スライ症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、スミス・マギニス症候群、シュナイダー・ロビンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（１－２９型）、ＳＳＢ症候群（ＳＡＤＤＡＮ）、シュタルガルト病（黄斑変性症）、スティックラー症候群（多形）、ストラドウィック症候群（脊椎骨端骨幹端異形成、ストラドウィック型）、テイ・サックス病、ビオプテリン代謝異常症、地中海貧血症、致死性骨異形成症、トリーチャーコリンズ症候群、結節性硬化症（ＴＳＣ）、ターナー症候群、アッシャー症候群、ファン・デル・ウンデ症候群、異型ポルフィリン症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ヴァイセンバッハー・ツヴェイミューラー症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウッドハウス・サカティ症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、色素性乾皮症、Ｘ連鎖知的障害及び巨精巣症（脆弱Ｘ症候群）、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症（球脊髄性筋萎縮症）、Ｘｐ１１．２重複症候群、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、４７ＸＸＸ（別名トリプルＸ症候群）、ＸＸＸＸ症候群（別名４８ＸＸＸＸ）、ＸＸＸＸＸ症候群（別名４９ＸＸＸＸＸ）、ＸＹＹ症候群（別名４７ＸＹＹ）、ツェルウェーガー症候群、がん、心疾患、糖尿病、統合失調症、上皮細胞由来のがん種（乳房、前立腺、肺、膵臓、及び結腸で発症するがんを含む）、結合組織（即ち骨組織、軟骨組織、脂肪組織、及び神経組織）から生じる肉腫、造血細胞から生じるリンパ腫及び白血病、多能性細胞由来であり、殆どの場合、精巣及び卵巣に存在する胚細胞性腫瘍、未熟な「前駆細胞」又は胚組織由来の芽細胞腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、心臓がん、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、毛様細胞性星状細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、グリオーマ、髄芽腫、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、松果体星状細胞腫、下垂体腺腫、視経路及び視床下部膠腫、乳がん、湿潤性小葉がん、管状がん、湿潤性篩状癌、髄様がん、男性乳がん、葉状腫瘍、炎症性乳がん、副腎皮質がん、膵島細胞がん（膵島）、多発性内分泌腫瘍症候群、副甲状腺がん、褐色細胞腫、甲状腺がん、メルケル細胞癌、ブドウ膜黒色腫、網膜芽細胞腫、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、大腸がん、肝外胆管がん、胆嚢がん、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、肝細胞がん、膵がん（島細胞）、直腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣がん、上皮性卵巣がん（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、陰茎がん、腎細胞がん、腎盂尿管（移行上皮がん）、前立腺がん、精巣がん、妊娠性絨毛腫瘍、腎盂尿管（移行上皮がん）、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ウィルムス腫瘍、食道がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん、上咽頭がん、口腔がん、中咽頭がん、副鼻腔がん及び鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、下咽頭がん、急性混合白血病、急性好酸球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、大顆粒リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、肥満細胞性白血病、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、菌状息肉腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚濾胞性リンパ腫、原発性皮膚免疫細胞腫、原発性体液性リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、セザリー症候群、脾臓周辺帯リンパ腫、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、基底細胞がん、メラノーマ、皮膚がん（非メラノーマ）、気管支腺腫／カルチノイド、肺小細胞

がん、中皮腫、非小細胞肺がん、胸膜肺芽腫、喉頭がん、胸腺腫及び胸腺がん、ＡＩＤＳ関連のがん、カポジ肉腫、類上皮血管内皮種（ＥＨＥ）、線維形成性小円形細胞腫瘍、並びに脂肪肉腫からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、溶液は、トランスポザーゼ酵素、エンドヌクレアーゼ酵素、トランスポザーゼ酵素をコードする遺伝材料、又はエンドヌクレアーゼ酵素をコードする遺伝材料を更に含む。

【0069】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、がんを治療する方法が提供され、本方法は、ａ）任意に、本明細書に記載された方法によって調製されたＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことと、ｂ）必要とする対象に形質移入されたＴ細胞を注入することとを含む。がんを治療する方法の幾つかの実施形態において、がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ性白血病を含む血液がんである。

【0070】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、がんを治療する方法が提供され、本方法は、ａ）必要とされる対象に形質移入されたＴ細胞を注入することを含む。がんを治療する方法の幾つかの実施形態において、がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ性白血病を含む血液がんである。幾つかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載された方法によって調製されたＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含む。

【0071】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、がんを治療する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載された方法によって調製されたＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含み、上記対象に、形質移入された細胞又は細胞様体が投与される。癌を治療する方法の幾つかの実施形態において、がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ性白血病を含む血液がんである。

【0072】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法が提供され、本方法は、ａ）任意に、細胞を哺乳類から単離することと、ｂ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｃ）細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｄ）本明細書に記載される組立体による少なくとも１つの剛性容器に試料溶液を装填することであって、試料はプランジャと接触する、前記装填することと、ｅ）プランジャを容器内で軸方向に移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞態様に形質移入することと、ｆ）任意に、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことと、ｇ）対象に、形質移入された細胞又は細胞態様を注入することとを含む。

【0073】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｂ）細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）本明細書に記載される組立体による少なくとも１つの剛性容器に試料溶液を装填することであって、試料はプランジャと接触する、前記装填することと、ｄ）プランジャを容器内で軸方向に移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｅ）対象に、形質移入された細胞又は細胞態様を注入することとを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞を哺乳類から単離することを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含む。

【0074】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法が提供され、本方法は、ａ）任意に、細胞を哺乳類から単離することと、ｂ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｃ）細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｄ）本明細書に記載される組立体による少なくとも１つの可撓性容器に試料溶液を装填することであって、試料は可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、ｅ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを容器に沿って軸方向に移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することと、ｆ）任意に、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことと、ｇ）対象に、形質移入された細胞又は細胞態様を注入することとを含む。

【0075】

少なくとも１つの実施形態の別の態様において、遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｂ）細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）本明細書に記載される組立体による少なくとも１つの可撓性容器に試料溶液を装填することであって、試料は可撓性容器の内面と接触する、前記装填することと、ｄ）少なくとも１つのウェッジ又はローラを容器に沿って軸方向に移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入し、それにより、遺伝子治療を使用して、疾患又は症状を有する対象を治療するに当たり使用される細胞を調製することとを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞を哺乳類から単離することを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含む。

【0076】

少なくとも１つの実施形態の更に別の態様において、遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法が提供され、本方法は、ａ）自己細胞、同種細胞、又は細胞様体を提供することと、ｂ）細胞又は細胞様体を、核酸、タンパク質、又はそれらの混合物を含む溶液と混合して、試料溶液を形成することと、ｃ）本明細書に記載される少なくとも１つのマイクロ流体デバイスに試料溶液を装填することであって、試料は構造と接触する、前記装填することと、ｄ）構造を少なくとも１つのチャネル内で移動させて、試料溶液を少なくとも１回、少なくとも１つの狭窄部に通して、細胞又は細胞様体に形質移入することであって、上記対象に、形質移入された細胞又は細胞様体が投与される、形質移入することとを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞を哺乳類から単離することを含む。幾つかの実施形態において、本方法は、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させて、細胞数を増やすことを含む。

【0077】

遺伝子治療を使用して疾患又は症状を有する対象を治療する方法の幾つかの実施形態において、疾患又は症状は、単一遺伝子障害、多遺伝子障害、神経疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん疾患、眼疾患、又は感染疾患である。幾つかの実施形態において、遺伝子治療は、欠陥遺伝子若しくは不適応遺伝子の置換、異常細胞の変性若しくは死滅、又は治療タンパク質の産生誘導を含む。

【0078】

幾つかの実施形態において、疾患又は症状は単一遺伝子障害又は多遺伝子障害であり、単一遺伝子障害又は多遺伝子障害は、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ／Ｘ－ＳＣＩＤ）、嚢胞性繊維症、血友病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、家族性高脂血症、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肉芽腫、ファンコニー貧血、ゴーシェ病、レーバー先天性黒内障、フェニルケトン尿症、地中海貧血症、眼皮膚白皮症、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、低リン血症性くる病、レット症候群、非閉塞性精子産生不全、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ失調症、脊髄小脳失調症、ファン・デル・ウンデ症候群、がん、心疾患、糖尿病、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、２２ｑ１１．２欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、色盲、ネコ鳴き症候群、ダウン症、血色素症、クラインフェルター症候群、プラダー・ウィリー症候群、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス病、又はターナー症候群を含む。

【0079】

幾つかの実施形態において、感染疾患は、慢性ウイルス感染、マイコバクテリア感染、細菌感染、又は寄生虫感染から生じる。幾つかの実施形態において、感染疾患は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、肝炎、マラリア、ヘルペス、バークホルデリア、クロイツフェルトヤコブ、及びヒトパピローマウイルスである。

【0080】

幾つかの実施形態において、がん疾患は、頭部がん、頸部がん、前立腺がん、脾臓がん、脳腫瘍、皮膚がん、肝臓がん、結腸がん、乳がん、腎臓がん、及び中皮腫である。

【0081】

本開示の他の特徴及び利点は、本開示の好ましい実施形態の以下の説明から及び特許請求の範囲から明らかになろう。別記されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料は、本開示の実施又はテストに使用することができるが、適した方法及び材料について以下説明する。本明細書に引用される全ての公開された外国特許及び特許出願は、参照により本明細書に援用され得。本明細書で引用されている、他の全ての公開されている参照、文献、原稿、及び科学文献は、参照により本明細書に援用される。加えて、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定を意図しない。

【0082】

実施形態は本開示の異なる態様下で説明されるが、該当する場合又は特に否定されない場合、本明細書に記載の実施形態の何れか１つを任意の他の１つ又は複数の実施形態と組み合わせることが可能なことが企図される。

【0083】

これら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明によって開示且つ／又は包含される。

【図面の簡単な説明】

【0084】

【図1】形質移入システムの模式図である。

【図2A-E】種々の容器／プランジャ組立体実施形態を示す。

【図2F-J】平坦な容器／プランジャ組立体の種々の図（側面及び上面）を示す。

【図2K】プランジャが、圧電スタックに結合された可撓性シートである平坦な容器／プランジャ組立体を示す。

【図2L】代替の容器組立体実施形態を示す。

【図2M-O】平坦構造上の高密度容器／プランジャシステムの大量作製方式を示す。

【図2P-Q】複数の狭窄部を有する容器組立体実施形態を示す。

【図2R】複数の狭窄部を有するインサートを有する容器組立体実施形態を示す。

【図2S-U】代替の容器組立体実施形態を示す。

【図3A-B】プランジャを示す。

【図3C】容器に挿入されたプランジャを示す。

【図3D】プランジャが挿入された代替の容器組立体実施形態を示す。

【図4】容器／プランジャ組立体を含む形質移入システムの筐体を示す。

【図5】形質移入プロセス中のプランジャ位置設定を示す。

【図6A-C】代替のプランジャ／容器組立体実施形態を示す。

【図7A-C】加熱ユニットの種々の図を示す。

【図8】容器狭窄部形成システムの模式図である。

【図9】４．７ｋｂプラスミド発現ベクターを用いた形質移入から４週間後のＧＦＰ４の発現を示すＮＩＨ／３Ｔ３細胞の写真を示し（左パネル：光学顕微鏡、右パネル：蛍光顕微鏡）、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、４７／４７マイクロリットル／秒の流量で１５サイクル、５０ＲＬ毛管を使用して完全培地において１５μｇのｐＡｃＧＦＰベクター（４．７ｋｂ）を用いて形質移入され、形質移入効率は約１０％であった。

【図10】Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識された２２ｋＤａタンパク質を用いて形質移入してから６時間後及び２４時間後の核局在化緑色蛍光の発現を示す、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の写真を示し（左パネル：光学顕微鏡、右パネル：蛍光顕微鏡）、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８と共役する２２ｋＤａタンパク質を用いて形質移入され、形質移入は、５０ＲＬ毛管を使用して、８μｇタンパク質を有する１００μｌ形質移入溶液中に１００，０００個の細胞を用い、３０／３０マイクロリットル／秒の流量で１５サイクルにわたって実行され、形質移入効率は９５％よりも大きかった。

【図11】Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識された２２ｋＤａタンパク質を用いて形質移入してから６時間後及び２４時間後の核局在化緑色蛍光の発現を示す、ヒーラ細胞の写真を示し（左パネル：光学顕微鏡、右パネル：蛍光顕微鏡）、形質移入は、５０ＲＬ毛管を使用して、８μｇタンパク質を有する１００μｌ形質移入溶液中に１００，０００個の細胞を用い、３０／３０マイクロリットル／秒の流量で１５サイクルにわたって実行され、形質移入効率は９５％よりも大きかった。

【図12】細胞生存率に対する流量の影響を示す写真を示し、概ね１００，０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ完全培地中に懸濁させ、５０ＲＬ毛管に４５／４５、７０／７０、及び１００／１００マイクロリットル／秒の流量で１５サイクルにわたって通し、流量値は内向き又は外向きの流量を示し、形質移入から２時間後及び２４時間後に細胞を撮影し、流量が上がるにつれて、細胞カウントは下がり、２４時間の時点は、細胞が手順を生き抜き、通常の増殖を経ることが可能であったことを示す。

【図13】細胞生存率に対する流量の影響を示す写真を示し、概ね１００，０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中に懸濁させ、５０ＲＬ毛管に４５／４５、７０／７０、及び１００／１００マイクロリットル／秒の流量で１５サイクルにわたって通し、流量値は内向き又は外向きの流量を示し、形質移入から２時間後及び２４時間後に細胞を撮影し、流量が上がるにつれて、細胞カウントは下がり、２４時間の時点は、細胞が手順を生き抜き、通常の増殖を経ることが可能であったことを示す。

【図14】細胞生存率に対する流量の影響を示す写真を示し、概ね１００，０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ完全培地中に懸濁させ、８０ＲＬ毛管に７０／７０、１００／１００、及び１１４／１１４マイクロリットル／秒の流量で１５サイクルにわたって通し、流量値は内向き又は外向きの流量を示し、形質移入から２時間後及び２４時間後に細胞を撮影し、流量が上がるにつれて、細胞カウントは下がり、２４時間の時点は、細胞が手順を生き抜き、通常の増殖を経ることが可能であったことを示す。

【図15】細胞生存率に対する流量の影響を示す写真を示し、概ね１００，０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中に懸濁させ、８０ＲＬ毛管に７０／７０、１００／１００、及び１１４／１１４マイクロリットル／秒の流量で１５サイクルにわたって通し、流量値は内向き又は外向きの流量を示し、形質移入から２時間後及び２４時間後に細胞を撮影し、流量が上がるにつれて、細胞カウントは下がり、２４時間の時点は、細胞が手順を生き抜き、通常の増殖を経ることが可能であったことを示す。

【図16】非操作コントロール細胞の写真を示し、概ね１００，０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ完全培地中又はＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中に懸濁させたが、毛管を通さず、プレーティングから２時間後及び２４時間後に細胞を撮影した。

【図17】ボツリヌス神経毒素血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）に結合する可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）をコードするｃＤＮＡに機能的にリンクされたヒト伸長因子１（ＥＦ１ａ）プロモーターを含む哺乳類発現ベクターのタンパク質の図を示し、ＶＨ及びＶＬはリンカー配列及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列によって隔てられる。

【図18】ＥＦ－１ａプロモーター、抗ＣＤ１９ｓｃＦＶ、ｃＤＮＡ、スペーサ配列、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、ＦｃエプシロンＲＩのガンマ鎖、及びＢＧＨ多アデニル化配列を含む抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードする機能カセットと、ＥＧＦＰ及びＢＧＨ多アデニル化配列をコードするｃＤＮＡに機能的にリンクされたサイトメガロウイルスプロモーターを含む増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする第２の機能カセットとを含む哺乳類発現ベクターの一部の図である。

【図19A-B】（Ａ）ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子座位の生殖細胞系マップの線図表現（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／５２６５）及び（Ｂ）ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子に機能的にリンクされたｃＭｙｃタグ配列を有するＤＮＡコンストラクトの線図表現である。

【図20】複数のセンサを用いたプロセスフロー例の模式図である。

【図21】１つのセンサ及び１つのフィードバック制御ループを有するプロセスフロー例の模式図である。

【図22】４．７ｋｂのｐＡｃＧＦＰベクターを用いた形質移入後のＧＦＰの発現を示すヒトＴ細胞（左パネル：位相像、右パネル：蛍光顕微鏡像）の一連の写真である。

【図23】容器（例えば毛管）及びインペラポンプを含むシステムを示す。

【図24】ＣＡＲ－Ｔ細胞キルアッセイの結果を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0085】

本開示は、少なくとも部分的に、分子及び細胞又は細胞様体を狭窄部に通すことによって溶液中の分子を細胞又は細胞様体に形質移入する方法に基づく。本開示は、形質移入を実行するデバイス、システム、及び方法を提供する。適切な狭窄部直径又は断面積（細胞よりも大きく、したがって、細胞が機械的に圧搾されない）が、（ａ）プランジャが試料溶液と接触する、容器と組み合わせられたプランジャ、及び／又は（ｂ）狭窄部が形成される特定の方法（即ちそのジオメトリ）、例えば容器の最小直径又は断面積と最大直径又は断面積との間の短距離又は長距離、及び／又は（ｃ）試料溶液がいかに容器に引き込まれ、再び押し戻されるか（例えば流量及び滞留時間）、及び／又は（ｂ）容器の内面の表面の粗度、及び／又は（ｅ）狭窄部の断面積のジオメトリ（例えば円形又は多角形）と組み合わせられた場合、形質移入は成功する。本明細書に提供されるデバイス、システム、キット、及び方法は、高い形質移入効率、高い細胞生存率、低いばらつき、低い細胞毒性、高速の細胞回復、及び複数の細胞サイズ及び種類に形質移入する能力を提供するため、重要である。

【0086】

デバイス／器具／システム
図１に模式的に示される形質移入システム１００が開示される。システム１００は一般に、形質移入チャンバ又は容器（例えば毛細管）及びプランジャを含む容器／プランジャ組立体１０１を含む。組立体１０１は、より詳細に後述するように、モータがプランジャを容器内において線形運動で前後に移動させるように、モータ１１４（例えばリニアモータ）に接続される。モータ１１４は、電源１１８に電気的に接続され、ユーザインターフェース１２０に接続されたユーザプログラマブルユニット１１６によって制御される。幾つかの実施形態において、ユーザインターフェース１２０は、モバイルパーソナルコンピュータ、タブレット、又はスマートフォンであり得る。ユーザインターフェース１２０は、ネットワーク接続を介してプログラマブルユニット１１６と通信し得る。幾つかの実施形態において、ネットワーク接続は、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）等の近距離無線技術であることができる。しかしながら、他の種類のユーザインターフェース１２０及びネットワーク接続も本開示によって企図される。システム１００は、更に後述するように、筐体内に少なくとも部分的に囲まれるように構成される。

【0087】

これより図２Ａを参照して、形質移入システム１００で使用される容器／プランジャ組立体１０１の第１の非限定的な実施形態を示す。容器／プランジャ組立体１０１は一般に、容器１０２と、容器１０２内に挿入可能なプランジャ１１０とを備える。幾つかの実施形態において、容器１０２は、開かれた基端部１０４ａ及び開かれた遠端部１０４ｂを有する剛性材料（ホウケイ酸ガラス等）で作られた中空円筒形体１０４を含む。しかしながら、多角形等の他の形状の本体１０４も本開示によって企図される。本体１０４の基端部１０４ａは、本体１０４の内壁１０５によって画定される第１の直径Ｄ_１を有する。幾つかの実施形態において、第１の直径Ｄ１は約５．０μｍ～約１００．０ｍｍであり、好ましくは約２．２ｍｍである。本体の遠端部１０４ｂは、試料溶液１５４に挿入するためのｓ先端部１０６を含む。図２Ａに示されるように、先端部１０６の対向する内壁１０５の少なくとも一方は、先端部１０６が、第１の直径Ｄ_１よりも小さくなるように選択された第２の直径Ｄ_２を有する狭窄部１０８を画定するように、本体１０４の遠端部１０４ｂに向かって狭まる（例えば０．２ｍｍ～１０ｍｍの距離にわたり）。遠端部１０４ｂにおける先端部１０６の終わりに向かって、狭窄部１０８は広くなる。図２Ａの実施形態において、両内壁１０５は、狭窄部１０８が本体１０４の中心軸に沿って配置されるように、等しい厚さまで狭まる。しかしながら、内壁１０５の一方のみが、狭窄部１０８が本体１０４の中心軸からずれるように狭まることができることが企図される。特に、狭窄部１０８の最小直径Ｄ_２は、形質移入中の細胞の直径の１．２倍～１００倍であるように選択される。即ち、細胞直径は典型的には、約４．５μｍ（ラット全血細胞）～約１２０μｍ（ヒト卵母細胞）の範囲である。したがって、狭窄部１０８の最小直径Ｄ_２は、約５．４μｍ～約１２０００μｍ（即ち約０．００５４ｍｍ～約１２．０ｍｍ）の範囲であるように選択される。

【0088】

幾つかの実施形態において、狭窄部１０８の最小直径の各側の流路長は約０．２ｍｍ～１０ｍｍである。最小直径狭窄部１０８における流路距離は０．１μｍ～１０ｍｍであることができる。プランジャ１１０は、容器１０２の基端部１０４ａを通して挿入可能であり、容器１０２内で軸方向に移動可能であるように構成される。プランジャ１１０の実施形態について図２及び図３に関してより詳細に説明する。

【0089】

幾つかの実施形態において、狭窄セクションを含む容器の内壁は、形質移入プロセス中、ガス球密度（ｇａｓ ｓｐｈｅｒｅ ｄｅｎｓｉｔｙ）及びサイズを制御するような粗度を有する。表面粗度は、フローの境界条件、ひいては細胞に付与される応力／エネルギーを制御且つ変更する。粗度に応じて、試料溶液と容器との間の境界面における局所フローは、層流から非層流に変更することができ、最適な形質移入結果の達成に必要な狭窄部サイズ及び流量要件に影響する。容器の内面表面の平均粗度数は１ｎｍ～１０μｍの範囲、より具体的には１０ｎｍ～１μｍの範囲であることができる。容器の内壁は、エッチング、サンドブラスト、成形、表面への分子若しくは粒子の吸着、又は表面への分子若しくは粒子の化学結合等の既知の機械的又は化学的粗化法によって粗化することができる。

【0090】

一実施形態において、表面粗度は、分子を表面上に吸着させることによって作成され、それにより、形質移入率が大幅に上がる。特定の実施形態において、表面粗度は、細胞断片を狭窄部近傍の容器の内壁に吸着させることによって作成された。光学顕微鏡法を用いて定性的に査定される形質移入効率は、大幅に上がった（５０％越の改善）。粗度は、細胞直径と同様の寸法であり、即ち１～１０μｍの範囲であった。

【0091】

図２Ｂ～図２Ｅは、容器／プランジャ組立体１０１内に狭窄部１０８を形成する代替の方法を示す。図２Ｂにおいて、狭窄部１０８は、本体１０４の外径Ｄ_３が「砂時計」形をなすように、本体１０４の外径Ｄ_３の狭まりにより本体１０４の中心軸に沿って形成される。例えば、外径Ｄ_３は１ｍｍ～５ｍｍの距離にわたって狭まり、次いで本体１０４の遠端部１０４ｂへの１ｍｍ～５ｍｍの距離にわたって再び広がり得る。図２Ｃにおいて、本体１０４は、金属、窒化物、酸化物、カーバイド、及びポリマー等の可撓性材料を含む。本体に使用することができるポリマーの代表的な例には、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリカプロラクトン、ラテックス、及び他のエラストマーがある。少なくとも１つのウェッジ１２６が片側又は両側から本体１０４内に締められて、狭窄部１０８を形成する。一方のプランジャ１１０ａが狭窄部１０８の近くに位置決めされ、別のプランジャ１１０ｂが狭窄部１０８の逆側に位置決めされる。プランジャ１１０ａと１１０ｂとの間の距離は、試料溶液１５４の所望の容量に基づいて様々であることができる。両プランジャ１１０ａ、１１０ｂは試料溶液１５４と接触し、両プランジャ１１０ａ、１１０ｂは同じ方向に移動して、狭窄部１０８を通るように試料溶液１５４を駆動する。試料溶液１５４が狭窄部１０８を通ると、プランジャ１１０ａ、１１０ｂは各々逆方向に移動する。この前後移動は、所望のサイクル数、繰り返すことができる。他の実施形態において、プランジャは、キャップ１１０ｃと狭窄部１０８との間に相対線形運動がある限り、狭窄部１０８を形成するウェッジ１２６ａ、１２６ｂが本体１０４に沿って移動する際、位置が固定されたキャップ１１０ｃで置換される。ウェッジ１２６ａ、１２６ｂの形状、サイズ、及び位置は、狭窄部のサイズを変更するように調整することができる。

【0092】

図２Ｄにおいて、本体１０４は可撓性材料で作られ、基端部１０４ａ及び遠端部１０４ｂは両方とも、試料溶液１５４が充填された後、プラグ又はキャップで封止される。狭窄部１０８は、本体１０４に沿って位置決めされたローラ１２８によって形成され、ローラ１２８は本体１０４に向けて下げられて、２つの固定されたキャップ１１０ｃ間に本体１０４の中心軸からずれた移動狭窄部１０８を作り出す。この実施形態において、ローラ１２８は本体１０４の長さに沿って側方に移動し、それにより試料溶液１５４は狭窄部１０８を通って流れるように強いられる。代替的には、図２Ｅに示されるように、２つのローラ１２８ａ、１２８ｂを使用して、本体１０４の長さに沿って連携して回転して、２つの固定されたキャップ１１０ｃ間に本体１０４の中心軸に沿った移動狭窄部１０８を作り出すことができる。したがって、これらの実施形態において、プランジャの機能はローラ１２８、１２８ａ、１２８ｂによって実行され、これらは移動すると、容器１０４内の溶液を狭窄部１０８に押し通す。

【0093】

他の実施形態図２Ｆ～図２Ｋにおいて、容器１０２は、ＳＵ８構造、他の付加層、例えばＳｉＯ_２、Ｓｉ_３Ｎ_４を用いた表面微細加工、非矩形構造用の格子面（ｇｒａｄｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ）エッチング（イオンミリング）、Ｓｉバルク微細加工、ＤＲＩＥ法、Ｓｉ埋め込みキャビティ技術（ＢＯＳＣＨ）、又はマイクロ成形及びマイクロプリント技法等の当業者に既知の小型化及び微細化技法を使用して平坦な表面又は基板１６０上に設計される。そのような容器１０２（例えばマイクロ流体デバイス）は、非常に小さな試料溶液量（例えば１０μｌ以下）が関わる形質移入に使用されるように構成される。容器１０２は、平坦構造１６２によって形成された１つ又は複数の狭窄部１０８を有する１つ又は複数の流路又はチャネル１６４を含む。全ての実施形態において、プランジャ１１０ａ、１１０ｂは、容器１０２内に挿入可能であり、試料溶液１５４を１つ又は複数の狭窄部１０８に通すように構成される。容器は管接続１６６を含み、これは、デバイスのマイクロ流体構造と形質移入前試料溶液リザーバとの間の境界面をなす。狭窄部を含むマイクロ流体構造の他端部に配置された管接続境界面もあり、この管接続は、マイクロ流体構造と形質移入後試料収集リザーバとの間の境界面をなす。図２Ｆは、厚膜及び薄膜作製プロセスを使用する形質移入デバイスの設計の断面図であり、図２Ｇは上面図であり、図２Ｉ～図２Ｊは図２Ｆの特定のエリア／部分の断面である。幾つかの実施形態図２Ｋにおいて、プランジャは、圧電スタック１１３ａ、１１３ｂと接触し、圧電スタック１１３ａ、１１３ｂによって給電される可撓性シート１１１ａ、１１１ｂである。幾つかの実施形態において、圧電相互作用が弾性表面波デバイスによって提供される。可撓性シートは、窒化物、酸化物、金属、及びポリマー等の無機材料で作ることができる。使用することができる代表的なポリマーには、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリウレタン、及びポリカプロラクトンがある。形質移入後、試料が、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスの狭窄部分の他端部に接続されるバルクリザーバに収集されることが更に企図される。図２Ｆ～図２Ｋの更に他の実施形態において、容器１０２は、大量の試料（例えば数リットル）を使用して形質移入を実行するために、フロースルーシステムとして設計される。大量試料システムでは、管１６６は延長され、又は大型容器に繋がる。

【0094】

図２Ｌにおいて、本体１０４は、試料溶液１５４が充填された可撓性材料で作られる。狭窄部１０８は、本体１０４に沿って位置決めされ、本体１０４に向かって下がり、本体１０４の中心軸からずれた移動狭窄部１０８を作り出すローラ１２８によって形成される。この実施形態において、ローラ１２８は、シャトル組立体１８８／１９０を移動させることによって本体１０４の長さに沿って側方に移動し、それにより、試料溶液１５４が狭窄部１０８を通って流れるように強いる。追加又は代替として、本体１０４は駆動ローラ１８２に沿って側方平面に沿って移動し、試料溶液１５４が狭窄部１０８を通って流れるように強いる。本体１０４内の試料溶液１５４の運動は、外部遮断機構１８６を押下して本体１０４を完全に閉じることによって停止することができる。駆動ローラ１８２は、押下／退避機構１８４によって退避して、本体１０４を駆動ローラ１８２外に移動させて、形質移入後の試料を収集することができる。本体１０４には、基端部又は遠端部（図示せず）における開口部１８０を通して試料溶液１５４が充填される。図２Ｌに示されるようなデバイスの機能動作は、図２Ｄに示されるようなデバイスのものと同等である。

【0095】

図２Ｍ～図２Ｏは、平坦式シリアルシート作製からロールツーロール作製までの容器／プランジャの大量作製を可能にする作製方式を示す。図２Ｍは、加熱ステップ又はポリマー架橋ステップを用いてサポートされて、ツールからシート形熱可塑性又は架橋可能ポリマーシートにチャネルパターンを転写することができるエンボスプロセスを示す。膨大な並列チャネルシステムを製造することができる。

【0096】

図２Ｎは、熱接合、接着接合、又は溶剤接合等の方法に基づく接合プロセスを示す。一方又は両方のシートは予め形成することができる。さらに、２つ以上の層を接合して、３Ｄチャネルシステムを平面に形成することができる。半円の断面を有するチャネルを有する２つの予め形成されたシートを使用することにより、所望の場合、円形断面の容器構造を作ることができる。

【0097】

図２Ｏは、作製方式をいかにロールツーロールプロセスに移すことができるかを示す。

【0098】

プランジャは、接合プロセスステップ前又は後、チャネル内に直接挿入することができ、又はポリマーシートの形成された入口を通して接続することができる。熱可塑性架橋可能ポリマーを使用することができ、好ましくは、生体適合性材料が使用される。

【0099】

図２Ｐは、２つ以上の狭窄部１０８ａ及び１０８ｂを有する容器１０２を示す。プランジャ（図示せず）は基端部１０４ａにおいて挿入される。これは、２つの狭窄部がある説明のための例であるが、３つ以上の狭窄部を有する容器も考えられる。複数の狭窄部は、同じ直径若しくは断面積又は異なる直径若しくは断面積であることができる。異なる直径又は断面積を有することの一利点は、最小狭窄部が、試料内の最大の細胞のいかなる機械的圧搾又は制約も回避するのに十分に大きい限り、異なるサイズの細胞に同時に形質移入することができることである。

【0100】

図２Ｑは、複数の狭窄部１０８ａ、１０８ｂ、１０８ｃと、喀痰部１１０ａ及び１１０ｂにプランジャを有する容器１０２を示す。プランジャは同じ方向に移動して、細胞及び形質移入する分子を含む試料溶液１５４を複数の狭窄部に通す。これは３つの狭窄部がある説明のための例であるが、様々な数の狭窄部を有する容器も考えられる。複数の狭窄部は、同じ直径若しくは断面積又は異なる直径若しくは断面積であることができる。

【0101】

図２Ｒは、複数の狭窄部１０８ａ～１０８ｆと、同じ方向に移動して、細胞及び形質移入される分子を含む試料溶液１５４を複数の狭窄部に通す２つのプランジャ１１０ａ及び１１０ｂとを有する容器１０２の側面図を示す。狭窄部は着脱可能なインサート１０７内に配置される。インサート１０７の断面図（ＡからＢ）は、複数の狭窄部１０８ａ～１０８ｆ及び記されていない他の狭窄部を示す。インサートは、複数の容器又は複数のチャネルを含み、各容器又はチャネルは少なくとも１つの狭窄部を有する。複数の狭窄部は、同じ直径若しくは断面積又は異なる直径若しくは断面積であることができる。この説明のための実施形態は、大量の試料を形質移入するのに有利である。

【0102】

図２Ｓ及び図２Ｔは、平滑ではなく、むしろ内壁１０５から離れて、試料溶液１５４を含むことができる容器１０２の内部空間に突出するリップル１０９ａ～１０９ｆを含む内壁１０５を有する容器１０２を示す。図２Ｓにおいて、リップル１０９ａ～１０９ｆは「円形」構成で示されており、即ち、示される断面図では、リップル１０９ａ～１０９ｆは、３Ｄ空間において、リップル１０９ａ～１０９ｆが円筒形容器１０２に一連の円を形成するように、互いに直接対向しない。図２Ｔでは、リップル１０９ａ～１０９ｆは「螺旋」構成で示されており、即ち、示される断面図では、リップル１０９ａ～１０９ｆは、３Ｄ空間において、リップル１０９ａ～１０９ｆが管状容器１０２に螺旋を形成するように、互いに直接対向するように見えない。最小狭窄部１０８に関しては、図２Ｓは比較的長い線形距離（１ｍｍ以上）にわたる狭窄部１０８’’を示し、それと比較して、図２Ｔは、より短い線形距離（１ｍｍ未満）にわたる狭窄部１０８’を示す。これらの特徴が変更可能且つ相互交換可能であり、例えば、容器が、長い線形距離の狭窄部とペアになった螺旋リップルを有してもよく、又は容器が短い線形距離の狭窄部とペアになった円形リップルを有してもよいことが考えられる。

【0103】

図２Ｕは、平滑な内壁１０５、容器１０２の出口、即ち遠端部１０４ｂに配置された最小狭窄部を有する容器１０２を示す。この代表的な例では、容器の内壁１０５は非対称である。

【0104】

図２Ｓ～図２Ｕの図示の容器１０２では、プランジャ１１０（図示せず）は、基端部１０４ａの、遠端部１０４ｂに可能な限り近い開始位置に挿入可能である。幾つかの実施形態において、高形質移入結果を得るために、即ち、例えば細胞の３０％を越える、多数の形質移入された細胞又は細胞様体を得るために、試料溶液１５４は、プランジャ１１０と接触するようにそのような容器１０２に予め装填される。

【0105】

これより図３Ａ及び図３Ｂを参照して、容器／プランジャ組立体１０１のプランジャ１１０の実施形態を側面図で示す。図３Ａに示されるように、プランジャ１１０は、基端部１３０ａ及び遠端部１３０ｂを有するロッド１３０を備える。ロッド１３０は、ステンレス鋼又はプラスチック等の剛性材料で構成し得る。先端部１３２は、プランジャ１１０の遠端部１３０ｂに結合される。先端部１３２は、ポリイミド又はＴｅｆｌｏｎ（商標）等の「粘着しない」性質を有するポリマー並びにポリプロピレン、ポリエチレン、ポリウレタン、及びポリカプロラクトン等の生体適合性ポリマー及びポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びコラーゲン等の生分解性材料で構成し得る。先端部１３２は円錐形（図３Ａ）又は円筒形（図３Ｂ）を有し得、容器１０２の狭窄部１０８に可能な限り近くに挿入され、容器１０２の第１の直径Ｄ^１内に気密且つ液密封止を形成するような寸法である。先端部１３２の長さは約１ｍｍ～３ｍｍであり得る。ロッド１３０の基端部１３０ａは、更に後述するように、形質移入システム１００の電動アーム１４０（図示せず）にプランジャ１１０を取り付けるように構成されたアタッチメント１３４を有する。プランジャ１１０の全長は、プランジャ１１０が容器１０２に完全に挿入されたとき、容器１０２の基端部１０４ａが電動アーム１４０の移動を制限しないように、プランジャ１１０の基端部１３０ａが容器１０２の開放基端部１０４ａを越えて延びるよう選択される。容器１０２に挿入されたとき、プランジャ１１０の先端部１３２は、試料溶液－プランジャ境界面に空気が存在しないように、試料溶液１５４と接触する。同様に、プランジャが圧電スタック１１３ａ、１１３ｂによって給電される可撓性シート１１１ａ、１１１ｂである実施形態において、可撓性シート１１１ａ、１１１ｂは、試料溶液－可撓性シート境界面に空気が存在しないように、試料溶液１５４と接触する。

【0106】

上述した実施形態図２Ａ～図２Ｌにおいて、容器又はチャネルは円筒形であり、直径という用語はその通常の意味で使用される。即ち、円筒形容器の断面の直径又は直径は、円の中心を通る線分又は端点が円上にある線分を指す。代替の実施形態において、容器又はチャネルは楕円形又は多角形であることができる。多角形の代表的な例には、三角形、正方形、矩形、五角形、六角形、七角形、八角形等がある。多角形容器又はチャネルの場合、断面積は、形質移入中の細胞の断面積の１．５倍～１０，０００倍である。偶数の辺を有する多角形容器又はチャネルの場合、対向する壁間の最小距離は、細胞直径の少なくとも１．２倍である。全ての場合で、細胞が通る容器又はチャネルの最小サイズは、細胞が狭窄部を通る際、細胞のいかなる機械的圧搾又は制約も回避するのに十分に大きいものでなければならない。

【0107】

図３Ｃ及び図３Ｄは、プランジャ１１０が容器１０２に挿入された状態の容器／プランジャ組立体１０１の実施形態を示す。幾つかの実施形態において、容器１０２は熱可塑性材料を使用して成形される。プランジャ１１０の先端部１３２は円錐形であり、鈍端（図３Ｃ）又は尖端（図３Ｄ）を有する。先端部１３２を含むプランジャ１１０は、熱可塑性材料を使用して成形される。図３Ｄにおいて、プランジャ／先端部１１０／１３２は、プランジャ／先端部１１０／１３２と容器の内壁との間に空間があったとしてもわずかなように、容器１０２の狭窄セクションに適合するように成形される。

【0108】

これより図４を参照して、容器／プランジャ組立体１０１を含み、容器／プランジャ組立体１０１を動作させるための筐体１５０の一実施形態を透視図で示す。筐体１５０は、主にベンチ若しくはテーブルに配置されるようなサイズであり得、又は代替的には可動式である。図４に示されるように、筐体１５０は、形質移入システム１００のモータ１１４及びユーザプログラマブルユニット１１６を収容する。モータ１１４は、モータ１１４がアーム１４０を線形「前後」運動で移動させるように、可動式アーム１４０に結合される。そしてアーム１４０は、アーム１４０が容器１０２を通して線形運動でプランジャ１１０を移動させるように、プランジャ１１０のアタッチメント１３４に結合される。容器１０２は、容器１０２の先端部１０６が試料溶液１５４と接触するように、クランプ１４２又は他の構造によって筐体１５０に対して固定し得る。容器１０２を保護するために、シールド１５２を筐体１５０に取り付け得る。幾つかの実施形態において、形質移入システム１００は、容器／プランジャ組立体１０１を通る前及び通った後、試料溶液１５４を保持するための試料リザーバ１１５を含む。

【0109】

これより図５を参照すると、ユーザインターフェース１２０を使用して、容器１０２の本体１０４内のプランジャ１１０の開始位置１２２を設定する。開始位置１２２において、プランジャ１１０は本体１０４の基端部１０４ａにおいて挿入され、狭窄部１０８の可能な限り近くのエリア（即ち容器１０２の内壁１０５が狭窄し始めるポイント）に進められる。プランジャ１１０の先端部１３２と狭窄部１０８の端部との間の容積には、試料溶液１５４とプランジャ１１０との間に空気空間がないように、試料溶液１５４が予め充填される。代替的には、プランジャ１１０の先端部１３２と狭窄部１０８の端部との間の容積には、形質移入される細胞を差し引いた試料溶液（即ちバッファー又は培地溶液）が予め充填される。幾つかの実施形態において、プランジャが試料溶液と直接接触していることが形質移入結果にとって重要であるため、そのような事前充填が好ましい。プランジャと試料溶液との間にエアギャップがある場合、エアギャップによりギャップのサイズに応じた膨張及び収縮が生じ得るため、試料溶液の流量は再現可能に制御することができない。これは、狭窄部を通る試料溶液の精密制御を低下させるか、又はなくし、したがって、形質移入結果の再現性を低下させるか、又はなくす。

【0110】

事前充填は、医療用シリンジで気泡がなくなるのと同様に達成される。即ち、細胞あり又は細胞なしの試料溶液が、プランジャ１１０を遠端部から引き離すことによって容器１０２に追加され、組立体１０１は、空気が逃げるように反転され、プランジャ１１０は容器１０２の遠端部に向かって押下される。次いでユーザインターフェース１２０を使用して、プランジャ１１０の移動を、プランジャ１１０を狭窄部１０８から離れて移動させる所望の「前」速度まで加速させることができる。そしてこれは、狭窄部１０８を通して、細胞及び形質移入される分子含む試料溶液１５４を容器１０２中に引き入れる。プランジャ１１０はまず、オフセット位置１２４に移動する。次いでユーザインターフェース１２０を使用して、プランジャ１１０の移動を減速させ、所望量の試料溶液１５４が狭窄部１０８を通って移動完了した第２の位置１２３で停止させることができる。次いでユーザインターフェース１２０を使用して、プランジャ１１０を狭窄部１０８に向けて移動させ、狭窄部１０８を通して試料溶液１５４を押す所望の「後」速度までプランジャ１１０の移動を加速させることができる。次いでユーザインターフェース１２０を使用して、プランジャ１１０の移動を減速させ、開始位置１２２からずれた第３の位置１２４で停止させることができる。次いでプランジャ１１０の前後移動は、所望のサイクル数、繰り返される。所望のサイクル数が完了した後、プランジャ１１０は第３の位置１２４から元の開始位置１２２に移動する。各流入（位置１２４から１２３への移動）と流出（位置１２３から１２４への移動）との間で、プランジャ位置はある時間期間（１２５ａ及び１２５ｂ）にわたって保持される。

【0111】

図６Ａ～図６Ｃは、容器１０２を予め充填するための代替の設計を示す。図６Ａ及び図６Ｂは、プランジャ１１０を通って延びる封止可能な真空管を含み、これは試料溶液１５４をリザーバ１１５（図示せず）から容器１０２に引き入れるのに使用することができる。図６Ｃは、プランジャ１１０に付着した非圧縮性材料１３２ａを有する代替の設計を示す。図６Ｃの代替は、まず、高粘度変形可能フェーズの非圧縮性材料１３２ａをプランジャ１１０の表面上に配置することによって形成される。次いで、狭窄部に「適合」するまで、プランジャ１１０を狭窄部１０８に向かって押す。次いでプランジャは加熱されて、粘性材料を非圧縮性材料１３２ａに硬化させる。

【0112】

本開示により、システム１００が、試料溶液１５４を所望の温度に維持するための加熱ユニットを含むことができることが企図される。例えば、ペルチェデバイスが、特に室温よりも高い又は低い温度での動作サイクルが求められる場合、低熱エネルギーバランスで温度調整及び制御を行う実用的な方法を提供する。図７Ａは、小試料流体量での試料流体温度制御ユニット２００を示し、小容器容積を有する断熱材で囲まれた熱ブロック２０１を使用することができる。穴２０３が、本明細書に記載されるシステムの容器１０２に適合するのに適切なサイズの銅円柱体に穿孔される。ペルチェデバイス２０５の両側での試料開口部の近くで、温度センサ２０７が熱ブロック２０１に取り付けられて、試料容器に適用される温度を測定し、温度制御ループへのフィードバックを提供する。ペルチェデバイス２０５の下には、熱交換器２１１及びベンチレータ２１３がある。

【0113】

図７Ｂは、温度ブロック２０１及び試料穴２０３の正面図である。

【0114】

図７Ｃは、熱ブロック２０１及び断熱材２０９の周縁に向かって延びるスロットのような試料穴２０３を有する一実施形態を示す。形質移入プロセスを観測するための切り込みが断熱材２１５に存在する。熱ブロック２０１は、接着されたガラス板２１７又はカットされたガラス管の一部で閉じられる。

【0115】

ブロックは、容器１０２を穴２０３に挿入することができるように、容器－プランジャ組立体の下の形質移入器具のフロントパネルに搭載される。

【0116】

システム１００が、複数のプランジャ１１０を動作させる複数のアーム１４０を含むことができることが更に企図され、各プランジャ１１０は容器１０２の内部に配置される。複数の容器１０２は、種々の試料溶液量を収容するように、異なるサイズであることができる。各狭窄部を通る異なるプランジャ速度及び異なるサイクル数等の種々の形質移入パラメータに適応するために、複数のアーム１４０は複数のモータ１１４に接続することができる。

【0117】

システム１００が、任意にユーザインターフェースに接続された光センサ（図示せず）を含むことができることが更に企図される。

【0118】

図２３は、容器（例えば毛管）及びインペラぽん法を含む一実施形態を示す。この実施形態において、流体（即ち細胞及び形質移入される分子と一緒の試料溶液）は、プランジャの線形運動ではなく、回転部品（インペラ）を通して移動する。インペラポンプは、ポンプケースに沿って試料流体を駆動する回転構成要素を含む。ポンプケースは、狭窄部を有する容器に接続され、したがって、流体はポンプから容器及び狭窄部を通して駆動される。これにより、容器狭窄部を通る試料流体の連続フローが可能になり、したがって、大量の試料流体に対応することができる形質移入デバイス設計が可能になる。オープンインペラ及びセミクローズド又はクローズドインペラが使用可能であるのと同様に、プロペラ、パドル、又はタービンの概念を使用した軸方向又は半径方向設計も使用可能である。

【0119】

本明細書に開示されるデバイス、器具、及びシステムにおいて、プランジャは試料溶液と直接接触する。プランジャは、部品のいずれも圧縮可能ではなく、試料溶液と混ざらず、且つ試料溶液と直接接触する限り、固体部品、液体部品、又はそれらの組合せからなることができる。

【0120】

ポンプのインペラ設計には、試料溶液を移動させるポンプの部品と試料溶液自体との間には空気又は圧縮可能な境界面はない。

【0121】

ポンプ設計は、ダイレクトリフト、変位、又は重力ポンプ設計であることができる。他の設計には、往復（プランジャが前後に移動する）設計又は回転（例えばインペラ）設計があり、正変位ポンプ又は遠心流若しくは軸流ポンプのいずれかになる。これらの設計には、マイクロポンプ設計及び内歯車ポンプ設計、スクリューポンプ設計、シャトルブロックポンプ設計、可撓性、摺動、若しくは回転ベーンポンプ設計、外周ピストンポンプ設計、可撓性インペラポンプ設計、螺旋捻転型ルーツポンプ設計（例えばウェンデルコルベン（Ｗｅｎｄｅｌｋｏｌｂｅｎ）ポンプ）、若しくは液封式ポンプ設計；ピストンポンプ設計、プランジャポンプ設計、ダイアフラムポンプ設計、ロープポンプ設計、チェーンポンプ設計、歯車ポンプ設計、スクリューポンプ設計、蠕動ポンプ設計、又は三連式プランジャポンプ設計がある。

【0122】

プランジャは、先に列記した固体プランジャと直に接触する安定化強磁性流体から油まで及ぶことができる。本明細書に記載されるプランジャに加えて、流体の流れを生じさせるあらゆるものはプランジャとして使用することができる。

【0123】

成功の鍵は、プランジャが、部品のいずれも圧縮可能ではなく、試料溶液と混ざらず、且つ試料溶液と直に接触する限り、固体、液体、又はそれらの組合せからなることである。

【0124】

キット
形質移入を実行するためのキットが開示される。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されるような容器／プランジャ組立体を含む。他の実施形態において、キットは本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスを含む。幾つかの実施形態において、キットはバッファー又は培地を含み、バッファー又は培地は、別個のバイアルで提供することもでき、容器／プランジャ組立体内若しくはマイクロ流体デバイス内に含まれて提供することもできる。幾つかの実施形態において、バッファー又は培地は細胞又は細胞様体を含む。

【0125】

幾つかの実施形態において、キットは、本開示の方法に従って使用するための使用指示を更に含む。幾つかの実施形態において、これらの使用指示は、本明細書に記載される方法の何れかに従った形質移入の実行の仕方の説明を含む。一般に、使用指示は、試薬の種類（例えばバッファー及び／又は培地）、量、及び濃度、細胞又は細胞様体の濃度、プランジャ位置、加速度及び減速度を含むプランジャ速度、並びにプランジャ保持時間についての情報を含む。

【0126】

方法
溶液中の分子又は組成物を細胞又は細胞様体に導入する方法が開示される。

【0127】

幾つかの実施形態において、分子又は組成物は、細胞又は細胞様体と一緒に溶液中に存在する。幾つかの実施形態において、溶液又はその試料は、狭窄セクションを有する本明細書に記載されるような容器に装填される。溶液又はその試料は、少なくとも１回、狭窄部に通される。

【0128】

幾つかの実施形態の方法を実行する場合、プランジャは試料溶液と直接接触することができる。

【0129】

理論による拘束を意図せず、本明細書に記載される形質移入プロセスが、エンドサイトーシスを引き起こし、溶液又はその試料に含まれる分子又は組成物の形質移入を生じさせる気体球及び真空球の生成をトリガーすると信じられる。幾つかの実施形態において、生成される球は約０．１ｎｍ～約１００μｍである。他の実施形態において、生成される球は約１μｍ～約１０μｍである。他の実施形態において、生成される球は約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、又は約１５０μｍである。球はプランジャ移動に起因して生成し得るが、幾つかの実施形態において、ガス（即ち気体球）又は固体材料（即ち固体球）は、試料装填中に追加されて、試料溶液の粘度、フローパターン、又は他のパラメータを変更し得る。気体球の代表的な例には、限定ではなく、酸素、窒素、又は二酸化炭素の追加によって作られるものがある。固体球の代表的な例には、限定ではなく、ガラスビード、ラテックスビード、ポリマービード、糖粒子、塩粒子、セルロース粒子、ポリマー粒子、脂質ビヒクル、リポソームビヒクル、又は不活性細胞等の不活性有機又は無機材料がある。幾つかの実施形態において、生体適合性ポリマーを粒子又はビードに使用することができる。粒子又はビードに使用することができるポリマーの代表的な例には、限定ではなく、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（フマル酸プロピレン）（ＰＰＦ）、ポリ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｆｕｍａｒａｔｅ）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、及びコラーゲンがある。

【0130】

気体球の核生成及び気体球の密度は、容器又はチャネルの内面の粗度及び形質移入溶液中のガスの分圧によって制御することができる。算術平均粗度は１ｎｍ～１０μｍ、より具体的には１０ｎｍ～１μｍの範囲であることができる。ガス分圧は、形質移入溶液の１０００パスカル～２００，０００パスカル、より具体的には１０，０００パスカル～１２０，０００パスカルの範囲であることができる。

【0131】

幾つかの実施形態において、分子又は組成物が導入されている細胞（即ち形質移入されている細胞）は原核細胞又は真核細胞である。原核細胞の代表的な例には、細菌、シアノバクテリア、又は古細菌がある。真核細胞の代表的な例には、動物細胞、植物細胞、原生生物、及び真菌がある。幾つかの実施形態において、分子又は組成物が導入されている細胞（即ち形質移入されている細胞）は、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、基底細胞、脂肪細胞、角膜実質細胞、軟骨細胞、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、網状赤血球、又は血小板を含む造血細胞、幹細胞（造血幹細胞、胚性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞を含む）、脾臓細胞、腎細胞、膵細胞、肝細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞、平滑筋細胞、心臓細胞、肺細胞、眼細胞、骨髄細胞、配偶子（卵母細胞及び精子細胞）、胎児臍帯血細胞、前駆細胞、腫瘍細胞、末梢血単核球、免疫細胞（限定ではなく白血球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、顆粒球、自然リンパ球、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、又は好中球を含む）を含む動物細胞である。

【0132】

幾つかの実施形態において、細胞は、生理学的不活性な細胞、例えば阻害、ＵＶ不活化、除核、無核化、又は加熱死滅された細胞を含む。特定の実施形態において、細胞は、非生殖細胞又は人工膜を有する合成細胞を含む。特定の実施形態において、細胞は正常細胞、感染した細胞、又は異常細胞を含む。

【0133】

幾つかの実施形態において、細胞は一次細胞である。他の実施形態において、細胞は培養される。幾つかの実施形態において、細胞は、本明細書に記載される方法で使用されるとき、細胞の大半が同じ細胞周期フェーズであるように同期される。

【0134】

幾つかの実施形態において、細胞は自己細胞である。自己細胞は、ドナー及びレシピエントの両方として機能する１つの対象からの細胞であり、即ち、細胞は対象から単離され、ｅｘ ｖｉｖｏで修飾又は処理され、同じ対象に再び導入される。他の実施形態において、細胞は同種細胞である。同種細胞は、ドナー対象から単離され、ｅｘ ｖｉｖｏで修飾又は処理され、ドナー対象と異なるレシピエント対象に導入される細胞である。

【0135】

幾つかの実施形態において、分子又は組成物は細胞様体に導入される。細胞様体の代表的な例には、限定ではなく、エクソソーム、小胞、細胞小器官、膜結合細胞内小胞、細胞由来又は合成由来膜結合小胞、及び細胞由来又は合成由来細胞内小胞がある。

【0136】

上述したように、幾つかの実施形態において、細胞は、細胞の直径の２倍～１０倍の狭窄部に通される。典型的には、動物細胞は約４．５μｍ～１２０μｍの範囲の細胞直径を有する。代表的な細胞及びそれらの平均直径を表１に列記する。

【0137】

表１

【表1】

【表1-2】

【0138】

幾つかの実施形態において、形質移入前、細胞は生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）の細胞培養培地又は緩衝液中に懸濁する。緩衝液の代表的な例には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びＭ１９９、ＲＰＭＩー１６４０、ＤＭＥＭ、又はＩＭＤＭ等の細胞培養培地がある。他の生理学的適合性の緩衝液及び細胞培養培地が当技術分野で既知であり、形質移入される細胞の種類と細胞に導入される材料との組合せに基づいて適宜選択することができる。

【0139】

種々の実施形態において、約１０００万個の細胞までが１００μｌ溶液中に含まれる。幾つかの実施形態において、約１００万個の細胞が１００μｌ溶液中に含まれる。他の実施形態において、約１万個の細胞が１００μｌ溶液中に含まれる。本明細書に記載される方法で使用される組立体のサイズ及び形状は、数千万個又はそれを越える細胞を含む数リットルまで及び数リットルを越える試料容量から１個以上の細胞を含むサブマイクロリットルという小量に適応するように様々であることができる。

【0140】

種々の実施形態において、細胞に導入される分子又は組成物には、限定ではなく、核酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ウイルス化合物（例えばウイルス及びウイルス様粒子）、有機及び／又は無機化合物、合成ポリマー、薬物、医薬組成物、又はそれらの組合せ若しくは混合物がある。

【0141】

核酸の代表的な例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子、及びｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡ又はＲＮＡの安定性又は半減期を増大させる１つ又は複数のヌクレオチドが修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡがある。幾つかの実施形態において、ＤＮＡはｃＤＮＡ及びメチル化ＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡを含む。幾つかの実施形態において、核酸はベクター、プラスミド、又はトランスポゾンである。幾つかの実施形態において、核酸は、タンパク質又はペプチドをコードする核酸を有する発現ベクターである。特定の実施形態において、発現ベクターは抗体、抗体断片、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。

【0142】

合成ポリマーの代表的な例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）がある。ウイルス化合物の代表的な例には、ウイルス及びウイルス様粒子がある。

【0143】

タンパク質の代表的な例には、限定ではなく、構造タンパク質（例えばケラチン）、収縮タンパク質（例えばアクチン）、貯蔵タンパク質（例えば卵白）、防御タンパク質（例えば抗体）、輸送タンパク質（例えばヘモグロビン）、シグナル伝達タンパク質（例えばホルモン）、及び酵素タンパク質（例えばラクトース）がある。特定の実施形態において、タンパク質は抗体、抗原、ホルモン、酵素、又は任意の天然タンパク質である。ペプチドの代表的な例には、限定ではなく、合成タンパク質又は天然若しくは合成短鎖ペプチドがある。

【0144】

抗体の代表的な例には、限定ではなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体がある。抗体は、任意の種の動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、又はネコから取得し得る。幾つかの実施形態において、使用し得る抗体のクラスには、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＭ、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体がある。使用し得る抗体又は抗体断片には、単鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、例えばジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、単一可変領域ドメイン（ｄＡｂｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、コンビボディ（ｃｏｍｂｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ及びマルチｓｃＦｖ等の多価抗体、ナノボディ等のラクダ科からの単一ドメイン又は遺伝子操作されたヒト等価物、及びＦａｂ発現ライブラリによって産生される断片がある。

【0145】

細胞に導入される分子又は組成物の組合せの代表的な例には、タンパク質と遺伝材料（即ち核酸）との混合物、例えば遺伝子編集成分又は遺伝子編集複合体を含むリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）がある。特定の実施形態において、遺伝子編集成分又は遺伝子編集複合体は、限定ではなく、Ｃａｓタンパク質又はＣｐｆ１タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ドナーＤＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）等のＣＲＩＳＰＲ成分を含む。更に他の実施形態において、遺伝子編集成分又は遺伝子編集複合体は、限定ではなく、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、又はＣｒｅリコンビナーゼを含む。

【0146】

医薬組成物の代表的な例には、限定ではなく、抗腫瘍薬、抗ウイルス薬、抗細菌薬、抗マイコバクテリア薬、抗真菌薬、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、抗遊走剤（ａｎｔｉ－ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、毒素結合剤、受容体分解薬、内部シグナル伝達カスケード分断薬（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）、及び抗アポトーシス剤がある。

【0147】

形質移入効率に影響する１つのパラメータには、形質移入ごとに使用される遺伝材料（例えば核酸）又はタンパク質の量がある。幾つかの実施形態において、形質移入ごとに使用されるＤＮＡ又はタンパク質の量は約２０～１５０μｇ／ｍｌである。他の実施形態において、形質移入ごとに使用されるＤＮＡ又はタンパク質の量は約１～１０００μｇ／ｍｌである。他の実施形態において、形質移入ごとに使用されるＤＮＡ又はタンパク質の量は、約１μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１３０μｇ／ｍｌ、約１４０μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１６０μｇ／ｍｌ、約１７０μｇ／ｍｌ、約１８０μｇ／ｍｌ、約１９０μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、又は約１０００μｇ／ｍｌである。形質移入効率に影響する別のパラメータには、形質移入ごとに使用される遺伝材料（例えば核酸）又はタンパク質のサイズがある。

【0148】

プランジャの速度、加速率及び減速率、並びに保持時間も形質移入効率に影響する。保持時間の例は、１～５秒、５分、１０分、又はそれよりも長い時間を含むことができる。幾つかの実施形態において、形質移入試料の流量は約１０～約１０００μｌ／ｓｅｃである。特定の実施形態において、内向き及び外向きの流量は同じである。流量の代表的な例には、３０／３０、４０／４０、４５／４５、４７／４７、５０／５０、６０／６０、７０／７０、８０／８０、９０／９０、１００／１００、及び１１４／１１４μｌ／ｓｅｃがある。更に他の実施形態において、内向き及び外向きの流量は異なることができる。流量は、細胞の種類、細胞のサイズ、容器及び狭窄部のサイズ、並びに形質移入溶液の量を含む種々のパラメータに基づいて調節することができる。流量はプランジャ速度によって決まる。円筒管内を流れる溶液の流量は断面積において均一ではなく、ガウス分布に従うため、本明細書に記載される流量は平均流量である。さらに、狭窄セクションにおける流量ははるかに高速である。狭窄部にわたる流量もガウス分布に従うが、この分布は、容器の非狭窄セクションよりもはるかに急である。図１２～図１６は、細胞生存率に対する流量の影響を示す。

【0149】

フローサイクル数、即ち形質移入される細胞及び分子又は組成物を含む試料が狭窄部を通る回数は、形質移入効率に影響する別のパラメータである。１回のフローサイクルは、１つの流入ステップ及び１つの流出ステップを含む。したがって、細胞は、各フローサイクルで２回、狭窄部を通る。幾つかの実施形態において、フローサイクル数は２サイクル以上である。特定の実施形態において、フローサイクル数は５～２５サイクル、好ましくは１５サイクルである。

【0150】

本開示の形質移入方法によって修飾される細胞及び細胞様体（本明細書では「形質移入される細胞」、「形質移入される細胞様体」、「修飾される細胞」、「修飾される細胞様体」、「遺伝子操作される細胞」、又は「遺伝子操作される細胞様体」と同義で呼ばれる）は、人間又は動物の疾患の治療、置換細胞の作製、及び創薬を含め、多様な用途で使用することができる。加えて、本開示の形質移入方法によって修飾される細胞及び細胞様体は、製造（例えば生物学的治療薬の生成）、農業及び栄養学的価値の改善（例えば遺伝子組換え生物「ＧＭＯ」）、又は環境調節（例えば環境毒素の消化）に使用することができる。

【0151】

本明細書に記載される容器及び方法を使用して調製された遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体の治療に有効な集団は、それを必要とする対象に投与することができる。対象に投与される遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体の数は、治療される症状の場所、種類、重症度、治療を受ける個人の年齢及び症状等に応じて広く変わる。幾つかの実施形態において、医師は使用に適切な用量を決定し得る。一般に、約１×１０^４～約１×１０^１０個の遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体を含む、遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体の治療に有効な集団を含む製剤が投与される。幾つかの実施形態において、約１×１０^５～約１×１０^９個の遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体、約５×１０^５～約５×１０^８個の遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体、又は約１×１０^６～約１×１０^７個の遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体を含む、遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体の治療に有効な集団を含む製剤が投与される。

【0152】

遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体の治療に有効な集団を含む製剤は、それを必要とする対象に、許容可能な医療行為に従って投与し得る。例示的な投与モードは静脈注射である。他のモードには、限定ではなく、腫瘍内、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ－Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、関節滑液嚢内（滑液エリア）、頭蓋内（対流増加送達を含む）、脊髄内、及び髄腔内（脊髄液）がある。製剤の非経口注射又は注入に有用な任意の既知のデバイスが、そのような投与モードを行うのに使用することができる。そのような製剤は、バッファー、例えば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水等；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡ又はグルタチオン；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。

【0153】

本明細書に開示される容器及び方法によって形質移入される遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体の治療に有効な集団の用途の代表的な一例は、感染因子からの対象の保護又は対象が感染因子に感染する尤度の低減である。幾つかの実施形態において、そのような方法は、本明細書に記載されるシステム及び組立体を使用して形質移入された細胞様体、自己細胞、又は同種細胞を提供することを含む。形質移入後、細胞又は細胞様体は、感染因子からの保護を必要とする対象に注入される。幾つかの実施形態において、注入前、形質移入された細胞は任意に、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖されて、細胞数を上げる。幾つかの実施形態において、形質移入材料は、感染因子又は感染因子によって産生される有毒物質に結合する抗体又は抗体断片をコードする発現ベクターであることができる。

【0154】

感染因子の代表的な例には、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、及びプリオンがある。感染因子によって産生される有毒物質の代表的な例には、毒素（例えばボツリヌス毒素）及びアレルゲンがある。

【0155】

本明細書に開示される容器及び方法によって形質移入される遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体の治療に有効な集団の用途の別の代表的な例は、治療処置に使用されるＣＡＲ－Ｔ細胞の産生である。幾つかの実施形態において、そのような方法は、本明細書に記載されるシステム及び組立体を使用して形質移入された自己細胞又は同種細胞を提供することを含む。形質移入後、細胞は治療を必要とする対象に注入される。幾つかの実施形態において、注入前、形質移入された細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖されて、細胞数を上げる。幾つかの実施形態において、形質移入材料は、例えばアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター若しくはプラスミドにパッケージングされた腫瘍関連抗原に結合するキメラ抗原受容体をコードするドナーＤＮＡであるか、又はＤＮＡ小環、線形ｄｓＤＮＡ、若しくはｍＲＮＡとして提供される。ｍＲＮＡを使用してキメラ抗原受容体を発現するようにＴ細胞を遺伝子修飾することは、高速で経済的な方法を提供するが、導入遺伝子は宿主細胞ゲノムに統合されず、したがって、発現は、Ｔ細胞の増殖を通して急速に薄まる。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ形質移入は、潜在的な毒性を評価するため又は治療の副作用を制限するために使用される。宿主細胞ゲノムへのドナーＤＮＡ（プラスミド又は小環）の非標的化統合は、スリーピングビューティ又はｐｉｇｇｙＢａｃ等のトランスポザーゼ酵素との同時形質移入によって達成することができる。宿主細胞ゲノムへのドナーＤＮＡ（ＡＡＶ又は線形ｄｓＤＮＡ）の標的化統合は、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のエンドヌクレアーゼ酵素との同時形質移入によって達成することができる。

【0156】

本明細書に開示される形質移入方法によって生成されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原に結合するキメラ抗原受容体を発現するようにＴ細胞を遺伝子操作することによってがんの治療に使用することができる。ユニバーサルＣＡＲは、腫瘍関連抗原を認識し、「タグ」を発現するように修飾された抗体ベースの分子を含むユニバーサルＣＡＲ及び「タグ」を認識して「タグ」に結合するユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含め、他のＣＡＲ－Ｔ細胞戦略も当技術分野で既知である。別の戦略は、ＳＵＰＲＡ ＣＡＲという名称のスプリットＣＡＲシステムであり、これは、細胞外ロイシンジッパーを含むｚｉｐＣＡＲ－Ｔ細胞を、第２のロイシンジッパーに融合されたｓｃＦｖドメイン（ｚｉｐＦｖ）と組み合わせる。ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて治療されるがんの代表的な例には、限定ではなく、血液がん、例えば非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ性白血病がある。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、固形腫瘍の治療に使用することもできる。

【0157】

本明細書に開示される方法によって形質移入される遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された細胞様体の治療に有効な集団の用途の別の代表的な例は、遺伝子治療用途である。遺伝子治療は一般に３つのカテゴリに入る：ｉ）欠陥遺伝子又は不適応遺伝子の置換（例えば単一遺伝子又は多遺伝子疾患又は障害の症状の治療又は少なくとも改善）、ｉｉ）異常細胞（例えばがん細胞又はＨＩＶ等のウイルスに感染した細胞）の変性又は死滅、及びｉｉｉ）治療タンパク質の産生誘導（例えば、細胞によりインスリンの産生及び分泌を促進することによる糖尿病の治療又は細胞によりインターフェロンの産生及び分泌を促進することによるＣ型肝炎の治療）。幾つかの実施形態において、形質移入材料は、ｉ）疾患若しくは障害と関連する欠陥遺伝子又は不適応遺伝子の置換、ｉｉ）異常細胞の変性若しくは死滅、又はｉｉｉ）治療タンパク質の産生誘導に適切な導入遺伝子をコードするドナーＤＮＡを含む。上述したような遺伝子操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞と同様に、形質移入材料は、導入遺伝子を宿主ゲノムに統合するように機能するタンパク質又はタンパク質をコードする遺伝材料を更に含むことができる。代表的な例には、限定ではなく、トランスポザーゼ酵素（スリーピングビューティ及びｐｉｇｇｙＢａｃ等）、エンドヌクレアーゼ酵素（ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等）、トランスポザーゼ酵素をコードする遺伝材料（即ち核酸）、又はエンドヌクレアーゼ酵素をコードする遺伝材料（即ち核酸）がある。

【0158】

本明細書に開示される形質移入方法によって促進される遺伝子治療を使用して治療することができる疾患又は症状の代表的な例には、限定ではなく、単一遺伝子障害、多遺伝子障害、神経疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、眼疾患、及び感染疾患がある。

【0159】

本明細書に開示される形質移入方法を使用して産生される遺伝子操作された細胞を用いて治療することができる単一遺伝子障害及び多遺伝子障害の代表的な例には、限定ではなく、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ／Ｘ－ＳＣＩＤ）、嚢胞性繊維症、血友病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、家族性高脂血症、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肉芽腫、ファンコニー貧血、ゴーシェ病、レーバー先天性黒内障、フェニルケトン尿症、地中海貧血症、眼皮膚白皮症、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、低リン血症性くる病、レット症候群、非閉塞性精子産生不全、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ失調症、脊髄小脳失調症、ファン・デル・ウンデ症候群、がん、心疾患、糖尿病、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、２２ｑ１１．２欠失症候群、アンジェルマン症候群、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、色盲、ネコ鳴き症候群、ダウン症、血色素症、クラインフェルター症候群、プラダー・ウィリー症候群、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス病、及びターナー症候群がある。

【0160】

本明細書に開示される形質移入方法を使用して産生される遺伝子操作された細胞を用いて治療することができる単一遺伝子障害及び多遺伝子障害の追加の代表的な例には、限定ではなく、１ｐ３６欠失症候群、１８ｐ欠失症候群、２１水酸化酵素欠損症、２２ｑ１１．２欠失症候群、α１アンチトリプシン欠損症、ＡＡＡ症候群（アカラシア・アジソン病・無涙症候群）、アースコグ・スコット症候群、ＡＢＣＤ症候群、無セルロプラスミン血症、無手足症、軟骨無発生症２型、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アラジール症候群、ＡＤＵＬＴ症候群、エカルディ・グティエール症候群、白化症、アレキサンダー病、アルカプトン尿症、アルポート症候群、小児交互性片麻痺、筋萎縮性側索硬化症－前頭側頭型認知症、アルストローム症候群、アルツハイマー病、遺伝性エナメル質形成不全症、アミノレブリン酸脱水酵素欠損ポルフィリン症、アンドロゲン不応症、アンジェルマン症候群、アペール症候群、関節拘縮・腎機能不全・胆汁うっ滞症候群、毛細血管拡張性運動失調症、アクセンフェルト症候群、ベーレ・スティーブンソン脳回状頭皮症候群、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、ベンジャミン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、ブヨルンスタッド症候群、ブルーム症候群、バート・ホッグ・デュベ症候群、ブロディーミオパシー、ブルンナー症候群、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、ＣＡＲＡＳＩＬ症候群、慢性肉芽腫、屈曲肢異形成症、カナバン病、カーペンター症候群、大脳形成異常・神経障害・魚鱗癬・角皮症症候群（ＳＥＤＮＩＫ）、嚢胞性繊維症、シャルコ・マリ・ツース病、ＣＨＡＲＧＥ症候群、チェディアック・東症候群、鎖骨頭蓋異骨症、コケイン症候群、コフィン・ローリー症候群、コーエン症候群、コラーゲン異常症（２型及び１１型）、色盲、先天性無痛無汗症（ＣＩＰＡ）、先天性筋ジストロフィー、コルネリア・デ・ランゲ症候群（ＣＤＬＳ）、カウデン病、ＣＰＯ欠損症（コプロポルフィリン症）、頭蓋・水晶体・縫合異形成症、ネコ鳴き症候群、クローン病、クルーゾン症候群、クルーゾン皮膚骨格症候群（黒色表皮腫を伴うクルーゾン症候群）、ダリエー病、デント病（遺伝性高カルシウム尿症）、デニス・ドラッシュ症候群、ド・グルーシー症候群、ダウン症、ディジョージ症候群、遠位型遺伝性運動性ニューロパチー、遠位型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ドラベ症候群、エドワーズ症候群、エーラス・ダンロス症候群、エメリー・ドレイフス症候群、表皮水疱症、骨髄性プロトポルフィリン症、ファンコニー貧血（ＦＡ）、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、致死性家族性不眠症、家族性大腸腺腫症、家族性自律神経失調症、家族性クロイツフェルトヤコブ病、ファインゴールド症候群、ＦＧ症候群、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、Ｇ６ＰＤ欠乏症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ギレスピー症候群、グルタル酸尿症（１型及び２型）、ＧＲＡＣＩＬＥ症候群、慢性肉芽腫、グリシェリ症候群、ヘイリー・ヘイリー病、道化師様魚鱗癬、遺伝性ヘモクロマトーシス、血友病、骨髄肝性ポルフィリン症、遺伝性コプロポルフィリン症、遺伝性出血性末梢血管拡張症（オスラー・ウェーバー・レンドゥ症候群）、遺伝性封入体ミオパチー、遺伝性多発性外骨腫症、遺伝性痙性対まひ（乳児期発症上行性遺伝性痙性対麻痺）、ヘルマンスキー・パドラック症候群、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）、内臓転位、ホモシスチン尿症、ハンチントン病、ハンター症候群、ハーラー症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、家族性高コレステロール血症、高リジン血症、原発性高シュウ酸尿症、高フェニルアラニン血症、低αリポ蛋白血症（タンジール病）、軟骨低発生症、軟骨低形成症、低リン血症性くる病、免疫不全・セントロメア不安定・顔面異常症候群（ＩＣＦ症候群）、色素失調症、坐骨膝蓋骨異形成症、アイソダイセントリック（Ｉｓｏｄｉｃｅｎｔｒｉｃ）１５、ジャクソン・ワイス症候群、ジュベール症候群、若年性原発性側索硬化症（ＪＰＬＳ）、ケロイド障害、クラインフェルター症候群、クニースト骨異形成症、小崎過成長症候群、クラッベ病、クフォー・ラケブ症候群、ＬＣＡＴ欠損症、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リー・フラウメニ症候群、肢帯型筋ジストロフィー、リンチ症候群、リポタンパクリパーゼ欠損症、悪性高熱症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、マロトー・ラミー症候群、マキューン・オルブライト症候群、マクラウド症候群、ＭＥＤＮＩＫ症候群、家族性地中海熱、メンケス病、メトヘモグロビン血症、メチルマロン酸血症、ミクロ症候群、小頭症、モルキオ症候群、モワット・ウィルソン症候群、ムエンケ症候群、多発性内分泌腫瘍症１型（ウェルマー症候群）、多発性内分泌腫瘍症２型、筋ジストロフィー、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型及びベッカー型）、ミオスタチン関連筋肥大、筋緊張性ジストロフィー、ナトビッチ（Ｎａｔｏｗｉｃｚ）症候群、神経線維腫症Ｉ型、神経線維腫症ＩＩ型、ニーマン・ピック病、非ケトーシス型高グリシン血症、非閉塞性（Ｎｏｎｏｂｓｔｒｕｃｔｕｉｖｅ）精子産生不全、非症候性難聴、ヌーナン症候群、ノーマン・ロバーツ症候群、眼皮膚白皮症、オグデン症候群、オーメン症候群、骨形成不全症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、パトー症候群（１３トリソミー）、ＰＣＣ欠乏症（プロピオン酸血症）、晩発性皮膚ポルフィリン症（ＰＣＴ）、ペンドレッド症候群、ポイツ・イェガース症候群、パイフェル症候群、フェニルケトン尿症、ピペコリン酸血、ピット・ホプキンス症候群、多発性嚢胞腎疾患、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、原発性線毛機能不全（ＰＣＤ）、原発性肺高血圧症、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、疑似ゴーシェ病、弾性線維性仮性黄色腫、網膜色素変性症、レット症候群、ローベルト症候群、ルビンスタイン・テイビ症候群（ＲＳＴＳ）、サンドホフ病、サンフィリポ症候群、シュワルツ・ヤンペル症候群、シェーグレン・ラルソン症候群、先天性脊椎骨端骨異形成症（ＳＥＤ）、シュプリンツェン・ゴールドバーグ症候群、鎌状赤血球貧血、シデリウス型Ｘ連鎖精神遅滞症候群、鉄芽球性貧血、スライ症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、スミス・マギニス症候群、シュナイダー・ロビンソン症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（１－２９型）、ＳＳＢ症候群（ＳＡＤＤＡＮ）、シュタルガルト病（黄斑変性症）、スティックラー症候群（多形）、ストラドウィック症候群（脊椎骨端骨幹端異形成、ストラドウィック型）、テイ・サックス病、ビオプテリン代謝異常症、地中海貧血症、致死性骨異形成症、トリーチャーコリンズ症候群、結節性硬化症（ＴＳＣ）、ターナー症候群、アッシャー症候群、ファン・デル・ウンデ症候群、異型ポルフィリン症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ヴァイセンバッハー・ツヴェイミューラー症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウッドハウス・サカティ症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、色素性乾皮症、Ｘ連鎖知的障害及び巨精巣症（脆弱Ｘ症候群）、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症（球脊髄性筋萎縮症）、Ｘｐ１１．２重複症候群、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、４７ＸＸＸ（別名トリプルＸ症候群）、ＸＸＸＸ症候群（別名４８ＸＸＸＸ）、ＸＸＸＸＸ症候群（別名４９ＸＸＸＸＸ）、ＸＹＹ症候群（別名４７ＸＹＹ）、ツェルウェーガー症候群、がん、心疾患、糖尿病、並びに統合失調症がある。

【0161】

本明細書に開示される形質移入方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞又は他の遺伝子操作された細胞を用いて治療することができるがんの種類の代表的な例には、限定ではなく、上皮細胞由来のがん種（乳房、前立腺、肺、膵臓、及び結腸で発症するがんを含む）、結合組織（即ち骨組織、軟骨組織、脂肪組織、及び神経組織）から生じる肉腫、造血細胞から生じるリンパ腫及び白血病、多能性細胞由来であり、殆どの場合、精巣及び卵巣に存在する胚細胞性腫瘍、並びに未熟な「前駆細胞」又は胚組織由来の芽細胞腫がある。

【0162】

本明細書に開示される形質移入方法を使用して産生されるＣＡＲ－Ｔ細胞又は他の遺伝子操作された細胞を用いて治療することができるがんの代表的な例には、限定ではなく、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、心臓がん、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、毛様細胞性星状細胞腫、上衣腫、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、グリオーマ、髄芽腫、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、松果体星状細胞腫、下垂体腺腫、視経路及び視床下部膠腫、乳がん、湿潤性小葉がん、管状がん、湿潤性篩状癌、髄様がん、男性乳がん、葉状腫瘍、炎症性乳がん、副腎皮質がん、膵島細胞がん（膵島）、多発性内分泌腫瘍症候群、副甲状腺がん、褐色細胞腫、甲状腺がん、メルケル細胞癌、ブドウ膜黒色腫、網膜芽細胞腫、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、大腸がん、肝外胆管がん、胆嚢がん、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、肝細胞がん、膵がん（島細胞）、直腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣がん、上皮性卵巣がん（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、陰茎がん、腎細胞がん、腎盂尿管（移行上皮がん）、前立腺がん、精巣がん、妊娠性絨毛腫瘍、腎盂尿管（移行上皮がん）、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ウィルムス腫瘍、食道がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん、上咽頭がん、口腔がん、中咽頭がん、副鼻腔がん及び鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、下咽頭がん、急性混合白血病、急性好酸球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、大顆粒リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、肥満細胞性白血病、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、菌状息肉腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚濾胞性リンパ腫、原発性皮膚免疫細胞腫、原発性体液性リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、セザリー症候群、脾臓周辺帯リンパ腫、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病、基底細胞がん、メラノーマ、皮膚がん（非メラノーマ）、気管支腺腫／カルチノイド、肺小細胞がん、中皮腫、非小細胞肺がん、胸膜肺芽腫、喉頭がん、胸腺腫及び胸腺がん、ＡＩＤＳ関連のがん、カポジ肉腫、類上皮血管内皮種（ＥＨＥ）、線維形成性小円形細胞腫瘍、並びに脂肪肉腫がある。

【0163】

本明細書において、範囲は「約」ある特定の値から且つ／又は「約」別の特定の値までとして表現することができる。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、そのある特定の値から且つ／又はその別の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」の使用によって概数として表現される場合、その特定の値は別の態様を形成することが理解される。各範囲の端点は、他方の端点との関連でも他方の端点から切り離しても意味があることが理解される。本明細書に多くの値が開示されており、各値が、その値自体に加えて、「約」その特定の値としても本明細書に開示されていることも理解される。本願全体を通して、データは多くの異なる形式で提供されており、このデータが、そのデータ点の任意の組合せに関して、終点及び起点並びに範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点「１５」が開示される場合、１０及び１５を越える、それ以上、それ未満、それ以下、及びそれと等しい点に加え、１０と１５との間も開示されていると見なされることが理解される。２つの特定の単位間の各単位も開示されることも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。本明細書において提供される範囲は、その範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からの任意の数字、数字の組合わせ、又は部分範囲を含むとともに、上記整数間に介在する全ての少数点値、例えば１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、及び１．９も含むと理解される。部分範囲に関して、範囲の何れかの端点から広がる「入れ子式部分範囲」が特に企図される。例えば、１～５０という例示的な範囲の入れ子式部分範囲は、一方向において１～１０、１～２０、１～３０、及び１～４０又は逆方向において５０～４０、５０～３０、５０～２０、及び５０～１０を含むことができる。

【0164】

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、本開示を説明し定義するために、「約」及び「略」という用語は、任意の定量的比較、値、測定、又は他の表現に起因し得る不確実性の固有の程度を表すために使用される。「約」及び「略」という用語は、本明細書では、定量的表現が、問題となっている趣旨の基本機能の変化を生じさせずに、述べられた参照から変化し得る程度を表すためにも使用される。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、及び／又は各々の複数形は、非限定的であり、列記した部品を含み、それとともに、列記されていない追加の部品を含むことが可能である。「及び／又は」は非限定的であり、列記された部品の１つ又は複数及び列記された部品の組合せを含む。

【0165】

別段のことが定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料は、本開示の実施又はテストに使用することができるが、適した方法及び材料について以下説明する。本明細書で触れられた全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献は全体的に、参照により本明細書に援用される。競合する場合、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び例は単なる例示にすぎず、限定を意図しない。

【0166】

これより、本開示の例示的な実施形態を詳細に参照する。本開示は例示的な実施形態と併せて説明されるが、本開示をそれらの実施形態に限定する意図がないことが理解されよう。それとは対照的に、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の趣旨及び範囲内に含むことができる代替、変更、及び均等物の包含が意図される。当技術分野で周知の標準的な技法又は特に以下説明する技法を利用した。

【実施例】

【0167】

実施例１：狭窄部を有する形質移入容器を製造する方法
図８は、形質移入容器１０２の狭窄部を作製するシステム３００の図である。プログラマブルコンピュータ３０１が、容器１０２を搭載するホルダを有するモータ３０３を制御する。モータは、長手方向軸に沿って容器を回転させる。コンピュータは、所望の狭窄部直径及び形状が達成されるまで、火炎の先端部がモータ３０７により、容器を加熱するように容器に沿って精密に位置決めされるように、マイクロ火炎の位置及びサイズも制御する。狭窄部の直径は顕微鏡を使用して測定され、直径データはコンピュータに通信され、所望の結果が達成されたとき（例えば図２Ａでのような遠端部狭窄又は図２Ｂでのような砂時計設計）、火炎及び回転プロセスは停止した。

【0168】

以下の例では、狭窄部を有する容器としてガラス毛管を使用した。

【0169】

実施例２：ＤＮＡ形質移入
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（マウス；細胞直径約１５μｍ）又はヒーラ細胞株（ヒト；細胞直径約１２～１４μｍ）を使用してＤＮＡ形質移入を実行した。サイトメガロウイルスプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドベクター４．７ｋｂをＤＮＡ形質移入に使用した。全ての形質移入は、細胞が生理学的緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変最小培地（ＤＭＥＭ）である培地１９９又はＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝食塩水）に形質移入混合物１ミリリットル当たり細胞１００万～１０００万個の細胞密度で分散した状態で実行された。本明細書で使用される場合、「形質移入混合物」及び「形質移入溶液」は同義で使用され、緩衝液、形質移入される分子、及び形質移入の効率を高めるために溶液に含まれ得る他の何かを含む。形質移入反応ごとに約１００マイクロリットルの形質移入混合物を使用した。形質移入ごとに使用されたＤＮＡ量は、１ミリリットル当たり２０～１５０マイクログラムで変化した。

【0170】

形質移入が実行されてから２４時間後（図９）、蛍光顕微鏡法を用いてＧＦＰの細胞質発現を検出することにより、ＤＮＡ形質移入の結果を評価した。ＧＦＰ発現レベルは弱い発現から非常に強い発現まで様々であった。発現強度は、細胞集団の固有の異質性により、細胞間で変化する。ＧＦＰの発現は、細胞の細胞質へのプラスミドＤＮＡの導入、細胞核へのプラスミドの輸送、続く細胞核でのＲＮＡ転写、及び細胞質ＧＦＰを生じさせるＲＮＡの翻訳の成功を示した。

【0171】

推定ＤＮＡ形質移入効率は、効率が幾つかのパラメータに依存することを示した。４．７ｋｂプラスミドＤＮＡの相対形質移入効率を表２に提示する。１５μｇのＤＮＡを含む１００μｌの形質移入溶液中に概ね２５０，０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を再懸濁させ、表２に示される種々の流量で１５サイクルを使用して、形質移入を実行した。種々の流量での毛管の種々の寸法を分析した。「相対」効率を「＋」符号で示す。効率は＋から＋＋「＋」は概ね５～１４％の細胞の相対形質移入効率を表し、「＋＋」は概ね１５～２９％の細胞の相対形質移入効率を表し、「＋＋＋」は概ね３０～５９％の細胞の相対形質移入効率を表し、「＋＋＋＋」は概ね６０～１００％の細胞の相対形質移入効率を表す。これは、使用されるパラメータ間で比較される、ＧＦＰを発現する細胞数に基づく。この研究では、流量１１４／１１４（内向き／外向き）の８０ＲＬ毛管は、４．７ｋｂプラスミドで最高のＤＮＡ形質移入効率をもたらした。

【0172】

表２：４．７ｋｂ ｐＡｃＧＦＰ－１プラスミドでのＤＮＡ形質移入効率

【表2】

【0173】

表２の１列目は、使用された毛管（即ち容器）を反映している。値５０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、及び１００μｍは、狭窄部での最小直径を示す。「ＲＬ」は、最小狭窄部直径への容器の内径の低下が、より長い距離（約１ｍｍ～約２５ｍｍ）にわたって生じたことを示し、それに対して、「ＲＳ」は、最小直径への容器の内径の低下がより短い長さ（即ち内径の低下がより急であった；約０．１ｍｍ～１ｍｍ）にわたって達成されたことを示す。したがって、内径の低下開始から最小直径までの距離は、約０．１ｍｍ～２５ｍｍである。

【0174】

実施例３：タンパク質形質移入
核局在化された２２ｋＤａタンパク質に共役されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８と共に５０ＲＬ毛管を使用したタンパク質形質移入研究において、細胞生存率及び形質移入効率は両方とも９５％（図１０及び図１１）を越えた。図１０は、１５サイクルにわたって毎秒３０／３０の流量を使用して８μｇのタンパク質を用いた形質移入から６時間後及び２４時間後のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を示す。図１１は、１５サイクルにわたって毎秒３０／３０の流量を使用して８μｇのタンパク質を用いた形質移入から６時間後及び２４時間後のヒーラ細胞を示す。

【0175】

実施例４：細胞生存度に対する毛管狭窄部サイズの影響
種々の狭窄部のガラス毛管を使用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質を形質移入混合物に添加せずに１５サイクルにわたって細胞を流した。結果を図１２～図１６に提示する。非操作細胞、即ち毛管を通過しなかった細胞を対照実験として使用した。狭窄部が狭く、流量が高いほど、累進的な細胞損失に繋がったことが観測された。

【0176】

フローサイトメータを使用して細胞数を数えることにより、形質移入に起因した細胞生存／細胞損失を定量した。毛管を通過しなかったＮＩＨ－３Ｔ３細胞を対照として使用した。実験群では、同数の細胞（概ね１００，０００個）をＭ１９９培養培地又はＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁させて、表３に示されるように４つの異なる流量で１５サイクルにわたって２つの毛管サイズに通した。より小さい毛管である５０ＲＬは、８０ＲＬ毛管と比較して全流量でより高い細胞損失レベルを示した。

【0177】

表３：形質移入から生じる細胞生存／細胞損失に対する流量の影響

【表3】

【0178】

実施例５：ＢｏＮＴ／Ａ中毒からの治療的保護を提供するｓｃＦＶ生物学的薬物の自己産生
ＢｏＮＴ／Ａ（ボツリヌス神経毒素血清型Ａ）結合ドメイン（Ｈｃ）及びＢＧＨポリアデニル化配列に強く結合し中和する単鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）をコードするｃＤＮＡ遺伝子に機能的にリンクするＥＦ－１ａプロモーターを含む哺乳類発現ベクターを設計した。ベクターの残りの配列は、レシピエント細胞内で複製が可能なほど十分なウイルス配列を含まない。一例のベクターは、ＣＭＶプロモーターがＥｆ－１ａプロモーターで置換され、ネオマイシンの選択可能なマーカーが削除されたｐｃＤＮＡ３である。この組合せは、哺乳類細胞での複製を促進するあらゆる配列を回避しながら、広範囲の細胞でのｓｃＦＶの高発現を可能にする。

【0179】

全血をＢａｌｂ／ｃマウスから抽出し、細胞及びプールされた血液を安定化させながら、詰まりを抑制するためにクエン酸塩、リン酸塩、ブドウ糖、及びアデニン（ＣＰＤＡ）を含む管に入れる。全血をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配にわたって層化し、スピンさせて単核白血球（ＷＢＣ）を濃縮する。単離されたＷＢＣをＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌ中に１．５×１０^５細胞のＰＢＳを用いて再懸濁させた。抗ＢｏＮＴ／Ａ ｓｃＦＶをコードする１００μｇの発現ベクターを細胞に添加し、ＲＴで５～１０分間、プレインキュベートする。次いで細胞／ＤＮＡ混合物を１５～２５サイクルの正及び負の流体圧力に付し、短期間、回復させる。

【0180】

細胞を培地に２１日間プレーティングし、毎日、培地及び試料を採取して、形質移入された一次細胞によって産生されている抗ＢｏＮＴ／ＡｓｃＦＶの量を測定する。必要に応じて、新鮮な培地を追加する。

【0181】

細胞は高分化しており、正常な細胞寿命ステージを変更するいかなるＤＮＡも受け取っていないため、時間の経過に伴い、細胞は正常な細胞配列に屈して死ぬ。形質移入された細胞が老化するにつれて、培地中のｓｃＦＶの濃度は低下し、最後には消失する。

【0182】

実施例６：マウスにおけるＢｏＮＴ／Ａ中毒からの治療的保護
実施例５に記載される実験は、以下の変更を行って繰り返される。上記のように、血液をＢａｌｂ／ｃマウスから抽出し、ＷＢＣを単離し、述べたように形質移入する。細胞をプレーティングする代わりに、形質移入されたＷＢＣを追加のＢａｌｂ／ｃマウスにゆっくりと注入する。数日後、致死未満から致死に及ぶ様々な用量のＢｏＮＴ／Ａをマウスに注入する。ＢｏＮＴ／Ａ中毒の発症及び死亡についてマウスを監視し、形質移入された発現ベクター及び生物学的薬物タンパク質の保護効果を特定する。形質移入されたＷＢＣによって経時産生された抗ＢｏＮＴ／ＡｓｃＦＶの量について、これもまた抗ＢｏＮＴ／ＡｓｃＦＶ形質移入されたＷＢＣが注入された対照マウスを経時テストする。

【0183】

実施例７：悪性Ｂ細胞を破壊する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
抗ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクト及びＢＧＨポリアデニル化配列をコードするｃＤＮＡ遺伝子に機能的にリンクするＥＦ－１ａプロモーターを含む哺乳類発現ベクターを設計した。抗ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトは、Ｄｒ．Ｋｏｃｈｅｎｄｅｎｆｅｒによって米国特許出願公開第２０１７／０１０７２８６Ａ１号明細書に記載されるものと同様である。ｓｃＦＶに加えて、ＣＡＲコンストラクトは、細胞外スペーサ、ヒトＣＤ８アルファの膜貫通領域、ヒトＣＤ２８由来の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、及びＦｃエプシロンＲＩのガンマ鎖を含む。ベクターの残りの配列は、レシピエント細胞内で複製が可能なほど十分なウイルス配列を含まない。一例のベクターは、ネオマイシンの選択可能なマーカーがＧＦＰの機能カセットで置換されたｐｃＤＮＡ３である。この組合せは、哺乳類細胞での複製を促進するあらゆる配列を回避しながら、広範囲の細胞でのＣＡＲコンストラクトの高発現を可能にする。ＧＦＰは、形質移入に成功した細胞の監視に使用することができる緑色蛍光タンパク質の内部発現を可能にする。

【0184】

ヒト全血を標準血液収集によって取得して、細胞及びプールされたを安定化させながら、詰まりを抑制するためにクエン酸塩、リン酸塩、ブドウ糖、及びアデニン（ＣＰＤＡ）を含む血液収集バッグに入れられる。全血を遠心沈殿させ、上澄みを破棄することにより、赤血球を溶解させる。ペレットをＲＢＣ溶解液中に再懸濁させ、１０分後、ＰＢＳ中で希釈し、遠心沈降させ、ＰＢＳ中で洗浄する。磁気ビーズと共役した抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体を白血球に添加し、磁性カラムを通して滴下させる。洗浄後、カラムを消磁させ、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を収集する。

【0185】

ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＰＢＳ中に２．５×１０^５個の細胞として再懸濁させる。１００μｇの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現ベクターを細胞に添加して、ＲＴで５～１０分間プレインキュベートする。次いで細胞／ＤＮＡ混合物を１５～２５サイクルの正及び負の流体圧力に付し、短期間、回復させる。

【0186】

形質移入後、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて培養し、活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖をトリガーする。種々の時間において、抗ＣＤ３抗ＣＡＲコンストラクト及びＧＦＰ ＦＡＣＳスクリーニングのために、試料を採取する。

【0187】

実施例８：形質移入されたＴ細胞を使用した細胞キルアッセイ
形質移入されたＴ細胞がヒト標的細胞株をキルする能力を測定するために、ヒトＣＤ１９発現の高レベルの表面発現を有するＲａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）を取得する。Ｒａｊｉ細胞は、悪性Ｂ細胞の代理として使用される。Ｒａｊｉ細胞をまずＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色し、洗浄して全ての余剰色素を除去する。Ｒａｊｉ細胞及びＣＡＲ発現Ｔ細胞を様々な濃度で組み合わせて、培地に配置する。それから３６時間にわたる種々の時間において、Ｒａｊｉ細胞の消失、そしてそれに続くＲｅｄ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ色素の消失を探してＦＡＣＳｃａｎにより試料を分析する。ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在の後に、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ１９－ＣＡＲ抗体及びＧＦＰが続くことができる。Ｒａｊｉ細胞破壊が最高率の時間フレームが特定される場合、実験は繰り返されるが、共焦点顕微鏡が後に続き、数分ごとに測定値が取得される。

【0188】

実施例９：修復された肝細胞の作製
ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の生殖細胞系領域配列を含むＤＮＡベクターを設計した。ｃ－Ｍｙｃタグを追加するために、ｃ－ＭｙｃのｃＤＮＡ配列をＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の最後のコドンとその停止コドンとの間に挿入する。これにより、ＣＲＩＳＰＲ標的遺伝子置換を首尾良く経た細胞において観測することができるＳＥＲＰＩＮＡ１タンパク質の作製が可能になる。

【0189】

実施例１０：ヒト肝細胞における標的遺伝子置換
ＡＡＴ酵素欠乏患者からの肝細胞は容易に取得できないため、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、正常なＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子をタグ付き版で置換する代理実験を代わりに行う。この実験では、ヒト新生児肝細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ４０２１をＡＴＣＣから取得し、培地で増殖させる。付着性細胞株であるため、非酵素細胞解離試薬（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、単細胞プレップを作製する。肝細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＰＢＳ中に２．５×１０^５個の細胞として再懸濁させる。様々な量のガイドＲＮＡ、Ｃａｓ－９結合とＳＥＲＰＩＮＡ１ゲノムＤＮＡ（図１９Ａ）から選ばれた２０ｍｅｒとの組み合わせ、及び様々な量のストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ポリープ）を細胞と組み合わせ、ＲＴで５～１０分間プレインキュベートする。タグ付きＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子（図１９Ｂ）のみを含む対照形質移入を使用して、ランダムＤＮＡ挿入の量を可視化する（標的遺伝子置換と対比して）。次いで細胞／ＲＮＡ／タンパク質又は対照細胞／ＤＮＡ混合物を１５～２５サイクルの正及び負の流体圧力に付し、短期間、回復させてから、プレーティングする。続く数日にわたり、形質移入された細胞の試料を収穫し、タンパク質プレップの作製に使用する。形質移入されない肝細胞試料は対照として使用される。タンパク質プレップをアクリルアミドゲル上で分離し、膜に移す。標準ウエスタン法に従い、膜をまず、抗α１アンチトリプシン抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて可視化して、ｃ－Ｍｙｃタグ付き及びタグなしの両方のＡＡＴ酵素の総量を特定し、次いで抗ｃ－Ｍｙｃ抗体を用いて可視化する。総量とタグ付きＡＡＴ酵素との比率を使用して、標的遺伝子をヒト肝細胞に置換させるに当たりどの実験組合せが最も有効であったかを判断する。

【0190】

実施例１１：ヒトＴ細胞の形質移入
単離されたヒトＴ細胞を４人の異なる人から取得し、Ｔ細胞培養培地を有する培地に配置した。Ｔ細胞を収穫し、８０／８０マイクロリットル／秒の流量で１５サイクル、７０ＲＬ毛管を使用して完全培地において１５μｇのｐＡｃＧＦＰベクター（４．７ｋｂ）を形質移入した。形質移入後、Ｔ細胞を培地に戻し、異なる時点で、ＧＦＰの出現について観測した。図２２に示される結果は、ＧＦＰの発現に基づく形質移入の成功を示す。

【0191】

実施例１２：計算的流体力学（ＣＦＤ）モデリング
本発明者らの指示の下、企業であるＩＭＰＡＣＴの科学者が、狭窄部における流体フローをモデリングし、細胞が狭窄部を通って流れるとき（ベルヌーイ圧ではない）、剪断力／応力が細胞の歪みを生じさせ、したがって、細胞が変形する様式が、細胞を包含する緩衝液の粘度を変更することによって影響を受け、又は制御されることができることを発見した。したがって、異なる緩衝系を、細胞に導入されている分子の種類及び形質移入されている細胞の種類の両方に合わせることができる。

【0192】

ＩＭＰＡＣＴは、最小内径（Ｉ．Ｄ．）５０μｍを有する毛管ジオメトリをモデリングするＣＦＤを実行した。モデルは、プランジャが流量５０μＬ／ｓで毛管を通して液体を押す事例に基づいた。この場合、液体粘度は水様と仮定した。

【0193】

以下の表において、ＩＭＰＡＣＴのＣＦＤ予測をＴｉｍｍ Ｔａｎｚｅｇｌｏｃｋ（“Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｌｏｂｅｄ Ｔａｙｌｏｒ－Ｃｏｕｅｔｔｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｈｅａｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ”，ＤＳｃ ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ＥＴＨ，Ｚｕｒｉｃｈ，２００８）のものと比較する。Ｄ＿毛管は最小Ｉ．Ｄ．であり、Ｑは定常状態流量であり、Ｕ＿毛管は毛管の最小Ｉ．Ｄ．部分での平均速度であり、ｔａｕ＿壁は毛管の中央４００μｍにわたる壁剪断応力範囲であり、ｔａｕ＿伸長は毛管の２００μｍ入口領域にわたる伸長応力範囲であり、ｔａｕ＿ＩＳは乱流に起因した流体力学的応力であり、デルタＰは毛管にわたる予測圧力降下である。

【0194】

【表4】

【0195】

ＩＭＰＡＣＴのＣＦＤ予測は上記表の１行目に提示されており、一方、Ｔａｎｚｅｇｌｏｃｋの予測は残りの行を占めている。ＩＭＰＡＣＴによりモデリングされた条件下で、壁剪断応力は、細胞膜に「孔」を生成するのに十分に高い大きさである。壁剪断応力（ｔａｕ＿壁）は、入口及び出口の影響による影響をあまり受けない。したがって、細胞膜に対する剪断応力の影響は、最小毛管Ｉ．Ｄ．の長さを変更し、ひいては剪断応力への露出時間を変更することによって調整することができる。流量が同じ場合、粘度を上げると、剪断応力も上がる。伸長応力（ｔａｕ＿伸長）は主に、毛管への入口で生じる。毛管の長尺化は、伸長応力に対して影響があったとしても極わずかである。粘度を上げると、伸長応力も上がる。乱流応力（ｔａｕ＿ＩＳ）は主に、流れが毛管を出る際に生じる。これもまた、毛管の長さによる影響を受けない。粘度を上げると、乱流応力は下がる。

【0196】

ＩＭＰＡＣＴ又はＴａｎｚｅｇｌｏｃｋにより予測される大きさの圧力降下は、細胞膜に影響すると予期されない。Ｔａｎｚｅｇｌｏｃｋは、測定が容易なパラメータを使用して自身のＣＦＤモデルを評価する好都合な手段として圧力降下のＣＦＤ予測を含んだが、細胞に対する圧力降下の影響を考慮しなかった。細胞は圧縮不可能な流体を含み、圧縮不可能な流体中に懸濁するため、数気圧のオーダの懸濁液の圧力変化に起因して、細胞膜に対して応力を及ぼす明確なメカニズムは存在しない。（ＩＭＰＡＣＴにより予測されたデルタＰ値は約３ａｔｍに対応する）。細胞壁を有する細胞への影響は、Ｈａｒｔｍａｎｎら（“Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｕｎｄｅｒ ｈｉｇｈ ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ”，Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，７：１－１２，２００６）により報告されているように、極めて高い静水圧（＞４０００ａｔｍ）で観測されている。

【0197】

圧力による力は、圧力勾配が、細胞サイズと同等の長さ尺度で生じる場合、フロー事件において細胞に影響し得る。これは、インターシャル小領域に乱流がある場合－即ち、コルモゴロフ渦サイズが細胞よりも小さい場合である。このファクタはｔａｕ＿ＩＳにより合算される。そのような微視的圧力勾配は乱流によって生じ、ベルヌーイ効果に関連しない。

【0198】

ＩＭＰＡＣＴが研究した１組の条件下で、即時ＣＦＤ分析は、研究中の１５μｍ細胞よりも小さな乱流渦と関連する流体力学的応力が、細胞膜に影響する可能性が最も高いことを示す。加えて、剪断応力及び伸長応力の影響も、観測された効果に寄与し得る。ベルヌーイ効果に起因した、懸濁した細胞に対する圧力降下の影響は、細胞膜に影響する可能性が非常に低い。

【0199】

実施例１３：新たなパンデミックの発生からの最前線の人員の迅速保護
２０１９年の終わりに、新規コロナウイルスであるＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－１９が国際的パンデミック及び世界的対応を引き起こした。フルゲノム配列が２０２０年初めに公開され、ワクチンに向けた競争が可能になった。多くの安全規則が緩和されても、最善の成果として、２０２１年初頭までに、わずか約１００万回のワクチン投与しか準備できない（米国の人口だけでも３億３千万）。一方、ファーストレスポンダーである医療従事者及び多くの患者は罹患し死亡しつつある。危機は特に、医療施設及び軍施設で深刻であるが、食糧及び必需品を含め、深刻な経済破綻も引き起こしつつある。危機は２０２２年まで続き、恐らくはその先も続くと予測される。

【0200】

新たな感染因子が常に発生している（即ちＳＡＲＳ、エボラ）が、以前は小さな領域に限られてきた。グローバリズムに伴い、今では、感染因子がいかに急速に拡散し得るかが知られている。最前線の防衛者及びレスポンダーに素早く作成し配備することができる新たな治療方法が必要とされている。私達を安全に維持する人々が守れられてこそ、私達は他人を守ることができる。

【0201】

ワクチンは、病気を防ぐに当たり圧倒的に重要であるが、作製に数年かかる。配備された場合であっても、有効免疫が接種者で有効になるには数週間かかる。ワクチンは、免疫系応答の多くの他の構成物質をトリガーする。一方法は、免疫系をトリガーして、プロセスをブロックする抗体を作ることができるＢ細胞を生成することにより、感染をブロックすることを含む。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－１９の場合、抗体はウイルスのスパイクタンパク質が、肺のアンジオテンシン変換酵素２タンパク質（ＡＣＥ２）及び他の細胞に付着することを阻止し、ひいてはウイルスが細胞に侵入して細胞を感染させないようにしなければならない。しかしながら、接種者のこの免疫獲得は、ワクチン接種後、数週間から数ヶ月かかる。医療危機では、与えられるワクチンが準備されている場合であっても、最前線の防御者及びレスポンダーは、ワクチンが免疫を誘導している間に死亡することになる。

【0202】

防御抗体は作製することができ、１年までバイアルに貯蔵することができるが、新たな防御抗体は作製、製造、及び必要な場所への配送に数年かかる。これは、崩御抗体の例を見つけ、次いで研究所において合成抗体を哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）内で製造することによって行われる。新たな遺伝子の作製は数週間で達成することができるが、製造プロセスのセットアップに１～２＋年かかる。間に合わせの対策として、抗体は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－１９から回復した人々から収集され、症状が重い患者に提供される。しかし、供給元は様々であり、無菌を保証することは不可能である。

【0203】

トランスサイトーシスの抗体プロセス（ＴＡｂＰ）：
トランスサイトーシスのＴＡｂＰ工程は、（ａ）Ａｂ ＤＮＡを取得すること、（ｂ）Ｂ細胞（１０～５０ｍｌの血液）を接種者（即ち医療従事者、ファーストレスポンダー、患者、軍人）から収穫すること、（ｃ）トランスサイトーシスの組立体、デバイス、システム、キット、及び方法の少なくとも１つを使用して、Ｂ細胞に合成保護抗体（単鎖可変断片／ｓｃＦＶ等）のＤＮＡを形質移入すること、（ｄ）形質移入されたＢ細胞を接種者に戻すことであって、それにより、数時間以内に、形質移入されたＢ細胞が保護抗体を産生し、数週間にわたって保護抗体を産生し続ける、戻すことである。

【0204】

最も重要なことに、トランスサイトーシス細胞改変（「形質移入」）プロセスは、ウイルス形質移入技法を必要とする既存のヒト治療とは違い、非ウイルス技術を使用する。ウイルスを使用する場合、治療は一回しか使用することができず、免疫無防御患者では使用することができない。

【0205】

したがって、トランスサイトーシスＴＡｂＰプロセスは大きな利点を提供する：トランスサイトーシスＴＡｂＰプロセスは非ウイルス形質移入工程を使用するため、接種者は繰り返し治療を受けることが可能である。

【0206】

実施例１４：機能性研究／キルアッセイ結果
分析に使用された細胞の種類
エフェクター細胞：ＣＡＲ－Ｔベクターを使用して本技術を用いて改変（形質移入）されたヒトＴ細胞及び非改変（対照）Ｔ細胞
標的細胞：細胞表面にＣＤ１９を発現しているＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ８６）をこの実験において標的細胞として使用した。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を安定して発現するように標的細胞をトランスサイトーシスにおいて改変し、高ＲＦＰ発現細胞を流動選別した。フロー分析による定量を容易にするために、ＲＦＰ発現Ｒａｊｉ細胞を標的細胞として使用した。
使用されたベクター：ＣＭＶプロモーターの制御下で抗ＣＤ１９キメラ受容体を発現し、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカーを発現するキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）プラスミドベクター

【0207】

形質移入及びキルアッセイ
１日目－トランスサイトーシス法を使用してヒトＴ細胞にＣＡＲ－Ｔベクターを形質移入した。
２日目－キメラ抗原を発現するＴ細胞を発現するＧＦＰを流動選別により精製した。精製されたＣＡＲ－Ｔ細胞又は非改変Ｔ細胞（対照細胞）を１：３の比率（Ｔ細胞：Ｒａｊｉ－ＲＦＰ細胞）でＲａｊｉ－ＲＦＰ細胞と混合し、約１８時間、細胞間相互作用及びキリングのためにインキュベートした。Ｒａｊｉ－ＲＦＰ細胞のみを第２の対照として含めた。
３日目－フロー分析により細胞を分析して、高発現ＲＦＰ細胞（生存細胞）数及び弱ＲＦＰ発現細胞（不全細胞／死細胞）数を測定し、生存細胞：死標的細胞の比率を特定した。

【0208】

結果を図２４に提示し、図２４は、形質移入された一次ヒトＴ細胞が、ウイルス形質移入されたＴ細胞と同じ機能を示すことを示す。即ち、攻撃を認識し、がん細胞を殺す。

【0209】

結果の解釈：
ＣＡＲ－Ｔ細胞＋標的細胞分析は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、概ね１８～２０時間のインキュベーションで標的細胞の８３％を殺したことを示した。

【0210】

対照Ｔ細胞に標的細胞を加えたものは、５２％生存細胞対４８％死細胞（平均３反応）を示した。

【0211】

標的細胞のみは、５９％生存細胞対４１％死細胞（平均３反応）を示した。

【0212】

参照による援用
本明細書において引用又は参照された全文献及び本明細書において引用された文献において引用又は参照されている全文献は、本明細書又は参照により本明細書に援用される任意の文献で触れられている任意の製品の任意の製造業者の指示、説明、製品仕様、及び製品シートと共に、参照により本明細書に援用され、本開示の実施に採用し得る。

【0213】

均等物
本明細書に記載された詳細な説明及び実施形態は、例示のみを目的として例として与えられており、本開示への限定として決して見なされないことが理解される。本開示に鑑みて種々の修正又は変更が当業者に示唆され、本願の趣旨及び範囲内に含まれ、添付の特許請求の範囲内であると見なされる。本開示のシステム、方法、及びプロセスと関連する追加の有利な特徴及び機能が、添付の特許請求の範囲から明らかになろう。さらに、当業者は、ただの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される開示の特定の実施形態への多くの均等物を認識するか、又は突き止めることが可能であろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F-2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図2M】

【図2N】

【図2O】

【図2P】

【図2Q】

【図2R】

【図2S】

【図2T】

【図2U】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A-7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20-21】

【図22】

【図23】

【図24】

【国際調査報告】