特表 2023-528071 ＡＴＰ加水分解酵素と免疫チェックポイントモジュレーターとの組合せ、並びにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-03

(54)【発明の名称】ＡＴＰ加水分解酵素と免疫チェックポイントモジュレーターとの組合せ、並びにその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20230626BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20230626BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230626BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20230626BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230626BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230626BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/16 B ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N1/20 E

C12N7/01

A61K38/46

A61K45/06

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/74 A

A61P35/00

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022574669

(86)(22)【出願日】2021-06-01

(85)【翻訳文提出日】2023-01-27

(86)【国際出願番号】 EP2021064659

(87)【国際公開番号】W WO2021245071

(87)【国際公開日】2021-12-09

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2020/065357

(32)【優先日】2020-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522470840

【氏名又は名称】エムヴィ バイオセラピューティクス エスエー

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】グラッシ，ファビオ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050DD13

4B050LL01

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA88Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084AA19

4C084AA20

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA04

4C084CA13

4C084CA53

4C084DC22

4C084MA02

4C084MA55

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087BC30

4C087BC34

4C087BC35

4C087BC38

4C087BC43

4C087BC56

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA02

4C087MA55

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）ＡＴＰ加水分解酵素、ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、かかるＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物又はウイルス粒子とからなる組合せを提供する。前記組合せは医術に使用されてもよく、特に、例えば癌の免疫療法などの癌の治療に使用されてもよい。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）ＡＴＰ加水分解酵素と、の組合せ。

【請求項2】

前記ＡＴＰ加水分解酵素が内在性ＣＤ３９ではない、請求項１に記載の組合せ。

【請求項3】

前記ＡＴＰ加水分解酵素が可溶性のＡＴＰ加水分解酵素である、請求項１又は２に記載の組合せ。

【請求項4】

前記ＡＴＰ加水分解酵素がアピラーゼである、請求項１から３のいずれかに記載の組合せ。

【請求項5】

前記アピラーゼが細菌又は植物由来のアピラーゼである、請求項４に記載の組合せ。

【請求項6】

前記ＡＴＰ加水分解酵素が配列番号１に規定されているアミノ酸配列、或いは、前記アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、又は９０％の配列同一性を有する配列変異体含む、請求項１から５のいずれかに記載の組合せ。

【請求項7】

（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）請求項１から６のいずれかに記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸と、の組合せ。

【請求項8】

前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸がベクターである、請求項７に記載の組合せ。

【請求項9】

前記核酸が、前記ＡＴＰ加水分解酵素の（異種）発現のための異種要素を更に含む、請求項７又は８に記載の組合せ。

【請求項10】

（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）請求項７から９のいずれかいに記載の前記核酸を含む宿主細胞と、の組合せ。

【請求項11】

前記宿主細胞が原核細胞又は真核細胞である、請求項１０に記載の組合せ。

【請求項12】

（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）請求項７から９のいずれかに記載の前記核酸を含む微生物と、の組合せ。

【請求項13】

前記微生物が古細菌、細菌及び真核生物から選択される、請求項１２に記載の組合せ。

【請求項14】

前記微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．からなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の組合せ。

【請求項15】

前記微生物がプロバイオティクスとして提供される、請求項１２から１４のいずれかに記載の組合せ。

【請求項16】

前記微生物の毒性が弱毒化されている、請求項１２から１５のいずれかに記載の組合せ。

【請求項17】

前記組合せが（組換え）細菌を含み、前記（組換え）細菌が前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１０から１６のいずれかに記載の組合せ。

【請求項18】

前記細菌が前記ＡＴＰ加水分解酵素を異種発現する、請求項１７に記載の組合せ。

【請求項19】

前記細菌がグラム陽性菌、グラム陰性菌、及びシアノ細菌から選択される、請求項１７又は１８に記載の組合せ。

【請求項20】

前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉから選択される、請求項１７から１９のいずれかに記載の組合せ。

【請求項21】

前記細菌がＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株である、請求項１７の組合せ。

【請求項22】

（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）請求項７から９のいずれかに記載の前記核酸を含むウイルス粒子と、の組合せ。

【請求項23】

前記ウイルス粒子がバクテリオファージである、請求項２２に記載の組合せ。

【請求項24】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子、及び／又は前記免疫チェックポイント阻害剤が組成物に含まれている、請求項１から２３のいずれかに記載の組合せ。

【請求項25】

前記組成物が、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を更に含む医薬組成物である、請求項２４に記載の組合せ。

【請求項26】

前記組成物が、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細菌のペリプラズム抽出物を含む、請求項２４又は２５に記載の組合せ。

【請求項27】

前記免疫チェックポイントモジュレーターが、チェックポイント抑制分子の阻害剤（チェックポイント阻害剤）である、請求項１から２６のいずれかに記載の組合せ。

【請求項28】

前記チェックポイント抑制分子が、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ、ＴＩＧＩＴ、及びＦａｓＲ／ＤｃＲ３から選択される、請求項２７に記載の組合せ。

【請求項29】

前記免疫チェックポイントモジュレーターが、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ、ＴＩＧＩＴ又はＤｃＲ３の阻害剤、又はこれらのリガンドの阻害剤である、請求項１から２８のいずれかに記載の組合せ。

【請求項30】

前記免疫チェックポイントモジュレーターがＣＴＬＡ－４経路又はＰＤ－１経路の阻害剤である、請求項１から２９のいずれかに記載の組合せ。

【請求項31】

前記免疫チェックポイントモジュレーターが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２の阻害剤であり、好ましくはＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の阻害剤である、請求項１から３０のいずれかに記載の組合せ。

【請求項32】

医術に使用される、請求項１から３１のいずれかに記載の組合せ。

【請求項33】

癌の治療に使用される、請求項１から３２のいずれかに記載の組合せ。

【請求項34】

前記使用が、養子（Ｔ）細胞療法における使用である、請求項３２又は３３に記載の使用のための組合せ。

【請求項35】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物又は前記ウイルス粒子とが、異なる投与経路により投与される、請求項３２から３４のいずれかに記載の使用のための組合せ。

【請求項36】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子が、経腸投与経路により投与される、好ましくは経口投与される、請求項３２から３５のいずれかに記載の使用のための組合せ。

【請求項37】

前記免疫チェックポイントモジュレーターが、非経口投与経路により投与される、請求項３２から３６のいずれかに記載の使用のための組合せ。

【請求項38】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーター、及び／又は（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子が、繰り返し投与される、請求項３２から３７のいずれかに記載の使用のための組合せ。

【請求項39】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーター、及び／又は（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物又は前記ウイルス粒子が、同日に投与される、請求項３２から３８のいずれかに記載の使用のための組合せ。

【請求項40】

（ａ）抗原、又は少なくとも１つの抗原エピトープを含む抗原断片、
（ｂ）前記抗原又は前記少なくとも１つの抗原エピトープを含む抗原断片をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子を
更に含む、請求項１から３９のいずれかに記載の組合せ。

【請求項41】

前記組合せが、宿主細胞又は微生物を含み、
前記宿主細胞又は前記微生物が、
前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む第一の核酸と、
前記抗原又は少なくとも１つの抗原エピトープを含む抗原断片をコードするポリヌクレオチドを含む第二の核酸と
を含む、請求項４０に記載の組合せ。

【請求項42】

前記ＡＴＰ加水分解酵素と、前記抗原又は少なくとも１つの抗原エピトープを含む抗原断片とを（異種）発現する宿主細胞又は微生物を含む、請求項４０又は４１に記載の組合せ。

【請求項43】

（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子と、
を含むことを特徴とする、キット。

【請求項44】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物又は前記ウイルス粒子とが、請求項２から３１のいずれかに記載のものである、請求項４３に記載のキット。

【請求項45】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物又は前記ウイルス粒子との組合せを使用して癌を治療する指示が記載された添付文書又はラベルを更に含む、請求項４３又は４４に記載のキット。

【請求項46】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物又は前記ウイルス粒子とが、それぞれ異なる容器で提供される、請求項４３から４５のいずれかに記載のキット。

【請求項47】

医術に使用される、請求項４３から４６のいずれかに記載のキット。

【請求項48】

癌の治療に使用される、請求項４３から４６のいずれかに記載のキット。

【請求項49】

医術に使用される免疫チェックポイントモジュレーターであって、
前記免疫チェックポイントモジュレーターが、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子と
組み合わせて投与されることを特徴とする、免疫チェックポイントモジュレーター。

【請求項50】

癌の治療に使用される、請求項４９に記載の免疫チェックポイントモジュレーター。

【請求項51】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とが、請求項２から３１のいずれかに記載のものである、請求項４９又は５０に記載の免疫チェックポイントモジュレーター。

【請求項52】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とが、請求項３５から３９のいずれかに記載されたように投与される、請求項４９又は５１に記載の免疫チェックポイントモジュレーター。

【請求項53】

前記（コードされた）ＡＴＰ加水分解酵素が可溶性のＡＴＰ加水分解酵素であり、
前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物又はウイルス粒子が経腸投与経路により投与される、請求項４９から５２のいずれかに記載の免疫チェックポイントモジュレーター。

【請求項54】

それを必要とする対象の、癌の発症のリスクを軽減する、癌を治療する、改善する、又は軽減する、或いは抗腫瘍応答を開始、増強、又は延長する方法であって、
前記方法が、
（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子と
を前記対象に投与すること含むことを特徴とする、方法。

【請求項55】

癌の発症のリスクを軽減する、癌を治療する、改善する、又は軽減する、或いは抗腫瘍応答を開始、増強、又は延長する併用療法であって、
前記併用療法が、
（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子と
を投与することを含むことを特徴とする、併用療法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば、癌免疫療法などにおける、免疫チェックポイントのモジュレーションによる免疫療法の技術分野に関する。本発明は、例えば、癌免疫療法において、免疫チェックポイントのモジュレーションにより免疫療法を向上させる新規の組合せ及び方法を提供する。特に、本発明は、免疫チェックポイントモジュレーターと、ＡＴＰ加水分解酵素、ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子との組合せ、及びそれらの使用を提供する。

【背景技術】

【0002】

癌免疫チェックポイント阻害剤を用いた癌免疫療法では、抑制性免疫チェックポイントを遮断することにより、抗腫瘍免疫が向上する。抑制性免疫チェックポイントは、通常、過剰な免疫応答を阻止する。これにより、免疫チェックポイントは、例えば、Ｔ細胞等の免疫システムが癌細胞を有効的に攻撃するのを阻止する。特に、癌細胞は、免疫抑制機能を利用して異なる免疫チェックポイント経路を活性化させる。したがって、免疫チェックポイントの遮断は、癌細胞に対する免疫応答を誘起させる又は強化するように免疫システムを「解除」する。Ｔ細胞又は癌細胞にみられるチェックポイントタンパク質の主な例としては、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を抑制するプログラム細胞死タンパク質１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＰＤ－１）／プログラム死リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １；ＰＤ－Ｌ１）、又は細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ－Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４；ＣＴＬＡ－４）が挙げられる。近年、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ－４阻害剤は、期待できる治療結果を示しており、様々な癌治療のために認可されている一方、更なる免疫チェックポイント阻害剤は現在、開発中であり、臨床試験中である。

【0003】

最近、細胞外アデノシンが、抗腫瘍免疫応答を干渉する有力な免疫チェックポイントモジュレーターであると確認された。免疫抑制アデノシンは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解により生成される。ヒトにおいては、ＡＴＰ加水分解における律速段階の細胞外酵素はＣＤ３９であり、ＡＴＰ加水分解酵素ＣＤ３９の阻害が最近、癌治療として提案されている（非特許文献１及び非特許文献２）。ルシフェラーゼを発現するＢ１６／Ｆ１０メラノーマ細胞及びＭＣＡ－３８結腸癌細胞を野生型あるいはＣＤ３９^－／－マウスに門脈内投与することによって作成したマウス肝転移モデルを使って、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によるＣＤ３９発現が、増殖促進の役割を果たすことが示されている（非特許文献３）。転移性メラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ）の成長は、ＣＤ３９^－／－マウス、又はＣＤ３９^－／－骨髄由来細胞で再構成されたキメラマウスにおいて、強度に阻害される（非特許文献３）。また、薬理学的ＣＤ３９阻害剤であるポリオキソメタレート１（ＰＯＭ１）を用いた治療は、腫瘍成長を顕著に制限することをも示されている（非特許文献４）。興味深いことに、ＣＤ３９阻害を免疫チェックポイント阻害と関連付けた併用療法の相乗効果が、最近報告されている。肺転移モデルにおいて、ＰＯＭ－１によるＣＤ３９の特異的遮断が、抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂのＮＫ細胞及びＩＦＮ－γに依存性抗腫瘍活性を顕著に強化した（非特許文献５）。更に、Ｂ１６又はＭＣＡ２０５腫瘍が接種されたＣＤ３９欠損マウスにおける抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡ４療法の強化された効能は、抗ＣＤ３９抗体ＩＰＨ５２０１（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）を用いたＣＤ３９標的遮断もまた免疫チェックポイント阻害剤と相乗効果を生むことを示唆している（非特許文献６）。

【0004】

様々な悪性腫瘍を患う患者が免疫チェックポイント阻害剤治療の恩恵を受けることができることが最近の報告で示されているなか、治療効果は、免疫チェックポイント阻害剤で治療された患者のうち、ごく一部の患者のみに見られる（非特許文献７）。免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）の治療効果への耐性は、大きく２つのカテゴリーに分けられる：（ｉ）一般的に、ＩＣＢに全く応答を示さない患者を意味する原発性耐性；及び（ｉｉ）ＩＣＢへ初期応答を示したが、その後、疾患が進行した患者を意味する獲得性耐性。原発性耐性に拮抗するために、多数の併用療法（例えば、化学療法、チロシンキナーゼ及び成長因子阻害剤）が現在検討されている（非特許文献８、非特許文献９、及び非特許文献１０）。しかし、ＩＣＢに対する獲得性耐性に至るメカニズムは解明されておらず、その過程を回復するための治療的アプローチは存在していない。

【0005】

免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）に応答を示す患者においては、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍外の部位から新しく、疲弊していないＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴ細胞クローンが補充されることが示されている。この現象は、癌免疫療法の臨床的利点を説明する上で主要な要因となると考えられる（非特許文献１１）。実際、ＴＭＥ中の細胞傷害性Ｔ細胞による抗原認識は、疲弊しエピゲノム的に不応性となった機能不全細胞の増殖を進めるため、エフェクター機能を回復させるのは困難である（非特許文献１２及び非特許文献１３）。また、最近の研究では、細胞傷害性はＴＭＥに浸潤している腫瘍特異性のないバイスタンダー細胞に限定されることが示されている（非特許文献１４及び非特許文献１５）。

【0006】

メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞は、抗原特異性に関係なく腫瘍に補充されることが示されている（非特許文献１６、非特許文献１７、及び非特許文献１８）。これらのＣＤ８^＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、同種抗原認識を必要とせず活性化されエフェクター機能を果たし、ホストの予後を向上させる（非特許文献１９及び非特許文献２０）。

【0007】

異なる免疫チェックポイント阻害剤の組合せが、より高い、進行フリーの生存率及び全体的な生存率を提供するなか、皮膚関連事象及び深刻な胃腸症状を含む、治療に関連した有害事象が、ＩＣＢ併用療法を行う患者に危険な脅威を与えている（非特許文献２１）。

【0008】

或いは、免疫チェックポイント阻害剤の術前補助併用は、進行したメラノーマ及び他の癌を患う患者への有望な治療法を示しているかもしれない（非特許文献２２）。しかし、かかる併用では、また、深刻な副作用が治療が完了するのを制限する可能性がある（非特許文献２３及び非特許文献２４）。

【0009】

要約すると、現在、癌を治療する免疫チェックポイント療法の開始は、おおむね、癌患者における低応答率及び免疫関連の有害事象により妨害されている。したがって、治療成績を向上することができる要素が必要である。例えば、切除可能な肺癌における単独のＩＣＢ術前補助療法は、僅かな副作用だけをもたらし、外科手術を遅らせることがないと最近報告されている（非特許文献２５）。したがって、免疫チェックポイント阻害剤（単剤）の術前補助効能を増強できる成分が、毒性を低減しつつ、有効な治療応答性を提供するかもしれない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ａｌｌａｒｄ Ｂ， Ｌｏｎｇｈｉ ＭＳ， Ｒｏｂｓｏｎ ＳＣ， Ｓｔａｇｇ Ｊ． Ｔｈｅ ｅｃｔｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅｓ ＣＤ３９ ａｎｄ ＣＤ７３： Ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔａｒｇｅｔｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２０１７；２７６（１）：１２１－１４４． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２５２８

【非特許文献2】Ａｌｌａｒｄ Ｄ， Ａｌｌａｒｄ Ｂ， Ｓｔａｇｇ Ｊ． Ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ３９ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ． ２０２０；８（１）：ｅ０００１８６． ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｉｔｃ－２０１９－０００１８６

【非特許文献3】Ｓｕｎ Ｘ， Ｗｕ Ｙ， Ｇａｏ Ｗ， ｅｔ ａｌ． ＣＤ３９／ＥＮＴＰＤ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ２０１０；１３９：１０３０－１０４０

【非特許文献4】Ｋｕｎｚｌｉ ＢＭ， Ｂｅｒｎｌｏｃｈｎｅｒ ＭＩ， Ｒａｔｈ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＣＤ３９ ａｎｄ ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ Ｓｉｇｎａｌ． ２０１１；７：２３１－２４１

【非特許文献5】Ｚｈａｎｇ Ｈ、 Ｖｉｊａｙａｎ Ｄ、 Ｌｉ Ｘ－Ｙ、 ｅｔ ａｌ． ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＣＤ３９ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１９；８：ｅ１５９３８０９１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１９．１５９３８０９

【非特許文献6】Ｐｅｒｒｏｔ Ｉ， Ｍｉｃｈａｕｄ Ｈ－Ａ， Ｇｉｒａｕｄｏｎ－Ｐａｏｌｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ． Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ３９／ＣＤ７３ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ Ｕｎｌｅａｓｈ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２０１９；２７：２４１１－２５．１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１９．０４．０９１

【非特許文献7】Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ， Ａ．Ｊ．， ａｎｄ Ｈｅｌｌｍａｎｎ， Ｍ．Ｄ． （２０２０）． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３７， ４４３－４５５

【非特許文献8】Ｇａｎｄｈｉ， Ｌ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｂｒｅｕ， Ｄ．， Ｇａｄｇｅｅｌ， Ｓ．， Ｅｓｔｅｂａｎ， Ｅ．， Ｆｅｌｉｐ， Ｅ．， Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ， Ｆ．， Ｄｏｍｉｎｅ， Ｍ．， Ｃｌｉｎｇａｎ， Ｐ．， Ｈｏｃｈｍａｉｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｐｏｗｅｌｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７８， ２０７８－２０９２

【非特許文献9】Ｍｏｔｚｅｒ， Ｒ．Ｊ．， Ｐｅｎｋｏｖ， Ｋ．， Ｈａａｎｅｎ， Ｊ．， Ｒｉｎｉ， Ｂ．， Ａｌｂｉｇｅｓ， Ｌ．， Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｍ．Ｔ．， Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ， Ｂ．， Ｋｏｌｌｍａｎｎｓｂｅｒｇｅｒ， Ｃ．， Ｎｅｇｒｉｅｒ， Ｓ．， Ｕｅｍｕｒａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ａｖｅｌｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ａｘｉｔｉｎｉｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｎａｌ－Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３８０， １１０３－１１１５

【非特許文献10】Ｓｃｈｍｉｄ， Ｐ．， Ａｄａｍｓ， Ｓ．， Ｒｕｇｏ， Ｈ．Ｓ．， Ｓｃｈｎｅｅｗｅｉｓｓ， Ａ．， Ｂａｒｒｉｏｓ， Ｃ．Ｈ．， Ｉｗａｔａ， Ｈ．， Ｄｉｅｒａｓ， Ｖ．， Ｈｅｇｇ， Ｒ．， Ｉｍ， Ｓ．Ａ．， Ｓｈａｗ Ｗｒｉｇｈｔ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ ａｎｄ Ｎａｂ－Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７９， ２１０８－２１２１

【非特許文献11】Ｗｕ， Ｔ．Ｄ．， Ｍａｄｉｒｅｄｄｉ， Ｓ．， ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ， Ｐ．Ｅ．， Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ， Ｒ．， Ｃｈｅｎ， Ｙ．Ｊ．， Ｃｈｉｔｒｅ， Ａ．Ｓ．， Ｃｈｉａｎｇ， Ｅ．Ｙ．， Ｉｆｔｉｋｈａｒ， Ｈ．， Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ， Ｗ．Ｅ．， Ａｕ－Ｙｅｕｎｇ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５７９， ２７４－２７８

【非特許文献12】Ｋｈａｎ， Ｏ．， Ｇｉｌｅｓ， Ｊ．Ｒ．， ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｓ．， Ｍａｎｎｅ， Ｓ．， Ｎｇｉｏｗ， Ｓ．Ｆ．， Ｐａｔｅｌ， Ｋ．Ｐ．， Ｗｅｒｎｅｒ， Ｍ．Ｔ．， Ｈｕａｎｇ， Ａ．Ｃ．， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｋ．Ａ．， Ｗｕ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． ＴＯＸ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｐｒｏｇｒａｍｓ ＣＤ８． Ｎａｔｕｒｅ ５７１， ２１１－２１８

【非特許文献13】Ｓｃｏｔｔ， Ａ．Ｃ．， Ｄｕｅｎｄａｒ， Ｆ．， Ｚｕｍｂｏ， Ｐ．， Ｃｈａｎｄｒａｎ， Ｓ．Ｓ．， Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｃ．Ａ．， Ｓｈａｋｉｂａ， Ｍ．， Ｔｒｉｖｅｄｉ， Ｐ．， Ｍｅｎｏｃａｌ， Ｌ．， Ａｐｐｌｅｂｙ， Ｈ．， Ｃａｍａｒａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． ＴＯＸ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ５７１， ２７０－２７４

【非特許文献14】Ｓｃｈｅｐｅｒ， Ｗ．， Ｋｅｌｄｅｒｍａｎ， Ｓ．， Ｆａｎｃｈｉ， Ｌ．Ｆ．， Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ， Ｃ．， Ｂｅｎｄｌｅ， Ｇ．， ｄｅ Ｒｏｏｉｊ， Ｍ．Ａ．Ｊ．， Ｈｉｒｔ， Ｃ．， Ｍｅｚｚａｄｒａ， Ｒ．， Ｓｌａｇｔｅｒ， Ｍ．， Ｄｉｊｋｓｔｒａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ｌｏｗ ａｎｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ＴＣＲ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５， ８９－９４

【非特許文献15】Ｓｉｍｏｎｉ， Ｙ．， Ｂｅｃｈｔ， Ｅ．， Ｆｅｈｌｉｎｇｓ， Ｍ．， Ｌｏｈ， Ｃ．Ｙ．， Ｋｏｏ， Ｓ．Ｌ．， Ｔｅｎｇ， Ｋ．Ｗ．Ｗ．， Ｙｅｏｎｇ， Ｊ．Ｐ．Ｓ．， Ｎａｈａｒ， Ｒ．， Ｚｈａｎｇ， Ｔ．， Ｋａｒｅｄ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａｂｕｎｄａｎｔ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５５７， ５７５－５７９

【非特許文献16】Ｅｒｋｅｓ、 Ｄ．Ａ．、 Ｓｍｉｔｈ、 Ｃ．Ｊ．、 Ｗｉｌｓｋｉ、 Ｎ．Ａ．、 Ｃａｌｄｅｉｒａ－Ｄａｎｔａｓ、 Ｓ．、 Ｍｏｈｇｂｅｌｉ、 Ｔ．、 ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ、 Ｃ．Ｍ． （２０１７）． Ｖｉｒｕｓ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８、 ２９７９－２９８８

【非特許文献17】Ｒｏｓａｔｏ， Ｐ．Ｃ．， Ｗｉｊｅｙｅｓｉｎｇｈｅ， Ｓ．， Ｓｔｏｌｌｅｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｎｅｌｓｏｎ， Ｃ．Ｅ．， Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｌ．， Ｍａｎｌｏｖｅ， Ｌ．Ｓ．， Ｐｅｎｎｅｌｌ， Ｃ．Ａ．， Ｂｌａｚａｒ， Ｂ．Ｒ．， Ｃｈｅｎ， Ｃ．Ｃ．， Ｇｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｏｐｕｌａｔｅ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｐｕｒｐｏｓｅｄ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０， ５６７

【非特許文献18】Ｓｉｍｏｎｉ， Ｙ．， Ｂｅｃｈｔ， Ｅ．， Ｆｅｈｌｉｎｇｓ， Ｍ．， Ｌｏｈ， Ｃ．Ｙ．， Ｋｏｏ， Ｓ．Ｌ．， Ｔｅｎｇ， Ｋ．Ｗ．Ｗ．， Ｙｅｏｎｇ， Ｊ．Ｐ．Ｓ．， Ｎａｈａｒ， Ｒ．， Ｚｈａｎｇ， Ｔ．， Ｋａｒｅｄ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａｂｕｎｄａｎｔ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５５７， ５７５－５７９

【非特許文献19】Ｍａｒｔｉｎ， Ｍ．Ｄ．， Ｊｅｎｓｅｎ， Ｉ．Ｊ．， Ｉｓｈｉｚｕｋａ， Ａ．Ｓ．， Ｌｅｆｅｂｖｒｅ， Ｍ．， Ｓｈａｎ， Ｑ．， Ｘｕｅ， Ｈ．Ｈ．， Ｈａｒｔｙ， Ｊ．Ｔ．， Ｓｅｄｅｒ， Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｂａｄｏｖｉｎａｃ， Ｖ．Ｐ． （２０１９）． Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｍｐａｃｔ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １３０， ３８９４－３９０８

【非特許文献20】Ｓｏｕｄｊａ， Ｓ．Ｍ．， Ｒｕｉｚ， Ａ．Ｌ．， Ｍａｒｉｅ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｌａｕｖａｕ， Ｇ． （２０１２）． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８（＋） Ｔ ａｎｄ ｉｎｎａｔｅ ＮＫ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｃｏｇｎａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｕｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｖａｓｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３７， ５４９－５６２

【非特許文献21】（Ｗｏｌｃｈｏｋ， Ｊ．Ｄ．， Ｃｈｉａｒｉｏｎ－Ｓｉｌｅｎｉ， Ｖ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｒ．， Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ， Ｐ．， Ｇｒｏｂ， Ｊ．Ｊ．， Ｃｏｗｅｙ， Ｃ．Ｌ．， Ｌａｏ， Ｃ．Ｄ．， Ｗａｇｓｔａｆｆ， Ｊ．， Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ， Ｄ．， Ｆｅｒｒｕｃｃｉ， Ｐ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗｉｔｈ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ａｎｄ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７， １３４５－１３５６

【非特許文献22】（Ｖｅｒｓｌｕｉｓ， Ｊ．Ｍ．， Ｌｏｎｇ， Ｇ．Ｖ．， ａｎｄ Ｂｌａｎｋ， Ｃ．Ｕ． （２０２０）． Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６， ４７５－４８４

【非特許文献23】Ａｍａｒｉａ， Ｒ．Ｎ．， Ｒｅｄｄｙ， Ｓ．Ｍ．， Ｔａｗｂｉ， Ｈ．Ａ．， Ｄａｖｉｅｓ， Ｍ．Ａ．， Ｒｏｓｓ， Ｍ．Ｉ．， Ｇｌｉｔｚａ， Ｉ．Ｃ．， Ｃｏｒｍｉｅｒ， Ｊ．Ｎ．， Ｌｅｗｉｓ， Ｃ．， Ｈｗｕ， Ｗ．Ｊ．， Ｈａｎｎａ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４， １６４９－１６５４

【非特許文献24】Ｂｌａｎｋ， Ｃ．Ｕ．， Ｒｏｚｅｍａｎ， Ｅ．Ａ．， Ｆａｎｃｈｉ， Ｌ．Ｆ．， Ｓｉｋｏｒｓｋａ， Ｋ．， ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｅｌ， Ｂ．， Ｋｖｉｓｔｂｏｒｇ， Ｐ．， Ｋｒｉｊｇｓｍａｎ， Ｏ．， ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒａｂｅｒ， Ｍ．， Ｐｈｉｌｉｐｓ， Ｄ．， Ｂｒｏｅｋｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ｖｅｒｓｕｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｐｌｕｓ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｉｎ ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔａｇｅ ＩＩＩ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４， １６５５－１６６１

【非特許文献25】Ｆｏｒｄｅ， Ｐ．Ｍ．， Ｃｈａｆｔ， Ｊ．Ｅ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｋ．Ｎ．， Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ， Ｖ．， Ｃｏｔｔｒｅｌｌ， Ｔ．Ｒ．， Ｈｅｌｌｍａｎｎ， Ｍ．Ｄ．， Ｚａｈｕｒａｋ， Ｍ．， Ｙａｎｇ， Ｓ．Ｃ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｄ．Ｒ．， Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ＰＤ－１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７８， １９７６－１９８６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

上記に鑑み、本発明は、チェックポイント阻害剤を用いた現状の免疫療法の上述した欠点を克服し、且つ、チェックポイント阻害剤と、該チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果を増強する薬剤との新規の組合せを提供することを目的とする。これにより、（ｉ）免疫チェックポイント阻害剤の治療に対して応答性を示す患者の割合が増加し、及び／又は（ｉｉ）前記免疫チェックポイント阻害剤の投与量を低減することができ、好ましくない副作用を低減又は予防することができる。

【0012】

これらの目的は、以下及び添付の特許請求の範囲に示す発明主題によって達成される。

【0013】

以下、本発明を詳細に説明するが、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬は変わる可能性あり、因って、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。特段の断りがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。

【0014】

以下に、本発明の要素について説明する。これら要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の方式で任意の数組み合わせて更なる実施形態を形成することができることが理解されるべきである。記載される様々は実施例及び好ましい実施形態は、明示的に記載した実施形態にのみ、本発明を限定するものではない。この記載は、明示的に記載された実施形態と、任意の数の開示された及び／又は好ましい要素とを組み合わせる実施形態をサポート及び包含すると理解すべきである。更に、特に指定しない限り、本願において記載された全ての要素の任意の入れ換え及び組合せが、本願の記載によって開示されるとみなすべきである。

【0015】

本明細書及びその後に続く特許請求の範囲全体を通して、特に必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、言及された部材、整数、又は工程を含むことを意味するが、その他の言及されていない部材、整数、又は工程を除外することを意味するものではない。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」は、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程が除外される、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の具体的な形態である。本発明において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、用語「からなる（ｃｏｍｓｉｓｔ ｏｆ）」を包含する。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘからなっていてもよく、追加の何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

【0016】

用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の説明（特に、特許請求の範囲）において使用される同様の参照は、本明細書に指定されているか又は文脈上明示的に否定されていない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内の各別個の値を個別に参照する簡易的な方法として機能することを意図する。本明細書において特に指定しない限り、各個別の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。明細書中のいずれの言語も、請求の範囲に記載されていないが、本発明を実施するのに必須である要素であることを示すと解釈されるべきではない。

【0017】

用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含んでいなくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略されることもある。

【0018】

数値ｘに関する用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。

【0019】

チェックポイント阻害剤とＡＴＰ－加水分解酵素とからなる組合せ
本発明の第一の態様は下記の組合せを提供する。即ち、
（ｉ）免疫チェックポイント阻害剤と、
（ｉｉ）（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子と、
の組合せ。

【0020】

添付の実施例に示されるように、本発明者は、驚くべきことに、ＡＴＰ加水分解酵素（又はＡＴＰ加水分解酵素をコードする宿主細胞／微生物）が免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効力を増加することを見出した。したがって、免疫チェックポイント阻害剤と、ＡＴＰ加水分解酵素、又はＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、かかる核酸を有する（よって、ＡＴＰ加水分解酵素を発現する）宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子と、からなる組合せにより効率的な癌治療をもたらす。これにより、チェックポイント阻害剤を用いた抗癌治療に応答性を示す患者の数が増えるかもしれない。また、深刻な副作用を低減させるため、チェックポイント阻害剤の投与量を減らすことができ、又はチェックポイント阻害剤の有害な組合せを避けることができる。

【0021】

以下、本発明の組合せの成分、即ち、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーター、及び（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記核酸を含む宿主細胞、前記核酸を含む微生物、又は前記核酸を含むウイルス粒子の詳細を説明する。以下に説明される（ｉ）前記免疫チェックポイント阻害剤の態様のいずれかと、以下に説明される（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記核酸を含む宿主細胞、前記核酸を含む微生物、又は前記核酸を含むウイルス粒子のいずれかとを、組み合わせることができる。

【0022】

免疫チェックポイントモジュレーター
ここで（即ち、本明細書中で）使用される用語「免疫チェックポイントモジュレーター」（「チェックポイントモジュレーター」とも参照される）は、少なくとも１つの（免疫）チェックポイント分子の機能を調節する（例えば、完全に又は一部低減する、阻害する、干渉する、活性化する、促進する、増加する、補強する、又は補助する）分子又は化合物を意味する。言い換えれば、「免疫チェックポイントモジュレーター」は免疫チェックポイント分子のモジュレーターである。したがって、免疫チェックポイントモジュレーターは、「免疫チェックポイント阻害剤」（「チェックポイント阻害剤」又は「阻害剤」とも参照される）、又は「免疫チェックポイント活性剤」（「チェックポイント活性剤」又は「活性剤」とも参照される）であってもよい。「免疫チェックポイント阻害剤」（「チェックポイント阻害剤」又は「阻害剤」とも参照される）は、少なくとも１つのチェックポイント分子の機能を、完全に又は一部低減、阻害、干渉、又はネガティブに調節する。「免疫チェックポイント活性剤」（「チェックポイント活性剤」又は「活性剤」とも参照される）は、少なくとも１つのチェックポイント分子の機能を完全に又は一部活性化、促進、増加、補強、補助、又はポジティブに調節する。免疫チェックポイントモジュレーターは、通常、（ｉ）自己寛容及び／又は（ｉｉ）免疫応答の強度及び／又は持続時間を調節することができる。好ましくは、本発明において使用される前記免疫チェックポイントモジュレーターは、１つ以上のヒトチェックポイント分子の機能を調節するものであり、したがって、前記免疫チェックポイントモジュレーターは「ヒトチェックポイントモジュレーター」である。好ましくは、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＧＩＴＲ、ＴＮＦＲ、ＴＩＧＩＴ及び／又はＦａｓＲ／ＤｃＲ３から選択される少なくとも１つの免疫チェックポイント分子の活性剤又は阻害剤、或いはそれらの少なくとも１つのリガンドの活性剤又は阻害剤である。

【0023】

チェックポイント分子（「免疫チェックポイント分子」又は「免疫チェックポイント」とも言われる）は、通常、免疫経路に関与するタンパク質等の分子であり、例えば、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、及び／又はＴ細胞機能に関与するタンパク質等の分子である。免疫チェックポイント分子は、しばしば、免疫システムの「門番（ゲートキーパー）」と言われる。免疫チェックポイント分子は、通常、自己寛容に重要であると言われ、免疫システムが無差別に細胞を攻撃するのを予防する。しかし、癌によっては、免疫チェックポイント標的を刺激することにより、免疫からの攻撃に対して癌自身を防衛することができ、よって、免疫応答を阻止又は低減する。この点から、免疫チェックポイントモジュレーターの目的は、免疫応答が阻止又は低減されないように、更には、免疫応答が誘起又は強化されるように免疫チェックポイント分子を調節することである。したがって、チェックポイントモジュレーターにより調節された（完全に又は一部低減、阻害、干渉、活性化、促進、増加、補強、又は補助する）チェックポイント分子の機能は、通常、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、及び／又はＴ細胞機能（の調整）である。したがって、免疫チェックポイント分子は、自己寛容を調整及び保持し、生理学的免疫応答の持続時間及び強度を調整及び保持する。免疫チェックポイント分子の多くは、Ｂ７：ＣＤ２８ファミリー又は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属し、特定のリガンドに結合することにより、細胞質ドメインにリクルートされるシグナリング分子を活性化する（Ｓｕｓｕｍｕ Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．、２０１６：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、 ２０１６：ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｊｃｏ／ｈｙｖ２０１［印刷出版に先立つＥ書籍］参照；特に表１）。

【0024】

Ｂ７：ＣＤ２８ファミリーは、免疫チェックポイントにおいて最も頻繁に標的とされる経路を含み、ＣＴＬＡ－４ － Ｂ７－１／Ｂ７－２経路及びＰＤ－１ － Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１）／Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２）経路を含む。前記ファミリーの他のものとしては、ＩＣＯＳ－ＩＣＯＳＬ／Ｂ７－Ｈ２が挙げられる。前記ファミリーのその他のものとしては、ＣＤ２８、Ｂ７－Ｈ３、及びＢ７－Ｈ４が挙げられる。

【0025】

ＣＤ２８は、殆どのヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞に、また、全てのＣＤ８Ｔ細胞のうち凡そ半分のものに構成的に発現する。前記ＣＤ２８は、樹状細胞に発現される２つのリガンドであるＣＤ８０（Ｂ７－１）及びＣＤ８６（Ｂ７－２）と結合し、Ｔ細胞増殖を促進する。前記チェックポイント共刺激分子ＣＤ２８は、チェックポイント抑制分子ＣＴＬＡ４と、共通のリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６を競合する（Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ Ｅ． Ｉ． ａｎｄ Ｄｅｓａｉ Ａ．， ２０１６：ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ＰＤ－１ Ｐａｔｈｗａｙｓ－Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３９（１）：９８－１０６）。

【0026】

細胞傷害性Ｔリンパ球関連プロテイン４（ＣＴＬＡ４；ＣＤ１５２としても知られる）は、Ｂ７に対してより高い結合親和性を有するＣＤ２８相同体である。ＣＴＬＡ－４のリガンドは、ＣＤ２８同様、ＣＤ８０（Ｂ７－１）及びＣＤ８６（Ｂ７－２）である。しかし、ＣＤ２８とは異なり、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合は、刺激シグナルを発生せず、ＣＤ２８により通常発生される共刺激シグナルを妨げる。また、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合は、ＣＤ２８：Ｂ７結合及びＴＣＲ：ＭＨＣ結合の刺激シグナルを妨害する阻害性シグナルを発生するとも考えられている。ＣＴＬＡ－４は、自己反応する可能性のあるＴ細胞をナイーブＴ細胞活性化の初期段階で阻止、通常、リンパ節で阻止するため、ＣＴＬＡ－４は抑制性免疫チェックポイントの「リーダー」であると考えられている（Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ Ｅ． Ｉ． ａｎｄ Ｄｅｓａｉ Ａ．，２０１６：ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ＰＤ－１ Ｐａｔｈｗａｙｓ：Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ３９（１）：９８－１０６）。ＣＴＬＡ４の好ましいチェックポイント阻害剤には、モノクローナル抗体Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）（イピリムマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びＴｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ（Ｐｆｉｚｅｒ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）が含まれる。更に好ましいＣＴＬＡ－４阻害剤としては、ＷＯ２００１／０１４４２４、ＷＯ２００４／０３５６０７、ＵＳ２００５／０２０１９９４、及びＥＰ１２１２４２２Ｂ１に開示されている抗ＣＴＬＡ－４抗体が含まれる。更に、本発明に使用することができる抗ＣＴＬＡ－４抗体としては、例えば、ＵＳ５，８１１，０９７、ＵＳ５，８５５，８８７、ＵＳ６，０５１，２２７、ＵＳ６，９８４，７２０、ＷＯ０１／１４４２４、ＷＯ００／３７５０４、ＵＳ２００２／００３９５８１、ＵＳ２００２／０８６０１４、ＷＯ９８／４２７５２、ＵＳ６，６８２，７３６、及びＵＳ６，２０７，１５６；並びに、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５（１７）：１００６７－１００７１（１９９８）；Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（２００４）（ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＰ－６７５２０６）；Ｍｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５８：５３０１－５３０４（１９９８）、ＵＳ５，９７７，３１８、ＵＳ６，６８２，７３６、ＵＳ７，１０９，００３、及びＵＳ７，１３２，２８１に開示されているものが含まれる。

【0027】

プログラム細胞死１受容体（ＰＤ１）は、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１及びＣＤ２７４としても知られる）と、ＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ及びＣＤ２７３としても知られる）との２つのリガンドを有する。前記ＰＤ１経路は、免疫応答の最終段階で、主に末梢組織において、既に活性化されたＴ細胞を調整する。したがって、ＰＤ１を標的とする利点は、腫瘍微小環境における免疫機能を回復できることである。前記ＰＤ１経路の好ましい阻害剤としては、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペムブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；ＷＯ２０１１／０６６３８９Ａ１に記載の通り）、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ＵＳ８，２１７，１４９Ｂ２参照）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、Ａｖｅｌｕｍａｂ（Ｍｅｒｃｋ）、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＩＨ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、ＡＭＰ－２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ、 ＧＳＫ）、ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）及びラムブロリズマブ（例えば、ＷＯ２００８／１５６７１２；Ｈａｍｉｄ ｅｔ ａｌ．、２０１３；及びＮ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９：１３４－１４４に開示のｈＰＤ１０９Ａ、並びにそのヒト化誘導体であるｈ４０９Ａｌｌ、ｈ４０９Ａ１６、及びｈ４０９Ａ１７）が含まれる。

【0028】

誘導性Ｔ細胞共刺激因子（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ［ＩＣＯＳ］；ＣＤ２７８としても知られる）は、活性化Ｔ細胞に発現する。前記ＩＣＯＳのリガンドはＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２；ＣＤ２７５）、であり、主にＢ細胞及び樹状細胞に発現する。この分子は、Ｔ細胞エフェクター機能において重要であると考えられている。

【0029】

Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）は、元々、共刺激分子として知られていたが、現在では、共阻害剤として知られている。Ｂ７－Ｈ３の好ましいチェックポイント阻害剤は、Ｆｃ最適化モノクローナル抗体であるＥｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ（ＭＧＡ２７１；ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ；ＵＳ２０１２／０２９４７９６Ａ１参照）である。

【0030】

Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても知られる）は、腫瘍細胞及び腫瘍関連マクロファージにより発現され、腫瘍エスケープにおいて重要な役割を果たす。好ましいＢ７－Ｈ４阻害剤としては、Ｄａｎｇａｊ、Ｄ． ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３（１５）：４８２０－９、及びＪｅｎｅｓｓａ Ｂ． Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．、２０１４：Ｂ７－Ｈ４ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ：Ａ ｃｌｏｓｅｒ ｌｏｏｋ． Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ １３４（１）：１８１－１８９の表１及びそれに対応する記載に開示の抗体が挙げられる。その他のＢ７－Ｈ４阻害剤の好ましい例としては、例えば、ＷＯ２０１３／０２５７７９Ａ１及びＷＯ２０１３／０６７４９２Ａ１に開示のヒトＢ７－Ｈ４の抗体、及びＵＳ２０１２／０１７７６４５Ａ１等に開示のＢ７－Ｈ４の可溶性組換え体が挙げられる。

【0031】

前記ＴＮＦスーパーファミリーとしては、特に、２９のサイトカイン受容体に結合する１９のタンパク質リガンドが含まれる。これらは、アポトーシス、炎症、細胞生存等の多くの生理学的応答に関与する（Ｃｒｏｆｔ、Ｍ．、Ｃ．Ａ． Ｂｅｎｅｄｉｃｔ、 ａｎｄ Ｃ．Ｆ． Ｗａｒｅ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ａｎｄ ＴＮＦＲ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｉｅｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、２０１３．１２（２）：ｐ．１４７－６８）。以下のチェックポイント分子／経路は、癌の認識に好ましい：ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０／０Ｘ４０Ｌ）、ＴＮＦＲＳＦＳ（ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７／ＣＤ７０）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ）、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ）、ＴＮＦＲＳＦ１０（ＴＲＡＩＬＲ／ＴＲＡＩＬ））、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＦＮ１４／ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＲＳＦ１３（ＢＡＦＦＲＴＡＣＩ／ＡＰＲＩＬ－ＢＡＦＦ）、及びＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ）。更に好ましいチェックポイント分子／経路としては、Ｆａｓ－リガンド及びＴＮＦＲＳＦ１（ＴＮＦα／ＴＮＦＲ）が挙げられる。また、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）／ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）経路は、ＣＴＬＡ－４遮断のように、免疫応答の強化に好ましい。したがって、本発明において、かかるチェックポイントモジュレーターは、癌の治療及び／又は予防に使用されるのに好ましく、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０／０Ｘ４０Ｌ）、ＴＮＦＲＳＦＳ（ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７／ＣＤ７０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ）、ＦａｓＲ／ＤｃＲ３／Ｆａｓリガンド、ＴＮＦＲＳＦ１（ＴＮＦα／ＴＮＦＲ）、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ、及びＣＴＬＡ４から選択される１つ以上のチェックポイント分子を調節する。

【0032】

ＯＸ４０（ＣＤ１３４又はＴＮＦＲＳＦ４としても知られる）は、エフェクター及びメモリーＴ細胞の増殖を促進するが、制御性Ｔ細胞の分化及び活動を抑制することもでき、サイトカインの生成を規制することができる。ＯＸ４０のリガンドは、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４又はＣＤ２５２としても知られる）である。ＯＸ４０は、Ｔ細胞受容体連結後に一過性発現し、炎症性病変において、抗原により直近で活性化したＴ細胞においてのみ発現上昇する。ＯＸ４０の好ましいチェックポイントモジュレーターとしては、ＭＥＤＩ６４６９（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＥＤＩ６３８３（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＥＤＩ０５６２（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＯＸＲ０９１６（ＲＧ７８８８；Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＧＳＫ３１７４９９８（ＧＳＫ）が挙げられる。

【0033】

ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５としても知られる）は、抗原提示細胞等の、多様な免疫システム細胞により発現される。ＣＤ４０のリガンドはＣＤ４０Ｌであり、ＣＤ１５４又はＴＮＦＳＦ５としても知られており、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞の表面において一過性発現される。ＣＤ４０シグナルは、樹状細胞が熟成することを「許可」し、それにより、Ｔ細胞活性化及び分化を誘起する。しかし、ＣＤ４０は、腫瘍細胞によっても発現される。したがって、癌患者においてＣＤ４０の刺激／活性化は、有益にも有害にもなりうる。そのため、この免疫チェックポイントの刺激又は阻害性モジュレーターが開発された（Ｓｕｆｉａ Ｂｕｔｔ Ｈａｓｓａｎ， Ｊｅｓｐｅｒ Ｆｒｅｄｄｉｅ Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎ， Ｂａｒｂａｒａ Ｎｉｃｏｌａ Ｏｌｓｅｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓ Ｅｌｍ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， ２０１４： Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｅｎｔ ａｎｄ ｏｎｇｏｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ， ３６：２， ９６－１０４）。ＣＤ４０チェックポイントモジュレーターの好ましい例としては、（ｉ）Ｓｕｆｉａ Ｂｕｔｔ Ｈａｓｓａｎ， Ｊｅｓｐｅｒ Ｆｒｅｄｄｉｅ Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎ， Ｂａｒｂａｒａ Ｎｉｃｏｌａ Ｏｌｓｅｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓ Ｅｌｍ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， ２０１４： Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｅｎｔ ａｎｄ ｏｎｇｏｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ， ３６：２， ９６－１０４に記載のアゴニスト抗ＣＤ抗体であって、例えば、Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ（ＳＧＮ－４０）、ＣＰ－８７０８９３、ＦＧＫ４．５／ＦＧＫ４５及びＦＧＫ１１５等、好ましくは、Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ、並びに（ｉｉ）Ｓｕｆｉａ Ｂｕｔｔ Ｈａｓｓａｎ， Ｊｅｓｐｅｒ Ｆｒｅｄｄｉｅ Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎ， Ｂａｒｂａｒａ Ｎｉｃｏｌａ Ｏｌｓｅｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓ Ｅｌｍ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， ２０１４： Ａｎｔｉ－ＣＤ４０－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｒｅｃｅｎｔ ａｎｄ ｏｎｇｏｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ， ３６：２， ９６－１０４に記載のアゴニスト抗ＣＤ抗体であって、例えば、Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ（ＨＣＤ１２２、ＣＨＩＲ－１２．１２）等を含む。ＣＤ４０の更に好ましい免疫チェックポイントモジュレーターとしては、ＳＥＡ－ＣＤ４０（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＡＤＣ－１０１３（Ａｌｌｉｇａｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＸ００５Ｍ（Ａｐｅｘｉｇｅｎ Ｉｎｃ）、及びＲＯ７００９７８９（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。

【0034】

ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７としても知られる）は、抗原に特異的なナイーブＴ細胞の増殖を援助し、メモリーＴ細胞の生成に重要な役割を果たす。ＣＤ２７は、また、Ｂ細胞のメモリーマーカーでもある。ＣＤ２７のリガンドであるＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７又はＣＤ２７Ｌとしても知られる）のリンパ球及び樹状細胞での一過性のアベイラビリティが、ＣＤ２７の活性を制御する。また、ＣＤ２７共刺激は、Ｔｈ１７エフェクター細胞機能を抑制することが知られている。ＣＤ２７の好ましい免疫チェックポイントモジュレーターとしては、Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ（Ｃｅｌｌｄｅｘ）が挙げられる。ＣＤ７０の好ましい免疫チェックポイントモジュレーターとしては、ＡＲＧＸ－１１０（ａｒＧＥＮ－Ｘ）及びＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）が挙げられる。

【0035】

ＣＤ１３７（４－１ＢＢ又はＴＮＦＲＳＦ９としても知られる）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーの一員であり、活性化Ｔ細胞のための共刺激活性と関連があることが明らかになりつつある。特に、（ＣＤ１３７のリガンドであるＣＤ１３７Ｌ［ＴＮＦＳＦ９又は４－１ＢＢＬとしても知られる］を介した）ＣＤ１３７シグナルは、Ｔ細胞増殖を引き起こし、Ｔ細胞、特に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が、活性化誘導細胞死することを防ぐ。ＣＤ１３７の好ましいチェックポイントモジュレーターとしては、ＰＦ－０５０８２５６６（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＵｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ）が挙げられる。

【0036】

グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ、ＴＮＦＲＳＦ１８としても知られる）は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）増殖を含むＴ細胞増殖を促進する。ＧＩＴＲ（ＧＩＴＲＬ、ＴＮＦＳＦ１８）のリガンドは、主に、抗原提示細胞に発現する。ＧＩＴＲに対する抗体は、Ｔｒｅｇ系列の安定性喪失を介して抗腫瘍応答を促進することが示されている。ＧＩＴＲの好ましいチェックポイントモジュレーターとしては、ＢＭＳ－９８６１５６（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＴＲＸ５１８（ＧＩＴＲ Ｉｎｃ）、及びＭＫ－４１６６（Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。

【0037】

Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（Ｂ ａｎｄ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ［ＢＴＬＡ］；ＣＤ２７２としても知られる）は、特に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞により発現され、ＢＴＬＡの表面でのＢＴＬＡの発現は、ナイーブ細胞表現型からエフェクター細胞表現型へのＣＤ８^＋Ｔ細胞の分化中に、次第に抑制される。しかし、腫瘍特異ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞は、高いレベルでＢＴＬＡを発現する。ＢＴＬＡの発現はＴ細胞の活性化中に誘起され、ＢＴＬＡはＴｈ１細胞上では発現されたままで留まるが、Ｔｈ２細胞上ではそうではない。ＰＤ１及びＣＴＬＡ４同様、ＢＴＬＡは、Ｂ７相同体であるＢ７Ｈ４と相互作用する。しかし、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４とは異なり、ＢＴＬＡは、Ｂ７ファミリーの細胞の表面受容体のみではなく、腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦ－Ｒ）との相互作用を介してＴ細胞阻害性を示す。ＢＴＬＡは、腫瘍壊死因子（受容体）スーパーファミリーのリガンドであるメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）であり、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒ［ＨＶＥＭ］、ＣＤ２７０としても知られる）としても知られている。ＢＴＬＡ－ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答をネガティブに（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ）規制する。好ましいＢＴＬＡ阻害剤としては、Ａｌｉｓｏｎ Ｃｒａｗｆｏｒｄ ａｎｄ Ｅ． Ｊｏｈｎ Ｗｈｅｒｒｙ， ２００９： Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ： Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＢＴＬＡ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８６： ５－８の表１に記載の抗体、特に、該抗体のヒト抗体が挙げられる。ヒトＢＴＬＡがそのリガンドと相互作用するのを阻止する、他の好ましい抗体は、ＷＯ２０１１／０１４４３８に開示されており、例えば、ＷＯ２０１１／０１４４３８に開示されている「４Ｃ７」等が挙げられる。

【0038】

他のチェックポイント分子ファミリーとしては、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の２つの主要なクラス（ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ）に関連するチェックポイント分子が挙げられる。前記ファミリーは、クラスＩのためのキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、及びクラスＩＩのためのリンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）を含む。

【0039】

キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）は、ＭＨＣクラスＩのための受容体であり、ナチュラルキラー細胞における受容体である。ＫＩＲの阻害剤の例としては、モノクローナル抗体Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ（ＩＰＨ ２１０２； Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ／ＢＭＳ； ｃｆ． ＵＳ ８，１１９，７７５ Ｂ２ ａｎｄ Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｂｌｏｏｄ １２０：４３２４－４３３３）が挙げられる。

【0040】

リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ３、ＣＤ２２３としても知られる）シグナルは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞における直接的な効果と共に、Ｔｒｅｇに対する作用により、免疫応答を抑制する。ＬＡＧ３阻害剤の好ましい例としては、抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体ＢＭＳ－９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。ＬＡＧ３阻害剤の他の好ましい例としては、ＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）、ＷＯ２００９／０４４２７３Ａ２及びＢｒｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００９、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：６２２５－６２３１に開示されているＬＡＧ３－Ｉｇ、マウス又はヒト化抗体遮断性ヒトＬＡＧ３（ｍｏｕｓｅ ｏｒ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＬＡＧ３）（例えば、ＷＯ２００８／１３２６０１Ａ１に開示されているＩＭＰ７０１）、及び完全ヒト抗体遮断性ヒトＬＡＧ３（ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＬＡＧ３）（ＥＰ２３２０９４０Ａ２に開示）が挙げられる。

【0041】

他のチェックポイント分子経路としては、ＴＩＭ－３／ＧＡＬ９経路が挙げられる。Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３、ＨＡＶｃｒ－２としても知られる）は活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現し、Ｔｈ１及びＴｈ１７サイトカインを規制する。ＴＩＭ－３は、ＴＩＭ－３のリガンドであるｇａｌｅｃｔｉｎ－９（ＧＡＬ９）との相互作用により細胞死を誘起することにより、Ｔｈ１／Ｔｃ１機能の負の（ネガティブ）制御因子として作用する。ＴＩＭ－３は、末梢性寛容の誘導を制御するＴｈ１特異細胞表面分子（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ １ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である。最近の研究では、ＴＩＭ－３抗体が抗腫瘍免疫を大幅に高めることができることが実際に示されている（Ｎｇｉｏｗ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ－ＴＩＭ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ＩＦＮ－ｇａｍｍａｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２０１１． ７１（１０）： ｐ． ３５４０－５１）。ＴＩＭ－３阻害剤の好ましい例としては、抗体標的ヒトＴＩＭ３（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＴＩＭ３）（例えば、ＷＯ２０１３／００６４９０Ａ２）が挙げられ、特に、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ ．、２００８、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０５（１２）：２７６３－７９に開示されている抗ヒトＴＩＭ３ブロッキング抗体Ｆ３８－２Ｅ２（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＴＩＭ３ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆ３８－２Ｅ２）が挙げられる。

【0042】

ＣＥＡＣＡＭ１（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１）は、更なるチェックポイント分子である（Ｈｕａｎｇ， Ｙ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， ＣＥＡＣＡＭ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＴＩＭ－３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ， ２０１５． ５１７（７５３４）： ｐ． ３８６－９０； Ｇｒａｙ－Ｏｗｅｎ， Ｓ．Ｄ． ａｎｄ Ｒ．Ｓ． Ｂｌｕｍｂｅｒｇ， ＣＥＡＣＡＭ１： ｃｏｎｔａｃｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００６． ６（６）： ｐ． ４３３－４６）。ＣＥＡＣＡＭ１の好ましいチェックポイントモジュレーターとしては、ＣＭ－２４（ｃＣＡＭ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。

【0043】

他の免疫チェックポイント分子としてはＧＡＲＰが挙げられ、ＧＡＲＰは腫瘍が患者の免疫システムから免れる機能に重要な役割を果たす。現在、臨床試験において、候補分子（ＡＲＧＸ－１１５）が興味深い効果を示しているようである。したがって、ＡＲＧＸ－１１５は、好ましいＧＡＲＰチェックポイントモジュレーターである。

【0044】

また、様々な研究グループにより、他のチェックポイント分子としてホスファチジルセリン（「ＰＳ」とも称される）が挙げられ、ホスファチジルセリンが癌治療のために標的とされ得ることを示している（Ｃｒｅｅｌａｎ， Ｂ．Ｃ．， Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ， ２０１４． ２１（１）： ｐ． ８０－９； Ｙｉｎ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｄｕｃｅｓ Ｍｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ， ２０１３． １（４）： ｐ． ２５６－６８）。ホスファチジルセリン（ＰＳ）の好ましいチェックポイントモジュレーターとしては、Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）が挙げられる。

【0045】

他のチェックポイント経路としては、ＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒが挙げられる（Ｚｈｕ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， ＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１４． ７４（１８）： ｐ． ５０５７－ ５０６９）。ＣＳＦ１Ｒの好ましいチェックポイントモジュレーターとしては、ＦＰＡ００８（ＦｉｖｅＰｒｉｍｅ）、ＩＭＣ－ＣＳ４（Ｅｌｉ－Ｌｉｌｌｙ）、ＰＬＸ３３９７（Ｐｌｅｘｘｉｃｏｎ）、及びＲＯ５５０９５５４（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。

【0046】

更には、子宮頸癌（Ｓｈｅｕ，Ｂ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．、Ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ ｗｉｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｒｆｏｒｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ８＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００５．６５（７）：ｐ．２９２１－９）及び白血病（Ｔａｎａｋａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．、Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＮＫ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｆｒｏｍ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００５．１９（３）：ｐ．４８６－９）においてＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａナチュラルキラー細胞受容体が果たす役割が評価されている。ＮＫＧ２Ａの好ましいチェックポイントモジュレーターとしては、ＩＰＨ２２０１（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）が挙げられる。

【0047】

他のチェックポイント分子としては、ＩＤＯ、即ち、キヌレニン経路のインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ酵素が挙げられる（Ｂａｌｌ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２；ａ ｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２００９．４１（３）：ｐ．４６７－７１）。インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、免疫阻害性を有するトリプトファン分解酵素である。ＩＤＯは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を抑制することが知られており、Ｔｒｅｇ及び骨髄由来抑制細胞を生成及び活性化し、また、腫瘍血管新生を促進する。ＩＤＯ１は、多くの癌において過剰に発現され、免疫システムから腫瘍細胞を免れさせ（Ｌｉｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＤ０１ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ，２０１０．１１５（１７）：ｐ．３５２０－３０；Ｉｎｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｒｓｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ：ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００８．１４（８）：ｐ．２３１０－７）、また、局所炎症により誘起された際、慢性腫瘍進行を促進する（Ｍｕｌｌｅｒ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｃｒｅａｔｅｓ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ，２００８．１０５（４４）：ｐ．１７０７３－８）。好ましいＩＤＯ阻害剤としては、Ｅｘｉｇｕａｍｉｎｅ Ａ、ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ（ＩＮＣＢ０２４３６０；ＩｎＣｙｔｅ）、Ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＤＣ－０９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＢＭＳ）、及び１－メチル－トリプトファン、特に、Ｓｈｅｒｉｄａｎ Ｃ．、２０１５：ＩＤＯ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｍｏｖｅ ｃｅｎｔｅｒ ｓｔａｇｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３：３２１－３２２の表１に挙げられている１－メチル－［Ｄ］－トリプトファン及びＩＤＯ阻害剤が挙げられる。

【0048】

また、モジュレーションされ得る他の免疫チェックポイント分子としては、キヌレニン代謝経路の一要素であるトリプトファン－２、３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）が挙げられる。数々の研究で既に癌免疫及び自己免疫におけるＴＤＯへの関心が示されている（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．、Ｅｖａｄｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ： ｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，２０１２．１０４（５）：ｐ．３４９－５２；Ｐｌａｔｔｅｎ，Ｍ．， Ｗ． Ｗｉｃｋ， ａｎｄ Ｂ．Ｊ． Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ、Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｂｅｙｏｎｄ！ＤＯ ａｎｄ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１２．７２（２１）：ｐ．５４３５－４０；Ｐｌａｔｔｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＩＤＯｌ／ＴＤＯ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１４．５：ｐ．６７３）。

【0049】

モジュレーションされ得る他の免疫チェックポイント分子としては、Ａ２ＡＲが挙げられる。通常、腫瘍微小環境ではアデノシン濃度が高く、該アデノシンはＡ２ＡＲを活性化させるため、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）は、癌療法において重要なチェックポイントであると考えられている。かかるシグナルは、免疫微小環境において、負のフィードバックループを提供する（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ． Ｌｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５： Ａ２ａＲ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ： Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １３： ２６５－２７２を参照）。好ましいＡ２ＡＲ阻害剤としては、イストラデフィリン（Ｉｓｔｒａｄｅｆｙｌｌｉｎｅ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）－５０９、ＳＴ１５３５、ＳＴ４２０６、トザデナント（Ｔｏｚａｄｅｎａｎｔ）、Ｖ８１４４４、プレラデナント（Ｐｒｅｌａｄｅｎａｎｔ）、ビパデナント（Ｖｉｐａｄｅｎａｎｔ）、ＳＣＨ５８２６１、ＳＹＮ１１５、ＺＭ２４１３６５、及びＦＳＰＴＰが挙げられる。

【0050】

モジュレーションされ得る他の免疫チェックポイント分子としては、ＶＩＳＴＡ挙げられる。腫瘍中の白血球におけるＶＩＳＴＡの一定した発現によりＶＩＳＴＡ遮断が広い範囲の固体腫瘍で有効となるように、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［ＶＩＳＴＡ］；Ｃ１０ｏｒｆ５４としても知られる）は、主に、造血細胞に発現する。好ましいＶＩＳＴＡ阻害剤としては、ＪＮＪ－６１６１０５８８（ＩｍｍｕＮｅｘｔ）、及び、最近、第１相臨床試験が開始された抗ＶＩＳＴＡ抗体が挙げられる。

【0051】

他の免疫チェックポイント分子としては、ＣＤ１２２が挙げられる。ＣＤ１２２は、インターロイキン２受容体βサブユニット（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ｓｕｂ－ｕｎｉｔ）である。ＣＤ１２２は、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の増殖を拡大する。

【0052】

最近、Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）が、免疫チェックポイント分子として浮上した。ＴＩＧＩＴは、リンパ球に発現する抑制性受容体であり、抗原提示細胞又は腫瘍細胞に発現するＣＤ１５５と相互作用してＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能をダウンレギュレーションする。ＴＩＧＩＴ活性及びＴＩＧＩＴ遮断の効果は、例えば、Ｈａｒｊｕｎｐａｅａｅ Ｈ、Ｇｕｉｌｌｅｒｅｙ Ｃ． ＴＩＧＩＴ ａｓ ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０；２００（２）：１０８－１１９．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１３４０７に開示されており、その全体が本明細書中に組み込まれる。ＴＩＧＩＴ遮断は、ＰＤ１－経路の遮断と組み合わされていてもよく、単独のチェックポイント阻害剤治療として用いられてもよい。単独のチェックポイント阻害剤として用いられる、又はＰＤ１経路の阻害剤（抗体）と組み合わせて使用されるＴＩＧＩＴの遮断のための抗体の例としては、Ｅｔｉｇｉｌｉｍａｂ（ＯＭＰ‐３１３Ｍ３２）、Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ（ＭＴＩＧ７１９２Ａ； ＲＧ６０５８）、ＡＢ１５４（Ａｒｃｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＭＫ‐７６８４、ＢＭＳ‐９８６２０７、ＡＳＰ８３７４、及びＡＳＰ８３７４が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0053】

免疫チェックポイント分子は、Ｔ細胞応答の共刺激又は抑制性相互作用が起こる要因である。したがって、チェックポイント分子は、（ｉ）チェックポイント（共）刺激分子と、（ｉｉ）チェックポイント抑制分子とに分けることができる。通常、チェックポイント（共）刺激分子は、抗原刺激により誘起されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルに合わせてポジティブに作用するのに対し、チェックポイント抑制分子はＴＣＲシグナルをネガティブに制御する。チェックポイント（共）刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＩＣＯＳが挙げられる。チェックポイント抑制分子の例としては、ＣＴＬＡ４と、ＰＤ１と、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２；更に、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ、ＴＩＧＩＴ及びＦａｓＲ／ＤｃＲ３が挙げられる。

【0054】

好ましくは、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、チェックポイント（共）刺激分子の活性剤、又はチェックポイント抑制分子、又はこれらの組合せである。例えば、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、（ｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及び／又はＩＣＯＳの活性剤、或いは、（ｉｉ）Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ、ＴＩＧＩＴ、及び／又はＦａｓＲ／ＤｃＲ３の阻害剤であってもよい。

【0055】

上述のように、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＩＤＯ、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ、ＴＩＧＩＴ、及び／又はＦａｓＲ／ＤｃＲ３の多数のモジュレーターが当業者に知られている。いくつかのものは臨床試験中であり、（一部の国における）行政機関により認可されたものもある。これらの公知の免疫チェックポイントモジュレーターに基づき、（近い）将来、他の免疫チェックポイントモジュレーターが開発されるかもしれない。特に、前記好ましい免疫チェックポイント分子の公知のモジュレーターはそのように用いられるかもしれなく、又はそれらの類似体、特に、それらのヒト化又はヒト型抗体、が使用されるかもしれない。

【0056】

好ましくは、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、チェックポイント抑制分子の阻害剤である（しかしチェックポイント刺激分子の阻害剤ではない）。前記チェックポイント抑制分子は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ、ＴＩＧＩＴ、及びＦａｓＲ／ＤｃＲ３から選択されてもよい。ある態様では、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ、ＴＩＧＩＴ及び／又はＤｃＲ３、或いは、これらのリガンドの阻害剤であってもよい。

【0057】

ある態様において、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、チェックポイント刺激又は共刺激分子の活性剤であってもよい（しかし、好ましくはチェックポイント抑制分子の活性剤ではない）。例えば、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ及び／又はＩＣＯＳの活性剤、或いは、これらのリガンドの活性剤であってもよい。

【0058】

より好ましくは、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、前記「ＣＴＬＡ４－経路」の阻害剤、又は前記「ＰＤ１－経路」の阻害剤であり、それぞれ、ＣＴＬＡ４とそのリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６、並びに、ＰＤ１とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を含む（ＣＴＬＡ４及びＰＤ－１経路の詳細、並びに、経路の更なる分子は、Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ Ｅ． Ｉ． ａｎｄ Ｄｅｓａｉ Ａ．，２０１６：ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ＰＤ－１ Ｐａｔｈｗａｙｓ－Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３９（１）：９８－１０６に開示されている）。ある態様では、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２の阻害剤であり、好ましくはＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２の阻害剤であり、より好ましくは、前記免疫チェックポイントモジュレーターはＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－１の阻害剤であり、更により好ましくは、ＰＤ－Ｌ１の阻害剤である。

【0059】

したがって、前記チェックポイントモジュレーターは、前記ＣＴＬＡ－４経路及び／又は前記ＰＤ－１経路の公知の阻害剤から選択されてもよい。前記ＣＴＬＡ－４経路及び前記ＰＤ－１経路の好ましい阻害剤としては、モノクローナル抗体であるＹｅｒｖｏｙ（登録商標）（イピリムマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びＴｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ（Ｐｆｉｚｅｒ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、並びに、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペムブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；ＷＯ２０１１／０６６３８９Ａ１参照）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ＵＳ８、２１７、１４９Ｂ２参照）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）、ＭＩＨ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、及びラムブロリズマブ（例えば、ＷＯ２００８／１５６７１２；Ｈａｍｉｄ ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９：１３４－１４４に開示のｈＰＤ１０９Ａ及びそのヒト化誘導物であるｈ４０９Ａｌｌ、ｈ４０９Ａ１６、及びｈ４０９Ａ１７）が挙げられる。より好ましいチェックポイント阻害剤としては、ＣＴＬＡ－４阻害剤であるＹｅｒｖｏｙ（登録商標）（イピリムマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びＴｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ（Ｐｆｉｚｅｒ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；及び／又はＰＤ－１阻害剤であるＯｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペムブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＭＰ－２２４、及びラムブロリズマブ（例えば、ＷＯ２００８／１５６７１２；Ｈａｍｉｄ Ｏ．ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．３６９：１３４－１４４に開示のｈＰＤ１０９Ａ、及びそのヒト化誘導体であるｈ４０９Ａｌｌ、ｈ４０９Ａ１６、及びｈ４０９Ａ１７）が挙げられる。

【0060】

ある態様では、本発明の組合せは、単独の免疫チェックポイントモジュレーターのみを含む。或いは、複数の免疫チェックポイントモジュレーター（例えば、チェックポイント阻害剤）を用いてもよく、特に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なる免疫チェックポイントモジュレーター（例えば、チェックポイント阻害剤）を用いてもよく、例えば、（ちょうど）２つの異なる免疫チェックポイントモジュレーター（例えば、チェックポイント阻害剤）を用いる。ある態様では、組み合わせて用いられる前記異なる免疫チェックポイントモジュレーター（例えば、チェックポイント阻害剤）は、異なるチェックポイント経路を調節（例えば、阻害）する。例えば、前記ＰＤ－１経路の阻害剤は、前記ＣＴＬＡ－４経路の阻害剤と組み合わされてもよい。他の態様では、組み合わせて用いられる前記異なる免疫チェックポイントモジュレーター（例えば、チェックポイント阻害剤）は、同一のチェックポイント経路を調節（例えば、阻害）する。

【0061】

本発明の文脈において、本発明免疫チェックポイントモジュレーターは、上述のように、１つ以上のチェックポイント分子の機能を完全に又は一部低減、阻害、干渉、活性化、促進、増加、補強、又は補助するものである限り、どのような種類の分子又は試剤であってもよい。特に、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、チェックポイントタンパク質又はその前駆体等の１つ以上のチェックポイント分子に結合し、例えばＤＮＡ又はＲＮＡレベルで、１つ以上のチェックポイント分子の機能を上述のように調整する（例えば、完全に又は一部低減、阻害、干渉、活性化、促進、増加、補強、又は補助する）。例えば、免疫チェックポイントモジュレーターは、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ分子、イムノトキシン、低分子阻害剤、及びそれら断片に結合する抗体又は抗原（例えば、チェックポイント分子遮断抗体又は抗体断片、アンタゴニスト抗体又は抗体断片、或いは、アゴニスト抗体又は抗体断片）であってもよい。

【0062】

ある態様では、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、オリゴヌクレオチドであってもよい。かかるオリゴヌクレオチドは、タンパク質の発現を低減するのに、特に、上述のチェックポイント受容体又はリガンド等のチェックポイントタンパク質の発現を低減するのに用いられてもよい。オリゴヌクレオチドは、短いＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、通常、２から５０のヌクレオチド、好ましくは３から４０のヌクレオチド、より好ましくは４から３０のヌクレオチド、更により好ましくは、５から２５のヌクレオチドを含み、例えば、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成により実験室で生成される。オリゴヌクレオチドは、一本鎖のものであってもよく、二本鎖のものであってもよいが、本発明の文脈において、前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもよい。ある態様では、前記チェックポイントモジュレーターであるオリゴヌクレオチドは、アンチセンス－オリゴヌクレオチドである。アンチセンス－オリゴヌクレオチドは、選択された配列、特に、チェックポイントタンパク質のＤＮＡ又はＲＮＡ配列（又はそれらの断片）から選択された配列に相補するＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖である。アンチセンスＲＮＡは、通常、メッセンジャーＲＮＡと結合することにより、例えば、チェックポイントタンパク質のためのｍＲＮＡ等の、ｍＲＮＡ鎖のタンパク質翻訳を防ぐのに用いられる。アンチセンスＤＮＡは、通常、特異的な相補的（コーディング又はノンコーディング）ＲＮＡを標的とするのに用いられる。結合されると、かかるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素であるリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）により分解される。また、モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、脊椎動物における遺伝子ノックダウンに使用することができる。例えば、Ｋｒｙｃｚｅｋらは、２００６年に、マクロファージにおいて特異的にＢ７－Ｈ４発現をブロックするＢ７－Ｈ４－特異的モルフォリノを設計し、Ｔ細胞増殖を拡大し、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的なＴ細胞により腫瘍体積を減少させている（Ｋｒｙｃｚｅｋ Ｉ、Ｚｏｕ Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｐ、Ｚｈｕ Ｇ、Ｗｅｉ Ｓ、Ｍｏｔｔｒａｍ Ｐ、ｅｔ ａｌ． Ｂ７－Ｈ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００６；２０３：８７１－８１）。

【0063】

ある態様では、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、ｓｉＲＮＡであってもよい。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ又はサイレンシングとしても知られており、通常、２０から２５塩基対の長さの、二本鎖ＲＮＡ分子のクラスである。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路において、ｓｉＲＮＡは、相補的ヌクレオチド配列により、チェックポイントタンパク質の遺伝子コーディング等の特定の遺伝子の発現に干渉する。ｓｉＲＮＡは、転写後にｍＲＮＡの破壊を起こすことにより機能し、翻訳が起こらなくなる。外因性のｓｉＲＮＡは遺伝子ノックダウンに用いられるが、特に急速に分割する細胞においては、その効果は一時的なものに限られるかもしれない。この効果の一時性は、例えば、ＲＮＡ修飾により、又はｓｉＲＮＡの発現ベクターを用いることにより克服することができる。ｓｉＲＮＡ配列は、二本鎖間に短いループを導入することにより修飾されてもよい。これにより得られる転写産物は、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、また「小ヘアピンＲＮＡ」とも称される）であり、ｓｈＲＮＡは、通常の方法に従って、Ｄｉｃｅｒにより機能性ｓｉＲＮＡに加工することができる。ｓｈＲＮＡは、分解率及びターンオーバー率が比較的低いことから、ＲＮＡｉの有利なメディエーターである。したがって、前記免疫チェックポイントモジュレーターはｓｈＲＮＡであってもよい。ｓｈＲＮＡは、通常、発現ベクター、例えば、プラスミド、ウイルス、又は細菌ベクターを用いる必要がある。

【0064】

ある態様では、前記免疫チェックポイントモジュレーターはイムノトキシンであってもよい。イムノトキシンは、毒素に連結している標的結合部位（例えば、抗体）を含むキメラタンパク質であり、前記標的結合部位は、通常、癌細胞等の特定の細胞における抗原を標的とする。ある態様では、前記イムノトキシンは、チェックポイント分子を標的とする標的結合部位を含んでいてもよい。前記イムノトキシンが、例えば、前記チェックポイント分子等の抗原を有する細胞と結合する際、前記イムノトキシンはエンドサイトーシスにより取り込まれ、前記毒素が前記細胞を死滅させる。イムノトキシンは、毒素（又は毒素の断片）に連結する（修飾された）抗体又は抗体断片を含んでいてもよい。連結の方法は公知である。前記イムノトキシンの標的結合部位は、通常、特定の細胞種を標的とする抗体のＦａｂ領域を含む。前記毒素は、通常、細胞毒素であり、前記細胞毒素は、例えば、細菌又は植物に由来するタンパク質であり、前記タンパク質からは、前記イムノトキシンの標的結合部位が前記毒素を、標的とする細胞上の抗原に誘導できるように、本来の結合ドメインが取り除いている。しかし、イムノトキシンは、成長因子等の、抗体又は抗体断片以外の標的結合部位を含んでいてもよい。例えば、毒素と成長因子とを含む組換え融合タンパク質も、また、組換えイムノトキシンと称される。

【0065】

ある態様では、前記免疫チェックポイントモジュレーターは低分子医薬品（「低分子阻害剤」とも称される）であってもよい。低分子医薬品は、通常、生物学的過程（の調整）に作用する、低分子量（９００ダルトンまで）の有機化合物である。本発明の文脈において、免疫チェックポイントモジュレーターである低分子医薬品は、分子量が９００ダルトン以下の有機化合物であり、上述のように、１つ以上のチェックポイント分子の機能を完全に又は一部低減、阻害、干渉、又はネガティブに調節する。分子量の上限値９００ダルトンは、低分子医薬品が急速に細胞膜を超えて拡散することを可能とし、経口バイオアベイラビリティを可能とする。場合によっては、免疫チェックポイントモジュレーターである前記低分子医薬品の分子量は５００ダルトン以下である。例えば、公知の多様なＡ２ＡＲアンタゴニストは、５００ダルトンに満たない分子量を有する有機化合物である。

【0066】

好ましくは、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、抗体、又は抗体の抗原結合断片である。前記免疫チェックポイントモジュレーターである抗体、又は抗体の抗原結合断片は、特に、免疫チェックポイント受容体に結合する抗体又は抗体の抗原結合断片、或いは、免疫チェックポイント受容体リガンドに結合している抗体に結合する抗体又は抗体の抗原結合断片を含む。免疫チェックポイントモジュレーター抗体、又は抗体の抗原結合断片は、免疫チェックポイント受容体又は免疫チェックポイント受容体リガンドのアゴニスト又はアンタゴニストであってもよい。抗体型チェックポイントモジュレーターの例としては、現在認可されている免疫チェックポイントモジュレーター、即ち、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）（イピリムマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及びＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペムブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）、並びに、上述の抗チェックポイント受容体抗体及び抗チェックポイントリガンド抗体が挙げられる。

【0067】

好ましくは、本発明の組合せに用いられる前記免疫チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ－１経路を、特に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２経路を、一部又は完全に遮断する抗体又は抗原結合断片（例えば、ＰＤ－１経路の部分又は完全アンタゴニスト）であってもよい。前記経路及び前記経路を遮断する抗体の例は、Ｏｈａｅｇｂｕｌａｍ ＫＣ， Ａｓｓａｌ Ａ， Ｌａｚａｒ－Ｍｏｌｎａｒ Ｅ， Ｙａｏ Ｙ， Ｚａｎｇ Ｘ． Ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ＰＤ－１ ａｎｄ ＰＤ－Ｌ１ ｐａｔｈｗａｙ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２０１５；２１（１）：２４‐３３． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｍｅｄ．２０１４．１０．００９に記載されている。一般的に、前記ＰＤ－１経路を遮断する抗体又は抗原結合断片は、抗ＰＤ－１抗体、ヒト抗ＰＤ－１抗体、マウス抗ＰＤ－１抗体、哺乳類抗ＰＤ－１抗体、ヒト化抗ＰＤ－１抗体、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体、ポリクローナル抗ＰＤ－１抗体、キメラ抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＰＤ－１Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ、抗ＰＤ－１ドメイン抗体、一本鎖抗ＰＤ－１断片、重鎖抗ＰＤ－１断片、及び軽鎖抗ＰＤ－１断片を含む。例えば、前記抗ＰＤ－１抗体は抗原結合断片であってもよい。好ましくは、前記免疫チェックポイントモジュレーター抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、一部又は完全に（ヒト）ＰＤ－Ｌ１の活動を遮断することができ（例えば、ＰＤ－１経路の部分又は完全アンタゴニスト）、よって、特に、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を発現する免疫細胞の機能を解放する。ＰＤ－１を標的とする抗体の例としては、ＣＴ－０１１（ピディリズマブ；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＭＫ－３４７５（ラムブロリズマブ、ペムブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）、ＢＭＳ－９３６５５８（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及びＡＭＰ－２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体としては、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）、及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。

【0068】

ある態様では、本発明の組合せに用いられる前記免疫チェックポイントモジュレーターは、前記ＣＴＬＡ－４経路を一部又は完全に遮断する抗体又は抗原結合断片（例えば、前記ＣＴＬＡ－４経路の部分又は完全アンタゴニスト）であってもよい。前記抗体又は抗原結合断片は、抗ＣＴＬＡ４抗体、ヒト抗ＣＴＬＡ４抗体、マウス抗ＣＴＬＡ４抗体、哺乳類抗ＣＴＬＡ４抗体、ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体、モノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体、ポリクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体、キメラ抗ＣＴＬＡ４抗体、ＭＤＸ－０１０（イピリムマブ）、Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ４Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ、抗ＣＴＬＡ４ドメイン抗体、一本鎖抗ＣＴＬＡ４断片、重鎖抗ＣＴＬＡ４断片、及び軽鎖抗ＣＴＬＡ４断片を含む。例えば、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は抗原結合断片であってもよい。好ましくは、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に結合し、ＣＴＬＡ４の活動を一部又は完全に遮断することができ（例えば、ＣＴＬＡ－４経路の部分又は完全アンタゴニスト）、よって、特に、ＣＴＬＡ４を発現する免疫細胞の機能を解放する。

【0069】

ＡＴＰ加水分解酵素及びＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸
本発明の第一の態様において、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターは、（ｉｉ）ＡＴＰ加水分解酵素と組み合わされる。

【0070】

本明細書において、用語「ＡＴＰ加水分解酵素」は、ＡＴＰからＡＤＰへの加水分解、ＡＴＰからＡＭＰへの加水分解、及び／又はＡＤＰからＡＭＰへの加水分解を触媒するあらゆる酵素を意味する。前記酵素としては、アピラーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＡＴＰ－ジホスファターゼ、アデノシンジホスファターゼ、ＡＤＰアーゼ、ＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼ、及びＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＮＴＰＤ１）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の文脈において、いかなるＡＴＰ加水分解酵素が用いられてもよい。

【0071】

ある態様では、前記ＡＴＰ加水分解酵素は内在性ＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＮＴＰＤ１）ではない。内在性ＣＤ３９は、カルシウム及びマグネシウム依存性に、ＡＴＰ及びＡＤＰを加水分解し、ＡＭＰを産生する膜内在性タンパク質である。グルコシル化及び細胞表面膜への局在変化により活性化され、エクトヌクレオチダーゼとしての酵素活性を示す。ＣＤ３９は２つの膜貫通型ドメインにより形質膜に付着する（Ｇｒｉｎｔｈａｌ Ａ，Ｇｕｉｄｏｔｔｉ Ｇ．ＣＤ３９、ＮＴＰＤａｓｅ １、ｉｓ ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｙ ｔｗｏ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｗｈｙ？．Ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ Ｓｉｇｎａｌ．２００６；２（２）：３９１－３９８．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１３０２－００５－５９０７－８）。しかし、上述のように、本発明の文脈においては、可溶性（膜結合性ではない）ＡＴＰ加水分解酵素が好ましい。膜結合性の内在性ＣＤ３９とは異なり、ＣＤ３９を可溶形態のＣＤ３９を得るように改変することができる（Ｇａｙｌｅ ＲＢ ３ｒｄ、Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ ＣＲ，Ｇｉｍｐｅｌ ＳＤ，Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ ＭＡ，Ｃａｓｐａｒｙ ＲＧ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｃ，Ｂｒａｓｅｌ Ｋ，Ｐｒｉｃｅ Ｖ，Ｄｒｏｓｏｐｏｕｌｏｓ ＪＨ，Ｉｓｌａｍ Ｎ，Ａｌｙｏｎｙｃｈｅｖａ ＴＮ，Ｂｒｏｅｋｍａｎ ＭＪ，Ｍａｒｃｕｓ ＡＪ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｃｔｏ－ＡＤＰａｓｅ／ＣＤ３９．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８ Ｍａｙ １；１０１（９）：１８５１－９．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ１７５３）。

【0072】

好ましくは、前記ＡＴＰ加水分解酵素は可溶性であり（分泌されたものであり）、即ち、（形質）膜に結合又は付着していない。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本願発明者は、膜結合酵素と比較し、可溶性ＡＴＰ加水分解酵素は様々な箇所（例えば、体内における様々な箇所）により効率的に到達することができると考える。特に、いかなる理論にも拘束されるものではないが、腸管腔において、（チェックポイント阻害剤と組み合わされた際）前記ＡＴＰ加水分解酵素はその有益な効果を媒介すると考えられ、即ち、腸内の細菌叢から放出された細胞外ＡＴＰを分解することにより、前記効果を媒介すると考えられる。本明細書の実験データは、前記チェックポイント阻害剤の活性に有益な効果を媒介するために、腸内の細菌叢から放出されたＡＴＰに前記ＡＴＰ加水分解酵素が重要な役割を果たすことが示している。内在性ＣＤ３９等の膜結合ＡＴＰ加水分解酵素は、該膜結合ＡＴＰ加水分解酵素が存在する組織という限られた範囲にしか活性を示さないため、腸内細菌叢から放出された（大部分の）細胞外ＡＴＰには影響を与えることができず、よって、前記ＡＴＰ加水分解酵素は（形質）膜に付着していないことが好ましい。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素は好ましくは可溶性ＡＴＰ加水分解酵素である。

【0073】

可溶性ＡＴＰ加水分解酵素の例としては、細菌由来（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）及びポテト由来アピラーゼ、並びに、（組換え）可溶性ＣＤ３９が挙げられる。

【0074】

好ましくは、前記ＡＴＰ加水分解酵素はアピラーゼである。アピラーゼは、ＡＴＰからＡＤＰへの及びＡＤＰからＡＭＰへの一連の加水分解を触媒し、無機リン酸塩を放出するＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼである。特に、アピラーゼは、ＡＴＰに加えて、ＡＤＰ及び他のヌクレオシド三リン酸及びヌクレオシド二リン酸に作用してもよい。アピラーゼは、膜結合状態及び／又は分泌された可溶性の状態で、様々な真核生物中に見つけることができる。

【0075】

一般的に、前記アピラーゼは、あらゆる生体からの自然発生するアピラーゼ配列を有してもよい。ある態様では、前記アピラーゼは内在性アピラーゼではない。言い換えると、前記アピラーゼは、投与対象である生体の内在性アピラーゼとは異なる。ある態様では、前記アピラーゼはヒト内在性アピラーゼではなく、例えば、前記アピラーゼは、非ヒトアピラーゼであってもよい。ある態様では、前記アピラーゼは哺乳類アピラーゼではない。好ましくは、前記アピラーゼは細菌又は植物由来のアピラーゼである。例えば、前記アピラーゼはＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉのアピラーゼ又はＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ポテト）のアピラーゼであってもよい。また、前記アピラーゼは、自然界に存在するアピラーゼと、少なくとも５０％又は６０％、好ましくは少なくとも７０％又は７５％、より好ましくは少なくとも８０％又は８５％、更により好ましくは少なくとも９０％又は９５％、それよりも更により好ましくは少なくとも９７％又は９８％、例えば、少なくとも９９％の配列同一性を示す自然発生アピラーゼの配列変異体であってもよい。特に、前記配列変異体は機能性を示すものであってもよく、即ち、前記配列変異体において、前記アピラーゼのＡＴＰ加水分解機能が保持されている。当業者は、アピラーゼを含み、且つ、特定のアピラーゼのＡＴＰ加水分解機能に重要な活性部位、ドメイン、及び領域（ヌクレオチド結合領域等）を認識する、アノテーションされたタンパク質の配列を提供する多様なバイオインフォマティクスのツールを認識している。したがって、当業者は、ＡＴＰ加水分解機能を保持するためには、アピラーゼにおいてアミノ酸の位置が保持されるべきであることはよく承知している。好ましくは、前記アピラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を含む。また、上述したように、配列番号１の機能性配列変異体を含み、即ち、自然界に存在するアピラーゼと、少なくとも５０％又は６０％、好ましくは少なくとも７０％又は７５％、より好ましくは少なくとも８０％又は８５％、更により好ましくは少なくとも９０％又は９５％、それよりも更により好ましくは少なくとも９７％又は９８％、例えば、少なくとも９９％の配列同一性を示す配列番号１の機能性配列変異体を含む。配列番号１の配列変異体において、機能を確実なものとするためＲ１９２は保持されなければならない。

【0076】

前記ＡＴＰ加水分解酵素は如何なる方法により得られたものでもよい。好ましくは、前記ＡＴＰ－加水分解酵素は組換えにより生成される。好ましくは、前記ＡＴＰ－加水分解酵素は組換えにより生成されたアピラーゼである。好ましくは、前記アピラーゼは、組換えにより生成された配列番号１の配列を有するアピラーゼ、又は、上述のように、例えば、少なくとも７０％又は７５％、より好ましくは少なくとも８０％又は８５％、更により好ましくは少なくとも９０％又は９５％、それより更により好ましくは少なくとも９７％又は９８％、例えば、少なくとも９９％の配列同一性を有する前記アピラーゼの配列変異体であって、Ｒ１９２が好ましくは保持されている。組換え体生成のため、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、自然界において前記ＡＴＰ加水分解酵素を発現する細胞又は生体には存在しない核酸によりコードされてもよい。例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素の組換え体生成は、（１）異種発現（前記アピラーゼ配列が、発現に使用される生体とは別の生体に由来する）、（２）発現ベクターに基づく発現（自然界には存在しない；例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素の過剰発現のために）、（３）自然界には存在しないＡＴＰ加水分解酵素（例えば、上述の機能性配列変異体）、又は（１）から（３）のいかなる組合せにより行われてもよい。例えば、ＡＴＰ加水分解酵素を発現する（異種）細胞は、天然の状態では存在していない前記ＡＴＰ加水分解酵素に翻訳後修飾（ＰＴＭ；例えば、グルコシル化）を付与してもよい。かかるＰＴＭは、機能的差異（例えば、低減された免疫原性）を引き起こす。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、自然界に存在するＡＴＰ加水分解酵素とは異なる、翻訳後修飾を有していてもよい。或いは、前記アピラーゼは自然界の原材量から直接使用されてもよい。前記アピラーゼは植物源、動物源、又は細菌源から得られてもよい。前記アピラーゼは精製されたものであってもよく、細胞抽出物（細菌細胞のペリプラズム抽出物）が用いられてもよい。

【0077】

前記ＡＴＰ加水分解酵素はタンパク質／ポリペプチドとして用いられてもよく、また、本明細書において記載されている前記ＡＴＰ加水分解酵素は、核酸に含まれるポリヌクレオチドによりコードされるものでもよい。したがって、本発明は、（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸とからなる組合せも提供する。核酸（分子）は、核酸成分を含む分子である。通常、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を意味する。核酸分子は、用語「ポリヌクレオチド」と同義語として用いられてもよく、即ち、前記核酸分子は、前記ＡＴＰ加水分解酵素コードするポリヌクレオチドのみからなっていてもよい。或いは、前記核酸分子は、前記ＡＴＰ加水分解酵素コードするポリヌクレオチドと併せて更なる要素を含んでいてもよい。通常、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステルによりそれぞれ共有結合しているヌクレオチドモノマーを含む又はからなるポリマーである。前記用語「核酸分子」は、また、改変された塩基、改変された糖、又は改変された骨格等からなるＤＮＡ又はＲＮＡ等の、改変された核酸分子をも意味する。核酸分子及び／又はポリヌクレオチドの例としては、例えば、組換えポリヌクレオチド、ベクター、オリゴヌクレオチド、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びａｔＲＮＡ等のＲＮＡ分子、及びｃＤＮＡ等のＤＮＡ分子が挙げられる。

【0078】

遺伝コードの冗長性のため、本発明はまた、同じアミノ酸配列をコードする核酸配列の配列変異体を含んでいてもよい。例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列を有するアピラーゼをコードするポリヌクレオチドは、同配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号３のヌクレオチド配列又はその配列変異体を（遺伝コードの冗長性のため）有していてもよい。

【0079】

前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド（又は核酸分子全体）は、前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現のために最適化されていてもよい。例えば、前記ヌクレオチド配列のコドン最適化を行って、前記ＡＴＰ加水分解酵素の作成のための発現システムにおける翻訳の効率を向上してもよい。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化されたものであってもよい。当業者は、コドン最適化の多様なツール、例えば、Ｊｕ Ｘｉｎ Ｃｈｉｎ， Ｂｅｖａｎ Ｋａｉ－Ｓｈｅｎｇ Ｃｈｕｎｇ， Ｄｏｎｇ－Ｙｕｐ Ｌｅｅ， Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ＯｎＬｉｎｅ （ＣＯＯＬ）： ａ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉ－ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ３０， Ｉｓｓｕｅ １５， １ Ａｕｇｕｓｔ ２０１４， Ｐａｇｅｓ ２２１０－２２１２に開示のもの；又はＧｒｏｔｅ Ａ， Ｈｉｌｌｅｒ Ｋ， Ｓｃｈｅｅｒ Ｍ， Ｍｕｎｃｈ Ｒ， Ｎｏｒｔｅｍａｎｎ Ｂ， Ｈｅｍｐｅｌ ＤＣ， Ｊａｈｎ Ｄ， ＪＣａｔ： ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｔｏ ａｄａｐｔ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｔｏ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈｏｓｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００５ Ｊｕｌ １；３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５２６－３１に開示のもの；又は、例えば、ジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ^ＴＭアルゴリズム（ＵＳ ２０１１／００８１７０８ Ａ１に開示）を認識している。

【0080】

また、前記核酸分子は、例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現（異種発現）のために、異種の要素（即ち、前記ＡＴＰ加水分解酵素のためのコード配列として、自然界では同じ核酸分子に存在しない要素）を含んでいてもよい。例えば、核酸分子は、異種プロモーター、異種エンハンサー、異種非翻訳領域（異種ＵＴＲ）（例えば、最適翻訳／発現のための）、異種ポリＡテール等を含んでいてもよい。ある態様では、前記核酸分子は、抗生物質に対する耐性を付与する要素を含んでいてもよい。他の態様では、前記核酸分子は、抗生物質に対する耐性を付与する要素を含んでいない。

【0081】

一般的に、前記核酸分子は、特定の核酸配列を挿入、削除、又は変更するように操作されたものであってもよい。かかる操作による改変としては、これらに限定されるものではないが、制限酵素切断部位を導入する改変、コドン使用頻度を修正する改変、転写及び／又は翻訳調整配列を追加又は最適化する改変等が挙げられる。また、コードされたアミノ酸を変更するように前記核酸を改変させることもできる。例えば、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）のアミノ酸置換、削除及び／又は挿入を前記ＡＴＰ加水分解酵素のアミノ酸配列に行うことも好適である。このような点変異は、安定性、翻訳後修飾、発現量等を変更することができ；共有結合基の付加（例えば、ラベル）のためのアミノ酸を導入することができ；又はタグ（例えば、精製のための）を導入することができる。或いは、核酸配列における変異は、「サイレント」、即ち、上述したように遺伝コードの冗長性のため、アミノ酸配列に反映されていなくてもよい。一般的に、変異は特定の部位に導入され、又は任意に導入され、その後、選択（例えば、分子進化）される。例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸は、任意に又方向性をもって変異させ、前記コードされたアミノ酸に異なる特性を付与してもよい。かかる改変は、最初の改変が保持され、新たな改変が他のヌクレオシド部位に導入される反復プロセスの結果であってもよい。更には、単独の工程により得られた改変が組み合わされてもよい。

【0082】

ある態様では、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、例えば、発現ベクター等のベクターであってもよい。ベクターは、通常、組換え核酸分子、即ち、自然界では存在しない核酸分子である。したがって、前記ベクターは、異種要素（即ち、自然界の他の起源の配列要素）を含んでいてもよい。例えば、前記ベクターは、マルチクローニングサイト、異種プロモーター、異種エンハンサー、（ベクターを含んでいない細胞と比較し、該ベクターを含む細胞を識別する）異種選択マーカー等を含んでいてもよい。本発明の文脈において、ベクターは、所望の核酸配列を組み込む又は保持するのに好適なものである。かかるベクターとしては、収納ベクター、発現ベクター、クローニングベクター、転写ベクター等であってもよい。収納ベクターは、核酸分子を便利に収納することができるベクターである。したがって、前記ベクターは、例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素に対応する配列を含んでいてもよい。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質等の発現物を作成するのに用いられてもよい。例えば、発現ベクターは、（異種）プロモーター配列等の、前記ベクターの一連の配列の転写に必要な配列を含んでいてもよい。クローニングベクターは、通常、核酸配列をベクターに組み込むのに用いられるクローニングサイトを含むベクターである。例えば、クローニングベクターは、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってもよい。転写ベクターは、例えば、ウイルスベクター等、細胞又は生体に核酸分子を転写するのに好適なベクターであってもよい。本発明の文脈において、ベクターは、例えば、ＲＮＡベクター又はＤＮＡベクターであってもよい。例えば、本願の文脈において、ベクターは、クローニングサイト、選択マーカー、及び複製起点のようなベクターの増殖に好適な配列を含んでいてもよい。本願の文脈において、ベクターはプラスミドベクターであってもよい。

【0083】

ある態様において、前記ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、ベクター内に挿入された又はクローニングされた１つ以上のポリヌクレオチドの発現を増強できるものであってもよい。かかる発現ベクターの例としては、バクテリオファージ、自律複製起点（ＡＲＳ）、セントロメア、及びインビトロ又は細胞内で複製できる又は複製させることができる、或いは、動物又は人間の細胞内の特定の位置に核酸セグメントを運ぶことができる他の配列が挙げられる。本発明に使用される発現ベクターとしては、染色体誘導ベクター、エピソーム誘導ベクター、及びウイルス誘導ベクター（例えば、細菌プラスミド又はバクテリオファージから誘導されたベクター、及びコスミド、ファージミド等の、それらの組合せから誘導されたベクター）；及びアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。

【0084】

前記発現ベクターは、プラスミドであってもよい。ホスト（宿主）内で複製及び生存できる如何なるプラスミド発現ベクターが使用されてもよい。

【0085】

細菌における前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現のために、前記発現ベクターは、細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質発現に最適化されたベクターであることが好ましい。かかる発現ベクターは、公知であり、市販されている。例えば、細菌において組換えタンパク質を発現するのに信頼性があり調節可能なシステムを提供するｐＢＡＤベクターシステムを用いてもよい。前記システムは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ－アラビノースの代謝を調節するａｒａＢＡＤオペロンに基づく。前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドは、ｐＢＡＤベクターのａｒａＢＡＤプロモーターの下流に配置され、Ｌ－アラビノースに応答して前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現を発動させ、グルコースにより阻害される。

【0086】

ある態様では、前記発現ベクターは、ミニサークルＤＮＡであってもよい。ミニサークルＤＮＡは、持続的に高いレベルの核酸に有用である。前記サークルベクターは、発現－サイレンシングの細菌配列が欠けていることにより特徴付けられる。例えば、ミニサークルベクターは、複製起点が欠けている点、及び、例えば、β－ラクタマーゼ、ｔｅｔ等の一般的に細菌プラスミドにみられる薬剤選択マーカーが欠ける点において、細菌プラスミドベクターとは異なっている。したがって、ミニサークルＤＮＡはサイズが小さくなり、より効率的な送達を可能とする。

【0087】

ある態様において、前記発現ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。いかなるウイルスに基づくいかなるウイルスベクターが試剤の担体として用いられてもよい。遺伝子治療に用いられるウイルスシステムの典型的に用いられるクラスは、そのゲノムが宿主細胞のクロマチンに挿入されるか（オンコレトロウイルス及びレンチウイルス）、又は主に染色体外のエピソームとして細胞核中に存続するか（アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、及びヘルペスウイルス）に基づき、２つのグループに分類することができる。したがって、前記ウイルスベクターは、上述のように、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。また、前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルスのいずれかから誘導されたものであってもよい。

【0088】

前記ウイルスベクターは、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターであってもよい。アデノウイルスは、２６Ｋｂｐから４８Ｋｂｐの線状ゲノムを有する、中型２本鎖の非エンベロープＤＮＡである。アデノウイルスは、受容体を介した結合及び内部移行により標的細胞に侵入し、非分割細胞及び分割細胞の両方の核に侵入する。アデノウイルスは、その生存及び複製を宿主細胞に大きく依存し、ホスト（宿主）の複製機構を用いて脊椎動物の細胞の核中で複製することができる。

【0089】

前記ウイルスベクターは、パルボウイルス科のものであってもよい。前記パルボウイルスは、約５，０００ヌクレオチドの長さのゲノムを有する、小さい１本鎖の非エンベロープＤＮＡウイルスの科である。前記ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であってもよい。ＡＡＶは、一般的に、生産的な感染サイクルを開始及び維持するためには他のウイルス（通常、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）と共感染する依存性パルボウイルスである。かかるヘルパーウイルスが不在であっても、ＡＡＶは依然として受容体を介した結合及び内部移行により標的細胞を感染又は形質導入することができ、非分割細胞及び分割細胞の両方の核に侵入する。ヘルパーウイルスが不在ではＡＡＶ感染から子孫ウイルスは生成されないことから、形質導入の範囲は、前記ウイルスが感染した最初の細胞のみに限られる。レトロウイルス、アデノウイルス、及び単純ヘルペスウイルスとは異なり、ＡＡＶはヒト病原性及び毒性がないようである。

【0090】

レトロウイルス科のウイルスに基づくウイルスベクターが用いられてもよい。レトロウイルスは、２つの独特な特徴に特徴付けられる１本鎖のＲＮＡ動物ウイルスを含む。第一に、レトロウイルスのゲノムは、ＲＮＡの２つのコピーからなる二倍体である。第二に、前記ＲＮＡはウイルス粒子内在酵素である逆転写酵素により２本鎖ＤＮＡに転写される。前記２本鎖ＤＮＡ、すなわちプロウイルス、は宿主ゲノムに組み込まれ、前記宿主ゲノムに安定して組込まれた成分として親細胞から子孫細胞へ移される。

【0091】

好ましくは、前記発現ベクターはプラスミドである。或いは、前記発現ベクターは好ましくはバクテリオファージである。前記発現ベクターがプラスミド又はバクテリオファージである場合、前記発現ベクターは細菌細胞及び本発明の組成物に含まれる前記細菌細胞中に形質転換される。前記細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよい。或いは、前記細菌担体は弱毒化されたサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）であってもよい。前記弱毒サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）は、チフス菌（ｓｅｒｏｖａｒ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のものであってもよい。

【0092】

ある態様では、上述のＡＴＰ－加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡ）であってもよい。言い換えると、前記ＡＴＰ－加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＴＰ－加水分解酵素を（異種）発現する生体の遺伝子に組み込まれてもよい。

【0093】

ある態様では、ＤＮＡ断片は、例えば、細菌等の宿主細胞／微生物のゲノムに組み込まれるために、細菌等の宿主細胞／微生物に導入されてもよい。このため、前記ＤＮＡ断片は、例えば、細菌等の宿主細胞／微生物のゲノムに組み込むため、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現するヌクレオチド、特にアピラーゼ（例えば、フレキシネル菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｐｈｏＮ２遺伝子）を含んでいてもよい。例えば、かかるＤＮＡ断片は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＥｃＮ））ゲノムにおけるフレキシネル菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｐｈｏＮ２遺伝子に組み込まれるものであってもよい。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＥｃＮ））ゲノムにおけるフレキシネル菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｐｈｏＮ２遺伝子への組み込むのためのＤＮＡ断片の例示は、図３９に示されている。ある態様では、前記ＤＮＡ断片は、マルトデキストリンホスホリラーゼ（ｍａｌＰ）のためのＥｃＮ遺伝子を含んでいてもよく；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）のためのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子を含んでいてもよ；アピラーゼのためのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ遺伝子（ｐｈｏＮ２）を含んでいてもよく；マルトース及びマルトデキストリンオペロンの転写活性剤（ｍａｌＴ）ためのＥｃＮ遺伝子を含んでいてもよく；フリッパーゼ認識標的（Ｆｌｉｐｐａｓｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ［ＦＲＴ］）配列を含んでいてもよく；前記ｃａｔ遺伝子のプロモーター（Ｐ_ｃａｔ）を含んでいてもよく；前記ｐｈｏＮ２遺伝子のプロモーター（Ｐ_ｐｒｏＤ）を含んでいてもよく；前記ｐｈｏＮ２遺伝子のリボソーム結合部位（ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳ）を含んでいてもよく；及び／又は前記ｐｈｏＮ２遺伝子の転写ターミネーター（Ｔ_{ｐｈｏＮ２}）を含んでいてもよい。ある態様では、前記ＥｃＮ ｍａｌＰ遺伝子部位のヌクレオチドは、配列番号４によるもの又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。ある態様では、前記ＥｃＮ ｍａｌＴ遺伝子部位のヌクレオチドは、配列番号５によるもの、又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。ある態様では、前記Ｐ_ｐｒｏＤプロモーター、ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子、又はｐｈｏＮ２転写ターミネーターを含む前記ＤＮＡ断片は、配列番号６によるもの又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するその配列変異体であってもよい。ある態様では、前記ＦＲＴ配列に隣接するＥ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片は配列番号７によるもの、又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するその配列変異体であってもよい。

【0094】

宿主細胞、微生物、及びウイルス粒子
更なる態様において、本発明はまた、（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述の核酸を含む宿主細胞、即ち、上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、との組合せを提供する。

【0095】

宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってもよい。かかる細胞の例としては、真核細胞（例えば、酵母細胞、動物細胞、又は植物細胞等）及び原核細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ．等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある態様では、前記細胞は、哺乳類細胞株等の哺乳類細胞であってもよい。例としては、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、ヒト肝細胞、及び骨髄腫細胞が挙げられる。

【0096】

前記細胞は、上述のように、（発現）ベクター等の核酸により形質転換又はトランスフェクションされてもよい。前記用語「トランスフェクション」は真核動物／ヒト細胞にＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、プラスミド）等の核酸分子を導入することを意味し、前記用語「形質転換」は、通常、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞又は真菌細胞にＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、プラスミド）等の核酸分子を導入することを意味する。本発明の文脈において、前記用語「トランスフェクション」及び「形質転換」は、例えば、哺乳類細胞及び細菌細胞等の細胞に核酸分子を導入する、当業者に公知の方法のいかなる方法をも包含する。前記方法としては、例えば、エレクトロポレーション、例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づくリポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーに基づくトランスフェクション等を含む。ある態様では、前記導入は非ウイルス性である。細菌細胞の場合、コンピテント細菌を形質転換に使用することができる。

【0097】

また、本発明の細胞は、前記核酸（ベクター）、例えば、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素を発現する核酸により安定的に又は一時的にトランスフェクション又は形質転換されてもよい。ある態様では、前記細胞は、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸（ベクター）により安定的にトランスフェクションされる。他の態様では、前記細胞は、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸（ベクター）により一時的にトランスフェクション／形質転換される。

【0098】

したがって、本発明は、（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述のＡＴＰ加水分解酵素を異種発現する組換え宿主細胞とからなる組合せも提供する。例えば、前記細胞は、前記ＡＴＰ加水分解酵素とは異なる種の細胞であってもよい。ある態様では、前記細胞の細胞種は、自然界では（かかる）ＡＴＰ加水分解酵素を発現しない。また、前記宿主細胞は、天然の状態では存在していない前記ＡＴＰ加水分解酵素に翻訳後修飾（ＰＴＭ；例えば、グルコシル化）を付与してもよい。かかるＰＴＭは、機能的差異（例えば、低減された免疫原性）を引き起こす。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、自然発生したＡＴＰ加水分解酵素とは異なる、翻訳後修飾を有していてもよい。

【0099】

更なる態様において、本発明は、（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）本明細書に記載の前記核酸分子を含む微生物、即ち、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸ととからなる組合せも提供する。前記微生物は、生きた微生物であってもよい。

【0100】

本明細書において用いられる用語「微生物」は、単独の細胞形状で又は細胞のコロニーとして存在していてもよい微生物を意味する。通常、用語「微生物」は全ての単細胞生物を含む。したがって、前記微生物は、古細菌及び細菌等の原核生物、並びに、単細胞原生生物、原生動物、菌類、及び植物等の真核生物から選択されてもよい。

【0101】

好ましくは、前記微生物は、細菌等の原核微生物、又は酵母等の真核微生物である。ある態様では、前記微生物は、エンテロバクター属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エルシニア属菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）、リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）、ラクトコッカス属菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、シゲラ属菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、赤痢菌）、シアノ細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、及びサッカロミケス属菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ.）からなる群から選択される。本明細書中で使用される、微生物に関連する表現「属菌（ｓｐｐ．）」は、種、亜種、及びその他等、記載された属に含まれる全てのものを包含することを意図している。

【0102】

ある態様において、前記微生物は、プロバイオティクス（例えば、生菌のプロバイオティクス）として提供されてもよい。本明細書中で使用される用語「プロバイオティクス」は、細菌及び酵母等の生きた微生物であって、消費されることにより、例えば、腸内細菌叢を改善又は回復することにより健康上の利益を提供するものを意味する。提供される健康上の利益から、上記生菌は食品添加物として用いることができる。例えば、前記生菌は、顆粒、錠剤、又はカプセル中の凍結乾燥されたものであってもよく、或いは、消費される乳製品に直接混合することができる。健康上の利益があることが示された微生物の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、特に、Ｆｉｊａｎ Ｓ． Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｃｌａｉｍｅｄ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｃｅｎｔ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ． Ｉｎｔ Ｊ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｒｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ． ２０１４；１１（５）：４７４５－４７６７． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｅｒｐｈ１１０５０４７４５、に記載されたそれらのプロバイオティクス株が挙げられ、参照により本明細書に援用する。

【0103】

有毒微生物の場合、前記微生物の毒性を弱毒化させていてもよい。細菌の毒性を弱毒化させる方法としては、公知であり、例えば、ＷＯ２０１８／０８９８４１に記載されている。通常、毒性の弱毒化は、毒性病原体から毒性因子を変異することにより達成することができる。

【0104】

特に、本発明は、（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）本明細書に記載の前記核酸分子（即ち、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸）を含む細菌（細菌細胞）と、からなる組合せを提供する。したがって、上述の宿主細胞は細菌細胞であってもよく、上述の微生物は細菌であってもよい。

【0105】

前記細菌は、組換え細菌、即ち、自然界で発生しない細菌、であってもよい。特に、前記組換え細菌は、例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素の異種発現又は過剰発現のための、自然界の細菌には存在しない核酸配列を含んでいてもよい。したがって、前記細菌は前記ＡＴＰ加水分解酵素を異種発現してもよく（即ち、発現されたＡＴＰ加水分解酵素は細菌において自然には存在しないものであってもよく、異なる株や系統等に由来するものでもよい）；又は前記細菌は前記ＡＴＰ加水分解酵素を過剰発現してもよい。本明細書において用いられる用語「過剰発現」は、標的とする（例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする）遺伝子の人工的な増量された発現を意味する。過剰発現は、例えば、標的とする遺伝子をコードする（例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする）核酸分子の数を増やすことにより、及び／又は発現を増加させる調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、又は遺伝子調節要素）を用いることにより等、多様な方法により行うことができる。

【0106】

前記細菌としては、生きた細菌であってもよい。前記細菌が病原体の場合、前記細胞の毒性は、上述のように弱毒化させてもよい。一般的に、前記細菌は、グラム陽性菌又はグラム陰性菌により選択されてもよい。ある態様では、前記細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エルシニア属菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）、及びシゲラ属菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、赤痢菌）から選択された細菌等のグラム陰性菌であってもよく、又は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、エルシニア・エンテロコイチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、及び赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）から選択された細菌等のシアノ細菌であってもよい。ある態様では、前記細菌はグラム陽性菌であってもよい。グラム陽性菌の例としては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）が挙げられる。好ましくは、前記細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、又はサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であってもよい。特に好ましくは、前記細菌は、特に、アピラーゼを（異種）発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、又はサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であってもよい。

【0107】

前記細菌は、上述のように、プロバイオティクス特性を提供するものであってもよい。特に、前記プロバイオティクス・細菌は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、又は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ （ＥｃＮ））等の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のプロバイオティクス株であってもよい。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７）は、便秘（Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋａ Ａ．， Ｓｚａｊｅｗｓｋａ Ｈ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌｓ： Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２０１０；１６：６９－７５）及び炎症性腸疾患（Ｂｅｈｎｓｅｎ Ｊ．， Ｄｅｒｉｕ Ｅ．， Ｓａｓｓｏｎｅ－Ｃｏｒｓｉ Ｍ．， Ｒａｆｆａｔｅｌｌｕ Ｍ． Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｅｘａｍｐｌｅｓ， ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｍｅｄ． ２０１３；３ ｄｏｉ： １０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１００７４）を治療し、消化器疾患、潰瘍性大腸炎、及びクローン病（Ｘｉａ Ｐ．， Ｚｈｕ Ｊ．， Ｚｈｕ Ｇ． Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ａｓ ｓａｆｅ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ－Ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｓｉｎ． ２０１３；５３：５３８－５４４）を緩和することが示されている。

【0108】

更なる態様では、本発明は、（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）本明細書に記載の前記核酸分子を含むウイルス粒子、即ち、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含むウイルス粒子とのからなる組合せも提供する。本明細書で用いられる用語「ウイルス粒子」は、ウイルス様粒子、ならびにビリオンを含む。「ビリオン」（「ウイルス」）は、通常、核酸を１つの細胞から他の細胞へ移行させることができる構造体であり、「エンベロープ」を有したものでもよく又は「無エンベロープ」のものでもよい。

【0109】

本明細書で使用される用語「ウイルス様粒子」（又は「ＶＬＰ」）は、特に、様々なウイルスに由来する非複写性のウイルス殻を意味する。ＶＬＰは、ウイルス複製に必要なウイルス成分が欠如しており、よって、ウイルスが高度に弱毒化した状態を示している。ＶＬＰは、一般的に、１つ以上のウイルスタンパク質からなっており、前記タンパク質としては、これらに限定されるものではないが、カプシド、外皮、殻、表面等と称されるタンパク質、及び／又はエンベロープタンパク質、或いは、これらタンパク質から誘導された粒子形成ポリペプチドが挙げられる。ＶＬＰは、適切な発現システムにおいて、タンパク質の組換え発現によって自発的に形成される。ウイルス様粒子及びその製造方法は、公知であり、当業者は熟知しており、複数のウイルスから得られるウイルスタンパク質がＶＬＰを形成するとして知られており、前記ウイルスとしては、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８０： ３５３－６４ （１９９９））、セムリキ森林熱ウイルス（Ｎｏｔｋａ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８０： ３４１－５２ （１９９９））、ヒト・ポリオーマウイルス（Ｇｏｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： ４４６５－９ （１９９９））、ロタウイルス（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、 Ｖａｃｃｉｎｅ １７： １００５－１３ （１９９９））、パルボウイルス（Ｃａｓａｌ、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｖｏｌ ２９、 Ｐａｒｔ ２、 ｐｐ １４１－ １５０ （１９９９））、犬パルボウイルス （Ｈｕｒｔａｄｏ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｖｉｒａｌ． ７０： ５４２２－９ （１９９６））、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｖｉｒａｌ． ７１： ３５ ７２０７－１３ （１９９７））、及びニューカッスル病ウイルスが挙げられる。上記ＶＬＰの形成は、好適な方法により検知することができる。媒体中のＶＬＰを検知する公知の好適な方法の例としては、例えば、電子顕微鏡技術、動的光拡散法（ＤＬＳ）、選択的クロマトグラフィー分離法（例えば、ＶＬＰのイオン交換、疎水性相互作用、及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー）及び密度勾配遠心分離法が挙げられる。更には、ＶＬＰは、公知の方法で分離することができ、例えば、密度勾配遠心分離法により分離し、特徴的な密度での帯形成により特定される。例えば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６０： １４４５－１４５６；及びＨａｇｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒａｌ． ６８：４５０３－４５０５； Ｖｉｎｃｅｎｔｅ、 Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．、 ２０１１； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ－Ｏｈｒｕｍ ａｎｄ Ｒｏｓｓ、 Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ３５４： ５３０７３ （２０１２）を参照。

【0110】

前記ウイルス粒子はヒトに感染性のものでないことが望ましい。特に、バクテリオファージ等の、細菌において感染及び複製するウイルスベクターが用いられてもよい。したがって、本発明は、（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述の核酸を含むバクテリオファージ、即ち、前述のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むバクテリオファージ、との組合せも提供する。バクテリオファージは、細菌及び古細菌中で感染を起こし、複製をするウイルスである。バクテリオファージは、通常、ＤＮＡ又はＲＮＡゲノムをカプセル化したタンパク質からなり、単純または精巧な、様々な異なる構造で存在する。ファージは抗細菌効果を提供するものであってもよい。前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む前記核酸を含むバクテリオファージは、細菌により前記ＡＴＰ加水分解酵素が発現されるように、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を細菌に容易に運ぶことができる。

【0111】

組成物
上述の本発明の組合せの免疫チェックポイントモジュレーターは、組成物に含まれていてもよい。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む微生物、及び前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含むウイルス粒子は、それぞれ、組成物中に含まれていてもよい。前記組成物はワクチンであってもよい。

【0112】

例えば、前記組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を任意に含む医薬組成物であってもよい。前記担体、希釈剤、又は賦形剤は投与を容易にするものであるが、これらは、前記組成物の授与対象にとって有害又は有毒なものであってはならない。通常、担体、希釈剤、及び賦形剤は、前記組成物の「有効」成分ではない。したがって、前記免疫チェックポイントモジュレーター、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含むウイルス粒子は、前記組成物の単独有効成分（即ち、特に、治療される病気に対して、薬学的に活性を有する）であってもよい。好ましい担体としては、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウイルス粒子等の、分子量が大きく、ゆっくりと代謝される高分子が挙げられる。

【0113】

薬学的に許容される塩が使用でき、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩等の鉱酸塩、又は、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩等の有機酸塩が使用できる。

【0114】

前記組成物は、媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）を含んでいてもよい。媒介物は、通常、薬学的に許容される化合物等の化合物を保存、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であると理解されている。例えば、前記媒介物は、薬学的に活性な化合物を保存、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であり、生理学的許容される液体であってもよい。前記組成物が処方されると、前記組成物は直接投与対象に投与することができる。ある態様では、組成物は、哺乳類（例えば、投与対象人）に投与するために調整される。

【0115】

ある態様では、前記医薬組成物は、特に複数の投与容量でパッケージ化されている場合、抗菌剤を含んでいてもよい。前記医薬組成物は、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）のような界面活性剤を含んでいてもよい。通常、界面活性剤は低レベル、例えば０．０１％以下で存在している。組成物は、強壮性を付与するためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）をも含んでいてもよい。例えば、１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＣｌが典型的である。

【0116】

更に、医薬組成物は、特に凍結乾燥される場合又は凍結乾燥された材料を戻して得られた材料を含む場合、糖アルコール（例えば、マンニトール）又は二糖類（例えば、スクロース又はトレハロース）を、例えば、１５～３０ｍｇ／ｍｌ程度（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）を含んでいてもよい。凍結乾燥する組成物のｐＨは、凍結乾燥前に、５から８の間、又は５．５から７の間、又は６．１程度に調節されてもよい。

【0117】

医薬組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、更に、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノール等の液体を含んでいてもよい。更に、湿潤又は乳化剤、或いは、ｐＨ緩衝剤等の補助剤が前記組成物に存在していてもよい。前記担体は、投与対象が摂取するため、前記医薬組成物が錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方されるのを可能とする。薬学的に許容される担体の細論はＧｅｎｎａｒｏ（２０００） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、 ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２に開示されている。

【0118】

医薬組成物は、多様な形状で用意されてもよく、多数の経路により投与されてもよい。前記投与経路としては、これらに限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、皮下、経腸、舌下、及び経直腸が挙げられる。好ましくは、前記医薬組成物は、経口投与のために錠剤、カプセル等として用意されてもよく、注射可能なように、例えば、液状溶液又は懸濁液として用意されてもよい。注射前の液状媒介物における溶液又は懸濁液に好適な個体形状が更に含まれ、例えば、前記医薬組成物は凍結乾燥された形状のものであってもよい。

【0119】

前記組成物は、例えば、錠剤又はカプセルとして、スプレーとして、又は（任意に風味付けされた）シロップとして経口投与用に調整されてもよい。経口的に許容される剤形としては、これに限定されるものではないが、カプセル、錠剤、水性懸濁液又は溶液が挙げられる。経口用の錠剤の場合、典型的に用いられる担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤も添加されていてもよい。カプセル形状での経口投与のための好適な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口用に水性懸濁液が必要な場合、有効成分、即ち、前記免疫チェックポイントモジュレーター、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子は、乳化及び懸濁剤と併用されてもよい。必要に応じて、特定の甘味料、香味料又は着色料が添加されていてもよい。前記有効成分は、それ自体では、胃腸管において分解されやすいものであることがある。したがって、前記組成物が胃腸管を用いる経路で投与されるものである場合、前記組成物は、前記ＡＴＰ加水分解酵素又は前記チェックポイントモジュレーターが分解されることを防止するが、一度胃腸管から吸収されると前記ＡＴＰ加水分解酵素又は前記チェックポイントモジュレーターを放出する成分を含んでいてもよい。前記組成物は、組合せられた組成物が、投与対象に投与させる直前に再構成されるように設計されたキット形状のものでもよい。例えば、凍結乾燥されたＡＴＰ加水分解酵素又は免疫チェックポイント阻害剤が、滅菌水又は滅菌緩衝剤と共にキット形状で提供されてもよい。

【0120】

様々な投与経路のために調整された多数の形状の組成物が本発明の範囲含まれ、前記形状としては、これらに限定されるものではないが、注射又は注入等、例えば、ボーラス投与による注射又は持続注入等の非経口投与に好適な形状が含まれる。前記製品が注射又は注入のためのものである場合、油性又は水性媒介物中で懸濁液または乳化液の形状を取っていてもよく、懸濁剤、保存剤、安定剤及び／又は分散剤等の調合剤を含んでいてもよい。或いは、前記ＡＴＰ加水分解酵素又は前記チェックポイントモジュレーターは、乾燥状態のもので、適当な減菌液と共に用いると再構成可能なものであってもよい。ある態様では、前記組成物は注射可能な溶液又は懸濁液として調整されてもよい。液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な、注射前の固体形状として調整することもできる（例えば、保存剤を含む減菌水で戻される凍結乾燥組成物）。例えば、静脈注射、皮膚注射、又は皮下注射、或いは、疾病部位への注射等の注射のため、前記有効成分は、パイロジェンフリーで好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する許容される非経口水性溶液の形状であってもよい。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液等の等張性媒介物を用いて好適な溶液を調整することが十分可能である。必要であれば、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤が含まれていてもよい。注射用としては、前記医薬組成物は、例えばシリンジ中にあらかじめ準備した状態で提供されてもよい。

【0121】

医薬組成物は、通常、ｐＨが５．５から８．５の間であるものであってもよく、ある態様では、ｐＨは６から８の間であってもよく、例えば、７であってもよい。前記ｐＨは、緩衝剤を用いることにより保持されていてもよい。前記組成物は無菌及び／又はパイロジェンフリーであってもよい。前記組成物はグルテンフリーであってもよい。前記組成物は人間に対して等張のものであってもよい。ある態様では、医薬組成物は、密封容器で提供されてもよい。

【0122】

対象に与えられるのが上述のタンパク質、ペプチド、核酸分子、宿主細胞、微生物、ウイルス粒子、又は他の医薬的に有用な化合物である場合、投与は、通常、「予防有効量」又は「治療有効量」（場合により）投与され、これら量は個人に効果を発現させるのに十分な量である。実際の投与量、及び投与の速度及び経時変化は、治療対象の特徴及び重度により異なる。したがって、１つ以上の有効成分の「有効」量は、通常、対象疾患又は症状を治療、改善、減弱、低減、又は予防するのに十分な量、又は検出可能な治療効果を示すのに十分な量である。治療効果としては、病原体の効力又は身体症状の低減又は減弱をも含む。特定の対象に対する厳密な有効量は、対象のサイズ、体重、健康状態、症状の特徴及び程度、並びに投与のために選択された治療法又は治療法の組合せによる。特定の状況における有効量は、日常的に行われる試験によって決定され、医療従事者の判断に委ねられる。

【0123】

ある態様では、本発明の医薬組成物は、前記免疫チェックポイントモジュレーター、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、及び前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子以外の、更なる有効成分を含んでいてもよい。前記更なる有効成分は、通常、同じ疾患（例えば、癌）に対して薬剤的に有効なものである。癌の治療のための更なる有効化合物の例としては、抗がん剤（細胞増殖抑制剤等）、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異抗原に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの前記更なる有効成分を含んでいてもよい。

【0124】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子とは、前記更なる有効成分が含まれている医薬組成物に含まれていてもよく、或いは、前記更なる有効成分が含まれている医薬組成物とは別の医薬組成物に含まれていてもよい。したがって、各更なる有効成分は異なる医薬組成物に含まれていてもよい。好ましくは、（ｉ）成分と（ｉｉ）成分と（即ち、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子と）は、それぞれ異なる（医薬）組成物に含まれていてもよい。かかる異なる医薬組成物は、組み合わせて／同時に、又は異なる時に、又は異なる箇所（例えば、人体の異なる箇所）に、又は異なる投与経路により投与されてもよい。例えば、前記免疫チェックポイントモジュレーター（を含む組成物）は非経口投与経路により投与されてもよく、一方、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、又は前記核酸を含む宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子（を含む組成物）は経腸投与経路により投与されてもよい。

【0125】

ある態様では、前記免疫チェックポイントモジュレーター又は前記ＡＴＰ加水分解酵素は、前記組成物中のタンパク質の合計の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）を占めていてもよい。

【0126】

ある態様では、前記組成物は、前記免疫チェックポイントモジュレーター、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸ウイルス粒子を精製した形態で含んでいてもよい。

【0127】

ある場合においては、前記組成物は、前記ＡＴＰ加水分解酵素又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、細胞抽出物を含んでいてもよい。例えば、前記組成物は、前記ＡＴＰ加水分解酵素を発現する細胞、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞からの細胞抽出物を含んでいてもよい。かかる細胞は、前述のように、細菌細胞であってもよい。例えば、前記組成物は、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細菌のペリプラズム抽出物を含んでいてもよい。この文脈において、好ましい細菌（細菌細胞）は上述の通りである。

【0128】

ある態様では、前記組成物はナノカプセルでの投与のために処方されてもよい。好ましくは、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含むウイルス粒子を含む前記組成物は、ナノカプセルでの投与のために処方されてもよい（一方で、前記免疫チェックポイントモジュレーターを含む組成物は、ナノカプセルでの投与のために処方されても、処方されていなくてもよい）。したがって、本発明は、本明細書に記載の組成物を含むナノカプセルも提供する。特に、本発明は、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含むウイルス粒子（を含む組成物）を含むナノカプセルを提供する。

【0129】

ナノカプセルは、通常、無毒のポリマー／脂質から形成され、成分を有害な環境から守ることができる。ナノカプセルは、通常、ナノスケールで内部の液体コアをカプセル化するポリマー膜からなる小胞系である。カプセル化の方法は公知であり、前記カプセル化の方法としては、ナノ沈殿、エマルジョン拡散、及び溶媒蒸発が挙げられる。ある態様では、前記ナノカプセルは、経腸投与、特に、経口投与のためのものであってもよい。ナノカプセル及びナノカプセルの作成方法は公知であり、例えば、Ｅｒｄｏｇａｒ Ｎ、 Ａｋｋｉｎ Ｓ、 Ｂｉｌｅｎｓｏｙ Ｅ． Ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ａｎ Ｕｐｄａｔｅｄ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｓｔ Ｄｅｃａｄｅ． Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｆｏｒｍｕｌ． ２０１８；１２（４）：２５２－２６６． ｄｏｉ： １０．２１７４／１８７２２１１３１３６６６１９０１２３１５３７１１に記載されており、その全体を本明細書に援用する。

【0130】

本発明はまた、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーター、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子用意する工程と、（ｉｉ）１つ以上の薬学的に許容される担体と混合する工程とを含む、（医薬）組成物を調製する方法も提供する。

【0131】

組合せ
本発明によると、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子と組合せられる。前記核酸によりコードされるＡＴＰ加水分解酵素は、前記組成物がその効果を発揮する作用箇所（例えば、人体又は動物体内）で前記免疫チェックポイントモジュレーターとＡＴＰ加水分解酵素とが組み合わされるように、発現される。

【0132】

一般的に、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ－加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子との「組合せ」は、組み合わされた状態で両成分がそれぞれの効果を発揮することができることを意味する。このため、両成分の効果の時間窓は通常重なり合っている。したがって、両成分の効果は、人体又は動物体内で同時に現れる（１つ又は両方の成分が物理的にもはや存在していないとしても）。ある態様では、両成分は、人体又は動物体内で同時に（物理的に）存在していてもよい。

【0133】

したがって、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターは、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子を用いた治療と好ましくはオーバーラップする。１つの成分（ｉ）又は（ｉｉ）が、例えば、他の成分（（ｉ）又は（ｉｉ）の他方）が投与された日と同日に投与されないとしても、これらの治療スケジュールは通常から絡みあわされる。

【0134】

ある態様では、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーター、及び／又は（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ－加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子は、繰り返し投与されてもよい。例えば、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターの投与後、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ－加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、並びに、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子が投与され、そしてその後、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターが更に続いて投与されてもよい。同様に、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、並びに、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子の投与後、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターが投与され、そしてその後、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、並びに、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子が更に続いて投与されてもよい。このようにして、（ｉ）及び（ｉｉ）の両成分の治療スケジュールが絡み合わされていてもよい。

【0135】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子と組み合わされた前記免疫チェックポイントモジュレーターは、相乗的治療効果等、追加的な治療効果を提供してもよい。用語「相乗的」は、個々の有効成分の効果を合計した効果よりも大きい、２つ以上の有効成分の組み合わされた効果を表現するのに用いられる。したがって、２つ以上の成分の組み合わされた効果が活性又はプロセスの「相乗的阻害性」をもたらす場合、活性又はプロセスの阻害性は、それぞれの有効成分の阻害性効果の合計よりも大きくなることが意図されている。用語「相乗的治療効果」は、２つ以上の治療を組み合わせて得られる治療効果を意味し、その（多数のパラメーターのいずれかで計測された）治療効果は、それぞれ単独の治療により得られたそれぞれ単独の治療効果の合計よりも大きいものである。

【0136】

ある態様では、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子とからなる組合せは、抗原又は少なくとも１つのエピトープ含む前記抗原の断片、前記抗原又は前記抗原の断片をコードする核酸、或いは、前記抗原又は前記抗原の断片をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子等の更なる（「第３の」）成分を組み合わされてもよい。

【0137】

言い換えると、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子とからなる組合せは、
（ａ）抗原又は少なくとも１つのエピトープを含む前記抗原の断片、
（ｂ）前記抗原又は少なくとも１つのエピトープを含む前記抗原の断片をコードする核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子
のいずれか１つ（又は組合せ）を更に含んでいてもよい。

【0138】

本明細書中、「抗原」は、適応免疫応答の受容体の標的となるいかなる構造物質をも含み、特に、抗体、Ｔ細胞受容体、及び／又はＢ細胞受容体の標的となる構造物質である。「抗原決定基」としても知られる「エピトープ」は、免疫システム、特に、抗体、Ｔ細胞受容体、及び／又はＢ細胞受容体によって認識される抗原の一部（又は断片）である。したがって、１つの抗原は少なくとも１つのエピトープを含む、即ち、単独の抗原は１つ以上のエピトープを有していてもよい。本発明の文脈において、前記用語「エピトープ」は、主に、Ｔ細胞エピトープを指すのに用いられ、前記Ｔ細胞エピトープは抗原提示細胞に表面に存在し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と結合している。ＭＨＣクラスＩ分子により提示されるＴ細胞エピトープは、限定されるものではないが、典型的には８から１１のアミノ酸の長さのペプチドであり、一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子はより長いペプチド、限定されるものではないが、通常、１２から２５のアミノ酸の長さのペプチドである。

【0139】

好ましくは、上述の（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、上述の（ｉｉ）前記ＡＴＰ－加水分解酵素、前記ＡＴＰ－加水分解酵素をコードする核酸、或いは前記ＡＴＰ－加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子とからなる組合せは、更に、抗原の断片と組み合わされていてもよく、前記断片は前記抗原の少なくとも１つのエピトープを含む。本明細書中、抗原の「断片」は、抗原の少なくとも１０連続アミノ酸を含み、好ましくは抗原の少なくとも１５連続アミノ酸を含み、より好ましくは抗原の少なくとも２０連続アミノ酸を含み、更により好ましくは抗原の少なくとも２５連続アミノ酸を含み、最もこのましくは抗原の少なくとも３０連続アミノ酸を含む。

【0140】

更に、抗原又は少なくとも１つのエピトープを含む抗原の断片の「配列変異体」が用いられてもよく、前記配列変異体は、参照配列（例えば、自然界に存在する抗原又は断片）と少なくとも７０％又は少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％又は少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９７％又は少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％同一の（アミノ酸）配列を有する。「機能性」配列変異体が好ましく、抗原／抗原断片／エピトープの文脈において、機能性配列変異体とは、例えば抗原（断片）に含まれるエピトープの機能が損なわれない又は消失されない、即ち、免疫原性であることを意味し、好ましくは、無欠損の完全な長さの抗原に含まれるエピトープと同様／同一の免疫原性を有している。ある態様では、例えば、本明細書に記載の癌／腫瘍抗原（断片）に含まれるエピトープのアミノ酸配列は変異しておらず、したがって、（自然界に存在する）参照エピトープ配列と同一である。

【0141】

前記抗原は、通常、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ－加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子との組合せにより誘起又は強化される所望の免疫応答の観点から選択される。言い換えると、前記選択された抗原（断片）が本発明の組合せにより誘起又は強化された免疫応答の標的／方向性を決定してもよい。

【0142】

例えば、癌／腫瘍の文脈において、前記抗原（又はその断片）は、癌／腫瘍抗原であり、特に、癌／腫瘍関連抗原、又は癌／腫瘍特異抗原である。多くの癌／腫瘍抗原が少なくとも１つの特定の癌又は腫瘍に関連するものとして公知であり、抗原又はその断片は、癌／腫瘍のタイプ、及び／又は所望の治療効果により適宜選択できることが知られている。

【0143】

本明細書中に記載される「癌／腫瘍抗原／エピトープ」は、癌／腫瘍細胞により生成される抗原／エピトープである。かかる抗原／エピトープは、通常、特定の種類の癌／腫瘍に特異性（関連性）を有する。

【0144】

癌／腫瘍関連（また、癌／腫瘍相関）抗原（ＴＡＡ）は、通常、癌／腫瘍細胞及び正常細胞の両方により発現される抗原である。例えば、ＴＡＡは、腫瘍細胞により発現される１つ以上の表面タンパク質又はポリペプチド、核タンパク質又は糖タンパク質、又はそれらの断片であってもよい。例えば、ヒト腫瘍関連抗原は、分化抗原（例えば、メラノサイト分化抗原）、変異抗原（例えば、ｐ５３）、過剰発現細胞抗原（例えば、ＨＥＲ２）、ウイルス抗原（例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質）、及び精巣及び卵巣における生殖細胞では発現するが、正常な体細胞（例えば、ＭＡＧＥ及びＮＹ－ＥＳＯ－１）では発現していない癌／精巣（ＣＴ）抗原を含む。多くのＴＡＡは、癌又は腫瘍に特異的ではなく、正常組織でもみられる。したがって、これらの抗原は、出生時（又はそれ以前）から存在していてもよい。したがって、これらの抗原に対し、免疫システムが自己寛容性を有する可能性はある。

【0145】

反対に、癌／腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）は、正常細胞ではなく、癌／腫瘍細胞により特異的に発現される抗原である。ＴＳＡは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介して、ネオ抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識される。したがって、ＴＳＡは、特に、ネオ抗原を含む。一般的に、ネオ抗原は、それ以前は存在していなかった、したがって免疫システムにおいて「新しい」抗原である。ネオ抗原は、通常、体細胞変異によるものである。癌／腫瘍において、癌／腫瘍特異的ネオ抗原は、通常、癌／腫瘍発生前には存在しておらず、癌／腫瘍特異的ネオ抗原は、普通、癌細胞／腫瘍細胞における体細胞遺伝子変異によりコードされる。免疫学的観点から、腫瘍ネオ抗原は、真に、外来タンパク質であり、正常ヒト器官／組織に完全に不在である。ウイルス性病因なしの大半のヒト腫瘍では、腫瘍ネオ抗原は、例えば、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入及び欠失（ｉｎｄｅｌ）、遺伝子融合、フレームシフト変異、及び構造変異（ＳＶ）等を含む多様な非同義遺伝子変異から誘導されたものである。例えば、腫瘍ネオ抗原は、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１９、 Ｐａｇｅｓ ９８０－９９２に開示されるような公知のイン・シリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）予測ツールを用いて、或いは、癌ゲノムシーケンシング、（癌）ゲノムのタンパク質コード部位内での変異を特定するディープシーケンシング技術等の当業者に公知の方法により特定されてもよい。

【0146】

好適な癌／腫瘍エピトープは、例えば、癌抗原ペプチドデータベース（Ｖｉｇｎｅｒｏｎ Ｎ， Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ Ｖ， Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ＢＪ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ． Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｆｉｎｅｄ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ： ｔｈｅ ２０１３ ｕｐｄａｔｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ． ２０１３；１３：１５）、又はデータベース「Ｔａｎｔｉｇｅｎ」（Ｚｈａｎｇ Ｇ， Ｃｈｉｔｋｕｓｈｅｖ Ｌ， Ｏｌｓｅｎ ＬＲ， Ｋｅｓｋｉｎ ＤＢ， Ｂｒｕｓｉｃ Ｖ． ＴＡＮＴＩＧＥＮ ２．０： ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｂａｓｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０２１；２２（Ｓｕｐｐｌ ８）：４０． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０２１ Ａｐｒ １４． ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８５９－０２１－０３９６２－７）等の癌／腫瘍エピトープのデータベースから得ることもできる。

【0147】

ある態様では、前記癌／腫瘍抗原、又は前記癌／腫瘍エピトープは、組換え癌／腫瘍抗原、又は組換え癌／腫瘍エピトープであってもよい。かかる組換え癌／腫瘍抗原又は組換え癌／腫瘍エピトープは、ネイティブ癌／腫瘍抗原、又はネイティブ癌／腫瘍エピトープの全体のアミノ酸配列における特定のアミノ酸を改変（追加、欠失、又は置換）させる変異を導入することにより設計されたものであってもよい。変異の導入は、哺乳類である対象、好ましくは、ヒト又は犬である対象に亘って普遍的に適用できない程、癌／腫瘍抗原又は癌／腫瘍エピトープを変化させるものではなく、アミノ酸配列が寛容を崩す、又は免疫応答を惹起しうる外来抗原であると認識されるのに十分な程度変化をもたらす。他の方法としては、対応するネイティブ癌／腫瘍抗原又はネイティブ癌／腫瘍エピトープと少なくとも８５％から９９％までのアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％から９８％までの配列同一性、より好ましくは少なくとも９３％から９８％までの配列同一性、更により好ましくは少なくとも９５％から９８％までの配列同一性を有するコンセンサス組換え癌／腫瘍抗原又は癌／腫瘍エピトープを作成することであってもよい。ある場合、前記組換え癌／腫瘍抗原又は前記組換え癌／腫瘍エピトープは、対応するネイティブ癌／腫瘍抗原又はネイティブ癌／腫瘍エピトープと、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。前記ネイティブ癌／腫瘍抗原は、通常、特定の癌又は腫瘍に関連する抗原である。癌／腫瘍抗原によっては、前記癌／腫瘍抗原のコンセンサス配列は、哺乳類種に亘ってもよく、種のサブタイプのものでもよく、又はウイルス株又は血清型に亘るものであってもよい。ある癌／腫瘍抗原では、癌／腫瘍抗原の野生型アミノ酸配列と大差ない。前述のアプローチは、最終的な組換え癌／腫瘍抗原又は癌／腫瘍エピトープが前述のネイティブ癌抗原アミノ酸配列と同様の比率（ｐｅｒｃｅｎｔ）を有するように組み合わされてもよい。ある態様では、本明細書に記載の前記癌／腫瘍抗原のエピトープのアミノ酸配列は変異されていなく、したがって、参照エピトープ配列と同一である。

【0148】

前記ＡＴＰ加水分解酵素と同様に、前記抗原又は少なくとも１つのエピトープを含む前記抗原の断片も、タンパク質／ペプチドとして投与されてもよく、又は核酸にコードされてもよく、或いは、宿主細胞、微生物、又はウイルス粒子が（かかる核酸の）デリバリーに用いられてもよい。前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、及び前記ウイルス粒子の（前記ＡＴＰ加水分解酵素の文脈における）詳細な説明は、そのまま前記抗原又は少なくとも１つのエピトープ含む前記抗原の断片にも適応される。前記ＡＴＰ加水分解酵素と、前記抗原又は少なくとも１つのエピトープを含む前記抗原の断片との投与形状はそれぞれ独立して選択されるが、両者は対応した形状で投与されてもよく、例えば、両者、タンパク質／ペプチドとして、又は核酸として投与されてもよい。ある態様では、前記組合せは、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む第一の核酸と、前記抗原又は少なくとも１つの抗原エピトープを含む前記抗原の断片をコードするヌクレオチドを含む第二の核酸とを含む宿主細胞又は微生物を含んでいてもよい。したがって、前記組合せは、前記ＡＴＰ加水分解酵素と、前記抗原又は少なくとも１つの抗原エピトープを含む前記抗原の断片を（異種）発現する宿主細胞又は微生物を含んでいてもよい。

【0149】

ある態様では、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子とからなる組合せは、バンコマイシン（又は抗生物質）を含まない。言い換えると、本明細書に記載の本発明の組合せが投与されると、バンコマイシン（又は抗生物質）の投与を避けることができる。

【0150】

キット
更なる態様では、本発明は更にキットを提供する。即ち、
（ｉ）免疫チェックポイント阻害剤と、
（ｉｉ）（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子と
を含むキットである。

【0151】

ある態様では、かかるキットは、（ｉ）上述の免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述のＡＴＰ加水分解酵素とを含む。ある態様では、かかるキットは、（ｉ）上述の免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸とを含む。ある態様では、かかるキットは、（ｉ）上述の免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞とを含む。ある態様では、かかるキットは、（ｉ）上述の免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物とを含む。ある態様では、かかるキットは、（ｉ）上述の免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子とを含む。したがって、上述の免疫チェックポイントモジュレーターの詳細な態様は、そのまま、本発明のキットに適用される。したがって、上述のＡＴＰ加水分解酵素、上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、上述の宿主細胞、上述の微生物、又は上述のウイルス粒子の詳細な態様は、本発明のキットのそのまま適用される。特に、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーター、及び／又は（ｉｉ）上述のＡＴＰ加水分解酵素、上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、上述の宿主細胞、上述の微生物、又は上述のウイルス粒子は、上述の通り、組成物として（又はそれぞれ異なる組成物として）提供されてもよい。

【0152】

また、前記キットは、
（ａ）上述の抗原又は少なくとも１つのエピトープを含む前記抗原の断片、
（ｂ）上述の抗原又は少なくとも１つのエピトープを含む前記抗原の断片をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）上述の核酸を含む宿主細胞
（ｄ）上述の核酸を含む微生物、又は
（ｅ）上述の核酸を含むウイルス粒子
のいずれか１つ（又はそれらの組合せ）を更に含んでいてもよい。

【0153】

上述の抗原又はその断片の詳細な説明はそのまま適用されると理解されるべきである。

【0154】

前記キットの様々な成分は、１つ以上の容器に包装されてもよい。ある態様では、異なる成分、特に、（ｉ）成分及び（ｉｉ）成分、即ち、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーター、及び（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子は、それぞれ個別の容器で提供されてもよい。前記成分の個別の容器は、例えば、箱／容器の中に一緒に提供されてもよい。前記成分は、凍結乾燥又は乾燥形状で、或いは適当な緩衝剤に溶解された状態で提供されてもよい。例えば、前記容器は、上述の免疫チェックポイントモジュレーターを含む（医薬）組成物と、上述のＡＴＰ加水分解酵素、上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、上述の宿主細胞、上述の微生物、又は上述のウイルス粒子のいずれかを含んだ（医薬）組成物とを、例えば、それぞれ異なる容器に含んでいてもよい。前記キットは、また、前記免疫チェックポイントモジュレーターと、上述のＡＴＰ加水分解酵素、上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、上述の宿主細胞、上述の微生物、又は上述のウイルス粒子のいずれかとの両方を含んだ（医薬）組成物を含んでいてもよい。

【0155】

前記キットは、更に、上記成分を保存及び／又は戻すための緩衝剤、洗浄溶液、等の追加の試剤を含んでいてもよい。

【0156】

更に、本発明のパーツのキットは、任意に、取扱説明書を含んでいてもよい。好ましくは、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述のＡＴＰ加水分解酵素、上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、上述の宿主細胞、上述の微生物、又は上述のウイルス粒子との組合せを使用して癌を治療する指示が記載された添付文書又はラベル。例えば、本発明の組合せを使用説明は投与指針を含んでいてもよい。

【0157】

医学的療法及び使用
上述の本発明の組合せ及び上述の本発明のキットは、例えば、癌の治療等の医術に用いることができる。

【0158】

（ｉ）上述の免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述のＡＴＰ加水分解酵素、上述のＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、上述の宿主細胞、上述の微生物、上述のウイルス粒子との組合せは、実施例で示されたように、チェックポイントモジュレーターの効能を誘起又は強化することができる。

【0159】

したがって、本発明は、更に、対象の癌の発症のリスクを軽減する、癌を治療する、改善する、又は軽減する、或いは抗腫瘍応答を開始、増強、又は延長する方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子と
を前記対象に投与すること含む。

【0160】

また、本発明は、更に、癌の発症のリスクを軽減する、癌を治療する、改善する、又は軽減する、或いは抗腫瘍応答を開始、増強、又は延長する併用療法を提供し、前記併用療法は、
（ｉ）免疫チェックポイントモジュレーターと、
（ｉｉ）（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子と
を投与することを含む。

【0161】

したがって、本発明は、更に、医術に使用される免疫チェックポイントモジュレーターを提供し、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、又は
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子
と組み合わされて投与される。

【0162】

好ましくは、上述の組合せに用いられる前記免疫チェックポイントモジュレーターは、癌の治療に用いられる。

【0163】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーター及び（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子（「組合せ」の文脈において）、並びに、対応する組成物及び投与形態についての上記（詳細な）説明は、組み合わせて使用される、本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターにもそのまま適用されると理解されるべきである。同様に、更に（上述の形態のいずれかで投与される）前記抗原又はその断片と組み合わされてもよい。また、更に、上述の詳細な説明がそのまま適用される。

【0164】

前記癌の治療は、予防処置（例えば、癌の発生リスクを低減する予防処置）であっても、治療処置であってもよい。本明細書中、前記用語「治療処置」は、病気の発症後の処置を意味し、一方、「予防処置」は、疾患の発症前又は初期症状が現れる前の処置を意味する。特に。「治療処置」は、疾患の発症前に行われる予防手段を含まない。疾患の発症は、しばしば、前記疾患の症状と関連しているため、ヒト又は動物対象は、しばしば、診断後、又は少なくとも、前記対象が特定の疾患に罹っていると（強く）想定される場合、「治療」処置される。治療処置は、特に、（１）疾患（の状態）を改善する、向上する、又は治すこと、又は（２）疾患の進行を妨げる又は遅らせること（例えば、癌患者の平均生存期間を増加させることにより）を目的とする。しかし、通常、疾患の発症予防は、治療処置によって達成することはできない。

【0165】

前記組合せは、癌疾患の治療のため（の薬剤の調整のため）に用いられてもよい。本発明の文脈において用いられる前記用語「疾患」は、一般的に、症状を意図するものであり、用語「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」及び（医学的状態のような）「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」と同義的に用いられ、それら用語全て、正常機能が損なわれたヒト又は動物の体、或いはその部分の一部の異常状態を表し、通常、症状や兆候を識別することにより明らかにされ、ヒト又は動物の生命の長さ又は質を低減させることを意味する。

【0166】

癌疾患（又は「癌」）は、特に、身体の他の部位に侵入又は伝播する可能性がある、異常細胞増殖を伴う疾患群である。癌細胞／組織は、通常、癌の６つの特徴、即ち、（ａ）適切なシグナル不在下での細胞成長又は分裂；（ｂ）逆のシグナルが与えられているのにもかかわらず継続的な成長及び分裂；（ｃ）プログラム細胞死の回避；（ｄ）無限の細胞分裂；（ｅ）血管構築の促進；及び（ｆ）組織浸潤及び転移（メタスタシス）の形成を示す。

【0167】

癌疾患は、アポトーシスの欠損により引き起こされた疾患を含む。前記癌は、固形腫瘍、血液がん、又はリンパ癌であってもよい。本発明の文脈において、治療される癌は、固形腫瘍であることが好ましい。前記治療される癌は、転移性のものであってもよい。

【0168】

好ましくは、癌の治療において、本発明の組合せは、腫瘍（又は転移）の進行中の成長／更なる成長を、阻害させる、低減させる、又は遅らせる。本発明の組合せは、また、腫瘍のサイズ（又は転移の数）を低減させるものであってもよい。ある態様では、本発明の組合せは、腫瘍及び／又は転移のリスクを低減するもの、又は再発を予防するものであってもよい。

【0169】

これに限定されるものではないが、癌疾患の例としては、メラノーマ；小腸の腫瘍、及び結腸癌、結腸直腸癌、結腸腺癌などの胃腸腫瘍、を含む腸癌；肛門癌；神経膠腫等の脳腫瘍；乳癌；腺癌（例えば、結腸腺癌）；前立腺癌等、尿生殖器官の癌を含む生殖器腫瘍；肝臓癌及び肺癌が挙げられる。

【0170】

上述のように、（ｉ）上述の前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素、上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、上述の前記宿主細胞、上述の前記微生物、又は上述の前記ウイルス粒子との「組合せ」は、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターを用いた処置と、（ｉｉ）上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素、上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、上述の前記宿主細胞、上述の前記微生物、又は上述の前記ウイルス粒子を用いた処置とが組み合わされることを意味する。言い換えると、前記成分（ｉ）及び（ｉｉ）（（ｉ）前記チェックポイントモジュレーター、及び（ｉｉ）上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素、上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、或いは、上述の前記宿主細胞、上述の前記微生物、又は上述の前記ウイルス粒子）のうちの１つが、例えば、他の成分（（ｉ）又は（ｉｉ）の他方）と同日に、投与されなくても、これら治療のスケジュールは絡み合わされている。これは、本発明の文脈において、「組合せ」が、特に、前記成分（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれか一方を用いた治療が既に終了している時、他方の成分（ｉ）又は（ｉｉ）を用いた治療を開始する態様を含まないことを意味する。より一般的には、前記成分（ｉ）及び（ｉｉ）の「絡み合わされた」治療スケジュールは下記、即ち、構成要素（ｉ）及び（ｉｉ）の組合せ、を意味する：
（ｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子の最初の投与が、前記免疫チェックポイントモジュレーターを用いた（最終）治療（例えば、前記免疫チェックポイントモジュレーターの最終投与）後、１週間以内（好ましくは、３日以内、より好ましくは、２日以内、更により好ましくは、１日以内）に開始する；又は
（ｉｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターの投与が、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子を用いた（最終の）治療（例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子の最終投与）後、１週間以内（好ましくは、３日以内、より好ましくは、２日以内、更により好ましくは、１日以内）に開始する。

【0171】

例えば、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子との組合せにおいて、１つの成分（（ｉ）又は（ｉｉ））（例えば、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーター）が１週間に１回又は２回投与されてもよく、一方で、他方の成分（例えば、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子）が毎日投与されてもよい。この例の場合、１つの成分の連日投与における任意の日に、他方の成分も投与される。しかし、他の例では、もし両成分が週毎に投与される場合、任意の週において両成分が投与される（同日に投与されないとしても、治療スケジュールは依然として重なり合っている）。一方の成分が１回だけ投与され、他方の成分は繰り返し投与される場合、１つの成分の単一投与は、組合せが達成されるように、通常、（同日に投与されないとしても）他方の成分の治療サイクル内に行われる。一般的に、組合せを達成するため、１つの成分は、その効果が他の成分の効果と重なり合っている間に投与されてもよい。

【0172】

上述のように、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターの投与、及び／又は（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子の投与は、例えば、複数回の注射、及び／又は複数回の経口投与等、繰り返し（複数回、即ち、１回を超える）投与が必要でもよい。したがって、投与は、例えば、一次免疫注射として一回、その後、ブースター注射として、少なくとも２回繰り返されてもよく、又は、毎日投与されてもよい。したがって、（ｉ）本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子とは、繰り返し又は継続的に投与されてもよい。本明細書に記載の前記免疫チェックポイントモジュレーターと、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子とは、少なくとも１、２、３、若しくは４週間；２、３、４、５、６、８、１０、若しくは１２か月間；又は２、３、４、若しくは５年間、繰り返し又は継続的に投与されてもよい。例えば、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、１日に２回、１日に１回、２日毎、３日毎、１週間に１回、２週間毎、３週間毎、１月に１回、又は２か月毎、投与されてもよい。例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子は、１日に２回、１日に１回（例えば、毎日）、２日毎、３日毎、１週間に１回、２週間毎、３週間毎、１月に１回、又は２か月毎、投与されてもよい。

【0173】

ある態様では、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーター、及び／又は（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子は、同日に投与される。ある態様では、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーター、及び／又は（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子は、繰り返し投与される。例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は、前記ウイルス粒子は毎日投与されてもよく、一方、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、週に１度又は２度、他の成分（前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子）が投与される日に投与されてもよい。

【0174】

ある態様では、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とは、略同時に投与してもよい。本明細書中、「略同時に」とは、特に、同時投与、或いは、成分（ｉ）の投与直後に成分（ｉｉ）投与されること、又はその逆を意味する。当業者であれば、「直後」が第二の投与を準備するのに必要な時間、例えば、「投与器具」（例えば、注射器、ポンプ等）の適切な準備と共に、第二の投与を行う部位を露出させ殺菌するのに必要な時間、を含むことを理解するであろう。同時投与は、また、両成分の投与の期間が重複する場合、又は、例えば、１つの成分が、例えば、注入により、３０分、１時間、２時間、又はそれ以上等長時間にわたって投与され、他方の成分が前記長時間内に投与される場合を含む。

【0175】

好ましくは、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とは、連続して投与される。例えば、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子が投与される前に（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターが投与されてもよく；又は、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子が投与された後に（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターが投与されてもよい。連続投与において、両成分（ｉ）及び（ｉｉ）の投与間の時間間隔は、好ましくは１週間以内、より好ましくは３日以内、更により好ましくは２日以内、最も好ましくは２４時間以内である。（ｉ）前記チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とが同日に投与されるのが特に好ましい。両成分（ｉ）及び（ｉｉ）の投与間の時間は１２時間以内であってもよく、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内であり、例えば、２時間以内、又は１時間以内である。

【0176】

前記免疫チェックポイントモジュレーターと、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子は、多様な投与経路により、例えば、全身に又は局部的に投与されてもよい。一般的に、全身投与の経路は、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、及び腹腔内経路等を含む、経腸及び非経口経路が挙げられる。一般的に、局部投与の経路は、例えば、腫瘍内等の患部での直接投与が挙げられる。

【0177】

好ましくは、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とは、異なる投与経路を介して投与される。

【0178】

特に、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子は、好ましくは、経腸投与経路を介して投与される。経腸投与経路は、胃腸管を介した投与を意味し、胃管を介した投与と共に、例えば、経口、舌下、及び直腸投与を含む。前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子の経口投与が好ましい。いかなる理論にも拘束されるものではないが、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、（チェックポイント阻害剤と組み合わせられた際）腸管腔において、すなわち、腸内の細菌叢から放出される細胞外ＡＴＰを分解することによって、その有利な効果を媒介すると考えられる。本明細書の実験データは、前記チェックポイント阻害剤の活性における前記ＡＴＰ加水分解酵素の有益な効果を伝達するため、腸内の細菌叢から放出される前記ＡＴＰにおける前記ＡＴＰ加水分解酵素の重要な効果を示している。前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子の経腸投与が前記ＡＴＰ加水分解酵素を胃腸管（腸）に送達するため、この投与経路は、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子にとって好ましい。

【0179】

例えば、前記（コードされた）ＡＴＰ加水分解酵素は可溶性ＡＴＰ加水分解酵素であってもよく、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子は、経腸投与経路を介して投与されてもよい。

【0180】

前記免疫チェックポイントモジュレーターは、好ましくは、非経口投与経路を介して投与される。非経口投与の非限定の例としては、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、節内、腹腔内、及び、皮下投与経路が挙げられる。好ましくは、前記免疫チェックポイントモジュレーターは、静脈内投与又は皮下投与される。前記チェックポイントモジュレーターは、例えば、腫瘍内等、患部に投与されてもよい。

【0181】

ある態様では、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とは、同一の投与経路により投与され、前記投与経路は、例えば、上述の経腸又は非経口経路のいずれか等である。

【0182】

前記免疫チェックポイントモジュレーターと、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とは、同じ組成物として提供されてもよく、それぞれ異なる組成物として提供されてもよい。好ましくは、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とは、例えば、上述のように、それぞれ異なる組成物として提供される。それにより、例えば、異なる媒介物等の、異なる他の成分を、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とのそれぞれに用いることができる。また、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とはそれぞれ異なる投与経路を介して投与することができ、投与量（特に、投与量の関係）は、実際の必要性に応じて調節することができる。

【0183】

（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子との本発明の組合せは、「単独の（ｓｔａｎｄ－ａｌｏｎｅ）」併用療法として（即ち、抗癌剤（例えば、細胞増殖抑制剤）又は腫瘍関連抗原に対する抗体等の更なる成分又は有効成分を併用することなしに）投与されてもよい。或いは、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）上述の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子との本発明の組合せは、抗癌剤（例えば、細胞増殖抑制剤）又は腫瘍関連抗原に対する抗体等の１つ以上の更なる有効成分と組み合わせて投与されてもよい。

【0184】

ある態様では、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物又は前記ウイルス粒子との上述の本発明の組合せは、養子細胞療法と、好ましくは、ＣＡＲＴ細胞療法と、又はインビトロで増殖された腫瘍浸潤Ｔ細胞の注入と組み合わされてもよい。養子細胞療法（「細胞免疫療法」としても知られる）は、ヒト免疫細胞を癌の治療に用いる。前記免疫細胞は、好ましくは自家細胞（即ち、細胞のインビトロ処理後にその細胞を受け取る同じ患者から分離される細胞）であるが、同種細胞（即ち、他のヒト患者から分離される細胞）であってもよい。分離後、前記免疫細胞は、インビトロで増殖及び／又は（例えば、抗腫瘍効果を強化するため）遺伝子操作される。養子細胞療法の例としては、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法が挙げられる。

【0185】

好ましくは、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物又は前記ウイルス粒子とからなる、前述の本発明の組合せは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）療法、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法等の養子Ｔ細胞療法と組み合わされてもよい。

【0186】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法において、既に患者の腫瘍に浸潤している自然発生するＴ細胞が捕獲される。前記腫瘍浸潤Ｔ細胞を活性化及び増殖した後、多数の活性化された前記Ｔ細胞が患者に再注入される。

【0187】

遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）療法において、Ｔ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入して前記細胞が特異癌抗原を標的とするために、インビトロで遺伝子改変される。これにより、各患者の腫瘍に最適な標的を選択し、異なる種類のＴ細胞が遺伝子操作され、更に治療を改善し、個々人に合わせてパーソナライズできる。

【0188】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法において、ＣＡＲの主要な利点は、抗原がＭＨＣを介して癌細胞表面に存在していない場合であっても、癌細胞に結合できるＣＡＲの能力であり、これにより、Ｔ細胞からの攻撃に対して、前記癌細胞をより脆弱なものとすることができる。ＣＡＲＴ細胞療法は、養子移植されたＴ細胞を直接、腫瘍細胞に誘導するため、効果的で恒久的な抗腫瘍応答を提供する。前記ＣＡＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現とは独立して、前記ＣＡＲが移植された細胞に、細胞表面抗原への高い結合親和性を与え、屈強なＴ細胞活性及び抗腫瘍応答を引き起こす。

【0189】

養子細胞療法において、（ｉ）前記免疫チェックポイントモジュレーターと、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子との、上述の本発明の組合せの投与は、（前記（Ｔ）細胞のインビトロ処理後）前記（Ｔ）細胞が患者に投与されるのと同日に開始されてもよい。これは、本発明の組合せの前記２つの成分（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも１つ（例えば、上述された前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子）が、患者がインビトロ処理後の（Ｔ）細胞を受け取るのと同日に、初めて、投与されることを意味する。或いは、本発明の組合せの前記２つの成分（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも１つ（又は両者）は、患者がインビトロ処理後の（Ｔ）細胞を受け取る前に、初めて投与されてもよい。この場合、本発明の組合せを用いた治療は、患者がインビトロ処理後の（Ｔ）細胞を受け取る間、継続されていてもよい。本発明の組合せの前記２つの成分（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも１つ（又は両者）を、患者がインビトロ処理後の（Ｔ）細胞を受け取る後に、初めて投与することも可能である。特に、本発明の組合せの前記２つの成分（ｉ）及び（ｉｉ）の両者が、患者がインビトロ処理後の（Ｔ）細胞を受け取る後に、初めて投与される場合、インビトロ処理後の（Ｔ）細胞の投与から、本発明の組合せの前記２つの成分（ｉ）及び（ｉｉ）の最初の投与までの期間は２週間を超えないのが好ましく、好ましくは、１週間を超えなく、より好ましくは、５日を超えなく、更により好ましくは、２又は３日を超えない。
以下では、添付図面の簡単な説明が与えられる。これらの図面は、本発明をより詳細に説明することを意図している。しかし、これらの図面は、本発明の主題を何ら限定することを意図しない。

【図面の簡単な説明】

【0190】

【図1】図１は、ペリプラズムＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）をコードするｐｈｏＮ２遺伝子を有するｐＨＮＤ１０プラスミドのマップを示す。

【図2】図２は、野生型ｐｈｏｎ２タンパク質のアミノ酸配列（アピラーゼ；配列番号１）を示し、機能喪失型アイソフォームにおけるＲ１９２Ｐ置換の位置（配列番号２）を示す。

【図3】図３は、ｐＨＮＤ１０プラスミドの作成に用いられるｐｈｏＮ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。

【図4】図４は、実施例２における、腫瘍サイズの経時的な発達を示す。１×１０^６のＢ１６－ＯＶＡメラノーマ細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｂ１６－ＯＶＡ）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（示された通り）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を経管投与された。実験の終了時点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝１５（Ｂ１６－ＯＶＡ）；１９（Ｂ１６－ＯＶＡ＋ａＰＤＬ１）；２０（Ｂ１６－ＯＶＡ＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図5】図５は、実施例２における生存率を示す。１×１０^６のＢ１６－ＯＶＡメラノーマ細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、リン酸緩衝生理食塩水（Ｂ１６－ＯＶＡ）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（示された通り）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与され、生存がモニタリングされた。生存曲線の統計分析にはマンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）ログランク検定が適用された。ｎ＝１８（Ｂ１６－ＯＶＡ）；２０（Ｂ１６－ＯＶＡ＋ａＰＤＬ１及びＢ１６－ＯＶＡ＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【0191】

【図6】図６は、実施例３における、腫瘍サイズの経時的な発達を示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（示された通り）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝１５（ＭＣ３８）；２２（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１）；２３（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）；２４（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図7】図７は、実施例３における生存率を示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（示された通り）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与され、生存がモニタリングされた。生存曲線の統計分析にはマンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）ログランク検定が適用された。ｎ＝９（ＭＣ３８）；１６（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１及びＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）；１５（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。＊ｐ＜０．０５。

【図8】図８は、実施例４における、腫瘍サイズの経時的な発達を示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、及び１４日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ１９１７又はＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ１９１７^ｐＡｐｙ（示された通り）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析には二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝９（ＭＣ３８）；１１（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１及びＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ１９１７）；１２（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ１９１７^{ｐＡｐｙｒ}）。＊ｐ＜０．０５。

【図9】図９は、実施例５における、腫瘍サイズの経時的な発達を示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、及び１４日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又は１００μｌのペリプラズム抽出物（ＡＰＹ抽出物）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝５（ＭＣ３８及びＭＣ３８＋ａＰＤＬ１）；６（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋ＡＰＹ抽出物又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図10】図１０は、実施例６において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬのＣＸＣＲ５発現をフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラムで示す。数値は、表示されているマーカーを超える陽性細胞のパーセンテージを示す。

【0192】

【図11】図１１は、実施例６において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＣＸＣＲ５^＋細胞の頻度、及びフローサイトメトリーで平均蛍光強度（ＭＦＩ）として計測されたＣＸＣＲ５発現レベルの統計分析を示す。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊＊＊ｐ＜０、０００１。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与はＣＸＣＲ５^＋細胞の増加及びＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＣＸＣＲ５発現レベルの上昇をもたらす。

【図12】図１２は、実施例６において、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}により治療されたマウスのＭＣ３８腫瘍内の電子的ゲーティングにより得られたＣＤ８^＋ＴＩＬ集団における、ＣＸＣＲ５^－（空曲線）及びＣＸＣＲ５^＋（灰色曲線）サブセットでのＴＣＦ１発現を代表的なフローサイトメトリーヒストグラムで示している。右側は、ＭＣ３８腫瘍を有し、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}により治療されたマウスのＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＣＸＣＲ５^－及びＣＸＣＲ５^＋細胞におけるＭＦＩの統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図13】図１３は、実施例７において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたマウスにおけるＣＸＣＲ５発現のため、回腸パイエル板のＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞のフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラムを示す。数値は、表示されているマーカーを超える陽性細胞のパーセンテージを示す。

【図14】図１４は、実施例７において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたマウスにおける、回腸パイエル板のＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞中の回腸パイエル板（ＰＰ）におけるＣＸＣＲ５^＋細胞の頻度、及びＭＦＩとして計測されたＣＸＣＲ５発現レベルの統計分析を示す。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図15】図１５は、実施例８において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおけるＩＣＯＳ発現を、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬのフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラムにて示す。数値は、表示マーカーを超える陽性細胞のパーセンテージを示す。

【0193】

【図16】図１６は、実施例８において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける、フローサイトメトリーで検出されたＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＩＣＯＳ^＋細胞の頻度の統計分析を示す。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊＊ｐ＜０．００１。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与は、ＣＤ８^＋ＴＩＬにおけるＩＣＯＳ^＋細胞の増加をもたらす。

【図17】図１７は、実施例９において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}．で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおけるＩＦＮ－γ分泌を、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬのフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラムにて示す。数値はＩＦＮ－γ分泌細胞のパーセンテージを示す。

【図18】図１８は、実施例９において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける、フローサイトメトリーで検出されたＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＩＦＮ－γ分泌細胞の頻度の統計分析を示す。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与は、ＣＤ８^＋ＴＩＬにおけるＩＦＮ－γ分泌細胞の増加をもたらす。

【図19】図１９は、実施例９において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける、ＩＬ－２１分泌を、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬのフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラムにて示す。数値は、ＩＬ－２１分泌細胞のパーセンテージを示す。

【図20】図２０は、実施例９において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける、フローサイトメトリーで検出されたＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＩＬ－２１分泌細胞の頻度の統計分析を示す。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊ｐ＜０．０５。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与は、ＣＤ８^＋ＴＩＬにおけるＩＬ－２１分泌細胞の増加をもたらす。

【0194】

【図21】図２１は、実施例１０において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたマウスにおけるＩＬ－２１分泌を、パイエル板（ＰＰ）からのＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞のフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラムにて示す。数値はＩＬ－２１分泌細胞のパーセンテージを示す。

【図22】図２２は、実施例１０において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたマウスの回腸ＰＰからのＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞中のＩＬ－２１分泌細胞の頻度の統計分析を示す。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊ｐ＜０．０１。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与は、回腸パイエル板から分離されたＣＤ８^＋細胞におけるＩＬ－２１分泌細胞の増加をもたらす。

【図23】図２３は、実施例１１において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおけるＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣＩＩ^＋細胞を、ＣＤ３細胞のフローサイトメトリー上で電子的にゲーティングしたプロットを示す。数値は、表示された象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）における陽性細胞のパーセンテージを示す。

【図24】図２４は、実施例１１において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける、フローサイトメトリーで検出されたＣＤ３^－細胞中のＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣＩＩ^＋細胞の頻度の統計分析を示す。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与は、ＣＤ３^－腫瘍浸潤白血球におけるのＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣＩＩ^＋細胞の増加をもたらす。

【図25】図２５は、実施例１１において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおけるＣＤ１０３^＋ＣＤ７０^＋細胞を、ＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣＩＩ^＋細胞の代表的なフローサイトメトリー上で電子的にゲーティングしたプロットを示す。数値は、表示された象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）における陽性細胞のパーセンテージを示す。

【0195】

【図26】図２６は、実施例１１において、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}（Ｅ．ｃｏｌｉ ｐ１９）、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける、フローサイトメトリーで検出されたＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣＩＩ^＋細胞中のＣＤ１０３^＋ＣＤ７０^＋細胞の頻度の統計分析を示す。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊ｐ＜０．０１。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与は、ＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣＩＩ^＋腫瘍浸潤細胞におけるＣＤ１０３^＋ＣＤ７０^＋細胞の増加をもたらす。

【図27】図２７は、実施例１２において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおける、抗ＰＤ－Ｌ１療法を組み合わされた腫瘍特異ＣＤ８細胞の養子移植の治療成績を向上することを示す。０日目、ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞を発現するＯＶＡ（１×１０^６）がマウスの皮下に移植された。８日目、８×１０^５のＴＣＲトランスジェニック抗ＯＶＡ ＣＤ８^＋ ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞がマウスの静脈内に注射された。１０日目、１４日目、１７日目、及び２０日目に、マウスは、１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、８日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝７、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図28】図２８は、実施例１３において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおける、抗ＣＴＬＡ４療法の治療成績を向上することを示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（示された通り）又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝５（ＭＣ３８）；６（ＭＣ３８＋ａＣＴＬＡ４）；７（ＭＣ３８＋ａＣＴＬＡ４＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図29】図２９は、実施例１３において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおける、抗ＣＴＬＡ４投与による生存期間の改善を示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（示された通り）又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与され、生存がモニタリングされた。生存曲線の統計分析のためのマンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）ログランク検定が適用された。ｎ＝５（ＭＣ３８）；６（ＭＣ３８＋ａＣＴＬＡ４）；７（ＭＣ３８＋ａＣＴＬＡ４＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図30】図３０は、実施例１４において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４併用療法の治療成績を向上することを示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体と１００μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体とを含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（示された通り）又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝５（ＭＣ３８）；７（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋ａＣＴＬＡ４）；７（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋ａＣＴＬＡ４＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【0196】

【図31】図３１は、実施例１４において、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４併用療法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が生存期間を改善させることを示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体と１００μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体と含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（示された通り）又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与され、生存がモニタリングされた。生存曲線の統計分析のためのマンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）ログランク検定が適用された。ｎ＝５（ＭＣ３８）；７（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋ａＣＴＬＡ４）；７（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋ａＣＴＬＡ４＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図32】図３２は、実施例１５において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が、ＣＴ２６結腸直腸腺癌を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおける抗ＰＤ－Ｌ１治療成績を向上することを示す。１×１０^６のＣＴ２６結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＣＴ２６）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}、又は空ベクターＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}による形質転換体（示された通り）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝１２（ＣＴ２６）；１９（ＣＴ２６＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}）；２０（ＣＴ２６＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図33】図３３は、実施例１５において、ＣＴ２６結腸直腸腺癌を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおける抗ＰＤ－Ｌ１により、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}は生存期間を改善することを示す。１×１０^６のＣＴ２６結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＣＴ２６）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}（示された通り）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与され、生存がモニタリングされた。生存曲線の統計分析のためのマンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）ログランク検定が適用された。ｎ＝１２（ＣＴ２６）；１９（ＣＴ２６＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}）；２０（ＣＴ２６＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡＰＹＲ}）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図34】図３４は、実施例１６において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与が、ＣＤ８^＋ＴＩＬ画分におけるＣＣＲ９^＋細胞を増加させることを示す。（Ａ）抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおけるＣＣＲ９の発現を、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬのフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラム。（Ｂ）示されたマウスにおけるＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＣＣＲ９^＋細胞の頻度の統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊＊ｐ＜０、００１。

【図35】図３５は、実施例１７において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与が、回腸パイエル板におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞中のＫｉ－６７^＋細胞の増加をもたらすことを示す。（Ａ）抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたマウスにおけるＫｉ－６７発現を、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞のフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラム。数値は、表示されたマーカーにおける陽性細胞のパーセンテージを示す。（Ｂ）示されたマウスにおけるＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞中の回腸パイエル板におけるＫｉ－６７^＋細胞の頻度の統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【0197】

【図36】図３６は、実施例１８において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与が、回腸パイエル板におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞中のＴ－ｂｅｔ^＋細胞の増加をもたらすことを示す。（Ａ）抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたマウスにおけるＴ－ｂｅｔ発現を、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞のフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラム。数値は、表示されたマーカーにおける陽性細胞のパーセンテージを示す。（Ｂ）示されたマウスにおけるＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞中の回腸パイエル板におけるＴ－ｂｅｔ^＋細胞の頻度の統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊ｐ＜０、０１、^＊＊＊ｐ＜０、００１。

【図37】図３７は、実施例１９において、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ． Ｐ_ｎｉｓＡ、 ｎｉｓｉｎ Ａ誘導プロモーター；ｕｓｐ４５遺伝子の１本鎖配列（ＳＰ ｕｓｐ４５）；Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉアピラーゼ遺伝子（ｐｈｏＮ２）；複製遺伝子Ｃ（ｒｅｐＣ）；複製遺伝子Ａ（ｒｅｐＡ）；クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｍＲ（ｃａｔ））を形質転換するのに用いられる、ｐｈｏＮ２遺伝子をコードするアピラーゼを有するｐＡｐｙｒプラスミドのマップを示す。

【図38】図３８は、実施例２０において、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ}が、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおける抗ＰＤ－Ｌ１療法の治療成績を向上することを示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ}又は空ベクターＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺによる形質転換体（示された通り）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝９（ＭＣ３８）；６（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１）；１７（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ）；２０（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ}）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図39】図３９は、実施２１における、ＥｃＮゲノムにおけるＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子の組み込みのためのＤＮＡ断片挿入を示す。ｍａｌＰは、マルトデキストリンホスホリラーゼのためのＥｃＮ遺伝子であり；ｃａｔは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのためのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子であり；ｐｈｏＮ２は、アピラーゼのためのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ遺伝子であり；ｍａｌＴは、マルトース及びマルトデキストリンオペロンの転写活性剤のためのＥｃＮ遺伝子であり；ＦＲＴは、フリッパーゼ認識標的配列であり；Ｐ_ｃａｔは、ｃａｔ遺伝子のプロモーターであり；Ｐ_ｐｒｏＤは、ｐｈｏＮ２遺伝子のプロモーターであり；ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳは、ｐｈｏＮ２遺伝子のリボソーム結合部位であり；Ｔ_{ｐｈｏＮ２}は、ｐｈｏＮ２遺伝子の転写ターミネーターである。

【図40】図４０は、実施例２１におけるＥｃＮ ｍａｌＰ遺伝子部位のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。ｍａｌＰ終止コドンは太字で示されている。

【0198】

【図41】図４１は、実施例２１における、ＥｃＮ ｍａｌＴ遺伝子部位のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。ｍａｌＴ開始コドンは太字で示されている。

【図42】図４２は、実施例２１における、前記Ｐ_ｐｒｏＤプロモーター、前記ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳ、前記Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子、及び前記ｐｈｏＮ２転写ターミネーターを含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。前記Ｐ_ｐｒｏＤ配列には下線が付与されている。前記ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳはイタリック体で示されている。前記ｐｈｏＮ２開始及び終止コドンは太字で示されている。前記ｐｈｏＮ２転写ターミネーターは太字のイタリック体で示されている。

【図43】図４３は、実施例２１において、ＦＲＴ配列が隣接（ｆｌａｎｋｅｄ）されたＥ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。前記ｃａｔ開始及び終止コドンは太字で示されている。前記ＦＲＴ配列はイタリック体で示されている。

【図44】図４４は、実施例２１において、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２のｍａｌＰ－ｐｈｏＮ２－ｍａｌＴ組換え遺伝子部位を示す。ｍａｌＰはマルトデキストリンホスホリラーゼのためのＥｃＮ遺伝子を示し；ｐｈｏＮ２はアピラーゼのためのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ遺伝子を示し；ｍａｌＴはマルトース及びマルトデキストリンオペロンの転写活性剤のためのＥｃＮ遺伝子を示し；ＦＲＴはフリッパーゼ認識標的配列を示し；Ｐ_ｐｒｏＤはｐｈｏＮ２遺伝子のプロモーターを示し；ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳはｐｈｏＮ２遺伝子のリボソーム結合部位を示し；Ｔ_{ｐｈｏＮ２}はｐｈｏＮ２遺伝子の転写ターミネーターを示す。

【図45】図４５は、実施例２１において、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２ペリプラズム抽出物におけるアピラーゼ検出を示す。ＥｃＮ及びＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２クローン１（ｃｌ １）菌は、ＬＢ培地において３７℃で２．５時間培養され、遠心分離により集菌された。各培養菌のペリプラズム断片は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で分離及び沈殿され、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で安定化され、ポリクローナル抗アピラーゼ・ウサギ血清を用いたウェスタンブロット法により分析された。

【0199】

【図46】図４６は、実施例２１において、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２ペリプラズム抽出物によるＡＴＰの用量依存分解性を示す。ＥｃＮ及びＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２クローン１（ｃｌ １）菌は、ＬＢ培地において３７℃で６時間培養され、遠心分離により集菌された。各培養菌のペリプラズム断片は、分離され、１倍（１×）のリン酸緩衝生理食塩水で透析され、１倍（１×）のリン酸緩衝生理食塩水で段階希釈された。ペリプラズム抽出物（ＰＥ）におけるアピラーゼ活性は、１倍（１×）のリン酸緩衝生理食塩水対する５０μＭのＡＴＰの分解のパーセンテージとして計測された。ＰＥにおけるアピラーゼ活性は、組換えホタルルシフェラーゼ及びその基質であるＤ－ルシフェリンを用いたＡＴＰ依存性生物発光アッセイにより、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．）に従って評価された。

【図47】図４７は、実施例２２において、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７：：ｐｈｏＮ２がＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおける抗ＰＤ－Ｌ１療法の治療成績を向上させること示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）又はｐｈｏＮ２遺伝子がゲノムに組み込まれたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２）、或いは、リン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝５（ＭＣ３８）；７（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋ＥｃＮ）；６（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図48】図４８は、実施例２３における、ｐＢＡＤ－ＯＶＡプラスミドの模式図を示す。ｐＢＡＤはアラビノース誘導プロモーターを示し；ｏｖａはｃＤＮＡコードニワトリオボアルブミンを示し；ａｒａＣはアラビノースオペロン調節遺伝子；ｆ１ ｏｒｉはｆ１バクテリオファージ複製起点を示し；ｐＢＲ３２２ ｏｒｉはｐＢＲ３２２プラスミド複製起点を示し；ｋａｎＲはカナマイシン耐性遺伝子を示す。

【図49】図４９は、実施例２３にいて、ｐＢＡＤ－ＯＶＡプラスミドの生成に用いられるニワトリオボアルブミンをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。

【図50】図５０は、実施例２３における、ニワトリオボアルブミンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。

【0200】

【図51】図５１は、実施例２４において、弱毒Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｈｙｐｉｍｕｒｉｕｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}による免疫化が、ＭＣ３８－ＯＶＡ結腸直腸腺癌を有するマウスにおける抗ＰＤ－Ｌ１療法の治療成績を向上させることを示す。マウスは、１×１０^６のオボアルブミンをトランスフェクションされたＭＣ３８結腸直腸腺癌（ＭＣ３８－ＯＶＡ）が皮下接種され、腫瘍生着から５日目及び１０日目に、１×１０^９ＯＶＡ発現Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｈｙｐｉｍｕｒｉｕｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}（Ｓ．Ｔｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}）又はアピラーゼ／ＯＶＡ発現Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｈｙｐｉｍｕｒｉｕｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}（Ｓ．Ｔｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}）を経口経管投与することにより免疫化された。腫瘍接種から８日目、１１日目、及び１４日目に、マウスは１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。腫瘍の存在は１７日目に確立された。腫瘍拒絶の統計分析のため、カイ二乗検定が適用された。Ｎ＝９（Ｓ．Ｔｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}）；９（Ｓ．Ｔｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}）。^＊ｐ＜０．０５。

【図52】図５２は、実施例２５において、リンパ器官からのＴ細胞放出の遮断が、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおけるＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}による治療成績の向上を無効化させることを示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種された。腫瘍接種から７日目に、マウスは、リン酸緩衝生理食塩水又は１ｍｇ／ｋｇのＦＴＹ７２０を腹腔内投与され、８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（示された通り）又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝１０（ＭＣ３８）；１５（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１）；１５（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋ＦＴＹ７２０）；１５（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）；１７（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}＋ＦＴＹ７２０）。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図53】図５３は、実施例２６において、リンパ器官からのＴ細胞放出の遮断が、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与により誘起された、ＣＤ８^＋中のＣＣＲ９^＋及びＩＣＯＳ^＋細胞の増加を消失させることを示す。（左）ＭＣ３８腫瘍を有し、抗ＰＤ－Ｌ１、又は抗ＰＤ－Ｌ１及びＦＴＹ７２０で治療されたマウスにおける、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＣＣＲ９^＋細胞の頻度の統計分析。マウスは、また、腫瘍接種から５日目から毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（示された通り）又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。（右）同マウスにおいて、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＩＣＯＳ^＋細胞の頻度の統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図54】図５４は、実施例２７において、ＭＣ腫瘍を有し、抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウスへのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与が、回腸細菌叢のＩｇＡ被覆の増加をもたらすことを示す。（Ａ）側方散乱光（ＳＳＣ－Ａ）のためのＳＹＴＯ ＢＣグリーン蛍光核酸色素（Ｓｙｔｏ^＋）染色と、ＩｇＡ被覆（ＩｇＡ）検出の為の抗マウスＩｇＡ抗体染色とを施された細菌のフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした等高線プロットを示す。細菌は、ＭＣ３８腫瘍を有し、抗ＰＤ－Ｌ１（Ｃｔｒｌ）、又は抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}（＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}）、又は抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）で治療されたマウスの回腸から、実験終了時に分離された。数値は、表示された象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）における陽性細胞のパーセンテージを示す。（Ｂ）示されたマウスの回腸におけるＩｇＡ結合細菌の頻度の統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図55】図５５は、実施例２８において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与による、パイエル板におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞中のＫｉ－６７^＋細胞の増加がＩｇＡに依存することを示す。（左）抗ＰＤ－Ｌ１（Ｃｔｒｌ）又は抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）で治療された野生型及びＩｇＡ ^－／－Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからのパイエル板におけるＫｉ－６７発現を、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞のフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラム。数値は、表示マーカー内の陽性細胞のパーセンテージを示す。（右）示されたマウスにおけるＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞中の回腸パイエル板（ＰＰ）におけるＫｉ－６７^＋細胞の頻度の統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊ｐ＜０．０５。

【0201】

【図56】図５６は、実施例２９において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与による、パイエル板におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞中のＴ－ｂｅｔ^＋細胞の増加が、ＩｇＡに依存することを示す。（左）抗ＰＤ－Ｌ１（Ｃｔｒｌ）又は抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）で治療された野生型及びＩｇＡ ^－／－Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからのパイエル板におけるＴ－ｂｅｔ発現を、ＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞のフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした代表的なヒストグラム。数値は、表示マーカー内の陽性細胞のパーセンテージを示す。（右）示されたマウスにおけるＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞中の回腸パイエル板（ＰＰ）におけるＫｉ－６７^＋細胞の頻度の統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊ｐ＜０．０５。

【図57】図５７は、実施例３０において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するＩｇＡ ^－／－マウスにおける抗ＰＤ－Ｌ１療法の治療成績を向上しないことを示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞が、野生型及ＩｇＡ ^－／－Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（示された通り）又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝３（ＭＣ３８）；７（ＩｇＡ ^－／－中のＭＣ３８）；７（ＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）；１１（ＩｇＡ ^－／－中のＭＣ３８＋ａＰＤＬ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図58】図５８は、実施例３１において、ＩｇＡが欠如したマウスにおけるＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与による、ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＣＣＲ９^＋及びＩＣＯＳ^＋細胞の増加の欠如を示す。（左）ＭＣ３８腫瘍を有し、抗ＰＤ－Ｌ１により治療された野生型及びＩｇＡ ^－／－Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＣＣＲ９^＋細胞の頻度の統計分析。マウスは、また、腫瘍接種後５日目から毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（示された通り）又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。（右）同マウスにおけるＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＩＣＯＳ^＋細胞の頻度の統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊ｐ＜０．０５。

【図59】図５９は、実施例３２において、回腸におけるＩｇＡ被覆細菌の頻度が、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有し、抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウスにおける腫瘍サイズと相関関係を有することを示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}（黒色円）又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（灰色円）を経管投与された。腫瘍生着から２０日目における、腫瘍サイズと、回腸中のＩｇＡｈ被覆細菌のパーセンテージとの相関関係。相関係数ｒと対応するＰ値とは、ノンパラメトリック・スピアマン検定（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｔｅｓｔ）により計算された。グラフにおける各点は個々のマウスを表す。

【図60】図６０は、実施例３２において、回腸におけるＩｇＡ被覆細菌の頻度が、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有し、抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウスにおける腫瘍サイズと相関関係を有することを示す。１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞がマウスに皮下接種され、腫瘍接種から８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）（黒色円）又はＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉからの遺伝子（ｐｈｏＮ２）をコードするアピラーゼが組み込まれた染色体を有するＥｃＮ Ｅｃｎ：：ｐｈｏＮ２）（灰色円）を経管投与された。腫瘍生着から１８日目における、腫瘍サイズと、回腸中のＩｇＡ被覆細菌のパーセンテージとの相関関係。相関係数ｒと対応するＰ値とは、ノンパラメトリック・スピアマン検定（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｔｅｓｔ）により計算された。グラフにおける各点は個々のマウスを表す。

【0202】

【図61】図６１は、実施例３３において、バンコマイシンの投与が、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおける、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}による治療成績の向上を撤廃させることを示す。マウスは、バンコマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）を含む飲料水により１５日間（示された通り）治療され、１×１０^６のＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞が皮下注射された（０日目）。実験終了時まで、飲料水中のバンコマイシンは維持された。８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、マウスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＭＣ３８、及びＭＣ３８＋バンコマイシン）又は１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。マウスは、また、５日目から実験終了まで毎日、１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（示された通り）、又はリン酸緩衝生理食塩水を経管投与された。実験の終了点まで、腫瘍成長がモニタリングされた。腫瘍成長の統計分析のための二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）が適用された。ｎ＝４（ＭＣ３８）；４（ＭＣ３８＋バンコマイシン）；５（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}）；７（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}＋バンコマイシン）；７（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）；８（ＭＣ３８＋ａＰＤ－Ｌ１＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}＋バンコマイシン）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図62】図６２は、実施例３４において、バンコマイシンの投与が、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}．で治療されたマウスの回腸におけるＩｇＡ被覆細菌に影響を与えることを示す。（左）Ａ）側方散乱光（ＳＳＣ－Ａ）のためのＳＹＴＯ ＢＣグリーン蛍光核酸色素（Ｓｙｔｏ^＋）染色と、ＩｇＡ被覆（ＩｇＡ）検出の為の抗マウスＩｇＡ抗体染色とを施された細菌のフローサイトメトリーを電子的にゲーティングした等高線プロットを示す。細菌は、ＭＣ３８腫瘍を有し、飲料水におけるバンコマイシンが（示された通り）存在又は不在の状況で抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}（＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}）、又は抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）で治療されたマウスの回腸から、実験終了時に分離された。数値は、表示された象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）における陽性細胞のパーセンテージを示す。（右）示されたマウスの回腸におけるＩｇＡ結合細菌の頻度の統計分析。両側マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【実施例】

【0203】

以下に、本発明の様々な実施形態及び態様を説明する具体例を提示する。しかし、本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施することができるように与えられるものである。しかし、本発明は、例示される実施形態によって範囲が限定されるものではなく、前記実施形態は、本発明の１つの態様を説明することのみを意図し、機能的に等価な方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載するものに加えて本発明の様々な変形例は、上述の記載、添付図面、及び以下の実施例から当業者に容易に明らかになる。すべてのかかる変形例は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。

【0204】

実施例１：アピラーゼ発現細菌の設計及び作成
アピラーゼを発現する細菌を得るため、ヘマグルチニン（ＨＡ）断片をタグとして有するＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（配列番号１）のペリプラズムＡＴＰジホスホヒドラーゼ（アピラーゼ）を発現する、ｐｈｏＮ２：：ＨＡ融合の全長を、ＰＢＡＤ Ｌ－アラビノース誘導プロモーターの制御下で、プラスミドｐＢＡＤ２８（ＡＴＣＣ ８７３９３８７４０２）のポリリンカー部位にクローニングした。これにより、概ね、下記の論文に従って作成された。Ｓａｎｔａｐａｏｌａ， Ｄ．， Ｄｅｌ Ｃｈｉｅｒｉｃｏ， Ｆ．， Ｐｅｔｒｕｃｃａ， Ａ．， Ｕｚｚａｕ， Ｓ．， Ｃａｓａｌｉｎｏ， Ｍ．， Ｃｏｌｏｎｎａ， Ｂ．， Ｓｅｓｓａ， Ｒ．， Ｂｅｒｌｕｔｔｉ， Ｆ．， ａｎｄ Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ， Ｍ． （２００６）；Ａｐｙｒａｓｅ， ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｐｌａｓｍｉｄ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｈｏＮ２ （ａｐｙ） ｇｅｎｅ， ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｐｒｏｐｅｒ ｕｎｉｐｏｌａｒ ＩｃｓＡ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｒｅａｄ； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８８， ｐ。１６２０－１６２７．

【0205】

コントロールとして、ｐＨＮＤ１９プラスミドを概ね下記の論文に従って作成した。Ｓｃｒｉｂａｎｏ、 Ｄ．、 Ｐｅｔｒｕｃｃａ、 Ａ．、 Ｐｏｍｐｉｌｉ、 Ｍ．、 Ａｍｂｒｏｓｉ、 Ｃ．、 Ｂｒｕｎｉ、 Ｅ．、 Ｚａｇａｇｌｉａ、 Ｃ．、 Ｐｒｏｓｓｅｄａ、 Ｇ．、 Ｎｅｎｃｉｏｎｉ、 Ｌ．、 Ｃａｓａｌｉｎｏ、 Ｍ．、 Ｐｏｌｔｉｃｅｌｌｉ、 Ｆ．、 ｅｔ ａｌ． （２０１４）；Ｐｏｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｈｏＮ２， ａ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ， ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｐｅｒ ＩｃｓＡ ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｏｌｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｌｅ．；ＰｌｏＳ ｏｎｅ ９、 ｅ９０２３０。ｐＨＮＤ１０プラスミドとは異なり、ｐＨＮＤ１９プラスミド（コントロール）は、Ｒ１９２Ｐ置換を有するアピラーゼの機能喪失型アイソフォームをコードするｐｈｏＮ２ _{Ｒ１９２Ｐ}：：ＨＡ融合を含む。

【0206】

図１は、ペリプラズムＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）をコードするｐｈｏＮ２遺伝子を有するｐＨＮＤ１０プラスミドのマップを示す。このマップは、通常、ｐＨＮＤ１９コントロールプラスミドにも適用され、唯一の違いは、Ｒ１９２Ｐ置換を有するアピラーゼの機能喪失型アイソフォームが、野生型アピラーゼの代わりにコードされていることである。図２は野生型ｐｈｏｎ２タンパク質のアミノ酸配列（アピラーゼ；配列番号１）を示し、機能喪失型アイソフォーム（配列番号２）におけるＲ１９２Ｐ置換の位置を示す。ｐＨＮＤ１０プラスミドを生成するのに用いられるｐｈｏＮ２遺伝子のヌクレオチド配列が図３に示される（配列番号３）。

【0207】

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂは、ｐＨＮＤ１０（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）又はｐＨＮＤ１９_{Ｒ１９２Ｐ}（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）で形質転換され、Ｌ－アラビノース（０．０３％）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）が添加されたＬＢ培地で増殖された。

【0208】

実施例２：アピラーゼを発現する細菌がメラノーマの抗ＰＤ－Ｌ１療法を向上する。
メラノーマ治療における、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされた、アピラーゼを発現する細菌（実施例１に記載のようにして得られた）の投与の効果を調査するため、オボアルブミンでトランスフェクションされたＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（Ｂ１６－ＯＶＡ）をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植し、腫瘍ネオ抗原の発現を模倣した。方法は下記の論文に概ね従った。Ｂｅｌｌｏｎｅ、 Ｍ．、 Ｃａｎｔａｒｅｌｌａ、 Ｄ．、 Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｉ、 Ｐ．、 Ｃｒｏｓｔｉ、 Ｍ．Ｃ．、 Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ、 Ａ．、 Ｍｏｒｏ、 Ｍ．、 Ｇａｒａｎｃｉｎｉ、 Ｍ．Ｐ．、 Ｃａｓｏｒａｔｉ、 Ｇ．、 ａｎｄ Ｄｅｌｌａｂｏｎａ、 Ｐ． （２０００）；Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５、 ２６５１－２６５６．簡潔には、メラノーマＢ１６Ｆ１０（Ｂ１６－ＯＶＡ）細胞を発現するオボアルブミンは１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長している時点で収穫され、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに１×１０^６細胞／１００μｌ（０日目）にて皮下移植された。

【0209】

抗ＰＤ－Ｌ１の腹腔内投与と組み合わせて、実施例１で記載したように、アピラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）又はその機能消失アイソフォームであるＲ１９２Ｐアミノ酸置換酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）をマウスに経口経管投与した。８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）を、マウスに腹腔内接種した。示されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0210】

結果を図４に示す。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はコントロールプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて腫瘍成長の顕著な減弱が示された。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明者は、アピラーゼ酵素活性が、免疫チェックポイント阻害剤での治療中に腸内生態系を調整し、能力のある抗腫瘍応答の形成を向上させたと考える。

【0211】

マウスの生存率が図５に示される。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍生着後のマウスの生存期間の分析により、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はコントロールＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せにより治療されたマウスにおいて生存期間が有意に延長したことが明らかとなった。

【0212】

実施例３：アピラーゼを発現する細菌が結腸直腸腺癌の抗ＰＤ－Ｌ１療法を向上する。
異なる腫瘍モデルにおける、免疫チェックポイント阻害剤が組み合わされた、アピラーゼを発現する細菌（実施例１に記載のようにして得られた）の投与の効果を調査するため、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞がＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植された。

【0213】

異なる腫瘍細胞（ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞）が用いられたという相違以外は、概ね実施例２に記載されているように実験が行われた。簡潔には、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに１×１０^６細胞／１００μｌ（０日目）で皮下移植された。

【0214】

実施例２と同様に、抗ＰＤ－Ｌ１の腹腔内投与と組み合わせて、実施例１で記載したように、アピラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）又は機能喪失アイソフォームであるＲ１９２Ｐアミノ酸置換酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）をマウスに経口経管投与した。８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）を、マウスに腹腔内接種した。示されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転換体（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0215】

結果を図６に示す。実施例２と同様、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はコントロールプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて腫瘍成長の有意な減弱が示された。

【0216】

マウスの生存率が図５に示される。ＭＣ３８腫瘍生着後のマウスの生存の分析により、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はコントロールＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せにより治療されたマウスにおいて生存期間が有意に延長したことが明らかとなり、よって、アピラーゼを発現する細菌の投与が免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療の効能を向上することが確認された。

【0217】

実施例４：アピラーゼを発現するプロバイオティクス細菌が腫瘍の抗ＰＤ－Ｌ１療法を向上する。
プロバイオティクス微生物によるアピラーゼ伝搬を調査するため、野生型アピラーゼを発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株のプロバイオティクス細菌を、概ね実施例１に記載されているようにして得た。簡潔には、実施例１に記載されたように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７はｐＨＮＤ１０（Ｎｉｓｓｌｅ ^{ｐＡｐｙｒ}）で形質転換され、Ｌ－アラビノース（０．０３％）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地で培養された。

【0218】

アピラーゼ（Ｎｉｓｓｌｅ ^{ｐＡｐｙｒ}）を発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株のプロバイオティクスは、実施例３に記載されているようにＭＣ３８腫瘍モデルで、即ち、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスに対し抗ＰＤ－Ｌ１抗体を組み合わせて、調査され、未処置ＭＣ３８コントロール群、抗ＰＤＬ－１のみが投与されたＭＣ３８コントロール群、及び抗ＰＤＬ－１と、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（アピラーゼ発現のためのｐＨＮＤ１０なし）とが投与されたＭＣ３８コントロール群と比較した。

【0219】

結果を図８に示す。抗ＰＤ－Ｌ１単独の治療効果の改善は認められなかった。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７におけるｐｈｏＮ２の発現は、抗ＰＤ－Ｌ１又は、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７で治療されたマウスに対し、腫瘍成長の有意な阻害をもたらした。この結果は、プロバイオティクス微生物を介したアピラーゼ伝搬が、癌免疫療法の治療成績を向上したことを示している。

【0220】

実施例５：アピラーゼを含む組成物の投与が腫瘍モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１療法を向上する。
アピラーゼを発現する生菌の投与が上記実施例２～４で得られた効果の要件であるのか、又はアピラーゼの投与で十分であるのかを調査するため、アピラーゼを含む組成物、即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}からのペリプラズム抽出物の投与が、上述のように、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて調査された。

【0221】

ペリプラズム抽出物を用意するため、上述のように（実施例１参照）Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が得られ、培養され、遠心分離により集菌された。洗浄後、細菌は、３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２０％のショ糖、及び０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームと共にリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁（１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ）され、３０℃で２分間インキュベートされた。ＭｇＣｌ_２（最終１０ｍＭ）が前記細菌溶液に添加され、インキュベーションが３０℃で１時間継続された。インキュベーション期間の終了時に細菌懸濁液を４℃で１０分間、１１，０００×ｇで遠心分離し、上清を保存した（ペリプラズム抽出物）。

【0222】

結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに１×１０^６細胞／１００μｌ（０日目）で皮下移植された。８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）を、マウスに腹腔内接種した。１００μｌのペリプラズム抽出物又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0223】

結果を図９に示す。実施例２及び３と同様、抗ＰＤ－Ｌ１単独で治療されたマウスと比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて腫瘍成長の有意な減弱が示された。抗ＰＤ－Ｌ１とアピラーゼを含む組成物、即ち、上述のペリプラズム抽出物との組合せは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたマウスで見られるように、腫瘍成長の同様な阻害をもたらす。これは、アピラーゼタンパク質の投与が、免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療の効能を高めるのに十分であることを示す。

【0224】

実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与がＣＤ８ ^＋ ＴＩＬのうちのＣＸＣＲ５ ^＋ 細胞の増加をもたらす。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのＭＣ３８腫瘍における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の免疫表現型を分析するため、実施例３のマウスの腫瘍性組織が消化され、白血球が濃縮された。このため、腫瘍は小さい片に裁断され、１．５ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）、及び５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０に再懸濁され、穏やかな攪拌下、３７℃で４５分間消化された。その後、消化物を７０μｍのセルストレーナーに通過させ、単一の細胞懸濁液を得た。その後、製造業者のプロトコルに従い、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配によってリンパ球を濃縮した。

【0225】

ＣＤ８^＋ＴＩＬは、ＣＤ８^＋ＴＩＬの電子的なゲーティングのためにＣＤ８及びＴＣＲβ鎖特異的抗体と、様々な蛍光標識抗体により染色され、フローサイトメトリーで分析された。簡潔には、細胞は下記のモノクローナル抗体で染色された：ビオチン結合抗ＣＸＣＲ５（クローン：２Ｇ８；ＢＤ）、ＰＥ標識抗ＩＣＯＳ（クローン：７Ｅ．１７Ｇ９；ＢＤ）、ＡＦ４８８標識抗ＴＣＲβ（クローン：Ｈ５７－５９７；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ標識又はＡＰＣｙ７標識抗ＣＤ８α（クローン：５３－６．７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅＣｙ７標識抗ＣＤ２５（クローン：ＰＣ６１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＦ－６４７標識抗ＴＣＦ１（クローン７Ｆ１１Ａ１０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥＣｙ７標識抗ＣＤ１１ｃ（クローン：Ｎ４１８；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＦ４０５標識抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ（クローン：Ｍ５／１１４．１５．２；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ビオチン結合抗ＣＤ７０（クローン：ＦＲ７０；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＰＥ標識抗ＣＤ１０３（クローン：２Ｅ７；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンはＢｉｏＬｅｇｅｎｄから、ｅｆｌｕｏ４０５標識ストレプトアビジンはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。細胞内染色は、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ及びＰｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーを用いて行われ、或いは、細胞内ＦｏｘＰ３（ＦＩＴＣ標識、クローン：ＦＪＫ－１６ｓ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）染色には、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦｏｘＰ３染色バッファーセットを用いて行われた。サンプルはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）フローサイトメーターで取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）又はＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてデータを分析した。

【0226】

抗ＣＸＣＲ５抗体で染色された細胞の分析により、驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はコントロールプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスの腫瘍におけるＣＸＣＲ５^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬが増加していることが明らかとなった。結果を図１０に示す。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明者は、このＴＩＬ成分の濃縮が、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}と組み合わされた抗ＰＤ－Ｌ１により治療されたマウスにおいて観察された、腫瘍成長の制御の向上とより良い予後に寄与した可能性があると予想する。

【0227】

図１１に示されるように、異なる動物の腫瘍におけるＣＸＣＲ５^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬの頻度の統計分析では、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はコントロールプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて、これらの細胞の有意な増加が示された。また、ＣＤ８ ＴＩＬの形質膜内のＣＸＣＲ５の発現レベルをフローサイトメトリーで分析した結果では、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}と組み合わされた抗ＰＤ－Ｌ１を用いて治療されたマウスにおいて成長した腫瘍から分離された細胞において、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の顕著な上昇が明らかとなった。これは、免疫チェックポイント阻害剤及び細菌発現アピラーゼの併用投与によるＣＸＣＲ５タンパク質発現のポジティブな制御を示している。

【0228】

ＣＸＣＲ５^＋ＣＤ８^＋細胞は、Ｔ細胞消耗の主要制御因子である転写因子ＴＣＦ１の発現で特徴付けられ、前記主要制御因子はＣＤ８^＋Ｔ細胞において消耗促進因子を抑制してＢｃｌ６を誘導し、これにより幹細胞様の自己再生を促進する。そこで、ＭＣ３８腫瘍において、電子的にゲーティングされたＣＤ８^＋ＴＩＬのＣＸＣＲ５^－及びＣＸＣＲ５^＋サブセットにおいて、ＴＣＦ１発現が分析された。図１２は、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＴＣＦ１は、未治療マウスの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）で優位を占めるＣＸＣＲ５^－ＣＤ８^＋細胞と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}で治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスで増加しているＣＸＣＲ５^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬにおいて発現上昇されることが分かった。

【0229】

実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与は回腸のバイエル板におけるＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞のうちＣＸＣＲ５ ^＋ 細胞の増加をもたらす。
次に、Ｔ細胞を介した免疫応答が腸内生態系により調節されるので、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与が、小腸のパイエル板（ＰＰ）のＣＸＣＲ５^＋ＣＤ８^＋細胞に影響を与えるかどうかを調査した。パイエル板（ＰＰ）が回腸粘膜内の二次リンパ器官であり、Ｔ細胞依存性ＩｇＡ応答の起点となる。ＰＰに局在するほとんどのリンパ球は胚中心（ＧＣ）に存在し、そこで、濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞はＢ細胞と相互作用してＢ細胞の増殖、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）誘導とその結果としてＩｇクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）、体細胞超変異（ＳＨＭ）、及び親和性成熟を促す（Ｃｒｏｔｔｙ， Ｓ． （２０１１）． Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｈｅｌｐｅｒ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ （ＴＦＨ）． Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２９， ６２１－６６３）。パイエル板（ＰＰ）におけるＴｆｈ細胞がＧＣ反応及びＩｇＡ親和性成熟に必須であるため、Ｔｆｈ細胞は、腸内微生物群の構成及び機能のモジュレーションに重要な役割を果たす（Ｋａｗａｍｏｔｏ， Ｓ．， Ｍａｒｕｙａ， Ｍ．， Ｋａｔｏ， Ｌ．Ｍ．， Ｓｕｄａ， Ｗ．， Ａｔａｒａｓｈｉ， Ｋ．， Ｄｏｉ， Ｙ．， Ｔｓｕｔｓｕｉ， Ｙ．， Ｑｉｎ， Ｈ．， Ｈｏｎｄａ， Ｋ．， Ｏｋａｄａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ｆｏｘｐ３（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１， １５２－１６５）。

【0230】

この目的のため、実施例３のマウスのＰＰは消化され、白血球が濃縮され、概ね腫瘍性組織について実施例６で記載したように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析した。

【0231】

結果を図１３に示す。腫瘍組織と同様、ＣＸＣＲ５^＋ＣＤ８^＋細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}と組み合わされた抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウスのパイエル板（ＰＰ）において増加した。一方、抗ＰＤ－Ｌ１をアピラーゼの機能喪失変異体を発現する細菌と併用して治療したマウスと細菌なしに抗ＰＤ－Ｌ１が投与されたマウスでは、この細胞群の量はほぼ同等であった。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}と組み合わされた抗ＰＤ－Ｌ１の投与が、回腸パイエル板におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞のうち、ＣＸＣＲ５^＋細胞の増加をもたらすことを示す。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明者はアピラーゼが仲介する腸内生態系の調整が、細菌叢由来抗原によって常に刺激を受けている局所二次リンパ器官におけるＣＸＣＲ５^＋ＣＤ８^＋細胞の誘導をもたらしたと考える。

【0232】

図１４に示されるように、異なる動物のパイエル板（ＰＰ）におけるＣＸＣＲ５^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はコントロールプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示した。また、フローサイトメトリーによる、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の形質膜内のＣＸＣＲ５の発現レベルの分析は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}と組み合わされた抗ＰＤ－Ｌ１を用いて治療されたマウスのパイエル板（ＰＰ）から分離された細胞において、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の顕著な上昇を明らかにした。これは、パイエル板（ＰＰ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞において、アピラーゼがＣＸＣＲ５タンパク質発現のポジティブな制御を行うことを示している。

【0233】

実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 投与がＣＤ８ ^＋ ＴＩＬのうちＩＣＯＳ ^＋ 細胞の増加をもたらす。
実施例６において記載されたように、電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋ＴＩＬのフローサイトメトリーによりＩＣＯＳ発現が分析された。

【0234】

結果を図１５に示す。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せにより治療されたマウスから切除されたＭＣ３８腫瘍から分離されたＴＩＬは、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウスと比較し、電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋ＴＩＬにおけるＩＣＯＳ^＋細胞の増加を示した。

【0235】

図１６に示されるように、異なる動物の腫瘍におけるＩＣＯＳ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬの頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいてこれら細胞の顕著な増加を示した。

【0236】

実施例９：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与がＣＤ８ ^＋ ＴＩＬのうちＩＦＮ－γ分泌細胞及びＩＬ－２１分泌細胞の増加をもたらす
次に、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}により増強された抗ＰＤ－Ｌ１の投与に対する応答性が、ＩＦＮ－γの分泌増加に関連するものであるのか、又はＣＤ８^＋ＴＩＬによるＩＬ－２１の産生増加に関連するものであるのかが検討された。このため、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスのＣＤ８^＋ＴＩＬにおけるＩＦＮ－γ及びＩＬ－２１の分泌が、概ね実施例６に記載されているように分析された。ＩＬ－２１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＦＮ－γ（ＰｅＣｙ７標識、クローン：ＸＭＧ１．２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の細胞内染色のため、腫瘍浸潤細胞は、イオノマイシン（７５０ｎｇ／ｍｌ）及びＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地で３７℃で５時間培養された。最後の４時間、モネンシン（１０００Ｘの溶液、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を培養物に加えた。ＩＬ－２１は、組換えマウスＩＬ－２１Ｒサブユニット／ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とＡＦ４８８に結合したヤギ抗ヒトＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とを用いて検出された。

【0237】

分析の結果を図１７に示す。ＭＣ３８腫瘍を有し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}と組み合わされた抗ＰＤ－Ｌ１により治療されたマウスのＣＤ８^＋ＴＩＬにおけるＩＦＮ－γ分泌の分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウスと比較し、ＩＦＮ－γ分泌細胞の頻度の向上を明らかにした。図１８に示されるように、異なる動物の腫瘍におけるＩＦＮ－γ分泌ＣＤ８^＋ＴＩＬの頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１で治療され、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が経管投与されたマウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示した。

【0238】

ＩＬ－２１分析の結果を図１９に示す。驚くべきことに、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の毎日の経管投与と組み合わされた抗ＰＤ－Ｌ１の投与は、ＣＤ８^＋ＴＩＬのうちＩＬ－２１分泌細胞の頻度の顕著な増加をもたらした。図２０に示されるように、異なる動物の腫瘍におけるＩＬ－２１分泌ＣＤ８^＋ＴＩＬの頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいてこれら細胞の有意な増加を示した。

【0239】

実施例１０：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与が回腸パイエル板から分離されたＣＤ８ ^＋ 細胞のうちＩＬ－２１分泌細胞の増加をもたらす。
次に、Ｔ細胞を仲介した免疫応答が腸内生態系により調整された小腸のパイエル板（ＰＰ）におけるＩＬ－２１分泌細胞にＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}投与が影響を与えるかどうか調査した。

【0240】

結果を図２１に示す。腫瘍組織と同様、ＩＬ－２１分泌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}と組み合わされた抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウスのパイエル板（ＰＰ）において増加した。一方、抗ＰＤ－Ｌ１をアピラーゼの機能喪失変異体を発現する細菌と併用して治療したマウスにおける存在比、及び細菌なしに抗ＰＤ－Ｌ１が投与されたマウスにおける存在比は同等のものであった。これは、アピラーゼを仲介した細菌叢のコンディショニングがＩＬ－２１分泌細胞の誘導をもたらすことを示す。

【0241】

図２２に示されるように、異なる動物のパイエル板（ＰＰ）におけるＩＬ－２１分泌ＣＤ８^＋細胞の頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１で治療されＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}を経管投与されたマウスにおいてこれら細胞の顕著な増加を示した。

【0242】

実施例１１：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与がＣＤ３ ^－ 腫瘍浸潤細胞のうち樹状細胞の増加をもたらす。
腫瘍細胞を認識し、死滅させるエフェクターＴ細胞の生成には、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）が必要である。樹状細胞（ＤＣ）は、最も有力なＡＰＣであり、腫瘍抗原を取り込み、処理し、提示して腫瘍特異Ｔ細胞を活性化する。ＭＨＣ－ＩＩのアップレギュレーションは、有力な殺腫瘍性Ｔ細胞応答の発生に寄与する。そこで、樹状細胞（ＤＣ）を、実施例６に記載のように、フローサイトメトリーにより、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのＭＣ３８腫瘍を浸潤するＣＤ３^－細胞から、ＣＤ１１ｃ及びＭＨＣＩＩを用いて識別した。

【0243】

結果を図２３に示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのＭＣ３８腫瘍を浸潤するＣＤ３細胞のうちＣＤ１１ｃ及びＭＨＣＩＩにより識別された樹状細胞（ＤＣ）の分析では、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}ではなくＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わされた時に、ＭＨＣＩＩを高発現する樹状細胞（ＤＣ）が堅調に増加することが明らかとなり、アピラーゼが腫瘍の樹状細胞（ＤＣ）浸潤にポジティブな影響を与えたことを示した。

【0244】

図２４に示されるように、異なる動物のＭＣ３８腫瘍を浸潤する樹状細胞（ＤＣ）の頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１で治療されＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}を経管投与されたマウスにおいてこれら細胞の有意な増加を示した。

【0245】

ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ－ＩＩ、及びＣＤ１０３の発現により特徴付けられるｃＤＣ１移動性ＤＣサブセットは、腫瘍に対する細胞性免疫を誘起する。したがって、樹状細胞（ＤＣ）のサブセットを、実施例６に記載されたように、フローサイトメトリーにより更に解析した。

【0246】

結果を図２５に示す。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わされた際と比較し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}が抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わされた際、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}はＣＤ１０３^＋ＣＤ７０^＋ＤＣのＭＣ３８腫瘍への浸潤を増強し、よって、ＩＣＢ療法の効能を向上した。

【0247】

図２６に示されるように、異なる動物のＭＣ３８腫瘍を浸潤するＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣＩＩ^＋ＤＣのうち、ＣＤ１０３^＋ＣＤ７０^＋細胞の頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示した。

【0248】

実施例１２：ＣＡＲ Ｔ細胞療法に実験モデルにおける免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍効果の増強
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、腫瘍細胞に直接養子移入されるＴ細胞を標的とし、効果的及び強固な抗腫瘍応答を提供する（Ｊｕｎｅ， Ｃ．Ｈ．， Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｒ．Ｓ．， Ｋａｗａｌｅｋａｒ， Ｏ．Ｕ．， Ｇｈａｓｓｅｍｉ， Ｓ．， ａｎｄ Ｍｉｌｏｎｅ， Ｍ．Ｃ． （２０１８）． ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９， １３６１－１３６５）。ＣＡＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現とは独立して、移入された細胞に細胞表面抗原への高い結合親和性を付与し、強固なＴ細胞活性及び抗腫瘍応答を始動させる（Ｓａｄｅｌａｉｎ， Ｍ．， Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ， Ｒ．， ａｎｄ Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． （２０１３）． Ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ３， ３８８－３９８）。この治療は、化学療法に応答しない血液悪性腫瘍を患う患者に良好な成績を収めている（Ｐａｒｋ， Ｊ．Ｈ．， Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ．， Ｇｏｎｅｎ， Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｘ．， Ｓｅｎｅｃｈａｌ， Ｂ．， Ｃｕｒｒａｎ， Ｋ．Ｊ．， Ｓａｕｔｅｒ， Ｃ．， Ｗａｎｇ， Ｙ．， Ｓａｎｔｏｍａｓｓｏ， Ｂ．， Ｍｅａｄ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｏｆ ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７８， ４４９－４５９； Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｓ．Ｊ．， Ｓｖｏｂｏｄａ， Ｊ．， Ｃｈｏｎｇ， Ｅ．Ａ．， Ｎａｓｔａ， Ｓ．Ｄ．， Ｍａｔｏ， Ａ．Ｒ．， Ａｎａｋ， Ｏ．， Ｂｒｏｇｄｏｎ， Ｊ．Ｌ．， Ｐｒｕｔｅａｎｕ－Ｍａｌｉｎｉｃｉ， Ｉ．， Ｂｈｏｊ， Ｖ．， Ｌａｎｄｓｂｕｒｇ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７， ２５４５－２５５４）。しかし、ＣＡＲＴ細胞療法は、固形腫瘍にはそれ程効果的に適用することができなかった。

【0249】

固形腫瘍へのＣＡＲ Ｔ細胞療法の成功を制限する要因としては、腫瘍への限られた輸送、及びＴＭＥの免疫抑制機能による移入された細胞の機能の存続が挙げられる。したがって、ＣＡＲ Ｔ細胞自身により外部から持ち込まれた又は産生された免疫チェックポイント阻害剤との組合せは、ＴＭＥにおける炎症誘起現象を促進することによりこれらの要因に対抗すると考えられる（Ｇｒｏｓｓｅｒ， Ｒ．， Ｃｈｅｒｋａｓｓｋｙ， Ｌ．， Ｃｈｉｎｔａｌａ， Ｎ．， ａｎｄ Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ， Ｐ．Ｓ． （２０１９）． Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３６， ４７１－４８２）。前臨床試験では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法と免疫チェックポイント阻害剤との組合せが、それぞれの薬剤単独による治療よりも効能が高いことを示しており、よって、患者へのこの方針の適用が支持される（（Ｃｈｅｒｋａｓｓｋｙ， Ｌ．， Ｍｏｒｅｌｌｏ， Ａ．， Ｖｉｌｌｅｎａ－Ｖａｒｇａｓ， Ｊ．， Ｆｅｎｇ， Ｙ．， Ｄｉｍｉｔｒｏｖ， Ｄ．Ｓ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｄ．Ｒ．， Ｓａｄｅｌａｉｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ， Ｐ．Ｓ． （２０１６）． Ｈｕｍａｎ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ－ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ＰＤ－１ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｒｅｓｉｓｔ ｔｕｍｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６， ３１３０－３１４４； Ｈｕ， Ｗ．， Ｚｉ， Ｚ．， Ｊｉｎ， Ｙ．， Ｌｉ， Ｇ．， Ｓｈａｏ， Ｋ．， Ｃａｉ， Ｑ．， Ｍａ， Ｘ．， ａｎｄ Ｗｅｉ， Ｆ． （２０１９）． ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＤ－１ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６８， ３６５－３７７； Ｊｏｈｎ， Ｌ．Ｂ．， Ｄｅｖａｕｄ， Ｃ．， Ｄｕｏｎｇ， Ｃ．Ｐ．， Ｙｏｎｇ， Ｃ．Ｓ．， Ｂｅａｖｉｓ， Ｐ．Ａ．， Ｈａｙｎｅｓ， Ｎ．Ｍ．， Ｃｈｏｗ， Ｍ．Ｔ．， Ｓｍｙｔｈ， Ｍ．Ｊ．， Ｋｅｒｓｈａｗ， Ｍ．Ｈ．， ａｎｄ Ｄａｒｃｙ， Ｐ．Ｋ． （２０１３）． Ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９， ５６３６－５６４６； Ｓｔｒｏｍｅ， Ｓ．Ｅ．， Ｄｏｎｇ， Ｈ．， Ｔａｍｕｒａ， Ｈ．， Ｖｏｓｓ， Ｓ．Ｇ．， Ｆｌｉｅｓ， Ｄ．Ｂ．， Ｔａｍａｄａ， Ｋ．， Ｓａｌｏｍａｏ， Ｄ．， Ｃｈｅｖｉｌｌｅ， Ｊ．， Ｈｉｒａｎｏ， Ｆ．， Ｌｉｎ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （２００３）． Ｂ７－Ｈ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｕｇｍｅｎｔｓ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３， ６５０１－６５０５）。

【0250】

この観点から、ＣＡＲ Ｔ細胞療法と、免疫チェックポイント阻害剤及びアピラーゼ（を発現する細菌）との組合せが抗腫瘍効果を更に増加させるか調査した。このため、ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞はオボアルブミン（ＭＣ３８－ＯＶＡ）でトランスフェクションされ、０日目に、１×１０^６のＯＶＡ発現ＭＣ３８細胞がＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植された。８日目に、８×１０^５のＯＴ－Ｉ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞（類遺伝子的にマークされたＯＴ－Ｉ Ｒａｇ１ ^－／－ＣＤ８^＋細胞であって、Ｈ－２Ｋ^ｂ制限ＯＶＡペプチド２５７－２６４に特異的なトランスジェニックＴＣＲを発現し、二重変異ＯＴ－Ｉ Ｒａｇ１^－／－マウスの脾臓及びリンパ節から分離された）がマウスに静脈内接種された。１０日目、１４日目、１７日目、及び２０日目に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１００μｇ／１００μｌ）をマウスに腹腔内接種し、８日目から実験終了まで毎日１×１０^１０のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又はリン酸緩衝生理食塩水をマウスに経管投与した。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0251】

結果を図２７に示す。驚くべきことに、（ＯＴ－Ｉ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞及びチェックポイント阻害剤に加えて）リン酸緩衝生理食塩水で治療されたマウス群と比較し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}を経管投与されたマウスにおいて腫瘍成長の有意な減弱が観察された。したがって、アピラーゼ（を発現する細菌）の投与は、ＣＡＲＴ細胞を用いた治療アプローチ、又はインビトロで拡大した腫瘍浸潤Ｔ細胞の注入を再現する実験モデルである、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が養子移入されたマウスにおいて、チェックポイント阻害剤の治療効果を有意に増進させた。

【0252】

実施例１３：アピラーゼを発現する細菌は結腸直腸腺癌の抗ＣＴＬＡ４療法を向上する。
異なる免疫チェックポイント阻害剤と組合せたアピラーゼを発現する細菌（実施例１に記載のようにして得られた）の投与の効果を調査するため、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞がＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植された。

【0253】

異なる腫瘍細胞（ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞）及び異なる免疫チェックポイント阻害剤（抗ＣＴＬＡ４）が用いられたという相違以外は、概ね実施例２に記載されているように実験が行われた。簡潔には、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに１×１０^６細胞／１００μｌ（０日目）で皮下移植された。

【0254】

実施例２と同様に、抗ＣＴＬＡ４の腹腔内投与と組み合わせて、アピラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）をマウスに経口経管投与した。８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（クローン：９Ｈ１０；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）をマウスに腹腔内接種した。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0255】

結果を図２８に示す。実施例２と同様、抗ＰＤ－Ｌ１単独で治療されたマウス群と比較し、チェックポイント阻害剤（抗ＣＴＬＡ４）とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて腫瘍成長の有意な減弱が示された。マウスの生存率が図２９に示される。ＭＣ３８腫瘍生着後のマウスの生存期間の分析により、抗ＣＴＬＡ４単独で治療されたマウス群と比較し、抗ＣＴＬＡ４とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて生存期間が有意に延長したことが明らかとなり、よって、アピラーゼを発現する細菌の投与が免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療の効能を向上することが確認された。

【0256】

実施例１４：アピラーゼを発現する細菌は抗ＰＤ－Ｌ１と抗ＣＴＬＡ４免疫チェックポイント阻害剤との組合せを用いた結腸直腸腺癌の治療を向上する。
２つの免疫チェックポイント阻害剤と組合せたアピラーゼを発現する細菌の投与の効果を調査するため、結腸直腸腺癌ＭＣ３８がＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植された。

【0257】

異なる２つの免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４）が同時に投与され、ＭＣ３８結腸直腸腺癌細胞が用いられた相違以外は、概ね実施例２に記載されているように実験が行われた。簡潔には、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに１×１０^６細胞／１００μｌ（０日目）で皮下移植された。

【0258】

実施例２と同様に、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４の腹腔内投与と組み合わせて、アピラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）をマウスに経口経管投与した。８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、抗ＰＤ－Ｌ１（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）及び抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（クローン：９Ｈ１０；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）をマウスに腹腔内接種した。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0259】

結果を図３０に示す。実施例２と同様、細菌無しで抗ＰＤ－Ｌ１とＣＴＬＡ４との組合せで治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ４ａとＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて腫瘍成長の有意な減弱が観察された。マウスの生存率が図３１に示される。ＭＣ３８腫瘍生着後のマウスの生存の分析により、細菌無しで抗体により治療されたマウス群と比較し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}と共に抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４の組合せで治療されたマウスにおいて生存期間が有意に延長したことが明らかとなり、よって、アピラーゼを発現する細菌の投与が免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療の効能を向上することが確認された。

【0260】

実施例１５：アピラーゼを発現する細菌はＢａｌｂ／ｃマウスにおける結腸直腸腺癌の抗ＰＤ－Ｌ１療法を向上する。
異なるマウス系統の腫瘍モデルにおける免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされたアピラーゼを発現する細菌の投与の効果を調査するため、結腸直腸腺癌ＣＴ２６細胞がＢａｌｂ／ｃマウスに皮下移植された。

【0261】

異なるマウス系統及び同系の腫瘍細胞が用いられた違い以外は、概ね実施例２に記載されているように実験が行われた。簡潔には、結腸直腸腺癌ＣＴ２６細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに１×１０^６細胞／１００μｌ（０日目）で皮下移植された。

【0262】

実施例２と同様に、抗ＰＤ－Ｌ１の腹腔内投与と組み合わせて、アピラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）又は空ベクターを有する形質転換体（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}）をマウスに経口経管投与した。８日目、１１日目、１４日目、及び１８日目に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）をマウスに腹腔内接種した。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0263】

結果を図３２に示す。実施例２と同様、抗ＰＤ－Ｌ１単独で又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}との組合せで治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せにより治療されたマウスにおいて腫瘍成長の有意な減弱が観察された。マウスの生存率が図３３に示される。ＣＴ２６腫瘍生着後のマウスの生存期間の分析により、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}と組み合わせて抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて、生存期間が有意に延長したことが明らかとなり、よって、アピラーゼを発現する細菌の投与が免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療の効能を向上することが確認された。

【0264】

実施例１６：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与がＣＤ８ ^＋ ＴＩＬのうちＣＣＲ９ ^＋ 細胞の増加をもたらす。
Ｔ細胞の移動性表現型は、腫瘍に対する免疫監視機構に寄与する。ＣＤ８^＋ＣＣＲ９^＋細胞の高い頻度は、メラノーマ患者及び自然発生メラノーマを有するマウスにおける全生存期間の延長と相関している。この結果と一致して、排他的ＣＣＲ９リガンドであるケモカインＣＣＬ２５の中和が腫瘍の増殖を促進した（Ｊａｃｑｕｅｌｏｔ， Ｎ．， Ｅｎｏｔ， Ｄ． Ｐ．， Ｆｌａｍｅｎｔ， Ｃ．， Ｖｉｍｏｎｄ， Ｎ．， Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｃ．， Ｐｉｔｔ， Ｊ． Ｍ．， Ｙａｍａｚａｋｉ， Ｔ．， Ｒｏｂｅｒｔｉ， Ｍ． Ｐ．， Ｄａｉｌｌｅｒｅ， Ｒ．， Ｖｅｔｉｚｏｕ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． ２０１６． Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｍｉｒｒｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， １２６， ９２１）。ＣＣＬ２５の腫瘍内伝達により誘起されたＣＤ８^＋ＣＣＲ９^＋Ｔ細胞の活性増強およびリクルートメントは、抗腫瘍免疫を誘導した（Ｃｈｅｎ， Ｈ．， Ｃｏｎｇ， Ｘ．， Ｗｕ， Ｃ．， Ｗｕ， Ｘ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｍａｏ， Ｋ．， Ｌｉ， Ｊ．， Ｚｈｕ， Ｇ．， Ｌｉｕ， Ｆ．， Ｍｅｎｇ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． ２０２０． Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＣＬ２５ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ＣＣＲ９^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ６， ｅａａｘ４６９０）。

【0265】

この観点から、ＣＣＲ９発現は、実施例６に記載されているように、電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋ＴＩＬをフローサイトメトリーにより分析した。結果を図３４に示す。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１と、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せにより治療されたマウスから切除されたＭＣ３８腫瘍から分離されたＴＩＬは、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}との組合せで治療されたマウスと比較し、電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＣＣＲ９^＋細胞の増加を示した。図３４に示されるように、異なる動物に由来する腫瘍におけるＣＣＲ９^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬの頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示した。

【0266】

実施例１７：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与が回腸パイエル板におけるＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞のうちＫｉ－６７ ^＋ 細胞の増加をもたらす。
ＣＤ８^＋ＣＣＲ９^＋細胞は、腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）で生成され、選択的に小腸上皮に存在する。

【0267】

Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}投与が、小腸のパイエル板（ＰＰ）におけるＣＤ８^＋細胞の増殖に影響を与えるかどうか検討するため、その増殖活性を調査した。細胞増殖に厳密に関連した核タンパク質Ｋｉ－６７が染色された、電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋細胞をフローサイトメトリーにより分析した。結果を図３５に示す。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスから採取されたパイエル板（ＰＰ）から分離されたＣＤ８^＋細胞は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}との組合せで治療されたマウスと比較し、電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋Ｔ細胞の中の、Ｋｉ－６７^＋細胞の増加を示した。図３５に示されるように、異なる動物に由来するパイエル板（ＰＰ）におけるＫｉ－６７^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示した。

【0268】

実施例１８：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与が回腸パイエル板におけるＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞のうちＴ－ｂｅｔ ^＋ 細胞の増加をもたらす。
ＣＤ８^＋Ｔ細胞の生成及び機能は、Ｔ－ｂｏｘ転写因子Ｔ－ｂｅｔ（Ｔｂｘ２１）に依存している（Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｂ． Ｍ．， Ｊｕｅｄｅｓ， Ａ．， Ｓｚａｂｏ， Ｓ． Ｊ．， ｖｏｎ Ｈｅｒｒａｔｈ， Ｍ．， ａｎｄ Ｇｌｉｍｃｈｅｒ， Ｌ． Ｈ． ２００３． Ａｎｔｉｇｅｎ－ｄｒｉｖｅｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｔ－ｂｅｔ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １００， １５８１８）。チェックポイント阻害処置中の効果的な抗腫瘍応答は、ＩＦＮ－γ産生およびＴＩＬの細胞傷害性に必要なＴ－ｂｅｔ誘導に依存している（Ｂｅｒｒｉｅｎ－Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｍ． Ｍ．， Ｙｕａｎ， Ｊ．， Ｓｗｉｅｒ， Ｌ． Ｅ．， Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｓ． Ｒ．， Ｃｈｅｎ， Ｃ． Ｌ．， Ｄｏｎｌｉｎ， Ｍ． Ｊ．， ａｎｄ Ｔｅａｇｕｅ， Ｒ． Ｍ． ２０１５． Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｌｉｅｓ ｏｎ Ｔ－ｂｅｔ ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｅｏｍｅｓ ｔｏ Ｉｎｄｕｃｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ８^＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３， １１６）。

【0269】

この観点から、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}投与が、小腸パイエル板（ＰＰ）ＣＤ８^＋細胞におけるＴ－ｂｅｔ発現に影響を与えるか調査を行った。Ｔ－ｂｅｔが染色された、電子的にゲーティングされたＣＤ８^＋細胞は、フローサイトメトリーにより分析された。結果を図３６に示す。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１と、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスから採取されたパイエル板（ＰＰ）から分離されたＣＤ８^＋細胞は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}との組合せで治療されたマウスと比較し、電子的にゲーティングされたＣＤ８^＋Ｔ細胞中の、Ｔ－ｂｅｔ^＋細胞の増加を示した。図３６に示されるように、異なる動物に由来するパイエル板（ＰＰ）におけるＴ－ｂｅｔ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１単独又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}と組み合わせて治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示した。

【0270】

実施例１９：アピラーゼを発現するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの設計及び産生
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＺ９００株における赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）アピラーゼの発現のため、アピラーゼをコードするｐｈｏＮ２遺伝子は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉゲノムからＰＣＲ増幅され、ｐＮＺ８１２３プラスミド中にクローニングされ、ｐＮＺ－Ａｐｙｒプラスミドを生成した（図３７）。ｐＮＺ－Ａｐｙｒプラスミドにおけるアピラーゼの発現は、ナイシン抗菌ペプチドによって誘導されるＰ_ｎｉｓＡプロモーターによって制御される。ｐｈｏＮ２遺伝子は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの主要分泌タンパク質Ｕｓｐ４５のシグナル配列と共にインフレームにクローニングされ、アピラーゼの分泌を可能としている。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ及びＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ}株は、グルコース（０．５％ｗ／ｖ）とナイシン（４ｎｇ／ｍｌ）を添加したＭ１７培地で培養された。

【0271】

実施例２０：アピラーゼを発現するラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目のプロバイオティクス細菌は結腸直腸腺癌の抗ＰＤ－Ｌ１療法を向上する。
免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされた際の、回腸にアピラーゼを運搬する異なるプロバイオティクス細菌の投与の効果を調査するため、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞がＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植され、マウスは続いてアピラーゼを発現する又は発現しないＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ株Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを経管投与された。

【0272】

実施例１９に記載されたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓが用いられた違い以外は、概ね実施例２に記載されているように実験が行われた。簡潔には、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＣ５７ＢＩ／６マウスに１×１０^６細胞／１００ｍｌ（０日目）で皮下移植された。空ベクターを有するＬ．ｌａｃｔｉｓ形質転換体（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ）又はアピラーゼを発現するＬ．ｌａｃｔｉｓ（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ}）は、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）、グルコース（０．５％ｗ／ｖ）、及びナイシン（４ｎｇ／ｍｌ）を添加したＭ１７培地で増殖された。

【0273】

実施例２と同様に、抗ＰＤ－Ｌ１の腹腔内投与と組み合わせて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ又はＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ}をマウスに経口経管投与した。８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）をマウスに腹腔内接種した。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ又はＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ}（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0274】

結果を図３８に示す。実施例２と同様、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺと組合せた抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて腫瘍成長の有意な減弱が観察された。

【0275】

実施例２１：ゲノム中にアピラーゼ遺伝子を組み込んだ、アピラーゼを異種発現する組換え細菌（ＥｃＮ：：ｐｈｏｎ２）の生成
実施例１及び実施例１９に記載のように設計及び生成されたアピラーゼ発現細菌は、アピラーゼを発現するプラスミドで細菌を形質転換することにより得られた。かかるプラスミドは、形質転換体の選択のため、抗菌耐性を有していてもよい。このような形質転換体である細菌は、通常、アピラーゼを発現するプラスミドの複数のコピーを有する（抗生物質耐性のために選択されてもよい）。異種のアピラーゼをコードする組換え細菌において、染色体外プラスミドの複数コピーではなく、ゲノム中の単一コピーで同様の効果が得られるかどうかを調べるために、（非伝達性）細菌染色体（抗生物質耐性無し）に、（異種）アピラーゼ（ｐｈｏＮ２）遺伝子の単一コピーを有する細菌を生成した。

【0276】

このため、ＥｃＮゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ００７７９９．１）への赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｐｈｏＮ２アピラーゼコード遺伝子の染色体組み込みが、λ Ｒｅｄ組換えのアプローチ（λ Ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ）により行われた（Ｄａｔｓｅｎｋｏ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ Ｂ．Ｌ． ２０００ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９７， ６６４０）。

【0277】

図３９は組み換えに用いられるＤＮＡ断片を概略的に示しており、前記ＤＮＡ断片は下記のものを含む：
・マルトデキストリンホスホリラーゼ酵素をコードするＥｃＮ ｍａｌＰ遺伝子の一部；
・抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を与えるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするＥ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子と、それに隣接するフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）配列；
・上流ではＰ_ｐｒｏＤ合成プロモーター（Ｄａｖｉｓ Ｊ．Ｈ．， Ｒｕｂｉｎ Ａ．Ｊ． ａｎｄ Ｓａｕｅｒ Ｒ．Ｔ． ２０１１ Ｄｅｓｉｇｎ， ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９， １１３１）及びＢＢａ＿ＢＢ００３２リボソーム結合部位（ＲＢＳ； ｉＧＥＭ Ｐａｒｔｓ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）と融合され、下流ではｐｈｏＮ２転写ターミネーターと融合されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２アピラーゼコード遺伝子；
・マルトース及びマルトデキストリンオペロンの転写活性化因子をコードするＥｃＮ ｍａｌＴ遺伝子の一部。

【0278】

図４０及び４１は、それぞれ、ＥｃＮ ｍａｌＰ及びｍａｌＴ遺伝子部分のヌクレオチド配列を示す（それぞれ、配列番号４及び配列番号５）。図４２は、Ｐ_ｐｒｏＤプロモーター、ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子、及びｐｈｏＮ２転写ターミネーターを含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す（配列番号６）。図４３は、ＦＲＴ配列が隣接したＥ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す（配列番号７）。

【0279】

ＥｃＮゲノムにおいて遺伝子組み換えを行うため、挿入ＤＮＡ断片は、ｐＫＤ４６プラスミドを有するＥｃＮ株において形質転換され、前記ｐＫＤ４６プラスミドはファージλ Ｒｅｄリコンビナーゼを発現するものである。ｍａｌＰ及びｍａｌＴ部位におけるλ Ｒｅｄ仲介相同組換えは、ＥｃＮのｍａｌＰ－ｍａｌＴ遺伝子間領域への挿入ＤＮＡ断片の組み込みを促進した。ｐＫＤ４６除去後、ゲノムに前記挿入ＤＮＡ断片を有するＥｃＮクローンは、クロラムフェニコール耐性の点から選択され、ゲノムにおいて正しい組み込みが行われたかＰＣＲで確認された。ＤＮＡ断片の正しい組み込みの点から選択されたＥｃＮクローンは、酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ（フリッパーゼ）を発現するｐＣＰ２０プラスミドで形質転換され、ゲノムからクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。ｐＣＰ２０の除去後、ゲノムにクロラムフェニコールカセットを含まない組換えＥｃＮクローンは、クロラムフェニコール感受性の点から選択され、ゲノムから正しくカセットが切除されているかＰＣＲで確認された。上述により得られた、ｍａｌＰ－ｍａｌＴ遺伝子間領域にＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子を有する組換えＥｃＮクローンはＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２と命名された。図４４は、得られたＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２クローンのｍａｌＰ－ｐｈｏＮ２－ｍａｌＴ組換えゲノム領域を概略的に示す。図４５は、ペリプラズム抽出物のウェスタンブロットにおける、選択された１つＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２クローン（ｃｌ １）でのアピラーゼの発現を示す。また、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２ ｃｌ １における酵素の活性が確認された。図４６は、インビトロＡＴＰ－分解アッセイにおける、ペリプラズム抽出物による用量依存のＡＴＰ分解を示す。両アッセイにおいて、ＥｃＮ野生型株（ＥｃＮ）はネガティブコントロールとして用いられた。ＥｃＮ野生型及びＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２細菌株はＬＢ培地で培養された。

【0280】

実施例２２：異種発現のためのゲノムにアピラーゼをコードする組換え細菌は結腸直腸腺癌の抗ＰＤ－Ｌ１療法を向上する。
ゲノムに組み込まれたｐｈｏＮ２遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）プロバイオティクス細菌（上述、実施例２１に記載のように得られた）の投与が、免疫チェックポイント阻害剤による腫瘍成長の制御を増強するのに有効であるかを調査するため、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞がＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植され、マウスは続いてＥｃｎ又はＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２株により経管投与された。

【0281】

上述の細菌（実施例２１：ＥｃＮ及びＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２）が用いられたという相違以外は、概ね実施例２に記載されているように実験が行われた。簡潔には、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＣ５７ＢＩ／６マウスに１×１０^６細胞／１００ｍｌ（０日目）で皮下移植された。ＥｃＮ及びＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２はＬＢ培地で増殖された。

【0282】

実施例２と同様に、抗ＰＤ－Ｌ１の腹腔内投与と組み合わせて、Ｅｃｎ又はＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２をマウスに経口経管投与した。８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）をマウスに腹腔内接種した。Ｅｃｎ又はＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0283】

結果を図４７に示す。実施例２と同様、ＥｃＮと組合せた抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２株との組合せで治療されたマウスにおいて腫瘍成長の有意な減弱が観察された。

【0284】

実施例２３：腫瘍抗原（ニワトリオボアルブミン）及びアピラーゼを発現するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株の生成
弱毒サルモネラ血清型ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ΔａｒｏＡ（Ｓ．Ｔｍ）株におけるニワトリオボアルブミンの発現のため、オボアルブミン（ｏｖａ）をコードするｃＤＮＡが、ｐｃＤＮＡ３プラスミドからＰＣＲ増幅され、ｐＢＡＤ１８－Ｋａｎプラスミド中でクローニングされ、ｐＢＡＤ－ＯＶＡプラスミドを生成した（図４８）。アラビノース誘導ｐＢＡＤプロモーターがＳ．Ｔｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}株におけるオボアルブミン発現を制御する。オボアルブミンｃＤＮＡ及びタンパク質配列を、それぞれ、図４９及び５０に示す（それぞれ、配列番号８及配列番号９）。

【0285】

ニワトリオボアルブミン及びＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉのアピラーゼの両者を発現するＳ．Ｔｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}株を生成するため、Ｓ．Ｔｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}株は、ｐＨＮＤ１０プラスミドで形質転換された。Ｓ．Ｔｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}株は、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）及びアラビノース（０．１％ｗ／ｖ）が添加されたＬＢ培地で培養された。Ｓ．Ｔｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}株は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、及びアラビノース（０．１％ｗ／ｖ）が添加されたＬＢ培地で培養された。

【0286】

実施例２４：アピラーゼ及び腫瘍抗原（ＯＶＡ）を発現する細菌による免疫が、抗ＰＤ－Ｌ１療法による結腸直腸腺癌の拒絶をもたらす。
アピラーゼ及び腫瘍抗原（ＯＶＡ）の併せた発現が、腫瘍抗原としてＯＶＡを発現するＳ．Ｔｍの経口免疫により誘起された結腸直腸腺癌の拒絶を増強されるかどうか検討するため、結腸直腸腺癌ＭＣ３８－ＯＶＡ細胞が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植され、マウスは続いて、経口胃経管投与によりＳ．Ｔｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}又はＳ．Ｔｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}で免疫が付与された。

【0287】

結腸直腸腺癌ＭＣ３８－ＯＶＡ細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＣ５７ＢＩ／６マウスに１×１０^６細胞／１００ｍｌ（０日目）で皮下移植された。Ｓ．Ｔｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}株は、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）及びアラビノース（０．１％ｗ／ｖ）が添加されたＬＢ培地で増殖された。Ｓ．Ｔｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}株は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、及びアラビノース（０．１％ｗ／ｖ）が添加されたＬＢ培地で増殖された。腫瘍生着後５日目及び１０日目に、マウスに１×１０^９のＳ．Ｔｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}又はＳ．Ｔｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}で経口経管投与することにより免疫された。腫瘍接種後８日目、１１日目、及び１４日目、マウスは１００μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水を腹腔内投与された。腫瘍の存在は１７日目に確認された。

【0288】

結果を図５１に示す。抗ＰＤ－Ｌ１で治療され、腫瘍抗原のみを発現する細菌（Ｓ．Ｔｍ^{ｐＢＡＤ－ＯＶＡ}）により免疫化されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１により治療され、アピラーゼ及び腫瘍抗原（Ｓ．Ｔｍ^{ｐＡｐｙｒ－ＯＶＡ}）の両方を発現する細菌で免疫されたマウス群において、腫瘍の兆候を示さない動物のパーセンテージの有意な増加が観察された。

【0289】

実施例２５：アピラーゼを発現する細菌が、新たに生成されたＴ細胞の腫瘍浸潤を誘起することにより結腸直腸腺癌の治療を向上する
上述のように、ＣＤ８^＋ＣＣＲ９^＋細胞は、腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）で生成され、選択的に小腸上皮に存在する。抗ＰＤ－Ｌ１と、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}ではなく、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスの腫瘍微小環境におけるＣＤ８^＋ＣＣＲ９^＋細胞の増加（実施例１６；図３４）は、腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）、例えば、パイエル板（ＰＰ）において、殺腫瘍機能を有するこれらの細胞の生成をアピラーゼが促進する可能性を示唆している。フィンゴリモド（ＦＴＹ７２０）は、リンパ器官からＴ細胞の排出を阻止するＳ１Ｐ１受容体の機能性アンタゴニストである（Ｍａｔｌｏｕｂｉａｎ， Ｍ．， Ｌｏ， Ｃ．Ｇ．， Ｃｉｎａｍｏｎ， Ｇ．， Ｌｅｓｎｅｓｋｉ， Ｍ．Ｊ．， Ｘｕ， Ｙ．， Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ， Ｖ．， Ａｌｌｅｎｄｅ， Ｍ．Ｌ．， Ｐｒｏｉａ， Ｒ．Ｌ．， ａｎｄ Ｃｙｓｔｅｒ， Ｊ．Ｇ． ２００４． Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｇｒｅｓｓ ｆｒｏｍ ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎｓ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ Ｓ１Ｐ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １． Ｎａｔｕｒｅ ４２７， ３５５）。そこで、腫瘍に移入し、腫瘍成長を制御することができるＣＤ８^＋ＣＣＲ９^＋細胞のパイエル板（ＰＰ）における生成をアピラーゼが促進しているか検討するため、抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療を開始する１日前、マウスはＦＴＹ７２０で治療され、Ｔ細胞のパイエル板（ＰＰ）からの排出が阻止された。

【0290】

腫瘍生着後７日目から実験終了まで２日毎にＦＴＹ７２０が腹腔内投与されたという違い以外は、概ね実施例３に記載のように実験が行われた。簡潔には、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに１×１０^６細胞／１００μｌ（０日目）で皮下移植された。

【0291】

実施例３と同様に、７日目及びそれから２日毎に、抗ＰＤ－Ｌ１の腹腔内投与と組み合わせて、アピラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）をマウスに経口経管投与し、引き続き１ｍｇ／ｋｇのＦＴＹ７２０の腹腔内接種が行われた、又は行われなかった。８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）をマウスに腹腔内接種した。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0292】

結果を図５２に示す。実施例３と同様、抗ＰＤ－Ｌ１単独で治療されたマウス群と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて腫瘍成長の有意な減弱が観察された。しかし、ＦＴＹ７２０でも治療されたマウス群においては、腫瘍成長におけるＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の有益な効果は消失していた。既報では（Ｃｈｏｗ Ｍ．Ｔ．， Ｏｚｇａ Ａ．Ｊ．， Ｓｅｒｖｉｓ Ｒ．Ｌ．， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｄ．Ｔ．， Ｌｏ Ｊ．Ａ．， Ｆｉｓｈｅｒ Ｄ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ． ２０１９ Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＣＸＣＲ３ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０， １４９８．）、抗ＰＤ－Ｌ１による腫瘍制御は、主に、抗ＰＤ－Ｌ１治療開始前に既に腫瘍微小環境に存在するＴ細胞によって仲介され、新たに生成された細胞傷害性Ｔ細胞には依存しないため、ＦＴＹ７２０の影響は受けなかった。

【0293】

実施例２６：リンパ器官からのＴ細胞排出の遮断が、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} により仲介される、ＣＤ８ ^＋ ＴＩＬ中のＣＣＲ９ ^＋ 及びＩＣＯＳ ^＋ 細胞の増加を阻害する。
抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスの腫瘍微小環境におけるＣＤ８^＋ＣＣＲ９^＋細胞の増加がＧＡＬＴからのＴ細胞の排出に依存するかどうかを検討するため、抗ＰＤ－Ｌ１抗体での治療を開始する１日前、マウスはＦＴＹ７２０で処置によりＧＡＬＴからのＴ細胞の排出が阻止され、実験終了時に腫瘍微小環境におけるＣＤ８^＋ＣＣＲ９^＋細胞をスコア化した。

【0294】

実施例６に記載されたように、電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋ＴＩＬにおいて、フローサイトメトリーによりＣＣＲ９発現を分析した。図５３に示されるように、異なる動物に由来する腫瘍におけるＣＣＲ９^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬの頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウス群と比較し、予想された通り、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示した。しかし、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せに追加してＦＴＹ７２０治療が行われたマウスから摘出されたＭＣ３８腫瘍から分離されたＴＩＬにおいては、この細胞サブセットの有意な増加は消失していた。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}とで治療されたマウスを特徴付ける（図１５）、ＣＤ８^＋ＴＩＬにおける、ＩＣＯＳ発現の増加もまた、ＦＴＹ７２０治療により消失しており、これは、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せがＧＡＬＴにおいて、機能的能力のある細胞傷害性Ｔ細胞の生成を誘起したことを示している。

【0295】

実施例２７：腸へのアピラーゼの細菌伝達が回腸細菌叢のＩｇＡ被覆を強化する。
細菌叢由来ＡＴＰは、ＡＴＰ依存性イオノトロピック受容体Ｐ２Ｘ７を介して小腸のパイエル板におけるＴ細胞依存性ＩｇＡ応答を制限することが示されている。Ｐ２Ｘ７受容体はＴ濾胞性ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞の機能を阻害し、これによりＩｇＡ分泌細胞の増殖を阻害する（Ｐｒｏｉｅｔｔｉ Ｍ， Ｃｏｒｎａｃｃｈｉｏｎｅ Ｖ， Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ Ｊｏｓｔ Ｔ， Ｒｏｍａｇｎａｎｉ Ａ， Ｆａｌｉｔｉ ＣＥ， Ｐｅｒｒｕｚｚａ Ｌ， Ｒｉｇｏｎｉ Ｒ， Ｒａｄａｅｌｌｉ Ｅ， Ｃａｐｒｉｏｌｉ Ｆ， Ｐｒｅｚｉｕｓｏ Ｓ， Ｂｒａｎｎｅｔｔｉ Ｂ， Ｔｈｅｌｅｎ Ｍ， ＭｃＣｏｙ ＫＤ， Ｓｌａｃｋ Ｅ， Ｔｒａｇｇｉａｉ Ｅ， Ｇｒａｓｓｉ Ｆ． ２０１４． ＡＴＰ－ｇａｔｅｄ ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ Ｐ２Ｘ７ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ Ｐｅｙｅｒ’ｓ ｐａｔｃｈｅｓ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｈｏｓｔ－ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｍｕｔｕａｌｉｓｍ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１， ７８９）。この観点から、抗ＰＤ－Ｌ１で治療された、腫瘍を有するマウスにＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}を投与することにより回腸細菌叢のＩｇＡ被覆が増強されるかどうか調査を行った。

【0296】

小腸の内容物を採取し、細菌を遠心分離により分離し、洗浄し、結合されていないＩｇＡを除去した。細菌ペレットは、５％のヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁され、氷上で１５分間インキュベーションされ、遠心分離が行われ、ＡＰＣ結合ラビット抗マウスＩｇＡ抗体（Ｃａｔ．＃：ＳＡＢ１１８６； Ｂｒｏｏｋｗｏｏｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、 Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）で染色するため、１％のＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁された。３０分のインキュベーション後、細菌は２回洗浄され、フローサイトメトリーで分析された。前方及び側方散乱光パラメーターは対数モードで用いられた。細菌サイズ粒子であって、且つ、核酸を含む粒子を識別するため、ＳＹＴＯ ＢＣが添加された。

【0297】

図５４に示されているように、フローサイトメトリー及び統計分析のデータは、抗ＰＤ－Ｌ１と、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}ではなく、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}とで治療されたＭＣ３８腫瘍を有するマウスの回腸におけるＩｇＡで被覆された細菌の顕著な増加を明らかとし、これは、アピラーゼを発現する細菌の投与が回腸細菌叢を認識する分泌型ＩｇＡの産生を促進したことを示している。

【0298】

いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明者は、アピラーゼを発現する細菌無しの抗ＰＤ－Ｌ１の投与ではなく、アピラーゼを発現する細菌と抗ＰＤ－Ｌ１との投与が分泌型のＩｇＡの産生を促進しるとの所見に基づき、アピラーゼ（腸管内腔に存在する）が共生細菌叢より放出されたＡＴＰを加水分解し、これがＴ細胞依存性ＩｇＡ応答を制限すると考える。したがって、アピラーゼは、腫瘍を有するマウスにおける分泌型ＩｇＡ応答を促進し、チェックポイント阻害薬と併用して有益な効果を発揮すると考えられる。

【0299】

実施例２８：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による回腸パイエル板のＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞中のＫｉ－６７ ^＋ 細胞の増加は分泌型ＩｇＡに依存する。
ＭＣ３８腫瘍を有し、抗ＰＤ－Ｌ１により治療されたマウスのパイエル板（ＰＰ）における細胞増殖の分析は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}投与がＣＤ８^＋細胞増加を促進することを示した（図３５）。この現象において分泌型ＩｇＡが重要であるかを検討するため、抗ＰＤ－Ｌ１、又は抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}とで治療された、ＭＣ３８腫瘍を有する野生型又はＩｇＡ ^－／－ マウスのパイエル板でのＫｉ－６７発現を、電子的にゲーティングしたＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞のフローサイトメトリーで分析した。

【0300】

結果を図５５に示す。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１と、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療された野生型マウスから採取されたパイエル板（ＰＰ）から分離され電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋Ｔ細胞中のＫｉ－６７^＋細胞の増加は、ＩｇＡ ^－／－マウスでは消失していた。図５５に示されるように、異なる動物からのパイエル板（ＰＰ）におけるＫｉ－６７^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１のみで治療された対照物と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療された、ＩｇＡ ^－／－マウスではなく、野生型マウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示した。

【0301】

実施例２９：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による回腸パイエル板のＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞中の、Ｔ－ｂｅｔ ^＋ 細胞の増加は分泌型ＩｇＡに依存する。
エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞の生成及び機能はＴ－ｂｏｘ転写因子Ｔ－ｂｅｔ（Ｔｂｘ２１）に依存する（Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｂ． Ｍ．， Ｊｕｅｄｅｓ， Ａ．， Ｓｚａｂｏ， Ｓ． Ｊ．， ｖｏｎ Ｈｅｒｒａｔｈ， Ｍ．， ａｎｄ Ｇｌｉｍｃｈｅｒ， Ｌ． Ｈ． ２００３． Ａｎｔｉｇｅｎ－ｄｒｉｖｅｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｔ－ｂｅｔ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １００， １５８１８）。チェックポイント阻害治療中の有効な抗腫瘍応答は、ＩＦＮ－ｇ産生およびＴＩＬ細胞毒素性に必要なＴ－ｂｅｔに依存する（Ｂｅｒｒｉｅｎ－Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｍ． Ｍ．， Ｙｕａｎ， Ｊ．， Ｓｗｉｅｒ， Ｌ． Ｅ．， Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｓ． Ｒ．， Ｃｈｅｎ， Ｃ． Ｌ．， Ｄｏｎｌｉｎ， Ｍ． Ｊ．， ａｎｄ Ｔｅａｇｕｅ， Ｒ． Ｍ． ２０１５． Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｌｉｅｓ ｏｎ Ｔ－ｂｅｔ ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｅｏｍｅｓ ｔｏ Ｉｎｄｕｃｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ８^＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３， １１６）。図３６に示すように（実施例１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}投与により、ＭＣ３８腫瘍を有し、抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウスのパイエル板におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞中のＴ－ｂｅｔ^＋細胞が増加する。この現象において分泌型ＩｇＡが重要であるかを検討するため、抗ＰＤ－Ｌ１、又は抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}とで治療された、ＭＣ３８腫瘍を有する野生型及びＩｇＡ ^－／－マウスのパイエル板におけるＴ－ｂｅｔ発現を、電子的にゲーティングしたＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋細胞のフローサイトメトリーにより分析した。

【0302】

結果を図５６に示す。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１と、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療された野生型マウスから採取されたパイエル板（ＰＰ）から分離され電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋Ｔ細胞のうちのＴ－ｂｅｔ^＋細胞の増加は、ＩｇＡ ^－／－ マウスでは消失していた。図５６に示されているように、異なる動物からのパイエル板（ＰＰ）におけるＴ－ｂｅｔ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１のみで治療された対照物と比較し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療された野生型マウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示したが、ＩｇＡ ^－／－マウスではそのような結果は得られなかった。

【0303】

実施例３０：ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおけるＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による抗ＰＤ－Ｌ１療法の改善はＩｇＡに依存する。
分泌型ＩｇＡｓは共生細菌叢の組成及び機能を調節するのに重要な役割を果たし、結果として、腸内免疫システムを調節する（Ｗｅｉｓ Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｒｏｕｎｄ Ｊ．Ｌ． ２０２１． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｇｕｔ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ． ２９， ３３４）。ＭＣ３８腫瘍を有し、抗ＰＤ－Ｌ１により治療されたマウスにＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}を投与することにより観察される腫瘍成長の制御の促進において、分泌型ＩｇＡ産生の増強が重要かどうかを検討するため、ＩｇＡ欠損マウスが用いられた。

【0304】

このため、アピラーゼを発現する細菌（実施例１に記載のようにして得られた）を、結腸直腸腺癌ＭＣ３８が皮下移植された野生型及びＣ５７ＢＬ／６マウスに、抗ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与された。

【0305】

概ね実施例３に記載されているように、実験が行われた。簡潔には、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢の野生型又はＩｇＡ ^－／－Ｃ５７ＢＩ／６マウスに１×１０^６細胞／１００ｍｌ（０日目）で皮下移植された。

【0306】

実施例３と同様に、抗ＰＤ－Ｌ１の腹腔内投与と組み合わせて、アピラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）をマウスに経口経管投与した。８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）をマウスに腹腔内接種した。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0307】

結果を図５７に示す。ＩｇＡの欠如は、抗ＰＤ－Ｌ１と組合せたＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与により野生型マウスに付与された腫瘍成長制御の強化の消失をもたらした。抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}とで治療されたＩｇＡ ^－／－マウスは、無治療のマウスと抗ＰＤ－Ｌ１単独で治療されたマウスとを比較したときと同様に、腫瘍サイズの減少がみられ、これは、ＩｇＡの欠如により抗ＰＤ－Ｌ１の治療効果は有意には損なわれないことを示唆している。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}投与により誘起された分泌型ＩｇＡ産生の強化は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の治療効果を増強するのに重要である。

【0308】

実施例３１：ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおける抗ＰＤ－Ｌ１と組合せたＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与による、ＣＤ８ ^＋ ＴＩＬ中のＣＣＲ９ ^＋ 及びＩＣＯＳ ^＋ 細胞の増加はＩｇＡに依存する。
抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せにより治療されたマウスの腫瘍微小環境におけるＣＤ８^＋ＣＣＲ９^＋細胞の増加が、分泌型ＩｇＡ産生増強に依存するかを検討するため、抗ＰＤ－Ｌ１又は、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}とにより治療された、ＭＣ３８腫瘍を有する野生型及びＩｇＡ ^－／－マウスにおけるＴＣＲβ^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＣＣＲ９^＋細胞がスコア化された。

【0309】

実施例６に記載の通り、ＣＣＲ９発現は、電子的にゲーティングしたＣＤ８^＋ＴＩＬにおいてフローサイトメトリーにより分析された。図５８に示されるように、異なる動物からの腫瘍におけるＣＣＲ９^＋ＣＤ８^＋ＴＩＬの頻度の統計分析は、抗ＰＤ－Ｌ１で治療されたマウス群と比較し、予想された通り、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療された野生型マウスにおいて、これら細胞の有意な増加を示した。しかし、ＩｇＡ ^－／－マウスから分離されたＴＩＬにおいて、この細胞サブセットの有意な増加は見受けられなかった。驚くべきことに、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}とで治療されたマウスを特徴付ける（図１５）、ＣＤ８^＋ＴＩＬ中のＩＣＯＳ発現の増加も、また、ＩｇＡが欠損するマウスでは見られなく、これは、腫瘍微小環境を浸潤する機能的に有能な細胞傷害性Ｔ細胞の生成を誘起するのに、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せにより誘起された分泌型ＩｇＡの産生増強が重要であることを示している。

【0310】

実施例３２：回腸におけるＩｇＡ被覆細菌の頻度は、ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有し、抗ＰＤ－Ｌ１により治療されたマウスにおける腫瘍サイズに相関する。
共生細菌叢のＩｇＡ被覆が、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスにおけるＴ細胞の殺腫瘍機能の増強を促進するのに重要であるかを検討するため、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスの回腸におけるＩｇＡ被覆された細菌のパーセンテージと実験エンドポイントでの腫瘍サイズとを関連付けた。

【0311】

図５９は、実施例３に記載のように、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}とで治療された、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおけるこの分析結果を示し、図６０は、実施例２１に記載のように、抗ＰＤ－Ｌ１と、ＥｃＮ又はＥｃｎ：：ｐｈｏＮ２とで治療された、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける同様の分析を示す。いずれの実験設定においても、回腸内のＩｇＡ被覆細菌の頻度と腫瘍のサイズとの間に負の相関が認められ、これは、回腸細菌叢のＩｇＡ被覆が、腫瘍成長を制御する動物の能力に有益な影響を与えたことが示されている。

【0312】

実施例３３：ＭＣ３８結腸直腸腺癌を有するマウスにおけるＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による治療成績の向上はバンコマイシンに対して感受性を有する共生細菌に依存する。
細菌叢の組成は、免疫チェックポイント阻害剤に対する癌患者の応答性を調整するのに重要な役割を果たす。治療応答性を示す患者の糞便の細菌叢の移植は、腸粘膜固有叢及び腫瘍微小環境の両方で免疫細胞浸潤及び遺伝子発現プロファイルにおいて好ましい変化をもたらすことにより、無応答患者を応答性へと転換することができ、これは、腸内細菌叢が、これらバイオ医薬品により誘起された、癌細胞に対する免疫応答を規制するのに重要な役割を果たしていることを示唆している（Ｄａｖａｒ Ｄ， Ｄｚｕｔｓｅｖ ＡＫ， ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ ＪＡ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ＲＲ， Ｃｈａｕｖｉｎ ＪＭ， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＲＭ， Ｄｅｂｌａｓｉｏ ＲＮ， Ｍｅｎｎａ Ｃ， Ｄｉｎｇ Ｑ， Ｐａｇｌｉａｎｏ Ｏ， Ｚｉｄｉ Ｂ， Ｚｈａｎｇ Ｓ， Ｂａｄｇｅｒ ＪＨ， Ｖｅｔｉｚｏｕ Ｍ， Ｃｏｌｅ ＡＭ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＭＲ， Ｐｒｅｓｃｏｔｔ Ｓ， Ｃｏｓｔａ ＲＧＦ， Ｂａｌａｊｉ ＡＫ， Ｍｏｒｇｕｎ Ａ， Ｖｕｊｋｏｖｉｃ－Ｃｖｉｊｉｎ Ｉ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｂｏｒｈａｎｉ ＡＡ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＭＢ， Ｄｕｂｎｅｒ ＨＭ， Ｅｒｎｓｔ ＳＪ， Ｒｏｓｅ Ａ， Ｎａｊｊａｒ ＹＧ， Ｂｅｌｋａｉｄ Ｙ， Ｋｉｒｋｗｏｏｄ ＪＭ， Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ， Ｚａｒｏｕｒ ＨＭ． ２０２１． Ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７１， ５９５． Ｂａｒｕｃｈ ＥＮ， Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒ Ｉ， Ｂｅｎ－Ｂｅｔｚａｌｅｌ Ｇ， Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ Ｒ， Ｌａｈａｔ Ａ， Ｋａｔｚ Ｌ， Ａｄｌｅｒ Ｋ， Ｄｉｃｋ－Ｎｅｃｕｌａ Ｄ， Ｒａｓｋｉｎ Ｓ， Ｂｌｏｃｈ Ｎ， Ｒｏｔｉｎ Ｄ， Ａｎａｆｉ Ｌ， Ａｖｉｖｉ Ｃ， Ｍｅｌｎｉｃｈｅｎｋｏ Ｊ， Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ－Ｓｉｌｍａｎ Ｙ， Ｍａｍｔａｎｉ Ｒ， Ｈａｒａｔｉ Ｈ， Ａｓｈｅｒ Ｎ， Ｓｈａｐｉｒａ－Ｆｒｏｍｍｅｒ Ｒ， Ｂｒｏｓｈ－Ｎｉｓｓｉｍｏｖ Ｔ， Ｅｓｈｅｔ Ｙ， Ｂｅｎ－Ｓｉｍｏｎ Ｓ， Ｚｉｖ Ｏ， Ｋｈａｎ ＭＡＷ， Ａｍｉｔ Ｍ， Ａｊａｍｉ ＮＪ， Ｂａｒｓｈａｃｋ Ｉ， Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ Ｊ， Ｗａｒｇｏ ＪＡ， Ｋｏｒｅｎ Ｏ， Ｍａｒｋｅｌ Ｇ， Ｂｏｕｒｓｉ Ｂ． ２０２１． Ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７１， ６０２）。

【0313】

抗ＰＤ－Ｌ１にＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}を組み合わせることにより誘起される治療の向上が腸内細菌叢に依存するのかを検討するため、抗ＰＤ－Ｌ１単独、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}と、又は抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}とで治療された、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにバンコマイシンを投与し、腸内細菌叢を枯渇させた。

【0314】

結腸直腸腺癌ＭＣ３８が皮下移植されたマウスに、アピラーゼを発現する細菌（実施例１に記載のように得られた）は、抗ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤と組み合わされて投与された。バンコマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）を含む飲料水で１５日間、腫瘍生着前に、マウスを前処置したという違い以外は、概ね実施例３記載されているように実験が行われた。Ｅ．ｃｏｌｉはバンコマイシンに対して耐性があるため、実験終了まで、前記抗生物質は飲料水中に含まれたままで維持した。簡潔には、結腸直腸腺癌ＭＣ３８細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬカナマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ_２中に維持された。腫瘍細胞は、指数関数的に成長した時点で採取され、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに１×１０^６細胞／１００μｌ（０日目）で皮下移植された。

【0315】

実施例３と同様に、抗ＰＤ－Ｌ１の腹腔内投与と組み合わせて、アピラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）又は空プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ形質転換（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}）をマウスに経口経管投与した。８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（クローン：１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（１００μｇ／１００μｌ）をマウスに腹腔内接種した。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}（１×１０^１０ＣＦＵ）は、５日目から実験終了まで毎日、経口胃経管投与により投与された。最大腫瘍直径とその直交線を計測して平均を求めることにより、腫瘍成長をキャリバーでスコア化し、面積を（平均／２）^２πとして計算した。

【0316】

結果を図６１に示す。バンコマイシンの投与は、リン酸緩衝生理食塩水又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}を経管投与されたマウスにおける抗ＰＤ－Ｌ１への応答に影響を与えなかったが、抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わされたＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の投与により付与された腫瘍成長制御の増強を完全に消失させた。これらの結果は、バンコマイシン感受性細菌が、抗ＰＤ－Ｌ１への応答には影響を与えないが、腫瘍成長の制御にＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}がもたらす有益な効果を発揮するのに必要であったことを示している。

【0317】

実施例３４：Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} により治療されたマウスの回腸におけるＩｇＡ被覆細菌はバンコマイシンに対し感受性を有する。
抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わされたＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}の治療効果への関連性の観点から、次に、バンコマイシンの投与が回腸におけるＩｇＡ被覆細菌の存在量に影響を与えるかが検討された。

【0318】

小腸の内容物を採取し、細菌が遠心分離により分離され、洗浄され、結合されていないＩｇＡが除去された。細菌ペレットは、５％のヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁され、氷上で１５分間インキュベーションされ、遠心分離が行われ、ＡＰＣ結合ラビット抗マウスＩｇＡ抗体（Ｃａｔ．＃：ＳＡＢ１１８６； Ｂｒｏｏｋｗｏｏｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、 Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）で染色するため、１％のＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁された。３０分のインキュベーション後、細菌は２回洗浄され、フローサイトメトリーで分析された。前方及び側方散乱光パラメーターが対数モードで用いられた。細菌サイズ粒子であって、かつ、核酸を含む粒子を識別するため、ＳＹＴＯ ＢＣが添加された。

【0319】

図６２に示されているように、フローサイトメトリー及び統計分析のデータは、バンコマイシンは、ＭＣ３８腫瘍を有し、抗ＰＤ－Ｌ１とＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}との組合せで治療されたマウスの回腸においてＩｇＡ被覆細菌の有意な減少を引き起こしたが、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８}で治療されたマウスにおける細菌のＩｇＡ被覆はバンコマイシンの影響を有意には受けないことを明らかにした。抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わされたＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}による腫瘍成長制御の改善にＩｇＡが必要であるため、これら結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}がアピラーゼの治療効果を仲介するバンコマイシン感受性共生細菌を標的とする分泌型ＩｇＡの産生を増強することを示している。

【0320】

【表1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【配列表】

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【国際調査報告】