特表 2023-528243 薬剤の組織送達を容易にするためのデバイス、システム及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-04

(54)【発明の名称】薬剤の組織送達を容易にするためのデバイス、システム及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61N 1/32 20060101AFI20230627BHJP

   A61N 1/04 20060101ALI20230627BHJP

   A61M 37/00 20060101ALI20230627BHJP

   A61N 1/30 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 9/70 20060101ALI20230627BHJP

【ＦＩ】

A61N1/32

A61N1/04

A61M37/00 510

A61M37/00 520

A61M37/00 516

A61M37/00 514

A61N1/30

A61K47/02

A61K9/70

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022570113

(86)(22)【出願日】2021-05-28

(85)【翻訳文提出日】2023-01-16

(86)【国際出願番号】 US2021034959

(87)【国際公開番号】W WO2021243270

(87)【国際公開日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】63/031,767

(32)【優先日】2020-05-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】505477235

【氏名又は名称】ジョージア テック リサーチ コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ブラムラ，モハメド サード

(72)【発明者】

【氏名】ビャガスバリ，ガウラブ

(72)【発明者】

【氏名】シア，デンニン

(72)【発明者】

【氏名】プラウスニツ，マーク，アール．

【テーマコード（参考）】

4C053

4C076

4C267

【Ｆターム（参考）】

4C053AA06

4C053BB13

4C053BB31

4C053BB32

4C053JJ02

4C053JJ13

4C053JJ32

4C076AA95

4C076AA99

4C076BB31

4C076DD21

4C076DD22

4C076FF70

4C267AA71

4C267BB06

4C267BB08

4C267BB31

4C267BB37

4C267BB39

4C267BB42

4C267CC01

4C267GG22

4C267GG26

(57)【要約】

細胞内送達及び／又は真皮送達によって等、患者の生体組織に薬剤を投与するためのデバイス及び方法が提供される。デバイスは、圧電パルス発生器と、圧電パルス発生器に電気的に結合されたマイクロニードル電極アレイと、を含み、デバイスは、マイクロニードル電極を生体組織中に挿入した後、生体組織中の細胞を電気穿孔し、電気穿孔された細胞内への薬剤の送達を可能にするのに有効なマイクロニードル電極を通して、１つ以上の電気パルスを生成して送達するように構成されている。
【選択図】図１Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者の生体組織内に又は生体組織にわたって薬剤を投与する際に使用するためのデバイスであって、
圧電パルス発生器と、
前記圧電パルス発生器に電気的に結合されたマイクロニードル電極のアレイと、
を備え、
前記デバイスは、前記マイクロニードル電極を前記生体組織中に挿入した後に、前記生体組織中の細胞を電気穿孔し、前記電気穿孔された細胞内への薬剤の送達を可能にするのに有効な前記マイクロニードル電極を通して、１つ以上の電気パルスを生成して送達するように構成されている、
デバイス。

【請求項2】

（ｉ）前記マイクロニードル電極の前記アレイが延在する基部と、
（ｉｉ）前記基部に接続され、前記圧電パルス発生器を収納しているハウジングと、
をさらに備える、
請求項１に記載のデバイス。

【請求項3】

前記デバイスは、前記薬剤をさらに含み、かつ、前記薬剤を前記生体組織に放出するように構成されている、
請求項１又は２に記載のデバイス。

【請求項4】

前記薬剤は、前記マイクロニードル電極上にコーティングされる、
請求項３に記載のデバイス。

【請求項5】

前記薬剤は、前記デバイス内の１つ以上のリザーバに貯蔵され、
前記マイクロニードル電極のうちの少なくとも一部は、各々の表面上にある中空孔又は溝を含み、
前記デバイスは、前記１つ以上のリザーバに流体連通している１つ以上の導管と、前記薬剤の通過のための前記マイクロニードル電極の前記中空ボア又は溝と、を含む、
請求項３に記載のデバイス。

【請求項6】

前記薬剤は、前記薬剤を含有する粒子の形態であり、
前記薬物は、薬剤封入脂質ナノ粒子又は薬剤封入ポリマーナノ粒子である、
請求項１～５のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項7】

前記薬剤は、核酸を含む、
請求項１～５のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項8】

前記薬剤は、ワクチンである、
請求項１～５のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項9】

前記ワクチンは、ＲＮＡワクチン又はＤＮＡワクチンである、
請求項８に記載のデバイス。

【請求項10】

前記マイクロニードル電極は、ステンレス鋼から作製されている、
請求項１～９のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項11】

前記マイクロニードル電極は、前記圧電パルス発生器から前記マイクロニードル電極に前記電気パルスを伝導するように構成されている１つ以上の金属プレートから延在する、
請求項１～１０のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項12】

前記マイクロニードル電極の線形アレイは、前記金属プレートの各々の１つの縁から延在している、
請求項１１に記載のデバイス。

【請求項13】

前記プレートは、互いに平行であり、かつ、互いに離間している、
請求項１１又は１２に記載のデバイス。

【請求項14】

前記マイクロニードル電極は、単一の金属プレートから延在し、
前記アレイは、二次元アレイである、
請求項１～１０のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項15】

前記マイクロニードル電極は、少なくとも１つの非導電性プレートから延在し、
前記マイクロニードル電極の間に、電気接続部が設けられており、前記電気接続部は、前記圧電パルス発生器から前記マイクロニードル電極に前記１つ以上の電気パルスを伝導するように構成されている、
請求項１～１０のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項16】

前記電気接続部は、前記少なくとも１つの非導電性プレートの表面上に位置している、
請求項１５に記載のデバイス。

【請求項17】

前記電気接続部が、前記少なくとも１つの非導電性プレートの第１の側部から前記プレートの対向する第２の側部まで前記少なくとも１つの非導電性プレートの孔を通って交差している、請求項１５又は１６に記載のデバイス。

【請求項18】

前記マイクロニードル電極の各々は、非導電性コアと、前記マイクロニードルコアの表面の少なくとも一部を覆う導電性電極材料と、を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項19】

前記圧電パルス発生器は、
圧電結晶と、
前記電気パルスを生成するのに有効な前記圧電結晶の表面を打撃するように構成されたスプリングラッチ－ハンマ機構と、
前記マイクロニードル電極に前記電気パルスを伝導するための電気接続部と、
を備える、
請求項１～１８のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項20】

前記圧電結晶は、ジルコン酸チタン酸塩鉛（ＰＺＴ）、窒化ケイ素、チタン酸バリウム、石英、酸化亜鉛、又はタングステン酸ナトリウムを含む、
請求項１９に記載のデバイス。

【請求項21】

スプリングの減圧によって駆動されるハンマを解放するように構成されたウェッジ制御ラッチを有するトグルスイッチをさらに備える、
請求項１９又は２０に記載のデバイス。

【請求項22】

前記ハンマと前記圧電結晶との間に配設された金属ピンをさらに備える、
請求項２１に記載のデバイス。

【請求項23】

前記圧電結晶のためのケーシングをさらに備え、
前記電気接続部は、下部電極と、前記ケーシングから延在する側部電極とからなる、
請求項１９～２２のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項24】

カートリッジをさらに備え、
前記カートリッジは、前記マイクロニードル電極アレイを収納し、かつ、前記下部電極と嵌合係合するための第１のレセプタクルと、前記側部電極と嵌合係合するための第２のレセプタクルと、を含み、
前記第１のレセプタクル及び前記第２のレセプタクルは、前記マイクロニードル電極と電気的に連通している、
請求項２３に記載のデバイス。

【請求項25】

前記マイクロニードル電極アレイは、１ｍｍ^２～１０ｃｍ^２の組織領域に挿入されるように配列されている、
請求項１～２４のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項26】

２～１０００個のマイクロニードル電極を有する、
請求項１～２５のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項27】

前記マイクロニードル電極は、１０μｍ～２ｍｍの長さを有する、
請求項１～２６のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項28】

前記マイクロニードル電極アレイは、交換可能かつ使い捨てであるように構成され、
前記圧電パルス発生器は、一連の前記アレイと共に再利用可能であるように構成されている、
請求項１～２７のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項29】

１０Ｖ～１０，０００Ｖ、５０Ｖ～５，０００Ｖ、１００Ｖ～１，０００Ｖ、又は２００Ｖ～５００Ｖのピーク電圧絶対値を有する１つ以上の電気パルスを生じさせるように構成されている、
請求項１～２８のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項30】

０．１～１０、０．３～５、又は０．５～２のピーク電圧の絶対値とピークピーク電圧の絶対値の比を有する１つ以上の電気パルスを生じさせるように構成されている、請求項１～２９のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項31】

１Ａ～１０００Ａ、５Ａ～５００Ａ、１０Ａ～１００Ａ、又は２０Ａ～５０Ａのピーク電流絶対値を有する１つ以上の電気パルスを生じさせるように構成されている、
請求項１～３０のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項32】

１００Ｖ～３５，０００Ｖ、１，０００Ｖ～３０，０００Ｖ、又は１５，０００Ｖ～２７，５００Ｖのピーク静電圧絶対値を有する１つ以上の電気パルスを生じさせるように構成されている、
請求項１～３１のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項33】

１００Ｖ／ｃｍ～３０，０００Ｖ／ｃｍ、２００Ｖ／ｃｍ～１０，０００Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍ～５，０００Ｖ／ｃｍ、又は５００Ｖ／ｃｍ～３，５００Ｖ／ｃｍの公称電場強度を生じさせるように構成されている、
請求項１～３２のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項34】

１μｓ～１，０００μｓ、３μｓ～１００μｓ、５μｓ～５０μｓ、又は１０μｓ～３０μｓの初期パルス長を有する１つ以上の電気パルスを生じさせるように構成されている、
請求項１～３３のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項35】

総パルス長に対する初期パルス長の比が１．５～１００、２～５０、又は３～２０である１つ以上の電気パルスを生じさせるように構成されている、
請求項１～３４のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項36】

前記マイクロニードル電極は、０．１ｍｍ～１０ｍｍ、０．２ｍｍ～５ｍｍ、０．３ｍｍ～２ｍｍ、又は０．５ｍｍ～１．５ｍｍのアレイ内の間隔を有する、
請求項１～３５のいずれか一項に記載のデバイス。

【請求項37】

生体組織内又は生体組織にわたって薬剤を送達する方法であって、
請求項１～３６のいずれか一項に記載のデバイスを生体組織中の標的組織部位に隣接して位置決めすることと、
前記マイクロニードル電極を前記標的組織部位に挿入することと、
前記デバイスを作動させて、前記マイクロニードル電極を通して、前記標的組織部位で細胞を電気穿孔するのに有効な前記標的組織部位内に前記１つ以上の電気パルスを送達することと、
前記薬剤を前記標的組織部位の組織内に送達すること、
を含む、
方法。

【請求項38】

前記生体組織は、哺乳動物の皮膚を含む、
請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記生体組織は、粘膜を含む、
請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記標的組織部位は、真皮又は表皮を含む、
請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項41】

前記薬剤は、前記電気パルスの送達前に前記標的組織部位に投与される、
請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記薬剤は、前記電気パルスの送達と同時に前記標的組織部位に投与される、
請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記薬剤は、前記マイクロニードル電極から、又は前記マイクロニードル電極を通して、前記標的組織部位に投与される、
請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記薬剤は、皮下注射針、ジェット注射針、マイクロニードルデバイス、又はイオントフォレシスによって前記標的組織部位に投与される、
請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記１つ以上の電気パルスは、２００Ｖ～５００Ｖのピーク電圧絶対値、２０Ａ～５０Ａのピーク電流絶対値、１５，０００Ｖ～２７，５００Ｖのピーク静電圧絶対値、１０μｓ～３０μｓの初期パルス長、又はそれらの組み合わせを有する、
請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月２９日に出願された米国特許出願第６３／０３１，７６７号の利益を主張するものであり、当該特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府支援の研究又は開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって付与された助成金番号Ｒ０１ＡＩ１４３８４４の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

本発明は、概して、治療剤及び予防剤を、それを必要とする人に投与するためのデバイス及び方法の分野に関し、より具体的には、特に薬剤作用部位が細胞中に位置する場合に、治療剤、ワクチン、核酸等を生体組織内及び／又は組織関門にわたって導入するための方法及びデバイスに関する。

【0004】

多数の製剤及びデバイスが、薬剤、核酸、ワクチン及び治療用タンパク質等の生物製剤を、皮膚を通して細胞内に送達するために研究されてきた。哺乳動物の皮膚の角質層は、穿通促進剤、超音波、電気穿孔、又はマイクロニードルを使用する場合でも、特に５００ダルトンより大きい分子に対して有効な関門である。超音波及び電気穿孔を使用する従来のデバイスは、通常、高価な技術を必要とし、全ての場合において、ＡＣ電源コンセント又は電池等の連続的な電源へのアクセスを必要とする。

【0005】

原形質膜は、特に、ナノ粒子、脂質、ポリマー、及び他の製剤が使用される場合でも、能動輸送プロセスによって通常取り込まれない分子に対する別の有効な関門である。これは、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の遺伝物質に基づく薬剤にとって特に重要である。ＤＮＡベースの薬剤の作用部位は、典型的には、細胞核中にある。ＲＮＡベースの薬剤の作用部位は、典型的には、細胞サイトソル中にある。

【0006】

したがって、超音波発生器等の補助的な技術及びＡＣ電源コンセント又は電池等の連続的な電力源を必要とせず、かつ有害な副作用を有することがある化学製剤を必要としない、真皮及び細胞内の薬剤送達のための安価なデバイスに対する極めて強い必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【0007】

患者に薬剤を投与するための従来のデバイス及び方法と関連する前述の問題のうちの１つ以上を克服し得る、電気穿孔ベースの薬剤送達デバイス及び方法が提供される。

【0008】

一態様では、患者の生体組織内に又は生体組織にわたって薬剤を投与する際に使用するためのデバイスが提供される。実施形態では、デバイスは、（ｉ）圧電パルス発生器と、（ｉｉ）圧電パルス発生器に電気的に結合されたマイクロニードル電極アレイとを含み、デバイスは、マイクロニードル電極を生体組織中に挿入した後に、生体組織中の細胞を電気穿孔し、電気穿孔された細胞内への薬剤の送達を可能にするのに有効なマイクロニードル電極を通して、１つ以上の電気パルス、これは圧電パルス発生器によって生成されるが、を生成して送達するように構成されている。いくつかの実施形態では、デバイスは、薬剤を含み、薬剤を生体組織に放出するように構成されている。いくつかの他の実施形態では、薬剤は、デバイスの一部として提供されず、薬剤は、別個の供給源から生体組織に投与される。薬剤は、核酸を含むもの等、５００ダルトンより大きい治療用分子又は予防用分子であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＲＮＡワクチン等のワクチンである。

【0009】

別の態様では、薬剤を生体組織に送達するための方法が提供される。複数の実施形態では、本方法は、（ｉ）圧電パルス発生器に電気的に結合されたマイクロニードル電極アレイを含むデバイスを、生体組織中の標的組織部位に隣接して位置決めすることと、（ｉｉ）マイクロニードル電極を標的組織部位に挿入することと、（ｉｉｉ）デバイスを作動させて、マイクロニードル電極を通して、標的組織部位で細胞を電気穿孔するのに有効な標的組織部位内に１つ以上の電気的パルスを送達することと、（ｉｖ）薬剤を標的組織部位の組織内に送達することと、を含む。いくつかの実施形態では、生体組織は、哺乳動物の皮膚又は粘膜である。いくつかの実施形態では、標的組織部位は、真皮又は表皮を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、電気パルスの送達の前に、又はそれと同時に、標的組織部位に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤は、マイクロニードル電極から、又はマイクロニードル電極を通して標的組織部位に投与される。いくつかの他の実施形態では、薬剤は、デバイスの別の部分から、又は別個の供給源から生体組織に投与される。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1A】本開示の一実施形態による、薬剤送達システムのハウジング及び圧電パルス発生器の平面図である。

【図1B】本開示の一実施形態による、圧電パルス発生器の分解図である。

【図2A】本開示の実施形態による、マイクロニードル電極及びそれらの関連金属プレートのアレイの斜視図であり、それらのためのカートリッジケーシング中に収容された状態を示す。

【図2B】本開示の実施形態による、マイクロニードル電極及びそれらの関連金属プレートのアレイの斜視図であり、それらのためのカートリッジケーシング中に収容されていない状態を示す。

【図3】本開示の実施形態による、（ｉ）圧電パルス発生器を収納しているハウジング、及び（ｉｉ）マイクロニードル電極アレイを備えるカートリッジを備える薬剤送達システムの斜視図である。

【図4】本開示の一実施形態による、中実マイクロニードル電極アレイを有するカートリッジの概略図である。

【図5】本開示の別の実施形態による、中空マイクロニードル電極アレイを有するカートリッジの概略図である。

【図6A】本開示のいくつかの実施形態による、マイクロニードル電極アレイの電気接続部の概略図である。

【図6B】本開示のいくつかの実施形態による、マイクロニードル電極アレイの電気接続部の概略図である。

【図6C】本開示のいくつかの実施形態による、マイクロニードル電極アレイの電気接続部の概略図である。

【図6D】本開示のいくつかの実施形態による、マイクロニードル電極アレイの電気接続部の概略図である。

【図7A】本開示の一実施形態による、エレクトロポレータの概略図である。

【図7B】本開示の一実施形態による、エレクトロポレータの概略図である。

【図7C】本開示の一実施形態による、エレクトロポレータの概略図である。

【図7D】本開示の一実施形態による、エレクトロポレータの概略図である。

【図7E】本開示の一実施形態による、エレクトロポレータの概略図である。

【図7F】本開示の一実施形態による、エレクトロポレータの概略図である。

【図8A】本開示の一実施形態による、電気穿孔に使用される圧電パルサの代表的な電気出力プロファイルのグラフである。

【図8B】本開示の一実施形態による、電気穿孔に使用される圧電パルサの代表的な電気出力プロファイルのグラフである。

【図8C】本開示の一実施形態による、電気穿孔に使用される圧電パルサの代表的な電気出力プロファイルのグラフである。

【図9】マイクロニードル電極アレイ（ＭＥＡ）又はクランプ電極を使用した電気穿孔後のラット皮膚におけるＧＦＰ発現を示すグラフである。

【図10A】マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＤＮＡワクチン接種後の体液性免疫応答を示すグラフである。

【図10B】マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＤＮＡワクチン接種後のウイルス中和を示すグラフである。

【図11A】本開示の実施形態による、電気パルスの投与中の電圧の測定を示す。電気穿孔中の電圧を測定するために使用される電気回路の概略図を示す。

【図11B】本開示の実施形態による、電気パルスの投与中の電流の測定を示す。電気穿孔中の電流を測定するために使用される電気回路の概略図を示す。

【図11C】本開示の実施形態による、電気パルスの投与中の電圧の測定を示す。電圧の市販の卓上エレクトロポレータでパルスした後の代表的なプロファイルである。

【図11D】本開示の実施形態による、電気パルスの投与中の電流の測定を示す。電流の市販の卓上エレクトロポレータでパルスした後の代表的なプロファイルである。

【図12】本明細書に記載の電気穿孔デバイスの一実施形態によって生じた皮膚における電場強度分布を示すコンピュータシミュレーション結果である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

新規かつ改良された電気穿孔デバイス及び患者への薬剤の投与方法が開発されている。本方法及びデバイスは、核酸を含むもの又は他の生物学的製剤等、５００Ｄａより大きい薬剤の送達に特に有用である。

【0012】

本明細書で使用されるとき、用語「ピーク電圧」は、生体組織に印加されたときに電極間で達成される最大電圧降下を指し、用語「ピークピーク電圧」は、生体組織に印加されたときのピーク正電圧とピーク負電圧との間の電圧差を指し、用語「ピーク静電圧」は、電極がオシロスコープのリード線に直接印加されたときに電極間で達成される最大電圧降下を指し、用語「ピークピーク静電圧」は、電極がオシロスコープのリード線に直接印加されたときのピーク正電圧とピーク負電圧との間の電圧差を指し、用語「ピーク電流」は、生体組織を通る最大電流を指し、用語「公称電場強度」は、電極間の電圧を、反対方向に帯電した電極間の間隔で除したものを指し、用語「初期パルス長」は、パルスの開始と、電圧が生体組織に印加されたときにパルスの開始前の電圧に最初に戻る時間との間の時間を指し、用語「総パルス長」は、パルスの開始と、電圧が生体組織に印加されたときにピーク電圧の絶対値の１０％より大きい絶対値をもはや達成しない時間との間の時間を指す。

【0013】

デバイス及び方法
デバイスは、圧電パルス発生器と、圧電パルス発生器に電気的に結合されたマイクロニードル電極アレイとを含み、デバイスは、マイクロニードル電極を生体組織中に挿入した後に、生体組織中の細胞を電気穿孔し、電気穿孔された細胞への薬剤の送達を可能にするのに有効なマイクロニードル電極を通して、電気パルスを生成して送達するように構成されている。好ましい実施形態では、デバイスは、手持ち式であり、好ましくは同じ手で、手動で操作可能であるようにサイズ決めされ、形作られている。いくつかの実施形態では、デバイスは、マイクロニードル電極アレイが延在している基部をさらに含む。電極の基部及びアレイは、圧電パルス発生器を収納するハウジングに解放可能に結合されるように構成されたカートリッジの一部であり得る。

【0014】

いくつかの実施形態では、デバイスは、投与される薬剤をさらに含み、薬剤を貯蔵し、生体組織部位に放出するための任意の好適な手段を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、マイクロニードル電極上のコーティングの形態である。いくつかの実施形態では、薬剤は、デバイス中に、例えば、カートリッジ内の１つ以上のリザーバ中に貯蔵され、及び／又はマイクロニードル電極の少なくとも一部分は各々、中空ボアと、１つ以上リザーバと流体連通する導管とを含み、それにより、マイクロニードル電極の中空ボアは、マイクロニードル電極の生体組織内への挿入の前、後、又はそれと同時に、リザーバから生体組織内への薬剤の通過を可能にする。別の変形例では、カートリッジ本体は、中実であり得る、すなわち、中空ボアを伴わない、マイクロニードル電極に隣接する開口部を含み、開口部は、リザーバと流体連通し、生体組織及びカートリッジ本体の界面における開口部を通したリザーバからの薬剤の放出を提供し、それによって、薬剤は、マイクロニードル電極によって生じた穿刺部中に流入し得る。別の実施形態では、マイクロニードルは、マイクロニードル表面に沿った流体流の経路を（すなわち、マイクロニードルの内部で流体の流れを可能にする中空孔とは対照的に）提供する溝又は他の非平面表面特徴を有し得、それによって、生体組織内への薬剤送達を容易にする。

【0015】

いくつかの実施形態では、薬剤は、デバイスとは別個に提供される。例えば、デバイスは、皮下注射針、ジェット注射、イオン導入、又は別個のマイクロニードルデバイス等の従来の手段によって、生体組織の標的組織部位に投与され得る。薬剤を投与するためのマイクロニードルは、電気穿孔デバイスの一部であってもよく、又は別個のデバイスであってもよい。

【0016】

実施形態では、生体組織内に又は生体組織にわたって薬剤を送達するための本明細書で提供される方法は、（ｉ）生体組織中の標的組織部位にエレクトロポレータデバイスを位置決めすることと、マイクロニードル電極を標的組織部位に挿入することと、（ｉｉ）デバイスを作動させて、マイクロニードル電極を通して、標的組織部位で細胞を電気穿孔するのに有効な標的組織部位に１つ以上の電気パルスを送達することと、（ｉｉｉ）薬剤を標的組織部位の組織内に送達することと、を含む。薬剤は、電気パルスの送達の前、電気パルスの送達の後、電気パルスの送達と同時に、又はそれらのいくつかの組み合わせで、標的組織部位に投与されてもよい。薬剤は、マイクロニードル電極から若しくはマイクロニードル電極を介して、又は別個の送達手段から標的組織部位に投与されてもよい。

【0017】

本方法は、マイクロニードル電極アレイで組織表面を穿通するのに有効な力をエレクトロポレータデバイスに手動で印加することと、次いで、圧電体上に機械的力を誘発するデバイス上のボタン又はスイッチを手動で押下し、それによって、細胞内の細孔形成を誘導するのに有効な電気パルスを生じさせることと、を含み得る。同じボタン若しくはスイッチ、又は異なるボタン若しくはスイッチを押し下げることは、例えば、オンボードリザーバからの薬剤放出を作動させ得る。

【0018】

好ましい実施形態では、エレクトロポレータデバイスは、貯蔵された電気エネルギーを有さず（例えば、電池を有さず）、エネルギー源への有線又は無線の取り付けを有さない（例えば、電気コンセントに差し込まれない）。デバイスの電極間に電圧を生成するエネルギーは、デバイスのユーザの機械的作用によって提供される。例えば、デバイス上のボタン又はスイッチを手動で押下することと関連付けられたエネルギーは、電極間に電圧を生成したエネルギーを提供する。圧電部品は、ユーザによって入力された機械的エネルギーを、電圧を生成する電気エネルギーに変換し得る。

【0019】

有利には、本デバイス及び方法は、単回使用のために十分に安価であり、所望に応じて、繰り返し使用のために十分に堅牢である、超低コスト（２米ドル未満、例えば、約１米ドル未満）の手持ち式、電池不要の電気穿孔システムを提供する。いくつかの実施形態では、デバイス及び薬剤／マイクロニードル電極アレイカートリッジのブリスタパックからなるシステム又はキットが提供される。加えて、本発明のデバイスは、容易に持ち運び可能であり、手持ち操作に好適である。例えば、デバイスは、３００ｇ未満、好ましくは１５０ｇ未満、好ましくは１００グラム未満、好ましくは、５０グラム未満）の重量であってもよく、１００ｃｍ^３未満、好ましくは５０ｃｍ^３未満、好ましくは２０ｃｍ^３未満のサイズを有してもよく、圧電結晶を超える電池又は電源を必要とせず、圧電結晶は、次いで、ユーザによる機械的入力によって電力供給されてもよい。

【0020】

本デバイス及び方法は、患者の任意の好適な生体組織に適用することができる。すなわち、電気パルス及び薬剤は、患者の身体の物理的にアクセス可能な部分にあるか又はその付近にある細胞に送達され得る。患者は、ヒト又は他の哺乳動物であってもよい。電気パルス及び薬剤の送達は、皮膚中の細胞、身体の上皮層中の細胞、又は例えば腹腔鏡下で若しくは外科的介入に起因してアクセス可能である身体の内部中の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、生体組織は、哺乳動物の皮膚を含む。いくつかの好ましい実施形態では、標的組織部位は、真皮又は表皮を含む。いくつかの他の実施形態では、生体組織は、粘膜を含む。いくつかの実施形態では、標的組織部位は、口、鼻、眼、消化管、又は膣中にあり得る。

【0021】

特定の方法では、本方法は、有利には、皮膚への送達を標的化するためにマイクロニードル電極を使用し、これは、筋肉内に送達されるワクチンと比較して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び他のワクチンに対してより高い免疫原性を提供することが示されている。マイクロニードルは短く、いくつかの実施形態では、わずか６５０μｍの長さであってもよく、これは、表皮、並びに、場合によっては真皮に電場を集中させることができる。表皮は、抗原提示細胞が特に豊富であり、したがって、送達のための望ましい場所である。加えて、表皮への送達は、有益には、真皮、皮下又は下の筋肉組織内のより深部の知覚神経及び運動神経を刺激することから電場を遠ざける。

【0022】

本デバイス及び方法は、任意の好適な薬剤、特に電気穿孔が細胞の薬剤取り込みを促進し得る薬剤を投与するために使用され得る。薬剤は、本質的に、当該技術分野において既知であるか、又は開発された任意の治療剤又は予防剤であり得る。複数の実施形態では、薬剤は、小分子、生物製剤、又はワクチンである。非限定的な例としては、治療用タンパク質（抗体、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、改変タンパク質、及びワクチン等）、ＲＮＡ（メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はＲＮＡアプタマー）、ＤＮＡ（プラスミド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡアプタマー、ＤＮＡザイム等）、抗がん薬、抗菌薬、（例えば、タンパク質合成、細胞壁合成、酵素活性、生化学的経路の）阻害剤、細胞内又は細胞間シグナリングに影響を及ぼす薬剤、遺伝子調節に影響を及ぼす薬剤が挙げられる。本デバイス及び方法は、２つ以上の異なる薬剤を送達するために使用され得る。好ましい実施形態では、薬剤は、核酸を含む。好ましい実施形態では、薬剤はワクチンである。様々な実施形態では、薬剤は、ｍＲＮＡワクチン等のＲＮＡ又はＤＮＡワクチンである。ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エボラ、インフルエンザ等を含むが、これらに限定されない、様々なウイルス、細菌、又は他の病原体のいずれかに対して効果的であるように選択されたものであってもよい。ワクチンは、１つ以上の抗原を符号化するｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡから構成されてもよく、又は疾患の複数の変異体に対して有効なワクチンであってもよい。

【0023】

上記のように、デバイスは、圧電パルス発生器と、圧電パルス発生器に電気的に結合されたマイクロニードル電極アレイとを含む。圧電パルス発生器及び結合されたマイクロニードル電極アレイは、本明細書において「ｅＰａｔｃｈ」デバイス又は電気穿孔デバイスと称されることがある。マイクロニードル電極アレイは、本明細書において「マイクロニードル電極アレイ」又はＭＥＡと称されることがある。圧電パルス発生器は、圧電結晶から好適な電気パルスを生成するのに有効な任意の機構を含み得る。いくつかの実施形態では、圧電パルス発生器は、（ｉ）圧電結晶、（ｉｉ）電気パルスを生成するのに有効な圧電結晶の表面を打撃するように構成されたスプリングラッチ－ハンマ機構、及び（ｉｉｉ）電気パルスをマイクロニードル電極に伝導するための電気接続部を含む。

【0024】

デバイスは、任意の好適な圧電結晶を含み得る。いくつかの実施形態では、圧電結晶は、ジルコン酸チタン酸塩鉛（ＰＺＴ）を含む。それは、当該技術分野において知られている様々等パントを含み得る。いくつかの実施形態では、圧電結晶は、チタン酸ジルコン酸塩鉛、窒化ケイ素、チタン酸バリウム、石英、酸化亜鉛、及び／又はタングステン酸ナトリウムを含む。圧電結晶は、大きな強度の圧電効果、すなわち電場を生じさせ、それによって、パルスの形態で短い時定数で大きな電圧を出力することを示す材料である。これは、結晶の表面に対して及ぼされる機械的な力、圧力、又は圧縮を通じて生じ得、一時的な変形を生じさせ、その結果、電荷が形成され、次いで電気パルスとして放出される。

【0025】

デバイスは、パルスをマイクロニードル電極に中継するための電気接続部を含む、圧電結晶のためのケーシングを含み得る。ケーシングは、下部電極と、ケーシングから延在する側部電極とを含み得る。デバイスは、マイクロニードル電極アレイを収納し、下部電極と嵌合係合するための第１のレセプタクルと、側部電極と嵌合係合するための第２のレセプタクルとを含むカートリッジを含み得、第１のレセプタクル及び第２のレセプタクルは、マイクロニードル電極と電気的に連通している。

【0026】

デバイスは、スプリングの減圧によって駆動されるハンマを解放するように構成されたウェッジ制御ラッチを有するトグルスイッチを含み得る。金属ピン等のピンが、ハンマと圧電結晶との間に配設され得る。一実施形態におけるデバイスは、以下のように動作し得る。マイクロニードル電極が皮膚、粘膜、又は他の生体組織中に挿入された後、ユーザは、サムトグルスイッチ等のトグルスイッチに対して力を加え、これが下部スプリングを圧縮し、ラッチにロックされたハンマに向かってウェッジを押す。ユーザが最後まで押すと、ウェッジはハンマをラッチから強制的に押し出し、ハンマは続いて、力を集中させるために結晶に対して着座するピンを打撃する。電圧出力は、次いで、デバイス上の電極に向けられ得る。上部スプリングは、次いで、ハンマ及びラッチを元のロック状態にリセットするために圧縮解除され得る。ユーザは、薬剤を細胞に送達するのに有効な組織の電気穿孔を提供するために、必要に応じて追加のパルスを生成するように動作を繰り返し得る。

【0027】

マイクロニードル電極は、標的組織中に（例えば、角質層を通して）穿通し、圧電結晶によって生成された電気パルスで細胞の電気穿孔を達成するのに有効な様式で、アレイ内で、サイズ決めされ、形作られ、離間される。マイクロニードルは、マイクロニードルの挿入又は引き抜き中にマイクロニードル電極が剪断される又は損傷を受けるのを防止するために機械的に堅牢である。マイクロニードル電極は、ステンレス鋼、ニッケル、鉄、又は他の金属若しくは合金、又は他の好適な導電性生体適合性材料から作製されてもよい。マイクロニードル電極は、円筒形又は正方形であってもよい直線状又はテーパ状の本体を含み得、テーパ状の先端部分を含んでもよい。マイクロニードル電極は、当該技術分野において知られている任意の好適な方法、例えば、リトグラフエッチング技術、３Ｄ印刷、マイクロモルディング、及びレーザ切断を使用して製造されてもよい。マイクロニードル電極は、中実であってもよく、基部から先端に延在する中空ボアを有してもよく、又はマイクロニードルの側面に１つ以上の溝を有してもよい。

【0028】

いくつかの実施形態では、マイクロニードル電極は、圧電パルス発生器からマイクロニードル電極に電気パルスを伝導するように構成されている一連の金属プレートから延在している。いくつかの実施形態では、マイクロニードル電極の線形アレイは、金属プレートの各々の一方の側部から延在している。プレート上で、マイクロニードル電極のいくつかは正であってもよく、いくつかは負であってもよいことが理解される。プレート上のマイクロニードル電極の全てが互いに接続されていなくてもよい。接続は、電極間で選択的であってもよく、複数の接続／電極グループが存在してもよい。いくつかの実施形態では、プレートは、互いに平行であり、互いに離間している。いくつかの実施形態では、プレートは、絶縁ホルダ、例えば、ポリマー材料で作製されたホルダに固定されている。例えば、絶縁ホルダは、中にプレートが固定され得る一連のスロットを有し、カートリッジ本体の表面からマイクロニードル電極が延在している、カートリッジ本体であってもよい。

【0029】

いくつかの実施形態では、同じ極性（すなわち、カソード又はアノード）を有する２つ以上のマイクロニードルは、同じ導電性材料片（例えば、金属）の一部であり、例えば、単一の材料片から形成され、切断、エッチング、又はそれ以外の方法で加工されて、マイクロニードルアレイの形状を達成する。材料は、シートであってもよく、マイクロニードルは、シートと同じ平面内にあってもよく、又はシートの平面から約９０度等の非ゼロ角にあってもよい。

【0030】

いくつかの実施形態では、マイクロニードル電極は、アノードの全てが電気的に接続され、カソードの全てが電気的に接続されるが、アノード及びカソードがマイクロニードルアレイ上で互いに電気的に絶縁されるように、マイクロニードルアレイの表面にパターン化された導電材料（例えば、金属）を有する非導電性マイクロニードルアレイを含み得る。

【0031】

いくつかの実施形態では、マイクロニードル電極は、導電性材料で作製され、導電性ではない基板に接続されている（すなわち、マイクロニードル電極及び基板がマイクロニードルアレイを含む）。マイクロニードルアレイ電極は、基板の表面のうちの１つ以上の上の導電性材料をパターン化することによって、及び／又はマイクロニードルアレイ以外のｅＰａｔｃｈの部分に位置しており、マイクロニードルアレイ表面を介して及び／又は基板内の孔を通してマイクロニードル電極に電気的に接続されたワイヤを伴い得る電気接続部によって、互いに電気的に接続されている。

【0032】

いくつかの実施形態では、同じ極性のマイクロニードル電極は全て、マイクロニードルアレイ上で互いに電気的に接続されるか、又は他の場合では、マイクロニードル電極は全て、マイクロニードルアレイ上で互いに電気的に接続されるわけではないが、マイクロニードルアレイ上ではなくｅＰａｔｃｈデバイス内の他の場所に位置する電気接続部を通して互いに接続されている。

【0033】

いくつかの実施形態では、マイクロニードル電極アレイは、ＳＯ Ｃｈｏｉ、ＹＣ Ｋｉｍ、ＪＷ Ｌｅｅ、ＪＨ Ｐａｒｋ、ＭＲ Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ、ＭＧ Ａｌｌｅｎ「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ ａｒｒａｙ」Ｓｍａｌｌ、８：１０８１－１０９１（２０１２）に記載される方法によって作製され、当該記述は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0034】

いくつかの実施形態では、マイクロニードル電極アレイは、１ｍｍ^２～１０ｃｍ^２の組織領域中に挿入されるように配列されている。

【0035】

マイクロニードル電極アレイは、任意の好適な数のマイクロニードル電極を有することができる。いくつかの実施形態では、アレイは、２～１０，０００個のマイクロニードル電極、例えば、５０～５０００個、１００～１０００個、又は２０～２００個のマイクロニードル電極を有する。デバイス中のアレイ当たりの他の数のマイクロニードルが想定される。マイクロニードル電極は、様々なパターンで配列され得る。カソード及びアノードは、交互の列であってもよく、チェッカーボードパターンであってもよく、又は他のパターンで配列されていてもよい。

【0036】

いくつかの実施形態では、マイクロニードル電極は、１０μｍ～２ｍｍの長さを有する。いくつかの実施形態では、マイクロニードル電極は、５０μｍ～１．５ｍｍ、又は１００μｍ～１ｍｍの長さを有する。いくつかの好ましい実施形態では、長さは、１０μｍ～１ｍｍの範囲内、例えば６５０μｍ又は７５０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、５０μｍ～６００μｍの基部幅又は直径を有し得る。他のマイクロニードル電極寸法が想定される。

【0037】

いくつかの実施形態では、マイクロニードル電極アレイのカートリッジは、交換可能かつ使い捨てであるように構成され、圧電パルス発生器は、一連のそのようなカートリッジと共に再使用可能であるように構成されている。

【0038】

本明細書に記載のデバイスの電気穿孔部分は、細胞への分子の送達を増加させることが可能な電気パルスを提供する。圧電結晶を電気パルスの供給源として使用すると、高電圧の短い時定数パルス（例えば、マイクロ秒）を通して膜透過化処理が誘発され、これは、電気パルス中にマイクロニードル電極によって生成された電場中において細胞の細胞膜の一時的変化を誘発すると考えられ、これは、マイクロニードル電極と接触する又はその近傍にある細胞を含み、分子が細胞に進入し、意図された効果を生じさせることを可能にする。

【0039】

いくつかの好ましい実施形態では、圧電パルス発生器は、従来の単極パルス又は指数関数的減衰パルス又は方形波パルスと比較して細胞をより効果的に電気穿孔し得る、双極振動パルスを生成する。

【0040】

近接して離間したマイクロニードル電極は、生体組織中の細胞を電気穿孔するのに効果的に作用するためにマイクロ秒パルスに必要とされる高い電場強度を達成するために必要である。圧電パルスはマイクロ秒の持続時間であるため、５００Ｖ／ｃｍを超える電場強度から効果的な電気穿孔が得られる。このような高い電場強度を達成するために、マイクロニードル電極は、好適に近接して、例えば、互いに、すなわち、アレイ内の最も近い隣接電極から、１ｍｍ未満離間される必要がある。この狭い間隔により、数百ボルトの圧電パルスが非常に大きな必要とされる電場強度を達成することを可能にする。対照的に、多くのミリメートル又はセンチメートルの間隔を有する従来のクランプ電極が使用される場合、この電場強度を達成するためにはるかに大きな電圧が必要であろう。いくつかの実施形態では、本発明のデバイス及び方法のマイクロニードル電極アレイは、アレイ内の間隔が０．１ｍｍ～１０ｍｍ、好ましくは０．２ｍｍ～５ｍｍ、より好ましくは０．３ｍｍ～２ｍｍである。いくつかの実施形態では、間隔は、０．５ｍｍ～１．５ｍｍの範囲である。

【0041】

従来のエレクトロポレータは、ミリ秒パルスを生成する。対照的に、本発明のデバイス及び方法は、典型的には、マイクロ秒ほど、例えば、約１０μｓ等の１００μｓ未満のより短いパルスを生成する。パルス長が短くなるにつれて、電場をより強くする必要がある。電圧が大きくなり、電極間の間隔が短くなると、より大きな電場強度が可能になる。従来のエレクトロポレータは、長い中電圧パルスを使用するが、これらは、熱傷及び／又は刺青を頻繁に引き起こす可能性がある。本開示におけるシステムの短い持続時間パルスは、強化された安全性プロファイルの追加の利点を提供する。電場強度は、マイクロニードルアレイ内の位置の関数として一定でなくてもよい。しかしながら、一般に、電場強度は、電極間隔で除算された電圧を使用して決定することができる。これにより、組織を電気穿孔するのに十分な電場は、本明細書に記載するように、電極間隔が小さいときにマイクロ秒パルスのみを使用して生成され得る。

【0042】

いくつかの実施形態では、デバイスは、１００Ｖ／ｃｍ～３０，０００Ｖ／ｃｍ、好ましくは２００Ｖ／ｃｍ～１０，０００Ｖ／ｃｍ、より好ましくは３００Ｖ／ｃｍ～５，０００Ｖ／ｃｍの公称電場強度を生じさせるように構成されている。例えば、公称電場強度は、５００Ｖ／ｃｍ～３，５００Ｖ／ｃｍの範囲であってもよい。

【0043】

いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは、１０Ｖ～１０，０００Ｖ、好ましくは５０Ｖ～５，０００Ｖ、より好ましくは１００Ｖ～１，０００Ｖのピーク電圧絶対値を有する。例えば、ピーク電圧絶対値は、２００Ｖ～５００Ｖの範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは、１００Ｖ～３５，０００Ｖ、好ましくは１，０００Ｖ～３０，０００Ｖのピーク静電圧絶対値を有する。例えば、１５，０００Ｖ～２７，５００Ｖの範囲である。

【0044】

いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは、２０Ｖ～２０，０００Ｖ、好ましくは１００Ｖ～１０，０００Ｖ、及びより好ましくは２００Ｖ～２，０００Ｖのピークピーク電圧絶対値を有する。例えば、ピークピーク電圧絶対値は、４００Ｖ～１，０００Ｖの範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは、２００Ｖ～７０，０００Ｖ、好ましくは２，０００Ｖ～６０，０００Ｖ、及びより好ましくは２５，０００Ｖ～５０，０００Ｖのピークピーク静電圧絶対値を有する。

【0045】

いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは、０．１～１０、好ましくは０．３～５、より好ましくは０．５～２のピークピーク電圧の絶対値に対するピーク電圧の絶対値の比を有する。

【0046】

いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは、２より大きい、又は５より大きい、又は１０より大きい、又は１００より大きいピーク電圧の絶対値に対するピーク静電圧の絶対値の比を有する。

【0047】

いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは、１Ａ～１０００Ａ、より好ましくは５Ａ～５００Ａ、より好ましくは１０Ａ～１００Ａのピーク電流絶対値を有する。例えば、ピーク電流絶対値は、２０Ａ～５０Ａの範囲であってもよい。

【0048】

いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは各々、１μｓ～１，０００μｓ、好ましくは３μｓ～１００μｓ、より好ましくは５μｓ～５０μｓの初期パルス長を有する。例えば、初期パルス長は、１０μｓ～３０μｓの範囲であってもよい。

【0049】

いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは各々、５μｓ～５，０００μｓ、好ましくは１０μｓ～１，０００μｓ、より好ましくは２０μｓ～５００μｓの総パルス長を有する。例えば、総パルス長は、３０μｓ～２００μｓの範囲であってもよい。

【0050】

いくつかの実施形態では、１つ以上の電気パルスは各々、１．５～１００、好ましくは２～５０、より好ましくは３～２０の総パルス長に対する初期パルス長の比を有する。

【0051】

前述のパルス値は、それらが静電圧（すなわち、ピーク静電圧、ピークピーク静電圧）として識別されない限り、皮膚等の生体組織におけるパルスを指す。同様の従来の圧電デバイスは、空気中でスパークを発生させるように設計されていることに留意されたい。対照的に、本明細書に記載の圧電デバイスは、マイクロニードル電極と結合され、導電性媒体を通して電流を通過させるために使用される（すなわち、スパークがない）。

【0052】

本デバイス及び方法の好ましい実施形態では、双極振動パルスが、多くの場合、電気穿孔のために従来使用される指数関数的減衰又は方形波パルスの形態で、単極パルスの代わりに電気穿孔のために使用される。この双極発振パルスは、圧電結晶を収納するケース内のスプリング衝撃によって誘発される圧電結晶の圧縮及び伸長の自然な結果であり得る。従来の単極パルスと比較して、双極振動パルスは、細胞膜の絶縁破壊を生じさせることができるだけでなく、細胞膜内で超音波処理運動を生じさせ、より効果的な細胞穿孔を誘発することもできる。さらに、振動パルスは、長期間にわたって臨界電位を超えて細胞膜を分極させることを回避し、したがって、細胞膜の不可逆的な破裂を防止することによって、より良い細胞生存率を提供し得る。

【0053】

電気穿孔デバイスの一実施形態を図７Ａ～図７Ｂに示す。本システムは、ハンドトグル、圧電結晶、結晶を取り囲むケース、銅線、及びＭＥＡを含む。

【0054】

実施形態では、マイクロニードル電極は、正方形又は長方形配列で基部上に配列され、行又は列は、正電極及び負電極として交互に機能する。代替的に、正電極及び負電極は、チェッカーボードパターンであってもよい。実施形態では、カートリッジは、マイクロニードルアレイを備える。円形配列等の他の配列も可能であり、マイクロニードルは任意の好適な形状で配列することができる。

【0055】

一実施形態では、ＭＥＡは、電場を表皮に局在化させる反対に帯電した電極の列の間に０．９ｍｍの間隔を有する長さ６５０μｍの５４個のマイクロニードル電極アレイを有する。電気穿孔は、１０^３Ｖ／ｃｍほどの強力な電場を必要とし、より短いパルスはより大きな電場強度を必要とする。これは、より近接に離間した電極が、より低い電圧で電気穿孔することができることを意味する。近接した電極間隔はまた、皮膚内への電場穿通深さを減少させ、これにより、表皮標的化を容易にし、神経刺激を低減させる。

【0056】

パルス長（又は減衰定数）は、利用される圧電結晶に応じて、マイクロ秒（例えば、１～１０００マイクロ秒）、場合によってはナノ秒（例えば、１～１０００ナノ秒）ほどである。パルス長は、例えば、結晶製造プロセスにおいて利用される異なるドーパントを選択することと、異なるドーパント、異なる圧電材料、及び当該技術分野において知られている他の方法を選択することと、を通して操作することができる。パルス長は、１ｎｓ～１ｍｓの範囲、好ましくは１～１００μｓの範囲であってもよい。

【0057】

非振動パルスの場合、初期パルス長及び総パルス長は同じであるが、本明細書に記載のデバイス及び方法のパルスは、振動型であってもよく、それにより、初期パルス長及び総パルス長は同じでなくてもよい。さらに、従来のエレクトロポレータが実質的に単極パルスを生成するが、本明細書に記載のデバイス及び方法は、好ましくは双極パルスを使用し、各パルスは、正と負の間で交互する。

【0058】

図１Ａ～図１Ｂは、本明細書に記載の電気穿孔デバイスのハウジング及び圧電パルス発生器の一例を図示している。ここで、ユーザトグルスイッチ２は、圧縮され得、それによって、上部スプリング４を圧縮し、スプリング４をハンマ６に近づける。トグルスイッチ２が完全に押し込まれると、取り付けられたウェッジ１２６がハンマ６をそのラッチから押し出し、上部スプリング４が圧縮解除する。トグルスイッチ２が押下されると、このスプリング４も圧縮されて弾性位置エネルギーを貯蔵する。ウェッジ１２６がハンマ６をそのラッチから押し出すと、このスプリング４は圧縮解除してハンマ６を突出させる。金属材料で作製され得るハンマ６は、圧電結晶１２と接触している金属ピン１０上に突出して、機械的変形を誘発し、電気パルスを生じさせる。トグルスイッチ２が圧縮されると、このスプリング８（下部圧縮スプリング）もハンマ６の下方及び周囲で圧縮される。ラッチ解放フェーズの後、ハンマ６が金属ピン１０上に突出し、それによって結晶１２上に突出すると、このスプリング８は圧縮解除されて、トグルスイッチ２、ハンマ６、及び上部圧縮スプリング４を復元する。このピン１０は、圧電結晶１２の上部に載っており、ハンマ６が突出した後にハンマ６と接触する。金属ピン１０は、結晶１２に力を集中させる。結晶１２は、ハンマ６によって金属ピン１０上に打撃されると、電気パルスを生成する。デバイスはまた、電極接点を有する結晶ケーシング１４を備える。このケーシング１４は、圧電結晶１２を収容し、第１の電気接続部１６を形成する底部から延在するピンを有し、さらに、側面１８上の第２の電気接続部まで延在する導電性片を有する。結晶ケーシング１４から突出する金属片は、電気的接続部として機能し、ここでは下部電気的接続部１６である。側面機構ケーシング２４から突出する金属片はまた、電極としての役割を果たし、ここでは側面電極１８である。ねじ山を使用して、頂部に任意選択のケーシングをねじ込み得る。下部ねじ山２０及び上部ねじ山２２の両方を使用してもよい。スプリングラッチ－ハンマ機構ケーシング２４は、その機構の要素を収容する。トグルスイッチ２に取り付けられているウェッジ片１２６は、ハンマ６をラッチから押し出し、金属ピン１０及び結晶１２上に突出させるために使用される。

【0059】

図２Ａ～図２Ｂは、マイクロニードル電極アレイ及びそのホルダ又はカートリッジの一実施形態を図示している。図２Ａは、図２Ａ及び図２Ｂの両方に示される一連の６つの金属プレート３６のハウジングとしての役割を果たすマイクロニードル電極ケーシング（カートリッジケーシング）３０を示し、これは、ケーシング３０の表面３２に隣接するプレート３６の１つの縁部表面３４から延在する線形マイクロニードル電極アレイを有する。ワイヤ端子２６、２８は、ケーシング内の金属プレート３６に直接的に又は間接的に接続され、圧電パルス発生器に接続するためにケーシング３０から延在している。第１のワイヤ３８及び第２のワイヤ４０は、金属導電プレート３６を接続して、電気パルスを圧電パルス発生器からマイクロニードル電極に伝送する。ワイヤ３８、４０は、例えば、それぞれ、正の電気接続部及び負の電気接続部としての役割を果たし得る。

【0060】

図３は、（ｉ）圧電パルス発生器を収納するハウジング、及び（ｉｉ）マイクロニードル電極アレイを備えるカートリッジを含む、デバイスの一実施形態を図示している。圧電パルス発生器４２は、図１Ａ～図１Ｂに示すものと同様であってもよい。図３に示すように、デバイスは、カートリッジ４８から延在するマイクロニードル電極アレイ５０をさらに含む。カートリッジは、ここではスロットとして本明細書に図示される電極挿入点５６及び５８を含み、圧電パルス発生器４２からの電気接続部と嵌合して、金属導体５２、５４と電気的に接続し、金属導体５２、５４は、順に、マイクロニードル電極５０に電気的に接続されている。デバイスは、任意選択の支持ハンドル４４をさらに含み得、支持ハンドル４４は、ユーザが圧電パルス発生器４２上のトグルスイッチを押し下げるのを支援し得る。支持ハンドル４４は、圧電パルス発生器４２のハウジング上のねじ山と嵌合するためのねじ山付き開口部４６を含み得る。

【0061】

図４～図５は、マイクロニードル電極アレイ及びケーシング／カートリッジの２つの実施形態を示している。図４に示すように、デバイス、例えば、カートリッジの端部は、中実マイクロニードル電極アレイ６２を含む。マイクロニードル６２は、ケーシング６０に接続される／ケーシング６０中に収納されている。ここで、薬剤６４は、１つ以上のマイクロニードル電極６２の表面にコーティングされる。図５に示すように、デバイス６６、例えば、カートリッジの端部は、中空マイクロニードル電極アレイ６８、及び流体薬剤配合物７４を収納する複数のリザーバ７２を含む。他の実施形態（図示せず）では、カートリッジは、中空マイクロニードル電極に薬剤を供給する単一の共有リザーバを有してもよい。導管７０は、リザーバ７２と中空マイクロニードル電極６８のボアとの間に流体連通を提供する。リザーバ７４は、放出前に流体薬剤製剤７４を貯蔵するのに有用であり、中実マイクロニードル上のコーティングに含有され得るよりも多くの薬剤を含み得る。

【0062】

図６Ａ～図６Ｄは、マイクロニードルアレイの電気接続部の４つの実施形態を示している。図６Ａに示すように、導電性マイクロニードル電極２００は、非導電性基板２０２に接続されている。基板２０２の上部表面（すなわち、マイクロニードル電極２００が接続されている基板２０２の同じ側）上の電気接続部２０４（例えば、ワイヤ）は、同じ極性のマイクロニードル電極２００間に選択的に電気接続を提供する。

【0063】

図６Ｂに示すように、導電性マイクロニードル電極２００は、非導電性基板２０２に接続されている。基板２０２の下部表面（すなわち、マイクロニードル電極２００が接続される基板２０２の反対側）上の電気接続部２０６は、同じ極性のマイクロニードル電極２００間に選択的に電気接続を提供する。

【0064】

図６Ｃに示すように、導電性マイクロニードル電極２００は、非導電性基板２０２に接続されている。電気接続部２０８は、基板２０２の上部表面（すなわち、マイクロニードル電極２００が接続されている基板２０２の同じ側）から基板２０２の下部表面まで延びている。電気接続部２１０は、同じ極性のマイクロニードル電極２００間に選択的に電気接続を提供する。

【0065】

図６Ｄに示すように、非導電性マイクロニードル２１４は、非導電性基板２０２に接続されている。導電性材料２１２は、マイクロニードル２１４の表面を少なくとも部分的に被覆して、マイクロニードル電極を形成している。基板２０２の上部表面（すなわち、マイクロニードル２１４が接続される基板２０２の同じ側）上の電気接続部２１６は、同じ極性の電極を形成する導電性材料２１２の間に選択的に電気接続を提供する。

【0066】

本デバイス及び方法の用途
本明細書に記載の方法は、作用物質、典型的には薬剤を、電気穿孔の助けを借りて患者に投与するために使用される。本明細書で使用される場合、用語「電気穿孔」は、電気融合等、当該技術分野において知られている関連現象を含み、ウイルス、ウイルス様粒子、リポソーム、及び脂質二重膜を含有する任意の他の粒子状物体を含み得る。患者は、それを必要とするヒト又は他の哺乳動物であり得る。

【0067】

本方法は、有利には、電池、コンデンサ、又は他の従来の電力貯蔵デバイスを使用することなく、かつ外部源からの電気を使用することなく（例えば、電気コンセントにプラグ接続されない）、電気穿孔を使用して患者の身体組織内に大分子薬剤を送達するために使用され得る。しかしながら、小分子、タンパク質、核酸ベースの化合物、及び生物薬剤を含む多種多様な薬剤は、それらの送達を容易にし得る。薬剤の範囲には、核酸若しくはタンパク質の形態で合成的に合成された、又は関連する供給源から天然に得られる抗原（外来物質に由来するか又は外来物質を模倣して、導入時に免疫応答を誘導する物質）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はプラスミド又は線状形態の他のポリヌクレオチド化合物等の核酸、ペプチド（アミノ酸配列）、ウイルスベクター若しくはウイルス、任意のタイプのワクチン、がんを治療するためのＣＡＲ－Ｔ細胞療法等の遺伝子療法、免疫療法、化学的若しくは生物学的に合成されたタンパク質、及び／又はこれらの任意の組み合わせ、又は脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子等の薬剤封入粒子が含まれ得る生物製剤が含まれる。

【0068】

いくつかの実施形態では、電場は、皮膚、特に表皮に局在化され、表皮への局在化は、電気穿孔状態を受ける細胞の大部分が、表皮に位置し、真皮又はより深い組織には位置しないことを意味する。この局在化は、より深い組織への電場の穿通を制限することと、生存表皮中の細胞密度が真皮中よりもはるかに大きいという事実との組み合わせによって促進される。電場を標的とすることと、皮膚、特に表皮への電気穿孔を引き起こすこととにより、免疫原性を改善し、副作用の低減が可能になる。大部分が無細胞である真皮とは異なり、表皮は、ケラチノサイトを含む細胞、並びにランゲルハンス細胞を含む樹状細胞等の強力な抗原提示細胞が高密度で存在している。これらの表皮細胞に対して抗原を標的化することは、ＩＭ注射と比較して免疫応答を改善することが示されている。真皮の電気穿孔はあまり価値がないが、真皮樹状細胞の存在及びリンパ節への排液を可能にする豊富な脈管構造に起因して、表皮細胞において産生される抗原の上部真皮への拡散は有益であり、これはまた免疫原性を増加させる。さらに、電場を表皮に局在化させることは、神経刺激を低減させ、それによって、電気穿孔をより許容可能にすることができる。特に懸念されるのは、皮膚の下の運動神経及び筋細胞の刺激であり、これは、他の状況において皮膚又は筋電気穿孔について報告されている激しい痙攣を引き起こす可能性がある。実際、これは、本明細書に開示の実施例に示したが、クランプ電極による従来の電気穿孔は、各パルスの印加時に電気穿孔の部位で強力な筋収縮を引き起こした。動物を麻酔したが、これは、筋細胞及び／又は運動神経における活動電位の直接刺激を示している。これらの収縮は、電場を筋肉から遠く離れて表面的に局在化させたＭＥＡで電気穿孔したときには見られなかった。

【0069】

電場局在化の方法は、いくつかの点で他の方法と異なる。他のアプローチは、本発明のマイクロニードル電極よりもはるかに長い穿通電極を使用する。これらの他の穿通電極は、表皮及び真皮を完全に横切り、真皮下組織に、多くの場合、さらに深く穿通する。本発明のマイクロニードル電極は、表皮及び真皮の可能な限り一部分に穿通するため、マイクロニードル電極は、真皮を完全に横切らず、真皮の下の組織に接触しない。これらのマイクロニードル電極をパルスするときに生じる電場は、反対側に帯電した電極間の組織において最も強いため、マイクロニードル電極の穿通深さよりも深い組織は、電気穿孔を引き起こす可能性が低いより弱い電場を受ける。

【0070】

組織を電気穿孔するための別のアプローチは、皮膚表面に接触するが皮膚内に穿通しない表面電極の使用を伴う。それらは、導電性ゲル若しくは他の材料の適用、又はサンドペーパー若しくは他の方法を使用した角質層の少なくとも部分的な除去等、接触を容易にするための皮膚表面の処理を伴い得る。この場合、電場は、電極間の間隔に類似する深さまで皮膚内に穿通する。典型的なシステムにおけるこの間隔は、少なくともミリメートル以上である。その結果、電場は真皮には集中せず、確かに表皮には集中しないが、真皮の下の組織に到達する。真皮下組織の電場への曝露をより良好に制限する、非常に近接して離間された表面電極（例えば、１ｍｍ未満）を有することが可能である。しかしながら、それらは、穿通マイクロニードル電極アレイと比較して、より不均一な電場強度を皮膚内に生成する。

【0071】

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解され得る。

【実施例】

【0072】

本明細書に記載のデバイス及び方法を市販のデバイス及び方法と比較するために実験を行った。

【0073】

以下の実施例に記載するマイクロニードル電極アレイ（ＭＥＡ）は、ポリ乳酸で作製された３Ｄプリント絶縁ホルダに取り付けられた鋭い先端に向かってテーパ状になる、長さ６５０μｍ、断面２００μｍ×５０μｍの６列のステンレス鋼マイクロニードル（電極）を組み付けることによって組み立てた。同じ電気極性を有する電極の各列は、各列内で、各々０．８ｍｍ間隔で分離された９つのマイクロニードル（すなわち、同じ極性のマイクロニードル電極）からなり、列は０．９ｍｍ間隔で分離されている（すなわち、反対の極性を有するマイクロニードル電極と分離している）。図７Ｅ（右）は、一実施形態による電極列の拡大図である。この近接した間隔は、マイクロ秒パルスを使用する電気穿孔に必要とされる大きな電場強度を可能にする役割を果たす。正端子及び負端子のためのワイヤを使用して、圧電パルス発生器をＭＥＡに接続した（例えば、図７Ｄを参照）。使用時、ＭＥＡは、マイクロニードルが皮膚の角質層関門を横切って穿通して、生存表皮及び表在性真皮に進入するように皮膚に押し付け、その後、親指トグルを押下してパルスを投与した（図７Ａ）。図７Ａは、作動前に手８２によって所定の位置に保持されているエレクトロポレータ８０を示している。エレクトロポレータ８０は、例えば、ユーザの親指によって作動され得るトグルスイッチ８４を有するハウジング８６を備える。エレクトロポレータ８０は、ＭＥＡカートリッジ８８をさらに備える。図７Ｂは、圧電パルス発生器と、ｅＰａｔｃｈとして知られる金属ＭＥＡとを備えるエレクトロポレータ９０の分解図である。圧電パルス発生器は、圧電結晶９４を収容する結晶ケース９６を備える。マイクロニードル１００を備えるＭＥＡカートリッジ１０２は、銅線９８を介して圧電パルス発生器に接続される。エレクトロポレータ９０は、ハンドトグル９２をさらに備える。図７Ｃは、マイクロニードル電極の列（左）及び単一電極１２０（右）を示し、図７Ｄは、ＭＥＡの一実施形態における電極の構成を示す図であり、図７Ｅは、指１３２に対するＭＥＡの断面の拡大図である。図７Ｅでは、ＭＥＡカートリッジ１３０が、マイクロニードル１３４を保持している。図７Ｆは、スロット１１２を介してホルダ１１０に接続され得るマイクロニードル電極のプレートのポリマーホルダ／ケーシング１１０の平面図である。

【0074】

本明細書における実施例は、圧電パルス発生器及び金属ＭＥＡを含む方法及びシステムが、皮膚への有意な損傷の証拠なしに、マイクロ秒パルスを使用して表皮中の細胞に分子を選択的に送達することができることを実証する。対照的に、従来の電気穿孔デバイスからのミリ秒パルスを使用した電気穿孔は、皮膚内の各マイクロニードル電極穿通部位において有意な損傷を呈することがある。本発明の方法及びシステムは、ＤＮＡワクチンを送達し、堅牢な体液性免疫応答及びウイルス中和を生じさせることができ、電気穿孔を伴わない皮内（ＩＤ）又は筋肉内（ＩＭ）注射と比較して、少なくとも１０倍の用量節約を実証する。

【0075】

実施例１－圧電パルス発生器及びマイクロニードル電極アレイを使用した、動物における電気穿孔試験
動物及びプラスミド
全ての動物実験は、エモリー大学及びジョージア工科大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して実施した。成体雌ウィスターラット（２５０～３００ｇ）及び５～６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。動物を、動物飼育施設で１２時間／１２時間の明／暗サイクルに維持し、食事及び水を自由に摂取させ、実験前に少なくとも７日間順応させた。高発現レポータプラスミドｇＷｉｚ－ＧＦＰを使用した。膜貫通ドメインを有さないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のＤＮＡを、融合クローニング技術を用いてｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングした。

【0076】

圧電パルス発生器及びマイクロニードル電極アレイの設計
圧電パルス発生器及び電気的に結合されたＭＥＡを備えるデバイスは、本明細書において「ｅＰａｔｃｈ」と称される。電気パルスは、一般的な家庭用圧電ストーブライタに由来するデバイスによって生成された（図７Ｂ）。市販のライタから採取した圧電結晶を収容するために、円筒形チャンバを３Ｄプリントした。チャンバは、圧電結晶に接続され、その基部を通ってチャンバを出たワイヤを有していた。ハンドトグルを頂部に取り付けて、従来のライタを下向きに押下したときに利用されるのと同等の力を提供した。ホルダにポリ（乳酸）を３Ｄプリンタで３Ｄプリントした。

【0077】

ＭＥＡは、絶縁ホルダ中に６列の中実金属マイクロニードルを組み付けることによって組み立てた。各列は、９個のマイクロニードルを有し、各々は、先端から先端まで測定して、０．７９ｍｍ離間していた。反対の電気極性を有するマイクロニードルを、列間０．９０ｍｍの距離で互いに隣接して位置決めした。ｅＰａｔｃｈデバイスからのパルスプロファイルを（図１１Ａ～図１１Ｂに示す電気回路に従って）オシロスコープによって測定した。

【0078】

電気穿孔のための電場の数値シミュレーション
電場強度分布は、市販のモデリングソフトウェアを使用して数値モデリングにより解析した。皮膚内の電場の数値シミュレーションのためのパラメータを以下の表１に示す。

【表1】

【0079】

モデルを単純化するために、電気穿孔中の透過処理された組織の導電性変化を考慮せず、それによって、以前に治療されていない皮膚に印加されたパルスの開始時のピーク電場強度を取得した。電場シミュレーションは、静電モードで行い、金属ニードル電極の列は、隣接する列間の電圧が目標電圧値を満たすように、静的高電位及び静的低電位に交互に設定した。マイクロニードルが皮膚を穿通するときのシナリオを模倣するために、皮膚パラメータを使用して、ニードル先端部間に媒質を設定した。このモデルを使用した結果を実施例５及び７に示す。

【0080】

共焦点顕微鏡による非生存細胞及び電気穿孔された細胞の識別
皮膚における細胞生存度及び細胞透過性に対する電気穿孔の効果を研究するために、細胞不透過性プローブ、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎを使用して、電気穿孔によって引き起こされる一過性細胞膜透過性による取り込みを同定した。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎを電気穿孔の前にマイクロニードルにコーティングし、電気穿孔によって引き起こされる一過性透過性の指標として使用した。別の細胞不透過性プローブである臭化エチジウム（ＥＢ）を、電気穿孔によって引き起こされる非生存細胞の指標として使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウス皮膚を組織モデルとして使用した。

【0081】

麻酔下、シェーバで背部真皮毛を除去し、次いで、脱毛クリームを３分間塗布した。湿ったガーゼで皮膚を清拭して脱毛剤を除去した。脱毛の３日後、マウスをイソフルランで麻酔し、ＭＥＡを皮膚に押し込み、５又は２０の圧電パルスを印加した。皮膚を電気穿孔した１０分後に、マウスを二酸化炭素で安楽死させた。皮膚を採取し、ＥＢ（５０μｇ／ｍｌ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬し、４℃でインキュベートし、１．５時間振盪した。皮膚を新鮮なＰＢＳで３回洗浄し、レーザ走査共焦点顕微鏡（２０×対物レンズ）を使用して画像化した（図示せず）。ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ及びＥＢを、アルゴンレーザを使用して、それぞれ４８８ｎｍ及び５１４ｎｍで順次励起した。共焦点顕微鏡下で、非生存細胞はＥＢからの赤色蛍光を有し、電気穿孔された細胞はＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎからの緑色蛍光を有した（図示せず）。

【0082】

ＧＦＰ発現のライブイメージング及び皮膚の組織学的検査
ラットを、ＤＮＡ送達試験の１日前に麻酔下で、クリッパを使用して背部皮膚上の毛を除去することによって準備し、その後、脱毛クリームを４分間塗布し、水できれいに拭いた。動物を、イソフルラン気化器によってＯ_２中５％のイソフルランを充填した誘導チャンバ中で麻酔し、次いで、標準的なげっ歯類マスクを装着し、処置中、全身麻酔を維持した。

【0083】

ＧＦＰプラスミド（２．５μｇ／μｌ）を含有する２０マイクロリットルのＰＢＳをＩＤに注射して、皮膚内に目に見えるブレブを形成した。電気穿孔パルスを、ＤＮＡの注射の１分後に、ＭＥＡ又はクランプ電極のいずれかで注射部位に印加した。特定数のマイクロ秒パルス（１、５、１０、２０パルス）をｅＰａｔｃｈデバイスによって生成し、遺伝子発現に及ぼすパルス数の影響を調査した。プログラマブルパルス電圧を有する市販の卓上エレクトロポレータもまた、遺伝子発現に対するミリ秒パルス電圧の効果を研究するために使用した。皮膚中のＧＦＰの蛍光強度を、異なる日にＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによってモニタリングした。

【0084】

組織学的検査研究のために、生体内のマウス皮膚をｅＰａｔｃｈデバイスによって２０パルスで電気穿孔し、電気穿孔の直後に及び再び３時間後に実体顕微鏡下で撮像した。電気穿孔の１２時間後に皮膚を採取した後、組織をＴｉｓｓｕｅ－Ｐｌｕｓ Ｏ．Ｃ．Ｔ．に包埋した。化合物を－２０℃で一晩凍結した後、凍結ミクロトームを使用して厚さ２０μｍで切片化した。組織切片をレーザ走査共焦点顕微鏡（図示せず）によって撮像した。Ｈ＆Ｅ染色のために、組織を１０％ホルマリン緩衝液中で一晩固定し、次いで、自動組織脱水システムによって脱水した。脱水した組織をパラフィン中に包埋し、回転ミクロトームによって厚さ５μｍに切片化し、染色した。組織を倒立顕微鏡によって画像化した（図示せず）。

【0085】

マウスにおける免疫研究
マウス免疫研究では、ラットにおいて使用されたのと同じ電気穿孔パラメータが、マウス皮膚において強力なＧＦＰ発現を同様に生じさせたことが確認された。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＰＢＳ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質ＤＮＡワクチンを含有する１０μｌ溶液の注射を受けた５つの群（１群当たりｎ＝５マウス）、すなわち、（ｉ）ＩＭ注射による１０μｇのＤＮＡワクチン、（ｉｉ）ＩＭ注射による１００μｇのＤＮＡワクチン、（ｉｉｉ）ＩＤ注射による１０μｇのＤＮＡワクチン、（ｉｖ）ＩＤ注射とそれに続くｅＰａｔｃｈデバイスによる２０パルスによる１０μｇのＤＮＡワクチン、及び（ｖ）陰性対照としてのＩＤ注射によるＰＢＳに無作為に分けた。マウスを、処置中に、イソフルランによって麻酔した。各動物は、４週間後、第１の用量と同じ処置で第２の用量を投与した。７週目に眼窩穿刺により採血し、血清を分離した。

【0086】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体分析のためのＥＬＩＳＡ
マウス血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク表面タンパク質に対するＩｇＧの力価を測定するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用した。ＥＬＩＳＡプレートを精製されたスパイクタンパク質でコーティングし、次いで５％ウシ血清アルブミンでブロックした。血清試料を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで８０倍希釈し、次いでＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温（２０～２５℃）で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴで３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス抗体を添加し、１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄した後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン基質を添加して発色させた。反応を市販の停止溶液によって停止させた。吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによって４５０ｎｍで読み取った。光学濃度（ＯＤ）値を記録し、マウスにおける相対的な抗体発現レベルとして使用した。

【0087】

疑似ウイルス中和アッセイ
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイクタンパク質疑似型ウイルスを、中和アッセイに使用した。疑似ウイルスを、ｅｎｖ欠損ＨＩＶー１骨格プラスミドＤＮＡ、及び完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現して確立されたプロトコルを流すＤＮＡプラスミドを用いた２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションによって産生した。疑似ウイルスを産生し、２９３Ｔ細胞に自己パッケージ化した。２９３Ｔ細胞の上清に分泌された疑似ウイルスを回収した。

【0088】

血清中和活性の分析のために、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を発現する２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩増殖させた。マウス血清試料を、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）で１００倍、３００倍、及び９００倍に希釈した。各希釈試料（５０μｌ）を等容積のウイルス懸濁液（５０μｌ）と混合した後、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、血清－疑似ウイルス混合物を含有する試料を、５０％コンフルエンシーまで増殖させたＡＣＥ２発現２９３Ｔ細胞を播種した９６ウェルプレートのウェルに３回に分けて添加した。感染の６時間後、懸濁液を１５００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、５％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭと置換した。４８時間後、各ウェル内の細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を判定した。免疫血清の中和活性は、以下の式によって判定した。［（疑似ウイルス単独）－（疑似ウイルス＋血清）］／［疑似ウイルス単独］×１００％。

【0089】

実施例２－予備的ブタ皮膚試験
最初に、ブタ皮膚を使用した予備的な蛍光研究を使用して、従来のマイクロニードル注射プラットフォームを、マイクロニードル電極アレイに動作可能に結合された圧電パルス発生器からなる送達システムと比較した。特に、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎを使用して発現をモニタリングした。赤色色素である臭化エチジウムもまた、注射によって死滅した細胞を示すために使用した。ブタ皮膚に従来のマイクロニードルプラットフォームを使用して注射し、細胞を撮像した（図示せず）。ブタ皮膚はまた、マイクロニードル電極アレイを有する圧電パルス発生器の新しい送達系を使用して注射した。０パルス、５パルス及び１０パルスで画像を撮影した（図示せず）。従来のマイクロニードルプラットフォームと比較して、新たな送達システムを使用すると、発現が有意に高かっただけでなく、注射による細胞生存率の有意な損失もなかった。

【0090】

実施例３－表皮における遺伝子トランスフェクション
表皮への遺伝子トランスフェクションの標的化を評価するために、ＤＮＡ送達の１日後に組織学的解析を行った。圧電パルス発生器及び金属ＭＥＡからなる「ｅＰａｔｃｈ」デバイスからのマイクロ秒パルス、及び市販のベンチトップエレクトロポレータ（ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００， Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）からのミリ秒パルスのいずれかを使用したＭＥＡでの電気穿孔は、皮膚表面上で正面から見たときにＭＥＡに曝露された皮膚表面にわたって、及び生存表皮全体にわたって強力な緑色蛍光を生じ、凍結組織切片として見たときに真皮又は角質層におけるＧＦＰ発現の証拠はほとんどなかった。画像は、トランスフェクトされた細胞が、角質層の下の表皮層内でほぼ排他的に同定されたことを示した（図示せず）。対照的に、クランプ電極を使用して電気穿孔を行った場合、ＧＦＰ蛍光はあまり強くなかった（図９に示す定量的な知見と一致する）。さらに、トランスフェクトされた細胞は大部分が表皮内にあったが、深部真皮層、特に毛包内でＧＦＰトランスフェクションの証拠が見られた。これらの知見は、表皮に電気穿孔を局在化するＭＥＡの能力を確証させる。

【0091】

実施例４－高電圧パルス及び電場の分析
高圧プローブとオシロスコープを使用して、皮膚穿通を伴わないｅＰａｔｃｈスルーエアスパークからの電圧出力を判定した。図８Ａ～図８Ｃは、電気穿孔に使用される圧電パルサの代表的な電気出力プロファイルを示している。圧電パルサを、電極リードをオシロスコーププローブに直接取り付けることによって（ａは電圧プロファイル）、及び生体外のブタ皮膚にパルスすることによって（図８Ｂは電圧プロファイル、図８Ｃは電流プロファイル）、作動させた。図８Ａでは、複数の複製電圧プロファイルが示されている（ｎ＝２０）。出力は、ピーク正静電圧及びピーク負静電圧がそれぞれ２４．４±１．３ｋＶ及び－７．０±０．８ｋＶであるパルスを生成した（図８Ａ）。電極間隔が０．９ｍｍであるとすると、これは、１２００ｋＶ／ｃｍのピーク正静電場強度に対応し、空気の絶縁耐力（すなわち、約３０ｋＶ／ｃｍ）よりも高い。ピーク正静電圧は、１０．６±０．７μｓ後に達成され、その後の振動電圧出力は、約１００μｓ以内に減衰した（図８Ａ）。この極めて高い静電圧は、非常に高い電気インピーダンスと電流の欠如によって可能になった。

【0092】

ＭＥＡを電極として使用して生体外のブタ皮膚に印加している間、ピーク正電圧出力及び負電圧出力は、それぞれ２８３±４９Ｖ及び－３４５±５４Ｖであった（図８Ｂ）。電圧測定は、図１１Ａに示す設定を使用して行った。ピーク電圧までの時間は、１２．６±１．１μｓであった。ここでは、電圧は、パルス持続時間全体にわたって電流の通過を可能にしたオシロスコープへの接続と比較して、皮膚のより低いインピーダンスに起因してはるかに低かった。電気パルスは、圧電パルスの特徴である双極振動衰退波形の形態であった。比較分析のために、実験室トランスフェクションに一般的に使用される市販の卓上エレクトロポレータを使用して電気パルスも生成し、生体外のブタ皮膚中のＭＥＡに結合させた。このパルサは、それぞれ、５９．２±７．８ミリ秒又は５５．４±２．３ミリ秒のパルス持続時間（すなわち、指数関数的減衰時間定数）を有する３１±３Ｖ又は１００±５Ｖの単極指数関数的減衰パルスを生成した（図１１Ｃ）。これらのミリ秒単極パルスは、従来の電気穿孔に使用されるものよりも典型的なものであり、これは、ｅＰａｔｃｈによって生成されるマイクロ秒の振動パルスと対照的である。

【0093】

ｅＰａｔｃｈデバイスからのパルスの間に皮膚を通る電流も測定し、これは、電圧波形と形状が類似した振動衰退波形を示し、２４．８±１．１Ａのピーク正電流を達成した（図８Ｃ）。電流測定は、図１１Ｂに示す設定を使用して行った。市販の卓上エレクトロポレータでは、３２±３Ｖ及び１０５±４Ｖのパルスを印加した場合、皮膚を通る最大電流はそれぞれ０．２８±０．０３Ａ及び１．３３±０．１６Ａであった（図１１Ｄ）。見かけの電気インピーダンス（すなわち、ピーク電圧をピーク電流で除したものとして特徴付けられる）は、ｅＰａｔｃｈパルス中に１１．４Ωであり、従来のエレクトロポレータによるパルス中に１１４Ω又は７８．９Ωであった（それぞれ３２Ｖ又は１０５Ｖで）。従来のパルサからのミリ秒パルスに対して、ｅＰａｔｃｈからのマイクロ秒パルスを使用して測定された非常に低い見かけの電気インピーダンスは、高周波数成分を有する複雑な波形を有する電場に曝露された皮膚及び他の組織において生じることが知られている低下したインピーダンスによって説明され得る。

【0094】

ＭＥＡを使用してパルスを印加する際の皮膚内の電場分布をより良く理解するために、図１２に示すように、電気穿孔中の皮膚内の電場強度をモデル化した。図１２は、コンピュータシミュレーションにより求めた皮膚内の電場強度分布を示している。ピーク電場強度は、（ａ）ＭＥＡ又は（ｂ）クランプ電極を使用して、ｅＰａｔｃｈからの３００Ｖパルスのようなパルスを印加したときに示される。電場強度分布は、ＭＥＡの上から（上部左）及び側面図（底部及び右）に示されている。真皮－表皮接合部は、破線で示している。スケールバーは１ｍｍである。

【0095】

ＭＥＡでは、電場強度は、各マイクロニードル電極の周囲で、特に、電極の曲率が電場強度を増加させることが知られている先端付近で最も高かった（図１２）。電場強度は、同じ極性の電極間で最も弱かった。電場はまた、電極の下の組織に深く穿通せず、数百ミクロンの長さのスケールで低下した。このようにして、電場は、表皮ランゲルハンス細胞及び真皮樹状細胞等の豊富な抗原提示細胞を収納し、リンパ節への効率的な排液を有し、これらの全てがワクチンの免疫原性を増強することができる、表皮及び真皮の上層に局在化された。

【0096】

可逆的電気穿孔の閾値は、電場への曝露の持続時間に依存する。ミリ秒長さのパルスでは、電気穿孔閾値は４００～６００Ｖ／ｃｍほどであると予想されるが、マイクロ秒長さのパルス持続時間では、閾値は１．０～１．５ｋＶ／ｃｍに増加する。圧電エレクトロポレータを使用して３００Ｖパルスを印加する場合、組織内の最も高い電場強度は電極のすぐ隣で１５ｋＶ／ｃｍであるが、組織の大部分は２～３ｋＶ／ｃｍの電場強度を経験し、これは電気穿孔を成功させるために必要な閾値よりも高いが、広範な細胞死滅を回避するのに十分な低電場強度である。このようにして、電極に隣接する高度に局在化した細胞死、並びに同じ極性の電極間で電気穿孔されない小さい領域が予想され得るが、ほとんどの組織は、可逆的な電気穿孔を引き起こすと予想される電場強度を経験する。

【0097】

これらの知見を、同じ電圧（３００Ｖ）で従来のクランプ電極を使用して生成された皮膚内の電場強度とさらに比較した。クランプ電極の大きな間隔（すなわち、３．９ｍｍ）は、ＭＥＡと比較してはるかに弱い電場強度を生じさせることが見出された。電場強度は、電極間の空間の一部分では１ｋＶ／ｃｍを超えただけであり、電極の最縁部では１．５ｋＶ／ｃｍを超えただけであった。

【0098】

クランプ電極又はＭＥＡを使用した従来のエレクトロポレータ（３０Ｖ及び１００Ｖ）からの代表的なパルスの印加中の皮膚内の磁場強度も調査した。クランプ電極を用いた３０Ｖパルスは、大部分が３００Ｖ／ｃｍ未満の非常に低い電場強度を生じ、これは、ミリ秒パルスの予想される電気穿孔閾値を達成しない。近接して離間したＭＥＡを用いた３０Ｖパルスの印加は、電極に直接隣接する組織が４００～６００Ｖ／ｃｍに達することを可能にしたが、組織の大部分は、はるかに弱い電場を経験した。１００Ｖパルスを使用した場合、クランプ電極は、組織の一部において電気穿孔することが予想される電場強度を達成し、ＭＥＡは、組織の大部分において電気穿孔するのに十分な強度の電場を生じさせた。

【0099】

実施例５－ｅＰａｔｃｈによる堅牢なレポータ遺伝子トランスフェクション
プラスミド送達及びトランスフェクションに対するｅＰａｔｃｈデバイスの効果を評価するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を符号化するＤＮＡプラスミドを生体内のラット皮膚に送達した。遺伝子発現のレベルを、経時的なＧＦＰ蛍光の生体内撮像によって測定した。

【0100】

ｅＰａｔｃｈを使用して、高電場強度マイクロ秒パルスの効果を試験し、単一パルスが目に見えるＧＦＰ発現を生成することができることが見出された（図９）。図９は、図８Ｂに示すような波形を有する約３００Ｖの１～２０パルスを与えるｅＰａｔｃｈを使用するか、又は減衰時定数（ｔａｕ＝４９～５７ｍｓ）を有する制御されたピーク電圧（１０～１００Ｖ）での従来の指数関数的減衰電気穿孔パルサを使用する電気穿孔によるＧＦＰレポータプラスミドの送達後の異なる日の皮膚におけるＧＦＰ蛍光の放射効率を示している。マイクロニードル電極アレイ（ＭＥＡ）又はクランプ電極を使用してパルスを印加した。データは、平均±標準偏差を表す（条件ごとにｎ＝５～６反復）。（＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【0101】

より多くのパルスは、１０パルスまでＧＦＰ発現を増加させ（ｐ＝０．００１）、２０パルスまで増加させても、ＧＦＰ発現はさらに増加しなかった（ｐ＞０．０５）。電気穿孔後３日間、ＧＦＰの発現は経時的に減少した（ｐ＝０．００２）。５日後、ＧＦＰ蛍光は検出不可であったが、これはおそらく皮膚におけるＧＦＰタンパク質の分解に起因するものである。

【0102】

陰性対照として、ＧＦＰプラスミドの皮膚へのＩＤ注射を電気穿孔なしで実施したところ、ＧＦＰトランスフェクションはほとんど検出できなかった（図９）。ｅＰａｔｃｈは、ＧＦＰ発現をＩＤ注射単独と比較して４１６倍増加させた（ｐ＜０．００１）。

【0103】

これらの結果をより良く解釈するため、透過性細胞を同定するために電気穿孔中に存在する細胞不透過性緑色マーカ化合物（ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ）を用いて追加の実験を行い、その後、非生存細胞を同定するために赤色生存染色を加えた。顕微鏡による皮膚の検査は、赤色蛍光細胞の存在によって示されるように（図示せず）、電気穿孔とは無関係に、皮膚へのマイクロニードル穿刺部位に細胞生存率の損失があったことを示した。これは、おそらくマイクロニードルによる機械的な穿刺からの損傷によるものであった。ｅＰａｔｃｈからの５又は１０の電気穿孔パルスの印加は、細胞生存率損失を増加させるようには見えなかったが、各マイクロニードル穿通部位の非生存コアを取り囲む生存細胞への緑色マーカ化合物の取り込みによる細胞透過性の増加を引き起こした。皮膚表面の顕微鏡検査は、以下で考察するように、各マイクロニードル電極穿通部位における皮膚損傷のわずかで一過性の証拠のみを示した。

【0104】

次に、市販のエレクトロポレータと結合したＭＥＡを使用して、中程度の電場強度、ミリ秒パルスの効果を試験した。これらの条件下での電気穿孔は、３０Ｖでピークに達したＧＦＰ発現を生じた（ｐ＝０．０２）（図９）。３０ＶでのピークＧＦＰ発現は、１０パルスでｅＰａｔｃｈによって生成されたピーク値と有意に異ならなかった（ｐ＝０．０５５）が、他の電圧でのＧＦＰ発現は有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ｅＰａｔｃｈと同様に、ミリ秒パルスを使用した電気穿孔によってトランスフェクトした細胞もまた、電気穿孔後３日間、ＧＦＰ蛍光の減衰を有した（ｐ＝０．００８）。

【0105】

電圧に対するＧＦＰ発現の依存性は、３０Ｖに対して１０Ｖでの電気穿孔の程度がより低く、トランスフェクションがより少なくなることによって説明することができる。３０Ｖを超えると、細胞内へのＤＮＡ送達の増加の可能性は、高い電場強度へのミリ秒長さの曝露中の不可逆的な電気穿孔及び組織加熱によって引き起こされる細胞生存率の損失の増加によって相殺された可能性が高い。この解釈は、緑色マーカ化合物の送達及び赤色生存率染色剤の適用後の追加の皮膚撮像によって支持される（図示せず）。細胞生存率の損失の増加が、電圧の増加と共に見られ、マイクロニードル電極配置の部位での組織加熱も同様に増加し、５０℃までのピーク値に達した。皮膚表面の顕微鏡検査は、ミリ秒パルスを使用したより高い電圧での広範な細胞死の観察と一致して、少なくとも２日間持続した各マイクロニードル電極穿通部位で変色を示した（図示せず）。

【0106】

皮膚電気穿孔の現在の方法に対処するために、ＭＥＡの代わりにクランプ電極（３．９ｍｍ間隔）を用いた。マイクロ秒圧電パルス発生器を用いてパルスする場合、単一パルスは検出可能なＧＦＰ発現をもたらさなかったが、１０、２０、又は３０パルスを印加すると、パルスの数に依存しないＧＦＰ発現が生じた（ｐ＞０．０５）。市販のエレクトロポレータからのミリ秒パルスでクランプ電極を使用して、検出可能なＧＦＰ発現が６０Ｖで見出され、電圧が１００Ｖに上昇したときにわずかに増加した（ｐ＞０．０５）。ＧＦＰ発現は、ｅＰａｔｃｈ又は市販のエレクトロポレータのいずれかと共にＭＥＡを使用した場合よりも、クランプ電極で有意に低かった（ｐ＜０．００１）。

【0107】

まとめると、これらの結果は、（ｉ）高いレベルのＤＮＡトランスフェクション及び発現が、ｅＰａｔｃｈによって達成することができること、（ｉｉ）ＭＥＡを使用することが、圧電パルサからのマイクロ秒パルスを有効にするのに十分な高い電場強度を生じさせたこと、（ｉｉｉ）従来のエレクトロポレータが、クランプ電極と比較してはるかに低い電圧で有効であることを可能にしたこと、及び（ｉｖ）マイクロ秒パルスが、ミリ秒パルスを使用するときに組織を損傷するようである組織加熱を最小限に抑えたこと、を実証する。

【0108】

実施例６－マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＤＮＡワクチン接種後の堅牢な免疫応答及びウイルス中和
ｅＰａｔｃｈが生体内で遺伝子発現を有意に増大させることができることを確認した後、ｅＰａｔｃｈによって送達されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＤＮＡワクチン、電気穿孔を伴わないＩＤ注射、及びＩＭワクチン接種を含む電気穿孔を伴わないＩＭ注射の免疫原性を、２つの異なる用量（１０μｇ及び１００μｇのＤＮＡ）で評価した。ＩＭワクチン接種は、抗原特異的ＩｇＧ力価（ｐ＝０．０４）及びウイルス中和アッセイ（ｐ＜０．００１）によって測定したように、１０μｇ用量よりも１００μｇ用量で高い体液性免疫応答を生じさせた（図１０Ａ～図１０Ｂ）。具体的には、マウスを０週目及び４週目に免疫化し、血液試料を７週目に採取した。マウス血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク表面タンパク質に対するＩｇＧ力価を４５０ｎｍでの吸光度として表した（図１０Ａ）。疑似ウイルスに対するＩｇＧの中和を、血清の異なる希釈で分析し、各希釈について中和パーセントとして表した（図１０Ｂ）。対照として、マウスをＰＢＳによって免疫化した。ＩＭ＿１０μｇ及びＩＭ＿１００μｇ：それぞれ、ＩＭ注射によって１０μｇ及び１００μｇのＤＮＡワクチンを免疫したマウス。ＩＤ＿１０μｇ：ＩＤ注射によって１０μｇのＤＮＡワクチンで免疫したマウス。ＩＤ＿１０μｇ＿ｅＰａｔｃｈ：ＩＤ注射によって１０μｇのＤＮＡワクチンで免疫した後、ｅＰａｔｃｈによって２０パルスを使用して電気穿孔したマウス。１群当たりｎ＝５匹。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【0109】

１０μｇのＤＮＡワクチンのＩＤ注射は、同じ用量でのＩＭワクチン接種と同様の結果を得た（ｐ＞０．０５）。ＩＤワクチン接種をｅＰａｔｃｈによる電気穿孔と共に実施したとき、免疫応答は、電気穿孔を伴わないＩＤワクチン接種又はＩＭワクチン接種よりも、同じＤＮＡ用量で有意に高かった（それぞれｐ＝０．０１及び０．００４）。さらに、１０μｇのＤＮＡのよるｅＰａｔｃｈワクチン接種は、１００μｇのＤＮＡによるＩＭワクチン接種と有意に異ならず（ｐ＝０．４７）、少なくとも１０倍の用量節約がｅＰａｔｃｈワクチン接種によって可能となったことを実証した。最後に、血清の１００倍希釈で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疑似ウイルスに対する抗体の９０％中和が低用量ｅＰａｔｃｈ及び高用量ＩＭ注射群で見出されたが、電気穿孔を伴わない低用量ＩＭ及びＩＤ注射群では、２０％の中和しか見出されなかったことは注目に価する（図１０Ｂ）。まとめると、この研究は、ｅＰａｔｃｈが、ＩＭ又はＩＤ注射単独と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を有意に改善したことを実証する。

【0110】

臨床及び組織学的検査は、ｅＰａｔｃｈを使用したワクチン接種が非常に良好に耐容されたことを示唆している。電気穿孔直後の皮膚表面の撮像は、拡大して観察した場合、マイクロニードル穿刺及び／又は局所化した電気穿孔の証拠を示した（図示せず）。３時間後のその後の撮像は、ワクチン接種処置の残存する証拠を示さなかった。ｅＰａｔｃｈワクチン接種１２時間後の皮膚の組織学的検査は、炎症マーカを示さなかった。対照的に、高電圧（１００Ｖ）ミリ秒パルスは、電気穿孔の１２時間後に皮膚に見られる炎症細胞の広範な浸潤を引き起こした。ワクチン接種後数週間にわたる動物の臨床検査では、有意な所見は得られなかった。これらのデータは、ｅＰａｔｃｈワクチン接種が、安全シグナルを生じさせない軽度の一過性の影響のみを皮膚に引き起こしたことを示唆している。

【0111】

全体として、本開示の送達システム及び方法は、２つの革新、すなわち、電気穿孔のための圧電ベースの電源、及び表皮を標的とする大きな電場を生成するＭＥＡ、これらの組み合わせから利益を得るＤＮＡワクチン接種方法を提供することができた。ｅＰａｔｃｈの形態のこの組み合わせは、ＣＯＶＩＤ－１９及び将来のパンデミックに対するワクチン接種の範囲及び速度を拡大することができる単純で超低コストなシステムを使用してＤＮＡワクチン接種を可能にすることが示された。

【0112】

本開示の送達システム及び方法は、電気穿孔を伴わない従来の注射よりも数桁大きい発現レベルを提供することができた。

【0113】

本明細書に記載の方法及びシステムの改変及び変形は、前述の詳細な記載から当業者には明らかであろう。そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【国際調査報告】