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特表2023-528267βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート凝集体形態を検出する方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-04

(54)【発明の名称】βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート凝集体形態を検出する方法

(51)【国際特許分類】

G01N 33/53 20060101AFI20230627BHJP

G01N 33/542 20060101ALI20230627BHJP

G01N 33/543 20060101ALI20230627BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 D

G01N33/542 A

G01N33/543 545A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022570442

(86)(22)【出願日】2021-05-17

(85)【翻訳文提出日】2023-01-18

(86)【国際出願番号】 FR2021050854

(87)【国際公開番号】W WO2021234261

(87)【国際公開日】2021-11-25

(31)【優先権主張番号】2004948

(32)【優先日】2020-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】514064671

【氏名又は名称】シスビオバイオアッセイズ

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ

(72)【発明者】

【氏名】トリンケ，エリック，ジー．

(72)【発明者】

【氏名】アキリーナ，アレクシ，ジェ．

(72)【発明者】

【氏名】プラロン，モー，ウー．

(57)【要約】

本発明は、試料においてβシート凝集体を形成するタンパク質のβシート凝集体形態（ＰＡＦβ）を検出するためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート非凝集体形態（ＰＮＡＦβ）を得るためにＰＡＦβのすべてまたは一部分を分離するために、ＰＡＦβを含有する可能性が高い試料のｐＨを９．７～１３．２の範囲のｐＨに調整するステップおよび６～９の範囲のｐＨで適切な免疫学的方法を用いてＰＮＡＦβ含量を測定するステップを含む、方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料においてβシート凝集体を形成するタンパク質のβシート凝集体形態（ＰＡＦβ）を検出するためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
ａ）第１の容器において：
ａ１）ＰＡＦβを含有する可能性が高い試料を入れるステップ、
ａ２）βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート非凝集体形態（ＰＮＡＦβ）を得るためにＰＡＦβのすべてまたは一部分を脱凝集するために、ｐＨを９．７～１３．２の範囲のｐＨに調整するステップ、
ａ３）ｐＨを６～９の範囲のｐＨに調整するステップ、
ｂ）適切な免疫学的方法を用いて第１の容器中のＰＮＡＦβ含量を測定するステップ、
ｃ）第２の容器において：
ｃ１）ステップａ１）と同一の試料を入れるステップ、
ｃ２）ｐＨを６～９の範囲のｐＨに調整するステップ、
ｄ）ステップｂ）と同一の方法を使用して第２の容器中のＰＮＡＦβ含量を測定するステップ、
ｅ）ステップｂ）およびｄ）において測定された含量を比較し、ステップｂ）において測定された含量と比較したステップｄ）において測定された含量の減少が、試料がＰＡＦβを含有することを示すステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記βシート凝集体を形成するタンパク質（ＰＦβ）が、ＦＵＳ（Ｆｕｓｅｄｉｎｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＦ１５、ＥＷＳＲ１、ＤＡＺＡＰ１、ＴＩＡ－１、ＴＴＲ（トランスサイレチン）、シスタチンＣ、β２－ミクログロブリン、ベータアミロイドペプチド（β１－４０アミロイドペプチドまたはβ１－４２アミロイドペプチドなど）、ＴＡＵ（チューブリン結合ユニット（Ｔｕｂｕｌｉｎ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＵｎｉｔ））、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、α－シヌクレイン、γ－シヌクレイン、ハンチンチン（ＨＴＴ）、プリオンおよびＴＤＰ－４３（ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質）から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＰＦβが、ベータアミロイド１－４２、α－シヌクレインおよびＴＤＰ－４３から選択される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記試料が、ＰＡＦβと関連する疾患を有する、または有すると疑われている個体に由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記試料が、ｉｎｖｉｔｒｏで培養された細胞または組織に由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記試料が、血液試料、血漿試料、血清試料、脳脊髄液試料、細胞溶解物、細胞ホモジネート、組織溶解物または組織ホモジネート、例えば、脳ホモジネートから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記試料が、細胞溶解物、細胞ホモジネート、組織溶解物、組織ホモジネート、細胞培養上清、組織培養上清、細胞細画分またはタンパク質（天然または組換え）から選択される、請求項１～３または５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ｐＨが、ステップａ２）において、塩基、例えば、ＮａＯＨを用いて調整される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ｐＨが、ステップａ３）において、酸、例えば、ＨＣｌを用いて調整される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ｐＨが、ステップｃ２）において、酸／塩基混合物、例えば、ＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物を用いて調整される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ステップｂ）およびｄ）において実行される免疫学的方法が、
（ｉ）ＰＮＡＦβに特異的に結合可能なリガンドであって、トレーサーで標識されているリガンド、または
（ｉｉ）ＰＮＡＦβに特異的に結合可能なリガンドの対であって、リガンドの対の少なくとも１つのリガンドがトレーサーで標識されているリガンドの対
を使用する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

－リガンド（ｉ）が、抗体、抗体断片、ペプチドもしくはアプタマーから選択される、または
－リガンドの対（ｉｉ）が、抗体の対、抗体断片の対、ペプチドの対もしくはアプタマーの対、好ましくは、抗体の対から選択される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ステップｂ）およびｄ）において実行される免疫学的方法が、ＥＬＩＳＡ法またはＲＥＴ法である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ステップｂ）およびｄ）が、ＲＥＴ法によって実施され、
（ｂ１）／（ｄ１）容器中に、ＲＥＴパートナーの対の第１のメンバーで標識された第１のＰＮＡＦβリガンドおよびＲＥＴパートナーの対の第２のメンバーで標識された第２のＰＮＡＦβリガンドを入れ、リガンドの対は、ＰＮＡＦβに特異的に結合できるステップ、ならびに
（ｂ２）／（ｄ２）容器において放出されたＲＥＴシグナルを測定するステップ
からなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

ステップｂ）およびｄ）が、ＥＬＩＳＡ法によって実施され、
（ｂ１）／（ｄ１）底部に第１のＰＮＡＦβリガンドが事前に固定化されている容器中に、トレーサーで標識された第２のＰＮＡＦβリガンドを入れ、リガンドの対がＰＮＡＦβに特異的に結合可能であるステップ、
（ｂ２）／（ｄ２）容器において放出されたＥＬＩＳＡシグナルを測定するステップ
からなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

患者においてＰＡＦβと関連する疾患の処置の治療効力をモニタリングするためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
Ａ）ステップｅ）がステップｂ）で測定された含量とステップｄ）で測定された含量の間の比（「試料１の比ｂ）／ｄ）」）を決定することからなる、前記患者の第１の試料で請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法を実行するステップ、
Ｂ）前記患者の第２の試料でステップＡ）と同一の方法を実行して、「試料２の比ｂ）／ｄ）」を決定するステップ、
Ｃ）ステップＡ）およびＢ）において決定された比を比較し、ステップＢ）において決定された比が、ステップＡ）において決定された比よりも低い場合に治療効力が観察されるステップ
を含む、方法。

【請求項17】

試験試料においてＰＡＦβと関連する疾患に対する薬物分子または薬物候補の薬理学的有効性を測定するためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
Ａ）ステップｅ）が、ステップｂ）で測定された含量とステップｄ）で測定された含量の間の比（「試料１の比ｂ）／ｄ）」）を決定することからなる、前記試験試料の第１の試料で本発明による方法を実行するステップ、
Ｂ）前記試験試料の第２の試料でステップＡ）と同一の方法を実行して、「試料２の比ｂ）／ｄ）」を決定するステップ、
Ｃ）ステップＡ）およびＢ）において決定された比を比較し、ステップＢ）において決定された比が、ステップＡ）において決定された比よりも低い場合に薬理学的有効性が観察されるステップ
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料においてβシート凝集体を形成するタンパク質のβシート凝集体形態（ＰＡＦβ）を検出するためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート非凝集体形態（ＰＮＡＦβ）を得るためにＰＡＦβを脱凝集するステップおよびＰＮＡＦβ含量を測定するステップを含む方法に関する。

【背景技術】

【0002】

多くの場合ミスフォールディングされるタンパク質の蓄積は、細胞におけるその凝集につながり、特にある特定の神経変性病理に特徴的な、細胞調節不全を引き起こす。βアミロイドペプチド、より詳しくはβ１－４２アミロイドペプチドは、アルツハイマー病におけるβシートを含有する原線維の形成、次いで、プレートの形成について広く研究されてきた。βアミロイドペプチドの凝集プロセスは、十分に特定決定されており、このプロセスは、いくつかの因子、特に、その濃度、ｐＨおよび温度に応じて変わる。プリオン様ドメインを含有する多数の他のタンパク質、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質はまた、プリオン様凝集体を形成できる［１］。プリオン様ドメインを含有するタンパク質は、βシート凝集体を形成するタンパク質（ＰＦβ）である。

【0003】

プリオン様ドメインは、βシートの豊富な原線維の形成を促進する疎水性アミノ酸を含有する。βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート凝集体形態（ＰＡＦβ）は、中性ｐＨでは水に可溶性ではない。

【0004】

ＰＡＦβによって誘導されるこれらの神経変性疾患の現在の診断は、最も多くはイメージングに基づいており、これによって、臨床および神経心理学的検査が完了される。それはいくつかの診断ステップを必要とする厄介な、費用がかかる手順である。

【0005】

生体試料におけるＰＦβの凝集またはオリゴマー化を実証または定量化することを可能にするさまざまな診断技術も、文献に記載されている。

【0006】

構造解析技術によって、ある特定のＰＦβ、特に、βアミロイドペプチドおよびＴＡＵまたはＴＤＰ－４３タンパク質の凝集の種々のレベルを強調することが可能となった：電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、クライオ電子顕微鏡、円偏光二色性、核磁気共鳴、Ｘ線回折。しかし、これらの技術は、試料中に存在する凝集体の含量を測定することを、たとえ相対的であっても困難にする。したがって、これらの技術では、ＰＦβの凝集のレベル（特に、凝集の阻害）に対する化合物の潜在的な効果は容易に研究できない。

【0007】

タンパク質をその分子量に従って分離可能な技術によって、高分子量ＰＡＦβと低分子量ＰＮＡＦβの間を識別することが可能になる。それらの一部はまた、種々のサイズの凝集体の間を識別することを可能にする。例えば、ウエスタンブロットによる検出と関連するまたは関連しないポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に言及できる。しかし、これらの技術において現在記載されている実験条件は、凝集のレベルの測定を歪める可能性がある。これは、特に、洗浄剤と還元剤（ＤＴＴ、ベータ－メルカプトエタノールまたはＴＣＥＰ）の組み合わされた使用が、凝集体のすべてまたは一部分を解離する可能性があるＳＤＳ－ＰＡＧＥの場合である。その実験上の制約（実施時間、多量の試料、感受性がないこと）のために、これらの技術は、ＰＦβ凝集のレベルを調節可能な化合物の特性決定に現実には適していない。

【0008】

免疫検出に基づく技術も記載されている：
－免疫検出と組み合わされた濾過：この方法では、生体試料は、高分子量種、特に、ＰＡＦβを保持可能なメンブレンで濾過される。発色または蛍光またはさらには発光トレーサーで直接的または間接的に標識されたＰＡＦβに特異的な抗体が、次いで、メンブレンに適用される。測定されるシグナルは、ＰＡＦβの量に正比例する。この方法は、アミロイドタンパク質の凝集パラメータまたは凝集のレベルに対する化合物の効果を研究するためにマイクロプレート形式に適応するように構成される場合がある。しかし、方法の自動化および処理能力は、この技術によって必要とされる濾過および洗浄ステップのために制限されている［２］。

【0009】

－ＥＬＩＳＡ：ＰＦβの凝集の特性決定を可能にするために、種々のＥＬＩＳＡ試験戦略が記載されている。第１の戦略は、その検出を可能にするトレーサーと同一の抗体を、固相上でのＰＡＦβの捕捉のために使用することからなる。この方法によって、捕捉および検出において使用される抗体のいくつかのエピトープを有するＰＡＦβのみを検出することが可能となる。したがって逆に、捕捉抗体および検出抗体は、使用される抗体によって認識される１つのエピトープのみを有するので、ＰＮＡＦβ上に同時に固定されることはできない。したがって、ＰＮＡＦβの存在下ではシグナルは生成しない［３］。第２の戦略は、ＥＬＩＳＡ試験において、ＰＡＦβを特異的に認識する抗体を、試料中に存在するＰＦβのすべての形態（ＰＡＦβおよびＰＮＡＦβ）を認識する抗体と会合させることからなる［４］。この形式では、ＰＡＦβの特異的抗体は、一般に、捕捉抗体であるが、検出抗体としてそれを使用する形式も記載されている［５］。第３の戦略は、両方とも目的のＰＡＦβを認識する２つの異なる抗体を使用することである。この最後の戦略は、凝集体の検出の特異性を改善すると思われる［６］。すべてのこれらのＥＬＩＳＡ試験によって、目的のＰＦβの凝集のレベルを決定すること、およびその凝集のレベルに対する化合物の効果を決定することが可能になる。それにもかかわらず、ＰＡＦβ単独の検出は十分ではないが、これは、測定値が、試験された生体試料の測定値に必ずバイアスをかける標準範囲に対して比較されない限り、所与のシグナルで、初期状態と比較して凝集のレベルを理解することは可能でないからである。

【0010】

－ＴＲ－ＦＲＥＴ（分解された時間におけるエネルギー移動）：有機試料におけるＴＡＵおよびアルファ－シヌクレインの凝集を検出するために、この方法に基づくキットが開発され、市販されている（ウェブサイトＣｉｓｂｉｏを参照されたい、商業的参照６ＦＴＡＵＰＥＧおよび６ＦＡＳＹＰＥＧ）。これらの試験は、それぞれ蛍光ドナーおよびアクセプターで同一の標識抗体を使用する。ＰＡＦβの存在下では、２つの標識抗体は、凝集のために同時にＰＡＦβに結合され、互いに近くに位置するドナーと蛍光アクセプターの間のエネルギー移動を誘導する。次いで、アクセプター抗体は、特異的ＦＲＥＴシグナルを放出し、これが分解された時間で測定される。他方、２つの抗体のうち１つのみが、ＰＮＡＦβ上に結合され、したがって、ドナーとアクセプター間の任意の近接を妨げる場合もある。次いで、ＰＮＡＦβ上でＦＲＥＴシグナルを得ることが不可能となる。これらのキットによって、小型化された高速形式で、目的のＰＦβの凝集のレベルを決定すること、およびその凝集のレベルに対する化合物の効果を決定することが可能になる。それにもかかわらず、これらのキットは、前記エピトープが凝集している場合であっても、ＰＦβのエピトープを認識可能な抗体の使用を必要とするが、免疫化は、一般にＰＮＡＦβを用いて行われ、これが抗ＰＡＦβ抗体を得ることを困難にする場合があるので、これが、検出試験の開発を制限、さらには、阻止することもある。

【0011】

先行技術において記載される方法は、したがって、特に、ＰＡＦβの１つまたは複数のリガンドを使用することによって試料中のＰＡＦβを直接的に検出することを目的としている。それにもかかわらず、ＰＡＦβを直接的に検出することは、これらの技術を実行することが困難なものにし、不正確なものにし、および／または大規模使用にとってほとんど適さないものにする場合がある。さらに、ＰＡＦβのみの検出は十分ではないが、これは、測定値を試験された生体試料の測定値に必ずバイアスをかける標準範囲に対して比較しない限り、所与のシグナルで、初期状態と比較して凝集のレベルを理解することは可能でないからである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｈａｒｒｉｓｏｎら、ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｐｒｉｏｎ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎｓｉｎｈｅａｌｔｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅ（２０１７）ＢｉｏｃｈｅｍＪ．；４７４（８）：１４１７～１４３８頁。ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＣＪ２０１６０４９９

【非特許文献2】Ｃｈａｎｇら、ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴＡＵａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｕｓｉｎｇａｍｅｍｂｒａｎｅｆｉｌｔｅｒａｓｓａｙ，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７３（２００８）３３０～３３６頁

【非特許文献3】Ｈｏｗｌｅｔｔら、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｉｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｂ－ａｍｙｌｏｉｄｐｅｐｔｉｄｅｂｙａｎｏｖｅｌｓｅｒｉｅｓｏｆｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９９）３４０、２８３～２８９頁

【非特許文献4】Ｌｉｎｇｈａｇｅｎ－Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ａｍｙｌｏｉｄ－ｂＯｌｉｇｏｍｅｒＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙＭｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅＩｇＭＩｓｏｔｙｐｅ－ＩｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒａＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＭｅｃｈａｎｉｓｍＥｘｅｒｔｅｄｂｙＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＡｕｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＰＬｏＳＯＮＥ、２０１０年１１月｜５巻｜１１号｜ｅ１３９２８

【非特許文献5】Ｅｎｇｌｕｎｄら、ＳｅｎｓｉｔｉｖｅＥＬＩＳＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｍｙｌｏｉｄ－ｂｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００７、１０３、３３４～３４５頁

【非特許文献6】ＶａｎＨｅｌｍｏｎｄら、ＨｉｇｈｅｒＳｏｌｕｂｌｅＡｍｙｌｏｉｄｂＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎＦｒｏｎｔａｌＣｏｒｔｅｘｏｆＹｏｕｎｇＡｄｕｌｔｓｔｈａｎｉｎＮｏｒｍａｌＥｌｄｅｒｌｙｏｒＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓＤｉｓｅａｓｅ，ＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌｏｇｙＩＳＳＮ１０１５－６３０５，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７５０－３６３９．２０１０．００３７４．ｘ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

したがって、ＰＦβの凝集と関連する疾患のより容易な、迅速な、より信頼できる診断が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本出願人は、ＰＮＡＦβを得るために、試料中に存在するＰＡＦβのすべてまたは一部分を脱凝集することを可能にする、簡単で、実行することが容易なプロトコールを開発した。このプロトコールによって、本出願人が、ＰＮＡＦβ含量の測定によって実施されるＰＡＦβ検出法を開発することが可能となり、これはＰＡＦβの検出に関連するすべての制約を克服することを可能にする。

【0015】

第１の態様によれば、本発明は、試料においてβシート凝集体を形成するタンパク質のβシート凝集体形態（ＰＡＦβ）を検出するためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
ａ）第１の容器において：
ａ１）ＰＡＦβを含有する可能性が高い試料を入れるステップ、
ａ２）βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート非凝集体形態（ＰＮＡＦβ）を得るためにＰＡＦβのすべてまたは一部分を脱凝集するために、ｐＨを９．７～１３．２の範囲のｐＨに調整するステップ、
ａ３）ｐＨを６～９の範囲のｐＨに調整するステップ、
ｂ）適切な免疫学的方法を用いて第１の容器中のＰＮＡＦβ含量を測定するステップ、
ｃ）第２の容器において：
ｃ１）ステップａ１）と同一の試料を入れるステップ、
ｃ２）ｐＨを６～９の範囲のｐＨに調整するステップ、
ｄ）ステップｂ）と同一の方法を使用して第２の容器中のＰＮＡＦβ含量を測定するステップ、
ｅ）ステップｂ）およびｄ）において測定された含量を比較し、ステップｂ）において測定された含量と比較したステップｄ）において測定された含量の減少が、試料がＰＡＦβを含有することを示すステップ
を含む、方法に関する。

【0016】

第２の態様によれば、本発明は、ＰＡＦβと関連する疾患の処置の治療効力をモニタリングするためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
Ａ）ステップｅ）が、ステップｂ）で測定された含量とステップｄ）で測定された含量の間の比（「試料１の比ｂ）／ｄ）」）を決定することからなる、第１の試料で本発明による方法を実行するステップ、
Ｂ）第２の試料でステップＡ）と同一の方法を実行して、「試料２の比ｂ）／ｄ）」を決定するステップ、
Ｃ）ステップＡ）およびＢ）において決定された比を比較し、ステップＢ）において決定された比が、ステップＡ）において決定された比よりも低い場合に治療効力が観察されるステップ
を含む方法に関する。

【0017】

第３の態様によれば、本発明は、ＰＡＦβと関連する疾患に対する分子の薬理学的有効性を測定するｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
Ａ）ステップｅ）が、ステップｂ）で測定された含量とステップｄ）で測定された含量の間の比（「試料１の比ｂ）／ｄ）」）を決定することからなる、第１の試料で本発明による方法を実行するステップ、
Ｂ）第２の試料でステップＡ）と同一の方法を実行して、「試料２の比ｂ）／ｄ）」を決定するステップ、
Ｃ）ステップＡ）およびＢ）において決定された比を比較し、ステップＢ）において決定された比が、ステップＡ）において決定された比よりも低い場合に薬理学的有効性が観察されるステップ
を含む、方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、本発明による方法の一般的な原理を図示する図である。したがって、ＰＮＡＦβレベルの比較（シグナルの比）によって、試験された試料がＰＡＦβを含むか否かを知ることが可能となる。ＰＡＦβを含まない試料のシグナルの比は、１に等しくなる。ＰＡＦβを含む試料のシグナルの比は、１よりも大きくなる。

【図2】図２は、ＰＮＡＦβの種々の希釈についての得られたＥＬＩＳＡシグナル（Ｏ．Ｄ．）を示す図である。最大シグナルの８０％に対応するＯ．Ｄ．値が、実験の残部において使用されるべき参照希釈を決定するために使用される。

【図3】図３は、抗体の対がＰＮＡＦβを選択的に認識するか否かを決定することを目的とするＥＬＩＳＡ試験において得られた結果を示す図である。Ａ）ＰＮＡＦβ非選択的な抗体の対。Ｂ）ＰＮＡＦβ選択的な抗体の対。

【図4】図４は、ＨＴＲＦイムノアッセイの原理を示す図である。このタイプのイムノアッセイは、それぞれドナーおよびアクセプターで標識された２つの抗体が目的の抗原を同時に認識可能な抗体の対を作出可能であるか否かを知ることを可能にする。Ａ）２つの試験された抗体が、目的の抗原を認識可能な抗体の対を作出できない；ドナーとアクセプターの間のエネルギー移動がなく、したがって、アクセプターによって蛍光シグナルが放出されない。Ｂ）２つの試験された抗体が、目的の抗原を同時に認識可能である。次いで、ドナーとアクセプターの間でエネルギーの移動が生じる。これは、アクセプターによって放出される６６５ｎｍでの特定の蛍光放出をもたらす。

【図5】図５は、ＰＮＡＦβの種々の希釈について得られたＨＴＲＦシグナルを示す。最大シグナルの８０％に対応するＨＴＲＦシグナル値が、実験の残部において使用されるべき参照希釈を決定するために使用される。

【図6】図６は、抗体の対がＰＮＡＦβを選択的に認識するか否かを決定することを目的とするＨＴＲＦ試験において得られた結果を示す図である。Ａ）ＰＮＡＦβ非選択的な抗体の対。Ｂ）ＰＮＡＦβ選択的な抗体の対。

【図7】図７は、ＴＤＰ－４３タンパク質に対して向けられる抗体の対を用いて得られた、ＴＤＰ－４３ＡＦβ凝集体試料とＴＤＰ－４３ＮＡＦβ単量体試料の間のシグナル比の算出を示す図である。２より大きいシグナル比は、試験された対がＴＤＰ－４３ＮＡＦβに対して選択的であることを示す。

【図8】図８は、ベータ１－４０アミロイドペプチドに対して向けられる抗体の対を用いて得られた、ベータ１－４０アミロイドペプチドの凝集体試料とこの同じペプチドの単量体試料の間のシグナル比の算出を示す図である。２より大きいシグナル比の値は、試験された対が１－４０アミロイドペプチドＮＡＦβ（単量体形態）に対して選択的であることを示す。

【図9】図９は、ベータ１－４２アミロイドペプチドに対して向けられる抗体の対を用いて得られた、ベータ１－４２アミロイドペプチドの凝集体試料とこの同じペプチドの単量体試料の間のシグナル比の算出を示す図である。２より大きいシグナル比の値は、試験された対が１－４２アミロイドペプチドＮＡＦβ（単量体形態）に対して選択的であることを示す。

【図10】図１０は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対するヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）の効果を示す図である。

【図11】図１１は、ＴＤＰ－４３ＡＦβの試料に対するヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）の崩壊効果がないことを示す図である。

【図12】図１２は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する尿素の効果を示す図である。

【図13】図１３は、ＴＤＰ－４３ＡＦβの試料に対する尿素の崩壊効果がないことを示す図である。

【図14】図１４は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する、塩化グアニジウムの効果を示す図である。

【図15】図１５は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する、ギ酸（Ａ）またはＴＦＡ（Ｂ）の効果を示す図である。

【図16】図１６は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する、ギ酸と、それに続くＮａＯＨを用いる中和の効果を示す図である。

【図17】図１７は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する、ＴＦＡと、それに続くＮａＯＨを用いる中和の効果を示す図である。

【図18】図１８は、ＴＤＰ－４３ＡＦβの試料に対して、ＴＦＡと、それに続くＮａＯＨを用いる中和の崩壊効果がないことを示す図である。

【図19】図１９は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する、ギ酸と、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和の効果を示す図である。

【図20】図２０は、ＴＤＰ－４３ＡＦβの試料に対する、ギ酸と、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和の崩壊効果がないことを示す図である。

【図21】図２１は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する、ＴＦＡと、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和の効果を示す図である。

【図22】図２２は、ＴＤＰ－４３ＡＦβの試料に対する、ＴＦＡと、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和の崩壊効果がないことを示す図である。

【図23】図２３は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する、８．２から１３．３の間で構成されるｐＨ値を与えるＮａＯＨ溶液と、それに続くＨＣｌを用いる中和の効果を示す図である。

【図24】図２４は、ＮａＯＨ溶液を用いた、ＴＤＰ－４３ＡＦβの試料を脱凝集する最小および最大ｐＨの決定を示す図である。

【図25】図２５は、ｐＨ＝１２．８のＮａＯＨの溶液を用いた、ＴＤＰ－４３ＡＦβの試料を脱凝集するのに必要な時間の決定を示す図である。

【図26】図２６は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出を測定する場合の、最小および最大ｐＨの決定を示す図である。

【図27】図２７は、脱凝集剤としてのＮａＯＨと、それに続くＨＣｌを用いる中和を使用するベータ１－４２アミロイドペプチドの凝集のレベルの測定を示す図である。

【図28】図２８は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する、ＮａＯＨ、ＫＯＨおよびＮＨ_４ＯＨ溶液と、それに続くＨＣｌ中和の効果を示す図である。

【図29】図２９は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの脱凝集に対する、ＮａＯＨ、ＫＯＨおよびＮＨ_４ＯＨの溶液と、それに続くＨＣｌを用いる中和の効果を示す図である。

【図30】図３０は、アルファ－シヌクレインに対して向けられる抗体の対を用いて得られた、アルファ－シヌクレインの凝集体試料（Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβ）とこの同一タンパク質の単量体試料（Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβ）の間のシグナル比の算出を示す図である。２より大きいシグナル比の値は、試験された対がＡｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβに対して選択的であることを示す。

【図31】図３１は、Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用するＨＴＲＦ法の検出能力に対する、ＮａＯＨ溶液と、それに続くＨＣｌを用いる中和の効果を示す図である。

【図32】図３２は、脱凝集剤としてＮａＯＨと、それに続くＨＣｌを用いる中和を使用するアルファ－シヌクレインの凝集のレベルの測定を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

定義
「βシート型凝集体を形成するタンパク質」または「ＰＦβ」という表現は、βシートの豊富な凝集体を形成可能なタンパク質、いわゆる、βシートの豊富な多量体形態（またはオリゴマー形態）を形成可能なタンパク質を示す。一般に、ＰＦβの非凝集体形態は正常であるが、その凝集体形態は、特に、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）によって特徴付けられる。ヒトまたは動物の天然または組換えタンパク質であり得る。本発明の文脈では、ＰＦβの非凝集体形態は、「βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート非凝集体形態」または「ＰＮＡＦβ」という表現によって示される。ＰＦβの凝集体形態は、「βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート凝集体形態」または「ＰＡＦβ」と呼ばれる。

【0020】

ＰＦβは、凝集体形態（ＰＡＦβ）である場合も、非凝集体形態（ＰＮＡＦβ）である場合もあり、ＦＵＳ（Ｆｕｓｅｄｉｎｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＦ１５、ＥＷＳＲ１、ＤＡＺＡＰ１、ＴＩＡ－１、ＴＴＲ（トランスサイレチン）、シスタチンＣ、β２－ミクログロブリン、βアミロイドペプチド（β１－４０アミロイドペプチドまたはβ１－４２アミロイドペプチドなど）、ＴＡＵ（チューブリン結合ユニット（Ｔｕｂｕｌｉｎ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＵｎｉｔ））、α－シヌクレイン、β－シヌクレイン、γ－シヌクレイン、ハンチンチン（ＨＴＴ）、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、プリオンおよびＴＤＰ－４３（ＴＡＲＤＮＡ結合タンパク質４３）から選択され得る。例えば、ＰＦβがＴＤＰ－４３である場合には、「ＴＤＰ－４３ＮＡＦβ」は、ＴＤＰ－４３の非凝集体形態に考えられ、「ＴＤＰ－４３ＡＦβ」はＴＤＰ－４３の凝集体形態に考えられる。

【0021】

上記で列挙されたＰＦβは、特に、神経変性疾患に関与する。例えば、ＦＵＳは、筋萎縮性側索硬化症に関与し、ＴＡＦ１５は、筋萎縮性側索硬化症に関与し、βアミロイドペプチドは、アルツハイマー病および遺伝性脳アミロイドアンギオパチーに関与し、プリオンは、クロイツフェルト・ヤコブ病および海綿状脳症に関与し、α－シヌクレインは、パーキンソン病に関与し、ＴＡＵタンパク質は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症に関与し、トランスサイレチンは、老人性全身性アミロイドシスまたは家族性アミロイドポリニューロパチーに関与し、シスタチンＣは、遺伝性脳アミロイドアンギオパチーに関与し、β２－ミクログロブリンは、血液透析関連アミロイドシスに関与し、ハンチンチンは、ハンチントン舞踏病に関与し、ＳＯＤ１は筋萎縮性側索硬化症に関与し、ＴＤＰ－４３は、筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭型認知症に関与する。好ましくは、ＰＦβは、β１－４２アミロイドペプチド、β１－４０アミロイドペプチド、α－シヌクレインまたはＴＤＰ－４３から選択される。

【0022】

本発明の方法が実行される試料は、少なくとも１つのＰＡＦβを含有する可能性が高い任意の試料であり得る。ヒトもしくは動物起源の生体試料またはｉｎｖｉｔｒｏで培養された細胞もしくは組織の試料であり得る。

【0023】

「ｉｎｖｉｔｒｏ法」という用語は、ヒトまたは動物身体の外側で、例えば、微生物、臓器、組織、細胞、細胞細画分（例えば、核、ミトコンドリア）または（天然もしくは組換え）タンパク質で実行された方法を意味する。「ｉｎｖｉｔｒｏ」という用語は、ｅｘｖｉｖｏを包含する。

【0024】

試料は、例えば、ＰＡＦβと関連する疾患、例えば、上記のような神経変性疾患を有する、または有すると疑われる個体、ヒトまたは動物に由来する場合がある。例えば、試料は、血液試料、血漿試料、血清試料または脳脊髄液試料から選択され得る。試料はまた、個体から得た組織または細胞から、例えば、脳、中枢神経系組織、臓器、例えば、脾臓および腸から調製できる。したがって、試料は、細胞溶解物、細胞ホモジネート、組織溶解物または組織ホモジネート、例えば、脳ホモジネートであり得る。試料はまた、細胞（例えば、細胞株）、細胞細画分（例えば、核、ミトコンドリア）または（天然もしくは組換え）タンパク質を含み得る。

【0025】

試料はまた、ｉｎｖｉｔｒｏもしくはｅｘｖｉｖｏで培養された細胞に、または組織に、好ましくは、ＰＡＦβと関連する疾患の細胞または組織モデルに由来する場合がある。例えば、試料は、細胞溶解物、細胞ホモジネート、組織溶解物、組織ホモジネート、細胞培養上清または組織培養上清から選択され得る。

【0026】

好ましくは、試料は、細胞溶解物または細胞ホモジネートである。

【0027】

「容器」という用語は、プレートのウェル、試験管または本発明による方法の実施に必要な試料を試薬と混合するのに適した任意の他の容器を示す。

【0028】

本発明の意味内で、「リガンド」という用語は、標的分子に結合可能な分子を表す。本発明の文脈において、標的分子はＰＮＡＦβである。そのため、これは、「ＰＮＡＦβのリガンド」と呼ばれる。リガンドは、タンパク質性（例えば、タンパク質またはペプチド）である場合も、ヌクレオチド性（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である場合もある。本発明の文脈において、リガンドは、有利には、抗体、抗体断片、ペプチドまたはアプタマー、好ましくは、抗体または抗体断片から選択される。

【0029】

本発明の意味内で、「ＰＮＡＦβに特異的に結合可能なリガンド」または「ＰＮＡＦβに特異的に結合可能なリガンドの対」という用語は、ＰＡＦβに関してＰＮＡＦβに優先的に結合するリガンドまたはリガンドの対、すなわち、少なくとも１つのＰＮＡＦβに関して、対応するＰＡＦβに関して生成されるシグナルよりも、２倍高い、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６倍高いシグナル（例えば、ＥＬＩＳＡシグナルまたはＲＥＴシグナル）を生成可能な、リガンドまたはリガンドの対を示す。本出願の実施例１～４および２５は、リガンドまたはリガンドの対がＰＮＡＦβに特異的に結合可能であるか否かを容易に決定することを可能にするＥＬＩＳＡおよびＦＲＥＴ法を記載する。

【0030】

有利には、「ＰＮＡＦβに特異的に結合可能なリガンド」または「ＰＮＡＦβに特異的に結合可能なリガンドの対」は、対応するＰＡＦβに対する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で、例えば、対応するＰＡＦβに対する親和性よりも少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い親和性でＰＮＡＦβに結合可能である。ＰＮＡＦβに特異的に結合可能なリガンドの対の場合には、リガンドの対がＰＮＡＦβに対して特異的であるためには、リガンドの対の２つのリガンドがＰＮＡＦに対して特異的である必要はない。実際、リガンドの対がＰＮＡＦβに対して特異的であるためには、リガンドの対の２つのリガンドのうち少なくとも１つがＰＮＡＦβに対して特異的なリガンドであることで十分である。それにもかかわらず、リガンドの対の両リガンドがＰＮＡＦβに対して特異的なリガンドである場合もある。

【0031】

「親和性」という用語は、リガンドおよび抗原の間のすべての非共有結合相互作用の強度を指す。親和性は、普通、解離定数（Ｋｄ）によって表される。Ｋｄの値が低いほど、リガンドとその標的の間の結合親和性は高くなる。解離定数（Ｋｄ）は、周知の方法によって、例えば、ＦＲＥＴによって、ＥＬＩＳＡによって、またはＳＰＲによって測定できる。したがって、文献に記載される技術によって、リガンドまたはリガンドの対が、ＰＮＡＦβに対して特異的であるか否かを知ることが容易になる。

【0032】

「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」とも呼ばれ、鎖内および鎖間ジスルフィド橋によって一緒に結合された、各々およそ５０～７０ｋＤａの２つの重鎖（重に対してＨ鎖と呼ばれる）および各々およそ２５ｋＤａの２つの軽鎖（軽に対してＬ鎖と呼ばれる）からなるヘテロ四量体を指す。各鎖は、Ｎ末端位置に、軽鎖についてＶＬ、重鎖についてＶＨと呼ばれる可変領域またはドメインならびにＣ末端位置に、軽鎖についてＣＬと呼ばれる単一ドメインおよび重鎖についてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４と呼ばれる３つまたは４つのドメインで構成されている定常領域から構成される。各可変ドメインは、一般に、４つの「ヒンジ領域」（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と呼ばれる）および「ＣＤＲ」と呼ばれる（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれる）抗原との結合に直接的に関与する３つの領域を含む。「抗体」は、哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウスまたはラットまたはラクダ類）、ヒト化、キメラ、組換え起源であり得る。好ましくは、当業者に広く知られた技術に従って遺伝子改変された細胞によって組換えによって産生されたモノクローナル抗体である。抗体は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、好ましくは、ＩｇＧのものであり得る。

【0033】

「抗体断片」という用語は、酵素消化によって得られた、または生物学的生産によって得られる、少なくとも１つのジスルフィド橋を含む、全抗体によって認識される抗原に結合可能である免疫グロブリンの任意の部分、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディー、線形抗体（「単一ドメイン抗体」もしくはｓｄＡｂ、またはナノボディーとも呼ばれる）、単一鎖を有する抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を意味する。ペプシンを用いる免疫グロブリンの酵素消化は、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片を生成し、いくつかのペプチドにわけられる。Ｆ（ａｂ’）２は、鎖間ジスルフィド橋によって結合された２つのＦａｂ’断片で構成されている。Ｆａｂ部分は、可変領域ならびにＣＨ１およびＣＬドメインで構成されている。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ領域およびヒンジ領域で構成されている。Ｆａｂ’－ＳＨとは、ヒンジ領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片を指す。

【0034】

「トレーサー」という用語は、適切な検出デバイスを用いて検出できるシグナルを直接的または間接的に放出可能な化学的または生物学的物質を意味する。蛍光、発光、放射活性または酵素的トレーサーであり得る。特定の実施形態では、トレーサーは、ＲＥＴパートナーの対のメンバーである。

【0035】

「ＲＥＴ」（「共鳴エネルギー移動」から）という用語は、エネルギー移動技術を示す。ＲＥＴは、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴであり得る。

【0036】

「ＦＲＥＴ」（「蛍光共鳴エネルギー移動」から）という用語は、２つの蛍光分子間のエネルギーの移動を示す。ＦＲＥＴは、エネルギードナーとエネルギーアクセプター間の双極子－双極子相互作用に起因する非放射性エネルギー移動として定義される。この物理現象は、これらの分子の間のエネルギー適合性を必要とする。これは、ドナーの発光スペクトルが、アクセプターの吸収スペクトルに少なくとも部分的に重複しなくてはならないということを意味する。フェルスターの理論と一致して、ＦＲＥＴは、２つの分子、ドナーおよびアクセプターを離す距離に依存するプロセスである：これらの分子が互いに近い場合には、ＦＲＥＴシグナルが放出される。

【0037】

「ＢＲＥＴ」（「生物発光共鳴エネルギー移動」から）という用語は、生物発光分子と蛍光分子の間のエネルギーの移動を示す。

【0038】

「ＲＥＴパートナーの対」という用語は、エネルギードナー化合物（本明細書において以下、「ドナー化合物」）およびエネルギーアクセプター化合物（本明細書において以下、「アクセプター化合物」）からなる対を示し、互いに極接近し、ドナー化合物の励起波長で励起されると、これらの化合物は、ＲＥＴシグナルを放出する。２つの化合物がＲＥＴパートナーであるには、ドナー化合物の発光スペクトルは、アクセプター化合物の励起スペクトルと部分的に重複しなくてはならないということが知られている。例えば、これは、蛍光ドナー化合物およびアクセプター化合物を使用する場合の「ＦＲＥＴパートナーの対」またはドナー生物発光化合物およびアクセプター化合物を使用する場合の「ＢＲＥＴパートナーの対」の場合である。

【0039】

「ＲＥＴシグナル」という用語は、ドナー化合物とアクセプター化合物の間のＲＥＴを代表とする任意の測定可能なシグナルを示す。したがって、例えば、ＦＲＥＴシグナルは、ドナー蛍光化合物またはアクセプター化合物の、後者が蛍光である場合の強度または発光寿命の変動であり得る。

【0040】

＜＜２つの容器＞＞検出法
第１の態様によれば、本発明は、試料においてβシート凝集体を形成するタンパク質のβシート凝集体形態（ＰＡＦβ）を検出するためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
ａ）第１の容器において：
ａ１）ＰＡＦβを含有する可能性が高い試料を入れるステップ、
ａ２）βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート非凝集体形態（ＰＮＡＦβ）を得るためにＰＡＦβのすべてまたは一部分を脱凝集するために、ｐＨを９．７～１３．２の範囲のｐＨに調整するステップ、
ａ３）ｐＨを６～９の範囲のｐＨに調整するステップ、
ｂ）適切な免疫学的方法を用いて第１の容器中のＰＮＡＦβ含量を測定するステップ、
ｃ）第２の容器において：
ｃ１）ステップａ１）と同一の試料を入れるステップ、
ｃ２）ｐＨを６～９の範囲のｐＨに調整するステップ、
ｄ）ステップｂ）と同一の方法を使用して第２の容器中のＰＮＡＦβ含量を測定するステップ、
ｅ）ステップｂ）およびｄ）において測定された含量を比較し、ステップｂ）において測定された含量と比較したステップｄ）において測定された含量の減少が、試料がＰＡＦβを含有することを示すステップ
を含む方法に関する。

【0041】

本発明による方法の一般的な原理が図１に例示されている。

【0042】

以下、方法を詳細に段階的に記載する。
ステップａ）
ステップａ１）は、第１の容器において、ＰＡＦβを含有する可能性が高い試料を入れるステップからなる。試料は、方法のステップ、特に、ＰＮＡＦβ含量を測定するステップを適宜実施できるように事前に調製できる。例えば、試料が組織または細胞である場合に、適切な溶媒、例えば、水中で溶解すること、粉砕すること、濾過することおよび／または分解することによって事前に調製できる。当業者ならば、試料を調製することは困難ではないであろう。

【0043】

ステップａ２）は、βシート凝集体を形成するタンパク質のβシート非凝集体形態（ＰＮＡＦβ）を得るためにＰＡＦβのすべてまたは一部分を脱凝集するために、ｐＨを９．７～１３．２の範囲のｐＨに調整するステップからなる。本出願人は、実際に９．７～１３．２の範囲のｐＨによってＰＡＦβを脱凝集することが可能になることに気づいた。この脱凝集現象によって、ＰＡＦβからＰＮＡＦβを得ることが可能になる。

【0044】

９．７～１３．２の範囲のｐＨでのこの脱凝集の現象は、先行技術において記載された脱凝集法は、むしろ酸性ｐＨで強力な洗浄剤を用いておよび／または超音波処理によってＰＮＡＦβを処置することからなるので、実に驚くべきことである。例えば、［７］に記載された作業は、アミロイド線維から相対的に単量体のアミロイドタンパク質を得るための種々の方法を示す。第１のアプローチでは、アミロイド線維の調製物が、酸、８８％ギ酸を、強力な界面活性剤タイプの洗浄剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と組み合わせることによって処置される。代替法として、カオトロピック剤、チオシアン酸グアニジンの飽和溶液（６．８Ｍ）をＳＤＳと組み合わせることがある。両方の場合において、著者らは、比較的単量体のアミロイドタンパク質（単量体および二量体の混合物）を支持してアミロイド線維の消失に注目できた。別の研究［８］には、生体試料を処置して、それらが含有するアミロイドタンパク質（β１－４２アミロイドペプチド）を脱凝集し、その後、それらをＥＬＩＳＡ試験によってアッセイする異なる方法が記載されている。マウス脳の抽出物または患者の脳脊髄液が、アミロイドタンパク質を脱凝集するためにフッ素化アルコール（ＨＦＩＰ）または酸（ＴＦＡ）の溶液を用い、１５分間の超音波処理と併用して処置される。次いで、窒素の一定流の下で乾燥することによってＨＦＩＰまたはＴＦＡが除去される。脱凝集されたアミロイドタンパク質を含有する乾燥試料が次いで、１％ＮＨ_４ＯＨ溶液に溶解され、その後分析される。著者らは、これら２種類の処置によって、β１４２アミロイドペプチド凝集体を脱凝集し、それによってその定量化を改善することが可能となると示唆している。

【0045】

それにもかかわらず、本出願人は、先行技術に記載された脱凝集方法では、生理学的ｐＨ（実施例５～１７を参照されたい）で実行することを必要とする免疫学的方法を用いてＰＮＡＦβ含量を測定することはできないことを示した。

【0046】

本発明の方法は、ＰＡＦβを脱凝集するために酸性ｐＨでの処置を必要としない。それどころか、本出願人は、ＰＡＦβを９．７～１３．２の範囲のｐＨで処置することによって脱凝集が可能であったことを示しただけでなく、この処置が、その後のＰＮＡＦβ含量を測定することを目的とする免疫学的方法の実施と完全に適合していたことも示した。

【0047】

有利には、ステップａ２）は、ｐＨを１０～１３．２の範囲のｐＨ、例えば、１１～１３．２の範囲のｐＨ、１１．５～１３．２の範囲のｐＨ、１２～１３．２の範囲のｐＨ、１２．５～１３．２の範囲のｐＨ、１２．８～１３．２の範囲のｐＨ、１０～１３の範囲のｐＨ、１１～１３の範囲のｐＨ、１２～１３の範囲のｐＨ、例えば、約１２．８に調整するステップからなる。

【0048】

ｐＨは、塩基、例えば、強塩基、例えば、ＫＯＨまたはＮａＯＨ、好ましくは、ＮａＯＨを用いて調整される。

【0049】

ステップａ２）の期間は、さまざまなパラメータ、例えば、使用される塩基または使用されるＰＦβに応じて変わり得る。特に、ステップａ２）は、少なくとも３０秒、例えば、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、例えば、３０秒から６０分の間または５分から３０分の間持続する場合がある。当業者ならば、ＰＮＡＦβを得るために、ＰＡＦβのすべてまたは一部分を脱凝集するように管理するためにステップａ２）の期間を適応させることは困難ではないであろう。

【0050】

ステップａ３）は、ｐＨを６～９の範囲のｐＨに調整するステップからなる。このステップは、ステップｂ）の免疫学的方法を実行することを可能にするので重要である。

【0051】

有利には、ステップａ３）は、ｐＨを６．４～９の範囲のｐＨ、例えば、６．４～８．４の範囲のｐＨ、６～８．５の範囲のｐＨ、７～８．５の範囲のｐＨに調整するステップからなる。

【0052】

ｐＨは、酸、例えば、強酸、例えば、ＨＣｌを用いて調整される。

【0053】

ステップｂ）
ステップｂ）は、適切な免疫学的方法（または適切な「イムノアッセイ」）を用いて第１の容器においてＰＮＡＦβ含量を測定するステップからなる。

【0054】

ステップｂ）の免疫学的方法によって、互いに同等である含量を得ることが可能になることが必要である。しかし、ステップｂ）において免疫学的方法が定量的である必要はないが、定量的である場合もある。ステップｂ）の免疫学的方法は少なくとも、相対含量の測定を可能にしなくてはならず、これを、同一免疫学的方法によって測定される別の相対含量と比較できる。

【0055】

特定の実施形態では、ステップｂ）において実行される免疫学的方法は、
（ｉ）ＰＮＡＦβに特異的に結合可能なリガンドであって、トレーサーで標識されているリガンド、または
（ｉｉ）ＰＮＡＦβに特異的に結合可能なリガンドの対であって、リガンドの対の少なくとも１つのリガンドがトレーサーで標識されている、リガンドの対
を使用する。

【0056】

リガンド（ｉ）は、抗体、抗体断片、ペプチドまたはアプタマー、好ましくは、抗体から選択され得る。リガンドの対（ｉｉ）は、抗体の対、抗体断片の対、ペプチドの対またはアプタマーの対、好ましくは、抗体の対から選択され得る。

【0057】

当業者ならば、例えば、マウスをＰＦβを用いて免疫化することによって、免疫化マウスの脾臓のリンパ球からリンパ球ハイブリダイゼーションを実施して、ハイブリドーマを生成することによって、および各ハイブリドーマの抗体をＰＮＡＦβに特異的に結合するその能力について試験することによって、所望の特性を有する抗体または抗体断片を得ることおよび／または選択することに困難はないであろう。抗ＰＮＡＦβ抗体の生成のための、次いで、特異的抗体の選択のための完全プロトコールの例が、実施例１～４および２５に詳述されている。したがって、例えば、実施例１～４および２５に記載される方法を実行することによって本発明による方法の実施のために、任意のＰＮＡＦβに対する抗体または抗体の対を得ることは極めて容易である。

【0058】

ＰＮＡＦβおよびＰＡＦβを得ることは、当業者の理解の範囲内である。例えば、「プリオン様」タンパク質と呼ばれるタンパク質、例えば、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ、ＴＡＦ１５およびＥＷＳＲ１について、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合されたこれらのタンパク質（タンパク質に応じてＮまたはＣ末端融合物）の生成によって、ＧＳＴ融合タンパク質を得ることが可能となり、その比濁法分析はそれらが非凝集体形態であることを示す［９］［１０］［１３］。タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）切断部位が、目的のＰＦβとＧＳＴの間に挿入される場合、ＧＳＴタンパク質のＴＥＶを用いる処置と、それに続く精製ステップによって、標識を用いずにＧＳＴタンパク質を得ることが可能となる。前記タンパク質が室温で撹拌しながら１時間３０静置されると、比濁法分析によって、それらが凝集体形態であることが示される［１０］［１３］。ＧＳＴに融合されたＰＦβはまた市販されており、例えば、Ａｂｎｏｖａ製：ＧＳＴ－ＴＤＰ－４３（参照Ｈ０００２３４３５－Ｐ０２）、ＧＳＴ－ＦＵＳ１（参照Ｈ００００２５２１－Ｐ０１）、ＧＳＴ－ＴＡＦ１５（参照Ｈ００００８１４８－Ｐ０２）ＧＳＴ－ＥＷＳＲ１（参照Ｈ００００２１３０－Ｑ０１）。

【0059】

アミロイドペプチド、特に、β１－４０およびβ１－４２形態も、多数の供給業者から粉末形態で入手可能である。これらの粉末のＨＦＩＰまたはＮＨ_４ＯＨでの可溶化によって、９０％より多い非凝集体形態を含有する保存溶液を得ることが可能となる。生理学的ｐＨ値を有するバッファーで前もって希釈したこれらの溶液の即時使用によって、非凝集体形態の試料を有することが可能となる。逆に、数時間～数日のインキュベーション、例えば、生理学的バッファー中、室温でのこれらの同一保存溶液の２４時間を超えるインキュベーションによって、極めて高割合の凝集体形態を含有する試料を得ることが可能となる［１１］。

【0060】

ＰＮＡＦβおよびＰＡＦβを含有する試料はまた、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ（ｗｗｗ．ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ．ｃｏｍ）から得ることができる。これは、特に、アルファ、ベータおよびガンマシヌクレイン、ＴＡＵタンパク質、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）タンパク質またはトランスサイレチン（ＴＴＲ）の場合である。

【0061】

有利には、ステップｂ）において実行される免疫学的方法は、ＥＬＩＳＡ法またはＲＥＴ法、例えば、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴである。

【0062】

使用される方法に応じて、ステップｂ）の測定は、適切な試薬を添加することによって第１の容器において直接的に、または第１の容器の内容物のすべてまたは一部分を有する別の容器において行うことができる。例えば、ＲＥＴ法の試薬は、第１の容器に直接的に添加することができる。逆に、ＥＬＩＳＡ法は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法の実施に適応している別の容器において、特に、底部にＰＮＡＦβリガンドが事前に固定化されている容器において実施される。

【0063】

特定の実施形態では、ステップｂ）は、ＲＥＴ法によって実施され、
（ｂ１）容器中に、ＲＥＴパートナーの対の第１のメンバーで標識された第１のＰＮＡＦβリガンドおよびＲＥＴパートナーの対の第２のメンバーで標識された第２のＰＮＡＦβリガンドを入れ、リガンドの対は、ＰＮＡＦβに特異的に結合できるステップ、ならびに
（ｂ２）容器において放出されたＲＥＴシグナルを測定するステップ
からなる。

【0064】

ＲＥＴ法の実施のために、第１のリガンドおよび第２のリガンドは、ＰＮＡＦβへの結合について競合してはならない、例えば、第１のリガンドおよび第２のリガンドは、ＰＮＡＦβ上の同一エピトープに結合してはならないことは明らかである。実施例１～４および２５に記載される方法を実施することによって適切なリガンドの対を選択することは容易である。

【0065】

リガンドは、直接的または間接的に標識できる。ＲＥＴパートナーの対のメンバーによるリガンドの直接標識は、リガンド上の反応性基の存在に基づいて当業者に公知の従来法によって実施できる。例えば、リガンドが抗体または抗体断片である場合には、以下の反応性基を使用できる：末端アミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシレート基、リジンのアミン基、アルギニンのグアニジン基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基、トリプトファンのインドール環、メチオニンのチオエーテル基、ヒスチジンのイミダゾール基。

【0066】

反応性基は、ＲＥＴパートナーの対のメンバーによって保持される反応性基と共有結合を形成できる。ＲＥＴパートナーの対のメンバーによって保持される適切な反応性基は、当業者には周知であり、例えば、マレイミド基によって官能基付与されたドナー化合物またはアクセプター化合物は、例えば、タンパク質またはペプチド、例えば、抗体または抗体断片によって保持されるシステインによって保持されるチオール基と共有結合によって結合可能となる。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを保持するドナー／アクセプター化合物は、タンパク質またはペプチド上に存在するアミンに共有結合によって結合できる。

【0067】

リガンドはまた、蛍光または生物発光化合物を用いて間接的に標識できる、例えば、抗体または抗体断片を、それ自体がアクセプター／ドナー化合物に共有結合によって結合している測定媒体中に導入し、この第２の抗体または抗体断片がリガンドを特異的に認識することによって標識できる。

【0068】

間接標識の別の極めて従来的な手段は、ビオチンを標識されるべきリガンドに付着すること、次いで、このビオチン化リガンドをアクセプター／ドナー化合物で標識されたストレプトアビジンの存在下でインキュベートすることからなる。適したビオチン化リガンドは、当業者に周知の技術によって調製できる；ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓは、例えば、商品名が「ｄ２」である、フルオロフォアで標識されたストレプトアビジンを市販している（参照６１０ＳＡＤＬＡ）。

【0069】

有利には、ＲＥＴパートナーの対のメンバーの一方は、蛍光ドナーまたは発光ドナー化合物であり、ＲＥＴパートナーの対のもう一方のメンバーは、蛍光アクセプター化合物または非蛍光アクセプター化合物（クエンチャー）である。

【0070】

ＲＥＴがＦＲＥＴである場合には、ドナー蛍光化合物は、ユウロピウムクリプテート、ユウロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体およびニトロベンゾオキサジアゾールから選択されるＦＲＥＴパートナーであり得る。ＲＥＴがＦＲＥＴである場合には、アクセプター蛍光化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰバリアント、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰトパーズ、ＹＦＰシトリン、ＹＦＰヴィーナスおよびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰバリアント、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＦＲＥＴパートナーであり得る。

【0071】

ＲＥＴがＢＲＥＴである場合には、ドナー発光化合物は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼのバリアント（Ｒｌｕｃ８）およびホタルルシフェラーゼから選択されるＢＲＥＴのパートナーであり得る。ＲＥＴがＢＲＥＴである場合には、アクセプター蛍光化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ホウ素－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰバリアント、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰトパーズ、ＹＦＰシトリン、ＹＦＰヴィーナスおよびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰバリアント、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄから選択されるＢＲＥＴパートナーである。

【0072】

特定の実施形態では、ステップｂ）は、ＥＬＩＳＡ法によって実施され、
（ｂ１）底部に第１のＰＮＡＦβリガンドが固定化されている容器中に、試料のすべてまたは一部分を入れ、次いで、トレーサーで標識された第２のＰＮＡＦβリガンドを入れ、リガンドの対がＰＮＡＦβに特異的に結合可能であるステップ、
（ｂ２）容器において放出されたＥＬＩＳＡシグナルを測定するステップ
からなる。

【0073】

ＥＬＩＳＡ法は、先行技術において広く記載されており、当業者には実施の困難は全くない。

【0074】

ステップｃ）
ステップｃ）は、第１の容器中に、ｃ１）ステップａ１）と同一の試料を入れるステップからなる。

【0075】

ステップａ）に反して、ｐＨは、ステップｃ）の間に９．７～１３．２の範囲のｐＨに調整される。ｐＨは、６～９の範囲のｐＨ（ステップｃ２））に、好ましくは、ステップａ３）のｐＨと同一のｐＨに直接的に調整される。

【0076】

ステップｃ２）のｐＨは、酸／塩基混合物、例えば、強酸／強塩基混合物を用いて調整できる。例えば、ＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物であり得る。好ましくは、ステップｃ２）において使用される酸は、ステップａ３）において使用されるものと同一であり、ステップｃ２）において使用される塩基は、ステップａ２）において使用される塩基と同一である。

【0077】

ステップｄ）
ステップｄ）は、ステップｂ）と同一の方法を用いて第２の容器中のＰＮＡＦβ含量を測定するステップからなる。ステップｄ）は、ステップｂ）と同一の方法で実行され、測定値を比較し、ステップｅ）を実行できる。

【0078】

したがって、ステップｂ）がＲＥＴ法によって実施される場合には、ステップｄ）は、
（ｄ１）容器中に、ＲＥＴパートナーの対の第１のメンバーで標識された第１のＰＮＡＦβリガンドおよびＲＥＴパートナーの対の第２のメンバーで標識された第２のＰＮＡＦβリガンドを入れ、リガンドの対が、ＰＮＡＦβに特異的に結合できるステップ、ならびに
（ｄ２）容器において放出されたＲＥＴシグナルを測定するステップ
からなる。

【0079】

同一方法では、ステップｂ）がＥＬＩＳＡ法によって実施される場合には、ステップｄ）は、
（ｄ１）底部に第１のＰＮＡＦβリガンドが固定化されている容器中に、試料のすべてまたは一部分を入れ、次いで、トレーサーで標識された第２のＰＮＡＦβリガンドを入れ、リガンドの対がＰＮＡＦβに特異的に結合可能であるステップ、
（ｄ２）容器において放出されたＥＬＩＳＡシグナルを測定するステップ
からなる。

【0080】

ステップｅ）
ステップｅ）は、ステップｂ）において、およびステップｄ）において測定された含量を比較し、ステップｂ）において測定された含量と比較したステップｄ）において測定された含量の減少が、試料がＰＡＦβを含有することを示すステップからなる。

【0081】

第１のおよび第２の容器が交換された場合には、ステップｅ）が、ステップｂ）において、およびステップｄ）において測定された含量を比較し、ステップｂ）において測定された含量と比較したステップｄ）において測定された含量の増大が、試料がＰＡＦβを含有することを示すステップからなることは明らかである。

【0082】

当業者ならば、ステップｂ）およびｄ）において測定された含量を容易に比較し、増大または減少を認定することを可能にする閾値を定義できる。例えば、５％より大きい、１０％より大きい、１５％より大きい、２０％より大きい、２５％より大きい測定された含量間の差。閾値の決定は、選択された免疫学的方法に固有の変動性に応じて変わる場合がある。

【0083】

当業者ならば、例えば、ステップｂ）およびｄ）において測定された含量間の比を算出できるであろう。一般に、測定された含量間の差が大きいほど、測定された含量間の比が大きくなり、試料中のＰＡＦβの量が多くなる。

【0084】

免疫学的方法がＥＬＩＳＡ法またはＲＥＴ法である場合には、ステップｂ）およびｄ）において測定されたＲＥＴシグナルまたはＥＬＩＳＡシグナルが比較される。したがって、ＲＥＴシグナルの減少またはＥＬＩＳＡシグナルの減少は、試料がＰＡＦβを含有することを示す。有利には、比は、第１の容器において測定されたシグナル（ステップｂ））と、第２の容器において測定されたシグナル（ステップｄ））の間で算出される。比の算出は、手作業で、または自動で行うことができる。

【0085】

好ましくは、ステップａ３）とステップｂ）の間および／またはステップｃ２）とステップｄ）の間の期間は、ＰＮＡＦβがＰＡＦβに再凝集することを防ぐように適応される。期間は、２４時間未満、例えば、５時間未満となることが好ましい。有利には、ステップｂ）およびｄ）は、それぞれステップａ３）およびｃ２）に続いて、すなわち、ステップａ３）およびｃ２）後３０分未満に実施される。当業者は、ステップｃ）および／またはステップｄ）の前に、ＰＮＡＦβのすべてまたは一部分がＰＡＦβに再凝集することを防ぐように、ステップａ３）の、および／またはステップｃ２）の期間を適応させることに困難はないであろう。

【0086】

ステップｅ）における２つの試料中の含量の比較によって、凝集のレベルを、特に、先行技術のほとんどの方法と比較して極めて正確に測定することが可能となる。

【0087】

治療効力をモニタリングする方法
本発明はまた、患者においてＰＡＦβと関連する疾患の処置の治療効力をモニタリングするためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
Ａ）ステップｅ）が、ステップｂ）で測定された含量とステップｄ）で測定された含量の間の比（「試料１の比ｂ）／ｄ）」）を決定することからなる、前記患者の第１の試料で本発明による方法を実行するステップ、
Ｂ）前記患者の第２の試料でステップＡ）と同一の方法を実行して、「試料２の比ｂ）／ｄ）」を決定するステップ、
Ｃ）ステップＡ）およびＢ）において決定された比を比較し、ステップＢ）において決定された比が、ステップＡ）において決定された比よりも低い場合に治療効力が観察されるステップ
を含む、方法に関する。

【0088】

処置は、ＰＡＦβと関連する疾患の公知の処置または実験的処置であり得る。試料は、好ましくは、ＰＡＦβ関連疾患を有する個体に由来する。

【0089】

処置の有効性をモニタリングできるためには、第１の試料および第２の試料は、異なる時点で患者から採取され、例えば、第１の試料はＴ１の時点で採取され、第２の試料はＴ２の時点で採取される。有利には、第１の試料は、第２の試料の前に採取される、例えば、第１の試料が、Ｔ１の時点、患者の処置の前または前記処置の間で採取され、第２の試料が、Ｔ２の時点、前記処置後または前記処置の間に採取される。第１の試料の収集と第２の試料の収集の間に経過する時間は、処置の治療的有効性を検出できるように選択される。

【0090】

薬理学的有効性の測定をモニタリングする方法
本発明はまた、試験試料においてＰＡＦβと関連する疾患に対する薬物分子または薬物候補の薬理学的有効性を測定するためのｉｎｖｉｔｒｏ法であって、以下のステップ：
Ａ）ステップｅ）が、ステップｂ）で測定された含量とステップｄ）で測定された含量の間の比（「試料１の比ｂ）／ｄ）」）を決定することからなる、前記試験試料の第１の試料で本発明による方法を実行するステップ、
Ｂ）前記試験試料の第２の試料でステップＡ）と同一の方法を実行して、「試料２の比ｂ）／ｄ）」を決定するステップ、
Ｃ）ステップＡ）およびＢ）において決定された比を比較し、ステップＢ）において決定された比が、ステップＡ）において決定された比よりも低い場合に薬理学的有効性が観察されるステップ
を含む、方法に関する。

【0091】

分子は、薬物または薬物候補であり得る。試料は、好ましくは、ｉｎｖｉｔｒｏで培養された細胞または組織に由来する。結果として、薬物分子または薬物候補は、好ましくは、ＰＡＦβと関連する疾患のｉｎｖｉｔｒｏモデルで試験される。このようなモデルは、文献において広く記載される。

【0092】

試験試料は、ｉｎｖｉｔｒｏで薬物または薬物候補を試験することを可能にする試料に対応し、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏで培養された細胞の試料またはｉｎｖｉｔｒｏで培養された組織の試料であり得る。試験試料は、「ＰＡＦβと関連する疾患のｉｎｖｉｔｒｏモデル」と一般に呼ばれるものに対応する。したがって、薬物分子または薬物候補の薬理学的有効性を測定できるためには、第１の試料および第２の試料は、異なる時点で試験試料から採取され、例えば、第１の試料はＴ１の時点で採取され、第２の試料はＴ２の時点で採取される。有利には、第１の試料は、第２の試料の前に採取される、例えば、第１の試料が、Ｔ１の時点、薬物分子または薬物候補を用いる試験試料の処置の前に採取され、第２の試料が、Ｔ１の時点、前記処置後に採取される。第１の試料の採取と第２の試料の採取の間に経過する時間は、薬物分子または薬物候補の薬理学的有効性を検出できるように選択される。

【実施例】

【0093】

本発明をここで、以下の限定されない実施例によって説明する。

【0094】

実施例１
ＰＮＡＦβに特異的な抗体を同定する方法

【0095】

抗ＰＮＡＦβ抗体の作製
マウス免疫化
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、生理学的条件下で調製されたリン酸バッファーで事前に希釈したＰＮＡＦβタンパク質の注射によって免疫化する。ＰＮＡＦβ多量体または凝集体の有無は、マウスの免疫応答を非凝集体形態に向けるために注射のために意図されるバッファー中で確認される。第１の注射に、３回のブースターを毎月の間隔で続ける。

【0096】

各注射の１５日後、マウスで血液穿刺を実施し、抗体の力価測定によって免疫応答の存在を確認する。

【0097】

ＥＬＩＳＡ試験による抗ＰＮＡＦβ抗体における免疫血清の力価測定
この目的のために、ＰＦβの性質に応じてＥＬＩＳＡ型免疫検出試験を実行する。アミロイド型ＰＦβまたはペプチドについては、ＰＮＡＦβを、ビオチン、炭素リンカーおよびＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）反応性基から構成される試薬を使用して、ビオチンを用いてその第一級リジンで事前に標識する。非アミロイドまたはアミロイドＰＦβについては、ＧＳＴ融合物中のＰＮＡＦβを、グルタチオン基で機能付与されたＥＬＩＳＡマイクロプレートを使用することによってＧＳＴタグを介して９６ウェルプレート上に直接的に固定化する。ビオチン標識されたタンパク質を、ストレプトアビジンを用いて機能付与されたマイクロプレートを使用してビオチンを介して９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に固定化する。この目的のために、１００μｌのＧＳＴ融合物および／またはビオチン化ＰＮＡＦβ溶液を各ウェルに添加し、次いで、室温で２時間インキュベートする。次いで、ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を補給したＰＢＳバッファーで３回洗浄する。洗浄溶液を除去した後、次いで、各ウェルを、ＰＢＳ、５％ＢＳＡから構成される２００μＬのブロッキング溶液とともに４℃で一晩インキュベートする。

【0098】

次いで、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡバッファー中、ウェルあたり１００μＬのレベルで、２連で血液試料の１０００万～１億倍の段階希釈（免疫血清）を添加し、撹拌しながら２時間インキュベートする。２００μｌのＰＢＳ１×バッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０での３回の洗浄ステップによって、固定化されたＰＮＡＦβに結合していない非特異的抗体を排除する。特異的な抗体の存在の可能性を、ウェルあたり１００μＬの、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合されたマウス抗Ｆｃ二次抗体（ＰＢＳ、ＢＳＡ０．１％で１／１００００に希釈されたＳｉｇｍａ番号Ａ０１６８）を使用して検出する。撹拌しながら室温での１時間のインキュベーション、次いで、２００μＬのＰＢＳ１×バッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の下で３回の洗浄後、４５０ｎｍでの発色アッセイによってＨＲＰの顕色を、そのＴＭＢ基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ番号Ｔ０４４０）の室温で撹拌しながら２０分間のインキュベーション後に実施する。次いで、このブロッキング溶液を吸引によって除去し、プレートを将来の使用のために４℃で保存する。

【0099】

ＥＬＩＳＡ試験によって検出された抗体が実際にＰＮＡＦβタンパク質に対して向けられており、ＧＳＴタグまたはビオチンに対するものではないことを確実にするために、同一穿刺を、過剰の、ＧＳＴまたはビオチンでタグが付けられた別の直交性タンパク質とのプレインキュベーション後にＥＬＩＳＡ試験で試験した。したがって、抗タグ抗体は、タグが付けられた直交性タンパク質に結合し、それゆえ、ウェルの底部に固定化されたＰＮＡＦβタンパク質に結合せず、この場合、ＨＲＰシグナルは検出されない、またはＨＲＰシグナルの低下が検出される。

【0100】

融合＆クローニング
最良の抗ＰＮＡＦβ抗体力価（シグナル、すなわち、４５０ｎｍで高い光学濃度）を有し、抗ＴＡＧ対照の場合にはシグナルの最小の低下を有するマウスを、融合とも呼ばれるリンパ球ハイブリダイゼーションの次のステップのために選択する。マウス脾臓を摘出して、リンパ球および形質細胞の混合物を単離する。この多細胞試料をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タイプの細胞融合触媒の存在下でｉｎｖｉｔｒｏで骨髄腫細胞株と融合する。酵素ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチングアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を欠損した突然変異体骨髄腫細胞株を使用して、ハイブリドーマと呼ばれるハイブリッド細胞の選択を可能にする。これらの細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン（メトトレキサート）およびチアミンを含有する培地（ＨＡＴ培地）で培養して、融合されていない骨髄腫細胞の排除を可能にし、したがって、目的のハイブリドーマを選択する。他方、融合していない脾臓細胞は、それらがｉｎｖｉｔｒｏで増殖できないので死滅する。したがって、ハイブリドーマのみがｉｎｖｉｔｒｏでこの選択圧を生き残る。

【0101】

これらのハイブリドーマを、培養プレートで培養する。これらのハイブリドーマの上清を試験して、抗ＰＮＡＦβ抗体を産生するその能力を評価する。この目的のために、ＥＬＩＳＡ試験を上記のように実施する。クローンを選択するために使用される最小閾値は、非特異的のものの４倍とする。安定なハイブリドーマクローンを得るために、最良ハイブリドーマを制限希釈ステップを用いてクローニングする。

【0102】

選択されたクローンを、ハイブリドーマのバンクを形成することを目的として培養し、細胞生存力について試験し、液体窒素中で保存する。このステップでは、クローンによって産生された抗体を、例えば、産生株細胞において抗体を産生できるように、先行技術において十分に記載された方法によって容易にシーケンシングできる。あるいは、抗体を以下に記載されるように生成する。

【0103】

抗ＰＮＡＦβ抗体の生成
腹水の液体における多量の抗体の産生を可能にするために、目的のハイブリドーマのクローンを培養物に戻し、次いで、細胞接種材料をＢＡＬＢ／ｃマウス中に注射（腹腔内注射、ＩＰ）する。

【0104】

抗体含量を定量化および定性化することを目的とするさまざまな技術による腹水の内容物の特性決定後、次いで、プロテインＡがグラフトされた樹脂を含むカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって、任意選択の塩を用いる沈殿後に前記抗体を精製する。カラムを洗浄して、抗体から離れた成分を除去した後、グリシンバッファーで酸性ｐＨでショックを与えることによって抗体含量を溶出する。ｐＨ中和および中性ｐＨのバッファーに対する透析後、抗ＰＮＡＦβ抗体は、４℃での保存または凍結およびその後の使用／特性決定（アイソタイピング、アッセイ、機能試験）の準備が整う。

【0105】

ＰＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対の選択（ＥＬＩＳＡ法）
ＰＡＦβに対してＰＮＡＦβを優先的に認識する抗体の対を選択するために、ＥＬＩＳＡ型試験を実行する。この目的のために、試験される対の抗体の一方を、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－ＬｉｎｋラピッドビオチンタイプＡキット（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ、参照ＳＫＵ３７０－０００５）を供給業者の推奨に従って使用してビオチン化する。１から２０μｇ／ｍＬの間で構成される濃度にＰＢＳバッファーで事前に希釈した試験される対の第２の抗体を、「高結合」ＥＬＩＳＡ型の９６ウェルプレート上に吸着させる。この目的のために、１００μＬの抗体を各ウェルに添加し、次いで、４℃で２０時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳ１×バッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。洗浄溶液を除去した後、次いで、各ウェルを、２００μＬの、ＰＢＳ、５％ＢＳＡから構成されるブロッキング溶液とともに４℃で一晩インキュベートする。次いで、吸引によってこのブロッキング溶液を除去し、プレートを将来の使用のために４℃で保存する。

【0106】

同一初期濃度のＰＮＡＦβまたはＰＡＦβを含有する試料の１～１／１００倍の段階希釈を１００μＬ／ウェルのレベルで添加し、撹拌しながら室温で２時間インキュベートする。プレート上に吸着された抗体に結合されていないＰＮＡＦβまたはＰＡＦβは、ＰＢＳ１×バッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０での３回の洗浄ステップによって排除される。１０から２００ｎｇ／ｍＬの間で構成される濃度にＰＢＳバッファーで事前に希釈したビオチン化抗体を１００μＬ／ウェルのレベルで添加し、撹拌しながら室温で２時間インキュベートする。ＰＮＡＦβまたはＰＡＦβに結合されていないビオチン化抗体は、ＰＢＳ１×バッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０での３回の洗浄ステップによって排除される。結合された抗体の検出は、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで１／１０に希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、参照ＤＹ９９８）を使用して実施する。撹拌しながら室温で３０分のインキュベーション、次いで、ＰＢＳ１×バッファー、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回の洗浄の後、４５０ｎｍでの光学濃度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を測定し、続いて、撹拌しながら室温で２０分間の、そのＴＭＢ基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ番号Ｔ０４４０）のインキュベーションによってＨＲＰの顕色を実施する。

【0107】

第１のステップでは、ＰＮＡＦβの種々の希釈を用いて測定されたＯ．Ｄ．４５０ｎｍを分析することによって、ＰＮＡＦβまたはＰＡＦβの試料の参照希釈を決定する。図２に示されるように、参照希釈は、最大Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍの８０％が得られるものである。

【0108】

第２のステップでは、ＰＮＡＦβの試料の参照希釈を用いて得られたＯ．Ｄ．４５０ｎｍを、ＰＡＦβの試料の同一希釈を用いて測定されたＯ．Ｄ．４５０ｎｍと比較する。図３に示されるように、ＰＮＡＦβに特異的に結合できる抗体の対は、ＰＮＡＦβ試料で測定されたＯ．Ｄ．４５０ｎｍと比較してＰＡＦβ試料で５０％低いＯ．Ｄ．４５０ｎｍをもたらす。

【0109】

ＰＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対の選択（ＦＲＥＴ法）
ＰＡＦβを上回ってＰＮＡＦβを優先的に認識する抗体の対を選択するために、ＦＲＥＴ試験を設定する。この試験は、ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓＨＴＲＦ（登録商標）技術に基づいている。この技術の原理は、ドナー分子、テルビウムクリプテート（ドナー）と蛍光エネルギーアクセプター分子ｄ２（アクセプター）間の蛍光エネルギー移動に基づいている。図４で図示されるように、これら２つの蛍光分子を、共有結合によって抗体にグラフトし、免疫学的アッセイを実行する。この目的のために、試験される対の抗体の一方を、テルビウムクリプテート標識キット（ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓ、参照６２ＴＢＳＰＥＡ）であるキットを製造業者の推奨に従って使用してドナーＬｕｍｉ４テルビウムで標識する。使用前に、ドナーで標識された抗体を２０ｍＭＨｅｐｅｓバッファーｐＨ＝７．４、０．１％ＢＳＡで０．５ｎＭの濃度に希釈する。試験される対の第２の抗体を、ｄ２標識キット（ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓ参照６２Ｄ２ＤＰＥＡ）を供給業者の推奨に従って使用してアクセプターｄ２で標識する。使用前に、ドナーで標識された抗体を２０ｍＭＨｅｐｅｓバッファーｐＨ＝７．４、０．１％ＢＳＡで５ｎＭの濃度に希釈する。同一初期濃度のＰＮＡＦβまたはＰＡＦβを含有する試料の１～１／１００倍の段階希釈を、１６μＬ／ウェルのレベルで３８４マイクロプレートに分配する。次いで、ドナーで標識された抗体の０．５ｎＭ溶液２μＬおよびアクセプターで標識された抗体の５ｎＭ溶液２μＬを各ウェルに添加する。マイクロプレートを室温で２０時間インキュベートする。種々のプレートにおけるＦＲＥＴシグナルの検出を、ＨＴＲＦ検出モジュールを使用するＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳＬａｍｐ装置（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で実施した。

【0110】

第１のステップでは、ＰＮＡＦβの種々の希釈を用いて測定されたＨＴＲＦシグナルを分析することによって、ＰＮＡＦβまたはＰＡＦβの試料の参照希釈を決定する。図５に示されるように、参照希釈は、イムノアッセイの飽和プラトーの前の最大ＨＴＲＦシグナルの８０％が得られるものである。

【0111】

第２のステップでは、ＰＮＡＦβの試料の参照希釈を用いて得られたＨＴＲＦシグナルを、ＰＡＦβの試料の同一希釈を用いて測定されたＨＴＲＦシグナルと比較する。図６で図示されるように、ＰＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対は、ＰＮＡＦβ試料で測定されたＨＴＲＦシグナルと比較してＰＡＦβ試料で５０％低いＨＴＲＦシグナルをもたらす。

【0112】

実施例２
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対の同定を可能にする方法（ＦＲＥＴ法）
ＴＤＰ－４３ＡＦβまたはＴＤＰ－４３ＮＡＦβを含有する試料を得るための代替法は、ＨｅＬａ細胞を培養することおよびそれらをスタウロスポリンを用いて少なくとも６時間処置することまたはしないことからなる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによる細胞溶解物の分析は、未処置ＨｅＬａ細胞溶解物がＴＤＰ－４３ＮＡＦβを含有するが、一方で、スタウロスポリンで処置されたＨｅＬａ溶解物は本質的にＴＤＰ－４３ＡＦβを含有することを示す［１２］。

【0113】

方法は、実施例１において記載されたＦＲＥＴ技術（ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓからのＨＴＲＦ（登録商標）技術）に基づいている。

【0114】

試験されるべき抗体の調製
ＴＤＰ－４３に対して向けられる５種の抗体を、ドナーを用いて、およびアクセプターを用いてそれぞれ標識した。これらの標識は、ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓによって販売されている標識キット（商業的参照６２ＥＵＳＵＥＡおよび６２Ｄ２ＤＰＥＡ）を使用して実施した。得られた標識比率（抗体あたりの蛍光分子数）は、見込みと一致した。ドナーマーキング比率は５．９から７．９の間で構成された。アクセプター標識比率は、２．３から３．３の間で構成された。

【0115】

以下の表は、試験された抗体の特徴を示す。

【0116】

【表1】

【0117】

試験するために、すべての抗体をバッファーで希釈して、ドナーで標識された抗体について３ｎＭおよびアクセプターで標識されたものについて３０ｎＭのそれぞれの濃度を得た。

【0118】

ＴＤＰ－４３ＮＡＦβ（単量体）の試料の調製
フラスコ（１７５ｃｍ^２）において、完全培養培地（ＭＥＭアルファ培地＋２ｍＭＨｅｐｅｓ＋１０％補体除去ウシ胎児血清＋１％抗生物質、ペニシリン５０００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン５０００μｇ／ｍｌ）中で、５００万個の細胞を用いてＨｅＬａ細胞を播種した。７８時間後、培養培地を吸引した。次いで、細胞溶解バッファーを用いて細胞を溶解した。ＴＤＰ－４３ＮＡＦβを含有する得られた溶解物（本明細書において以下「単量体試料」）を、その使用を目的として－８０℃で凍結した。この試料を、文献［１２］において推奨されるようにウエスタンブロットによって調べて、非凝集ＴＤＰ４３（ＴＤＰ－４３ＮＡＦβ）を本質的に含有することを確実にした。

【0119】

ＴＤＰ－４３ＡＦβ（凝集体）の試料の調製
フラスコ（１７５ｃｍ^２）において、完全培養培地（ＭＥＭアルファ培地＋２ｍＭＨｅｐｅｓ＋１０％補体除去ウシ胎児血清＋１％抗生物質、ペニシリン５０００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン５０００μｇ／ｍｌ）中で、５００万個の細胞を用いてＨｅＬａ細胞を播種した。７２時間後、培養培地を吸引した。完全培地中の１μＭのスタウロスポリン溶液を、培養細胞に６時間添加した。スタウロスポリンを用いる細胞の処置によって、ＴＤＰ－４３が凝集され、ＴＤＰ－４３ＡＦβを得ることが可能となる。次いで、培養培地を吸引し、その後、細胞溶解バッファーを添加した。ＴＤＰ－４３ＡＦβを含有する得られた溶解物（本明細書において以下「凝集体試料」）を、その後の使用を目的として－８０℃で凍結した。この試料を、文献［１２］において推奨されるようにウエスタンブロットによって調べて、凝集されたＴＤＰ４３（ＴＤＰ－４３ＡＦβ）を本質的に含有することを確実にした。

【0120】

単量体または凝集体での抗体の対のスクリーニング
試験当日に、単量体および凝集体試料を解凍し、その後、３８４ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ参照７８４０７５）に分配した。

【0121】

以下の試薬を以下の順序でマイクロプレートに添加した：
－１６μＬの単量体試料または凝集体試料、
－２μＬのドナー抗体、
－２μＬのアクセプター抗体。

【0122】

次いで、プレートを室温で一晩インキュベートした。

【0123】

さまざまなプレートにおけるＦＲＥＴシグナルの検出を、ＨＴＲＦ検出モジュールを使用するＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳＬａｍｐ装置（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で実施した。対Ａｃ１－ドナー／Ａｃ４－アクセプターを用いて図７で示されるように、試験した抗体の対のすべてについて、単量体試料で、および凝集体試料でＦＲＥＴにおいて得られたシグナルを、ＦＲＥＴシグナルの比（単量体／凝集体）を算出することによって比較した。

【0124】

試験した抗体の対のすべてについて、ＦＲＥＴシグナルの比（単量体／凝集体）を算出した。以下の表２には、得られた結果がまとめられている。２より大きい比（単量体／凝集体）を有するすべての抗体の対は、ＴＤＰ－４３ＡＦβに対してＴＤＰ－４３ＮＡＦβに選択的であると考えられる。

【0125】

【表2】

【0126】

７つの抗体の対によって、それらが２より大きい単量体／凝集体比を有するので、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβとＴＤＰ－４３ＡＦβを識別することが可能になった。それらは表３に列挙されている。

【0127】

【表3】

【0128】

実施例３
ベータ１－４０アミロイドペプチドＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を同定する方法（ＦＲＥＴ法）
方法は、実施例１において詳述されたＦＲＥＴ技術（ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓからのＨＴＲＦ（登録商標）技術）に基づいている。

【0129】

試験された抗体の対
ドナーを用いて、およびアクセプターを用いてそれぞれ標識されたベータ１－４０アミロイドペプチドに対して向けられる抗体は、ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓによって販売されたアミロイドベータ１－４０ＨＴＲＦキット中に含有されるもの（参照６２Ｂ４０ＰＥＧ）である。それらをアミロイドベータ１－４０ＨＴＲＦキットマニュアルによって推奨されるように参照希釈剤６２ＲＢ３ＦＤＧで希釈した。

【0130】

ベータ１－４０アミロイドペプチドＮＡＦβ（単量体）の調製
凍結乾燥ヒトベータ１－４０アミロイドペプチド（ＥＲＩ２７５ＢＡＳ、ＴｈｅＥＲＩＡｍｙｌｏｉｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＬＬＣ、オックスフォード）を、供給業者の推奨に従って再懸濁し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファーで３０μＭの濃度に希釈した。次いで、ベータ１－４０アミロイドペプチドＮＡＦβを含有する溶液（本明細書において以下「単量体試料」）を－８０℃で凍結した。この溶液でチオフラビンＴ試験を実施した。９０％より多いベータ１－４０アミロイドペプチド単量体を含有することを示す。

【0131】

ベータ１－４０アミロイドペプチドＡＦβ（凝集体）の調製
凍結乾燥ヒトベータ１－４０アミロイドペプチド（ＥＲＩ２７５ＢＡＳ、ＴｈｅＥＲＩＡｍｙｌｏｉｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＬＬＣ、オックスフォード）を、供給業者の推奨に従って再懸濁し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファーで３０μＭの濃度に希釈した。次いで、この溶液を２５℃で４９５時間インキュベートし、これによって、ベータ１－４０アミロイドペプチドが凝集し、ベータ１－４０アミロイドペプチドＡＦβを得ることが可能となる。次いで、ベータ１－４０アミロイドペプチドＡＦβを含有する溶液（本明細書において以下「凝集体試料」）を－８０℃で凍結した。この溶液でチオフラビンＴ試験を実施した。９０％より多いベータ１－４０アミロイドペプチド凝集体を含有することを示す。

【0132】

単量体または凝集体での抗体の対の試験
試験当日に、単量体および凝集体試料を解凍し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファーで２０．３ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈し、その後、３８４ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ参照７８４０７５）に分配した。

【0133】

以下の試薬を以下の順序でマイクロプレートに添加した：
－５μＬの単量体試料または凝集体試料
－５μＬの希釈剤（参照６２ＤＬ１ＤＤＤ、ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓ）
－５μＬのドナー抗体
－５μＬのアクセプター抗体

【0134】

次いで、プレートを２℃から８℃の間から構成される温度で一晩インキュベートした。

【0135】

種々のプレートにおけるＦＲＥＴシグナルの検出を、ＨＴＲＦ検出モジュールを使用するＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳＬａｍｐ装置（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で実施した。図８で示されるように、単量体試料で、および凝集体試料でＦＲＥＴにおいて得られたシグナルを、ＦＲＥＴシグナルの比（単量体／凝集体）を算出することによって比較した。

【0136】

抗体の対のＦＲＥＴ（単量体／凝集体）シグナルの比は、２より大きい（３．１の値）。これは、この抗体の対が、ベータアミロイドペプチド１－４０ＡＦβからベータ１－４０アミロイドペプチドＮＡＦβを識別すること、すなわち、この抗体の対が、ベータアミロイドペプチド１－４０ＮＡＦβに特異的であることを示す。

【0137】

実施例４
ベータアミロイドペプチド１－４２ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を同定する方法（ＦＲＥＴ法）
方法は、実施例１において詳述されたＦＲＥＴ技術（ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓからのＨＴＲＦ（登録商標）技術）に基づいている。

【0138】

試験された抗体の対
ドナーおよびアクセプターを用いてそれぞれ標識されたベータアミロイドペプチド１－４２に対して向けられる２つの抗体を、それぞれ３ｎＭ（ドナー）および３０ｎＭ（アクセプター）の濃度に希釈した。

【0139】

べータ１－４２アミロイドペプチドＮＡＦβ（単量体）の調製
凍結乾燥ヒトベータアミロイドペプチド１－４２（ＴｈｅＥＲＩＡｍｙｌｏｉｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＬＬＣ、オックスフォード）を、供給業者の推奨に従って再懸濁し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファーで３０μＭの濃度に希釈した。次いで、ベータアミロイドペプチド１－４２ＮＡＦβを含有する溶液（本明細書において以下「単量体試料」）を－８０℃で凍結した。この溶液でチオフラビンＴ試験を実施した。９０％より多いベータアミロイドペプチド１－４２単量体を含有することを示す。

【0140】

ベータアミロイドペプチド１－４２ＡＦβ（凝集体）の調製
凍結乾燥ヒトベータアミロイドペプチド１－４２（ＥＲＩ２７５ＢＡＳ、ＴｈｅＥＲＩＡｍｙｌｏｉｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＬＬＣ、オックスフォード）を、供給業者の推奨に従って再懸濁し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファーで３０μＭの濃度に希釈した。次いで、この溶液を２５℃で１８８時間インキュベートする。次いで、ベータ１－４２アミロイドペプチドＡＦβを含有する溶液（本明細書において以下「凝集体試料」）を－８０℃で凍結した。この溶液でチオフラビンＴ試験を実施した。９０％より多いベータアミロイドペプチド１－４２凝集体を含有することを示す。

【0141】

単量体または凝集体での抗体の対の試験
試験当日に、単量体および凝集体試料を解凍し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファーで２．４ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈し、その後、３８４ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ参照７８４０７５）に分配した。

【0142】

以下の試薬を以下の順序でマイクロプレートに添加した：
－１６μＬの単量体試料または凝集体試料
－２μＬのドナー抗体
－２μＬのアクセプター抗体。

【0143】

プレートを２℃から８℃の間から構成される温度で一晩インキュベートした。

【0144】

さまざまなプレートにおけるＦＲＥＴシグナルの検出を、ＨＴＲＦ検出モジュールを使用するＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳＬａｍｐ装置（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で実施した。図９に示されるように、単量体試料で、および凝集体試料でＦＲＥＴにおいて得られたシグナルを、ＦＲＥＴシグナルの比（単量体／凝集体）を算出することによって比較した。

【0145】

研究された抗体の対のＦＲＥＴシグナル（単量体／凝集体）比は、２より大きい（４．５の値）。これは、この抗体の対が、ベータアミロイド１－４２ＡＦβからベータ１－４２アミロイドＮＡＦβを識別すること、すなわち、この抗体の対が、ベータアミロイドペプチド１－４２ＮＡＦβに特異的であることを示す。

【0146】

実施例５
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用する方法の検出能力に対する、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）の効果の試験
ＨＦＩＰは純粋（１００％）で使用するか、または溶解バッファーで希釈して、２０％、１０％および２％溶液を得た。

【0147】

以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）８μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβの試料。
２）８μＬの、１００％、２０％、１０％および２％のＨＦＩＰの、または補給された溶解バッファーの種々の溶液。
３）ＦＲＥＴ検出試薬の添加：
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたドナー抗体Ａｃ１
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたアクセプター抗体Ａｃ２。

【0148】

プレートを室温で一晩インキュベートした。種々のプレートにおけるＨＴＲＦシグナルの検出を、ＨＴＲＦ検出モジュールを使用するＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳＬａｍｐ装置（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で実施した。

【0149】

図１０は、種々の試験された濃度のＨＦＩＰを用いて得られたシグナルを示す。２％より高い濃度については、ＨＦＩＰは、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出シグナルを７５％より多く低下させる。したがって、凝集体に対するその可能性ある効果は、２％の濃度を用いてこの形式で評価される。

【0150】

実施例６
ＴＤＰ－４３ＡＦβの脱凝集剤としてのＨＦＩＰの試験
ＨＦＩＰを溶解バッファーで希釈して、２％溶液を得た。

【0151】

以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）８μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＡＦβの試料。
２）８μＬの２％ＨＦＩＰ溶液または溶解バッファー。
３）ＦＲＥＴ検出試薬の添加：
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたドナー抗体Ａｃ１
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたアクセプター抗体Ａｃ２。

【0152】

【0153】

得られたシグナルの比を、試料で得られたＦＲＥＴシグナルから以下のように算出した：

【0154】

シグナルの比＝（２％ＨＦＩＰを用いて処置した試料シグナル）／（溶解バッファーを用いて処置した試料シグナル）。

【0155】

図１１は、得られた結果を示す。シグナル比は、１以下（０．８９）であり、これは、２％ＨＦＩＰ処置が、ＴＤＰ－４３ＡＦβを含有する試料においてＰＮＡＦβの検出を増大しないことを示す。２％ＨＦＩＰを用いる処置が、ＴＤＰ－４３ＡＦβを部分的であっても脱凝集することを可能にしないと結論付けることができる。

【0156】

実施例７
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用する方法の検出能力に対する尿素の効果の試験
尿素を溶解バッファーで希釈して、７Ｍ、３．５Ｍ、１．７５Ｍおよび０．８８Ｍ溶液を得た。

【0157】

以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）８μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβの試料。
２）８μＬの種々の７Ｍ、３．５Ｍ、１．７５Ｍおよび０．８８Ｍ尿素溶液または溶解バッファー。
３）ＦＲＥＴ検出試薬の添加：
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたドナー抗体Ａｃ１
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたアクセプター抗体Ａｃ２。

【0158】

【0159】

図１２は、種々の試験濃度の尿素を用いて得られたシグナルを示す。３．５Ｍを上回る濃度については、尿素は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出シグナルを７５％より多く低下させる。したがって、凝集体に対するその可能性ある効果は、３．５Ｍ以下の濃度を用いてこの形式で評価される。

【0160】

実施例８
ＴＤＰ－４３ＡＦβの崩壊剤としての尿素の試験
尿素を補給した溶解バッファーで希釈して、３．５Ｍ、１．７５Ｍおよび０．８８Ｍ溶液を得た。

【0161】

以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）８μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＡＦβの試料。
２）８μＬの種々の濃度（３．５Ｍ、１．７５Ｍおよび０．８８Ｍ）の尿素溶液または溶解バッファー。
３）ＦＲＥＴ検出試薬の添加：
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたドナー抗体Ａｃ１。
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたアクセプター抗体Ａｃ２。

【0162】

【0163】

得られたシグナルの比を、試料で得られたＦＲＥＴシグナルから以下のように算出した：

【0164】

シグナル比＝（３．５Ｍ尿素を用いて処置した試料シグナル）／（補給された溶解バッファーを用いて処置した試料シグナル）。

【0165】

図１３は、得られた結果を示す。シグナル比は、尿素の試験濃度すべてについて１以下であり、これは、これらの処置が凝集体試料においてＴＤＰ－４３ＰＮＡＦβの検出を増大しないことを示す。３．５Ｍ以下の尿素濃度を用いる処置は、ＴＤＰ－４３ＡＦβを部分的であっても脱凝集しないと結論付けることができる。

【0166】

実施例９
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用する方法の検出能力に対する塩化グアニジウムの効果の試験
塩化グアニジウムを補給された溶解バッファーで希釈し、６Ｍ、３Ｍおよび１．５Ｍ溶液を得た。

【0167】

以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）８μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβの試料。
２）８μＬの、６Ｍ、３Ｍおよび１．５Ｍのさまざまな塩化グアニジウム溶液または補給された溶解バッファー。
３）ＦＲＥＴ検出試薬の添加：
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたドナー抗体Ａｃ１
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたアクセプター抗体Ａｃ２。

【0168】

【0169】

図１４は、種々の試験濃度の塩化グアニジウムを用いて得られたシグナルを示す。塩化グアニジウムはその濃度にかかわらず、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出シグナルを７５％より多く低減する。したがって、この化合物がＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出を妨げるので、凝集体に対するその可能性ある効果をこの形式で評価できない。

【0170】

実施例１０
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用する方法の検出能力に対するギ酸（ＦＡ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の効果の試験
ＦＡおよびＴＦＡを、補給された溶解バッファーで希釈して、２０％、１０％および２％溶液を得た。

【0171】

以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）８μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβ。
２）８μＬの、２０％、１０％および２％のＦＡもしくはＴＦＡの種々の溶液または補給された溶解バッファー。
３）ＦＲＥＴ検出試薬の添加：
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたドナー抗体Ａｃ１
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたアクセプター抗体Ａｃ２。

【0172】

【0173】

図１５は、種々の試験濃度のＦＡまたはＴＦＡを用いて得られたシグナルを示す。これらの試薬はその濃度にかかわらず、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出シグナルを７５％より多く低減する。したがって、それらがＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出を妨げるので、凝集体に対するその可能性ある効果をこの形式で評価できない。

【0174】

実施例１１
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用する方法の検出能力に対するギ酸（ＦＡ）と、それに続くＮａＯＨを用いる中和の効果の試験
ＦＡを、補給された溶解バッファーで希釈して、２０％溶液を得た。

【0175】

ＮａＯＨを４５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファーで希釈して、５Ｎ溶液を得た。

【0176】

以下の試薬を以下の順序で９６ウェルプレートに分配した：
１）６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβの試料。
２）８μＬの２０％ＦＡ溶液または補給された溶解バッファー。混合物を室温で１５分間インキュベートした。このステップで測定されるｐＨは、２．５に等しい。
３）９μＬの５ＮＮａＯＨ溶液または補給された溶解バッファー。これらの添加後に測定されるｐＨは、７．６に等しい。

【0177】

９６ウェルプレートのウェルに含有される内容物の一部分を３８４ウェルプレートに移し、その後、以下を用いてＦＲＥＴ検出試薬を添加した：
－１６μＬの９６ウェルプレートからの混合物
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたドナー抗体Ａｃ１
－２μＬの実施例２に記載されたように調製されたアクセプター抗体Ａｃ２。

【0178】

【0179】

図１６では、ＦＡ、次いでＮａＯＨ処置を用いて得られたＰＮＡＦβ検出シグナルを、処置の不在下で得られたものと比較する。処置は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβ検出シグナルのほとんど完全な消失を引き起こす。したがって、ＴＤＰ－４３ＡＦβの脱凝集に対するその可能性ある効果を評価できない。

【0180】

実施例１２
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用する方法の検出能力に対する、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と、それに続くＮａＯＨを用いる中和の効果の試験
ＴＦＡを、補給した溶解バッファーで希釈して、２０％溶液を得た。

【0181】

ＮａＯＨを４５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファーで希釈して、５Ｎ溶液を得た。

【0182】

以下の試薬を以下の順序で９６ウェルプレートに分配した：
１）６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβの試料。
２）８μＬの２０％ＴＦＡ溶液または補給された溶解バッファー。混合物を室温で１５分間インキュベートした。このステップで測定されるｐＨは、０．６に等しい。
３）４．５μＬの５ＮＮａＯＨ溶液または補給された溶解バッファー。この添加後に測定されるｐＨは、７．５に等しい。

【0183】

【0184】

【0185】

図１７では、ＴＦＡ、次いでＮａＯＨ処置を用いて得られたＰＮＡＦβ検出シグナルを、処置の不在下で得られたものと比較する。この処置がＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出シグナルに著しく影響を及す場合であっても（－６２％）、残存するシグナルによってそれをＴＤＰ－４３ＡＦβの脱凝集に関して試験することが可能となる。

【0186】

実施例１３
ＴＤＰ－４３ＡＦβの崩壊剤としての、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と、それに続くＮａＯＨを用いる中和の効果の試験

【0187】

ＴＦＡを、補給した溶解バッファーで希釈し、２０％溶液を得た。

【0188】

ＮａＯＨを４５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファーで希釈して、５Ｎ溶液を得た。

【0189】

以下の試薬を以下の順序で９６ウェルプレートに分配した：
１）６０μｌの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＡＦβの試料。
２）８μＬの２０％ＴＦＡ溶液またはＴＦＡ／ＮａＯＨ混合物（８容積の２０％ＴＦＡ溶液を４．５容積の５ＮＮａＯＨ溶液と混合することによって得た）。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
３）４．５μＬの５ＮＮａＯＨ溶液またはＴＦＡ／ＮａＯＨ混合物。この添加後に測定されるｐＨは、７．５に等しい。

【0190】

【0191】

【0192】

得られたシグナルの比を、試料で得られたＦＲＥＴシグナルから以下のように算出した：

【0193】

シグナル比＝（２０％ＴＦＡ、次いで５ＮＮａＯＨを用いて処置した試料シグナル）／（ＴＦＡ／ＮａＯＨ混合物を用いて処置した試料シグナル）。

【0194】

図１８は、得られた結果を示す。シグナル比は、１以下（０．５６）であり、これは、処置が、凝集体試料においてＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出を増大しないことを示す。２０％ＴＦＡと、それに続くＮａＯＨを用いる中和を用いる処置が、ＴＤＰ－４３ＡＦβを部分的であっても脱凝集しないことと結論付けることができる。

【0195】

実施例１４
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用する方法の検出能力に対する、ギ酸（ＦＡ）と、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和の効果の試験
ＦＡを、補給された溶解バッファーで希釈して、２０％溶液を得た。

【0196】

ＮＨ_４ＯＨを４５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファーで希釈して、５Ｎ溶液を得た。

【0197】

以下の試薬を以下の順序で９６ウェルプレートに分配した：
１）６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβの試料。
２）８μＬの２０％ＦＡ溶液または補給された溶解バッファー。混合物を室温で１５分間インキュベートした。このステップで測定されるｐＨは、２．５に等しい。
３）１２μＬの５ＮＮＨ_４ＯＨ溶液。この添加後に測定されるｐＨは、７．２に等しい。

【0198】

【0199】

【0200】

図１９では、ＦＡ、次いでＮＨ_４ＯＨ処置を用いて得られたＴＤＰ－４３ＮＡＦβ検出シグナルを、処置の不在下で得られたものと比較する。この処置がＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出シグナルに著しく影響を及す場合であっても（－６８％）、残存するシグナルによってそれをＴＤＰ－４３ＡＦβの脱凝集に関して試験することが可能となる。

【0201】

実施例１５
ＴＤＰ－４３ＡＦβの崩壊剤としての、ギ酸（ＦＡ）と、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和の効果の試験
ＦＡを、補給した溶解バッファーで希釈し、２０％溶液を得た。

【0202】

ＮＨ_４ＯＨを４５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファーで希釈して、５Ｎ溶液を得た。

【0203】

以下の試薬を以下の順序で９６ウェルプレートに分配した：
１）６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＡＦβの試料。
２）８μＬの２０％ＦＡ溶液またはＦＡ／ＮＨ_４ＯＨ混合物（８容積の２０％ＴＦＡ溶液を１２容積の５ＮＮＨ_４ＯＨ溶液と混合することによって得た）。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
３）１２μＬの５ＮＮＨ_４ＯＨ溶液またはＦＡ／ＮＨ_４ＯＨ混合物。この添加後に測定されるｐＨは、７．２に等しい。

【0204】

【0205】

【0206】

得られたシグナルの比を、試料で得られたＦＲＥＴシグナルから以下のように算出した：

【0207】

シグナル比＝（２０％ＦＡ、次いで５ＮＮＨ_４ＯＨを用いて処置した試料シグナル）／（ＦＡ／ＮＨ_４ＯＨ混合物を用いて処置した試料シグナル）。

【0208】

図２０は、得られた結果を示す。シグナル比は、１以下（０．７８）であり、これは、処置が、凝集体試料においてＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出を増大しないことを示す。２０％ＦＡと、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和を用いる処置は、ＴＤＰ－４３ＡＦβをたとえ部分的であっても脱凝集しないと結論付けることができる。

【0209】

実施例１６
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用する方法の検出能力に対する、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和の効果の試験
ＴＦＡを、補給された溶解バッファーで希釈し、２０％溶液を得た。

【0210】

ＮＨ_４ＯＨを４５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファーで希釈して、５Ｎ溶液を得た。

【0211】

以下の試薬を以下の順序で９６ウェルプレートに分配した：
１）６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβの試料。
２）８μＬの２０％ＴＦＡ溶液または補給された溶解バッファー。混合物を室温で１５分間インキュベートした。このステップで測定されるｐＨは、０．６に等しい。
３）７μＬの５ＮＮＨ_４ＯＨ溶液。この添加後に測定されるｐＨは、７．５に等しい。

【0212】

【0213】

【0214】

図２１では、ＴＦＡ、次いでＮＨ_４ＯＨ処置を用いて得られたＰＮＡＦβ検出シグナルを、処置の不在下で得られたものと比較する。この処置がＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出シグナルに著しく影響を及す場合であっても（－７２％）、残存するシグナルによってそれをＴＤＰ－４３ＡＦβの脱凝集に関して試験することが可能となる。

【0215】

実施例１７
ＴＤＰ－４３ＡＦβの崩壊剤としての、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和の効果の試験
ＴＦＡを、補給した溶解バッファーで希釈し、２０％溶液を得た。

【0216】

ＮＨ_４ＯＨを４５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファーで希釈して、５Ｎ溶液を得た。
以下の試薬を以下の順序で９６ウェルプレートに分配した：
１）６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＡＦβの試料。
２）８μＬの２０％ＴＦＡ溶液またはＴＦＡ／ＮＨ_４ＯＨ混合物（８容積の２０％ＴＦＡ溶液を７容積の５ＮＮＨ_４ＯＨ溶液と混合することによって得た）。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
３）７μｌの５ＮＮＨ_４ＯＨ溶液またはＴＦＡ／ＮＨ_４ＯＨ混合物。この添加後に測定されるｐＨは、７．５に等しい。

【0217】

【0218】

【0219】

得られたシグナルの比を、試料で得られたＦＲＥＴシグナルから以下のように算出した：

【0220】

シグナル比＝（２０％ＴＦＡ、次いで５ＮＮＨ_４ＯＨを用いて処置した試料シグナル）／（ＴＦＡ／ＮＨ_４ＯＨ混合物を用いて処置した試料シグナル）。

【0221】

図２２は、得られた結果を示す。シグナル比は、１以下（０．４２）であり、これは、処置が、凝集体試料においてＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出を増大しないことを示す。２０％ＴＦＡと、それに続くＮＨ_４ＯＨを用いる中和を用いる処置は、ＴＤＰ－４３ＡＦβをたとえ部分的であっても脱凝集しないと結論付けることができる。

【0222】

実施例１８
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβ検出試薬を使用する方法に対する、８．２から１３．３の間で構成されるｐＨ値を示すＮａＯＨ溶液と、それに続くＨＣｌを用いる中和の効果
試験されたＮａＯＨ溶液

【0223】

【表4】

【0224】

試験されたＨＣｌ溶液

【0225】

【表5】

【0226】

試験されたＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（ＮａＯＨ溶液およびＨＣｌ溶液の同一容量を混合することによって得られた）

【0227】

【表6】

【0228】

以下の試薬を９６ウェルプレートに分配した：
－６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβの試料。
－１０μＬの種々のＮａＯＨ溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥもしくはＦ）またはバッファー。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
－１０μＬの種々のＨＣｌ溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥもしくはＦ）またはバッファー。

【0229】

【0230】

【0231】

図２３は、種々の処置様式を用いて得られた結果を示す。１３．３のｐＨをもたらすＮａＯＨ溶液を用いる処置と、それに続くＨＣｌを用いる中和は、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出を可能にしない。すべての他の溶液の崩壊力はＴＤＰ－４３ＡＦβで試験できるであろう。

【0232】

実施例１９
ＮａＯＨを用いてＴＤＰ－４３ＡＦβを脱凝集する最小および最大ｐＨの決定
試験されたＮａＯＨ溶液

【0233】

【表7】

【0234】

試験されたＨＣｌ溶液

【0235】

【表8】

【0236】

試験されたＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（ＮａＯＨ溶液およびＨＣｌ溶液の同一容量を混合することによって得られた）

【0237】

【表9】

【0238】

以下の試薬を９６ウェルプレートに分配した：
－６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＡＦβの試料。
－１０μＬの種々のＮａＯＨ溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤもしくはＥ）または対応するＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤもしくはＥ）。混合物は室温で１５分間インキュベートした。
－１０μＬの種々のＨＣｌ溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）または対応するＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。

【0239】

【0240】

【0241】

得られたシグナルの比を、試料で得られたＦＲＥＴシグナルから以下のように算出した：

【0242】

シグナルの比＝（ＮａＯＨ、次いでＨＣｌを用いて処置した試料シグナル）／（ＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物を用いて処置した試料シグナル）。

【0243】

図２４は、試験されたさまざまなＮａＯＨ溶液によって誘導されたｐＨの関数として得られた結果を示す。ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出は、脱凝集ステップの際にｐＨが８．５～１３．２の範囲である場合にあり得る。しかし、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβを検出するための最適振幅を可能にするｐＨは、およそｐＨ１２．８である。

【0244】

実施例２０
１２．８のｐＨでＴＤＰ－４３ＡＦβを脱凝集するのに必要な時間の決定
以下の試薬を以下の順序で９６ウェルプレートに分配した：
１）６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＡＦβの試料
２）１０μＬの１．２ＮＮａＯＨ溶液（１２．８に導かれた試料のｐＨ）またはＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（１．２ＮＮａＯＨ溶液および１ＮＨＣｌ溶液の同一容量を混合することによって得られた）。混合物をウェルに応じて室温で３０秒から１時間インキュベートした。
３）１．２ＮＮａＯＨを用いて処置されたウェル中の１０μＬの１ＮＨＣｌ溶液（７．５に導かれた試料のｐＨ）またはＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物を用いて処置されたウェル中の１０μＬのＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物。

【0245】

【0246】

【0247】

得られたシグナルの比を、試料で得られたＦＲＥＴシグナルから以下のように算出した：

【0248】

シグナルの比＝（１．２ＮＮａＯＨ、次いで１ＮＨＣｌを用いて処置した試料シグナル）／（ＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物を用いて処置した試料シグナル）。

【0249】

図２５は、１．２ＮＮａＯＨと接触した時間の関数として、得られた結果を示す。結果は、１．２ＮＮａＯＨ処置によって、接触時間とは独立に（シグナルの比は常に１より大きい）、ＴＤＰ－４３ＡＦβを少なくとも部分的に脱凝集することが可能となったことを示す。しかし、最良の脱凝集は、５分～３０分の範囲の接触時間について得られた。

【0250】

実施例２１
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出を測定する場合の最小および最大ｐＨの決定
試験されたＮａＯＨ溶液

【0251】

１．２ＮＮａＯＨ溶液（試料のｐＨを１２．８に導くことを可能にする）

【0252】

試験されたＨＣｌ溶液

【0253】

【表10】

【0254】

試験されたＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（ＮａＯＨ溶液およびＨＣｌ溶液の同一容量を混合することによって得られた）

【0255】

【表11】

【0256】

以下の試薬を９６ウェルプレートに分配した：
－６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＡＦβの試料。
－１０μＬの種々の１．２ＮＮａＯＨ溶液または対応するＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨまたはＩ）。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
－１０μＬの種々のＨＣｌ溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩ）または対応するＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩ）。

【0257】

【0258】

【0259】

得られたシグナルの比を、試料で得られたＦＲＥＴシグナルから以下のように算出した：

【0260】

シグナル比＝（１．２ＮＮａＯＨ、次いでＨＣｌを用いて処置した試料シグナル）／（ＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物を用いて処置した試料シグナル）。

【0261】

図２６は、ｐＨ＝１２．８での処置後に、ｐＨが次いで、ｐＨ＝６からｐＨ＝１０．５の間に戻される場合には、ＴＤＰ－４３ＮＡＦβを検出できることを示す。検出は、ｐＨが６から８．５の間で構成される場合に最適である。

【0262】

実施例２２
脱凝集剤としてＮａＯＨを、中和剤としてＨＣｌを使用するベータアミロイドペプチド１－４２の凝集のレベルの測定
以下に記載される方法は、ＨＴＲＦ技術（原理については実施例１を参照されたい）に基づいている。

【0263】

１．２ＮＮａＯＨおよび１ＮＨＣｌ溶液をこれまでの実施例に記載されたように調製した。

【0264】

単量体の（１－４２ＮＡＦβ）または凝集した（１－４２ＡＦβ）ベータ１－４２アミロイドペプチドを含有する試料の調製：凍結乾燥ヒトベータ１－４２アミロイドペプチド（ＥＲＩ２７５ＢＡＳ、ＴｈｅＥＲＩＡｍｙｌｏｉｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＬＬＣ、オックスフォード）を供給業者の推奨に従って再懸濁し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファーで３０μＭ（１－４２ＮＡＦβ）の濃度に希釈した。ベータ１－４２アミロイドペプチドの同一溶液を、２５℃で１８８時間インキュベートして、１－４２ＡＦβを得る。２つの試料を将来の使用の前に－８０℃で凍結した。使用前に、チオフラビンＴ法によって２つの試料の凝集のレベルを調べた。

【0265】

試験当日に、試料１－４２ＮＡＦβおよび１－４２ＡＦβを解凍し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４で２．４ｎｇ／ｍＬ濃度に希釈し、その後、マイクロプレートに分配した。

【0266】

以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）１２μＬの１－４２ＡＦβ試料または１－４２ＮＡＦβ試料。
２）２μＬの１．２ＮＮａＯＨ溶液またはＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（１．２ＮＮａＯＨ溶液および１ＮＨＣｌ溶液の等容量を混合することによって得られた）。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
３）２μＬの１ＮＨＣｌ溶液またはＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物。
４）ＦＲＥＴ検出試薬の添加：
－２μＬの実施例４に記載されたように調製されたドナー抗体。
－２μＬの実施例４に記載されたように調製されたアクセプター抗体。

【0267】

プレートを２℃から８℃の間で構成される温度で一晩インキュベートした。

【0268】

さまざまなプレートにおけるＨＴＲＦシグナルの検出を、ＨＴＲＦ検出モジュールを使用するＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳＬａｍｐ装置（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で実施した。

【0269】

凝集比は、試料で得られたＨＴＲＦシグナルから以下のように算出する：

【0270】

シグナル比＝（１．２ＮＮａＯＨ、次いで１ＮＨＣｌを用いて処置した試料シグナル）／（ＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物を用いて処置した試料シグナル）。

【0271】

図２７は、試料１－４２ＮＡＦβおよび１－４２ＡＦβを用いて得られたシグナル比を示す。１－４２ＡＦβ試料で得られたシグナル比は、１－４２ＮＡＦβ試料で得られたものよりもかなり高い。この結果は、当該方法が１－４２アミロイドペプチド凝集のレベルを測定できることを示す。

【0272】

実施例２３
ＴＤＰ－４３ＮＡＦβに特異的に結合できる抗体の対を使用する方法の検出能力に対する、ＮａＯＨ、水酸化カリウム（ＫＯＨ）またはＮＨ_４ＯＨを用いる処置と、それに続くＨＣｌを用いる中和の効果
ＴＤＰ４３－ＡＦβ溶解物を処置するための、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ_４ＯＨおよびＨＣｌ溶液の調製

【0273】

【表12】

【0274】

試験されたＨＣｌ溶液

【0275】

【表13】

【0276】

試験された塩基／ＨＣｌ混合物（ＮａＯＨ溶液およびＨＣｌ溶液の同一容量を混合することによって得られた）

【0277】

【表14】

【0278】

以下の試薬を９６ウェルプレートに分配した：
－６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＮＡＦβの試料。
－１０μＬの種々の塩基溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤもしくはＥ）または対応する塩基／ＨＣｌ混合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤもしくはＥ）。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
－１０μＬの種々のＨＣｌ溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）または対応する塩基／ＨＣｌ混合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。

【0279】

【0280】

【0281】

図２８は、種々の処置を用いて得られたＴＤＰ－ＮＡＦβ検出シグナルを示す。ＴＤＰ－４３ＮＡＦβの検出は、７から８の間で構成されるｐＨを可能にするＨＣｌを用いる中和ステップが実施される場合には、使用された塩基にかかわらず可能である。したがって、これらの塩基の崩壊効果がＴＤＰ－４３ＡＦβで試験される。

【0282】

実施例２４
ＴＤＰ－４３ＡＦβの脱凝集に対する、ＮａＯＨ、水酸化カリウム（ＫＯＨ）またはＮＨ_４ＯＨを用いる処置と、それに続くＨＣｌを用いる中和の効果
ＴＤＰ４３－ＡＦβ溶解物を処置するための、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ_４ＯＨおよびＨＣｌ溶液の調製

【0283】

【表15】

【0284】

試験されたＨＣｌ溶液

【0285】

【表16】

【0286】

試験された塩基／ＨＣｌ混合物（ＮａＯＨ溶液およびＨＣｌ溶液の同一容量を混合することによって得られた）

【0287】

【表17】

【0288】

以下の試薬を９６ウェルプレートに分配した：
－６０μＬの実施例２に記載されたプロトコールに従って調製されたＴＤＰ－４３ＡＦβの試料。
－１０μＬの種々の塩基溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤもしくはＥ）または対応する塩基／ＨＣｌ混合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤもしくはＥ）。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
－１０μＬの種々のＨＣｌ溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）または対応する塩基／ＨＣｌ混合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。

【0289】

【0290】

【0291】

得られたシグナルの比を、試料で得られたＦＲＥＴシグナルから以下のように算出した：

【0292】

シグナルの比＝（塩基、次いでＨＣｌを用いて処置した試料シグナル）／（塩基／ＨＣｌ混合物を用いて処置した試料シグナル）。

【0293】

図２９は、さまざまな処置を用いて得られたシグナルの比を示す。それぞれ１２．８および９．６のｐＨ値をもたらす２つのＮａＯＨ処置条件（１．２Ｎおよび０．８Ｎ）によって、ＴＤＰ４３－ＮＡＦβを検出することが可能になり、これによって、ＴＤＰ－４３ＡＦβに対する脱凝集効果が確認される。１．２ＮＫＯＨ（ｐＨ＝１２．５）を用いる処置によって、ＴＤＰ４３－ＮＡＦβの弱い検出が可能になり、これは、ＴＤＰ－４３ＡＦβの弱い脱凝集効果を示す。ＮａＯＨ処置と同様のｐＨ値をもたらすＮＨ_４ＯＨを用いる（１０Ｎおよび１．２Ｎ）２つの処置は、ＴＤＰ４３－ＮＡＦβを検出することを可能にしない。この結果は、ＮＨ_４ＯＨにはＴＤＰ－４３ＡＦβの脱凝集効果がないことを示す。

【0294】

実施例２５
アルファ－シヌクレインＮＡＦβ（Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβ）に特異的に結合可能な抗体の対を同定することを可能にする方法
当該方法は、実施例１において詳述されたＦＲＥＴ技術（ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓからのＨＴＲＦ（登録商標）技術）に基づいている。

【0295】

試験された抗体の対
ドナーを用いて、およびアクセプターを用いてそれぞれ標識されたアルファ－シヌクレインに対して向けられる抗体の対は、ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓによって販売されたＨＴＲＦトータル－アルファ－シヌクレインキット中に含有されたもの（参照６ＦＮＳＹＰＥＧ）である。各抗体をユーザーマニュアルによって推奨されるようにキット希釈剤で希釈した。

【0296】

Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβおよびＡｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβ試料の調製
Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβおよびＡｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβは、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ（ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ活性ヒト組換えＡ５３Ｔ突然変異体アルファシヌクレインタンパク質単量体、参照ＳＰＲ－３２５および活性ヒト組換えＡ５３Ｔ突然変異体アルファシヌクレインタンパク質事前形成原線維タイプ１参照ＳＰＲ－３２６）から入手した。それらをＨＴＲＦトータル－Ａシヌクレインキットの溶解バッファーで１５．６ｎｇ／ｍＬに希釈した。

【0297】

Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβおよびＡｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβでの抗体の対の試験
以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）１２μＬの１５．６ｎｇ／ｍＬのＡｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβまたはＡｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβ。
２）２μＬの溶解バッファー。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
３）２μＬの溶解バッファー。
４）２μＬのドナー抗体。
５）２μＬのアクセプター抗体。

【0298】

種々のプレートにおけるＦＲＥＴシグナルの検出を、ＨＴＲＦ検出モジュールを使用するＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳＬａｍｐ装置（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で実施した。

【0299】

図３０で示されるように、Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβ試料（単量体）で、およびＡｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβ試料（凝集体）でＦＲＥＴにおいて得られたシグナルを、ＦＲＥＴシグナルの比（単量体／凝集体）を算出することによって比較した。

【0300】

抗体の対のＦＲＥＴ（単量体／凝集体）シグナルの比は、２より大きい（６．６４の値）。これは、この抗体の対が、Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβを上回ってＡｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβに特異的に結合できることを示す。

【0301】

実施例２６
Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβに特異的に結合可能な抗体の対を使用する方法の検出能力に対する１．２ＮＮａＯＨ溶液と、それに続く１ＮＨＣｌを用いる中和の効果
Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβ（ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ、活性ヒト組換えＡ５３Ｔ突然変異体アルファシヌクレインタンパク質単量体、参照ＳＰＲ－３２６）を、ＨＴＲＦトータル－アルファシヌクレインキット（ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓ、参照６ＦＮＳＹＰＥＧ）の溶解バッファーで１５．６ｎｇ／ｍＬに希釈した。ＨＴＲＦトータル－Ａシヌクレインキット中のドナーおよびアクセプター抗体を、キットマニュアルにおいて供給業者によって推奨されるように希釈した。

【0302】

以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）１２μＬの１５．６ｎｇ／ｍＬのＡｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβ。
２）２μＬの１．２ＮＮａＯＨ溶液（１２．８に導かれた試料のｐＨ）またはＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（１．２ＮＮａＯＨ溶液および１ＮＨＣｌ溶液の同一容量を混合することによって得られた）。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
３）１．２ＮＮａＯＨを用いて処置されたウェル中の２μＬの１ＮＨＣｌ溶液（７．５に導かれた試料のｐＨ）またはＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物を用いて処置されたウェル中の２μＬのＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物。
４）２μＬの実施例２５に記載されたように調製されたドナー抗体
５）２μＬの実施例２５に記載されたように調製されたアクセプター抗体

【0303】

【0304】

図３１は、得られた結果を示す。それらは、１．２ＮＮａＯＨを用いる処置と、それに続く１ＮＨＣｌを用いる中和は、抗体によるＡｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβの検出に対してほとんど効果がないことを示す。したがって、Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβの分離においてこの処置の効果を評価できる。

【0305】

実施例２７
崩壊剤としてＮａＯＨおよび中和剤としてＨＣｌを使用するアルファ－シヌクレインの凝集のレベルの測定
方法は、実施例１において詳述されたＦＲＥＴ技術（ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓからのＨＴＲＦ（登録商標）技術）に基づいている。

【0306】

試験された抗体の対
ドナーを用いて、およびアクセプターを用いてそれぞれ標識されたアルファ－シヌクレインに対して向けられる抗体は、ＣｉｓｂｉｏＢｉｏａｓｓａｙｓによって販売されたＨＴＲＦトータル－アルファ－シヌクレインキット中に含有されたもの（参照６ＦＮＳＹＰＥＧ）である。それらをユーザーマニュアルによって推奨されるようにキット希釈剤で希釈した。

【0307】

Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβおよびＡｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβ試料の調製
Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβおよびＡｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβは、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ（ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ活性ヒト組換えＡ５３Ｔ突然変異体アルファシヌクレインタンパク質単量体、参照ＳＰＲ－３２５および活性ヒト組換えＡ５３Ｔ突然変異体アルファシヌクレインタンパク質事前形成原線維タイプ１参照ＳＰＲ－３２６）から入手した。それらをＨＴＲＦトータル－アルファシヌクレインキットの溶解バッファーで１５．６ｎｇ／ｍＬに希釈した。

【0308】

Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβおよびＡｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβでの抗体の対の試験
以下の試薬を以下の順序で３８４ウェルプレートに分配した：
１）１２μＬの１５．６ｎｇ／ｍＬのＡｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβまたはＡｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβ。
２）２μＬの１．２ＮＮａＯＨ溶液（１２．８に導かれた試料のｐＨ）またはＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物（１．２ＮＮａＯＨ溶液および１ＮＨＣｌ溶液の同一容量を混合することによって得られた）。混合物を室温で１５分間インキュベートした。
３）１．２ＮＮａＯＨを用いて処置されたウェル中の２μＬの１ＮＨＣｌ溶液（７．５に導かれた試料のｐＨ）またはＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物を用いて処置されたウェル中の２μＬのＮａＯＨ／ＨＣｌ混合物。
４）２μＬのドナー抗体。
５）２μＬのアクセプター抗体。

【0309】

さまざまなプレートにおけるＦＲＥＴシグナルの検出を、ＨＴＲＦ検出モジュールを使用するＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳＬａｍｐ装置（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）で実施した。

【0310】

図３２は、Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβおよびＡｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβ試料を用いて得られたシグナル比を示す。Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＡＦβ試料で得られたシグナル比は、Ａｌｐｈａ－ＳｙｎＮＡＦβ試料で得られたものよりもかなり高い。この結果は、本発明による方法によってアルファ－シヌクレインの凝集のレベルを測定することが可能となることを示す。

【0311】

参考文献
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【図1】