知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ディヴェロップメント センター フォー バイオテクノロジーの特許一覧
特表2023-528306抗メソテリン抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-04
(54)【発明の名称】抗メソテリン抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20230627BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230627BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230627BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230627BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230627BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20230627BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230627BHJP
A61K 39/44 20060101ALI20230627BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/437 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20230627BHJP
A61K 31/5365 20060101ALI20230627BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20230627BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230627BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230627BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230627BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230627BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230627BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K19/00
A61K47/68
A61K45/00
A61K49/00
A61K51/10 200
A61K39/395 E
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 Y
A61K39/44
A61K38/07
A61K31/437
A61K31/4745
A61K31/5365
A61P15/00
A61P1/18
A61P11/00
A61P1/00
A61P1/16
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022572330
(86)(22)【出願日】2021-06-04
(85)【翻訳文提出日】2023-01-19
(86)【国際出願番号】 US2021035972
(87)【国際公開番号】W WO2021248048
(87)【国際公開日】2021-12-09
(31)【優先権主張番号】63/035,175
(32)【優先日】2020-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507275235
【氏名又は名称】ディヴェロップメント センター フォー バイオテクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】チュアン， シー‐シェン
(72)【発明者】
【氏名】スン， ウェイ‐ティン
(72)【発明者】
【氏名】ライリー， イン‐シュアン
(72)【発明者】
【氏名】ライ， チュン‐リャン
(72)【発明者】
【氏名】リン， ウン‐フエイ
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ， ウィン‐イン
(72)【発明者】
【氏名】ツァイ， シー‐チョン
(72)【発明者】
【氏名】ユ， チェン‐チョウ
(72)【発明者】
【氏名】ホアン， チャオ‐ヤン
【テーマコード（参考）】
4B064
4C076
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF68
4C084AA17
4C084BA01
4C084BA10
4C084BA16
4C084BA23
4C084CA59
4C084MA05
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA10
4C084NA13
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA25
4C085AA26
4C085AA27
4C085BB31
4C085BB41
4C085BB42
4C085BB43
4C085CC22
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE05
4C085HH01
4C085HH03
4C085HH11
4C085HH13
4C085KA03
4C085KA04
4C085KA27
4C085KA29
4C085KA36
4C085KB82
4C085LL18
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB05
4C086CB22
4C086MA02
4C086MA05
4C086NA10
4C086NA13
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZB26
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA50
4H045BA53
4H045BA71
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、メソテリン中のエピトープに特異的に結合する抗原結合フラグメント、Ｎ－グリカン結合ドメイン及びＮ－グリカンを含む抗体；Ｎ－グリカンに連結するリンカー；並びにリンカーにそれぞれ結合した、同一であるか又は異なるペイロードＡ及びペイロードＢを含む、イムノコンジュゲートを提供する。イムノコンジュゲートを含む医薬組成物及び癌を治療する方法もまた、本開示において提供される。
【選択図】図１Ｂ
【選択図】図１Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
メソテリン中のエピトープに特異的に結合する抗原結合フラグメント、Ｎ－グリカン結合ドメイン及び式（１）の構造を有するＮ－グリカンを含む抗体：【化1】
（式中、「＊」は結合又は保護基を表す）；
「＊」が結合を表す場合、Ｎ－グリカン中の「＊」のそれぞれに連結するリンカー；並びに
独立的にリンカーにコンジュゲートされた、同じか又は異なるペイロードＡ及びペイロード
を含む、イムノコンジュゲート。
【請求項2】
抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、切断された抗体からのＦｖフラグメント若しくはＦｃフラグメント、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、ミニボディ、ダイアボディ、又はｓｃＦｖである、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項3】
抗原結合フラグメントが、重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖可変領域の相補性決定領域を含み、重鎖可変領域の相補性決定領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変領域の相補性決定領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域を含み；ＣＤＲＨ１領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＨ２領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＨ３領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＬ１領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＬ２領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＬ３領域は、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項4】
抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項5】
抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項6】
抗体が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項7】
抗体が、重鎖定常領域を含み、Ｎ－グリカン結合ドメインが、重鎖定常領域中に位置する、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項8】
抗体が、２つのＮ－グリカンを含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項9】
リンカーが、２～２０個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、アリールアミン基、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、カーボネート、式（３）から式（７）、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ不安定リンカー、及びエステラーゼ不安定リンカー、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され、【化2】
式（３）及び式（４）において：
Ｒ１は、独立的に、水素、ハロゲン、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、
アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択的に置換されており、
２つの置換基Ｒ１は、一緒に連結して、縮環シクロアルキル又は縮環（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、
Ｒ５は、独立的に、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基、及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され；
Ｘは、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２はＲ１であり；ａは０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；ａ’は０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；ａ＋ａ’＜１０であり；
Ｌは、２～２０個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、アリールアミン基、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、カーボネート、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ不安定リンカー、及びエステラーゼ不安定リンカー、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され；
【化3】
式（５）において：
Ｒ１は、独立的に、水素、ハロゲン、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、
アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択的に置換されており、
２つの置換基Ｒ１は、一緒に連結して、縮環シクロアルキル又は縮環（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、
Ｒ５は、独立的に、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され；
Ｌは、２～２０個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、アリールアミン基、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、カーボネート、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ不安定リンカー、及びエステラーゼ不安定リンカー、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され；
Ｒ３は、独立的に、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され；
Ｒ４は、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基は、任意選択的にＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１つ又は複数のヘテロ原子により中断されており、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、独立的に、任意選択的に置換されており；
【化4】
式（６）及び式（７）において：
Ｌは、２～２０個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、アリールアミン基、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、カーボネート、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ不安定リンカー、及びエステラーゼ不安定リンカー、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、
請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項10】
ペイロードＡ及びペイロードＢが独立的に、治療薬又は標識である、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項11】
治療薬が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、アルキル化様薬剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、カリケアマイシン、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、放射性同位体、又は同位体キレート剤である、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項12】
治療薬が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メイタンシノイド、デュオカルマイシン－ヒドロキシベンズアミドアザインドール（ＤＵＢＡ）、ジエチレントリアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタアセテート（ＤＴＰＡ）、エキサテカン、又はＤｘｄ２である、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項13】
標識が、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、又は陽電子放出体である、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項14】
保護基がアジドである、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物。
【請求項16】
請求項１～１４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートの治療有効量を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象における癌を治療する方法。
【請求項17】
癌が、メソテリンを発現する癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
癌が、卵巣癌、中皮腫、膵臓癌、非小細胞肺癌、食道癌、胃癌、胆道癌、大腸癌、子宮内膜癌、又は乳癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
癌が、卵巣癌である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[0001]本開示は、抗メソテリン抗体－薬物コンジュゲートに関し、その中に含まれる糖タンパク質は１つ又は複数のトリマンノシルコアを含んでいる。本開示はまた、抗メソテリン抗体－薬物コンジュゲートを対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象における癌などの疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
[0002]抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、典型的にはマーカー、例えば腫瘍マーカーを特異的にターゲティングする抗体に結合した抗癌剤（例えば、細胞毒素）を含む。抗体は体内でこれらのマーカーを追跡し、癌細胞の表面に自らを付着させる。抗体と標的マーカー（抗原）との結合は、腫瘍細胞においてシグナルを発生させて、ＡＤＣを内在化させる。ＡＤＣが内在化された後、細胞毒性薬が放出されて、癌細胞を殺傷しうる。特異的なターゲティングにより、薬の副作用が低減されうる。
【0003】
[0003]メソテリン（ＭＳＬＮ）は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌、膵臓腺癌、肺腺癌、胆管癌、肝外胆道癌、肺癌、及び上皮性中皮腫を含む、いくつかのヒト腫瘍において過剰発現されている腫瘍分化抗原である。したがって、メソテリンは診断／治療のターゲットとして有望である。
【0004】
[0004]ＳＳ１Ｐ（シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａの切断されたフラグメントに遺伝子融合されたターゲティング抗体フラグメントで構成される抗メソテリン免疫毒素）、アネツマブ（モノクローナル抗体）、及びアネツマブ・ラブタンシン（抗体－薬物コンジュゲート）など、メソテリンに対する多くの抗体が開発されているが、抗メソテリン抗体を使用した改善された治療薬が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
[0005]本開示は、抗メソテリン抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート及び治療におけるそれらの使用に関する。
【0006】
[0006]本開示の一態様は、イムノコンジュゲートに関する。本開示の一実施形態によるイムノコンジュゲートは、以下を含む：
メソテリン中のエピトープに特異的に結合する抗原結合フラグメント、Ｎ－グリカン結合ドメイン及び式（１）の構造を有するＮ－グリカンを含む抗体：
（式中、「＊」は結合又は保護基を表す）；
「＊」が結合を表す場合、Ｎ－グリカン中の「＊」のそれぞれに連結するリンカー；並びに
独立的にリンカーにコンジュゲートされた、同じか又は異なるペイロードＡ及びペイロードＢ。
メソテリン中のエピトープに特異的に結合する抗原結合フラグメント、Ｎ－グリカン結合ドメイン及び式（１）の構造を有するＮ－グリカンを含む抗体：
【化1】
（式中、「＊」は結合又は保護基を表す）；
「＊」が結合を表す場合、Ｎ－グリカン中の「＊」のそれぞれに連結するリンカー；並びに
独立的にリンカーにコンジュゲートされた、同じか又は異なるペイロードＡ及びペイロードＢ。
【0007】
[0007]本開示のいくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、切断された抗体からのＦｖフラグメント若しくはＦｃフラグメント、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、ミニボディ、ダイアボディ、又はｓｃＦｖである。
【0008】
[0008]本開示のいくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖可変領域の相補性決定領域を含み、重鎖可変領域の相補性決定領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変領域の相補性決定領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域を含み；ＣＤＲＨ１領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＨ２領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＨ３領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＬ１領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＬ２領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＬ３領域は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。本開示の一実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。本開示の一実施形態では、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。本開示の一実施形態では、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0009】
[0009]本開示のいくつかの実施形態において、抗体は、重鎖定常領域を含み、Ｎ－グリカン結合ドメインは、重鎖定常領域中に位置する。
【0010】
[0010]本開示のいくつかの実施形態では、抗体は２つのＮ－グリカンを含む。
【0011】
[0011]本開示のイムノコンジュゲートの有効量の特定の実施形態は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～８００ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ～６００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ～８０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ～６０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの範囲のものである。
【0012】
[0012]本開示のいくつかの実施形態において、リンカーは、２～２０個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、アリールアミン基、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、カーボネート、式（３）から式（７）、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ不安定リンカー、及びエステラーゼ不安定リンカー、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0013】
[0013]本開示のいくつかの実施形態では、ペイロードＡ及びペイロードＢは、治療薬及び標識から独立的に選択される。
【0014】
[0014]治療薬の例には、代謝拮抗剤、アルキル化剤、アルキル化様薬剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、カリケアマイシン、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、放射性同位体、及び同位体キレート剤が含まれるが、これらに限定はされない。治療薬の特定の化合物の例には、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メイタンシノイド、デュオカルマイシン－ヒドロキシベンズアミドアザインドール（ＤＵＢＡ）、ジエチレントリアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタアセテート（ＤＴＰＡ）、エキサテカン、及びＤｘｄ２が含まれるが、これらに限定はされない。
【0015】
[0015]標識の例としては、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、及び陽電子放出体が含まれるが、これらに限定はされない。
【0016】
[0016]保護基の一例はアジドである。
【0017】
[0017]本開示の一態様は、上記のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物に関する。
【0018】
[0018]本開示の一態様は、癌を治療するための方法に関する。本開示の一実施形態による方法は、癌治療を必要とする対象に、治療有効量の上記のイムノコンジュゲートを投与するステップを含みうる。
【0019】
[0019]本開示のいくつかの実施形態では、癌はメソテリンを発現する癌である。癌の例には、卵巣癌、中皮腫、膵臓癌、非小細胞肺癌、食道癌、胃癌、胆道癌、大腸癌、子宮内膜癌、及び乳癌が含まれるが、これらに限定はされない。
【0020】
[0020]当業者は、治療有効量が、患者の状態、年齢、疾患状態、投与経路などの多くの要因に依存すること、そのような有効量が、これらの要因に基づいて、過度の実験を要せずに日常的な実務において決定されうることを理解する。
【0021】
[0021]本開示の他の態様は、以下の説明により明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
[0043]本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数形への参照を含むことに留意すべきである。同様に、本明細書では、「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ又は複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は互換的に使用され得る。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語が、互換的に使用され得ることにも留意されたい。
【0024】
[0044]他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学的又は技術的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明を実施するために当業者によって理解され、使用され得る。
【0025】
[0045]本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指示していない限り、複数形への参照を含むことに留意しなければならない。よって、文脈によって別段要求されない限り、単数形の用語は複数形を包含し、複数形の用語は単数形を包含するものとする。
【0026】
[0046]「及び／又は」という用語は、両方のもの、又は言及された２つのうちのどちらかを指すために使用される。
【0027】
[0047]本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、ペイロードＡ及びＢのような少なくとも１つのエフェクター部分と抗体とを含むポリペプチド分子を指す。特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、１つ以下のエフェクター部分を含む。本発明による特定のイムノコンジュゲートは、１つ又は複数のリンカーによって結合された１つのエフェクター部分と１つの抗体から本質的になる。
【0028】
[0048]本明細書で使用される「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、メソテリン）に特異的に結合又は相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結した４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を包含する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化でき、そこにはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。本開示の異なる実施形態において、抗α毒素抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であっても、又は自然に若しくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ又はそれ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義されうる。
【0029】
[0049]本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、真核生物、原核生物又はファージクローンを含む単一のクローンから、利用可能な任意の手段又は当該技術分野で既知の手段によって得られる。
【0030】
[0050]非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ免疫グロブリンである。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。
【0031】
[0051]本明細書で使用される「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続的抗原結合部位を指す。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６（１９７７年）；Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９９１年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７年）；及びＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６年）によって記載されており、その定義には、互いに対して比較した場合、アミノ酸残基の重複又はサブセットが包含される。
【0032】
[0052]本明細書で使用される抗体の「抗原結合フラグメント」などの用語は、天然に存在する、酵素的に得られる、合成された又は遺伝子改変された、あらゆるポリペプチド又は糖タンパク質であって、抗原に特異的に結合して複合体を形成するものを包含する。
【0033】
[0053]本明細書で使用される場合、「メソテリン」という用語は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合によって細胞膜に固定されており、巨核球増強因子（ＭＰＦ）と呼ばれるアミノ末端側の３１ｋＤａのフラグメントが脱落した、４０ｋＤａのタンパク質、メソテリンを指す。どちらのフラグメントも、Ｎ－グリコシル化部位を含んでいる。好ましくは、この用語は、例えば、細胞膜、例えば癌細胞膜上に発現されたヒトメソセリン及びその天然の切断された部分を指す。特に、メソテリンのフラグメントは、メソテリンのＮ末端領域を含む。
【0034】
[0054]本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。
【0035】
[0055]本明細書で使用される「Ｎ－グリカン」という用語は、Ｎ－結合オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン－Ｎ－アセチルグルコサミン結合によって結合したものを指す。Ｎ－グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノース；「Ｇｌｃ」はグルコースを指す、「ＮＡｃ」はＮ－アセチルを指す；「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ－アセチルグルコサミンを指す）という共通の五糖コアを有している。Ｎ－グリカンに関して使用される「トリマンノースコア」という用語も、構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）を意味する。Ｎ－グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に付加される周辺糖（例えば、フコース及びシアル酸）を含む枝（アンテナ）の数に関して異なる。
【0036】
[0056]本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、生物学的又は薬学的活性を有する有効成分及び薬学的に許容できる担体を含む製剤又は調製物を指す。医薬組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、粉末、ペレット、ビーズ、顆粒、ミクロスフェア、カプセル、丸剤などの形態でありうる。
【0037】
[0057]「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患、障害又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防的であってもよく、疾患、障害及び／又はそれに起因する症状の部分的又は完全な治癒という点で治療的であってもよい。本明細書において使用される「治療」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける疾患の治療をカバーし、（１）対象における疾患、障害又はその症状の進展を抑制すること、又は（２）対象における疾患、障害又はその症状を緩和又は改善することを包含する。
【0038】
[0058]本明細書中で使用される「対象」という用語は、本明細書中に開示される化合物又は組成物の投与から利益を得ることができる任意の動物である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、齧歯類、例えば、ラット又はマウスである。典型的には、哺乳動物はヒトである。
【0039】
[0059]本明細書で提供される有効成分の「有効量」という用語は、所望の機能の所望の調節を提供するのに十分な量の成分を意味する。以下に指摘するように、正確な必要量は、対象の疾患状態、身体条件、年齢、性別、種及び体重、組成物の具体的なアイデンティティ及び製剤などに応じて、対象ごとに変動する。投与レジメンは、最適な治療反応を誘発するように調整されうる。例えば、いくつかに分割された用量が、毎日投与されてもよいし、治療状況の要求により示されるように投与量を比例的に減らしてもよい。したがって、正確な「有効量」を特定することは可能ではない。しかしながら、適切な有効量は、日常的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
【0040】
[0060]本明細書で使用される「薬学的に許容できる」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、対象（ヒト又は非ヒト動物のいずれか）の組織と接触して使用するのに適し、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を持たず、合理的な利益／リスク比の釣り合いがとれている、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。各担体、賦形剤などもまた、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容できる」ものでなければならない。適切な担体、賦形剤などは、標準的な薬学の教科書の中に見出され得る。
【0041】
[0061]本開示のイムノコンジュゲートは「担体」と共に製剤化されてもよい。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び／又は抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。そのような媒体及び／又は薬剤を医薬活性物質のために使用することは、当技術分野において周知である。例えば、薬学的組み合わせは、以下に適合されたものを含む固体又は液体形態での投与のために特別に製剤化され得る：（１）経口投与、例えば、ドレンチ（水性若しくは非水性の溶液若しくは懸濁液）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、丸剤、錠剤（例えば、頬、舌下、及び全身吸収を標的とするもの）、ボーラス、粉末、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト；（２）非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは硬膜外注射によるもの、例えば、滅菌溶液若しくは懸濁液、若しくは持続放出製剤として；（３）局所適用、例えば、クリーム、ローション、ジェル、軟膏、若しくは皮膚に適用される制御放出パッチ若しくはスプレーとして；（４）膣内若しくは直腸内投与、例えば、ペッサリー、クリーム、座薬又はフォームとして；（５）舌下投与；（６）経眼投与；（７）経皮投与；（８）経粘膜投与；又は（９）経鼻投与。
【0042】
[0062]抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬物（又はペイロード）が抗体又はその抗原結合フラグメントに結合している治療薬のクラスである。ＡＤＣ中の抗体は、選択されたターゲット（典型的には、細胞上のターゲット）に結合し、それにより、薬物をターゲットの近傍に運ぶ結果、選択性の高い治療効果をもたらす。ＡＤＣの例は、癌細胞上に発現されるタンパク質をターゲティングする抗体であってもよく、ペイロードは、細胞障害性の薬剤であってもよい。本開示の一実施形態は、抗メソテリン抗体若しくはその結合フラグメント並びに２つ以上のペイロードを含むイムノコンジュゲート（抗体－薬物コンジュゲート）に関する。本開示の一実施形態では、イムノコンジュゲートは、以下を含む：メソテリン中のエピトープに特異的に結合する抗原結合フラグメント、Ｎ－グリカン結合ドメイン及び式（１）の構造を有するＮ－グリカンを含む抗体：
式中、「＊」は結合又は保護基を表す；
「＊」が結合を表す場合、Ｎ－グリカン中の「＊」のそれぞれに連結するリンカー；並びに
独立的にリンカーにコンジュゲートされた、同じか又は異なるペイロードＡ及びペイロードＢ。
【化2】
式中、「＊」は結合又は保護基を表す；
「＊」が結合を表す場合、Ｎ－グリカン中の「＊」のそれぞれに連結するリンカー；並びに
独立的にリンカーにコンジュゲートされた、同じか又は異なるペイロードＡ及びペイロードＢ。
【0043】
[0063]本開示の一実施形態において、Ｎ－グリカン、リンカー、並びにペイロードＡ及びＢは、式（２）の構造を有する：
【化3】
【0044】
[0064]本開示のさらなる実施形態では、ペイロードＡ及びペイロードＢは、同一又は異なる。
【0045】
[0065]本開示の実施形態によれば、抗メソテリン抗体又はその結合フラグメントは、メソテリン又はそのフラグメントを認識し、結合することができる。本明細書において、抗体という用語は最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント、並びに二本鎖及び単鎖抗体を包含する。また、本明細書において「抗体」という用語は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びメソセリンと特異的に結合する抗体も含有することが意図される。「抗体」という用語は、抗体全体を包含するが、抗体のフラグメント、例えば、抗体Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、切断された抗体からのＦｖフラグメント若しくはＦｃフラグメント、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、ミニボディ、ダイアボディ又はｓｃＦｖも含むことが意図されている。さらに、この用語は、抗体の遺伝子改変された誘導体を包含する。抗体、抗体のフラグメント及び遺伝子改変された抗体は、当技術分野で公知の方法によって得られうる。
【0046】
[0066]本明細書に記載の抗体は、Ｎ－グリカン結合ドメインを含む。一実施形態において、抗体は、重鎖定常領域を含み、Ｎ－グリカン結合ドメインは、重鎖定常領域中に位置する。いくつかの実施形態では、記載の抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２定常ドメインの重鎖中にアスパラギン残基のＮ－グリコシル化を有する。一実施形態では、抗体は２つの重鎖と２つのＮ－グリカンを含み、各Ｎ－グリカンは１つの重鎖に結合している。特に、式（１）に示されるＮ－グリカン中の最初のＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ１）は、抗体に結合している。
【0047】
[0067]本開示の一実施形態では、抗体ＤＣＢＰＲ２００２の抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖可変領域の相補性決定領域を含み、重鎖可変領域の相補性決定領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域を含み、軽鎖可変領域の相補性決定領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域を含み；ＣＤＲＨ１領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＨ２領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＨ３領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＬ１領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＬ２領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲＬ３領域は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0048】
[0068]本開示の一実施形態において、抗体はマウス抗体である。マウス抗メソテリン抗体であるクローンＳＳ１は、臨床試験において癌治療のために開発された。抗体ＳＳ１は、米国特許第７０８１５１８号に開示されているように、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0049】
[0069]ＳＳ１は、患者において強力な免疫原性と抗薬物抗体を誘導することが観察される。したがって、ＳＳ１のヒト化は、さらなる医薬品開発にとって不可欠かつ重要なステップである。ヒト化ＳＳ１ ４Ｄ５（ＨｄＳＳ１）の調製のために、臨床において検証されたフレームワークから、ヒトのアクセプターフレームワークを選択した。本開示の一実施形態では、抗体ＨｄＳＳ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0050】
[0070]本開示のいくつかの実施形態では、抗体は、ｍＡｂ ＳＳ１フレームワーク領域に対して最も高い度合いの相同性を有するヒト生殖系列ＶＬ及びＶＨ配列を含んでいる。特に、ヒト化抗体ＨｕＳＳ１（ＤＣＢＰＲ２００２）は、図１Ａ及び１Ｂに示されるように、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでいる。
【0051】
[0071]配列を表１に示す。
【0052】
[0072]表１
【表1】
【0053】
[0073]本明細書で使用される場合、「ＧｌｃＮＡｃ１」、「ＧｌｃＮＡｃ２」、「ＧｌｃＮＡｃ３」及び「ＧｌｃＮＡｃ４」はそれぞれアンテナ型グリカン部分の異なる位置におけるＧｌｃＮＡｃ糖を表す。
【0054】
[0074]本明細書で使用される場合、「
」は、３つのマンノースを含むトリマンノース構造を表し、第１のマンノース（Ｍａｎ１）はＧｌｃＮＡｃ糖に連結し；第２及び第３のマンノース（Ｍａｎ２及びＭａｎ３）はそれぞれα－１，３及びα－１，６グリコシド結合を介してＭａｎ１に連結している。
【化4】
」は、３つのマンノースを含むトリマンノース構造を表し、第１のマンノース（Ｍａｎ１）はＧｌｃＮＡｃ糖に連結し；第２及び第３のマンノース（Ｍａｎ２及びＭａｎ３）はそれぞれα－１，３及びα－１，６グリコシド結合を介してＭａｎ１に連結している。
【0055】
[0075]本明細書で使用される場合、「－（Ｆｕｃ）０－１」は、フコース糖が任意選択で存在することを表し、存在する場合には、フコース糖が１つだけ存在することを表す。
【0056】
[0076]本明細書に記載のＮ－グリカンは、式（１）の構造を有する。式（２）において示されるＮ－グリカン、リンカー、ペイロードＡ及びＢを合成するプロセスは、少なくとも国際公開第２０１８／１２６０９２号中に見られ得る。
【0057】
[0077]本明細書において使用される場合、「－（ＣＨ２）０－８－」は、－ＣＨ２－が存在してもしなくてもよく、存在する場合には、独立的に１、２、３、４、５、６、７又は８個の－ＣＨ２－基でありうることを表す。
【0058】
[0078]いくつかの実施形態では、リンカーは、コンジュゲーターとペイロードを接続することができる機能を有する。そのようなリンカーの例には、切断不可能なリンカー及び切断可能なリンカーが含まれるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、切断不可能なリンカーには、２～２０個の炭素原子を有する、直鎖状又は分岐状のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、又はアリールアミン基が含まれるが、それらに限定はされない。いくつかの実施形態では、切断能なリンカーには、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ不安定リンカー、及びエステラーゼ不安定リンカーが含まれるが、これらに限定はされない。リンカーの例には、２～２０個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、アリールアミン基、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、カーボネート、式（３）から式（７）、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ不安定リンカー、及びエステラーゼ不安定リンカーが含まれるが、これらに限定されない。上記の例のうち複数が、任意の順序で同時に使用され得る。
【化5】
【0059】
[0079]式（３）及び式（４）において：
Ｒ１は、独立的に、水素、ハロゲン、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、
アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択的に置換されており、
２つの置換基Ｒ１は、一緒に連結して、縮環シクロアルキル又は縮環（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、
Ｒ５は、独立的に、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基、及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され；
Ｘは、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２はＲ１であり；ａは０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；ａ’は０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；ａ＋ａ’＜１０であり；
Ｌは、２～２０個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、アリールアミン基、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、カーボネート、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ不安定リンカー、及びエステラーゼ不安定リンカー、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
Ｒ１は、独立的に、水素、ハロゲン、－ＯＲ５、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、
アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択的に置換されており、
２つの置換基Ｒ１は、一緒に連結して、縮環シクロアルキル又は縮環（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、
Ｒ５は、独立的に、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基、及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され；
Ｘは、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２はＲ１であり；ａは０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；ａ’は０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；ａ＋ａ’＜１０であり；
Ｌは、２～２０個の炭素原子を有する、直鎖状若しくは分枝状のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アシル、アルキルアミン、アリールアミン基、エーテル、エステル、アミド、カルバメート、カーボネート、ジスルフィド含有リンカー、酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ不安定リンカー、及びエステラーゼ不安定リンカー、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【化6】
【0060】
[0080]式（５）において：
Ｒ１及びＬは、式（３）及び式（４）において定義されるとおりであり；
Ｒ３は、独立的に、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され；
Ｒ４は、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基は、任意選択的にＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１つ又は複数のヘテロ原子により中断されており、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、独立的に、任意選択的に置換されている。
Ｒ１及びＬは、式（３）及び式（４）において定義されるとおりであり；
Ｒ３は、独立的に、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され；
Ｒ４は、水素、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ２４アルキル基、Ｃ６～Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７～Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７～Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基は、任意選択的にＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１つ又は複数のヘテロ原子により中断されており、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、独立的に、任意選択的に置換されている。
【化7】
【0061】
[0081]式（６）及び（７）において、Ｌは式（３）及び式（４）において定義されるとおりである。
【0062】
[0082]いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートが対象における疾患の治療のために使用される場合には、したがって、ペイロードＡ及びＢは、独立的に、治療薬でありうる。治療薬は、細胞分裂阻害性若しくは細胞障害性の薬剤、又は対応する放射性同位元素を有する同位体キレート剤であり得る。細胞分裂阻害性又は細胞障害性の薬剤の例には、代謝拮抗剤（例えば、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスリジン（５－ＦＵｄＲ）、メトトレキサート、ロイコボリン、ヒドロキシ尿素、チオグアニン（６－ＴＧ）、メルカプトプリン（６－ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、フルダラビンホスフェート、クラドリビン（２－ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、カペシチビン、アザチオプリン、シトシンメトトレキサート、トリメトプリム、ピリメタミン、又はペメトレキセド）；アルキル化剤（例えば、セルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、マイトマイシンＣ、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、ジブロモグラニット、テトラニトリ、プロカルバジン、アルトロタミン、ミトロミド又はテモゾロマイド）；アルキル化様薬剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、又はトリプラチン）；ＤＮＡ副溝アルキル化剤（例えば、ＣＣ－１０６５などのデュオカルマイシン、及びその任意の類似体又は誘導体；ピロロベンゾジアザペン、又はその任意の類似体又は誘導体）；アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、又はバルビシン）；抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミスラマイシン、アントラマイシン、ストレプトゾトシン、グラミシジンＤ、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）；カリケアマイシン；有糸分裂阻害剤（例えば、メイタンシノイド（ＤＭ１、ＤＭ３、及びＤＭ４など）、オーリスタチン（例えば、モノメチルオーロスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーロスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む）、ドラスタチン、クリプトフィシン、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノールビン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、又は新規タキサン）、ツブリシン、及びコルヒチンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、シラテカン、コシテカン、エキサテカン、ルルトテカン、ギマテカン、ベロテカン、ルビテカン、ＳＮ３８、ＤＸｄ、ＤＸｄ２、エトポサイド、テニポサイド、アミサクリン又はミトコトローン）；ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ボリノスタット、ロミデプシン、チダミド、パノビノスタット、又はベリノスタット）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ペプチジルボロン酸）；並びにＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２若しくは２１３、Ｐ３２などの放射性同位体及びＬｕ１７７を含むＬｕの放射性同位元素が含まれるが、限定はされない。同位体キレート剤の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタアセテート（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラアセテート（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラキス（２－ヒドロキシプロピル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（ＴＨＰ）、トリエチレンテトラアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’－ヘキサアセテート（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラキス（メチレンホスホネート）（ＤＯＴＰ）、及びメルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）が含まれるが、限定はされない。
【0063】
[0083]特に、本明細書において使用される治療薬は、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ、メイタンシノイド、デュオカルマイシン－ヒドロキシベンズアミドアザインドール、ジエチレントリアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタアセテート、エキサテカン、又はＤｘｄ２である。
【0064】
[0084]いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートが検出のために使用される場合、ペイロードＡ及びＢは、独立して標識でありうる。標識には、直接検出される標識若しくは部分（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）、並びに酵素若しくはリガンドなど、例えば、酵素反応若しくは分子相互作用によって間接的に検出される部分が含まれるが、これらに限定はされない。例示的な標識には、放射性同位体のＰ３２、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｈ３、及びＩ１３１、希土類キレート若しくはフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどの蛍光体、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタレンジオン、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、若しくはマイクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化する過酸化水素を用いる酵素と結合したウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどが含まれるが、これらに限定はされない。別の実施形態では、標識は陽電子放出体である。陽電子放出体には、Ｇａ６８、Ｆ１８、Ｃｕ６４、Ｙ８６、Ｂｒ７６、Ｚｒ８９、及びＩ１２４が含まれるが、これらに限定はされない。
【0065】
[0085]本開示のいくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、ペイロードＡ及びＢ並びにリンカーで完全に装填されていなくてもよく、Ｎ－グリカンは保護基と直接結合していてもよい。保護基は、治療薬又は標識でさらに置換されうる。保護基の一例はアジドである。
【0066】
[0086]本開示の一実施形態は、本開示のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物に関する。
【0067】
[0087]本開示の一実施形態は、本開示のイムノコンジュゲートを用いて疾患又は障害を治療する方法に関するものである。疾患は癌でありうる。特に癌は、メソテリンを発現する癌である。「メソテリンを発現する癌」とは、メソテリンを発現している細胞を持つ癌全般を指す。メソテリンは一般に、肺、胸膜、卵巣、乳房、胃、胆管、子宮、及び胸腺に関連する腫瘍を含む固形腫瘍に発現している。よって、メソテリンを発現する癌の例には、卵巣癌、中皮腫、膵臓癌、非小細胞肺癌、食道癌、胃癌、胆道癌、大腸癌、子宮内膜癌、及び乳癌が含まれるが、これらに限定はされない。特に癌は、卵巣癌である。
【0068】
[0088]いくつかの実施形態では、イムノコンジュゲートは、インビボ薬物動態プロファイルに基づき、ランダムコンジュゲーションイムノコンジュゲートよりも比較的安定なコンジュゲーション結合を示す。
【0069】
[0089]いくつかの実施形態において、Ｎ－グリカンを有するイムノコンジュゲートは、ゼノグラフト動物モデルにおいてランダムコンジュゲーションイムノコンジュゲートよりも優れた有効性を示す。
【0070】
[0090]本開示の実施形態について、以下の具体例を用いて説明する。当業者であれば、これらの例は説明のためのみのものであり、本開示の範囲を逸脱することなく他の改変及び変形が可能であることを理解する。
【実施例】
【0071】
[0091]特に断りのない限り、各１Ｈ ＮＭＲデータは５００ＭＨｚで得られたものである。本明細書で使用される略語は、別段の指定がない限り、以下のとおりである：Ａｚ：アジド；Ｂｕ：ブチル；Ｂｎ：ベンジル；ＢＯＣ：ｔ－ブチルオキシカルボニル；ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリ／ジメチルアミノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；ＤＢＣＯ：ジベンゾシクロオクチン基；ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン；ＥＤＣ：１－（３－ジメチルアミノプロピル）３－エチルカルボジイミド塩酸塩；ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル；ｅｑ．：当量（複数可）；ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ－アセチルグルコサミン；ＧｌｃＮＡｚ：アジド－Ｎ－アセチルグルコサミン；ＨＢＴＵ：３－［ビス（ジメチルアミノ）メチルイウミル］－３Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－オキシドヘキサフルオロホスフェート；ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム；ＨＯＢｔ：ヒドロキシベンズトリアゾール；ＨＯＳｕ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド；ＨＡＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート；ヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム；ＬＡＨ：水素化アルミニウムリチウム；ＭｅＯＨ：メタノール；ＭＥＳ：４－モルホリンエタンスルホン酸；ＭＧＡＴ－１：マンノシル（α－１，３－）－糖タンパク質β－１，２－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；ＭＧＡＴ－２：マンノシル（α－１，６－）－糖タンパク質β－１，２－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；ＭＨｚ：メガヘルツ；ＭＭＡＥ：モノメチルアウリスタチンＥ；ＭＳ（ＥＳ）：質量分析－エレクトロスプレー；ＮＭＰ：Ｎ－メチルピロリジノン；Ｐｈ：フェニル；Ｐｒ：プロピル；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー；Ｔｅｔｒａｋｉｓ：テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム；ＵＤＰ：ウリジン二リン酸。
【0072】
[0092]実施例１ 抗メソテリンＳＳ１、ｍＡｂのヒト化
【0073】
[0093]ヒトＶ領域フレームワーク配列の選択：
[0094]親抗体として米国特許第７，０８１，５１８号に配列が開示されているマウスモノクローナル抗体ＳＳ１を使用して、カバット（Ｋａｂａｔ）の定義によるＳＳ１ ｍＡｂ ＣＤＲ配列を図１Ａに記載した（配列番号７及び８）。
[0094]親抗体として米国特許第７，０８１，５１８号に配列が開示されているマウスモノクローナル抗体ＳＳ１を使用して、カバット（Ｋａｂａｔ）の定義によるＳＳ１ ｍＡｂ ＣＤＲ配列を図１Ａに記載した（配列番号７及び８）。
【0074】
[0095]ヒト化ＳＳ１ ４Ｄ５（ＨｄＳＳ１）の調製のために、臨床において検証されたフレームワークから、ヒトのアクセプターフレームワークを選択した。ＶＨサブグループＩＩＩ、ＩＧＨＶ３－６６＊０４及びＶＬκサブグループＩ、ＩＧＫＶ１－３９＊０１のヒト重鎖及び軽鎖フレームワーク配列は、臨床において検証されており、また、多くのヒト化抗体にも使用されて、成功を収めている。
【0075】
[0096]図１Ａに示されているように、ＩＧＨＶ３－６６＊０４重鎖フレームワーク領域の配列は、ｍＡｂ ＳＳ１のものとは３５アミノ酸（下線の残基）だけ異なっており、これは、４２．６８％（フレームワーク領域中の総残基数８２のうちの３５残基）の変動に相当する。さらに、ＩＧＫＶ１－３９＊０１（ＶＬ）軽鎖フレームワーク領域の配列は、２５アミノ酸（下線の残基）だけｍＡｂ ＳＳ１のものと異なっており、これは、３０．８６％（フレームワーク領域中の総残基数８１のうちの２５残基）の変動に相当する。
【0076】
[0097]ヒト化ＳＳ１ ＩＭＧＴ（ＨｕＳＳ１）の調製のために、ｍＡｂ ＳＳ１フレームワーク領域との相同性が最も高いヒト生殖系列ＶＬ及びＶＨ配列をＩＭＧＴデータベース（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））から同定した。相同性検索は、ＢＬＡＳＴ又は同様な方法で実行されうる。これらの研究により、ヒト生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ１－２＊０２（ＶＨ）及びＩＧＶＫ３－１１＊０１（ＶＬ）が、ｍＡｂ ＳＳ１の対応する重鎖及び軽鎖フレームワーク配列に最も相同なＶＨ及びＶＬ配列として、それぞれ同定された。
【0077】
[0098]図１Ｂに示されているように、ＩＧＨＶ１－２＊０２重鎖フレームワーク領域の配列は、ｍＡｂ ＳＳ１のものとは２５アミノ酸（下線の残基）だけ異なっており、これは、３０．４９％（フレームワーク領域中の総残基数８２のうちの２５残基）の変動に相当する。図１Ｂに示されているように、ＩＧＶＫ３－１１＊０１（ＶＬ）軽鎖フレームワーク領域の配列は、２７アミノ酸（下線の残基）だけｍＡｂ ＳＳ１のものと異なっており、これは、３３．３３％（フレームワーク領域中の総残基数８１のうちの２７残基）の変動に相当する。
【0078】
[0099]これらの２対の軽鎖及び重鎖配列（ｈｕｍ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＩＭＧＴ）をヒトメソテリンに対するヒト化抗体の構築のための例として使用した。（配列番号９、１０、１１、及び１２）
【0079】
[0100]実施例２ ヒト化抗体の結合親和性分析
【0080】
[0101]全長抗体の発現
[0102]マウス抗体をヒト化した後の親和性の変化を確認するため、ＩＭＧＴ版及び４Ｄ５版のヒト化軽鎖及びヒト化重鎖の可変領域をそれぞれヌクレオチド合成法によって直接的に生成した。図２に示されているように、マウス可変領域、ＩＭＧＴのヒト化版（配列番号１１及び１２）及び４Ｄ５（配列番号９及び１０）可変領域をヒトＦｃキメラ抗体発現ベクターｐＴＣＡＥ８にサブクローニングし、宿主細胞に導入して、組換え抗体発現細胞を調製した。発現用の宿主細胞として、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。
[0102]マウス抗体をヒト化した後の親和性の変化を確認するため、ＩＭＧＴ版及び４Ｄ５版のヒト化軽鎖及びヒト化重鎖の可変領域をそれぞれヌクレオチド合成法によって直接的に生成した。図２に示されているように、マウス可変領域、ＩＭＧＴのヒト化版（配列番号１１及び１２）及び４Ｄ５（配列番号９及び１０）可変領域をヒトＦｃキメラ抗体発現ベクターｐＴＣＡＥ８にサブクローニングし、宿主細胞に導入して、組換え抗体発現細胞を調製した。発現用の宿主細胞として、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。
【0081】
[0103]このように構築されたベクターを３０ｍｌ体積のフリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）（商標）２９３細胞の懸濁液にトランスフェクトするために、以下の手順が使用される。トランスフェクションの間、細胞はフリースタイル（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中に保持されうる。トランスフェクションの約２４時間前に、フリースタイル（商標）２９３細胞を１５ｍｌの２×１０６細胞／ｍｌで継代した。（１つ又は複数の）フラスコを８％のＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターに入れた。次に、３７．５μｇのプラスミドＤＮＡを１．５ｍｌの滅菌１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈して、総量を１．５ｍｌとした。別のチューブで、３７．５μｌのＰＥＩ（２．０ｍｇ／ｍｌ）を１．５ｍｌの滅菌１５０ｍＭ ＮａＣｌで希釈した。ＤＮＡ及びＰＥＩ溶液を室温において５分間静置した。チューブを反転させて溶液を穏やかに混合し、その後、室温で１０～２０分程度放置した。ＤＮＡ－ＰＥＩ混合物をＦ２９３細胞に添加し、トランスフェクトした細胞を３７℃、８％ＣＯ２のインキュベーター中、１３５～１５０ｒｐｍで回転するオービタルシェーカープラットフォーム上で４時間インキュベートした。その後、等量の新鮮な培養培地を加えて、総量を３０ｍｌとし、細胞を５～７日間培養した。次いで、抗体の精製及び定量化のために細胞を回収した。
【0082】
[0104]回収した上清を０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）で濾過して、夾雑物を除去した。プロテインＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）、１．５Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨバッファー、３Ｍ ＮａＣｌ，（ｐＨ９．０）を吸収バッファーとして使用し、０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．５）を溶出バッファーとして使用して、抗体を含む培養上清をアフィニティー精製した。溶出画分は１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）を加えることによってｐＨ６．０～７．０付近に調整した。調製した抗体溶液を透析膜（１０，０００ＭＷカット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いてＰＢＳで置換し、ポアサイズ０．２２μｍのメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）で濾過滅菌して、精製抗体を得た。精製された抗体の濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定し、１ｍｇ／ｍｌに等しい１．４５の最適密度に基づいて測定値を換算した。
【0083】
[0105]ＥＬＩＳＡによる抗体結合親和性の測定
[0106]ＥＬＩＳＡプレートに１ウェルあたり１～２μｇ／１００μｌのメソテリンタンパク質をコーティングした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で２時間、１ウェルあたり３００μｌの５％ ＭＰＢＳによりブロッキングした。ＰＢＳで洗浄した後、ウェルを５％のＭＰＢＳで連続希釈したメソテリン抗体と共に３７℃で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（１：１０，０００）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を各ウェルに添加した。吸光度を上記のようにして測定し、抗体の結合親和性を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非線形回帰によって計算した。
[0106]ＥＬＩＳＡプレートに１ウェルあたり１～２μｇ／１００μｌのメソテリンタンパク質をコーティングした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で２時間、１ウェルあたり３００μｌの５％ ＭＰＢＳによりブロッキングした。ＰＢＳで洗浄した後、ウェルを５％のＭＰＢＳで連続希釈したメソテリン抗体と共に３７℃で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（１：１０，０００）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を各ウェルに添加した。吸光度を上記のようにして測定し、抗体の結合親和性を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非線形回帰によって計算した。
【0084】
[0107]ｍＡｂ ＳＳ１のＣＤＲ配列をＩＧＨＶ３－６６＊０４及びＩＧＶＫ１－３９＊０１配列に移植することによって生成されたＨｄＳＳ１（ＨＨ）は、フレームワーク領域における変動の度合いが高く、メソテリンに対してはるかに低い親和性を示す（ＫＤ＝２．６１Ｅ－０８Ｍ）（比較のために、ｍＡＢ ＳＳ１ではＫＤ＝８．３６Ｅ－１１Ｍ）（図３）、（以下の表２）。
【0085】
[0108]ＨｄＳＳ１とは対照的に、ｍＡｂ ＳＳ１のＣＤＲ配列をＩＧＨＶ１－２＊０２及びＩＧＶＫ３－１１＊０１配列に移植することによって生成されたＨｕＳＳ１（ＨＨ）は、フレームワーク領域における変動の度合いが高いが、メソテリンに対する比較的良好な親和性を有している（ＫＤ＝４．９９Ｅ－１１Ｍ）（比較のために、ｍＡＢ ＳＳ１ではＫＤ＝８．３６Ｅ－１１Ｍ）（図３）（以下の表２）。
【0086】
[0109]これらの結果は、ＩＧＨＶ１－２＊０２重鎖フレームワーク領域及びＩＧＶＫ３－１１＊０１軽鎖フレームワーク領域が、ＣＤＲ領域のコンフォメーションに影響を与えることなく、比較的高い度合いの変動を許容することに優れていることを示唆している。
【0087】
[0110]表２
【表2】
【0088】
[0111]ＢＩＡｃｏｒｅを使用した親和性測定と速度論的分析
[0112]個々の抗体間の結合動態の違いを知るために、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ Ｉｎｃ．）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を以前に記載されたようにして使用した（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ＆ Ｆａｌｔ、（１９９７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００：１２１－１３３）。サプライヤーの指示に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｃｙｔｉｖａ Ｉｎｃ．）をＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化した。メソセリンタンパク質を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で５μｇ／ｍｌに希釈してから１０μＬ／分の流速で注入し、結合タンパク質が約１５００反応単位（ＲＵ）に達した後に１Ｍのエタノールアミンの注入により未反応基をブロックした。動態測定のために、抗メソテリンｍＡｂ（０．３１２５ｎＭ～４０ｎＭ）の２倍連続希釈をメーカー（Ｃｙｔｉｖａ Ｉｎｃ．）によって提供されたＨＢＳ－ＥＰ＋ Ｂｉａｃｏｒｅランニングバッファーに加えて２５℃、流速３０μＬ／分で注入し、ブランクフローセルに対する反応を減算することによって、メソテリンタンパク質に対する結合反応を補正した。結合速度（ｋｏｎ又はｋａ）と解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）は、ｋｏｎとｋｏｆｆを別々にフィッティングしたシンプルな１対１のラングミュア結合モデルを用いて計算した。（サイティバ（Ｃｙｔｉｖａ）（商標）Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
[0112]個々の抗体間の結合動態の違いを知るために、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ Ｉｎｃ．）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を以前に記載されたようにして使用した（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ＆ Ｆａｌｔ、（１９９７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００：１２１－１３３）。サプライヤーの指示に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｃｙｔｉｖａ Ｉｎｃ．）をＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化した。メソセリンタンパク質を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で５μｇ／ｍｌに希釈してから１０μＬ／分の流速で注入し、結合タンパク質が約１５００反応単位（ＲＵ）に達した後に１Ｍのエタノールアミンの注入により未反応基をブロックした。動態測定のために、抗メソテリンｍＡｂ（０．３１２５ｎＭ～４０ｎＭ）の２倍連続希釈をメーカー（Ｃｙｔｉｖａ Ｉｎｃ．）によって提供されたＨＢＳ－ＥＰ＋ Ｂｉａｃｏｒｅランニングバッファーに加えて２５℃、流速３０μＬ／分で注入し、ブランクフローセルに対する反応を減算することによって、メソテリンタンパク質に対する結合反応を補正した。結合速度（ｋｏｎ又はｋａ）と解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）は、ｋｏｎとｋｏｆｆを別々にフィッティングしたシンプルな１対１のラングミュア結合モデルを用いて計算した。（サイティバ（Ｃｙｔｉｖａ）（商標）Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
【0089】
[0113]結果を図４及び表３（下図）に示す。メソテリンと結合するキメラＳＳ１ ｍＡｂのｋｏｎ及びｋｏｆｆは、それぞれ３．４１５Ｅ６及び１．１９４Ｅ－５であり、ＫＤは３．４９６Ｅ－１２ｍｏｌ／Ｌである。ＨｕＳＳ１ｍＡｂ（ＩＭＧＴ版）のメソテリン結合のｋｏｎ及びｋｏｆｆはそれぞれ、４．４９３Ｅ６及び１．１２４Ｅ－５であり、ＫＤは２．５０１Ｅ－１２である。
【0090】
[0114]図４の結果から、ヒト化抗体ＨｕＳＳ１（ＤＣＢＰＲ２００２）は、ヒトメソテリンタンパク質を認識することができ、ヒト化後のＩＭＧＴ版の親和性は、マウスＳＳ１抗体のものと同様であり、約２．５０１Ｅ－１２のＫＤ値という好ましい親和性を有することが示唆される。
【0091】
[0115]表３
【表3】
【0092】
[0116]実施例３ トリマンノシル－ＤＣＢＰＲ２００２（ＤＣＢＰＲ２００２－ＴＭ）の調製）
【0093】
[0117]ＤＣＢＰＲ２００２からＮ－グリカンのガラクトース及びシアル酸部分を除去するために、１０ｍｇのＤＣＢＰＲ２００２を２０μｌのβ１，４－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＮＥＢ、Ｐ０７４５Ｌ、８ユニット／μｌ）及び５μｌのα２－３，６，８ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＥＢ、Ｐ０７２０Ｌ、５０ユニット／μｌ）を１×ＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ、総体積１ｍＬ）中、３７℃で２４時間処理した。反応物にさらにβ１，４－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ＮＥＢ、Ｐ０７４５Ｌ、８ユニット／μｌ）を１０μｌ加え、３７℃でさらに２４時間反応を行わせて、Ｇ０Ｆ／Ｇ０抗体サンプルを得た。抗体サンプルをｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－１２７９－０２）を使用して精製した。精製後、抗体サンプルを還元マスクロマトグラフィー分析に供した。
【0094】
[0118]ＤＣＢＰＲ２００２－２Ａｚの調製（図２１Ａ）
[0119]ＭＧＡＴ－１は、ＵＤＰ－アジド－Ｎ－アセチルグルコサミンをトリマンノシルコアタンパク質の各アームの末端マンノースの１つに転移させる。この現象を抗体で確認するために、トリマンノシル－ＤＣＢＰＲ２００２（５ｍｇ）とＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｚ（最終濃度２．５ｍｇ）を１０００μｌの１×バッファーＳＰ（２５ｍＭ ＭＥＳ（４－モルホリンエタンスルホン酸）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）中、ＭＧＡＴ－１（０．１ｍｇ；Ｒ＆Ｄ，８３３４－ＧＴ又は自家製）の存在下、３７℃で１６時間インキュベートした。生成物のＤＣＢＰＲ２００２－２Ａｚを還元マスクロマトグラフィー分析に供した。
[0119]ＭＧＡＴ－１は、ＵＤＰ－アジド－Ｎ－アセチルグルコサミンをトリマンノシルコアタンパク質の各アームの末端マンノースの１つに転移させる。この現象を抗体で確認するために、トリマンノシル－ＤＣＢＰＲ２００２（５ｍｇ）とＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｚ（最終濃度２．５ｍｇ）を１０００μｌの１×バッファーＳＰ（２５ｍＭ ＭＥＳ（４－モルホリンエタンスルホン酸）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）中、ＭＧＡＴ－１（０．１ｍｇ；Ｒ＆Ｄ，８３３４－ＧＴ又は自家製）の存在下、３７℃で１６時間インキュベートした。生成物のＤＣＢＰＲ２００２－２Ａｚを還元マスクロマトグラフィー分析に供した。
【0095】
[0120]ＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの調製（図２１Ｂ）
[0121]８００μｌの１×バッファーＳＰ（２５ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）中のトリマンノシル－ＤＣＢＰＲ２００２（５ｍｇ）及びＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｚ（２．５ｍｇ）をウサギＭＧＡＴ－１（０．２ｍｇ）及びラットＭＧＡＴ－２（０．０５ｍｇ）の存在下、３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、反応生成物のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚを還元マスクロマトグラフィー分析及びインタクトマスクロマトグラフィー分析に供した。
[0121]８００μｌの１×バッファーＳＰ（２５ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）中のトリマンノシル－ＤＣＢＰＲ２００２（５ｍｇ）及びＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｚ（２．５ｍｇ）をウサギＭＧＡＴ－１（０．２ｍｇ）及びラットＭＧＡＴ－２（０．０５ｍｇ）の存在下、３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、反応生成物のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚを還元マスクロマトグラフィー分析及びインタクトマスクロマトグラフィー分析に供した。
【0096】
[0122]実施例４：ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（化合物５）の調製
【0097】
[0123]化合物３の合成
【化8】
【0098】
[0124]ＤＢＣＯ－ＣＯ２Ｈ（１）（２００ｍｇ、１ｅｑ）、ＥＤＣ（２２６ｍｇ、３ｅｑ）、ＨＯＳｕ（３７６ｍｇ、３ｅｑ）の混合物をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶かし、室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去し、さらに精製することなく、化合物２を得た。
【0099】
[0125]ジクロロメタン（５ｍＬ）中の化合物２（１ｅｑ）及び３－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（１７４ｍｇ、１．２ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（１７０ｍｇ、２ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び１Ｎ ＨＣｌ（ａｑ）で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、褐色液体の化合物３を得た（収率５４％）。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 7.69 (dd, J = 7.7, 1.3 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.53 -7.44 (m, 3H), 7.39 (td, J = 7.5, 1.6 Hz, 1H), 7.35 (td, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H),7.30 (dd, J = 7.4, 1.6 Hz, 1H), 5.04 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 3.62 (d, J = 14.0Hz, 1H), 3.58 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.48 - 3.43 (m, 8H), 3.29 (dd, J = 5.9, 2.3Hz, 2H), 3.13 - 3.04 (m, 2H), 2.61 - 2.55 (m, 1H), 2.42 (t, J = 6.4 Hz, 2H),2.24 (dt, J = 15.5, 7.8 Hz, 1H), 2.00 (ddd, J = 15.4, 8.2, 5.7 Hz, 1H), 1.76(ddd, J = 16.3, 8.0, 5.7 Hz, 1H).LC-MS(ESI): m/z [C28H32N2O7]の計算値509.2 [M +1]+, 実測値509.2[M +1]+.
【0100】
[0126]ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（化合物５）の合成
【化9】
【0101】
[0127]２：１のＤＣＭ：ＤＭＦ（６ｍＬ）中の化合物３（２８６ｍｇ、１ｅｑ）、ｖｃ－ＭＭＡＥ（化合物４）（６３０ｍｇ、１．１ｅｑ）及びＨＡＴＵ（４２８ｍｇ、２ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（１４５ｍｇ、２ｅｑ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体の化合物５を得た（収率７１％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.66 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 3.5 Hz, 3H), 7.51 - 7.44 (m,3H), 7.42 - 7.37 (m, 3H), 7.33 (dt, J = 15.5, 8.2 Hz, 5H), 7.26 (d, J = 7.3 Hz,1H), 7.23 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 5.23 - 5.07 (m, 3H), 4.71 - 4.48 (m, 4H), 4.29 -4.15 (m, 4H), 3.75 - 3.69 (m, 3H), 3.63 - 3.54 (m, 8H), 3.46 - 3.39 (m, 3H),3.36 (s, 4H), 3.30 (d, J = 16.5 Hz, 3H), 3.26 - 3.23 (m, 2H), 3.23 - 3.16 (m,2H), 3.12 (s, 2H), 2.96 (dd, J = 17.0, 10.0 Hz, 3H), 2.75 - 2.68 (m, 1H), 2.57- 2.46 (m, 4H), 2.38 (dt, J = 15.0, 7.5 Hz, 1H), 2.28 - 2.04 (m, 5H), 2.04 -1.66 (m, 8H), 1.66 - 1.49 (m, 4H), 1.45 (d, J = 29.4 Hz, 2H), 1.19 (dd, J =6.6, 3.0 Hz, 3H), 1.15 (dd, J = 12.8, 6.8 Hz, 3H), 1.03 - 0.70 (m, 24H).
【0102】
[0128]実施例５ ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１（化合物１１）の調製
【0103】
[0129]化合物７の合成
【化10】
【0104】
[0130]メタノール（１０ｍＬ）中の４－メルカプトブタン酸（０．５ｇ、１ｅｑ）の溶液に１，２－ジ（ピリジン－２－イル）ジスルファン（１．８３ｇ、２ｅｑ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をヘキサン／酢酸エチルを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、無色液体の化合物６を得た（収率１４％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.49 (ddd, J = 4.8, 1.8, 0.9 Hz, 1H), 7.72 (dt, J = 8.1, 1.0 Hz,1H), 7.69 - 7.61 (m, 1H), 7.12 (ddd, J = 7.3, 4.9, 1.1 Hz, 1H), 2.88 (t, J =7.1 Hz, 2H), 2.53 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.07 (p, J = 7.2 Hz, 2H).
【0105】
[0131]ＤＣＭ（５ｍＬ）中の化合物６（２８６ｍｇ、１ｅｑ）、ｖｃ－ＭＭＡＥ（４）（６３０ｍｇ、１．１ｅｑ）及びＨＡＴＵ（４２８ｍｇ、２ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（１４５ｍｇ、２ｅｑ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体の化合物７を得た（収率７１％）。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 7.18 (d, J = 1.5Hz, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.62 - 6.56 (m, 1H), 6.56 - 6.52 (m, 1H), 5.94 (s, 1H),5.56 (dd, J = 14.8, 9.0 Hz, 1H), 5.31 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 4.52 (dd, J = 12.0,2.7 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 12.3 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.52 - 3.45 (m, 2H), 3.25(s, 3H), 3.13 (s, 3H), 2.93 - 2.78 (m, 4H), 2.72 (s, 3H), 2.21 (t, J = 7.2 Hz,2H), 2.04 (dd, J = 14.4, 2.4 Hz, 1H), 1.69 (p, J = 7.4 Hz, 2H), 1.59 (s, 3H),1.50 - 1.40 (m, 2H), 1.14 (dd, J = 28.7, 6.6 Hz, 6H), 0.97 (d, J = 6.4 Hz, 6H),0.78 (s, 3H).
【0106】
[0132]化合物９の合成
【化11】
【0107】
[0133]ＤＭＦ（８ｍＬ）中の化合物１（０．５ｇ、１ｅｑ）及び化合物８（０．６２ｇ、１．３ｅｑ）の混合物にＨＢＴＵ（０．９２ｇ、１．５ｅｑ）及びＤＩＰＥＡ（０．５７ｍＬ、２ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、オレンジ色液体の化合物９を得た（収率７６％）。LC-MS(ESI): m/z [C32H41N3O7]の計算値579.68 [M +1]+, 実測値479.95[M +1]+.
【0108】
[0134]化合物１０の合成
[0135]ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の化合物９（０．７２ｇ、１ｅｑ）の溶液に、氷浴下でＴＦＡ（２．８５ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、褐色固体の化合物１０を得た（収率６９％）。H NMR (600 MHz, DMSO) δ 7.78 - 7.74 (m, 2H),7.69 - 7.66 (m, 1H), 7.62 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.52 - 7.45 (m, 2H), 7.40 - 7.33(m, 2H), 7.30 (dd, J = 7.4, 1.2 Hz, 1H), 5.03 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 3.62 (d, J= 14.0 Hz, 1H), 3.57 - 3.53 (m, 6H), 3.49 - 3.44 (m, 6H), 3.30 (td, J = 6.0,1.8 Hz, 2H), 3.12 - 3.04 (m, 2H), 2.96 (dd, J = 10.7, 5.5 Hz, 2H), 2.59 (ddd, J= 24.2, 9.8, 4.7 Hz, 1H), 2.23 (dt, J = 15.4, 7.6 Hz, 1H), 2.04 - 1.96 (m, 1H),1.76 (ddd, J = 16.4, 8.0, 5.8 Hz, 1H). LC-MS(ESI): m/z [C27H33N3O5]の計算値479.57 [M +1]+, 実測値480.1 [M +1]+.
[0135]ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の化合物９（０．７２ｇ、１ｅｑ）の溶液に、氷浴下でＴＦＡ（２．８５ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、褐色固体の化合物１０を得た（収率６９％）。H NMR (600 MHz, DMSO) δ 7.78 - 7.74 (m, 2H),7.69 - 7.66 (m, 1H), 7.62 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.52 - 7.45 (m, 2H), 7.40 - 7.33(m, 2H), 7.30 (dd, J = 7.4, 1.2 Hz, 1H), 5.03 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 3.62 (d, J= 14.0 Hz, 1H), 3.57 - 3.53 (m, 6H), 3.49 - 3.44 (m, 6H), 3.30 (td, J = 6.0,1.8 Hz, 2H), 3.12 - 3.04 (m, 2H), 2.96 (dd, J = 10.7, 5.5 Hz, 2H), 2.59 (ddd, J= 24.2, 9.8, 4.7 Hz, 1H), 2.23 (dt, J = 15.4, 7.6 Hz, 1H), 2.04 - 1.96 (m, 1H),1.76 (ddd, J = 16.4, 8.0, 5.8 Hz, 1H). LC-MS(ESI): m/z [C27H33N3O5]の計算値479.57 [M +1]+, 実測値480.1 [M +1]+.
【0109】
[0136]ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１（化合物１１）の合成
【化12】
【0110】
[0137]ＤＭＦ（７ｍＬ）中の化合物７（７０ｍｇ、１ｅｑ）及び化合物１０（１００ｍｇ、０．９ｅｑ）の混合物にＨＢＴＵ（７７ｍｇ、１．５ｅｑ）及びＤＩＰＥＡ（０．０４７ｍＬ、２ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、オレンジ色固体の化合物１１を得た（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）（収率５４％）。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 7.86 (t, J = 5.6Hz, 1H), 7.76 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.70 - 7.66 (m, 1H), 7.62 (d, J = 7.3 Hz,1H), 7.52 - 7.43 (m, 2H), 7.40 - 7.32 (m, 2H), 7.29 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.17(s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.63 - 6.56 (m, 1H), 6.55 - 6.52 (m, 1H), 5.94 (s, 1H),5.56 (dd, J = 14.8, 9.0 Hz, 1H), 5.31 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 5.02 (d, J = 14.0Hz, 1H), 4.52 (dd, J = 12.1, 2.7 Hz, 1H), 4.06 (t, J = 12.3 Hz, 1H), 3.93 (d, J= 8.8 Hz, 3H), 3.61 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 3.47 (s, 9H), 3.37 (t, J = 5.9 Hz,2H), 3.29 (td, J = 5.9, 2.2 Hz, 2H), 3.24 (s, 3H), 3.17 (dt, J = 11.6, 9.2 Hz,3H), 3.12 (s, 2H), 3.10 - 3.02 (m, 2H), 2.88 (ddd, J = 15.9, 12.2, 5.3 Hz, 2H),2.84 - 2.81 (m, 1H), 2.81 - 2.78 (m, 1H), 2.71 (s, 2H), 2.60 - 2.53 (m, 2H),2.53 - 2.51 (m, 5H), 2.48 - 2.44 (m, 3H), 2.23 (dt, J = 15.5, 7.8 Hz, 1H), 2.07(td, J = 7.0, 2.7 Hz, 2H), 2.00 (ddd, J = 15.3, 12.4, 8.4 Hz, 2H), 1.76 (ddd, J= 16.4, 7.9, 5.7 Hz, 1H), 1.71 - 1.65 (m, 2H), 1.59 (s, 2H), 1.50 - 1.41 (m,2H), 1.24 (dd, J = 6.9, 5.8 Hz, 2H), 1.17 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.12 (d, J = 6.4Hz, 3H), 0.84 (ddd, J = 13.1, 9.9, 6.7 Hz, 1H), 0.78 (s, 2H). LC-MS(ESI): m/z[C66H85ClN6O16S2]の計算値1317.99 [M +1]+, 実測値1299.41 [M-18]+.
【0111】
[0138]実施例６ ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ（化合物２０）の調製
【0112】
[0139]化合物１２の合成
[0140]化合物１２は、Ｂｅｕｓｋｅｒ，Ｐ．Ｈ．（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１５年、１２、１８１３－１８３５）に記載されているとおりに調製した。
[0140]化合物１２は、Ｂｅｕｓｋｅｒ，Ｐ．Ｈ．（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１５年、１２、１８１３－１８３５）に記載されているとおりに調製した。
【0113】
[0141]化合物１４の合成
【化13】
【0114】
[0142]ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の化合物１２（０．８０５ｇ、１ｅｑ）の溶液に、氷浴下でビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（０．８５８ｇ、２ｅｑ）及びトリメチルアミン（０．９８３ｍＬ、５ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で８時間撹拌し、次いで化合物１３（１．８５ｇ、５ｅｑ）を氷浴下で反応混合物に加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１４を得た（収率２１．７％）。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.33 (s, 1H), 9.47(s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.40 - 8.31 (m, 1H), 7.99 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.74 (d,J = 9.6 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 7.18(d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.30 (s, 2H), 5.16 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 4.69 - 4.61 (m,2H), 4.47 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 3.83 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.80 - 3.64 (m, 3H),3.64 - 3.60 (m, 1H), 3.60 - 3.51 (m, 4H), 3.52 - 3.43 (m, 3H), 3.41 (s, 4H),3.33 (s, 1H), 2.96 - 2.92 (m, 1H), 2.88 - 2.81 (m, 3H), 2.81 - 2.73 (m, 2H),1.47 - 1.21 (m, 9H). LC-MS(ESI): m/z [C44H51ClN6O10]の計算値859.36 [M +1]+, 実測値859.7 [M +1]+.
【0115】
[0143]化合物１５の合成
【化14】
【0116】
[0144]ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物１（０．３ｇ、１ｅｑ）、ＨＢＴＵ（０．５６ｇ、１．５ｅｑ）、２－（２－アミノエトキシ）エタン－１－オール（０．１２ｇ、１．２ｅｑ）の混合物に氷浴下でＤＩＰＥＡ（０．３４ｍＬ、２ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１５を得た（収率７０％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.55 (d, J = 7.4Hz, 1H), 7.51 - 7.47 (m, 1H), 7.38 - 7.33 (m, 3H), 7.24 (dtd, J = 22.1, 7.5,1.2 Hz, 2H), 7.14 (dd, J = 7.5, 1.4 Hz, 1H), 5.02 (t, J = 10.9 Hz, 1H), 3.66 -3.56 (m, 2H), 3.56 - 3.50 (m, 2H), 3.39 - 3.36 (m, 2H), 3.36 - 3.28 (m, 2H),3.16 - 3.11 (m, 2H), 2.59 (dt, J = 16.4, 7.6 Hz, 1H), 2.25 (dt, J = 15.1, 7.5Hz, 1H), 2.10 - 2.01 (m, 1H), 1.90 - 1.82 (m, 1H). LC-MS(ESI): m/z [C23H24N2O4]の計算値392.45 [M +1]+, 実測値393.39 [M +1]+.
【0117】
[0145]化合物１６の合成
[0146]ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（６／２ｍＬ）中の化合物１５（０．２ｇ、１ｅｑ）の溶液にビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（０．４７ｇ、３ｅｑ）及びＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ、３ｅｑ）を不活性雰囲気下で添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を組み合わせて、減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１６を得た（収率７０％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.30 - 8.27 (m,2H), 7.70 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.53 - 7.50 (m, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 5H), 7.37(dd, J = 7.5, 1.4 Hz, 1H), 7.32 (td, J = 7.5, 0.8 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 1.2 Hz,1H), 5.17 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 4.43 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.81 - 3.72 (m, 2H),3.69 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 3.57 - 3.44 (m, 2H), 3.43 - 3.32 (m, 2H), 2.83 (ddd,J = 16.9, 8.6, 5.9 Hz, 1H), 2.45 (ddd, J = 14.7, 8.6, 5.8 Hz, 1H), 2.21 (dt, J= 15.2, 6.1 Hz, 1H), 1.97 (dt, J = 17.0, 6.1 Hz, 1H). LC-MS(ESI): m/z [C30H27N3O8]の計算値557.55 [M +1]+, 実測値558.58 [M +1]+.
[0146]ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（６／２ｍＬ）中の化合物１５（０．２ｇ、１ｅｑ）の溶液にビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（０．４７ｇ、３ｅｑ）及びＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ、３ｅｑ）を不活性雰囲気下で添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を組み合わせて、減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１６を得た（収率７０％）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.30 - 8.27 (m,2H), 7.70 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.53 - 7.50 (m, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 5H), 7.37(dd, J = 7.5, 1.4 Hz, 1H), 7.32 (td, J = 7.5, 0.8 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 1.2 Hz,1H), 5.17 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 4.43 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.81 - 3.72 (m, 2H),3.69 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 3.57 - 3.44 (m, 2H), 3.43 - 3.32 (m, 2H), 2.83 (ddd,J = 16.9, 8.6, 5.9 Hz, 1H), 2.45 (ddd, J = 14.7, 8.6, 5.8 Hz, 1H), 2.21 (dt, J= 15.2, 6.1 Hz, 1H), 1.97 (dt, J = 17.0, 6.1 Hz, 1H). LC-MS(ESI): m/z [C30H27N3O8]の計算値557.55 [M +1]+, 実測値558.58 [M +1]+.
【0118】
[0147]化合物１８の合成
[0148]ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物１６（０．２ｇ、１ｅｑ）、化合物１７（０．２ｇ、１．５ｅｑ）及びＨＯＢｔ（０．１１ｇ、２．２ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．１３４ｍＬ、２．２ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を組み合わせて、減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１８を得た（収率３６％）。
[0148]ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物１６（０．２ｇ、１ｅｑ）、化合物１７（０．２ｇ、１．５ｅｑ）及びＨＯＢｔ（０．１１ｇ、２．２ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．１３４ｍＬ、２．２ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を組み合わせて、減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１８を得た（収率３６％）。
【0119】
[0149]化合物１９の合成
[0150]ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物１８（０．０５ｇ、１ｅｑ）の溶液にビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（０．０８ｇ、３ｅｑ）及びＤＩＰＥＡ（０．０４３ｍＬ、３ｅｑ）を不活性雰囲気下で添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を組み合わせて、減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１９を得た（収率３３％）。
[0150]ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物１８（０．０５ｇ、１ｅｑ）の溶液にビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（０．０８ｇ、３ｅｑ）及びＤＩＰＥＡ（０．０４３ｍＬ、３ｅｑ）を不活性雰囲気下で添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチル及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を組み合わせて、減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１９を得た（収率３３％）。
【0120】
[0151]ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ（化合物２０）の合成
【化15】
【0121】
[0152]ＣＨ２Ｃｌ２（１１．２ｍＬ）中の化合物１４（０．２６３ｇ、１ｅｑ）の溶液に、氷浴下でＴＦＡ（１１．２ｍＬ、３ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をＤＭＦ（７．６ｍＬ）中に溶解させた。化合物１９（０．３２４ｇ、１．１ｅｑ）及びＴＥＡ（０．２１ｍＬ、５ｅｑ）を氷浴下で混合物に加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をジクロロメタン及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物２０（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）を得た（収率５５．２％）。
【0122】
[0153]実施例７ ＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ（化合物２２）の合成
【化16】
【0123】
[0154]化合物２１の合成
[0155]ジクロロメタン（５ｍＬ）中のＤＢＣＯ－ＣＯ２Ｈ（１）（２００ｍｇ、１ｅｑ）、ＥＤＣ（３７６ｍｇ、３ｅｑ）の混合物にＨＯＳｕ（２２６ｍｇ、３ｅｑ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をＤＣＭ及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去し、淡黄色の液体を得た。
[0156]黄色の液体をジクロロメタン中のエチレンジアミンの溶液に２０分間かけて滴下した。混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をＤＣＭ及びＮａＨＣＯ３（ａｑ．）で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、黄色の油を得た（収率：５８．９％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.63 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.61 - 7.56 (m, 1H), 7.47 - 7.41 (m, 3H),7.32 (dtd, J = 23.9, 7.5, 1.2 Hz, 2H), 7.23 (dd, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H), 5.08 (d,J = 14.0 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 3.14 (dtd, J = 19.7, 13.5, 6.2 Hz,2H), 2.74 (ddd, J = 16.6, 8.0, 6.8 Hz, 1H), 2.68 - 2.54 (m, 2H), 2.31 (ddd, J =14.8, 8.0, 6.6 Hz, 1H), 2.16 (dt, J = 15.2, 6.5 Hz, 1H), 1.95 (dt, J = 16.7,6.4 Hz, 1H) . LC-MS (ESI): m/z [C21H21N3O2]の計算値348.16 [M +1]+, 実測値348.03 [M +1]+.
[0157]ＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ（化合物２２）の合成
[0158]３：１のＨ２Ｏ：ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物２１（１３ｍｇ、１ｅｑ）の溶液に、市販のＤＴＰＡ（２６ｍｇ、１．１ｅｑ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去し、黄色固体のＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ（２０ｍｇ）を得た。LC-MS (ESI): m/z [C43H49N7O12S]の計算値888.32 [M +1]+, 実測値888.47 [M +1]+.
[0155]ジクロロメタン（５ｍＬ）中のＤＢＣＯ－ＣＯ２Ｈ（１）（２００ｍｇ、１ｅｑ）、ＥＤＣ（３７６ｍｇ、３ｅｑ）の混合物にＨＯＳｕ（２２６ｍｇ、３ｅｑ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をＤＣＭ及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去し、淡黄色の液体を得た。
[0156]黄色の液体をジクロロメタン中のエチレンジアミンの溶液に２０分間かけて滴下した。混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をＤＣＭ及びＮａＨＣＯ３（ａｑ．）で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、黄色の油を得た（収率：５８．９％）。1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.63 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.61 - 7.56 (m, 1H), 7.47 - 7.41 (m, 3H),7.32 (dtd, J = 23.9, 7.5, 1.2 Hz, 2H), 7.23 (dd, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H), 5.08 (d,J = 14.0 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 3.14 (dtd, J = 19.7, 13.5, 6.2 Hz,2H), 2.74 (ddd, J = 16.6, 8.0, 6.8 Hz, 1H), 2.68 - 2.54 (m, 2H), 2.31 (ddd, J =14.8, 8.0, 6.6 Hz, 1H), 2.16 (dt, J = 15.2, 6.5 Hz, 1H), 1.95 (dt, J = 16.7,6.4 Hz, 1H) . LC-MS (ESI): m/z [C21H21N3O2]の計算値348.16 [M +1]+, 実測値348.03 [M +1]+.
[0157]ＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ（化合物２２）の合成
[0158]３：１のＨ２Ｏ：ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物２１（１３ｍｇ、１ｅｑ）の溶液に、市販のＤＴＰＡ（２６ｍｇ、１．１ｅｑ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去し、黄色固体のＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ（２０ｍｇ）を得た。LC-MS (ESI): m/z [C43H49N7O12S]の計算値888.32 [M +1]+, 実測値888.47 [M +1]+.
【0124】
[0159]実施例８ ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ｖｃ－エキサテカン（化合物２５）の合成
【化17】
【0125】
[0160]化合物２３の合成
[0161]ＤＭＦ（３ｍＬ）中のエキサテカンメシレート（０．１１ｇ、１．１ｅｑ）とＦｍｏｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（０．１４４ｇ、１ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．０８２ｍＬ、２．５ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下でＤＭＦを除去した。残留物をジエチルエーテル及びジクロロメタンで洗浄して、さらに精製することなく、０．２ｇの灰色固体（化合物２３）を得た。
[0162]化合物２４の合成
[0163]ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物２３の溶液にジエチルアミン（０．０８２ｍＬ、２．５ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下でＤＭＦを除去した。残留物をジエチルエーテル及びジクロロメタンで洗浄して、さらに精製することなく、０．１４ｇの黒色固体（化合物２４）を得た。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.18 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.96 (s,1H), 7.79 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz,2H), 7.32 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.03 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.46 (s, 2H), 5.45(s, 2H), 5.34 - 5.22 (m, 3H), 5.14 - 5.04 (m, 2H), 4.54 - 4.45 (m, 1H), 4.13(dt, J = 6.9, 6.2 Hz, 1H), 3.28 - 3.21 (m, 1H), 3.19 - 3.15 (m, 1H), 3.15 -3.07 (m, 1H), 3.06 - 3.00 (m, 1H), 2.98 - 2.93 (m, 1H), 2.39 - 2.35 (m, 3H),2.25 - 2.18 (m, 1H), 2.18 - 2.11 (m, 1H), 2.04 - 1.98 (m, 1H), 1.93 - 1.83 (m,2H), 1.74 - 1.67 (m, 1H), 1.64 - 1.56 (m, 1H), 1.50 - 1.42 (m, 1H), 1.42 - 1.34(m, 1H), 0.96 - 0.91 (m, 3H), 0.91 - 0.85 (m, 6H). LC-MS (ESI): m/z [C43H49FN8O9]の計算値841.36 [M +1]+, 実測値841.34 [M +1]+.
[0161]ＤＭＦ（３ｍＬ）中のエキサテカンメシレート（０．１１ｇ、１．１ｅｑ）とＦｍｏｃ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（０．１４４ｇ、１ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．０８２ｍＬ、２．５ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下でＤＭＦを除去した。残留物をジエチルエーテル及びジクロロメタンで洗浄して、さらに精製することなく、０．２ｇの灰色固体（化合物２３）を得た。
[0162]化合物２４の合成
[0163]ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物２３の溶液にジエチルアミン（０．０８２ｍＬ、２．５ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応終了後、減圧下でＤＭＦを除去した。残留物をジエチルエーテル及びジクロロメタンで洗浄して、さらに精製することなく、０．１４ｇの黒色固体（化合物２４）を得た。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.18 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.96 (s,1H), 7.79 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz,2H), 7.32 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.03 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.46 (s, 2H), 5.45(s, 2H), 5.34 - 5.22 (m, 3H), 5.14 - 5.04 (m, 2H), 4.54 - 4.45 (m, 1H), 4.13(dt, J = 6.9, 6.2 Hz, 1H), 3.28 - 3.21 (m, 1H), 3.19 - 3.15 (m, 1H), 3.15 -3.07 (m, 1H), 3.06 - 3.00 (m, 1H), 2.98 - 2.93 (m, 1H), 2.39 - 2.35 (m, 3H),2.25 - 2.18 (m, 1H), 2.18 - 2.11 (m, 1H), 2.04 - 1.98 (m, 1H), 1.93 - 1.83 (m,2H), 1.74 - 1.67 (m, 1H), 1.64 - 1.56 (m, 1H), 1.50 - 1.42 (m, 1H), 1.42 - 1.34(m, 1H), 0.96 - 0.91 (m, 3H), 0.91 - 0.85 (m, 6H). LC-MS (ESI): m/z [C43H49FN8O9]の計算値841.36 [M +1]+, 実測値841.34 [M +1]+.
【0126】
[0164]化合物２５の合成
[0165]２：１のＤＣＭ：ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物３（１３ｍｇ、１ｅｑ）、化合物２４（３３ｍｇ、１．５ｅｑ）及びＨＡＴＵ（３０ｍｇ、３ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（１３．７ｕＬ、３ｅｑ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をＤＣＭ及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンによるカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体の化合物２５を得た（収率６６．７％）。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.00 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.47 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.14 (d, J =7.7 Hz, 1H), 8.07 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.82 - 7.74(m, 2H), 7.68 (dd, J = 7.6, 1.0 Hz, 1H), 7.64 - 7.60 (m, 2H), 7.52 - 7.43 (m,3H), 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.35 - 7.27 (m, 2H), 6.54 (s, 1H), 5.99 (t, J =7.1 Hz, 1H), 5.45 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.32 - 5.27 (m, 2H), 5.10 - 5.06 (m,1H), 5.02 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 4.38 (dd, J = 13.0, 7.7 Hz, 1H), 4.26 - 4.20(m, 1H), 3.64 - 3.56 (m, 3H), 3.51 - 3.41 (m, 7H), 3.31 - 3.19 (m, 4H), 3.18 -2.91 (m, 6H), 2.62 (dt, J = 3.6, 1.8 Hz, 1H), 2.61 - 2.54 (m, 1H), 2.40 - 2.33(m, 4H), 2.27 - 2.11 (m, 3H), 2.03 - 1.92 (m, 2H), 1.91 - 1.81 (m, 2H), 1.80 -1.65 (m, 3H), 1.63 - 1.59 (m, 1H), 1.59 - 1.54 (m, 1H), 1.52 - 1.40 (m, 2H),1.38 - 1.32 (m, 1H), 0.91 - 0.79 (m, 9H) . LC-MS(ESI): m/z [C71H79FN10O15]の計算値1331.57 [M +1]+, 実測値1331.72 [M+1]+.
[0165]２：１のＤＣＭ：ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物３（１３ｍｇ、１ｅｑ）、化合物２４（３３ｍｇ、１．５ｅｑ）及びＨＡＴＵ（３０ｍｇ、３ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（１３．７ｕＬ、３ｅｑ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をＤＣＭ及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンによるカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体の化合物２５を得た（収率６６．７％）。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.00 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.47 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.14 (d, J =7.7 Hz, 1H), 8.07 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.82 - 7.74(m, 2H), 7.68 (dd, J = 7.6, 1.0 Hz, 1H), 7.64 - 7.60 (m, 2H), 7.52 - 7.43 (m,3H), 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.35 - 7.27 (m, 2H), 6.54 (s, 1H), 5.99 (t, J =7.1 Hz, 1H), 5.45 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.32 - 5.27 (m, 2H), 5.10 - 5.06 (m,1H), 5.02 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 4.38 (dd, J = 13.0, 7.7 Hz, 1H), 4.26 - 4.20(m, 1H), 3.64 - 3.56 (m, 3H), 3.51 - 3.41 (m, 7H), 3.31 - 3.19 (m, 4H), 3.18 -2.91 (m, 6H), 2.62 (dt, J = 3.6, 1.8 Hz, 1H), 2.61 - 2.54 (m, 1H), 2.40 - 2.33(m, 4H), 2.27 - 2.11 (m, 3H), 2.03 - 1.92 (m, 2H), 1.91 - 1.81 (m, 2H), 1.80 -1.65 (m, 3H), 1.63 - 1.59 (m, 1H), 1.59 - 1.54 (m, 1H), 1.52 - 1.40 (m, 2H),1.38 - 1.32 (m, 1H), 0.91 - 0.79 (m, 9H) . LC-MS(ESI): m/z [C71H79FN10O15]の計算値1331.57 [M +1]+, 実測値1331.72 [M+1]+.
【0127】
[0166]実施例９ ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン（化合物２９）の合成
【化18】
【0128】
[0167]化合物２７の合成
[0168]ジクロロメタン（１８ｍＬ）中のＥＤＣＩ（２７３ｍｇ、１．５ｅｑ）及びＨＯＳｕ（１６４ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物に市販のＢｏｃ－ＧＧＦＧ－ＯＨ（化合物２６）（４１５ｍｇ、１ｅｑ）を加えた。混合物を室温で３．５時間撹拌した。反応混合物をエキサテカンメシレート（３４３ｍｇ、０．８３ｅｑ）とトリエチルアミン（０．２ｍＬ、１．５ｅｑ）の混合ＤＭＦ溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体の化合物２７を得た（５０７ｍｇ、収率６３％）。LC-MS(ESI): m/z [C44H48FN7O10]の計算値853.91 [M +1]+, 実測値854.35 [M +1]+.875.91[M + Na]+ , 実測値875.52[M + Na]+.
[0168]ジクロロメタン（１８ｍＬ）中のＥＤＣＩ（２７３ｍｇ、１．５ｅｑ）及びＨＯＳｕ（１６４ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物に市販のＢｏｃ－ＧＧＦＧ－ＯＨ（化合物２６）（４１５ｍｇ、１ｅｑ）を加えた。混合物を室温で３．５時間撹拌した。反応混合物をエキサテカンメシレート（３４３ｍｇ、０．８３ｅｑ）とトリエチルアミン（０．２ｍＬ、１．５ｅｑ）の混合ＤＭＦ溶液に滴下して加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体の化合物２７を得た（５０７ｍｇ、収率６３％）。LC-MS(ESI): m/z [C44H48FN7O10]の計算値853.91 [M +1]+, 実測値854.35 [M +1]+.875.91[M + Na]+ , 実測値875.52[M + Na]+.
【0129】
[0169]化合物２８の合成
[0170]ジクロロメタン（４ｍＬ）中の化合物２７（５０７ｍｇ、１ｅｑ）の溶液にトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をジクロロメタンで洗浄し、黄色固体の化合物２８を得た（３７８ｍｇ、収率８５％）。LC-MS(ESI): m/z [C39H40FN7O8]の計算値753.79 [M +1]+, 実測値754.18 [M +1]+.
[0170]ジクロロメタン（４ｍＬ）中の化合物２７（５０７ｍｇ、１ｅｑ）の溶液にトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をジクロロメタンで洗浄し、黄色固体の化合物２８を得た（３７８ｍｇ、収率８５％）。LC-MS(ESI): m/z [C39H40FN7O8]の計算値753.79 [M +1]+, 実測値754.18 [M +1]+.
【0130】
[0171]化合物２９の合成
[0172]ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物２８（４０ｍｇ、１ｅｑ）の溶液にＤＩＰＥＡ（０．１８ｍＬ、２０ｅｑ）を添加した。反応混合物を氷浴下で１５分間撹拌した。反応混合物を化合物３（４８ｍｇ、１．２ｅｑ）とＨＢＴＵ（３０ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に滴下して加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体の化合物２９を得た（４４ｍｇ、収率６７％）。LC-MS(ESI): m/z [C67H70FN9O14]の計算値1244.34 [M +1]+, 実測値1244.56 [M+1]+. 1266.34[M + Na]+ , 実測値1266.83[M+ Na]+.
[0172]ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物２８（４０ｍｇ、１ｅｑ）の溶液にＤＩＰＥＡ（０．１８ｍＬ、２０ｅｑ）を添加した。反応混合物を氷浴下で１５分間撹拌した。反応混合物を化合物３（４８ｍｇ、１．２ｅｑ）とＨＢＴＵ（３０ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に滴下して加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体の化合物２９を得た（４４ｍｇ、収率６７％）。LC-MS(ESI): m/z [C67H70FN9O14]の計算値1244.34 [M +1]+, 実測値1244.56 [M+1]+. 1266.34[M + Na]+ , 実測値1266.83[M+ Na]+.
【0131】
[0173]実施例１０ ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン（化合物３１）の合成
【化19】
【0132】
[0174]化合物３０の合成
[0175]ジクロロメタン／ＤＭＦ（８ｍＬ／８ｍＬ）中の化合物２とＮＨ２－ＰＥＧ１２－ＣＯＯＨ（１２１７ｍｇ、１．０ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．７ｍＬ、２ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、粘性液体のＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン（化合物３１）を得た（４０１ｍｇ、収率２３％）。LC-MS(ESI): m/z [C46H68N2O16]の計算値905.05 [M]+, 実測値905.53 [M]+.
[0175]ジクロロメタン／ＤＭＦ（８ｍＬ／８ｍＬ）中の化合物２とＮＨ２－ＰＥＧ１２－ＣＯＯＨ（１２１７ｍｇ、１．０ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．７ｍＬ、２ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、粘性液体のＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン（化合物３１）を得た（４０１ｍｇ、収率２３％）。LC-MS(ESI): m/z [C46H68N2O16]の計算値905.05 [M]+, 実測値905.53 [M]+.
【0133】
[0176]化合物３１の合成
[0177]ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物２８（３０ｍｇ、１ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ、２０ｅｑ）を添加した。反応混合物を氷浴下で１５分間撹拌した。反応混合物をＤＭＦ中の化合物３０（４３ｍｇ、１．２ｅｑ）とＨＢＴＵ（２３ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合溶液（１ｍＬ）に滴下して加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、黄色固体の化合物３１を得た（１７ｍｇ、収率２６％）。LC-MS(ESI): m/z [C85H106FN9O23]の計算値1640.82 [M +1]+, 実測値1641.07 [M+1]+.
[0177]ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物２８（３０ｍｇ、１ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ、２０ｅｑ）を添加した。反応混合物を氷浴下で１５分間撹拌した。反応混合物をＤＭＦ中の化合物３０（４３ｍｇ、１．２ｅｑ）とＨＢＴＵ（２３ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合溶液（１ｍＬ）に滴下して加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をメタノール／ジクロロメタンを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、黄色固体の化合物３１を得た（１７ｍｇ、収率２６％）。LC-MS(ESI): m/z [C85H106FN9O23]の計算値1640.82 [M +1]+, 実測値1641.07 [M+1]+.
【0134】
[0178]実施例１１ ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（化合物３６）の合成
【化20】
【0135】
[0179]化合物３２の合成
[0180]ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４－アミノブタン酸（２００ｍｇ、１．０ｅｑ）とＥＤＣＩ（２８３ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物にＨＯＳｕ（１７０ｍｇ、１．５ｅｑ）を加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をＤＭＦ（５ｍＬ）中のエキサテカンメシレート（４３４ｍｇ、０．８３ｅｑ）及びＥｔ３Ｎ（０．２１ｍＬ、１．５ｅｑ）の混合溶液に添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し、黄色固体の化合物３２を得た（４０２ｍｇ、収率７９％）。LC-MS (ESI): m/z C33H37FN4O7[M + H]+の計算値: 621.26, 実測値: 621.01.
[0180]ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＮ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４－アミノブタン酸（２００ｍｇ、１．０ｅｑ）とＥＤＣＩ（２８３ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物にＨＯＳｕ（１７０ｍｇ、１．５ｅｑ）を加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をＤＭＦ（５ｍＬ）中のエキサテカンメシレート（４３４ｍｇ、０．８３ｅｑ）及びＥｔ３Ｎ（０．２１ｍＬ、１．５ｅｑ）の混合溶液に添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し、黄色固体の化合物３２を得た（４０２ｍｇ、収率７９％）。LC-MS (ESI): m/z C33H37FN4O7[M + H]+の計算値: 621.26, 実測値: 621.01.
【0136】
[0181]化合物３３の合成
[0182]化合物３２をＤＣＭ／ＴＦＡ＝１／１（９．５ｍＬ／９．５ｍＬ）の混合溶液に加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物３３を得た（２３ｍｇ、収率６９％）。LC-MS (ESI): m/z C28H29FN4O5[M + H]+: 521.21, 実測値: 521.09. 1HNMR (600 MHz, DMSO) δ 8.53 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.82(d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.32 (s, 3H), 6.56 (s, 1H), 5.65 - 5.53 (m, 1H), 5.43 (s,2H), 5.25 (d, J = 18.7 Hz, 1H), 5.15 (d, J = 18.7 Hz, 1H), 3.17 (t, J = 6.0 Hz,2H), 2.81 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.42 - 2.37 (m, 3H), 2.26 (t, J = 7.1 Hz, 2H),2.14 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 1.99 - 1.70 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
[0182]化合物３２をＤＣＭ／ＴＦＡ＝１／１（９．５ｍＬ／９．５ｍＬ）の混合溶液に加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物３３を得た（２３ｍｇ、収率６９％）。LC-MS (ESI): m/z C28H29FN4O5[M + H]+: 521.21, 実測値: 521.09. 1HNMR (600 MHz, DMSO) δ 8.53 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.82(d, J = 10.8 Hz, 1H), 7.32 (s, 3H), 6.56 (s, 1H), 5.65 - 5.53 (m, 1H), 5.43 (s,2H), 5.25 (d, J = 18.7 Hz, 1H), 5.15 (d, J = 18.7 Hz, 1H), 3.17 (t, J = 6.0 Hz,2H), 2.81 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.42 - 2.37 (m, 3H), 2.26 (t, J = 7.1 Hz, 2H),2.14 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 1.99 - 1.70 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
【0137】
[0183]化合物３４の合成
[0184]ＤＣＭ（９ｍＬ）中のＥＤＣＩ（１０４ｍｇ、１．５ｅｑ）とＨＯＳｕ（７７ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物に化合物２６（２５２ｍｇ、１．３ｅｑ）を加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物を化合物３３（２３１ｍｇ、１．０ｅｑ）及びＥｔ３Ｎ（０．１ｍＬ、１．５ｅｑ）の混合溶液に添加した。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で１２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物３４（１５３ｍｇ、収率２８％）を得た。LC-MS (ESI): m/z C48H55FN8O11[M + H]+の計算値: 939.4, 実測値: 939.68.
[0184]ＤＣＭ（９ｍＬ）中のＥＤＣＩ（１０４ｍｇ、１．５ｅｑ）とＨＯＳｕ（７７ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物に化合物２６（２５２ｍｇ、１．３ｅｑ）を加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去した。残留物を化合物３３（２３１ｍｇ、１．０ｅｑ）及びＥｔ３Ｎ（０．１ｍＬ、１．５ｅｑ）の混合溶液に添加した。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で１２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物３４（１５３ｍｇ、収率２８％）を得た。LC-MS (ESI): m/z C48H55FN8O11[M + H]+の計算値: 939.4, 実測値: 939.68.
【0138】
[0185]化合物３５の合成
[0186]化合物３４をＤＣＭ／ＴＦＡ＝１／１（３ｍＬ／３ｍＬ）の混合溶液に加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物３５（９０ｍｇ、収率６５％）を得た。LC-MS (ESI): m/z C43H47FN8O9[M + H]+の計算値: 839.35, 実測値: 839.22.
[0186]化合物３４をＤＣＭ／ＴＦＡ＝１／１（３ｍＬ／３ｍＬ）の混合溶液に加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物３５（９０ｍｇ、収率６５％）を得た。LC-MS (ESI): m/z C43H47FN8O9[M + H]+の計算値: 839.35, 実測値: 839.22.
【0139】
[0187]ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（化合物３６）の合成
【化21】
【0140】
[0188]ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物３（１３．３ｍｇ、１．１ｅｑ）、ＤＩＰＥＡ（０．０８３ｍＬ、２０ｅｑ）及びＨＢＴＵ（１３．６ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物に化合物３５（２０ｍｇ、１ｅｑ）を加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で１．５時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物３６（１８ｍｇ、収率５８％）を得た。LC-MS (ESI): m/z C71H77FN10O15[M + H]+の計算値: 1329.43, 実測値: 1329.69.
【0141】
[0189]実施例１２ ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（化合物３７）の合成
【化22】
【0142】
[0190]ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物３０（１９ｍｇ、０．９ｅｑ）、ＤＩＰＥＡ（０．０８３ｍＬ、２０ｅｑ）及びＨＢＴＵ（１３．６ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物に化合物３５（２０ｍｇ、１ｅｑ）を加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で１．５時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物３７を得た（６．４ｍｇ、収率１７％）。LC-MS (ESI): m/z C89H113FN10O24[M + H]+の計算値: 1726.9, 実測値: 1726.6.
【0143】
[0191]実施例１３ ＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（化合物４０）の合成
【化23】
【0144】
[0192]化合物３９の合成
[0193]ジクロロメタン／ＤＭＦ（３ｍＬ／３ｍＬ）中の市販の化合物３８（３００ｍｇ、１ｅｑ）とＮＨ２－ＰＥＧ３－ＣＯＯＨ（２７３ｍｇ、１．３ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、３ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、粘稠な液体の化合物３９を得た（２３５ｍｇ、収率６２％）。LC-MS(ESI): m/z [C20H31NO7]の計算値397.47 [M +1]+, 実測値397.39 [M +1]+.420.47[M + Na]+ , 実測値420.07[M + Na]+.
[0193]ジクロロメタン／ＤＭＦ（３ｍＬ／３ｍＬ）中の市販の化合物３８（３００ｍｇ、１ｅｑ）とＮＨ２－ＰＥＧ３－ＣＯＯＨ（２７３ｍｇ、１．３ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、３ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、粘稠な液体の化合物３９を得た（２３５ｍｇ、収率６２％）。LC-MS(ESI): m/z [C20H31NO7]の計算値397.47 [M +1]+, 実測値397.39 [M +1]+.420.47[M + Na]+ , 実測値420.07[M + Na]+.
【0145】
[0194]化合物４０の合成
[0195]ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物３９（４１ｍｇ、１ｅｑ）、化合物４（１３５ｍｇ、１．２ｅｑ）及びＨＡＴＵ（５７ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（６９ｕｌ、４ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物４０（４１ｍｇ、収率２７％）を得た。LC-MS(ESI): m/z [C78H123N11O18]の計算値1502.90 [M +1]+, 実測値1503.13 [M+1]+.1524.90[M + Na]+ , 実測値1525.43[M+ Na]+.
[0195]ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物３９（４１ｍｇ、１ｅｑ）、化合物４（１３５ｍｇ、１．２ｅｑ）及びＨＡＴＵ（５７ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（６９ｕｌ、４ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物４０（４１ｍｇ、収率２７％）を得た。LC-MS(ESI): m/z [C78H123N11O18]の計算値1502.90 [M +1]+, 実測値1503.13 [M+1]+.1524.90[M + Na]+ , 実測値1525.43[M+ Na]+.
【0146】
[0196]実施例１４ ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン（化合物４２）の合成
【化24】
【0147】
[0197]化合物４１の合成
[0198]ジクロロメタン／ＤＭＦ（４ｍＬ／４ｍＬ）中の市販の化合物３８（３００ｍｇ、１ｅｑ）とＮＨ２－ＰＥＧ１２－ＣＯＯＨ（５８７ｍｇ、１．０ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、３ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、粘稠な液体の化合物４１を得た（５９８ｍｇ、収率７９％）。LC-MS(ESI): m/z [C38H67NO16]の計算値793.95 [M +1]+, 実測値794.25 [M +1]+.
[0198]ジクロロメタン／ＤＭＦ（４ｍＬ／４ｍＬ）中の市販の化合物３８（３００ｍｇ、１ｅｑ）とＮＨ２－ＰＥＧ１２－ＣＯＯＨ（５８７ｍｇ、１．０ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、３ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、粘稠な液体の化合物４１を得た（５９８ｍｇ、収率７９％）。LC-MS(ESI): m/z [C38H67NO16]の計算値793.95 [M +1]+, 実測値794.25 [M +1]+.
【0148】
[0199]ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン（化合物４２）の合成
[0200]ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物２８（３０ｍｇ、１ｅｑ）、化合物４１（３８ｍｇ、１．２ｅｑ）及びＨＢＴＵ（２３ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ、２０ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物４２を得た（１０．９ｍｇ、収率１８％）。LC-MS(ESI): m/z [C77H105FN8O23]の計算値1529.72 [M +1]+, 実測値1530.9 [M +1]+.
[0200]ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物２８（３０ｍｇ、１ｅｑ）、化合物４１（３８ｍｇ、１．２ｅｑ）及びＨＢＴＵ（２３ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ、２０ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物４２を得た（１０．９ｍｇ、収率１８％）。LC-MS(ESI): m/z [C77H105FN8O23]の計算値1529.72 [M +1]+, 実測値1530.9 [M +1]+.
【0149】
[0201]実施例１５ ＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン（化合物４３）の合成
【化25】
【0150】
[0202]ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物２８（３０ｍｇ、１ｅｑ）、化合物３９（１９ｍｇ、１．２ｅｑ）及びＨＢＴＵ（２３ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ、２０ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物４３を得た（７．４ｍｇ、収率１６％）。LC-MS(ESI): m/z [C59H69FN8O14]の計算値1133.24 [M +1]+, 実測値1133.63 [M+1]+.
【0151】
[0203]実施例１６ ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（化合物４４）の合成
【化26】
【0152】
[0204]ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物３５（３４ｍｇ、１ｅｑ）、化合物３９（２９ｍｇ、０．９ｅｑ）及びＨＢＴＵ（２３ｍｇ、１．５ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（０．１４ｍＬ、２０ｅｑ）を加えた。反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、黄色固体の化合物４４を得た（１９ｍｇ、収率３２％）。LC-MS (ESI): m/z C81H112FN9O24[M + H]+の計算値: 1615.8, 実測値: 1615.42.
【0153】
[0205]実施例１７ ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－２（ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）（化合物４８）の合成
【化27】
【0154】
[0206]化合物４５の合成
[0207]乾燥ジクロロメタン／乾燥ＤＭＦ（２．４ｍＬ／２．４ｍＬ）中のＥＤＣ（５５２ｍｇ、３ｅｑ）とＨＯＳｕ（３３３ｍｇ、３ｅｑ）の混合物に化合物３（４９０ｍｇ、１ｅｑ）を加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去し、さらに精製することなく、粘性のある液体化合物４５（８５６ｍｇ）を得た。
[0207]乾燥ジクロロメタン／乾燥ＤＭＦ（２．４ｍＬ／２．４ｍＬ）中のＥＤＣ（５５２ｍｇ、３ｅｑ）とＨＯＳｕ（３３３ｍｇ、３ｅｑ）の混合物に化合物３（４９０ｍｇ、１ｅｑ）を加えた。反応混合物をＮ２雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。反応が完了した後、反応混合物をジクロロメタン及び水で抽出した。その後、有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。有機溶媒を減圧下で除去し、さらに精製することなく、粘性のある液体化合物４５（８５６ｍｇ）を得た。
【0155】
[0208]化合物４７の合成
[0209]ジクロロメタン／ＤＭＦ（４．８ｍＬ／４．８ｍＬ）中の化合物４６（８５６ｍｇ）とＮＨ－ｂｉｓ（ＰＥＧ３－ＣＯ２Ｈ）（５７４ｍｇ、１．４ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（６２１．７ｍｇ、５ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、粘稠な液体の化合物４７を得た（４８５ｍｇ、収率５４％）。
LC-MS(ESI): m/z [C46H65N3O16]の計算値916.03 [M]+, 実測値916.3 [M]+.1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 12.17 (s, 2H), 7.77 (t, J =5.6 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 7.7, 1.3 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.48 (m,3H), 7.36 (m, 2H), 7.30 (dd, J = 7.4, 1.4 Hz, 1H), 5.02 (d, J = 14.1 Hz, 1H),3.61 - 3.56 (m, 8H), 3.54 - 3.32 (m, 39H), 3.31 - 3.26 (m, 2H), 3.16 (d, J =4.9 Hz, 1H), 3.13 - 3.03 (m, 3H), 2.63 - 2.54 (m, 4H), 2.43 (td, J = 6.3, 2.7Hz, 4H), 2.23 (dt, J = 15.5, 7.7 Hz, 1H), 1.99 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.24 (d,J = 5.9 Hz, 9H).
[0209]ジクロロメタン／ＤＭＦ（４．８ｍＬ／４．８ｍＬ）中の化合物４６（８５６ｍｇ）とＮＨ－ｂｉｓ（ＰＥＧ３－ＣＯ２Ｈ）（５７４ｍｇ、１．４ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（６２１．７ｍｇ、５ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、粘稠な液体の化合物４７を得た（４８５ｍｇ、収率５４％）。
LC-MS(ESI): m/z [C46H65N3O16]の計算値916.03 [M]+, 実測値916.3 [M]+.1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 12.17 (s, 2H), 7.77 (t, J =5.6 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 7.7, 1.3 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.48 (m,3H), 7.36 (m, 2H), 7.30 (dd, J = 7.4, 1.4 Hz, 1H), 5.02 (d, J = 14.1 Hz, 1H),3.61 - 3.56 (m, 8H), 3.54 - 3.32 (m, 39H), 3.31 - 3.26 (m, 2H), 3.16 (d, J =4.9 Hz, 1H), 3.13 - 3.03 (m, 3H), 2.63 - 2.54 (m, 4H), 2.43 (td, J = 6.3, 2.7Hz, 4H), 2.23 (dt, J = 15.5, 7.7 Hz, 1H), 1.99 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.24 (d,J = 5.9 Hz, 9H).
【0156】
[0210]ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－２（ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）（化合物４８）の合成
[0211]ＤＭＦ（０．４３ｍＬ）中の化合物４７（４９ｍｇ、１ｅｑ）、化合物４（７２ｍｇ、１．２ｅｑ）及びＨＢＴＵ（５１ｍｇ、２．５ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（２２ｍｇ、３．２ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、粘稠な液体の化合物４８（４１ｍｇ）を得た。
LC-MS (TOF): m/z [C162H249N23O38]の計算値3126.9 [M]+, 実測値1042.95 [M]3+,1563.92 [M]2+
[0211]ＤＭＦ（０．４３ｍＬ）中の化合物４７（４９ｍｇ、１ｅｑ）、化合物４（７２ｍｇ、１．２ｅｑ）及びＨＢＴＵ（５１ｍｇ、２．５ｅｑ）の混合物にＤＩＰＥＡ（２２ｍｇ、３．２ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下で有機溶媒を除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、粘稠な液体の化合物４８（４１ｍｇ）を得た。
LC-MS (TOF): m/z [C162H249N23O38]の計算値3126.9 [M]+, 実測値1042.95 [M]3+,1563.92 [M]2+
【0157】
[0212]実施例１８ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）の調製（図２１Ｃ）
[0213]ＭＥＳ ｐＨ６．５バッファーの調製：４．８８１ｇのＭＥＳ遊離酸（２－モルフォリノエタンスルホン酸、ＣＡＳ ４４３２－３１－９）を７５０ｍＬのｄＨ２Ｏ中に懸濁させた。１０Ｎ ＮａＯＨ（ａｑ）によってｐＨを６．５に調整した。次に、体積が１Ｌに達するまで蒸留水を懸濁液に加えた。
[0213]ＭＥＳ ｐＨ６．５バッファーの調製：４．８８１ｇのＭＥＳ遊離酸（２－モルフォリノエタンスルホン酸、ＣＡＳ ４４３２－３１－９）を７５０ｍＬのｄＨ２Ｏ中に懸濁させた。１０Ｎ ＮａＯＨ（ａｑ）によってｐＨを６．５に調整した。次に、体積が１Ｌに達するまで蒸留水を懸濁液に加えた。
【0158】
[0214]５．７８ｍＬのＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（３４ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．８９であると測定された。
【0159】
[0215]実施例１９ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）の調製（図２１Ｄ）
[0216]４．４８ｍＬのＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１（ＤＭＡ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（１１．２ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で６時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
[0216]４．４８ｍＬのＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１（ＤＭＡ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（１１．２ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で６時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
【0160】
[0217]実施例２０ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）の調製（図２１Ｅ）
[0218]０．４ｍＬのＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び１．２ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（４ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で２０時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
[0218]０．４ｍＬのＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び１．２ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（４ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で２０時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
【0161】
[0219]実施例２１ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）の調製（図２１Ｆ）
[0220]ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦは、市販されているリンカー－ペイロードである。
[0220]ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦは、市販されているリンカー－ペイロードである。
【0162】
[0221]０．４ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）及び０．４ｍＬのＤＭＳＯをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（４ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
【0163】
[0222]実施例２２ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ）の調製（図２１Ｇ）
[0223]０．２４ｍＬのＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ（ｄｄＨ２Ｏ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（２．４ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
[0223]０．２４ｍＬのＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ（ｄｄＨ２Ｏ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（２．４ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＤＴＰＡ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
【0164】
[0224]実施例２３ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ｖｃ－エキサテカン）の調製（図２１Ｈ）
[0225]０．０４ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＶＣ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．１２ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．４ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＶＣ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．７７であると測定された。
[0225]０．０４ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＶＣ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．１２ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．４ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＶＣ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．７７であると測定された。
【0165】
[0226]実施例２４ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン）の調製（図２１Ｉ）
[0227]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０６ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．２１であると測定された。
[0227]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０６ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．２１であると測定された。
【0166】
[0228]実施例２５ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン）の調製（図２１Ｊ）
[0229]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０２ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．９１であると測定された。
[0229]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０２ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．９１であると測定された。
【0167】
[0230]実施例２６ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２）の調製（図２１Ｋ）
[0231]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０６ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．２１３ｍＬ、４．７ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－分枝ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．１２であると測定された。
[0231]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０６ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．２１３ｍＬ、４．７ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－分枝ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．１２であると測定された。
【0168】
[0232]実施例２７ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２）の調製（図２１Ｌ）
[0233]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０６ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．２１３ｍＬ、４．７ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸ８９５１）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．５２であると測定された。
[0233]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０６ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．２１３ｍＬ、４．７ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸ８９５１）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．５２であると測定された。
【0169】
[0234]実施例２８ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）の調製（図２１Ｍ）
[0235]０．００６７ｍＬのＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）及び０．０３３３ｍＬのＤＭＳＯをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって２．６７であると測定された。
[0235]０．００６７ｍＬのＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）及び０．０３３３ｍＬのＤＭＳＯをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって２．６７であると測定された。
【0170】
[0236]実施例２９ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン）の調製（図２１Ｎ）
[0237]０．０２ｍＬのＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０１ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．０５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で４２時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．５１であると測定された。
[0237]０．０２ｍＬのＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０１ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．０５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で４２時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．５１であると測定された。
【0171】
[0238]実施例３０ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン）の調製（図２１Ｏ）
[0239]０．０１ｍＬのＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０１ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．０５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．７３であると測定された。
[0239]０．０１ｍＬのＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０１ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．０５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ３－ＧＧＦＧ－エキサテカン）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．７３であると測定された。
【0172】
[0240]実施例３１ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２）の調製（図２１Ｐ）
[0241]０．０２ｍＬのＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０６ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．０８ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．５１であると測定された。
[0241]０．０２ｍＬのＢＣＮ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２（ＤＭＡ中１０ｍＭ）及び０．０６ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．０８ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１２－ＧＧＦＧ－ＤＸｄ２）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって３．５１であると測定された。
【0173】
[0242]実施例３２ ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ））の調製（図２１Ｑ）
[0243]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－分枝－ＰＥＧ－ＶＣ－ＭＭＡＥ－Ｂ（ＤＭＡ中１０ｍＭ）と０．１１３ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．３３３ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－２（ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ））を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって５．６８であると測定された。
[0243]０．０２ｍＬのＤＢＣＯ－分枝－ＰＥＧ－ＶＣ－ＭＭＡＥ－Ｂ（ＤＭＡ中１０ｍＭ）と０．１１３ｍＬのＤＭＡをバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－４Ａｚの溶液（０．３３３ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をＭＥＳ ｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ３－２（ＰＥＧ３－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ））を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって５．６８であると測定された。
【0174】
[0244]実施例３３ ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）の調製（図２１Ｒ）
【0175】
[0245]ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）の合成
[0246]２．０４ｍＬのＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２Ａｚの溶液（１２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で２０時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－トリマンノシル－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約２であると測定された。
[0246]２．０４ｍＬのＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２Ａｚの溶液（１２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で２０時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－トリマンノシル－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約２であると測定された。
【0176】
[0247]ＤＣＢＰＲ２００２－２（リンカー－ペイロード）－２Ａｚの一般的な合成
[0248]１０００μｌの１×バッファーＳＰ（２５ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）中の５ｍｇのＤＣＢＰＲ２００２－２（リンカー－ペイロード）及びＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｚ（２．５ｍｇ）をラットＭＧＡＴ－２（０．０５ｍｇ）存在下、３７℃で１６時間インキュベーションした。反応後、抗体生成物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスで精製して、重鎖の残りの末端マンノースに活性なＧｌｃＮＡｚが２個結合したＤＣＢＰＲ２００２－２（リンカー－ペイロード）を得た。この生成物を還元マスクロマトグラフィー分析に供した。
[0248]１０００μｌの１×バッファーＳＰ（２５ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ６．５）中の５ｍｇのＤＣＢＰＲ２００２－２（リンカー－ペイロード）及びＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｚ（２．５ｍｇ）をラットＭＧＡＴ－２（０．０５ｍｇ）存在下、３７℃で１６時間インキュベーションした。反応後、抗体生成物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスで精製して、重鎖の残りの末端マンノースに活性なＧｌｃＮＡｚが２個結合したＤＣＢＰＲ２００２－２（リンカー－ペイロード）を得た。この生成物を還元マスクロマトグラフィー分析に供した。
【0177】
[0249]ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）の合成。
[0250]４．０８ｍＬのＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ（ＤＭＡ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２Ａｚの溶液（１０．２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
[0250]４．０８ｍＬのＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ（ＤＭＡ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２Ａｚの溶液（１０．２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
【0178】
[0251]実施例３４ ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）の調製（図２１Ｓ）
【0179】
[0252]ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）の合成。
[0253]２．０８ｍＬのＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１（ＤＭＡ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２Ａｚの溶液（５．２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＥＡ）－２（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
[0253]２．０８ｍＬのＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１（ＤＭＡ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２Ａｚの溶液（５．２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＥＡ）－２（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
【0180】
[0254]実施例３５ ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）の調製（図２１Ｔ）
【0181】
[0255]ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）の合成
[0256]７．２ｍＬのＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２Ａｚの溶液（１８ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で２０時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約２であると測定された。
[0256]７．２ｍＬのＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２Ａｚの溶液（１８ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で２０時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約２であると測定された。
【0182】
[0257]ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）の合成
[0258]２．４ｍＬのＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１（ＤＭＡ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）－２Ａｚの溶液（６ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
[0258]２．４ｍＬのＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１（ＤＭＡ中１０ｍＭ）をバッファー（ＭＥＳ ｐＨ６．５）中のＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）－２Ａｚの溶液（６ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、３７℃で１８時間撹拌した。抗体調製物をクエン酸ナトリウムｐＨ６．５バッファー中、３０ｋＤａ ＮＭＷＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターデバイスを用いて脱塩して濃縮し、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－Ｓ－ＤＭ１）を得た。ＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、ＬＣ－ＭＳによって約４であると測定された。
【0183】
[0259]実施例３６ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
[0260]本発明のＡＤＣは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣなどの当技術分野で公知の技術により分析されうる。例えば、抗ＭＳＬＮ ｍＡｂ及び抗ＭＳＬＮ ＡＤＣの溶液は、４～１２％の非還元及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用した後、クーマシーブリリアント ブルー染色を行うことで分析され得る。
[0260]本発明のＡＤＣは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣなどの当技術分野で公知の技術により分析されうる。例えば、抗ＭＳＬＮ ｍＡｂ及び抗ＭＳＬＮ ＡＤＣの溶液は、４～１２％の非還元及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用した後、クーマシーブリリアント ブルー染色を行うことで分析され得る。
【0184】
[0261]実施例３７ ペイロードカップリングアッセイ
[0262]薬物対抗体比（ＤＡＲ）の評価は、ターゲット抗体のペイロードコンジュゲーション効率をモニターするために重要である。薬物対抗体比は、抗ＭＳＬＮ ＡＤＣ製品の治療効果に影響を与えうる。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）は、薬物対抗体比（ＤＡＲ）及びリジン結合抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物負荷分布を決定するための選り抜きの方法である。ピークの面積パーセンテージは、特定の薬物負荷ＡＤＣ種の相対的な分布を表す。次に、加重平均ＤＡＲをパーセンテージピーク面積情報と薬物負荷数を使用して計算する。
[0262]薬物対抗体比（ＤＡＲ）の評価は、ターゲット抗体のペイロードコンジュゲーション効率をモニターするために重要である。薬物対抗体比は、抗ＭＳＬＮ ＡＤＣ製品の治療効果に影響を与えうる。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）は、薬物対抗体比（ＤＡＲ）及びリジン結合抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物負荷分布を決定するための選り抜きの方法である。ピークの面積パーセンテージは、特定の薬物負荷ＡＤＣ種の相対的な分布を表す。次に、加重平均ＤＡＲをパーセンテージピーク面積情報と薬物負荷数を使用して計算する。
【0185】
[0263]図７は、本発明のＡＤＣ（ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ））の質量分析の一例を示しており、これは、抗体に結合した様々な数の薬物の分布を示しているが、最も豊富な種は抗体に結合した薬物を４つ有している。このサンプルの平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）は４．０７である。
【0186】
[0264]実施例３８ ＥＬＩＳＡ結合親和性
[0265]１μｇ／ｍＬの濃度のコーティングバッファー中のメソテリン１００μＬをプレートの各ウェルに添加して、コーティングした。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。２００μＬのＰＢＳ－５％スキムミルクを加えてウェルをブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した４００ｎｇのＡＤＣサンプル１００μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。５０μｌの抗ヒトカッパ軽鎖（１：５０００）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加え、プレートを室温で１５分間インキュベートした。１００μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより、発色を止めた。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、プレートを４５０～６５０ｎｍの吸光度で測定した。データを図５に示す。
[0265]１μｇ／ｍＬの濃度のコーティングバッファー中のメソテリン１００μＬをプレートの各ウェルに添加して、コーティングした。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。２００μＬのＰＢＳ－５％スキムミルクを加えてウェルをブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した４００ｎｇのＡＤＣサンプル１００μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。５０μｌの抗ヒトカッパ軽鎖（１：５０００）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢを各ウェルに加え、プレートを室温で１５分間インキュベートした。１００μＬの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより、発色を止めた。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、プレートを４５０～６５０ｎｍの吸光度で測定した。データを図５に示す。
【0187】
[0266]ＤＣＢＰＲ２００２ Ｋｄ＝９．２４３ｅ－０１１；ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）Ｋｄ＝１．３２９ｅ－０１０；ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）Ｋｄ＝１．４４９ｅ－０１０；ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）Ｋｄ＝９．７４７ｅ－０１１；ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）Ｋｄ＝１．３５５ｅ－０１０；ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）Ｋｄ＝１．５８０ｅ－０１０；及びＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）Ｋｄ＝７．３１５ｅ－０１１。
【0188】
[0267]実施例３９ 抗メソテリンＡＤＣの結合動態
[0268]メソテリンに対する抗メソテリンＡＤＣ相互作用の速度定数を表面プラズマ共鳴（ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）Ｔ１００、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ニュージャージー）によって決定した。ＣＭ５ウエハーのフローセルを１０ｍＭグリシンｐＨ５．０中の約１０，０００反応単位（ＲＵ）の抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ビアコア（登録商標））により、１０μＬ／分で６００秒間、固定した。ＴＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬの抗メソテリン抗体及び抗メソテリンＡＤＣを１０μｌ／分でＣＭ５チップに捕捉させた。１ｍＭのＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中で３分間、４つの濃度（３．７～１００ｎＭ）のヒトメソテリン組換えタンパク質及びゼロ濃度（フローバッファー）を１００μｌ／分で結合させたときの記録を行った。複合体の解離を１０分間測定した。３ＭのＭｇＣｌ２と３ｍＭのＥＧＴＡを１０μｌ／分で６０秒間注入することにより、水面を再生させた。ビアコア（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェア（ビアコア（登録商標））を使用して、参照シグナルとバッファーシグナルを差し引いた後に得られた曲線を１：１ラングミュア結合モデルに取り入れた。Ｋａ、Ｋｄ及びＫＤを表４に示す。速度論的分析は、抗メソテリン抗体と抗メソテリンＡＤＣが同様なｋａ（ｏｎ）及びｋｄ（ｏｆｆ）速度を有することを示した。
[0268]メソテリンに対する抗メソテリンＡＤＣ相互作用の速度定数を表面プラズマ共鳴（ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）Ｔ１００、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ニュージャージー）によって決定した。ＣＭ５ウエハーのフローセルを１０ｍＭグリシンｐＨ５．０中の約１０，０００反応単位（ＲＵ）の抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ビアコア（登録商標））により、１０μＬ／分で６００秒間、固定した。ＴＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬの抗メソテリン抗体及び抗メソテリンＡＤＣを１０μｌ／分でＣＭ５チップに捕捉させた。１ｍＭのＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中で３分間、４つの濃度（３．７～１００ｎＭ）のヒトメソテリン組換えタンパク質及びゼロ濃度（フローバッファー）を１００μｌ／分で結合させたときの記録を行った。複合体の解離を１０分間測定した。３ＭのＭｇＣｌ２と３ｍＭのＥＧＴＡを１０μｌ／分で６０秒間注入することにより、水面を再生させた。ビアコア（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェア（ビアコア（登録商標））を使用して、参照シグナルとバッファーシグナルを差し引いた後に得られた曲線を１：１ラングミュア結合モデルに取り入れた。Ｋａ、Ｋｄ及びＫＤを表４に示す。速度論的分析は、抗メソテリン抗体と抗メソテリンＡＤＣが同様なｋａ（ｏｎ）及びｋｄ（ｏｆｆ）速度を有することを示した。
【0189】
[0269]表４
【表4】
【0190】
[0270]実施例４０ インビトロ細胞障害性試験（ＫＬＭ－１及びＯＶＣＡＲ－３）
[0271]膵臓癌細胞株ＫＬＭ－１をそれぞれ１０％ウシ胎仔血清補充ＲＰＭＩ１６４０ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ改変）培地で増殖させた。卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３は、２０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ改変）培地で増殖させた。ＫＬＭ－１及びＯＶＣＡＲ－３細胞株は、加湿した３７℃のインキュベーターにおいて５％ＣＯ２雰囲気で維持した。処理の前日、細胞を回収し、９６ウェルプレートに播種した（１ウェルあたり４，０００細胞）。２日目に、細胞を毒性ペイロード及びＡＤＣの３倍連続希釈濃度で処理した。各処理は８つのデータポイントで三重に行った。７２時間の処理後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、メーカーの指示に従って細胞生存率を評価した。インキュベーションの終わりに、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ Ｍｕｌｔｉ Ｍｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して発光を測定した。化合物の細胞障害性を０．０５％ＰＢＳ（ＡＤＣ）又は０．０５％ＤＭＳＯ（毒性ペイロード）で処理した細胞と比較して評価した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム５．０ソフトウェアを使用して、生存率データを４パラメータのロジスティック方程式でフィッティングすることにより計算した。結果を表５に示す。
[0271]膵臓癌細胞株ＫＬＭ－１をそれぞれ１０％ウシ胎仔血清補充ＲＰＭＩ１６４０ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ改変）培地で増殖させた。卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３は、２０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ改変）培地で増殖させた。ＫＬＭ－１及びＯＶＣＡＲ－３細胞株は、加湿した３７℃のインキュベーターにおいて５％ＣＯ２雰囲気で維持した。処理の前日、細胞を回収し、９６ウェルプレートに播種した（１ウェルあたり４，０００細胞）。２日目に、細胞を毒性ペイロード及びＡＤＣの３倍連続希釈濃度で処理した。各処理は８つのデータポイントで三重に行った。７２時間の処理後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、メーカーの指示に従って細胞生存率を評価した。インキュベーションの終わりに、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ Ｍｕｌｔｉ Ｍｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して発光を測定した。化合物の細胞障害性を０．０５％ＰＢＳ（ＡＤＣ）又は０．０５％ＤＭＳＯ（毒性ペイロード）で処理した細胞と比較して評価した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム５．０ソフトウェアを使用して、生存率データを４パラメータのロジスティック方程式でフィッティングすることにより計算した。結果を表５に示す。
【0191】
[0272]表５：毒性ペイロード及びＡＤＣのＩＣ５０値
【表5】
【0192】
[0273]実施例４１ 内在化アッセイ
[0274]ＫＬＭ－１又はＯＶＣＡＲ３細胞をトリプシン処理し、回収してＦＡＣバッファーに再懸濁させた。対照：二次Ａｂ抗ヒトＩｇＧ ＰＥ（１：２００）をＫＬＭ－１又はＯＶＣＡＲ３細胞に添加した。０、０．５、２、５、２４時間の時間間隔で細胞を４℃でインキュベートした後、１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄した。上澄みを廃棄した。試験群：ＫＬＭ－１又はＯＶＣＡＲ３細胞を氷上で６０分間、ＦＡＣＳバッファー中の１０μｇ／ｍＬのトリマンノシル抗メソテリンＡＤＣと共にプレインキュベーションし、ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、０、０．５、２、５及び２４時間の時間間隔で３７℃においてインキュベートした。細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ）で分析し、その結果を図６に示す。
[0274]ＫＬＭ－１又はＯＶＣＡＲ３細胞をトリプシン処理し、回収してＦＡＣバッファーに再懸濁させた。対照：二次Ａｂ抗ヒトＩｇＧ ＰＥ（１：２００）をＫＬＭ－１又はＯＶＣＡＲ３細胞に添加した。０、０．５、２、５、２４時間の時間間隔で細胞を４℃でインキュベートした後、１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄した。上澄みを廃棄した。試験群：ＫＬＭ－１又はＯＶＣＡＲ３細胞を氷上で６０分間、ＦＡＣＳバッファー中の１０μｇ／ｍＬのトリマンノシル抗メソテリンＡＤＣと共にプレインキュベーションし、ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、０、０．５、２、５及び２４時間の時間間隔で３７℃においてインキュベートした。細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ）で分析し、その結果を図６に示す。
【0193】
[0275]実施例４２ インビボＰＫ
[0276]この試験では、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（ＥＣＬ）法を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びラットサンプルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）の薬物動態解析を実施した。ＭＳＤアッセイは、コンジュゲート抗体と非コンジュゲート抗体の両方を測定できる。この例、又は全抗体アッセイにおいて示されているように、プレートは、全てのヒト化抗体（コンジュゲート及び非コンジュゲート）を捕捉できるヤギ抗ヒトＩｇＧでコーティングされている。コンジュゲート抗体アッセイの場合、プレートは、抗ＭＭＡＥ抗体などのペイロード（薬物）に対する抗体でコーティングされている。
[0276]この試験では、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（ＥＣＬ）法を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びラットサンプルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）の薬物動態解析を実施した。ＭＳＤアッセイは、コンジュゲート抗体と非コンジュゲート抗体の両方を測定できる。この例、又は全抗体アッセイにおいて示されているように、プレートは、全てのヒト化抗体（コンジュゲート及び非コンジュゲート）を捕捉できるヤギ抗ヒトＩｇＧでコーティングされている。コンジュゲート抗体アッセイの場合、プレートは、抗ＭＭＡＥ抗体などのペイロード（薬物）に対する抗体でコーティングされている。
【0194】
[0277]マウスに尾静脈を介して３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで投与した。その後、マウスにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）の濃度をＭＥＳＯ ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ １２０法によって測定するために、異なる時点で血液サンプルを採取した。ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）の薬物動態パラメータは、フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラム、バージョン６．３を用いたノンコンパートメント解析によって分析した。
【0195】
[0278]表６は、ＰＫ試験の結果をまとめたものである。全抗体ＭＳＤアッセイ：コンジュゲート抗体と非コンジュゲート抗体の両方を測定。コンジュゲート抗体ＭＳＤアッセイ：コンジュゲート抗体のみを測定。ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）のインビボ半減期は約８７．２時間であり、これは、マウスにおいて他の種よりも高いリンカーのタンパク質分解が観察されたため、我々のＡＤＣ上のバリン－シトルリンリンカーが基質となる酵素カルボキシルステラーゼ１Ｃに起因し得る。
【0196】
[0279]インビボ薬物動態試験は、トリマンノシルコンジュゲートとシステインコンジュゲート合成ＡＤＣ（アドセトリス）のリンカーペイロード安定性を比較するために設計された。ラットにＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）とアドセトリスを５ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈から投与した。その後、異なる時点で血清サンプルを取得し、ＭＥＳＯ ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ １２０法によりラットにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）とアドセトリスの濃度を決定した。ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）及びアドセトリスの薬物動態パラメータは、フェニックス（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラム、バージョン６．３を用いたノンコンパートメント解析によって分析した。
【0197】
[0280]表７は、ＰＫ試験の結果をまとめたものである。全抗体ＭＳＤアッセイ：コンジュゲート抗体と非コンジュゲート抗体の両方を測定。コンジュゲート抗体ＭＳＤアッセイ：コンジュゲート抗体のみを測定。ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｍＭＡＥ）のインビボ半減期は、全抗体で１９４±３５．０時間である；コンジュゲート抗体の半減期は、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）で１４８±８．１４時間、アドセトリスで１８２±１０．９時間である。（図８）
【0198】
[0281]表６
【表6】
【0199】
[0282]表７
【表7】
【0200】
[0283]ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）とアドセトリスの薬物動態プロファイルの全抗体とコンジュゲート抗体の比較では、全抗体とコンジュゲート抗体の曲線の差が、アドセトリスのものよりもＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）において近い。インビボの結果は、提示されたトリマンノシルコンジュゲーションが、システインコンジュゲーション（アドセトリス）と比較して、コンジュゲートされたリンカーペイロードの安定性に違いを有することを実証した。
【0201】
[0284]実施例４３：抗ＭＳＬＮ ＡＤＣのゼノグラフトモデル（膵臓癌）
[0285]この試験の目的は、雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＫＬＭ－１ヒト膵臓癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－リジン－ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（アジドにより活性化されたリジンを介して抗体のポリペプチドに連結したＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）のインビボ抗腫瘍効力を評価することにあった。
[0285]この試験の目的は、雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＫＬＭ－１ヒト膵臓癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－リジン－ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（アジドにより活性化されたリジンを介して抗体のポリペプチドに連結したＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）のインビボ抗腫瘍効力を評価することにあった。
【0202】
[0286]試験品ＤＣＢＰＲ２００２リジン－ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ、試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）をそれぞれ含む製剤、及び対応するビヒクルを２５ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）でストックを希釈することによって製剤化した。製剤のそれぞれをマウスに１週間に１回、３週間、静脈内（ＩＶ）投与した。
【0203】
[0287]ＫＬＭ－１細胞は、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃、空気中５％ＣＯ２の雰囲気において、単層培養としてインビトロで維持した。腫瘍細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、週に２回、定期的に継代した。指数増殖期に増殖している細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。
【0204】
[0288]６～７週齢の雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスをＢｉｏＬａｓｃｏ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ，ＬＴＤから購入し、１週間検疫を行った。各ケージに５匹のマウスを収容した。全ての動物を１９～２５℃、１２時間／１２時間の明暗サイクルの動物施設で飼育した。動物は、齧歯類用の固形飼料と水を自由に摂取できるようにした。
【0205】
[0289]ＫＬＭ－１細胞を雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの右脇腹の皮下（ＳＣ）に移植した（１：１のＰＢＳ／マトリゲル混合物中、４×１０６個の細胞をマウス１匹あたり０．１ｍＬで移植）。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したときに、マウスをランダムに３群に分けた（１群あたりＮ＝６）。ビヒクル、ＤＣＢＰＲ２００２－リジン－ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（１５ｍｇ／ｋｇ）、及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。
【0206】
[0290]２８日間、週３回、腫瘍の体積、体重、死亡率、及び明らかな毒性の徴候をモニターし、記録した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、ノギスを使用して週に３回測定し、次の式に従って計算した：腫瘍体積＝（ｗ２×ｌ）／２、式中、ｗ＝幅、ｌ＝腫瘍の直径（ｍｍ）の長さ。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）は、次の式を使用して計算した：％ＴＧＩ＝［１－（Ｔ／Ｃ）］×１００％、式中、Ｔ及びＣはそれぞれ、治療群と対照群の平均腫瘍体積を表す。ＴＧＩ（％）値≧５８％を有意な抗腫瘍活性と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。試験の完了まで、動物の体重を週に３回測定した。
【0207】
[0291]図９は、ＫＬＭ－１を移植した雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖曲線を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－リジン－ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（１５ｍｇ／ｋｇ）及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）≧５８％をビヒクル群と比較して有意な抗腫瘍活性（＃）と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。１５ｍｇ／ｋｇのＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）は、７日目から２８日目にかけてＫＬＭ－１腫瘍の増殖を有意に減少させた。１５ｍｇ／ｋｇのＤＣＢＰＲ２００２－リジン－ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥは、有意な抗腫瘍活性を示さなかった。
【0208】
[0292]図１０は、ＫＬＭ－１を移植した雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの体重変化を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－リジン－ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（１５ｍｇ／ｋｇ）及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。実験を通して、体重の減少は観察されなかった。
【0209】
[0293]実施例４４：抗ＭＳＬＮ ＡＤＣのゼノグラフトモデル（膵臓癌）
[0294]この試験の目的は、雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＫＬＭ－１ヒト膵臓癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２、及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）のインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
[0294]この試験の目的は、雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＫＬＭ－１ヒト膵臓癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２、及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）のインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
【0210】
[0295]試験品ＤＣＢＰＲ２００２、試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、及び対応するビヒクルをそれぞれ含む製剤を２５ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）でストックを希釈することによって製剤化した。製剤のそれぞれをマウスに１週間に１回、３週間、静脈内（ＩＶ）投与した。
【0211】
[0296]ＫＬＭ－１細胞は、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃、空気中５％ＣＯ２の雰囲気において、単層培養としてインビトロで維持した。腫瘍細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、週に２回、定期的に継代した。指数増殖期に増殖している細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。
【0212】
[0297]６～７週齢の雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスをＢｉｏＬａｓｃｏ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ，ＬＴＤから購入し、１週間検疫を行った。各ケージに５匹のマウスを収容した。全ての動物を１９～２５℃、１２時間／１２時間の明暗サイクルの動物施設で飼育した。動物は、齧歯類用の固形飼料と水を自由に摂取できるようにした。
【0213】
[0298]ＫＬＭ－１細胞を雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの右脇腹の皮下（ＳＣ）に移植した（１：１のＰＢＳ／マトリゲル混合物中、４×１０６個の細胞をマウス１匹あたり０．１ｍＬで移植）。平均腫瘍体積が２００ｍｍ３に達したときに、マウスをランダムに４群に分けた（１群あたりＮ＝６）。ビヒクル、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５及び３０ｍｇ／ｋｇ）、及び裸の抗体（ＤＣＢＰＲ２００２、３０ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。
【0214】
[0299]２８日間、週３回、腫瘍の体積、体重、死亡率、及び明らかな毒性の徴候をモニターし、記録した。腫瘍体積（ｍｍ３）をノギスを使用して週に３回測定し、次の式に従って計算した：腫瘍体積＝（ｗ２×ｌ）／２、式中、ｗ＝幅、ｌ＝腫瘍の直径（ｍｍ）の長さ。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）は、次の式を使用して計算した：％ＴＧＩ＝［１－（Ｔ／Ｃ）］×１００％、式中、Ｔ及びＣはそれぞれ、治療群と対照群の平均腫瘍体積を表す。ＴＧＩ（％）値≧５８％を有意な抗腫瘍活性と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。試験の完了まで、動物の体重を週に３回測定した。
【0215】
[0300]図１１は、ＫＬＭ－１を移植した雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖曲線を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２（３０ｍｇ／ｋｇ）及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５及び３０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ週１回、３週間、静脈内投与した。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）≧５８％をビヒクル群と比較して有意な抗腫瘍活性（＃）と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。１５及び３０ｍｇ／ｋｇのＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）は、７日目から２８日目にかけてＫＬＭ－１腫瘍の増殖を有意に減少させた。３０ｍｇ／ｋｇのＤＣＢＰＲ２００２は、有意な抗腫瘍活性を示さなかった。
【0216】
[0301]図１２は、ＫＬＭ－１を移植した雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの体重変化を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２（３０ｍｇ／ｋｇ）及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５及び３０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ週１回、３週間、静脈内投与した。実験を通して、体重の減少は観察されなかった。
【0217】
[0302]実施例４５：抗ＭＳＬＮ ＡＤＣのゼノグラフトモデル（膵臓癌）
[0303]この試験の目的は、雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＫＬＭ－１ヒト膵臓癌ゼノグラフトモデルにおいて、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、及びＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）のインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
[0303]この試験の目的は、雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＫＬＭ－１ヒト膵臓癌ゼノグラフトモデルにおいて、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、及びＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）のインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
【0218】
[0304]試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５ｍｇ／ｋｇ）、試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）（１５ｍｇ／ｋｇ）、試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）（１５ｍｇ／ｋｇ）、試験品ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）（１５ｍｇ／ｋｇ）、試験品ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）（１５ｍｇ／ｋｇ）、試験品ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）（１５ｍｇ／ｋｇ）、及び対応するビヒクルをそれぞれ含む製剤を２５ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）でストックを希釈することによって製剤化した。製剤のそれぞれを週１回、３週間、静脈内（ＩＶ）投与した。
【0219】
[0305]ＫＬＭ－１細胞は、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃、空気中５％ＣＯ２の雰囲気において、単層培養としてインビトロで維持した。腫瘍細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、週に２回、定期的に継代した。指数増殖期に増殖している細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。
【0220】
[0306]６～７週齢の雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスをＢｉｏＬａｓｃｏ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ，ＬＴＤから購入し、１週間検疫を行った。各ケージに５匹のマウスを収容した。全ての動物を１９～２５℃、１２時間／１２時間の明暗サイクルの動物施設で飼育した。動物は、齧歯類用の固形飼料と水を自由に摂取できるようにした。
【0221】
[0307]ＫＬＭ－１細胞を雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの右脇腹の皮下（ＳＣ）に移植した（１：１のＰＢＳ／マトリゲル混合物中、４×１０６個の細胞をマウス１匹あたり０．１ｍＬで移植）。平均腫瘍体積が３００ｍｍ３に達したときに、マウスをランダムに７群に分けた（１群あたりＮ＝６）。ビヒクル、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）のそれぞれを１５ｍｇ／ｋｇで週１回、３週間、静脈内投与した。
【0222】
[0308]２８日間、週３回、腫瘍の体積、体重、死亡率、及び明らかな毒性の徴候をモニターし、記録した。腫瘍体積を、ノギスを使用して週に３回測定し、次の式に従って計算した：腫瘍体積＝（ｗ２×ｌ）／２、式中、ｗ＝幅、ｌ＝腫瘍の直径（ｍｍ）の長さ。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）は、次の式を使用して計算した：％ＴＧＩ＝［１－（Ｔ／Ｃ）］×１００％、式中、Ｔ及びＣはそれぞれ、治療群と対照群の平均腫瘍体積を表す。ＴＧＩ（％）値≧５８％を有意な抗腫瘍活性と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。試験の完了まで、動物の体重を週に３回測定した。
【0223】
[0309]図１３は、ＫＬＭ－１を移植した雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖曲線を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、及びＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）のそれぞれを１５ｍｇ／ｋｇで週１回、３週間、静脈内投与した。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）≧５８％をビヒクル群と比較して有意な抗腫瘍活性（＃）と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。抗ＭＳＬＮ ＡＤＣの全てが、有意な抗腫瘍活性を示した。効能の順位は、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）＝ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）＝ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）＞ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）＞ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）＞ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）であった。
【0224】
[0310]図１４は、ＫＬＭ－１を移植した雄のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの体重変化を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）、ＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、及びＤＣＢＰＲ２００２－２（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）－２（ＤＢＣＯ－ｓ－ＤＭ１）のそれぞれを１５ｍｇ／ｋｇで週１回、３週間、静脈内投与した。治療群において体重の減少は観察されなかった。
【0225】
[0311]実施例４６ 抗ＭＳＬＮ ＡＤＣのゼノグラフトモデル（卵巣癌）
[0312]この試験の目的は、雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）のインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
[0312]この試験の目的は、雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）のインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
【0226】
[0313]試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）、及び対応するビヒクルをそれぞれ含む製剤を２５ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）でストックを希釈することによって製剤化した。製剤のそれぞれを週１回、３週間、静脈内（ＩＶ）投与した。
【0227】
[0314]ＯＶＣＡＲ－３細胞は、２０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃、空気中５％ＣＯ２の雰囲気において、単層培養としてインビトロで維持した。腫瘍細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、週に２回、定期的に継代した。指数増殖期に増殖している細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。
【0228】
[0315]６～７週齢の雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスをＢｉｏＬａｓｃｏ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ，ＬＴＤから購入し、１週間検疫を行った。各ケージに５匹のマウスを収容した。全ての動物を１９～２５℃、１２時間／１２時間の明暗サイクルの動物施設で飼育した。動物は、齧歯類用の固形飼料と水を自由に摂取できるようにした。
【0229】
[0316]ＯＶＣＡＲ－３細胞を雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの右脇腹の皮下（ＳＣ）に移植した（１：１のＰＢＳ／マトリゲル混合物中、１×１０７個の細胞をマウス１匹あたり０．２ｍＬで移植）。平均腫瘍体積が３００ｍｍ３に達したときに、マウスをランダムに４群に分けた（１群あたりＮ＝６）。ビヒクル、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５及び３０ｍｇ／ｋｇ）、及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）（１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。
【0230】
[0317]腫瘍体積を、ノギスを使用して週に３回測定し、次の式を用いて推定した：腫瘍体積＝（ｗ２×ｌ）／２、式中、ｗ＝幅、ｌ＝腫瘍の直径（ｍｍ）の長さ。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）は、次の式を使用して計算した：％ＴＧＩ＝［１－（Ｔ／Ｃ）］×１００％、式中、Ｔ及びＣはそれぞれ、治療群と対照群の平均腫瘍体積を表す。ＴＧＩ（％）値≧５８％を有意な抗腫瘍活性と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。試験の完了まで、動物の体重を週に３回測定した。
【0231】
[0318]図１５は、ＯＶＣＡＲ－３を移植した雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖曲線を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５及び３０ｍｇ／ｋｇ）及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）（１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）≧５８％をビヒクル群と比較して有意な抗腫瘍活性（＃）と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５及び３０ｍｇ／ｋｇ）、及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＯＶＣＡＲ－３腫瘍の増殖を有意に減少させ、ＴＧＩ（％）の値はそれぞれ＞９０％であった。
【0232】
[0319]図１６は、ＯＶＣＡＲ－３を移植した雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの体重変化を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（１５及び３０ｍｇ／ｋｇ）及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ｓｅｃｏ－ＤＵＢＡ）（１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。治療群において体重の減少は観察されなかった。
【0233】
[0320]実施例４７ 抗ＭＳＬＮ ＡＤＣのゼノグラフトモデル（卵巣癌）
[0321]この試験の目的は、雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）及びＤＣＢＰＲ２００２－ＴＭのインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
[0321]この試験の目的は、雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）及びＤＣＢＰＲ２００２－ＴＭのインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
【0234】
[0322]試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、試験品ＤＣＢＰＲ２００２－ＴＭ及び対応するビヒクルをそれぞれ含む製剤を２５ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）でストックを希釈することによって製剤化した。製剤のそれぞれを週１回、３週間、静脈内（ＩＶ）投与した。
【0235】
[0323]ＯＶＣＡＲ－３細胞は、２０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃、空気中５％ＣＯ２の雰囲気において、単層培養としてインビトロで維持した。腫瘍細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、週に２回、定期的に継代した。指数増殖期に増殖している細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。
【0236】
[0324]６～７週齢の雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスをＢｉｏＬａｓｃｏ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ，ＬＴＤから購入し、１週間検疫を行った。各ケージに５匹のマウスを収容した。全ての動物を１９～２５℃、１２時間／１２時間の明暗サイクルの動物施設で飼育した。動物は、齧歯類用の固形飼料と水を自由に摂取できるようにした。
【0237】
[0325]ＯＶＣＡＲ－３細胞を雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの右脇腹の皮下（ＳＣ）に移植した（１：１のＰＢＳ／マトリゲル混合物中、１×１０７個の細胞をマウス１匹あたり０．２ｍＬで移植）。平均腫瘍体積が３００ｍｍ３に達したときに、マウスをランダムに４群に分けた（１群あたりＮ＝５）。ビヒクル、ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（５及び１５ｍｇ／ｋｇ）、及びＤＣＢＰＲ２００２－ＴＭ（１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。
【0238】
[0326]腫瘍体積を、ノギスを使用して週に３回測定し、次の式を用いて推定した：腫瘍体積＝（ｗ２×ｌ）／２、式中、ｗ＝幅、ｌ＝腫瘍の直径（ｍｍ）の長さ。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）は、次の式を使用して計算した：％ＴＧＩ＝［１－（Ｔ／Ｃ）］×１００％、式中、Ｔ及びＣはそれぞれ、治療群と対照群の平均腫瘍体積を表す。ＴＧＩ（％）値≧５８％を有意な抗腫瘍活性と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。試験の完了まで、動物の体重を週に３回測定した。
【0239】
[0327]図１７は、ＯＶＣＡＲ－３を移植した雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖曲線を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（５及び１５ｍｇ／ｋｇ）及びＤＣＢＰＲ２００２－ＴＭ（１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）≧５８％をビヒクル群と比較して有意な抗腫瘍活性（＃）と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（５及び１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＯＶＣＡＲ－３腫瘍の増殖を有意に減少させた。１５ｍｇ／ｋｇのＤＣＢＰＲ２００２－ＴＭは、抗腫瘍活性を示さなかった。
【0240】
[0328]図１８は、ＯＶＣＡＲ－３を移植した雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの体重変化を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（５及び１５ｍｇ／ｋｇ）及びＤＣＢＰＲ２００２－ＴＭ（１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。治療群において体重の減少は観察されなかった。
【0241】
[0329]実施例４８ 抗ＭＳＬＮ ＡＤＣのゼノグラフトモデル（卵巣癌）
[0330]この試験の目的は、雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）のインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
[0330]この試験の目的は、雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスのＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣癌ゼノグラフトモデルにおけるＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）のインビボ抗腫瘍効力を評価することであった。
【0242】
[0331]試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）、及び対応するビヒクルをそれぞれ含む製剤を２５ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）でストックを希釈することによって製剤化した。製剤のそれぞれを週１回、３週間、静脈内（ＩＶ）投与した。
【0243】
[0332]ＯＶＣＡＲ－３細胞は、２０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃、空気中５％ＣＯ２の雰囲気において、単層培養としてインビトロで維持した。腫瘍細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、週に２回、定期的に継代した。指数増殖期に増殖している細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。
【0244】
[0333]６～７週齢の雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスをＢｉｏＬａｓｃｏ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ，ＬＴＤから購入し、１週間検疫を行った。各ケージに５匹のマウスを収容した。全ての動物を１９～２５℃、１２時間／１２時間の明暗サイクルの動物施設で飼育した。動物は、齧歯類用の固形飼料と水を自由に摂取できるようにした。
【0245】
[0334]ＯＶＣＡＲ－３細胞を雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの右脇腹の皮下（ＳＣ）に移植した（１：１のＰＢＳ／マトリゲル混合物中、１×１０７個の細胞をマウス１匹あたり０．２ｍＬで移植）。平均腫瘍体積が３００ｍｍ３に達したときに、マウスをランダムに４群に分けた（１群あたりＮ＝５）。ビヒクル、及びＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（５、１０、及び１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。
【0246】
[0335]腫瘍体積をノギスを使用して週に３回測定し、次の式を用いて推定した：腫瘍体積＝（ｗ２×ｌ）／２、式中、ｗ＝幅、ｌ＝腫瘍の直径（ｍｍ）の長さ。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）は、次の式を使用して計算した：％ＴＧＩ＝［１－（Ｔ／Ｃ）］×１００％、式中、Ｔ及びＣはそれぞれ、治療群と対照群の平均腫瘍体積を表す。ＴＧＩ（％）値≧５８％を有意な抗腫瘍活性と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。試験の完了まで、動物の体重を週に３回測定した。
【0247】
[0336]図１９は、ＯＶＣＡＲ－３を移植した雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖曲線を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（５、１０、及び１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）≧５８％をビヒクル群と比較して有意な抗腫瘍活性（＃）と判断した。一元配置分散分析に続いてダネット検定を適用し、ビヒクルと試験品治療群との比較を行った。＊Ｐ＜０．０５において、差を有意と判断する。ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（５、１０、１５ｍｇ／ｋｇ）は、用量依存的にＯＶＣＡＲ－３腫瘍の増殖を有意に減少させた。
【0248】
[0337]図２０は、ＯＶＣＡＲ－３を移植した雌のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスの体重変化を示している。試験品ＤＣＢＰＲ２００２－４（ＤＢＣＯ－ｖｃ－ＭＭＡＥ）（５、１０、及び１５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれを週１回、３週間、静脈内投与した。治療群において体重の減少は観察されなかった。
【0249】
[0338]上記の実施例は、本発明のＡＤＣを取得してキャラクタリゼーションするための様々な方法、並びに癌の治療における本発明のＡＤＣの有効性を明確に示すものである。本発明の実施形態は限られた数の例により示されているが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく他の変形及び改変が可能であることを理解する。したがって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図21D】
【図21E】
【図21F】
【図21G】
【図21H】
【図21I】
【図21J】
【図21K】
【図21L】
【図21M】
【図21N】
【図21O】
【図21P】
【図21Q】
【図21R】
【図21S】
【図21T】
【配列表】
【国際調査報告】