特表 2023-528333 ウイルスベクター用製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-04

(54)【発明の名称】ウイルスベクター用製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20230627BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20230627BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20230627BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230627BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20230627BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20230627BHJP

   C07K 14/765 20060101ALN20230627BHJP

   C07K 14/77 20060101ALN20230627BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

A61K9/08

A61K47/42

A61K47/36

A61K47/02

A61K47/18

A61K47/12

A61K47/26

A61K9/19

A61K35/761

A61K35/763

A61P43/00

C12N15/86 Z

C07K14/765

C07K14/77

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022572521

(86)(22)【出願日】2021-05-28

(85)【翻訳文提出日】2022-11-25

(86)【国際出願番号】 US2021034943

(87)【国際公開番号】W WO2021243264

(87)【国際公開日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】63/031,436

(32)【優先日】2020-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ノニデット

２．ＮＯＮＩＤＥＴ

３．プルロニック

４．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

５．ＴＷＥＥＮ

６．ＴＲＩＴＯＮ

７．ゲナポール

８．Ｇｅｎａｐｏｌ

(71)【出願人】

【識別番号】391003864

【氏名又は名称】ロンザ リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＬＯＮＺＡ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】アーメド・ベシア

(72)【発明者】

【氏名】ヨーナス・コスト

(72)【発明者】

【氏名】エディ・ベルティエ

(72)【発明者】

【氏名】ハンス－クリスティアン・マーラー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076AA31

4C076CC26

4C076CC50

4C076DD01F

4C076DD09F

4C076DD23

4C076DD26Z

4C076DD42Z

4C076DD43Z

4C076DD51Z

4C076DD67

4C076EE23F

4C076EE30Q

4C076EE36Q

4C076EE37Q

4C076EE41Q

4C076FF16

4C076FF36

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4C076FF63

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087ZC80

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA70

4H045EA20

(57)【要約】

アルブミンなどの球状タンパク質を含むウイルスベクター製剤が提供される。ヒアルロン酸などの多糖を含むウイルスベクター製剤も提供される。提供されるウイルスベクター製剤は、増加した安定性及び低減したウイルスベクター凝集を有する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウイルスベクター、
緩衝液、及び
球状タンパク質を含む、製剤。

【請求項2】

前記球状タンパク質が、アルブミン、α－フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、アファミン、グロビンタンパク質、αグロブリン、βグロブリン、γグロブリン、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の製剤。

【請求項3】

前記製剤が、液体である、請求項１又は２に記載の製剤。

【請求項4】

前記製剤が、約０．１％～約５．０％の球状タンパク質を含む、請求項３に記載の製剤。

【請求項5】

前記製剤が、約０．５％～約２．０％の球状タンパク質を含む、請求項３に記載の製剤。

【請求項6】

前記製剤が、約０．７５％～約１．５％の球状タンパク質を含む、請求項３に記載の製剤。

【請求項7】

前記製剤が、約０．８％～約１．２％の球状タンパク質を含む、請求項３に記載の製剤。

【請求項8】

前記製剤が、約１．０％の球状タンパク質を含む、請求項３に記載の製剤。

【請求項9】

ウイルスベクター、
緩衝液、及び
アルブミンを含む、製剤。

【請求項10】

前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、又はラクトアルブミンである、請求項１に記載の製剤。

【請求項11】

前記製剤が、液体である、請求項９又は１０に記載の製剤。

【請求項12】

前記製剤が、約０．１％～約５．０％のアルブミンを含む、請求項１１に記載の製剤。

【請求項13】

前記製剤が、約０．５％～約２．０％のアルブミンを含む、請求項１１に記載の製剤。

【請求項14】

前記製剤が、約０．７５％～約１．５％のアルブミンを含む、請求項１１に記載の製剤。

【請求項15】

前記製剤が、約０．８％～約１．２％のアルブミンを含む、請求項１１に記載の製剤。

【請求項16】

前記製剤が、約１．０％のアルブミンを含む、請求項１１に記載の製剤。

【請求項17】

ウイルスベクター、
緩衝液、及び
多糖を含む、製剤。

【請求項18】

前記多糖が、ヒアルロン酸ナトリウム、ヘパラン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、アルギン、キトサン、キトサン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、又はそれらの組み合わせである、請求項１７に記載の製剤。

【請求項19】

前記多糖が、ヒアルロン酸ナトリウムである、請求項１７に記載の製剤。

【請求項20】

前記製剤が、液体である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項21】

前記製剤が、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬの多糖を含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項22】

前記製剤が、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬの多糖を含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項23】

前記製剤が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬの多糖を含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項24】

前記製剤が、約０．１５ｎｇ／ｍＬ～約０．２５ｍｇ／ｍＬの多糖を含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項25】

前記製剤が、約０．２ｎｇ／ｍＬの多糖を含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項26】

前記製剤が、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項27】

前記製剤が、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項28】

前記製剤が、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項29】

前記製剤が、約０．１５ｎｇ／ｍＬ～約０．２５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項30】

前記製剤が、約０．２ｎｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む、請求項２０に記載の製剤。

【請求項31】

前記製剤が、球状タンパク質及び多糖の両方を含む、請求項１～８及び１７～３０のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項32】

前記製剤が、アルブミン及び多糖の両方を含む、請求項９～３０のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項33】

前記多糖が、ヒアルロン酸ナトリウムである、請求項３１又は３２に記載の製剤。

【請求項34】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約２ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝液を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項35】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約５ｍＭ～約５０ｍＭの緩衝液を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項36】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの緩衝液を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項37】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約２０ｍＭの緩衝液を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項38】

前記緩衝液が、リン酸ナトリウム、Ｌ－ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせである、請求項１～３７のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項39】

糖を更に含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項40】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの糖を含む、請求項１８に記載の製剤。

【請求項41】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約１００ｍＭ～約４００ｍＭの糖を含む、請求項１８に記載の製剤。

【請求項42】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約２５０ｍＭ～約３５０ｍＭの糖を含む、請求項１８に記載の製剤。

【請求項43】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約２９０ｍＭの糖を含む、請求項１８に記載の製剤。

【請求項44】

前記糖が、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、又はそれらの組み合わせである、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項45】

前記糖が、スクロースである、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項46】

界面活性剤を更に含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項47】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約０．０１％～約０．１％の界面活性剤を含む、請求項４６に記載の製剤。

【請求項48】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約０．０１５％～約０．０２５％の界面活性剤を含む、請求項２５に記載の製剤。

【請求項49】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約０．０２％の界面活性剤を含む、請求項２５に記載の製剤。

【請求項50】

前記界面活性剤が、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、又はＫｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８である、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項51】

塩化ナトリウムを更に含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項52】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約１０ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項５１に記載の製剤。

【請求項53】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約５０ｍＭ～約３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項５１に記載の製剤。

【請求項54】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項５１に記載の製剤。

【請求項55】

前記製剤が、液体であり、前記製剤が、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項５１に記載の製剤。

【請求項56】

前記製剤が、凍結乾燥固体である、請求項１、２、９、１０、又は１７～１９のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項57】

前記緩衝液が、リン酸ナトリウム、Ｌ－ヒスチジン、トリス、コハク酸塩、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせである、請求項５６に記載の製剤。

【請求項58】

糖を更に含む、請求項５６又は５７に記載の製剤。

【請求項59】

前記糖が、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、又はそれらの組み合わせである、請求項５８に記載の製剤。

【請求項60】

前記糖が、スクロースである、請求項５８に記載の製剤。

【請求項61】

界面活性剤を更に含む、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項62】

前記界面活性剤が、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、又はＫｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８である、請求項６１に記載の製剤。

【請求項63】

塩化ナトリウムを更に含む、請求項５６～６２のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項64】

前記製剤が、約５０ｎｍ以下のＺ平均値を有する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項65】

前記製剤が、約４０ｎｍ以下のＺ平均値を有する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項66】

前記製剤が、約３１ｎｍ以下のＺ平均値を有する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項67】

前記製剤が、約２５ｎｍ以下のＺ平均値を有する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項68】

前記製剤が、約２０ｎｍ以下のＺ平均値を有する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項69】

前記製剤が、約０．５以下の多分散性指数を有する、請求項１～６８のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項70】

前記製剤が、約０．３５以下の多分散性指数を有する、請求項１～６８のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項71】

前記製剤が、約０．３以下の多分散性指数を有する、請求項１～６８のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項72】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はハイブリッドベクターである、請求項１～７１のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項73】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１～７２のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項74】

前記製剤が、ヒトへの投与のために製剤化される、請求項１～７３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項75】

約１０×１０^８ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１３ｖｇ／ｍＬのウイルスベクター、
約５ｍＭ～約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、
約２００ｍＭ～約４００ｍＭのスクロース、及び
約０．１％～約５．０％のアルブミンを含む、製剤。

【請求項76】

前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又はそれらの組み合わせである、請求項７５に記載の製剤。

【請求項77】

約１０×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１１ｖｇ／ｍＬの前記ウイルスベクターを含む、請求項７５又は７６に記載の製剤。

【請求項78】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はハイブリッドベクターである、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項79】

約１０×１０^８ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１３ｖｇ／ｍＬのウイルスベクター、
約５ｍＭ～約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、
約２００ｍＭ～約４００ｍＭのスクロース、及び
約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．４ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む、製剤。

【請求項80】

約１０×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１１ｖｇ／ｍＬの前記ウイルスベクターを含む、請求項７９に記載の製剤。

【請求項81】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はハイブリッドベクターである、請求項７９又は８０に記載の製剤。

【請求項82】

前記ウイルスベクターが、ウイルス粒子中にある、請求項１～８１のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項83】

前記ウイルス粒子が、感染性ウイルス粒子である、請求項８２に記載の製剤。

【請求項84】

製剤中のウイルスベクターの凝集を低減する方法であって、請求項１～８３のいずれか一項に記載の製剤のいずれか中に前記ウイルスベクターを製剤化することを含む、方法。

【請求項83】

ウイルスベクター製剤を調製する方法であって、前記方法が、
ａ．前記ウイルスベクターを含む組成物を得ることと、
ｂ．前記製剤を形成するために前記（ａ）の組成物に球状タンパク質又は多糖を添加することと、を含み、前記球状タンパク質又は多糖が、約５０ｎｍ以下のＺ平均値を提供するのに十分な量で添加される、方法。

【請求項84】

前記球状タンパク質が、アルブミンである、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記アルブミンが、前記製剤の約０．１％～約５．０％である、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記多糖が、ヒアルロン酸ナトリウムである、請求項８３に記載の方法。

【請求項87】

前記ヒアルロン酸ナトリウムが、前記製剤の約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．４ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムである、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記製剤を１週間以上保存することを更に含む、請求項８３～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記製剤を１ヶ月を超えて保存することを含む、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記ウイルスベクターが、ウイルス粒子中にある、請求項８３～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

ウイルスベクター製剤を調製する方法であって、前記方法が、
ａ．前記ウイルスベクターを含む組成物を得ることと、
ｂ．前記製剤を形成するために前記（ａ）の組成物に球状タンパク質又は多糖を添加することと、を含み、前記球状タンパク質又は多糖が、約０．５以下の多分散性指数を提供するのに十分な量で添加される、方法。

【請求項92】

前記球状タンパク質が、アルブミンである、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記アルブミンが、前記製剤の約０．１％～約５．０％である、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

前記多糖が、ヒアルロン酸ナトリウムである、請求項９１に記載の方法。

【請求項95】

前記ヒアルロン酸ナトリウムが、前記製剤の約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．４ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムである、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記製剤を１週間以上保存することを更に含む、請求項９１～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記製剤を１ヶ月を超えて保存することを含む、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記ウイルスベクターが、ウイルス粒子中にある、請求項９１～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

長期保存のためにウイルスベクター製剤を安定化する方法であって、前記方法が、
ａ．前記ウイルスベクターを含む組成物を得ることと、
ｂ．前記製剤を形成するために前記（ａ）の組成物に球状タンパク質又は多糖を添加することであって、前記球状タンパク質又は多糖が、約０．５以下の多分散性指数を提供するのに十分な量で添加される、添加することと、
ｃ．前記製剤を１週間を超えて保存することと、を含む、方法。

【請求項100】

前記製剤が、１ヶ月を超えて保存される、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記製剤が、前記（ａ）の組成物に前記球状タンパク質又は多糖を添加した後、凍結乾燥される、請求項９９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、概して、ウイルスベクターを含む製剤に関する。製剤は、容易に投与される安定な製剤を提供するウイルスベクターの凝集を防止する薬剤を含む。

【背景技術】

【0002】

ウイルスベクターは、ワクチン及び遺伝子療法における治療用核酸の送達のためのビヒクルである。ウイルスベクターを作製するために、産生細胞を増殖させ、トランスフェクトし、典型的にはプラスミドである。次に、ウイルスベクターを細胞から回収し、使用のために製剤化する。凝集することなく高いベクター濃度を達成することは、ウイルスベクターの製造における重大な技術的障害である。

【0003】

ウイルス粒子は凝集体を形成することができ、これは、環境ストレス及び殺菌剤による分解に対する耐性を増加させる。凝集は、細胞種及び細胞関連不純物、ウイルス種、ウイルスの生化学的特性（例えば、ウイルスサイズ及び形状、等電点など）、生理化学的要因（例えば、ｐＨ、イオン強度）、及び動作要因（例えば、プロセス温度）によって影響を受ける。ウイルス凝集の研究は１９５０年代に始まったが、この現象は、ウイルスベクター製造における主要な課題の１つとして研究及び検討され続けている。

【0004】

ウイルス凝集は、治療薬の下流の処理及びその投与適合性に影響を及ぼす。ウイルス凝集は、静電的及び疎水的相互作用に起因して起こり、凝集したウイルス粒子は、下流の処理において合併症を引き起こし、濾過及びその後の精製ステップなどの膜ベースのプロセス中に、有意なベクター損失及び収率の低下をもたらし得る。更に、凝集は、最終製品の品質の指標を提供するウイルス感染性の読み取りに影響を与える。

【0005】

本発明の概要
本開示は、ウイルスベクター、緩衝液、及び球状タンパク質を含む製剤に関する。実施形態では、球状タンパク質は、アルブミン、α－フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、アファミン、グロビンタンパク質、αグロブリン、βグロブリン、γグロブリン、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、製剤は、液体である。実施形態では、製剤は、約０．１％～約５．０％の球状タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約０．５％～約２．０％の球状タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約０．７５％～約１．５％の球状タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約０．８％～約１．２％の球状タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約１．０％の球状タンパク質を含む。

【0006】

本開示はまた、ウイルスベクター、緩衝液、及びアルブミンを含む製剤に関する。実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、又はラクトアルブミンである。実施形態では、製剤は、液体である。実施形態では、製剤は、約０．１％～約５．０％のアルブミンを含む。実施形態では、製剤は、約０．５％～約２．０％のアルブミンを含む。実施形態では、製剤は、約０．７５％～約１．５％のアルブミンを含む。実施形態では、製剤は、約０．８％～約１．２％のアルブミンを含む。実施形態では、製剤は、約１．０％のアルブミンを含む。

【0007】

本発明はまた、ウイルスベクター、緩衝液、及び多糖を含む製剤に関する。実施形態では、多糖は、グリコサミノグリカンである。実施形態では、多糖は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヘパラン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、アルギン、キトサン、キトサン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、多糖は、ヒアルロン酸ナトリウムである。実施形態では、製剤は、液体である。実施形態では、製剤は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．１５ｎｇ／ｍＬ～約０．２５ｍｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．２ｎｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約０．１５ｎｇ／ｍＬ～約０．２５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約０．２ｎｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。

【0008】

実施形態では、本開示はまた、球状タンパク質及び多糖の両方を含む製剤を提供する。実施形態では、本開示は、アルブミン及び多糖の両方を含む製剤を提供する。これらの製剤の実施形態では、多糖は、ヒアルロン酸ナトリウムである。

【0009】

本明細書の製剤の実施形態では、製剤は、液体である。液体製剤の実施形態では、製剤は、約２ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝液を含む。液体製剤の実施形態では、製剤は、約５ｍＭ～約５０ｍＭの緩衝液を含む。液体製剤の実施形態では、製剤は、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの緩衝液を含む。液体製剤の実施形態では、製剤は、約２０ｍＭの緩衝液を含む。

【0010】

本明細書の製剤の実施形態では、緩衝液は、リン酸ナトリウム、Ｌ－ヒスチジン、トリス、コハク酸塩、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせである。

【0011】

実施形態では、本明細書の製剤は、糖を更に含む。糖を含む製剤の実施形態では、製剤は、液体である。糖を含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの糖を含む。糖を含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約１００ｍＭ～約４００ｍＭの糖を含む。糖を含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約２５０ｍＭ～約３５０ｍＭの糖を含む。糖を含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約２９０ｍＭの糖を含む。糖を含む製剤の実施形態では、糖は、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、糖は、スクロースである。

【0012】

実施形態では、本明細書の製剤は、界面活性剤を更に含む。界面活性剤を含む製剤の実施形態では、製剤は、液体である。界面活性剤を含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約０．０１％～約０．１％の界面活性剤を含む。界面活性剤を含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約０．０１５％～約０．０２５％の界面活性剤を含む。界面活性剤を含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約０．０２％の界面活性剤を含む。界面活性剤を含む製剤の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、又はＫｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８である。

【0013】

実施形態では、本明細書の製剤は、塩化ナトリウムを更に含む。塩化ナトリウムを含む製剤の実施形態では、製剤は、液体である。塩化ナトリウムを含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約１０ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。塩化ナトリウムを含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。塩化ナトリウムを含む、液体製剤の実施形態では、製剤は、約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。塩化ナトリウムを含む液体製剤の実施形態では、製剤は、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。

【0014】

本明細書に開示される製剤の実施形態では、製剤は、凍結乾燥固体である。凍結乾燥製剤の実施形態では、緩衝液は、リン酸ナトリウム、Ｌ－ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせである。凍結乾燥製剤の実施形態では、製剤は、糖を更に含む。実施形態では、糖は、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、糖は、スクロースである。凍結乾燥製剤の実施形態では、製剤は、界面活性剤を更に含む。実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、又はＫｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８である。凍結乾燥製剤の実施形態では、製剤は、塩化ナトリウムを更に含む。

【0015】

本明細書の製剤のいずれかの実施形態では、製剤は、約５０ｎｍ以下のＺ平均値を有する。実施形態では、製剤は、約４０ｎｍ以下のＺ平均値を有する。実施形態では、製剤は、約３１ｎｍ以下のＺ平均値を有する。実施形態では、製剤は、約２５ｎｍ以下のＺ平均値を有する。実施形態では、製剤は、約２０ｎｍ以下のＺ平均値を有する。

【0016】

本明細書の製剤のいずれかの実施形態では、製剤は、約０．５以下の多分散性指数を有する。実施形態では、製剤は、約０．３５以下の多分散性指数を有する。実施形態では、製剤は、約０．３以下の多分散性指数を有する。

【0017】

本明細書の製剤のいずれかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はハイブリッドベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。

【0018】

本明細書の製剤のいずれかの実施形態では、製剤は、ヒトへの投与のために製剤化される。

【0019】

本開示はまた、製剤中のウイルスベクターの凝集を低減する方法であって、本明細書に開示される製剤のいずれか中でウイルスベクターを製剤化することを含む、方法を提供する。

【0020】

実施形態では、本開示はまた、約１０×１０^８ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１３ｖｇ／ｍＬのウイルスベクター、約５ｍＭ～約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２００ｍＭ～約４００ｍＭのスクロース、並びに約０．１％～約５．０％のアルブミンを含む製剤を提供する。実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、製剤は、約１０×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１１ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はハイブリッドベクターである。

【0021】

実施形態では、本開示はまた、約１０×１０^８ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１３ｖｇ／ｍＬのウイルスベクター、約５ｍＭ～約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２００ｍＭ～約４００ｍＭのスクロース、及び約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．４ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む製剤を提供する。実施形態では、製剤は、約１０×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１１ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はハイブリッドベクターである。

【0022】

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様の例示的な実施形態を更に示すために含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】実施例５．１に記載される、ｑＰＣＲによるＡＡＶ２滴定に対するＤＮａｓｅ Ｉ消化及び熱カプシド開口ステップの影響に関するウイルスゲノム力価の棒グラフを示す。

【図2】実施例５．１に記載される、エッペンドルフチューブ中での２４時間の保存時での混合されていない試料と比較した混合された試料のＡＡＶ２力価定量化の棒グラフを示す。

【図3A】実施例５．１に記載される、ＡＡＶ２試料の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。（Ａ）標準試料調製プロトコルで調製した１・１０^１０ｖｇ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ２試料、及び（Ｂ）修正した試料調製プロトコルで調製した１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ２試料。

【図3B】実施例５．１に記載される、ＡＡＶ２試料の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。（Ａ）標準試料調製プロトコルで調製した１・１０^１０ｖｇ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ２試料、及び（Ｂ）修正した試料調製プロトコルで調製した１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ２試料。

【図4A】実施例５．１に記載される、動的光散乱（ＤＬＳ）及び多角度動的光散乱（ＭＡＤＬＳ）で得られた結果のプロットを示す。（Ａ）１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する４つの複製の後方散乱を用いた粒子サイズ分布、（Ｂ）後方散乱測定の相関曲線、（Ｃ）後方散乱、（Ｄ）側方散乱、（Ｅ）前方散乱、及び（Ｆ）ＭＡＤＬＳ。

【図4B】実施例５．１に記載される、動的光散乱（ＤＬＳ）及び多角度動的光散乱（ＭＡＤＬＳ）で得られた結果のプロットを示す。（Ａ）１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する４つの複製の後方散乱を用いた粒子サイズ分布、（Ｂ）後方散乱測定の相関曲線、（Ｃ）後方散乱、（Ｄ）側方散乱、（Ｅ）前方散乱、及び（Ｆ）ＭＡＤＬＳ。

【図4C】実施例５．１に記載される、動的光散乱（ＤＬＳ）及び多角度動的光散乱（ＭＡＤＬＳ）で得られた結果のプロットを示す。（Ａ）１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する４つの複製の後方散乱を用いた粒子サイズ分布、（Ｂ）後方散乱測定の相関曲線、（Ｃ）後方散乱、（Ｄ）側方散乱、（Ｅ）前方散乱、及び（Ｆ）ＭＡＤＬＳ。

【図4D】実施例５．１に記載される、動的光散乱（ＤＬＳ）及び多角度動的光散乱（ＭＡＤＬＳ）で得られた結果のプロットを示す。（Ａ）１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する４つの複製の後方散乱を用いた粒子サイズ分布、（Ｂ）後方散乱測定の相関曲線、（Ｃ）後方散乱、（Ｄ）側方散乱、（Ｅ）前方散乱、及び（Ｆ）ＭＡＤＬＳ。

【図4E】実施例５．１に記載される、動的光散乱（ＤＬＳ）及び多角度動的光散乱（ＭＡＤＬＳ）で得られた結果のプロットを示す。（Ａ）１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する４つの複製の後方散乱を用いた粒子サイズ分布、（Ｂ）後方散乱測定の相関曲線、（Ｃ）後方散乱、（Ｄ）側方散乱、（Ｅ）前方散乱、及び（Ｆ）ＭＡＤＬＳ。

【図4F】実施例５．１に記載される、動的光散乱（ＤＬＳ）及び多角度動的光散乱（ＭＡＤＬＳ）で得られた結果のプロットを示す。（Ａ）１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する４つの複製の後方散乱を用いた粒子サイズ分布、（Ｂ）後方散乱測定の相関曲線、（Ｃ）後方散乱、（Ｄ）側方散乱、（Ｅ）前方散乱、及び（Ｆ）ＭＡＤＬＳ。

【図5A】実施例５．１に記載される、ゼータ電位測定のプロットである。（Ａ）１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ２製剤の相プロット及び（Ｂ）ゼータ電位測定。

【図5B】実施例５．１に記載される、ゼータ電位測定のプロットである。（Ａ）１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ２製剤の相プロット及び（Ｂ）ゼータ電位測定。

【図6】実施例５．１に記載される、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を用いたＵ２ＯＳ－ＨＴＢ－９６細胞生存率アッセイのプロットである。

【図7】実施例５．１に記載される、ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰの１０^５及び１０^６ｖｇ／細胞のＭＯＩで感染した後のＵ２ＯＳ細胞の蛍光の棒グラフである（例えば、４８８ｎｍ ｅｍ：５２０ｎｍ）。

【図8】実施例５．１に記載される、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６ｖｇ／細胞のＡＡＶ２ ＭＯＩで形質導入したときの２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、及び７日後のＵ２ＯＳ－ＨＴＢ－９６細胞の蛍光強度の棒グラフである（例えば、４６０ｎｍ ｅｍ：５１５ｎｍ）。

【図9】実施例５．２に記載される、Ｔ０における製剤研究１のｑＰＣＲで測定されたＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ滴定結果の棒グラフである。

【図10】実施例５．２に記載される、Ｔ０における製剤研究１のＧＦＰ発現アッセイから検出された蛍光の棒グラフである。ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ製剤での形質導入時のＵ２ＯＳ細胞の蛍光を２４、４８、及び７２時間後に測定する。

【図11】実施例５．３に記載される、製剤３、４、６、及び７（左から右へ）の凍結乾燥ケーキの画像を示す。製剤３及び４は、ケーキにおける小さな亀裂を示した。

【図12】実施例５．３に記載される、製剤研究２中にｑＰＣＲで測定された全ての力価定量の要約を有する棒グラフである。

【図13】実施例５．３に記載される、Ｔ０並びに－２０℃及び－８０℃で３ヶ月間保存された凍結試料と比較した、２～８℃で１ヶ月間又は３ヶ月間保存された異なるＡＡＶ２製剤で形質導入した後のＵ２ＯＳ細胞における蛍光の棒グラフである。

【図14】実施例５．３に記載される、Ｔ０並びに－２０℃及び－８０℃で３ヶ月間保存された凍結試料と比較した、２５℃で１ヶ月間保存された異なるＡＡＶ２製剤での形質導入後のＵ２ＯＳ細胞における蛍光の棒グラフである。

【図15】実施例５．３に記載される、凍結融解サイクル、水平攪拌ストレス、及び４０℃への曝露に曝露した後のＵ２ＯＳ細胞におけるＧＦＰ発現の棒グラフである。

【図16A】実施例５．３に記載される、Ｔ０における全ての製剤の後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットである：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図16B】実施例５．３に記載される、Ｔ０における全ての製剤の後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットである：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図16C】実施例５．３に記載される、Ｔ０における全ての製剤の後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットである：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図16D】実施例５．３に記載される、Ｔ０における全ての製剤の後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットである：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図16E】実施例５．３に記載される、Ｔ０における全ての製剤の後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットである：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図16F】実施例５．３に記載される、Ｔ０における全ての製剤の後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットである：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図16G】実施例５．３に記載される、Ｔ０における全ての製剤の後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットである：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図16H】実施例５．３に記載される、Ｔ０における全ての製剤の後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットである：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図17A】図１７（Ａ）は、実施例５．３に記載される、全ての測定されたプルポイント中の全ての製剤のＺ平均値の棒グラフであり、図１７（Ｂ）は、実施例５．３に記載される、全ての測定されたプルポイント中の全ての製剤の多分散性指数の棒グラフである。

【図17B】図１７（Ａ）は、実施例５．３に記載される、全ての測定されたプルポイント中の全ての製剤のＺ平均値の棒グラフであり、図１７（Ｂ）は、実施例５．３に記載される、全ての測定されたプルポイント中の全ての製剤の多分散性指数の棒グラフである。

【図18A】実施例５．３に記載される、異なるサイズを有する目視で見えない（ｓｕｂ ｖｉｓｉｂｌｅ）粒子の棒グラフである：（Ａ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｂ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｃ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｄ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｅ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｆ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｇ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ、（Ｈ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ。

【図18B】実施例５．３に記載される、異なるサイズを有する目視で見えない（ｓｕｂ ｖｉｓｉｂｌｅ）粒子の棒グラフである：（Ａ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｂ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｃ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｄ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｅ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｆ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｇ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ、（Ｈ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ。

【図18C】実施例５．３に記載される、異なるサイズを有する目視で見えない（ｓｕｂ ｖｉｓｉｂｌｅ）粒子の棒グラフである：（Ａ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｂ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｃ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｄ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｅ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｆ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｇ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ、（Ｈ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ。

【図18D】実施例５．３に記載される、異なるサイズを有する目視で見えない（ｓｕｂ ｖｉｓｉｂｌｅ）粒子の棒グラフである：（Ａ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｂ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｃ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｄ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｅ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｆ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｇ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ、（Ｈ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ。

【図18E】実施例５．３に記載される、異なるサイズを有する目視で見えない（ｓｕｂ ｖｉｓｉｂｌｅ）粒子の棒グラフである：（Ａ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｂ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｃ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｄ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｅ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｆ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｇ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ、（Ｈ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ。

【図18F】実施例５．３に記載される、異なるサイズを有する目視で見えない（ｓｕｂ ｖｉｓｉｂｌｅ）粒子の棒グラフである：（Ａ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｂ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｃ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｄ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｅ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｆ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｇ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ、（Ｈ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ。

【図18G】実施例５．３に記載される、異なるサイズを有する目視で見えない（ｓｕｂ ｖｉｓｉｂｌｅ）粒子の棒グラフである：（Ａ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｂ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｃ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｄ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｅ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｆ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｇ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ、（Ｈ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ。

【図18H】実施例５．３に記載される、異なるサイズを有する目視で見えない（ｓｕｂ ｖｉｓｉｂｌｅ）粒子の棒グラフである：（Ａ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｂ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２μｍ、（Ｃ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｄ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧５μｍ、（Ｅ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｆ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧１０μｍ、（Ｇ）全ての製剤中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ、（Ｈ）全てのプラセボ中の目視で見えない粒子数≧２５μｍ。

【図19】実施例５．３に記載される、製剤研究２で測定される全てのゼータ電位の要約の棒グラフである。

【図20A】実施例５．３に記載される、（Ａ）全ての製剤及び（Ｂ）プラセボについてのｐＨ測定の要約の棒グラフである。

【図20B】実施例５．３に記載される、（Ａ）全ての製剤及び（Ｂ）プラセボについてのｐＨ測定の要約の棒グラフである。

【図21】実施例５．４に記載される、異なる０．２μｍの滅菌ＰＶＤＦフィルターを用いた滅菌濾過後のＡＡＶ２力価回復に対する１５０ｍＭの塩化ナトリウムの影響を示すウイルス力価の棒グラフである。

【図22A】実施例５．４に記載される、１５０ｍＭ ＮａＣｌで提供される製剤と比較した、塩化ナトリウムを含まないＡＡＶ２製剤のＤＬＳによって測定された粒子サイズ分布のプロットである。（Ａ）ＮａＣｌを含まない製剤、（Ｂ）１５０ｍＭ ＮａＣｌを補充した製剤、（Ｃ）１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む製剤、及び０．２μｍのＭｉｌｌｅｘ ＰＶＤＦ滅菌フィルターを通した滅菌濾過。

【図22B】実施例５．４に記載される、１５０ｍＭ ＮａＣｌで提供される製剤と比較した、塩化ナトリウムを含まないＡＡＶ２製剤のＤＬＳによって測定された粒子サイズ分布のプロットである。（Ａ）ＮａＣｌを含まない製剤、（Ｂ）１５０ｍＭ ＮａＣｌを補充した製剤、（Ｃ）１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む製剤、及び０．２μｍのＭｉｌｌｅｘ ＰＶＤＦ滅菌フィルターを通した滅菌濾過。

【図22C】実施例５．４に記載される、１５０ｍＭ ＮａＣｌで提供される製剤と比較した、塩化ナトリウムを含まないＡＡＶ２製剤のＤＬＳによって測定された粒子サイズ分布のプロットである。（Ａ）ＮａＣｌを含まない製剤、（Ｂ）１５０ｍＭ ＮａＣｌを補充した製剤、（Ｃ）１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む製剤、及び０．２μｍのＭｉｌｌｅｘ ＰＶＤＦ滅菌フィルターを通した滅菌濾過。

【図23】実施例５．４に記載される、異なる染料を補充した異なる濃度の全ての試料の熱シフトを示すプロットである。

【図24A】実施例５．４に記載される、（Ａ）１倍、５倍、及び１０倍のＳＹＰＲＯ－オレンジを補充したＡＡＶ２試料の蛍光強度、（Ｂ）１倍、５倍、及び１０倍のＳＹＢＲ－ゴールドを補充したＡＡＶ２試料の蛍光強度のプロットである。

【図24B】実施例５．４に記載される、（Ａ）１倍、５倍、及び１０倍のＳＹＰＲＯ－オレンジを補充したＡＡＶ２試料の蛍光強度、（Ｂ）１倍、５倍、及び１０倍のＳＹＢＲ－ゴールドを補充したＡＡＶ２試料の蛍光強度のプロットである。

【図25】実施例５．１．９に記載される、空のＡＡＶ２カプシド及び完全なＡＡＶ２カプシドの定量化に使用されたＴＥＭ画像を示す。画像は１１ｋＶで撮影され、１つは２０ｋＶで撮影し、１つは３７ｋＶで撮影した。

【図26A】実施例５．１に記載される、Ｔ０における全てのプラセボの後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットを示す：（Ａ）プラセボ１、（Ｂ）プラセボ２、（Ｃ）プラセボ３、（Ｄ）プラセボ４、（Ｅ）プラセボ５、（Ｆ）プラセボ６、（Ｇ）プラセボ７、及び（Ｈ）プラセボ８。

【図26B】実施例５．１に記載される、Ｔ０における全てのプラセボの後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットを示す：（Ａ）プラセボ１、（Ｂ）プラセボ２、（Ｃ）プラセボ３、（Ｄ）プラセボ４、（Ｅ）プラセボ５、（Ｆ）プラセボ６、（Ｇ）プラセボ７、及び（Ｈ）プラセボ８。

【図26C】実施例５．１に記載される、Ｔ０における全てのプラセボの後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットを示す：（Ａ）プラセボ１、（Ｂ）プラセボ２、（Ｃ）プラセボ３、（Ｄ）プラセボ４、（Ｅ）プラセボ５、（Ｆ）プラセボ６、（Ｇ）プラセボ７、及び（Ｈ）プラセボ８。

【図26D】実施例５．１に記載される、Ｔ０における全てのプラセボの後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットを示す：（Ａ）プラセボ１、（Ｂ）プラセボ２、（Ｃ）プラセボ３、（Ｄ）プラセボ４、（Ｅ）プラセボ５、（Ｆ）プラセボ６、（Ｇ）プラセボ７、及び（Ｈ）プラセボ８。

【図26E】実施例５．１に記載される、Ｔ０における全てのプラセボの後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットを示す：（Ａ）プラセボ１、（Ｂ）プラセボ２、（Ｃ）プラセボ３、（Ｄ）プラセボ４、（Ｅ）プラセボ５、（Ｆ）プラセボ６、（Ｇ）プラセボ７、及び（Ｈ）プラセボ８。

【図26F】実施例５．１に記載される、Ｔ０における全てのプラセボの後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットを示す：（Ａ）プラセボ１、（Ｂ）プラセボ２、（Ｃ）プラセボ３、（Ｄ）プラセボ４、（Ｅ）プラセボ５、（Ｆ）プラセボ６、（Ｇ）プラセボ７、及び（Ｈ）プラセボ８。

【図26G】実施例５．１に記載される、Ｔ０における全てのプラセボの後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットを示す：（Ａ）プラセボ１、（Ｂ）プラセボ２、（Ｃ）プラセボ３、（Ｄ）プラセボ４、（Ｅ）プラセボ５、（Ｆ）プラセボ６、（Ｇ）プラセボ７、及び（Ｈ）プラセボ８。

【図26H】実施例５．１に記載される、Ｔ０における全てのプラセボの後方散乱を用いた粒子サイズ分布のプロットを示す：（Ａ）プラセボ１、（Ｂ）プラセボ２、（Ｃ）プラセボ３、（Ｄ）プラセボ４、（Ｅ）プラセボ５、（Ｆ）プラセボ６、（Ｇ）プラセボ７、及び（Ｈ）プラセボ８。

【図27A】実施例５．１に記載される、２５℃での１ヶ月後の後方散乱を用いた製剤のプロットを示す：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図27B】実施例５．１に記載される、２５℃での１ヶ月後の後方散乱を用いた製剤のプロットを示す：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図27C】実施例５．１に記載される、２５℃での１ヶ月後の後方散乱を用いた製剤のプロットを示す：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図27D】実施例５．１に記載される、２５℃での１ヶ月後の後方散乱を用いた製剤のプロットを示す：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図27E】実施例５．１に記載される、２５℃での１ヶ月後の後方散乱を用いた製剤のプロットを示す：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図27F】実施例５．１に記載される、２５℃での１ヶ月後の後方散乱を用いた製剤のプロットを示す：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図27G】実施例５．１に記載される、２５℃での１ヶ月後の後方散乱を用いた製剤のプロットを示す：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【図27H】実施例５．１に記載される、２５℃での１ヶ月後の後方散乱を用いた製剤のプロットを示す：（Ａ）製剤１、（Ｂ）製剤２、（Ｃ）製剤３、（Ｄ）製剤４、（Ｅ）製剤５、（Ｆ）製剤６、（Ｇ）製剤７、及び（Ｈ）製剤８。

【発明を実施するための形態】

【0024】

改善された安定性を有し、かつ、ウイルスベクターの凝集が低減されたウイルスベクター製剤が本明細書に記載される。安定性の増加及び凝集の低減により、製剤は、保存、輸送、及び投与が容易になる。ウイルスベクター製剤の安定性を増加させ、かつ、ウイルスベクターの凝集を低減させる方法も本明細書に記載される。

【0025】

本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、単語「ａ」又は「ａｎ」は、単語「含む」と併せて使用される場合、１つ又は１つ超を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」又は「更なる」は、少なくとも第２の又はそれ以上を意味し得る。

【0026】

本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、その値の決定に用いられる方法／デバイスでの誤差の固有の変動又は研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、「約」という用語は、状況に応じて、およそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％未満、又はそれ以上の変動を包含することを意味する。実施形態では、当業者は、「約」という用語によって示される変動のレベルを本明細書で使用される文脈により理解するであろう。「約」という用語の使用はまた、具体的に記載される値を含むことも理解されるべきである。

【0027】

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されるか、又は選択肢が互いに排他的でない限り、「及び／又は」を意味するように使用されるが、本開示は、選択肢のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

【0028】

本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の変形若しくは形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の変形若しくは形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の変形若しくは形態）、又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（並びに「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の変形若しくは形態）という用語は、包含的又はオープンエンドであり、追加の、記載されていない要素又は方法ステップを除外しない。

【0029】

「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語及びその対応する略語「例えば（ｅ．ｇ．）」（斜体であるかどうかにかかわらない）の使用は、別段で明示的に記載されない限り、記載された特定の用語が、参照又は引用される特定の例に限定されることを意図しない、本開示の代表的な例及び実施形態であることを意味する。

【0030】

本明細書で使用される場合、「間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」は、範囲の末端を含む範囲である。例えば、ｘとｙとの間の数には、ｘ及びｙの数、並びにｘとｙとの範囲に入る任意の数が明示的に含まれる。

【0031】

球状タンパク質製剤
本開示は、改善された安定性及び低減されたベクター凝集を有する球状タンパク質を含むウイルスベクター製剤を提供する。実施形態では、本開示は、ウイルスベクター、緩衝液、及び球状タンパク質を含む製剤を提供する。

【0032】

実施形態では、球状タンパク質は、ウイルスベクター製剤中のウイルス凝集を低減するのに好適な任意の球状タンパク質であり得る。実施形態では、製剤は、２種以上の球状タンパク質を含む。球状タンパク質という用語は、形状が比較的球形である水溶性タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、球状タンパク質という用語は、相当な数のαヘリックス及び／又はβシート、例えば、２、３、４、５、６、７、若しくは８つのαヘリックス及び／又は２、３、４、５、６、７、若しくは８つのβシートを有するタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、αヘリックス及び／又はβシートは、コンパクトな構造に折り畳まれる。いくつかの実施形態では、球状タンパク質は、疎水性アミノ酸側鎖及び親水性アミノ酸側鎖を含み、疎水性アミノ酸側鎖の殆どは、球状タンパク質の内部に埋入され（すなわち、水と相互作用することができない）、親水性アミノ酸側鎖の大部分は、球状タンパク質の表面上にある（すなわち、水と相互作用することができる）。いくつかの実施形態では、球状タンパク質は、疎水性アミノ酸側鎖を含み、疎水性アミノ酸側鎖の６０％、７０％、８０％、又は９０％が、球状タンパク質の内部に埋入される。いくつかの実施形態では、球状タンパク質は、親水性アミノ酸側鎖を含み、６０％、７０％、８０％又は９０％親水性アミノ酸側鎖が、球状タンパク質の内部に埋入される。いくつかの実施形態では、球状タンパク質は、１、２、３つ、又はそれ以上のジスルフィド結合を有する。いくつかの実施形態では、球状タンパク質は、１つより大きいポリペプチドを含み、例えば、球状タンパク質は、三次元構造を堅固にする２、３、又は４つのポリペプチドを含む。実施形態では、球状タンパク質は、実質的に変性しておらず、すなわち、球状タンパク質は、その三次元構造を実質的に保持する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ウイルスベクター、緩衝液、及び球状タンパク質を含む製剤であって、製剤が、天然状態の球状タンパク質を維持するのに好適であり、すなわち、球状タンパク質が、実質的に変性されない、製剤を提供する。

【0033】

いくつかの実施形態では、球状タンパク質は、１０ｋＤａ～１２００ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約１２００ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約１０００ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約７００ｋＤａ、約４０ｋＤａ～約５００ｋＤａ、約５０ｋＤａ～約２５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ～約２００ｋＤａ、約５０ｋＤａ～約１５０ｋＤａ、又は約５０ｋＤａ～約１００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、球状タンパク質は、７００ｋＤａ～１２００ｋＤａ、８００ｋＤａ～１２００ｋＤ、９００ｋＤａ～１２００ｋＤａ、又は１０００ｋＤａ～１２００ｋＤａの分子量を有する。

【0034】

いくつかの実施形態では、球状タンパク質は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～約１２０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ～約９０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬ、又は約４０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬ溶解度を有する。

【0035】

実施形態では、球状タンパク質は、アルブミン、α－フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、アファミン、グロビンタンパク質、αグロブリン、βグロブリン、γグロブリン、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、球状タンパク質は、水溶性球状タンパク質である。実施形態では、球状タンパク質は、アルブミンである。実施形態では、球状タンパク質は、血清アルブミンである。実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、又はラクトアルブミンである。実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。実施形態では、アルブミンは、ウシ血清アルブミンである。

【0036】

実施形態では、製剤は、約０．１％～約５．０％の球状タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約０．５％～約２．０％の球状タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約０．７５％～約１．５％の球状タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約０．８％～約１．２％の球状タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約１．０％の球状タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、又は５．０％の球状タンパク質を含む。

【0037】

実施形態では、製剤は、液体又はゲルである。実施形態では、製剤は、液体である。実施形態では、製剤は、液体又はゲルから凍結乾燥される。実施形態では、製剤は、凍結乾燥形態から再構成される。

【0038】

実施形態では、本開示は、ウイルスベクター、緩衝液、及びアルブミンを含む製剤を提供する。

【0039】

実施形態では、製剤は、１種を超えるアルブミンを含む。実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、又はラクトアルブミンである。実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。実施形態では、アルブミンは、ウシ血清アルブミンである。

【0040】

実施形態では、製剤は、約０．１％～約５．０％のアルブミンを含む。実施形態では、製剤は、約０．５％～約２．０％のアルブミンを含む。実施形態では、製剤は、約０．７５％～約１．５％のアルブミンを含む。実施形態では、製剤は、約０．８％～約１．２％のアルブミンを含む。実施形態では、製剤は、約１．０％のアルブミンを含む。実施形態では、製剤は、約０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、又は５．０％のアルブミンを含む。

【0041】

実施形態では、アルブミンを含む製剤は、液体又はゲルである。実施形態では、製剤は、液体である。実施形態では、製剤は、液体又はゲルから凍結乾燥される。実施形態では、製剤は、凍結乾燥形態から再構成される。

【0042】

多糖製剤
他の実施形態では、本開示は、ウイルスベクター、緩衝液、及び多糖を含む製剤を提供する。

【0043】

実施形態では、多糖は、ウイルスベクター製剤中のウイルス凝集を低減するのに好適な任意の多糖であり得る。実施形態では、製剤は、１種を超える多糖を含む。実施形態では、多糖は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヘパラン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、アルギン、キトサン、キトサン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、多糖は、グリコサミノグリカンである。実施形態では、多糖は、ケラタン硫酸である。実施形態では、多糖は、ヒアルロン酸ナトリウムである。

【0044】

本明細書で使用される場合、「ヒアルロン酸ナトリウム」という用語は、共役塩基形態のヒアルロン酸塩及び酸形態のヒアルロン酸の両方を含む。

【0045】

実施形態では、製剤は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．１５ｎｇ／ｍＬ～約０．２５ｍｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．２ｎｇ／ｍＬの多糖を含む。実施形態では、製剤は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．１５ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．２５ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．３５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．４５ｎｇ／ｍＬ、又は０．５ｎｇ／ｍＬの多糖を含む。

【0046】

実施形態では、製剤は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬグリコサミノグリカンを含む。実施形態では、製剤は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬグリコサミノグリカンを含む。実施形態では、製剤は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬグリコサミノグリカンを含む。実施形態では、製剤は、約０．１５ｎｇ／ｍＬ～約０．２５ｍｇ／ｍＬグリコサミノグリカンを含む。実施形態では、製剤は、約０．２ｎｇ／ｍＬのグリコサミノグリカンを含む。実施形態では、製剤は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．１５ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．２５ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．３５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．４５ｎｇ／ｍＬ、又は０．５ｎｇ／ｍＬのグリコサミノグリカンを含む。

【0047】

実施形態では、製剤は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約０．１５ｎｇ／ｍＬ～約０．２５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約０．２ｎｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．１５ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．２５ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．３５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．４５ｎｇ／ｍＬ、又は０．５ｎｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む。

【0048】

実施形態では、製剤は、液体又はゲルである。実施形態では、製剤は、液体である。実施形態では、製剤は、液体又はゲルから凍結乾燥される（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）（すなわち、凍結乾燥される（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ））。実施形態では、製剤は、凍結乾燥形態から再構成される。

【0049】

組み合わせ製剤
実施形態では、本開示は、ウイルスベクター、緩衝液、球状タンパク質、及び多糖を含む製剤を提供する。実施形態では、製剤は、上記に開示される濃度の球状タンパク質及び上記に開示される濃度の多糖の両方を含む。実施形態では、製剤は、アルブミン及び多糖の両方を含む。実施形態では、製剤は、上記に開示される濃度のアルブミン及び上記に開示される濃度の多糖の両方を含む。

【0050】

実施形態では、製剤は、アルブミン及びグリコサミノグリカンの両方を含む。実施形態では、製剤は、上記に開示される濃度のアルブミン及び上記に開示される濃度のグリコサミノグリカンの両方を含む。

【0051】

組み合わせ製剤の実施形態では、多糖は、ヒアルロン酸ナトリウムである。実施形態では、製剤は、アルブミン及びヒアルロン酸ナトリウムの両方を含む。実施形態では、製剤は、上記に開示される濃度のアルブミン及び上記に開示される濃度のヒアルロン酸ナトリウムの両方を含む。

【0052】

液体及びゲル製剤
実施形態では、製剤は、緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、ゲルであり、緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、約２ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、約５ｍＭ～約５０ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、約２０ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、約５ｍＭ～約７５ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ｍＭの緩衝液を含む。

【0053】

実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約２ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約５ｍＭ～約５０ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は液体であり、製剤は、約２０ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約５ｍＭ～約７５ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭの緩衝液を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ｍＭの緩衝液を含む。

【0054】

実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液、テトラホウ酸塩緩衝液、ＭＰＯＳ緩衝液、グリシン緩衝液、又はイミダゾール緩衝液である。実施形態では、緩衝液は、リン酸ナトリウム、Ｌ－ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせである。

【0055】

実施形態では、製剤は、糖を更に含む。実施形態では、製剤は、液体であり、糖を更に含む。実施形態では、製剤は、ゲルであり、糖を更に含む。実施形態では、製剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、約１００ｍＭ～約４００ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、約２５０ｍＭ～約３５０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、約２９０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、約５０ｍＭ～約４００ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、約１００ｍＭ～約３４０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、約２００ｍＭ～約３４０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、約２４０ｍＭ～約３４０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、約２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、３００ｍＭ、３１０、ｍＭ、３２０ｍＭ、３３０ｍＭ、３４０ｍＭ、３５０ｍＭ、３６０ｍＭ、３７０ｍＭ、３８０ｍＭ、３９０ｍＭ、又は４００ｍＭの糖を含む。

【0056】

実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約１００ｍＭ～約４００ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約２５０ｍＭ～約３５０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は液体であり、製剤は約２９０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約５０ｍＭ～約４００ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約１００ｍＭ～約３４０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約２００ｍＭ～約３４０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約２４０ｍＭ～約３４０ｍＭの糖を含む。実施形態では、製剤は液体であり、製剤は、約２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、３００ｍＭ、３１０、ｍＭ、３２０ｍＭ、３３０ｍＭ、３４０ｍＭ、３５０ｍＭ、３６０ｍＭ、３７０ｍＭ、３８０ｍＭ、３９０ｍＭ、又は４００ｍＭ糖を含む。

【0057】

実施形態では、糖は、単糖類、二糖類、又は三糖類である。実施形態では、糖は、デキストロース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、リブロース、マンノース、スクロース、トレハロース、セロビオース、キトビオース、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、糖は、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、糖は、スクロースである。

【0058】

実施形態では、製剤は、界面活性剤を更に含む。実施形態では、製剤は液体であり、界面活性剤を更に含む。実施形態では、製剤は、ゲルであり、界面活性剤を更に含む。実施形態では、製剤は、約０．０１％～約０．１％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、約０．０１５％～約０．０２５％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、約０．０２％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、約０．０５％～約０．５０％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、約０．０５％～約０．３％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、約０．１％～約０．３％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、又は０．３％の界面活性剤を含む。

【0059】

実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約０．０１％～約０．１％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約０．０１５％～約０．０２５％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約０．０２％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約０．０５％～約０．５０％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約０．０５％～約０．３％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約０．１％～約０．３％の界面活性剤を含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、又は０．３％の界面活性剤を含む。

【0060】

当該技術分野で既知の様々な界面活性剤であり、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、又は両性イオン性界面活性剤を含むことができる。

【0061】

いくつかの一般的に遭遇する各種界面活性剤には、

【0062】

イオン性界面活性剤：ｉ）陰イオン性界面活性剤（典型的には、硫酸塩、スルホン酸塩、又はカルボキシン酸塩アニオンに基づく）、例えば、α－オレフィン硫酸塩、アンモニウムオクチル／デシルエーテル硫酸塩、スルホコハク酸ナトリウム、トリデシルエーテル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、グリオコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシン、アルキル硫酸塩、特に、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属アルキル硫酸塩、又はラウリル硫酸アンモニウム；ラウレス硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、デオキシコール酸アルカリ若しくはアルカリ土類塩又はデオキシコール酸、リン酸エステル及び塩、ｉｉ．）カチオン性界面活性剤、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド又は他のアルキルトリメチルアンモニウム塩などの四級アンモニウムカチオン、ステアリルアミン酢酸塩又はココナッツアルキルアミン酢酸塩などのアルキルアミン塩、塩化及び臭化ベンザルコニウム、例えば、塩化ベンゼトニウム又は塩化メチルベンゼトニウム、ステアリルアミンポリグリコールエーテル又はオレイルアミンポリグリコールエーテルに基づくカチオン性界面活性剤が挙げられる。。

【0063】

両性イオン（両性）界面活性剤、例えば、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミノキシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＢｉｇＣＨＡＰ、ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ（Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン）、ラウリルジメチルアミンオキシド、ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－０８、ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１０、ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１２、ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１４、ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３－１６など、又は非イオン性界面活性剤、例えば、アルキルポリエチレンオキシド、オクチルグリコシド及びデシルマルトシドを含むアルキルポリグリコシド、例えば、ノニデット（ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ１０又はノニデット（ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０界面活性剤、ＭＥＧＡ－８、ＭＥＧＡ－９又はＭＥＧＡ－１０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００及び関連する界面活性剤、又はＴｗｅｅｎファミリーの界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＡＰＯ－１０、ＡＰＯ－１２、Ｃ_８Ｅ_６、Ｃｉ_０Ｅ_６、Ｃｉ_２Ｅ_６、Ｃｉ_２Ｅ_８、Ｃｉ_２Ｅ_９、Ｃｉ_２Ｅ_１０、Ｃｉ_６Ｅｉ_２、Ｃｉ_６Ｅ_２Ｉ、ヘプタン－１，２，３－トリオール、ルブロール（ｌｕｂｒｏｌ）ＰＸ、ゲナポール（ｇｅｎａｐｏｌ）ファミリー、ｎ，－ドデシル－ｂ－Ｄ－グルコピラノシド、テシット（ｔｈｅｓｉｔ）、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ファミリー。

【0064】

いくつかの実施形態では、界面活性剤は、少なくとも２つの界面活性剤の組み合わせである。好ましくは、１つの界面活性剤は、カチオン性界面活性剤であり、少なくとも１つの更なる界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、カチオン性界面活性剤としてのセチルトリメチルアンモニウムブロミドと、非イオン性界面活性剤としてのポリソルベート、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｗｅｅｎ８０との組み合わせである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムブロミドではない。

【0065】

いくつかの実施形態では、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤である。実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、又はＫｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８である。

【0066】

実施形態では、製剤は、塩化ナトリウムを更に含む。実施形態では、製剤は、液体であり、塩化ナトリウムを更に含む。実施形態では、製剤は、ゲルであり、塩化ナトリウムを更に含む。実施形態では、製剤は、約１０ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、約５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、又は２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。

【0067】

実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約１０ｍＭ～約５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は液体であり、製剤は約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。実施形態では、製剤は、液体であり、製剤は、約５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、又は２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
凍結乾燥（Ｆｒｅｅｚｅ－Ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））製剤

【0068】

実施形態では、製剤は、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））固体である。凍結乾燥固体は、本明細書に記載のプロセスを含む、当該技術分野で既知のプロセスを使用して作製することができる。

【0069】

実施形態では、凍結乾燥固体は、緩衝液を含む。実施形態では、緩衝液は、リン酸ナトリウム、Ｌ－ヒスチジン、トリス、コハク酸塩、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、凍結乾燥製剤は、糖を更に含む。実施形態では、糖は、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、糖は、スクロースである。

【0070】

実施形態では、凍結乾燥製剤は、界面活性剤を更に含む。実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、又はＫｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８である。

【0071】

実施形態では、凍結乾燥製剤は、塩化ナトリウムを更に含む。

【0072】

実施形態では、凍結乾燥製剤は、本明細書に記載される液体又はゲル製剤を凍結乾燥することによって製造される。実施形態では、凍結乾燥製剤は、本明細書に記載される液体又はゲル製剤を形成するように再構成される。実施形態では、凍結乾燥製剤は、本明細書に記載される液体又はゲル製剤を形成するように水中で再構成される。
製剤の特性

【0073】

実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルス粒子中にある。したがって、いくつかの実施形態では、ウイルスベクターという用語は、ウイルスベクターに関連する、例えば、ウイルスベクターを包含する、タンパク質カプシド粒子を含むことができる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、感染性ウイルス粒子中にあり、すなわち、宿主生物に感染することができる。完全な明確性のために、本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、ウイルスベクターという用語は、ウイルス粒子、例えば、感染性ウイルス粒子を含むことができる。したがって、本明細書に記載の製剤又は方法におけるウイルスベクターへの言及は、ウイルス粒子、例えば、感染性ウイルス粒子を含むことができる。

【0074】

実施形態では、製剤は、ウイルスベクター製剤を評価するための当該技術分野における標準技術を使用して測定される特性を有する。実施形態では、製剤について、Ｚ平均値が測定される。本明細書で使用される「Ｚ平均値」という用語は、溶液中の粒子の強度加重平均流体力学的サイズである。実施形態では、ウイルスベクター製剤中のより大きな粒子の存在は、ベクター凝集を示すことができる。Ｚ平均値を測定するための方法は、本明細書に記載されている。実施形態では、Ｚ平均値は、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して測定される。実施形態では、Ｚ平均値は、多角度動的光散乱（ＭＡＤＬＳ）を使用して測定される。実施形態では、Ｚ平均値は、ナノトラッキング分析を使用して測定される。

【0075】

実施形態では、製剤は、約５０ｎｍ以下のＺ平均値を有する。実施形態では、製剤は、約４０ｎｍ以下のＺ平均値を有する。実施形態では、製剤は、約３１ｎｍ以下のＺ平均値を有する。実施形態では、製剤は、約２５ｎｍ以下のＺ平均値を有する。実施形態では、製剤は、約２０ｎｍ以下のＺ平均値を有する。

【0076】

実施形態では、製剤について、多分散性指数（ＰＤＩ）が測定される。本明細書で使用される「多分散性指数」という用語は、サイズに基づく試料の不均一性の尺度である。実施形態では、ウイルスベクター製剤中の異種粒子の存在は、ウイルスベクター凝集を示すことができる。多分散性指数を測定するための方法は、本明細書に記載されている。実施形態では、多分散性指数は、動的光散乱を使用して測定される。実施形態では、多分散性指数は、サイズ排除クロマトグラフィー、例えば、ゲル透過クロマトグラフィーを使用して測定される。実施形態では、多分散性指数は、質量分析法を使用して測定される。

【0077】

実施形態では、製剤は、約０．５以下の多分散性指数を有する。実施形態では、製剤は、約０．３５以下の多分散性指数を有する。実施形態では、製剤は、約０．３以下の多分散性指数を有する。

【0078】

ウイルスベクター
製剤中のウイルスベクターは、当該技術分野で既知の任意のウイルスベクターであり得る。実施形態では、製剤は、１種を超えるウイルスベクターを含む。実施形態では、製剤は、同じタイプの１種を超えるウイルスベクターを含み、ウイルスベクターの各々は、異なる核酸配列を含む。

【0079】

実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はハイブリッドベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、又はＡＡＶ８のアデノ随伴ウイルスベクターである。

【0080】

実施形態では、本開示は、約１０×１０^８ｖｇ／ｍＬ（１ｍＬ当たりのウイルスゲノム）～約１０×１０^１３ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む製剤を提供する。実施形態では、製剤は、約１０×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１１ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。実施形態では、製剤は、約１０×１０^５ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１５ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。実施形態では、製剤は、約１０×１０^６ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１４ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。実施形態では、製剤は、約１０×１０^７ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１３ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。実施形態では、製剤は、約１０×１０^８ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１２ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。実施形態では、製剤は、約１０×１０^５ｖｇ／ｍＬ、１０×１０^６ｖｇ／ｍＬ、１０×１０^７ｖｇ／ｍＬ、１０×１０^８ｖｇ／ｍＬ、１０×１０^９ｖｇ／ｍＬ、１０×１０^１０ｖｇ／ｍＬ、１０×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、１０×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１０×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、１０×１０^１４ｖｇ／ｍＬ、又は１０×１０^１５ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。

【0081】

対象への投与
実施形態では、製剤は、哺乳動物に投与するために製剤化される。実施形態では、製剤は、ヒトへの投与のために製剤化される。実施形態では、製剤は、コンパニオン動物、例えば、イヌ又はネコに投与するために製剤化される。実施形態では、製剤は、農場動物、例えば、ウシ、ブタ、家禽、ヒツジ、ヤギ、又はウマに投与されるように製剤化される。

【0082】

ウイルスベクターの凝集を低減する方法
実施形態では、本開示は、製剤中のウイルスベクターの凝集を低減するための方法を提供する。実施形態では、本明細書に記載の製剤のいずれかにウイルスベクターを製剤化することを含む、製剤中のウイルスベクターの凝集を低減する方法。実施形態では、ウイルスベクターの凝集を低減する方法は、治療用タンパク質を製造するプロセスで使用される。実施形態では、ウイルスベクターの凝集を低減する方法は、治療用抗体を製造するためのプロセスで使用される。実施形態では、ウイルスベクターの凝集を低減する方法は、ワクチンを製造するプロセスで使用される。実施形態では、ウイルスベクターの凝集を低減する方法は、治療用タンパク質を開発するプロセスで使用される。実施形態では、ウイルスベクターの凝集を低減する方法は、治療用抗体を開発するためのプロセスで使用される。実施形態では、ウイルスベクターの凝集を低減する方法は、ワクチンを開発するためのプロセスで使用される。

【0083】

製剤
実施形態では、本開示は、
約１０×１０^８ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１３ｖｇ／ｍＬのウイルスベクター、
約５ｍＭ～約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、
約２００ｍＭ～約４００ｍＭのスクロース、及び
約０．１％～約５．０％のアルブミンを含む製剤を提供する。

【0084】

製剤の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、又はそれらの組み合わせである。実施形態では、製剤は、約１０×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１１ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はハイブリッドベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、又はＡＡＶ８のアデノ随伴ウイルスベクターである。

【0085】

実施形態では、本開示は、
約１０×１０８ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０１３ｖｇ／ｍＬのウイルスベクター、
約５ｍＭ～約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、
約２００ｍＭ～約４００ｍＭのスクロース、及び
約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．４ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを含む製剤を提供する。

【0086】

製剤の実施形態では、製剤は、約１０×１０^９ｖｇ／ｍＬ～約１０×１０^１１ｖｇ／ｍＬのウイルスベクターを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はハイブリッドベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、又はＡＡＶ８のアデノ随伴ウイルスベクターである。

【実施例】

【0087】

本明細書に記載の方法及び用途に対する他の好適な修正及び適合を、実施形態のいずれかの範囲から逸脱することなく行うことができることは、関連する技術分野の当業者には容易に明らかとなるであろう。以下の例は、例示のみを目的として本明細書に含まれ、限定することを意図するものではない。

【0088】

【表1】

【0089】

要約
背景：アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）は、遺伝子治療におけるポピュラーなベクターとして用いられている。遺伝毒性を示さずに効率的かつ安定した導入遺伝子発現を引き起こす能力に基づいて、これらのベクターは治療アプローチに有望である［１］。ＡＡＶ２ベースの遺伝子療法は既に市場に参入しているにもかかわらず、それらの製剤開発に関する報告された文献は殆どない。

【0090】

目的：本明細書では、ＡＡＶ２の特性評価に使用される分析方法の評価及び開発、並びにＡＡＶ２製剤の知識を向上及び拡大するための３ヶ月間の製剤安定性試験におけるこれらの戦略の適用を報告する。

【0091】

方法：ＡＡＶ２試料の特性評価を行うために、以下の方法を使用した：逆位末端配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）ｑＰＣＲ、ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰによるＵ２ＯＳ－ＨＴＢ－９６細胞の感染、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）、及びゼータ電位

【0092】

結果：方法評価及び開発の際、汎用ＩＴＲ ｑＰＣＲを使用したベクター定量前に、酵素ＤＮａｓｅ Ｉ及び熱カプシド開放ステップを添加したことにより、精度が向上したことが示された。ＴＥＭを使用して、完全なカプシドの５８％がベクターゲノムを含むことが決定された。導入遺伝子発現に関して、製剤安定性試験は、液体又は凍結状態で保存された試料が凍結乾燥のものよりも良好な性能を示すことを示した。異なる緩衝系を比較すると、クエン酸ナトリウム緩衝液と比較して、ベクターがＬ－ヒスチジン又はリン酸ナトリウム中に保存されるときに、導入遺伝子発現が有意に高かった。更に、発現は、保存時に、温度に依存する様式で急速に減少することが観察された。発現の変化とは対照的に、力価は研究の過程を通じて一定のままであり、攪拌ストレスによってのみ影響を受けた。更に、ベクター凝集が製剤化中に生じることが示された。１％ヒトアルブミンの添加は、凝集を防止し、発現に関するベクター安定性プロファイルを改善した。

【0093】

結論：本プロジェクトの目的は、ＡＡＶ２製剤に関する知識の向上及び拡大であった。これは、ＡＡＶ２の特性評価のためのいくつかの分析方法の評価及び開発並びにその後の製剤研究によって達成された。ＡＡＶ２の導入遺伝子発現が、製剤緩衝液、ｐＨ、及び保存条件によって影響を受けることが示された。力価の変化のようなパラメータの影響は少なかった。それにもかかわらず、製剤の安定性を更に向上させ、アルブミンの添加による凝集を防止するための戦略が提供される。

【0094】

２ 導入部
最近、遺伝子治療は臨床試験での成功により多くの注目を集めている［２］。遺伝子治療は、遺伝性疾患などのまだ満たされていない医療ニーズに対する解決策を提供する［３］。治療原理は、疾患の原因となる欠陥遺伝子の置き換え又は治療としての治療遺伝子の送達に基づいている［４］。遺伝子導入を促進するために、いくつかの異なるベクターが使用される。ウイルスベクター及び非ウイルスベクターがあり、後者は物理的方法、機械的方法、化学的方法に分けることができる［５］。レーザー照射、エレクトロポレーション、遺伝子銃の使用などの物理的方法は劇的に改善されたが、それらの使用は局所投与に限定されている［６］。リポソーム及びカチオン性ポリマーなどの化学的及び合成方法は、最も成功し、かつ、広く使用されている非ウイルス担体に共通する［７］。

【0095】

レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスは、遺伝子治療に使用されるウイルスベクターの代表である［８］。図１を参照されたい。これらのベクターは、２つの群に分類することができる。第１の群は、それらのゲノムを宿主細胞染色分体に安定的に組み込むことができる。レトロウイルス、レンチウイルス、及びヘルペスウイルスは、その群のメンバーである。第２の群は、そのウイルスゲノムを染色体外スペースに沈着させる。その群の代表は、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスである［８］。レトロウイルスは、一本鎖ＲＮＡを、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる二本鎖ＤＮＡに変換することができる［９］。この永続的な組み込みにより、連続的して長期間持続する発現が可能になる。全てのレトロウイルスは、安定した組み込みを達成するために有糸分裂を必要とする［１０］。変異原性及び有糸分裂活性細胞の必要性などの欠点にもかかわらず、レトロウイルス遺伝子療法はいくつかの成功を記録している。これらは、がん細胞に対するキメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ－Ｔ）を発現するために、Ｔ細胞のエキソビボ形質導入において頻繁に適用される［１１］。別の用途は、重症複合免疫不全に対する市場に出回っているエキソビボレトロウイルス療法であるＳｔｒｉｍｖｅｌｉｓに代表される［１２］。

【0096】

最近では、臨床試験におけるレトロウイルスの使用の減少及びレンチウイルスへの移行が記録されている［１３］。レンチウイルスは、レトロウイルス科に属するが、非分裂細胞に感染する特殊な能力を有する［１４］。レンチウイルスの主要なリスクは、安全性及び効率性プロファイルを損なう免疫応答の刺激である［１５］。

【0097】

単純ヘルペスウイルス１型は、中枢神経系内の疾患を治療すること及びがん細胞の溶解について調査されている［１６］。

【0098】

アデノウイルスは、そのゲノムを染色体外に送達するウイルスベクターの第２の群のメンバーを表す。レンチウイルスと同様に、アデノウイルスは非分裂細胞に感染することができる。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡを含む［１７］。アデノウイルスベクターの利点は、その高い形質導入及び発現効率である。その高い免疫原性は、主な欠点である［１８］。

【0099】

しかしながら、このような有望なウイルス療法の開発の経路は困難である。１９９９年に、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を有する最初の患者が組換えアデノウイルスで治療され、多臓器不全を引き起こす重度の免疫応答を経験した後に死亡した［１９］。２０００年の別の研究では、重症複合免疫不全を有する４人の子供が、ＣＤ３４＋細胞をレトロウイルスでエキソビボ治療した後に白血病のようなＴ細胞増殖を発症した［２０］。

【0100】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の発見及び開発により、遺伝子療法の分野は飛躍的進歩を経験した。分裂細胞及び非分裂細胞に感染し、遺伝毒性又は重度の免疫応答を引き起こすことなく安定したインビボタンパク質発現を引き起こすそれらの能力は、現時点で最も有望なウイルスベクターとなる。多くのＡＡＶ療法は、臨床試験及び市場に移行している［２１］。

【0101】

２０１２年に、Ｇｌｙｂｅｒａという名前の最初のＡＡＶベースの遺伝子療法が認可されて上市した。これは、遺伝性家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症を治療するために開発された。臨床研究により、このＡＡＶ１ベースの療法が、最大１４週間にわたって血液中のトリグリセリド濃度を有意に低下させることを示された。これは、膵炎及び腹痛の発生率の低下を伴う［２２］。２０１８年に、Ｇｌｙｂｅｒａは、長期的な有効性が不十分であり、かつ、商用利用の可能性がないため、市場から撤退した［２３］。２０１７年に、Ｌｕｘｔｕｒｎａの認可によって、遺伝子療法における画期的な進歩がもたらされた。これは、欠損した遺伝子を送達して網膜染料上皮タンパク質を産生する、ＡＡＶ２ベースの遺伝子療法である［２４］。この療法は、網膜ジストロフィーを治療するためにＳｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発された［１３］。最も最近では、ＡｖｅＸｉｓが、脊髄性筋萎縮症に対する１回用量治療である遺伝子療法ＺｏｌｇｅｎｓｍａについてＦＤＡの認可を受けた。この疾患は、運動神経細胞生存ニューロン１遺伝子（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏ ｎｅｕｒｏｎ １ ｇｅｎｅ）の変異又は欠失によって生ずる。Ｚｏｌｇｅｎｓｍａは、欠失又は欠損した遺伝子を骨格筋に送達するためにＡＡＶ９ベクターを利用している［２５］。その高い価格は多くの否定的な見出しを飾ったが、この療法の成功は、他のウイルス遺伝子療法の概念を証明する重要な出来事である［２６］。

【0102】

【表2】

【0103】

２．１ アデノ随伴ウイルス
その成功及び有望な特性により、ＡＡＶベクターは現在、ウイルス遺伝子療法の研究対象となっている。ＡＡＶに関する知識は長年にわたって著しく増加したが、ＡＡＶの製剤開発に関する文献は殆ど報告されていない。ＡＡＶ製剤開発の分野での少ない寄稿、並びにそれらの分子組成物及び感染経路は、次のセクションで更に詳述される。

【0104】

Ｃｒｏｙｌｅ及びその同僚は、この分野に最初の貢献をした。彼らは、ＡＡＶ及びアデノウイルス安定性研究を実施し、ウイルスベクターの安定性に影響を及ぼすいくつかのプロセス要因及び賦形剤を同定した。凍結乾燥した場合にＡＡＶがかなり安定することが観察された。最大３ヶ月間にわたって２５℃で保存した場合、感染力価の喪失は観察されなかった。ＡＡＶ製剤を－８０℃に凍結させると、－２０℃に凍結するよりも大きな感染力価の損失がもたらされた。彼らによると、この損失は凍結時のｐＨ低下と関連している。しかしながら、賦形剤及び緩衝液を適切な選択することにより、－８０℃、－２０℃、２～８℃、２５℃で５ヶ月以上保存した場合、安定したＡＡＶ感染力価となる［２７］。

【0105】

別のグループは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の適切な出荷及び保存温度に関する第２の研究を発表した。彼らは、－８０℃、－２０℃、２～８℃、２５℃、及び３７℃などの異なる保存温度がインビトロ及びインビボでの形質導入効率に及ぼす影響を調べた。－８０℃で保存されたウイルスストックは、ＡＡＶを凍結保護剤なしで保存したにもかかわらず、最大１ヶ月間にわたって安定したままであり、形質導入効率の損失を記録しなかった。温度の上昇に伴い、形質導入効率は低下する。特に保存初期では、３７℃などの高い温度は、２５℃の保存温度と比較して大きな形質導入効率の低下をもたらす。更に、研究では、形質導入効率が急速に低下したにもかかわらず、３７℃で保存してもウイルスの一部が感染性を保つことが示された［２８］。

【0106】

より最近の研究では、異なるＡＡＶ保存温度、緩衝溶液、及び異なる臨床材料の適合性が試験された。彼らは、ベクターコピー数及び導入遺伝子発現がベクター安定性のマーカーとして使用した。導入遺伝子発現のインビボでの低下は、ＡＡＶを７２℃に２０分間加熱した後、又はＵＶ光でＡＡＶを１０分間曝露した後にのみ見られた。２０分間にわたる５５℃などの温度又は４回の凍結融解サイクルは、導入遺伝子発現に影響を及ぼさなかった。彼らはまた、補体タンパク質を含むヒト血清をＡＡＶ１ベクターに曝露した。そのような状態によっても導入遺伝子発現のいかなる損失も生じなかったが、集団の７０％超がＡＡＶ１免疫を有する。並行して、頻繁に使用される臨床材料及び希釈剤を用いて適合性試験を行った。導入遺伝子発現に対するステンレス鋼針並びにポリエチレン及びガラス表面の影響を試験した。更に、リン酸緩衝液、乳酸リンゲル溶液、及びガドリニウムなどの臨床用途のために頻繁に使用される異なる希釈剤が調べられた。材料も希釈剤も、導入遺伝子発現の低下をもたらさなかった。５．５～８．５の範囲の異なるｐＨでさえ、発現に影響を及ぼさなかった［２９］。

【0107】

上記の研究は全て、感染力価又は形質導入効率のみをモニタリングした。追加の物理化学的特性評価は行われなかった。

【0108】

Ｗｒｉｇｈｔ及びその同僚は、ベクター凝集を更にモニタリングした研究を発表した。対称的なカプシド構造及び逆荷電カプシドポケット間の追加のイオン相互作用は、低いＡＡＶ溶解性をもたらす。したがって、凝集は、力価＞１０^１４ｖｇ／ｍＬの高力価製剤において頻繁に生じる。しかしながら、凝集は、凍結融解サイクルに曝露されたときに非常低い力価でも観察された。彼らは、主に塩であるいくつかの賦形剤が、ベクター凝集を防止することができることを示した。この効果は、イオン強度によって引き起こされ、特定のイオン種に依存しない。荷電アミノ酸は、例えば、特定の塩と同じイオン強度でのみ凝集を防止することができた。更に、この刊行物では、ＡＡＶの精製プロセスがベクター凝集に重要な影響を有することが示された。精製後のヌクレアーゼ処理は、ベクター凝集を著しく低減した。この所見は、残存宿主細胞タンパク質及びＤＮＡ断片がカプシド間のイオン結合を促進することを示唆する。高イオン強度製剤は、形質導入効率及び導入遺伝子発現に負の影響を及ぼさなかった［３０］。

【0109】

ＡＡＶの安定性に影響を与える特性をよりよく理解するために、カプシド構造及び特徴をより深く掘り下げる必要がある。アデノ関連ウイルスは、パルボウイルス科のメンバーである［３１］。それらは、約２５ｎｍの直径を有する６０個のタンパク質からなる２０面体カプシドを有する［３２］。ＡＡＶカプシドは、約６．３の等電点を有する。殆どの血清型の三次元構造は、低温電子顕微鏡法によって解明されている［３３］。ＡＡＶ２の場合、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３という名称の構造タンパク質が、それぞれ１：１：１０の比率でカプシドを構成する。ＶＰ３は、最も豊富にあるカプシドタンパク質であるだけでなく、他の構造タンパク質よりもＮ末端上で６５アミノ酸短い［３４］。ＶＰ１及びＶＰ２は、細胞の感染を成功させるために重要であるようである。Ｎ末端には、それらは、ホスホリパーゼＡ_２（ＰＬＡ_２）及びカプシド内に埋入された核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含む。ＶＰ１／２カプシドタンパク質の欠失及びそのＰＬＡ_２ドメインの変異によって、カプシド構造がインタクトなままであっても、ウイルスは形質導入性を失う［３５］。形質導入の成功のためには、埋込されたＰＬＡ_２及びＮＬＳを外在化させる必要がある。外在化は、５倍対称軸のチャネルを通して行われる。この孔はかなり小さいため、嵩高いＶＰ２Ｎ末端が外在化している可能性は低い［３６］。正確には１２個の孔がＡＡＶ２カプシド上に位置している。孔形成アミノ酸の変異又は欠失によって、ＰＬＡ_２活性の低下及びＶＰ１ Ｎ末端外在化が生じていないか、又はそれらの低下のみが生じることが示された。このような変異は、受容体媒介性カプシドの取り込みには影響を及ぼさなかったが、ウイルス感染性に強い影響を及ぼした［３７］。より最近の研究では、ｐＨの変化によってＶＰ１Ｎ末端の立体構造変化が誘発され得ることが示されている。７．５から５へのｐＨ低下によって、ＶＰ１Ｎ末端の可逆的なコンフォメーション変化及び外在化が引き起こされ、これにより、エンドソーム脱出が可能になる。細胞がエンドソームｐＨを低く保つことを防止するＨ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤であるバフィロマイシンＡ１で細胞を処理した場合、エンドソーム脱出は生じなかった。これは、エンドソーム脱出を促進するためには低ｐＨ環境であることの必要性を示している［３３］。ｐＨ誘発性立体構造変化と同様に、温度上昇は、ＶＰ１外在化を引き起こすことができる。ＡＡＶカプシドの熱安定性を詳細に調べると、カプシド融解温度が、最も安定性の高いＡＡＶ血清型と最も安定性の低いＡＡＶ血清型との間で２０℃を超えて異なることが示された。ＡＡＶ５は、７０℃の融解温度を有する最も安定していないＡＡＶ２と比較して、９０℃の融解温度を有する最も安定した血清型である。実験では、ＶＰ１は、熱安定性に寄与せず、埋包された表面積も、一次アミノ酸配列も寄与しないことが示された。カプシドのＸ線結晶構造分析により、ＡＡＶ２血清型が、ＡＡＶ５と比較して非常にフレキシブルなタンパク質複合体であることが明らかとなり、これは、カプシド融解温度の低下を説明することができる。しかしながら、熱安定性の大きな違いについての明確な説明がまだ懸案中である。それにもかかわらず、これらの知見は、カプシドの特性評価に重要な価値を付加する［３２］。

【0110】

カプシドは、ゲノムの保護に関与するだけでなく、細胞のウイルス取り込みにも重要である。受容体媒介性クラスリンエンドサイトーシスは、取り込みに関与する［３８］。２時間後、ウイルスゲノムは既に核内に位置している［３９］。血清型は、異なる特定の受容体に結合し、これは組織トロピズムを明確にしている［２１］。アデノ随伴ウイルス２は、細胞に侵入するために、主にヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を用いる。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦＲ）、ラミニン受容体、及びインテグリンα_Ｖβ_１／α_Ｖβ_５などの４つの共受容体は、取り込みを支援することが知られている［４０］。ＨＳＰＧをノックアウトすることにより、ＡＡＶ２に対する感染抵抗性が生じた［４１］。一方、ＦＧＦＲ１受容体のノックアウトは、宿主細胞感染に有意な影響を及ぼさなかった［４２］。ＡＡＶ４はＡＡＶ５と５３％の配列相同性しか共有しないが、両方とも、細胞に入るためにシアル酸を必要とする［２１］。より最近の研究は、新たに発見された受容体 ＫＩＡＡ０３１９Ｌの重要性を示す。ＫＩＡＡ０３１９Ｌノックアウト細胞は、全てのＡＡＶ感染に抵抗性であった［４２］。しかしながら、血清型特異的受容体相互作用は、ＡＡＶ組織トロピズムの原因となる［４］。

【0111】

ＡＡＶ安定性は、カプシドタンパク質だけでなく、ゲノム長、浸透圧、及び環境のｐＨによっても影響を受ける。小さいゲノムサイズを有するＡＡＶは、より高いＤＮＡ放出温度を有する。ベクターＤＮＡとカプシドのヒスチジン残基との生相互作用の発生は、より低いｐＨにおける安定化効果の原因となり得る。低ｐＨでのこれらの追加の相互作用は、エンドソームにおいてウイルスを保護し、安定化し得る［４３］。これは、カプシド構造がウイルスの安定性に寄与するだけでなく、カプシド遺伝子相互作用も重要であることを示している。ＡＡＶのゲノム構造を調べることは特に価値がある。

【0112】

ｗｔＡＡＶには、４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡがパッケージングされる［４４］。ゲノムは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む［４５］。Ｒｅｐ ＯＲＦは、転写調節及びウイルス複製に関与する４つのタンパク質をコードする。異なるＲｅｐタンパク質の発現は、スプライシングによって制御される。スプライシングされたＲＮＡは、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０をコードし、スプライシングされていないＲＮＡは、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７２をコードする［４６］。Ｃａｐ ＯＲＦは、３つの構造カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３をコードする［４７］。アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）は、Ｃａｐ遺伝子上に位置し、異なるリーディングフレームで転写されるため、第３のＯＲＦを表す［４５］。逆位末端配列（ＩＴＲ）を形成する１４５塩基対の長いＴ字型ヘアピンは、両方の遺伝子に隣接している［４８］。ＩＴＲは、ＤＮＡポリメラーゼ結合を可能にするため、ベクター複製に不可欠である［４９］。これらの配列の他に、ＤＮＡ上に位置する３つの異なるプロモーターがある。Ｐ４０は、Ｃａｐ遺伝子の転写の誘導に関与している。Ｐ５及びＰ１９は、Ｒｅｐタンパク質転写産物を生成する［５０］。ｗｔＡＡＶと比較して、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）中のＲｅｐ及びＣａｐ遺伝子が治療用導入遺伝子及びそれぞれのプロモーターで置き換えられる。ＩＴＲ配列は保持されている［５１］。

【0113】

送達されたＡＡＶゲノムの殆どは、染色体外では環状形態で保存されている［５２］。ベクターＤＮＡの最大９９．５％は、エピソーム形態で見出すことができ、宿主染色体に組み込まれていない［５３］。小さな割合が、ヒト染色体１９の特定の遺伝子座に組み込まれる［５４］。

【0114】

以下のセクションでは、多様なＡＡＶ特性評価に使用される分析方法を詳述する。
２．２ 分析方法
２．２．１ 定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）による強度及び用量決定

【0115】

送達されるウイルスゲノムの数は、通常、治療効果と相関する［５６］。したがって、力価測定は、用量評価のための重要なアッセイである［５７］。定量リアルタイムＰＣＲ、サザンブロッティング、及び紫外分光光度法を含む、力価決定のためのいくつかの方法が存在する［５５］。紫外分光光度法は速くて経済的なアプローチであるが、その精度が欠点である。宿主細胞の不純物、緩衝液、及び賦形剤は、この技術の精度を損なう［５８］。

【0116】

ｑＰＣＲを用いたＤＮＡアンプリコンの定量化には、二本鎖ＤＮＡに結合し、蛍光に開始するＳＹＢＲ－緑色染料、又はｓｓＤＮＡに結合し、ＤＮＡ－ポリメラーゼによる除去時に蛍光に開始する標識ＴａｑＭａｎプローブのいずれかが必要である［５９］。高い価格にもかかわらず、ＴａｑＭａｎアプローチは、最も頻繁に使用される定量化アプローチである。その高い感度及び特異性によって、これは非常に信頼性の高い戦略となる。そして、高い再現性及びＴａｑＭａｎ戦略との高い同等性により、これは魅力的なアプローチとなる［６２］。ＳＹＢＲ－グリーン感度は、プライマー二量体及び二次構造の形成によって損なわれ得る［６０］。それにもかかわらず、ＳＹＢＲ－グリーンは、低価格で簡単であるために頻繁に使用されている［６１］。ＳＹＢＲ－グリーンは更に、特異性を確認するために溶融曲線ステップを必要とする［６３］。

【0117】

ｑＰＣＲ用いた力価定量化は、迅速で、処理が容易であり、かつ、広いダイナミックレンジを有するため、ウイルス力価定量化のための最も頻繁に使用される方法に進化した［５６］。多くの場合、ＩＴＲ断片がヘアピン構造を形成するため、ｑＰＣＲはウイルス力価を過小評価する［４９］。このような構造は、プライマーのアニーリングを妨げ、力価を人工的に低下させる。定量化前に試料をエンドヌクレアーゼで処理することにより、過小評価の問題が解決され、更に、アッセイ間の変動が改善される。導入遺伝子の中心内の増幅領域を標的とするアッセイは、不正確さを引き起こすＩＴＲヘアピン構造の影響を受けることが少ない［６４］。

【0118】

開発されたｑＰＣＲ戦略の殆どは、特定の導入遺伝子配列を標的化する［６５］。しかしながら、ＣＭＶプロモーターなどの一般的に使用されるプロモーターも、これらがより広い適用範囲を提供するので、有望な増幅標的である［６６］。このようなプロモーター特異的又は導入遺伝子特異的ｑＰＣＲ測定の実施は、異なる導入遺伝子又はプロモーターを有するベクターについて新たに開発される必要があるため、限定的である。

【0119】

Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ及びその同僚は、全てのＡＡＶ２に適用することができるニユバーサルＩＴＲ特異的ｑＰＣＲアプローチを開発した。プライマー及びプローブの位置は、ＩＴＲ配列内にある［６５］。これらの利点にもかかわらず、実験は、ＩＴＲ ｑＰＣＲ測定値が常にウイルス力価を過大評価し、更に、高い実験室間変動を有することを示している。系統立った過大評価は、１回切断直線化プラスミド標準物質によって生ずる。プラスミドに埋め込まれたＩＴＲの増幅効率の低下は、過大評価の原因となり得る。ＩＴＲ配列の両端で切断されたプラスミド標準物質は、この過大評価を解決する［６７］。ｑＰＣＲの欠点は、市販されている標準材料がＡＡＶ２及びＡＡＶ８のみに存在し、定量化精度がアンプリコンの二次構造に影響されることである。

【0120】

最近、ＡＡＶ力価測定に適した代替物として、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）と名付けられた新しいＰＣＲ法が登場した［６８］。その名が示すように、試料は、約２０，０００個の液滴に分けられる。これらの液滴は、従来のＰＣＲサイクルを受けて、それに応じて、染色され、フローサイトメトリーで分析される。１つ以上のＤＮＡアンプリコンを含む液滴は、陽性として分類され、空の液滴は、陰性として分類される。ポアソン統計の助けを借りて、ＤＮＡ標準を必要とせずに、ＤＮＡ分子の平均数を計算することができる［６９］。結果は、ｄｄＰＣＲが、堅牢性及びアッセイの変動に関して従来のｑＰＣＲよりも優れたＡＡＶ滴定を行ったことを示している［７０］。

【0121】

しかしながら、分析方法、増幅配列、及び蛍光染料は、ＡＡＶ滴定の精度、感度、及び堅牢性に影響を与えるだけでなく、試料調製も影響を及ぼす。Ｄｏｂｎｉｋ及びその同僚は、定量化前にＡＡＶ試料をＤＮａｓｅ Ｉとインキュベートすることによって宿主細胞ＤＮＡ残基を除去することにより、力価が著しく低下することを示している［７０］。

【0122】

２．２．２ ＴＥＭ、ＡＥＸ－ＨＰＬＣ、及びＡＵＣを用いた空のカプシドと完全なカプシドとの比率の決定
空のカプシドは、ＡＡＶ生合成中に生成される全てのカプシドのかなりの量を構成する［７１］。全てのカプシドの最大９０％が空であり得る［５５］。空のカプシドが存在する理由は不明である。ｐＨ、イオンの種類、濃度などの細胞培養条件が比率に影響を及ぼす［７２］。しかしながら、空のカプシドは、治療効果を媒介しないので望ましくない。細胞受容体に結合することによって、それらは完全なウイルスベクターの取り込みを減少させ、免疫応答を引き起こす可能性さえある［７３］。次のセクションでは、空のカプシドと完全なカプシドとの比率を定量化するための異なる方法を詳述する。

【0123】

透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）は、空のカプシドと完全なカプシドとの比率を定義するために広く使用される技術である。ＡＡＶは、酢酸ウラニルを用いたいわゆる「ネガティブ染色」によって可視化される。完全な粒子は染料を除外し、したがって白い点として現れる。一方、空のカプシドは染料を取り込み、カプシド中に暗い斑点を伴って現れる［７４］。ＴＥＭには、最小限の試料消費及び直接的な可視化などのいくつかの利点がある。それにもかかわらず、それは時間がかかり、高価であり、恣意的であり、試料調製に依存する［７３］。

【0124】

ＤＮＡを含むカプシドは、わずかに異なる表面電荷を有し、これは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）による連続溶出を可能にする。カプシドの溶出は、蛍光又は紫外線吸光度のいずれかによって検出することができる。このような測定は、完全なカプシド比と空のカプシドとの比率の迅速で、単純で、かつ非常に再現性の高い決定を可能にする［７５］。高スループット、品質管理（ＱＣ）フレンドリー性、測定の自動化、及び少容量の試料は、アニオン交換クロマトグラフィー法の大きな利点である［７６］。通常、ウイルス製剤は、低い量のタンパク質濃度を含み、これは、低いシグナル対雑音比を引き起こす。蛍光検出器を使用することにより、シグナル対雑音比を向上させることができる。このような進歩にもかかわらず、ＡＥＸ戦略は、完全なカプシドと空のカプシドとの比率の大雑把な推定しかできない［７３］。

【0125】

完全なカプシドと空のカプシドとの比率を定量化するための第３の方法は、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）である。ＡＵＣは、空のカプシドと完全なカプシドの比率を定義するためのゴールドスタンダードとみなされている［７６］。ベクターゲノムの存在は、密度を増加させ、したがって、空のカプシドから沈降速度を上回って分離することを可能にする［７３］。この方法は、空のカプシド及び完全なカプシドを定量化するための非常に正確で再現可能なツールである［７７］。従来、空のカプシドと完全なカプシドとを分離するためにセシウム－塩化物密度勾配ＡＵＣを適用していたが、このアプローチはスケーラブルではない［７１］。超遠心分離及び計算方法の最近の進歩により、沈降のリアルタイムモニタリングと、その後の紫外線検出システムを使用したＡＡＶカプシドの定量化が可能になった［７８］。その高い感度は、異なるゲノムサイズを有するカプシドの分離及び定量化を可能にすることさえある［７８］。特に研究目的のための大きな制限は、少なくとも４００μｌの高容量及び約５・１０^１２ｖｇ／ｍＬの高力価の要件である［７３］。
２．２．３ カプシド－ＥＬＩＳＡ及びＮＴＡを用いたカプシド総数

【0126】

前述の戦略は、主にＤＮＡ含有ベクターの定量化に焦点を当てている。ＡＡＶカプシドの総数を定量化するためのアプローチが不足している。カプシド－ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶカプシドの総数を直接的に定量化するわずかなアプローチのうちの１つである［７９］。血清型１、４、５、及び６特異的抗体を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、それぞれのカプシド総数を定量化することができる［８０］。ＥＬＩＳＡアッセイの主な欠点は、価格、高い変動性、及び遊離タンパク質への非特異的結合の可能性である［５５］。

【0127】

Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ及びその同僚による最近の刊行物では、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を使用して、ＡＡＶカプシドの総数を計数した。検出可能なシグナルを得るために、カプシドを金ナノ粒子で標識した［８１］。
２．２．４ 細胞ベースの発現アッセイを用いたベクター製剤の活性及び効力

【0128】

ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞を形質導入することができる［５２］。ＡＡＶベクターの形質導入効率は、導入遺伝子発現を測定することによって同定される［８２］。ベクターの不安定性及び分解が形質導入の低下を引き起こすため、これはベクター製剤の重要な品質特性である［２７］。主に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子を有するベクターが、形質導入アッセイに使用される［５５］。細胞ベースのアッセイにおけるベクター濃度は、感染多重度（ＭＯＩ）として表される。ＭＯＩは、１つの細胞に追加されるゲノム含有ベクターの数である［８３］。

【0129】

形質導入実験は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロのいずれかで実施される［８４］。ＡＡＶ血清型は別個の組織トロピズムを有するため、インビトロ実験では、高い形質導入効率を有する細胞株を選択することが重要である［４］。多くのインビトロ研究では、形質導入実験のためにＨＥＫ２９３細胞を使用する。これは、確立された既知の細胞株であり、ＡＡＶの生合成にも使用される［８５］。

【0130】

Ｅｌｌｉｓ及びその同僚は、様々な異なる細胞及び血清型をスクリーニングする形質導入研究を行った。実験は、多くの前駆細胞が十分に形質導入されておらず、インビトロＡＡＶ形質導入アッセイに好適ではないことを示した。しかしながら、多くの不死化ヒト細胞株は、特にＡＡＶ１及びＡＡＶ６によって高度に形質導入された［８４］。

【0131】

頻繁に使用される血清型２（ＡＡＶ２）をより詳しく見ると、いくつかの刊行物は、Ｕ２ＯＳ細胞の形質導入実験の成功を記載している。これらの骨肉腫細胞は、ＡＡＶ２感染症に非常に感受性である。しかしながら、これがそれらの変異又は骨細胞様の性質によって引き起こされるかどうかはまだ不明である［８６］。ＡＡＶ２による高い形質導入のため、この細胞株は、前述のＫＩＡＡ０３１９Ｌ受容体を同定する実験に利用された［４２］。Ｅｌｌｉｓ及びその同僚により、Ｕ２ＯＳ細胞において９８％のＡＡＶ２形質導入効率が測定され、これは、上記の他の刊行物で観察された形質導入効率に対応する［８４］。

【0132】

引用文献の殆どでは、形質導入効率を定量化するためにフローサイトメトリーが使用されている。フローサイトメトリーは、ベクター媒介遺伝子移入の迅速かつ堅牢な品質評価に関して十分に好適である［８７］。
２．２．５ ＤＬＳ及びＮＴＡを用いた粒子サイズ評価

【0133】

動的光散乱（ＤＬＳ）は、ブラウン運動下の粒子の光散乱を測定する。大きな粒子は、小さな粒子よりもゆっくりとした運動であるために、より高い相関を有し、逆もまた同様である［８８］。これに基づいて、ＤＬＳは、それぞれの粒子の拡散係数を計算し、これにより流体力学的半径の計算が可能となる［８９］。

【0134】

ナノトラッキング分析は、より新規なアプローチであり、ＤＬＳと同じ原理に基づいている。レーザーはブラウン運動下での光の散乱を可視化する。デジタルカメラは、粒子サイズを追跡し、計数し、測定する。ＮＴＡは、ＤＬＳよりも高い分解能を有し、試料不純物にもに乏しい［９０］。ＤＬＳに対するその利点にもかかわらず、これはＡＡＶのサイズ決定に使用されることは殆どない。

【0135】

ＤＬＳは、非常に感度が高く、低容量の試料を必要とする［３０］。したがって、ＤＬＳは、ウイルスベクターのサイズ測定及び凝集測定用に普及した［８９］。ベクター凝集が精製中に生じ、したがって、ウイルス療法の安全性及び効力プロファイルを損なう可能性がある［９１］。それゆえに、ＤＬＳは、ベクター精製後の品質管理のためのツールとして使用され得る［９２］。調べる際には殆ど、ベクターサイズ及び凝集分析のためにＤＬＳを使用している［９０］。例えば、Ｗａｎｇ及びその同僚は、ＤＬＳを用いて、ＡＡＶカプシド修飾がそのサイズに及ぼす影響を調べた［３４］。他の研究は、ＤＬＳを使用して、抗体が組織相互作用に影響を与えるベクター凝集をどのようにして媒介するかを調べた［９３］。凝集はまた、ウイルスベクターの保存中に生じ得る。したがって、精製戦略を改善するだけでなく、ベクターを安定させるための新しい革新的な製剤アプローチに焦点を当てることが重要である［９１］。本出願では、ＤＬＳを使用して、ＡＡＶ２凝集に対する異なる賦形剤の影響を評価した。凝集測定により、十分なイオン強度を製剤に添加したときに、ＡＡＶ２凝集体のサイズが減少することが明らかになった［３０］。
２．２．６ ゼータ電位を用いたコロイド安定性の評価

【0136】

ゼータ電位は、粒子の表面電位を測定し、ナノ粒子のコロイド安定性の特性評価を行うための重要なツールである［９４］。ゼータ電位は、主にｐＨの影響を受ける。ウイルスなどのナノ粒子は、ｐＨがそれらの等電点に近い場合にコロイド安定性の低下を示す。それにもかかわらず、イオン強度及び粒子濃度はまた、ゼータ電位に影響する［９５］。表面電位の測定は、アデノ関連ウイルスの製剤開発の際に適用することができる。文献によれば、ＡＡＶ２は、－９．４ｍＶの表面電位を有する［９６］。コロイド安定性は、ゼータ電位の大きさによって影響を受ける。－３０ｍＶ未満の値又は＋３０ｍＶより大きい値は、高度な安定性を示す。－２５ｍＶより大きいゼータ電位又は＋２５ｍＶより小さいゼータ電位は、ファンデルワールス、疎水性相互作用、及び水素結合の形成に起因して凝集し、塊になり、又は凝塊する傾向がある［９７］。
２．２．７ 製剤化開発における有用なツールとしての示差走査蛍光測定法

【0137】

示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）は、タンパク質の熱安定性を決定することができる蛍光ベースのアッセイである。分析方法は、内因性又は外因性の蛍光変化のいずれかを検出する。内因性蛍光は、トリプトファン、フェニルアラニン、及びチロシンなどの芳香族アミノ酸によって引き起こされる。温度誘導性タンパク質のアンフォールディング時に、アミノ酸はそれらの位置を変化させ、これにより蛍光スペクトルの変化がもたらされる。一方、外因性蛍光は、外因性染料の添加によって引き起こされる［９８］。ＳＹＰＲＯ－オレンジは、良好なシグナル対雑音比により、ＤＳＦに最も一般的に使用される染料である［９９］。したがって、ＡＡＶの熱安定性に関する殆どの実験は、ＳＹＰＲＯ－オレンジを使用する。これは、カプシドアンフォールディング時にアクセス可能になる疎水性領域に結合する。製剤開発においてその使用を制限するＳＹＰＲＯ－オレンジの欠点は、頻繁に使用される界面活性剤に対する親和性である。これらの界面活性剤の疎水性領域への結合は、高いバックグラウンド蛍光をもたらす［１００］。したがって、より新しいアプローチは、ＳＹＰＲＯ オレンジＤＳＦの簡単かつ正確な代替として、ＡＡＶカプシドの内因性蛍光を利用する［１０１］。これらの改善に加えて、試料消費量が低く、迅速であり、堅牢であり、かつ費用対効果の高い測定がＤＳＦの主な利点である［４］。

【0138】

ＤＳＦは、製剤開発における非常に価値ある方法として現れた。前述したように、カプシド融解温度を測定することにより、血清型を同定することができる［３２］。最近の研究では、ＤＳＦの適用は、ＡＡＶ血清型の同定以上のことをすることができることが示されている。タンパク質不純物は、例えば、ＤＳＦフィンガープリントに著しく影響を与え、ＡＡＶバッチ純度を評価することが可能になる。同様に、蛍光シグナル強度は、カプシド濃度に直接比例する。両方の言及した適用を利用して、ＡＡＶ調製物のバッチ間の一致を評価することができる［１０２］。

【0139】

Ｂｅｎｎｅｔｔ及び同僚は、緩衝液スクリーニングを行い、したがって、別の製剤に関連するＤＳＦの実施を示した。彼らは、緩衝液がＡＡＶの熱安定性にどのように影響するかを測定した。結果は、緩衝液の選択が、血清型特異的な様式でカプシドの融解温度に影響することを示した。ＡＡＶ２の場合、トリス緩衝液は、リン酸緩衝液と比較して、融解温度を最大１５℃上昇させた［１０３］。緩衝液だけでなく、そのｐＨは、血清型特異的な様式で熱安定性に影響を及ぼす。ＡＡＶ５の熱安定性は、ｐＨの低下と比例して低下する。一方、ＡＡＶ２は、ｐＨ５において最高の熱安定性を有する［１０２］。上記の刊行物は、新たな製剤関連のＤＳＦの適用を浮き彫りにしている。
２．３ プロジェクトの構成及び製剤研究

【0140】

プロジェクトは２つの部分に分けられる。最初の数ヶ月間は、ＡＡＶ２の特性評価のための分析方法の評価及び開発に焦点を当てた。最初に、用量の推定を行うためにｑＰＣＲ法を改変した。並行して、製剤によって誘導される発現を試験するために、細胞ベースの導入遺伝子アッセイを開発した。粒子分析を行い、ゼータ電位測定、光遮蔽法を用いた目視で見えない粒子の形成、及び動的光散乱に焦点を当てた。更に、ＤＳＦ技術を確立し、ＡＡＶ２製剤に適用した。

【0141】

プロジェクトの第２部では、３ヶ月間の安定性試験において８つの異なる製剤を評価した。文献中の製剤は、ＡＡＶ供給元によって提供される製剤、及びＬｕｘｔｕｒｎａなどの市販の製剤とともに、０．００１％Ｐ１８８を補充したリン酸緩衝液を使用する。この緩衝液を、製剤開発の出発点として使用した。製剤ごとに１つの変数のみを変更することによって、更なる製剤を開発した。これにより、変更されたパラメータの影響に関する結論が得られた。ＡＡＶ２の安定性に対するそれらの影響を評価するために、異なる緩衝液、ｐＨ、及び賦形剤を使用した。Ｂｅｎｎｅｔｔ及びその同僚は、ｐＨが熱安定性に直接影響することを既に示している。したがって、異なるｐＨ範囲を試験し、５．５、６．８、及び７．５のｐＨを選択した。最も低いｐＨ５．５は、最高のＡＡＶ２熱安定性をもたらしただけでなく、エンドソーム環境を模倣した［１０３］。その後に、選択されたｐＨ範囲において緩衝し、かつ、凍結乾燥に好適である、３つのポピュラーで確立された製剤緩衝液を選択した。直接の比較が可能になるように、同じ緩衝液濃度を選択した。２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、及びリン酸ナトリウムをＡＡＶ２安定性試験のための製剤緩衝液として選択した。後者は、ポピュラーなＡＡＶ保存用及び出荷用緩衝液である一方、Ｌ－ヒスチジン緩衝液は、生物学的製剤において一般的に使用される。最後に、クエン酸ナトリウム緩衝液は、特に、ＡＡＶ安定性へのその影響が文献に記載されていないため、選択された。全ての製剤に２９０ｍＭのスクロースを補充した。スクロースは、凍結乾燥のための増量剤として必要であった。研究では、２つの異なる界面活性剤を試験した。一方で、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８をＡＡＶ製剤において頻繁に使用される界面活性剤として試験し、一方で、ポリソルベート８０を試験した。それぞれ０．００１％及び０．０２％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８及びＰＳ８０濃度を使用した。これらは、文献に記載されている標準的な界面活性剤濃度であり、ＡＡＶ供給元によって使用され、市販のＡＡＶ製剤において使用されている。このような低い界面活性剤濃度は、ガラス又はプラスチック表面への非特異的結合を防止するのに十分であることが示された［１０４］。

【0142】

本プロジェクトの中心的な目的は、凍結乾燥がＡＡＶ２ベクターの安定性に及ぼす影響を評価することであった。凍結乾燥は、－８０℃の現在のＡＡＶ保存及び出荷温度に魅力的な代替物を提示するであろう。高価なＡＡＶベクターのために、４つの製剤に凍結乾燥を適用することが決定された。ＡＡＶは安定であることが知られているが、それらは凝集する傾向がある。

【0143】

Ｗｒｉｇｈｔ及びその同僚は、凝集の原因となる異なるメカニズムを提案した。１０^１４ｖｇ／ｍＬより大きい力価を有する高力価製剤では、対称的なキャプシド構造及び逆荷電キャプシドポケット間の相互作用により、ＡＡＶの溶解度が低下する。ヌクレアーゼで処理したＡＡＶ２試料では、より少ないベクター凝集が見られるため、彼らは、残存する宿主細胞ＤＮＡ断片が、静電相互作用を上回ってＡＡＶ２カプシドに結合し、凝集を媒介することを提案した。このようなベクター凝集体を防止するために、イオン強度が記載されている［３０］。本研究は凍結乾燥に焦点を当てたため、凝集の問題に対処し、かつ、同時に凍結乾燥させることができる新規な非塩ベースの賦形剤を評価した。

【0144】

０．２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウムを使用した１つの製剤を提供した。ＡＡＶ製剤の開発におけるヒアルロン酸の使用は、文献にはまだ記載されていない。別の製剤は、１％ヒト血清アルブミンを使用した。アルブミンは、ＡＡＶカプシドと相互作用し、その形質導入効率を高めると考えられている［１０５］。これらの賦形剤は凍結乾燥を妨げないので、該賦形剤を選択した。表２は、全ての製剤組成物を要約している。ＡＡＶ２ベクターは非常に高価格であるため、本開示の最初の部分で評価された全ての選択された分析方法の実施を依然として可能にする最小の力価を使用することを決定した。したがって、製剤研究を１・１０^１１ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２力価により行った。

【0145】

【表3】

【0146】

ＡＡＶ２の安定性に対する異なる温度曝露の影響を比較するための実験を行った。したがって、広範囲の温度範囲を研究に追加した。まず、－２０℃及び－８０℃などの２つの異なる凍結温度及びＡＡＶ２安定性に対するこれらの影響を比較することが望ましい。第二に、２～８℃、２５℃、４０℃の上昇した保存温度を調べた。同時に、製剤を、－２０℃及び－８０℃までの凍結融解サイクル並びに水平攪拌ストレスへの曝露などのいくつかのストレスに曝露した。後者は、それがまだ文献に記載されていないという条件を提供している。しかしながら、いくつかの刊行物では、凍結融解ストレスは記載されていた。Ｃｒｏｙｌｅ及びその同僚は、凍結融解サイクルに曝露したときのベクター遺伝子発現の減少を示した［２７］。低い力価では、そのようなサイクルによってベクター凝集が誘導されることが記載されていた［３０］。両方の特徴を調べたため、このストレス条件は興味深い条件となった。ＡＡＶ２は高価格であったため、限られた量のベクターしか入手できず、凍結乾燥を４つの製剤に限ることを決定した。いくつかの文献的証拠に基づき、材料を節約するために、４０℃への曝露によって感染性がすぐに失われることを予想した。したがって、製剤を２週間のみ曝露した［２８］。他の温度に曝露した製剤の安定性を３ヶ月間調べた。全ての製剤を製造後直ぐに及び３ヶ月間の保存後にＴ０で分析したが、材料を節約するために凍結乾燥のＴ０分析は行わなかった。その後の分析では、材料を節約するために、条件特異的なプルポイントを設定した。詳細なプルポイントの設定は、表３及び４に示されている。

【0147】

【表4】

【0148】

【表5】

【0149】

２．４ プロジェクトの目的
本プロジェクトの目的は、ＡＡＶ２ベクターの特性評価に使用される分析方法を評価及び開発し、続いて、ＡＡＶ２を用いた３ヶ月間の安定性試験を実施することである。

【0150】

評価される分析方法は、用量及び効力の特性評価を行うことを目的とした。一方、ＡＡＶ２ベクターの凝集挙動、目視で見えない粒子の形成、表面電位、及び熱安定性に関する情報を得るために、物理化学的特性評価を行う。

【0151】

次いで、最適化又は開発された分析方法を３ヶ月間の製剤安定性試験に適用する。この研究の際に、ＡＡＶ２ベクターの安定性に対する異なる賦形剤、ｐＨ範囲、緩衝液、及び界面活性剤の影響の特性評価を行うことが目標であった。中心となる目標は、ベクター安定性に対する凍結乾燥の影響を評価することであった。安定性試験では、製剤を、異なる温度並びに水平攪拌ストレス及び凍結融解ストレスなどの異なるストレスに曝露する。

【0152】

３ 材料
緩衝液の製造及び配合：
Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩（Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ）、クエン酸１Ｈ_２Ｏ（Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ）、クエン酸トリナトリウム２Ｈ_２Ｏ（Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ）、リン酸ナトリウム一塩基性１Ｈ_２Ｏ（Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ）、リン酸ナトリウム二塩基２Ｈ_２Ｏ（Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ）、スクロース（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ）、ポリソルベート８０（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８ ＢＩＯ（ＢＡＳＦ）、ヒアルロン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、アルブミン，ヒト（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ計７８０（Ｍｅｔｒｏｈｍ）、２Ｒ／１３ｍｍ ＳｃｈｏｔｔバイアルＳＬ／ＮＢＢ Ｔｕｂｕｌａｒ Ｆｉｏｌａｘ Ｃｌｅａｒ Ｔｙｐｅ Ｉ（Ｓｃｈｏｔｔ）、１３ｍｍ血清グレーＦｌｕｏｒｏｔｅｃストッパーＷＥＳ（Ｌｏｎｚａ ＤＰＳ）、１３ｍｍ ｌｙｏ グレーＦｌｕｒｏｔｅｃ－ストッパーＷＥＳ（Ｌｏｎｚａ ＤＰＳ）、Ｗｈａｔｍａｎ Ｐｕｒｓｄｉｓｃ ＰＶＤＦシリンジフィルター，０．２μｍ，１３ｍｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）

【0153】

凍結乾燥及びＫａｒｌ－Ｆｉｓｈｅｒ滴定：
Ｌｙｏｓｔａｒ３（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、安全キャビネット（Ａ１ Ｓａｆｅｔｅｃｈ）、Ｋａｒｌ－Ｆｉｓｈｅｒ滴定装置（Ｍｅｔｒｏｈｍ ３．０）

【0154】

ｑＰＣＲ：
１０００×ＡＡＶ標準（Ｖｉｒｏｖｅｋ Ｉｎｃ）、ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（Ｖｉｒｏｖｅｋ Ｉｎｃ）、フォワードプライマー１００μＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、リバースプライマー１００μＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐｏｗｅｒＵｐ、ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ＳＹＢＲ グリーン Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（ａｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ヌクレアーゼフリー水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅフリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＤＮａｓｅ Ｉ用の１０×ＤＮａｓｅ Ｉ 緩衝液＋ ＭｇＣｌ_２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ５（ａｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭｉｃｒｏＡｍｐ、ＥｎｄｕｒａＰｌａｔｅ光学９６ウェル（ａｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、光学接着カバー（ａｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）

【0155】

ＴＥＭ：
透過型電子顕微鏡Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１００（Ｐｈｉｌｉｐｓ）、２％酢酸ウラニル（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、銅グリッド（Ｃｏｐｐｅｒ Ｇｒｉｄ）（Ｇｒａｔｉｃｕｌｅｓ Ｏｐｔｉｃｓ）、ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（Ｖｉｒｏｖｅｋ Ｉｎｃ）

【0156】

ＤＬＳ／ＭＡＤＬＳ及びゼータ電位：
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、高精度石英セル１０×１０ｍｍ光路（Ｈｅｌｌｍａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）、ナノスフィアサイズ標準（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄ）５０ｎｍ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ナノスフィアサイズ標準６０ｎｍ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ナノスフィアサイズ標準１００ｎｍ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＴＳ１０７０キュベット（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ゼータ電位移動標準ＤＴＳ１２３５（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｔａｎｄａｒｄ ＤＴＳ１２３５）（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）

【0157】

ＤＳＦ：
Ｏｐｔｉｍ Ｕｎｉｔ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ ｌａｂｓ）、ＳＹＢＲ－ゴールド核酸染色（ａｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＳＹＰＲＯ－オレンジ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）

【0158】

Ｕ２ＯＳ細胞の増殖及び再培養：
Ｕ２ＯＳ－ＨＴＢ－９６（ＡＴＣＣ）、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、胎児ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎｕｎｃ Ｅａｓｙフラスコ７５、１７５、及び２２５ｃｍ^２ Ｎｕｃｌｏｎ ｄｅｔａ ｓｕｒｆａｃｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２５％トリプシン－－ＥＤＴＡ（１Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ）、ＣＯ_２インキュベーター（Ｂｉｎｄｅｒ）、Ｖｉａ１－ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）、等温Ｖ１５００－ＡＢシリーズ（Ｌａｂｔｅｃ）、振盪水浴ＧＦＬ１０８６（ＦＡＵＳＴ）、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５９２０Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）

【0159】

細胞生存率アッセイ：
ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞生存試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎｕｎｃ Ｆ９６マイクロウェルブラック（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｖｉａ１－ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉｄ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）、マッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）、ＣＯ_２インキュベーター（Ｂｉｎｄｅｒ）

【0160】

導入遺伝子発現アッセイ：
ｒＧＦＰ１ｍｇ／ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｎｕｎｃ Ｆ９６マイクロウェルブラック（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｖｉａ１カセット（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉｄ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）、マッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）、ＣＯ_２インキュベーター（Ｂｉｎｄｅｒ）、Ｕ２ＯＳ－ＨＴＢ－９６（ＡＴＣＣ）、ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（Ｖｉｒｏｖｅｋ Ｉｎｃ．）、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）

【0161】

フィルター実験：
１３ｍｍ Ｐｕｒａｄｉｓｃシリンジフィルター，０．２μｍ，ＰＶＤＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１０ｍｍ Ａｎｏｔｏｐシリンジフィルター、０．２μｍ ＰＶＤＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１３ｍｍ Ｍｉｌｌｅｘシリンジフィルター，０．２μｍ，ＰＶＤＦ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ５（ａｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び上記の全てのｑＰＣＲ装置。

【0162】

４ 方法
４．１ ＡＡＶ２特性評価のための分析方法の評価及び開発
殆どの方法を、製剤研究に適用する前に試験した。分析方法の評価及び開発の際に、方法がＡＡＶ２に適用可能であるかどうか、及び修正が必要であるかどうかを評価する必要がある。この研究の際に、ｑＰＣＲなどのいくつかの方法を大きく改変し、ＧＦＰ発現アッセイなどの他の方法を新たに開発した。分析方法の評価及び開発の一部として行った実験を次のセクションで更に詳述する。

【0163】

４．１．１ 定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によるＡＡＶ２逆位末端配列（ＩＴＲ）の定量化
この汎用ＩＴＲ定量化アプローチは、これが文献において及びＡＡＶ２供給元によってよく説明され、頻繁に使用されているために使用した。この汎用ＡＡＶ２方法の最適化及び確立により、代わりに導入遺伝子に依存しないＡＡＶ２滴定が可能になり、これは様々な異なるＡＡＶ２プロジェクトに適用することができる。力価の定量化のために、Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ及び同僚によって最初に開発された汎用ＡＡＶ２ ＩＴＲ ｑＰＣＲを更に修正した［６５］。ＴａｑＭａｎアプローチをより便利で対費用効果の高いＳＹＢＲ－グリーンアプローチに置き換えることによって、ｑＰＣＲ法を改変した。この改変は、一般にアクセス可能なＡｄｄｇｅｎｅのプロトコルに基づいた。ＳＹＢＲ－グリーンベースのＡＡＶ２－ＩＴＲ ｑＰＣＲに、ＤＮａｓｅ Ｉ消化ステップ及びカプシド開口ステップを更に補充した。これらの処理の影響を推定するために、これらの消化及び開始ステップを使用して及び使用せずに、実験を行った。

【0164】

以下の配列をプライマーとして使用した［６５］。
フォワードプライマー（ＦＷ）：５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’
リバースプライマー（ＲＷ）：５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’

【0165】

４．１．２ ＡＡＶ２滴定手順
まず、購入した直鎖化プラスミド標準物質を用いた希釈系を調製した。得られた標準曲線は、滴定中の定量化ツールとして機能した。ヌクレアーゼフリー水で５つの希釈液を作製した。１μＬ当たり１．０・１０^８ ＤＮＡアンプリコンの濃度を有する得られた１０００倍標準物質を必要な濃度に希釈した（１・１０^７、１・１０^６、１・１０^５、１・１０^４、１・１０^３のＤＮＡアンプリコン／μＬ）。全てのｑＰＣＲ実験を通じて、標準曲線をこの様式で調製した。

【0166】

続いて、ＤＮａｓｅ Ｉ消化ステップ及びカプシド開口ステップのいずれかを使用して又は使用せずに、ＡＡＶ試料を調製した。製剤研究１及び２の際の全てのプルポイント分析は、そのような消化ステップ及び開口ステップが含んだ。これらの実験の前に、そのような処理の影響を検出するために、未処理試料を処理試料とともに調製した。１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する５μＬの試料を３８μＬのヌクレアーゼフリー水、ＭｇＣｌ_２を含む５μＬの１０×ＤＮａｓｅ反応緩衝液、及び２μＬのＤＮａｓｅ Ｉ（１Ｕ／μＬ）と混合することにより、そのような処理を含んだ試料を調製した。混合物を３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、１０μＬの５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を混合物に入れ、試料を最高６５℃で１０分間加熱して、ＤＮａｓｅ Ｉを不活性化した。次いで、カプシドを９５℃で３０分間開口し、それに応じて希釈した。その後、これらの試料をヌクレアーゼフリー水中で希釈した（１：１０、１：２００、１：１０００、１：５０００）。開口もされておらず、ＤＮａｓｅ Ｉで消化もされていない試料を、消化及び開口した試料と同じく直接希釈した。ｑＰＣＲプレートに、５μＬの各試料及び標準希釈液を２つ組で充填した。更に、２つのウェルに５μＬのヌクレアーゼフリー水を充填し、鋳型なし対照（ＮＴＣ）として機能させた。プレートを密封し、マスターミックスを調製した。１つのウェルに使用されるマスターミックスレシピは、４．７μＬのヌクレアーゼフリー水、１０μＬのＰｏｗｅｒ ＵＰ ＳＹＢＲ－グリーンマスターミックス、及び０．１５μＬの１００μＭフォワード及びリバースプライマーで構成される。マルチチャネルピペットを使用して、１５μＬのマスターミックスを各ウェルに添加した。プレートを光学接着カバーで密封し、３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ５に移した。使用したマスターミックス（５０℃で２分、９８℃で３分、４０×９８℃で１５秒、続いて５８℃で３０秒）の要件を満たすように、ＰＣＲ実施プロファイルを調整した。３つのステップの溶融曲線（９５℃で１５秒、６０℃で１分、及び９５℃で１５秒）を用いて分析を終了した。データ分析には、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ設計及び分析ソフトウェアを使用した。

【0167】

４．１．３ ｑＰＣＲのＡＡＶ２試料処理の評価
第１の実験は、カプシド開口及びＤＮａｓｅ Ｉ消化ステップの影響の特性評価を行う。まず、０．００１％ Ｐ１８８を含む２０ｍＭリン酸緩衝液を調製した。この緩衝液を使用して、１．２・１０^１１ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２懸濁液を作製した。各５μＬのその懸濁液に、３本のエッペンドルフチューブを設けた。４５μＬのヌクレアーゼフリー水を第１のアリコートに添加した。他のアリコートに、各々、３８μＬのヌクレアーゼフリー水、５μＬのＭｇＣｌ_２を含む１０×ＤＮａｓｅ反応緩衝液及び２μＬのＤＮａｓｅ Ｉ（１Ｕ／μＬ）を提供した。その後、上記のように２つのアリコートのカプシドを開口した。開口手順を、ヌクレアーゼフリー水のみで希釈したアリコート及びＤＮａｓｅ Ｉを含む２つのアリコートのうちの１つに適用した。ＤＮａｓｅ Ｉを含む他のアリコートのカプシドは開口しなかった。開口後、試料を希釈し、上記のｑＰＣＲ手順に従って増幅した。

【0168】

４．１．４ エッペンドルフチューブへのＡＡＶ２の接着
全ての連続希釈をエッペンドルフチューブ中で行い、多くの実験は中間ステップでエッペンドルフチューブを使用したため、接着実験を行った。１・１０^１０ｖｇ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ２製剤を０．００１％Ｐ１８８を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製した。５００μＬのこの製剤を作製し、２つのアリコートに分けた。各アリコートを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中で２４時間保存した。２４時間後、１つのアリコートを１００μＬの容量で１０回上下にピペッティングすることによってしっかり混合したが、他方のアリコートは全く混合しなかった。消化及びカプシド開放ステップを含む、両方のアリコートのｑＰＣＲを行った。

【0169】

４．１．５ ＴＥＭを用いた完全なカプシド及び空のカプシドの定量化
完全なカプシド比と空のカプシドとの比率の決定のためにＴＥＭを使用することを決定した。ＡＵＣ及びＡＥＸ－ＨＰＬＣと比較して、ＴＥＭは、非常に小さな容量及び力価を必要とする。ＡＵＣは、完全なカプシド及び空のカプシドを定量化するためのゴールドスタンダードとして既知であるが、いくつかの刊行物は、ＴＥＭでの定量化がＡＵＣで得られた結果と直接的に相関することを示している。ＡＡＶ２ストック懸濁液の完全なカプシド及び空のカプシドのみを定量化したため、ＡＥＸ－ＨＰＬＣなどの高スループット方法の非常に時間がかかる実施を必要としなかった。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）及び関連する試料調製を、Ｂａｓｅｌ大学のＮａｎｏ Ｉｍａｇｉｎｇ ＬａｂにおいてフィリップスＣＭ１００で行った。２％酢酸ウラニルでの陰性染色により、空のＡＡＶカプシド及び完全なＡＡＶカプシドの区別が可能になった。銅グリッドにウイルスを添加する前に、グリッドをグロー放電する必要があった。銅グリッドを放電チャンバー内に配置した。ドームを銅グリッド上に設置し、ニードルバルブを注意深く閉じ、真空ポンプをオンにした。続いて、電源を５０ボルトにし、銅グリッドを３０秒間グロー放電した。続いて、銅グリッド上で、試料をインキュベート、洗浄、及び染色した。このプロジェクトの際に、２つの異なる試料調製物を試験した。第１の実験では、ＡＡＶ陰性染色のためのＮａｎｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｌａｂの標準プロトコルを適用した。したがって、銅グリッドを１０μＬの１・１０^１０ｖｇ／ｍＬの試料とともに１分間インキュベートした。インキュベーション後、グリッドを５０μＬ ｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄した。各洗浄ステップの後、濾紙を使用して水を除去した。銅グリッドを２回、１０秒間、２％酢酸ウラニル溶液５μＬとともにインキュベートすることにより、陰性染色を達成した。この試料調製物を使用して、わずかなカプシドしか検出されなかった。それが、試料調製手順の改変及び繰り返しの理由である。２回目の染色の試みでは、グロー放電を１回目と同じように行った。次いで、放電された銅グリッドを１５μＬの１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの試料とともにインキュベートした。この後、５０μＬのｄｄＨ_２Ｏを用いた１回の洗浄ステップのみを行った。２％酢酸ウラニルを用いた染色ステップの数を上記と同じに維持した。空のカプシド比と完全なカプシドとの比率の定量化のために、１１枚のランダムな写真を撮影した。１枚の写真は２０ｋＶの電圧で撮影し、１枚は３７ｋＶで撮影した。他の９枚の写真は１１ｋＶの電圧で撮影した。

【0170】

４．１．６ ＤＬＳ及びＭＡＤＬＳを用いた粒子及び凝集分析
ＤＬＳを使用して、ナノメートル範囲の粒子サイズ分布をモニタリングした。これは、ウイルスベクター凝集を測定及び定量化するための最先端技術である。これは試料消費量が少ないため、魅力的な方法である。前述したように、使用した力価は１・１０^１１ｖｇ／ｍＬであった。この力価は、約０．６２μｇ／ｍＬの非常に低いタンパク質濃度に対応する。評価法の際に、これらの濃度を検出できるかどうかを調べる必要があった。全てのＤＬＳ測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａで、低容量で高精度のＺＥＮ ２１１２石英キュベットで行った。まず、ラテックスビーズを用いたシステム適合性試験（ＳＳＴ）を行った。１０ｍＭ ＮａＣｌ溶液を調製し、滅菌濾過し、４つの滅菌１５ｍＬチューブに等分した。各チューブに、５０、６１、又は１００ｎｍのラテックスビーズ標準のいずれかの２滴を提供した。フラスコをゆっくりと反転させることによって、懸濁液を慎重に均質化した。高精度ＺＥＮ ２１１２石英キュベットに、５０μＬの各標準物質を提供した。１．５９の屈折率及び０．０１の吸収率のポリスチレンラテックスビーズ設定を選択し、ＳＳＴを行った。水を１．３３の屈折率及び０．８８７２ｍＰａｓの粘度の分散剤として選択した。５０ｎｍラテックスビーズ標準物質のＺ平均値の受入基準は、４８ｎｍ±３ｎｍであった。６１ｎｍ標準では、受入基準は６１ｎｍ±４ｎｍであり、１００ｎｍ規格では、受入基準は±８ｎｍであった。試料を少容量の石英キュベットタイプＺＥＮ ２１１２に充填する前に、これを水及びエタノールですすいだ。粒子を含まない加圧された空気を使用して、キュベットを乾燥させた。次いで、ＡＡＶ２ベクターを０．００１％Ｐ１８８を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈し、１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価とした。キュベットに５０μＬの試料を充填した。ＡＡＶ２設定を使用して測定を行った。この測定方法は、１．４５の屈折率及び０．００１の吸収率からなる。水を１．３３の屈折率及び０．８８７２ｍＰａｓの粘度の分散剤として選定した。温度を２５℃に設定し、平衡時間を１２０秒に設定した。分散剤の散乱を７５ｋｃｐｓに設定した。各試料を３つの後方散乱によって特性評価を行った。３つ組のＭＡＤＬＳ測定値を全ての製剤に適用した。ＭＡＤＬＳ測定値は、凍結融解サイクル、攪拌ストレス、４０℃での２週間の保存、及び２～８℃での１ヶ月間の凍結乾燥試料の保存後、Ｔ０でプラセボにも適用した。分析後、試料をエッペンドルフチューブに移し、更なる分析のために２～８℃で保存した。

【0171】

４．１．７ ゼータ電位測定
ゼータ電位は、拡散バリア法を用いて、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＵｌｔｒａでＤＴＳ １０７０キュベット中で測定した。システム適合性試験（ＳＳＴ）は、ＤＴＳ １０７０ポリスチレンキューブに－４２ｍＶ±４．２ｍＶのゼータ電位移動標準物質を充填することによって行った。２つの熱接触プレートをキュベットに取り付けた。標準物質を、１．５９の屈折率及び０．０１の吸収率で測定されたポリスチレンラテックスビーズの機器設定を用いて測定した。分散剤として水を選択した。システム適合性試験に合格した後、キュベットを水で洗い流し、０．００１％ Ｐ１８８を補充したＰＢＳ（ｐＨ７．４）を充填した。拡散バリア法（ＤＢＭ）を用いて、試料をキュベットに添加した。この方法は、低い試料容量のために特別に開発された。ゲル電気泳動充填チップの助けにより、１３０μＬの試料をキュベットの底部に充填した。使用したＡＡＶ２製剤は、０．００１％ Ｐ１８８を補充したＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で調製され、１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有した。熱伝導プレートをキュベットに取り付けた。１．４５の屈折率及び０．００１の吸収率であったタンパク質について機器設定をして、試料を測定した。分散剤として水を選択した。全ての測定を３つ組で行った。その後、キュベットを水及びエタノールで洗い流し、少なくとも２回再利用した。

【0172】

４．１．８ 細胞株の増殖
細胞株を受け取ったら、細胞培養培地を調製した。マッコイの５Ａ培地に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）及びペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を提供し、１０％ ＦＢＳ及び１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むマッコイの５Ａ培地の最終濃度を得た。

【0173】

約１・１０^６ Ｕ２ＯＳ－ＨＴＢ－９６細胞を含む１つのクライオバイアルをＡＴＣＣから入手した。細胞を解凍し、９ｍＬの予熱した媒体に懸濁した。チューブを１３６ｒｃｆで５分間遠心分離し、培地を吸引した。その後、細胞ペレットを１６ｍＬの予熱した培地に再懸濁し、７５ｃｍ^２培養フラスコに播種した。約９０％のコンフルエンシー後、接着細胞を懸濁し、８ｍＬの予熱した培地を提供した。１３６ｒｃｆで５分間遠心分離した後、上清を吸引し、ペレットを４ｍＬの培地に再懸濁した。４８ｍＬの予熱した培地を含む２つの２２５ｃｍ^２培養フラスコに各々、２ｍＬの懸濁液を提供し、３７℃、５％ＣＯ_２で保存した。９０％のコンフルエンシーに達した後、１つの培養フラスコの細胞を懸濁し、計数した。細胞を洗浄した後、１．２・１０^６細胞／ｍＬの細胞懸濁液（２継代）を５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを補充した培地中で調製した。７つのクライオチューブに１ｍＬの懸濁液（２継代）を提供し、液体窒素中で凍結した。他のフラスコの細胞を、それらの細胞を４ｍＬの培地に懸濁し、１ｍＬの懸濁液を４つの１７５ｃｍ^２培養フラスコに移すことにより、更に増殖させた。９０％のコンフルエンシーで、細胞を採取し、計数し、５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを補充した培地中に再懸濁した。１．６・１０^６細胞／ｍＬ（３継代）のＵ２ＯＳ濃度での別の３０個のクライオチューブを液体窒素中で凍結した。

【0174】

４．１．９ 再培養手順：
再培養を常に７５ｃｍ^２フラスコで行った。古い培地を吸引し、接着細胞を１２ｍＬの予熱したＰＢＳで洗浄した。リン酸緩衝液を吸引した後、２ｍＬの０．２５％トリプシン、０．０３％ＥＤＴＡ溶液をフラスコに添加し、細胞が脱着するまで、フラスコを３７℃で３分間インキュベートした。脱着した細胞を８ｍＬの培地に懸濁し、１３６ｒｃｆで５分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを５ｍＬの培地中に再懸濁した。次いで、１６ｍＬの予熱した培地を充填した新しい７５ｃｍ^２細胞培養フラスコに、１ｍＬのこの懸濁液を提供し、３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベーター中で保存した。細胞が９０％のコンフルエンシーに達した場合、再培養を開始した。３０継代に達するまで各細胞株を再培養した。

【0175】

４．１．１０ 細胞株の確立及び細胞生存率アッセイ：
細胞ベースの導入遺伝子発現アッセイの前に、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞生存率アッセイを行うことによって細胞株を確立した。このアッセイは、理想的な播種密度、得られる増殖速度、及び細胞生存率に関する情報を得るために行った。Ｕ２ＯＳ細胞を回収し、懸濁した。ストック懸濁液を８．２・１０^６細胞／ｍＬの濃度で調製した。異なる細胞濃度（４．１・１０^５、２．０・１０^５、１．０・１０^５、５．０・１０^４、２．５・１０^４、及び１．２５・１０^４細胞／ｍＬ）で希釈系列を調製した。正確に１００μＬの各懸濁液を９６ウェルプレートに添加し、４．０・１０^４、２．０・１０^４、１．０・１０^４、５０００、２５００、及び１２５０細胞／ウェル（３９０６、７８１３、１．５６・１０^４、３．１３・１０^４、６．２５・１０^４、１．３・１０^５、２．６３・１０^５細胞／ｃｍ^２）をとした。各密度を８つ組でプレーティングした。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で一晩保存した。２４時間のインキュベーション後、古い培地を吸引し、それを１８０μＬの新鮮な培地に置き換えることによって、第１の細胞生存率アッセイを行った。２０μＬのａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を添加し、１０％（ｖ／ｖ）のａｌａｍａｒＢｌｕｅ－Ｍｅｄｉｕｍ溶液を得た。プレートを３７℃及び５％ＣＯ_２で２時間４５分間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルの１００ｕＬの上清を黒色９６ウェルプレートに移した。５５０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの発光で蛍光を測定した。比較できる結果を得るために、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉｄ３内の光電子増倍管（ＰＭＴ）を低に設定した。この測定後、残存した上清を吸引し、これを１５０μＬの培地に置き換えた。細胞生存率アッセイを７日間連続して繰り返した。８日目に、培地を７０％イソプロパノールに置き換えることによって細胞を死滅させた。５分間のインキュベーション後、イソプロパノールを再び培地に置き換え、上記のようにしてアッセイを行った。この測定は、蛍光が生存細胞でのみ得られることを示すために陰性対照として作用した。

【0176】

４．１．１１ 導入遺伝子発現アッセイの開発
殆どの公開された文献は、形質導入された及び導入遺伝子発現細胞を定量化するために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）デバイス又は共焦点顕微鏡のいずれかを使用している。ＦＡＣＳ細胞選別器も共焦点顕微鏡も利用できなかったため、プレートリーダーを使用した細胞ベースの発現アッセイを開発した。このアッセイの欠点は、ＧＦＰを発現する細胞の正確な数を定量化できないことであった。主な関心は、製剤がＴ０での発現の開始と比較して導入遺伝子発現をどのように誘導するかであったため、これらの制限事項は許容された。このプレートリーダーアッセイは、高スループット、費用有効性、及び社内利用性を提供した。

【0177】

詳細な文献検索の後、接着Ｕ２ＯＳ－ＨＴＢ－９６細胞（ＢＳＬ－１）をＧＦＰ発現アッセイの開発に使用される細胞株として候補とした。文献には、そのような実験のためにＨＥＫ２９３細胞が主に記載されているが、それらはＡＡＶ２によって十分に形質導入されず、強く接着しないため、それらを意図的に使用しなかった。両方の特徴は、プレートリーダーアッセイの成功に必須であり、Ｕ２ＯＳ細胞によって満たされる。シグナル強度が低すぎることが危惧されたため、細胞生存率に悪影響を及ぼすことなく、１ウェル当たりにできるだけ多くの細胞を配置した。細胞生存率が低下する前に、ＧＦＰの発現を４日間モニタリングすることができるため、１０，０００細胞／ウェルの初期細胞密度がアッセイに適しているようであった。この細胞数により、複数組で作業を行うことも可能になった。

【0178】

まず、４つのウェルに、それぞれ１００μＬの１．０・１０^５細胞／ｍＬの細胞懸濁液（（１．０・１０^４細胞／ウェル）を提供した。播種直後、１・１０^１０ｖｇ／ｍＬのウイルス懸濁液１００μＬを１ウェルに添加し、１０^５の多重感染度（ＭＯＩ）が得られ、１・１０^１１ｖｇ／ｍＬのウイルス懸濁液１００μＬを他のウェルに添加し、１０^５のＭＯＩが得られた。他の２つのウェルをブランクとして使用し、したがって、１００μＬのＰＢＳを提供した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。２４、４８、７２、９６時間後、それぞれ４８８ｎｍ及び５２０ｎｍの励起及び発光波長で蛍光を測定した。培地は４日間新しくせず、交換もしなかった。９６時間の測定後、培地を吸引し、１００μＬのＰＢＳで置き換え、蛍光測定を繰り返した。前の実験の結果を解釈した後、波長走査を行い、ＧＦＰの励起波長及び発光波長を決定した。１ｍｇ／ｍＬの組換えＧＦＰ溶液を、ＰＢＳ中の連続希釈（１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ）で調製した。波長走査は、黒色９６ウェルプレートで行った。各ウェルに、１００μＬの各希釈液を提供した。理想的な励起波長及び発光波長を決定し、手順を最適化した後、ＭＯＩスクリーニングンを行った。このスクリーニングは、製剤研究内でＧＦＰ発現アッセイを設計する方法に関する情報を得るために行った。最低の検出可能な蛍光をもたらすＭＯＩを定義することと、異なるＭＯＩによって引き起こされる蛍光差を検出するプレートリーダーの能力の特性評価を行うこととが目的であった。実験により、ＧＦＰ発現に対するインキュベーション時間の影響を更に浮き彫りにする必要がある。４つの異なるウイルス試料を異なる力価で調製した。試料は、１・１０^１１ｖｇ／ｍＬ、１・１０^１０ｖｇ／ｍＬ、１・１０^９ｖｇ／ｍＬ、１・１０^８ｖｇ／ｍＬの力価を有した。全ての希釈物を、０．００１％ Ｐ１８８を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて作製した。Ｕ２ＯＳ－ＨＴＢ－９６細胞を回収し、懸濁した。懸濁液を希釈して、１・１０^５ｖｇ／ｍＬの濃度にした。１００μＬの細胞懸濁液をウェルに播種し、１・１０^４細胞／ウェルの細胞密度とした。新たに播種した細胞に、直ちに、それぞれ１００μＬのウイルス希釈液を添加し、それぞれ、１０^６、１０^５、１０^４及び１０^３ｖｇ／ｍＬのＭＯＩをもたらした。各ウイルス濃度を５つ組で測定した。各複製ウェルについて、対照ウェルも調製した。対照ウェルに、１００μＬの細胞懸濁液を充填した。ウイルスを添加する代わりに、０．００１％ Ｐ１８８を含む１００μＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した。感染後、プレートをインキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ_２で保存した。２４、４８、７２、９６時間での各蛍光測定前に、培地を吸引し、１００μＬのリン酸緩衝液に置き換えた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉｄ３で、４６０ｎｍの励起及び５１５ｎｍの発光で測定を行った。測定後、リン酸緩衝液を再び１５０μＬの培地に置き換えた。製剤研究１及び製剤研究２の際のプルポイント分析を１０^５ｖｇ／細胞のＭＯＩで行い、７２時間後の読み取りを比較した。

【0179】

４．２ 製剤研究１

【表6】

【0180】

Ｒ．Ｊ．Ｂｅｙｎｏｎ ａｎｄ Ｔ．Ｐａｔａｐｏｆｆによって開発されたプログラムである緩衝液及びレシピフォーミュラリー（Ｂｕｆｆｅｒ ａｎｄ ｒｅｃｉｐｅ ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）（Ｂ．Ａ．Ｒ．Ｆ．）を使用することによって、緩衝液レシピを決定した。全ての緩衝液を作製し、プルポイント分析に使用する場合に０．２μｍのＰＶＤＦ膜を通して滅菌濾過した（表５）。プルポイント中に、ゼータ電位、目視で見えない粒子の測定、及び導入遺伝子発現アッセイのための希釈剤として、緩衝液を使用した。プルポイント分析に使用した緩衝液には、アルブミンもヒアルロン酸ナトリウムも提供されていなかった。全ての緩衝液を、最大２週間にわたって遮光し、２～８℃で保存した。

【0181】

配合に使用した緩衝液を異なる方法で調製した。緩衝液とともに、２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウム、５％ ＰＳ８０、及び１％ Ｐ１８８ストック溶液を作製した。各ストックをそれぞれの緩衝液で調製した。その後、界面活性剤を規定の容量の緩衝液に入れ、０．０２％ ＰＳ８０又は０．００１％ Ｐ１８８の最終界面活性剤濃度とした。次いで、配合を開始した。このステップは、滅菌条件下、Ｃｌａｉｒｅ－Ｂｅｒｎｅｒ安全キャビネット内で行った。配合を開始する前に、Ｃｌａｉｒｅ－Ｂｅｒｎｅｒ安全キャビネットをイソプロパノールで激しく洗浄した。安全キャビネット内で操作するときには、滅菌した手袋及びスリーブを使用した。第１のステップでは、ＡＡＶ２ストック懸濁液を解凍し、８つのアリコートに分け、それぞれの緩衝液で２．１９・１０^１２ｖｇ／ｍＬの力価に希釈した。次いで、粒子を含まない滅菌細口ボトル内で配合を行った。まず、細口ボトルに緩衝液を提供した。第二に、アルブミン又はヒアルロン酸ナトリウムなどの予め作製した賦形剤ストック溶液を緩衝液に添加した。最後に、２．１９・１０^１２ｖｇ／ｍＬの力価を有する予め作製したＡＡＶ２希釈液を添加して、１．０９５・１０^１１ｖｇ／ｍＬの最終力価を達成した。ＡＡＶ２を含まないプラセボ製剤に同じ手順を適用した。シリコンなしの５ｍＬのシリンジで吸引する前に、各製剤を慎重に混合した。針をｗｈａｔｍａｎ ｐｕｒａｄｉｓｃ０．２μｍ、１３ｍｍシリンジフィルターと交換した。製剤を、粒子を含まない新しい滅菌狭口ボトルに滅菌濾過した。滅菌濾過後、Ｎａｌｇｅｎｅボトルを閉じ、安全キャビネットを再び清浄化した。次のステップでは、粒子を含まない滅菌２ｍＬガラスバイアルに、２４５μＬの製剤を提供した。製剤を更に凍結乾燥させる場合は１６個のガラスバイアルに充填し、凍結乾燥を行わない場合は１２個のガラスバイアルを充填した。全てのバイアルを、粒子を含まない滅菌した血清又は凍結乾燥ストッパーのいずれかで手で栓をした。凍結乾燥が意図されていない全てのバイアルを手で圧着し、異なる温度又はストレス条件のいずれかに曝露し、表３に記載されるように最大３ヶ月間保存した。凍結融解及び攪拌ストレスへの曝露を製造直後に開始した。凍結乾燥を意図するバイアルを凍結乾燥機に移した。凍結乾燥を行ったプラセボを過剰に作製した。凍結乾燥棚上に、それらを製剤バイアルの周りに配置して、凍結融解プロセス中に均質な熱流束を確保した。２つのプラセボバイアルに温度センサーを提供した。温度センサーを含む１つのバイアルを隅に配置した一方、もう一方を棚の中央に配置した。バイアルを棚に乗せた後、棚を凍結乾燥機前の安全キャビネットに移した。このキャビネット内で、凍結乾燥ストッパーを滅菌ピンセットで持ち上げた。次いで、棚を凍結乾燥機に移し、電極を差し込んだ。４つの製剤及びそれらのプラセボ、すなわち、製剤３、４、６、７に凍結乾燥を適用した。凍結乾燥後、バイアルを手動で圧着し、異なる条件（２～８℃で１ヶ月間及び３ヶ月間、又は２５℃で２週間、１ヶ月間、及び３ヶ月間）で保存した。プルポイント分析の際に、分析方法の評価及び開発に記載された方法を用いて製剤を分析した。これらの２つの測定の結果に基づいて、進行中の研究を中止し、改変された配合スキームを用いて第２の研究を開始することを決定した。

【0182】

４．３ 製剤研究２
製剤研究２を研究１と同様に調製した。同じ緩衝液レシピ及びＡＡＶ濃度を使用した。しかしながら、製剤化手順のわずかな調整を行った。製剤を滅菌濾過しなかった。それ以外の点は、配合手順を同じままにした。

【0183】

全ての方法を方法評価及び開発実験の際に記載されたように行った。異なる時点での導入遺伝子アッセイで使用される細胞の播種密度、細胞生存率、及び継代を別表の表８に示す。更に、ｐＨ及び目視で見えない粒子の測定を行った。任意の目視で見えない粒子の測定前に、５μｍのラテックスビーズ懸濁液を用いてシステム適合性試験を行った。製剤の８５μＬアリコートを製剤緩衝液で１．０・１０^１０ｖｇ／ｍＬの力価に希釈した。その後、全ての試料をＨＩＡＣ９７０３＋で分析した。

【0184】

４．４ 追加実験
ＡＡＶ２ベクターが製剤研究１での配合後に低い回復を示した理由を評価するための追加実験を行った。ベクター凝集又は滅菌フィルター膜への親和性がベクター損失の原因であるかどうかを観察するように実験を設計した。

【0185】

ＳＹＰＲＯ－オレンジ又はＳＹＢＲ－ゴールドを使用することによって１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する低濃度製剤にＤＳＦを適用することができるかどうかも試験した。

【0186】

４．４．１ ＡＡＶ２の滅菌濾過に対する１５０ｍＭ ＮａＣｌの影響
製剤研究１の際の力価損失がフィルター特異的であるかどうかを見出すために、１３ｍｍのＰｕｒａｄｉｓｃ０．２μｍ ＰＶＤＦを１３ｍｍのＭｉｌｌｅｘ ０．２μｍ ＰＶＤＦ及び１０ｍｍのＡｎｏｔｏｐ ０．２μｍ ＰＶＤＦフィルターと比較した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅに連絡後、Ａｎｏｔｏｐフィルターがウイルス物質の濾過に推奨された。２つの異なるフィルターサイズにより、濾過後の力価回復に対するフィルター表面積の影響の比較が可能となった。最初に、２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、２９０ｍＭ スクロース、０．０２％ ＰＳ８０の１００ｍＬの溶液（ｐＨ６．８）を作製した。２つの１０ｍＬのアリコートを採取し、８８ｍｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を１つのアリコートに添加し、最終的なＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭとした。２９８５μＬを各アリコートから２つのエッペンドルフチューブに移した。一方、２．１９・１０^１３ｖｇ／ｍＬの力価を有するウイルスストックを解凍した。各緩衝液アリコートに、１５μＬのＡＡＶ２ストックを提供した。上下にピペッティングすることによって、試料を激しく混合した。その後、塩化ナトリウムを含まない製剤を濾過した。Ｐｕｒａｄｉｓｃ、Ａｎｏｔｏｐ、及びＭｉｌｌｅｘ滅菌フィルターを通して濾過を行った。塩化ナトリウムを含まない１ｍＬの製剤を各フィルターを通して濾過した。１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む製剤に同じ手順を適用した。その後、上記の標準的なｑＰＣＲプロトコルを使用して、ウイルス力価を決定した。更に、異なる試料のＤＬＳ測定を行った。

【0187】

４．４．２ ＳＹＰＲＯ－オレンジ及びＳＹＢＲ－ゴールドを用いた熱シフトアッセイ
示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）による測定をＵｎｃｈａｉｎｅｄ ｌａｂのＯｐｔｉｍシステムで行った。実験では、シグナル強度を増強するためにＳＹＰＲＯ－オレンジ及びＳＹＢＲ－ゴールドを利用した。この実験では、ＳＹＰＲＯ－オレンジ及びＳＹＢＲ－ゴールドの染料及び異なる濃度を比較した。ＳＹＰＲＯ－オレンジ及びＳＹＢＲ－ゴールドをそれぞれ５０００倍及び１００００倍の濃度で購入した。実験のために、染料を２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、２９０ｍＭ スクロース、０．０２％ ポリソルベート８０、ｐＨ６．８で希釈した。ＳＹＰＲＯ－オレンジ及びＳＹＢＲ－ゴールドについて、３つの染料ストックを作製した。３μＬの１０倍、５０倍、及び１００倍ストックを作製し、２７μＬの１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬ ＡＡＶ２試料に入れた。これにより、１倍、５倍、又は１０倍の最終染料濃度が得られた。各染料濃度について、同じ濃度の緩衝液対照を調製した。９μＬの染色したＡＡＶ２試料をＤＳＦキャピラリーに添加した。ＳＹＰＲＯ－オレンジのＯｐｔｉｍ設定を用いて、各試料を３つ組で測定した。開始温度及び終了温度をそれぞれ１５℃及び９５℃に設定した。加熱速度を０．３３℃／分に設定した。

【0188】

５ 結果
５．１ ＡＡＶ２の特性評価のための分析方法の評価及び開発の結果
５．１．１ ＤＮａｓｅ Ｉ消化及び熱カプシド開口ステップがウイルス力価に及ぼす影響
ｑＰＣＲ法の評価及び改変の目的は、力価の定量化に対するＤＮａｓｅ Ｉ消化及び熱カプシド開口の影響に関する情報を得ることであった。図１は、３つの異なる処理によって得られる力価を示す。最も高い力価は、定量化前に試料を開口したときに得られた。このような熱カプシド開口ステップを加えることにより、１．６６・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価が得られた。この手順の実施は、供給元によって与えられた力価の過大評価をもたらした。ＤＮａｓｅ Ｉ消化ステップを加えることにより、力価が１．０７・１０^１１ｖｇ／ｍＬに低下した。ＤＮａｓｅ Ｉ消化ステップのみを行い、それに続く熱カプシド開口を行わなかった場合、力価は７．７４・１０^１０ｖｇ／ｍＬに更に低下した。未消化の試料から消化後に生じる力価を減算することにより、１ｍＬ当たり約５．９・１０^９の宿主細胞ＤＮＡ断片がＡＡＶ試料に存在することが示された。この実験により、定量化前のＤＮａｓｅ Ｉ処理が力価を有意に低下させる一方で、カプシド開口ステップが力価を増加させることが示された。両方の試料処理の組み合わせにより、供給元からの所与の力価と比較してわずかな偏差での正確な力価決定が可能になる。この結果に基づいて、製剤研究中の力価定量化は、ＤＮａｓｅ Ｉ消化及び熱カプシド開口ステップを適用した。図１を参照されたい。

【0189】

５．１．２ ＡＡＶ２のエッペンドルフチューブへの接着
プルポイント分析中、ＡＡＶ２製剤をエッペンドルフチューブに頻繁に保存した。したがって、２４時間の保存時のＡＡＶ２のエッペンドルフチューブへの接着を決定するための実験を行った。図２は、エッペンドルフチューブに２４時間保存した後の混合された試料及び混合されていない試料のＡＡＶ２力価を示す。定量化前の試料混合は、２．９・１０^９ｖｇ／ｍＬの力価をもたらし、１．５・１０^９ｖｇ／ｍＬの力価であることが測定された混合されなかった試料と比較して２倍高かった。データは、激しい混合が力価を増加させることができることを示している。両方の測定値は、ＡＡＶ２供給元によって付与された力価を過小評価した。これらの結果に基づいて、低結合チューブを以下の実験で使用し、試料を使用前に激しく混合した。図２を参照されたい。

【0190】

５．１．３ 透過型電子顕微鏡法を用いた完全なカプシドと空のカプシドとの比率
透過型電子顕微鏡法を使用して、完全なＡＡＶ２カプシド及び空のＡＡＶ２カプシドの比率を決定した。最初のカプシド可視化は、バーゼル大学のＮａｎｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｌａｂからの標準プロトコル及び１．０・１０^１０ｖｇ／ｍＬの力価を有する試料を利用した。図（３Ａ）に示すように、不十分な数のカプシドを可視化した。このような少量のカプシドでは、完全なカプシド及び空のカプシドの定量化が可能にならなかった。この結果に基づいて、試料調製物を改変し、１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬのより高い力価を使用した。このアプローチにより、図（３Ｂ）に示されるように、非常に高い数の染色カプシドがもたらされた。酢酸ウラニルがカプシドに入ることができないため、完全なカプシドは白い点として現れた。しかしながら、空のカプシドは、染料がカプシドに入ることによって引き起こされる暗い斑点をカプシドの中央に含む。１１枚の写真（図２５を参照）の全てのカプシドを手動で計数することにより、完全なカプシド及び空のカプシドの数の推定が可能であった。試料は、５８．３％の完全なカプシド及び４１．６％の空のカプシドを含んでいた。両方の実験の比較により、定量化のために十分なカプシドを可視化するためには、少なくとも１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価及び１つの洗浄ステップのみを有する改変された染色プロトコルが必要であることが明らかになった。

【0191】

５．１．４ ＡＡＶ２試料のＤＬＳ及びＭＡＤＬＳ
ＡＡＶ２は、２０～２５ｎｍのサイズを有する。ＤＬＳは流体力学半径を測定するため、２０～３０ｎｍのピークが予想された。図４に示されるように、後方散乱測定（４Ａ）は２つの粒子種の存在を示した。予想されるサイズ範囲内の１つの粒子サイズ分布が、約６４０ｎｍの１つの非常に大きな種とともに得られた（別表７を参照）。６４３ｎｍのＺ平均値により、より大きな粒子種の存在が確認された。多分散性指数測定はまた、試料が多分散であることを示した。方法評価の一部として、追加のＭＡＤＬＳを行い、この測定でも結果を得ることができるかどうかを試験した。（４Ｃ）に示されるように、後方散乱は両方の粒子種を検出することができる。側方散乱（４Ｄ）により、後方散乱によって得られた粒子分布が確認された。しかしながら、前方散乱（４Ｅ）は、５００ｎｍに１つのピークのみを検出した。ＭＡＤＬＳ（４Ｆ）内の前方散乱及び側方散乱は一致した一方、前方散乱は、約２０～３０ｎｍの粒子種を検出することができなかった。２０～３０ｎｍの粒子種を検出する能力に基づき、後方散乱を製剤研究中に使用して、ＡＡＶ２製剤の特性評価を行った。

【0192】

５．１．５ ＡＡＶ２のゼータ電位測定
方法評価中に、拡散バリア法を行い、１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する１３０μＬのＡＡＶ２試料を使用した場合にゼータ電位を得ることができるかどうかを試験した。データ品質の指標として図（５Ａ）に示された位相プロット測定は、時間の関数としての参照周波数と測定された拍動周波数との間の位相の明確な差を明らかにした。これにより、０．００１％ Ｐ１８８を補充したＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に保存したときに、ＡＡＶ２ベクターのゼータ電位を測定することが可能であることが示された。方法評価中に行われた測定を３つ組で行い、－９．４６ｍＶの平均ゼータ電位が得られた。

【0193】

５．１．６ ａｌａｍａｒＢｌｕｅによるＵ２ＯＳ－ＨＴＢ－９６細胞生存率アッセイ
この生存率アッセイにより、異なる播種密度が増殖速度及び細胞生存率にどのように影響するかを試験した。図６に示されるように、アッセイは、増殖速度が細胞密度に依存することを示した。１０，０００細胞／ウェルの細胞播種密度が赤色で強調表示されているが、それは、この密度を導入遺伝子アッセイの開発において後で使用したためである。蛍光強度は、増殖速度がプレーティングされた細胞密度に依存することを示した。より小さな播種密度は、より小さな初期蛍光強度をもたらした。１．３・１０^５細胞／ｃｍ^２の最も高い初期密度は、４～５日後に最大の細胞密度に達した。６．２５・１０^４細胞／ｃｍ^２及び３．１３・１０^４細胞／ｃｍ^２のより小さい密度は、同じ時間後に同じ密度に達した。この結果により、最も高い播種細胞密度を用いた増殖速度が、より低い密度と比較して小さいことが示された。７８１３及び１．５６・１０^４細胞／ｃｍ^２の播種密度は、５日後にプラトーに到達し、最小の播種密度は、６日後に最大の細胞密度に達した。それにもかかわらず、最大の細胞密度に達した後、全てのウェルは、７日後に細胞生存率の低下を記録した。蛍光が培地の成分ではなく細胞によって引き起こされることを確認するために、細胞を８日後に死滅させ、陰性対照として機能させた。ａｌａｍａｒＢｌｕｅの添加によっては蛍光が生じなかったが、これは、蛍光シグナルを達成するために生存細胞が必要であることを示している。

【0194】

５．１．７ Ｕ２ＯＳ細胞ベースのＧＦＰ発現アッセイの開発
最初に開発した導入遺伝子発現アッセイの結果を図７に示す。示される蛍光強度は、細胞、培地、及びＰＢＳのみを含むブランクを既に減算している。図７に示されるように、結果により、両方のＭＯＩは、３６時間後に既に検出可能な蛍光シグナルを引き起こしていることが示された。蛍光シグナルは経時的に増加し、７２時間後に最大値に達した。シグナル強度は時間依存的であるだけでなく、ＭＯＩ依存的であった。本開示の過程に際して、ＭＯＩという用語は、１つの細胞に添加されるウイルスゲノムの数として常に使用される。１０^６ｖｇ／細胞のＭＯＩは、１０^５ｖｇ／細胞のＭＯＩよりも高い蛍光をもたらした。７２時間後、１０^６ｖｇ／細胞のＭＯＩによって引き起こされた蛍光は、１０^５ｖｇ／細胞のＭＯＩによって引き起こされた蛍光の２倍であった。９６時間後、蛍光は低下した。９６時間において培地をＰＢＳに置き換えると、蛍光シグナルが増幅された。培地を用いた９６時間の蛍光強度と比較して、１０^６ｖｇ／細胞のＭＯＩでインキュベートしたウェルのＰＢＳでの蛍光は、ほぼ１２倍増加した１０^５ｖｇ／細胞のＭＯＩでインキュベートしたウェルと対照的に、ほぼ４倍増加した。その結果に基づき、次いで、ＧＦＰ発現を決定するための蛍光測定値をＰＢＳ形態で測定した。

【0195】

５．１．７．１ 組換えＧＦＰ及びＭＯＩ滴定の波長走査
ｒＧＦＰ波長走査によって、４６０ｎｍの励起波長及び５１５ｎｍの発光波長を使用した場合にｒＧＦＰの蛍光強度が最大になることが明らかになった。その後、プレートリーダーが異なるＭＯＩによって引き起こされる発現を区別できるかどうか、及び検出限界がどこに位置するかを見出すために、異なるＭＯＩの滴定を行った。図８は、ＭＯＩ画面の結果を示す。これは、形質導入されたＵ２ＯＳ細胞のＭＯＩ依存的な蛍光強度を明確に示している。ＭＯＩが高いほど、発現が高くなる。更に、ＧＦＰ発現は経時的に増加した。最大の蛍光増加は、４８時間～７２時間に現れた。一方、７２～９６時間にはわずかな蛍光増加しか見られなかった。７日後の蛍光の読み取りでは、発現が有意に低下したことが明らかになった。１０^３ｖｇ／細胞のＭＯＩは、４８時間後に測定可能な蛍光強度をもたらしたが、有意な発現変化をもたらさなかった。これらの結果に基づいて、製剤研究中の導入遺伝子発現アッセイを１０^５ｖｇ／細胞のＭＯＩで行い、７２時間後の読み取りを比較のために使用した。

【0196】

５．２ 製剤研究１
５．２．１ Ｔ０における製剤のＡＡＶ２力価決定
第１の製剤研究において、ｑＰＣＲを用いたＡＡＶ２滴定及びＧＦＰ導入遺伝子発現アッセイからなるＴ０分析を行った。配合の際に、１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を目標とした。ｑＰＣＲ ＡＡＶ２滴定結果を図９に示し、８つの製剤全てが目標とした力価よりも非常に小さい力価を有していたことが明らかとなった。製剤間の力価変動にもかかわらず、全ての力価は、９．８６・１０^７ｖｇ／ｍＬ～８．１３・１０^８ｖｇ／ｍＬの範囲であった。

【0197】

５．２．２ Ｔ０における製剤のＧＦＰ発現
ＧＦＰ導入遺伝子アッセイのデータを図１０に要約する。示されたデータは、負の蛍光シグナルの一部を説明するブランクを既に減算している。これらの結果により、製剤６及び７は高ＧＦＰ発現を誘発したことが示された。一方、他の全ての製剤は、７２時間後であっても測定可能なＧＦＰ発現をもたらさなかった。製剤３、４、５、８の蛍光強度は、５．７・１０^５以下の蛍光にしか達しなかった。製剤１及び２は、その後、検出可能な蛍光を示さなかった。ＡＡＶ２滴定から取得したデータを加えた場合、結果は、ＧＦＰ発現が、全ての製剤において、約１０^３ｖｇ／細胞のＭＯＩで起こったことを示した。製剤６は、非常に高い蛍光強度を引き起こしたが、ＭＯＩは、他の製剤と比較して更に小さかった。低い導入遺伝子発現及び低いＡＡＶ２力価に基づき、この研究を終了することを決定した。

【0198】

５．３ 製剤研究２の結果
５．３．１ 凍結乾燥及び残存水分量
凍結乾燥ケーキの目視検査では、３２個のケーキのうち５個が凍結乾燥ケーキに小さな亀裂を示すことが示された。凍結乾燥ケーキの写真を図１１に示す。残存水分量を、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｈｅｒ滴定を用いて、３つのプラセボバイアル中で測定した。分析により、残存水分量は１．１１、１．１３、及び１．２３％であることが明らかとなった。

【0199】

５．３．２ 製剤研究２における全てのＡＡＶ２力価決定の要約
各プルポイント中に、ｑＰＣＲを使用して、全ての製剤の力価を決定した。全てのｑＰＣＲ結果の要約を図１２に示す。配合の際に、全ての製剤は１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を目標とした。定量化により、製剤１、２、４、及び５が異なるプルポイント測定値間で低い力価変動を有し、それらが１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの目標とした力価にほぼ到達することが示された。攪拌ストレスへの曝露は、製剤１、３、５、及び８の力価低下をもたらした。プルポイント測定値間の大きな力価変動及び殆どの測定値の大きな標準偏差が、製剤６で見られた。製剤６の－８０℃の凍結融解サイクルへの曝露は、約２ｌｏｇの力価低下をもたらした。同様に、製剤６の全ての力価は、他の製剤と比較して非常に小さく、１・１０^１０ｖｇ／ｍＬを超えなかった。製剤７は、全ての測定値間で大きな変動を示さなかったにもかかわらず、殆どの力価測定値は、力価を約１ｌｏｇ過少評価した。製剤２、４、６、及び７では攪拌モデル後に力価低下がないことは注目すべきことである。上記の力価低下に加えて、製剤は、製剤研究の過程にわたって一定のウイルス力価を示した。

【0200】

５．３．３ 製剤研究２における全てのＧＦＰ発現アッセイの要約
以下のセクションは、細胞ベースのＧＦＰ導入遺伝子発現アッセイの結果を提供する。細胞を８つの異なるＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ製剤で形質導入した。形質導入が成功したら、細胞はＧＦＰを発現する。プレートリーダーで蛍光を測定することにより、ＧＦＰ発現を直接定量化することが可能であった。

【0201】

５．３．３．１ ２～８℃で保存した製剤による形質導入後のＵ２ＯＳ細胞におけるＧＦＰ導入遺伝子発現
図１３は、２～８℃に異なる時間にわたって曝露された全ての製剤のＧＦＰ導入遺伝子アッセイから得られた結果を示す。各製剤は、Ｔ０で異なる蛍光強度を誘発した。Ｔ０での製剤特異的ＧＦＰ発現にもかかわらず、殆どの製剤は、３ヶ月間凍結したとき、凍結温度とは関係なしに有意な蛍光低下を記録した。製剤６及び８は、凍結時に発現低下を示さず、製剤７は、小さな発現低下しか記録しなかった。製剤８の２～８℃での１ヶ月間及び３ヶ月間の曝露は、－２０又は－８０℃での３ヶ月間の保存とは対照的に、非常に少ない発現をもたらした。２～８℃で保存された他の製剤は、凍結した製剤と比較して、同様の発現を示した。２～８℃で保存した場合、１ヶ月及び３ヶ月の間の保存間に差は見られなかった。製剤３及び４の凍結乾燥、続いて、２～８℃で１ヶ月間の保存により、液体製剤と対照的に同様の発現を示した。一方、製剤６及び７は、凍結乾燥した際時に有意に低い蛍光強度をもたらした。全てのプルポイントの際に、製剤３を用いた形質導入は、他の製剤と比較して、非常に小さい絶対蛍光強度をもたらした。製剤１では、製剤２と比較して、研究全体の際に既にＴ０でより少ない発現であることが明らかになった。

【0202】

全てのプルポイントの際の絶対ＧＦＰ発現は、製剤６で最も高かった。ＧＦＰ発現アッセイにおいてＭＯＩを適用した（別表９を参照されたい）。

【0203】

５．３．３．２ ２５℃で保存した製剤による形質導入後のＵ２ＯＳ細胞におけるＧＦＰ導入遺伝子発現
図１４の結果は、ＧＦＰ発現が２５℃での２週間の保存後に有意に低下したことを示す。２５℃で２週間保存した後に蛍光が大きく低下したにもかかわらず、１ヶ月保存したときに更なる低下は観察されなかった。しかしながら、２５℃で３ヶ月間保存した後、全ての製剤で発現が更に低下した。製剤１及び２は、２５℃で２週間及び４週間の保存後に、最大の発現低下を示した。再び、製剤６は、最高の絶対ＧＦＰ発現をもたらした。製剤３を除く全ての凍結乾燥製剤は、形質導入時に凍結乾燥していない製剤よりも更に小さいＧＦＰ発現をもたらした。凍結乾燥、続いて、２５℃での３ヶ月間の保存は、１ヶ月間の保存と比較して更に低い発現をもたらした。

【0204】

５．３．３．３ ４０℃への曝露後、凍結融解サイクル後、及び攪拌ストレス後のＧＦＰ導入遺伝子発現
図１５は、製剤を４０℃又は凍結融解及び攪拌ストレスなどのストレス条件に曝露した後のＧＦＰ発現を示す。製剤６及び８は、－２０℃までの凍結融解サイクル後でも、－８０℃までの凍結融解サイクル後でも、ＧＦＰ発現低下を記録しなかった。他の全ての製剤は、凍結融解時に発現の低下を示した。－２０℃までのサイクルは、－８０℃までのサイクルとは対照的に、製剤３、４、及び５の発現についてより明確な低下を引き起こした。他の全ての製剤は、－８０℃までのサイクルと比較して、同様の発現を明らかにした。提示されたデータは、２～８℃で５日間の水平振盪が、凍結融解サイクルよりも更に低いＧＦＰ発現を引き起こしたことを示した。いずれの製剤も振盪ストレスに耐性はなかったが、製剤６は、他の製剤と比較して最小の発現低下を示した。製剤１、２、５、及び７では、攪拌ストレスは、－２０℃の凍結融解サイクルへの曝露と同様のＧＦＰ発現の低下を引き起こした。他の製剤は、より低い発現をもたらした。製剤８におけるＧＦＰ発現は、５日間振盪した後に有意に低下した。４０℃に２週間曝露することにより、全ての製剤においてＧＦＰ発現が防止された。

【0205】

５．３．４ 製剤研究２においてＤＬＳで測定した全てのＺ平均値及び粒子サイズ分布の要約
図１７（Ａ）は、全ての測定されたプルポイントの際の全ての製剤のＺ平均値を示す。凝集を示さない製剤については、２０～３０ｎｍのＺ平均値が予想された。データは、製剤６が全てのプルポイントの際に３１ｎｍを超えない最小のＺ平均値を有することを示し、対照的に、他の全ての製剤は、Ｔ０で既に有意に高いＺ平均値を有していた。製剤１は、Ｔ０で既に約１５００ｎｍの最高のＺ平均値を示した。一方、製剤２、３は、Ｔ０で約４００ｎｍのより小さいＺ平均値を有した。更に、製剤２、３、及び７は、他の製剤と比較して低いＺ平均値を示した。２５℃への２週間又は１ヶ月間の曝露時に、いくつかの製剤において、Ｚ平均値が有意に増加した。製剤１、４、５、７、及び８は、そのような増加を記録した。製剤２及び３は、２５℃への２週間又は１ヶ月間の曝露時に、いかなるＺ平均値の増加も示さなかった。攪拌ストレスに曝露した後の最高のＺ平均値が、製剤８で見られた。この製剤は、振盪後に最高のＺ平均値を示しただけではなく、－２０℃までの凍結融解サイクル後にも最高値を有した。

【0206】

図１６に示すＴ０における各製剤の粒子分布を見ると、製剤７のみが３０ｎｍにおいて小さな粒子サイズ分布を示す。

【0207】

他の全ての製剤は、その範囲内でいかなるサイズ分布も示さなかった。１％のアルブミンを含む製剤６は、１０ｎｍ前後の非常に顕著な粒子サイズ分布を有した。０．０２％ ＰＳ８０を含んだ製剤１、２、３、４、及び５も、１０ｎｍでのピークを明らかにした。全ての製剤は、方法評価実験中に既に検出されているように、より高いナノメートル範囲において特異的な粒子サイズ分布を示した。製剤１では、このピークは約１０００ｎｍであった一方、製剤２では、これは５６６ｎｍであった。同様に、製剤４は、１０７４ｎｍにおいてサイズ分布を示し、製剤３は、５２２ｎｍにおいてサイズ分布を示した。製剤５及び６では、それぞれ、１２９２ｎｍ及び１５６１ｎｍのピークが明らかになった。製剤７及び８では、粒子サイズ分布が、それぞれ９５７ｎｍ及び１３２０ｎｍで見出された。本研究の過程中に、Ｔ０で記載された粒子サイズ分布プロファイルは一定のままであった。特に、約１、１０、３０ｎｍに記載されたピークは、全ての条件及びプルポイントにおいて、それぞれの製剤で同じままであった。より高いナノメートル範囲で記載されたピークのみが、研究の過程中でいくつかのシフトを記録した。製剤２の場合、Ｔ０で約１００ｎｍで殆ど見られなかった分布は、２５℃に４週間曝露した後に強度が増した。ＤＬＳをプラセボでもＴ０で行った。保存中にピークシフトは観察されなかった。プラセボのＺ平均値は、全ての製剤において３．２～８．５ｎｍであった。１％のアルブミンを含むプラセボ６を除く全てのプラセボは、１ｎｍでピークを示した。プラセボは、製剤とは対照的に、高いナノメートル範囲では、いかなるピークも示されていない。２５℃に１ヶ月間曝露した製剤及びＴ０におけるプラセボのサイズ分布を図２９及び３０に示す。

【0208】

図１７（Ｂ）に示される多分散性測定。文献によれば、単分散ＡＡＶ製剤は、０．２以下のＰＤＩ値を有する。したがって、製剤６は単分散であり、凍結乾燥し、２～８℃及び２５℃で保存されたときに多分散となった。Ｔ０では、製剤５も単分散であることが明らかであったが、保存時には多分散性となった。他の全ての製剤は、Ｔ０から多分散であり、多分散のままであった。製剤８は、振盪時には最高のＺ平均値を有しただけでなく、多分散性が他の製剤と比較して高かった。

【0209】

５．３．５ 製剤研究２における目視で見えない粒子測定の要約
目視で見えない粒子を決定するために全ての試料を希釈したため、得られた粒子数に希釈係数を乗じた。計数した後、ソフトウェアにより、粒子をそのサイズに応じて４つの群に分割した。測定によって、全ての製剤における粒子数が非常に少ないことが明らかになった。全ての計数をそれぞれのプラセボと比較した。図１８Ｂ、１８Ｄ、１８Ｆ、及び１８Ｈに示されるように、多くのプラセボ測定値は、製剤中の粒子数とは対照的に、より高い粒子数を示した。プラセボ１は、他のプラセボと比較して、全ての時点で最も高い粒子数を示した。一方、製剤１は、Ｔ０で、４０℃での保存後に、凍結融解サイクル後に、及び攪拌ストレス後に、他の製剤と比較して高い粒子数のみを有していた。－８０℃までの凍結融解サイクルへの曝露時に、製剤２は、プラセボと対照的に、２、５、及び１０μｍの粒子数が有意に多かった。同様に、製剤３は、２５℃に２週間曝露したときに、より高い２、５、１０、及び２５μｍの粒子数を有した。他の全ての製剤は、それらのプラセボと比較して、有意に大きな粒子数を有しなかった。目視で見えない粒子の殆どは、製剤及びプラセボ１で検出された。図１８～２１を参照されたい。

【0210】

５．３．６ 製剤研究２におけるゼータ電位測定の要約
図１９は、全ての製剤のゼータ電位を示す。全ての製剤は、負のゼータ電位を有する。特に製剤７では、プルポイント間の大きな変動が観察された。製剤１及び８のゼータ電位は、プルポイント分析間のより小さな変動を示した。製剤１は、全てのプルポイント中で最小のゼータ電位を有した。製剤７では、２週間にわたって４０℃に曝露し、２～８℃で凍結乾燥及び保存したことより、約－３１ｍＶの高いゼータ電位が得られた一方、－２０℃までの１０回の凍結融解サイクルでは、－２ｍＶのゼータ電位が得られた。攪拌ストレスへの曝露により、製剤６でのみゼータ電位が増加した。方法評価中に既に示されているように、Ｔ０での製剤８のゼータ電位は－９．４６ｍＶに達し、これを文献に記載されているＡＡＶ２表面電位とアラインした。攪拌後のゼータ電位は、製剤８で最小であった。

【0211】

５．３．７ 製剤研究２におけるｐＨ測定の要約
殆どの製剤は、製剤安定性研究の経過にわたって一定のｐＨ値を示した。－２０℃の凍結融解サイクル後、製剤１及び２並びにプラセボ１及び２では、ｐＨの小さな増加が観察された。同様に、製剤１は、２～８℃及び２５℃で１ヶ月間保存した後、５．５から５．８へのｐＨ増加を示した。図２０（Ａ）及び２０（Ｂ）を参照されたい。

【0212】

５．４ 追加の結果
５．４．１ 塩化ナトリウムを含まない製剤と比較した１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む製剤の濾過
第１の製剤研究から得られた結果に基づいて、滅菌濾過後の力価低下の理由を調べるために追加の実験を行った。これらの実験は、製剤研究２のプルポイント分析の間で行った。図２１は、ＡＡＶ２製剤の濾過能力に対する塩化ナトリウムの影響を示す。１５０ｍＭの塩化ナトリウムを補充した製剤は、滅菌濾過後に完全な力価の回復を示した。滅菌濾過プロセスでは、有意でない量のウイルスゲノムが失われた。しかしながら、塩化ナトリウムを含まない製剤は、３つ全てのフィルターで１．５Ｌｏｇ単位を超えて力価が失われたことを記録した。Ｐｕｒａｄｉｓｃ ＰＶＤＦフィルターを通して濾過することより、それぞれ３．８７・１０^９ｖｇ／ｍＬ及び３．５３・１０^９ｖｇ／ｍＬの力価が得られたＭｉｌｌｅｘ及びＡｎｏｔｏｐフィルターと比較して、２．２７・１０^９ｖｇ／ｍＬのわずかに小さい力価が得られた。

【0213】

５．４．２ ＤＬＳで測定した粒子サイズ分布に対する１５０ｍＭの塩化ナトリウムの影響

【表7】

【0214】

図２２及び表６に示されるように、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む製剤と、いかなる塩も含まない製剤とでは、粒子サイズ分布が異なる。両方の製剤は、同じ緩衝液、同じ賦形剤及びスクロース濃度で構成された。結果は、ＮａＣｌを含まない製剤のＺ平均値が５８７ｎｍであることを示した。製剤に塩化ナトリウムを補充することによって、Ｚ平均値が８３ｎｍに低下した。製剤を０．２μｍのＭｉｌｌｅｘ ＰＶＤＦフィルターを通して滅菌濾過したとき、Ｚ平均値は更に低下する。多分散性は、ＮａＣｌを含まない製剤と比較して、ＮａＣｌを含む製剤ではほぼ２倍の大きさであった。１５０ｍＭ ＮａＣｌを補充した製剤では、約２０～３０ｎｍのサイズ分布が明らかなった一方で、ＮａＣｌを含まない製剤は、その範囲においていかなる粒子サイズ分布も示さなかった。代わりに、約７８０ｎｍの粒子種を検出した。ＮａＣｌの添加は、このサイズ分布プロファイルを大きく変化させた。滅菌濾過した製剤は、滅菌濾過しなかった試料と比較して、非常に小さい標準偏差を示した。

【0215】

５．４．３ ＳＹＰＲＯ－オレンジ及びＳＹＢＲ－ゴールドを用いた熱シフトアッセイ
導入部に記載されているように、ＤＳＦは、賦形剤、緩衝液系、及びｐＨ範囲がカプシドの熱安定性に及ぼす影響を研究するための魅力的なツールである。製剤研究２のプルポイント分析間で方法評価を行った。１．０・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を有する試料を用いて、示差走査蛍光測定法を実施した。これらの力価は非常に低い濃度に対応するため、ＳＹＰＲＯ－オレンジ及びＳＹＢＲ－ゴールドを添加してシグナル強度を増強した。カプシド変性により引き起こされる熱シフトを観察し、融解温度を決定することが目的であった。図２３の結果は、いずれの試料においても熱シフトが観察されなかったことを示した。熱シフトは見られないが、図２４（Ａ）及び（Ｂ）は、染料含有試料の励起が、検出可能であり、かつ濃度に依存する蛍光シグナルを引き起こすことを示している。より高いＡＡＶ２濃度での更なる測定は行わなかった。

【0216】

６ 議論
６．１ ＡＡＶ２の特性評価のための分析方法の評価及び開発
予想されるように、残存宿主細胞不純物が試料中に存在するため、ＤＮａｓｅ Ｉ試料処理によって力価が低下した。この消化ステップがなければ、宿主細胞ＤＮＡがウイルス力価の定量化を妨げるため、力価は過大評価されるであろう。２つのニユットのＤＮａｓｅ Ｉを用いたＤＮａｓｅ Ｉ処置時の同様の力価低下は、Ｄｏｂｎｉｋ及びその同僚によって観察及び記載された［７０］。このような不純物の存在は、ＤＮａｓｅ Ｉ消化ステップの必要性を浮き彫りにするだけでなく、潜在的な凝集についての危険シグナルでもあった。Ｗｒｉｇｈｔ及びその同僚が提案したように、残存宿主細胞ＤＮＡは、濃度はかなり低いが、凝集を媒介することができる［３０］。

【0217】

熱カプシド開口は、ＡＡＶ２力価を増加させ、ｑＰＣＲサイクルの開始時の短いカプシド開口時間は、分析前に全てのウイルスゲノムを放出するのに十分ではないことを示した。両方の処理を組み合わせることで、供給元によって与えられた力価の正確な決定が可能になった。

【0218】

エッペンドルフ接着実験では、試料をエッペンドルフチューブ中で２４時間保存した後に混合したときに、ＡＡＶ２力価が増加することが示された。しかしながら、増加が、ＡＡＶをチューブ壁から脱着させることによって引き起こされるのか、又は試料を均質化することによって引き起こされるのかどうかを結論付けることはできない。それにもかかわらず、この知識を適用し、エッペンドルフチューブに保存されている試料は、その容量の半分を用いて少なくとも１０回上下にピペッティングすることによって常に混合された。

【0219】

ＴＥＭ測定については、銅グリッド上の十分なカプシドを可視化するために、標準的なネガティブ染色プロトコルの修正及び力価の増加が必要であることが示された。力価が高いほど、グリッド上のＡＡＶカプシドの数が多くなることは妥当であると思われるが、文献では、１０^９～１０^１０ｖｇ／ｍＬの力価によってグリッド上で高量のカプシドをもたらされたことが既に示されている。したがって、試料の調製における主な改変がカプシド数の増加をもたらしたと想定することができる。特に、銅グリッド上でのベクター懸濁液の長期間にわたるインキュベーション時間によって、より多くのカプシドが接着することが可能となり、したがって、以後の洗浄ステップ中に洗い流すことができなかった。結果は、試料が、空のカプシドよりもわずかに多くの完全なカプシドを含んでいることを示した。これは、精製されていないＡＡＶ試料が、通常、非常に多くの空のカプシドを有するため、ＡＡＶ２供給元がＡＡＶを十分に精製したことを示す指標である。

【0220】

ゼータ電位測定は拡散バリア法を用いて行うことができ、１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価は、読み取りを得るのに十分であることが示された。ゼータ電位方法評価の結果は、ｐＨ７．５で－９．４６ｍＶのＡＡＶ２表面電位を示したが、これはｐＨ７．５で測定したＡＡＶ２の文献値に対応する。

【0221】

ＧＦＰ発現アッセイの開発中に、濃度に依存するＧＦＰ蛍光は、プレートリーダーで測定することができることが示された。蛍光強度は、蛍光測定の前に、ウェル中の培地をＰＢＳに置き換えたときに増加した。この結果の説明は、フェノールレッドを含む培地がＧＦＰのクエンチャーとして機能することである。フェノールレッドによる追加の妨害は、細胞培養ｐＨがシフトしているときに引き起こされ得、したがってフェノールレッド吸光度スペクトルが変化する。このような混乱因子を防ぐために、測定中に培養培地をＰＢＳに置き換えることに決め、一方の側及び他方の側のシグナル強度を得てし、経時的に一貫した結果を保証した。

【0222】

第１の発現実験は、文献に記載された４８８ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの発光波長で行った。シグナル強度が非常に低かったため、ｒＧＦＰ対照を用いて波長走査を行うことに決めた。この対照を使用して、理想的な励起波長及び発光波長（すなわち、それぞれ４６０ｎｍ及び５１５ｎｍ）を同定した。これらの波長の使用は、シグナル強度を更に増加させた。

【0223】

次のステップにおいて、プレートリーダーが、異なるＭＯＩによって引き起こされるＧＦＰ発現を区別することができることが示された。予想どおり、この結果は、濃度依存性の発現を浮き彫りした。同様に、ＧＦＰ発現は、２４時間後に既に検出されたが、経時的に更に増加した。このような迅速な蛍光の発生は、一方では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが、Ｕ２ＯＳ細胞におけるＧＦＰ発現をモニタリングするのに好適な効率的かつ強力なプロモーターであることを示し、他方では、ＡＡＶ形質導入が、細胞とともに行ったインキュベーションから数時間以内に生じたことを示した。見出された結果は、Ｂａｒｔｌｅｔｔ及びその同僚によって裏付けられ、彼らは、ＡＡＶ感染及び核へのゲノム形質導入が３～４時間以内に起こることを示した［３９］。

【0224】

全てのＭＯＩにおいて３～４日後に最大の発現に達した。細胞生存率アッセイを見ると、これは細胞密度及び細胞生存率と相関することが明らかとなる。４日後にウェルプレートで最高の細胞密度が観察され、細胞が更に密度を増加させることができないことが示された。細胞密度は更に２日間一定のままであり、細胞が平衡状態にあることが示された。７日後に細胞生存率は有意に低下し、これはＧＦＰ発現アッセイでも見ることができる。ＧＦＰ発現細胞が死滅していたため、７日後にＧＦＰ発現、したがって蛍光の低下が見られた。細胞生存能が失われる理由は、ウェル内の細胞密度が高すぎること、及び細胞の恒常性を維持するのに十分な栄養素が不足していることである。

【0225】

１０^３ｖｇ／細胞のＭＯＩが測定可能なＧＦＰ発現をもたらしたにもかかわらず、発現の変化は長い時間にわたって検出されなかった。したがって、このＭＯＩを検出の最下限として定義した。１０^４ｖｇ／細胞のより高いＭＯＩは、既に、時間依存性のＧＦＰ発現をもたらした。これらの結果に基づいて、１０^５ｖｇ／細胞のＭＯＩで製剤研究を行うこととした。このようなＭＯＩは、強いＧＦＰ発現及び蛍光をもたらした。同様に、検出下限に直接到達することなく、発現の低下をモニタリングすることが可能であった。１０^６のより高いＭＯＩと比較した別の利点は、１つのみではなく５つの複製においてＧＦＰ発現を定量化することが可能であったことである。細胞生存率アッセイは、この密度によって、細胞及び発現を失うことなく、４日間にわたってＧＦＰ発現をモニタリングすることが可能になったことが示した。より高い密度では、そのような長い観察が保証されず、これは不十分な発現時間のリスクを露呈し得る。一方、低い密度では、測定可能なシグナルを発生させるには小さすぎる可能性がある。

【0226】

ＡＡＶ２粒子サイズ分布をモニタリングする方法としてのＤＬＳの評価の際に、ＡＡＶ２カプシドを１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価で検出することができることが示された。単純な後方散乱分析は、ＡＡＶ２に帰属する約２０～３０ｎｍのサイズ分布を明らかにすることができた。ＤＬＳはＡＡＶ２を検出することができるが、約６００ｎｍに別のピークが現れた。その後の実験により、凝集体がこれらのサイズ分布を生じさせたことが示された。シグナル強度が非常に低かったため、ＡＡＶの検出下限について機器製造元に連絡した。デバイス供給元によると、使用されたカプシド量は検出下限に等しかった。ＭＡＤＬＳ測定を行い、後方散乱測定から得られた結果を確認した。前方散乱は後方散乱及び側方散乱よりも感度が低いため、２０～３０ｎｍの予想される範囲でのサイズ分布を検出することができなかった。したがって、製剤研究では、後方散乱測定のみを適用することを決定した。

【0227】

導入部に記載のように、ＤＳＦを用いた熱シフトアッセイは、製剤研究内での価値あるデータを追加することができる。染料を添加したにもかかわらず、熱シフトは検出されなかった。染料の励起は濃度に依存するシグナル強度を示し、これにより、十分な染料が試料中に存在することが証明された。したがって、失われた熱シフトは、小さすぎるＡＡＶ２濃度によって生じ、不十分な染料濃度によって生じない。より高い力価が必要とされたため、更なる実験を行わなかった。文献から、約６・１０^１１～１・１０^１２ｖｇ／ｍＬの力価を使用したときの測定可能な熱シフトを予想した［１０２］。

【0228】

６．２ 製剤研究１
製剤研究１においてｑＰＣＲ発現アッセイをＴ０で行った後、全ての製剤が、目標とするよりも低い力価を含むことが明らかになった。この所見は、ＧＦＰ発現アッセイによって確認された。力価が低いにもかかわらず、アルブミン及びヒアルロン酸を含む製剤において、有意なＧＦＰ発現が観察された。有意な発現が見られたが、ｑＰＣＲ測定は、他の製剤とは対照的に、同様の力価を示した。その結果に基づき、アルブミン及びヒアルロン酸は、ｑＰＣＲ法を妨害し、ベクター力価を人工的に低下させる可能性があると仮定した。

【0229】

全ての製剤において観察される力価の損失は、ＡＡＶ凝集又はフィルターへの吸着によって説明することができる。方法評価中のＤＬＳの結果は、６４３ｎｍのＺ平均値を明らかにしたため、第１の仮説を潜在的に裏付けている。したがって、その問題の理由及び解決策を明らかにするように、製剤研究２のプルポイント間の追加の実験を設計した。

【0230】

追加の実験に示されるように、ＡＡＶ２製剤は、ＰＶＤＦフィルター商品とは関係なく、１５０ｍＭ ＮａＣｌが提供されるときに滅菌濾過され得る。文献によれば、そのような塩濃度はＡＡＶ２の凝集を防止するが、吸着を完全に排除することはできない［３０］。

【0231】

追加のＤＬＳ測定では、塩化ナトリウムが凝集を防止し、Ｚ平均値を非常に低くすることが示された。粒子サイズ分布をより詳しく見ると、１５０ｍＭ ＮａＣｌの補充時には、２０～３０ｎｍの粒子分布が現れ、未凝集のＡＡＶ２が存在することが示された。この分布は、ＮａＣｌが提供されない製剤では認められなかった。代わりに、そのような製剤では、ベクター凝集を示す７８２ｎｍのピークのみが明らかになった。

【0232】

１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む製剤の滅菌濾過では、滅菌濾過されていない試料の測定と比較して、より低い標準偏差が得られた。興味深いことに、約２７３ｎｍのサイズ分布がまだ現れた。多分散性指数により、滅菌濾過にもかかわらず、試料が多分散であることが確認された。これは、凝集体を形成するようになる濾過後のＡＡＶベクターの再平衡化に起因し得る。

【0233】

両方の場合（ＮａＣｌが有り及びなし）において、凝集体の存在がＤＬＳによって観察されたことは言及に値する。滅菌濾過、続いて、ｑＰＣＲを用いたＡＡＶ２力価定量化を行うことだけが、１５０ｍＭ ＮａＣｌを製剤に提供したときに、凝集が低減され、滅菌濾過が力価の損失を引き起こさなかったことを信頼して示すことができた。

【0234】

製剤研究は凍結乾燥後の製剤の安定性を評価することを目的としていたため、選択された製剤はＮａＣｌを含まなかった。これは、そのような高レベルのＮａＣｌを使用することにより、凍結点の低下がもたされ、したがって、極めて長い凍結乾燥サイクルの開発が必要になるからである。一方、ＡＡＶ凝集を防止する可能性を有し、かつ、同時に凍結乾燥させることができる潜在的な代替物として、アルブミン及びヒアルロン酸を調べた。

【0235】

ＧＦＰの発現は、製剤研究１中に、製剤６及び７において観察された。この所見は、より少ない凝集が起こり、より多くのベクターが滅菌フィルターを通過したことを示した。アルブミンを含む製剤は、ヒアルロン酸を含む製剤よりも多くの発現を示したが、これは、より効率的な凝集防止によって生じた可能性が高い。それにもかかわらず、ＧＦＰの発現は、方法開発中に測定された発現と比較して低かったが、これは、凝集が完全に防止されていないことを示している。

【0236】

６．３ 製剤研究２
全ての製剤を成功裏に凍結乾燥させた。いくつかの凍結乾燥ケーキでは、軽微な亀裂が明らかになったが、これは、スクロースを含む製剤で一般的に観察されるケーキ収縮及び使用される製剤が小容量であることによって説明できる。

【0237】

第２の製剤安定性研究は、研究１とは対照的に一般に高い力価を示した一方、アルブミン及びヒアルロン酸を含む製剤は、それらのＧＦＰ発現は高いが、比較的低い力価を示した。これは、文献にそのような現象が記載されていないため、更なる調査が必要な仮説であるｑＰＣＲでの両方の賦形剤の潜在的な妨害を指摘している可能性がある。－８０℃までのＦ／Ｔサイクル後の１つの外れ値を除いて、力価は試験過程中に一貫性を維持した。

【0238】

試験全体を通じて、力価は、緩衝液及びｐＨとは関係なく、一定であることが示された。注目すべきは、唯一のストレス条件としての攪拌ストレスが、いくつかの製剤において有意な力価低下を引き起こすことである。その仮説は、攪拌ストレスがいくつかのカプシドを破壊し、それらのゲノムの放出を引き起こしたというものである。次いで、ＤＮａｓｅ Ｉ消化ステップ中に、このＤＮＡを消化し、除去する。アルブミン、ヒアルロン酸を含む試料は、振盪後に力価低下を記録しなかった。

【0239】

しかしながら、ｐＨ６．８を有するＬ－ヒスチジン及びリン酸ナトリウムは、攪拌ストレスに対して耐性であった。いくつかの要因が原因となり得る。まず、Ｌ－ヒスチジンｐＨ５．５製剤は、力価低下に耐性であったＬ－ヒスチジンｐＨ６．８製剤と比較して力価低下を記録したため、ｐＨがカプシドの安定性に影響を及ぼすと結論付けられた。より高い７．５のｐＨでは、振盪ストレスに対する安定性が低下するようであった。したがって、約６．８のｐＨは、カプシド安定性に関して好ましいことが示された。

【0240】

凍結乾燥を成功裏に行い、該凍結乾燥は全く力価低下をもたらさなかった。更に、ＡＡＶは、力価の損失を観察することなく凍結乾燥された。

【0241】

力価測定とは対照的に、導入遺伝子発現は、療法の効力について情報を提供する。異なる温度及びストレス時に、力価は殆ど一定のままであるにもかかわらず、発現は急速に減少する。異なるストレスへの曝露は、－８０℃までの凍結融解サイクルが、－２０℃までの凍結融解サイクルと比較して、同様の発現をもたらし、いくつかの場合では、より高い発現をもたらすことを示した。この所見は、－８０℃の凍結融解サイクルが、－２０℃の凍結融解サイクルとは対照的に、導入遺伝子発現により悪影響を及ぼすことを提案したＣｒｏｙｌｅ及びその同僚と矛盾する［２７］。リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）にアルブミン又はＰ１８８を添加することにより、Ｔ０でのＧＦＰ発現と比較して、両方の温度の凍結融解サイクルに耐性が生じた。アルブミンは、形質導入効率の障害をもたらす大きなカプシド変化を防ぐことからカプシドを保護するようであった。攪拌ストレス及び得られた力価低下は、ＧＦＰ発現においても観察された。特に、Ｐ１８８を含む製剤８は、Ｔ０とは対照的に、攪拌ストレスにさらされたときに、そのＧＦＰ発現の半分しか記録されなかった。Ｐ１８８では、ＰＳ８０と比較して、攪拌ストレスからのカプシドの保護がより悪くなると結論付けられた。この所見は力価測定によって確認された。驚くべきことに、力価の差異は測定されたが、製剤４と製剤５との間に発現差は観察されなかった。Ｌ－ヒスチジンｐＨ６．８と比較したＬ－ヒスチジンｐＨ５．５との間の振盪後の発現の差異は、ｑＰＣＲ試験で観察された力価低下によって説明することができる。ｐＨ５．５でのカプシドは、安定性が低く、したがって、攪拌及び温度ストレスの影響を受けやすい。それにもかかわらず、全ての製剤は、力価低下を記録していない製剤と同様に、振盪時に発現の損失があった。このような結果は、振盪ストレスがカプシド破壊を引き起こすか、又はカプシド変化をもたらし、これによりベクターの形質導入効率が低下することを示した。

【0242】

Ｌ－ヒスチジン、又はリン酸緩衝液へのアルブミンの添加は良好に機能し、言及した全てのストレスにおいてわずかなＧＦＰ発現低下のみを示した。ＡＡＶ２の融解温度は約７０℃であるが、４０℃への曝露は任意の発現を消失させるのに十分である。このような温度への曝露は、不可逆的なカプシド変化をもたらし、ベクター感染性を無効にしたと仮定された。

【0243】

研究全体を通して、クエン酸ナトリウムを含む製剤は、Ｔ０で既に他の全ての製剤とは対照的に、非常に少ないＧＦＰ発現を観察したことが観察された。クエン酸塩はキレート剤として機能することが知られている。このキレート能力が、観察される発現／効力の低下をもたらしたかどうかは、評価中のままである。

【0244】

５．５の酸性ｐＨは、より高いｐＨを有する製剤と比較して、Ｔ０で既に非常に低い発現をもたらした。導入部に記載されているように、より低いｐＨは、ＶＰ１タンパク質のＮ末端の細孔の開口及び外在化をもたらす。このような立体構造変化により、エンドソーム脱出が可能になるが、これは、受容体媒介性取り込みを妨害し、カプシド安定性を損ない、又は成功したエンドソーム脱出をその後に妨げる可能性がある。

【0245】

全ての製剤を－２０℃又は－８０℃まで凍結させ、続いて３ヶ月間保存したことにより、殆どの製剤においてＧＦＰ発現が大きく低下した。再び、Ｐ１８８又はアルブミンを含むリン酸ナトリウム緩衝液は、発現低下に耐性であり、Ｔ０で同様の発現を示した。両方の製剤は、凍結融解サイクルに対する耐性を既に示していた。このような特性が示されたことで、Ｐ１８８又はアルブミンのいずれかを補充したリン酸ナトリウム緩衝液は、優れた保存用及び出荷用緩衝液となる。このような好ましい特徴は、このＰ１８８がＡＡＶ製造元によって頻繁に使用される理由を説明している。－２０℃及び－８０℃で３ヶ月間保存することは、アルブミンを含む製剤においても非常に成功し、更に、２～８℃での保存中に発現を安定化させた。一方、Ｐ１８８を含む製剤は、２～８℃で保存したときに有意な発現低下を記録した。したがって、その主な使用は、－２０℃又は－８０℃での長期保存に限定されるべきである。そのような理由により、アルブミンの添加は、Ｐ１８８よりも優れた新しい魅力的な代替保存用賦形剤を提供する。

【0246】

他の全ての製剤は、２～８℃で１ヶ月間又は３ヶ月間の保存とは対照的に、凍結されたときに同様の発現を示した。製剤は、２～８℃で１ヶ月間保存したとき、３ヶ月間と比較して発現の変化を示さなかった。この結果は、将来の安定性試験の設計のために価値がある。特に、ＧＦＰ発現の低下をもたらす不安定性は、２～８℃での１ヶ月間の保存前に生じたことを示している。最大の減少は、２～８℃での１ヶ月間の保存後に達成され、３ヶ月間保存した場合には更なる減少はなかった。いくつかの刊行物及びＡＡＶ供給元の推奨事項は、－２０℃でベクターを保存しないことを勧告していたが、－８０℃で３ヶ月間保存したときと比較して、－２０℃で保存したときの発現に有害な影響は評価されなかった。長期保存の影響については、まだ評価中である。

【0247】

本明細書での結果は、２５℃で２週間だけ保存することで、２～８℃での保存とは対照的にＧＦＰの発現が非常に小さくなり、製剤は発現の低下を防ぐことができなかったことを示した。興味深いことに、発現は２週間後と比較して４週間後に同様であったが、３ヶ月間保存した場合には更に減少した。ＡＡＶ２は、そのような温度では明らかに不安定であった。

【0248】

本研究の主な目標は、ＡＡＶ２製剤の凍結乾燥を評価することであった。２～８℃で保存された凍結乾燥製剤は、２～８℃で保存された液体製剤と同様の発現をもたらすことが示されたが、唯一の違いは、液体製剤とは対照的に３ヶ月間保存されたときに、発現の更なる低下が見られたことであった。賦形剤としてのヒアルロン酸ナトリウムは、ガラス転移温度を上昇させる特徴を有し、したがって、凍結乾燥に好適である。好ましい特性にもかかわらず、ヒアルロン酸ナトリウムを含む製剤は、他の製剤と比較して、より低いＧＦＰ発現を示した。本明細書での結果は、液体製剤が、凍結乾燥製剤と比較して、２～８℃又は２５℃で１ヶ月間又は２ヶ月間保存したときに、同様の又はより高いＧＦＰ発現を示したことを示した。この結果は、凍結乾燥試料内で９０日間感染力価が一定に保たれたことを示したＣｒｏｙｌｅ及びその同僚の結果と矛盾する［２７］。

【0249】

ＡＡＶ２ベクター製剤へのアルブミンの添加は、他の製剤とは対照的に、研究全体を通して最も高いＧＦＰ発現をもたらした。１つ理由は、アルブミンがカプシドに結合し、追加の層を形成することであり得る。カプシドに結合したアルブミンでは、ウイルスの取り込みは、アルブミン特異的受容体によって更に媒介され、ＨＳＰＧ受容体依存性であるだけではない［１０５］。アルブミンが、温度及びストレスに依存する構造変化からウイルスカプシドを更に保護するかどうかを調べるために、更なる調査を行う必要があった。

【0250】

一般に、ＧＦＰ発現測定は、力価と比較して、異なる製剤、賦形剤、曝露されるストレス及び温度によって発現がより影響を受けることを浮き彫りにした。力価測定は、信頼できる安定性予測因子ではないことが示された。逆に、攪拌時の力価低下は、ＧＦＰ発現低下と関連付けられる。力価測定は、ＡＡＶ２の安定性に関するわずかな予測を可能にし、用量の推定に不可欠であるが、それらを安定性の予測にのみ使用すべきではない。力価測定は、治療効果に重要な導入遺伝子発現を表すものではなく、これは、力価よりもストレスに非常に感受性があることが示された。

【0251】

凝集していないＡＡＶ２製剤については、約２５ｎｍのＺ平均値が予想された。ＤＬＳ測定は、アルブミンの添加が低いＺ平均値をもたらし、凝集が防止されなかったことを示した。一方、他の全てのＡＡＶ２製剤では、Ｔ０で既に凝集していることが明らかになった。多分散性測定は、これらの結論を支持し、製剤６が単分散であることを示した。アルブミンはカプシドに結合し、カプシド－カプシド相互作用の発生を防止するとことが想定された。凍結乾燥はＺ平均値を著しく増加させなかったが、アルブミンを含む製剤は多分散となった。Ｚ平均値の大きな差異が製剤間で見られた。製剤２、３、及び７は、製剤１、４、５、及び８と比較して、非常に小さいＺ平均値を有した。現在の知見では、これらの製剤がベクター凝集に好まし特徴を有していたかについて結論を導き出すことはできない。製剤６を除く全ての製剤が凝集したとしか結論付けができない。

【0252】

光遮蔽法を用いた目視で見えない粒子の測定では、濃度の問題が存在した。この方法は、８００～１０００μＬの容量を使用した。導入部に記載されているように、製剤の容量は、わずか２４５μＬであった。したがって、試料を１・１０^１０ｖｇ／ｍＬの力価まで希釈した。試料希釈は確実にデータ品質を損なうものであり得、良好な実施ではない場合があるが、そのような測定を行う唯一の方法であった。製剤バイアル中の粒子数は、プラセボバイアル中よりも大きくないことが示された。粒子数は１０００粒子／ｍＬを超えなかった。製剤及びプラセボ１中のより高い粒子数は、ポリソルベート８０の自己酸化及び加水分解によって生じ得る。ゼータ電位測定値の方法評価により、そのような測定値がＡＡＶ２特性評価に適用することができることが示された。評価方法中に測定された表面電位は、文献に記載される値と相関している。特に、ヒアルロン酸ナトリウムを含む製剤は、ゼータ電位内で変動があったことを明らかにした。変動にもかかわらず、ヒアルロン酸ナトリウムは、Ｔ０で最低のゼータ電位を引き起こした。負に帯電したヒアルロン酸がカプシドに結合することで、この所見が説明され得る。ゼータ電位は、コロイド安定性の指標である。負又は正のゼータ電位が大きいほど、粒子間の反発は大きくなり、小さいほど、粒子の凝集挙動は小さくなる。文献によると、試験した全ての製剤では、初期不安定性を明らかにし、かつ、凝集する傾向があるゼータ電位を有する［９７］。製剤６は凝集を示さなかったにもかかわらず、ゼータ電位の有意な変化は観察されなかった。結果は、ゼロに近い小さなカプシド電位のみがＡＡＶ２で得られることを示したが、これはカプシドが電位の大きな差異を明らかにしないことを示している。この値と凝集していないＡＡＶ２ベクターの文献値とを比較すると、表面電位が影響を受けず、したがって、そのようなベクターのコロイド安定性を正確に明らかにしないことは注目に値する。この結果により、ＡＡＶ２の製剤開発におけるゼータ電位測定の使用及び利点が疑問視された。ゼータ電位はｐＨによって影響を受け、これは、最大のゼータ電位があることが明らかになった製剤１に見ることができる。低ｐＨ製剤の酸性環境は、約６．４のｐＩでカプシドをプロトン化し、これにより表面電位が増加した。

【0253】

世界的な新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の拡大中に検査施設が閉鎖されたため、３ヶ月の時点が完全に分析されなかったことは言及に値する。先に得られた結果に基づいて、３ヶ月の安定性後にＧＦＰ発現アッセイの実施を優先し、データを示して上記で論じた。残念ながら、力価分析並びに粒子及びゼータ電位の測定を行う時間は残されていなかった。

【0254】

７ 結論
このプロジェクトの最初の部分では、ＡＡＶ２の特性評価に使用される分析方法を評価及び開発した。まず、汎用ＩＴＲ ｑＰＣＲは、ＴａｑＭａｎアプローチをＳＹＢＲ－グリーンアプローチと交換することによって成功裏に最適化された。２単位のＤＮａｓｅ Ｉの添加及び熱カプシド開口ステップの実施によって、方法の精度が向上した。導入遺伝子発現をモニタリングするために、プレートリーダーアッセイを開発し、Ｕ２ＯＳ細胞がＡＡＶ２誘導発現を定量化するのに好適な細胞株であることが示された。ＴＥＭを用いて、約６０％のカプシドがウイルスＤＮＡを含んでいたことが示された。完全なカプシドと空のカプシドとの比率が成功裏に決定されたにもかかわらず、測定は、より時間のかからないスケーラブルなアプローチの必要性を浮き彫りにした。ＤＬＳによる粒子分析を用いて、１・１０^１１ｖｇ／ｍＬの力価を検出することができたが、検出の下限にあることが示された。ゼータ電位測定により、－９．４６ｍＶの文献値が確認された。

【0255】

第２のステップでは、３ヶ月のＡＡＶ２製剤安定性研究において、分析方法を適用及び開発した。配合後に大きな力価損失が観察された後、第１の製剤研究を終了した。これらの調査により、ＡＡＶ２が製剤化中に速やかに凝集し、したがって濾過されたことが示された。１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加することにより、凝集が防止さえれ、滅菌濾過が可能となった。ｑＰＣＲ滴定と組み合わせた滅菌濾過のみが、１５０ｍＭ ＮａＣｌが凝集を著しく低減することを正確に示した。

【0256】

第２の製剤研究では、１％のアルブミンの添加によってこの研究の経過中の凝集が防止されることが示された。一方、他の全ての製剤は、Ｔ０で既に凝集していた。製剤６及び８は、凍結及び凍結融解サイクル時に発現低下を示さず、したがって保存緩衝液として好適である。導入遺伝子の発現は、温度に依存した様式（４０℃＞２５℃＞２～８℃≧－２０／－８０℃）での保存時に急速に低下した。凍結乾燥、続いて２５℃での保存は、２５℃で保存されたそれぞれの液体製剤と比較して低い発現をもたらした。この研究では、２～８℃での保存は、１ヶ月の保存後には既に最小の発現に達していたことが示された。これは、研究の早い段階でより多くのプルポイントを追加する必要性を示している。

【0257】

力価はこの研究の過程中に一定のままであり、攪拌ストレスによってのみ影響を受けた。ポリソルベート８０の添加は、振盪時の有意な力価低下から製剤を保護した一方、Ｐ１８８は、保護効果を明らかにすることができなかった。アルブミン及びヒアルロン酸の補充はｑＰＣＲ力価定量化を妨げる可能性があることが本明細書で示されている。

【0258】

分析方法のこの評価及び開発並びに製剤研究内のそれらの応用により、ＡＡＶ２ベクター製剤開発の分野における貴重な知見が得られた。

【0259】

８ 参考文献
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［１６］Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉ，Ｒ．，Ａｒｇｎａｎｉ，Ｒ．＆ Ｍａｒｃｏｎｉ，Ｐ．ＨＳＶ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．４，１２３－１５６（２０１０）．
［１７］Ｃｈｉｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｓａｆｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６，３０６７５－３０７０３（２０１５）．
［１８］Ｂｅｓｓｉｓ，Ｎ．，ＧａｒｃｉａＣｏｚａｒ，Ｆ．Ｊ．＆ Ｂｏｉｓｓｉｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１，１０－１７（２００４）．
［１９］Ｈｏｌｌｏｎ，Ｔ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｒｅｆｌｅｃｔ ｏｎ ｆｉｒｓｔ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｅａｔｈ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，６（２０００）．
［２０］Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ４ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ＳＣＩＤ－Ｘ１ Ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｌａｔｅｓｔ ｖｅｒｓｉｏｎ：Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ４ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ＳＣＩＤ－Ｘ１．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１８，３１３２－３１４２（２００８）．
［２１］Ｖａｎｃｅ，Ｍ．Ａ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ａ．＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ＡＡＶ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ（２０１５）．
［２２］Ｓｃｏｔｔ，Ｌ．Ｊ．Ａｌｉｐｏｇｅｎｅ ｔｉｐａｒｖｏｖｅｃ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｉａｌ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｄｉｓ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌ．７５，１７５－１８２（２０１５）．
［２３］Ｄｅ Ｇｉｏｒｇｉ，Ｍ．＆ Ｌａｇｏｒ，Ｗ．Ｒ．Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔ Ｄｅｂａｋｅｙ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｊ．１５，６２－６９（２０１９）．
［２４］Ｔｒａｐａｎｉ，Ｉ．＆ Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，Ａ．Ｓｅｅｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｇｈｔ ａｆｔｅｒ ２５ Ｙｅａｒｓ ｏｆ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２４，６６９－６８１（２０１８）．
［２５］Ａｌ－Ｚａｉｄｙ，Ｓ．Ａ．＆ Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．Ｆｒｏｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ＳＭＡ Ｔｙｐｅ １．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１００，３－１１（２０１９）．
［２６］Ｋｅｅｌｅｒ，Ａ．Ｍ．＆ Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｌｉｇｈｔ ｏｆ Ｌｕｘｔｕｒｎａ（ａｎｄ Ｚｏｌｇｅｎｓｍａ ａｎｄ Ｇｌｙｂｅｒａ）：Ｗｈｅｒｅ Ａｒｅ Ｗｅ，ａｎｄ Ｈｏｗ Ｄｉｄ Ｗｅ Ｇｅｔ Ｈｅｒｅ？ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌ．６，６０１－６２１（２０１９）．
［２７］Ｃｒｏｙｌｅ，Ｍ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８，１２８１－１２９０（２００１）．
［２８］Ｘｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．１１，３０５－３０８（２００５）．
［２９］Ｇｒｕｎｔｍａｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｉａｌｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６，７１－７６（２０１５）．
［３０］Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ２ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｔｓ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２，１７１－１７８（２００５）．
［３１］Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ５ ｔｏ ２，３－Ｌｉｎｋｅｄ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２０６１０－２０６１６（２００１）．
［３２］Ｒａｙａｐｒｏｌｕ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７，１３１５０－１３１６０（２０１３）．
［３３］Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ １ ＶＰ１－Ｕｎｉｑｕｅ Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃａｐｓｉｄ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７，４９７４－４９８４（２０１３）．
［３４］Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｒｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７，９７１－９８１（２０１６）．
［３５］Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＶＰ１ Ｕｎｃｏｖｅｒｓ Ｎｅｗ Ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４，８８８８－８９０２（２０１０）．
［３６］Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｂｏｔｔｃｈｅｒ，Ｂ．，ｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｉｅｔｈ，Ｃ．Ｗ．，Ｂｌｅｋｅｒ，Ｓ．＆ Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ａ．Ａ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ Ｃａｐｓｉｄ Ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ Ｈｉｄｄｅｎ ＶＰ１ Ｎ Ｔｅｒｍｉｎｉ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９，５２９６－５３０３（２００５）．
［３７］Ｂｌｅｋｅｒ，Ｓ．，Ｓｏｎｎｔａｇ，Ｆ．＆ Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ａ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎａｒｒｏｗ Ｐｏｒｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｆｉｖｅｆｏｌｄ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ａｘｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ Ｃａｐｓｉｄｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｄｕａｌ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９，２５２８－２５４０（２００５）．
［３８］Ｌｅｖｙ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２．Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１６５，１４６－１５６（２００９）．
［３９］Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．，Ｗｉｌｃｈｅｒ，Ｒ．＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｅｎｔｒｙ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，２７７７－２７８５（２０００）．
［４０］Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ａ．＆ Ｃｈａｐｍａｎ，Ｍ．Ｓ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－２ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８５，４３４－４４３（２００９）．
［４１］Ｑｉｎｇ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｉｓ ａ ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５，７１－７７（１９９９）．
［４２］Ｐｉｌｌａｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５３０，１０８－１１２（２０１６）．
［４３］Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｅ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｕｎｃｏａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｌｅａｓｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７，２９９４－３００２（２０１３）．
［４４］Ｅｉｃｈｈｏｆｆ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｂｏｄｙ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＡＡＶ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．１５，２１１－２２０（２０１９）．
［４５］Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌ．１，４２７－５１（２０１４）．
［４６］Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．＆ Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１１）．
［４７］Ｃｏｕｒａ，Ｒ．Ｄ．Ｓ．＆ Ｎａｒｄｉ，Ｎ．Ｂ．Ｔｈｅ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．４，（２００７）．
［４８］Ｗａｎｇ Ｙ，Ｌ．Ｃ．，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｌ．Ｙ．＆ Ａｓｌａｎｉｄｉ ＧＶ，Ｊ．Ｇ．Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｐｕｚｚｌｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．０９，（２０１５）．
［４９］ＭｃＣａｒｔｙ，Ｄ．Ｍ．Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ；ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６，１６４８－１６５６（２００８）．
［５０］Ｓａｌｇａｎｉｋ，Ｍ．，Ｈｉｒｓｃｈ，Ｍ．Ｌ．＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３，（２０１５）．
［５１］Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｒＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２，１０４５－１０５４（２０１８）．
［５２］Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｅｒｓｉｓｔ ａｓ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２，７８７５－７８８５（２００８）．
［５３］Ｓｃｈｎｅｐｐ，Ｂ．Ｃ．，Ｃｌａｒｋ，Ｋ．Ｒ．，Ｋｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｄ．Ｌ．，Ｐａｃａｋ，Ｃ．Ａ．＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｆａｔｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，３４９５－３５０４（２００３）．
［５４］Ｄｏｎｇ，Ｂ．，Ｎａｋａｉ，Ｈ．＆ Ｘｉａｏ，Ｗ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｆｏｒ ｏｖｅｒｓｉｚｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８，８７－９２（２０１０）．
［５５］Ｄｏｒａｎｇｅ，Ｆ．＆ Ｌｅ Ｂｅｃ，Ｃ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ４，１１９－１２９（２０１８）．
［５６］Ｆａｇｏｎｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，１－７（２０１２）．
［５７］Ｗｅｒｌｉｎｇ，Ｎ．Ｊ．，Ｓａｔｋｕｎａｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｔｈｏｒｐｅ，Ｒ．＆ Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６，８２－９２（２０１５）．
［５８］Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄｓ ｂｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７，１２２－１２８（２００３）．
［５９］Ａｒｙａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．５，２０９－２１９（２００５）．
［６０］Ｐｏｎｃｈｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｔｈｅ ＴａｑＭａｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ，ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３，１－１３（２００３）．
［６１］Ｔａｊａｄｉｎｉ，Ｍ．，Ｐａｎｊｅｈｐｏｕｒ，Ｍ．＆ Ｊａｖａｎｍａｒｄ，Ｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ａｄｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．３，８５（２０１４）．
［６２］Ａｒｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｓｓ－ｐｌａｔｆｏｒｍ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＳＹＢＲ(R) Ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ，ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＭＡＱＣ）ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９，１－１２（２００８）．
［６３］Ｚｈａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ（ＴａｑＭａｎ(R) ａｎｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ ａｎｄ Ｂａｂｅｓｉａ ｂｏｖｉｓ，ａｎｄ ａ Ｎｏｖｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ－ＩＴＳ１－ＰＣＲ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｂ．ｂｏｖｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．３，１－１５（２０１６）．
［６４］Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｃｕｉ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｘｉａｏ，Ｗ．＆ Ｘｕ，Ｒ．Ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｄ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｑＰＣＲ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｉｔｒａｔｉｎｇ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ．１９，１８７－１９３（２０１３）．
［６５］Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，１８－２８（２０１２）．
［６６］Ｒｏｈｒ，Ｕ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｆａｓｔ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ－２ ｕｓｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０６，８１－８８（２００２）．
［６７］Ｄ’Ｃｏｓｔａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ：ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅｓ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｒｅｅ ＩＴＲ ｑＰＣＲ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．３，１６０１９（２０１６）．
［６８］Ｆｕｒｕｔａ－Ｈａｎａｗａ，Ｂ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．＆ Ｕｃｈｉｄａ，Ｅ．Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ａｓ ａ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０，１２７－１３６（２０１９）．
［６９］Ｈｉｎｄｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３，８６０４－８６１０（２０１１）．
［７０］Ｄｏｂｎｉｋ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０，（２０１９）．
［７１］Ｑｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｅｍｐｔｙ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ａｎｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０，１８３－１９２（２００７）．
［７２］Ｘｉｎｇｈｕａ，Ｐ．＆ Ｎａｚｍｕｌ，Ｋ．Ｅｍｐｔｙ Ｃａｐｓｉｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ：Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．８，（２０１８）．
［７３］Ｆｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｅｍｐｔｙ ｃａｐｓｉｄｓ ｔｏ ｓｕｐｐｏｒｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０，１４４－１５２（２０１９）．
［７４］Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｏｌｔｙｓ，Ｓ．Ｍ．＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｈａｒｖｅｓｔ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＧＭＰ ＦＩＸ ａｎｄ ＦＬＴ１ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４，２８７－２９７（２０１６）．
［７５］Ｌｏｃｋ，Ｍ．，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ．Ｒ．＆ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，５６－６４（２０１２）．
［７６］Ｗａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎ Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｅｍｐｔｙ ａｎｄ Ｆｕｌｌ Ｃａｐｓｉｄ Ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ＡＡＶ６．２．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．１５，２５７－２６３（２０１９）．
［７７］Ｎａｓｓ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．９，３３－４６（２０１８）．
［７８］Ｂｕｒｎｈａｍ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６，２２８－２４２（２０１５）．
［７９］Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ－２ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｖｉａ ａ ｎｏｖｅｌ ｃａｐｓｉｄ ＥＬＩＳＡ：Ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅｓ ｃａｎ ｌｉｍｉｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ－２．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６，１３２２－１３３０（１９９９）．
［８０］Ｋｕｃｋ，Ｄ．，Ｋｅｒｎ，Ａ．＆ Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＥＬＩＳＡｓ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０，１７－２４（２００７）．
［８１］Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５，２６６１－２６７５（２０１７）．
［８２］Ｄｉ Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤＧＦＲ ａｓ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＡＡＶ－５ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１３０６－１３１２（２００３）．
［８３］Ｄｕｏｎｇ，Ｔ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＡＡＶ－ＥＧＦＰ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １－９，７Ｍ８，ａｎｄ ８ｂ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＲＰＥｓ，ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｒａｔ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ．（２０１９）．
［８４］Ｅｌｌｉｓ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｅｘ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｎｉｎｅ ｎａｔｕｒａｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ１－９）ａｎｄ ｏｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．１０，１（２０１３）．
［８５］Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．，Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．，Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｎ．＆ Ａｙｕｓｏ，Ｅ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．８，１６６－１８０（２０１８）．
［８６］Ｄｅｙ，Ｓ．，Ｌａｒｅｄｊ，Ｌ．，Ｄａｍｊａｎｏｖｉｃ，Ｋ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．＆ Ｂｅａｒｄ，Ｐ．Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｂｏｎｅ－ｌｉｋｅ ｍａｔｒｉｘ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅｉｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９５，１５３９－１５４３（２０１４）．
［８７］Ｎｕｎｅｚ，Ｒ．，Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｍ．，Ｓａｅｋｉ，Ｙ．，Ｃｈｉｏｃｃａ，Ａ．＆ Ｆｒａｅｆｅｌ，Ｃ．Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １－ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｃｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ４４，９３－９９（２００１）．
［８８］Ｌｏｒｂｅｒ，Ｂ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆ．，Ｂａｉｌｌｙ，Ｍ．，Ｒｏｙ，Ｈ．＆ Ｋｅｒｎ，Ｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｄｕｃ．４０，３７２－３８２（２０１２）．
［８９］Ｓｔｅｔｅｆｅｌｄ，Ｊ．，ＭｃＫｅｎｎａ，Ｓ．Ａ．＆ Ｐａｔｅｌ，Ｔ．Ｒ．Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．８，４０９－４２７（２０１６）．
［９０］Ｎｉｋｏｌａｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｖｉｒｕｓｅｓ ｓｉｚｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０，１－１１（２０１５）．
［９１］Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．Ｐｒｏｄｕｃｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｇｒａｄｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ２，８０－９７（２０１４）．
［９２］Ｎａｓｏ，Ｍ．Ｆ．，Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ，Ｂ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｗ．Ｌ．＆ Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１，３１７－３３４（２０１７）．
［９３］Ｓｔｉｅｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １１，１－１６（２０１４）．
［９４］Ｖｏｇｅｌ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｚｅｔａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ Ｐｕｌｓｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７，１－１３（２０１７）．
［９５］Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ，Ｓ．ＤＬＳ ａｎｄ ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ－Ｗｈａｔ ｔｈｅｙ ａｒｅ ａｎｄ ｗｈａｔ ｔｈｅｙ ａｒｅ ｎｏｔ？ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ２３５，３３７－３５１（２０１６）．
［９６］Ｓｈａｏ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ－ｃｏａｔｅｄ ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ７，１５７５－１５８６（２０１２）．
［９７］Ｋｕｍａｒ，Ａ．＆ Ｋｕｍａｒ Ｄｉｘｉｔ，Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ４３－５８（２０１７）．
［９８］Ｗｅｎ，Ｊ．，Ｌｏｒｄ，Ｈ．，Ｋｎｕｔｓｏｎ，Ｎ．＆ Ｗｉｋｓｔｒｏｍ，Ｍ．Ｎａｎｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９３，１１３５８１（２０２０）．
［９９］Ｎｉｅｓｅｎ，Ｆ．Ｈ．，Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｈ．＆ Ｖｅｄａｄｉ，Ｍ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２，２２１２－２２２１（２００７）．
［１００］Ａｂｌｉｎｇｅｒ，Ｅ．，Ｌｅｉｔｇｅｂ，Ｓ．＆ Ｚｉｍｍｅｒ，Ａ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｕｓｉｎｇ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｏｔｏｒ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４４１，２５５－２６０（２０１３）．
［１０１］Ｒｉｅｓｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ｆａｓｔ ａｎｄ Ｅａｓｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０９，８５４－８６２（２０２０）．
［１０２］Ｐａｃｏｕｒｅｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＡＡＶ－ＩＤ：Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｒｏｂｕｓｔ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｂａｔｃｈ－ｔｏ－Ｂａｔｃｈ Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５，１３７５－１３８６（２０１７）．
［１０３］Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｏｆ ＡＡＶ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．６，１７１－１８２（２０１７）．
［１０４］Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｑｕ，Ｇ．，Ｔａｎｇ，Ｃ．＆ Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．６，１７４－１７８（２００３）．
［１０５］Ｗａｎｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ＡＡＶ Ｖｉｒｉｏｎｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ＡＡＶ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２４，４９－５９（２０１７）．

【0260】

【表8】

【0261】

【表9】

【0262】

【表10】

【0263】

【表11】

【0264】

【表12】

【0265】

【表13】

【0266】

【表14】

【0267】

【表15】

【0268】

【表16】

【0269】

【表17】

【0270】

【表18】

【0271】

【表19】

【0272】

【表20】

【0273】

【表21】

【0274】

【表22】

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図16G】

【図16H】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図18F】

【図18G】

【図18H】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図26E】

【図26F】

【図26G】

【図26H】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図27D】

【図27E】

【図27F】

【図27G】

【図27H】

【国際調査報告】