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特表2023-528337単一抗体によるナイーブＴ細胞およびＢ細胞のネガティブセレクションのための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-04
(54)【発明の名称】単一抗体によるナイーブＴ細胞およびＢ細胞のネガティブセレクションのための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20230627BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20230627BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230627BHJP
C12N 1/02 20060101ALI20230627BHJP
C12M 1/26 20060101ALN20230627BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20230627BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 Y
G01N33/543 541A
G01N33/53 D
C12N5/0783
C12N1/02
C12M1/26
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022572543
(86)(22)【出願日】2021-05-28
(85)【翻訳文提出日】2022-12-26
(86)【国際出願番号】 US2021034817
(87)【国際公開番号】W WO2021243190
(87)【国際公開日】2021-12-02
(31)【優先権主張番号】63/031,184
(32)【優先日】2020-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522458505
【氏名又は名称】バイオマグネティック ソリューションズ エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】チェン、チューイェン
(72)【発明者】
【氏名】リベルティ、ポール、エー．
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA09
4B029BB11
4B029BB17
4B029CC01
4B029CC03
4B029CC13
4B065AA92
4B065AA94X
4B065AC12
4B065BD14
4B065CA44
(57)【要約】
【要約】
【解決手段】 目的のナイーブで未接触の標的細胞を単離するための組成物および方法が開示される。
【選択図】 なし
【解決手段】 目的のナイーブで未接触の標的細胞を単離するための組成物および方法が開示される。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくともＴ細胞およびＢ細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物から標的細胞画分を単離する方法であって、前記調製物は内因性または添加ＩｇＧを実質的に欠き、前記標的細胞表面はＦｃ受容体を実質的に含まず、前記方法は、（ａ）前記ＰＢＭＣ調製物に、Ｆｃ受容体保有細胞および前記調製物に存在するＢ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する単一の免疫学的に活性な捕捉剤を導入する工程であって、前記捕捉剤は磁気応答性粒子を含むフェロフルイドに作動可能に連結され、それによってＢ細胞、単球、顆粒球、および血小板から選択されるＦｃ受容体保有細胞の磁気クラスターを形成する、前記導入する工程と、
（ｂ）前記調製物からＦｃ受容体保有細胞およびＢ細胞の前記磁気クラスターを磁気分離器で分離する工程と、および
（ｃ）本質的にナイーブな状態で前記標的細胞画分を回収する工程と、
を含む、方法。
【請求項2】
少なくともＴ細胞およびＢ細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物から標的細胞画分を単離する方法であって、前記調製物は内因性または添加ＩｇＧを実質的に欠き、前記標的細胞表面はＦｃ受容体を実質的に含まず、前記方法は、（ａ）前記ＰＢＭＣ調製物に、Ｆｃ受容体保有細胞および前記調製物に存在するＢ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する単一の免疫学的に活性な捕捉剤を導入する工程であって、前記捕捉剤は特異的結合対の第１のメンバーに作動可能に連結される、前記導入する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記調製物を、第２の結合部材に作動可能に連結された磁気応答性粒子を含むフェロフルイドと、前記第１および第２の結合対部材間に特定の結合対が形成する条件下で接触させる工程であって、それによってＢ細胞、単球、顆粒球、および血小板から選択されるＦｃ受容体保有細胞の磁気クラスターを形成する、前記接触させる工程と、
（ｃ）前記調製物からＦｃ受容体保有細胞およびＢ細胞の前記磁気クラスターを磁気分離器で分離する工程と、および
（ｄ）本質的にナイーブな状態で前記標的細胞画分を回収する工程と、
を含む、方法。
【請求項3】
内因性ＩｇＧを実質的に含まない少なくともＴ細胞およびＢ細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物から標的細胞画分を分離する方法であって、前記標的細胞表面はＦｃ受容体を実質的に含まず、前記方法は、（ａ）前記ＰＢＭＣ調製物に、抗ヒトＩｇＧと、特異的結合対の第１メンバーおよびＢ細胞上のエピトープに結合するＦａｂまたはＦ（ａｂ）'２を含む捕捉剤とを導入する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記調製物を、第２の結合対部材に作動可能に連結された磁気応答性粒子を含むフェロフルイドと、前記第１および第２の結合対部材間に特定の結合対が形成する条件下で接触させる工程であって、それによってＢ細胞、単球、顆粒球、および血小板から選択されるＦｃ受容体保有細胞の磁気クラスターを形成する、前記接触させる工程と、
（ｃ）前記調製物から前記捕捉剤結合Ｆｃ受容体保有細胞およびＢ細胞を磁気分離器で分離する工程と、および
（ｄ）本質的にナイーブな状態で前記標的細胞画分を回収する工程と、
を含む、方法。
【請求項4】
請求項１、２、または３のいずれかに記載の方法において、前記標的細胞が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である、方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法において、前記捕捉剤が、Ｂ細胞上のエピトープと免疫特異的に結合するＦａｂ領域と、および非標的細胞上のＦｃγＲと結合するＦｃ領域とを有する抗体またはその免疫学的活性断片である、方法。
【請求項6】
請求項５に記載の方法において、前記ＦｃγＲを有する非標的細胞が、単球、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、およびＮＫ細胞から選択される、方法。
【請求項7】
請求項５に記載の方法において、前記Ｆａｂ領域が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＩｇＧ、およびＣＤ３２から選択されるＢ細胞エピトープに結合する、方法。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法において、前記免疫学的に活性な捕捉剤が、マウスまたはヒト由来のモノクローナルＩｇＧ抗体であり、ヒトＦｃγＲによって結合されるＦｃ領域を含む、方法。
【請求項9】
請求項８に記載の方法において、前記モノクローナル抗体がＩｇＧである、方法。
【請求項10】
前記請求項１～９の何れかに記載された方法において、前記結合対部材が、ビオチン－ストレプトアビジン、受容体－リガンド、アゴニスト－アンタゴニスト、レクチン－炭水化物、アビジン－ビオチン、ビオチンアナログ－アビジン、デチオビオチン－ストレプトアビジン、デチオビオチン－アビジン、イミノビオチン－ストレプトアビジン、およびイミノビオチン－ビジンから選択される、方法。
【請求項11】
請求項１に記載の方法において、前記捕捉剤が、磁気応答性粒子がラット－抗マウスＩｇＧ抗体またはマウス－抗ヒトＩｇＧ抗体と作動可能に連結されるフェロフルイドを含む、方法。
【請求項12】
請求項２に記載の方法において、前記特異的結合対の前記第１または第２のメンバーがビオチンである、方法。
【請求項13】
請求項１２に記載の方法において、前記各抗体が３～７個のビオチン分子を含む、方法。
【請求項14】
請求項２に記載の方法において、前記特異的結合対の前記第１または第２のメンバーがストレプトアビジンである、方法。
【請求項15】
少なくともＴ細胞およびＢ細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物からナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する方法であって、前記調製物は内因性または添加ＩｇＧを実質的に欠き、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞表面はＦｃ受容体を実質的に含まず、前記方法は、（ａ）前記ＰＢＭＣ調製物に、Ｆｃ受容体保有細胞およびＢ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する第１の免疫学的に活性な捕捉剤と、およびＣＤ８＋Ｔ細胞に結合する第２の免疫学的に活性な捕捉剤とを導入する工程であって、前記第１および第２の免疫学的に活性な捕捉剤の各々が、フェロフルイド中に存在する磁気応答性粒子に作動可能に連結する、前記導入する工程と、
（ｂ）前記調製物から前記捕捉剤結合Ｆｃ受容体保有細胞と、およびＢ細胞およびＣＤ８＋細胞を磁気分離器で分離する工程と、および
（ｃ）本質的にナイーブな状態で前記ＣＤ４＋Ｔ細胞を回復させる工程と、
を含む、方法。
【請求項16】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物からナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する方法であって、前記調製物は内因性または添加ＩｇＧを実質的に欠き、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞表面はＦｃ受容体を実質的に含まず、前記方法は、（ａ）前記ＰＢＭＣ調製物に、Ｆｃ受容体保有細胞およびＢ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する第１の免疫学的に活性な捕捉剤と、およびＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する第２の免疫学的に活性な捕捉剤とを導入する工程であって、前記第１および第２の免疫学的に活性な捕捉剤の各々が、フェロフルイド中に存在する磁気応答性粒子と作動可能に連結し、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞、前記Ｂ細胞および前記Ｆｃ受容体保有細胞が磁気クラスターを形成する、前記導入する工程と、
（ｂ）前記調製物から前記磁気クラスターを磁気分離器で分離する工程と、および
（ｃ）本質的にナイーブな状態で前記ＣＤ８＋Ｔ細胞を回復させる工程と、
を含む、方法。
【請求項17】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物からナイーブＮＫ細胞を単離する方法であって、高親和性Ｆｃレセプター結合に適した条件下で、前記調製物は内因性または添加ＩｇＧを実質的に欠き、前記方法は、（ａ）前記ＰＢＭＣ調製物に、Ｆｃ受容体保有細胞とＢ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する第１の免疫学的に活性な捕捉剤と、高親和性ＦｃＲ結合に適した条件下でＣＤ３＋Ｔ細胞に結合する第２の免疫学的に活性な捕捉剤とを導入する工程であって、前記第１および第２の免疫学的に活性な捕捉剤の各々が、フェロフルイド中に存在する磁気応答性粒子と作動可能に連結し、Ｆｃ受容体保有細胞、Ｂ細胞、およびＣＤ３＋細胞の磁気クラスターを形成する、前記導入する工程と、
（ｂ）前記調製物から前記磁気クラスターを磁気分離器で分離する工程と、および
（ｃ）本質的にナイーブな状態で前記ＮＫ細胞を回復させる工程と、
を含む、方法。
【請求項18】
少なくともＴ細胞およびＢ細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物からナイーブＣＤ３４＋幹細胞を単離する方法であって、前記調製物は内因性または添加ＩｇＧを実質的に欠き、前記ＣＤ３４＋細胞表面はＦｃ受容体を実質的に含まず、前記方法は、（ａ）前記ＰＢＭＣ調製物に、Ｆｃ受容体保有細胞およびＴ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する免疫学的に活性な捕捉剤を導入する工程であって、前記免疫学的に活性な捕捉剤は、フェロフルイド中に存在する磁気応答性粒子に作動可能に連結する、前記導入する工程と、
（ｂ）前記調製物から前記捕捉剤結合Ｆｃ受容体保有細胞、およびＴ細胞を磁気分離器で分離する工程と、および
（ｃ）本質的にナイーブで、未接触の状態で前記ＣＤ３４＋幹細胞細胞を回復させる工程と、
を含む、方法。
【請求項19】
請求項１８に記載の方法において、前記ＰＢＭＣが、造血幹細胞を骨髄から末梢血に移行させるためにＧ－ＣＳＦで処理されたドナーから単離される、方法。
【請求項20】
請求項１８に記載の方法において、前記モノクローナル抗体およびストレプトアビジンが、ＦｃγＲＩとの相互作用を促進する濃度で存在する、方法。
【請求項21】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記フェロフルイドが、粒子あたり４０００～７０００個のモノクローナル抗体を含む、方法。
【請求項22】
請求項１７に記載の方法において、前記モノクローナル抗体の濃度を約０．２μｇ／ｍｌに下げることにより、前記高親和性ＦｃＲ結合条件を促進する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年５月２８日に出願された米国仮出願６３／０３１，１８４の優先権を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、免疫学および生体液からの未接触の免疫細胞（例えば、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞）の磁気分離・単離の分野に関するものである。具体的には、生体試料から望ましくない細胞タイプを効率的に分離し、目的の細胞タイプを未接触のナイーブな状態で残し、それを分離して様々な治療用途に使用できる組成物および方法が提供される。
【背景技術】
【0003】
本明細書では、本発明が属する技術の状況を説明するために、いくつかの刊行物および特許文献を引用している。これらの引用文献の各々は、参照することにより、あたかも全文が記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
【0004】
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の選択、プライミング、増殖、トランスフェクションを経てキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を作り出す免疫療法は、現代における最も重要な医学的進歩の一つである。ＦＤＡ承認製品（大型Ｂ細胞リンパ腫（Ｋｙｍｒｉａｈ－Ｎｏｖａｒｔｉｓ）および非ホジキンリンパ腫（Ｙｅｓｃａｒｔａ－Ｇｉｌｅａｄ））により特定の白血病およびリンパ腫の治癒を実証したことから、ＣＡＲ Ｔ細胞の他の多くの応用が検討されており、世界中で多くの臨床試験が行われている（Ｋａｎｓａｇｒａ ＡＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１９９４）。Ａｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２５：ｅ７６－８５， ２０１９；Ｓｅｉｆ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｂｅｙｏｎｄ Ｃａｎｃｅｒ：Ｈｏｐｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２７１１，２０１９）。最近のレビューに示されているように、このような治療法を固形腫瘍に適用するための非常に大きな取り組みが行われている（Ｍｏｈａｎｔｙ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．４２：２１８３－２１９５、２０１９）。
【0005】
ＣＡＲ Ｔ細胞（生薬）の製造工程は、同種ＣＡＲ Ｔの場合、患者またはドナーからのアフェレーシス法による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の採取から始まり、それらの細胞は、（ｉ）直接刺激して活性化・増殖させ、その後の工程で十分な数の細胞を処理し、十分に製品を製造できるようにするか、（ｉｉ）Ｔ細胞またはＣＤ４＋やＣＤ８＋Ｔ細胞などのサブセットの選択を受けることがある。製造の最初の段階として細胞を選択することで、より良い製品が得られるという証拠が続々と出てきている。さらに、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の開始比率が、より耐久性のある治療法を提供する上で重要であるという説得力のある証拠がある（Ｔｕｒｔｌｅ ＣＪ．，ｅｔ ａｌ．ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ＣＤ４＋：ＣＤ８＋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ Ｂ ｃｅｌｌ ＡＬＬ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２６：２１２３－３８，２０１６）．
【0006】
ＣＡＲ Ｔ細胞の製造には、いくつかのＴ細胞選択法が用いられてきた。「未接触の」Ｔ細胞から始めるべき多くの正当な生物学的理由があるにもかかわらず、ほとんどのプロセスでは、Ｔ細胞上のＣＤ３受容体に特異性を持つ標的ｍＡｂ、またはＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞のポジティブセレクションの場合には、適切なｍＡｂを使用したポジティブセレクションが行われている。これらのｍＡｂは、一般的な捕捉装置と組み合わせて使用するか、磁性ナノ粒子、浮遊能力を有するマイクロバブル、その他の固体支持体などの分離ビークルに結合させるか、あるいはｍＡｂを蛍光標識して、標識細胞をフローサイトメトリー法により選択できるようにすることができる。それらの方法のいずれも、未接触のＴ細胞を生成しない。さらに、粒子が分離方法に採用されている場合、その後の製造工程を開始する前に除去することが必要である。粒子を除去しない場合、出発細胞にそのような粒子が存在しても悪影響がないことを明確に証明しなければならないが、これは面倒で費用のかかる作業である。
【0007】
Ｔ細胞およびＴ細胞サブセットに対してポジティブセレクション法を採用することには、ある種の利点がある。例えば、ほとんどのネガティブセレクションプロトコルでは、ＰＢＭＣからすべての非Ｔ細胞種を除去する必要があるため、利用可能なネガティブ分離システムは通常、９種類ものｍＡｂ（最低でも７種類）を含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）カクテルを採用している。これらの抗体は、非標的細胞、例えば、ＣＤ１４－単球、ＣＤ１５－顆粒球、ＣＤ１６－ＮＫ細胞および顆粒球、ＣＤ１９－Ｂ細胞、ＣＤ３４－幹細胞、ＣＤ３６－単球／マクロファージ／血小板、ＣＤ５６－ＮＫ細胞、ＣＤ１２３－ミエル系細胞および一部のＢ細胞、（Ｔ細胞がネガティブ選択される場合）およびＣＤ２３５ａ－赤血球を除去するための特定の表面受容体と結合する。
【0008】
ＦＤＡのガイドラインでは、治療用として前駆細胞に接触する物質は、この場合ｍＡｂにおいて、人体で使用する治療用ｍＡｂと同じ品質でなければならないことを念頭に置いている。したがって、生体内で使用する多数のｍＡｂを用いたネガティブセレクションシステムを構築するためのスタートアップ費用は、医療システムおよびそのような治療製品を必要とする患者にとってコスト負担となる。不要な細胞を除去するために、市販の陽性選択キットを寄せ集めてそのような選択を行うことに関連するコストは、ロイコパック治療１回につき合計約２万ドルである。このコストを現在のＣＡＲ Ｔの生産コストに上乗せすることは、到底容認できるものでは無い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明に従って、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物からＦｃ受容体陰性標的細胞画分を単離する方法が開示される。一実施形態において、内因性または添加されたＩｇＧを実質的に含まないようにされたＰＢＭＣ調製物が提供される。Ｆｃ受容体保有細胞とＢ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する単一の免疫学的に活性な捕捉剤を導入し、捕捉剤が磁気応答性粒子を含むフェロフルイドに作動可能に連結し、Ｂ細胞、単球、顆粒球、および血小板を含むＦｃ受容体保有細胞の磁気クラスターを形成し、次に、磁気分離器においてＦｃ受容体保有細胞およびＢ細胞の前記磁気クラスターを準備物から分離して、標的細胞画分を本質的にナイーブで触れていない状態において回収する。
【0010】
Ｆｃ受容体陰性標的細胞を未接触の状態で分離するための別の実施形態では、Ｆｃ受容体を有する細胞およびＢ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する単一の免疫学的に活性な捕捉剤をＰＢＭＣ調製物に導入し、捕捉剤は、特定の結合ペアの第１の部材に作動可能に連結される。次に、この調製物を、第２の結合部材に作動可能に結合した磁気応答性粒子を含むフェロフルイドと接触させ、前記第１および第２の結合対部材間に特異的結合対を形成させ、それによってＢ細胞、単球、顆粒球および血小板から選ばれるＦｃ受容体保有細胞の磁気クラスターを形成させる条件下で、この磁気クラスターを分離する。この磁気クラスターを磁気分離器で分離し、ナイーブな状態で標的細胞画分を回収する。本明細書に開示された方法において使用するためのＢ細胞エピトープは、限定されないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＩｇＧ、およびＣＤ３２を含む。
【0011】
Ｆｃ受容体陰性標的細胞を未接触の状態で単離する方法のさらに別の実施形態では、抗ヒトＩｇＧと、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）'μ細胞である特異的結合対の第１のメンバーからなる捕捉剤とが、前記ＩｇＧおよびＦａｂまたはＦ（ａｂ）'２、Ｂ細胞エピトープに対する親和性を有する、内因性ＩｇＧのレベルが減少したＰＢＭＣ調製物中に導入される。このＰＢＭＣ調製物を、第２の結合対部材に作動可能に連結された磁気応答性粒子を含むフェロフルイドと、前記第１および第２の結合対部材間に特定の結合対が形成される条件下で接触させ、それによってＩｇＧ結合Ｂ細胞、単球、顆粒球、および血小板を含むＦｃ受容体保有細胞の磁気クラスターを形成させる。次に、この磁気クラスターを前記調製物から磁気分離器で分離し、本質的にナイーブな状態で標的細胞画分を回収する。
【0012】
特定の好ましい実施形態において、標的細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。抗体の特異性が変更される他の実施形態では、上述のクラスタリング機能を使用して、Ｂ細胞を単離することができる。適切な結合ペアメンバーを提供することにより、ＣＤ３４＋幹細胞、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＮＫ細胞を単離することができる。
【0013】
上記の方法で使用するための捕捉剤は、例えば、ヒトＦｃγＲが結合するＦｃ領域を含むマウスまたはヒト由来のモノクローナルＩｇＧ抗体を含み、該抗体は、Ｂ細胞上のエピトープ、未接触のＴ細胞を回収する場合の非標的細胞上への結合親和性を有する。ある好ましい実施形態において、抗体はＩｇＧ１である。他のアプローチにおいて、ＩｇＧは、免疫学的に活性な抗体断片、（例えば、Ｆａｂ）と共に添加され、ここで断片は、特異的結合ペアの第一メンバーに作動可能に連結される。ＦｃγＲを有する非標的細胞が除去される実施形態では、そのような細胞には単球、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、およびＮＫ細胞などが含まれる。
【0014】
本明細書では、ビオチンおよびストレプトアビジンの使用を例示するが、他の有用な結合対メンバーとしては、これらに限定されない、受容体－リガンド、アゴニスト－アンタゴニスト、レクチン－炭水化物、アビジン－ビオチン、ビオチンアナログ－アビジン、デチオビオチン－ストレプトアビジン、デチオビオチン－アビジン、イミノビオチン－ストレプトアビジンおよびイミノビオチン－アビジンが存在する。
【0015】
また、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物からナイーブＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を分離するための方法も提供される。ナイーブＣＤ４＋細胞を単離する実施形態では、Ｆｃ受容体保有細胞およびＢ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する第１の免疫学的に活性な捕捉剤と、ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合する第２の免疫学的に活性な捕捉剤とを、ＰＢＭＣ調製物中に導入する。この場合、前記第１および第２の免疫学的に活性な捕捉剤の各々は、フェロフルイド中に存在する磁気応答性粒子に作動可能に連結し、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞および前記Ｆｃ受容体保有細胞の磁気クラスターを形成させる。細胞の磁気クラスターは、磁気分離器で前記調製物から分離され、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、本質的にナイーブな状態で回収される。ＣＤ８＋Ｔ細胞を分離することが望ましい状況においては、抗ＣＤ８抗体を抗ＣＤ４抗体に置き換える。
【0016】
本発明はまた、高親和性Ｆｃ受容体結合に適した条件下で、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物からナイーブＮＫ細胞を単離する方法を提供するものである。この実施形態において、Ｆｃ受容体保有細胞とＢ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する第１の免疫学的に活性な捕捉剤と、ＣＤ３＋Ｔ細胞に高親和性ＦｃＲ結合を促進する条件下で結合する第２の免疫学的に活性な捕捉剤と、前記第１および第２の免疫学的に活性な捕捉剤の各々がフェロフルイド中に存在する磁気応答性粒子と作動可能に連結し、Ｆｃ受容体保有細胞、Ｂ細胞およびＣＤ３＋細胞の磁気クラスターを形成していることを示す。その後、磁気クラスターを磁気分離器で調製品から分離し、ナイーブＮＫ細胞を本質的にナイーブな状態で回収する。
【0017】
さらに別の態様において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物からナイーブＣＤ３４＋幹細胞を単離するための方法が提供される。例示的な方法は、ＰＢＭＣ調製物に、Ｆｃ受容体保有細胞およびＴ細胞上のエピトープの両方に同時に結合する免疫学的に活性な捕捉剤を導入することを含み、前記免疫学的に活性な捕捉剤は、フェロフルイド中に存在する磁気応答性粒子に作動可能に連結され、前記Ｆｃ受容体保有細胞、およびＴ細胞が磁気分離器中で前記調製物から分離される磁気クラスターを形成し、これによって本質的にナイーブで未装着状態にあるＣＤ３４＋幹細胞を回収することが可能になる。この方法の好ましい実施形態において、造血幹細胞が骨髄から末梢血に移動するようにＧ－ＣＳＦで処理したドナーからＰＢＭＣを分離する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１は、以下の実施例で説明するナイーブな未接触のＣＤ３細胞のネガティブセレクションのための結合パートナーの模式図である。抗ＣＤ３２ ｍＡｂは、Ｆａｂパラトープ－ＣＤ３２エピトープ相互作用によりＣＤ３２発現細胞に結合し、Ｆｃ－ＦｃｇＲ相互作用により他のＦｃｇＲに結合する。ＣＤ１９とＣＤ２０はＢ細胞特異的な受容体で、抗ＣＤ１９とＣＤ２０はそれぞれ特異的なＣＤ１９とＣＤ２０エピトープを介してＢ細胞に結合し、さらにＦｃ－ＦｃｇＲ相互作用を介して他の細胞にも結合する。ＳＩｇはＢ細胞表面特異的受容体でもあり、抗ＩｇＧ ｍＡｂはｓＩｇエピトープを介してＢ細胞に結合し、Ｆｃ－ＦｃγＲ相互作用を介して他の細胞に結合する。さらに、抗ＩｇＧはＦｃｇＲを発現する細胞を標識する血漿遊離Ｉｇとの結合にも使用することができる。抗ＩｇＧ抗体を使用する場合、抗体は完全長ＩｇＧ形式であっても、ＦｃγＲＣを標識する血漿遊離Ｉｇに対して親和性を有するＦａｂ／Ｆ（ａｂ'）形式であっても良い。
【発明を実施するための形態】
【0019】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を用いた免疫療法など、遺伝子操作されたＴ細胞の養子移入が、がんや自己免疫疾患の治療に効果的であることを示す臨床データが増えつつある。現在までのところ、免疫細胞の製造には、主にＴ細胞上に発現する特定の受容体のｍＡｂ標識に基づくポジティブセレクションが用いられている。このポジティブセレクションは、細胞を試薬と接触させる必要があるため、異なる遺伝子の発現を変化させる可能性がある。さらに、ポジティブセレクションは、レシピエントへの移植後すぐに抗体依存性の細胞毒性を引き起こすという逸話もある。これらの欠点が、採用された免疫細胞の効力と長期持続性に悪影響を及ぼす可能性は十分にある。したがって、所望の細胞タイプ、例えばナイーブＴ、Ｂ、ＮＫ、またはＣＤ３４＋幹細胞を単純化したネガティブセレクションを用いる代替戦略は、大きな価値があり、標的細胞の望ましくない活性化を抑えることができるだろう。
【0020】
ＰＢＭＣ／ロイコパックに含まれる白血球の構成は。Ｔ細胞（４５－６０％）、Ｂ細胞（５－１５％）、単球（１０－３０％）、顆粒球（０．６－１０％）、およびＮＫ細胞（５－１０％）である。現在までのところ、臨床応用においてＣＡＲＴ細胞を調製するためのネガティブセレクションプロトコルは存在しない。しかしながら、磁気分離を用いたＰＢＭＣ／ロイコパックに対する従来の研究レベルのネガティブセレクションはいくつか存在する。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ｐａｎ－Ｔ ｃｅｌｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （＃１３０－０９６－５３５）では、抗体カクテルは、ＰＢＭＣから非Ｔ細胞を除去するために、９つの抗体（ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、およびＣＤ２３５ａ）を含む。同様に、ＤｙｎａｌのビーズベースのＣＤ３ネガティブセレクション製品では、７つの抗体（ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、およびＣＤ２３５ａ）が関与し、同等の純度（～９５％以上）が得られる（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ、＃１１３４４Ｄ）。ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ５６の３つの抗体を用いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞をネガティブエンリッチした報告もあるが、顆粒球を取り除くために分離前にＦｉｃｏｌｌ精製が必要である（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｂｙ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）。Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １９：Ｓ３８，２０１７）。
【0021】
ＣＤ３陽性Ｔ細胞選択に関する先行研究（Ｌｉｂｅｒｔｉ ＰＡ，Ｒｉｔｅｒ ＤＷ，Ｋｈｒｉｓｔｏｖ ＴＲ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｌｏｗ ｃｏｓｔ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃａｌｅ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｏｒ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｓｉｇｈｔ．４：５８１－６００，２０１８）、Ｔ細胞を磁気標識する間接的な方法を採用し、ポジティブな免疫磁気分離を効果的に行った。それらの研究では、ＰＢＭＣをまず抗ＣＤ３ ｍＡｂとインキュベートし、その後、当社の１３５～１６５ｎｍの独自の高度磁性ナノ粒子（代替的にフェロフルイドまたはＦＦと呼ばれる）の共通の捕捉バージョンで磁気標識した（Ｌｉｂｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６９８，２７１号、６，１２０，８５６号）。予備的な研究は、ＦＦに結合したラット抗マウスＦｃ（ＲＡＭ）ｍＡｂという共通の捕捉剤を用いて開始された。そのシステムは一貫して、ＣＤ３＋細胞の優れた収率（>７５％）のＴ細胞産物をもたらしたが、異なるレベルの単球（ＰＢＭＣ調製物中の単球の１０～９５％）で繰り返し汚染されたものであった。ＲＡＭ－ＦＦがＦｃＲと相互作用していると仮定し、単球の結合を阻害するために、熱凝集性ヒトＩｇＧ（ＨＡＩＧ）およびＦｃＲ遮断抗体とＰＢＭＣをプレインキュベートするなどの大きな試みが行われた。ＨＡＩＧの添加量にかかわらず、単球の結合は阻害されなかったが、Ｆｃブロッキング抗体は有効であった。しかし、このようなブロッカーはコストがかかるため、市販の安価な分離キットを作ることは不可能であった。
【0022】
初期の陽性選択Ｔ細胞研究で使用された多くの異なるＲＡＭ－ＦＦ調製物の分析から、ＦＦとの結合に使用されたＲＡＭのレベルと単球の汚染（捕捉）の間に強い相関関係があることが示唆された。分析によると、ＦＦへのＲＡＭ結合のあるレベルにおいて、これらのナノ粒子はＦｃγＲベアリング細胞（ＦｃγＲＣ）に高い親和性で結合し、ＦＦおよび他の固体表面または支持体への結合においてＲＡＭのＦｃ部分の近接が重要な役割を果たすことが示された。我々の研究室では、ＦＦの表面にＲＡＭ（４０００－７０００ＩｇＧ／粒子）を効果的に飽和させ、単球に対する親和性を低レベルの結合（５００－１０００ＩｇＧ／粒子）および他の非免疫タンパク質の結合と比較することにより、ＦＦなどの固体支持体上のＲＡＭ Ｆｃ近接の役割を実験的に実証する。高濃度のＲＡＭで調製したＦＦは、アフェレーシス製品のアリコートから単球を完全に除去することが可能であった。さらに、このような除去は、ｍＡｂ標的細胞分離に使用されるのと同じ濃度のＦＦで実施することができる。ＲＡＭはＩｇＧ１サブタイプであることに注意。さらに、ウシまたはヒト血清アルブミン（ＢＳＡ、ＨＳＡ）を結合したＦＦとＰＢＭＣをインキュベートした場合、結合の程度にかかわらず、単球を磁気的に除去することができなかった。
【0023】
単球がＲＡＭＦｃ：ＦｃγＲ結合相互作用ではなく、ＲＡＭ－ＦＦを摂取して磁気応答性細胞を作り出しているかどうかを判断するために、０℃で実験を行ったが、室温で行った実験と同じ結果が得られた。ＦＦに結合したＲＡＭのレベルが低い実験を行った場合、回収された単球のレベルが低かった。これらの結果は、ＲＡＭ－ＦＦ：単球の相互作用は、主に結合性のものであり、ＲＡＭのＦｃ領域の近接を必要とするか、またはそれによって増強されることを示すものである。
【0024】
なぜなら、そのようなレベルでは、そのような抗体のＦｃ部分は、ＦｃγＲｓの高い親和性を持つ結合者として働くために十分に近接し、同時にその抗体の特異性は、少なくとも１つの他の細胞の特異性、すなわち、ＩｇＧサブクラスの単一の抗体を結合するために使用できるはずであるから、つまりＢ細胞である。このように、固体支持体上のＦｃの近接は、近接するＦｃγＲへの多価の付着を介して、親和性を高める。さらに、単一のｍＡｂによるＴ細胞ネガティブセレクションを調べるために、ＩｇＧ１アイソタイプのマウス抗ヒトＩｇＧ抗体を高レベル（４０００～７０００ｍＡｂ／粒子）でＦＦにコンジュゲートさせた。この実験の作業仮説は、Ｂ細胞は表面ＩｇＧを発現しているのでＦａｂ可変ドメインはＢ細胞に結合し、表面に近接したこの抗体のＦｃ領域は単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、顆粒球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に発現するＦｃγＲ、またＢ細胞発現ＦＣγＲＩＩＢとしてＢ細胞にも結合するだろうというものであった。
【0025】
多くの順列とコントロールで行われた実験により、仮説が証明され、この戦略により、９５％以上の純度でナイーブＣＤ３＋Ｔ細胞を繰り返しネガティブに分離できることが実証された。ある実験では、ＰＢＭＣ調製物は、抗ヒトＩｇＧ抗体と明らかに反応する内在性ＩｇＧを避けるために、３サイクルの遠心分離によって洗浄されたため、内在性ＩｇＧを実質的に含まないものとなった。このようなＰＢＭＣ調製物にヒトＩｇＧを約４～１０μｇ／ｍＬより大きいレベルで添加すると、Ｔ細胞の回収率は低下し、Ｂ細胞の汚染は増加した。これらの実験では、Ｂ細胞を標識するために抗ヒトＩｇＧが使用されたことから、内因性ＩｇＧが抗ヒトＩｇＧ抗体の細胞標識能力を効果的に中和するものと推論された。実施形態では、ジスルフィドで結合したＦａｂまたはＦａｂ様フラグメント、例えばＦ（ａｂ'）２、低レベルの内因性ＩｇＧが選択を容易にする、すなわち、ビオチン化ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２はＢ細胞表面ＩｇＧに結合してＢ細胞を標識し、Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ'）２は遊離血漿ＩｇＧに結合してＦ（ａｂ'）２－ＩｇＧ複合体を形成してＦｃγＲＣを標識して除去できる（図１）。試料を「実質的にＩｇＧフリー」にするためには、少なくとも３回の洗浄と再懸濁が必要。Ｆａｂ／Ｆ（ａｂ'）２を使用する場合、細胞は１回または２回しか洗浄されないため、サンプルに血漿中ＩｇＧが残存することになる。
【0026】
抗ヒトＩｇＧ抗体は、ＦｃγＲＣに結合したＩｇと同様に細胞産物中の内在性ＩｇＧに結合することができるので、モデルを単純化するために、抗ＣＤ１９ｍＡｂを高レベルでＦＦに結合させ（４０００～７０００ｍＡｂ／粒子）、内在性ＩｇＧを欠くＰＢＭＣのネガティブセレクションに使用した。この実験により、ナイーブＴ細胞も高純度（>９２％）で生産された。上記の抗ヒトＩｇ実験と比較したこの概念的に単純な実験から、Ｂ細胞と特異的に反応する１つの成分と、凝集したＦｃと思われるものを介してＦｃγＲＣと反応する１つの成分があれば、十分にナイーブＴ細胞を生産できることが推測された。
【0027】
単一の抗体を用いて標的細胞を濃縮することにより、細胞標識の手順が大幅に簡略化され、従来のプロトコルのように多くの抗体を必要とするコストが劇的に削減され、その結果、プロセスが驚くほど高速になる。このコンセプトの魅力は、以下に開示する実験データによって裏付けられており、臨床に関連する製品への転換を大幅に加速させる。また、同じ戦略を用いて、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞のネガティブセレクションを簡略化することも可能であり、これは以下に述べるように、システムに他のｍＡｂを１つ追加することで達成される。
【0028】
上記のように、ＰＢＭＣからの最初の陽性Ｔ細胞選択は、（ｉ）抗ＣＤ３ｍＡｂのインキュベーション、（ｉｉ）未結合ｍＡｂの除去、（ｉｉｉ）ＲＡＭ－ＦＦとのインキュベーションという工程を用いた間接磁気標識法で行われた。これらの選択プロトコールにおける単球の混入は、全く許容できないものであった。もし、Ｔ細胞をビオチン化抗ＣＤ３抗体で標識し、結合しなかった抗体を除去し、ＳＡ－ＦＦをインキュベートして磁気分離し、同様のポジティブセレクション実験を行った場合、単球の汚染は劇的に改善されたが、依然として受け入れがたいレベルであった。この問題は、内因性ＩｇＧを実質的に含まないＰＢＭＣを、わずか１．０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧとインキュベートし、その後ビオチン－抗ＣＤ３抗体とインキュベートし、結合しなかったｍＡｂを取り除き、その後ＳＡ－ＦＦで磁気標識することで解決された。これらの実験により、単球の混入がないＴ細胞調製物が得られた。これらの結果は、ビオチン化抗ＣＤ３抗体とＦｃＲ、特に高親和性レセプターとの相互作用が、ＩｇＧを添加しない場合の単球汚染に関与している可能性を示唆するものである。なお、上記の実験では、単球の混入を防ぐために１ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧが必要であり、すなわち標識ｍＡｂの約１０００分の１であることを念頭に置いておくことが重要である。
【0029】
そこで、他のＩｇが存在しない状態でＰＢＭＣとインキュベートしたビオチン－抗ＣＤ３ｍＡｂが、ＦｃγＲに結合した内在性ＩｇＧと交換するか、あるいは「空の」ＦｃＲが十分に存在し、標識ｍＡｂ添加により、その部位がＦｃγＲＣ標識用の標的化アンカーとして使用されるという可能性を検討した。単量体ＩｇＧに対する異なるＦｃγＲの結合反応のＫｄは１０－６から１０－９Ｍであるので、ＩｇＧは標識剤として機能するのに十分なエネルギーで結合しているはずである。さらに、我々のＳＡ－ＦＦは多価であるため、ＦｃγＲＣ上のビオチン化ｍＡｂに多価の付着を介してＦｃγＲＣとＳＡ－ＦＦの結合エネルギーを高める機会があり、ｍＡｂのＦｃ－ＦｃγＲ相互作用が一因である可能性も考えられる。
【0030】
これらの知見は、特にネガティブな分離実験に関連するものである。好ましいプロトコルは、一般的な捕捉剤を添加する前に、未結合の標識ｍＡｂを反応混合物中に保持することである。これにより、そのような薬剤（この場合はＳＡ－ＦＦ）は、ｍＡｂ標識Ｂ細胞だけでなく、ビオチンを有する他のあらゆる成分と反応する機会を得ることができる。例えば、ビオチン－抗ＣＤ１９ｍＡｂを使用する場合、ｍＡｂとＰＢＭＣをインキュベートすると、ｍＡｂ標識Ｂ細胞が生じ、ＦｃγＲＣ上のＦｃγＲのｍＡｂ標識が生じる可能性がある。ＳＡ－ＦＦのような一般的な捕捉剤を添加すると、後者がｍＡｂ標識Ｂ細胞に結合し、ビオチンを有する任意のＦｃγＲＣに結合し、さらに未結合のビオチン－抗ＣＤ１９に結合するなど、いくつかの反応が起こる可能性がある。したがって、磁気標識のインキュベーション期間中、Ｂ細胞との標識反応に加えて、新しい種、すなわち、結合した抗体とＳＡ－ＦＦの複合体が形成されることになる。この複合体は、前述のＲＡＭ－ＦＦのデータから、ＦｃγＲＣに強く結合することが予想される。このように、Ｂ細胞に特異的なｍＡｂ（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＩｇＧなど）を間接選択プロトコルに使用する場合、多くの複雑な反応を伴い、一般的な捕捉剤がいくつかの有利な役割を果たすと思われる。例えば、ナノ粒子または表面上のＳＡ多価は、そのＦｃＲＣに結合したビオチン－抗体を介してＦｃＲＣの標識を促進することができ、その場合、ＳＡ－ＦＦの多価はそのようなＦｃＲＣを捕捉できる点まで結合強度を向上させる。ＳＡ－ＦＦの同じ多価性と結合していないビオチン－ｍＡｂとの反応により、充填されていないＦｃＲと反応することができる種が生じ、したがって、その後の除去のためにＦｃＲ細胞（ＦｃＲＣ）を標識する別のメカニズムが作り出される。
【0031】
ＳＡ－ＦＦを用いた我々のポジティブセレクションＴ細胞研究、および単球汚染を減少させる添加ヒトＩｇＧの効果に基づいて、添加ＩｇＧは、ＦｃγＲに結合したビオチン化ｍＡｂへの多価ＳＡ－ＦＦ結合を否定できると思われ,十分高濃度の添加ＩｇＧでは、これらのｍＡｂはＦｃから競合することが予想され、特にそれらの実験では未結合のビオチン－抗ＣＤ３ｍＡｂを除去後、ＦｃγＲと競合すると予想される。
【0032】
ＦｃγＲＣの除去に関与する可能性のあるメカニズムについて、以下のネガティブＴ細胞選択実験が行われた：ビオチン化抗ＣＤ１９ｍＡｂをＩｇＧ非存在下でＰＢＭＣとインキュベートし、その後ＳＡ－ＦＦとインキュベートして磁気分離を行った。Ｔ細胞純度は>９２％で、Ｔ細胞画分に単球がほとんど混入していない。ＩｇＧ（０．１２５～１ｍｇ／ｍＬ）を添加しても、予想通り単球減少効果に大きな変化は見られなかった。さらに、ビオチン化抗ＣＤ１９ｍＡｂの添加量を増やすと、単球の除去はより完全になり（例えば、２～４μｇ／ｍＬは<２μｇｍＬよりも良好）、ＣＤ３純度はより高くなった。これらの結果から、ビオチン－ｍＡｂは、閉じた状態で結合できる表面と複合化することで、ＦｃＲＣと高い親和性で結合できるようになったと考えられる。
【0033】
これらの開示は、ＦｃγＲを細胞分離に非常に積極的に関与させる様々な方法があることを示し、簡単で試薬を節約した方法で、ナイーブで未接触の細胞を分離するいくつかのルートを作り出した。
【0034】
定義
本開示をより容易に理解できるようにするために、最初に特定の用語を定義する。本願で使用される場合、本明細書に明示的に規定される場合を除き、以下の各用語は、以下に規定される意味を有するものとする。追加の定義は、本願を通じて規定される。
本開示をより容易に理解できるようにするために、最初に特定の用語を定義する。本願で使用される場合、本明細書に明示的に規定される場合を除き、以下の各用語は、以下に規定される意味を有するものとする。追加の定義は、本願を通じて規定される。
【0035】
「生体試料」という用語は、限定されないが、細胞を含む体液、末梢血、組織ホモジネート、アスピレート、およびヒト被験者から取得可能な希少細胞の他の供給源を含む。
【0036】
「決定基」という用語は、本明細書に記載された標的細胞のいずれかに関連して用いられる場合、生物特異的リガンドまたは生物特異的試薬によって特異的に結合され、特定の結合物質への選択的結合に関与し、それを担う標的細胞の部分を指し、その存在は選択的結合が生じるために必要である。基本的な用語では、決定基は、特異的結合対反応において受容体によって認識される標的細胞上の分子接触領域である。
【0037】
本明細書で使用する「特異的結合対」という用語には、抗原－抗体、受容体－ホルモン、受容体－リガンド、アゴニスト－アンタゴニスト、レクチン－糖質、ビオチン－ストレプトアビジン、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ハイブリダイゼーション配列、Ｆｃ受容体またはマウスＩｇＧ－プロテインＡ、アビジン－ビオチン、ストレプトアビジン－ビオチンおよびウイルス－受容体の相互作用が含まれている。様々な他の決定基特異的結合物質の組み合わせが、この発明の方法の実施に使用するために企図され、それは当業者には明らかであるものである。抗ＣＤ３ｍＡｂのような特異的結合対の第１のメンバーがその第２のメンバーであるＴ細胞上のＣＤ３エピトープに結合するとき、このような反応は「標識反応」と呼ばれ、それらのＴ細胞はｍＡｂにより標識されたとみなされる。
【0038】
「ポジティブセレクション」とは、目的の細胞タイプ上に存在する第２の結合対の第２のメンバーに選択的に結合する特異的結合対の第１のメンバーの異なる付着の混合物から精製し、それによって混合物から細胞を単離することを指す。特異的結合対の第２のメンバーを採用して、正の選択を行う、すなわち、目的の実体を精製するための様々な手段および方法は、当技術分野において周知である。
【0039】
「ネガティブセレクション」とは、異なる細胞種の混合物から、目的の細胞種を除く混合物中の各細胞種に１つまたはそれ以上の特異的結合対の第１メンバーを付着させることにより、目的の細胞種を精製することを指す。結合対の第２メンバーを用いる特異的結合対反応により、結合対の第１メンバーを有する実体が、目的の実体を残して混合物から分離されることができる。このような分離を行う手段および方法は、当技術分野でよく知られている。混合物から取り残された部分は、陰性画分と呼ばれる。
【0040】
「本質的にナイーブまたは未接触の状態」とは、特定の結合ペアのメンバーによって接触されていない細胞のサブセットを指す。
【0041】
「Ｔ細胞」は、ＣＤ３＋細胞を意味するものとする。定義によれば、ＣＤ３＋細胞のネガティブセレクションは、特定の結合ペアのいずれのメンバーとも接触していないナイーブＴ細胞を産生する。
【0042】
「Ｆｃ受容体陰性標的細胞」とは、Ｆｃ受容体をほとんど、あるいは全く発現していない標的細胞のことである。
【0043】
ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションでは、それぞれ回収または除去されるべき細胞タイプが、通常、対応する抗体またはそのエピトープに高い親和性で特異的に結合する何らかの薬剤と反応するそれらの細胞上のエピトープなど、特定の結合ペアの一方のメンバー、特定の結合ペアの第２のメンバーと接触される。このような高親和性の結合対反応は、しばしば「標識化反応」と呼ばれる。
【0044】
用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する糖タンパク質免疫グロブリンを含むが、これに限定されない。一般に、抗体は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖、またはその抗原結合分子を含み得る。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域と重鎖定数領域を含む。重鎖定数領域は、３つの定数ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域と軽鎖定数領域を含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。軽鎖と重鎖の可変領域（ＶＬとＶＨ）および定常領域（ＣＬとＣＨ１）の相互作用によって形成される抗体分子の部分は、ＦａｂまたはＦａｂフラグメント（抗原結合画分）と呼ばれる。抗体をパパイン分解すると、１分子あたり２個のＦａｂ断片と、Ｆｃと呼ばれる結晶化する断片（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｒｙｓｔａｌｉｚｅｄ）が生成される。Ｆｃ断片はヒンジ領域以下の重鎖ドメインからなり、ＣＨ２ドメイン同士、同様にＣＨ３ドメインが相互作用して形成される。抗体をペプシン分解すると、ヒンジ領域以下の抗体分子が切断され、重鎖をつなぐジスルフィド結合はそのまま残る。こうして、ジスルフィドで結合した２つのＦａｂ様フラグメントが生成され、（Ｆａｂ'）２と呼ばれる。これらのジスルフィドが減少すると、単一の抗原結合断片（Ｆａｂ'）が生成される。重鎖のヒンジ領域とＣＨ２ドメイン（ヒンジ領域の直下、近傍の領域）には、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体分子の領域が存在する。抗体のペプシン分解は必ずしも均一に切断されないため、（Ｆａｂ'）２製剤にはＦｃＲ結合配列が含まれる場合がある。
【0045】
抗体または免疫グロブリン（Ｉｇ）は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび分泌型ＩｇＡを含むがこれらに限定されない、一般に知られているアイソタイプのいずれかに由来しても良い。ＩｇＧサブクラスも当業者にはよく知られており、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３が含まれるが、これらに限定されるわけではない。「抗体」という用語は、一実施例として、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、ヒトまたは非ヒト抗体、完全合成抗体、組換え生産抗体、免疫グロブリン、抗体軽鎖モノマー、抗体重鎖モノマー、抗体軽鎖ダイマー、抗体重鎖ダイマー、抗体軽鎖－重鎖ペア、イントラボディ、抗体融合、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体。一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、アフィボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本書では「抗体擬態」と呼ぶこともある）および上記のいずれかの抗原結合フラグメントを含む。上記で定義されたような抗体は、任意の種から得ることができる。
【0046】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲＣ）を発現する細胞は、抗体－抗原複合体に接着する能力によって、他の造血系細胞と区別される。ＦｃＲは、主に特定のサブクラスの抗体のＣＨ２ドメインに存在するアミノ酸配列に結合する。ＦｃＲは、抗体重鎖上の、ある種のサブクラスのＣＨ２のヒンジ領域の下、またはその近傍にある配列に結合する。ＦｃγＲは、特定のサブクラスのＩｇＧ抗体のみに特異的に結合するクラスである。これらの膜貫通型分子は、いくつかの免疫グロブリン（Ｉｇ）クラスおよびサブクラスのＦｃ領域を認識する。異なるアイソタイプのＦｃＲとそれに対応するＣＤの呼称は、ＩｇＧ（ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４、ＦｃγＲＩＩ／ＣＤ３２、およびＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６）、ＩｇＥ（ＦｃεＲＩ）、ＩｇＡ（ＦｃαＲＩ／ＣＤ８９）、ＩｇＭ（ＦｃμＲ）、およびＩｇＡ／ＩｇＭ（Ｆｃα／μＲ）などがある。「ＦｃＲを実質的に含まない」とは、ＦｃＲに結合することが知られるＩｇアイソタイプおよびそのサブクラスから形成される免疫複合体を有する表面に接着しない細胞を意味する。
【0047】
「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子がコードする抗体クラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を意味する。
【0048】
「検出可能な標識」とは、物理的または化学的手段により直接または間接的に検出または測定することで、試験サンプル中の標的細胞の存在を示すことができる物質を指す。吸光、蛍光、反射、光散乱、燐光、ルミネセンスの特性に基づいて直接または間接的に検出可能な分子またはイオン、放射性特性によって検出可能な分子またはイオン、核磁気共鳴または常磁性特性によって検出可能な分子またはイオンなどである。吸光または蛍光に基づいて間接的に検出可能な分子のグループには、例えば、適切な基質を、例えば、非光吸収分子から光吸収分子へ、または非蛍光分子から蛍光分子へと変換させる様々な酵素が含まれる。
【0049】
この「実質的に除外する」という表現は、生物試料特異的リガンド（例えば、ｍＡｂ）または生物試料特異的試薬（ビオチン、ストレプトアビジンなど）と対応する標的決定基（例えば、対象細胞上の細胞受容体）との間の結合反応の特異性を意味する。生物特異的リガンドおよび試薬は、標的決定基に対して特異的な結合活性を有するが、他の試料成分に対して低レベルの非特異的な結合を示すこともある。
【0050】
本明細書で使用する「濃縮」という用語は、生体試料から標的Ｔ細胞およびＢ細胞を濃縮することを意味する。
【0051】
本発明を実施するのに使用するための好ましい磁性粒子は、コロイドとして挙動する粒子である。そのような粒子は、一般に約２００ナノメートル（ｎｍ）（０．２０ミクロン）未満であるサブミクロン粒子サイズと、長期間にわたる溶液からの重力分離に対する安定性とによって特徴付けられる。その他多くの利点に加え、このサイズ範囲では、細胞分析に一般的に適用される分析技術では本質的に見えない。９０－１５０ｎｍの範囲内にあり、７０－９０％の磁性質量を有する粒子が、本発明での使用に企図されている。適切な磁性粒子は、超常磁性材料の結晶性コアを、磁性コアに結合し、例えば物理的に吸収されるかまたは共有結合し、安定化コロイド特性を付与する分子によって取り囲んだものである。コーティング材料は、試料中に見出される生体高分子と磁性コアとの間の非特異的相互作用を防止するのに有効な量で適用されることが好ましい。このような生体高分子としては、非標的細胞表面のシアル酸残基、レクチン、グリプロテイン、その他の膜構成成分などが考えられる。さらに、できるだけ多くの磁性質量／ナノ粒子を含むことが望ましい。コアを構成する磁性結晶の大きさは十分に小さく、完全な磁区を含んでいない。ナノ粒子のサイズは、ブラウンエネルギーが磁気モーメントを上回る程度に十分に小さい。その結果、中程度の強さの磁場でも、コロイド磁性粒子の北極・南極の配列とそれに続く相互引力・斥力が発生しないようで、溶液の安定性に寄与する。最後に、磁性粒子は高磁場勾配の外場分離装置で分離可能であることが望ましい。その特性は、強磁性ビーズやスチールウールを装填したより複雑な内部勾配カラムに比べて、試料の取り扱いを容易にし、経済的な利点をもたらすものである。上記のような特性を有する磁性粒子は、米国特許第４，７９５，０００号明細書に記載されている基材を改良することにより調製することができる。米国特許第４，７９５，６９８号、同第５，５９７，５３１号および同第５，６９８，２７１号に記載された基材を改良することにより、上記の特性を有する磁性粒子を調製することができる。それらの基材からの調製を以下に説明する。
【0052】
ナイーブで未接触の標的細胞を効率的に分離することが可能
本明細書では、養子細胞療法などの遺伝子工学および治療法において使用するためのナイーブ細胞、例えば、Ｔ細胞を調製する方法が記載される。具体的には、いくつかの実施形態では、方法は、単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞集団などの複数の異なる細胞集団または種類の細胞を含む組成物を使用または生成する。いくつかの実施形態では、方法は、１つまたはそれ以上の細胞集団を単離するための工程を含む。本明細書に記載の方法に供される細胞は、一般に、哺乳類被験者、好ましくはヒト被験者に由来する試料から単離される。
本明細書では、養子細胞療法などの遺伝子工学および治療法において使用するためのナイーブ細胞、例えば、Ｔ細胞を調製する方法が記載される。具体的には、いくつかの実施形態では、方法は、単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞集団などの複数の異なる細胞集団または種類の細胞を含む組成物を使用または生成する。いくつかの実施形態では、方法は、１つまたはそれ以上の細胞集団を単離するための工程を含む。本明細書に記載の方法に供される細胞は、一般に、哺乳類被験者、好ましくはヒト被験者に由来する試料から単離される。
【0053】
我々は、ＦｃＲＣ上のＦｃＲを利用して、いくつかの重要な細胞集団のネガティブセレクションを最小数の特異抗体で行う方法が複数存在することを発見した。Ｔ細胞の場合、好ましくはＩｇＧクラスの単一抗体で、そのアミノ酸残基がヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、あるいは無傷のＦｃの下および近傍にあるものが、ＦｃγＲＣと結合反応を起こすことを見いだした。このような抗体のＦａｂ部分は、Ｂ細胞上のユニークなエピトープと反応し、標識抗体以外の内因性または添加されたＩｇＧが実質的に存在しない場合、およびＩｇＧが存在する他の場合には、ＰＢＭＣ標本中のナイーブおよびメモリーＴ細胞以外のすべての細胞の標識に有効に使用することが可能である。固体担体を用いた特異的結合対反応やフローサイトメトリーによる細胞選別法などの様々な周知の細胞分離技術と組み合わせることにより、我々の発見が単一のｍＡｂまたは特異性の高いポリクローナル抗体によるナイーブＴ細胞の精製を可能にする。すなわち、単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、顆粒球、ＮＫ細胞などに発現するＦｃγＲや、ＦｃγＲと相互作用する抗体のＦｃ部分を、ナイーブＴ細胞の細胞分離・精製に独創的かつ有利に利用することができる。この発見を、Ｂ細胞上の表面Ｉｇ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、又はＣＤ３２などのＢ細胞エピトープを指向する単一のｍＡｂの使用と組み合わせると、ナイーブＴ細胞を調製するための単純で効率的かつ驚くほど経済的な方法論が達成される。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞に向けられた第２のｍＡｂとの組み合わせで、ナイーブＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞が容易に調製される。この発明には、多面的な実施形態が存在する。
【0054】
ナイーブＴ細胞を製造するための１つの実施形態において、その後の除去のために、ＰＢＭＣ中のナイーブＴ細胞以外のすべての実質的な標識は、ＦｃγＲに結合する抗体クラスからのＦｃ断片の、固体支持体への付着に加えて、両方の場合において、ＦｃγＲＣおよびＢ細胞をそれぞれ懸濁液から除去するために十分な結合エネルギーでＢ細胞と結合できる他の１つの実体によって、達成される。それは、ユニークなＢ細胞特異性を持ち、ＦｃγＲに結合するサブクラスの１つの抗体で達成できる。注目すべきは、そのような表面上のＦｃの密度がＦｃγＲまたはＦｃγＲに結合したＩｇとの結合相互作用に影響し、その表面上のＦｃの近接性を考慮する必要があることを明らかにしたことである。我々は、生物学的プロセスでよく知られる多価の結合相互作用を介して、それらの相互作用の増強があることを理論的に説明する。
【0055】
ＣＤ１９、ＣＤ２０、表面Ｉｇｓなど、上記の目的のために標的とすることができるＢ細胞に特異的な決定因子またはエピトープがいくつか存在する。これらのＢ細胞特異的エピトープの発現は、Ｂ細胞が発生する間、かなり安定している。別の好適なエピトープはＣＤ３２であり、これはその幅広い発現のために、他のＢ細胞特異的エピトープの中で好ましいものである。ＣＤ３２は、Ｔ細胞を除くＢ細胞および他のＷＢＣに発現している。この広い発現は、強いＦａｂ／ＣＤ３２エピトープ結合とＦｃ／ＦｃγＲ結合を介して、すべてのＦｃγ ＲＣに対する標識のための効果的なアプローチを提供するものである。このアプリケーションでは、このタスクに適したいくつかのｍＡｂｓを説明する。それらのＦｃγＲ反応性ｍＡｂのいずれかを適切な密度で表面に結合させるだけで、Ｂ細胞とＦｃγＲＣを結合させる固体支持体ができる。それらのｍＡｂの１つをペトリ皿または同様の容器に結合させた場合、研究者または診断者は、不要な細胞をパンニングするだけでナイーブＴ細胞を容易に調製することができる。このようなｍＡｂを、ここで採用したＦＦのようなナノ粒子、他の磁性粒子、または浮遊能力を有するナノ／マイクロ実体に結合させる場合、より大規模な分離のための簡単な手段が可能になる。ｍＡｂｓを表面に直接付着させる方法と、適切なリンカーを介して結合させる方法は様々である。リンカーを介した結合は有利であるが、我々が示したように直接結合はうまく機能する。
【0056】
抗体の断片が上記実施形態に採用され得ることは理解されよう。ＦａｂおよびＦｃ断片の作製方法は５０年近く前から知られており、ＦｃγＲに結合するＩｇＧ分子の主要部分であるＣＨ２ドメインの作製方法と同様に容易に作製することができる。したがって、ＦｃまたはＣＨ２断片のいずれか、あるいはヒンジ領域とその直下および近位のアミノ酸配列（Ｋｉｙｏｓｈｉ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｔｏ ｉｔｓ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦｃγＲＩ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（２０１５），６：６８６６）は、ＦｃγＲＣおよびＢ細胞を捕捉し、その後除去するための強力かつ特異的な固体支持体を製造するために、抗Ｂ細胞特異的実体とともに固定化することができる。それらの断片は直接連結することができるが、後者のアプローチはより多くの立体化学的結合の機会をもたらすので、リンカーを採用することがより効果的である可能性がある。
【0057】
間接標識法の利点と共通の捕捉剤の利点を併せ持つナイーブＴ細胞を製造するための別の実施形態では、ＰＢＭＣを抗ＣＤ１９、－ＣＤ２０、抗ヒトＩｇ、または抗ＣＤ３２などのＢ細胞エピトープに向けられたｍＡｂとインキュベートする。その後、標識ｍＡｂの起源となる種に対する抗Ｆｃを有する適切な支持体上で共通の捕捉剤とインキュベートすることになる。このような抗Ｆｃの要件は、当該技術分野でよく知られているＦｃγＲと強い相互作用ができるサブタイプでなければならないことである。臨床使用のために、この実施形態が２つのｍＡｂ（標識ｍＡｂおよび共通捕捉ｍＡｂ）を必要とするにもかかわらず、標識ｍＡｂの効率的な使用、すなわち、抗Ｂ細胞ｍＡｂをその分子形態で使用することがあり、共通捕捉剤上の第２のｍＡｂは、他の多くの特定の分離工程においてその方法で使用することが可能である。我々はこの目的のためにＦＦに高密度に結合したモノクローナルラット抗マウスＦｃ（ＲＡＭ）を採用し、すでに述べたように、固体支持体に結合したＳＡをビオチン化ターゲティングｍＡｂと組み合わせて同様に使用してきた。
【0058】
間接プロトコルでＦｃγＲＣの標識に固体支持体に結合したＲＡＭが使用される場合、その標識反応に関与する２つの種、すなわち、ＲＡＭ－固体支持体および標的化抗体に結合したその成分（それらが適切なサブクラスであることを条件）がありそうだということは注目すべきことである。あるいは、ＳＡ結合固体支持体、または他の特異的結合ペア反応が使用される場合、異なるメカニズムが存在すると思われる。これらの場合、共通の捕捉剤は、ＦｃγＲＣが標的化ｍＡｂと結合する時、そしておそらくは、その多価性を介して、ＦｃγＲに関連するビオチン標識ｍＡｂと結合することによっても、最も可能性の高い標識剤になるだろう。ビオチン／ストレプトアビジンの代わりに使用できるＤＮＰ／抗ＤＮＰ、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ビオチン／抗ビオチン、およびアルサニル酸／抗アルサニル酸のような当技術分野で既知の他の特異的結合対反応があるが、ビオチン／ＳＡ結合対の強さは容易に利用できる共有結合のそれに近いものである。このようなネガティブセレクションでは、ラベルを反転させる必要はないが、将来、除去した細胞との反応を反転させる必要がある場合には、結合親和性の低い結合対、例えばデスチオビオチンとストレプトアビジンや、アビジンやストレプトアビジンで解離できるビオチン－抗ビオチン結合対反応も使用可能である。その他、ｍＡｂとビオチン、またはストレプトアビジンとＨＳＡの間の結合を切断する方法も考えられる。
【0059】
ＰＢＭＣは、ナイーブＴ、Ｂ細胞、ＦｃγＲＣの３つのサブグループまたはフラクションに分類されるので、後者の２つのグループを除去できる方法は、ナイーブＴ細胞の単離につながるはずである。上記の実施形態は、多くの種類の細胞上のＦｃγＲの共通性を利用し、固体支持体に結合した抗Ｂ細胞ｍＡｂとの組み合わせで、そのような細胞を標的とすることで、適切な処理によりナイーブＴ細胞を生成することができる。さらに、ビオチン化ｍＡｂまたはその結合断片をＳＡ共通捕捉剤と組み合わせて使用する間接的な手順で、標識および分離処理段階を実施することができる。ＳＡは、言及されたナノ／マイクロ粒子のいずれかに結合され得るか、またはセファロースもしくは繊維および当技術分野で公知の他のもののようなカラム充填材料に結合され得る（例えば、Ｅｔｃｈｅｌｌｓ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、米国特許第５，２１５，９２６号参照）。
【0060】
ＰＢＭＣは、ナイーブＴ、Ｂ細胞、ＦｃγＲ細胞の３つのサブグループまたはフラクションに分類されると述べたが、Ｂ細胞エピトープを特異的に標的とする１つの抗体を用いることで、ＣＤ３＋Ｔ細胞を高純度に分離することが可能である。実際、Ｂ細胞も低親和性のＦｃγＲ、ＦｃγＲＩＩＢを発現しているので、ＰＢＭＣもＴ細胞とＦｃγＲ細胞の２クラスに分類される。ＦｃγＲを標的とする抗体を用いれば、そのＦａｂとＦｃの両部分がＦｃγＲと結合することで、非Ｔ細胞を除去することも可能となる。ＣＤ３２はＦｃγＲＩＩとも呼ばれ、Ｂ細胞、単球、顆粒球、樹状細胞、ＮＫ細胞、血小板に広く発現していることが知られており、ＩｇＧクラスの抗ヒトＣＤ３２抗体はＦａｂ領域を用いたＦｃγＲＩＩ発現細胞とＦｃ領域とＦＦの適正結合度を用いた他のＦｃγＲを持つ細胞を全て除去し、Ｔ細胞のみを画分に残せば良いことになる。
【0061】
前述したように、単一の抗体、すなわちＢ細胞に固有の特異性を有するｍＡｂを採用してナイーブＴ細胞を産生する実施形態において、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞に向けられる第２のｍＡｂを加えた場合、ナイーブＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞のいずれかが適切な分離系を介して生産されることが明らかだろう。別の実施形態では、同様に、１つの分離スキームにおいて、ｍＡｂで標識されたそれらの細胞の一方または他方とともに、ナイーブＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞のいずれかを回収することが可能だろう。言い換えると、１回の磁気分離または浮力分離で実施できる、それらのナイーブサブセットの一方を未接触で、他方をｍＡｂで標識して得るための方法が提供される。例えば、ある場合には、ビオチン化抗Ｂ細胞およびデスチオビオチン抗ＣＤ４のｍＡｂカクテルをＰＢＭＣと混合すると、すべてのＦｃＲＣ、Ｂ細胞およびＣＤ４＋細胞は、添加およびＳＡ固体支持体とのインキュベーションにより磁気標識されるだろう。磁気分離後、ＣＤ８＋細胞は上清または液相に残り、ＦｃＲＣ、Ｂ細胞およびＣＤ４＋細胞は含まれない。このように、懸濁液中のＣＤ８＋は容易に回収される。磁気分離された細胞は、この場合、ＣＤ４＋細胞を「ポジティブセレクション」して含むことになる。これらの細胞は、デスチオビオチン：ＳＡ結合を切断するビオチンの添加により、容易に放出される可能性がある。分離が、我々が開発したシステム（ＷＯ ２０１６／１８３０３２Ａ１）の場合のように、広い面積にわたって細胞を磁気的に収集することができる装置およびかなり均一に層になっている細胞で行われた場合、それらのＣＤ４＋細胞の良好な回収が期待されるだろう。この方法によるナイーブＣＤ４＋細胞の回収は、所望により、抗ＣＤ４ ｍＡｂの代わりにデスチオビオチン抗ＣＤ８ｍＡｂを使用することによって達成することが可能である。ビオチン置換によるデスチオビオチン解離手段に加えて、ビオチン／抗ビオチン反応を解離させる方法は当技術分野でよく知られる（Ｌｕｎｄ，Ｇ．ａｎｄ Ｗｅｇｍａｎｎ，Ｔ．，米国特許番号５，５１８，８８２；Ｂｒｉｅｄｅｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｄｏｓｅ，Ｃ．米国特許番号２０１４０１１３３１５Ａ１）。したがって、上記のスキームにおいて、ｍＡｂ標識されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を回収する方法はいくつか存在する。
【0062】
本明細書に開示された上記のすべての実施形態に加えて、これらの概念および方法をさらに拡張し、ナイーブＮＫ細胞およびナイーブＢ細胞さえも分離することを可能にする、採用し得る別の変数が存在する。上述のように、ナイーブＴ細胞を除く白血球はＦｃγＲｓを発現し、高親和性受容体と低親和性受容体の解離定数には非常に大きな差があるため（Ｍｋａｄｄｅｍ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．"Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ"：Ｆｒｏｍ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｏｏｌｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：８１１，２０１９；Ｃｈａｕｈａｎ Ａ．Ｋ．，Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｔ－ｃｅｌｌｓ：Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：２１５，２０１６）、標識ＰＢＭＣ調製に使用するｍＡｂの濃度を変えることで、最適化された陰性分離条件を実現することができる。我々は、高親和性ＦｃγＲは、低親和性ＦｃγＲとの十分に強い結合に必要とされ得るものよりも少ない程度にクラスター化した固体支持体上のＦｃとの相互作用によって選択的に標識することができると仮定している。したがって、低親和性ＦｃγＲのみを有するＦｃγＲＣの単離が可能になった。
【0063】
適切なｍＡｂがＳＡ－ＦＦのような多価結合表面と相互作用し、その後ＦｃＲと相互作用するときに形成される複合体の別の結果は、血小板もＦｃγＲを負担することである。したがって、ＰＢＭＣを、例えば、適切なアイソタイプのビオチン化ｍＡｂと十分に高い濃度（>２μｇ／ｍＬ、例えば、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５μ／ｍｌ）でインキュベートした後、ＳＡ－ＦＦすると、血小板もビオチン標識されるようになる。したがって、上記のような共通捕捉磁性ナノ粒子による分離や、固体支持体、あるいは他の分離基材を用いる何らかの手段により、陰性画分から血小板も除去されることになる。ほとんどの内因性ＩｇＧを欠くＰＢＭＣの調製においても、血小板の混入は問題となり得るので、そのＦｃγＲを介して除去することができる。したがって、本発明は、ナイーブＴ細胞および他の細胞の調製方法を作成するための手段を提供するだけでなく、選択を開始する前に血液製剤の重要な処理を行う必要性が排除されるため、時間と費用を節約することができる。
【0064】
前述のすべてに加えて、本明細書に開示されるようにＦｃγＲＣを容易に枯渇させることができるという原理は、他の重要な臨床戦略を可能にする。例えば、現在、ＣＤ３４幹細胞は、抗ＣＤ３４ ｍＡｂｓを用いたポジティブセレクションにより単離される。このような細胞を、移植や遺伝子工学的治療のために、未接触の細胞やナイーブな細胞から処理できることが望ましいだろう。現在のやり方でもネガティブセレクションは可能だが、ＣＤ３４（＋）以外の細胞を取り除くには７－９個のｍＡｂが必要である。経済的な観点からは、この方法は実行不可能である。一方、正常および白血病患者の胎児および成人骨髄の研究から、ＦｃγＲは非転移前駆ＣＤ３４＋細胞では発現しないことが確認される（Ｏｌｗｅｕｓ Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＣＤ６４／Ｆｃ Ｇａｍｍａ ＲＩ ｉｓ ａ ｇｒａｎｕｌｏ－ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｎ ＣＤ３４＋ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ，．Ｂｌｏｏｄ．８５：２４０２－１３，１９９５；Ａｏｋｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３４＋ ａｎｄ ＣＤ３４－ ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＭＬＬ－ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．１２５：９６７－８０，２０１５）．したがって、本明細書に記載される方法および試薬を用いて、未接触であるＣＤ３４＋幹細胞の負の選択が達成可能である。以下に例示されるように、その結果は、たった１つのｍＡｂ、すなわち、ビオチン化抗ＣＤ３ ｍＡｂで達成され得る。
【0065】
ＦｃγＲＣと血小板の結合のために表面上のクラスター化したＦｃを使用するという原理は、別の有利な目的のために有利に使用することができる。開示されているように、我々は、ＰＢＭＣをＲＡＭ－ＦＦで処理すると、すべての単球を枯渇させることができることを発見した。さらに、血小板は、その表面にクラスター化したＦｃ領域を有する構築物で枯渇させることができることを観察している。したがって、ＰＢＭＣおよび他の類似の混合物をそのような薬剤で処理することにより、ＦｃＲを有する成分を欠いたＰＢＭＣ調製物および混合物を作成することができる。そのＦｃ断片を近接させる方法で表面に結合したヒトＩｇＧは、ＦｃγＲを有する成分との結合に理想的であろう。ＦｃγＲのそのような担体の除去は、磁性または浮力のある粒子で、密に結合したヒトＩｇＧ吸着剤上をＰＢＭＣが通過し、単に、細胞体の密度の差に基づく分離の遠心分離法を可能にする方法で密度が変化するようにその実体を標識することによって容易に達成できるだろう。
【0066】
要約すると、Ｂ細胞に対する特異的反応性とＦｃγＲに結合するＦｃ領域を有する単一の抗体のみを用いたナイーブＴ細胞のネガティブセレクションに、ＦｃγＲＣ上のＦｃγＲを有利に使用できることを発見した。直接標識法、すなわち固体支持体に結合した単一の鍵試薬で、または単一の鍵試薬を、その鍵試薬を密着して結合させることができる共通の捕捉剤などの表面または固体支持体とともに用いる間接標識法でそれぞれ実施することができる２つの主要方法が開示される。分離方法としては、様々な方法を採用することができる。
【0067】
Ｂ細胞との直接的な結合に加え、ＦｃγＲＣの標識化において作動していると考えられるメカニズムは、（ｉ）抗ＣＤ１９やＣＤ２０のようなＢ細胞に対する抗体を用いた場合、固体支持体上にクラスター化したＦｃγＲＣの標識化、（ｉｉ）抗Ｂ細胞表面Ｉｇ、例えば，γマウス抗ヒトＩｇＧもＦｃγＲＣに結合した免疫グロブリンに結合でき、近傍の免疫グロブリンの架橋を介してそれらの結合反応を安定化し、したがってＦｃγＲ－抗体反応の結合定数を高めることができるという事実、および（ｉｉｉ）抗ＣＤ３２を用いる場合、抗体はＦａｂパラトープを介し、すべてのＦｃγＲにＦｃ領域を介して結合できる（図１）。上記のように、メカニズム「２」はシステム内の遊離ＩｇＧに敏感であり、それゆえ、洗浄していないＰＢＭＣサンプルに見られる低レベルの内在性ＩｇＧにおいて最もよく実施される。低親和性ＦｃγＲは、その親和性定数の増大を介して互いに近接するＦｃ領域と相互作用するとき、ＦｃγＲＣを「標識」する役割を果たすこともできるようである。したがって、ＰＢＭＣに結合させるｍＡｂの量を変えることにより、高親和性ＦｃγＲだけを選択的に標識することが可能だろう。この能力により、ナイーブＮＫ細胞やＢ細胞の分離が可能になる。
【0068】
ＦｃＲと表面上のクラスター化したＦｃとの間で観察された「特異的結合対反応」を事実上利用する上記の方法に加えて、未接触またはナイーブＴ細胞のいずれかを精製する手段として、ＦｃγＲを免疫特異的に標的化する方法も開示する。
【0069】
現在請求されている方法および組成物は、ＣＡＲ Ｔ療法用の細胞の調製において有利に使用することができる。本発明はまた、ＣＤ３４＋のネガティブセレクションのための手段も提供し、これもまた重要な治療的可能性を有する。
【0070】
最後に、本明細書で提供される情報を考慮すると、ＦｃγＲに結合するそれらの抗体のＦｃγＲ結合領域を模倣する１つまたはそれ以上のポリペプチド配列と、本開示に従ってＢ細胞または何らかの他の特異性に特異的に結合できる分子実体（結合または独立）の生成を介して、ｍＡｂが果たす機能を果たすように組換え分子が設計可能である。
【0071】
本発明の実施を容易にするために、以下の材料および方法が提供される。
【0072】
磁性粒子－フェロフルイド（ＦＦ）:ＦＦはすべてＢｉｏＭａｇｎｅｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ社（ステートカレッジ、ペンシルバニア州）製を使用した。ＢＳＡ／ＨＳＡ－ＦＦは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ａｋｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、フロリダ州）をＦＦにコーティングして合成され、コーティング後のサイズは約１２５～１３０ｎｍであり、８４％の磁気質量を含んでおり、ＲＡＭ－ＦＦは、ＢＳＡまたはＨＳＡ－ＦＦにラット抗マウスＩｇＧ１ ｍＡｂを標準的なトラウト試薬とスルホＳＭＣＣ手順（サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて結合させることで作製、ＳＡ－ＦＦは、ＢＳＡまたはＨＳＡ－ＦＦにストレプトアビジン（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、カリフォルニア）を結合させて同様に合成され、サイズはＲＡＭ－およびＳＡ－ＦＦともに約１５５～１６５ｎｍであった。
【0073】
抗体とフローサイトメトリー解析抗ヒトＩｇＧのマウスポリクローナル抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（カタログ番号２０９－００５－０８２）から入手した。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ'）２－ビオチンおよびＦａｂ－ビオチンはＲｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ポッツタウン、ペンシルバニア州）から、ヒトＣＤ３、ＣＤ１９、ＩｇＧ、ＣＤ２０およびＣＤ３２へのｍＡｂはＡｂｓｏｌｕｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ボストン、マサチューセッツ州）から購入された。抗ヒトＣＤ３４およびＣＤ５６抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から、蛍光抗体抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣ、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ１１ｂ－ＰＥｃｙ５、ＣＤ１９－ＰＥｃｙ５、ＣＤ３４－ＰＥおよびＣＤ５６－ＰＥはＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのものであった。分離前後の細胞を蛍光結合抗体で染色し、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９陽性細胞はＣＤ４５陽性細胞でゲーティングして解析、アイソタイプコントロールは解析ゲートの設定に使用、サンプルはＧｕａｖａ（登録商標） ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を用いて解析した。
【0074】
細胞および細胞の分離：多くの実験のための細胞は、血漿を除去するために直ちに遠心分離したアフェレーシス製品から得られた。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで３サイクルの遠心分離により洗浄し、最後にペレット化した細胞をＣｒｙｏＳｔｏｒ－ＣＳ１０（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ワシントン州）で懸濁し、分注、凍結した。ＣｒｙｏＳｔｏｒ－ＣＳ１０は、無血清、無タンパク質の細胞凍結培地である。これらのアリコートは、内因性ヒトＩｇＧを実質的に含まないので、ＰＢＭＣ－Ｉｇと称される。また、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡまたはＨＳＡで２回洗浄した新鮮なアフェレシス製品を用いて実験も行った。
【0075】
ダイレクトネガティブセルセレクションの手順:主にＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＩｇＧ（ＭＡＨ－Ｉｇ）のマウスポリクローナル抗体を、製造元の推奨に従って、トラウト試薬とスルホＳＭＣＣを用いてＢＳＡ－ＦＦにコンジュゲートした。このコンジュゲーションは、ＦＦの表面に抗体を密に充填することを目的とした（４０００～７０００ｍＡｂ／粒子）。同様のコンジュゲーションは、抗ヒトＣＤ１９ｍＡｂでも行われた。凍結ＰＢＭＣをそのまま等量の緩衝液（ＰＢＳ中４％ＢＳＡ）で希釈し、１５ｕｇ／ｍＬ（Ｆｅ基準）ＭＡＨ－Ｉｇ－ＦＦと細胞濃度２－１０ｘ１０７ｃｅｌｌ／ｍＬで室温にて２０分インキュベートした。ＦＦは拡散によって容易に細胞を標識するので、２０分のインキュベーションの間、それ以上の混合は必要ない。インキュベーション終了後、必要に応じて細胞をさらに２ｘ１０７／ｍＬに希釈し、四重極磁選機で１５分間分離した。分離されなかった細胞－陰性画分－は吸引により回収された。陰性画分（未接触の細胞）の分析は、ＣＤ４５、ＣＤ３、およびＣＤ１１ｂ抗体を用いて、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ Ｐｌｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒでフローサイトメトリーにより行われた。ＣＤ３＋Ｔ細胞の純度および収量を分析した。
【0076】
間接的なネガティブセレクションの手順:ビオチン化抗体と２０分間インキュベートした後、ＳＡ－ＦＦを細胞混合物に直接添加し、さらに１５分間インキュベートした。その後、細胞を２ｘ１０７／ｍＬに希釈し、磁気分離に供した。
【0077】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するために提供されるものである。これらは、本発明を何ら限定することを意図するものではない。
【実施例1】
【0078】
抗ヒトＩｇＧ抗体による直接標識法を用いたアフェレシス製品／ＰＢＭＣからのアンタッチドＣＤ３＋Ｔ細胞の単離
ＩｇＧ１アイソタイプを主とする抗ヒトＩｇＧのマウスポリクローナル抗体（ＭＡＨ－Ｉｇ）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し（カタログ番号２０９－００５－０８２）、Ｔｒｏｕｔの試薬とスルホＳＭＣＣを用いてＦＦにコンジュゲートさせた。ＭＡＨ－Ｉｇ－ＦＦ上の抗体結合のレベルは、約３００μｇ～５００／μｇの鉄であった。この１４５ｎｍのナノ粒子では、粒子表面に抗体が「密集」しており、粒子あたり約４０００～７０００ｍＡｂが存在することになる。
ＩｇＧ１アイソタイプを主とする抗ヒトＩｇＧのマウスポリクローナル抗体（ＭＡＨ－Ｉｇ）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し（カタログ番号２０９－００５－０８２）、Ｔｒｏｕｔの試薬とスルホＳＭＣＣを用いてＦＦにコンジュゲートさせた。ＭＡＨ－Ｉｇ－ＦＦ上の抗体結合のレベルは、約３００μｇ～５００／μｇの鉄であった。この１４５ｎｍのナノ粒子では、粒子表面に抗体が「密集」しており、粒子あたり約４０００～７０００ｍＡｂが存在することになる。
【0079】
解凍したＰＢＭＣ－Ｉｇ（内因性Ｉｇを実質的に除去）をさらに処理せずに、１５μｇ／ｍＬ（鉄濃度に基づく）ＭＡＨ－Ｉｇ－ＦＦおよび細胞濃度２－１０ｘ１０７ｃｅｌｌ／ｍＬとともに室温で２０分間インキュベートした。ＦＦは拡散によって容易に細胞を標識するので、２０分間のインキュベーションの間、さらなる混合は必要ない。インキュベーション終了後、オプションで細胞を２ｘ１０７／ｍＬに希釈し、四重極型磁選機で１５分間分離した。分離されなかった細胞－陰性画分－は吸引により回収した。陰性画分（未接触の細胞）の分析は、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ Ｐｌｕｓフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーによって行われ、Ｔ細胞は抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ３－ＰＥで細胞を染色することによって同定された。図２を参照。複数の実験におけるＣＤ３＋Ｔ細胞の純度は>９５％であった。
【0080】
これらの結果から、ヒトＢ細胞表面Ｉｇに対する結合特異性を有する抗体１つで、Ｂ細胞だけでなくＦｃγＲＣの大部分も除去できることが明らかとなった。Ｔ細胞の純度９５％は、一般的に主要な臨床製造機関でＣＡＲ Ｔの製造に使用されているものよりも優れている。
【実施例2】
【0081】
実施例２ａ
ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体とＳＡ－ＦＦを用いたアフェレシス製品／ＰＢＭＣからの未接触ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離
ポリクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（ＭＡＨ－Ｉｇ）は、ＨＡＢＡテストで測定したところ、７ビオチン／ｍＡｂのレベルにビオチン化（ＭＡＨ－Ｉｇ－ビオチン）された。ＳＡ－ＦＦ（１４５ｎｍ）は、ＢｉｏＭａｇｎｅｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ステートカレッジ、ペンシルバニア州（カタログ＃ＳＡＦＦ－１０９）から得た。２－１０ｘ１０７の濃度のＰＢＭＣ－Ｉｇを、２～４μｇ／ｍＬのＩｇＧ１アイソタイプのＭＡＨ－Ｉｇ－Ｂｉｏｔｉｎを主体に、室温で２０分間インキュベートした。ＳＡ－ＦＦ（１５μｇ／ｍＬ）を細胞混合物に添加し、さらに１５分間インキュベートした。インキュベーション終了後、細胞を２×１０７／ｍＬに希釈し、上記と同様に磁気分離を行った。実施例１と同様に、陰性画分の細胞を蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により解析し、複数の実験において、>９５％が未接触またはナイーブＣＤ３＋Ｔ細胞であることが判明した。
ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体とＳＡ－ＦＦを用いたアフェレシス製品／ＰＢＭＣからの未接触ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離
ポリクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（ＭＡＨ－Ｉｇ）は、ＨＡＢＡテストで測定したところ、７ビオチン／ｍＡｂのレベルにビオチン化（ＭＡＨ－Ｉｇ－ビオチン）された。ＳＡ－ＦＦ（１４５ｎｍ）は、ＢｉｏＭａｇｎｅｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ステートカレッジ、ペンシルバニア州（カタログ＃ＳＡＦＦ－１０９）から得た。２－１０ｘ１０７の濃度のＰＢＭＣ－Ｉｇを、２～４μｇ／ｍＬのＩｇＧ１アイソタイプのＭＡＨ－Ｉｇ－Ｂｉｏｔｉｎを主体に、室温で２０分間インキュベートした。ＳＡ－ＦＦ（１５μｇ／ｍＬ）を細胞混合物に添加し、さらに１５分間インキュベートした。インキュベーション終了後、細胞を２×１０７／ｍＬに希釈し、上記と同様に磁気分離を行った。実施例１と同様に、陰性画分の細胞を蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により解析し、複数の実験において、>９５％が未接触またはナイーブＣＤ３＋Ｔ細胞であることが判明した。
【0082】
共通の捕捉剤であるＳＡ－ＦＦは、ＰＢＭＣ－Ｉｇ中の細胞、特にそれらの細胞のＦｃγ Ｒと反応しないことを考えると、これらの実験では、ｔ ＦｃγＲＣは、以下のメカニズムのうちの１つまたはそれ以上を介して除去されていると考えられる。まず、ＭＡＨ－Ｉｇ－ビオチンは、ＰＢＭＣと混合すると、Ｂ細胞を明確に標識する；それはまた、高親和性ＦｃγＲに結合でき、十分な濃度があれば、低親和性ＦｃγＲにも結合できる;ＭＡＨ－Ｉｇ－ビオチンはＦｃγＲを占有する内在性Ｉｇｓを架橋し、かかる架橋は親和定数を多価に増強するのでそれらのＦｃγＲへの内在性Ｉｇｓの結合を増大させる結果になった。したがって、ＭＡＨ－Ｉｇ－Ｂｉｏｔｉｎは、ＦｃγＲＣを高い親和性でビオチンで標識している可能性がある。最初の抗体インキュベーションの後、ＳＡ－ＦＦをシステムに加えたときに起こるはずの別の反応は、未結合のＭＡＨ－Ｉｇ－ビオチンも同時にＳＡ－ＦＦに結合して、ＦｃγＲに結合できる複合体を形成することである。したがって、ＦｃγＲＣが磁気標識化される方法は複数存在するようだ。それらをまとめると（ｉ）ＳＡ－ＦＦがＦｃγＲＣ上のビオチンに多価の相互作用を介して結合し、非常に強い結合を生じる、すなわち、親和性である、（ｉｉ）ＭＡＨ－Ｉｇ－Ｂｉｏｔｉｎと複合化したＳＡ－ＦＦは、「空」のＦｃγＲと強く相互作用するか、多価の付着の可能性のために、「充填」ＦｃγＲのＩｇを置換する、または（ｉｉｉ）、ＭＡＨ－Ｉｇ－ＢｉｏｔｉｎはＦｃγＲを占めるＩｇに結合し、多価付着を介してＩｇを架橋し、細胞がＳＡ－ＦＦによって容易にラベルされるように十分な結合エネルギーを生成する。
【0083】
実施例２ｂ
ビオチン化抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ'）２断片を用いたアフェレシス製品／ＰＢＭＣからの未接触ＣＤ３＋Ｔ細胞の分離
ヤギ抗ヒトＩｇＧのポリクローナルビオチン化（Ｆａｂ'）２フラグメント（ＦαＨＩｇ）をＲｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ポッツタウン、ペンシルバニア州）から購入し、異なる量のヒトＩｇＧを抗体標識前に細胞に添加した以外は例２ａに記載のものと同様の実験において使用した。抗ヒトＩｇＧのビオチン化Ｆ（ａｂ'）２フラグメント（ＦαＨＩｇ）の添加前にヒトＩｇＧとプレインキュベーションしたＰＢＭＣ－Ｉｇの効果を表１に表わす。Ｂ細胞の混入（この調製ではもともと１５％）は、ヒトＩｇＧの添加量の増加とともに著しく増加するが、これは標識抗体が添加されたヒトＩｇＧによって中和されていることから予想されることである。一方、ＣＤ１１ｂ＋細胞（元々２９．３％）は、著しく影響を受けていない。このことから、これらの実験では複雑な結合反応が起こっていることが示唆される。例えば、ヒトＩｇＧが添加されていない場合、（Ｆａｂ'）２はＦｃγＲに結合したＩｇｓに結合し、それらのＩｇｓの架橋を引き起こし、ＦｃγＲとの相互作用を安定化させる可能性が最も高い。さらに、ヒトＩｇＧが添加される量が増加するとき、第２の現象が起こっていると考えられる、すなわち、（Ｆａｂ'）２はＩｇＧに結合し、ＦｃγＲＣと強く相互作用する複合体を形成し、したがって、それらはビオチン標識され、続いてＳＡ－ＦＦによって、またはＩｇ－（Ｆａｂ'）２－ＳＡ－ＦＦ複合体の一部として、ＳＡ－ＦＦによって除去されていることになる。しかし、ＩｇＧの添加量が増加すると、（Ｆａｂ'）２とＢ細胞表面のＩｇＧとの相互作用が競合し、Ｂ細胞の枯渇に影響を与える。
ビオチン化抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ'）２断片を用いたアフェレシス製品／ＰＢＭＣからの未接触ＣＤ３＋Ｔ細胞の分離
ヤギ抗ヒトＩｇＧのポリクローナルビオチン化（Ｆａｂ'）２フラグメント（ＦαＨＩｇ）をＲｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ポッツタウン、ペンシルバニア州）から購入し、異なる量のヒトＩｇＧを抗体標識前に細胞に添加した以外は例２ａに記載のものと同様の実験において使用した。抗ヒトＩｇＧのビオチン化Ｆ（ａｂ'）２フラグメント（ＦαＨＩｇ）の添加前にヒトＩｇＧとプレインキュベーションしたＰＢＭＣ－Ｉｇの効果を表１に表わす。Ｂ細胞の混入（この調製ではもともと１５％）は、ヒトＩｇＧの添加量の増加とともに著しく増加するが、これは標識抗体が添加されたヒトＩｇＧによって中和されていることから予想されることである。一方、ＣＤ１１ｂ＋細胞（元々２９．３％）は、著しく影響を受けていない。このことから、これらの実験では複雑な結合反応が起こっていることが示唆される。例えば、ヒトＩｇＧが添加されていない場合、（Ｆａｂ'）２はＦｃγＲに結合したＩｇｓに結合し、それらのＩｇｓの架橋を引き起こし、ＦｃγＲとの相互作用を安定化させる可能性が最も高い。さらに、ヒトＩｇＧが添加される量が増加するとき、第２の現象が起こっていると考えられる、すなわち、（Ｆａｂ'）２はＩｇＧに結合し、ＦｃγＲＣと強く相互作用する複合体を形成し、したがって、それらはビオチン標識され、続いてＳＡ－ＦＦによって、またはＩｇ－（Ｆａｂ'）２－ＳＡ－ＦＦ複合体の一部として、ＳＡ－ＦＦによって除去されていることになる。しかし、ＩｇＧの添加量が増加すると、（Ｆａｂ'）２とＢ細胞表面のＩｇＧとの相互作用が競合し、Ｂ細胞の枯渇に影響を与える。
【表1】
【0084】
ビオチン化抗ＣＤ１９ｍＡｂを用いて上記とほぼ同様の実験を行ったところ、高純度のナイーブＴ細胞が得られた。この実験では、ヒトＩｇＧによる前処理はほとんど影響を与えず、相互作用のメカニズムに関する我々の仮説が確認された。
【実施例3】
【0085】
ビオチン化抗ヒトＣＤ３２およびＳＡ－ＦＦを用いたアフェレシス製品からの未接触ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離
ＦｃγＲは、上記実施例で示したようにＦｃγＲＣを除去するために用いることができるので、ＦｃγＲに対する抗体を用いて、抗体－エピトープ反応とクラスターＦｃを介したＦｃＲＣ磁気標識の組み合わせにより、以下の方法でそのような細胞をすべて除去することが可能であると思われる。抗ＣＤ３２抗体は、Ｂ細胞／単球／顆粒球／血小板などの白血球に広く発現しているが、Ｔ細胞には発現していないＦｃγＲＩＩに結合する。本抗体は、抗体－エピトープ反応により、調製品中のＢ細胞を含む全てのＦｃγＲＩＩを持つ細胞を標識するために使用できる。また、未結合のビオチン化抗ＣＤ３２抗体とＳＡ－ＦＦとの間で結合が起こり、ＦＦ上のＦｃがクラスター化し、ＦｃγＲＣにも強く結合する。この方法は、抗ＣＤ３２抗体と、システムに導入された捕捉表面に結合した抗ＣＤ３２抗体とで、ＦｃＲのすべてのガンマクラスを標識することを可能にするものである。適切な分離装置でインキュベートした後、ナイーブＴ細胞の高純度な懸濁液を得ることができる。この方法の有効性を実証するために、ヒトＣＤ３２に親和性のあるＩｇＧクラスのビオチン化マウスｍＡｂを使用した。２－１０ｘ１０７の濃度のＰＢＭＣを、ＩｇＧ１アイソタイプのビオチン化マウス抗ヒトＣＤ３２ ｍＡｂと室温で１５分間インキュベートし、その後の反応に十分な未結合ｍＡｂを提供した。ＳＡ－ＦＦを細胞混合物に添加し、さらに１５分間インキュベートした。抗体－エピトープ反応またはＳＡ－ＦＦ上のクラスター化ＦｃによるＦｃＲγＣの効率的な標識が達成された。標識された細胞を分離した結果、陰性画分中の未接触あるいはナイーブＣＤ３＋Ｔ細胞の純度は>９２％であった。
ＦｃγＲは、上記実施例で示したようにＦｃγＲＣを除去するために用いることができるので、ＦｃγＲに対する抗体を用いて、抗体－エピトープ反応とクラスターＦｃを介したＦｃＲＣ磁気標識の組み合わせにより、以下の方法でそのような細胞をすべて除去することが可能であると思われる。抗ＣＤ３２抗体は、Ｂ細胞／単球／顆粒球／血小板などの白血球に広く発現しているが、Ｔ細胞には発現していないＦｃγＲＩＩに結合する。本抗体は、抗体－エピトープ反応により、調製品中のＢ細胞を含む全てのＦｃγＲＩＩを持つ細胞を標識するために使用できる。また、未結合のビオチン化抗ＣＤ３２抗体とＳＡ－ＦＦとの間で結合が起こり、ＦＦ上のＦｃがクラスター化し、ＦｃγＲＣにも強く結合する。この方法は、抗ＣＤ３２抗体と、システムに導入された捕捉表面に結合した抗ＣＤ３２抗体とで、ＦｃＲのすべてのガンマクラスを標識することを可能にするものである。適切な分離装置でインキュベートした後、ナイーブＴ細胞の高純度な懸濁液を得ることができる。この方法の有効性を実証するために、ヒトＣＤ３２に親和性のあるＩｇＧクラスのビオチン化マウスｍＡｂを使用した。２－１０ｘ１０７の濃度のＰＢＭＣを、ＩｇＧ１アイソタイプのビオチン化マウス抗ヒトＣＤ３２ ｍＡｂと室温で１５分間インキュベートし、その後の反応に十分な未結合ｍＡｂを提供した。ＳＡ－ＦＦを細胞混合物に添加し、さらに１５分間インキュベートした。抗体－エピトープ反応またはＳＡ－ＦＦ上のクラスター化ＦｃによるＦｃＲγＣの効率的な標識が達成された。標識された細胞を分離した結果、陰性画分中の未接触あるいはナイーブＣＤ３＋Ｔ細胞の純度は>９２％であった。
【実施例4】
【0086】
アフェレシス製品もしくは、ＰＢＭＣを２種類の抗体を用いたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のネガティブセレクション
これまでの実施例に基づいて、ナイーブＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の調製方法が考案され、ネガティブ選択されるＴ細胞タイプに応じて、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかに指向するｍＡｂを追加で１つ含むようにした。ＣＤ４＋ナイーブ細胞のネガティブセレクションを例にとって説明すると、２つのｍＡｂがＦＦに固定化され、一方または両方がＦｃγＲ、すなわち正しいサブクラス／アイソタイプと反応することになる。したがって、もし実施例１が、ＦＦに結合した抗ヒトＩｇＧおよび抗ＣＤ８ ｍＡｂｓの両方を有することによって修正されたなら、そのような結合体は、かなりのレベルの競合ＩｇＧがない場合、ＦｃγＲＣ、Ｂ細胞およびＣＤ８＋細胞のすべてを消耗し、負の画分に未接触のＣＤ４＋細胞が残されるはずである。ナイーブＣＤ８＋細胞を得るために、固定化される２番目のｍＡｂは、抗ＣＤ８ではなく抗ＣＤ４だろう。したがって、陰性画分にはＣＤ８＋細胞が含まれることになる。
これまでの実施例に基づいて、ナイーブＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の調製方法が考案され、ネガティブ選択されるＴ細胞タイプに応じて、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかに指向するｍＡｂを追加で１つ含むようにした。ＣＤ４＋ナイーブ細胞のネガティブセレクションを例にとって説明すると、２つのｍＡｂがＦＦに固定化され、一方または両方がＦｃγＲ、すなわち正しいサブクラス／アイソタイプと反応することになる。したがって、もし実施例１が、ＦＦに結合した抗ヒトＩｇＧおよび抗ＣＤ８ ｍＡｂｓの両方を有することによって修正されたなら、そのような結合体は、かなりのレベルの競合ＩｇＧがない場合、ＦｃγＲＣ、Ｂ細胞およびＣＤ８＋細胞のすべてを消耗し、負の画分に未接触のＣＤ４＋細胞が残されるはずである。ナイーブＣＤ８＋細胞を得るために、固定化される２番目のｍＡｂは、抗ＣＤ８ではなく抗ＣＤ４だろう。したがって、陰性画分にはＣＤ８＋細胞が含まれることになる。
【0087】
別のアプローチにおいて、ＳＡ－ＦＦのような共通の捕捉剤を使用する場合、２つのビオチン化ｍＡｂを使用して、上記と同じ結果を達成することができる。したがって、ナイーブＣＤ４＋細胞の製造は、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞およびＦｃＲＣを標識するために、ビオチン化抗ＣＤ８および抗Ｂ細胞特異的ｍＡｂとＰＢＭＣをインキュベートすることにより達成されるであろう。ＳＡ－ＦＦを用いた磁気分離により、ネガティブに選択されたＣＤ４＋細胞を得ることができる。ここで報告された純度から、ＣＤ４＋細胞の純度は９０％台半ばから後半と予想される。このことは、抗ＣＤ１９ビオチン、抗ＣＤ８ビオチンとＳＡ－ＦＦを併用して実験的に確認され、>９２％の純度のＣＤ４＋細胞が得られる。
【実施例5】
【0088】
１回の磁気分離で２種類のｍＡｂを用いたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の回収
ＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞の定義された比率によって調製されたＣＡＲ Ｔコンストラクトの臨床的重要性に基づき、そのような分離を効率的に達成することが望ましいと思われる。ここで説明した手順を用いると、２つのｍＡｂ特異性のみを利用する以下のスキームが、そのタスクを遂行することができると合理的に期待されるだろう。このような分離を達成するための１つの戦略は、ＰＢＭＣ－ＩｇからＣＤ４＋細胞以外のすべてを枯渇させ、ＣＤ４＋細胞を陰性画分に残し、次に単純な抽出プロセスによって陽性選択画分からＣＤ８＋細胞を回収することである。
ＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞の定義された比率によって調製されたＣＡＲ Ｔコンストラクトの臨床的重要性に基づき、そのような分離を効率的に達成することが望ましいと思われる。ここで説明した手順を用いると、２つのｍＡｂ特異性のみを利用する以下のスキームが、そのタスクを遂行することができると合理的に期待されるだろう。このような分離を達成するための１つの戦略は、ＰＢＭＣ－ＩｇからＣＤ４＋細胞以外のすべてを枯渇させ、ＣＤ４＋細胞を陰性画分に残し、次に単純な抽出プロセスによって陽性選択画分からＣＤ８＋細胞を回収することである。
【0089】
例えば、ＩｇＧを実質的に含まないＰＢＭＣを、Ｂ細胞に特異的なＦｃγＲ相互作用ビオチン化ｍＡｂ、例えばアイソタイプＩｇＧ１，２ｏｒ３，およびＣＤ８＋細胞に特異的な非ＦｃＲ結合抗体を持つＩｇＧサブクラスのデスチオビオンチニル化ｍＡｂとインキュベートすることができる。したがって、すべてのＦｃγＲを持つ細胞は抗Ｂ細胞ｍＡｂでビオチン標識され、ＣＤ８＋細胞はデスチオビオチン標識ｍＡｂで標識されるだろう。結合と分離の後、共通の捕捉剤、例えばＳＡ－ＦＦを加えると、ＣＤ８＋細胞とすべてのＦｃγＲＣは正に分離され、残りの負に選択されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は容易に回収されるだろう。ビオチンおよびデスチオビオチンのＳＡとの結合定数の非常に大きな差に基づき（Ｈｉｒｓｃｈ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０８：３４３－３５７，２０２２）、ビオチンとのインキュベーションによってＳＡ－ＦＦからＣＤ８＋細胞を放出でき、ＳＡ結合部位からデスチオビオチンｍＡｂを置換する。ビオチン置換によるデスチオビオチン解離手段に加えて、ビオチン－抗ビオチン反応を解離させる方法は当技術分野でよく知られる（Ｌｕｎｄ，Ｇ．ａｎｄ Ｗｅｇｍａｎｎ，Ｔ．，米国特許第５，５１８，８８２号明細書；Ｂｒｉｅｄｅｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｄｏｓｅ，Ｃ．米国特許第２０１４０１１３３１５Ａ１）。したがって、上記のスキームにおいて、ｍＡｂ標識されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を回収する方法は、いくつかある。
【0090】
ＳＡ－ＦＦまたは他の適切な解離性結合対からのＣＤ８＋細胞の回収のために、磁気標識された細胞が山に蓄積しないような十分な面積および磁気勾配特性の収集表面上にそれらを広げることによって、磁気分離装置を採用することが有利であるだろう。それが達成された場合、特許公開ＷＯ２０１６／１８３０３２Ａ１に開示された磁気分離システムを採用する場合のように、ＣＤ８＋細胞は、収集面上に磁気的に保持される間、穏やかに抽出され得る。あるいは、磁気的に捕捉された細胞は、ビオチン（ＳＡ－ビオチンシステムの場合）と共に懸濁され得、放出が起こるであろう。その後、混合物を再度分離し、ＣＤ８＋細胞を浮遊させたまま、容易に回収することができる。
【実施例6】
【0091】
２種類のｍＡｂを用いた間接標識によるアフェレシス製品からの未分化Ｂ細胞の単離
これまでの実施例での結果をもとに、これらの方法を適応し、ナイーブＢ細胞の作製に成功した。この方法では、白血球に発現するＦｃγＲが異なる結合親和性を持つことを利用する。例えば、単球、マクロファージ、ＤＣ、顆粒球は高親和性のＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ）を発現し、Ｂ細胞やＮＫ細胞は低親和性のＦｃγＲ（Ｂ細胞はＦｃγＲＩＩＢ、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＣとＦｃγＲＩＩＩＡ）を発現している。高親和性ＦｃγＲは価数の影響を受けないが、低親和性ＦｃγＲは多量体の抗体を好んで結合する。Ｂ細胞は低親和性のＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＢ）を発現しているので、標識工程で使用するｍＡｂの濃度を下げ、ＦＦ上のＳＡのコーティングを調整することにより、高親和性の反応のみを促進し、標的化に用いるｍＡｂ上のＦｃ結合を介して反応混合物中の単球、顆粒球、ＤＣなどの高親和性のＦｃγＲを持つ細胞を優先的に標識することができるはずである。ＣＤ３＋細胞およびＮＫ細胞も除去のために標的化する必要があるので、抗ＣＤ３および抗ＣＤ１６を含むがこれに限定されない、この目的に適した２つのｍＡｂｓを採用することができる。ＰＢＭＣ－Ｉｇは、ビオチン化抗ＣＤ３（約０．１５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ１６（約０．０５μｇ／ｍＬ）と共に１５～２０分間インキュベートして適切な標識レベルを達成することが可能である。その後、すべての望ましくない細胞タイプは、一般的な捕捉磁気ナノ粒子または当技術分野でよく知られた他の適切な薬剤で除去することができる。これらの方法によって、高純度の未接触のＢ細胞の回収が達成される。
これまでの実施例での結果をもとに、これらの方法を適応し、ナイーブＢ細胞の作製に成功した。この方法では、白血球に発現するＦｃγＲが異なる結合親和性を持つことを利用する。例えば、単球、マクロファージ、ＤＣ、顆粒球は高親和性のＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ）を発現し、Ｂ細胞やＮＫ細胞は低親和性のＦｃγＲ（Ｂ細胞はＦｃγＲＩＩＢ、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＣとＦｃγＲＩＩＩＡ）を発現している。高親和性ＦｃγＲは価数の影響を受けないが、低親和性ＦｃγＲは多量体の抗体を好んで結合する。Ｂ細胞は低親和性のＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＢ）を発現しているので、標識工程で使用するｍＡｂの濃度を下げ、ＦＦ上のＳＡのコーティングを調整することにより、高親和性の反応のみを促進し、標的化に用いるｍＡｂ上のＦｃ結合を介して反応混合物中の単球、顆粒球、ＤＣなどの高親和性のＦｃγＲを持つ細胞を優先的に標識することができるはずである。ＣＤ３＋細胞およびＮＫ細胞も除去のために標的化する必要があるので、抗ＣＤ３および抗ＣＤ１６を含むがこれに限定されない、この目的に適した２つのｍＡｂｓを採用することができる。ＰＢＭＣ－Ｉｇは、ビオチン化抗ＣＤ３（約０．１５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ１６（約０．０５μｇ／ｍＬ）と共に１５～２０分間インキュベートして適切な標識レベルを達成することが可能である。その後、すべての望ましくない細胞タイプは、一般的な捕捉磁気ナノ粒子または当技術分野でよく知られた他の適切な薬剤で除去することができる。これらの方法によって、高純度の未接触のＢ細胞の回収が達成される。
【実施例7】
【0092】
アフェレシス製品から未接触のＮＫ細胞を分離すること、もしくは２種類の抗体を用いたＰＢＭＣ
ＰＢＭＣの５～１０％はＮＫ細胞であり、現在知られている最も効果的な抗がん剤の１つである革新的なＣＡＲ－Ｔ免疫療法の主要な構成要素となっている（Ｓｈｉｍａｓａｋｉ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ２０２０，１９：２００－２１８）。癌抗原を用いた遺伝子工学のためのナイーブＮＫ細胞の単離は、ＣＡＲ－Ｔの重要な初期段階を構成する。実施例６に詳述した同じ概念に基づいて、標識反応中のｍＡｂ濃度およびＦＦ粒子上のＳＡ密度を制限することにより、競合するＩｇＧの実質的非存在下で、単離された未接触のＮＫ細胞が達成され得る。１つのアプローチでは、ビオチン化マウス抗ヒトＢ細胞抗体（抗ＣＤ１９ ｍＡｂなど）とビオチン化マウス抗ヒトＣＤ３抗体の組み合わせ、少なくとも１つの試薬がＩｇＧ１アイソタイプのものが採用される。抗体は、合計で約０．２μｇ／ｍＬの濃度（抗ＣＤ３ｍＡｂは０．１５μｇ／ｍＬ、抗Ｂ（ＣＤ１９）ｍＡｂは０．０５μｇ／ｍＬ）で添加されることになる。これらの抗体制限条件下では、高親和性ＦｃγＲの結合のみが起こる。上記の濃度でｍＡｂをインキュベートした後、ＳＡ－ＦＦを添加し、実施例２に記載したように分離を行う。このようにｍＡｂ濃度を下げると、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および高親和性ＦｃγＲＣは磁気分離され、ＮＫ細胞は陰性画分に残される。
ＰＢＭＣの５～１０％はＮＫ細胞であり、現在知られている最も効果的な抗がん剤の１つである革新的なＣＡＲ－Ｔ免疫療法の主要な構成要素となっている（Ｓｈｉｍａｓａｋｉ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ２０２０，１９：２００－２１８）。癌抗原を用いた遺伝子工学のためのナイーブＮＫ細胞の単離は、ＣＡＲ－Ｔの重要な初期段階を構成する。実施例６に詳述した同じ概念に基づいて、標識反応中のｍＡｂ濃度およびＦＦ粒子上のＳＡ密度を制限することにより、競合するＩｇＧの実質的非存在下で、単離された未接触のＮＫ細胞が達成され得る。１つのアプローチでは、ビオチン化マウス抗ヒトＢ細胞抗体（抗ＣＤ１９ ｍＡｂなど）とビオチン化マウス抗ヒトＣＤ３抗体の組み合わせ、少なくとも１つの試薬がＩｇＧ１アイソタイプのものが採用される。抗体は、合計で約０．２μｇ／ｍＬの濃度（抗ＣＤ３ｍＡｂは０．１５μｇ／ｍＬ、抗Ｂ（ＣＤ１９）ｍＡｂは０．０５μｇ／ｍＬ）で添加されることになる。これらの抗体制限条件下では、高親和性ＦｃγＲの結合のみが起こる。上記の濃度でｍＡｂをインキュベートした後、ＳＡ－ＦＦを添加し、実施例２に記載したように分離を行う。このようにｍＡｂ濃度を下げると、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および高親和性ＦｃγＲＣは磁気分離され、ＮＫ細胞は陰性画分に残される。
【実施例8】
【0093】
ネガティブセレクションによる未接触のＣＤ３４＋造血幹細胞の分離
現在広く用いられているプロトコルでは、ＣＤ３４＋、抗ＣＤ３４ｍＡｂｓを用いたポジティブセレクションにより幹細胞が分離される。このような細胞を、移植や遺伝子工学的治療のために、手を加えていない、あるいはナイーブな細胞から処理できることが望ましいと思われる。現在行われている方法では、ネガティブセレクションは可能であるが、ＣＤ３４＋の細胞以外を除去するために７～９個のｍＡｂｓが必要である。経済的な観点からは、これは実行可能なアプローチではない。一方、正常および白血病患者の胎児および成人骨髄に関する研究から、ＦｃγＲは非転移性前駆細胞ＣＤ３４＋細胞では発現しないことが確認された（Ｏｌｗｅｕｓ Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＣＤ６４／Ｆｃ Ｇａｍｍａ ＲＩ ｉｓ ａ ｇｒａｎｕｌｏ－ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｎ ＣＤ３４＋ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．８５：２４０２－１３，１９９５；Ａｏｋｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３４＋ ａｎｄ ＣＤ３４－ ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＭＬＬ－ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．１２５：９６７－８０，２０１５）．
現在広く用いられているプロトコルでは、ＣＤ３４＋、抗ＣＤ３４ｍＡｂｓを用いたポジティブセレクションにより幹細胞が分離される。このような細胞を、移植や遺伝子工学的治療のために、手を加えていない、あるいはナイーブな細胞から処理できることが望ましいと思われる。現在行われている方法では、ネガティブセレクションは可能であるが、ＣＤ３４＋の細胞以外を除去するために７～９個のｍＡｂｓが必要である。経済的な観点からは、これは実行可能なアプローチではない。一方、正常および白血病患者の胎児および成人骨髄に関する研究から、ＦｃγＲは非転移性前駆細胞ＣＤ３４＋細胞では発現しないことが確認された（Ｏｌｗｅｕｓ Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＣＤ６４／Ｆｃ Ｇａｍｍａ ＲＩ ｉｓ ａ ｇｒａｎｕｌｏ－ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｎ ＣＤ３４＋ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．８５：２４０２－１３，１９９５；Ａｏｋｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３４＋ ａｎｄ ＣＤ３４－ ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＭＬＬ－ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．１２５：９６７－８０，２０１５）．
【0094】
したがって、ＰＢＭＣ中のＣＤ３４＋ナイーブ細胞以外のすべての細胞を除去するためにｍＡｂを適切に選択することから始めて、次の戦略を適用することができる。ビオチン化ｍＡｂ（ＩｇＧアイソタイプの抗ＣＤ３）をＰＢＭＣと約２０分間インキュベートし、それによってすべてのＴ細胞とＦｃγＲ発現細胞を標識することができる。非標識細胞のネガティブセレクションは、ＦＦのような固体支持体上のＳＡで行うことができる。このような磁気分離の上澄みは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および他のＦｃγＲＣ（血小板を含む）が溶液から磁気的に分離されるため、濃縮ＣＤ３４＋細胞集団となるであろう。特定の実施形態では、ＰＢＭＣのドナーは、造血幹細胞が骨髄から末梢血に移動するように誘導するためにＧ－ＣＳＦで処理される。
【0095】
この実施形態では、有核細胞の約９８～９９％が除去される必要があるので、システムに十分な量のビオチン化ｍＡｂを提供し、十分なインキュベーション時間によって、除去すべきすべての細胞を徹底的に標識することが重要だろう。細胞濃度が約１ｘ１０８／ｍＬの場合、高親和性ｍＡｂを細胞懸濁液１ｍＬ当たり２μｇの濃度で約２０分のインキュベーション時間で使用すれば十分であるはずである。この場合、約８万個のｍＡｂ／細胞が存在することになり、このような細胞の標識とその後の除去には十分すぎるほどである。
【0096】
このような大きな割合の細胞が除去されると、望ましいＣＤ３４＋細胞が巻き込まれる危険性がある。したがって、このタイプの分離は、総細胞濃度が約３ｘ１０７総細胞／ｍＬ未満、場合によっては５ｘ１０６総細胞と同様に低く行うことが望ましいと思われる。我々の経験では、１％のスクロースを添加すると、劇的に減少することがわかった。さらに、磁気分離を採用する場合、望ましくない細胞を広い面積で分離して除去し、巻き込みを最小限に抑えることが望ましいと思われる。それを達成するために、Ｌｉｂｅｒｔｉら、ＷＯ２０１６／１８３０３２Ａ１によって開示されるような分離システムを使用することが望ましいだろう。そのシステムは、細胞が山積みに集められるのを最小限に抑えるだけでなく、そこに「メニスカス・スクラビング」と呼ばれるプロセス、つまり巻き込まれた細胞を除去するための穏やかな手段も提供しているのである。
【0097】
以上、本発明の好ましい実施形態の一部を説明し、具体的に例示したが、本発明がかかる実施形態に限定されることは意図していない。本明細書で引用したすべての特許、特許出願、および出版物は、すべての目的のために、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。以下の特許請求の範囲に規定されるように、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な変更がそれらになされ得る。
【図1】
【図2】
【国際調査報告】