特表 2023-528342 誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別チップ、装置、及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-04

(54)【発明の名称】誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別チップ、装置、及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/42 20060101AFI20230627BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20230627BHJP

   C12M 1/34 20060101ALN20230627BHJP

【ＦＩ】

C12M1/42

C12Q1/04

C12M1/34 B

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022572561

(86)(22)【出願日】2021-05-26

(85)【翻訳文提出日】2023-01-05

(86)【国際出願番号】 CN2021096171

(87)【国際公開番号】W WO2021239010

(87)【国際公開日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】202010457651.9

(32)【優先日】2020-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517353747

【氏名又は名称】中国科学院青島生物能源与過程研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】▲馬▼波

(72)【発明者】

【氏名】▲ディア▼志▲鈿▼

(72)【発明者】

【氏名】王喜先

(72)【発明者】

【氏名】徐健

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA09

4B029BB02

4B029BB07

4B029BB11

4B029CC01

4B029DG08

4B029FA04

4B063QA18

4B063QQ06

4B063QQ07

4B063QQ08

4B063QS36

4B063QX01

4B063QX04

(57)【要約】

誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別チップ、装置及び方法を提供する。当該チップは、１つの注入口（４．１）、直通路及び２つの注出口を含むマイクロ流路（４）を含み、直通路の底部には、集束電極群（１）、選別電極群（２）及び分離電極群（３）の３組の電極アレイ対が集積され、当該集束電極群は、細胞の集束及び信号の検出に用いられ、当該選別電極群は、単一細胞の選別に用いられ、当該分離電極群は、単一細胞の分離に用いられる。高速、正確かつ完璧にターゲット細胞の選別を実現することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つの注入口、直通路及び２つの注出口を含むマイクロ流路を含み、
直通路の底部には、集束電極群、選別電極群及び分離電極群の３組の電極アレイ対が集積され、
前記集束電極群は、細胞の集束及び信号の検出に用いられ、
前記選別電極群は、単一細胞の選別に用いられ、
前記分離電極群は、単一細胞の分離に用いられる、
ことを特徴とする誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別マイクロ流体チップ。

【請求項2】

前記集束電極群及び分離電極群は、少なくとも一対の電極を含み、前記選別電極群は、少なくとも１つの電極であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項3】

前記集束電極群は、一対の電極アレイを少なくとも有し、各対の電極アレイにおける電極は互いに平行であり、単一の電極アレイ上の電極の一端は接続され、各対の電極アレイにおける電極は、間隔をおいて分布され、前記電極は、挟角を有することを特徴とする請求項２に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項4】

電極の挟角の角度は、ａ＋ｂであり、電極角度ａ、ｂの範囲は、０～９０度であることを特徴とする請求項３に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項5】

前記角度ａとｂは同じであることを特徴とする請求項４に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項6】

前記分離電極群と集束電極群は構造が同じであり、挟角方向が異なり、前記選別電極と中心線との挟角はａである請求項４に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項7】

前記集束電極群と分離電極群の電極対の中心線は、同一直線上にないことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項8】

前記電極群の材質は、ＩＴＯ、炭素、グラフェン、金属電極である請求項１に記載のマイクロ流体チップ。

【請求項9】

前記マイクロ流体チップのいずれかと、
周波数及び電圧が異なる正弦交流電圧を発生させるための関数発生器と、
プログラムの実行及び関連光学機器による信号の採取及び收集を制御し、関数発生器の出力電圧、周波数、デューティ比等のパラメータを制御し、リレーのスイッチングを制御するためのコンピュータと、
制御回路のスイッチングを制御するためのリレーと、
流体がマイクロ流路に入るよう駆動する駆動力源としての流体駆動装置と、
を含むことを特徴とする誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別装置。

【請求項10】

前記流体駆動装置は、注射ポンプ又は重力駆動装置を含むことを特徴とする請求項９に記載の誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別装置。

【請求項11】

請求項１から８のいずれか１項に記載のマイクロ流体チップ、請求項９から１０に記載の装置を利用して、
１）流体駆動装置を利用して細胞を含有する流体をマイクロ流体チップの注入口を介して直通路に入れる細胞を注入するステップと、
２）導線を介して集束電極群と関数発生器の出力端とを接続し、集束電極群に高周波電圧を周期的に印加して、流体中の細胞を電極挟角の信号モニタリング点の位置に集束させる細胞を集束するステップと、
３）光学信号採取点とモニタリング点との位置合わせをして光学信号を検出し、検出された信号をコンピュータプログラムで処理してターゲット細胞であるか否かを判断する信号を検出するステップと、
４）ターゲット細胞である場合、リレーをトリガして選別電極群に連通して高周波電圧を出力することにより、ターゲット細胞を選別電極に沿って中心線の位置からずらし、非ターゲット細胞であるとプログラムによって判定された場合、リレーをオンしないようにプログラムで制御することにより、非ターゲット細胞をもとの集束電極群の中心線の位置に沿ってずれずに移動を続けさせる細胞を選別するステップと、
５）分離電極群に高周波電圧を周期的に印加することにより、流体中の非ターゲット細胞とターゲット細胞とを異なる注出口に向かって流す細胞を分離するステップと、
を含むことを特徴とする誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別方法。

【請求項12】

前記細胞は、酵母細胞、大腸菌細胞又はＨｅｌａ細胞のうちの１つ又は複数であることを特徴とする請求項１１に記載の誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別方法。

【請求項13】

前記流体の流速は、０．０１～５０マイクロリットル／分であることを特徴とする請求項１１に記載の誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別方法。

【請求項14】

前記ステップ３）における光学信号の検出は、ラマン信号の検出又は蛍光信号の検出であることを特徴とする請求項１１に記載の誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオ技術及び機器科学の分野に属し、具体的には、誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別チップ、装置、及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、生物学では、主に集団細胞レベルで生物細胞が特徴づけられているが、異質な集団の平均測定は細胞培養に依存し、個々の細胞の違いを具現化することができない上、自然界の細胞の大多数は依然として培養することが難しい。単一細胞の機能識別と指向選別は、細胞の増殖に依存しないため、細胞培養のステップを直接スキップできるとともに、細胞の異質性を反映することもできる。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は、高スループットな単一細胞分析技術であり、この技術を応用することにより単一細胞の同定効率が大幅に向上している。しかし、大多数の細胞はそれ自体蛍光効果が弱いか、又は蛍光がないため、この方法では、一般に蛍光標識を付す必要がある。また、細胞コロニーにおける機能的構成要素を識別する際、重要な細胞表現型は、おおまかに認識されるか又は完全に未知（つまり、「未知」の細胞表現型）でしかないことが多く、他のバイオ標識もなく、これらの研究の目的は、まさにこれら未知ながら重要な表現型（及びそのバイオ標識）を見つけることであることが多い。したがって、「未知の細胞表現型を検出する」という壁によって現在ＦＡＣＳ等の細胞選別技術の単一細胞研究への応用が著しく制限されている。単一細胞ラマンスペクトル技術（ＳＣＲＳ）は、効率の高い、細胞内の化学物質情報を識別する技術であり、細胞内の化合物分子の構成及び構造に関する情報を提供することができ、ラマンスペクトルは、単一細胞全体の化学物質指紋スペクトルを取得する際にいかなる標識も必要としないため、生体細胞の細胞型、生理的特性及び表現型の変化を識別することができ、細胞ラマン信号の変化を利用して「未知の細胞表現型」を追跡し選別することができる。ＳＣＲＳに基づくラマン活性化細胞選別（ＲＡＣＳ）の実現は、上述の壁の解消に向けて新たなアイデアを提供するものである。

【0003】

従来技術には、光クランプ、レーザジェット結合等のラマン活性化細胞選別に関する一連の技術があり、これらはその静的バージョンに属する。これらのシステムは、簡単で実用的であるが、スループットが過度に低く、高スループット選別にラマンスペクトル技術を応用するのを妨げている。単一細胞選別のスループット向上を図るべく、高スループット選別を実現できるラマン活性化液滴選別システム及び選別方法も登場したが、この類の技術的解決案では油中水滴が用いられるため、流路が複雑で、取り扱いにくく、依然として実用におけるニーズを完全に満たすことができていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

以上の問題に鑑みて、本発明は、簡単なチップ構造を用いて、不均一な電界を印加することにより、単一細胞の選別を実現する誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別チップ、装置及び方法を提案するものである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

上述の目的を達成するため、本発明の一方面が提供する誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別マイクロ流体チップは、１つの注入口、直通路及び２つの注出口を含むマイクロ流路を含み、直通路の底部には、集束電極群、選別電極群及び分離電極群の３組の電極アレイ対が集積され、当該集束電極群は、細胞の集束及び信号の検出に用いられ、当該選別電極群は、単一細胞の選別に用いられ、当該分離電極群は、単一細胞の分離に用いられる。

【0006】

当該集束電極群及び分離電極群は、少なくとも一対の電極を含み、選別電極群は、一対の電極であっても、１つの電極であってもよい。

【0007】

当該集束電極群は、一対の電極アレイを少なくとも有し、各対の電極アレイにおける電極は、互いに平行であり、単一の電極アレイ上の電極の一端は接続され、各対の電極アレイにおける電極は、間隔をおいて分布され、当該電極は、挟角を有する。

【0008】

当該電極は、形状が「＞」に類似する２つの辺を有する。

【0009】

電極の挟角の角度は、ａ＋ｂであり、電極角度ａ、ｂの範囲は、０～９０度であり、好ましくは、１５～４５度である。

【0010】

ａは、電極の一辺と中心線との挟角であり、ｂは、電極の他辺と中心線との挟角である。

【0011】

別の好ましい例において、当該角度ａとｂは同じではない。

【0012】

別の好ましい例において、当該角度ａとｂは同じである。

【0013】

当該分離電極群と集束電極群は構造が同じであり、挟角方向が異なり、当該選別電極と中心線との挟角はａである。

【0014】

当該分離電極群の電極形状は、「＜」に類似する。

【0015】

電極対の幅Ｌは、マイクロ流路の幅に応じて柔軟に調整できる。

【0016】

電極幅Ｄ及び電極ピッチｄは、細胞／粒子の寸法に応じて調整可能であるが、電極幅Ｄ及び電極ピッチｄは、いずれも細胞／粒子の最大寸法より大きい。

【0017】

別の好ましい例において、当該集束電極群と分離電極群の電極対の中心線は、同一直線上にない。

【0018】

別の好ましい例において、２組の電極対の中心線の距離ｃは、電極幅Ｄ及び電極ピッチｄによって決まる。

【0019】

別の好ましい例において、電極対の幅Ｌは１ミリメートル、電極幅Ｄは２５ミクロン、電極間距離ｄは２５ミクロン、電極角度ａ、ｂのいずれも３０度、２組の電極対の中心線の距離ｃは３５ミクロンである。

【0020】

別の好ましい例において、当該電極群の材質は、ＩＴＯ、炭素、グラフェン、金属電極である。

【0021】

別の好ましい例において、当該電極の高さは１０ナノメートル～１０ミクロンであり、好ましくは、５０～１５０ナノメートルである。

【0022】

別の好ましい例において、当該チップ底部に電極対を集積するキャリアの材質は、珪酸塩ガラス、石英ガラス、フッ化カルシウムガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）又はポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）であり、好ましくは、石英ガラスである。

【0023】

別の好ましい例において、当該電極アレイ群には、電極に高周波交流電圧を印加するための関数発生器が外部に接続されている。

【0024】

別の好ましい例において、当該選別電極群の応答時間は５０ミリ秒である。

【0025】

高周波交流電圧を電極に周期的に印加することにより、流体中の微粒子が電極に沿って流れるようにする。これは、不均一な電界を印加することにより、分極しにくい溶液中の細胞／微粒子が分極しやすくなり、電極に垂直で電極を指向する誘電泳動力を受けるとともに、細胞がさらに、流れ方向に平行で流れ方向を指向する流体推進力を受け、両者の合力によって細胞が電極に沿って移動するものである。

【0026】

当該直流道の幅は、理論上上限を設けなくともよく、チャンネル幅は、電極アレイを増やすことによっても好ましい集束効果に達することができる。

【0027】

別の好ましい例において、当該直流道の幅は１～２ミリメートルである。

【0028】

本発明の別の方面が提供する誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別装置は、
マイクロ流体チップと、
周波数及び電圧が異なる正弦交流電圧を発生させるための関数発生器と
プログラムの実行及び関連光学機器による信号の採取及び收集を制御し、関数発生器の出力電圧、周波数、デューティ比等のパラメータを制御し、リレーのスイッチングを制御するためのコンピュータと、
制御回路のスイッチングを制御するためのリレーと、
流体がマイクロ流路に入るよう駆動する駆動力源としての流体駆動装置とを含む。

【0029】

別の好ましい例において、当該流体駆動装置は、注射ポンプ又は重力駆動装置を含む。

【0030】

本発明のさらに別の方面が提供する誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別方法は、具体的に、
１）流体駆動装置を利用して細胞を含有する流体をマイクロ流体チップの注入口を介して直通路に入れる細胞を注入するステップと、
２）導線を介して集束電極群と関数発生器の出力端とを接続し、集束電極群に高周波電圧を周期的に印加して、流体中の細胞を電極挟角の信号モニタリング点の位置に集束させる細胞を集束するステップと、
３）光学信号採取点とモニタリング点５との位置合わせをして光学信号を検出し、検出された信号をコンピュータプログラムで処理してターゲット細胞であるか否かを判断する信号を検出するステップと、
４）ターゲット細胞である場合、リレーをトリガして選別電極群に連通して高周波電圧を出力することにより、ターゲット細胞を選別電極に沿って中心線の位置からずらし、非ターゲット細胞であるとプログラムによって判定された場合、リレーをオンしないようにプログラムで制御することにより、非ターゲット細胞をもとの集束電極群の中心線の位置に沿ってずれずに移動を続けさせる細胞を選別するステップと、
５）分離電極群に高周波電圧を周期的に印加することにより、流体中の非ターゲット細胞とターゲット細胞とを異なる注出口に向かって流す細胞を分離するステップとを含む。

【0031】

別の好ましい例において、当該細胞は、酵母細胞、大腸菌細胞又はＨｅｌａ細胞等の生物細胞の１つ又は複数である。

【0032】

別の好ましい例において、当該流体の流速は０．０１～５０マイクロリットル／分であり、流速の大きさは直通路の幅及び高さに関係し、好ましくは、注入流速は１０～４０マイクロリットル／分である。

【0033】

酵母を例に挙げると、酵母を純水で３回洗浄し純水を注入緩衝液とし、通電電圧１６ボルト、周波数１０メガヘルツの正弦交流電圧を最適パラメータとする。

【0034】

別の好ましい例において、印加する高周波電圧の持続時間は、流動場における流体流速等のパラメータに基づいて調整し、負荷時間は、ターゲット細胞から２組の電極の中心線の距離ｃ以上の距離ずれることを満たすものである必要がある。

【0035】

当該ステップ３）における光学信号の検出は、ラマン信号の検出又は蛍光信号の検出である。

【0036】

当該ステップ３）における光学信号の検出とステップ４）における選別との間に遅延時間が存在し、当該遅延時間は、間隔時間＝液流長さ／液流流速によって計算し決定される。なお、液流長さとは、信号検出点から選別操作点までに検出された液体が流れた実際の距離をいう。

【0037】

選別電極群及び分離電極群をトリガしない場合、当該システム方法は、フローサイトメトリー検出として用いることができるが、検出点を流れる細胞ごとに信号検出が行われる。

【発明の効果】

【0038】

本発明には、以下に示す有益な効果がある。
１）チップマイクロ流路は、構造が簡単で、流路が１本の直通路であり、実際の取り扱いが容易である。
２）選別電極の応答時間はミリ秒オーダーであり、高スループットの選別効率が得られる。
３）集束電極群を集積し、細胞の捕獲効率及び検出効率を保証できるとともに、細胞の注入流速を大幅に向上させてマイクロチューブに細胞を注入する際に沈降するのを効果的に防止し、注入効率を向上させることができ、システムが安定的に稼働する時間を効果的に延ばすことができる。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別チップの模式図である。符号の説明：１ 集束電極群、２ 選別電極群、３ 分離電極群、４ マイクロ流路、４．１ 注入口、４．２ 収集口、４．３ 廃液口、５ 信号検出点。

【図2】電極の各パラメータの模式図である。ａ、ｂは、いずれも電極角度を表し、ｄは、電極と電極との間の距離を表し、Ｄは、電極幅を表し、ｃは、２組の電極対の中心線の距離を表し、Ｌは、電極対の幅を表す。

【図3】別の電極群の構造模式図である。

【図4】誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別装置の模式図である。符号の説明：１ マイクロ流体チップ、２ 関数発生器、３ コンピュータ、４ リレー、５ 注射ポンプ。

【図5】誘電泳動による決定論的横変位に基づく細胞選別の流れを示した模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0040】

発明の詳細な説明
以下、図面及び実施例を参照して本発明についてさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。

【0041】

マイクロ流体チップの構造を図１に示す。当該マイクロ流体チップは、マイクロ流路４を含み、当該マイクロ流路は、１つの注入口４．１、直通路、収集口４．２、及び廃液口４．３を含む。マイクロ流路４の底部には、集束電極群１、選別電極群２及び分離電極群３の３組の電極アレイ対が集積されている。当該集束電極群は、細胞の集束及び信号の検出に用いられ、当該選別電極群は、単一細胞の選別に用いられ、当該分離電極群は、単一細胞の分離に用いられる。

【0042】

図２は電極の各パラメータの模式図である。ａ、ｂは、いずれも電極角度を表し、ｄは、電極と電極との間の距離を表し、Ｄは、電極幅を表し、ｃは、２組の電極対の中心線の距離を表し、Ｌは、電極対の幅を表す。

【0043】

図３は、別の電極群の構造模式図である。なお、選別電極群には、電極が１つしかない。

【実施例】

【0044】

実施例１
油脂生産量の多い酵母細胞のラマンフローサイトメトリーによる選別

【0045】

実験の準備：
培養した酵母細胞１ミリリットルを遠沈管に取り、５０００回転／分で５分間遠心分離し、上澄みを捨て、純水１ミリリットルを加えて再懸濁させた後、再度遠心分離させ、５０００回転／分で５分間遠心分離した。３回洗浄した後、純水１ミリリットルを加えて再懸濁させた。菌の濃度に応じてこれを１０００～１００００倍に希釈し、一定濃度の界面活性剤（例えば、終濃度０．５％のＰＦ１２７）を加え、細胞が電極に吸着するのを防止し、均一に混ぜた後、注射器に注入した。

【0046】

ラマン測定器をオンにし、レーザ光が信号のモニタリング点５と一致するようにしてレーザ光をオンにした。

【0047】

用いたマイクロ流体チップの構造は、図３に示すとおりである。マイクロ流体チップ内の電極のパラメータは、電極対の幅Ｌが１ミリメートル、電極幅Ｄが２５ミクロン、電極間距離ｄが２５ミクロン、電極角度ａ、ｂのいずれも３０度、２組の電極対の中心線の距離ｃが３５ミクロンであった。

【0048】

マイクロ流体チップ１、関数発生器２、コンピュータ３、リレー４、注射ポンプ５を図４に示すように接続し、コンピュータ内の編成されたプログラムを実行して、関数発生器の出力チャンネル２に出力チャンネル１を制御させ、チャンネル２に、電圧２０ボルト、周波数５ヘルツの方形波を出力させ、出力チャンネル１に、電圧１６ボルト、周波数１０メガヘルツの正弦波を出力させた。同時に、ラマン信号の採取と分析をプログラムで制御し、ターゲット細胞が検出されると、リレー４のオンをプログラムで制御した。

【0049】

実験中：
注射ポンプ５を用いて上述の処理をした菌液をマイクロ流路に注入し、液体中の酵母細胞を集束電極群の集束作用下で電極対の先端まで徐々に移動させた。マイクロ流路の流速は、約４０マイクロリットル／分、電極の通電パラメータは、電圧１６ボルト、周波数１０メガヘルツ、集束トラップ効率は９５％超に達した。

【0050】

酵母細胞が信号モニタリング点まで移動すると、ラマンスペクトルを採取され、採取されたスペクトルをプログラムによって簡単に分析した。ターゲット細胞である場合、ラマンスペクトルは油脂の特徴的なピークを反映することから、プログラムによってターゲット細胞であると判断され、プログラムによってリレーがアクティブに制御されて、選別電極群がオンになり、遅延及び負荷の持続時間を予め設定することにより、ターゲット細胞を下に移動させた。非ターゲット細胞である場合、ラマンスペクトルに油脂の特徴的なピークは示されないことから、リレーはアクティブにならないため、選別電極群に電圧負荷はなく、細胞は中心線に沿って移動を続けた。

【0051】

分離電極群の役割は、分離電極群の中心線両端の細胞を中心線からさらにずらして、ターゲット細胞をチャンネル下方に、非ターゲット細胞をチャンネル上方に位置させることである。

【0052】

最後に、油脂生産量の多い酵母細胞が収集口で收集され、油脂の生産量が低いか又は生産しない酵母細胞が廃液口にあった。

【0053】

実験終了：
マイクロ流体チップチャンネルを無水エタノールで２回洗い流した後、オーブンに入れて乾燥させ、繰り返し利用した。

【0054】

実施例２
油脂生産量の多い酵母細胞のラマンフローサイトメトリーによる検出

【0055】

実験の準備：
培養した酵母細胞１ミリリットルを遠沈管に取り、５０００回転／分で５分間遠心分離し、上澄みを捨て、純水１ミリリットルを加えて再懸濁させた後、再度遠心分離させ、５０００回転／分で５分間遠心分離した。３回洗浄した後、純水１ミリリットルを加えて再懸濁させた。菌の濃度に応じてこれを１０００～１００００倍に希釈し、一定濃度の界面活性剤（例えば、終濃度０．５％のＰＦ１２７）を加え、細胞が電極に吸着するのを防止し、均一に混ぜた後、注射器に注入した。

【0056】

ラマン測定器をオンにし、レーザ光が信号のモニタリング点５と一致するようにしてレーザ光をオンにした。

【0057】

用いたマイクロ流体チップの構造は、図３に示すとおりである。マイクロ流体チップ内の電極のパラメータは、電極対の幅Ｌが１ミリメートル、電極幅Ｄが２５ミクロン、電極間距離ｄが２５ミクロン、電極角度ａ、ｂのいずれも３０度、２組の電極対の中心線の距離ｃが３５ミクロンであった。

【0058】

マイクロ流体チップ１、関数発生器２、コンピュータ３、リレー４、注射ポンプ５を図４に示すように接続し、コンピュータ内の編成されたプログラムを実行して、関数発生器の出力チャンネル２に出力チャンネル１を制御させ、チャンネル２に、電圧２０ボルト、周波数５ヘルツの方形波を出力させ、出力チャンネル１に、電圧１６ボルト、周波数１０メガヘルツの正弦波を出力させた。同時に、ラマン信号の採取と分析をプログラムで制御した。

【0059】

注射ポンプ５を用いて上述の処理をした菌液をマイクロ流路に注入し、液体中の酵母細胞を集束電極群の集束作用下で電極対の先端まで徐々に移動させた。マイクロ流路の流速は、約４０マイクロリットル／分、電極の通電パラメータは、電圧１６ボルト、周波数１０メガヘルツ、集束トラップ効率は９５％超に達した。

【0060】

酵母細胞が信号モニタリング点まで移動すると、ラマンスペクトルを採取され、採取されたスペクトルをプログラムによって簡単に分析した。

【0061】

最後に、検出を終えた酵母細胞を収集口で收集した。

【0062】

実験終了：
マイクロ流体チップチャンネルを無水エタノールで２回洗い流した後、オーブンに入れて乾燥させ、繰り返し利用した。
採取されたラマンスペクトルを後で分析することによって、油脂生産量の多い酵母細胞が占める割合等の関連情報を得ることができた。

【0063】

実施例３
蛍光細胞のフローサイトメトリーによる選別

【0064】

実験の準備：
培養した、一部発現可能な蛍光タンパクを含有する大腸菌１ミリリットルを遠沈管に取り、５０００回転／分で５分間遠心分離し、上澄みを捨て、純水１ミリリットルを加えて再懸濁させた後、再度遠心分離させ、５０００回転／分で５分間遠心分離した。３回洗浄した後、純水１ミリリットルを加えて再懸濁させた。菌の濃度に応じてこれを１０００～１００００倍に希釈し、一定濃度の界面活性剤（例えば、終濃度０．５％のＰＦ１２７）を加え、細胞が電極に吸着するのを防止し、均一に混ぜた後、注射器に注入した。

【0065】

蛍光画像生成器をオンにし、レーザ光が信号のモニタリング点５と一致するようにしてレーザ光をオンにした。

【0066】

用いたマイクロ流体チップの構造は、図３に示すとおりである。電極対の幅Ｌが１ミリメートル、電極幅Ｄが２５ミクロン、電極間距離ｄが２５ミクロン、電極角度ａ、ｂのいずれも１５度、２組の電極対の中心線の距離ｃが５０ミクロンであった。

【0067】

マイクロ流体チップ１、関数発生器２、コンピュータ３、リレー４、注射ポンプ５を図４に示すように接続し、コンピュータ内の編成されたプログラムを実行して、関数発生器の出力チャンネル２に出力チャンネル１を制御させ、チャンネル２に、電圧２０ボルト、周波数０．２ヘルツの方形波を出力させ、出力チャンネル１に、電圧１６ボルト、周波数１メガヘルツの正弦波を出力させた。同時に、蛍光信号の採取と分析をプログラムで制御し、ターゲット細胞が検出されると、リレー４のオンをプログラムで制御した。

【0068】

実験中：
注射ポンプ５を用いて上述の処理をした菌液をマイクロ流路に注入し、液体中の大腸菌細胞を集束電極群の集束作用下で電極対の先端まで徐々に移動させた。マイクロ流路の流速は、約１０マイクロリットル／分、電極の通電パラメータは、電圧１６ボルト、周波数１メガヘルツ、集束トラップ効率は９０％超に達した。

【0069】

大腸菌細胞が信号モニタリング点まで移動すると、蛍光タンパクを含有する大腸菌がレーザ光に励起されて蛍光信号を出し、この蛍光信号がコンピュータに採取され、プログラムによってリレーがアクティブに制御されて、選別電極群がオンになり、遅延及び負荷の持続時間を予め設定することにより、ターゲット細胞を下に移動させた。蛍光タンパクを含有しない大腸菌はモニタリング点を通過するときに蛍光信号を励起しないことから、プログラムは、リレーをアクティブにしないように制御され、選別電極群に電圧負荷はなく、細胞は中心線に沿って移動を続けた。

【0070】

分離電極群の役割は、分離電極群の中心線両端の細胞を中心線からさらにずらして、ターゲット細胞をチャンネル下方に、非ターゲット細胞をチャンネル上方に位置させることである。

【0071】

最後に、蛍光を帯びた大腸菌が収集口で收集され、非蛍光の大腸菌細胞が廃液口にあった。

【0072】

実験終了：
マイクロ流体チップチャンネルを無水エタノールで２回洗い流した後、オーブンに入れて乾燥させ、繰り返し利用した。

【0073】

本発明の上述の内容を踏まえ、当業者は、本発明に様々な変更又は修正を行うことができ、これらの均等物も本願に添付の特許請求の範囲により限定される範囲にあることが理解される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】