特表 2023-528375 抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-04

(54)【発明の名称】抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230627BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230627BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230627BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230627BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230627BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12P21/02 C

A61P35/00

A61K39/395 N

A61K45/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022573152

(86)(22)【出願日】2021-05-28

(85)【翻訳文提出日】2022-12-08

(86)【国際出願番号】 US2021034852

(87)【国際公開番号】W WO2021243204

(87)【国際公開日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】63/032,508

(32)【優先日】2020-05-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521269861

【氏名又は名称】２３アンドミー・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】２３ａｎｄＭＥ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001656

【氏名又は名称】弁理士法人谷川国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ユウ

(72)【発明者】

【氏名】フェノー，ジリアン，ベス

(72)【発明者】

【氏名】フー－ケリー，ジャーメイン

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ヤオ－ミン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ウエイ－ジェン

(72)【発明者】

【氏名】カーラー，エリック，エドワード

(72)【発明者】

【氏名】レイ，セシリア

(72)【発明者】

【氏名】ピッツ，スティーブン，ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】シャーフ，ルイーゼ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC412

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ヒトＣＤ２００Ｒ１受容体タンパク質（ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１）に特異的に結合し、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１によって媒介される免疫調節効果を減少、阻害、及び／又は完全にブロックすることができる、抗体及び抗原結合断片などの結合タンパク質を提供する。本開示はまた、抗体（及びその組成物）を使用して、ＣＤ２００Ｒ１へのＣＤ２００の結合によって媒介される免疫調節機能又は活性の減少、阻害及び／又はブロックに応答する疾患及び状態を治療する方法も提供する。

【選択図】図８Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｌ１）、第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｌ２）、及び第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｌ３）、並びに／又は（ｉｉ）第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｈ１）、第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｈ２）、及び第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｈ３）を含む抗ＣＤ２００Ｒ１抗体であって、
（ａ）ＨＶＲ－Ｌ１が、ＲＡＳＥＳＶＤＹＳＧＮＳＦＭＨ（配列番号１１）、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１９）、ＲＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡ（配列番号２７）、ＲＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡ（配列番号３５）、ＱＡＳＨＴＩＮＬＮ（配列番号４３）、ＱＡＳＨＴＩＮＬＮ（配列番号５１）、ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨ（配列番号５９）、及びＲＡＳＥＳＶＤＹＳＧＮＳＦＭＨ（配列番号７７）から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ－Ｌ２が、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号１２）、ＬＴＳＫＬＡＳ（配列番号２０）、ＳＧＳＴＬＱＳ（配列番号２８）、ＳＧＳＴＬＱＳ（配列番号３６）、ＧＴＳＮＬＥＤ（配列番号４４）、ＧＴＳＮＬＥＤ（配列番号５２）、ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号６０）、及びＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号７８）から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ－Ｌ３が、ＨＱＳＮＥＤＰＰＴ（配列番号１３）、ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号２１）、ＱＱＹＮＥＹＰＷＴ（配列番号２９）、ＱＱＹＮＥＹＰＷＴ（配列番号３７）、ＬＱＨＴＹＬＰＷＴ（配列番号４５）、ＬＱＨＴＹＬＰＷＴ（配列番号５３）、ＱＨＮＲＥＬＬＴ（配列番号６１）、及びＨＱＳＮＷＤＰＰＴ（配列番号７９）から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ－Ｈ１が、ＴＮＹＡＶＳ（配列番号１５）、ＫＤＤＹＭＨ（配列番号２３）、ＫＤＤＹＭＨ（配列番号３１）、ＫＤＤＹＩＨ（配列番号３９）、ＫＤＤＹＩＨ（配列番号４７）、ＴＳＹＷＭＨ（配列番号５５）、ＴＳＹＶＭＦ（配列番号６３）、ＴＮＹＲＶＳ（配列番号８１）、及びＴＮＹＷＶＳ（配列番号８５）から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｅ）ＨＶＲ－Ｈ２が、ＶＭＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳ（配列番号１６）、ＲＩＤＰＡＮＤＮＴＫＹＡＰ（配列番号２４）、ＲＩＤＰＥＮＧＮＴＫＹＧＰ（配列番号３２）、ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＡＰ（配列番号４０）、ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＡＰ（配列番号４８）、ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＮＹＮＱ（配列番号５６）、ＹＩＮＰＹＮＤＤＴＫＹＮＥ（配列番号６４）、ＶＭＹＡＧＧＧＴＮＹＮＳ（配列番号８２）、及びＴＭＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳ（配列番号８６）から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ－Ｈ３が、ＡＲＥＲＰＬＴＧＶＭＤＹ（配列番号１７）、ＴＲＶＥＧＲＴＧＴＹＦＤＹ（配列番号２５）、ＴＲＱＬＧＬＲＲＶＷＹＡＬＤＹ（配列番号３３）、ＡＲＱＬＧＬＲＲＴＷＹＳＬＤＹ（配列番号４１）、ＴＲＱＬＧＬＲＲＴＷＹＡＭＤＹ（配列番号４９）、ＴＴＡＶＧＳＹ（配列番号５７）、ＡＲＥＤＹＹＧＳＲＦＶＹＷ（配列番号６５）、ＡＲＥＲＰＬＴＧＶＭＤＮ（配列番号８３）、及びＡＲＥＲＰＬＴＧＰＭＤＹ（配列番号８７）から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体。

【請求項2】

（ａ）配列番号１１のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号１５のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１６のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１７のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｂ）配列番号１９のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２０のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号２１のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号２３のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２４のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号２５のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｃ）配列番号２７のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２８のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号２９のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号３１のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号３２のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号３３のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｄ）配列番号３５のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号３６のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号３７のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号３９のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４０のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号４１のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｅ）配列番号４３のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号４４のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号４５のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号４７のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４８のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号４９のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｆ）配列番号５１のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５２のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号５３のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号５５のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５６のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号５７のＨＶＲ－Ｈ３、｝
（ｇ）配列番号５９のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号６０のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号６１のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号６３のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号６４のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号６５のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｈ）配列番号７７のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号７８のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号７９のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号８１のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号８２のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号８３のＨＶＲ－Ｈ３、｝
（ｉ）配列番号１１のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号８５のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号８６のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号８７のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｊ）配列番号１１のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号８１のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号８２のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号８３のＨＶＲ－Ｈ３、あるいは、
（ｋ）配列番号７７のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号７８のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号７９のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号８５のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号８６のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号８７のＨＶＲ－Ｈ３、を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記抗体が、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０、５８、６６、若しくは７６から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、６２、６７、８０、若しくは８４から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体。

【請求項4】

（ａ）前記抗体が、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号１４と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｂ）前記抗体が、配列番号１８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号２２と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｃ）前記抗体が、配列番号２６と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号３０と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｄ）前記抗体が、配列番号３４と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号３８と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｅ）前記抗体が、配列番号４２と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号４６と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｆ）前記抗体が、配列番号５０と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号５４と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｇ）前記抗体が、配列番号５８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号６２と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｈ）前記抗体が、配列番号６６と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号６７と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｉ）前記抗体が、配列番号７６と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８０と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｊ）前記抗体が、配列番号６６と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８４と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｋ）前記抗体が、配列番号６６と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８０と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、あるいは
（ｌ）前記抗体が、配列番号７６と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８４と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項5】

前記抗体が、配列番号６８、７１、及び７４から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、並びに／又は配列番号６９、７０、７２、７３、７５、８８、及び８９から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項6】

（ａ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号６９と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号７０と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８８と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｄ）配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号７２と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８９と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｆ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号７３と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｇ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８８と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｈ）配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８９と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、あるいは
（ｉ）配列番号７４と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号７５と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項7】

前記抗体が、以下の特性：
（ａ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１に結合し、任意選択的に、前記結合親和性が、配列番号１、２、３、及び／又は４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｂ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１に結合し、任意選択的に、前記結合親和性が、配列番号１及び／又は２のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４ポリペプチド、及び配列番号３及び／又は４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１ポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｃ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔ及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆに結合し、任意選択的に、前記結合親和性が、配列番号１のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔポリペプチド、及び配列番号２のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｄ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔ、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆ、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ａｌｔ、及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ｒｅｆに結合し、任意選択的に、前記結合親和性が、配列番号１のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔポリペプチド、配列番号２のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆポリペプチド、配列番号３のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ａｌｔポリペプチド、及び配列番号４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ｒｅｆポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｅ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に結合し、任意選択的に、前記結合親和性が、配列番号５のｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｆ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に結合し、任意選択的に、前記結合親和性が、配列番号１、２、３及び／又は４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチド、並びに配列番号５のｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｇ）ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔ（配列番号１）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆ（配列番号２）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ａｌｔ（配列番号３）、及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ｒｅｆ（配列番号４）へのｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃの結合を、ＥＬＩＳＡによって測定されたとき、１０ｎＭ以下、７ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下又は１ｎＭ以下のＩＣ_５０でブロックする、
（ｈ）２．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＩＣ_５０で、細胞上に発現されたｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１へのｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃの結合をブロックし、任意選択的に、前記細胞が、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１を安定して発現するＵ９３７細胞である、
（ｉ）２．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０でヒトＴ細胞に結合し、任意選択的に、前記ヒトＴ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である、
（ｊ）１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下の抗体濃度で、ヒト腫瘍細胞からのＩＦＮγ産生を少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、又はそれ以上増加させ、任意選択的に、前記腫瘍細胞の型が、結腸直腸、子宮内膜、肺、黒色腫、卵巣、膵臓、又は前立腺から選択される、
（ｋ）ｈｕ－ＣＤ２００－ＦｃでコーティングされたヒトＴ細胞からのＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を、ＩｇＧ対照と比較して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、又はそれ以上増加させる、
（ｌ）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞又はヒトＣｄ８＋Ｔ細胞の活性化を、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍又はそれ以上増加させる、
（ｍ）ＣＤ２００Ｒ１シグナル伝達を刺激しない、
（ｎ）可溶性ｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃで処理されたＵ９３７単球細胞株におけるｐＤｏｋ２活性の誘導をブロックする、かつ／あるいは
（ｏ）ｈｕ－ＣＤ２００結合ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１発現細胞株によって誘導されるＮＦｋβ転写をブロックし、任意選択的に、前記細胞株が、ＣＤ２００Ｒ１発現Ｋ５６２レポーター細胞及びＣＤ２００発現２９３Ｔ細胞である、のうちの１つ以上を特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープに特異的に結合する抗ＣＤ２００Ｒ１抗体であって、任意選択的に、１０Ｆ６、ｈ１０Ｆ６、２２．１、又はｈ２２．１から選択される抗体と同じエピトープに結合する、抗体。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド又はベクター。

【請求項10】

請求項９に記載のオリゴヌクレオチド又はベクターを含む、単離された宿主細胞であって、任意選択的に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、サル腎細胞（ＣＯＳ－７）、ヒト胚性腎臓系統（２９３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞、ＴＲ１細胞、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ５（ＭＲＣ５）細胞、及びＦＳ４細胞から選択される、宿主細胞。

【請求項11】

抗体を産生する方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を培養して、抗体を産生させることを含む、方法。

【請求項12】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２００抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物であって、任意選択的に、前記組成物が、免疫チェックポイント分子に対する特異性を含む化学療法剤若しくは抗体を更に含むか、又は、任意選択的に、前記抗ＣＤ２００Ｒ１抗体が前記組成物の唯一の有効成分である、医薬組成物。

【請求項13】

対象のＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体を前記対象に投与するか、又は治療有効量の請求項１２に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項14】

前記治療有効量が、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記治療有効量が、少なくとも約０．３ｍｇ、少なくとも約１．０ｍｇ、少なくとも約３．０ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約３００ｍｇ、又は少なくとも約９００ｍｇである、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記治療有効量が、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体の前記治療有効量で、顕著なオフターゲット効果がない、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体の１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、顕著なオフターゲット効果がない、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体の２０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、顕著なオフターゲット効果がない、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記疾患ががんであり、任意選択的に、前記がんが、から選択される前記がんが、副腎がん、膀胱がん、肉腫、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）がん（固形ＭＳＩがんを含む）、ＴＭＢ（腫瘍変異負荷）高腫瘍、ミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、ＥＧＪ腺がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん（例えば、消化管カルチノイド（ＧＩカルチノイド））、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞がん、腎臓がん、肝臓がん、黒色腫、中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、非小細胞肺がん、卵巣がん、上皮性卵巣がん、子宮内膜がん、小児固形がん、膵臓がん、前立腺がん、脾臓がん、小細胞肺がん、精巣がん、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様がん又は甲状腺濾胞がん）、血液がん（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、白血病、リンパ腫、骨髄腫）、腎細胞がん腫、明細胞腎がん、神経内分泌腫瘍（例えば、悪性褐色細胞腫及び傍神経節腫）、及び子宮がんから選択される、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０３２，５０８号の優先権を主張するものであり、これはあらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、広義には、ＣＤ２００Ｒ１受容体に結合する抗体及び抗原結合断片などの結合タンパク質、並びにかかる結合タンパク質を使用する方法に関する。

【0003】

配列表への言及
配列表の公式写しは、ＡＳＣＩＩ方式のテキストファイルとして、特許明細書と同時に、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出され、ファイル名は「０９４０２－００７ＰＶ１＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日は２０２０年５月２９日、サイズは８５，８６９バイトである。ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で出願された配列表は、特許明細書の一部であり、配列表全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

細胞表面膜貫通糖タンパク質ＣＤ２００受容体１（本明細書では「ＣＤ２００Ｒ１」と称され、当技術分野ではＣＤ２００受容体１、ＣＤ２００Ｒ、ＨＣＲＴＲ２、ＯＸ２Ｒ、及びＭＯＸ２Ｒとしても知られている）は、骨髄細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の表面に発現するヒトタンパク質である。ＣＤ２００Ｒ１は、２つの免疫グロブリン様ドメインを含む細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ２００Ｒ及びその結合パートナーであるＣＤ２００は、どちらも高度に保存されたＩ型ペア膜糖タンパク質であり、Ｉｇタンパク質スーパーファミリーに属する２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（Ｖ及びＣ）で構成されている。ＣＤ２００Ｒは、主にＴ細胞及び骨髄系細胞のサブセットで発現する。しかしながら、ＣＤ２００は、ニューロン、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、リンパ系細胞など、様々なヒト細胞でも広範囲に発現している。ＣＤ２００Ｒ１は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）及びインターフェロンなどの炎症誘発性分子の発現を調節するよう作用する。ＣＤ２００ＲがそのリガンドであるＣＤ２００に結合すると、Ｔ細胞免疫応答及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞傷害活性の阻害、マクロファージによるインドールアミン－２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の分泌の促進、及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の拡大のトリガーを含む、免疫抑制活性をシグナル伝達することがわかっている（例えば、Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ，“ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．”ＩＳＲＮ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；２０１２を参照）。ＣＤ２００は、樹状細胞及びリンパ系エフェクター細胞に対する免疫チェックポイント機能を有し、炎症性免疫応答の活性化を調節し、自己寛容の維持に寄与すると理解されている（例えば、Ｒｙｇｉｅｌ ＴＰ，Ｍｅｙａａｒｄ Ｌ．“ＣＤ２００Ｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：ａ ｔｒｉｃｋｙ ｂａｌａｎｃｅ．”Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；２４（２）：２３３－８を参照）。ＣＤ２００は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などを含む、様々な種類の固形及び血液腫瘍細胞で過剰発現する（例えば、ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｌｏｃｋ ａ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｈａｔ ｐｌａｙｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００６；１０３（４）：１０４１－６を参照）。抗腫瘍細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答の低下の発見は、積極的な腫瘍の進行と相関しており、患者の生存率の低下は、腫瘍細胞でのＣＤ２００の過剰発現と関連し、相関している。したがって、ＣＤ２００は、ＣＤ２００に特異的に結合してＣＤ２００Ｒ１へのライゲーションをブロックするヒト化抗体であるサマリズマブの開発を含む、がん免疫療法の標的となっており、進行性の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者の腫瘍量を軽減するための臨床試験が行われている（例えば、Ｍａｈａｄｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ＣＤ２００，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｃａｎｃｅｒ ７，２２７（２０１９）を参照）。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、高い親和性でヒトＣＤ２００Ｒ１に特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、ＣＤ２００Ｒ１によって媒介される免疫調節効果を減少、阻害、及び／又は完全にブロックすることができる。本開示はまた、ＣＤ２００Ｒ１によって媒介される免疫調節機能又は活性の減少、阻害及び／又はブロックに応答する疾患及び状態を治療するための組成物及び方法を提供する。

【0006】

少なくとも１つの実施形態において、本開示は、（ｉ）第１の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｌ１）、第２の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｌ２）、及び第３の軽鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｌ３）、並びに／又は（ｉｉ）第１の重鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｈ１）、第２の重鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｈ２）、及び第３の重鎖超可変領域（ＨＶＲ－Ｈ３）を含む抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を提供し、
（ａ）ＨＶＲ－Ｌ１は、ＲＡＳＥＳＶＤＹＳＧＮＳＦＭＨ（配列番号１１）、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１９）、ＲＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡ（配列番号２７）、ＲＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡ（配列番号３５）、ＱＡＳＨＴＩＮＬＮ（配列番号４３）、ＱＡＳＨＴＩＮＬＮ（配列番号５１）、ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨ（配列番号５９）、及びＲＡＳＥＳＶＤＹＳＧＮＳＦＭＨ（配列番号７７）から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ－Ｌ２は、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号１２）、ＬＴＳＫＬＡＳ（配列番号２０）、ＳＧＳＴＬＱＳ（配列番号２８）、ＳＧＳＴＬＱＳ（配列番号３６）、ＧＴＳＮＬＥＤ（配列番号４４）、ＧＴＳＮＬＥＤ（配列番号５２）、ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号６０）、及びＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号７８）から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ－Ｌ３は、ＨＱＳＮＥＤＰＰＴ（配列番号１３）、ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号２１）、ＱＱＹＮＥＹＰＷＴ（配列番号２９）、ＱＱＹＮＥＹＰＷＴ（配列番号３７）、ＬＱＨＴＹＬＰＷＴ（配列番号４５）、ＬＱＨＴＹＬＰＷＴ（配列番号５３）、ＱＨＮＲＥＬＬＴ（配列番号６１）、及びＨＱＳＮＷＤＰＰＴ（配列番号７９）から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ－Ｈ１は、ＴＮＹＡＶＳ（配列番号１５）、ＫＤＤＹＭＨ（配列番号２３）、ＫＤＤＹＭＨ（配列番号３１）、ＫＤＤＹＩＨ（配列番号３９）、ＫＤＤＹＩＨ（配列番号４７）、ＴＳＹＷＭＨ（配列番号５５）、ＴＳＹＶＭＦ（配列番号６３）、ＴＮＹＲＶＳ（配列番号８１）、及びＴＮＹＷＶＳ（配列番号８５）から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ－Ｈ２は、ＶＭＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳ（配列番号１６）、ＲＩＤＰＡＮＤＮＴＫＹＡＰ（配列番号２４）、ＲＩＤＰＥＮＧＮＴＫＹＧＰ（配列番号３２）、ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＡＰ（配列番号４０）、ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＡＰ（配列番号４８）、ＡＩＹＰＧＮＳＤＴＮＹＮＱ（配列番号５６）、ＹＩＮＰＹＮＤＤＴＫＹＮＥ（配列番号６４）、ＶＭＹＡＧＧＧＴＮＹＮＳ（配列番号８２）、及びＴＭＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳ（配列番号８６）から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｆ）ＨＶＲ－Ｈ３は、ＡＲＥＲＰＬＴＧＶＭＤＹ（配列番号１７）、ＴＲＶＥＧＲＴＧＴＹＦＤＹ（配列番号２５）、ＴＲＱＬＧＬＲＲＶＷＹＡＬＤＹ（配列番号３３）、ＡＲＱＬＧＬＲＲＴＷＹＳＬＤＹ（配列番号４１）、ＴＲＱＬＧＬＲＲＴＷＹＡＭＤＹ（配列番号４９）、ＴＴＡＶＧＳＹ（配列番号５７）、ＡＲＥＤＹＹＧＳＲＦＶＹＷ（配列番号６５）、ＡＲＥＲＰＬＴＧＶＭＤＮ（配列番号８３）、及びＡＲＥＲＰＬＴＧＰＭＤＹ（配列番号８７）から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0007】

本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の少なくとも１つの実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号１１のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号１５のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１６のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号１７のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｂ）配列番号１９のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２０のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号２１のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号２３のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２４のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号２５のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｃ）配列番号２７のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号２８のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号２９のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号３１のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号３２のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号３３のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｄ）配列番号３５のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号３６のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号３７のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号３９のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４０のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号４１のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｅ）配列番号４３のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号４４のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号４５のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号４７のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４８のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号４９のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｆ）配列番号５１のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５２のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号５３のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号５５のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号５６のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号５７のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｇ）配列番号５９のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号６０のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号６１のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号６３のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号６４のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号６５のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｈ）配列番号７７のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号７８のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号７９のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号８１のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号８２のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号８３のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｉ）配列番号１１のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号８５のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号８６のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号８７のＨＶＲ－Ｈ３、
（ｊ）配列番号１１のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１２のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号１３のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号８１のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号８２のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号８３のＨＶＲ－Ｈ３、あるいは
（ｋ）配列番号７７のＨＶＲ－Ｌ１、配列番号７８のＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号７９のＨＶＲ－Ｌ３、並びに／又は配列番号８５のＨＶＲ－Ｈ１、配列番号８６のＨＶＲ－Ｈ２、及び配列番号８７のＨＶＲ－Ｈ３、を含む。

【0008】

本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の少なくとも１つの実施形態において、抗体は、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、５０、５８、６６、若しくは７６から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、６２、６７、８０、若しくは８４から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。

【0009】

本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の少なくとも１つの実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号１４に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｂ）配列番号１８に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号２２に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｃ）配列番号２６に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号３０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｄ）配列番号３４に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｅ）配列番号４２に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号４６に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｆ）配列番号５０に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号５４に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｇ）配列番号５８に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号６２に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｈ）配列番号６６に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号６７に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｉ）配列番号７６に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｊ）配列番号６６に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８４に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、
（ｋ）配列番号６６に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含むか、あるいは、
（ｌ）配列番号７６に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８４に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列を含む。

【0010】

本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の少なくとも１つの実施形態において、抗体は、配列番号６８、７１、及び７４から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、並びに／又は配列番号６９、７０、７２、７３、７５、８８、及び８９から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む。

【0011】

本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の少なくとも１つの実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号６９と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号７０と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８８と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｄ）配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号７２と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８９と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｆ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号７３と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｇ）配列番号６８と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８８と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、
（ｈ）配列番号７１と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号８９と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、あるいは
（ｉ）配列番号７４と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列、及び／又は配列番号７５と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、を含む。

【0012】

本開示によって提供される抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の少なくとも１つの実施形態において、抗体は、以下のうちの１つ以上の特性を有する：
（ａ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１に結合し、任意選択的に、結合親和性が、配列番号１、２、３、及び／又は４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｂ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１に結合し、任意選択的に、結合親和性が、配列番号１及び／又は２のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４ポリペプチド、及び配列番号３及び／又は４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１ポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｃ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔ及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆに結合し、任意選択的に、結合親和性が、配列番号１のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔポリペプチド、及び配列番号２のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｄ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔ、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆ、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ａｌｔ、及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ｒｅｆに結合し、任意選択的に、結合親和性が、配列番号１のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔポリペプチド、配列番号２のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆポリペプチド、配列番号３のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ａｌｔポリペプチド、及び配列番号４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ｒｅｆポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｅ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に結合し、任意選択的に、結合親和性が、配列番号５のｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｆ）１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に結合し、任意選択的に、結合親和性が、配列番号１、２、３及び／又は４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチド、及び配列番号５のｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される、
（ｇ）ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔ（配列番号１）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆ（配列番号２）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ａｌｔ（配列番号３）、及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ｒｅｆ（配列番号４）へのｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃの結合を、ＥＬＩＳＡによって測定されたとき、１０ｎＭ以下、７ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下又は１ｎＭ以下のＩＣ_５０でブロックする、
（ｈ）２．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＩＣ_５０で、細胞上に発現されたｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１へのｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃの結合をブロックし、任意選択的に、細胞が、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１を安定して発現するＵ９３７細胞である、
（ｉ）２．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０でヒトＴ細胞に結合し、任意選択的に、ヒトＴ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である、
（ｊ）１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、又は１０ｎＭ以下の抗体濃度で、ヒト腫瘍細胞からのＩＦＮγ産生を少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、又はそれ以上増加させ、任意選択的に、腫瘍細胞の型が、結腸直腸、子宮内膜、肺、黒色腫、卵巣、膵臓、又は前立腺から選択される、
（ｋ）ｈｕ－ＣＤ２００－ＦｃでコーティングされたヒトＴ細胞からのＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を、ＩｇＧ対照と比較して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、又はそれ以上増加させる、
（ｌ）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞又はヒトＣｄ８＋Ｔ細胞の活性化を、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍以上増加させる、
（ｍ）ＣＤ２００Ｒ１シグナル伝達を刺激しない、
（ｎ）可溶性ｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃで処理されたＵ９３７単球細胞株におけるｐＤｏｋ２活性の誘導をブロックする、かつ／あるいは
（ｏ）ｈｕ－ＣＤ２００結合ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１発現細胞株によって誘導されるＮＦｋβ転写をブロックし、任意選択的に、細胞株は、ＣＤ２００Ｒ１発現Ｋ５６２レポーター細胞及びＣＤ２００発現２９３Ｔ細胞である。

【0013】

いくつかの実施形態において、治療有効量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、治療有効量は、少なくとも約０．３ｍｇ、少なくとも約１．０ｍｇ、少なくとも約３．０ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約３００ｍｇ、又は少なくとも約９００ｍｇである。いくつかの実施形態において、治療有効量は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、治療有効量での本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の有意なオフターゲット効果はない。いくつかの実施形態において、１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の有意なオフターゲット効果はない。いくつかの実施形態において、２０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の有意なオフターゲット効果はない。

【0014】

本開示はまた、以下の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の実施形態を提供する：（ｉ）抗体が、モノクローナル抗体である、（ｉｉ）抗体が、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、（ｉｉｉ）抗体が、クラスＩｇＧの完全長抗体であり、任意選択的に、クラスＩｇＧ抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及びＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ及びＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅから選択されるアイソタイプを有する、（ｉｖ）抗体が、Ｆｃ領域変異体、任意選択的に、エフェクター機能を改変されたＦｃ領域変異体（例えば、結果としてエフェクターのない抗体になっている変異体）であるか、又は、抗体半減期を改変されたＦｃ領域変異体であるか、又は、エフェクター機能及び抗体半減期を改変されたＦｃ領域変異体であり、いずれのＦｃ領域の例も、ｃ末端のリジンを含んでも含まなくてもよい、（ｖ）抗体が、任意選択的に、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）、及びｓｃＦｖからなる群から選択される抗体断片である、（ｖｉ）抗体が、免疫複合体であり、任意選択的に、免疫複合体が、ＣＤ２００Ｒ１の媒介する疾患又は状態の治療のための治療薬を含む、（ｖｉｉ）抗体が、多重特異性抗体（任意選択的に、二重特異性抗体）である、かつ、（ｖｉｉｉ）抗体が、合成抗体であり、ＨＶＲが、イムノグロブリン足場又はフレームワーク以外の足場又はフレームワークにグラフト化され、任意選択的に、代替的なタンパク質足場及び人工ポリマー足場から選択される足場である。

【0015】

他の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される抗ＣＤ２００Ｒ１抗体をコードする単離された核酸を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるような抗ＣＤ２００Ｒ１抗体をコードする核酸を含む宿主細胞も提供する。

【0017】

本開示は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を産生する方法を提供し、本方法は、抗体が産生されるように、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体をコードする核酸（又はベクター）を含む宿主細胞を培養することを含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるような抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患又は状態を治療するための治療薬を更に含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、医薬組成物の唯一の有効成分である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体と、例えば免疫チェックポイント分子である抗原に対する特異性を含む二次抗体などのチェックポイント阻害剤などであるがこれに限定されない追加の有効成分とを含み、任意選択的に、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＶＲＩＧ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＣＤ９６、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＳＩＲＰａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＣＤ３３、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、ＧＰＣ３、ＣＤ７３、ＣＤ８３、ＣＤ３９、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ２２６、ＶＥＧＦ、及びＶＩＳＴＡから選択される。

【0019】

いくつかの実施形態において、本開示は、対象のＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患を治療する方法を提供し、本方法は、本明細書に開示されるような治療有効量の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、又は本明細書に開示されるような抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の治療有効量の医薬製剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００Ｒ１媒介性状態を治療するために対象に投与される唯一の有効成分である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２００Ｒ１媒介性状態について対象を治療するのに有効な、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上の有効成分などの、２つ以上の有効成分を対象に投与する。いくつかの実施形態において、対象に投与される２つ以上の有効成分は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体と、免疫チェックポイント分子である抗原に対する特異性を含む抗体などのチェックポイント阻害剤などの少なくとも１つの追加の有効成分と、を含む。

【0020】

本開示は、対象の細胞上に発現されるＣＤ２００Ｒ１へのＣＤ２００の結合によって媒介される疾患を治療する方法も提供し、本方法は、本明細書に開示されるような治療有効量の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、又は本明細書に開示されるような抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、対象の細胞上に発現するＣＤ２００Ｒ１へのＣＤ２００の結合によって媒介される疾患について対象を治療するために対象に投与される唯一の有効成分である。いくつかの実施形態において、対象は、対象を治療するのに有効な複数の活性薬剤を投与され、例えば、複数の活性薬剤は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体と、追加の活性薬剤、例えば、限定されないが、免疫チェックポイント分子である抗原に対する特異性を含む二次抗体などの、チェックポイント阻害剤と、を含む。少なくとも１つの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１に結合し、任意選択的に、結合親和性が、配列番号１、２、３、及び／又は４のいずれか１つ以上のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１アイソフォームに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される。

【0021】

本明細書に開示される使用及び治療方法のいくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体又はその医薬組成物で治療することができる、ＣＤ２００Ｒ１媒介性の疾患及び症状、又はＣＤ２００により媒介される疾患には、がんが含まれる。いくつかの実施形態において、がんは、副腎がん、膀胱がん、肉腫、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）がん（固形ＭＳＩがんを含む）、ＴＭＢ（腫瘍変異負荷）高腫瘍、ミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、ＥＧＪ腺がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん（例えば、消化管カルチノイド（ＧＩカルチノイド））、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞がん、腎臓がん、肝臓がん、黒色腫、中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、非小細胞肺がん、卵巣がん、上皮性卵巣がん、子宮内膜がん、小児固形がん、膵臓がん、前立腺がん、脾臓がん、小細胞肺がん、精巣がん、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様がん又は甲状腺濾胞がん）、血液がん（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、白血病、リンパ腫、骨髄腫）、腎細胞がん腫、明細胞腎がん、神経内分泌腫瘍（例えば、悪性褐色細胞腫及び傍神経節腫）、及び子宮がんから選択される。いくつかの実施形態において、がんは、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、皮膚がん（例えば、黒色腫）、膵臓がん、子宮内膜がん、前立腺がん、結腸直腸がん、卵巣がん、中皮腫、及び膀胱がんから選択される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1A】本開示の選択された抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及び市販の抗体ＯＸ１０８からの、ＶＬドメイン及びＶＨドメイン配列のアラインメントを示す。ＨＶＲを灰色で強調表示し、位置はＫａｂａｔ付番に基づいて番号付けしている。

【図1B】同上。

【図2】マウス抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、１０Ｆ６のＶＬドメイン及びＶＨドメイン配列と、最も近いヒト生殖系列配列、及び１０Ｆ６のヒト化バージョンの配列とのアラインメントを示す。位置はＫａｂａｔ付番に基づいて番号付けした。

【図3】本開示の選択された抗ＣＤ２００Ｒ１抗体によるｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１（アイソフォーム１又は４及びハプロタイプＲｅｆ又はＡｌｔ）へのｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃ結合のブロックに関するＥＬＩＳＡ結果のプロットを示す。１μｇ／ｍＬのｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃをプレートにコーティングした。ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１溶液中の抗体の段階希釈（０．１μｇ／ｍＬ又は０．４μｇ／ｍＬ）をプレート結合ｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃとともにインキュベートした。ストレプトアビジンポリＨＲＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を検出に使用した。

【図4】ＣＤ２００Ｒ１を発現する細胞へのｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃの結合をブロックする本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の能力を示すアッセイ結果のプロットを示す。

【図5A】抗ＣＤ２００Ｒ１抗体ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１のヒト又はｃｙｎｏＴ細胞への結合を示すアッセイ結果のプロットを示す。

【図5B】同上。

【図6】抗ＣＤ２００Ｒ１ブロック抗体による治療が、９人のがん患者から採取した一次ＰＢＭＣサンプルの免疫活性化（ＩＦＮγ分泌の増加）をもたらしたことを示すデータのプロットを示す。ＰＢＭＣを、１００ｎＭの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、ｈ２２．１若しくはｈ１０Ｆ６、又はエフェクターのないアイソタイプ対照で処理し、アッセイを実施例５に記載のように行った。

【図7A】可溶性抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１が、アイソタイプ対照（Ｌｙｓｏ ＩｇＧ）と比較し、健康なドナーのｐａｎ Ｔ細胞においてＣＤ２００－Ｆｃによって抑制されたＩＬ－２及びＩＦＮγ分泌をレスキューできることを示すプロットを示す。抗体は、１００ｎＭの固定濃度又は最高用量反応濃度を使用して試験した。示されるエラーバーは、３回作製したサンプルからの標準偏差又は標準誤差平均を代表する。プレートに結合したヒト化ＣＤ２００－Ｆｃリガンドは、ｐａｎ Ｔ細胞機能を阻害する。ＩＬ－２及びＩＦＮγレベルは、実施例５に記載のＥＬＩＳＡによって測定した。

【図7B】同上。

【図7C】同上。

【図7D】同上。

【図8A】抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１によるＴ細胞の処理が、Ｔ細胞に対する寛容原性樹状細胞の抑制又は免疫原性樹状細胞による活性化をどのようにもたらすかを示すプロットを示す。１０μｇ／ｍＬで固定されたＣＤ２００Ｒ１抗体を用いたＣＤ８＋Ｔ細胞上の初期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９（図８Ａ参照）及びＣＤ４＋Ｔ細胞上の増殖マーカーＫｉ６７（図８Ｂ参照）の発現を、アイソタイプ対照と比較した（標識としてＩｇＧ Ｅ^－）。図８Ｃは、アイソタイプ対照（ここではＩｓｏ ＩｇＧ Ｅ－と識別する）と比較した、１０μｇ／ｍＬで固定されたＣＤ２００Ｒ１抗体の処理によるＭＬＲ後４、５、及び６日のＩＦＮｇ放出の計算値を示す。

【図8B】同上。

【図8C】同上。

【図9】可溶性ヒト化２２．１（図ではｓｏｌ ２２．１ ＩｇＧと表示）、ヒト化１０Ｆ６（ｓｏｌ １０Ｆ６ ＩｇＧ）、ＯＸ１０８（ｓｏｌ ＯＸ１０８ ＩｇＧ）、ＣＤ２００－Ｆｃ（ｓｏｌ ＣＤ２００Ｆｃ）、及びアイソタイプ対照ＩｇＧ（ｓｏｌ Ｉｓｏ ＩｇＧ）で３０分間処理した後に誘導されたｐＤｏｋ２レベルを示す。ＣＤ２００Ｒ１を安定して発現するＵ９３７は、図では「ＣＤ２００Ｒ＋」として示し、２００ｎＭから始まる６倍希釈で処理した。親細胞を最高用量の２００ｎＭで処理し、図では「ＷＴ」として示す。上の行にはｐＤｏｋ２と表示し、下の行には合計Ｄｏｋ２と表示する。

【図10A】ＣＤ２００発現細胞と共培養したＫ５６２－ＣＤ２００Ｒ１に対する可溶性抗ＣＤ２００Ｒ１抗体ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１の拮抗作用を示すデータのプロットを示す。図１０Ａ：抗体のＩｇＧ形態、図１０Ｂ：抗体のＦａｂ形態。

【図10B】同上。

【図11】実施例７に記載のように実施された、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１のラットにおける薬物動態試験からのデータのプロットを示す。

【図12】ｈ１０Ｆ６の２ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇ投与後の、２匹の雄及び２匹の雌のサルのｈ１０Ｆ６の血清中濃度を経時的に示す。

【図13A】実施例１０に記載のように実施された、Ｔ細胞サブタイプへのｈ１０Ｆ６の結合のフローサイトメトリー試験からのデータのプロットを示す。

【図13B】同上。

【図14】ビオチン化ｈ１０Ｆ６の段階希釈液でインキュベートし、ストレプトアビジン－ＰＥ及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色で染色したＭｏＤＣの結合のＥＣ５０値を示す。

【図15-1】カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、ビーグル、ウサギのＰＢＭＣを示し、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを５０又は２００ｎＭのビオチン化ｈ１０Ｆ６又はアイソタイプ対照とインキュベートし、ストレプトアビジン－ＰＥ及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色で染色した。

【図15-2】同上。

【図15-3】同上。

【図16】ヒト、ウサギ、マーモセット、アカゲザル、又はカニクイザル由来の全長ＣＤ２００－Ｒ１をトランスフェクトし、ビオチン化ｈ１０Ｆ６の連続希釈液、続いてストレプトアビジン－ＰＥ及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色液とともにインキュベートした、ＣＨＯ細胞への、ｈ１０Ｆ６の結合を示す。

【図17-1】がん患者及び健常対照者の、ＴＩＬとＰＢＭＣでのＣＤ２００の発現を示す。ＣＤ２００発現は、腫瘍由来の免疫細胞サブセットと、がん患者のＰＢＭＣ及び健康な被験者のＰＢＭＣで評価した。単一細胞免疫サブセットは、ＣＤ４５＋Ｔヘルパー細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、及びＢ細胞（ＣＤ３－ＣＤ１９＋）に基づいてゲートし、骨髄細胞はＣＤ１１ｂ＋（系統陰性）と同定された。ＭＦＩ（平均蛍光強度）によって測定されたＣＤ２００発現を、ＴＩＬサブセットと、対応するＰＢＭＣとで比較した。

【図17-2】同上。

【図18-1】腫瘍由来の免疫細胞サブセット及びがん患者由来のＰＢＭＣ及び健常者由来のＰＢＭＣにおいて評価されたＣＤ２００Ｒ１発現を示す。単一細胞免疫サブセットは、ＣＤ４５＋Ｔヘルパー細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、及びＢ細胞（ＣＤ３－ＣＤ１９＋）に基づいてゲートし、骨髄細胞はＣＤ１１ｂ＋（系統陰性）と同定された。ＭＦＩ（平均蛍光強度）によって測定されたＣＤ２００Ｒ１発現を、ＴＩＬサブセットと、対応するＰＢＭＣとで比較した。

【図18-2】同上。

【図19A】高発現集団（総Ｔ細胞の約２８％）を表すと予想されるレベルのｈＣＤ２００Ｒ１を発現するよう操作されたＵ９３７細胞株を示す。パネルＡは、Ｕ９３７－ＣＤからの、様々な濃度のビオチン化ｈＣＤ２００－Ｆｃの置換を示す。

【図19B】同上。

【図20】増加する濃度のｈ１０Ｆ６に結合させたインビトロ単球分化ＤＣの濃度の関数としての結合を示す。

【図21】ＣＤ２００を発現するＨＥＫ２９３細胞と共培養された、ＣＤ２００Ｒ１及びＤＯＫ２を発現するよう操作されたヒトＪｕｒｋａｔ細胞における、ＣＤ２００Ｒ１へのＤＯＫ２の誘導された動員のブロックを示す。

【図22A】ＣＤ２００Ｒ１及びＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターを安定して発現するよう操作されたヒト骨髄細胞株Ｋ５６２のＣＤ２００－Ｒ１誘導ＮＦκＢ活性化に対するｈ１０Ｆ６の効果を示す。パネルＡは、ＣＤ２００Ｒ１を発現するＫ５６２細胞と、ＣＤ２００を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞との共培養が、細胞数依存的にＮＦκＢレポーター遺伝子活性を誘導したことを示す。パネルＢは、ＣＤ２００Ｒ１を発現するＫ５６２細胞とＣＤ２００を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞との共培養に、ｈ１０Ｆ６又はアイソタイプ対照の連続希釈を適用することにより、ＮＦκＢシグナル伝達をブロックする、ｈ１０Ｆ６の能力を示す。

【図22B】同上。

【図23A】２０ｎｇ／ｍＬ ＧＭＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４で７日間培養して樹状細胞に分化した単球を示す。樹状細胞は、寛容原性に分極するか（２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０及びＩＦＮα－２ｂを使用）、又は免疫原性ＤＣに分極する（１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ及び５０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ－αを使用）。分極の３日後、汎Ｔ細胞及び成熟ＤＣを、２０：１（Ｔ：ＤＣ）の比率で１０ｕｇ／ｍＬ ｈ１０Ｆ６又はアイソタイプ対照と混合した。馴化培地を、サイトカイン測定のために４、５、及び６日後に回収した。Ｔ細胞活性化マーカーは、ＦＡＣＳ分析によって測定した（抗ＣＤ６９、抗ＣＤ２５及び抗Ｋｉ６７）。サイトカイン産生（パネルＡ：ＩＦＮγ、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１８）及びＴ細胞活性化マーカー（パネルＢ：ＣＤ４＋Ｋｉ６７＋及びＣＤ８＋ＣＤ６９＋）の両方を測定し、４、５、及び６日目のＩＦＮγ分泌の経時変化（パネルＣ）は、時間依存性を示す。

【図23B】同上。

【図23C】同上。

【図24A】健康なＰＢＭＣドナーから分離され、完全培地で７日間、２μｇ／ｍＬ ＰＨＡ及び４ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－２で慢性的に刺激されたヒト汎Ｔ細胞を示す。次いで、細胞を回収し、刺激剤を休止し、４０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－４で２４時間プライミングした。細胞をプレーティングする前に、プレートを１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３及び１５μｇ／ｍＬのｈＣＤ２００－Ｆｃ又はアイソタイプが一致するＦｃ対照（ＰＢＳで希釈した対照コートと称する）で一晩４℃でコーティングした。細胞を回収し、洗浄し、５０ｎＭ抗体で２４時間プレーティングした。細胞上清を回収し、ＩＬ－２分泌をＥＬＩＳＡで測定した。パネルＡでは、生物学的３回反復とＳＥＭからのＩＬ－２分泌レベルの平均を、各ドナーについてグラフ化している。不対ｔ検定を実施し、アイソタイプ対照と比較した有意なｈ１０Ｆ６処理効果を決定した（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。パネルＢでは、ＩＦＮγ分泌のｈ１０Ｆ６レスキューの用量反応曲線は、１人のドナーからの生物学的３回反復を示す。

【図24B】同上。

【図25A】アイソタイプ対照で処理されたＰＢＭＣと比較して、ＳＥＢでプライミングされたＰＢＭＣのｈ１０Ｆ６（内因的にＣＤ２００を発現するＧＦＰ＋ＣＯＶ６４４腫瘍細胞）による処理による腫瘍細胞殺傷の加速を示す。パネルＡは、指定濃度のｈ１０Ｆ６又はアイソタイプ対照で処理した３人中１人のドナー（ＲＧ１２１２）からの細胞の増殖曲線（ウェル当たりの緑色の面積で測定）を示す。パネルＢは、パネルＡ（ＲＧ１２１２）に示される同じドナーからの殺傷期の時間枠の間に曲線の下の緑色の面積を使用して測定された腫瘍細胞ＧＦＰシグナルの用量依存的な減少を示す。データを、４～６の個々の測定値の平均±ＳＥＭとしてプロットする。

【図25B】同上。

【図26A】ｈ１０Ｆ６は、３人のユニークなドナーにおいてＰＢＭＣを介する腫瘍細胞殺傷を濃度依存的に増強したことを示す（パネルＡ～Ｃ）。ｎ＝４の反復からの、殺傷された腫瘍細胞の平均増加率をｈ１０Ｆ６濃度でプロットし、ドナー別に分けた（パネルＤ）。ＲＧ１９３９（Ｎ＝２）及びＲＧ１３０７（Ｎ＝３）で繰り返し実験したデータを集計し、３項非線形回帰モデルにフィットさせた。ｈ１０Ｆ６効果の範囲及びドナー間変動性を評価するために、アイソタイプ対照と比較した個々及びモデル適合の最大及び最小％腫瘍殺傷をドナーごとにプロットした。

【図26B】同上。

【図26C】同上。

【図26D】同上。

【図27】ビオチン化ｈ１０Ｆ６の段階希釈液とインキュベートし、ストレプトアビジン－ＰＥ、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色、並びに抗ＣＤ３クローンＳＫ７、抗ＣＤ４クローンＭ－Ｔ４６６、抗ＣＤ８クローンＢＷ１３５／８０、抗ＣＤ２０クローン２Ｈ７、抗ＣＤ１１ｂクローンＭ１／７０、抗ＣＤ１４クローンＴＵＫ４及び抗ＨＬＡ－ＤＲクローンＲＥＡ－８０５などの蛍光色素結合型の市販の抗体カクテルで染色したサルＰＢＭＣを示す。免疫細胞のサブタイプは、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）として定義した。サルＣＤ４＋Ｔ細胞への結合に関するＥＣ５０値は、３パラメータ、ｌｏｇ１０［ｈ１０Ｆ６］対応答、非線形曲線フィットを用いて決定した。

【図28】ＥＬＩＳＡを用いて評価した、固定化されたＦｃタグ付きＭｆＣＤ２００へのビオチン化ＭｆＣＤ２００Ｒ１の結合をブロックするｈ１０Ｆ６の能力を示す。１μＭから２．３８ｘ１０－７μＭの範囲のｈ１０Ｆ６の４倍連続希釈を、ｈＣＤ２００Ｒ１（０．０４ｕｇ／ｍｌ）又はＭｆＣＤ２００Ｒ１（０．１２ｕｇ／ｍｌ）とプレインキュベートした後、固定化ＭｆＣＤ２００をプレートに添加した。ＨＲＰ－ストレプトアビジン及び比色基質とインキュベートし、続いて各ウェルのＯＤ４５０をモニターすることによって、結合を評価した。

【図29】ＭｆＣＤ２００Ｒ１を安定して発現するよう操作されたヒト単球細胞株Ｋ５６２を示す。非グリコシル化ｈＩｇＧ１ Ｆｃタグと融合した組換えＭｆＣＤ２００の、ＭｆＣＤ２００Ｒ１を発現するＫ５６２細胞への結合を、ＦＡＣＳによって確認した。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１は、ＭｆＣＤ２００Ｒ１を発現するＫ５６２細胞へのＭｆＣＤ２００－Ｆｃの結合を用量依存的に阻害した。

【図30】片対数プロットでプロットされた、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の、平均及び個々の血清濃度を示す。アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は０．０６μｇ／ｍＬであった。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本開示は、ＣＤ２００Ｒ１に高い親和性で特異的に結合し、それによって免疫調節に関与する細胞表面受容体としてのＣＤ２００Ｒ１の機能、特にリンパ球（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）の活性化の阻害剤としてのＣＤ２００Ｒ１の機能を、阻害、低減、及び／又は完全にブロックする、ヒト化抗体を含む抗体を提供する。したがって、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む組成物又は製剤のいずれも、ＣＤ２００Ｒ１又はその標的リガンドであるＣＤ２００の機能によって媒介される疾患（がん及びウイルス感染症など）の治療のための治療薬として使用できることが企図される。更に、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＶＲＩＧ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、及びＣＲＴＡＭを含むがこれらに限定されない免疫チェックポイント分子を標的とする抗体などの他の治療薬と組み合わせて治療薬として使用できることが企図される。本開示によって企図される治療薬の中には、本開示の抗体の抗ＣＤ２００Ｒ１結合特異性と、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＶＲＩＧ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、及びＣＲＴＡＭなどの免疫チェックポイント分子に対する抗体の別の結合特異性と、を含む二重特異性抗体がある。

【0024】

用語及び技法の概要
本明細書の記載及び添付の特許請求の範囲について、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及には複数のタンパク質が含まれ、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は複数の化合物を指す。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するために起草される場合があることに更に留意されたい。したがって、この言及は、特許請求の範囲要素の列挙に関連して「単独で」、「のみ」などの排他的な用語を使用するか、又は「否定的な」制限を使用するための先行する基礎として機能することを意図としている。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、互いに交換可能であり、限定することを意図するものではない。様々な実施形態の記載が「含む」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、実施形態が「本質的にからなる」又は「からなる」という言語を使用して代替的に説明できることを理解するであろうことを更に理解されたい。

【0025】

値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、その範囲の上限と下限との間にある値の各介在整数、及び値の各介在整数の各１０分の１、明らかに別段の指示がない限り、及びその記載範囲における任意の他の記載値又は介在値は、本発明に包含されると理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立してより小さな範囲に含まれ、本発明内にも包含され、記載範囲における明確に除外される制限を受ける。記載された範囲が制限の一方又は両方を含む場合、含まれるそれらの制限の（ｉ）いずれか又は（ｉｉ）両方を除く範囲も本発明に含まれる。例えば、「１～５０」には、「２～２５」、「５～２０」、「２５～５０」、「１～１０」などが含まれる。

【0026】

一般に、本明細書で使用される命名法並びに本明細書に記載される技法及び手順は、当業者によって十分に理解されかつ一般的に使用されるものを含み、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（ｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒ“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ２０１１）（ｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒ“Ａｕｓｕｂｅｌ”）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．１ａｎｄ２，Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖ．Ｏｓｓｉｐｏｗ ａｎｄ Ｎ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｄｓ．，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１４）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｚ．Ａｎ，ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．（２００９）、及びＰｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｔｉｍ Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｒｙ Ｂ．Ｌｏｗｍａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（２００４）に記載される一般的な技法及び方法論などに記載されている。

【0027】

本開示で参照される全ての出版物、特許、特許出願、及び他の文書は、個々の出版物、特許、特許出願、又は他の文書の各々が、あらゆる目的で参照として本明細書に組み込まれることを個別に示すような場合と同程度に、あらゆる目的で全体を参照として本明細書に組み込まれる。

【0028】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。本開示を解釈する目的で、以下の用語の説明が適用され、適切な場合、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同様である。

【0029】

本明細書で使用される「ＣＤ２００Ｒ１」は、細胞表面膜貫通糖タンパク質ＣＤ２００受容体１を指し、ヒト、カニクイザル（本明細書では場合によっては「ｃｙｎｏ」と称される）、アカゲザル、及びそれらの様々なアイソフォームのＣＤ２００Ｒ１タンパク質を包含する。様々な例示的なＣＤ２００Ｒ１タンパク質及びアイソフォームのアミノ酸配列が当技術分野で知られており、以下の表２及び添付の配列表に示す。

【0030】

本明細書で使用される「ＣＤ２００Ｒ１媒介性状態」又は「ＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患」は、リガンド（例えば、ＣＤ２００）へのＣＤ２００Ｒ１の特異的な結合に関連する任意の医学的状態を包含する。例えば、細胞表面に発現されたＣＤ２００がＣＤ２００Ｒ１受容体を発現する他の細胞に特異的に結合すると、ＣＤ２００発現細胞と他の免疫調節分子との結合に影響を与え、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）の活性化を変化させる可能性がある。したがって、ＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患には、限定されないが、ＣＤ２００Ｒ１若しくはＣＤ２００発現細胞の間の結合によって媒介される、及び／又はそれらのアンタゴニスト若しくは阻害剤に応答性の任意の疾患又は状態、及び／又は免疫チェックポイントの阻害に応答する任意の疾患又は状態、限定されないががんが挙げられる。具体的な例示的ながんは、本明細書の他の場所で示す。

【0031】

本明細書で使用される「免疫チェックポイント分子」は、免疫系経路を調節するように機能し、それによって不必要に細胞を攻撃するのを防止する分子を指す。多くの免疫チェックポイント分子は、抑制性及び共刺激性のいずれも、がん及びウイルス感染症の治療における（例えば、免疫抑制をブロックするためのブロッキング抗体又は免疫刺激を促進するためのアゴニストによる）免疫療法の標的である。がん免疫療法のために標的とされる免疫チェックポイント分子の例としては、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＶＲＩＧ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＳＩＲＰａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＣＤ３３、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、ＧＰＣ３、ＣＤ７３、ＣＤ８３、ＣＤ３９、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ２２６、及びＶＩＳＴＡが挙げられる。

【0032】

本明細書で使用される「抗体」とは、特定の抗原に特異的に結合するか、又は免疫学的に反応する１つ以上のポリペプチド鎖を含む分子を指す。本開示の例示的な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異性（又はヘテロコンジュゲート）抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体（例えば、単一アーム抗体）、多価抗体、抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、及びｓｃＦｖ断片）、抗体融合物、及び合成抗体（又は抗体模倣物）が含まれる。

【0033】

「抗ＣＤ２００Ｒ１抗体」又は「ＣＤ２００Ｒ１に結合する抗体」とは、抗体がＣＤ２００Ｒ１を標的とする際の診断剤及び／又は治療剤として有用であるように十分な親和性でＣＤ２００Ｒ１に結合する抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１特異的抗体の無関係の非ＣＤ２００Ｒ１抗原への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定したときの、ＣＤ２００Ｒ１への抗体の結合に対して、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満である。いくつかの実施形態において、ＣＤ２００Ｒ１に結合する抗体は、＜１μＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、又は＜１ｐＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。

【0034】

「完全長抗体」、「インタクト抗体」、又は「全抗体」とは、本明細書で互換的に使用され、天然の抗体構造に実質的に類似する構造を有する抗体、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

【0035】

「抗体断片」とは、完全長抗体と同じ抗原に結合することができる完全長抗体の一部を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、線形抗体、一価又は単一アーム抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。

【0036】

抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0037】

「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ）は一般に類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ９１を参照）。単一のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインを使用して、、抗原に結合する抗体から単離し、それぞれ相補的なＶ_Ｌ又はＶ_Ｈドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０：８８０－８８７（１９９３）Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照）。

【0038】

本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列が超可変性であり、かつ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然抗体は、６つのＨＶＲを有する４つの鎖を含み、重鎖可変ドメインＶ_Ｈ（ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２、ＨＶＲ－Ｈ３）に３つ、軽鎖可変ドメインＶ_Ｌ（ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２、ＨＶＲ－Ｌ３）に３つである。ＨＶＲは一般に、超可変ループ及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。多数の超可変領域の描写が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造ループの位置を参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の妥協点を表し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用される。「接触」超可変領域は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。これらの超可変領域の各々からの残基を以下の表１に示す。

【0039】

【表1】

【0040】

別段に明記しない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前出に従って本明細書で付番される。

【0041】

本明細書で使用される超可変領域は、以下の拡張又は代替超可変領域を含み得る：Ｖ_Ｌドメインの２４－３６又は２４－３４（Ｌ１）、４６－５６又は５０－５６（Ｌ２）、及び８９－９７又は８９－９６（Ｌ３）、並びにＶ_Ｈドメインの２６－３５又は３０－３５（Ｈ１）、５０－６１、５０－６５又は４９－６５（Ｈ２）、及び９３－１０２、９４－１０２又は９５－１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、上記のＫａｂａｔらに従って番号付けされている。

【0042】

本明細書で使用される「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とは、最も高い配列多様性を有する及び／又は抗原認識に関与する、可変ドメインのＨＶＲ内の領域を指す。一般に、天然抗体は、６つのＣＤＲを有する４つの鎖を含み、重鎖可変ドメインＶ_Ｈ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、軽鎖可変ドメインＶ_Ｌ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つである。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４～３４、Ｌ２の５０～５６、Ｌ３の８９～９７、Ｈ１の３１～３５、Ｈ２の５０～６１、及びＨ３の９５～１０２で出現する。（付番はＫａｂａｔら、上記による）。

【0043】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の４つのＦＲドメインで構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、Ｖ_Ｈ（又はＶ_Ｌ）において次の配列で出現する。ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

【0044】

「天然抗体」とは、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成されている。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は可変領域（Ｖ_Ｈ）を有し、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれ、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は可変領域（Ｖ_Ｌ）を有し、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれ、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられ得る。

【0045】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」とは、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、可能な変異体抗体（例えば、変異体抗体は、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体の産生中に生じる変異、及び一般に少量存在する変異を含む）を除いて、同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技法によって作製され得、このような方法及び他の例示的なモノクローナル抗体作製法は、本明細書に記載されている。

【0046】

「キメラ抗体」とは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。

【0047】

「ヒト化抗体」とは、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸配列及びヒトＦＲからのアミノ酸配列を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲの全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体の「ヒト化形態」、例えば、非ヒト抗体とは、ヒト化を受けた抗体を指す。

【0048】

「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される抗体又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

【0049】

「ヒト共通フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶ_Ｌ又はＶ_Ｈフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶ_Ｌ又はＶ_Ｈ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３のようなサブグループである。いくつかの実施形態において、Ｖ_Ｌの場合、サブグループは、前出のＫａｂａｔらのようなサブグループカッパＩである。いくつかの実施形態において、Ｖ_Ｈの場合、サブグループは、前出のＫａｂａｔらのようなサブグループＩＩＩである。

【0050】

本明細書で使用される「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共通フレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒト共通フレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、又はアミノ酸配列の変化を含み得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸の変化数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施形態において、Ｖ_Ｌアクセプターヒトフレームワークは、Ｖ_Ｌヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒト共通フレームワーク配列と配列が同一である。

【0051】

「Ｆｃ領域」とは、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、Ｃ末端ポリペプチド配列は、インタクト抗体のパパイン消化によって得られるものである。Ｆｃ領域は、天然又は変異体のＦｃ配列を含み得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変化する場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ配列は通常、約Ｃｙｓ２２６番目でのアミノ酸残基から、又は約Ｐｒｏ２３０番目からＦｃ配列のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。ただし、Ｆｃ配列のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合と存在しない場合がある。免疫グロブリンのＦｃ配列は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択的に、ＣＨ４ドメインを含む。

【0052】

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。いくつかの実施形態において、ＦｃＲは、天然のヒトＦｃＲである。いくつかの実施形態において、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（例えば、Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：２０３－２３４（１９９７）を参照）。本明細書で使用されるＦｃＲは、新生児受容体であるＦｃＲｎも含み、ＦｃＲｎは、胎児への母体ＩｇＧの移動（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ １７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））及び免疫グロブリンのホメオスタシスに関与する。ＦｃＲは、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２５－３４（１９９４）、及びＨａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）で概説されている。

【0053】

本明細書で使用される「多価抗体」は、３つ以上の抗原結合部位を含む抗体である。多価抗体は、好ましくは、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般に、天然配列のＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。

【0054】

「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる結合部位を有し、各部位が異なる結合特異性を有する抗体である。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片であることができ、異なる結合部位は、各々異なる抗原に結合し得るか、又は異なる結合部位は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。

【0055】

「Ｆｖ断片」とは、完全な抗原認識及び結合部位を含む抗体断片を指す。この領域は、緊密に結合した１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインの二量体で構成されており、例えば、ｓｃＦｖでは天然で共有結合性であり得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。まとめると、６つのＨＶＲ又はそのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、通常は結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識して結合する能力を有する。

【0056】

「Ｆａｂ断片」とは、軽鎖の可変及び定常ドメイン、並びに重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、一対のＦａｂ断片を含み、これらは一般に該Ｆａｂ断片間のヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端近くで共有結合している。抗体断片の他の化学カップリングも当技術分野で知られている。

【0057】

本明細書で使用される「抗原結合アーム」とは、目的の標的分子に特異的に結合する能力を有する抗体の構成要素を指す。典型的には、抗原結合アームは、免疫グロブリンポリペプチド配列、例えば、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のＨＶＲ及び／又は可変ドメイン配列の複合体である。

【0058】

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドには、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間に、ｓｃＦｖが所望の抗原結合構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーが更に含まれる。

【0059】

「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ）に軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合するしかなく、２つの抗原結合部位を作成する。

【0060】

「線形抗体」とは、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５）に記載されている抗体を指す。簡潔に述べると、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドとともに、一対の抗原結合領域を形成する、一対の（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）Ｆｄセグメントを含む。線形抗体は二重特異性又は単一特異性であり得る。

【0061】

「裸の抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害部分）又は放射性標識に結合していない抗体を指す。

【0062】

「親和性」とは、分子の単一結合部位（例えば、抗体）とその結合相手（例えば、抗原）との非共有相互作用の全体的な強さを指す。「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は、一般に平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で表すことができる。親和性は、当技術分野で知られている一般的方法によって測定することができ、本明細書に記載されているものを含む。結合親和性を測定するための具体的な事例的及び例示的な実施形態を以下に記載する。

【0063】

「特異的に結合する」又は「特異的結合」とは、約１×１０^－７Ｍ以下の親和性値で抗体が抗原に結合することを指す。いくつかの実施形態において、抗体は、それが特異的に結合する抗原以外の抗原に対して二次親和性を有してもよく、ここで、「二次親和性」とは一般に、本明細書の他の場所に記載されているように、約１０ｎＭを超える親和性値を有する二次抗原への抗体の結合を指す。抗体が二次抗原に対して二次親和性を有する場合でも、かかる抗体は一次抗原に特異的に結合する。

【0064】

「親和性成熟」抗体とは、このような変化を保有しない親抗体と比較して、１つ以上のＨＶＲに１つ以上の変化を有する抗体を指し、このような変化は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。

【0065】

抗体の「機能的抗原結合部位」は、標的抗原に結合できる部位である。抗原結合部位の抗原結合親和性は、必ずしも抗原結合部位が由来する親抗体ほど強力ではないが、抗原に結合する能力は、抗原への抗体の結合を評価するために知られている様々な方法のいずれか１つを使用して測定可能でなければならない。

【0066】

「単離された抗体」とは、その自然環境の構成要素から分離された抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように９５％超又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９－８７を参照されたい。

【0067】

本明細書で使用される「実質的に類似する」又は「実質的に同じ」とは、２つの数値（例えば、一方は試験抗体に関連し、他方は参照抗体に関連する）間の十分に高度な類似性を指し、当業者は、２つの値の差が、該値（例えば、Ｋ_Ｄ値）によって測定される生物学的特徴に照らして、生物学的及び／又は統計的な有意性がほとんど又は全くないとみなすであろう。

【0068】

本明細書で使用される「実質的に異なる」とは、２つの数値（一般に、一方は分子に関連し、他方は参照分子に関連する）間の十分に高度な差異を指し、当業者は、２つの値の差が、該値（例えば、Ｋ_Ｄ値）によって測定される生物学的特徴に照らして、統計的に有意であるとみなすであろう。

【0069】

「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指し、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節及びＢ細胞の活性化が含まれる。

【0070】

「免疫複合体」とは、細胞毒性剤を含むがこれに限定されない、１つ以上の異種分子に結合した抗体を指す。

【0071】

「治療」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、治療されている個体の障害の自然経過を変えようとする試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理学の過程のいずれかで実施することができる。治療の望ましい結果には、障害の発生又は再発の予防、症状の緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）、障害の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、進行速度の低下、病態の改善又は緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ）、及び寛解又は予後の改善が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、治療は、対象に抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む医薬製剤の治療上有効量の投与を行い、ＣＤ２００Ｒ１によって媒介される疾患若しくは状態、又はＣＤ２００Ｒ１が発病学及び／若しくは進行で役割を果たし得る疾患若しくは状態の成長を遅延させ、又は進行を遅延させることを含むことができる。

【0072】

「医薬製剤」とは、有効成分の生物活性が有効であり、製剤が投与される対象に毒性のある追加成分を含まない形態の調製物を指す。医薬製剤は、１つ以上の有効成分を含み得る。例えば、医薬製剤は、製剤の唯一の有効成分として抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含んでもよく、又は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体と、例えば免疫チェックポイント阻害剤などの１つ以上の追加の有効成分と、を含んでもよい。

【0073】

本明細書で使用される「唯一の有効成分」とは、言及される薬剤が、製剤中に存在するか、又は治療に使用される唯一の薬剤であって、本明細書で示される「治療」の説明と一致する、疾患を治療するための関連する薬理学的効果を提供する、又は提供することが期待される薬剤のことを意味する。唯一の有効成分を含む医薬製剤は、製剤中の例えば薬学的に許容される担体などの１つ以上の非有効成分の存在を排除しない。「非有効成分」とは、対象の状態を治療することを意図した関連する薬学的効果を提供するか、又はそうでなければ有意に寄与する、ことが期待されない薬剤である。

【0074】

「薬学的に許容される担体」とは、それが投与される対象に対して無毒である、有効成分以外の医薬製剤の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0075】

「治療有効量」とは、例えば、対象の疾患、障害、又は状態を治療又は予防するために所望する治療結果又は予防結果を達成するための有効成分又は薬剤（例えば、医薬製剤）の量を指す。ＣＤ２００Ｒ１媒介性の疾患又は状態の場合、治療剤の治療有効量は、疾患、障害、又は状態に関連する１つ以上の症状をある程度低減、予防、阻害、及び／又は軽減する量である。がん療法の場合、インビボでの有効性は、例えば、原発性腫瘍の成長、二次腫瘍の発生又は成長、転移の発生又は数、症状の持続時間、重症度、及び／若しくは再発、応答率（ＲＲ）、応答の持続時間、並びに／又は生活の質を評価することによって測定することができる。

【0076】

本明細書で使用される「同時に」とは、２つ以上の治療剤の投与を指し、投与の少なくとも一部が時間的に重複する。したがって、同時投与は、１つ以上の他の薬剤の投与を中止した後、１つ以上の薬剤の投与が継続する場合の投薬計画を含む。

【0077】

「個体」又は「対象」とは、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。

【0078】

様々な実施形態の詳細な説明
Ｉ．ＣＤ２００Ｒ１
ヒトＣＤ２００Ｒ１（「ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１」）は、細胞、特に骨髄細胞及びＴ細胞の表面に発現する膜貫通糖タンパク質である。ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１のＵｎｉｐｒｏｔ配列Ｑ８ＴＤ４６－１は、アイソフォーム１と称される３２５アミノ酸のアイソフォームをコードする。ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１のＵｎｉｐｒｏｔ配列Ｑ８ＴＤ４６－４は、アイソフォーム１と称される３４８アミノ酸のアイソフォームをコードする。しかしながら、ヒト集団で主に観察されるｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１アイソフォームは、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ８ＴＤ４６－４アイソフォーム４の３４８アミノ酸配列変異体であり、Ｅ３３５Ｑが置換されている。このアイソフォーム４の変異体（Ｑ８ＴＤ４６－４＋Ｅ３３５Ｑ）は、１０００ゲノムプロジェクト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）で観察された全個体の９９％超を占める２つの主要なハプロタイプのうちの１つである。このハプロタイプ（本明細書では「Ａｌｔ」と称する）は、０．５４の頻度でヨーロッパ系の個体で最も頻繁に観察される。他の主要なハプロタイプ（本明細書では「Ｒｅｆ」と称する）は、０．４６の頻度でヨーロッパ系の個体に観察され、ヒトゲノム参照配列に対応する。Ａｌｔハプロタイプは、Ｑ８ＴＤ４６－４配列の細胞外ドメイン（ＥＣＤ、アミノ酸１～２６６）、及びＥ３３５Ｑ置換を有する、Ｑ８ＴＤ４６－４配列の細胞内ドメイン（ＩＣＤ、アミノ酸２９１～３４８）を有する。Ｒｅｆハプロタイプは、３つの置換、Ｒ１１２Ｋ、Ｐ１４４Ｔ、及びＱ２００Ｈを有する、Ｑ８ＴＤ４６－４配列の細胞外ドメイン（ＥＣＤ、アミノ酸１～２６６）、及びＱ８ＴＤ４６－４配列の細胞内ドメイン（ＩＣＤ、アミノ酸２９１～３４８）を有する。

【0079】

ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４Ａｌｔ及びＲｅｆハプロタイプＥＣＤ配列（位置２７～２６６）の２４０アミノ酸セグメントは、以下の表２において、それぞれ配列番号１及び２として本明細書に示す。ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１Ａｌｔ及びＲｅｆハプロタイプＥＣＤ配列（位置２９～２４３）の２１５アミノ酸セグメントは、以下の表２において、それぞれ配列番号３及び４として本明細書に示す。

【0080】

ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１アイソフォーム４に類似する、ｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１及びアカゲザルＣＤ２００Ｒ１の組換えにより調製されたセグメントを、以下の表２にそれぞれ配列番号５及び６として示す。

【0081】

ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１受容体標的リガンドであるｈｕ－ＣＤ２００タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４１２１７として存在し得、本明細書では配列番号７として示す。対応するｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１ＣＤ２００タンパク質もまた、本明細書において配列番号８として示す。全てのＣＤ２００ポリペプチドは、配列番号９として示されるエフェクターのないヒトＩｇＧ ＦｃとのＣ末端融合体である。

【0082】

以下の表２は、本開示の様々なＣＤ２００Ｒ１の配列及びＣＤ２００ポリペプチド構築物の要約的説明、並びにそれらの配列識別子を提供する。配列は、添付の配列表にも含まれる。

【0083】

【表2-1】

【0084】

【表2-2】

【0085】

ＩＩ．抗ＣＤ２００Ｒ１抗体
いくつかの実施形態において、本開示は、様々な周知の免疫グロブリン特徴（例えば、ＨＶＲ、ＦＲ、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌドメイン、並びに全長の重鎖及び軽鎖）のアミノ酸配列及びコードヌクレオチド配列に関して抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の構造を提供する。以下の表３は、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体配列、及びこれらの配列識別子の要約説明を提供する。配列は、添付の配列表に含まれる。

【0086】

【表3-1】

【0087】

【表3-2】

【0088】

【表3-3】

【0089】

【表3-4】

【0090】

【表3-5】

【0091】

【表3-6】

【0092】

【表3-7】

【0093】

【表3-8】

【0094】

１．抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の結合親和性、ブロッキング及び細胞シグナル伝達阻害
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００Ｒ１に結合するための平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、又は＜０．００１ｎＭである（例えば、１０^－８Ｍ以下、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）。

【0095】

いくつかの実施形態において、結合親和性は、配列番号１、２、３、及び／又は４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１アイソフォーム／ハプロタイプポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１は、配列番号１、２、３、及び４の４つ全てのｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１アイソフォーム／ハプロタイプポリペプチドに対して、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、又は＜０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）のＣＤ２００Ｒ１に対する結合についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の親和性で結合することができる。少なくとも１つの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１は、配列番号１及び２のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドに対して、１０^－８Ｍ以下の範囲の匹敵する（例えば、２０％以内）又は同等の親和性で結合することができる。

【0096】

少なくとも１つの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性で、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１に結合することを特徴とする。いくつかの実施形態において、結合親和性は、配列番号１及び／又は２のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４ポリペプチド、並びに配列番号３及び／又は４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１ポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される。

【0097】

少なくとも１つの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性で、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆに結合することを特徴とする。いくつかの実施形態において、結合親和性は、配列番号１のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔポリペプチド及び配列番号２のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆポリペプチドに対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される。

【0098】

本明細書に開示されるように生成される様々な抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１、並びに／又はｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１の両方に高親和性結合することができる抗体を含むことが企図される。より具体的には、いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に結合する。いくつかの実施形態において、結合親和性は、配列番号５のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドに結合するための平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）として測定される。いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性でｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に結合する。いくつかの実施形態において、結合親和性は、配列番号５のｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドに結合するための平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）として測定される。いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－１０Ｍ以下又は１×１０^－１１Ｍ以下の結合親和性で、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１及びｃｙ－ＣＤ２００Ｒ１の両方に結合する。いくつかの実施形態において、結合親和性は、配列番号１、２、３又は４のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチド、及び配列番号５のｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に結合するための平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）として測定される。

【0099】

一般に、リガンドのその受容体への結合親和性は、様々なアッセイのいずれかを使用して決定することができ、様々な定量値で表すことができる。抗体の親和性を決定するのに有用である具体的なＣＤ２００Ｒ１結合アッセイは、本明細書の実施例に開示されている。更に、抗原結合アッセイが、当技術分野で知られており、本明細書で使用することができ、ウエスタンブロット、放射性免疫アッセイ、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（ＷＯ２００５／０１２３５９に記載されているＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイ、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）などの技法を使用する任意の直接又は競合結合アッセイを含むが、これらに限定されない。

【0100】

したがって、いくつかの実施形態において、結合親和性は、Ｋ_Ｄ値として表され、固有の結合親和性を反映する（例えば、最小化された結合活性効果を有する）。本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ヒトにおいて優勢である４つの別個のＣＤ２００Ｒ１アイソフォーム／ハプロタイプ、すなわちｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔ（配列番号１）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆ（配列番号２）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ａｌｔ（配列番号３）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ｒｅｆ（配列番号４）、の組み合わせの細胞外ドメインに対して強い結合親和性を示す。これらの４つのアイソフォーム、配列番号１～４の４つのｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドの細胞外ドメインは、１０ｎＭ～１ｐＭのＫ_Ｄ値を示す。したがって、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００Ｒ１の同じ又は重複するエピトープに対してより低い親和性を有する抗体と競合し得る。

【0101】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００のＣＤ２００Ｒ１への結合を減少、阻害、及び／又は完全にブロックし、それによって、Ｔ細胞の活性化を含む、ＣＤ２００Ｒ１によって媒介される免疫調節及び／又は免疫シグナル伝達をブロックする。ＣＤ２００発現細胞に結合するＣＤ２００Ｒ１発現細胞によって媒介されるこれらの免疫調節及び／又は免疫シグナル伝達経路を阻害する抗体の能力は、本開示の実施例に記載の様々な細胞ベースのアッセイを含む既知の細胞ベースのアッセイを使用してインビトロでアッセイすることができる。したがって、いくつかの実施形態において、本開示のＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００へのＣＤ２００Ｒ１の結合によって媒介される細胞のシグナル伝達経路を減少させ、阻害し、及び／又は完全にブロックする能力に基づく、以下の機能特性のうちの１つ以上を特徴とする。

【0102】

少なくとも１つの実施形態において、本開示のＣＤ２００Ｒ１抗体は、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔ（配列番号１）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆ（配列番号２）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ａｌｔ（配列番号３）、及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ｒｅｆ（配列番号４）へのｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃの結合を、ＥＬＩＳＡによって測定したときに、１０ｎＭ以下、７ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下のＩＣ_５０でブロックする。

【0103】

少なくとも１つの実施形態において、本開示のＣＤ２００Ｒ１抗体は、２．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＩＣ_５０で、細胞上に発現されたｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１へのｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃの結合をブロックし、任意選択的に、細胞は、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１を安定して発現するＵ９３７細胞である。

【0104】

少なくとも１つの実施形態において、本開示のＣＤ２００Ｒ１抗体は、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．１ｎＭの抗体ＩＣ_５０濃度で、ヒトＴ細胞上で発現されるＣＤ２００Ｒ１へのＣＤ２００の結合をブロックし、任意選択的に、細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞である。

【0105】

少なくとも１つの実施形態において、本開示のＣＤ２００Ｒ１抗体は、２．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下のＥＣ_５０でヒトＴ細胞に結合し、任意選択的に、ヒトＴ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0106】

少なくとも１つの実施形態において、本開示のＣＤ２００Ｒ１抗体は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ、又は１０ｎＭ以下の抗体濃度で、ヒト腫瘍細胞からのＩＦＮγ産生を少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、又はそれ以上増加させ、任意選択的に、腫瘍細胞型は、結腸直腸、子宮内膜、肺、黒色腫、卵巣、膵臓、又は前立腺の型から選択される。

【0107】

少なくとも１つの実施形態において、ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＩｇＧ対照と比較して、ＣＤ２００－ＦｃコートされたヒトＴ細胞からのＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、又はそれ以上増加させる。

【0108】

少なくとも１つの実施形態において、ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣｄ８＋Ｔ細胞の活性化を、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍以上増加させる。

【0109】

少なくとも１つの実施形態において、ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００とＣＤ２００Ｒ１発現細胞株との間の結合によって誘導されるＮＦｋβ転写をブロックし、任意選択的に、細胞株は、ＣＤ２００Ｒ１発現Ｋ５６２レポーター細胞及びＣＤ２００発現２９３Ｔ細胞である。

【0110】

少なくとも１つの実施形態において、本開示のＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００Ｒ１媒介性細胞シグナル伝達をブロックすることができ、ＣＤ２００Ｒ１活性のアゴニストとして作用しないか、そうでなければ不注意にＣＤ２００Ｒ１シグナル伝達を刺激する。ＣＤ２００Ｒ１アゴニスト活性の誘導の１つの実験的指標は、ＣＤ２００で処理した細胞におけるｐＤｏｋ２活性の誘導である。したがって、少なくとも１つの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、可溶性ＣＤ２００－Ｆｃで処理されたＵ９３７単球細胞株におけるｐＤｏｋ２活性の誘導をブロックする。

【0111】

２．抗体断片
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、抗体断片であり得る。本開示の結合決定基とともに有用な抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片、単価、単一ドメイン抗体、一アーム若しくは単一アーム抗体、及び本明細書に記載され、当技術分野で知られている他の断片が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のいくつかの実施形態において、抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）、単一アーム抗体、及びｓｃＦｖからなる群から選択される抗体である。

【0112】

様々な抗体断片の概説については、例えば、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９－１３４（２００３）を参照。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照。ＷＯ９３／１６１８５、並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。他の一価抗体形態は、例えば、ＷＯ２００７／０４８０３７、ＷＯ２００８／１４５１３７、ＷＯ２００８／１４５１３８、及びＷＯ２００７／０５９７８２に記載されている。一価の単一アーム抗体は、例えば、ＷＯ２００５／０６３８１６に記載されている。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる２つの抗原結合部位を有する抗体断片である（例えば、ＥＰ０４０４０９７、ＷＯ９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１２９－１３４（２００３）及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）。

【0113】

いくつかの実施形態において、抗体断片は、抗体の重鎖可変ドメインの全部又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全部又は一部を含む単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照）である。

【0114】

抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解消化、並びに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ又はファージ）による産生を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製され得る。

【0115】

３．キメラ及びヒト化抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、キメラ抗体であり得る。（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）に記載のキメラ抗体を参照）。一実施形態において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変換された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含むことができると企図される。

【0116】

いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応残基で置換される。

【0117】

ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ，．１３：１６１９－１６３３（２００８）で概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´Ｉ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＨＶＲ）グラフティングの記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」の記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」の記載）、並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「ガイド下選択」アプローチの記載）で更に記載されている。

【0118】

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）、軽鎖又は重鎖の可変領域の特定サブグループのヒト抗体共通配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２６２３（１９９３）を参照）、ヒト成熟（体細胞変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）、及びＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１ １－２２６１８（１９９６）を参照）。

【0119】

４．ヒト抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ヒト抗体であり得る。ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）で概説されている。ヒト抗体は、インタクトヒト抗体又は抗原接種に応答してヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に置き換わる、又は染色体外に存在するか、若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、米国特許第５，７７０，４２９号のＨＵＭＡＢ（登録商標）技術、米国特許第７，０４１，８７０号のＫ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術及び米国特許出願公開第２００７／００６１９００号のＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術も参照）。このような動物によって生成されたインタクト抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、更に改変され得る。

【0120】

ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法で作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）にも記載されている。更なる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号に記載されている方法が挙げられる（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を説明する）。ヒトハイブリドーマ技術（すなわち、トリオーマ技法）はまた、例えば、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）、及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。

【0121】

ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。このような可変ドメイン配列を、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法を以下に記載する。

【0122】

５．ライブラリー由来の抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、所望する活性又は複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、そのようなライブラリーを所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で知られている。本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体ヒト化型の親和性成熟変異体を調製するためのファージディスプレイの使用は、本明細書に開示される実施例に記載されている。このようなライブラリー由来の抗体を産生するための他の方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２－５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１－２）：１ １９－１３２（２００４）に見出すことができる。

【0123】

６．多重特異性抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる結合部位を有し、各々が異なる抗原に対する結合特異性を有し、そのうちの少なくとも１つがＣＤ２００Ｒ１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。

【0124】

いくつかの実施形態において、多重特異性抗体は、ＣＤ２００Ｒ１に対する特異性と、免疫調節、免疫シグナル伝達を媒介する、及び／又はがん若しくは腫瘍細胞上で発現される、別の抗原に対する特異性と、を含む二重特異性抗体である。二重特異性抗体のいくつかの実施形態において、他の特異性は、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＶＲＩＧ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＳＩＲＰａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＣＤ３３、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、ＧＰＣ３、ＣＤ７３、ＣＤ８３、ＣＤ３９、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ２２６、及びＶＩＳＴＡから選択される免疫チェックポイント分子である抗原に対するものである。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１二重特異性抗体、抗体が特異性を有する他の抗原は、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＶＲＩＧ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、及びＣＲＴＡＭから選択される。

【0125】

いくつかの実施形態において、結合部位のうちの少なくとも１つは、細胞毒性剤に特異的に結合する。例示的な実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、二重特異性抗体であり、ＣＤ２００Ｒ１を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化するために使用することができる。

【0126】

多重特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現が含まれるが、これに限定されない（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１０：３６５５（１９９１）を参照）。「ノブインホール」技術も、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体に有用な二重特異性抗体を生成するために使用することができる。ノブインホール技術の技法は当技術分野で知られており、例えば米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている。

【0127】

多重特異性抗体は、ホモ二量体ではなくＦｃヘテロ二量体抗体分子の形成に有利な「静電ステアリング」効果の操作（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体又は断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）、二重特異性抗体を産生するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照）、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照）又は三重特異性抗体（例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０（１９９１）を参照）によっても作製することができる。

【0128】

７．抗体変異体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の変異体も企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善された抗体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換が含まれる。最終構築物がＣＤ２００Ｒ１抗原結合の所望の特徴を保有するという条件で、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達することができる。

【0129】

Ａ．置換、挿入、及び欠失の変異体
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるものに加えて、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗ＣＤ２００Ｒ１抗体変異体が提供される。変異誘発の部位には、ＨＶＲ及びＦＲを含めることができる。典型的な「保存的」アミノ酸置換及び／又は共通側鎖のクラス又は特性に基づく置換は、当技術分野で周知であり、本開示の実施形態で使用することができる。本開示は、アミノ酸側鎖クラスの１つのメンバーが別のクラスからのアミノ酸と交換される非保存的アミノ酸置換に基づく変異体も企図する。

【0130】

アミノ酸側鎖は典型的には、次のクラス又は共通の特性に従ってグループ化される。（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ノルロイシン、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖配向の影響：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0131】

抗体へのアミノ酸置換、及び所望する機能、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについての後続のスクリーニングのための技法は当技術分野で周知である。

【0132】

アミノ酸置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含み得る。一般に、更なる研究用に選択された結果として生じる変異体は、親抗体と比べて特定の生物学的特性が改変され（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）、かつ／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、便宜上、例えば、本明細書の実施例に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して生成され得る。簡潔に述べると、１つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体がファージに提示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0133】

変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」である（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５を参照）。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、中性又は負電荷のアミノ酸（例えば、Ａｌａ又はポリアラニン）で置き換えられ、抗体と抗原との相互作用が影響するか否かを決定する。アミノ酸位置に更なる置換を導入し、最初の置換に対する機能感受性を実証することができる。あるいは、又は更に、抗体と抗原との接触点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造を決定することができる。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的化又は排除され得る。変異体をスクリーニングして、所望の特性が含まれているか否かを決定できる。

【0134】

アミノ酸配列の挿入には、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さにわたるアミノ酸及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。

【0135】

抗体親和性を改善するために、ＨＶＲで置換され得る。かかる変更は、「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）で行うことができ、得られた変異体Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌは、結合親和性について試験される。いくつかの実施形態において、親和性成熟は、二次ライブラリーから構築及び再選択することによって実行することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）を参照）。多様性を導入する別の方法には、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一回に４～６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向アプローチが含まれる。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定することができる。特に、ＨＶＲ－Ｈ３及びＨＶＲ－Ｌ３が標的化されることが多い。

【0136】

いくつかの実施形態において、置換、挿入、又は欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的変更（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）がＨＶＲにおいてなされ得る。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」の外部にあり得る。上記で提供された変異体Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列のいくつかの実施形態において、各ＨＶＲは、変更されていないか、又はわずか１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換を含む。

【0137】

Ｂ．グリコシル化変異体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増減するように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を変更することによって実行することができ、それにより１つ以上のグリコシル化部位を作成又は除去することができる。

【0138】

抗体がＦｃ領域を含む実施形態において、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を変更することができる。典型的には、哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインの約２９７番目のアスパラギン（「Ｎ２９７」）周辺へのＮ－結合によって結合された分岐、二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２６－３２（１９９７）を参照）。オリゴ糖には、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」内のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースなどの様々な炭水化物が含まれ得る。いくつかの実施形態において、抗体のＦｃ領域のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する変異体を作成することができる。

【0139】

いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、親抗体の変異体であり得、変異体は、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を含む。例えば、そのような抗体中のフコース量は、約１％～約８０％、約１％～約６５％、約５％～約６５％、又は約２０％～約４０％であり得る。フコース量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６を参照）によって測定されるように、Ｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の総量と比べて、Ａｓｎ２９７で糖鎖内のフコース平均量を算出することにより決定できる。Ｎ２９７とは、Ｆｃ領域の約２９７番目に位置するアスパラギン残基を指すが（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）、Ｎ２９７は、抗体のわずかな配列変異のため、２９７番目の上流又は下流±約３アミノ酸、すなわち、２９４～３００番目の間にも位置し得る。

【0140】

いくつかの実施形態において、フコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号又は同第２００４／００９３６２１号を参照。「脱フコシル化」又は「フコース欠失」抗体の例及びそれらを調製するための関連方法は、例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）に開示されている。

【0141】

脱フコシル化抗体を産生するのに有用な細胞株には、タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｄ３ ＣＨＯ細胞（例えば、Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，．２４９：５３３－５４５（１９８６）、ＵＳ２００３／０１５７１０８、及びＷＯ２００４／０５６３１２を参照）、及びアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８などのノックアウト細胞株、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７）が含まれる。

【0142】

Ｃ．Ｆｃ領域変異体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、Ｆｃ領域（すなわち、Ｆｃ領域変異体）に１つ以上のアミノ酸修飾を含み得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体とともに有用であり、当技術分野で知られている広範囲のＦｃ領域変異体を以下に記載する。

【0143】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、エフェクター機能が変更されたＦｃ領域変異体とすることができる。いくつかの実施形態において、エフェクター機能が変更された抗体は、親抗体のエフェクター機能の一部（全てではない）を保有できるか、低いエフェクター機能を保有するか、又はエフェクター機能のいずれも保有しない（例えば、エフェクターレス）。エフェクターレスＦｃ領域変異体は、エフェクター機能（ＡＤＣＣなど）が不要又は有害である、及び／又は抗体のインビボ半減期が重要である、特定の適用においてより望ましいものとすることができる。

【0144】

エフェクター機能が低減した、又はエフェクターレスであるＦｃ領域変異体抗体は、次のＦｃ領域、すなわち２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９番目の１つ以上にアミノ酸置換を含み得る。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号を参照）。このようなＦｃ領域変異体は、２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７番目のうちの２つ以上でのアミノ酸置換を含み得る。このようなＦｃ領域変異体は、２６５及び２９７の両残基のアラニンへの置換も含み得る（例えば、米国特許第７，３３２，５８１号を参照）。いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、エフェクターレスＦｃ領域変異体である。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のエフェクターレスＦｃ領域変異体は、Ｎ２９７Ｇ（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ

【0145】

【数1】

ａｎｄ ＦｃＲｎ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ１ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ

【0146】

【数2】

＊”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６（９）：６５９１－６６０４（２００１）を参照）、Ｎ２９７Ａ（例えば、Ｆｒｉｅｎｄ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＣＤ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ”，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６８（１１）：１６３２－７（１９９９）を参照）、Ｐ３３１Ｓ／Ｋ３２２Ａ（例えば、Ｔａｗａｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｌａｙｓ ａ Ｋｅｙ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｍｏｎｋｅｙｓ ａｎｄ Ｒａｔｓ”，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８０（４）：２２９４－８（２００８）を参照）、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ（例えば、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｃ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４ Ｒｅｔａｉｎｓ Ｉｔｓ Ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ＣＤ４ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｂｕｔ Ｄｏｅｓ Ｎｏｔ Ｄｅｐｌｅｔｅ ＣＤ４（＋）Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉＮ Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ”，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，９８（２）：１６４－７４（２００１）を参照）、又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（また「ＬＡＬＡＰＧ」と称する）（例えば、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２９（１０）：４５７－４６６（２０１６）、Ｌｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，”Ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ Ｔｈａｔ Ｍａｉｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９２（９）：３９００－３９０８（２０１７）を参照）から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。他の実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のエフェクターレスＦｃ領域変異体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む（Ｗｏｏｄｌｅ，Ｅ．Ｓｔｅｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６８（５）：６０８－６１６（１９９９））。

【0147】

したがって、いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のエフェクターレスＦｃ領域変異体は、Ｎ２９７Ａ又はＮ２９７Ｇから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のエフェクターレスＦｃ領域変異体は、アミノ酸置換Ｐ３３１Ｓ／Ｋ３２２Ａのペアを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のエフェクターレスＦｃ領域変異体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）を含む。抗ＣＤ２００Ｒ１がアイソタイプＩｇＧ２又はＩｇＧ４のものであるいくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ及び／又はＬ２３５Ｅを含む。

【0148】

ＦｃＲへの結合が改善又は減少したＦｃ領域変異体は、例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）に開示されている。ＡＤＣＣが改善されたＦｃ領域変異体は、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４番目（ＥＵ付番に基づく）に１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃｌｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が変更された（すなわち、改善あるいは減少した）Ｆｃ領域変異体。半減期が増加し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善されたＦｃ領域変異体は、例えば、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。かかるＦｃ領域変異体は、２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、及び４３４番目のうちの１つ以上でアミノ酸置換を含む。半減期が増加した他のＦｃ領域変異体には、例えば、ＵＳ７６５８９２１Ｂ２（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている２５２、２５４、及び２５６番目のＹＴＥ変異のセット（すなわち、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）が含まれる。Ｆｃ領域変異体の他の例は、例えば、米国特許第５，６４８，２６０号及び同第５，６２４，８２１号及びＷＯ９４／２９３５１に見出すことができる。

【0149】

一般に、インビトロ及び／又はインビボの細胞傷害アッセイを実行して、Ｆｃ領域変異体におけるＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／喪失を確認する（ｃｏｎｆｉｒｍ）ことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９－１５０２（１９８５）、第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用することができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価され得る。抗体がＣｌｑに結合できないため、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃｌｑ結合アッセイを実行することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣｌｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５－１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，ＳＷ１０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定は、当技術分野で知られている方法を使用して実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照）。

【0150】

Ｄ．システイン操作変異体
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、反応性チオール基を作成するために、特定の非ＨＶＲ位置でシステイン残基で置換され得ることが企図される。このような操作された「チオＭＡｂ」は、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、薬物部分又はリンカー－薬物部分に抗体を結合することによって免疫複合体を作成するために使用され得る。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成することができる。いくつかの実施形態において、以下の抗体残基のうちのいずれか１つ以上は、システインで置換され得る。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ付番）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）、重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）。

【0151】

Ｅ．抗体誘導体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、非タンパク質性部分で更に修飾（すなわち、誘導体化）され得る。抗体の誘導体化に好適な非タンパク質性部分には、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸のホモポリマー又はランダムコポリマー、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体の修飾は、メトキシ－ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用して実行することができる。ポリマーは、任意の分子量のものであり、分岐又は非分岐であり得る。抗体に結合するポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子又は異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、抗体の特定の特性又は機能を含むがこれらに限定されない考慮事項、例えば、抗体誘導体が定義する条件下で療法に使用されるか否か、に基づいて決定することができる。

【0152】

８．免疫複合体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、免疫複合体でもあり得、免疫複合体は、１つ以上の細胞毒性剤に結合した抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む。本開示によって企図される好適な細胞毒性剤には、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体が含まれる。

【0153】

いくつかの実施形態において、免疫複合体は、本明細書に記載されるような抗ＣＤ２００Ｒ１抗体が１つ以上の薬物と結合する抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）である。

【0154】

いくつかの実施形態において、本開示の免疫複合体は、ＣＤ２００Ｒ１媒介性の疾患又は状態を治療するための薬物又は治療薬と結合した本明細書に記載の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む。

【0155】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むがこれらに限定されない、酵素活性毒素又はその断片に結合することができる。

【0156】

いくつかの実施形態において、本開示の免疫複合体は、放射性同位体と結合した本明細書に記載の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体（すなわち、放射性複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））を含む。このような放射性複合体の産生には、様々な放射性同位体が利用できる。例としては、限定されないが、^６４Ｃｕ、^８９Ｚｒ、^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１２Ｂｉ、^３２Ｐ、^２１２Ｐｂ、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。いくつかの実施形態において、放射性同位元素は、^１８Ｆ、ＦＤＧであるか、又はそれを含むことができる。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、シンチグラフィー検出用の放射性同位体、又はＮＭＲ検出又はＭＲＩ用のスピン標識を含み得る。好適な放射性同位体又はスピン標識には、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^１３Ｃ、^１９Ｆ、^１５Ｎ、^１７Ｏ、Ｇｄ、Ｍｎ、及びＦｅの様々な同位体が含まれ得る。

【0157】

抗ＣＤ２００Ｒ１抗体と細胞毒性剤との免疫複合体は、タンパク質との結合に好適な幅広い周知の二機能性試薬及び化学物質を使用して作製することができる。このような試薬には、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＱ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス－（ｐ－アジドベンゾイル）－ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン－２，６－ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）が含まれるが、これらに限定されない。

【0158】

本開示の免疫複合体を調製するための試薬は、市販の「架橋」試薬、例えば、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａを参照）も含み得る。

【0159】

９．合成抗体
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、免疫グロブリン足場若しくはフレームワーク以外の足場若しくはフレームワーク、例えば、代替タンパク質足場、又は人工ポリマー足場にグラフティングされた抗ＣＤ２００Ｒ１免疫グロブリン（例えば、ＨＶＲ－Ｌ１など）からのＣＤＲ又はＨＶＲのセットを含む合成抗体であり得る。

【0160】

本開示の合成抗体を調製するために企図される例示的な代替タンパク質足場には、フィブロネクチン、ネオカルチノスタチンＣＢＭ４－２、リポカリン、Ｔ細胞受容体、プロテインＡドメイン（プロテインＺ）、Ｉｍ９、ＴＰＲタンパク質、亜鉛フィンガードメイン、ｐＶＩＩＩ、鳥類膵臓ポリペプチド、ＧＣＮ４、ＷＷドメインＳｒｃ相同性ドメイン３、ＰＤＺドメイン、ＴＥＭ－１ベータラクタマーゼ、チオレドキシン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、ＰＨＤ－ｆｍｇｅｒドメイン、ＣＬ－２、ＢＰＴＩ、ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチン、ＬＡＣＩ－Ｄ１、ＬＤＴＩ、ＭＴＩ－ＩＩ、サソリ毒素、昆虫デフェンシン－Ａペプチド、ＥＥＴＩ－ＩＩ、Ｍｉｎ－２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、チトクロームｂ－５６２、Ｌｄｌ受容体ドメイン、ガンマ－クリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン、及び／又はＣ型レクチン様ドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。

【0161】

合成抗体に有用な例示的人工ポリマー（非タンパク質）の足場は、例えば、Ｆｉｅｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）“Ｎｏｎ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，”ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｅｄｓ．Ｓ．Ｄｕｂｅｌ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．、Ｇｅｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，１３：２４５－２５５（２００９）、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３（１０）：１２５７－１２６８（２００５）に記載されている。

【0162】

ＩＶ．組換え方法及び組成物
本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、抗体産生の分野で周知の組換え方法及び材料を使用して産生することができる。いくつかの実施形態において、本開示は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸は、Ｖ_Ｌを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶ_Ｈを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードすることができる。いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体をコードする核酸配列を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。いくつかの実施形態において、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体をコードする核酸配列を含む宿主細胞が提供される。一実施形態において、宿主細胞は、抗体のＶ_Ｌを含むアミノ酸配列及び抗体のＶ_Ｈを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターで形質転換されている。別の実施形態において、宿主細胞は、抗体のＶ_Ｌを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶ_Ｈを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターで形質転換されている。

【0163】

組換え法のいくつかの実施形態において、使用される宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの真核細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０）である。少なくとも１つの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の作製方法が提供され、この方法は、上で提供されるように、抗体の発現に好適な条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することとを含む。

【0164】

簡潔に述べると、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の組換え産生は、抗体をコードする核酸を単離し（例えば、本明細書に記載されるように）、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のためにこの核酸を１つ以上のベクターに挿入することによって実行される。このような核酸は、当技術分野で周知の従来手順を使用して（例えば、所望の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定される。抗体をコードするベクターをクローニング又は発現するための好適な宿主細胞及び培養方法は、当技術分野で周知であり、原核細胞又は真核細胞が含まれる。典型的には、発現後、抗体は、可溶性画分で細胞ペーストから単離され、更に精製され得る。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌又は酵母株を含む、抗体をコードするベクターの好適なクローニング又は発現宿主であり、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２４：２１０－２１５（２００６）を参照）。

【0165】

本開示のグリコシル化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来し得る。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫の細胞が含まれる。特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクション用に、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる（例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、及び同第７，１２５，９７８号を参照）。

【0166】

本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の産生に有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０）を参照）、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０などの骨髄腫細胞株、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶｌ株、ヒト胚性腎臓系統（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７）に記載されている２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されているＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶｌ）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲ１細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）及びＵＳ６，２３５，４９８）、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ５（ＭＲＣ５）細胞（例えば、ＡＴＣＣより入手可能であり、ＣＣＬ－１７１とも称される）、及びＦｏｒｅｓｋｉｎ４（ＦＳ－４）細胞（例えば、Ｖｉｌｃｅｋ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２８４：７０３－７１０（１９７７）、Ｇａｒｄｎｅｒ＆Ｖｉｌｃｅｋ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４４：１６１－１６８（１９７９）、及びＰａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：５３４１－５３４５（１９８０））が挙げられる。抗体産生に好適である有用な哺乳動物宿主細胞株の一般的概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照。

【0167】

Ｖ．抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の医薬組成物及び製剤
本開示は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む医薬組成物及び医薬製剤も提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、医薬組成物の唯一の有効成分である。このような医薬製剤は、所望の純度を有する抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を、１つ以上の薬学的に許容される担体と混合することによって調製することができる。典型的には、このような抗体製剤は、水溶液（例えば、米国特許第６，１７１，５８６号、及びＷＯ２００６／０４４９０８を参照）として、又は凍結乾燥製剤（例えば、米国特許第６，２６７，９５８号を参照）として調製することができる。

【0168】

薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒である。このような薬学的に許容される広範囲の担体が当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照）。本開示の製剤に有用で薬学的に許容される例示的な担体には、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0169】

本開示の製剤に有用な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）など、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（例えば、ｒＨｕＰＨ２０又はＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などの間質性薬分散剤も含み得る（例えば、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号を参照）。

【0170】

本明細書に開示されるような製剤は、抗ＣＤ２００Ｒ１に加えて、必要に応じて、製剤が投与される対象において治療される特定の兆候に有用な有効成分を含み得ることも企図される。好ましくは、任意の有効成分は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体活性の活性と相補的な活性を有し、その活性は互いに悪影響を及ぼさない。

【0171】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体と、チェックポイント阻害剤などであるがこれに限定されない追加の有効成分とを含む。そのような実施形態で有用なチェックポイント阻害剤には、免疫チェックポイント分子である抗原に対する特異性を含む二次抗体が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、二次抗体は、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＶＲＩＧ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＳＩＲＰａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＣＤ３３、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、ＧＰＣ３、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ１、ＣＤ７３、ＣＤ８３、ＣＤ３９、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ２２６、及びＶＩＳＴＡから選択される免疫チェックポイント分子に対する特異性を含む。

【0172】

少なくとも１つの実施形態において、医薬組成物は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及び追加の有効成分を含み、追加の有効成分は、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＶＲＩＧ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、及びＣＲＴＡＭから選択される免疫チェックポイント分子に対する特異性を含む抗体である。

【0173】

少なくとも１つの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及び追加の有効成分を含む医薬組成物であって、追加の有効成分が免疫チェックポイント分子ＰＤ１に対する特異性を含む抗体である。本明細書に開示される医薬組成物の実施形態において有用なＰＤ１に対する特異性を含む例示的な抗体には、ドスタリマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、及びピジリズマブが含まれるが、これらに限定されない。

【0174】

有効成分は、例えば、コアセルベーション技法によって、又は界面重合によって、例えば、コロイド薬送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンで、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセルによって、調製されたマイクロカプセルに封入され得る。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0175】

いくつかの実施形態において、製剤は、抗体及び／又は他の有効成分の徐放性調製物であり得る。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルの形態である。

【0176】

典型的には、対象に投与される本開示の製剤は滅菌性である。滅菌製剤は、よく知られた技法を使用して、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に調製することができる。

【0177】

ＩＶ．使用及び治療方法
本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む組成物又は製剤のいずれも、いかなる方法又は使用にも、例えば、ＣＤ２００Ｒ１に特異的に結合し、それによって、免疫調節又はシグナル伝達に関係する細胞表面受容体としての、ＣＤ２００Ｒ１の機能、特にＴ細胞又はＮＫ細胞の活性化を負に制御する（又は、抑制する）際のＣＤ２００Ｒ１の機能、を阻害、低減及び／又は完全にブロックするそれらの能力を利用する治療法において、使用できることが企図される。

【0178】

細胞表面糖タンパク質ＣＤ２００は、ＣＤ２００Ｒ１の天然の結合標的である。しかしながら、ＣＤ２００は、ニューロン、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、リンパ系細胞など、様々なヒト細胞でより広く発現しており、ＣＤ２００Ｒ１とそのリガンドであるＣＤ２００との結合は、免疫抑制活性を示すことがわかっている。したがって、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００Ｒ１のＣＤ２００への特異的結合を阻害、低減、及び／又は完全にブロックすることを含む治療方法で使用できることが企図される。

【0179】

ＣＤ２００Ｒ１の免疫調節及び／又は免疫シグナル伝達活性、特にリンパ球活性化に対するＣＤ２００Ｒ１の免疫抑制効果を阻害、低減、及び／又は完全にブロックすることによって治療できる可能性のある疾患、障害、及び状態が、数多く存在する。疾患、障害、及び状態の範囲には、がんが含まれるが、これに限定されない。

【0180】

例えば、特定のタンパク質（例えば、ＰＤ１）の免疫阻害作用をブロックする薬剤が、副腎がん、膀胱がん、肉腫、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）がん（固形ＭＳＩがんを含む）、ＴＭＢ（腫瘍変異負荷）高腫瘍、ミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、ＥＧＪ腺がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん（例えば、消化管カルチノイド（ＧＩカルチノイド））、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞がん、腎臓がん、肝臓がん、黒色腫、中皮腫（例えば、胸膜中皮腫）、非小細胞肺がん、卵巣がん、上皮性卵巣がん、子宮内膜がん、小児固形がん、膵臓がん、前立腺がん、脾臓がん、小細胞肺がん、精巣がん、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様がん又は甲状腺濾胞がん）、血液がん（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、白血病、リンパ腫、骨髄腫）、腎細胞がん腫、明細胞腎がん、神経内分泌腫瘍（例えば、悪性褐色細胞腫及び傍神経節腫）、及び子宮などの、広範囲にわたるがんを治療するために現在開発中である。いくつかの実施形態において、がんは、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、皮膚がん（例えば、黒色腫）、膵臓がん、子宮内膜がん、前立腺がん、結腸直腸がん、卵巣がん、中皮腫、及び膀胱がんから選択される。したがって、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む組成物又は製剤のいずれも、上に挙げたがんのいずれかの治療のための方法又は使用に使用できることが企図される。いくつかの実施形態において、がんは、肺がん（例えば、小細胞肺がん）、皮膚がん（例えば、黒色腫）、膵臓がん、子宮内膜がん、前立腺がん、結腸直腸がん、卵巣がん、中皮腫及び膀胱がんから選択される。いくつかの実施形態において、本開示は、対象のがんを治療する方法を提供し、本方法は、治療有効量の本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体をそれを必要とする対象に投与すること、又は、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0181】

以下の実施例を含む本明細書に開示されるように、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００にＣＤ２００Ｒ１結合を低減させ、阻害し、及び／又は、ブロックし、それにより、免疫抑制性シグナル伝達経路を変化させる能力を有する。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、対象におけるＣＤ２００Ｒ１媒介性の疾患又は状態を治療する方法を提供し、本方法は、治療有効量の本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を対象に投与すること、又は、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む治療有効量の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。同様に、いくつかの実施形態において、本開示は、対象の細胞に発現されるＣＤ２００への結合によって媒介される疾患を治療する方法を提供し、本方法は、治療有効量の本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を対象に投与すること、又は、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む治療有効量の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。

【0182】

治療有効量の医薬組成物は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体又は少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含むことができる。治療有効量の医薬組成物は、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体又は少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含むことができる。治療有効量の医薬組成物は、少なくとも約０．３ｍｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、少なくとも約１．０ｍｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、少なくとも約３．０ｍｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、少なくとも約１０ｍｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、少なくとも約３０ｍｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、少なくとも約１００ｍｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、少なくとも約３００ｍｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、少なくとも約９００ｍｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、又は少なくとも約１４００ｍｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含むことができる。治療有効量の医薬組成物は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、又は少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含むことができる。いくつかの実施形態において、治療有効量の医薬組成物は、前述の任意の２つの値の間の範囲に存在する抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の量を含むことができる。

【0183】

いくつかの実施形態において、医薬組成物の治療有効量は、顕著なオフターゲット効果を誘発することができない。例えば、場合によっては、１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の有意なオフターゲット効果をなくすことができる。別の例として、場合によっては、２０ｍｇ／ｋｇ以下の用量、又は１００ｍｇ／ｋｇ以下の用量で抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の有意なオフターゲット効果をなくすことができる。いくつかの実施形態において、オフターゲット効果は、ヒト組織における非特異的結合（例えば、ＢＶ ＥＬＩＳＡによって測定される）又は交差反応性を含むことができる。いくつかの医薬組成物では、本明細書に提供される別の治療有効量で、又は本明細書に提供される任意の２つの治療有効量の範囲内で、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の有意なオフターゲット効果をなくすことができる。

【0184】

本治療方法に従う抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、組成物、又は医薬製剤の投与は、対象の抗ＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患の進行から対象を保護及び／又は治療する、抗体誘導性治療効果を提供する。いくつかの実施形態において、本治療方法は、抗ＣＤ２００Ｒ１媒介性の疾患又は状態を予防及び／又は治療するために、当業者に知られている１つ以上の追加の治療剤の投与又は治療を更に含むことができる。１つ以上の追加薬剤の投与を含むこのような方法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は個別の製剤に含まれる場合）、及び個別投与を包含し、その場合、抗体組成物又は製剤は、追加治療剤投与の前、同時、及び／又は後に投与され得る。

【0185】

本開示の治療方法のいくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体又は抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む医薬製剤は、薬剤を全身的に又は所望の標的組織に送達する任意の投与様式（ｍｏｄｅ ｏｆ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって対象に投与される。全身投与は、一般に、所望の標的部位、組織、又は器官への直接ではない部位で対象に抗体を投与する任意の様式を指し、抗体又はその製剤は、対象の循環系に入るため、代謝及び他の同様なプロセスを受ける。

【0186】

したがって、本開示の治療方法において有用な投与様式には、注射、注入、点滴、及び吸入が含まれ得るが、これらに限定されない。注射による投与には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳内脊髄、及び胸骨内の注射及び注入が含まれ得る。

【0187】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の医薬製剤は、抗体が腸内の不活性化から保護されるように製剤化される。したがって、本治療方法は、製剤の経口投与を含み得る。

【0188】

いくつかの実施形態において、薬剤としての本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む組成物又は製剤の使用も提供される。更に、いくつかの実施形態において、本開示は、薬剤、特にＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患を治療、予防又は阻害するための薬剤の製造又は調製における、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を含む組成物又は製剤の使用を提供する。更なる実施形態において、本薬剤は、ＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患の個体に有効量の薬剤を投与することを含む、ＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患を治療、予防又は阻害するための方法で使用するためのものである。特定の実施形態において、薬剤は、有効量の少なくとも１つの追加治療剤、又は治療を更に含む。かかる医薬品に使用できる例示的な追加の治療薬又は治療法としては、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＰＶＲＩＧ、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＳＩＲＰａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＣＤ３３、ＣＥＡ、Ｅｐｃａｍ、ＧＰＣ３、ＣＤ７３、ＣＤ８３、ＣＤ３９、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ２２６、及びＶＩＳＴＡなどの免疫チェックポイント分子に対する特異性を含む抗体が含まれるが、これらに限定されない。少なくとも１つの実施形態において、本開示の薬剤に存在する追加の治療薬又は治療法は、免疫チェックポイント分子ＰＤ１に対する特異性を含む抗体であり、ドスタリマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、及びピジリズマブから選択される抗体を含むが、これらに限定されない。

【0189】

更なる実施形態において、薬剤は、ＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患を治療、阻害又は予防するために薬剤の有効な量を対象に投与することを含む、対象のＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患を治療、阻害又は予防するために使用するものである。

【0190】

ＣＤ２００Ｒ１媒介性の疾患又は状態の予防又は治療のため、本開示の組成物及び製剤に含まれる抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の適切な投与量（単独で又は１つ以上の他の追加治療剤と併用して使用される場合）は、治療される特定の疾患又は状態、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるか否か、患者に投与された薬歴、患者の病歴及び抗体に対する応答、及び主治医の裁量に依存するだろう。本明細書に記載の組成物及び製剤に含まれる抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、一度に、又は一連の治療にわたって患者に適切に投与することができる。本明細書では、様々な時点にわたる単回投与又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。

【0191】

疾患の種類及び重症度に応じて、本開示の製剤中約１μｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、例えば、１回以上の個別投与によるか又は持続注入によるかを問わず、ヒト対象に投与するための初回の候補投与量である。一般に、抗体の投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、又はこれらのいずれか２つの間のいずれかの値（又はこれらの任意の組み合わせ）の１つ以上の用量をヒト対象に投与し得る。いくつかの実施形態において、ヒト対象に投与される用量は、約２０ｍｇ／ｋｇを超えることができる。

【0192】

いくつかの実施形態において、治療有効量をヒト対象などの対象に投与することができる。治療有効量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇと約１０ｍｇ／ｋｇの間の用量とすることができる。治療有効量は、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約２ｍｇ／ｋｇと約２０ｍｇ／ｋｇの間の用量とすることができる。治療有効量は、少なくとも約０．３ｍｇ、少なくとも約１．０ｍｇ、少なくとも約３．０ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約３００ｍｇ、少なくとも約９００ｍｇ、少なくとも約１４００ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約、前述の２つの値の間の範囲にある用量とすることができる。治療有効量は、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも、上記の２つの値の間の範囲にある任意の用量とすることができる。

【0193】

投与量の投与は、対象の状態に応じて、数日以上にわたって維持することができ、例えば、当技術分野で知られている方法によって決定されるように、ＣＤ２００Ｒ１媒介性疾患が十分に治療されるまで投与を続けることができる。いくつかの実施形態において、高い初回負荷量が投与され、その後、１回以上の低用量（例えば、１回以上の維持用量）が投与され得る。しかしながら、他の投与計画が有用な場合がある。投与量投与の治療効果の進行は、従来の技法及びアッセイによって監視することができる。

【0194】

したがって、本開示方法のいくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の投与は、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの１日投与量を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の投与量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇでの１日投与量を含む。

【実施例】

【0195】

本開示の様々な特徴及び実施形態は、下記の代表的な実施例で示され、これらは、例示を意図するものであり、限定するものではない。当業者は、特定の実施例が、その後に続く特許請求の範囲でより完全に説明されるように、本発明の例示にすぎないことを容易に理解するであろう。本出願に記載されている全ての実施形態及び特徴は、その中に含まれる全ての実施形態と互換性があり、組み合わせ可能であると理解されるべきである。

【0196】

実施例１：ＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドの生成
本実施例は、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を誘発及びスクリーニングする際に抗原として使用される様々なＣＤ２００Ｒ１ポリペプチド構築物の調製を例示する。

【0197】

Ａ．ＣＤ２００Ｒ１の作製
４つのｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１アイソフォームの細胞外ドメイン、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔ（配列番号１）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆ（配列番号２）、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ａｌｔ（配列番号ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ１－Ｒｅｆ（配列番号４）、並びにカニクイザルＣＤ２００Ｒ１（配列番号５）及びアカゲザルＣＤ２００Ｒ１（配列番号６）の類似の細胞外ドメインセグメントを、発現のために、ＣＭＶプロモーターを有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。構築物は、Ｃ末端に精製用タグ、ＧＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＳＧＧＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号９０）、及びＮ末端にマウスＩｇＧ１重鎖分泌シグナル、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号９１）を含む。組換えＣＤ２００Ｒ１ポリペプチドは、Ｅｘｐｉ２９３システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、標準的な説明書に従い使用し、発現させた。培地上清を３００ｇでの遠心分離によって清澄化し、続いて０．２２ミクロンフィルターで濾過した。濾過された培地からＡｋｔａ精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に連結されたＨｉｓｔｒａｐＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用した固定化金属アフィニティクロマトグラフィーにより、組換えＣＤ２００Ｒ１を精製した。Ｈｉｓｔｒａｐカラムの溶出液を、Ａｋｔａ精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に連結されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用した１×ＰＢＳ緩衝液でのサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。精製タンパク質の大部分を濃縮し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。

【0198】

Ｂ．ＣＤ２００の産生
ヒトＣＤ２００（配列番号７）及びカニクイザルＣＤ２００（配列番号８）の細胞外ドメインを、発現のために、ＣＭＶプロモーターを有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。構築物は、Ｎ末端にマウスＩｇＧ１重鎖分泌シグナル（配列番号９１）、及びＣ末端にＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ断片結晶化可能（Ｆｃ）領域（配列番号９）を含む。ＣＤ２００－Ｆｃポリペプチドは、Ｅｘｐｉ２９３システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、標準的な説明書に従い使用し、発現させた。培地上清を３００ｇでの遠心分離によって清澄化し、続いて０．２２ミクロンフィルターで濾過した。濾過された培地から、Ａｋｔａ精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続されたＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、組換えＣＤ２００－Ｆｃを精製した。精製されたＣＤ２００－Ｆｃは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅから１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０で溶出し、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８によって直ちに中和した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅの溶出液を、Ａｋｔａ精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に連結されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いて、１×ＰＢＳ緩衝液中のサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。精製タンパク質の大部分を濃縮し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。

【0199】

実施例２：ハイブリドーマ法を使用した抗ヒトＣＤ２００Ｒ１抗体の生成、スクリーニング及び特徴解析
この実施例は、マウスハイブリドーマ技術を使用して抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を生成する方法、並びに更なる特徴解析のための抗体のスクリーニング及び選抜方法を例示する。

【0200】

Ａ．免疫キャンペーン
ＢａｌｂＣ（２２．１のための）又はＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（１０Ｆ６のための）の免疫は、社内で産生させた、組換えｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ａｌｔポリペプチド（配列番号１）及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４－Ｒｅｆハプロタイプポリペプチド（配列番号２）細胞外ドメインによって実施した。Ｓｉｇｍａアジュバントシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を全ての免疫に使用した。力価は、以下に記載されるようにＥＬＩＳＡによって決定された。力価に基づいて選択されたマウスには、融合前にアジュバントなしで最終の追加免疫を与えた。１日後、脾臓を採取し、標準プロトコルに従って処理した。標準プロトコルに従って、ＰＥＧを使用して、脾細胞を骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクションＣＲＬ１５８０）と融合させ、標準的な技法を使用して９６ウェルプレートに約５０，０００骨髄腫細胞／ウェルで播種し、得られたコロニーのクローン性を最大化した。親ハイブリドーマは、ＡＨ（アザセリン＋ヒポキサンチン）を補充した選択培地を使用して選抜した。

【0201】

Ｂ．ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡスクリーニング
培養の１２～１４日後、上清を回収し、ヒトＣＤ２００Ｒ１でコーティングされた９６ウェルプレートを用いたＥＬＩＳＡによる一次スクリーニングに供した。９６ウェルＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）平底プレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｎｕｍｂｅｒ４３９４５４）を、５０μＬ／ウェルのタンパク質を用いて、コーティング緩衝液（０．０５Ｍカーボネート緩衝液、ｐＨ９．６又はホスフェート緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）中１μｇ／ｍＬの濃度で、４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を除去した後、ホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（ＥＬＩＳＡ希釈液）に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２００μＬのアッセイ／ブロッキング溶液を添加し、室温で１時間インキュベーションすることにより、非特異的結合をブロッキングした。

【0202】

Ｃ．ハイブリドーマのシークエンシング
モノクローナル抗ＣＤ２００Ｒ１ハイブリドーマのヒットを、標準ハイブリドーマ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）において、８０％超の生存率で、７～１０日間、Ｔ７５フラスコで１～３×１０^５の密度まで増殖させた。培養物から１～３００万個の細胞を１５ｍＬ ｆａｌｃｏｎチューブにて、３００ｇで５分間ペレット化した。細胞ペレットを５ｍＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁して洗浄した。ＰＢＳを除去し、細胞を１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。細胞を確実に溶解させるために、溶解物を２０Ｇ１ゲージ針（ＢＤ３０５１７５）を備えた１ｍＬシリンジに２０回通した。ＴＲＩＺＯＬ／細胞懸濁液を直ちにドライアイスで凍結し、処理するまで－８０℃で保存した。

【0203】

Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して溶解物から全ＲＮＡを単離し、５ｕｇの全ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ５’キット（Ｔａｋａｒａ）を使用して、５’－ＲＡＣＥ対応ハイブリドーマｃＤＮＡを生成させた。ｃＤＮＡから重鎖及び軽鎖特異的遺伝子断片を増幅するために、以下のプライマーを５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応でキットに含まれるユニバーサルプライマーと組み合わせて使用した。
（ａ）マウスＶＨファミリー特異的可変領域プライマーＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＧ（配列番号９２）、ＴＴＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴ（配列番号９３）、
（ｂ）マウスＶκファミリー特異的可変領域プライマー：ＧＡＴＣＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＧＧＡＣＧＣＣ（配列番号９４）、又は
（ｃ）マウスＶλファミリー特異的可変領域プライマー：ＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＧＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＴ（配列番号９５）、ＡＣＡＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＴ（配列番号９６）、ＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＧＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧ（配列番号９７）。

【0204】

ＰＣＲ産物を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を使用してｐＲＡＣＥにクローニングし、Ｍ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーを使用してＳａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して両方の鎖を配列決定した。７つの抗ＣＤ２００Ｒ１ハイブリドーマ（１０Ｆ６、９Ｂ８、５Ｄ１、１０Ａ２、１Ｆ３、１１Ｅ４、２２．１）のＶＬドメイン、ＶＨドメイン、及び超可変領域（ＨＶＲ）配列を表２にまとめる。１０Ｆ６、９Ｂ８、５Ｄ１、１０Ａ２、１Ｆ３、１１Ｅ４、２２．１及び市販の抗体ＯＸ１０８の配列のアラインメントを、図１ＡのＶＬドメイン及び図１ＢのＶＨドメインについて示す。

【0205】

Ｄ．１０Ｆ６及び２２．１のヒト化
マウス１０Ｆ６抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）配列を、ヒト生殖細胞系抗体配列対してアラインメントし、ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖（遺伝子ＩＤ：ＩＧＫＪ４．０２）及びヒト生殖細胞系列重鎖（遺伝子ＩＤ：ＩＧＨＪ４．０３）を、最も近いヒトフレームワークとして同定した（アラインメントを図２に示す）。マウス１０Ｆ６軽鎖及び重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、同定された最も近いヒトフレームワークにそれぞれ移植し、ヒト化抗体クローンを生成させた。このプロセスでは、マウス１０Ｆ６ ＶＬのＣＤＲ－Ｌ１の２４～３４位、ＣＤＲ－Ｌ２の５０～５６位、及びＣＤＲ－Ｌ３の８９～９７位を、ヒトκ軽鎖フレームワークアクセプターに移植し、マウス１０Ｆ６ ＶＨのＣＤＲ－Ｈ１の３１～３５位、ＣＤＲ－Ｈ２の５０～６１位、及びＣＤＲ－Ｈ３の９３～１０２を、ヒト重鎖フレームワークアクセプターに移植した。得られた１０Ｆ６のヒト化バージョン「ｈ１０Ｆ６」のＶＨドメイン、ＶＬドメイン、及びＨＶＲ配列を表３に要約する。ｈ１０Ｆ６の全長重鎖及び軽鎖配列も表３に示す。２２．１抗体を同様にヒト化して、ｈ２２．１抗体を得た。ｈ２２．１の関連する配列も表３に要約する。

【0206】

Ｅ．ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１の発現及び精製
ヒト化１０Ｆ６（ｈ１０Ｆ６）及びヒト化２２．１の重鎖及び軽鎖可変ドメインを合成し、ｐＲＫプラスミドにクローニングした。組換えヒト化１０Ｆ６ ＩｇＧ及び２２．１ ＩｇＧの発現は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、提供された説明書に従って行った。トランスフェクション反応では、重鎖と軽鎖のプラスミドの比率を１対１に保ち、トランスフェクション細胞を６日間培養してから採取した。組換えＩｇＧ分子は下記のプロトコルで精製した。細胞を除去するために３００ｇで１０分間遠心分離し、０．２２ミクロンのフィルターで濾過することにより、培地上清を清澄化した。清澄化した培地上清を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＰＯＲＯＳ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ Ａ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、穏やかに回転させながら室温で１．５時間インキュベーションした。インキュベーション後、スラリーをカラムに充填し、０．５ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ緩衝液２０カラム体積によって樹脂を洗浄し、次に、０．１Ｍの酢酸＋０．１５ＭのＮａＣｌの３カラム床体積によって溶出させた。溶出液を１Ｍ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０でｐＨ５．２にすばやく中和し、ＰＤ－１０カラム（ＧＥ）でＰＢＳ緩衝液にバッファー交換した。

【0207】

実施例３：抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の結合親和性、エピトープマッピング、及びブロッキング能力
この実施例は、実施例１及び２で調製された抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の結合及びエピトープ特性の試験を説明する。

【0208】

Ａ．ＣＤ２００Ｒ１の結合親和性の測定
ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１、ｈ１０Ｆ６の、様々なヒトＣＤ２００Ｒ１アイソフォーム（Ｉｓｏ１及びＩｓｏ４、代替又は参照ハプロタイプ）及びｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ１への結合親和性を測定するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）８Ｋ機器を使用してＳＰＲ測定を実施した。簡潔に述べると、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面有効成分Ｐ２０）へのＢｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ試薬（ＧＥ）の１：４希釈液を、２μＬ／分の流速でチップに適用した。動態測定では、３ｎＭのビオチン化ヒトＣＤ２００Ｒ１であった。次に、抗体ｈ１０Ｆ６を含むＨＢＳ－Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面有効成分Ｐ２０）中の、低濃度（０．２７ｎＭ）～高濃度（２００ｎＭ）までの３倍段階希釈液を、３７℃で注入した（流速：３０μＬ／分）。センサーグラムを記録し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン１．１．１．７４４２）により評価する前に、参照及び緩衝液の減算を行った。結合率（ｋ_ｏｎ）及び解離率（ｋ_ｏｆｆ）は、単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して算出された。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比率として算出した。ｈ１０Ｆ６のｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１への結合親和性は、６ｎＭのビオチン化ｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１を使用して、同じプロトコルで測定した。様々なｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１アイソフォームに対するｈ１０Ｆ６の結合親和性データを、以下の表４に要約する。

【0209】

【表4】

【0210】

結果：表４に示すように、ｈ１０Ｆ６は、市販の抗体ＯＸ１０８よりも１００倍～１０００倍高いｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１への結合親和性を有する。親和性は、結合アッセイで使用される特定のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１アイソフォームとハプロタイプに依存する。長いＣＤ２００Ｒ１アイソフォーム４（ｉｓｏ４）が優勢な形態であるため（ＡＬＳ、Ｔ１Ｄ、敗血症、多発性硬化症患者の、インターフェロンβ治療前後の、健常サンプル及び疾患時サンプルのＲＮＡ－ｓｅｑデータからのスプライスイベントの解析（例えば、Ｌｉｎｓｌｅｙ Ｐ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９（１０）：ｅ１０９７６０（２０１４）を参照）からの、ゲノムベースの予測及び定量化の方法を使用して実行された予測分析から、アイソフォーム４は８６％であると予測され、アイソフォーム１は１４％であると予測される）、また、参照ハプロタイプと代替ハプロタイプの頻度が集団間で本質的に分かれているため（Ｒｅｆ４６％及びＡｌｔ５４％）、抗ＣＤ２００Ｒ１治療薬は、主要なアイソフォーム４の参照ハプロタイプと代替ハプロタイプの両方に高い親和性で結合するはずである。ｈ１０Ｆ６は、ＯＸ１０８よりも１０００倍高い親和性でアイソフォーム４ａｌｔ及びアイソフォーム４ｒｅｆに結合する。対照的に、ＯＸ１０８はあまり一般的ではないアイソフォーム１に結合し、すなわち、優勢なアイソフォーム４に対する結合親和性と比較して１０倍の親和性があり、治療薬としてはあまり適していない。ｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に対するｈ１０Ｆ６の親和性は＞１０００ｎＭである。

【0211】

Ｂ．ＥＬＩＳＡで測定されたｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１のブロッキング
ｈ１０Ｆ６、及び６つの他のヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体（ｈ２２．１、ｈ９Ｂ８、ｈ５Ｄ１、ｈ１０Ａ２、ｈ１Ｆ３、及びｈ１１Ｅ４）を、以下のようにＥＬＩＳＡによってｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１のブロックについてアッセイした。９６ウェルＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３９４５４）を、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬヒトＣＤ２００－Ｆｃで４℃で一晩コーティングした。コーティング溶液を除去した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで非特異的結合をブロックし、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０を含むＰＢＳ（洗浄緩衝液）で５回洗浄した。ブロッキング期間中、ＮＵＮＣ Ｆプレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号２６９６２０）中で、０．５％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＥＬＩＳＡ緩衝液）を使用して、６０μｌ／ウェルの０．１ｎＭ又は０．４ｎＭビオチン化ヒトＣＤ２００Ｒ１、及び６０ｕｌ／ウェルの抗体（０．３ｕＭから始まる、１：４の連続希釈）を、室温で１時間調製した。次いで、抗原－抗体混合溶液を１００ｕｌ／ウェルでｈｕＣＤ２００－Ｆｃ被覆ウェルに室温で１５分間移した。次いで、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ＥＬＩＳＡ緩衝液で１：５０００に希釈した５０μｌ／ウェルのストレプトアビジンポリＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号２１１４０）を室温で１時間添加した。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、５０μＬ／ウェルでテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）マイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＶＷＲ、カタログ番号９５０５９－１５６）を添加することによって１５分間発色させた。酵素による発色を、５０μＬ／ウェルのＴＭＢ停止溶液（ＶＷＲ、カタログ番号９５０５９－２００）で停止させた。プレートを４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で分析した。

【0212】

結果：ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１の様々なアイソフォームに対するｈ１０Ｆ６、ｈ２２．１、ｈ９Ｂ８、ｈ５Ｄ１、ｈ１０Ａ２、ｈ１Ｆ３、ｈ１１Ｅ４のＥＬＩＳＡブロッキングデータを示すプロットを図３に示す。プロットによって示されるように、ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１、ｈ１０Ｆ６は、試験された他の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体よりもｈｕ－ＣＤ２００：ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１相互作用の良好なブロッカーである。

【0213】

ブロッキングＩＣ_５０は、ビオチン化ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１のコーティングｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃへの結合を５０％阻害するｈ１０Ｆ６の濃度を表す。表５に要約されたＩＣ_５０値によって示されるように、ｈ１０Ｆ６は、ブロッキングアッセイで使用される特定のｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１アイソフォーム及びハプロタイプに依存して、１．７ｎＭ～６．６ｎＭの間のＩＣ_５０でｈｕ－ＣＤ２００：ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１相互作用をブロックする。

【0214】

【表5】

【0215】

Ｃ．エピトープビニング分析
エピトープビニング実験を、実施例２に記載のように調製された６つのヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体ｈ１０Ｆ６、ｈ９Ｂ８、ｈ５Ｄ１、ｈ１０Ａ２、ｈ１Ｆ３、ｈ１１Ｅ４、及びｈ２２．１に対して実施した。エピトープビニング測定は、ＳＡＶ Ｏｃｔｅｔセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でビオチン化ヒトＣＤ２００Ｒ１を捕捉し、抗体１に結合し、続いて抗体２でプローブすることにより、ＯｃｔｅｔＲｅｄ９６で実施した。抗体２が抗体１結合ＣＤ２００Ｒ１に結合できる場合、２つの抗体を異なるビンに割り当てた。抗体２が抗体１結合ＣＤ２００Ｒ１に結合できなかった場合、２つの抗体を同じエピトープビンに割り当てた。

【0216】

結果：エピトープビニング実験の結果を表６に要約する。測定された６つの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＣＤ２００Ｒ１上の３つの異なるエピトープを認識するとして、エピトープビニングによって決定された。ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１は、ＣＤ２００Ｒ１上の重複するＣＤ２００ブロックエピトープに結合することが決定された。抗体ｈ９Ｂ８、ｈ１０Ａ２、ｈ５Ｄ１、及びｈ１Ｆ３はエピトープビンを共有しているが、ｈ１１Ｅ４はＣＤ２００Ｒ上の異なるエピトープに結合する。

【0217】

【表6】

【0218】

Ｄ．細胞ベースの、抗体によるｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１ブロッキングのアッセイ
ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のブロッキング活性を、以下の細胞ベースのアッセイで試験した。ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１（ＵＮＱ＃Ｑ８ＴＤ４６）を安定して発現するＵ９３７細胞を、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２）とともに４℃で１０分間インキュベートした後、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体を４℃で２０分間添加した。細胞を洗浄した後、５５ｎＭ ｈｕＣＤ２００－Ｆｃ－Ｆｌａｇとともに４℃で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄した後、抗Ｆｌａｇ－ＰＥクローンＬ５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号６３７３１０）とともに４℃で２０分間インキュベートすることにより、ｈｕＣＤ２００－Ｆｃ－Ｆｌａｇ結合を検出した。細胞への結合は、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。結合曲線は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて算出した。

【0219】

結果：図４に示すように、ＢｉｎＡ抗体ｈ１０Ｆ６は、他の２つのＢｉｎＡ抗体ＯＸ１０８及びｈ２２．１よりも１０倍及び６倍強力なｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１のブロック（すなわち、より低いＩＣ_５０値）を示す。４つのヒト化ＢｉｎＢ抗体ｈ９Ｂ８、ｈ５Ｄ１、ｈ１０Ａ２、及びｈ１Ｆ３は、ｈ１０Ｆ６よりも弱い様々なレベルのＣＤ２００Ｒ１ブロッキング活性を有するが、唯一、ＢｉｎＣヒト化クローンｈ１１Ｅ４は、ＣＤ２００Ｆｃ結合をブロックしない。

【0220】

Ｅ．ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１のヒト及びカニクイザルＴ細胞への結合
ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体が内因性抗原に結合する能力を、健康なドナーから分離されたヒトＰａｎＴ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７０５００．２）及びカニクイザル末梢血単核細胞（ＷｏｒｌｄＷｉｄｅ Ｐｒｉｍａｔｅｓ）を使用して測定した。ヒトの場合、Ｔ細胞は、ＰａｎＴ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０９５－５３５）を使用して単離した。細胞をヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２）と４℃で１０分間インキュベートした後、ビオチン標識抗ＣＤ２００Ｒ１抗体（ｈ１０Ｆ６又はｈ２２．１）又はアイソタイプ対照と４℃で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗ＣＤ２００Ｒ１結合をストレプトアビジン－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。ヒト免疫細胞タイプを、抗ＣＤ４クローンＯＫＴ４及び抗ＣＤ８クローンＲＰＡ－Ｔ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識した。Ｃｙｎｏ免疫細胞を、抗ＣＤ３クローン１０Ｄ１２、抗ＣＤ４クローンＭ－Ｔ４６６、及び抗ＣＤ８クローンＢＷ１３５／８０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で標識した。細胞への結合は、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。幾何平均蛍光強度に基づいて結合曲線を算出した。

【0221】

結果：図５Ａに示すように、ｈ１０Ｆ６は、ｈ２２．１及びＯＸ１０８よりもヒトＴ細胞に対して高い親和性を有する。しかしながら、図５Ｂに示されるように、ｈ１０Ｆ６もＯＸ１０８もカニクイザルＴ細胞との交差反応性を示さない。

【0222】

実施例４：抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のインビトロ及びインビボ機能アッセイ
この実施例は、本開示の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の機能的活性を特徴付けるために使用されるインビトロ細胞ベースのアッセイ及びインビボ試験を説明する。

【0223】

Ａ．抗ＣＤ２００Ｒ１抗体による腫瘍患者のＰＢＭＣの免疫活性化
抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の機能活性を、初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で試験した。９人の腫瘍患者からのＰＢＭＣを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｏｓ Ｏｓｏｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。選択した抗ＣＤ２００Ｒ１抗体１００ｎＭを含む３８４ウェルプレートに、１ウェル当たり２～４×１０^４個の細胞を３連で播種した。次いで、細胞を０．１ｎｇ／ｍＬのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号ＢＴ２０２）で刺激し、３７℃で３日間培養した。ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されているキットを使用して、ＥＬＩＳＡによって上清のＩＦＮγレベルを測定した。生物学的トリプリケートの平均をアイソタイプ対照に対して正規化し、複数のＴ検定を実行して有意差を決定した。

【0224】

結果：図６に示されるように、ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１は、様々ながんタイプを有する患者由来のサンプルにおいてＩＦＮγの産生を増加させた。具体的には、図６は、１００ｎＭのｈ１０Ｆ６又はｈ２２．１で処理されたサンプルにおける、アイソタイプ対照に対して正規化されたＩＦＮγ産生の倍率変化を示す。ｈ１０Ｆ６で処理した場合、９人の腫瘍患者の細胞のうち６人が、ＩＦＮγ産生の統計的に有意な増加を示した。ｈ２２．１で治療した場合、９人の患者のうち４人が有意な治療効果を示した。

【0225】

Ｂ：初代ヒト汎Ｔ細胞アッセイ
ＩＦＮγ分泌のレスキューにおける抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の機能的活性を、プレート結合ＣＤ２００－Ｆｃの存在下で測定した。健康なＰＢＭＣドナーから分離された初代ヒト汎Ｔ細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、カタログ番号７０５００．２）を、完全培地中で７日間、２μｇ／ｍＬ ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１１０８２１３２００１）及び４ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－２（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号２４９５１７００）で慢性的に刺激した。次に、細胞を回収し、４０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０４）で２４時間プライミングした。細胞をプレーティングする前に、プレートを１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３クローンＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３２６）及びＰＢＳで希釈した１５μｇ／ｍＬのヒトＣＤ２００Ｆｃ又はアイソタイプ対照（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号２１－０４０－ＣＭ）で４℃で一晩コーティングした。細胞を回収し、洗浄し、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体で２４時間プレーティングした。細胞上清を回収し、サイトカイン、ヒトＩＦＮγ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号８８－７０２５－８８）及びヒトＩＬ－２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、コーティング８８－７３１６－８８）の分泌をＥＬＩＳＡで測定した。

【0226】

結果：図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、ｈ１０Ｆ６ ＩｇＧによる処置は、２人の異なる健康なドナー（ドナー２０３及びドナー５３８）におけるＩＬ－２分泌の機能的レスキューを示すが、ｈ２２．１による処置によるレスキューは、１人のドナーのみで見られた。図７Ｃ及び図７Ｄに示されるように、ｈ１０Ｆ６による処置はまた、ＩＬ－２分泌においてアイソタイプ対照よりも用量依存的応答においてより優れた有効性を示し（図７Ｃ）、ＩＦＮγ分泌において市販の抗体、ＯＸ１０８よりもより優れた有効性を示した（図７Ｄ）。

【0227】

Ｄ．初代ヒト混合リンパ球反応アッセイ
ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の機能活性を、同種混合リンパ球反応アッセイで、汎Ｔ細胞及び分極樹状細胞を使用して測定した。ＰＢＭＣは、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７０５００．１からの健康なドナーロイコパックから、遠心分離及びＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１０４９２－０１）を使用する赤血球溶解によって調製した。ｐａｎ単球分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９６－５３７）を使用して、単球をＰＢＭＣから単離した。汎Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの汎Ｔ Ｃｅｌｌ分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９６－５３５）を使用して単離した。次に、単球を、２０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１５ＧＭ０１０）及びＩＬ－４（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２０４ＩＬ０１０）を含む完全培地に１００万個／ｍＬで７日間播種した。次に樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ－４３９１）及び５０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦα（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１０ＴＡ０２０ＣＦ）を使用して免疫原性ＤＣに更に分極し、又は２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１７ＩＬ０１０）及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮａ－２ｂ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１０５１）を使用しＤＣを３日間馴化させた。分極後、汎Ｔ細胞及び成熟ＤＣを、１：２０のｐａｎＴ：ＤＣ細胞比で、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２００Ｒ１抗体又はアイソタイプ対照と完全培地で混合した。Ｔ細胞の活性化を評価するために、ＭＬＲ上清と細胞を４、５、及び６日目に採取した。サイトカイン分泌は、ＩＦＮγ Ｈｕｍａｎ Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｐｒｏｃａｒｔａｐｌｅｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＥＰＸ０１Ａ－１０２２８－９０１）を使用して測定した。Ｔ細胞の活性化を評価するために、細胞をヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２）とともに４℃で１０分間インキュベートした後、細胞外染色抗ＣＤ３クローンＵＣＨＴ１、抗ＣＤ４クローンＯＫＴ４、抗ＣＤ８クローンＲＰＡ－Ｔ８、抗－ＣＤ８６クローンＢＵ６３、抗ＣＤ１１ｃクローンＢＵ１５とインキュベートした。更に、Ｔ細胞の活性化を測定するために、活性化マーカーとして抗ＣＤ６９クローンＦＮ５０、抗ＣＤ２５クローンＢＣ９６、及び抗ＨＬＡ－ＤＲクローンＬ２４３を追加した。細胞を４℃で２０分間染色し、洗浄し、細胞内染色の準備をした。Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号００－５５２３－００）を使用して、４Ｃで４５分間、抗Ｋｉ６７クローンＢ５６による細胞内染色のために細胞を固定及び透過処理した。細胞内染色後、細胞を再度洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いたフローサイトメトリーによって発現を分析した。

【0228】

結果：図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃに示されるように、ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ抗体、ｈ１０Ｆ６による処理は、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を増加させ（図８Ａ）、ＣＤ４Ｔ細胞の増殖を増加させ（図８Ｂ）、ｈ２２．１ ＩｇＧより大きく、アイソタイプ制御を有意に超えて、ＩＦＮγ分泌を増加させた（図８Ｃ）。

【0229】

Ｅ．抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のＰｈｏｓｐｈｏ－Ｄｏｋ２誘導アッセイ
ＣＤ２００との嵌合により、ＣＤ２００Ｒ１のホスホチロシン結合認識モチーフへのＤｏｋ２キナーゼの動員を介して、ＣＤ２００Ｒ１阻害シグナル伝達が開始される（Ｍｉｈｒｓｈａｈｉ２００９及びＭｉｈｒｓｈａｈｉ２０１０などを参照）。ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１のアゴニズム活性を、Ｕ９３７単球細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５９３．２）及びｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１を安定的に発現するＵ９３７細胞株の両方におけるホスホ－Ｄｏｋ２の誘導によって評価した。１８時間血清飢餓状態にした後、親細胞又はＣＤ２００Ｒ１過剰発現細胞を、様々な濃度の可溶性ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１又はアイソタイプ対照又はＣＤ２００－Ｆｃで６０分間処理した。細胞を、１×ＳＤＳ＋プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤で溶解させた。ライセートを、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＭＥＳ ＳＤＳ（ＢｉｏＲａｄ）で非還元条件で分離した。ウエスタンブロットは、抗ｐＤｏｋ２ Ｙ３５１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号３９１１Ｓ）及び抗Ｄｏｋ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号ｓｃ－１７８３０）を用いて行った。

【0230】

結果：図９に示されるように、野生型（ＷＴ）Ｕ９３７細胞株と比較して、ｐＤｏｋ２は、２００ｎＭの最高用量の可溶性ＣＤ２００－Ｆｃ、３３ｎＭのＯＸ１０８、及び５．６ｎＭという低用量のｈ２２．１で処理した場合に誘導される。対照的に、ｈ１０Ｆ６による処理は、ＷＴと比較してｐＤｏｋ２を誘導できず、ｈ１０Ｆ６にはＣＤ２００Ｒ１アゴニスト特性がないことが示唆された。ｈ１０Ｆ６が、ＣＤ２００のＣＤ２００Ｒ１結合をブロックする一方で、ＣＤ２００Ｒ１シグナル伝達を不注意に刺激しない能力（ｐＤｏｋ２発現によって測定される）は、ともに不注意なＣＤ２００Ｒ１アゴニスト活性を示すｈ２２．１及びＯＸ１０８と比べてｈ１０Ｆ６の治療能力を大幅に増強する。

【0231】

Ｆ．ＮＦＫｂ－Ｌｕｃレポーター細胞株における、Ｋ５６２－ＣＤ２００Ｒ１に対するアンタゴニスト活性のアッセイ
ＣＤ２００をＣＤ２００Ｒ１発現細胞株と共培養すると、ＣＤ２００はＮＦｋＢ転写を誘導することが過去に報告されている（例えば、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２５：６５６－６６６（２０１９）を参照）。Ｋ５６２単球細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４３）を、ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１のアンタゴニスト活性を測定するために、ＣＤ２００Ｒ１及びＮＦｋＢルシフェラーゼレポーターを安定して発現するよう操作した。抗ＣＤ２００Ｒ１クローン、ｈ２２．１及びｈ１０Ｆ６の二価及び一価Ｆａｂフォーマットの両方を、様々な濃度で、Ｋ５６２レポーター細胞及びＣＤ２００を安定的に発現する２９３Ｔ（ＵＮＱ＃Ｐ４１２１７）の共培養液に、３７℃で６時間添加した。培養物に２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号２１０－ＴＡ）を添加した。

【0232】

結果：図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるように、ＮＦｋＢ転写は、ＣＤ２００^－発現細胞と比較して、ＣＤ２００^＋発現細胞によって誘導される。ブロッキング抗体を共培養物に加えた後、ｈ１０Ｆ６とｈ２２．１の間のアンタゴニスト機能の違いが明らかになる。二価（図１０Ａ）及び一価ｈ１０Ｆ６（図１０Ｂ）のいずれも、ＣＤ２００駆動ＮＦｋＢ転写をベースラインレベルまでブロックすることができる。しかしながら、ＣＤ２００^＋のｈ２２．１ ＩｇＧとの共培養は、ＮＦｋＢの誘導を部分的にブロックするだけであり、一価のｈ２２．１ Ｆａｂは効果がない。

【0233】

実施例５：ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体ｈ１０Ｆ６の親和性成熟
この実施例は、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１の両方への結合を改善するための、ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体ｈ１０Ｆ６の親和性成熟に使用されるファージライブラリー構築及びパニング法を例示する。

【0234】

Ａ．ｈ１０Ｆ６親和性成熟ＮＮＫライブラリーの構築及びパニング
抗ＣＤ２００Ｒ１抗体クローンｈ１０Ｆ６の親和性成熟変異体配列を特定するために、ファージライブラリーを、重鎖及び軽鎖残基を含む一価Ｆａｂファージディスプレイ用にＦａｂ－ａｍｂｅｒ形式で構築し、２０個のアミノ酸全てを３２コドンでコードするＮＮＫ縮重コドンを使用してランダム化した（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ライブラリーは、３つの軽鎖又は重鎖の各々のＨＶＲに１つのＮＮＫ変異を適用するように設計した。次に、合成変異誘発オリゴヌクレオチドを使用して、クンケル変異誘発を用いて重鎖及び軽鎖ライブラリーを構築した（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。得られたライブラリーＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１細胞にエレクトロポレーションし、約６．５×１０^８～４．３×１０^９個の形質転換体を得た。

【0235】

ファージライブラリーをＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ（商標）ＰＢＳ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）及び０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で３０分間インキュベートし、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１（ｉｓｏ４、Ａｌｔ及びＲｅｆハプロタイプ）及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１をコーティングしたプレートに適用して、最初のラウンドのパニングを行った。その後の２～３ラウンドでは、ファージライブラリーをビオチン化ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１又はｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１抗原の濃度を下げながらインキュベートした。溶出したファージを対数期ＸＬ－１に感染させ、更なるアフィニティースクリーニングのためにＬＢカルベニシリンプレートに３７℃で一晩プレーティングした。

【0236】

ＮＧＳを使用して親和性成熟ライブラリーから配列を抽出するために、ファージミド二本鎖ＤＮＡを、最初のファージライブラリー（非選別ライブラリー）並びに第１及び第２ラウンドの溶液選択（選別ライブラリー）からファージミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ－１細胞から単離した。精製されたＤＮＡをテンプレートとして使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ１６ｓライブラリー調製プロトコルを使用してＶＨ及びＶＬ領域のアンプリコンを生成させた。配列決定アダプター及びデュアルインデックスバーコードを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔを使用して追加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでの配列決定用の調製において、アダプターを連結したアンプリコンを、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３（６００サイクル）を使用して、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー変性及びサンプルローディングプロトコルに供した。ペアエンド配列決定は、２００塩基対～３００塩基対の挿入サイズでアンプリコンの全長をカバーするように実施した。

【0237】

ペアエンド配列決定データは、最初に、ペアエンドアセンブラＰＡＮＤＡｓｅｑ（Ｍａｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を使用してアセンブルし、完全なアンプリコンを得た。次に、同定されたアンプリコンについて品質管理（ＱＣ）を実施し、各アンプリコンが配列の挿入又は欠失及び終止コドンがないことを確認し（ｃｈｅｃｋ）、各ＣＤＲ配列は、最大１つのＮＮＫ変異のみを保有し、非ＮＮＫ変異はなかった。位置特異的重み行列は、ランダム化された全ての位置の全変異頻度を算出することによって生成された。各変異の濃縮比は、前述のように、選別サンプルの所与の位置での所与の変異頻度を、非選別サンプルのまったく同じ変異の頻度で割ることによって算出した（Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0238】

結果：ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１の両方に対する、得られたｈ１０Ｆ６変異体の結合の増加をサポートする、富化されたＨＶＲ変異を表７にまとめる。

【0239】

【表7-1】

【0240】

【表7-2】

【0241】

実施例６：精製された親和性改良型のｈ１０Ｆ６の変異体の特徴解析
この実施例は、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１の結合親和性、並びに実施例６に記載の親和性成熟によって調製された、選抜されたｈ１０Ｆ６変異体、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１、ｈ１０Ｆ６．Ｖ２、ｈ１０Ｆ６．Ｖ３、及びｈ１０Ｆ６．Ｖ４によるブロッキングを示す。

【0242】

Ａ．Ｂｉａｃｏｒｅ結合
哺乳動物発現構築物へクローニングしてＩｇＧ１タンパク質を生成させるために、ｈ１０Ｆ６変異体を合成した。変異体ＩｇＧ１タンパク質のＬＣ及びＨＣ配列を表３にまとめる。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１は、配列番号７１のＬＣ及び配列番号８８のＨＣを有する。ｈ１０Ｆ６．Ｖ２は、配列番号６８のＬＣ（ｈ１０Ｆ６及びｈ１０Ｆ６．Ｖ３と同じ）及び配列番号８９のＨＣ（ｈ１０Ｆ６．Ｖ４と同じ）を有する。ｈ１０Ｆ６．Ｖ３は、配列番号６８のＬＣ（ｈ１０Ｆ６及びｈ１０Ｆ６．Ｖ２と同じ）及び配列番号８８のＨＣ（ｈ１０Ｆ６．Ｖ１と同じ）を有する。ｈ１０Ｆ６．Ｖ４は、配列番号７１のＬＣ（ｈ１０Ｆ６．Ｖ１と同じ）及び配列番号８９のＨＣ（ｈ１０Ｆ６．Ｖ２と同じ）を有する。

【0243】

重鎖又は軽鎖をコードするプラスミドを、実施例２に記載のように発現及び精製した。ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１－ｉｓｏ４（Ａｌｔ及びＲｅｆハプロタイプ）及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に結合する、選抜されたｈ１０Ｆ６親和性改善変異体の結合動態を決定するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）８Ｋ機器を用いたＳＰＲ測定を実施例３のＡと同様に実施した。簡潔に述べると、ｈ１０Ｆ６変異体をＨＢＳ－Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０）で０．５μｇ／ｍＬに希釈し、フローセル２（ＦＣ２）中、プロテインＡチップに３０μＬ／分の流速で６０秒間適用した。次に、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％界面有効成分Ｐ２０）中のヒト又はｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１の、３００ｎＭからの３倍連続希釈液を３７℃で、フローセル１（ＦＣ１）及びフローセル２（ＦＣ２）の両方に注入した（流速：３０μＬ／分）。センサーグラムを記録し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン１．１．１．７４４２）により評価する前に、参照及び緩衝液の減算を行った。結合率（ｋ_ｏｎ）及び解離率（ｋ_ｏｆｆ）は、単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して算出された。平衡解離定数（ＫＤ）を、表８に要約するように、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比率として算出した。

【0244】

【表8】

【0245】

結果：表８に要約される結合親和性値によって示されるように、４つの変異体、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１、ｈ１０Ｆ６．Ｖ２、ｈ１０Ｆ６．Ｖ３、及びｈ１０Ｆ６．Ｖ４は、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１に対する結合交差反応性を示すことがわかった。

【0246】

Ｂ．ブロッキングアッセイ
４つのｈ１０Ｆ６変異体、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１、ｈ１０Ｆ６．Ｖ２、ｈ１０Ｆ６．Ｖ３、及びｈ１０Ｆ６．Ｖ４を、実施例３．Ｂに記載のように実施したヒトＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ１ブロッキングＥＬＩＳＡアッセイにおける性能についてアッセイした。コーティングされたｈｕ－ＣＤ２００－Ｆｃ又はｃｙｎｏ－ＣＤ２００－Ｆｃへのビオチン化ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１又はビオチン化ｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１の結合を５０％阻害する、抗ＣＤ２００Ｒ１変異体ＩｇＧ１の濃度を表す、ブロッキングＩＣ_５０値を測定した。

【0247】

結果：表９に要約するように、４つのｈ１０Ｆ６変異体は、ｈｕ－ＣＤ２００Ｒ１及びｃｙｎｏ－ＣＤ２００Ｒ１の両方を最も強力にブロックするｈ１０Ｆ６．Ｖ１との交差反応性ブロッキング活性を示した。

【0248】

【表9】

【0249】

実施例７：抗ＣＤ２００Ｒ１抗体のラット薬物動態試験
この実施例は、ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１のラットにおけるインビボ薬物動態（ＰＫ）試験を説明する。

【0250】

材料及び方法：ヒト化抗ＣＤ２００Ｒ１抗体ｈ１０Ｆ６及びｈ２２．１を、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内投与した。１０ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの単回用量を、投与群ごとに雄２匹及び雌２匹のラットに投与した。採血は、注射後５分、２時間、６時間、２４時間、３日、７日、１０日、１４日、１７日、及び２１日後に行った。ヒツジ抗ヒトＩｇＧ１でヒトＩｇＧ抗体を捕捉し、ビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）及びストレプトアビジン－ＨＲＰで検出する一般的なＥＬＩＳＡ法を使用して、血清中の抗ＣＤ２００Ｒ１レベルを定量化した。非コンパートメント分析を使用して、３～２１日の時間範囲でＰＫパラメータを計算した。

【0251】

図１１に示されるように、薬物動態は、非標的媒介枯渇プロファイルのものを例示する。ｈ１０Ｆ６の半減期は、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群でそれぞれ１１．４～１４．８日の範囲である。ｈ２２．１の半減期は、両用量群で約１２日である。１０ｍｇ／ｋｇ ｈ２２．１グループの１匹の動物は、同じグループの他の３匹のラットと比較してより速いクリアランスプロファイルを示し、分析から除外した。

【0252】

ラットにおけるｈ１０Ｆ６の平均ＰＫパラメータを以下の表１０に要約する。Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットへの１又は１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶボーラス注射の後、ｈ１０Ｆ６血清濃度が二相的に低下した。ｈ１０Ｆ６のＰＫは用量に比例し、雄及び雌で同様であった。Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおけるｈ２２．１の平均最終半減期は、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれ１１．４日及び１４．８日であった。

【0253】

【表10】

【0254】

実施例８：サルにおけるｈ１０Ｆ６の単回投与薬物動態
ｈ１０Ｆ６の単回投与ＰＫ試験は、非結合種であるカニクイザルで行い、そのＰＫ特性及び耐性を特徴解析した。

【0255】

ナイーブカニクイザル（Ｎ＝８、４Ｍ／４Ｆ）に、ｈ１０Ｆ６を単回ＩＶボーラス注射により、それぞれ２及び２０ｍｇ／ｋｇで投与した（１群当たり２Ｍ／２Ｆ）。血清中のｈ１０Ｆ６の濃度、臨床化学的パラメータ、血液学的パラメータ、並びにサルの一般的な健康状態及び外観を、投与後３５日間モニターした。ＰＫ分析のための血液サンプルを、投与前、及び投与後１５分、２時間、８時間、及び１、２、４、７、１０、１４、２１、２８、及び３５日目に採取した。臨床病理学用のサンプルを、投与前と投与後１日目及び３５日目に採取した。サル血清サンプル中のｈ１０Ｆ６の濃度は、０．０６μｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）でｈ１０Ｆ６の濃度を測定するために開発及び認定されたＥＬＩＳＡを使用して測定した。サルにおけるｈ１０Ｆ６の濃度－時間ＰＫプロファイルを図１２に示す。

【0256】

サルにおけるｈ１０Ｆ６の平均ＰＫパラメータを以下の表１１に要約する。カニクイザルに２又は２０ｍｇ／ｋｇのｈ１０Ｆ６を単回ＩＶボーラス注射した後、ｈ１０Ｆ６血清濃度は二相的に低下した。ｈ１０Ｆ６の平均最終半減期（Ｔ１／２）は、２ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇグループでそれぞれ１１．５日及び１３．３日であった。ｈ１０Ｆ６のＰＫは用量に比例し、２～２０ｍｇ／ｋｇの試験用量範囲にわたって性差は観察されなかった。サル８匹中２匹（２０ｍｇ／ｋｇ群の雄１匹、雌１匹）で、１４日目から２１日目にかけて血清中のｈ１０Ｆ６濃度が急激に低下した。この発見は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成の可能性に起因していた。そのため、ＡＤＡの影響を受けたと疑われるＰＫパラメータをｈ１０Ｆ６要約データから除外し、部分的なＡＵＣ（ＡＵＣ０～１４Ｄ）をＰＫ分析に含めた。ＡＤＡが疑われる２匹の動物のデータを要約平均データから除外しても、ｈ１０Ｆ６用量の比例性又は性差に関する結論に影響はなかった。

【0257】

１０Ｆ６はサルで直線的なＰＫを示し、雄及び雌で同様のＰＫを示し、定常状態でのクリアランスの平均値と分布の推定量は、サルで直線的なＰＫを示すヒト化ＩｇＧの典型的な値と一致していた（Ｂｅｔｔｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１８）。非結合種において予想されたように、ｈ１０Ｆ６のＰＫプロファイルは、サルにおけるｈ１０Ｆ６の主要な除去経路が直線的で不飽和、非特異的なクリアランス機構であることを示唆している。ｈ１０Ｆ６は、臨床観察並びに血清化学及び血液学パラメータの評価に基づいて、３５日目まで良好に許容された。

【0258】

【表11】

【0259】

実施例９：ヒトにおけるｈ１０Ｆ６の薬物動態
ｈ１０Ｆ６のＰＫを、カニクイザルで２～２０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットで１～１０ｍｇ／ｋｇの、単回投与試験で評価した。ｈ１０Ｆ６への曝露はほぼ用量に比例し、雄と雌との間に違いは観察されなかった。ＰＫプロファイルは、ＡＤＡ形成を示唆するＰＫプロファイルを有した、２０ｍｇ／ｋｇで投与された２匹のサルを除いて、標的媒介性の素因又はＡＤＡ効果の証拠を示唆していない。これらの結果は、アロメトリック法がｈ１０Ｆ６のヒトＰＫを予測するのに適切である可能性があることを裏付けている。

【0260】

以下の表１２に示すように、クリアランス及び分布体積などのヒトＰＫパラメータを、サルにおける非臨床データから計算した。簡潔に述べると、サルのｈ１０Ｆ６血清濃度は、二相的に投与後に低下した。したがって、２又は２０ｍｇ／ｋｇのｈ１０Ｆ６を投与されたＮ＝８匹のサルからの濃度－時間データは、ＡＤＡが疑われるデータを除外して、２コンパートメントモデルに同時にフィットした。このモデルからのサルのＰＫパラメータを、アロメトリック指数＝１でスケーリングされる分布項（Ｖ１及びＶ２）の量と、指数＝０．８５でスケーリングされるクリアランス項（ＣＬ及びＱ）のスケールという仮定に基づいて、ヒトＰＫパラメータを導出するためにアロメトリック的にスケーリングした（Ｄｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１１）。体重２．４ｋｇ（単回投与ＰＫ試験、ｈ１０Ｆ６－ＶＩＶ－０１におけるサルの平均体重）及び７０ｋｇを、サル及びヒトの体重としてそれぞれ採用した。体重７０ｋｇのヒトのＰＫパラメータは、ヒト化ＩｇＧモノクローナル抗体の典型的な範囲内にある。

【0261】

ｈ１０Ｆ６はヒトのＣＤ２００Ｒ１に特異的であるため、標的を介する薬物動態を前臨床的に評価することはできなかった。ただし、ＧＬＰ ｈ１０Ｆ６．Ｖ１ハザード同定試験からの毒物動態（ＴＫ）データは、ＴＭＤＤについて評価することができ、ＴＭＤＤがサルにおけるｈ１０Ｆ６．Ｖ１の支配的なクリアランス経路であることが判明した場合、この試験からの知見を使用して、ｈ１０Ｆ６ヒトＰＫ予測を通知又は潜在的に改良することができる。これらのＰＫパラメータに基づいて、ｈ１０Ｆ６除去半減期は１９．４日と計算できる。

【0262】

【表12】

【0263】

ヒトにおけるｈ１０Ｆ６の予測ＰＫパラメータを使用して、健康なボランティアと患者のｈ１０Ｆ６ＰＫを推定し、それぞれ開始用量と予想される治療用量範囲の選択を通知した。

【0264】

ヒトにおけるｈ１０Ｆ６のＰＫは、用量範囲にわたって線形であると想定できる。しかしながら、標的を介する薬物動態がヒトの総クリアランスに寄与する可能性がある場合、排出半減期は低用量で予測されるよりも短い可能性がある。したがって、ｈ１０Ｆ６のＡＵＣは、健康なボランティア及び患者では、特に低用量で過剰に予測される可能性がある。そのため、用量範囲全体にわたって直線性があると仮定すると、特に低用量では、用量選択において保守的なアプローチとなる。

【0265】

以下の表１３に示す用量は、健康なボランティアで評価された最大用量であり得、開始用量を０．３ｍｇとし、最大用量は半対数（約３倍）増加する。これらの用量は、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１のハザード特定試験及びｈ１０Ｆ６のエクスビボ組織交差反応性試験などのハザード特定試験によって通知され、データのレビューに基づいて保証される場合は変更できる。過去のコホートからの安全性、ＰＫ及びＰＤデータの全体を、ＳＲＣの用量漸増決定において慎重に考慮する必要があろう。

【0266】

【表13】

【0267】

予測されたヒトＰＫパラメータは、患者のｈ１０Ｆ６ＰＫを推定して、予測される治療用量範囲を得るためにも使用した。以下の仮定を使用して、患者のｈ１０Ｆ６ＰＫを推定したが、これには、線形ＰＫ、Ｑ３Ｗ投与、又は１０％の血清対腫瘍分配係数、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0268】

患者に使用される実際の投与頻度は、進行がん患者におけるｈ１０Ｆ６．Ｖ１の複数回投与試験からの安全性、ＰＫ及びＰＤデータによって知ることができる。患者は、健康なボランティアよりも高いレベルのＣＤ２００Ｒ１発現（例えば、ＴＩＬ）を有する可能性があり、ＣＤ２００Ｒ１の存在により、例えば標的媒介クリアランスが完全に飽和していない場合に低用量で、クリアランスが速くなり、ｈ１０Ｆ６への曝露が低くなる可能性がある。ＣＤ２００Ｒ１は低密度の表面受容体であるが、例えば好中球などの骨髄系細胞で最高レベルで発現され得、その急速なターンオーバーが低用量でのｈ１０Ｆ６除去の中心となる可能性がある。例えば、腫瘍内のＴＩＬにおけるＣＤ２００Ｒ１の発現により、健康なボランティアにおいて直線的なＰＫを達成するｈ１０Ｆ６の用量と比較して同等以上の用量のｈ１０Ｆ６を投与して、患者において直線的なＰＫを達成することができる。固形腫瘍における抗体の濃度は、平均して血清濃度の１０％から３０％であり得る。各コホートで考慮される最大用量を得るために、１０％という保守的なアプローチを使用できる。

【0269】

実施例１０：初代ヒト細胞への抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の結合
ｈ１０Ｆ６がヒト細胞に発現する内因性ＣＤ２００Ｒ１に結合することを確認するために、健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを使用したフローサイトメトリーによって、末梢免疫細胞サブセットへのｈ１０Ｆ６の結合を測定した。

【0270】

３人のドナーから分離されたＰＢＭＣでは、免疫サブセットへのｈ１０Ｆ６結合は、文献で報告されている予想されるＣＤ２００Ｒ１発現と一致し（Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｒｉｊｋｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｃｚａｒｎｏｗｉｃｋｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ＣＤ４＋Ｔ細胞は最高レベルのＣＤ２００Ｒ１を発現し、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではわずかに低い発現が観察された。比較すると、Ｂ細胞ではかなり低いレベルのＣＤ２００Ｒ１発現が観察され、Ｂ細胞の染色の分布は二峰性であり、全Ｂ細胞のサブセット（約１６％）がＣＤ２００Ｒ１を発現したことを示唆している。ｈ１０Ｆ６は、３人の健康なドナーからの末梢単球への結合が限られていることを示す。これらの結果は、市販の抗ＣＤ２００Ｒ１抗体と３人の他の健康なドナーから新たに分離された単球を使用した試験と一致している（データ示さず）。Ｔ細胞サブタイプへの結合は、ｈ１０Ｆ６の段階希釈を試験することによって評価し（図１３）、以下の表１４に示すように、これらの末梢免疫サブセットへの結合のＥＣ５０値は、試験した３人のドナー全体で一貫しており、０．３０～０．４０ｎＭの範囲であった。

【0271】

【表14】

【0272】

組織常在性ＤＣの表現型を再現するために、健康なドナーＰＢＭＣから単球を単球分離キットを使用して分離し、２０ｎｇ／ｍＬの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４を使用してインビトロで１週間分化させた。ｈ１０Ｆ６は、評価された３人の個々のドナーにわたって単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）への結合を示し、同様の用量反応曲線が得られた（図１４）。ドナー全体の結合ＥＣ５０値（０．４５～０．６０ｎＭ）を以下の表１５に要約する。

【0273】

【表15】

【0274】

実施例１１：抗ＣＤ２００－Ｒ１抗体は初代ラット、ウサギ、イヌ、マーモセット、アカゲザル、及びカニクイザルＰＢＭＣに結合しない
ｈ１０Ｆ６の他の種由来の免疫細胞への結合能力も評価した。評価のために、ヒトＣＤ２００Ｒ１と≧５０％の配列相同性を共有する種として、ラットＣＤ２００Ｒ１（５４％細胞外ドメイン、ＥＣＤ、類似性）、イヌＣＤ２００Ｒ１（５０％ＥＣＤ類似性）、ウサギＣＤ２００Ｒ１（６１％ＥＣＤ類似性）、マーモセット（８２％ＥＣＤ類似性）、アカゲザル（９１％ＥＣＤ類似性）、及びカニクイザル（８９％ＥＣＤ類似性）を選択した。それぞれの種の各々に由来するＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析の結果は、ｈ１０Ｆ６がラット、ウサギ、又はイヌの初代免疫細胞に結合しないことを示した。ｈ１０Ｆ６はまた、図１５に示されるように、高い配列相同性にもかかわらず、アカゲザル、マーモセット、又はカニクイザル細胞への結合を示さなかった。

【0275】

ウサギ、マーモセット、アカゲザル、及びカニクイザルＣＤ２００Ｒ１に対する交差反応性を示さないことは、ヒトＣＤ２００Ｒ１を陽性対照として使用し、これらの種の完全長ＣＤ２００Ｒ１コンセンサス配列をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞へのｈ１０Ｆ６の結合を測定することによって確認した（図１６）。初代細胞で観察された結果と一致して、ｈ１０Ｆ６はヒトＣＤ２００Ｒ１のみを認識した。

【0276】

実施例１２：末梢及び腫瘍浸潤免疫細胞におけるＣＤ２００Ｒ１の発現
ＣＤ２００及びＣＤ２００Ｒ１の発現を、凍結保存された切除した腫瘍組織からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）で評価し、明細胞腎、乳房、黒色腫、子宮内膜腺がん、及び卵巣がんの患者からのＰＢＭＣと一致し、腫瘍微小環境と比較し、末梢の免疫細胞におけるそれらの分布が理解された（ＣＤ２００ ＩＮＤ ｂｏｏｋの図５、ＣＤ２００Ｒ１ ＩＮＤ ｂｏｏｋの図６）。末梢免疫細胞のＣＤ２００レベルは、がん患者と健康なドナーの間で類似していたが、腫瘍浸潤性免疫細胞では、試験した５人のがん患者全員のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＣＤ２００発現レベルがアップレギュレートされていた。５人中４人のがん患者における腫瘍浸潤ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞もまた、末梢からの対応するサンプルと比較して高いＣＤ２００発現を示した（図１７）。患者ＰＢＭＣサブセットでのＣＤ２００Ｒ１発現は、健康な対照発現レベルに匹敵した（図１８）。ただし、ＣＤ２００Ｒ１は、がん患者５人中４人において、対応する末梢サンプルと比較して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬ Ｔ細胞でより高い発現を示した。試験した５人の患者サンプル全てにおいて、ＴＩＬ Ｂ細胞及びＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞は、対応する末梢サンプルと比較してＣＤ２００Ｒ１発現の上昇を示した。このデータは、腫瘍微小環境におけるＣＤ２００及びＣＤ２００Ｒ１アップレギュレーションの文献による報告を裏付けるものであり（Ｚｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｔｈｏｍｍｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｃａｓｓｅｔｔａ，ｅｔ ａｌ．，２０１９）、ＣＤ２００Ｒ１抑制性受容体の発現上昇とそのリガンドが、免疫抑制性の腫瘍微小環境に寄与している可能性がある。

【0277】

実施例１３：抗ＣＤ２００－Ｒ１抗体によるＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ１相互作用のブロック
Ａ．抗ＣＤ２００－Ｒ１抗体による、ＣＤ２００Ｒ１を発現する細胞からの既結合ＣＤ２００の置換

【0278】

腫瘍及び腫瘍浸潤免疫細胞の文脈では、腫瘍細胞及び／又は血管上の内皮細胞に発現するＣＤ２００の一定の割合が、免疫細胞で発現するＣＤ２００Ｒ１に事前に結合していると予想される。ＣＤ２００Ｒ１から既結合ＣＤ２００を置換するｈ１０Ｆ６の能力を評価するために、ｈＣＤ２００Ｒ１（Ｕ９３７－ＣＤ２００Ｒ１）を発現するようＵ９３７細胞株を操作し、ｈ１０Ｆ６とのインキュベーション前に様々な濃度のｈＣＤ２００－Ｆｃとプレインキュベーションした。アッセイは、ｈ１０Ｆ６によるＵ９３７－ＣＤ２００Ｒ１からのビオチン化ｈＣＤ２００－Ｆｃの置換をモニタリングすることにより（図１９、パネルＡ）、又は、異なる濃度のｈＣＤ２００－Ｆｃの存在下でビオチン化ｈ１０Ｆ６のＵ９３７－ＣＤ２００Ｒ１細胞への結合をモニタリングすることにより（図１９、パネルＢ）行った。ｈ１０Ｆ６は、両方のアッセイ形式で細胞表面に発現したｈＣＤ２００Ｒ１からｈＣＤ２００－Ｆｃを強力に置換し、存在するｈＣＤ２００－Ｆｃの濃度に応じて、０．１６から１．２８ｎＭの範囲のｈ１０Ｆ６ブロッキングＩＣ５０値をもたらした。予想どおり、既結合ＣＤ２００の置換に対するｈ１０Ｆ６のＩＣ５０値は、ＣＤ２００Ｒ１を発現する細胞をｈ１０Ｆ６とプレインキュベートした場合よりもかなり高かった（効力が低かった）（ＩＣ５０＝０．０８ｎＭ）。

【0279】

Ｂ．アント－ＣＤ２００－Ｒ１抗体による、ＣＤ２００Ｒ１を内因的に発現する初代樹状細胞へのＣＤ２００の結合のブロック
ｈ１０Ｆ６の生物学的作用メカニズムの重要な属性は、ＣＤ２００Ｒ１発現細胞へのＣＤ２００結合を効果的に防止することであるため、インビトロで分化させ、高レベルの内因性ＣＤ２００Ｒ１を発現させた樹状細胞への可溶性組換えＣＤ２００結合をブロックするｈ１０Ｆ６の能力を評価した。ｈ１０Ｆ６は、０．０８ｎＭのＩＣ５０値で濃度依存的にＣＤ２００Ｒ１発現ＤＣへのＣＤ２００結合を１００％ブロックした（図２０）。ここでは、インビトロで単球分化したＤＣを、漸増濃度のｈ１０Ｆ６に結合させた。未結合の抗体を２回洗浄して除去した後、５００ｎＭのＣＤ２００－Ｆｃ－ＦＬＡＧ融合タンパク質を添加した。４℃で２０分間インキュベーションした後、ＣＤ２００結合を検出するために抗Ｆｌａｇ ＰＥ抗体を添加した。結合のＥＣ５０値は、３パラメータ、ｌｏｇ１０［ｈ１０Ｆ６］対応答、非線形曲線フィット（フィット曲線を、このモデルに基づいて外挿推定）を使用して決定した。ＣＤ２００Ｒ１に結合するが、ＣＤ２００Ｒ１－ＣＤ２００結合をブロックしない対照抗体（ノンブロッカー）は、ＣＤ２００結合を阻害せず、実際、結合を強化するようにも見えた。まとめると、これらの結果は、ｈ１０Ｆ６が初代免疫細胞上のＣＤ２００Ｒ１へのＣＤ２００の結合を防止できることを示す。

【0280】

実施例１４：抗ＣＤ２００Ｒ１抗体によるＣＤ２００Ｒ１シグナル伝達の阻害
下流のＣＤ２００Ｒ１を介するシグナル伝達に対するｈ１０Ｆ６の効果を、２つの異なる細胞ベースのアッセイシステムを使用してインビトロで特徴付けた。ＣＤ２００Ｒ１受容体細胞内ドメインへのＤＯＫ２の動員を防止するｈ１０Ｆ６の能力を評価した。そのほか、ＮＦκＢレポーター遺伝子を使用して、ＣＤ２００Ｒ１を介する核因子κＢ（ＮＦκＢ）の下流活性化を評価した。

【0281】

ＣＤ２００Ｒ１シグナル伝達経路は、ＣＤ２００によって誘導されるＣＤ２００Ｒ１のＹ３０２のリン酸化から始まり、その後にＤＯＫ２が動員される（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｍｉｈｒｓｈａｈｉ，ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｍｉｈｒｓｈａｈｉ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，２０１０）。そのため、市販のＣＤ２００Ｒ１特異的ＤＯＫ２動員アッセイ（ＥｕｒｏＦｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を使用して、ｈ１０Ｆ６がＤＯＫ２の下流動員をブロックする能力を評価した。このインビトロ細胞ベースのアッセイシステムでは、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞株はＣＤ２００Ｒ１とＤＯＫ２を発現するよう操作されており、各々のＣ末端が別の相補的なβ－ガラクトシダーゼ酵素断片で修飾されている。ＤＯＫ２がＣＤ２００Ｒ１の細胞内ドメインに近接すると、２つの操作された酵素断片が互いに補完し合い、特殊な基質を加水分解して化学発光シグナルを生成できる機能的な酵素を形成する。したがって、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞をＣＤ２００発現ＨＥＫ２９３細胞と共培養すると、ＣＤ２００Ｒ１シグナル伝達を反映する用量依存的化学発光シグナルが誘導される（図２１）。可溶性ｈ１０Ｆ６の段階希釈物を共培養物に添加すると、濃度依存的にＣＤ２００リガンドによるＣＤ２００Ｒ１へのＤＯＫ２の動員がブロックされた（ＩＣ５０＝０．０３ｎＭ）。ＣＤ２００内因性発現のないＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、シグナルのベースラインレベルを決定した。シグナルがベースラインレベル（ＨＥＫ２９３Ｔ対照細胞刺激によって示される）に戻ったとき、抗体濃度の増加に伴う阻害の完了とした。

【0282】

前臨床試験では、正規のＮＦκＢ経路が、卵巣、大腸炎関連のがん、肝細胞及び神経膠芽腫のマウスモデルで腫瘍促進の役割を果たし得ることが示唆されている。文献の報告では、免疫抑制性腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）Ｍ２表現型及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が、ＮＦκＢに依存する可能性があることが示唆されている（Ｈａｇｅｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０２０）。更に、骨髄細胞の標準的なＮＦκＢ経路を破壊すると、腫瘍の増殖が遅くなり、抗炎症性Ｍ２が炎症誘発性Ｍ１免疫浸潤に再分極し、ＣＤ８＋Ｔ細胞と腫瘍細胞アポトーシスの増加をサポートする（Ａｃｈｙｕｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ヒト単球細胞株Ｋ５６２を、ＣＤ２００Ｒ１及びＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターを発現するよう操作し、ＮＦκＢ経路に対するＣＤ２００－ＣＤ２００Ｒ１シグナル伝達の効果と、この効果をブロックするｈ１０Ｆ６の能力を解析した。

【0283】

ＣＤ２００Ｒ１発現Ｋ５６２細胞をプレート結合ＣＤ２００で処理するか（データは示さず）、又はＣＤ２００発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共培養すると、細胞数依存的にＮＦκＢレポーター遺伝子活性が誘導された（図２２、パネルＡ）。このＫ５６２ ＨＥＫ２９３－ＣＤ２００＋共培養物への可溶性ｈ１０Ｆ６の連続希釈物の添加は、２．３１ｎＭのＩＣ５０値で、膜結合ＣＤ２００依存性ＮＦκＢ応答を効果的かつ完全にブロックし（図２２、パネルＢ）、またプレート結合ＣＤ２００の場合、３．３８ｎＭのＩＣ５０であった（データ示さず）。これらのデータは、ｈ１０Ｆ６が２つの独立した細胞ベースのシステムでＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ１シグナル伝達を効果的にブロックすることを示す。

【0284】

実施例１５：抗ＣＤ２００Ｒ１抗体による免疫細胞活性化の増強
Ａ．混合リンパ球アッセイにおける抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の効果
同種Ｔ細胞共培養の状況で寛容原性ＤＣの抑制効果を逆転させるｈ１０Ｆ６の能力を、混合リンパ球アッセイで評価した。サイトカイン産生とＴ細胞活性化マーカーの両方を測定した。簡潔に述べると、単球をＧＭＣＳＦ及びＩＬ－４とともに７日間培養することによって樹状細胞に分化させた。樹状細胞を、寛容原性に分極化させるか、又は免疫原性ＤＣに分極化させ、免疫刺激性の陽性対照として機能させた。分極の３日後、汎Ｔ細胞及び成熟ＤＣを、ｈ１０Ｆ６又はアイソタイプ対照抗体の存在下で混合した。続いて、サイトカイン産生及びＴ細胞活性化マーカーを４～６日間の共培養後に分析した。寛容原性ＤＣ混合リンパ球アッセイにおけるｈ１０Ｆ６処理は、ＩＦＮγ、ＩＬ－１２ｐ７０、及びＩＬ－１８を含む炎症誘発性サイトカインの時間依存的な２～３倍の誘導によって証明されるように、Ｔ細胞活性化をもたらした（図２３、パネルＡ及びＣ）。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９及び増殖マーカーＫｉ６７の顕著な増加も観察され、免疫原性ＤＣ共培養によって示される最大活性化の４０～７０％に達した（図２３、パネルＢ）。まとめると、これらのデータは、寛容原性ＤＣの存在下でＴ細胞機能をレスキューするｈ１０Ｆ６の能力を示す。

【0285】

Ｂ．ＩＬ－２の分泌及びＩＮＦγの産生を評価する汎Ｔ細胞アッセイにおける抗ＣＤ２００Ｒ１抗体の効果
Ｔ細胞機能をレスキューするｈ１０Ｆ６の能力について、プレート結合ＣＤ２００－Ｆｃの存在下での汎Ｔ細胞アッセイで評価した（図２４、パネルＡ）。健康なＰＢＭＣドナーから分離されたヒト汎Ｔ細胞を、フィトヘマグルチニン及びＩＬ－２で７日間、完全培地で慢性的に刺激した。次いで、細胞を回収し、刺激剤を休止し、ＩＬ－４で２４時間プライミングした。この前処理により、汎Ｔ細胞でのＣＤ２００Ｒ１発現が増加し、リガンド（ＣＤ２００）に対する感受性が高まった。５０ｎＭ ｈ１０Ｆ６による汎Ｔ細胞の処理は、プレート結合ＣＤ２００－Ｆｃの存在下でＩＬ－２分泌の機能的レスキューを示した。ｈ１０Ｆ６はまた、用量依存的にＩＦＮγ産生をレスキューした（図２４、パネルＢに示す、０．０７ｎＭのＥＣ５０）。したがって、ｈ１０Ｆ６は、骨髄細胞とは無関係にＴ細胞機能も直接調節する。

【0286】

実施例１６：抗ＣＤ２００Ｒ１抗体は、ＰＢＭＣ媒介による腫瘍細胞殺傷を用量依存的にリアルタイムで増強する
標的腫瘍細胞（内因性ＣＤ２００を発現するＣＯＶ６４４細胞）を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するよう操作した。ＧＦＰ標識ＣＯＶ６４４腫瘍細胞を健康なドナーＰＢＭＣとインキュベートした。刺激剤（ＳＥＢ）も、免疫細胞を活性化するために培地に添加した。ＰＢＭＣを介する腫瘍細胞の殺傷を、各ウェルの蛍光強度の経時的な損失を測定することによって定量化した。

【0287】

免疫媒介性の腫瘍細胞の殺傷は、蛍光シグナルの喪失が腫瘍細胞の殺傷と一致することを確認するために、目視検査によって確認した。プライミング及び活性化の成功は、標識されていない免疫細胞のクラスター化によって明らかであった。免疫細胞の殺傷は、ＧＦＰ標識細胞膜の破壊と標的腫瘍細胞の収縮によって確認された。ｈ１０Ｆ６を、リアルタイムのＩｎｃｕＣｙｔｅ腫瘍増殖アッセイで３人の異なるドナーで試験した。実施された合計２４の試験のうち１５において、ｈ１０Ｆ６は、アイソタイプ対照と比較した、ウェル当たりのＧＦＰシグナルの減少によって定量化されるように、抗腫瘍殺傷活性を促進した。ｈ１０Ｆ６は、用量依存的に、ＳＥＢプライミングＰＢＭＣ媒介腫瘍細胞死を促進した（図２５）。

【0288】

図２５において、ｈ１０Ｆ６効果を示した１５回のＩｎｃｕＣｙｔｅ ＰＢＭＣ媒介腫瘍殺傷実験の殺傷期からのＧＦＰシグナルの曲線下面積（ＡＵＣ）を、非線形の阻害剤応答回帰モデルにフィットさせ、データの適合度を評価した。３人のドナーによる６回の実験では、Ｒ２≧０．４０の許容しきい値を超えた。これらの６つの実験からのデータを、アイソタイプ対照と比較した％ＰＢＭＣ媒介腫瘍殺傷に変換した。腫瘍殺傷率の個々の値を計算し（濃度ごとにｎ＝４で反復）、腫瘍殺傷率の平均値に変換した。アイソタイプ対照と比較した殺傷された腫瘍細胞の増加率として報告された平均殺傷率を、ｈ１０Ｆ６濃度によってプロットし、反復実験からのドナー固有のデータを集計し、図２６に示すように、ドナーによるアッセイでのｈ１０Ｆ６のＥＣ５０を報告する。

【0289】

３人のドナーにわたるＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞殺傷の値を表１６に報告する。ｈ１０Ｆ６はＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞殺傷を濃度依存的に増加させ、平均ＥＣ５０が１．３７ｎＭ（又は０．２０μｇ／ｍＬ、範囲：０．１７～２．３８ｎＭ）であった。アイソタイプ対照と比較して、ｈ１０Ｆ６はＰＢＭＣを介する腫瘍細胞の殺傷を最大５２．９％（個人）増加させ、３人のドナー全体で３５．２％の平均最大効果があった（０％はアイソタイプ対照によって得られた殺傷であり、１００％は、腫瘍細胞が殺傷期全体でＧＦＰシグナルを放出しなかった場合である）。

【0290】

【表16】

【0291】

ｈ１０Ｆ６の能力は、ＳＥＢで刺激されたドナーＰＢＭＣの存在下で、ＰＢＭＣを介するＣＤ２００＋がん細胞の死を強力に増強した。

【0292】

実施例１７：ｈ１０Ｆ６．Ｖ１を使用した毒物学的試験
ｈ１０Ｆ６の非臨床安全性評価には、インビトロ薬学データ、潜在的オフターゲット結合を評価するインビボＰＫ試験からの許容度データ、インビトロでのサイトカイン放出、ｈ１０Ｆ６の組織交差反応性、及びサロゲート抗体ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の許容度及びＧＬＰ毒物学的試験、の評価を含めた。

【0293】

ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の忍容性と、オフターゲット結合及び毒性の可能性を、ラット及びカニクイザルにおけるｈ１０Ｆ６の単回投与ＩＶボーラス投与後に評価した。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１による、末梢ヒト免疫細胞によるサイトカイン放出を誘導する能力も評価した。

【0294】

Ａ．Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける忍容性
ｈ１０Ｆ６．Ｖ１は、１０ｍｇ／ｋｇの用量までの単回ＩＶボーラス注射（１～２ｍＬ／ｋｇ）（２／性別／群；１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）で忍容された。動物を、各投与又はサンプル収集時点で、有意な臨床徴候、瀕死、及び死亡率について観察した。投与時と７、１４、及び２１日目に体重を記録した。早期死亡率又は瀕死状態はなく、被験物質に関連する臨床徴候又は体重の変化はなかった。結論として、例えば１０ｍｇ／ｋｇまでの単回ＩＶ投与後のラットにおけるｈ１０Ｆ６．Ｖ１のオフターゲット結合を示す明白な毒性は観察されなかった。

【0295】

Ｂ．カニクイザルにおける忍容性
ｈ１０Ｆ６．Ｖ１は、カニクイザル（２ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇで雌雄各２匹）に２０ｍｇ／ｋｇの用量まで単回ＩＶボーラス注射（２ｍＬ／ｋｇ）を行った後、忍容性が良好であった。動物に対し、研究現場に到着した時点で、認定された獣医スタッフによって一般的な健康状態についてスクリーニングした。コロニー固有の参照データと一致する臨床病理学的パラメータを有する健康状態の良好な動物のみを試験に供した。投与日に、動物を、投与後最初の６時間の各サンプル採取時点の前後に観察し、サンプル採取のその後の各時点で再び観察した。投与後、重要な臨床徴候、死亡率、疼痛及び苦痛の徴候について少なくとも１日２回、一般的な健康状態及び外観について少なくとも１日１回、動物を観察した。投与前、投与時、及び少なくとも毎週投与後に体重を記録した。血液学的及び血清化学的な変化を評価するために、投与前、投与後２４時間、及び投与後３５日に血液を採取した。早期死亡率又は瀕死状態はなく、臨床徴候、体重、血液学的又は臨床化学的側面において、被験物質に関連する変化もなかった。結論として、２０ｍｇ／ｋｇまでの単回ＩＶ投与後のカニクイザルにおけるｈ１０Ｆ６のオフターゲット結合を示す明らかな毒性は観察されなかった。

【0296】

Ｃ．サイトカイン放出アッセイ
ｈ１０Ｆ６への曝露後のＰＢＭＣによるサイトカイン放出の可能性を評価し、影響がないことがわかった。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１による処理に対する１０人の健康なヒトドナー由来の全血及びＰＢＭＣサンプルの反応を、抗ＣＤ３抗体又はＳＥＢ処理（それぞれＰＢＭＣ及び全血アッセイのポジティブ対照）、ヒト化抗ニワトリリゾチームＩｇＧ１カッパ（Ｎ２９７Ｇ Ｆｃドメイン変異アイソタイプ対照処理（アイソタイプネガティブ対照）、及び無処理対照、と比較した。全血サンプルを可溶性フォーマットで処理し、ＰＢＭＣをプレート結合ウェットコーティングフォーマットで処理した。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の濃度依存的応答を、両方の処理形式で、０．００２、０．０２、０．２、２、及び２０μｇ／ｍｌで解析した。サイトカイン放出を、ＩＬ－２、ＩＬ－６ ＴＮＦα、及びＩＦＮγの誘導について、処理後２４時間の単一の時点で評価した。

【0297】

ｈ１０Ｆ６．Ｖ１処理は、試験したどの濃度又は条件下でも、顕著なＩＬ－２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγサイトカインの放出を誘発しなかった。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１処理は、全血可溶性フォーマットで顕著なＩＬ－６放出を誘発しなかった。ｈ１０Ｆ６処理後、全てのドナーは、ＰＢＭＣプレート結合ウェットコーティング形式で低から中程度のレベルのＩＬ－６を有していた。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１で処理したサンプルで観察されたＩＬ－６のレベルは、アイソタイプＩｇＧ１陰性対照抗体処理と同等であり、同じ濃度で使用した場合、抗ＣＤ３陽性対照よりも低かった。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の濃度と測定されたＩＬ－６のレベルとの間に相関は観察されなかった。ｈ１０Ｆ６は、１０人の健康なヒトドナーからの全血（例えば、可溶性処理フォーマット）又はＰＢＭＣ（例えば、プレート結合、湿式コーティング処理フォーマット）で試験した場合、陰性対照を超えるＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦα、又はＩＦＮγのインビトロでのサイトカイン放出の証拠を示さなかった。

【0298】

実施例１８：例示的サロゲート抗体の薬理学
Ａ．Ｅｘｐｉ－ＨＥＫ２９３細胞におけるサロゲート抗体非臨床試験材料の産生
ｈ１０Ｆ６は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類（アカゲザル、マーモセット、カニクイザル）を含む試験した非臨床種で発現したＣＤ２００Ｒ１と交差反応しない。したがって、カニクイザルＣＤ２００Ｒ１、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１に結合する完全にヒト化されたサロゲート抗体を、ＣＤ２００Ｒ１阻害に関連する潜在的な危険性を評価するために開発した。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１はｈ１０Ｆ６の変異体であり、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）領域の３つのアミノ酸と軽鎖ＣＤＲ領域の１つのアミノ酸を除いて、同じ一次配列を共有している。

【0299】

ｈ１０Ｆ６．Ｖ１は、ｈ１０Ｆ６について説明したのと同じプロセスを使用して、Ｅｘｐｉ－ＨＥＫ２９３発現システムで産生させた。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の特徴を以下の表１７に示す。

【0300】

【表17】

【0301】

Ｂ．カニクイザルから単離されたＰＢＭＣへのサロゲート抗体の結合
ｈ１０Ｆ６．Ｖ１がカニクイザル細胞に発現する内因性ＣＤ２００Ｒ１に結合することを確認するために、カニクイザル由来のＰＢＭＣを使用したフローサイトメトリーによって、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の末梢免疫細胞サブセットへの結合を測定した。

【0302】

３匹のサルから単離されたＰＢＭＣにおいて、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞への予想される結合を示した（図２７）。Ｔ細胞への結合を、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の段階希釈を試験することによって評価した。用量依存的な結合が観察され、ＥＣ５０値は０．３４～１．５４ｎＭの範囲であった。

【0303】

Ｃ．サロゲート抗体によるＭｆＣＤ２００／ＭｆＣＤ２００Ｒ１相互作用のブロック
ＭｆＣＤ２００Ｒ１の固定化ＭｆＣＤ２００への結合をブロックするｈ１０Ｆ６．Ｖ１の能力を、ＥＬＩＳＡを使用して実施した。図２８に示されるように、サロゲート抗体は、ＭｆＣＤ２００Ｒ１：ＭｆＣＤ２００相互作用を２．４５ｎＭのブロッキングＩＣ５０値でブロックした。

【0304】

ヒト単球細胞株、Ｋ５６２を、ＭｆＣＤ２００Ｒ１を安定して発現するよう操作した。ＭｆＣＤ２００Ｒ１の配列を、バイオインフォマティクス解析及び２匹のドナーサルの食道から抽出したＲＮＡを使用したシークエンシング実験の確認によって明確に決定した。ＭｆＣＤ２００Ｒ１を発現するＫ５６２細胞への非グリコシル化ｈＩｇＧ１ Ｆｃタグと融合したＭｆＣＤ２００の結合を、ＦＡＣＳによって確認した。この結合は、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１によって強力にブロックされた（ＩＣ５０＝０．５０ｎＭ）が、非ＭｆＣＤ２００Ｒ１バインダーｈ１０Ｆ６はこの相互作用をブロックしなかった（図２９）。

【0305】

Ｄ．カニクイザルにおけるサロゲート抗体の単回投与薬物動態
ｈ１０Ｆ６．Ｖ１は、カニクイザル由来のＣＤ２００Ｒ１に対して高い結合親和性を有するｈ１０Ｆ６のサロゲートである。ｈ１０Ｆ６は主要な毒物学種であるカニクイザル由来のＣＤ２００Ｒ１に結合しないため、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の単回投与ＰＫ試験を実施して、カニクイザルにおけるそのＰＫ特性及び忍容性を評価し、ＧＬＰハザード同定試験での使用への適合性を判断した。サルにおけるｈ１０Ｆ６．Ｖ１の濃度－時間ＰＫプロファイルを図３０に示す。

【0306】

サルにおけるｈ１０Ｆ６．Ｖ１の平均ＰＫパラメータを以下の表１８に要約する。カニクイザルへの２０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶボーラス注射の後、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１血清濃度は二相的に低下した。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の除去は、時間に対して直線的であり、３５日間までＡＤＡ又は他の非線形除去挙動（例えば、標的媒介薬物動態；ＴＭＤＤ）の証拠がないことを示唆した。平均最終半減期は１０．２日で、クリアランスの平均値及び定常状態での分布の推定量は、サルにおいて線形ＰＫを示すヒト化ＩｇＧの典型的であり得る値と一致していた。

【0307】

【表18】

【0308】

ｈ１０Ｆ６．Ｖ１はサルで直線的なＰＫを示し、試験された２０ｍｇ／ｋｇの用量で、直線的で非飽和性の非特異的なクリアランスメカニズムが、サルにおけるｈ１０Ｆ６．Ｖ１の除去の主要な要因であることを示唆している。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１は、臨床観察及び血清化学的及び血液学的パラメータの評価に基づいて、３５日目まで十分に許容された（セクション１４．２．３．１を参照）。したがって、サルにおけるｈ１０Ｆ６．Ｖ１のＰＫ及び忍容性は、ｈ１０Ｆ６の代用としての適合性と、ＧＬＰ毒物学的試験での使用を裏付けるものである。

【0309】

実施例１９：サロゲート抗体を使用した毒物学的試験
他の種で発現されたＣＤ２００Ｒ１へのｈ１０Ｆ６の結合の評価は、非臨床安全性を評価するために使用される種で発現されたＣＤ２００Ｒ１と交差反応しないことを明らかにした。その結果、薬学的に関連する動物種におけるｈ１０Ｆ６の潜在的な毒性の評価は不可能であり、カニクイザル由来のＣＤ２００Ｒ１に結合する代替抗体ｈ１０Ｆ６．Ｖ１を開発し、ハザードを特定する目的で非臨床的な安全性を評価した。

【0310】

Ａ．カニクイザルの単回投与試験における忍容性
ｈ１０Ｆ６．Ｖ１を、１回のＩＶボーラス注射（２ｍＬ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ）の後、カニクイザル（雄３匹）で十分に許容された。動物に対し、研究現場に到着した時点で、認定された獣医スタッフによって一般的な健康状態についてスクリーニングした。コロニー固有の参照データと一致する臨床病理学的パラメータを有する健康状態の良好な動物のみを試験に供した。投与日に、動物を、投与後最初の６時間の各サンプル採取時点の前後に観察し、サンプル採取のその後の各時点で再び観察した。投与後、重要な臨床徴候、死亡率、疼痛及び苦痛の徴候について少なくとも１日２回、一般的な健康状態及び外観について少なくとも１日１回、動物を観察した。投与前、投与時、及び少なくとも毎週投与後に体重を記録した。血液学的及び血清化学的な変化を評価するために、投与前、投与後２４時間、及び投与後３５日に血液を採取した。早期死亡率又は瀕死状態はなく、臨床徴候、体重、血液学的又は臨床化学的側面において、被験物質に関連する変化もなかった。２０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後のカニクイザルにおけるＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ１相互作用の阻害が危険であることを示し得る明白な毒性は観察されなかった。

【0311】

Ｂ．カニクイザルにおける反復投与試験における毒性学及び安全性薬理学
反復投与ＧＬＰ試験では、ＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ１相互作用の中断と潜在的に関連する毒性のハザードを特定する目的で、雄及び雌のカニクイザルに低速ボーラスＩＶ注射によって週１回、例えば４週間投与した場合の、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の潜在的な毒性を測定することができる。この試験では、６週間の回復期間後の結果の潜在的な可逆性も評価できる。更に、ＴＫ特性及び探索的バイオマーカーを評価できる。用量は、上記のような非ＧＬＰ単回用量ＰＤ試験に基づいて選択することができる。ＲＯ予測に基づいて、１００ｍｇ／ｋｇ／用量は、長期間にわたり標的を飽和させることができる。１０ｍｇ／ｋｇ／用量レベルでは観察可能な徴候は見られず、週１回の投与間隔で約９９％のＲＯが得られる。試験デザインを以下の表１９に示す。

【0312】

【表19】

【0313】

臨床観察、体重、体重変化、摂餌量、眼科、血液学、臨床化学、凝固、尿検査、臓器重量、肉眼的及び顕微鏡的組織病理学などの、標準的な毒性学的エンドポイントに対する被験物質関連の影響を評価できる。更に、安全性薬理パラメータ（神経行動、心電図、心拍数、血圧、又は呼吸数）への影響をモニターできる。標準パラメータに加えて、末梢血免疫表現型パラメータ（ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ２０、ＣＤ４、Ｋｉ６７、及びＣＤ８）及びサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＩＦＮγ、及びＴＮＦα）レベルを、例えば検証済みのアッセイを使用してモニターできる。ＴＫ及び探索的バイオマーカー分析用のサンプルを、評価のために採取できる。局所的な忍容性も評価できる。

【0314】

この試験では、次のパラメータ及びエンドポイントを評価した：死亡率、臨床観察、体重、定性的な食物消費、眼科、定性的な心電図、体温、神経学的検査、呼吸数、臨床病理学パラメータ（血液学、凝固、臨床化学、及び尿検査）、生物分析及び毒物動態パラメータ、抗薬物抗体パラメータ、免疫表現型検査、受容体占有率分析、サイトカイン分析、探索的血漿処理、ＲＮＡの探索的全血、臓器重量、及び肉眼及び顕微鏡検査。

【0315】

カニクイザルへの１０又は１００ｍｇ／ｋｇのｈ１０Ｆ６．Ｖ１の週１回４週間の静脈内ボーラス注射による投与は、臨床観察、摂餌量、体重、眼科検査、心電図、体温、神経学的検査、呼吸数、血液学、凝固、臨床化学、尿検査パラメータ、又は骨髄細胞学に係る変化と関連していなかった。

【0316】

免疫表現型検査では、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１関連の変化は、１０及び１００ｍｇ／ｋｇ群で、投与前１５日目及び２９日目に観察されたＴリンパ球、ＣＤ２５＋Ｔリンパ球、及びＮＫ細胞でのＫｉ６７発現の増加に限定されていた。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１の投与により、１日目１０ｍｇ／ｋｇ群では、投与後４８時間及び投与前８日に、また１日目１００ｍｇ／ｋｇ群では、投与後４８時間から６３日目の回復期間の終わりまで、好中球の遊離受容体％が減少し、受容体占有率（％ＲＯ）が増加した。また、２２日目：投与後４８時間で両用量群のＴヘルパーリンパ球の総受容体％が増加し、１日目：投与後４８時間から２９日目まで、両方の用量群でＴリンパ球の％ＲＯが増加した。これらの増加は、５０日目までにほぼベースラインに戻った。両方の用量群で、他の試験細胞集団又は活性化マーカーにｈ１０Ｆ６．Ｖ１関連の変化はなかった。

【0317】

サイトカイン評価では、試験前及び対照範囲と比較して、投与された全ての動物において、いずれの時点においても、血漿中のＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＩＦＮ－γ、及びＴＮＦ－αの濃度に、何らのｈ１０Ｆ６．Ｖ１投与に起因する可能性のある変化は見られなかった。

【0318】

顕微鏡観察による評価では、安楽死の末期に、１００ｍｇ／ｋｇを投与された１匹の雌の脳（軽度）及び眼（軽度）、≧１０ｍｇ／ｋｇを投与された動物の下垂体（最小）、及び１００ｍｇ／ｋｇを投与された雄の副腎（最小）で、単核細胞浸潤の高い発生率及び／又は重症度が観察された。回復安楽死時に、１００ｍｇ／ｋｇを投与された１匹の雄の脳（軽度）、１００ｍｇ／ｋｇを投与された１匹雌の下垂体（最小）、及び１００ｍｇ／ｋｇを投与された雄の副腎（最小）で、単核細胞浸潤の高い発生率及び／又は重症度が観察された。単核細胞浸潤は、背景所見として、又は生物製剤の投与に関連して観察できる。投与された動物で観察されたより高い発生率及び／又は重症度、雌雄間の発生率の不一致、及び重症度の差の大きさは、これらの浸潤が直接的なｈ１０Ｆ６．Ｖ１関連効果よりもむしろ生物製剤の投与に関連する非特異的なクラス効果を表している可能性が最も高いことを示唆しているが、寄与及び／又は直接的なｈ１０Ｆ６．Ｖ１関連の影響を完全に排除することはできない。最終安楽死及び回復安楽死では、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１に関連する臓器重量の違い又は肉眼的所見は観察されなかった。

【0319】

結論として、１、８、１５、及び２２日目に週１回、静脈内（低速ボーラス）注射によるｈ１０Ｆ６．Ｖ１の投与は、カニクイザルにおいて、≦１００ｍｇ／ｋｇで良好に忍容された。組織病理学的変化は、脳、眼（安楽死終末のみ）、及び１００ｍｇ／ｋｇでの下垂体、及び≧１０ｍｇ／ｋｇでの副腎、における単核細胞浸潤からなった。これらの変化は、抗薬物抗体による免疫複合体に関連している可能性があり、有害ではないと考えられた。以上の結果から、無影響量は１００ｍｇ／ｋｇと判断された。

【0320】

実施例２０：ｈ１０Ｆ６及びサロゲート抗体についての比較薬理の要約
Ｅｘｐｉ－２９３ＨＥＫ細胞で生成された材料を使用して生成された予備的データは、以下の表２０に示すように、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１が２．６３ｎＭのＫＤで組換えＭｆＣＤ２００Ｒ１に結合することを示しており、ＭｆＣＤ２００Ｒ１に対するその結合親和性が、ｈ１０Ｆ６のｈＣＤ２００Ｒ１に対する結合親和性と同等（～２０倍以内）であり得ることを示している。組換えタンパク質結合試験の結果と一致して、試験したサロゲート抗体は、ヒトＴ細胞に結合するｈ１０Ｆ６に匹敵する親和性（約４倍以内；表２０）で、ＣＤ２００Ｒ１を発現する初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞に結合できる。更に、インビトロブロッキング試験の結果は、ｈ１０Ｆ６．Ｖ１が、ＥＬＩＳＡ及びＭｆＣＤ２００Ｒ１過剰発現細胞ベースのシステムの両方で、ヒトｈＣＤ２００Ｒ１及びｈＣＤ２００に対してｈ１０Ｆ６に匹敵する効力で、ＭｆＣＤ２００Ｒ１とＭｆＣＤ２００の間の相互作用を～６～７倍でブロックできることを示した（表２０）。

【0321】

【表20】

【0322】

まとめると、これらの結果は、サロゲート抗体ｈ１０Ｆ６．Ｖ１が、ｈＣＤ２００Ｒ１：ｈＣＤ２００の結合のｈ１０Ｆ６による阻害と同等の方法で、ＭｆＣＤ２００Ｒ１：ＭｆＣＤ２００の結合を阻害できることを示す。

【0323】

ｈ１０Ｆ６及びｈ１０Ｆ６．Ｖ１の比較薬物動態
ｈ１０Ｆ６．Ｖ１及びｈ１０Ｆ６のＰＫ特性は、ＩＶボーラス注射による２０ｍｇ／ｋｇの単回投与でカニクイザルで評価した場合に類似していた。ｈ１０Ｆ６．Ｖ１及びｈ１０Ｆ６の平均最終半減期は、それぞれ１０．２日及び１１．５～１３．３日であり、それらの曝露は同等であった（Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔで測定して１．５倍以内）。ＣＨＯ－Ｋ１細胞で得られたｈ１０Ｆ６．Ｖ１のＰＫは、ＧＬＰハザード同定試験で評価する予定である。ｈ１０Ｆ６は、ｈＣＤ２００Ｒ１特異的でグリコシル化されていない中性荷電ＩｇＧ抗体であるため、ｈ１０Ｆ６がＣＨＯ－Ｋ１細胞又はＥｘｐｉ－ＨＥＫ２９３細胞で産生される場合、同様のＰＫ特性を有すると予想される。

【0324】

本発明の前述の開示は、明確化及び理解の目的で例及び例示としていくらか詳細に説明されてきたが、本明細書に記載の実施例、説明、及び実施形態を含む本開示は、例示を目的とし、本開示を制限するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例、説明、及び実施形態に対して様々な改変又は変更を行うことができ、本開示及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び視野内に含まれるべきであることは当業者には明らかであろう。更に、当業者は、本明細書に記載されているものと同等な多くの方法及び手順を認識するであろう。そのような全ての同等物は、本開示の範囲内にあると理解されるべきであり、添付の特許請求の範囲によって網羅される。

【0325】

本発明の追加の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載されている。

【0326】

そのような個々の出版物、特許、特許出願、又は他の文書が各々参照により、その全体をあらゆる目的で本明細書に組み込むために個別具体的に示され、本明細書にその全体が記載されたかのような場合と同程度に、本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、又は他の文書の開示は、あらゆる目的でその全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、規定用語を含む本明細書が優先されるであろう。
参考文献
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【0327】

【数3】

（Ａｌａ－Ａｌａ）ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｎａｌ Ａｌｌｏｇｒａｆｔ Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ”，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６８（５）：６０８－６１６（１９９９））．
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【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【配列表】

2023528375000001.app

【国際調査報告】