特表 2023-528415 ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用した系列特異的抗原の阻害のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-04

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用した系列特異的抗原の阻害のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20230627BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20230627BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230627BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230627BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20230627BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20230627BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230627BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 38/50 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20230627BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230627BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230627BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230627BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230627BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230627BHJP

   A61K 38/47 20060101ALN20230627BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61P7/00

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 121

A61K35/28

A61K35/15

A61K35/76

A61K48/00

A61K38/50

A61K47/62

A61K47/68

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61K35/17

C12N15/09 110

C12N15/12

A61K38/47

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022574196

(86)(22)【出願日】2021-06-03

(85)【翻訳文提出日】2023-01-16

(86)【国際出願番号】 US2021035691

(87)【国際公開番号】W WO2021247856

(87)【国際公開日】2021-12-09

(31)【優先権主張番号】63/033,966

(32)【優先日】2020-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/033,970

(32)【優先日】2020-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/183,791

(32)【優先日】2021-05-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】306018457

【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ムカジー，シッダールタ

(72)【発明者】

【氏名】ボロット，フローレンス

(72)【発明者】

【氏名】アリ，アブドゥッラー マフムード

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC14

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA41

4C084BA44

4C084DC22

4C084NA13

4C084ZA511

4C084ZB261

4C084ZB271

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB12

4C085BB50

4C085CC03

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB34

4C087BB37

4C087BB44

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA12

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA51

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

(57)【要約】

本書では、血液学的悪性腫瘍の免疫療法のために、ＣＤ３３またはＥＭＲ２などの系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤と、ＣＤ３３またはＥＭＲ２などの系列特異的細胞表面抗原の発現が改変されている造血細胞集団とを投与する方法が開示される。また本書では、血液学的悪性腫瘍の免疫療法のために、複数の系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤と、複数の系列特異的細胞表面抗原の発現が改変されている造血細胞集団とを投与する方法も開示される。ＣＤ３３、もしくはＥＭＲ２、または複数の系列特異的細胞表面抗原に変異を含む細胞も提供され、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用してそのような細胞を産生する方法も提供される。
【選択図】図４Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、前記改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＣＤ３３のエキソン２によってコードされるエピトープの発現レベル低下を引き起こす、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項2】

前記改変は、ＣＤ３３のエキソン２内の前記スプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位におけるヌクレオチド置換である、請求項１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項3】

前記改変は、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションのヌクレオチド配列におけるヌクレオチド置換である、請求項１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項4】

前記改変は、ＣからＴ、ＧからＡ、ＡからＧ、及びＴからＣからなる群から選択されるヌクレオチド置換である、請求項３に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項5】

遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位を含み、前記改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＥＭＲ２のエキソン１３によってコードされるエピトープの発現レベル低下を引き起こす、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項6】

前記改変は、ＥＭＲ２のエキソン１３内の前記スプライスドナー部位におけるヌクレオチド置換である、請求項５に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項7】

前記改変は、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションのヌクレオチド配列におけるヌクレオチド置換である、請求項５に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項8】

前記改変は、ＣからＴ、ＧからＡ、ＡからＧ、及びＴからＣからなる群から選択されるヌクレオチド置換である、請求項７に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項9】

遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、系列特異的抗原をコードする第１の内因性遺伝子のエキソン内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位と、系列特異的抗原をコードする第２の内因性遺伝子のエキソン内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位とを含み、前記改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、前記第１の内因性遺伝子の前記エキソンによってコードされるエピトープの発現レベル低下及び／または前記第２の内因性遺伝子の前記エキソンによってコードされるエピトープの発現低下を引き起こす、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項10】

前記第１の内因性遺伝子はＣＤ３３であり、前記エキソンはエキソン２であり、前記第２の内因性遺伝子はＥＭＲ２であり、前記エキソンはエキソン１３である、請求項９に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項11】

遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、系列特異的抗原をコードする遺伝子に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含み、前記ヌクレオチド置換は、スプライスエレメントをコードする配列内に含まれ、前記ヌクレオチド置換は、前記遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらし、前記選択的スプライシングは、野生型の同等の細胞と比較した場合、前記遺伝子によってコードされるエピトープの発現レベル低下を引き起こし、前記エピトープは、免疫療法剤によってターゲティングされる、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項12】

前記スプライスエレメントは、スプライスアクセプター、スプライスドナー、スプライスエンハンサー、及びスプライスサイレンサーからなる群から選択される、請求項１１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項13】

選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす、請求項１１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項14】

選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす、請求項１１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項15】

前記ヌクレオチド置換は、ＣからＴ、ＧからＡ、ＡからＧ、及びＴからＣからなる群から選択される、請求項１１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項16】

ＣＤ３４＋である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項17】

対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞に由来する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項18】

前記対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である、請求項１７に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項19】

前記対象は、健康なヒトドナーである、請求項１７に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項20】

予測されるオフターゲット部位のいずれにも変異を含まない、請求項１～１９のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項21】

請求項１～２１のいずれか１項に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を複数含む細胞集団。

【請求項22】

系列特異的抗原をコードする遺伝子に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）スプライスエレメントを含む前記造血幹細胞または前駆細胞のゲノム内のヌクレオチド配列をターゲティングするターゲティングドメインを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓ９エンドヌクレアーゼを導入することとを含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する前記方法。

【請求項23】

前記スプライスエレメントは、スプライスアクセプター、スプライスドナー、スプライスエンハンサー、及びスプライスサイレンサーからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

遺伝子中の前記少なくとも１つのヌクレオチド置換は、選択的スプライシングを引き起こす、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

遺伝子中の前記少なくとも１つのヌクレオチド置換は、選択的スプライシングを引き起こし、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記ヌクレオチド置換は、ＣからＴ、ＧからＡ、ＡからＧ、及びＴからＣからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。

【請求項28】

前記ｇＲＮＡは、配列番号１～４及び４６～４７からなる群から選択される配列を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項29】

前記系列特異的抗原はＣＤ３３である、請求項２２に記載の方法。

【請求項30】

前記系列特異的抗原はＥＭＲ２である、請求項２２に記載の方法。

【請求項31】

第１の系列特異的抗原及び第２の系列特異的抗原をコードする遺伝子に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）スプライスエレメントを含む前記造血幹細胞または前駆細胞のゲノム内の第１のヌクレオチド配列をターゲティングするターゲティングドメインを含む第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した、第１の触媒的に損なわれたＣａｓ９エンドヌクレアーゼを導入することと、
（ｉｉｉ）前記細胞に、（ａ）スプライスエレメントを含む前記造血幹細胞または前駆細胞のゲノム内の第２のヌクレオチド配列をターゲティングするターゲティングドメインを含む第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した、第２の触媒的に損なわれたＣａｓ９エンドヌクレアーゼをさらに導入することとを含み、これにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する前記方法。

【請求項32】

前記スプライスエレメントは、スプライスアクセプター、スプライスドナー、スプライスエンハンサー、及びスプライスサイレンサーからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

遺伝子中の前記少なくとも１つのヌクレオチド置換は、選択的スプライシングを引き起こす、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす、請求項３１に記載の方法。

【請求項35】

遺伝子中の前記少なくとも１つのヌクレオチド置換は、選択的スプライシングを引き起こし、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす、請求項３１に記載の方法。

【請求項36】

前記ヌクレオチド置換は、ＣからＴ、ＧからＡ、ＡからＧ、及びＴからＣからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記第１のｇＲＮＡは、配列番号１～３からなる群から選択される配列を含み、前記第２のｇＲＮＡは、配列番号４及び４６～４７からなる群から選択される配列を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項38】

前記第１の系列特異的抗原はＣＤ３３であり、前記第２の系列特異的抗原はＥＭＲ２である、請求項３１に記載の方法。

【請求項39】

前記塩基エディターは、シトシン塩基エディターである、請求項２２～３８のいずれかに記載の方法。

【請求項40】

前記塩基エディターは、アデノシン塩基エディターである、請求項２２～３８のいずれかに記載の方法。

【請求項41】

（ａ）及び（ｂ）は、前記細胞に導入される１つのベクターにおいてコードされる、請求項２２～４０のいずれかに記載の方法。

【請求項42】

前記ベクターはウイルスベクターである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

（ｂ）はタンパク質形態にあり、（ａ）及び（ｂ）は、予備形成されたリボ核タンパク質複合体として前記細胞に導入される、請求項２２～４０のいずれかに記載の方法。

【請求項44】

前記リボ核タンパク質複合体は、電気穿孔を介して前記細胞に導入される、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記造血幹細胞または前駆細胞はＣＤ３４＋である、請求項２２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記造血幹細胞または前駆細胞は、対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する、請求項２２～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記対象は造血障害を有する、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

請求項２２～４７のいずれか１項に記載の方法によって産生された、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。

【請求項49】

造血障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～２０及び４８のいずれか１項に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または請求項２１に記載の細胞集団の有効量を投与することを含む前記方法。

【請求項50】

前記造血障害は造血器悪性腫瘍である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

系列特異的抗原をターゲティングする薬剤の有効量を前記対象に投与することをさらに含み、前記薬剤は、前記系列特異的抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む、請求項４９または請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記系列特異的抗原をターゲティングする前記薬剤は、前記系列特異的抗原と結合する前記抗原結合性フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記系列特異的抗原はＣＤ３３またはＥＭＲ２である、請求項５１及び５２に記載の方法。

【請求項54】

前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤の有効量を前記対象に投与することをさらに含み、前記薬剤は、前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む、請求項５１～５３に記載の方法。

【請求項55】

前記免疫細胞はＴ細胞である、請求項５２に記載の方法。

【請求項56】

前記免疫細胞、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、またはその両方は、同種異系である、請求項４９～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記免疫細胞、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、またはその両方は、自己由来である、請求項４９～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記対象は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を有するヒト患者である、請求項４９～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記対象は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ芽球性白血病である白血病を有するヒト患者である、請求項５８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０２０年６月３日に出願された米国第６３／０３３，９６６号、２０２０年６月３日に出願された米国第６３／０３３，９７０号、及び２０２１年５月４日に出願された米国第６３／１８３，７９１号の優先権を主張し、これら各々の内容全体は、参照により本書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表が含まれ、その全体は参照によりここに組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

標的免疫療法の出現は新たな可能性を開き、リンパ芽球性白血病患者に関して大きな成功を示している。しかし、キメラ抗原Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）の臨床試験では、ターゲティング可能な独特の細胞表面抗原がないことから、ＣＤ１９標的免疫療法を超える成功は限られることが示されている。実際、ＣＤ１９免疫療法の成功は、免疫グロブリンの補充により管理できるＢ細胞形成不全にかかっている。

【0004】

しかし、あらゆる標的免疫療法のアプローチは、がん性細胞において独特にまたは優先的に発現される抗原を必要とする。実際、抗原が免疫療法の理想的な候補となるためには、その抗原はがん細胞に特有であり、その生存に不可欠であり、正常細胞では発現しない必要がある。今日まで、がん性細胞に対する真に腫瘍特異的な抗原は見出されていない。そのような理想的な抗原が存在しないがんのために、系列特異的であり悪性細胞によって過剰発現される抗原のターゲティングを、系列特異的抗原（ＬＳＡ）を欠く遺伝子工学操作された幹細胞の移植と組み合わせた新たなアプローチが検討された。

【0005】

以前に公開された研究及び特許（米国特許第１０，１３７，１５５号）において、ＣＤ３３をターゲティングするＣＡＲ－Ｔ細胞及び／またはＡＤゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）を使用したアプローチは、系列特異的抗原を欠失させるようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して工学操作されたＣＤ３３ノックアウト（ＫＯ）造血幹細胞の生着及びリポピュレーションに影響を与えることなく、ＣＤ３３＋急性骨髄性白血病保有マウスをレスキューできたことが示された。

【0006】

しかし、ＣＲＩＳＰＲ／ＷＴ Ｃａｓ９によるゲノム編集はＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し、これはｐ５３を介したＤＮＡ損傷応答及び染色体転座に関連付けられている。

【0007】

よって、オフターゲット効果及び消耗性の免疫抑制副作用を引き起こさないターゲティング抵抗性造血幹細胞を生成するために、異なるアプローチが必要である。

【発明の概要】

【0008】

本開示は、系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤（例えば、系列特異的細胞表面抗原をターゲティングするキメラ受容体を発現する免疫細胞）が、系列特異的細胞表面抗原を発現する細胞の細胞死を選択的に引き起こすが、抗原が欠損している細胞（例えば、遺伝子工学操作された造血細胞）は、それによって引き起こされる細胞死を回避するという発見に少なくとも部分的に基づく。このような所見に基づけば、系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤、例えばＣＤ３３をターゲティングするＣＡＲ－Ｔ細胞と、系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）が欠損しているかまたは改変されている造血細胞との組み合わせを用いる免疫療法が、造血器悪性腫瘍の効果的な処置方法をもたらすことは予想されたであろう。

【0009】

本書では、抗体及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を含む治療剤によってターゲティングされるエピトープを欠いているか、または修飾されたエピトープを含むＨＳＣである、ターゲティング抵抗性造血幹細胞を生成するための、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターの使用が記述される。このアプローチはさらに、標的免疫療法と、塩基エディターを用いて生成されたターゲティング抵抗性造血幹細胞の移植とを組み合わせた、血液学的悪性腫瘍患者の処置を可能にし、ＣＲＩＳＰＲ／ＷＴ Ｃａｓ９ゲノム編集の潜在的な遺伝毒性を回避するであろう。この新たなアプローチは、ＣＲＩＳＰＲベースのシトシン塩基エディター及びアデニン塩基エディター（ＣＢＥ及びＡＢＥ）を使用したＨＳＣ／ＨＳＰＣの高い編集効率を可能にする。ＣＢＥ及びＡＢＥは、それぞれシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼに融合したＣａｓ９ニッカーゼであり、ＤＳＢを生成することなく、ターゲットの領域における正確な塩基置換を可能にする。塩基エディターは、ＤＳＢを避けるため、ＤＳＢに起因する望まれないインデル、転座、または再構成をなくす安全性の高い編集ツールと考えられている。

【0010】

一態様において、本開示は、遺伝子工学操作の前には造血細胞上に存在する系列特異的細胞表面抗原が欠損している、遺伝子工学操作された造血細胞（例えば、ＨＳＣ）を提供する。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子の全体または一部が、例えば塩基エディターを使用する（例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを用いる）ゲノム編集によって欠失する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、系列特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子からエキソンを欠失させる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、系列特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子におけるヌクレオチド置換をもたらす。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、スプライスエレメントをコードする配列内にあり、ヌクレオチド置換は、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、内因性遺伝子におけるスプライスエレメントをターゲティングし、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、早期コドン終結を誘導する。いくつかの実施形態では、スプライスエレメントは、スプライスドナー、スプライスアクセプター、スプライスエンハンサー、またはスプライスサイレンサーである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、シトシン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、アデニン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。

【0011】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＣＤ３３である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３のエキソン２内のスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位が改変される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションのヌクレオチド配列が改変される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３をコードするヌクレオチド配列のエキソン２内のスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３のＳＮＰであるｒｓ１２４５９４１９をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションをターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、配列番号３７を含むヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１～３のいずれか１つを含む配列を有する。

【0012】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２である。いくつかの実施形態では、ＥＭＲ２のエキソン１３内のスプライスドナー部位が改変される。いくつかの実施形態では、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションのヌクレオチド配列が改変される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＥＭＲ２をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＥＭＲ２をコードするヌクレオチド配列のエキソン１３内のスプライスドナー部位をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションをターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、配列番号４０を含むヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号４または４６～４７のいずれか１つを含む配列を有する。

【0013】

いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^Δ２細胞またはＣＤ３４^＋／ＥＭＲ^Δ１３）である。

【0014】

いくつかの実施形態では、造血幹細胞は、骨髄細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得することができる。

【0015】

いくつかの態様では、本開示は、第１の系列特異的細胞表面抗原及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原、すなわち、第２の系列特異的細胞表面抗原、第３の系列特異的細胞表面抗原、第４の系列特異的細胞表面抗原などを組み合わせて阻害するための組成物及び方法を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態では、更なる系列特異的細胞表面抗原も、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して造血細胞中で欠失または阻害される。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードする内因性遺伝子の全体または一部が、例えば塩基エディターを使用する（例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを用いる）ゲノム編集によって欠失する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードする内因性遺伝子からエキソンを欠失させる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードする内因性遺伝子におけるヌクレオチド置換をもたらす。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、スプライスエレメントをコードする配列内にあり、ヌクレオチド置換は、遺伝子（複数可）によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、内因性遺伝子（複数可）におけるスプライスエレメントをターゲティングし、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、遺伝子（複数可）によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、早期コドン終結を誘導する。いくつかの実施形態では、スプライスエレメントは、スプライスドナー、スプライスアクセプター、スプライスエンハンサー、またはスプライスサイレンサーである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、シトシン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、アデニン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、アデニン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。

【0017】

いくつかの実施形態では、第１の系列特異的細胞表面抗原はＣＤ３３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原または第２の系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２である。

【0018】

いくつかの実施形態では、複数の更なる系列特異的細胞表面抗原が、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して欠失または阻害される。いくつかの実施形態では、複数の更なる系列特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３及びＥＭＲ２とは異なる。

【0019】

いくつかの実施形態では、造血細胞は、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^Δ２／ＥＭＲ２^Δ１３細胞）である。

【0020】

いくつかの実施形態では、造血幹細胞は、骨髄細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得することができる。

【0021】

いくつかの態様では、本開示は、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含む、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を提供する。本開示の一態様は、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞であって、野生型の同等物と比較した場合、ＣＤ３３のエキソン２によってコードされるエピトープの発現レベルが低下している遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、野生型の同等物によって発現されるＣＤ３３のエピトープの１０％未満を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、ＣＤ３３のエピトープを発現しない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３のエキソン２内のスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位が改変される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションのヌクレオチド配列が改変される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞はＣＤ３４^＋である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、対象（例えば、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者、または健康なドナー）の骨髄細胞または末梢血単核細胞に由来する。

【0022】

いくつかの態様では、本開示は、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位を含む、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を提供する。本開示の一態様は、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を提供し、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、野生型の同等物と比較した場合、ＥＭＲ２のエキソン１３によってコードされるエピトープの発現レベルが低下している。本開示の一態様は、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を提供し、改変されたスプライスドナー部位は、野生型の同等物と比較した場合、早期コドン終結及び変異型またはトランケート型のＥＭＲ２の産生を誘導する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、ＥＭＲ２のエピトープを発現しない。いくつかの実施形態では、ＥＭＲ２のエキソン１３内のスプライスドナー部位が改変される。いくつかの実施形態では、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションのヌクレオチド配列が改変される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞はＣＤ３４^＋である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、対象（例えば、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者、または健康なドナー）の骨髄細胞または末梢血単核細胞に由来する。

【0023】

いくつかの態様では、本開示は、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位、及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原のエキソン内の改変されたスプライスエレメントを含む、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を提供する。本開示の一態様は、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を提供し、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、野生型の同等物と比較した場合、ＣＤ３３及び／または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原のエキソンによってコードされるエピトープの発現レベルが低下している。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、野生型の同等物によって発現される、ＣＤ３３及び／または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原のエキソンによってコードされるエピトープの１０％未満を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞はＣＤ３４^＋である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、対象（例えば、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者、または健康なドナー）の骨髄細胞または末梢血単核細胞に由来する。

【0024】

いくつかの態様では、本開示は、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位、及び内因性ＥＭＲ２のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位を含む、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を提供する。本開示の一態様は、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を提供し、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、野生型の同等物と比較した場合、ＣＤ３３のエキソン２によってコードされるエピトープ及び／またはＥＭＲ２のエキソン１３によってコードされるエピトープの発現レベルが低下している。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、野生型の同等物によって発現される、ＣＤ３３のエキソン２によってコードされるエピトープ及び／またはＥＭＲ２のエキソン１３によってコードされるエピトープの１０％未満を発現する。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、野生型の同等物と比較した場合、ＥＭＲ２の早期コドン終結及び変異型またはトランケート型のＥＭＲ２の産生を誘導する。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞はＣＤ３４^＋である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞は、対象（例えば、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者、または健康なドナー）の骨髄細胞または末梢血単核細胞に由来する。

【0025】

本開示は、いくつかの実施形態では、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を複数含む細胞集団も提供する。

【0026】

別の態様では、本開示は、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を産生する方法であって、（ｉ）造血幹細胞及び／または前駆細胞を用意することと、（ｉｉ）細胞に、（ａ）系列特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列をターゲティングするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素すなわちＣａｓ９ニッカーゼに融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質を導入することとを含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を産生する方法を提供する。

【0027】

別の態様では、本開示は、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を産生する方法であって、（ｉ）造血幹細胞及び／または前駆細胞を用意することと、（ｉｉ）細胞に、（ａ）スプライスエレメントを含む造血幹細胞または前駆細胞のゲノム内のヌクレオチド配列をターゲティングするターゲティングドメインを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素すなわちＣａｓ９ニッカーゼに融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質を導入することとを含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を産生する方法を提供する。

【0028】

いくつかの実施形態では、この方法は、系列特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子からエキソンを欠失させる。いくつかの実施形態では、この方法は、系列特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子におけるヌクレオチド置換をもたらす。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、スプライスエレメントをコードする配列内にあり、ヌクレオチド置換は、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、内因性遺伝子におけるスプライスエレメントをターゲティングし、この方法は、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす。いくつかの実施形態では、スプライスエレメントは、スプライスドナー、スプライスアクセプター、スプライスエンハンサー、またはスプライスサイレンサーである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、シトシン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、アデニン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。

【0029】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＣＤ３３である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＤ３３のエキソン２にフランキングするヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、及び／または配列番号３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションをターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、配列番号３７を含むヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＤＮＡ修飾酵素に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質とは、細胞に導入される１つのベクターにおいてコードされる。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＤＮＡ修飾酵素に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質とは、予備形成されたリボ核タンパク質複合体として細胞に導入される。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、電気穿孔を介して細胞に導入される。

【0030】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＥＭＲ２のエキソン１３にフランキングするヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号４、配列番号４６及び／または配列番号４７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションをターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、配列番号４０を含むヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＤＮＡ修飾酵素に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質とは、細胞に導入される１つのベクターにおいてコードされる。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＤＮＡ修飾酵素に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質とは、予備形成されたリボ核タンパク質複合体として細胞に導入される。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、電気穿孔を介して細胞に導入される。

【0031】

別の態様では、本開示は、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を産生する方法であって、（ｉ）造血幹細胞及び／または前駆細胞を用意することと、（ｉｉ）細胞に、（ａ）第１の系列特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列をターゲティングするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素すなわちＣａｓ９ニッカーゼに融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質を導入することとを含み、かつ、細胞に、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素すなわちＣａｓ９ニッカーゼに融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質を導入することをさらに含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を産生する方法を提供する。

【0032】

別の態様では、本開示は、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を産生する方法であって、（ｉ）造血幹細胞及び／または前駆細胞を用意することと、（ｉｉ）細胞に、（ａ）第１の系列特異的細胞表面抗原のスプライスエレメントを含む造血幹細胞または前駆細胞のゲノム内のヌクレオチド配列をターゲティングするターゲティングドメインを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素すなわちＣａｓ９ニッカーゼに融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質を導入することとを含み、かつ、細胞に、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原の造血幹細胞または前駆細胞のゲノム内のヌクレオチド配列をターゲティングするターゲティングドメインを含む第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素すなわちＣａｓ９ニッカーゼに融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質を導入することをさらに含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を産生する方法を提供する。

【0033】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＣＤ３３である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＤ３３のエキソン２にフランキングするヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、及び／または配列番号３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションをターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、配列番号３７を含むヌクレオチド配列をターゲティングする。

【0034】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＤＮＡ修飾酵素に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質とは、細胞に導入される１つのベクターにおいてコードされる。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＤＮＡ修飾酵素に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質とは、予備形成されたリボ核タンパク質複合体として細胞に導入される。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、電気穿孔を介して細胞に導入される。

【0035】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＥＭＲ２のエキソン１３にフランキングするヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号４、配列番号４６及び／または配列番号４７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションをターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、配列番号４０を含むヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＤＮＡ修飾酵素に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質とは、細胞に導入される１つのベクターにおいてコードされる。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＤＮＡ修飾酵素に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質とは、予備形成されたリボ核タンパク質複合体として細胞に導入される。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、電気穿孔を介して細胞に導入される。

【0036】

本開示はまた、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中の系列特異的細胞表面抗原のエピトープの発現を低下させるための、本書に記述されるｇＲＮＡの使用を提供する。

【0037】

本開示はまた、いくつかの態様において、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中の系列特異的細胞表面抗原のエピトープの発現を低下させるための、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用を提供する。

【0038】

本開示はまた、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中のＣＤ３３のエピトープの発現を低下させるための、本書に記述されるｇＲＮＡの使用を提供する。

【0039】

本開示はまた、いくつかの態様において、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中のＣＤ３３のエピトープの発現を低下させるための、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用を提供する。

【0040】

本開示はまた、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中のＥＭＲ２のエピトープの発現を低下させるための、本書に記述されるｇＲＮＡの使用を提供する。

【0041】

本開示はまた、いくつかの態様において、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中のＥＭＲ２のエピトープの発現を低下させるための、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用を提供する。

【0042】

本開示はまた、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中のＣＤ３３及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原の発現を低下させるための、本書に記述されるｇＲＮＡの使用を提供する。

【0043】

本開示はまた、いくつかの態様において、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中のＣＤ３３及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原の発現を低下させるための、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用を提供する。

【0044】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの更なる系列特異的抗原はＥＭＲ２である。

【0045】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。

【0046】

いくつかの実施形態では、造血幹細胞及び／または前駆細胞はＣＤ３４^＋である。いくつかの実施形態では、造血幹細胞及び／または前駆細胞は、対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する。いくつかの実施形態では、対象は造血障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は健康なＨＬＡ適合ドナーである。

【0047】

本開示は、いくつかの実施形態では、本書に記述される方法によって産生された、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を提供する。

【0048】

別の態様では、本開示は、造血障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞あるいは細胞集団の有効量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、造血障害は造血器悪性腫瘍である。

【0049】

いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤の有効量を対象に投与することをさらに含み、薬剤は、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤は、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞である。

【0050】

いくつかの態様では、本開示は、造血障害の処置において使用するための、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団を提供し、処置は、それを必要とする対象に、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の有効量を投与することを含み、かつ、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤の有効量を対象に投与することをさらに含む。

【0051】

いくつかの態様では、本開示は、造血障害の処置において使用するための、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤を提供し、処置は、それを必要とする対象に、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤の有効量を投与することを含み、かつ、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団の有効量を対象に投与することをさらに含む。

【0052】

造血障害の処置において使用するための、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団と、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤との組み合わせであって、処置は、それを必要とする患者に、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団、及びＣＤ３３と結合する薬剤の有効量を投与することを含む、組み合わせ。

【0053】

いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団は、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤と併用投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団は、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤は、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の前に投与される。

【0054】

いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞、あるいはその両方は、同種異系である。いくつかの実施形態では、免疫細胞、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞、あるいはその両方は、自己由来である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体中の抗原結合性フラグメントは、ヒトＣＤ３３と特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。

【0055】

いくつかの実施形態では、この方法は、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤の有効量を対象に投与することをさらに含み、薬剤は、ＥＭＲ２と結合する抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤は、ＥＭＲ２と結合する抗原結合性フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞である。

【0056】

いくつかの態様では、本開示は、造血障害の処置において使用するための、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団を提供し、処置は、それを必要とする対象に、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の有効量を投与することを含み、かつ、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤であって、ＥＭＲ２と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤の有効量を対象に投与することをさらに含む。

【0057】

いくつかの態様では、本開示は、造血障害の処置において使用するための、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤であって、ＥＭＲ２と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤を提供し、処置は、それを必要とする対象に、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤の有効量を投与することを含み、かつ、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団の有効量を対象に投与することをさらに含む。

【0058】

造血障害の処置において使用するための、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団と、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤であって、ＥＭＲ２と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤との組み合わせであって、処置は、それを必要とする患者に、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団、及びＥＭＲ２と結合する薬剤の有効量を投与することを含む、組み合わせ。

【0059】

いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団は、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤と併用投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団は、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤は、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の前に投与される。

【0060】

いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞、あるいはその両方は、同種異系である。いくつかの実施形態では、免疫細胞、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞、あるいはその両方は、自己由来である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体中の抗原結合性フラグメントは、ヒトＥＭＲ２と特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。

【0061】

いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤の有効量と、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤であって、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤の有効量とを対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤は、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤は、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤、及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤は、ＣＤ３３及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞である。

【0062】

いくつかの態様では、本開示は、造血障害の処置において使用するための、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団を提供し、処置は、それを必要とする対象に、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の有効量を投与することを含み、かつ、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤の有効量と、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤であって、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤の有効量とを対象に投与することをさらに含む。

【0063】

いくつかの態様では、本開示は、造血障害の処置において使用するための、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤と、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤であって、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤とを提供し、処置は、それを必要とする対象に、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤の有効量と、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤であって、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤の有効量とを投与することを含み、かつ、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団の有効量を対象に投与することをさらに含む。

【0064】

造血障害の処置において使用するための、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団と、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤と、有効量の、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤であって、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤との組み合わせであって、処置は、それを必要とする患者に、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団、ならびにＣＤ３３と結合する薬剤及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する薬剤の有効量を投与することを含む、組み合わせ。

【0065】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３３をターゲティングし、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤と、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングし、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤とは、同じ薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ３３及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする免疫細胞である。

【0066】

いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団は、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤と併用投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団は、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤は、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の前に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤は、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の前に投与され、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤は、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の後に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤は、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の前に投与され、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤は、遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団の後に投与される。

【0067】

いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞、あるいはその両方は、同種異系である。いくつかの実施形態では、免疫細胞、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞、あるいはその両方は、自己由来である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体中の抗原結合性フラグメントは、ヒトＣＤ３３及び／または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体中の抗原結合性フラグメントは、ヒトの少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。

【0068】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２である。

【0069】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３３、及び／またはＥＭＲ２、及び／または更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤は、本書に記述される、該薬剤と併せて投与される遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団において改変されている、発現が低下している、または欠失しているエピトープをターゲティングする。

【0070】

いくつかの実施形態では、対象は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を有するヒト患者である。いくつかの実施形態では、対象は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ芽球性白血病である白血病を有するヒト患者である。本書における組成物及び方法の特徴を、以下に列挙する実施形態にも記述する。

【0071】

本書における組成物及び方法の特徴を、以下に列挙する実施形態にも記述する。
１． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、系列特異的抗原をコードする遺伝子に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含み、前記ヌクレオチド置換は、スプライスエレメントをコードする配列内に含まれ、前記遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらし、前記選択的スプライシングは、野生型の同等の細胞と比較した場合、前記遺伝子によってコードされるエピトープの発現レベル低下を引き起こし、前記エピトープは、免疫療法剤によってターゲティングされる、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２． 前記スプライスエレメントは、スプライスアクセプター、スプライスドナー、スプライスエンハンサー、及びスプライスサイレンサーからなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３． 選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす、実施形態１または２に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４． 選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５． 前記ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」または「Ｇ」から「Ａ」である、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
６． 前記ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」または「Ｔ」から「Ｃ」である、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
７． 前記ヌクレオチド置換は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用してなされる、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
８． 前記エピトープの前記発現レベル低下は、前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞におけるものであり、前記野生型の同等の細胞は、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞である、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
９． 前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した前記細胞は、骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態８に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１０． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、前記改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＣＤ３３のエキソン２によってコードされるエピトープの発現レベル低下をもたらす、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１１． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、前記改変は、野生型の同等の細胞と比較したレベルの２０％未満である、ＣＤ３３のエキソン２によってコードされるエピトープの発現レベル低下をもたらす、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１２． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、前記改変は、ＣＤ３３のエキソン２内の前記スプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位におけるヌクレオチド置換である、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１３． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、前記改変は、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションのヌクレオチド配列におけるヌクレオチド置換である、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１４． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、前記改変は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１５． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、前記改変は、配列番号２のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１６． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、前記改変は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１７． 前記改変は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用してなされる、実施形態１０～１６に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１８． 前記改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＣＤ３３の前記エキソン２によってコードされるエピトープの発現レベル低下（例えば、前記野生型の同等の細胞におけるレベルの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満）をもたらす、実施形態１０～１７に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１９． ＣＤ３３のエピトープの前記発現レベル低下は、前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞におけるものであり、前記野生型の同等の細胞は、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞である、実施形態１０～１８に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２０． 前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した前記細胞は、骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態１９に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２１． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位を含み、前記改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＥＭＲ２のエキソン１３によってコードされるエピトープの発現レベル低下をもたらす、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２２． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位を含み、前記改変されたスプライスドナー部位は、野生型の同等物と比較した場合、早期コドン終結及び変異型またはトランケート型のＥＭＲ２の産生を誘導する、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２３． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位を含み、前記改変は、ＥＭＲ２のエキソン１３内のスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位におけるヌクレオチド置換である、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２４． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位を含み、前記改変は、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションのヌクレオチド配列におけるヌクレオチド置換である、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２５． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位を含み、前記改変は、配列番号４または４６～４７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２６． 前記改変は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用してなされる、実施形態２１～２５に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２７． 前記改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＥＭＲ２の前記エキソン１３によってコードされるエピトープの発現レベル低下（例えば、前記野生型の同等の細胞におけるレベルの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満）をもたらす、実施形態２１～２５に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２８． ＥＭＲ２のエピトープの前記発現レベル低下は、前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞におけるものであり、前記野生型の同等の細胞は、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞である、実施形態２１～２６に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
２９． 前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した前記細胞は、骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態２９に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３０． ＣＤ３４＋である、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３１． 対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３２． 前記対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である、実施形態３１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３３． 前記対象は、健康なヒトドナー（例えば、ＨＬＡ適合ドナー）である、実施形態３１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３４． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、系列特異的抗原をコードする遺伝子における少なくとも１つのヌクレオチド置換であって、前記ヌクレオチド置換は、スプライスエレメントをコードする配列内に含まれ、前記遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらし、前記選択的スプライシングは、野生型の同等の細胞と比較した場合、前記遺伝子によってコードされるエピトープの発現レベル低下を引き起こし、前記エピトープは、免疫療法剤によってターゲティングされる、前記ヌクレオチド置換と、少なくとも１つの更なる系列特異的抗原をコードする遺伝子における少なくとも１つのヌクレオチド置換であって、前記ヌクレオチド置換は、スプライスエレメントをコードする配列内に含まれ、前記遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらし、前記選択的スプライシングは、野生型の同等物と比較した場合、少なくとも１つの更なる系列特異的抗原をコードする前記遺伝子によってコードされるエピトープの発現レベル低下を引き起こす、前記ヌクレオチド置換とを含み、両方のエピトープが免疫療法剤（複数可）によってターゲティングされる、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３５． 前記スプライスエレメントは、スプライスアクセプター、スプライスドナー、スプライスエンハンサー、及びスプライスサイレンサーからなる群から選択される、実施形態３４に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３６． 選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす、実施形態３４～３５に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３７． 選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす、実施形態３４～３５に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３８． 前記ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」または「Ｇ」から「Ａ」である、実施形態３４～３７に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
３９． 前記ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」または「Ｔ」から「Ｃ」である、実施形態３４～３７に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４０． 前記ヌクレオチド置換は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用してなされる、実施形態３４～３９に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４１． 前記エピトープの前記発現レベル低下は、前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞におけるものであり、前記野生型の同等の細胞は、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞である、実施形態３４～４０に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４２． 前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した前記細胞は、骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態４１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４３． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位であって、前記改変は、ＣＤ３３のエキソン２内の前記スプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位におけるヌクレオチド置換である、前記改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位と、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子のエキソン内の改変されたエレメントの改変とを含む、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４４． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位であって、前記改変は、ＣＤ３３のエキソン２内の前記スプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位におけるヌクレオチド置換である、前記改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位と、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位であって、前記改変は、ＥＭＲ２のエキソン１３内の前記スプライスドナー部位におけるヌクレオチド置換である、前記改変されたスプライスドナー部位とを含む、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４５． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位であって、前記改変は、ＣＤ３３のエキソン２内の前記スプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位におけるヌクレオチド置換であり、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＣＤ３３のエキソン２によってコードされるエピトープの発現レベル低下をもたらす、前記改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、かつ、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位であって、前記改変は、ＥＭＲ２のエキソン１３内の前記スプライスドナー部位におけるヌクレオチド置換であり、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＥＭＲ２のエキソン１３によってコードされるエピトープの発現レベル低下をもたらし、及び／または、野生型の同等の細胞と比較した場合、早期コドン終結及び変異型もしくはトランケート型のＥＭＲ２の産生を誘導する、前記改変されたスプライスドナー部位をさらに含む、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４６． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位であって、前記改変は、ＣＤ３３のエキソン２内の前記スプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位におけるヌクレオチド置換であり、配列番号１のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、かつ、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナー部位であって、前記改変は、ＥＭＲ２のエキソン１３内の前記スプライスドナー部位におけるヌクレオチド置換であり、配列番号４または４６～４７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記改変されたスプライスドナー部位をさらに含む、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４７． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位であって、前記改変は、ＣＤ３３のエキソン２内の前記スプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位におけるヌクレオチド置換であり、配列番号２のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、かつ、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３の改変されたスプライスドナー部位であって、前記改変は、ＥＭＲ２のエキソン１３内の前記スプライスドナー部位におけるヌクレオチド置換であり、配列番号４または４６～４７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記改変されたスプライスドナー部位をさらに含む、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４８． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位であって、前記改変は、ＣＤ３３のエキソン２内の前記スプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位におけるヌクレオチド置換であり、配列番号３のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位を含み、かつ、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３の改変されたスプライスドナー部位であって、前記改変は、ＥＭＲ２のエキソン１３内の前記スプライスドナー部位におけるヌクレオチド置換であり、配列番号４または４６～４７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡの使用によりなされる、前記改変されたスプライスドナー部位をさらに含む、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
４９． 前記改変（複数可）は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用してなされる、実施形態４３～４８に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５０． 前記改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＣＤ３３の前記エキソン２によってコードされるエピトープの発現レベル低下（例えば、前記野生型の同等の細胞におけるレベルの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満）、及び／または、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＥＭＲ２の前記エキソン１３によってコードされるエピトープの発現レベル低下（例えば、前記野生型の同等の細胞におけるレベルの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満）をもたらす、実施形態４３～４９に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５１． 前記野生型の同等物によって発現される前記ＣＤ３３の前記エキソン２によってコードされるエピトープの２０％未満、及び／または、前記野生型の同等物によって発現されるＥＭＲ２の前記エキソン１３によってコードされるエピトープの２０％未満を発現する、実施形態４３～５０に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５２． ＣＤ３３及び／またはＥＭＲ２のエピトープの前記発現レベル低下は、前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞におけるものであり、前記野生型の同等の細胞は、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞である、実施形態４３～５１に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５３． 前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した前記細胞は、骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態５２に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５４． ＣＤ３４＋である、実施形態３４～５３に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５５． 対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞に由来する、実施形態３４～５３に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５６． 前記対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である、実施形態５５に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５７． 前記対象は、健康なヒトドナー（例えば、ＨＬＡ適合ドナー）である、実施形態５５に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５８． シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと、前記内因性ＣＤ３３遺伝子を接触させること、及び、シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと、前記内因性ＥＭＲ２遺伝子を接触させることを含むプロセスによって作製された、実施形態４３～５７に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
５９． 予測されるオフターゲット部位のいずれにも変異を含まない、先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
６０． 先行する実施形態のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を複数含む（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、またはそれらの組み合わせを含む）細胞集団。
６１． 内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２の欠失または改変と、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３の欠失または改変とを含む、複数の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団。
６２． １つまたは複数の工学操作されていないＣＤ３３遺伝子及び／または工学操作されていないＥＭＲ２遺伝子を含む１つまたは複数の細胞をさらに含む、実施形態６１に記載の細胞集団。
６３． ＣＤ３３についてホモ接合性野生型である、及び／またはＥＭＲ２についてホモ接合性野生型である、１つまたは複数の細胞をさらに含む、実施形態６１～６２に記載の細胞集団。
６４． ＣＤ３３についてヘテロ接合性野生型である、及び／またはＥＭＲ２のヘテロ接合性野生型である、１つまたは複数の細胞をさらに含む、実施形態６１～６３のいずれかに記載の細胞集団。
６５． ＣＤ３３及び／またはＥＭＲ２の前記発現レベル低下は、前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞におけるものであり、前記野生型の同等の細胞は、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、最終分化した）細胞である、実施形態６１～６４のいずれかに記載の細胞集団。
６６． 前記造血幹細胞または前駆細胞から分化した前記細胞は、骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態６５に記載の細胞集団。
６７． 造血幹細胞及び造血前駆細胞を含む、実施形態６１～６６のいずれかに記載の細胞集団。
６８． 実施形態１～５９のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む医薬組成物。
６９． 実施形態６０～６７のいずれかに記載の細胞集団を含む医薬組成物。
７０． 実施形態１～３３のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または実施形態６０～６７のいずれかに記載の細胞集団を作製する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞（例えば、野生型造血幹細胞または前駆細胞）を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）スプライスエレメントを含む前記造血幹細胞または前駆細胞のゲノム内のヌクレオチド配列をターゲティングするターゲティングドメインを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素に融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質を導入することとを含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を産生する前記方法。
７１． 実施形態３４～５９のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または実施形態６０～６７のいずれかに記載の細胞集団を作製する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）スプライスエレメントを含む前記造血幹細胞または前駆細胞のゲノム内の第１のヌクレオチド配列をターゲティングするターゲティングドメインを含む第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した、第１の触媒的に損なわれたＣａｓ９エンドヌクレアーゼを導入することと、
（ｉｉｉ）前記細胞に、（ａ）スプライスエレメントを含む前記造血幹細胞または前駆細胞のゲノム内の第２のヌクレオチド配列をターゲティングするターゲティングドメインを含む第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した、第２の触媒的に損なわれたＣａｓ９エンドヌクレアーゼをさらに導入することとを含み、これにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する前記方法。
７２． 前記方法は、前記系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードする内因性遺伝子（複数可）におけるヌクレオチド置換をもたらす、実施形態７０～７１に記載の方法。
７３． 前記方法は、内因性遺伝子（複数可）におけるスプライスエレメントをターゲティングし、前記方法は、前記遺伝子（複数可）によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす、実施形態７０～７２のいずれかに記載の方法。
７４． 前記選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす、実施形態７０～７３のいずれかに記載の方法。
７５． 前記選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす、実施形態７０～７３のいずれかに記載の方法。
７６． 前記スプライスエレメント（複数可）は、スプライスドナー、スプライスアクセプター、スプライスエンハンサー、またはスプライスサイレンサーである、実施形態７０～７５のいずれかに記載の方法。
７７． 前記塩基エディター（複数可）は、シトシン塩基エディターである、実施形態７０～７６のいずれかに記載の方法。
７８． 前記塩基エディター（複数可）は、アデニン塩基エディターである、実施形態７０～７６のいずれかに記載の方法。
７９． 前記エンドヌクレアーゼ（複数可）は、Ｃａｓ９ニッカーゼである、実施形態７０～７８のいずれかに記載の方法。
８０． 前記シトシン塩基エディター（複数可）は、ＢＥ４Ｍａｘである、実施形態７７に記載の方法。
８１． 前記アデノシン塩基エディター（複数可）は、ＡＢＥ８ｅである、実施形態７８に記載の方法。
８２． 前記選択的スプライシングは、ＣＤ３３のエキソン２によってコードされるエピトープの発現低下をもたらす、実施形態７０～８１のいずれかに記載の方法。
８３． 前記選択的スプライシングは、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＥＭＲ２のエキソン１３によってコードされるエピトープの発現低下、及び／または、早期コドン終結及び変異型もしくはトランケート型のＥＭＲ２の産生をもたらす、実施形態７０～８１のいずれかに記載の方法。
８４． 配列番号１～４及び４６～４７のいずれかに記載の配列、もしくはその逆相補体、または前述のいずれかと少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有する配列、または前述のいずれかに対して１個以下、２個以下、もしくは３個以下の変異を有する配列を含む、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）。
８５． １つまたは複数の化学修飾（例えば、核酸塩基、糖、または骨格部分に対する化学修飾）を含む、実施形態８４に記載のｇＲＮＡ。
８６． Ｃａｓ９と結合する、実施形態８４及び８５のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
８７． 配列番号１～３を含むｇＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を含む、キットまたは組成物。
８８． 第２のｇＲＮＡ、または前記第２のｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含み、前記第２のｇＲＮＡは、ＣＤ３３以外の系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする、実施形態８７に記載のキット。
８９． 前記第２のｇＲＮＡは、ＥＭＲ２をターゲティングする、実施形態８８に記載のキットまたは組成物。
９０． 前記第２のｇＲＮＡは、配列番号４または４６～４７のいずれか１つを含む、実施形態８９及び９０のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９１． 第３のｇＲＮＡ、または前記第３のｇＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、実施形態８８～９０のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９２． 前記第３のｇＲＮＡは、ＣＤ３３及びＥＭＲ２以外の系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする、実施形態９１に記載のキットまたは組成物。
９３． シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した、１つまたは複数の触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態８７～９２のいずれかに記載のキットまたは組成物。
９４． ｇＲＮＡが配列番号１～３を含む、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中のＣＤ３３の発現を低下させるためのＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用。
９５． ｇＲＮＡが配列番号４及び４６～４７を含む、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中のＥＭＲ２の発現を低下させるためのＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用。
９６． ｇＲＮＡが配列番号１～４及び４６～４７を含む、造血幹細胞または前駆細胞のサンプル中のＣＤ３３及び／またはＥＭＲＲ２の発現を低下させるためのＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用。
９７． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）配列番号１～３を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した前記ｇＲＮＡと結合するヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）を導入することとを含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する前記方法。
９８． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）配列番号１～３と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼを導入することとを含み、それにより、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する前記方法。
９９． 前記ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションをターゲティングする、実施形態９７及び９８に記載の方法。
１００． 前記ｇＲＮＡは、配列番号３７を含むヌクレオチド配列をターゲティングする、実施形態９７～９９に記載の方法。
１０１． 前記方法は、ＣＤ３３のエキソン２のスプライスエレメントをコードする配列内のヌクレオチド置換をもたらし、前記ヌクレオチド置換は、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす、実施形態９７～１００のいずれかに記載の方法。
１０２． 前記転写物の前記選択的スプライシングは、ＣＤ３３のエキソン２のエピトープの発現低下をもたらす、実施形態１０１に記載の方法。
１０３． 前記塩基エディターは、シトシン塩基エディターであり、ＢＥ４ｍａｘである、実施形態９７～１０２のいずれかに記載の方法。
１０４． 前記塩基エディターは、アデノシン塩基エディターであり、ＡＢＥ８ｅである、実施形態９７～１０２のいずれかに記載の方法。
１０５． 野生型の同等の細胞と比較した場合、ＣＤ３３のエキソン２のエピトープの発現レベルが低下している、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞をもたらす、実施形態９７～１０４のいずれかに記載の方法。
１０６． 複数の造血幹細胞または前駆細胞に対して行われる、実施形態９７～１０５のいずれかに記載の方法。
１０７． 実施形態６０～６７のいずれかによる細胞集団を産生する、実施形態９７～１０６のいずれかに記載の方法。
１０８． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）配列番号４または４６～４７を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した前記ｇＲＮＡと結合するヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）を導入することとを含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する前記方法。
１０９． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）配列番号４または４６～４７と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼを導入することとを含み、それにより、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する前記方法。
１１０． 前記ｇＲＮＡ配列は、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションをターゲティングする、実施形態１０８及び１０９に記載の方法。
１１１． 前記ｇＲＮＡは、配列番号４０を含むヌクレオチド配列をターゲティングする、実施形態１０８～１１０に記載の方法。
１１２． 前記方法は、ＥＭＲ２のエキソン１３のスプライスエレメントをコードする配列内のヌクレオチド置換をもたらし、前記ヌクレオチド置換は、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす、実施形態１０８～１１１のいずれかに記載の方法。
１１３． 前記転写物の前記選択的スプライシングは、野生型の同等物と比較した場合、ＥＭＲ２のエキソン１３のエピトープの発現低下をもたらし、及び／または、早期コドン終結及び変異型もしくはトランケート型のＥＭＲ２の産生を誘導する、実施形態１１２に記載の方法。
１１４． 前記塩基エディターは、シトシン塩基エディターであり、ＢＥ４ｍａｘである、実施形態１０８～１１２のいずれかに記載の方法。
１１５． 前記塩基エディターは、アデノシン塩基エディターであり、ＡＢＥ８ｅである、実施形態１０８～１１２のいずれかに記載の方法。
１１６． 野生型の同等の細胞と比較した場合、ＥＭＲ２のエキソン１３のエピトープの発現レベルが低下している、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞をもたらす、実施形態１０８～１１５のいずれかに記載の方法。
１１７． 複数の造血幹細胞または前駆細胞に対して行われる、実施形態１０８～１１６のいずれかに記載の方法。
１１８． 実施形態６０～６７のいずれかによる細胞集団を産生する、実施形態１０８～１１７のいずれかに記載の方法。
１１９． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する方法であって、
（ｉ）造血幹細胞または前駆細胞（例えば、野生型造血幹細胞または前駆細胞）を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）配列番号１～３を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した前記ｇＲＮＡと結合するヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）を導入することと、
（ｉｉｉ）前記細胞に、（ａ）少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合した前記ｇＲＮＡと結合するヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をさらに導入することとを含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する前記方法。
１２０． 遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を産生する方法であって、
（ｉ）遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆細胞を用意することと、
（ｉｉ）前記細胞に、（ａ）配列番号１～３と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼを導入することと、
（ｉｉｉ）前記細胞に、（ａ）少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び（ｂ）シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼをさらに導入することとを含み、それにより、遺伝子工学操作された造血幹細胞及び／または前駆体を産生する前記方法。
１２１． 野生型の同等の細胞と比較した場合、ＣＤ３３のエキソン２のエピトープの発現レベルが低下している、及び／または前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原のエキソンのエピトープの発現レベルが低下している、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞をもたらす、実施形態１１９～１２０のいずれかに記載の方法。
１２２． 複数の造血幹細胞または前駆細胞に対して行われる、実施形態１１９～１２１のいずれかに記載の方法。
１２３． 複数の造血幹細胞及び複数の造血前駆細胞を含む細胞集団に対して行われる、実施形態１１９～１２２のいずれかに記載の方法または使用。
１２４． 実施形態６０～６７のいずれかによる細胞集団を産生する、実施形態１１９～１２３のいずれかに記載の方法。
１２５． 前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２であり、前記方法は、野生型の同等物と比較した場合、ＥＭＲ２のエキソン１３によってコードされるエピトープの発現レベル低下をもたらし、及び／または、早期コドン終結及び変異型もしくはトランケート型のＥＭＲ２の産生を誘導する、実施形態１１９～１２３のいずれかに記載の方法。
１２６． 前記ｇＲＮＡは配列番号４または４６～４７である、実施形態１２５に記載の方法。
１２７． （ａ）及び（ｂ）の核酸は、前記細胞に導入される１つのベクターにおいてコードされる、実施形態９７～１２６のいずれかに記載の方法。
１２８． 前記ベクターはウイルスベクターである、実施形態１２７に記載の方法。
１２９． 前記塩基エディターはタンパク質の形態にあり、（ａ）及び（ｂ）は、予備形成されたリボ核タンパク質複合体として前記細胞に導入される、実施形態９７～１２６のいずれかに記載の方法。
１３０． 前記リボ核タンパク質複合体は、電気穿孔を介して前記細胞に導入される、実施形態１２９に記載の方法。
１３１． 前記ｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態９７～１３０のいずれかに記載の方法。
１３２． 前記ｇＲＮＡは、修飾されたｓｇＲＮＡである、実施形態９７～１３１のいずれかに記載の方法。
１３３． 前記ｇＲＮＡは、化学修飾されたｓｇＲＮＡである、実施形態９７～１３２のいずれかに記載の方法。
１３４． 前記造血幹細胞または前駆細胞はＣＤ３４＋である、実施形態９７～１３３のいずれかに記載の方法。
１３５． 前記造血幹細胞または前駆細胞は、対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する、実施形態９７～１３３のいずれかに記載の方法。
１３６． 前記対象は造血障害を有する、実施形態１３５に記載の方法。
１３７． 前記対象は健康なドナーである、実施形態１３５に記載の方法。
１３８． 実施形態９７～１３７のいずれかに記載の方法または使用によって産生された、遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１３９． 実施形態１３８に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を複数含む（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、またはそれらの組み合わせを含む）細胞集団。
１４０． 造血障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態１～４３及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団の有効量を投与することを含む前記方法。
１４１． 造血障害の処置において使用するための、実施形態１～２０及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団であって、前記処置は、それを必要とする対象に、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団の有効量を投与することを含み、かつ、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤の有効量を前記対象に投与することをさらに含む、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団。
１４２． 造血障害の処置において使用するための、実施形態１～２０及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団と、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤との組み合わせであって、前記処置は、それを必要とする患者に、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団、及びＣＤ３３と結合する前記薬剤の有効量を投与することを含む、前記組み合わせ。
１４３． 造血障害の処置において使用するための、実施形態１～９、２１～２９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団であって、前記処置は、それを必要とする対象に、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団の有効量を投与することを含み、かつ、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤であって、ＥＭＲ２と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤の有効量を前記対象に投与することをさらに含む、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団。
１４４． 造血障害の処置において使用するための、実施形態１～９、２１～２９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団と、ＥＭＲ２をターゲティングする薬剤であって、ＥＭＲ２と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤との組み合わせであって、前記処置は、それを必要とする患者に、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団、及びＥＭＲ２と結合する前記薬剤の有効量を投与することを含む、前記組み合わせ。
１４５． 造血障害の処置において使用するための、実施形態１～９、４３～５９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団であって、前記処置は、それを必要とする対象に、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団の有効量を投与することを含み、かつ、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤の有効量と、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤であって、前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤の有効量とを前記対象に投与することをさらに含む、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団。
１４６． 造血障害の処置において使用するための、実施形態１～９、４３～５９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団と、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤と、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤であって、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤との組み合わせであって、前記処置は、それを必要とする患者に、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団、ならびにＣＤ３３及び前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する前記薬剤の有効量を投与することを含む、前記組み合わせ。
１４７． 前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２である、実施形態１４５に記載の組み合わせ及び実施形態１４６に記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞。
１４８． がん免疫療法において使用するための、実施形態１～５９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団。
１４９． 前記患者は造血障害を有する、がん免疫療法において使用するための、実施形態１～５９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団。
１５０． 造血障害を有する患者の造血系リポピュレーションにおいて使用するための、実施形態１～５９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団。
１５１． 造血障害を処置する方法において使用するための、実施形態１～５９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団であって、本書に記述される前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団が前記患者をリポピュレートする、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団。
１５２． 免疫療法においてＣＤ３３及び／または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤の細胞傷害効果を低下させるのに使用するための、実施形態１～５９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団。
１５３． ＣＤ３３及び／または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤を使用する免疫療法の方法において使用するための、実施形態１～５９及び１３８のいずれかに記載の遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞、または実施形態６０～６７及び１６９のいずれかに記載の細胞集団であって、本書に記述される前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本書に記述される細胞集団は、ＣＤ３３及び／または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする前記薬剤の細胞傷害効果を低下させる、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団。
１５４． 前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団は、ＣＤ３３及び／または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする前記薬剤と併用投与される、実施形態１４０～１５３のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
１５５． 前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団は、ＣＤ３３及び／または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする前記薬剤の前に投与される、実施形態１４０～１５３のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
１５６． ＣＤ３３及び／または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする前記薬剤は、前記遺伝子工学操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または前記細胞集団の前に投与される、実施形態１４０～１５３のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、または組み合わせ。
１５７． 前記造血障害は造血器悪性腫瘍である、実施形態１４０～１５６のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、使用、または組み合わせ。
１５８． 前記対象に、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤であって、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤の有効量、及び／または、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤であって、前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む前記薬剤の有効量を投与することをさらに含む、実施形態１４０～１５７のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、使用、または組み合わせ。
１５９． ＣＤ３３をターゲティングする前記薬剤は、ＣＤ３３と結合する前記抗原結合性フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞であり、前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする前記薬剤は、前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する前記抗原結合性フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞である、実施形態１５８に記載の方法、細胞、薬剤、使用、または組み合わせ。
１６０． 前記少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２である、実施形態１５２～１５９に記載の方法、細胞、薬剤、使用、または組み合わせ。
１６１． 前記免疫細胞はＴ細胞である、実施形態１５９に記載の方法、細胞、薬剤、使用、または組み合わせ。
１６２． 前記対象は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を有するヒト患者である、実施形態１４０～１６１のいずれかに記載の方法、細胞、薬剤、使用、または組み合わせ。
１６３． 前記対象は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ芽球性白血病である白血病を有するヒト患者である、実施形態１６３に記載の方法、細胞、薬剤、使用、または組み合わせ。

【0072】

以下の図面は、本明細書の一部をなし、本開示のある特定の態様をさらに示すために含まれるものであり、これらの態様は、これらの図面のうちの１つまたは複数を本書で提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、よりよく理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0073】

【図1】０型、１型、２型、及び３型の系列特異的抗原の例示的な図解を提示する。

【図2】０型の系列特異的細胞表面抗原であるＣＤ３０７をターゲティングするキメラ受容体を発現する免疫細胞を示す概略図である。ＣＤ３０７を発現する多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞、及び形質細胞などの他のＣＤ３０７発現細胞は、抗ＣＤ３０７キメラ受容体を発現する免疫細胞によってターゲティングされる。

【図3】２型の系列特異的細胞表面抗原であるＣＤ３３をターゲティングするキメラ受容体を発現する免疫細胞を示す概略図である。ＣＤ３３を発現する急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞。ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＤ３３が欠損するように遺伝子工学操作され、したがって、抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する免疫細胞によって認識されない。ＨＳＣは、骨髄性細胞を生じさせることができる。

【図4A】ＣＤ３３の塩基編集方式を示す。図４Ａは、エキソン１～３領域の詳細及び可能性のあるスプライシングの結果を示す。ａｇ：スプライシングアクセプター部位（ＳＡ）。ｇｔ：スプライシングドナー部位。点線は、可能性のあるスプライシング事象を表す。ＧＯゲンツズマブオゾガマイシン（抗体（Ａｂ）アイコン）は、エキソン２に位置するエピトープを認識する。

【図4B】ＣＤ３３の塩基編集方式を示す。図４Ｂは、エキソン２ ＳＡ（赤）及びエキソンスプライシングエンハンサー部位（黄色のＥＳＥ）を強調したイントロン１（小文字）／エキソン２（大文字）ジャンクションＤＮＡ配列を示す。

【図4C】ＣＤ３３の塩基編集方式を示す。図４Ｃは、ＣＤ３３ ｍＲＮＡ完全長（ＣＤ３３^ＦＬ）が７つのエキソンを含むことを示す。エキソン２は、Ｉｇ様Ｖ型ドメインをコードする。ＣＤ３３^Δ２は、ＣをＴに変化させて改変されたエキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）部位をもたらす一般的な多型（ｒｓ１２４５９４１９）のためにエキソン２を欠いている。

【図5A】ＡＢＥが、ターゲットの部位において最大９５％の効率でＡ＞Ｇ変換を導入し、インデルはごくわずかであり、エキソン２スキッピングを誘導することを示す。図５Ａは、野生型ゲノム配列（上）と比較した、編集済細胞のサンガーシーケンシングプロファイルである。ＥＳＥまたはＳＡを変異させるシトシンまたはアデニンの編集が矢印で示されている。

【図5B】ＡＢＥが、ターゲットの部位において最大９５％の効率でＡ＞Ｇ変換を導入し、インデルはごくわずかであり、エキソン２スキッピングを誘導することを示す。図５Ｂは、ターゲット部位における編集結果を表すＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２によるＨＴＳ分析の結果を示す。ターゲットのヌクレオチドを囲むおよそ２５０ｂｐは、抽出されたゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑでシーケンシングされた。結果は、ターゲットの塩基各々が意図される変異を獲得したことを示す。

【図5C】ＡＢＥが、ターゲットの部位において最大９５％の効率でＡ＞Ｇ変換を導入し、インデルはごくわずかであり、エキソン２スキッピングを誘導することを示す。図５Ｃは、エキソン２内に位置するエピトープを認識する２つの異なる抗体クローンＷＭ５３及びＰ６７．６を使用したＦＡＣＳ分析による、電気穿孔７日後の編集済細胞におけるＣＤ３３発現の評価を示す。ＢＥ４による編集後、ＣＤ３４^＋細胞の約３０％がＣＤ３３発現を示すが、ＡＢＥによる編集後は５％未満である。

【図5D】ＡＢＥが、ターゲットの部位において最大９５％の効率でＡ＞Ｇ変換を導入し、インデルはごくわずかであり、エキソン２スキッピングを誘導することを示す。図５Ｄは、ＥＳＥまたはＳＡの編集がエキソン２スキッピングを誘導することを示す。ＣＤ３４^＋編集済細胞におけるエキソンスキッピングを、ＣＤ３３^Δ２に特異的なプライマー（エキソンジャンクション１－３にまたがる）、またはすべてのアイソフォームに共通するプライマー（エキソン１、５、及び７内）のセットを用いたｃＤＮＡに対するＰＣＲを行うことによって特性評価した。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ＳＹＢＲ－ｓａｆｅの蛍光により可視化した。ゲルの下で、ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングにより、編集済細胞にはエキソン２が存在しないが、他のエキソンはすべてインタクトであることが確認される。

【図6A】ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＷＴまたはＣＤ３３^Δ２の単球が正常な貪食能力を示すこと、及びＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＯ細胞傷害性に対する抵抗性をもつことを示す。図６Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＷＴまたはＣＤ３３^Δ２の単球が、Ｅ．Ｃｏｌｉ生体粒子の内部移行によって測定した場合に同等の貪食能力を示すことを示す。左側は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＷＴまたはＣＤ３３^Δ２の単球によるＥ．Ｃｏｌｉ生体粒子の内部移行の代表的なＦＡＣｓプロットである。アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンＤによる処置は、貪食を抑止する。右側は、貪食の定量化を示すグラフである。

【図6B】ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＷＴまたはＣＤ３３^Δ２の単球が正常な貪食能力を示すこと、及びＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＯ細胞傷害性に対する抵抗性をもつことを示す。図６Ｂは、ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＯ細胞傷害性に抵抗することを示す。細胞をＧＯと共に４８時間インキュベートし、細胞傷害性をＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２は、ＧＯ細胞傷害性に対し、ホモ接合性ｒｓ１２４５９４１９ Ａ１４Ｖ ＳＮＰを有するドナーと比べて同じ抵抗性を示す。

【図7A】ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２が、ｉｎ ｖｉｖｏで生着し、完全な造血系を再現し、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）に対する抵抗性をもつことを示す。図７Ａは、移植後１６週で分析した骨髄（ＢＭ）及び脾臓における、ヒトＣＤ４５＋細胞の頻度、ならびに、ヒトＣＤ４５集団内の骨髄系前駆細胞（ＣＤ１２３）及びリンパ系前駆細胞（ＣＤ１０）、ならびに成熟した骨髄系細胞（ＣＤ１４）及びリンパ系細胞（ＣＤ１９）、及びＴ細胞（ＣＤ３）の頻度を示すグラフである。

【図7B】ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２が、ｉｎ ｖｉｖｏで生着し、完全な造血系を再現し、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）に対する抵抗性をもつことを示す。図７Ｂは、ＣＤ３４^＋ＷＴまたはＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２を生着させたマウスのＢＭに対するＨ＆Ｅ染色及び抗ＣＤ３３による免疫組織化学の代表的画像である。

【図7C】ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２が、ｉｎ ｖｉｖｏで生着し、完全な造血系を再現し、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）に対する抵抗性をもつことを示す。図７Ｃは、ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞がｉｎ ｖｉｖｏでＧＯ抵抗性をもつことを示す。移植１２週間後のマウスの末梢血（ＰＢ）を、ＣＤ３３^＋ＣＤ１４^＋細胞またはＣＤ３３^Δ２ＣＤ１４^＋細胞の存在について分析した。次にマウスに２．５ｕｇｒのＧＯを注射し、ＧＯ処置の１週間後に採血して袋詰めし、ヒト化マウスのＰＢ及びＢＭ中の骨髄性細胞の存在を評価した。ＧＯ処置前、ＣＤ３４^＋ＷＴ移植マウスまたはＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２移植マウスは、ＰＢ中のＣＤ１４^＋細胞の頻度が同じであることを示していた（上のＦＡＣＳプロット）。ＧＯ注射の１週間後、ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞を生着させたマウスのＰＢ及びＢＭ中ではＣＤ３３^－ＣＤ１４^＋細胞が検出されるが、ＣＤ３４^＋ＷＴ生着マウスのＰＢ及びＢＭ中ではＣＤ３３^＋細胞及びＣＤ１４^＋細胞が根絶されている。

【図7D】ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２が、ｉｎ ｖｉｖｏで生着し、完全な造血系を再現し、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）に対する抵抗性をもつことを示す。図７Ｄは、移植１６週間後の骨髄サンプルから生着したＷＴ（未編集）細胞または編集済細胞中のターゲット部位（Ａ７）におけるＣＤ３３オンターゲットＡ－Ｇ編集のグラフである。移植の１６週間後、ＣＤ３３遺伝子座をマウスの骨髄由来のゲノムＤＮＡから増幅させた。アンプリコンをＨＴＳによってシーケンシングし、Ａ７位におけるＡからＧへの編集を定量化した。

【図8A】オフターゲット分析の結果を示す。図８Ａは、識別された上位１９のオフターゲット遺伝子座をまとめた表である。

【図8B】オフターゲット分析の結果を示す。図８Ｂは、移植１６週間後の骨髄から生着したヒトＷＴ（未編集）細胞または編集済細胞中で識別された上位１９のオフターゲット遺伝子座のＡ７位におけるＡからＧへの編集の評価のグラフである。

【図8C】オフターゲット分析の結果を示す。図８Ｃは、移植１６週間後の骨髄から生着したヒトＷＴ（未編集）細胞または編集済細胞中で識別された上位１９のオフターゲット遺伝子座におけるインデルの評価のグラフである。

【図9A】ＣＤ３３及びＥＭＲ２の塩基編集方式を示し、ＡＢＥが、ＣＤ３４^＋細胞の二重編集につながるターゲット部位におけるＡ＞Ｇ変換を導入することを示す。図９Ａ（上）は、ＥＭＲ２、エキソン１３、ｇｔｇａｇｔ：スプライシングドナー部位（ＳＤ）の詳細を示す。図９Ａ（下）は、イントロン１２（小文字）／エキソン１３（大文字）ジャンクションＤＮＡ配列を示し、エキソン１３ ＳＤ（赤）及び太字のプロトスペーサーが強調されている。

【図9B】ＣＤ３３及びＥＭＲ２の塩基編集方式を示し、ＡＢＥが、ＣＤ３４^＋細胞の二重編集につながるターゲット部位におけるＡ＞Ｇ変換を導入することを示す。図９Ｂは、野生型ゲノム配列（上）と比較した編集済細胞のサンガーシーケンシングプロファイルである。ＣＤ３３エキソン２のＳＡまたはＥＭＲ２エキソン１３のＳＤを変異させるアデニンの編集が矢印で示されている。

【図9C】ＣＤ３３及びＥＭＲ２の塩基編集方式を示し、ＡＢＥが、ＣＤ３４^＋細胞の二重編集につながるターゲット部位におけるＡ＞Ｇ変換を導入することを示す。図９Ｃは、ヌクレオフェクション１週間後のＷＴ及び編集済細胞のＦＡＣＳ分析を示す。

【図10A】ＣＤ３３をターゲティングする抗原結合性フラグメントを含む例示的なキメラ受容体の概略図を示す。図１０Ａ：抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメインを含む、ＣＤ３３をターゲティングする一般的なキメラ受容体。

【図10B】ＣＤ３３をターゲティングする抗原結合性フラグメントを含む例示的なキメラ受容体の概略図を示す。図１０Ｂ：抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来のヒンジドメイン、ＣＤ８由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８及びＣＤ３ζ由来の細胞内ドメインを含む、ＣＤ３３をターゲティングするキメラ受容体。

【図10C】ＣＤ３３をターゲティングする抗原結合性フラグメントを含む例示的なキメラ受容体の概略図を示す。図１０Ｃ：抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来のヒンジドメイン、ＣＤ８由来の膜貫通ドメイン、ならびにＩＣＯＳ（またはＣＤ２７、４－１ＢＢ、もしくはＯＸ－４０）及びＣＤ３ζ由来の細胞内ドメインを含む、ＣＤ３３をターゲティングするキメラ受容体。

【図10D】ＣＤ３３をターゲティングする抗原結合性フラグメントを含む例示的なキメラ受容体の概略図を示す。図１０Ｄ：抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来のヒンジドメイン、ＣＤ８由来の膜貫通ドメイン、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２８、及びＣＤ３ζ由来の細胞内ドメインを含む、ＣＤ３３をターゲティングするキメラ受容体。

【図11】免疫毒素の概略図である。

【図12A】空のベクターまたは抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするベクターが形質導入されたＫ５６２細胞において発現される抗ＣＤ３３キメラ受容体の発現を示す。図１２Ａ：ＣＤ３ζを認識する一次抗体を使用したウェスタンブロット。表は、試験したキメラ受容体の各々の推定分子量を提示している。

【図12B】空のベクターまたは抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするベクターが形質導入されたＫ５６２細胞において発現される抗ＣＤ３３キメラ受容体の発現を示す。図１２Ｂ：抗ＣＤ３３キメラ受容体について陽性に染色される細胞集団の増加を示すフローサイトメトリー分析。

【図13A】抗ＣＤ３３キメラ受容体がＣＤ３３に結合することを示す。図１３Ａ：ポンソー染色されたタンパク質ゲル。レーン１、３、５：ＣＤ３３分子。レーン２、４、６：ＣＤ３３分子＋ＡＰＣコンジュゲート。

【図13B】抗ＣＤ３３キメラ受容体がＣＤ３３に結合することを示す。図１３Ｂ：ＣＤ３ζを認識する一次抗体を使用したウェスタンブロット。レーン１、３、及び５は、ＣＤ３３分子とコインキュベートされたキメラ受容体を含み、レーン２、４、及び６は、ＣＤ３３－ＡＰＣコンジュゲートとコインキュベートされたキメラ受容体を含む。

【図13C】抗ＣＤ３３キメラ受容体がＣＤ３３に結合することを示す。図１３Ｃ：抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現しＣＤ３３と結合する細胞集団の増加を示すフローサイトメトリー分析。

【図14】示されているキメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞によるＫ５６２細胞の細胞傷害性を示す。Ａ：空のＨＩＶｚｓＧベクターと比較したＣＡＲＴ１及びＣＡＲＴ２。Ｂ：空のＨＩＶｚｓＧベクターと比較したＣＡＲＴ３。

【図15】示されているキメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞による、ＣＤ３３が欠損したＫ５６２細胞の細胞傷害性（ｙ軸に細胞傷害率として表されている）を示す。Ａ：ＣＤ３３ターゲティングＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬で前処理したＫ５６２細胞の未選別集団。Ｂ：ＣＤ３３が欠損したＫ５６２細胞の単一クローン。縦列は、左から右へ、空のＨＩＶｚｓＧベクター、ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、及びＣＡＲＴ３に対応する。

【図16】初代Ｔ細胞集団のフローサイトメトリー分析を示す。Ａ：Ｔ細胞マーカーＣ４^＋、ＣＤ８^＋、またはＣＤ４^＋ＣＤ８^＋の両方の発現に基づく細胞の選別。Ｂ：示されている初代Ｔ細胞集団におけるＣＤ３３の相対的発現。

【図17】示されているキメラ受容体を発現する初代Ｔ細胞によるＫ５６２細胞の細胞傷害性を示す。Ａ：ＣＤ４^＋Ｔ細胞。Ｂ：ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋（ＣＤ４／８）及びＣＤ８^＋（ＣＤ８）。

【発明を実施するための形態】

【0074】

がん細胞の細胞表面に存在する抗原をターゲティングするがん免疫療法は、対象の発達及び／または生存に必要であるか、あるいはそれらに決定的に関与する、正常な非がん細胞の細胞表面にもターゲット抗原が存在する場合、特に困難である。これらの抗原をターゲティングすると、免疫療法の細胞傷害効果が、がん細胞に加えてかかる細胞に向かうため、対象に有害効果が及ぶ可能性がある。

【0075】

本書に記述される方法、核酸、及び細胞は、がん細胞だけでなく、対象の発達及び／または生存に重要な細胞にも存在する抗原（例えば、１型または２型の抗原）のターゲティングを可能にする。この方法は、（１）ターゲットの系列特異的細胞表面抗原を保有する細胞の数を、そのような抗原をターゲティングする薬剤を使用して低下させること、及び（２）抗原を提示する故に薬剤の投与により死滅し得る正常細胞（例えば、非がん細胞）を、系列特異的細胞表面抗原が欠損している造血細胞で置換することを伴う。本書に記述される方法は、目的の系列特異的細胞表面抗原を発現するがん細胞を含むターゲット細胞の監視を維持することができ、対象の発達及び／または生存に重要であり得る系列特異的抗原を発現する非がん細胞集団を維持することもできる。

【0076】

したがって、本書には、造血器悪性腫瘍を処置するための、系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）をターゲティングする抗原結合性フラグメントを含むキメラ受容体を発現する免疫細胞と、系列特異的細胞表面抗原が欠損している造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞（ＨＰＣ）などの造血細胞との併用が記述される。また本書では、キメラ受容体、それをコードする核酸、それを含むベクター、及びそのようなキメラ受容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が提供される。

【0077】

本開示は、本書に記述されるものなどの系列特異的抗原が欠損している遺伝子工学操作された造血細胞、及びそれを作製するための方法（例えば、ゲノム編集方法）も提供する。

【0078】

また本書には、造血器悪性腫瘍を処置するための、系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＥＭＲ２）をターゲティングする抗原結合性フラグメントを含むキメラ受容体を発現する免疫細胞と、系列特異的細胞表面抗原（複数可）が欠損している造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞（ＨＰＣ）などの造血細胞との併用が記述される。また本書では、キメラ受容体、それをコードする核酸、それを含むベクター、及びそのようなキメラ受容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が提供される。本開示は、本書に記述されるものなどの系列特異的抗原が欠損している遺伝子工学操作された造血細胞、及びそれを作製するための方法（例えば、ゲノム編集方法）も提供する。

【0079】

また本書には、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用した造血細胞のゲノム編集の方法が記述される。ＣＩＲＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用は、ＣＲＩＳＰＲベースのシトシン塩基エディター及びアデニン塩基エディター（ＣＢＥ及びＡＢＥ）を使用したＨＳＣ／ＨＳＰＣの高い編集効率を可能にする。ＣＢＥ及びＡＢＥは、それぞれシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼに融合したＣａｓ９ニッカーゼであり、ＤＳＢを生成することなく、ターゲットの領域における正確な塩基置換を可能にする。塩基エディターは、ＤＳＢを避けるため、ＤＳＢに起因する望まれないインデル、転座、または再構成をなくす安全性の高い編集ツールと考えられている。

【0080】

本書では、スプライスエレメントのヌクレオチド配列を特異的に改変することによって造血細胞を修飾するための、塩基エディター、特にアデノシン塩基エディターであるＡＢＥ８ｅの高度に効果的な使用が示される。スプライスエレメントの改変は、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらし、さらに、遺伝子によってコードされるエピトープ、例えば遺伝子のエキソンによってコードされるエピトープの発現レベル低下を引き起こす。本書では、ＣＤ３３のエキソン２内のスプライスアクセプターまたはエキソンエンハンサー部位を改変するための塩基エディター及びｇＲＮＡの使用が示される。特に、ＡＢＥ８ｅ塩基エディターと、ジャンクションＤＮＡ配列をターゲティングするように特別に設計されたガイドＲＮＡとを使用したゲノム編集は、インデルなしで最大９５％の効率を示した。

【0081】

また本書では、ＥＭＲ２のエキソン１３のスプライスドナー部位を改変するための塩基エディターの使用が示される。

【0082】

更に、本書に記述されるシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼに融合したＣａｓ９ニッカーゼは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の形態で使用することができる。後者の形態は、前者よりも少ないオフターゲット効果をもたらし、ＨＳＣを編集するために首尾よく使用され、このＨＳＣはｉｎ ｖｉｖｏで生着し、ＣＤ３４細胞にＧＯへの抵抗性を与えることができた。

【0083】

例えば、実施例１～５を参照のこと。

【0084】

定義
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、同義に使用され、脊椎動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、またはマウス、ウシ、ウマ、イヌ、もしくはネコの種を含むが、これらに限定されない。本開示の文脈において、「対象」という用語には、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで培養可能またはｉｎ ｖｉｖｏで操作可能な組織及び細胞も包含される。「対象」という用語は、「生物」という用語と同義に使用され得る。

【0085】

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は同義に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの例は、遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド内の１つまたは複数のヌクレオチドは、さらに修飾されていてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識剤とのコンジュゲーションにより、重合後に修飾することもできる。

【0086】

「ハイブリダイゼーション」という用語は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対合、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、または任意の他の配列特異的な様式で発生し得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より広範なプロセスにおけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列は、所与の配列の「相補体」と呼ばれる。

【0087】

「組換え発現ベクター」という用語は、遺伝子修飾されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物であって、構築物がｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現させるのに十分な条件下でベクターを細胞と接触させた場合に、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする構築物を意味する。本開示のベクターは、全体として天然に存在するものではない。ベクターの一部は天然に存在し得る。本開示の天然に存在しない組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意の種類のヌクレオチドを含むことができ、これらは、一本鎖でも二本鎖でもよく、合成されても天然源から部分的に取得されてもよく、天然の、非天然の、または改変されたヌクレオチドを含んでもよい。

【0088】

「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」は、本書で使用される場合、物理的または化学的な方法を使用することにより、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを指す。

【0089】

「抗体」、「抗体のフラグメント」、「抗体フラグメント」、「抗体の機能的フラグメント」、または「抗原結合性部分」は、特定の抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントまたは部分を意味するように同義に使用される（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５）２３（９）：１１２６）。本件の抗体は、抗体及び／またはそのフラグメントであり得る。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆｃ、あるいはバリアント及び／または混合物を含む。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、または二重特異性抗体であり得る。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む、すべての抗体アイソタイプが本開示に包含される。好適なＩｇＧサブタイプには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれる。抗体の軽鎖または重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域によって中断されたフレームワーク領域からなる。本件の抗体または抗原結合性部分のＣＤＲは、非ヒト由来でもヒト由来でもよい。本件の抗体または抗原結合性部分のフレームワークは、ヒト、ヒト化、非ヒト（例えば、ヒトにおける抗原性を減少させるように修飾されたマウスフレームワーク）、または合成のフレームワーク（例えば、コンセンサス配列）であり得る。

【0090】

本件の抗体または抗原結合性部分は、約１０^－７Ｍ未満、約１０^－８Ｍ未満、約１０^－９Ｍ未満、約１０^－１０Ｍ未満、約１０^－１１Ｍ未満、または約１０^－１２Ｍ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で特異的に結合することができる。本開示による抗体の親和性は、従来の技法を使用して容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９４９）５１：６６０、及び米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または均等物を参照のこと）。

【0091】

「キメラ受容体」、「キメラ抗原受容体」、または代替的に「ＣＡＲ」という用語は、全体を通して同義に使用され、少なくとも細胞外抗原結合性ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義する刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）とを含む組換えポリペプチド構築物を指す。Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１２）１８（１０）：２７８０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１４）２５７（１）：１２７。一実施形態では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義する少なくとも１つの共刺激分子に由来する、１つまたは複数の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／またはＣＤ２８、あるいはこれらの分子のフラグメントでもよい。別の態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ融合タンパク質を含む。ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ融合タンパク質を含む。代替的に、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の共刺激分子（複数可）に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ融合タンパク質を含む。ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の共刺激分子（複数可）に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ融合タンパク質を含んでもよい。核酸配列によってコードされるＣＡＲの抗原認識部分は、任意の系列特異的な抗原結合性抗体フラグメントを含むことができる。抗体フラグメントは、１つまたは複数のＣＤＲ、可変領域（またはその一部）、定常領域（またはその一部）、または前述のもののいずれかの組み合わせを含み得る。

【0092】

「シグナル伝達ドメイン」という用語は、セカンドメッセンジャーを生成すること、またはかかるメッセンジャーに応答することでエフェクターとして機能することにより、規定のシグナル伝達経路を介して細胞活動を制御するように、細胞内で情報を伝達することによって作用するタンパク質の機能的部分を指す。

【0093】

「ゼータ」または代替的に「ゼータ鎖」、「ＣＤ３ゼータ」もしくは「ＴＣＲゼータ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９３２１７０、ＮＰ＿０００７２５、もしくはＸＰ＿０１１５０８４４７として提供されるタンパク質、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などに由来する均等な残基と定義され、「ゼータ刺激ドメイン」または代替的に「ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分である、ゼータ鎖の細胞質ドメイン由来のアミノ酸残基と定義される。

【0094】

「遺伝子工学操作された」または「遺伝子修飾された」という用語は、遺伝子工学操作によって、例えばゲノム編集によって細胞が操作されることを指す。すなわち、細胞は、前記細胞に天然には存在しない異種配列を含む。典型的に、異種配列は、ベクター系、またはリポソームを含む細胞に核酸分子を導入するための他の手段を介して導入される。異種核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれてもよいし、染色体外に、例えばプラスミドの形態で存在してもよい。この用語には、遺伝子工学操作された、単離されたＣＡＲポリペプチドを細胞に導入する実施形態も含まれる。

【0095】

「自己由来」という用語は、後に同じ個体に再導入されるものと同じ個体に由来する任意の材料を指す。

【0096】

「同種異系」という用語は、材料が導入される個体と同じ種に属する異なる動物に由来する任意の材料を指す。１つまたは複数の遺伝子座における遺伝子が同一でない場合、２体以上の個体は互いに同種異系であると言われる。

【0097】

「細胞系列」という用語は、共通の祖先をもち、同じ種類の識別可能な細胞から特定の識別可能な／機能性の細胞へと発達する細胞を指す。本書で使用される細胞系列は、呼吸器、前立腺、膵臓、乳腺、腎臓、腸、神経、骨格、血管、肝臓、造血、筋肉または心臓の細胞系列を含むが、これらに限定されない。

【0098】

系列特異的抗原の遺伝子発現または機能に関して使用される場合の「阻害」という用語は、系列特異的抗原の遺伝子発現または機能のレベルの低下を指し、阻害は遺伝子発現または機能への干渉の結果である。阻害は、完全なこともあり、その場合は検出可能な発現もしくは機能がなく、または部分的なこともある。部分的な阻害は、ほぼ完全な阻害から、ほぼ阻害がないものまで、幅があり得る。特定のターゲット細胞を排除することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞は、特定の細胞系列の全体的な発現を効果的に阻害し得る。

【0099】

「系列特異的抗原が欠損している」造血細胞などの細胞は、天然に存在する同等物、例えば、同じ種類の内因性造血細胞、または、系列特異的抗原を発現しない細胞、すなわち、ＦＡＣＳなどの定型的なアッセイによって検出できない細胞と比較した場合、系列特異的抗原の発現レベルが実質的に低下している細胞を指す。場合によっては、「抗原が欠損している」細胞による系列特異的抗原の発現レベルは、天然に存在する同等物による同じ系列特異的抗原の発現レベルの約４０％未満（例えば、３０％、２０％、１５％、１０％、５％またはそれ以下）であり得る。

【0100】

本書で使用される「スプライスエレメント」という用語は、スプライスアクセプター部位、スプライスドナー部位、スプライスエンハンサー部位、及びスプライスサイレンサー部位を含む。

【0101】

本書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値±５％を指す。例えば、約４０％の発現レベルは、３５％～４５％のいずれかの発現量を含み得る。

【0102】

系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤
本開示の諸態様は、例えばターゲットがん細胞にある、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をターゲティングする薬剤（例えば、ＣＤ３３をターゲティングする薬剤、例えば、ＣＤ３３と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤、及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤、例えば、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤）を提供する。そのような薬剤は、系列特異的細胞表面抗原（複数可）と結合しこれをターゲティングする抗原結合性フラグメントを含み得る。場合によっては、抗原結合性フラグメントは、系列特異的抗原に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。

【0103】

Ａ． 系列特異的細胞表面抗原
本書で使用される場合、「系列特異的」、「系列特異的細胞表面抗原」及び「細胞表面系列特異的抗原」という用語は、同義に使用されることがあり、細胞の表面に十分に存在する、細胞系列（複数可）の１つまたは複数の集団に関連する任意の抗原を指す。例えば、抗原は、細胞系列（複数可）の１つまたは複数の集団に存在し、他の細胞集団の細胞表面には存在しない（またはレベルが低下している）場合がある。

【0104】

概して、系列特異的細胞表面抗原は、抗原及び／または抗原を提示する細胞集団が宿主生物の生存及び／または発達に必要とされるかどうかといった、いくつかの要素に基づいて分類することができる。系列特異的抗原の例示的な種類の概要を以下の表１に提示する。図１も参照のこと。

【表1】

【0105】

表１及び図１に示すように、０型系列特異的細胞表面抗原は、組織の恒常性及び生存に必要であり、０型系列特異的細胞表面抗原を保有する細胞型も、対象の生存に必要であり得る。よって、恒常性及び生存における０型系列特異的細胞表面抗原または０型系列特異的細胞表面抗原を保有する細胞の重要性を考えると、かかる抗原及びかかる抗原を保有する細胞の阻害または除去は対象の生存に対して有害であり得るため、従来のＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法を使用してこのカテゴリの抗原をターゲティングするのは困難であり得る。それ故、系列特異的細胞表面抗原（０型系列特異的抗原など）及び／またはかかる抗原を保有する細胞型は、例えば対象において必須の重複しない機能を果たすため、生存のために必要である可能性があり、その場合、この種類の系列特異的抗原は、ＣＡＲ Ｔ細胞ベースの免疫療法のターゲットとして不適切であり得る。

【0106】

０型抗原とは異なり、１型系列特異的細胞表面抗原及び１型系列特異的細胞表面抗原を保有する細胞は、対象の組織恒常性または生存に必要とされない。１型系列特異的細胞表面抗原をターゲットにした場合、対象に有害な結果をもたらす可能性は低い。例えば、正常な形質細胞と多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞との両方で独特に発現される１型抗原であるＣＤ３０７をターゲティングするように工学操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、両方の細胞型の排除につながる（図２）（Ｅｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２０１２）１０：２２２２）。しかし、形質細胞系列は生物の生存のために消費されるため、ＣＤ３０７及び他の１型系列特異的抗原は、ＣＡＲ Ｔ細胞ベースの免疫療法に好適な抗原である。１型クラスの系列特異的抗原は、卵巣、精巣、前立腺、乳房、子宮内膜、及び膵臓を含む多種多様な異なる組織で発現され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、１型抗原である系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする。

【0107】

２型抗原のターゲティングは、１型抗原と比較すると大きな問題点を提示する。２型抗原は、（１）抗原が生物の生存のために不必要である（すなわち、生存に必要とされない）こと、及び（２）抗原を保有する細胞系列が生物の生存に不可欠である（すなわち、特定の細胞系列が生存に必要とされる）ことを特徴とするものである。例えば、ＣＤ３３は、正常な骨髄性細胞及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の両方で発現される２型抗原である（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）ＮＥＪＭ ３７３：１１３６）。結果として、ＣＤ３３抗原をターゲティングするように工学操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、正常細胞及びＡＭＬ細胞の両方の死滅につながる可能性があり、対象の生存と両立しない可能性がある（図３）。いくつかの実施形態では、薬剤は、２型抗原である系列特異的抗原細胞表面をターゲティングする。

【0108】

多種多様な抗原が本開示の方法及び組成物のターゲットになり得る。これらの抗原に対するモノクローナル抗体は、商業的に購入してもよいし、または、上述のように、目的の抗原で動物を免疫化した後、従来のモノクローナル抗体方法論、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法を行うことを含む、標準的な技法を使用して生成してもよい。抗体または抗体をコードする核酸は、任意の標準的なＤＮＡまたはタンパク質のシーケンシング技法を使用してシーケンシングすることができる。

【0109】

いくつかの実施形態では、本書に記述される方法及び細胞を使用してターゲティングされる系列特異的細胞表面抗原は、白血球または白血球の亜集団の系列特異的細胞表面抗原である。いくつかの実施形態では、系列特異的抗原細胞表面は、骨髄性細胞に関連する抗原である。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原は、細胞膜分化抗原（ＣＤ）である。ＣＤ抗原の例は、限定されるものではないが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、Ｄ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２及びＣＤ３６３を含む。ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＢＤ＿Ｒｅａｇｅｎｔｓ＿ＣＤＭａｒｋｅｒＨｕｍａｎ＿Ｐｏｓｔｅｒ．ｐｄｆを参照のこと。

【0110】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、及びＣＤ２６である。

【0111】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＣＤ３３である。

【0112】

代替的に、またはさらに、系列特異的細胞表面抗原は、がん抗原、例えば、がん細胞に示差的に存在する系列特異的細胞表面抗原であり得る。いくつかの実施形態では、がん抗原は、組織または細胞系列に特異的な抗原である。特定の種類のがんに関連する系列特異的細胞表面抗原の例は、限定されるものではないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（共通（プレＢ）急性リンパ球性白血病及び悪性黒色腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫及び白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫及び白血病）、ＣＤ２６（上皮系及びリンパ系の悪性腫瘍）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、及びＨＬＡ－ＤＱ（リンパ系悪性腫瘍）、ＲＣＡＳ１（婦人科癌、胆管腺癌及び膵管腺癌）、ならびに前立腺特異的膜抗原を含む。

【0113】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＣＤ３３であり、ＡＭＬ細胞に関連する。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２であり、ＡＭＬ細胞に関連する。

【0114】

Ｂ． 抗原結合性フラグメント
任意の抗体またはその抗原結合性フラグメント（例えば、ＣＤ３３または少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原、例えばＥＭＲ２と結合するもの）を使用して、本書に記述される系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤を構築することができる。そのような抗体または抗原結合性フラグメントは、従来の方法により、例えば、ハイブリドーマ技術または組換え技術を使用して調製することができる。

【0115】

例えば、目的の系列特異的抗原に特異的な抗体は、従来のハイブリドーマ技術によって作製することができる。ＫＬＨなどの担体タンパク質にカップリングできる細胞表面系列特異的抗原を使用して、その複合体に結合する抗体を生成するために宿主動物を免疫化することができる。宿主動物の免疫化の経路及びスケジュールは、概して、本書にさらに記述されるように、抗体刺激及び産生のための確立された従来の技法に従う。マウス抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体の産生のための一般的技法は、当技術分野では公知であり、本書に記述されている。ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞株を産生するための基礎とするために、ヒトを含む任意の哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞が操作され得ることが企図される。典型的には、宿主動物の腹腔内、筋肉内、口腔内、皮下、足底内、及び／または皮内に、本書に記述されるものを含むある量の免疫原を接種する。

【0116】

ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５－４９７の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法またはＢｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（１９８２）１８：３７７－３８１により修正されたものを使用して、リンパ球及び不死化骨髄腫細胞から調製することができる。ハイブリダイゼーションには、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、及びＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡからのものを含むがこれらに限定されない、利用可能な骨髄腫株を使用してもよい。概して、この技法は、ポリエチレングリコールなどの融合剤を使用して、または当業者によく知られている電気的手段によって、骨髄腫細胞及びリンパ系細胞を融合させることを伴う。融合後、細胞を融合培地から分離し、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的増殖培地で増殖させて、ハイブリダイズしていない親細胞を排除する。本書に記述される培地はいずれも、血清を補うか補わないかにかかわらず、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用することができる。細胞融合技法の別の代替法として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、本書に記述されるＴＣＲ様モノクローナル抗体を産生してもよい。ハイブリドーマを拡大培養し、必要に応じてサブクローニングし、上清を従来のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）によって抗免疫原活性についてアッセイする。

【0117】

抗体源として使用できるハイブリドーマは、系列特異的抗原に結合可能なモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞を包含する。そのような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、必要に応じて、硫酸アンモニウム沈殿法、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、及び限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地または体液から単離することができる。望まれない活性が存在する場合、これは例えば、固相に結合した免疫原で作られた吸着剤に調製物を流し、所望の抗体を免疫原から溶離または遊離させることによって除去することができる。ターゲット抗原、または、二官能性薬剤もしくは誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ、もしくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、免疫化しようとする種において免疫原性のあるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、もしくは大豆トリプシン阻害剤にコンジュゲートされたターゲットアミノ酸配列を含むフラグメントで宿主動物を免疫化すると、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団がもたらされ得る。

【0118】

必要に応じて、目的の抗体（例えば、ハイブリドーマによって産生されるもの）をシーケンシングしてもよく、次にポリヌクレオチド配列を発現または増殖のためにベクターにクローニングしてもよい。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞内のベクターにおいて維持してもよく、次に宿主細胞を拡大培養し、将来使用するために凍結することができる。代替法では、ポリヌクレオチド配列は、抗体の「ヒト化」または抗体の親和性の改善（親和性成熟）もしくは他の特徴の改善を行うための遺伝子操作に使用され得る。例えば、定常領域は、抗体がヒトの臨床試験及び処置に使用される場合、免疫応答を回避するためにヒト定常領域により類似するように工学操作され得る。系列特異的抗原に対する高い親和性が得られるように抗体配列を遺伝子操作することが望ましい場合がある。当業者には、抗体に対して１つまたは複数のポリヌクレオチドの変更を行っても、ターゲット抗原に対するその結合特異性が維持され得ることは明らかであろう。

【0119】

他の実施形態では、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように工学操作されている市販のマウスを使用して、完全ヒト抗体を取得することができる。より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）またはよりロバストな免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物を使用して、ヒト化抗体またはヒト抗体を生成することもできる。そのような技術の例は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）のＨｕＭＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（商標）及びＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。別の代替法では、抗体は、ファージディスプレイまたは酵母技術によって組換え的に作製され得る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，５８０，７１７号、同第５，７３３，７４３号、及び同第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１２：４３３－４５５を参照のこと。代替的に、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２－５５３）を使用して、非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体フラグメントをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生してもよい。

【0120】

インタクトな抗体（完全長抗体）の抗原結合性フラグメントは、定型的な方法によって調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって産生することができ、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成することができる。

【0121】

ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、及び二重特異性抗体などの遺伝子工学操作された抗体は、例えば、従来の組換え技術を介して産生することができる。一例では、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、ターゲット抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離しシーケンシングすることができる。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源としての機能を果たす。ＤＮＡを単離したら、１つまたは複数の発現ベクターに入れることができ、これを次に、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすると、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が達成される。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２を参照のこと。次に、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８４）８１：６８５１）、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてもしくは一部を共有結合することによって、ＤＮＡを修飾してもよい。この様式で、ターゲット抗原の結合特異性を有する「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体などの遺伝子工学操作された抗体を調製することができる。

【0122】

「キメラ抗体」の産生のために開発された技法は、当技術分野ではよく知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８４）８１，６８５１、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２，６０４、及びＴａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１４：４５２を参照のこと。

【0123】

ヒト化抗体を構築するための方法も当技術分野ではよく知られている。例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）８６：１００２９－１００３３を参照のこと。一例では、親非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬの可変領域を、当技術分野で公知の方法に従う三次元分子モデリング分析に供する。次に、同じ分子モデリング分析を使用して、正しいＣＤＲ構造の形成に重要であると予測されるフレームワークアミノ酸残基を識別する。並行して、親ＶＨ及びＶＬ配列を検索クエリとして使用して、親非ヒト抗体のものと相同なアミノ酸配列を有するヒトＶＨ及びＶＬ鎖を任意の抗体遺伝子データベースから識別する。次に、ヒトＶＨ及びＶＬアクセプター遺伝子を選択する。

【0124】

選択されたヒトアクセプター遺伝子内のＣＤＲ領域は、親非ヒト抗体またはその機能的バリアント由来のＣＤＲ領域に置き換えることができる。必要であれば、ＣＤＲ領域（上記の説明を参照のこと）との相互作用に重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基を使用して、ヒトアクセプター遺伝子における対応する残基を置換することができる。

【0125】

単鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列とを連結することによる組換え技術を介して調製することができる。好ましくは、可動性リンカーが２つの可変領域間に組み込まれる。代替的に、単鎖抗体の産生に関して報告されている技法（米国特許第４，９４６，７７８号及び同第４，７０４，６９２号）を応用して、ファージまたは酵母ｓｃＦｖライブラリを産生することができ、系列特異的抗原に特異的なｓｃＦｖクローンを定型的な手順に従ってライブラリから識別することができる。陽性クローンをさらなるスクリーニングに供して、系列特異的細胞表面抗原と結合するものを識別してもよい。

【0126】

場合によっては、目的の系列特異的細胞表面抗原はＣＤ３３であり、抗原結合性フラグメントは、ＣＤ３３、例えばヒトＣＤ３３と特異的に結合する。抗ヒトＣＤ３３抗体の例示的な重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸及び核酸配列を以下に提示する。ＣＤＲ配列は太字で示し、アミノ酸配列に下線を引いてある。

【0127】

抗ＣＤ３３重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）

【化1】

【0128】

抗ＣＤ３３重鎖可変領域の核酸配列（配列番号６）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ

【0129】

抗ＣＤ３３軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）

【化2】

【0130】

抗ＣＤ３３重鎖可変領域の核酸配列（配列番号８）
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧ

【0131】

本書に記述されるＣＤ３３をターゲティングする薬剤の構築において使用するための抗ＣＤ３３抗体結合性フラグメントは、配列番号５及び配列番号７のものと同じ重鎖及び／または軽鎖ＣＤＲ領域を含み得る。そのような抗体は、フレームワーク領域のうちの１つまたは複数にアミノ酸残基変化を含み得る。場合によっては、抗ＣＤ３３抗体フラグメントは、配列番号５と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）を共有する重鎖可変領域を含んでもよく、及び／または配列番号７と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）を共有する軽鎖可変領域を含んでもよい。

【0132】

２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４－６８のアルゴリズムを、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３－７７に記載のように修正したものを使用して決定される。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行うと、本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を取得することができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５（１７）：３３８９－３４０２に記述されているようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。

【0133】

Ｃ． キメラ受容体を発現する免疫細胞
いくつかの実施形態では、本書に記述される系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤は、系列特異的抗原（例えば、ＣＤ３３、ＥＭＲ２）に結合することができる抗原結合性フラグメント（例えば、単鎖抗体）を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞である。細胞表面に系列特異的抗原を有するターゲット細胞（例えば、がん細胞）をキメラ受容体の抗原結合性フラグメントによって認識することで、キメラ受容体のシグナル伝達ドメイン（複数可）（例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または細胞質シグナル伝達ドメイン）へ活性化シグナルが伝達され、これにより、キメラ受容体を発現する免疫細胞におけるエフェクター機能が活性化され得る。

【0134】

本書で使用される場合、キメラ受容体とは、宿主細胞の表面で発現することができ、細胞表面系列特異的抗原に結合する抗原結合性フラグメントを含む、天然に存在しない分子を指す。概して、キメラ受容体は、異なる分子に由来する少なくとも２つのドメインを含む。本書に記述される抗原結合性フラグメントに加えて、キメラ受容体は、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインのうちの１つまたは複数をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端へ、細胞表面系列特異的抗原に結合する抗原結合性フラグメント、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、少なくとも１つの共刺激ドメインをさらに含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、本書に記述されるキメラ受容体は、抗原結合性フラグメントと膜貫通ドメインとの間に位置し得るヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、タンパク質の２つのドメイン間に一般的に見られるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の可動性及びドメインの一方または両方の互いに対する移動を許容し得る。キメラ受容体の別のドメインに対する抗原結合性フラグメントのかかる可動性及び移動をもたらす任意のアミノ酸配列を使用することができる。

【0136】

ヒンジドメインは、約１０～２００アミノ酸、例えば、１５～１５０アミノ酸、２０～１００アミノ酸、または３０～６０アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、約１０、１１、１２、１３、１４，１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００アミノ酸長であり得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当技術分野で知られているいずれのタンパク質のヒンジドメインも、本書に記述されるキメラ受容体における使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体に可動性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８αのものである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８αまたはＣＤ２８αのヒンジドメインの少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０）個の連続アミノ酸を含むフラグメントである。

【0138】

ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などの抗体のヒンジドメインも、本書に記述されるキメラ受容体における使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２を結合するヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のものであり、抗体のヒンジドメイン及び抗体の１つまたは複数の定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体のＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインならびに抗体のＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２及びＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域及びＣＨ３定常領域を含む。

【0139】

本開示の範囲内には、天然に存在しないペプチドであるヒンジドメインを含むキメラ受容体も含まれる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合性ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、（Ｇｌｙ_ｘＳｅｒ）_ｎリンカー）などのペプチドリンカーであり、式中、ｘ及びｎは、独立して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２を含む３～１２の整数、またはそれ以上であり得る。

【0140】

本書に記述されるキメラ受容体のヒンジドメインにおいて使用され得る更なるペプチドリンカーは、当技術分野では公知である。例えば、Ｗｒｉｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）８０（６）：７３６－７４６及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０８８４６１号を参照のこと。

【0141】

いくつかの実施形態では、本書に記述されるキメラ受容体は、膜貫通ドメインを含み得る。キメラ受容体において使用するための膜貫通ドメインは、当技術分野で知られている任意の形態であり得る。本書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは真核細胞膜において、熱力学的に安定している任意のタンパク質構造を指す。本書で使用されるキメラ受容体における使用に適合する膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から取得することができる。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の天然に存在しないタンパク質セグメント、例えば、細胞膜において熱力学的に安定している疎水性タンパク質セグメントであり得る。

【0142】

膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインが膜を通過する回数及びタンパク質の向きを含む、膜貫通ドメインのトポロジーに基づいて分類される。例えば、シングルパス膜タンパク質は細胞膜を１回横断し、マルチパス膜タンパク質は細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の回数）横断する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、シングルパス膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、キメラ受容体のＮ末端を細胞の細胞外側に向け、キメラ受容体のＣ末端を細胞の細胞内側に向けるシングルパス膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、シングルパス膜貫通タンパク質から取得される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αのものである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８のものである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＩＣＯＳのものである。

【0143】

いくつかの実施形態では、本書に記述されるキメラ受容体は、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本書で使用される「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内のシグナル伝達を媒介してエフェクター機能などの免疫応答を誘導するタンパク質の少なくとも一部を指す。本書に記述されるキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、シグナルを伝達し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球などの免疫細胞によって媒介される応答を調節する、共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。

【0144】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、複数（少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、異なる共刺激タンパク質から取得される複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。

【0145】

概して、多くの免疫細胞には、細胞増殖、分化、及び生存を促進し、細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて共刺激が必要である。宿主細胞（例えば、免疫細胞）内の共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、サイトカインの産生及び分泌、貪食特性、増殖、分化、生存、及び／または細胞傷害性を増加または減少させるように細胞を誘導し得る。いずれの共刺激タンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインも、本書に記述されるキメラ受容体における使用に適合し得る。共刺激シグナル伝達ドメインの種類（複数可）は、キメラ受容体が発現される免疫細胞の種類（例えば、初代Ｔ細胞、Ｔ細胞株、ＮＫ細胞株）、及び所望の免疫エフェクター機能（例えば、細胞傷害性）などの因子に基づいて選択される。キメラ受容体において使用するための共刺激シグナル伝達ドメインの例は、限定されるものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、Ｃｄ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３を含む、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳに由来する。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８に由来し、キメラ受容体は、４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ由来の第２の共刺激ドメインを含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、複数の共刺激ドメインまたは複数の共刺激ドメインの一部を含む融合ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８及びＩＣＯＳ由来の共刺激ドメインの融合体である。

【0147】

いくつかの実施形態では、本書に記述されるキメラ受容体は、細胞質シグナル伝達ドメインを含む。任意の細胞質シグナル伝達ドメインが、本書に記述されるキメラ受容体において使用され得る。概して、細胞質シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合性ドメインとそのリガンドとの相互作用などのシグナルを中継して、細胞のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性）を誘導するなど、細胞応答を刺激する。

【0148】

当業者には明らかであるように、Ｔ細胞活性化に関与する因子は、細胞質シグナル伝達ドメインの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化である。当技術分野で知られている任意のＩＴＡＭ含有ドメインを使用して、本書に記述されるキメラ受容体を構築することができる。概して、ＩＴＡＭモチーフは、アミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つのリピートが６～８アミノ酸によって分離され（ここで、各ｘは独立して、任意のアミノ酸である）、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉとなったものを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ由来である。

【0149】

例示的なキメラ受容体を以下の表２及び３に提示する。

【表2】

【0150】

キメラ受容体を構築するための例示的な構成要素の核酸配列を以下に提示する。

【0151】

ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン－ＤＮＡ－ヒト（配列番号１５）
ＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ

【0152】

ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメイン－ＤＮＡ－ヒト（配列番号１６）
ＣＴＡＴＣＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＡＡＣＴＣＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＣＣＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＣＡＴＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ

【0153】

ＣＤ２８／ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域－ＤＮＡ－ヒト（配列番号１７）
ＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ

【0154】

いくつかの実施形態では、核酸配列は、ＣＤ３３に結合し、配列番号５のＣＤＲと同じＣＤＲを有する重鎖可変領域と、配列番号７のＣＤＲと同じＣＤＲを有する軽鎖可変領域とを含む、抗原結合性フラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、抗原結合性フラグメントは、配列番号５に提示される重鎖可変領域と、配列番号７に提示される軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ヒンジドメイン及び／または共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。

【0155】

表３は、本書に記述される例示的なキメラ受容体を提示する。例示的な構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗原結合性フラグメント、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを有する。いくつかの例において、キメラ受容体は、抗原結合性フラグメントと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの例において、キメラ受容体は、膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に位置し得る、１つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む。

【表3】

【0156】

上記の表３に列記した例示的なキメラ受容体のアミノ酸配列を以下に提示する。

【0157】

ＣＡＲＴ１アミノ酸配列（配列番号１８）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

【0158】

ＣＡＲＴ２アミノ酸配列（配列番号１９）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

【0159】

ＣＡＲＴ３アミノ酸配列（配列番号２０）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

【0160】

ＣＡＲＴ８アミノ酸配列（配列番号２１）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＷＬＰＩＧＣＡＡＦＶＶＶＣＩＬＧＣＩＬＩＣＷＬＴＫＫＫＹＳＳＳＶＨＤＰＮＧＥＹＭＦＭＲＡＶＮＴＡＫＫＳＲＬＴＤＶＴＬＴＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

【0161】

ＣＡＲＴ４ｄｕａｌアミノ酸配列（配列番号２２）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

【0162】

ＣＡＲＴ５ｄｕａｌアミノ酸配列（配列番号２３）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ

【0163】

ＣＡＲＴ６アミノ酸配列（配列番号２４）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

【0164】

ＣＡＲＴ７アミノ酸配列（配列番号２５）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

【0165】

上記の表３に列記した例示的なキメラ受容体の核酸配列を以下に提示する。

【0166】

ＣＡＲＴ１核酸配列（配列番号２６）
ＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＣＧＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＧ

【0167】

ＣＡＲＴ２核酸配列（配列番号２７）
ＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＧ

【0168】

ＣＡＲＴ３核酸配列（配列番号２８）
ＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＧ

【0169】

ＣＡＲＴ４ｄｕａｌ核酸配列（配列番号２９）
ＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＴＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＧ

【0170】

ＣＡＲＴ５ｄｕａｌ核酸配列（配列番号３０）
ＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＧ

【0171】

ＣＡＲＴ６核酸配列（配列番号３１）
ＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧＧＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＧ

【0172】

ＣＡＲＴ７核酸配列（配列番号３２）
ＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＡＧＴＧＡＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＧ

【0173】

さらに、本書では、ＡＭＬ患者においてＣＤ３３をターゲティングするキメラ受容体に加えてＥＭＲ２をターゲティングするキメラ受容体を発現する免疫細胞も企図される。これは、１）抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する免疫細胞と、抗ＥＭＲ２キメラ受容体を発現する免疫細胞とを別々に生成し、両種類の免疫細胞を別々に患者に注入すること、または２）ＣＤ３３及びＥＭＲ２の両方をターゲティングする免疫細胞を同時に生成すること（Ｋａｋａｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（２０１４）２：１５１）という、２つの異なるアプローチによって達成することができる。

【0174】

本書に記述されるキメラ受容体のいずれも、組換え技術などの定型的な方法によって調製することができる。本書におけるキメラ受容体を調製するための方法は、抗原結合性フラグメントと、場合により、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ受容体のドメインの各々を含むポリペプチドをコードする核酸の生成を伴う。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の構成要素の各々をコードする核酸は、組換え技術を使用してひとつに結合される。

【0175】

キメラ受容体の構成要素の各々の配列は、定型的な技術、例えば、ＰＣＲ増幅を介して、当技術分野で知られている種々の供給源のうちのいずれか１つから取得することができる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の構成要素のうちの１つまたは複数の配列は、ヒト細胞から取得される。代替的に、キメラ受容体の１つまたは複数の構成要素の配列は、合成することができる。構成要素（例えば、ドメイン）の各々の配列は、ＰＣＲ増幅またはライゲーションなどの方法を使用して、キメラ受容体をコードする核酸配列を形成するために、直接的または間接的に（例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を使用して）結合させることができる。代替的に、キメラ受容体をコードする核酸は、合成してもよい。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、核酸はＲＮＡである。

【0176】

構成要素の各々の配列を結合させる前または後の、キメラ受容体の構成要素のうちの１つまたは複数（例えば、抗原結合性フラグメント）における１つまたは複数の残基の変異。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の構成要素における１つまたは複数の変異は、ターゲットに対する構成要素（例えば、ターゲット抗原に対する抗原結合性フラグメント）の親和性を調節する（増加または減少させる）及び／または構成要素の活性を調節するためになされ得る。

【0177】

本書に記述されるキメラ受容体のいずれも、従来の技術を介して、好適な免疫細胞に導入して発現させることができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、初代Ｔ細胞またはＴ細胞株などのＴ細胞である。代替的に、免疫細胞は、確立されたＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ－９２細胞）などのＮＫ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ８（ＣＤ８^＋）またはＣＤ８及びＣＤ４（ＣＤ８^＋／ＣＤ４^＋）を発現するＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、確立されたＴ細胞株のＴ細胞、例えば、２９３Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞である。

【0178】

初代Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、脾臓、リンパ節、胸腺、または腫瘍組織などの組織のような、任意の供給源から取得することができる。所望の種類の免疫細胞を取得するために好適な供給源は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者、例えば、患者から取得された骨髄またはＰＢＭＣに由来する。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、健康なドナーに由来する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、キメラ受容体を発現する免疫細胞が後に投与される対象から取得される。細胞の取得元となった対象と同じ対象に投与される免疫細胞は自己由来細胞と呼ばれ、一方、細胞が投与される対象ではない対象から取得される免疫細胞は同種異系細胞と呼ばれる。

【0179】

所望の種類の宿主細胞は、刺激分子と共に細胞をコインキュベートすることによって取得された細胞集団内で拡大培養することができ、例えば、Ｔ細胞の拡大培養には、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。

【0180】

本書に記述されるキメラ受容体構築物のいずれかを発現する免疫細胞を構築するためには、キメラ受容体構築物の安定発現または一過性発現のための発現ベクターを、本書に記述される従来の方法を介して構築し、免疫宿主細胞に導入することができる。例えば、キメラ受容体をコードする核酸を、好適なプロモーターに作動可能に連結したウイルスベクターなどの好適な発現ベクターにクローニングしてもよい。核酸及びベクターを好適な条件下で制限酵素と接触させて、各分子上に相補的な末端を作り出してもよく、相補的な末端は、互いと対合することができ、リガーゼで結合させることができる。代替的に、キメラ受容体をコードする核酸の末端に合成核酸リンカーをライゲートしてもよい。合成リンカーは、ベクター内の特定の制限部位に対応する核酸配列を含み得る。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、キメラ受容体の発現のための宿主細胞の種類に依存するが、真核細胞における組み込み及び複製に好適なものであるべきである。

【0181】

本書に記述されるキメラ受容体の発現のためには種々のプロモーターを使用することができ、プロモーターは、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ、例えばラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ－ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲ、マロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＬＴＲ、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）ＬＴＲ、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）ＬＴＲ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーター、ＥＦ１－αイントロンありまたはなしの伸長因子１－アルファ（ＥＦ１－α）プロモーターを含む。キメラ受容体の発現のための更なるプロモーターには、免疫細胞において構成的活性型の任意のプロモーターが含まれる。代替的に、免疫細胞内で発現が調節され得るように、任意の制御可能なプロモーターを使用してもよい。

【0182】

更に、ベクターは、例えば、次のうちのいくつかまたはすべてを含み得る：宿主細胞における安定なまたは一過性のトランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結シグナル及びＲＮＡプロセシングシグナル；α－グロビンまたはβ－グロビンのような高発現遺伝子からのｍＲＮＡ安定性及び翻訳効率のための５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点及びＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）；多目的多重クローニング部位；センス及びアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７及びＳＰ６ ＲＮＡプロモーター；起動されるとベクター保有細胞の死を引き起こす「自殺スイッチ」または「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ｉＣａｓｐ９などの誘導性カスパーゼ）；ならびにキメラ受容体の発現を評価するためのレポーター遺伝子。導入遺伝子を含むベクターを産生するための好適なベクター及び方法は、当技術分野でよく知られており、利用可能である。キメラ受容体の発現のためのベクターの調製の例は、例えば、全体が参照により本書に組み込まれているＵＳ２０１４／０１０６４４９に見出すことができる。

【0183】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物または前記キメラ受容体をコードする核酸は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物または前記キメラ受容体をコードする核酸はＤＮＡベクターであり、免疫細胞に電気穿孔することができる（例えば、Ｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１２）１１９（１７）：３９４０－３９５０を参照のこと）。いくつかの実施形態では、キメラ受容体をコードする核酸は、免疫細胞に電気穿孔することができるＲＮＡ分子である。

【0184】

本書に記述されるキメラ受容体構築物をコードする核酸配列を含むベクターのいずれも、本開示の範囲内にある。そのようなベクターは、好適な方法によって宿主免疫細胞などの宿主細胞内に送達され得る。ベクターを免疫細胞へ送達する方法は当技術分野でよく知られており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはトランスポゾンを送達するための、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはトランスポゾンの電気穿孔、リポソームもしくはナノ粒子などのトランスフェクション試薬；機械的変形によるＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはトランスポゾン、もしくはタンパク質の送達（例えば、Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１３）１１０（６）：２０８２－２０８７を参照のこと）；またはウイルス形質導入を含み得る。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現のためのベクターは、ウイルス形質導入によって宿主細胞に送達される。例示的なウイルスによる送達方法は、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６号、同第ＷＯ９４／０３６２２号、同第ＷＯ９３／２５６９８号、同第ＷＯ９３／２５２３４号、同第ＷＯ９３／１１２３０号、同第ＷＯ９３／１０２１８号、同第ＷＯ９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号及び同第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；ならびに欧州特許第０３４５２４２号を参照のこと）、アルファウイルスベースのベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、同第ＷＯ９３／０３７６９号、同第ＷＯ９３／１９１９１号、同第ＷＯ９４／２８９３８号、同第ＷＯ９５／１１９８４号、及び同第ＷＯ９５／００６５５号を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現のためのベクターは、レトロウイルスである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現のためのベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現のためのベクターは、アデノ随伴ウイルスである。

【0185】

キメラ受容体をコードするベクターがウイルスベクターの使用により宿主細胞に導入される例では、免疫細胞に感染可能でありベクターを保有するウイルス粒子を、当技術分野で知られている任意の方法によって産生することができ、これは例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ１９９１／００２８０５号Ａ２、同第ＷＯ１９９８／００９２７１号Ａ１、及び米国特許第６，１９４，１９１号に見出すことができる。ウイルス粒子は細胞培養上清から回収され、ウイルス粒子を免疫細胞と接触させる前に単離及び／または精製されてもよい。

【0186】

本書に記述されるキメラ受容体のいずれかを発現する宿主細胞を調製する方法は、免疫細胞をｅｘ ｖｉｖｏで活性化及び／または拡大培養することを含み得る。宿主細胞の活性化は、宿主細胞を刺激して活性化状態にすることを意味し、この状態で細胞はエフェクター機能（例えば、細胞傷害性）を果たすことが可能であり得る。宿主細胞を活性化する方法は、キメラ受容体の発現のために使用される宿主細胞の種類に依存する。宿主細胞の拡大培養は、キメラ受容体を発現する細胞の数の増加をもたらす任意の方法、例えば、宿主細胞の増殖を可能にすること、または宿主細胞を刺激して増殖させることを含み得る。宿主細胞の拡大培養を刺激する方法は、キメラ受容体の発現のために使用される宿主細胞の種類に依存し、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、本書に記述されるキメラ受容体のいずれかを発現する宿主細胞は、対象への投与の前にｅｘ ｖｉｖｏで活性化及び／または拡大培養される。

【0187】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をターゲティングする薬剤は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。当業者には明らかであるように、「抗体－薬物コンジュゲート」という用語は、「免疫毒素」と同義に使用することができ、毒素または薬物分子にコンジュゲートされた抗体（またはその抗原結合性フラグメント）を含む融合分子を指す。抗体が対応する抗原に結合すると、細胞表面上に抗原を提示する細胞（例えば、ターゲット細胞）への毒素または薬物分子の送達が可能になり、それにより、ターゲット細胞の死がもたらされる。

【0188】

いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体－薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、抗原結合性フラグメントと、ターゲット細胞において細胞傷害性を誘導する毒素または薬物とを含む。いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、２型抗原をターゲティングする。いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、ＣＤ３３またはＥＭＲ２をターゲティングする。

【0189】

いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートの抗原結合フラグメントは、配列番号５により提示される重鎖可変領域と同じ重鎖ＣＤＲと、配列番号７により提示される軽鎖可変領域と同じ軽鎖ＣＤＲＳとを有する。いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートの抗原結合フラグメントは、配列番号５により提示される重鎖可変領域と、配列番号７により提示されるものと同じ軽鎖可変領域とを有する。

【0190】

抗体－薬物コンジュゲートにおける使用に適合する毒素または薬物は、当技術分野でよく知られており、当業者には明らかであろう。例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）３５（４）：ｅ００２２５、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１７）１６：３１５－３３７、Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１８）１１：８、Ｅｌｇｕｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１７）１２２：２－１９を参照のこと。

【0191】

いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、抗体及び薬物分子を結合させるリンカー（例えば、切断可能なリンカーなどのペプチドリンカー）をさらに含み得る。抗体－薬物コンジュゲートの例は、限定されるものではないが、ブレンツキシマブベドチン、グレンバツムマブベドチン／ＣＤＸ－０１１、デパツキシズマブマホドチン／ＡＢＴ－４１４、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ポラツズマブベドチン／ＲＧ７５９６／ＤＣＤＳ４５０１Ａ、デニンツズマブマホドチン／ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＧＳ－１６Ｃ３Ｆ、ＣＤＸ－０１４、ＲＧ７８４１／ＤＬＹＥ５９５３Ａ、ＲＧ７８８２／ＤＭＵＣ４０６Ａ、ＲＧ７９８６／ＤＣＤＳ０７８０Ａ、ＳＧＮ－ＬＩＶ１Ａ、エンホルツマブベドチン／ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＧ－１５ＭＥ、ＡＧＳ６７Ｅ、テリソツズマブベドチン／ＡＢＢＶ－３９９、ＡＢＢＶ－２２１、ＡＢＢＶ－０８５、ＧＳＫ－２８５７９１６、チソツマブベドチン／ＨｕＭａｘ－ＴＦ－ＡＤＣ、ＨｕＭａｘ－Ａｘｌ－ＡＤＣ、ピナツズマブベドチン／ＲＧ７５９３／ＤＣＤＴ２９８０Ｓ、リファスツズマブベドチン／ＲＧ７５９９／ＤＮＩＢ０６００Ａ、インデュサツマブベドチン／ＭＬＮ－０２６４／ＴＡＫ－２６４、バンドルツズマブベドチン／ＲＧ７４５０／ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ソフィツズマブベドチン／ＲＧ７４５８／ＤＭＵＣ５７５４Ａ、ＲＧ７６００／ＤＭＯＴ４０３９Ａ、ＲＧ７３３６／ＤＥＤＮ６５２６Ａ、ＭＥ１５４７、ＰＦ－０６２６３５０７／ＡＤＣ ５Ｔ４、トラスツズマブエムタンシン／Ｔ－ＤＭ１、ミルベツキシマブソラブタンシン／ＩＭＧＮ８５３、コルツキシマブラブタンシン／ＳＡＲ３４１９、ナラツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ５２９、インダツキシマブラブタンシン／ＢＴ－０６２、アネツマブラブタンシン／ＢＡＹ ９４－９３４３、ＳＡＲ４０８７０１、ＳＡＲ４２８９２６、ＡＭＧ ２２４、ＰＣＡ０６２、ＨＫＴ２８８、ＬＹ３０７６２２６、ＳＡＲ５６６６５８、ロルボツズマブメルタンシン／ＩＭＧＮ９０１、カンツズマブメルタンシン／ＳＢ－４０８０７５、カンツズマブラブタンシン／ＩＭＧＮ２４２、ラプリツキシマブエムタンシン／ＩＭＧＮ２８９、ＩＭＧＮ３８８、ビバツズマブメルタンシン、ＡＶＥ９６３３、ＢＩＩＢ０１５、ＭＬＮ２７０４、ＡＭＧ １７２、ＡＭＧ ５９５、ＬＯＰ ６２８、バダスツキシマブタリリン／ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ｂ、ＳＧＮ－ＣＤ１２３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ３５２Ａ、ロバルピツズマブテシリン／ＳＣ１６ＬＤ６．５、ＳＣ－００２、ＳＣ－００３、ＡＤＣＴ－３０１／ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ－ＰＢＤ、ＡＤＣＴ－４０２、ＭＥＤＩ３７２６／ＡＤＣ－４０１、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ６３２、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン／ＣＭＣ－５４４、ＰＦ－０６６４７２６３、ＣＭＤ－１９３、ＣＭＢ－４０１、トラスツズマブデュオカルマジン／ＳＹＤ９８５、ＢＭＳ－９３６５６１／ＭＤＸ－１２０３、サシツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３２、ラベツズマブゴビテカン／ＩＭＭＵ－１３０、ＤＳ－８２０１ａ、Ｕ３－１４０２、ミラツズマブドキソルビシン／ＩＭＭＵ－１１０／ｈＬＬ１－ＤＯＸ、ＢＭＳ－９８６１４８、ＲＣ４８－ＡＤＣ／ヘルツズマブ－ｖｃ－ＭＭＡＥ、ＰＦ－０６６４７０２０、ＰＦ－０６６５０８０８、ＰＦ－０６６６４１７８／ＲＮ９２７Ｃ、ルパルツマブアマドチン／ＢＡＹ１１２９９８０、アプルツマブイクサドチン／ＢＡＹ１１８７９８２、ＡＲＸ７８８、ＡＧＳ６２Ｐ１、ＸＭＴ－１５２２、ＡｂＧｎ－１０７、ＭＥＤＩ４２７６、ＤＳＴＡ４６３７Ｓ／ＲＧ７８６１を含む。一例において、抗体－薬物コンジュゲートはゲムツズマブオゾガマイシンである。

【0192】

いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートが系列特異的細胞表面タンパク質のエピトープに結合すると、抗体－薬物コンジュゲートの内部移行が誘導され、薬物（または毒素）が細胞内に放出され得る。いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートが系列特異的細胞表面タンパク質のエピトープに結合すると、毒素または薬物の内部移行が誘導され、これにより、毒素または薬物が、系列特異的タンパク質を発現する細胞（ターゲット細胞）を死滅させることが可能になる。いくつかの実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートが系列特異的細胞表面タンパク質のエピトープに結合すると、毒素または薬物の内部移行が誘導され、これにより、系列特異的タンパク質を発現する細胞（ターゲット細胞）の活性が制御され得る。本書に記述される抗体－薬物コンジュゲートに使用される毒素または薬物の種類は、いずれかの特定の種類に限定されない。

【0193】

本書に記述されるＡＤＣは、本書に記述される併用療法を受けた対象に対する後続処置として使用され得る。

【0194】

１つまたは複数の系列特異的細胞表面抗原（複数可）が欠損している造血細胞
本開示は、系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）が欠損するように遺伝子修飾された造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）などの造血細胞も提供する。いくつかの実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）などの造血細胞は、系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＥＭＲ２）が欠損するように遺伝子修飾されている。

【0195】

いくつかの実施形態では、細胞を遺伝子修飾し、オフターゲット効果及び望ましくない消耗性の免疫抑制副作用を低下させるために、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用した。いくつかの実施形態では、１つのＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、系列特異的細胞表面抗原が欠損するように細胞を修飾し、第２のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原が欠損するように細胞を修飾する。本書では、複数の系列特異的細胞表面抗原が欠損するように細胞を修飾するための、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用の成功を示す。いくつかの実施形態では、同じ細胞において、複数のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、複数の更なる系列特異的細胞表面抗原が欠失または阻害され得る。

【0196】

本書では、系列特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子における特定のヌクレオチド置換をもたらす、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの使用が示される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、スプライスエレメントをコードする配列内にあり、ヌクレオチド置換は、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、内因性遺伝子におけるスプライスエレメントをターゲティングし、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンがスキップされることを引き起こす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、エピトープをコードするエキソンが延長されることを引き起こす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、早期コドン終結を誘導する。いくつかの実施形態では、スプライスエレメントは、スプライスドナー、スプライスアクセプター、スプライスエンハンサー、またはスプライスアクセプターである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。いくつかの実施形態では、エピトープは、治療剤または免疫療法剤によってターゲティングされる。

【0197】

本書に記述されるＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素すなわちＣａｓ９ニッカーゼに融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質と、シングルガイドＲＮＡとを含む。ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディター複合体の各々は、系列特異的抗原ポリヌクレオチドに結合し、１つまたは複数のヌクレオチドの置換を可能にし、それにより、ポリヌクレオチドを修飾することができる。複数のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、複数の系列特異的細胞表面抗原を修飾することができる。

【0198】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、シトシン塩基エディターに融合したＣａｓニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターは、シトシン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、シトシン塩基エディターは、ＢＥ４ｍａｘである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、ＣＤ３３をターゲティングし、ｇＲＮＡは、配列番号１及び２からなる群から選択される。

【0199】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターは、アデノシン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、シトシン塩基エディターは、ＡＢＥ８ｅである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、ＣＤ３３をターゲティングし、ｇＲＮＡは、配列番号３である。

【0200】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３３のエキソン２内のスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位が改変される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションのヌクレオチド配列が改変される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３をコードするヌクレオチド配列のエキソン２内のスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサー部位をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３のＳＮＰであるｒｓ１２４５９４１９をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＣＤ３３のイントロン１／エキソン２ジャンクションをターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、配列番号３７を含むヌクレオチド配列をターゲティングする。

【0201】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターは、アデノシン塩基エディターである。いくつかの実施形態では、シトシン塩基エディターは、ＡＢＥ８ｅである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、ＥＭＲ２をターゲティングし、ｇＲＮＡは、配列番号４である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、ＥＭＲ２をターゲティングし、ｇＲＮＡは、配列番号４６である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、ＥＭＲ２をターゲティングし、ｇＲＮＡは、配列番号４７である。

【0202】

いくつかの実施形態では、ＥＭＲ２のエキソン１３内のスプライスドナー部位が改変される。いくつかの実施形態では、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションのヌクレオチド配列が改変される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｃ」から「Ｔ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｇ」から「Ａ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ａ」から「Ｇ」である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換は、「Ｔ」から「Ｃ」である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＥＭＲ２をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＥＭＲ２をコードするヌクレオチド配列のエキソン１３内のスプライスドナー部位をターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ＥＭＲ２のイントロン１２／エキソン１３ジャンクションをターゲティングする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、配列番号４０を含むヌクレオチド配列をターゲティングする。

【0203】

いくつかの実施形態では、前述のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムのすべてが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達系に塩基エディタータンパク質及びｇＲＮＡを含むことができる。

【0204】

いくつかの実施形態では、造血細胞は、ＨＳＣ、ＨＰＣ、または本書で「ＨＳＰＣ」（「造血幹細胞及び／または前駆細胞」）と呼ばれるそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本書に記述される細胞集団は、複数の造血幹細胞を含み、いくつかの実施形態では、本書に記述される細胞集団は、複数の造血前駆細胞を含み、いくつかの実施形態では、本書に記述される細胞集団は、複数の造血幹細胞及び複数の造血前駆細胞を含む。ＨＳＣは、骨髄系前駆細胞とリンパ系前駆細胞との両方を生じさせることができ、これらはさらに、骨髄性細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など）及びリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）をそれぞれ生じさせる。ＨＳＣは、ＨＳＣの識別及び／または単離に使用され得る細胞表面マーカーＣＤ３４の発現（例えば、ＣＤ３４^＋）、及び細胞系列への傾倒に関連する細胞表面マーカーの非存在を特徴とする。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＣはＣＤ３４^＋である。

【0205】

いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、哺乳動物対象などの対象から取得される。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象は、非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ブタ、ウマ、または家畜である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者などのヒト患者から取得される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、健康なドナーから取得される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、キメラ受容体を発現する免疫細胞が後に投与される対象から取得される。細胞の取得元となった対象と同じ対象に投与されるＨＳＣは自己由来細胞と呼ばれ、一方、細胞が投与される対象ではない対象から取得されるＨＳＣは同種異系細胞と呼ばれる。

【0206】

ＨＳＣは、当技術分野で知られている従来手段を使用して、任意の好適な供給源から取得することができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、骨髄サンプルまたは血液サンプルなど、対象由来のサンプルから取得される。代替的に、またはさらに、ＨＳＣは臍帯から取得することができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、骨髄または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する。概して、骨髄細胞は、対象の腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨、または他の髄腔から取得することができる。骨髄は、患者から採取され、当技術分野で知られている様々な分離及び洗浄手順によって単離され得る。骨髄細胞を単離するための例示的な手順は、次のステップを含む：ａ）骨髄サンプルを抽出すること；ｂ）骨髄懸濁液を遠心分離で３つの画分に分け、中間画分またはバフィーコートを収集すること；ｃ）ステップ（ｂ）のバフィーコート画分を、分離液、一般的にはＦｉｃｏｌｌ（商標）中でもう一度遠心分離し、骨髄細胞を含む中間画分を収集すること；及びｄ）ステップ（ｃ）から収集された画分を洗浄して、再輸注可能な骨髄細胞を回収すること。

【0207】

ＨＳＣは通常、骨髄に存在するが、末梢血からＨＳＣを採取するために動員剤を投与することにより、循環血中に動員することができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣの取得元になる対象は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）などの動員剤を投与される。動員剤を使用した動員後に収集されるＨＳＣの数は、通常、動員剤を使用せずに取得される細胞の数より多い。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、末梢血ＨＳＣである。

【0208】

いくつかの実施形態では、サンプルが対象から取得され、次に、所望の細胞型が濃縮される。例えば、ＰＢＭＣ及び／またはＣＤ３４^＋造血細胞は、本書に記述されるように、血液から単離され得る。細胞は、例えば、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体を用いた単離及び／または活性化により、他の細胞から単離することもできる。使用できる別の方法には、細胞表面マーカーに対する抗体を使用して、受容体の関与により細胞を活性化することなく特定の細胞型を選択的に濃縮する、負の選択が含まれる。

【0209】

ＨＳＣの集団は、ＨＳＣを遺伝子工学操作して系列特異的細胞表面抗原を欠損させる前または後に拡大培養することができる。細胞は、１つまたは複数のサイトカイン、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、またはインターロイキン６（ＩＬ－６）を含む、拡大培養培地を含む条件下で培養され得る。細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５日、または必要な任意の範囲にわたって拡大培養してもよい。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、対象から取得されたサンプルから所望の細胞集団（例えば、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３３^－）を単離した後、かつ遺伝子工学操作の前に拡大培養される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、遺伝子工学操作の後に拡大培養され、それにより、遺伝子修飾を受けて系列特異的細胞表面抗原が欠損している細胞が選択的に拡大培養される。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾後に所望の特徴（例えば、表現型または遺伝子型）を有する１つの細胞（「クローン」）または幾つかの細胞を選択し、独立して拡大培養することができる。

【0210】

いくつかの実施形態では、造血細胞は、系列特異的抗原細胞表面（例えば、ＣＤ３３）が欠損する（例えば、それを発現しない）ように遺伝子工学操作される。いくつかの実施形態では、造血細胞は、系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原が欠損する（例えば、それらを発現しない）ように遺伝子工学操作される。いくつかの実施形態では、造血細胞は、薬剤（複数可）によってターゲティングされるものと同じ系列特異的細胞表面抗原（複数可）が欠損するように遺伝子工学操作される。本書で使用される場合、造血細胞において系列特異的細胞表面抗原（複数可）が欠損しているとみなされるのは、造血細胞における系列特異的細胞表面抗原（複数可）の発現が、遺伝子工学操作された造血細胞と同じ種類の（例えば、ＣＤ３４などの同じ細胞表面マーカーの存在によって特徴付けられる）天然に存在する造血細胞と比較して実質的に低下している場合である。いくつかの実施形態では、造血細胞は、系列特異的細胞表面抗原（複数可）の発現が検出不可能である（例えば、系列特異的細胞表面抗原（複数可）を発現しない）。系列特異的細胞表面抗原の発現レベルは、当技術分野で知られている任意の手段によって評価され得る。例えば、系列特異的細胞表面抗原の発現レベルは、抗原特異的抗体で抗原を検出すること（例えば、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロッティング）によって評価することができる。

【0211】

いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血細胞における系列特異的細胞表面抗原（複数可）の発現が、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型の同等物）における系列特異的細胞表面抗原（複数可）の発現と比較される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作は、天然に存在する造血細胞における系列特異的細胞表面抗原（複数可）の発現と比較した場合、系列特異的細胞表面抗原（複数可）の発現レベルにおける少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の低下をもたらす。すなわち、いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型の同等物）と比較した場合、系列特異的細胞表面抗原（複数可）（例えば、ＣＤ３３）の約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満を発現する。

【0212】

いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作は、天然に存在する造血細胞における野生型の系列特異的細胞表面抗原（複数可）のレベルの発現と比較した場合、野生型の系列特異的細胞表面抗原（複数可）（例えば、ＣＤ３３）の発現レベルにおける少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の低下をもたらす。すなわち、いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型の同等物）と比較した場合、野生型の系列特異的細胞表面抗原（複数可）（例えば、ＣＤ３３）の約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満を発現する。

【0213】

いくつかの実施形態では、造血細胞は、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードする内因性遺伝子全体が欠損している。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードする内因性遺伝子全体が欠失している。いくつかの実施形態では、造血細胞は、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードする内因性遺伝子の一部を含む。いくつかの実施形態では、造血細胞は、系列特異的細胞表面抗原（複数可）の一部（例えばトランケート型タンパク質）を発現する。他の実施形態では、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードする内因性遺伝子の一部が欠失している。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードする遺伝子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上が欠失している。

【0214】

いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血細胞における系列特異的細胞表面抗原（複数可）のエキソンによってコードされるエピトープの発現が、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型の同等物）における系列特異的細胞表面抗原（複数可）のエピトープの発現と比較される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作は、天然に存在する造血細胞における系列特異的細胞表面抗原（複数可）のエピトープの発現と比較した場合、系列特異的細胞表面抗原（複数可）のエピトープの発現レベルにおける少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の低下をもたらす。すなわち、いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば、野生型の同等物）と比較した場合、系列特異的細胞表面抗原（複数可）（例えば、ＣＤ３３）のエピトープの約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満を発現する。

【0215】

いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの置換が、内因性遺伝子のエキソンによってコードされるエピトープにおいてなされる。

【0216】

当業者には理解されるように、造血細胞において抗原（複数可）が欠損する（例えば、抗原（複数可）の発現が実質的に低下する）ように、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をコードするヌクレオチド配列の一部、または１つもしくは複数の非コード配列が欠失していてもよい。

【0217】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＣＤ３３である。ＣＤ３３の予測される構造には、ＩｇＶドメイン及びＩｇＣ２ドメインという２つの免疫グロブリンドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３のエキソン２が欠失する。いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ３３遺伝子のエキソン２内の改変されたスプライスアクセプターまたはエキソンスプライシングエンハンサーが改変され、改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＣＤ３３のエキソン２によってコードされるエピトープの発現レベル低下を引き起こす。

【0218】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２である。いくつかの実施形態では、ＥＭＲ２のエキソン１３が欠失する。いくつかの実施形態では、内因性ＥＭＲ２遺伝子のエキソン１３内の改変されたスプライスドナーが改変され、改変は、野生型の同等の細胞と比較した場合、ＥＭＲ２のエキソン１３によってコードされるエピトープの発現レベル低下を引き起こす。いくつかの実施形態では、選択的スプライシングは、野生型の同等の細胞と比較した場合、早期コドン終結及び変異型またはトランケート型のＥＭＲ２の産生を誘導する。

【0219】

１つまたは複数の細胞表面系列特異的抗原が欠損している、または改変されている、ＨＳＣなどの遺伝子工学操作造血細胞のいずれも、定型的な方法または本書に記述される方法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子工学操作は、ゲノム編集を使用して行われる。本書で使用される場合、「ゲノム編集」とは、生物のタンパク質をコードするまたはコードしない任意のヌクレオチド配列を含むゲノムを修飾して、ターゲット遺伝子の発現をノックアウトする方法を指す。

【0220】

本開示の一態様では、系列特異的抗原が修飾されている正常細胞を使用する、修飾された正常細胞集団による腫瘍細胞の置換が行われる。そのような修飾は、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ベースの塩基エディターシステムを使用した、任意の系列特異的抗原の枯渇または阻害を含み得る。

【0221】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、細菌、ヒト、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ及び植物を含むがこれらに限定されない様々な生物のゲノムを編集するために首尾よく利用されている。例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）３１（３）：２３３、Ｑｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ（２０１３）５：１１７３、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１３）７：４３３６、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３），３：２２７）、Ｇｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９４：１０２９、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）６１２１：８１９、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）６１２１：８２３、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３）３：２３０、及びＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）４１（２０）：ｅｌ８８を参照のこと。

【0222】

本開示は、系列特異的抗原ポリヌクレオチドにおけるターゲット配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを利用し、ここで、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素すなわちＣａｓ９ニッカーゼに融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質と、シングルガイドＲＮＡとを含む。ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディター複合体は、系列特異的抗原ポリヌクレオチドに結合し、１つまたは複数のヌクレオチドの置換を可能にし、それにより、ポリヌクレオチドを修飾することができる。

【0223】

本開示のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、コード領域もしくは非コード領域内の細胞表面系列特異的抗原において、遺伝子においてもしくは遺伝子に隣接して、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロンなどで、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内で、目的の領域に結合し、及び／または目的の領域を切断し得る。本開示で使用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ゲノム内の所定の切断部位（ターゲット部位）への塩基エディタータンパク質－ｇＲＮＡ複合体の結合をｇＲＮＡが指示するように設計され得る。切断部位は、配列が未知の領域、またはＳＮＰ、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、再構成などを含む領域を含むフラグメントを遊離させるように選択され得る。

【0224】

本開示で使用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ゲノム内の所定のターゲット部位への塩基エディタータンパク質－ｇＲＮＡ複合体の結合をｇＲＮＡが指示するように設計され得る。ターゲット部位は、ＳＮＰ、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、再構成などを含む領域であり得る。

【0225】

「ｇＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」及び「ＣＲＩＳＰＲガイド配列」という用語は、全体を通して同義に使用されることがあり、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの塩基エディタータンパク質の特異性を決定する配列を含む核酸を指す。ｇＲＮＡは、宿主細胞のゲノム中のターゲット核酸配列に（部分的または完全に相補的に）ハイブリダイズする。ターゲット核酸にハイブリダイズするｇＲＮＡまたはその一部は、１５～２５ヌクレオチド長、１８～２２ヌクレオチド長、または１９～２１ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、ターゲット核酸にハイブリダイズするｇＲＮＡ配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ターゲット核酸にハイブリダイズするｇＲＮＡ配列は、１０～３０または１５～２５ヌクレオチド長である。

【0226】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ターゲット核酸に結合する配列に加えて、足場配列も含む。ターゲット核酸に相補的な配列と足場配列との両方をコードするｇＲＮＡの発現は、ターゲット核酸に結合（ハイブリダイズ）すること、及びエンドヌクレアーゼをターゲット核酸に動員することの両方の二重機能を有し、部位特異的ＣＲＩＳＰＲ活性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、そのようなキメラｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれることがある。

【0227】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは修飾されており、例えば、化学修飾されている。修飾されたｇＲＮＡは、核酸塩基、糖、及びホスホジエステル結合または骨格部分（例えば、ヌクレオチドリン酸）のうちの少なくとも１つの化学構造に対する修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。例示的なｇＲＮＡ修飾は、当業者には明らかであり、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ（２０１７）Ｍａｙ ２；６及び米国公開２０１６／０２８９６７５に見出すことができる。更なる好適な修飾には、ホスホロチオエート骨格修飾、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾糖、２’Ｆ修飾糖、リボース糖の二環式ヌクレオチド－ｃＥｔによる置換、３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。好適なｇＲＮＡ修飾は、例えば、Ｒａｈｄａｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（５１）：Ｅ７１１０－Ｅ７１１７及びＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５ Ｓｅｐ）３３（９）：９８５－９８９に記述されており、これらは各々、その全体が参照により本書に組み込まれている。

【0228】

いくつかの実施形態では、本書に記述されるｇＲＮＡは、化学修飾されている。例えば、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’末端に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを、ｇＲＮＡの３’末端に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－修飾ヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’末端及び３’末端の両方に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは化学修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学修飾された糖を有しない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル修飾されている。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのリン酸結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのチオＰＡＣＥ結合を含む。

【0229】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾されたヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾された、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’末端に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾された、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを、ｇＲＮＡの３’末端に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾された、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエートヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’末端及び３’末端に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の非架橋酸素原子が硫黄原子で置換されている骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは化学修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学修飾された糖を有しない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート修飾されている。

【0230】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の２’－Ｏ修飾かつ３’－リン修飾された、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾された、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’末端に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾された、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを、ｇＲＮＡの３’末端に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾された、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥヌクレオチドを、ｇＲＮＡの５’末端及び３’末端に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の非架橋酸素原子が硫黄原子で置換されており、１つまたは複数の非架橋酸素原子がアセテート基で置換されている骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは化学修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチドは、化学修飾された糖を有しない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ修飾かつ３’リン修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾されている。

【0231】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾された骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の非架橋酸素原子が硫黄原子で置換されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。

【0232】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数の非架橋酸素原子が硫黄原子で置換されており、１つまたは複数の非架橋酸素原子がアセテート基で置換されている骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から２番目のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３’末端から３番目のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３’末端から４番目のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。

【0233】

ｇＲＮＡの化学修飾は、例えば、全体が参照により本書に組み込まれているＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１５）３３（９）に記述されている。

【0234】

本書で使用される場合、「足場配列」は、ｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれ、相補的ｇＲＮＡ配列に結合（ハイブリダイズ）したターゲット核酸へとＣａｓエンドヌクレアーゼを動員する核酸配列を指す。少なくとも１つのステムループ構造を含み、エンドヌクレアーゼを動員する任意の足場配列が、本書に記述される遺伝要素及びベクターに使用され得る。例示的な足場配列は当業者には明らかであり、例えば、Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１－２３０８、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１４／０９３６９４号、及びＰＣＴ出願第ＷＯ２０１３／１７６７７２号に見出すことができる。

【0235】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は足場配列を含まず、足場配列は別個の転写物として発現される。そのような実施形態において、ｇＲＮＡ配列には、足場配列の一部に相補的であり、足場配列と結合（ハイブリダイズ）してエンドヌクレアーゼをターゲット核酸に動員するように機能する更なる配列がさらに含まれる。

【0236】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ターゲット核酸に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも１００％相補的である（ｇＲＮＡ配列とターゲットポリヌクレオチド配列との相補性の教示について参照により組み込まれている米国特許第８，６９７，３５９号も参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲガイド配列とターゲット核酸の３’末端付近のターゲット核酸との間のミスマッチは、ヌクレアーゼ切断活性を消失させ得ることが示されている（Ｕｐａｄｈｙａｙ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）３（１２）：２２３３－２２３８）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、ターゲット核酸の３’末端（例えば、ターゲット核酸の３’末端の最後の５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド）に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも１００％相補的である。

【0237】

ターゲット核酸の３’側には、エンドヌクレアーゼと相互作用し、ターゲット核酸へのエンドヌクレアーゼ活性のターゲティングにさらに関与し得る、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）がフランキングしている。ターゲット核酸にフランキングするＰＡＭ配列は、エンドヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの由来源に依存すると一般に考えられている。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列はＮＧＧである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列はＮＮＧＲＲＴである。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴである。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡである。Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａに由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列はＴＴＮである。

【0238】

いくつかの実施形態では、細胞の遺伝子工学操作は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディタータンパク質を細胞に導入することも含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターと、ｇＲＮＡをコードする核酸とは、同じ核酸（例えば、ベクター）において提供される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディタータンパク質と、ｇＲＮＡをコードする核酸とは、異なる核酸（例えば、異なるベクター）において提供される。代替的に、またはさらに、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターは、タンパク質形態で細胞に提供または導入され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、タンパク質形態でＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターと複合体を形成する。

【0239】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９酵素またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮｍＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣａｓ９）、またはＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質の活性を改変するようにさらに修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、「ニッカーゼ」または「Ｃａｓ９ｎ」と呼ばれるエンドヌクレアーゼの触媒残基のうちの１つを不活性化するよう修飾されている。Ｃａｓ９ニッカーゼエンドヌクレアーゼは、ターゲット核酸の１本のＤＮＡ鎖を切断する。例えば、Ｄａｂｒｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）１２（７５）を参照のこと。酵素のＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメインにおける１つまたは複数の変異はＣａｓ９効率を改善し得ることが示されている。例えば、Ｓａｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ Ｐｈａｒｍａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）１８（１３）を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９である。例えば、ｄＣａｓ９は、触媒活性残基（Ｄ１０及びＨ８４０）の変異を含み、ヌクレアーゼ活性を有しない。代替的に、またはさらに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、別のタンパク質またはその一部に融合していてもよい。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＫＲＡＢドメインなどのリプレッサードメインに融合している。いくつかの実施形態では、そのようなｄＣａｓ９融合タンパク質は、多重遺伝子抑制（例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ））のために、本書に記述される構築物と共に使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＶＰ６４またはＶＰＲなどのアクチベータードメインに融合している。いくつかの実施形態では、そのようなｄＣａｓ９融合タンパク質は、遺伝子活性化（例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ））のために、本書に記述される構築物と共に使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ヒストンデメチラーゼドメインまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインなどのエピジェネティック調節ドメインに融合している。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、ＬＳＤ１もしくはｐ３００、またはその一部に融合している。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９融合は、ＣＲＩＳＰＲベースのエピジェネティック調節のために使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９は、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインに融合している。いくつかの実施形態では、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインに融合したＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、ゲノム編集のために使用される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）に融合している。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質に融合したＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質は、ゲノム遺伝子座の標識及び／または可視化あるいはＣａｓエンドヌクレアーゼを発現する細胞の識別のために使用される。

【0240】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、酵素の特異性を増強する（例えば、オフターゲット効果を低下させ、ロバストなオンターゲット切断を維持する）ために修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、特異性が増強されたＣａｓ９バリアント（例えば、ｅＳＰＣａｓ９）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）３５１（６２６８）：８４－８８を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、高忠実度Ｃａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５２９：４９０－４９５を参照のこと。

【0241】

ＣａｓエンドヌクレアーゼなどのＣａｓ酵素は、当技術分野で知られており、様々な供給源から得ること、及び／または酵素の１つもしくは複数の活性もしくは特異性を調節するように工学操作／修飾することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、１つまたは複数のＰＡＭ配列を認識するように工学操作／修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ酵素が工学操作／修飾なしで認識するＰＡＭ配列とは異なる１つまたは複数のＰＡＭ配列を認識するように工学操作／修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、酵素のオフターゲット活性を低下させるように工学操作／修飾されている。

【0242】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、エンドヌクレアーゼ活性の特異性を改変する（例えば、オフターゲット切断を低下させ、細胞におけるＣａｓエンドヌクレアーゼ活性または寿命を減少させ、相同指向組換えを増加させ、非相同末端結合を低下させる）ようにさらに修飾されている。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１７）１６８：２０－３６を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、エンドヌクレアーゼのＰＡＭ認識を改変するように修飾されている。例えば、ＣａｓエンドヌクレアーゼＳｐＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＧＧを認識し、一方で、エンドヌクレアーゼの１つまたは複数の修飾を含むＳｐＣａｓ９の緩和型（ｒｅｌａｘｅｄ）バリアント（例えば、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＥＱＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧを認識し得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、修飾されていないＣａｓエンドヌクレアーゼと比較してより多くの潜在的なＰＡＭ配列を認識する場合、修飾されたＣａｓエンドヌクレアーゼのＰＡＭ認識は、「緩和型」とみなされる。例えば、ＣａｓエンドヌクレアーゼＳａＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴを認識し、一方で、エンドヌクレアーゼの１つまたは複数の修飾を含むＳａＣａｓ９の緩和型バリアント（例えば、ＫＫＨ ＳａＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＲＲＴを認識し得る。一例において、ＣａｓエンドヌクレアーゼＦｎＣａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＧを認識し、一方で、エンドヌクレアーゼの１つまたは複数の修飾を含むＦｎＣａｓ９の緩和型バリアント（例えば、ＲＨＡ ＦｎＣａｓ９）は、ＰＡＭ配列ＹＧを認識し得る。一例において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、置換変異Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列ＴＹＣＶを認識する。一例において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、置換変異Ｓ５４２Ｒ、Ｋ６０７Ｒ、及びＮ５５２Ｒを含むＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列ＴＡＴＶを認識する。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７）３５（８）：７８９－７９２を参照のこと。

【0243】

いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）のＣａｓエンドヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つはＣａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つはＣｐｆ１酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、少なくとも１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓではない生物に由来する。

【0244】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、塩基エディターである。塩基エディターエンドヌクレアーゼは、概して、機能ドメインに融合した、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１８）４７５（１１）：１９５５－１９６４、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８を参照のこと。

【0245】

ＣＲＩＳＰＲベースの塩基編集システムは、概して、編集を行うデアミナーゼに融合したＣａｓニッカーゼまたはＣａｓ、Ｃａｓを特定の遺伝子座にターゲティングするｇＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質によって指定される編集ウィンドウ内の編集のためのターゲット塩基を含む。

【0246】

現在、塩基エディターのクラスには、シトシン（ＣＢＥ）及びアデニン（ＡＢＥ）の２つがある。ＣＢＥは、ＣからＴへの変化（または逆鎖におけるＧからＡへの変化）を媒介する。ＡＢＥは、ＡからＧへの変化（または逆鎖におけるＴからＣへの変化）を行う。これは、可能な１２の変化のうちの４つを占めるにすぎない。

【0247】

最初のシトシン塩基エディターは、シチジンデアミナーゼを不活性なｄＣａｓ９とカップリングすることによって作製された（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５３３：４２０－４２４）。これらの融合物は、ＤＮＡを切断することなくシトシンをウラシルに変換する。そしてウラシルはその後、ＤＮＡの複製または修復によってチミンに変換される。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤（ＵＧＩ）をｄＣａｓ９に融合させると、ＵをＣ変異に戻す塩基除去修復が防止される。塩基編集効率を増加させるために、ｄＣａｓ９の代わりにＣａｓニッカーゼが使用された。得られたエディターのＢＥ３は、未修飾のＤＮＡ鎖にニックを入れることにより、細胞に「新しく合成された」ように見せる。よって、細胞はＵ含有鎖をテンプレートとして使用してＤＮＡを修復し、塩基編集をコピーする。

【0248】

第４世代の塩基エディターであるＢＥ４は、以前のＢＥで発生し得る望まれないＣ→ＧまたはＣ→Ａ変換を低下させる。これらの副産物は、塩基除去修復中にウラシルＮ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）による除去に起因した可能性が高い。ＵＮＧ阻害剤であるＵＧＩの第２のコピーを付加すると、塩基編集産物の純度が増加する。ＡＰＯＢＥＣ１－Ｃａｓ９ｎ及びＣａｓ９ｎ－ＵＧＩリンカーは、産物の純度を改善するために伸長された。これら３つの改善が、第４世代の塩基エディターを表す。ＢＥ３と比較すると、ＢＥ４は、Ｃ→Ｇ及びＣ→Ａ産物の２．３倍の減少ならびにインデル形成の２．３倍の減少をもたらす。

【0249】

哺乳動物編集のための塩基編集効率を改善することは、エディターが核に達して良好に発現されることを確実にすることである。核局在化シグナル及びＢＥ４のコドン使用法が改善されて、編集効率が４．２～６倍改善されたＢＥ４ｍａｘ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘが作り出された（Ｋｏｂｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１８）３６：８４３－８４６）。

【0250】

アデニン塩基エディターはアデニンをイノシンに変換し、ＡからＧへの変化をもたらす（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１７）５５１：４６４－４７１）。既知のＤＮＡアデニンデアミナーゼが存在しないため、アデニン塩基エディターを作るには更なるステップが必要である。同著者らは、定向進化を使用して、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡからそれを作り出した。

【0251】

核局在化及び発現を改善することによってもアデニン塩基エディターの改善が行われている。２０２０年には、塩基エディターのターゲティングの柔軟性及び特異性が改善された、ＡＢＥ７．１０から進化した更なるＡＢＥについて記述する２つの論文が公開された。この最初の論文では、オフターゲット活性を増加させることなく、ＡＢＥ７．１０のＴａｄＡよりも約５９０倍速く編集するＡＢＥ８ｅが生成された（Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０２０）３８：８８３－８９１）。

【0252】

更に、ＡＢＥ７．１０を出発点として使用して、Ｇａｕｄｅｌｌｉは、塩基エディターを４０の新しいＡＢＥ８バリアントに進化させた（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０２０）３８：８９２－９００）。ＡＢＥ７．１０と比較すると、ＡＢＥ８は、ＡＢＥ７．１０と比較した場合、プロトスペーサー位置Ａ５～Ａ７で１．５倍の編集、ならびにＮＧＧ ＰＡＭの位置Ａ３～Ａ４及びＡ８～Ａ１０で３．２倍の編集、ならびに非ＮＧＧ ＰＡＭバリアントで４．２倍高い編集効率をもたらした。ＡＢＥ８は、以前はターゲティングが困難であった部位においても、改善された塩基編集能力を有する。ＡＢＥ８は、初代Ｔ細胞において９８～９９％のターゲット修飾を達成できるため、細胞療法用途で有望なツールとなっている。

【0253】

いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合したｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えばＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合したｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＡＢＥ８ｅに融合したｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合したｄＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＢＥ４ｍａｘに融合したｄＣａｓ９を含んでいた。

【0254】

いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはＣａｓ９ｎである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合したＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えばＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合したＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＡＢＥ８ｅに融合したＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合したＣａｓ９ニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＢＥ４ｍａｘに融合したＣａｓ９ニッカーゼを含んでいた。

【0255】

塩基エディターの例は、限定されるものではないが、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＣＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＢＥ３、ＳａＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＢＥ３、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＡＢＥ８ｅ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、Ｓａ（ＫＫＨ）－ＡＢＥ、及びＣＲＩＳＰＲ－ＳＫＩＰを含む。塩基エディターの更なる例は、例えば、米国公開第２０１８／０３１２８２５号Ａ１、米国公開第２０１８／０３１２８２８号Ａ１、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１６５６２９号Ａ１に見出すことができ、これらは全体が参照により本書に組み込まれている。

【0256】

いくつかの実施形態では、塩基エディターは、ターゲット部位における塩基除去修復を阻害し、細胞のミスマッチ修復を誘導するようにさらに修飾されている。本書に記述されるＣａｓエンドヌクレアーゼのいずれも、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを分解及びエキソヌクレアーゼ活性から保護するために、Ｇａｍドメイン（バクテリオファージＭｕタンパク質）に融合していてもよい。例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１８）４７５（１１）：１９５５－１９６４を参照のこと。

【0257】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのクラス２タイプＶに属する。クラス２タイプＶのＣａｓエンドヌクレアーゼは、タイプＶ－Ａ、タイプＶ－Ｂ、タイプＶ－Ｃ、及びタイプＶ－Ｕにさらにカテゴリ分けできる。例えば、Ｓｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１７）を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼなどのタイプＶ－Ａ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼなどのタイプＶ－Ｂ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（２０１５）６０：３８５－３９７を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｍａｄ７である。

【0258】

代替的に、またはさらに、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼまたはそのバリアントである。当業者には理解されるように、ＣａｓエンドヌクレアーゼＣｐｆ１ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａと呼ばれることもある。例えば、Ｓｔｒｏｈｋｅｎｄｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１８）７１：１－９を参照のこと。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｐｒｏｖｅｔｅｌｌａ菌種もしくはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ菌種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ菌種（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＬｐＣｐｆ１）、またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質の活性を改変するようにさらに修飾されている。

【0259】

Ｃｐｆ１の触媒的に不活性なバリアント（Ｃａｓ１２ａ）は、ｄＣａｓ１２ａと呼ばれることがある。本書に記述されるように、Ｃｐｆ１の触媒的に不活性なバリアントは、機能ドメインに融合して塩基エディターを形成していてもよい。例えば、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０－７８８を参照のこと。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼは、ｄＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインに融合したｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）、例えばＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥに融合したｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＡＢＥ８ｅに融合したｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、シトジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ、ｐｍＣＤＡ１、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ））に融合したｄＣａｓ１２ａを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＢＥ４ｍａｘに融合したｄＣａｓ１２ａを含んでいた。

【0260】

代替的に、またはさらに、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントであり得る。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとは異なり、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼは古細菌に由来し、サイズが小さい傾向にある（例えば、４００～７００アミノ酸）。エンドヌクレアーゼはＰＡＭ配列を必要としない。例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）を参照のこと。

【0261】

本書に記述されるＣａｓエンドヌクレアーゼのいずれも、所望の時点でＣａｓエンドヌクレアーゼの発現及び／または活性のレベルを制御するように調節され得る。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの発現及び／または活性のレベルを細胞周期の特定の段階（複数可）において上昇させることが有利であり得る。相同性指向修復のレベルは細胞周期のＧ１期中に低下することが示されており、したがって、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの発現及び／または活性のレベルをＳ期、Ｇ２期、及び／またはＭ期中に上昇させると、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ編集後の相同性指向修復が増加し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの発現及び／または活性のレベルは、細胞周期のＳ期、Ｇ２期、及び／またはＭ期中に上昇する。一例において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ヒトジェミニンのＮ末端領域に融合した。例えば、Ｇｕｔｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（２０１６）１４（６）：１５５５－１５６６を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの発現及び／または活性のレベルは、Ｇ１期中に低下する。一例において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｇ１期中に活性が低下するように修飾されている。例えば、Ｌｏｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２０１８）を参照のこと。

【0262】

代替的に、またはさらに、本書に記述されるＣａｓエンドヌクレアーゼのいずれかは、エピジェネティック調節因子（例えば、クロマチン修飾酵素、例えば、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ）に融合していてもよい。例えば、Ｋｕｎｇｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．（２０１６）３２（２）：１０１－１１３を参照のこと。エピジェネティック調節因子に融合したＣａｓエンドヌクレアーゼは、「エピエフェクター」と呼ばれることがあり、一時的及び／または一過性のエンドヌクレアーゼ活性を可能にし得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、クロマチン修飾酵素に融合したｄＣａｓ９である。

【0263】

更に、本書に記述される組成物及び方法は、ＣＲＩＳＰＲのプライム編集方法において使用することができる。ＣＲＩＳＰＲベースのプライムエディターシステムは、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）に融合したＣａｓ９ニッカーゼを含み得る。プライムエディターシステムは、プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）も使用する。プライム編集は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターよりも多くの塩基置換を可能にし、これを使用することで、ヌクレオチド置換が、スプライスエレメントをコードする配列内にあり、ヌクレオチド置換が、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞を生成することができる。

【0264】

さらなる実施形態では、相同性指向修復を使用することで、ヌクレオチド置換が、スプライスエレメントをコードする配列内にあり、ヌクレオチド置換が、遺伝子によってコードされる転写物の選択的スプライシングをもたらす、本書に記述される遺伝子工学操作された造血幹細胞または前駆細胞が生成される。

【0265】

いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ配列が、系列特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、造血細胞における系列特異的細胞表面抗原を阻害するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ配列が、系列特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、造血細胞における複数の系列特異的細胞表面抗原を阻害するための組成物及び方法を提供する。

【0266】

いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ配列が、系列特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、造血細胞における系列特異的細胞表面抗原を改変するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ配列が、系列特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを使用して、造血細胞における複数の系列特異的細胞表面抗原を改変するための組成物及び方法を提供する。

【0267】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＣＤ３３であり、ｇＲＮＡは、ＣＤ３３をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＤ３３のエキソン２にフランキングする配列をハイブリダイズする（図４）。ＣＤ３３をターゲティングするｇＲＮＡの例を表４に提示するが、ＣＤ３３の適切なヌクレオチド配列にハイブリダイズし、本書に記述される方法において使用され得る、更なるｇＲＮＡを開発してもよい。

【0268】

場合によっては、本開示において使用するためのｇＲＮＡは、表４の例示的なガイドＲＮＡ配列のいずれかと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一のスペーサー配列を含み得る。

【0269】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原はＥＭＲ２であり、ｇＲＮＡは、ＥＭＲ２をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＥＭＲ２をコードするヌクレオチド配列のエキソン１３にフランキングする配列をハイブリダイズする（図９Ｂ）。ＥＭＲ２をターゲティングするｇＲＮＡの例を以下に提示するが、ＥＭＲ２の適切なヌクレオチド配列にハイブリダイズし、本書に記述される方法において使用され得る、更なるｇＲＮＡを開発してもよい。

【0270】

場合によっては、本開示において使用するためのｇＲＮＡは、配列番号４及び４６～４７のいずれかと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一のスペーサー配列を含み得る。

【表4】

【0271】

更に、本開示は、第１の系列特異的細胞表面抗原及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原、すなわち、第１の系列特異的抗原、第２の系列特異的抗原、第３の系列特異的抗原、第４の系列特異的抗原などを組み合わせて阻害するための組成物及び方法を提供する。

【0272】

更に、本開示は、第１の系列特異的細胞表面抗原及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原、すなわち、第１の系列特異的抗原、第２の系列特異的抗原、第３の系列特異的抗原、第４の系列特異的抗原などを組み合わせて改変するための組成物及び方法を提供する。

【0273】

いくつかの実施形態では、第１の系列特異的抗原はＣＤ３３である。いくつかの実施形態では、第２の系列特異的抗原はＥＭＲ２である。

【0274】

２つの核酸の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４－６８のアルゴリズムを、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３－７７に記載のように修正したものを使用して決定される。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長－１２で行うと、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を取得することができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５（１７）：３３８９－３４０２に記述されているようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。

【0275】

また本書では、細胞を用意することと、ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの構成要素を細胞に導入することとを含む、系列特異的細胞表面抗原が欠損しているまたは改変されている細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすると予測されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸が、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ベクターにおいて細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターは、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターをコードする核酸として細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターをコードするヌクレオチド配列とは、同じ核酸（例えば、同じベクター）において細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターは、タンパク質の形態で細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディター及びｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予備形成され、複合体として細胞に導入される。いくつかの実施形態では、複合体（例えば、リボ核タンパク質複合体）は、電気穿孔を使用して導入される。

【0276】

また本書では、細胞を用意することと、ゲノム編集のための複数のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステム、すなわち、系列特異的細胞表面抗原のゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲベースのエディターシステム、及び少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原のゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲベースのエディターシステム、例えば、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを細胞に導入することとを含む、複数の系列特異的細胞表面抗原が欠損しているまたは改変されている細胞を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、複数のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの構成要素が細胞に導入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすると予測されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸が、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ベクターにおいて細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターは、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターをコードする核酸として細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターをコードするヌクレオチド配列とは、同じ核酸（例えば、同じベクター）において細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターは、タンパク質の形態で細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディター及びｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予備形成され、複合体として細胞に導入される。いくつかの実施形態では、複合体（例えば、リボ核タンパク質複合体）は、電気穿孔を使用して導入される。

【0277】

いくつかの実施形態では、第１のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムは、後続ベースの塩基エディターシステムとは異なる方法によって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムのすべてが、同じ方法を使用して細胞に導入される。

【0278】

本開示は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの１つまたは複数の構成要素をコードし得る、工学操作された、天然に存在しないベクター及びベクター系をさらに提供し、このベクターは、（ｉ）系列特異的抗原配列にハイブリダイズする（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ及び（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0279】

本開示のベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用した哺乳動物細胞における１つまたは複数の配列の発現を駆動し得る。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：１８７）を含む。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターのコントロール機能は、通常、１つまたは複数の制御エレメントによってもたらされる。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、及び本書で開示され当技術分野で知られている他のものに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方で好適な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９のチャプター１６及び１７を参照のこと。

【0280】

本開示のベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的制御エレメントが核酸を発現させるために使用される）。そのような制御エレメントは、組織特異的または細胞特異的であり得るプロモーターを含む。プロモーターに適用される「組織特異的」という用語は、特定の型の組織（例えば、種子）に対して目的のヌクレオチド配列の選択的発現を指示することができ、異なる型の組織において同じ目的のヌクレオチド配列の発現が相対的にないプロモーターを指す。プロモーターに適用される「細胞型特異的」という用語は、特定の型の細胞における目的のヌクレオチド配列の選択的発現を指示することができ、同じ組織内の異なる型の細胞における同じ目的のヌクレオチド配列の発現が相対的にないプロモーターを指す。プロモーターに適用される「細胞型特異的」という用語は、単一の組織内の一領域において目的のヌクレオチド配列の選択的発現を促進することができるプロモーターも意味する。プロモーターの細胞型特異性は、当技術分野でよく知られている方法、例えば、免疫組織化学染色を使用して評価することができる。

【0281】

従来のウイルスに基づく遺伝子移入方法及びウイルスに基づかない遺伝子移入方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターをコードする核酸を哺乳動物細胞またはターゲット組織に導入することができる。そのような方法は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの構成要素をコードする核酸を培養下の細胞または宿主生物に投与するために使用することができる。

【0282】

非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本書に記述されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合された核酸を含む。一実施形態では、使用される非ウイルスベクター送達系は、予備形成されたリボ核タンパク質複合体（例えば、ターゲティングｇＲＮＡと複合したＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディタータンパク質を含む複合体）である。予備形成されたリボ核タンパク質複合体は次に、電気穿孔、微粒子銃照射、または他の物理的送達方法を介して細胞に導入され得る。一実施形態では、電気穿孔を使用して、予備形成されたリボ核タンパク質複合体を細胞に導入する。例えば、実施例１を参照のこと。

【0283】

ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含む。ウイルスベクターは、患者に直接（ｉｎ ｖｉｖｏ）投与されてもよいし、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで細胞を操作するために使用されてもよく、修飾された細胞は、患者に投与されてもよい。一実施形態では、本開示は、遺伝子移入のために、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルスのベクターを含むがこれらに限定されない、ウイルスベースのシステムを利用する。さらに、本開示は、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどの宿主ゲノムにおける組み込みが可能なベクターを提供する。好ましくは、本開示のＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの発現に使用されるベクターは、レンチウイルスベクターである。

【0284】

一実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターをコードする１つまたは複数のベクターを真核細胞に導入することを提供する。細胞は、がん細胞であり得る。代替的に、細胞は、造血幹細胞などの造血細胞である。幹細胞の例としては、多能性、複能性、及び単能性の幹細胞が挙げられる。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、胚性癌細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。好ましい実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターを造血幹細胞に導入することを提供する。

【0285】

本開示のベクターは、対象の真核細胞に送達される。ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムによる真核細胞の修飾は、細胞培養下で行うことができ、この方法は、修飾前に対象から真核細胞を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、前記真核細胞及び／またはそれに由来する細胞を対象に戻すことをさらに含む。

【0286】

併用療法
本書に記述されるように、系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）に結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤は、系列特異的細胞表面抗原またはそのエピトープが欠損している造血細胞、例えば、本書に記述されるＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステム及びｇＲＮＡを使用して産生された造血幹細胞または前駆細胞と組み合わせて対象に投与することができ、例えば、ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のヌクレオチド配列を含む。

【0287】

本書に記述されるように、系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＥＭＲ２）に結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤は、系列特異的細胞表面抗原またはそのエピトープが欠損している造血細胞、例えば、本書に記述されるＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステム及びｇＲＮＡを使用して産生された造血幹細胞または前駆細胞と組み合わせて対象に投与することができ、例えば、ｇＲＮＡは、配列番号４、配列番号４６、または配列番号４７のヌクレオチド配列を含む。

【0288】

また本書に記述されるように、系列特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）に結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤と、少なくとも１つの更なる系列特異的細胞表面抗原に結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤とは、系列特異的細胞表面抗原またはそのエピトープが欠損している造血細胞、例えば、本書に記述されるＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステム及びｇＲＮＡを使用して産生された造血幹細胞または前駆細胞と組み合わせて対象に投与することができ、例えば、ｇＲＮＡは、次のヌクレオチド配列を含む：
（配列番号１）、
（配列番号２）、または
（配列番号３）、及び
（配列番号４）、
（配列番号４６）、または
（配列番号４７）。

【0289】

本書で使用される場合、「対象」、「個体」、及び「患者」は、同義に使用され、脊椎動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、またはマウス、ウシ、ウマ、イヌ、もしくはネコの種を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である。

【0290】

いくつかの実施形態では、薬剤及び／または造血細胞を薬学的に許容できる担体と混合して医薬組成物を形成することができ、これも本開示の範囲内にある。

【0291】

本書に記述される方法を実施するために、系列特異的細胞表面抗原（複数可）に結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤（複数可）の有効量と、造血細胞の有効量とを、処置を必要とする対象に同時投与することができる。本書で使用される場合、「有効量」という用語は、「治療有効量」という用語と同義に使用されることがあり、それを必要とする対象に投与されると所望の活性をもたらすのに十分である、薬剤、細胞集団、または医薬組成物（例えば、薬剤及び／または造血細胞を含む組成物）の量を指す。本開示の文脈において、「有効量」という用語は、本開示の方法によって処置される障害の少なくとも１つの症状の顕在化を遅延させる、その進行を阻止する、それを軽減または緩和するのに十分である、化合物、細胞集団、または医薬組成物の量を指す。活性成分の組み合わせが投与される場合、組み合わせの有効量は、個別に投与された場合に有効であっただろう各成分の量を含んでも含まなくてもよいことに留意されたい。

【0292】

当業者には認識されるように、有効量は、処置される特定の状態、状態の重篤度、年齢、身体状態、サイズ、性別及び体重を含む個々の患者パラメータ、処置期間、並行療法（存在する場合）の性質、特定の投与経路、ならびに医療従事者の知識及び専門技術の範囲内にある同様の因子に応じて変動する。いくつかの実施形態では、有効量は、対象における任意の疾患または障害の症状を緩和、軽減、寛解、改善、低減させるか、またはその進行を遅延させる。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である。

【0293】

本書に記述されるように、キメラ受容体を発現する造血細胞及び／または免疫細胞は、対象にとって自己由来であり得、すなわち、細胞は、処置を必要とする対象から取得され、細胞表面系列特異的抗原の発現またはキメラ受容体構築物の発現が欠損するまたは改変されるように遺伝子工学操作され、次に同じ対象に投与される。自己由来細胞の対象への投与は、非自己由来細胞の投与と比較して、宿主細胞の拒絶反応の低減をもたらし得る。代替的に、宿主細胞は同種異系細胞であり、すなわち、細胞は、第１の対象から取得され、細胞表面系列特異的抗原の発現またはキメラ受容体構築物の発現が欠損するまたは改変されるように遺伝子工学操作され、第１の対象とは異なるが同じ種である第２の対象に投与される。例えば、同種異系免疫細胞は、ヒトドナーに由来し、ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与され得る。

【0294】

いくつかの実施形態では、本書に記述されるキメラ受容体のいずれかを発現する免疫細胞は、ターゲット細胞（例えば、がん細胞）の数を少なくとも２０％、例えば、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上低下させるのに有効な量で対象に投与される。

【0295】

哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される細胞、すなわち、免疫細胞または造血細胞の典型的な量は、例えば、細胞１００万個～１０００億個の範囲内であり得るが、この例示的な範囲を下回るまたは上回る量も本開示の範囲内にある。例えば、細胞の一日用量は、細胞約１００万個～約５００億個（例えば、細胞約５００万個、細胞約２５００万個、細胞約５億個、細胞約１０億個、細胞約５０億個、細胞約２００億個、細胞約３００億個、細胞約４００億個、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）、好ましくは細胞約１０００万個～約１０００億個（例えば、細胞約２０００万個、細胞約３０００万個、細胞約４０００万個、細胞約６０００万個、細胞約７０００万個、細胞約８０００万個、細胞約９０００万個、細胞約１００億個、細胞約２５０億個、細胞約５００億個、細胞約７５０億個、細胞約９００億個、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）、より好ましくは細胞約１億個～細胞約５００億個（例えば、細胞約１億２０００万個、細胞約２億５０００万個、細胞約３億５０００万個、細胞約４億５０００万個、細胞約６億５０００万個、細胞約８億個、細胞約９億個、細胞約３０億個、細胞約３００億個、細胞約４５０億個、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）であり得る。

【0296】

一実施形態では、キメラ受容体（例えば、キメラ受容体をコードする核酸）が免疫細胞に導入され、対象（例えば、ヒト患者）は、キメラ受容体を発現する免疫細胞の最初の投与または用量を受ける。薬剤（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞）の１回または複数回の後続投与が、前回の投与の後、１５日、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日の間隔で患者に提供されてもよい。薬剤の複数用量、例えば、薬剤の２回、３回、４回、またはそれ以上の投与が、１週間毎に対象に投与されてもよい。対象は、１週間に複数用量の薬剤（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞）を受け、その後１週間は薬剤の投与を受けず、続いて最後に薬剤の１回または複数回の更なる用量（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞の１週間に複数回の投与）を受けてもよい。キメラ受容体を発現する免疫細胞は、１週間に３回の隔日投与で、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、またはそれ以上にわたって投与され得る。

【0297】

本開示の文脈において、本書に列挙される疾患状態のいずれかに関連する限り、「処置する」、「処置」などの用語は、かかる状態に関連する少なくとも１つの症状を軽減もしくは緩和すること、またはかかる状態の進行を緩徐化もしくは逆転させることを意味する。本開示の意味において、「処置する」という用語は、疾患を阻止すること、その発症（すなわち、疾患の臨床的顕在化の前の期間）を遅延させること、及び／またはその発生もしくは悪化のリスクを低下させることも意味する。例えば、がんとの関連において、「処置する」という用語は、患者の腫瘍負荷を排除もしくは低下させること、または転移を防止、遅延、もしくは阻害することを意味し得る。

【0298】

いくつかの実施形態では、薬剤（複数可）は、系列特異的細胞表面抗原（複数可）と結合する抗原結合性フラグメントと、系列特異的細胞表面抗原（複数可）が欠損しているまたは改変されている造血細胞集団とを含む。したがって、そのような治療方法において、薬剤（複数可）は、薬剤（複数可）によってターゲティングされる細胞型の系列特異的細胞表面抗原（複数可）リポピュレーションを発現するターゲット細胞を認識する（それと結合する）。いくつかの実施形態では、患者の処置は、次のステップを含み得る：（１）系列特異的細胞表面抗原（複数可）をターゲティングする薬剤（複数可）の治療有効量を患者に投与すること、及び（２）自己由来または同種異系のいずれかの造血幹細胞を患者に注入または再注入することであって、系列特異的な疾患関連抗原（複数可）の発現が低下しているまたは改変されている造血細胞を注入または再注入すること。いくつかの実施形態では、患者の処置は、次のステップを含み得る：（１）キメラ受容体を発現する免疫細胞の治療有効量を患者に投与することであって、系列特異的細胞表面疾患関連抗原（複数可）と結合するキメラ受容体をコードする核酸配列を含む免疫細胞を投与すること、及び（２）自己由来または同種異系のいずれかの造血細胞（例えば、造血幹細胞）を患者に注入または再注入することであって、系列特異的疾患関連抗原（複数可）の発現が低下しているまたは改変されている造血細胞を注入または再注入すること。

【0299】

細胞表面系列特異的抗原（複数可）と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤（複数可）と、系列特異的細胞表面抗原（複数可）が欠損しているまたは改変されている造血細胞集団とを使用する治療方法の有効性は、当技術分野で知られている任意の方法によって評価することができ、熟練した医療専門家には明らかであろう。例えば、療法の有効性は、対象の生存または対象もしくは組織もしくはそのサンプルにおけるがん負荷によって評価され得る。いくつかの実施形態では、療法の有効性は、細胞の特定の集団または系列に属する細胞の数を定量化することによって評価される。いくつかの実施形態では、療法の有効性は、細胞表面系列特異的抗原を提示する細胞の数を定量化することによって評価される。

【0300】

いくつかの実施形態では、細胞表面系列特異的抗原に結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤と、造血細胞集団とは、併用投与される。

【0301】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原（複数可）と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤（複数可）（例えば、本書に記述されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）は、造血細胞の投与の前に投与される。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原（複数可）と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤（複数可）（例えば、本書に記述されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）は、造血細胞の投与の少なくとも約１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前、１０週間前、１１週間前、１２週間前、３ヶ月前、４ヶ月前、５ヶ月前、６ヶ月前、またはそれよりも前に投与される。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原（複数可）と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤（複数可）（例えば、本書に記述されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）は、造血細胞の投与の前に対象に複数回投与される。

【0302】

いくつかの実施形態では、造血細胞は、系列特異的細胞表面抗原（複数可）と結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤（複数可）（例えば、本書に記述されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）の前に投与される。いくつかの実施形態では、造血細胞集団は、系列特異的細胞表面抗原（複数可）に結合する抗原結合性フラグメントを含む薬剤（複数可）の投与の少なくとも約１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前、１０週間前、１１週間前、１２週間前、３ヶ月前、４ヶ月前、５ヶ月前、６ヶ月前、またはそれよりも前に投与される。

【0303】

いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤（複数可）と、造血細胞集団とは、実質的に同時に投与される。いくつかの実施形態では、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をターゲティングする薬剤（複数可）が投与され、患者が一定期間にわたって評価され、その後、造血細胞集団が投与される。いくつかの実施形態では、造血細胞集団が投与され、患者が一定期間にわたって評価され、その後、系列特異的細胞表面抗原（複数可）をターゲティングする薬剤（複数可）が投与される。

【0304】

本開示の範囲内には、薬剤及び／または造血細胞集団の複数回の投与（例えば、用量）も含まれる。いくつかの実施形態では、薬剤及び／または造血細胞集団は、対象に１回投与される。いくつかの実施形態では、薬剤及び／または造血細胞集団は、対象に複数回（例えば、少なくとも２回、３回、４回、５回、またはそれ以上）投与される。いくつかの実施形態では、薬剤及び／または造血細胞集団は、規則的な間隔で、例えば、６ヶ月毎に対象に投与される。

【0305】

いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト対象である。本書で使用される場合、造血器悪性腫瘍は、造血細胞（例えば、前駆細胞及び幹細胞を含む血液細胞）が関与する悪性異常を指す。造血器悪性腫瘍の例は、限定されるものではないが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を含む。白血病としては、急性骨髄性白血病、急性リンパ系白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病または慢性リンパ芽球性白血病、及び慢性リンパ系白血病が挙げられる。

【0306】

いくつかの実施形態では、白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ＡＭＬは、主要な分化制御経路及び成長制御経路を破壊する重要な遺伝子変化を徐々に獲得した形質転換細胞に起因する、異種性、クローン性、腫瘍性の疾患と特徴付けられる。（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ，（２０１５）３７３：１１３６）。ＣＤ３３糖タンパク質は、正常な骨髄系前駆細胞及び単球前駆細胞だけでなく骨髄性白血病細胞の大部分に発現し、ＡＭＬ療法の魅力的なターゲットと考えられてきた（Ｌａｓｚｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．（２０１４）２８（４）：１４３－５３）。抗ＣＤ３３モノクローナル抗体ベースの療法を使用した臨床試験では、標準的な化学療法と組み合わせた場合に一部のＡＭＬ患者において生存の改善が示されたが、これらの効果には、安全性及び有効性に関する懸念も付随した。

【0307】

ＡＭＬ細胞のターゲティングを目的とした他の取り組みには、ＡＭＬにおけるＣＤ３３を選択的にターゲティングするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の生成が含まれている。Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．（２０１５）２：６５。しかし、データは限られており、このアプローチが患者の処置においてどの程度有効であり得るか（ターゲティングされる細胞のすべてが除去されるかどうか）は不確かである。更に、骨髄系列細胞は生命に不可欠であるため、対象の骨髄系列細胞を枯渇させると、患者の生存に有害な影響が及ぶ可能性がある。本開示は、少なくとも部分的に、ＡＭＬ処置に関連するそのような問題を解決することを目的とする。

【0308】

代替的に、またはさらに、本書に記述される方法は、肺癌、耳鼻咽頭癌、結腸癌、黒色腫、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、上皮内腫瘍、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、線維腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口、及び咽頭）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、腎癌、呼吸器系癌、肉腫、皮膚癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、泌尿器系癌、ならびに他の癌腫及び肉腫を含むがこれらに限定されない非造血性癌を処置するために使用され得る。

【0309】

癌腫は、上皮起源のがんである。本開示の方法による処置が意図される癌腫は、腺房癌、腺房癌腫、濾胞状腺癌（腺様嚢胞癌、腺筋上皮腫、篩状癌腫、及び円柱腫とも呼ばれる）、腺腫性癌腫、腺癌、副腎皮質の癌腫、肺胞癌、肺胞細胞癌（細気管支癌、肺胞細胞腫瘍及び肺腺腫症とも呼ばれる）、基底細胞癌、基底細胞癌腫（バサローマまたはバシローマ、及び毛母癌とも呼ばれる）、類基底癌、基底扁平細胞癌、乳癌、気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支癌、脳様癌、胆管細胞癌（胆管腫及び肝内胆管癌とも呼ばれる）、絨毛膜癌、膠様癌（ｃｏｌｌｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、面皰癌、子宮体部癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌腫、円柱状癌腫、円柱細胞癌、管癌、硬性癌腫、胚性癌腫、脳様癌腫、上眼球癌、類表皮癌、上皮性腺様癌、潰瘍癌、線維癌、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌、巨大細胞、腺性癌腫、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血様癌、肝細胞癌（肝細胞腫、悪性肝細胞腫、及び肝臓癌腫とも呼ばれる）、Ｈｕｉｒｔｈｌｅ細胞癌、硝子質癌、副腎様癌、乳児胚性癌、上皮内癌、表皮内癌、上皮内癌腫、Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ癌腫、Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ細胞癌、レンズ状癌、レンズ状癌腫、脂肪腫性癌腫、リンパ上皮癌、乳腺癌、髄様癌腫、髄様癌、黒色癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｌａｎｏｄｅｓ）、黒色癌（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性癌腫、粘液分泌癌、粘液細胞癌、粘膜類表皮癌、粘液癌、粘膜癌、粘液腫様癌、鼻咽腔癌、黒色癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｎｉｇｒｕｍ）、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、卵巣癌、乳頭癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、前立腺癌、腎臓の腎細胞癌（腎臓腺癌及び副腎様癌（ｈｙｐｅｍｅｐｈｏｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）とも呼ばれる）、補充細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー（ｓｃｈｅｉｎｄｅｒｉａｎ）癌、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ状癌、楕円状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平細胞癌、紐様癌（ｓｔｒｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血管拡張性癌腫、毛細血管拡張性癌腫、移行細胞癌、結節癌、結節性癌、疣状癌、絨毛癌腫を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、本開示の方法は、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、または腎臓癌を有する対象を処置するために使用される。

【0310】

肉腫は、骨及び軟部組織に生じる間葉新生物である。様々な種類の肉腫が認識されており、これらは、脂肪肉腫（粘液性脂肪肉腫及び多形性脂肪肉腫を含む）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性神経鞘腫、神経線維肉腫、または神経原性肉腫とも呼ばれる）、ユーイング腫瘍（ユーイング骨肉腫、骨外性（すなわち、非骨）ユーイング肉腫、及び原始神経外胚葉性腫瘍［ＰＮＥＴ］を含む）、滑膜肉腫、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａｓ）、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａｓ）、リンパ管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、線維肉腫、類腱腫（侵襲性線維腫症とも呼ばれる）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、血管外皮腫、悪性間葉腫、胞状軟部肉腫、類上皮肉腫、明細胞肉腫、結合組織形成性小細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（ＧＩ間質肉腫としても知られている）、骨肉腫（骨原性肉腫としても知られている）－骨格性及び骨外性、ならびに軟骨肉腫を含む。

【0311】

いくつかの実施形態では、処置されるがんは、難治性がんであり得る。「難治性がん」は、本書で使用される場合、処方される標準治療に抵抗性のあるがんである。これらのがんは、最初は処置に応答するように見える（その後再発する）場合もあれば、処置に対して完全に不応性である場合もある。通常の標準治療は、がんの種類及び対象における進行度に応じて異なる。これは化学療法、もしくは手術、もしくは放射線、またはそれらの組み合わせでもよい。当業者は、そのような標準治療を認識している。したがって、本開示による難治性がんの処置を受ける対象は、そのがんのために別の処置に既に曝露されている可能性がある。代替的に、がんが難治性である可能性が高い場合（例えば、がん細胞または対象の記録の分析を所与として）、対象は別の処置に既に曝露されていない可能性がある。難治性がんの例は、白血病、黒色腫、腎細胞癌、結腸癌、肝臓（肝）癌、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、及び肺癌を含むが、これらに限定されない。

【0312】

本書に記述されるキメラ受容体を発現する免疫細胞のいずれも、薬学的に許容できる担体または賦形剤において、医薬組成物として投与することができる。

【0313】

「薬学的に許容できる」という語句は、本開示の組成物及び／または細胞との関連で使用される場合、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与した際に生理学的に忍容可能であり、通常は有害反応をもたらさない、そのような組成物の分子実体及び他の成分を指す。好ましくは、本書で使用される場合、「薬学的に許容できる」という用語は、哺乳動物における、より特定するとヒトにおける使用に関して、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。「許容できる」とは、担体が組成物の活性成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、または治療用抗体）と適合し、組成物（複数可）が投与される対象に悪影響を及ぼさないことを意味する。本件の方法で使用される医薬組成物及び／または細胞のいずれも、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤を含むことができる。

【0314】

バッファーを含む薬学的に許容できる担体は、当技術分野でよく知られており、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物；金属錯体；及び／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照のこと。

【0315】

治療用途のためのキット
本開示の範囲内には、系列特異的細胞表面抗原をターゲティングする薬剤を細胞表面系列特異的抗原（複数可）が欠損している造血細胞集団と組み合わせて使用するためのキットも含まれる。そのようなキットは、系列特異的細胞表面抗原（複数可）と結合する抗原結合性フラグメントを含む任意の薬剤（複数可）（例えば、本書に記述されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）及び薬学的に許容できる担体を含む第１の医薬組成物と、１つまたは複数の細胞表面系列特異的抗原（複数可）が欠損している造血細胞（例えば、造血幹細胞）の集団及び薬学的に許容できる担体を含む第２の医薬組成物とを含む、１つまたは複数の容器を含み得る。

【0316】

いくつかの実施形態では、本書に記述されるキットは、配列番号１～３の配列を有するｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本書に記述されるキットは、配列番号４、及び４６～４７の配列を有するｇＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、キットは、配列番号１～４及び４６～４７のいずれかの配列を有するｇＲＮＡをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ（塩基エディター）に融合したＤＮＡ修飾酵素すなわちＣａｓ９ニッカーゼに融合した、触媒的に損なわれたＣａｓタンパク質を含む、ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムの試薬をさらに含み得る。

【0317】

いくつかの実施形態では、キットは、本書に記述される方法のいずれかの使用説明書を含んでもよい。含まれる説明書は、対象において意図される活性を達成するために第１及び第２の医薬組成物を対象に投与することに関する説明を含み得る。キットは、対象が処置を必要としているかどうかの識別に基づいて処置に好適な対象を選択することに関する説明をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、説明書は、処置を必要とする対象に第１及び第２の医薬組成物を投与することに関する説明を含む。

【0318】

本書に記述される細胞表面系列特異的抗原をターゲティングする薬剤ならびに第１及び第２の医薬組成物の使用に関する説明書は、概して、意図される処置のための投与量、投薬スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）またはサブユニット用量であり得る。本開示のキットにおいて供給される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書に記載された説明書である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が、対象の疾患または障害を処置するため、その発症を遅延させるため、及び／またはそれを緩和するために使用されることを示す。

【0319】

本書において提供されるキットは、好適なパッケージングに入っている。好適なパッケージングは、バイアル、ボトル、瓶、可撓性パッケージングなどを含むが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与デバイス、または注入デバイスのような特定のデバイスと組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静注液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであり得る）。容器が滅菌アクセスポートを有していてもよい。医薬組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本書に記述されるキメラ受容体バリアントである。

【0320】

キットは、場合により、バッファー及び解説情報などの更なる構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器に付けられたまたは関連付けられたラベルまたは添付文書（複数可）とを含む。ある実施形態では、本開示は、上述のキットの内容物を含む製品を提供する。

【0321】

一般的技法
本開示の実施には、別段の記載がない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技法が用いられ、これらは当業者の技能の範囲内にある。そのような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献で十分に説明されている。

【0322】

当業者であれば、さらなる詳述がなくとも、上記説明に基づいて本開示を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示と解釈されるべきであり、決して本開示の残部を限定するものと解釈されてはならない。本書で引用されるすべての刊行物は、本書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。

【実施例】

【0323】

実施例１：塩基エディターによるＨＳＣ／ＨＳＰＣの効率的な編集
材料及び方法
１％のペニシリンストレプトマイシン、ならびに次のヒトサイトカイン、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３Ｌ及びＵＭ１７１ ０．３５ｎＭ（Ｘｃｅｓｓｂｉｏ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋幹細胞を維持した。ヒトサイトカインはすべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。

【0324】

ＡＢＥタンパク質及びｓｇＲＮＡをＰ３バッファー（Ｌｏｎｚａ、Ａｍａｘａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ）中で混合し、１０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｐ３バッファーに再懸濁し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体と混合し、次に４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒで電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を分析または注射するまで３７℃で培養した。

【0325】

ＡＢＥ８ｅタンパク質によるＨＳＣ／ＨＳＰＣの編集
Ｌｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクター及びプログラムＤＺ１００を使用し、１００万個のＨＳＣ／ＨＳＰＣに１１ｕｇｒのＡＢＥ８ｅタンパク質＋１．５ｕｇｒのｓｇＲＮＡ（化学修飾したもの（配列番号３））をヌクレオフェクトした。

【0326】

ＢＥ４ｍａｘタンパク質によるＨＳＣ／ＨＳＰＣの編集
Ｌｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクター及びプログラムＤＺ１００を使用し、５０００００個のＨＳＣ／ＨＳＰＣに８ｕｇｒのＢＥ４ｍａｘタンパク質＋１．５ｕｇｒのｓｇＲＮＡ（化学修飾したもの（配列番号１または２））をヌクレオフェクトした。

【0327】

電気穿孔後、細胞を分析するまで３７℃で培養した。

【0328】

編集結果及びオフターゲット評価：
ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２によるＨＴＳ分析
プロトスペーサーｓｇＲＮＡ ２０８またはｓｇＲＮＡ ＳＡの周囲の３５０ｂｐ領域を囲むプライマーを設計した。各プライマーには、適切なＩＬＬＵＭＩＮＡアダプターを付加した。次に、生成されたＰＣＲ産物を、ＩＬＬＵＭＩＮＡフォワード及びリバースインデックスプライマーを使用して再増幅し、２５０～３００ｂｐのシングルエンドＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを生成した。次に、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２を使用して、各リードを参照アンプリコンとアラインし、プロトスペーサーを囲むウィンドウ内でその参照に対するインデルまたは塩基変化を識別した。これらはソフトウェアによって定量化される。Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１９）３７：２２４－２６、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０２１）１６（２）：１０８９－１１２８を参照のこと。

【0329】

ＰＣＲ
ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ ＥｃｏＤｒｙ ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を使用し、細胞由来の１００ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。ＣＤ３３^Δ２に特異的なプライマー（エキソンジャンクション１－３にまたがる）、ＣＤ３３^ＦＬに特異的なプライマー（エキソンジャンクション２－３またはエキソン２にまたがる）、またはすべてのアイソフォームに共通のプライマー（エキソン１、５、及び７内）を使用して、３０サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、サンガーシーケンシングによって分析した。

【0330】

フローサイトメトリー
エキソン２内に位置するエピトープを認識する抗ＣＤ３３抗体クローンＭ５３及びＰ６７．６を使用した電気穿孔の７日後にヒトＣＤ３４^＋幹細胞を分析した。

【0331】

統計
統計はすべてＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．１．１を使用して行った。連続変数については、対応のない両側ｔ検定を行った。平均の差はｐ値が＜０．０５の場合に有意とみなし、さもなければ有意ではない（ｎｓ；ｐ＞０．０５）とした。

【0332】

結果
ＢＥまたはＡＢＥ塩基エディターを使用してエキソン２スキッピングを誘導するように３つのｓｇＲＮＡを設計した（図４）。ＣＤ３３ ｍＲＮＡ完全長（ＣＤ３３^ＦＬ）は７つのエキソンを含み、エキソン２はＩｇ様Ｖ型ドメインをコードする。ＣＤ３３^Δ２は、ＣをＴに変化させて改変されたエキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）部位をもたらす一般的な多型（ｒｓ１２４５９４１９、Ａ１４ＶＳＮＰ））のためにエキソン２を欠いている。

【0333】

ｍＲＮＡ及びリボ核タンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達系を試験して、初代細胞における効率を調べた。ＣＤ３４細胞に、これらのｇＲＮＡの各々と、塩基エディター（ＢＥ）またはアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）タンパク質とを電気穿孔した。具体的には、ＣＤ３４細胞に、ＡＢＥ８ｅ及び配列番号３を有するｓｇＲＮＡ、またはＢＥ４ｍａｘ及び配列番号１を有するｓｇＲＮＡ、もしくはＢＥ４ｍａｘ及び配列番号２を有するｓｇＲＮＡ（表４）を電気穿孔した。

【0334】

サンガーシーケンシングにより示されるように、ＢＥ及びＡＢＥは、ターゲットのヌクレオチドにＣ＞ＴまたはＡ＞Ｇのいずれかの変換を導入した（図５Ａ）。

【0335】

また、ＰＣＲ及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用して、編集済細胞を分析した。これらの結果は、ターゲットの塩基各々が意図される変異を獲得したことを示した。配列番号３及びＡＢＥ８ｅで編集された細胞は、４％の野生型リードしか示さなかった。配列番号１または２及びＢＥ４ｍａｘで編集された細胞は、約９～１２％の野生型リードを示した（図５Ｂ）。ＣＤ３３のエキソン２内に位置するエピトープを認識する２つの抗体を用いた編集済細胞のフローサイトメトリー分析により、編集済細胞にＣＤ３３エキソン２が存在しないことが確認された（図５Ｃ）。

【0336】

ｃＤＮＡと、ＣＤ３３^Δ２に特異的なプライマー（エキソンジャンクション１－３にまたがる）、ＣＤ３３ＦＬに特異的なプライマー（エキソンジャンクション２－３またはエキソン２にまたがる）、またはすべてのアイソフォームに共通のプライマー（エキソン３内、エキソンジャンクション３－５または４－５にまたがる）を用いるＰＣＲとを使用し、編集済細胞を編集結果についてさらに分析した。結果は、ＥＳＥまたはＳＡの編集が他のエキソンに影響を与えることなくエキソン２スキッピングを誘導したことを示した（図５Ｄ）。

【0337】

実施例２：ＣＤ３３^Δ２細胞はＩｎ Ｖｉｔｒｏで正常な貪食能力を示し、ＧＯに対する抵抗性をもつ
実施例１に記述したＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞をさらに分析した。

【0338】

貪食
ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＣＤ３４^＋ＣＤ３３^ＷＴ及びＣＤ３３^Δ２単球がｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ ｃｏｌｉ生体粒子を貪食する能力を試験した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＷＴまたはＣＤ３３^Δ２の単球は、Ｅ．Ｃｏｌｉ生体粒子の内部移行によって測定した場合に同等の貪食能力を示す。図６Ａを参照のこと。

【0339】

ＧＯ細胞傷害性
更に、ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＯ細胞傷害性に抵抗した。細胞をＧＯと共に４８時間インキュベートし、Ｓｙｔｏｘ Ｂｌｕｅまたは７ＡＡＤを生死判別色素として使用したＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２は、ＧＯ細胞傷害性に対し、ホモ接合性ｒｓ１２４５９４１９（ＴＴ）Ａ１４Ｖ ＳＮＰを有するドナーと比べて同じ抵抗性を示す（図６Ｂ）。

【0340】

実施例３：ＣＤ３４＋ＣＤ３３Δ２はＩｎ Ｖｉｖｏで長期の多系列生着が可能であり、ＣＤ３３標的免疫療法（ＧＯ）に対する抵抗性をもつ
材料及び方法
Ｉｎ ｖｉｖｏ実験
本件のアプローチは、ＣＤ３３抗原のＣＡＲ－Ｔによるターゲティング及びＡＤＣ送達（ＧＯ）のためのプラットフォームとしてＣＤ３３遺伝子編集済幹細胞（ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２）を移植することを含み得るため、生着し骨髄造血及びリンパ球新生に寄与するＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞の能力を試験することが重要である。

【0341】

ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスまたはＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ} Ｔｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３，ＣＳＦ２，ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ（ＮＳＧ－ＳＧＭ３）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）を致死量以下（１００ｃＧｙ）の全身照射（ＴＢＩ）で前処置した。致死量以下の照射を受けたマウスに、ＣＤ３４＋ＷＴまたはＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２のＨＳＰＣ（実施例１に記述したようにＡＢＥ８ｅ及び配列番号３を使用して編集された細胞）を尾静脈注射によって注射した。

【0342】

造血系の経時的な生着及びリポピュレーション（図７Ａ）を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）による次の抗体；Ｔｅｒ１１９－ＰｅＣｙ５、Ｌｙ５－ＢＶ７１１、Ｈ２ｋｄ－ＢＶ７１１、ｈＣＤ４５－ＢＶ５１０、ｈＣＤ３－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ｈＣＤ１２３－ＢＶ６０５、ｈＣＤ３３－ＡＰＣ、ｈＣＤ１４－ＡＰＣ／Ｃｙ７、ｈＣＤ１０－ＢＵＶ３９５、ｈＣＤ１９－ＢＶ６５０、ＣＤ３４－ＢＶ４２１、ＣＤ９０－ＰｅＣｙ７、ｈＣＤ３８－ＢＵＶ６６１、及びｈＣＤ４５ＲＡ－ＢＵＶ７３７を使用した末梢血（ＰＢ）、脾臓、及び全骨髄（ＢＭ）の分析によって評価した。ヨウ化プロピジウムを使用して死細胞を排除した。注射したＣＤ３４^＋ヒト由来細胞をＴｅｒ１１９－、Ｌｙ５－／Ｈ２ｋｄ－ヒトＣＤ４５＋でゲーティングした。

【0343】

ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞がｉｎ ｖｉｖｏでＧＯ抵抗性をもつことを示すために、移植１２週間後のマウスのＰＢをＣＤ３３^＋ＣＤ１４^＋細胞またはＣＤ３３^Δ２ＣＤ１４^＋細胞の存在について分析した。次にマウスに２．５ｕｇｒのＧＯを注射し、処置の１週間後に採血して袋詰めし、ヒト化マウスのＰＢ及び骨髄中の骨髄性細胞の存在を評価した。ＧＯ処置前、ＣＤ３４^＋ＷＴ移植マウスまたはＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２移植マウスは、ＰＢ中のＣＤ１４^＋細胞の頻度が同じであることを示していた（図７Ｄ、上のＦＡＣＳプロット）。ＧＯ注射の１週間後、ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞を生着させたマウスのＰＢ及びＢＭ中ではＣＤ３３^－ＣＤ１４^＋細胞が検出されたが、ＣＤ３４＋ＷＴ生着マウスのＰＢ及びＢＭ中ではＣＤ３３^＋細胞及びＣＤ１４^＋細胞が根絶されていた。

【0344】

移植の１６週間後、ＣＤ３３遺伝子座をマウスの骨髄由来のゲノムＤＮＡから増幅させた。アンプリコンをＨＴＳによってシーケンシングし、Ａ７位におけるＡからＧへの編集を定量化した。

【0345】

実験はすべて、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコールのもとで行った。

【0346】

結果
移植１６週間後の骨髄及び脾臓の両方で、ヒトＣＤ４５＋細胞、ならびに、ヒトＣＤ４５内の骨髄系前駆細胞（ＣＤ１２３）及びリンパ系前駆細胞（ＣＤ１０）、ならびに成熟した骨髄系細胞（ＣＤ１４）及びリンパ系細胞（ＣＤ１９）、及びＴ細胞（ＣＤ３）の存在が明らかになった（図７Ｂ）。すべての細胞がＣＤ３３陰性のままであった（図７Ａ）。

【0347】

ＧＯ処置後ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞を生着させたマウスの末梢血及び骨髄においてＣＤ３３－ＣＤ１４＋が検出され、一方でＣＤ３３＋細胞は検出できず、ＣＤ１４^＋ＣＤ３４^＋ＷＴ生着マウスの根絶に至っている。したがって、ＣＤ３３^ＷＴ細胞はＧＯへの感受性を保っているが、ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞は非感受性であった。図７Ｂ及び７Ｃ。

【0348】

生着したＷＴ（未編集）細胞または編集済細胞中のターゲット部位（Ａ７）におけるオンターゲット編集を、移植１６週間後の骨髄サンプルから分析した。移植の１６週間後、ＣＤ３３遺伝子座をマウスの骨髄由来のゲノムＤＮＡから増幅させた。図７Ｄ。

【0349】

実施例４：オフターゲット評価
材料及び方法
ＣＩＲＣＬＥｓｅｑ
オフターゲット部位の塩基編集を識別するために、ＱＩＡｇｅｎ Ｇｅｎｔｒａ ＰｕｒｅＧｅｎｅキット（カタログ番号１５８４４５）を使用して、匿名化されたヒトドナー由来のＣＤ３４＋濃縮細胞集団からゲノムＤＮＡを抽出した。ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑを既報（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１７）１４：６０７－１４）のように行った。簡潔に述べると、精製されたゲノムＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓ Ｓ２器具で平均３００ｂｐの長さに切断した。ＫＡＰＡ ＨＴＰ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＰＣＲ Ｆｒｅｅ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、フラグメント化されたＤＮＡを末端修復し、Ａテールを付加し、ウラシル含有ステムループアダプターにライゲートした。アダプターにライゲートしたＤＮＡをラムダエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）及びＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）で処理し、次にＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）で処理した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてＤＮＡの分子内環状化を行い、残留した線状ＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）によって分解した。２５０ｎｇのＰｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ処理環状化済みＤＮＡ、９０ｎＭのＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＮＥＢ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバッファー（ＮＥＢ）及び９０ｎＭの合成化学修飾ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を１００μｌの容量で用い、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断反応を行った。切断された産物にＡテールを付加し、ヘアピンアダプター（ＮＥＢ）をライゲートし、ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）で処理し、Ｋａｐａ ＨｉＦｉ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してバーコード化ユニバーサルプライマーＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）を用いたＰＣＲによって増幅させた。ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ器具において１５０ｂｐペアエンドリードでシーケンシングした。ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑデータ分析は、オープンソースのＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ分析ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｓａｉｌａｂＳＪ／ｃｉｒｃｌｅｓｅｑ）を使用し、デフォルトのパラメータを使用して行った。ヒトゲノムＧＲＣｈ３７をアラインメントのために使用した。

【0350】

オフターゲット編集を評価するために、ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑによって指定された上位１９のオフターゲット部位を、移植１６週間後の骨髄から生着したヒトＷＴ細胞（未編集細胞）または編集済細胞においてシーケンシングした。

【0351】

各オフターゲット部位について、ガイドＲＮＡ用のアラインされたオフターゲット結合部位と、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング用の付加されたアダプターとを含む、２５０～３００ｂｐの産物を生成するように、プライマーを設計した。二次ＰＣＲによって各サンプルにバーコードを付けた後、産物をプールし、３００サイクルｖ２ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑキットを使用してシーケンシングした。アンプリコンをＨＴＳによってシーケンシングし、Ａ７位におけるＡからＧへの編集を定量化した。

【0352】

得られたｆａｓｔｑファイル中の編集結果を分析するために、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２を使用して各リードを参照アンプリコンとアラインし、インデルまたは塩基変化を定量化した。

【0353】

実施例１に記述したようにＡＢＥ８ｅ及び配列番号３を使用して編集されたＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞をさらに分析した。

【0354】

結果
ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑを使用し、上位１９のオフターゲット遺伝子座を識別した。図８Ａ。

【0355】

上述のように、シーケンシングを行って、生着したヒトＷＴ（未編集）細胞または編集済細胞において識別された上位１９のオフターゲット遺伝子座におけるＡ７ターゲットヌクレオチドを編集するＡ７位におけるＡからＧへの編集を評価した。図８Ｂに示すように、ターゲットのほとんどについて、Ａ７編集はＷＴ細胞及び編集済細胞において同様であった。

【0356】

図８Ｃに示すように、ターゲットのインデルのパーセントも、ＷＴ細胞及び編集済細胞の両方で同様であった。

【0357】

実施例５：多重塩基編集
２つのｓｇＲＮＡを設計した。１つは、ＡＢＥエディターを使用してＣＤ３３におけるエキソンスキッピングを誘導するもの（配列番号３）である。２つ目は、ＡＢＥエディターを使用してＥＭＲ２におけるエキソン１３のスキッピングを誘導するもの（配列番号４）であった。図４Ａ及び９Ａ。

【0358】

５ｕｇｒのＡＢ８ｅ＋１．５ｕｇｒのｓｇＲＮＡ（化学修飾したもの）を使用し、２つのＲＮＰ（ターゲット遺伝子毎に１つ）を別々に調製した。インキュベーション後、ＲＮＰを５００，０００個のＨＳＣ／ＨＳＰＣと混合し、Ｌｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクター及びプログラムＤＺ１００を使用してヌクレオフェクトした。

【0359】

編集済細胞をヌクレオチド変換の導入について分析した。サンガーシーケンシングによって示されるように、ＡＢＥ塩基エディターは両方の遺伝子座にＡ＞Ｇ変換を導入し、それによってＣＤ３３遺伝子座のＳＡ及びＥＭＲ２遺伝子座のＳＤを編集した（図９Ｂ）。編集済細胞のフローサイトメトリー分析により、編集済細胞ではＣＤ３３及びＥＭＲ２抗体の結合が編集により抑止されることが確認された（図９Ｃ）。

【0360】

実施例６：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における細胞表面系列特異的ＣＤ３３のターゲティング
本実施例は、ＡＭＬにおけるＣＤ３３抗原のターゲティングを包含する。この実施例の特定のステップを表５に概説する。

【表5】

【0361】

Ｉ． ＣＤ３３標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法
Ａ． 抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物の生成
本書に記述されるＣＤ３３をターゲティングするキメラ抗原受容体は、５’から３’の順に次の構成要素からなり得る：ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎレンチウイルス骨格（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１８１２１／）、ペプチドシグナル、ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８の細胞内ドメイン、及びＴＣＲ－ζ分子のシグナル伝達ドメイン。

【0362】

最初に、ペプチドシグナル、抗ＣＤ３３軽鎖（配列番号８）、可動性リンカー、及び抗ＣＤ３３重鎖（配列番号６）を、最適なＫｏｚａｋ配列と共にｐＨＩＶ－ＺｓｇｒｅｅｎのＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。

【0363】

軽鎖－リンカー－重鎖－ヒンジ－ＣＤ２８／ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζの基本構造を有するＣＤ３３と結合する例示的なキメラ受容体の核酸配列を以下に提示する。

【0364】

パート１：軽鎖－リンカー－重鎖（配列番号３３）：Ｋｏｚａｋ開始部位は太字で示されている。ペプチドシグナルＬ１はイタリック体で示されている。抗ＣＤ３３軽鎖及び重鎖は太字のイタリック体で示され、リンカーで区切られている。

【化3】

【0365】

パート２：ヒンジ－ＣＤ２８／ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ ＮｏｔＩ制限酵素認識部位は大文字で示されている。翻訳停止部位は太字で示されている。ＢａｍＨＩ制限切断部位は下線で示されている。

【0366】

ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号３４）

【化4】

【0367】

ＩＣＯＳ共刺激ドメイン（配列番号３５）

【化5】

【0368】

融合（ハイブリッド）ＣＤ２８及びＩＣＯＳ共刺激ドメイン（配列番号３６）

【化6】

【0369】

次のステップでは、ヒンジ領域、ＣＤ２８ドメイン（配列番号１５）、及びＴＣＲ－ζの細胞質成分を、ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ（ペプチドシグナル及びＣＤ３３ ｓｃＦｖを既に含んでいる）のＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローニングする。代替的に、ＣＤ２８ドメインをＩＣＯＳドメイン（配列番号１６）で置換してもよい。

【0370】

ＣＤ２８及びＩＣＯＳドメインに加えて、ＣＤ２８及びＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達ドメインのフラグメントを含む融合ドメインを工学操作し（配列番号１７）、更なるキメラ受容体を生成するために使用する。そのような構成では、キメラ受容体は、抗原結合性フラグメント、抗ＣＤ３３軽鎖可変領域、リンカー、抗ＣＤ３３重鎖可変領域、ＣＤ２８／ＩＣＯＳハイブリッド領域（ＣＤ２８のＴＭ領域を含む）、及びＴＣＲ－ζ分子のシグナル伝達ドメインを含む。

【0371】

キメラ受容体を生成するために使用され得る構成要素のアミノ酸配列の例は、本書で提示されており、例えば、ＣＤ２８ドメイン（配列番号１０）、ＩＣＯＳドメイン（配列番号１１）、ＣＤ２８／ＩＣＯＳハイブリッドドメイン（配列番号１３）、及びＴＣＲ－ζは、本書で提示されている。代替的にキメラ受容体を生成してもよい（セクションＢ）。

【0372】

Ｂ． 抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物の生成のための代替的方法
例示的なキメラ受容体の概略図を、図１０、パネルＡ～Ｄに提示する。キメラ受容体は、細胞外ＣＤ８ヒンジ領域、膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ ζシグナル伝達鎖に連結した、ＣＤ３３抗原を認識する細胞外ヒト化ｓｃＦｖを使用して生成される（図１０、パネルＢ）。抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするＤＮＡは、ヒト化ｓｃＦｖを使用することによって生成される（Ｅｓｓａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．（２０１３）２７３（２）：１６６）。代替手段には、ＣＤ２８の代わりにＯＸ－１もしくは４１－ＢＢを含むＣＡＲ Ｔ細胞、またはＣＤ２８／ＯＸ１もしくはＣＤ２８／４－１－Ｂ－Ｂハイブリッドが含まれる（図１０、パネルＣ及びＤ）。

【0373】

抗ＣＤ３３ ｓｃＦＶ配列を生成するために、上述の抗ＣＤ３３抗体の可変領域の重鎖及び軽鎖（配列番号６及び８）のコード領域を特異的プライマーで増幅させ、細胞内発現のためにｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎベクターにクローニングする。ターゲット抗原に対するｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）の結合強度を評価するために、ｓｃＦｖをＨｅｋ２９３Ｔ細胞内で発現させる。この目的のために、ベクター（コード領域を含むｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ）をＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ細菌に形質転換し、プラスミドを調製する。得られたｓｃＦｖ抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクションによりＨｅｋ２９３Ｔ細胞に導入する。トランスフェクトされた細胞を５日間培養した後、上清を除去し、抗体を精製する。

【0374】

得られた抗体は、当技術分野で知られているプロトコールによるフレームワーク置換を使用してヒト化することができる。例えば、ＢｉｏＡｔｌａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）により提供されているこのようなプロトコールの１つを参照されたい。このプロトコールでは、テンプレート抗体に由来する合成ＣＤＲコーディングフラグメントライブラリを、機能的に発現された抗体由来の生殖系列配列に限定されたヒトフレームワークプールからのヒトフレームワーク領域コーディングフラグメントにライゲートする（ｂｉｏａｔｌａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｅｘｐｒｅｓｓ－ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ／）。

【0375】

抗原結合親和性を改善するために親和性成熟を行ってもよい。これは、ファージディスプレイ（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（１９９６），２６３：５５１）などの当技術分野で知られている一般的技法を使用して達成することができる。バリアントは、例えばＢｉａｃｏｒｅ分析を使用して、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングすることができる。修飾に適した候補となる超可変領域残基を識別するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を識別することができる。更に、報告されているコンビナトリアルライブラリを、抗体の親和性を改善するために使用することもできる（Ｒａｊｐａｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００５）１０２（２４）：８４６６）。代替的に、ＢｉｏＡｔｌａは抗体の高速かつ効率的な親和性成熟のためのプラットフォームを開発しており、これを抗体最適化の目的で利用してもよい（ｂｉｏａｔｌａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ／）。

【0376】

Ｃ． ＣＡＲ構築物のアセンブリ
次に、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを、細胞外ＣＤ８ヒンジ領域、膜貫通ドメイン及び細胞質ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ ζシグナル伝達鎖に連結する。簡潔に述べると、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ配列に特異的なプライマーを使用して、上述のようにｓｃＦｖを増幅させる。完全なヒトＣＤ８コード配列を搭載したプラスミド（ｐＵＮ１－ＣＤ８）（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｕｎｏ－ｃｄ８ａ）を使用して、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン（アミノ酸１３５～２０５）を増幅させる。完全なヒトＣＤ３ζコード配列を搭載したＩｎｖｉｖｏｇｅｎプラスミドｐＯＲＦ９－ｈＣＤ２４７ａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ＰＤＦ／ｐＯＲＦ９－ｈＣＤ２４７ａ＿１０Ｅ２６ｖ０６．ｐｄｆ）から、ＣＤ３ ζフラグメントを増幅させる。最後に、ＣＤ２８（アミノ酸１５３～２２０、ＣＤ２８のＴＭ及びシグナル伝達ドメインに対応する）を、Ｔｒｉｚｏｌ法により活性化Ｔ細胞から収集されたＲＮＡを使用して生成されたｃＤＮＡから増幅させる。スプライスオーバーラップ伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲを使用して、抗ＣＤ３３－ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ヒンジ＋ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含むフラグメントをアセンブルする。得られたＰＣＲフラグメントをｐＥＬＰＳレンチウイルスベクターにクローニングする。ｐＥＬＰＳは、ＣＭＶプロモーターがＥＦ－１αプロモーターに置き換えられ、ＨＩＶのセントラルポリプリントラクトがプロモーターの５’に挿入された、第３世代レンチウイルスベクターｐＲＲＬ－ＳＩＮ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥの誘導体である（Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００９）（８）：１４５３、Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２０１１）（８）：７２５）。すべての構築物をシーケンシングによって検証する。

【0377】

代替的に、ＣＤ２８ドメインの代わりにＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４１ＢＢ、またはＯＸ－４０シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを生成し、Ｔ細胞に導入し、ＣＤ３３陽性細胞を根絶させる能力について試験する（図１０、パネルＣ）。「第３世代」キメラ受容体の生成も企図され（図１０、パネルＤ）、これは、効力をさらに増強するためにＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０などの複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせるものである（Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１３）４：３８８）。

【0378】

Ｄ． 抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞の調製
初代ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を免疫磁気分離法（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって患者の末梢血から単離する。既報（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９（１２）：５９２１）のように、完全培地（１０％の熱失活ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン硫酸塩、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補ったＲＰＭＩ １６４０）でＴ細胞を培養し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ ｍＡｂで被覆されたビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激する。

【0379】

ターゲット細胞に形質導入することができ、抗ＣＤ３３キメラ受容体を含むウイルスベクターを生成するために、パッケージング細胞株を使用する。レンチウイルス粒子を生成するために、本実施例のセクション（１）で生成されたＣＡＲを、不死化正常胎児腎２９３Ｔパッケージング細胞にトランスフェクトする。１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む高グルコースＤＭＥＭで細胞を培養する。トランスフェクションの４８～７２時間後に上清を収集し、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中で組換えレンチウイルスを濃縮する。次に、初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞をポリブレンの存在下で約５～１０の感染多重度（ＭＯＩ）において形質導入する。ヒト組換えＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を隔日添加する（５０ＩＵ／ｍＬ）。Ｔ細胞を刺激後約１４日間培養する。ヒト初代Ｔ細胞の形質導入効率をＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の発現によって評価する。

【0380】

Ｅ． 患者へのＣＡＲ Ｔ細胞の注入
抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞を患者に静脈内（ｉ．ｖ．）注入する前に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、濃縮する。閉鎖式無菌システムを提供するＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ ＣｅｌｌＳａｖｅｒ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）などのセルプロセッサを、配合前の洗浄及び濃縮ステップに使用する。抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する最終的なＴ細胞を、ヒト血清アルブミンを補った滅菌生理食塩水１００ｍｌに配合する。最後に、患者に１～１０×１０^７個のＴ細胞／ｋｇを１～３日間にわたって注入する（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２０１４）３７１（１６）：１５０７）。注入される抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現するＴ細胞の数は、がん患者の状態、患者の年齢、以前の処置などといった多数の因子に依存する。

【0381】

さらに、本書では、ＡＭＬ患者においてＣＤ３３をターゲティングするキメラ受容体に加えてＥＭＲ２をターゲティングするキメラ受容体を発現する免疫細胞も企図される。これは、１）抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する免疫細胞と、抗ＥＭＲ２キメラ受容体を発現する免疫細胞とを別々に生成し、両種類の免疫細胞を別々に患者に注入すること、または２）ＣＤ３３及びＥＭＲ２の両方をターゲティングする免疫細胞を同時に生成すること（Ｋａｋａｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（２０１４）２：１５１）という、２つの異なるアプローチによって達成することができる。

【0382】

ＩＩ． ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞を使用した自己由来造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）
患者からの幹細胞の単離、前処置レジメン、及び患者への幹細胞の注入に関するプロトコールは、患者の年齢、状態、処置歴、及び処置が実施される施設に応じて大きく異なることが理解される。よって、以下に記述するプロトコールは単なる例であり、当業者による定型的な最適化の対象である。

【0383】

Ａ． 抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入後の末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）の動員を使用した造血幹細胞の単離
ＡＭＬ患者を１日当たり１０ｍｇ／ｋｇの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）のｉ．ｖ．投与によって刺激する。免疫磁気ビーズ及び免疫磁気濃縮デバイスを使用して、ＣＤ３４^＋細胞の正の選択を行う。Ｆｅｎｗａｌｌ ＣＳ ３０００＋細胞分離機を使用すると、少なくとも２×１０^６個のＣＤ３４^＋細胞／ｋｇ体重が収集されると予想される（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００３）３２：８８９）。

【0384】

Ｂ． 患者の前処置レジメン
自己由来末梢血幹細胞移植（ＰＢＳＣＴ）の前処置レジメンは、エトポシド（ＶＰ－１６）＋シクロホスファミド（ＣＹ）＋全身照射（ＴＢＩ）を使用して行う。簡潔に述べると、このレジメンは、単回用量としての２６時間にわたる１．８ｇ／ｍ^２のエトポシド（ＶＰ－１６）のｉ．ｖ．持続注入（ｃ．ｉ．ｖ．）に続いて、１日当たり６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＹ）の２時間にわたるｉ．ｖ．投与を３日間行い、その後次の３日間にわたって１日当たり３００ｃＧｙの全身照射（ＴＢＩ）を行うことからなる。

【0385】

用量を計算するには、理想体重または実際の体重のいずれか少ない方を使用する。前述のように、がん患者の状態、患者の年齢、以前の処置、及び手技が実施される施設の種類などの因子のすべてが、正確な前処置レジメンを決定する際に考慮される。

【0386】

Ｃ． ＣＤ３３をターゲティングするＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムのプラスミド構築
アデノシン塩基エディター（例えば、ＡＢＥ８ｅ）に融合したＣａｓニッカーゼを含むレンチウイルスベクターを取得し、ＣＤ３３をターゲティングするｇＲＮＡ（例えば、配列番号３）をベクターにクローニングする。ＣＤ３３ ｇＲＮＡオリゴヌクレオチドをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から取得し、３７℃で３０分間ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してリン酸化し、９５℃まで５分間加熱して１．５℃／分で２５℃まで冷却することによってアニールする。Ｔ７リガーゼを使用してオリゴをアニールし、その後、アニールされたオリゴをゲル精製ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に２５℃で５分間ライゲートする。得られたプラスミドは次に、エンドトキシン不含ミディプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して増幅させることができる（Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１４）（８）：７８３）。

【0387】

代替的に、２ベクター系を使用してもよく（ｇＲＮＡ及びＣａｓが別々のベクターから発現される）、プロトコールは既報である（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１４）１５（５）：６４３）。ここで、Ｍａｎｄａｌらは、非ウイルスベクターから発現されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用してヒト造血幹細胞における遺伝子の効率的なアブレーションを達成した。

【0388】

また代替的には、タンパク質形態のアデノシン塩基エディター（例えば、ＡＢＥ８ｅ）に融合したＣａｓニッカーゼ及びｇＲＮＡが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達系を使用して細胞に送達される。

【0389】

ＣＤ３３枯渇造血幹細胞ＨＳＣを患者に注入することに加えて、あるプロトコールでは、実施例５の方法を使用してＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２ＥＭＲ^Δ１３枯渇ＨＳＣを注入した。

【0390】

Ｄ． ＣＤ３４^＋細胞ＨＳＣのトランスフェクションによるＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２またはＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２ＥＭＲ^Δ１３－細胞の生成
新たに単離された末梢血由来ＣＤ３４^＋細胞（ステップ４から）を、細胞培養グレードの幹細胞因子（ＳＣＦ）３００ｎｇ／ｍｌ、ＦＬＴ３－Ｌ ３００ｎｇ／ｍｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）１００ｎｇ／ｍｌ、及びＩＬ－３ ６０ｎｇ／ｍｌの存在下で無血清ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ培地に１×１０^６細胞／ｍｌで播種する。２４時間の前刺激の後、ＣＤ３４^＋ＨＳＣに、Ａｍａｘａ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（Ｕ－００８）（＃ＶＰＡ－１００３）を使用して（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１４）１５（５）：６４３）、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達系を使用して、Ｃａｓ９及びＣＤ３３ ｇＲＮＡを含むＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２をトランスフェクトする。トランスフェクションの２４～４８時間後、ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞またはＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２ＥＭＲ^Δ１３細胞を１．２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択する。ピューロマイシンによる選択の後、細胞をピューロマイシン不含培地中で数日間維持する。

【0391】

Ｅ． 患者へのＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞の再注入
ｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムがトランスフェクトされたＣＤ３４^＋細胞（ＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２細胞またはＣＤ３４^＋ＣＤ３３^Δ２ＥＭＲ^Δ１３細胞）を、Ｈｉｃｋｍａｎカテーテルにより、標準的な血液投与セットをフィルターなしで使用して直ちに再注入した（Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ Ａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ（２０１５）３１３（１５）：１５５０）。

【0392】

概して、上記に概説した処置プロトコールを受けた患者を、循環芽細胞の再出現及び血球減少についてモニタリングする。更に、特定の患者におけるＡＭＬの発症機序に応じて、情報価値のある分子マーカーもしくは細胞遺伝学的マーカーの再出現、または情報価値のあるフローサイトメトリーパターンについて試験することにより、処置の成功をモニタリングする。例えば、フィラデルフィア染色体陽性ＡＭＬにおけるＢＣＲ－ＡＢＬシグナルの再出現は、ＢＣＲ用（２２番染色体上）及びＡＢＬ用（９番染色体上）のプローブを用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して検出される。

【0393】

ＣＲＩＳＰＲベースの塩基エディターシステムを介したＣＤ３３欠失の成功を評価するために、末梢血ＣＤ３４^＋細胞を患者（移植後）から単離し、例えばフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、または免疫組織化学を使用して、ＣＤ３３発現について評価する。

【0394】

本書に記述されるように、本実施例に記述されるＨＳＣＴは、自己由来または同種異系のいずれでもよく、両方のアプローチが好適であり、本開示に記述される方法に組み込むことができる。

【0395】

ＩＩＩ． 任意選択のステップ：毒素に結合したＣＤ３３抗体による患者の継続処置
Ａ． ＣＤ３３免疫毒素ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）による患者の処置
２時間の静脈内注入としての９ｍｇ／ｍ^２の抗ＣＤ３３抗体ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）により、２週間の間をあけて２回、患者を処置する（Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（２００５）１０４（７）：１４４２－５２）。ＧＯは、細胞分裂阻害剤のカリケアマイシンとコンジュゲートされた、ＣＤ３３に対するヒト化モノクローナル抗体から成る（図１１）。

【0396】

代替的に、抗ＣＤ３３抗体を異なる毒素にコンジュゲートしてもよく、例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、またはリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）を生成することができる（Ｗａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１４）１２３（１６）：２４７０）。同様に、抗ＥＭＲ２抗体を毒素に結合させ、処置レジメンに含めてもよい。

【0397】

実施例７：抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現するＴ細胞及びＮＫ細胞株は、ＣＤ３３を発現するターゲット細胞の細胞死を誘導する
ＣＤ３３へのキメラ受容体の結合
ＣＤ３３と結合するキメラ受容体（例えば、ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、ＣＡＲＴ３）を、従来の組換えＤＮＡ技術を使用して生成し、ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に挿入した。キメラ受容体を含むベクターを使用してレンチウイルス粒子を生成し、これを使用して、異なる細胞型、例えばＴ細胞株（例えば、２９３ Ｔ細胞）及びＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ９２細胞）に形質導入した。キメラ受容体の発現をウェスタンブロッティング（図１２、パネルＡ）及びフローサイトメトリー（図１２、パネルＢ）によって検出した。

【0398】

キメラ受容体を発現する細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選択し、ＣＤ３３と結合する能力について評価した。簡潔に述べると、キメラ受容体を発現する２９３Ｔ細胞の溶解物を、ＣＤ３３またはＣＤ３３－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートとコインキュベートした。サンプルをタンパク質電気泳動に供し、ポンソータンパク質染色で染色したか（図１３、パネルＡ）、または膜に移して抗ＣＤ３ζ一次抗体でプローブした（図１３、パネルＢ）。両方の場合において、キメラ受容体と、そのターゲットであるＣＤ３３との間の結合。

【0399】

キメラ受容体を発現するＫ５６２細胞のＣＤ３３に対する結合についても、ＣＤ３３をプローブとして使用したフローサイトメトリーによって評価した（図１３、パネルＣ）。空のベクター対照を含む細胞と比較して、キメラ受容体（ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、またはＣＡＲＴ３）の発現について陽性の細胞の数及びＣＤ３３結合が増加し、キメラ受容体がＣＤ３３に結合することが示された。

【0400】

キメラ受容体を発現する細胞により誘導された細胞傷害性
キメラ受容体を発現するＮＫ－９２細胞を、細胞表面にＣＤ３３を提示するターゲット細胞の細胞傷害性を誘導する能力について機能的に特性評価した（例えば、Ｋ５６２は、ＣＤ３３＋のヒト慢性骨髄性白血病細胞株である）。細胞傷害性アッセイを行うために、エフェクター細胞（ＮＫ－９２細胞などの免疫細胞）に、キメラ受容体をコードするレンチウイルス粒子を感染させ、拡大培養した。感染の７日後、キメラ受容体を発現する細胞を、キメラ受容体コードベクターによってもコードされる蛍光マーカー（例えば、ＧＦＰ＋またはＲｅｄ＋）を選択することによるＦＡＣＳ分析によって選択した。選択されたキメラ受容体発現細胞を１週間拡大培養した。感染の１４日後、ターゲット細胞（ターゲット細胞表面系列特異的抗原ＣＤ３３を発現する細胞）をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色し、ターゲット細胞及びキメラ受容体発現細胞の両方をカウントすることを含む細胞傷害性アッセイを行った。異なる比率のターゲット細胞とキメラ受容体発現細胞とを丸底９６ウェルプレートで４．５時間コインキュベートし、その後、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を添加して生存不能細胞を染色した。フローサイトメトリーを行って、生存可能なターゲット細胞及び生存不能なターゲット細胞の集団を計数した。図１４、パネルＡ及びＢに示すように、キメラ受容体ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、またはＣＡＲＴ３を発現するＮＫ９２細胞は、評価した細胞比の各々で、ターゲットＫ５６２細胞のかなりの量の細胞死を誘導した。

【0401】

Ｋ５６２細胞の細胞死がＣＤ３３に対するキメラ受容体の特異的ターゲティングに依存したことを決定するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用し、ＣＤ３３が欠損するようにＫ５６２を遺伝子工学操作した。簡潔に述べると、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ＣＤ３３のＩｇＣドメインの一部をターゲティングするｇＲＮＡとを、Ｋ５６２細胞において発現させ、ＣＤ３３欠損Ｋ５６２細胞集団をもたらした。細胞を拡大培養し、キメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞とコインキュベートし、細胞傷害性アッセイを上述のように行った。図１５のパネルＡに示すように、プールされたＣＤ３３欠損Ｋ５６２細胞は、キメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞とコインキュベートした場合、細胞死のわずかな低減を示した。しかし、ＣＤ３３欠損Ｋ５６２細胞の単一クローンを単離し、拡大培養し、細胞傷害性アッセイを行うために使用した場合、細胞傷害性におけるより有意な低減が観察された（図１５、パネルＢ）。

【0402】

初代Ｔ細胞におけるキメラ受容体の発現
ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の正の選択によるＦＡＣＳによりドナーから取得されたＰＭＢＣから初代Ｔ細胞集団を単離し、高度に純粋な集団を得た（図１６、パネルＡ及びＢ）。初代Ｔ細胞（ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞）の各集団に、キメラ受容体（例えば、ＣＡＲＴ１及びＣＡＲＴ８）を含むレンチウイルスベクターを形質導入し、得られたキメラ受容体発現初代Ｔ細胞を使用して、上述のように細胞傷害性アッセイを行った。キメラ受容体を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞集団とＫ５６２（１０００個のターゲットＫ５６２細胞）とのコインキュベーションは、Ｋ５６２細胞の細胞傷害性をもたらさなかった（図１７、パネルＡ）。対照的に、キメラ受容体を発現するＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のいずれかと、１０００個のターゲットＫ５６２細胞とを使用した細胞傷害性アッセイでは、ＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞は、低い細胞比でＫ５６２細胞の細胞死を誘導することができた（図１７、パネルＢ）。

【0403】

他の実施形態
本明細書で開示された特徴はすべて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同一、均等、または同様の目的を果たす代替的な特徴に置き換えてもよい。よって、別段の明確な記載がない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の均等または同様の特徴の一例にすぎない。

【0404】

当業者であれば、上記の説明から、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神及び範囲を逸脱することなく、様々な用途及び条件に適合するように本開示に様々な変更及び修正を行うことができる。よって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。

【0405】

均等物
幾つかの発明実施形態を本書に記述及び例示したが、当業者は、本書に記述される機能を果たすため及び／または結果及び／または利点のうちの１つもしくは複数を得るための種々の他の手段及び／または構造を容易に想起するであろう。そのような変更及び／または修正の各々は、本書に記述される発明実施形態の範囲内にあるとみなされる。より一般的に言えば、当業者には、本書に記述されるパラメータ、寸法、材料、及び構成はすべて例示を意図すること、そして実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は発明の教示が使用される特定の用途または複数の用途に依存することが容易に理解されよう。当業者であれば、本書に記述される特定の発明実施形態の多くの均等物を認識するか、または定型的な実験を使用するだけでそれらを確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例として提示されるにすぎず、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲において、発明実施形態が、具体的に記述され請求されているものとは別様に実施され得ることを理解されたい。本開示の発明実施形態は、本書に記述される各個の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法を対象とする。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に矛盾しなければ、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法の任意の組み合わせが本開示の発明範囲内に含まれる。

【0406】

本書で定義され使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書の定義、及び／または定義された用語の通常の意味に優先すると理解されたい。

【0407】

本書で開示されるすべての参考文献、特許及び特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により組み込まれており、これは場合によっては文書全体を包含し得る。

【0408】

本明細書及び特許請求の範囲において本書で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、相反することが明確に示されない限り、「少なくとも１」を意味すると理解されたい。

【0409】

本明細書及び特許請求の範囲において本書で使用される「及び／または」という語句は、それによって等位接続された要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されたい。「及び／または」を用いて列記された複数の要素は、同じ様式で、すなわち、それによって等位接続された要素の「１つまたは複数」と解釈されたい。「及び／または」節によって具体的に特定された要素に関連するか関連しないかにかかわらず、具体的に特定された要素以外の他の要素が場合により存在してもよい。よって、非限定的な例として、「Ａ及び／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの制限のない文言と併せて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（場合によりＢ以外の要素を含む）を指すことがあり、別の実施形態では、Ｂのみ（場合によりＡ以外の要素を含む）を指すことがあり、さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（場合により他の要素を含む）を指すことがある、などということである。

【0410】

本明細書及び特許請求の範囲において本書で使用される場合、「または」は、上記で定義した「及び／または」と同じ意味を有すると理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「及び／または」は、包括的であるもの、すなわち、いくつかの要素またはリストの要素のうちの少なくとも１つを含むが複数も含み、場合により、列記されていない更なる項目を含むと解釈されるものとする。「のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」もしくは「のうちの１つだけ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、または特許請求の範囲において使用される場合は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」など、相反することが明確に示されている用語のみが、いくつかの要素またはリストの要素のうちの１つの要素だけを含むことを指す。概して、本書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの１つだけ」といった排他性の用語が先行する場合に限り、排他的選択肢（すなわち「一方または他方、しかし両方ではない」）を示すと解釈されるものとする。特許請求の範囲において使用される場合、「から本質的になる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許法の分野で使用されている通常の意味を有するものとする。

【0411】

本明細書及び特許請求の範囲において本書で使用される場合、１つまたは複数の要素のリストに関する「少なくとも１」という語句は、要素のリスト内のいずれか１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素のリスト内で具体的に列記されたあらゆる要素を少なくとも１つ含むとは限らず、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外するものではないと解釈されたい。この定義はまた、「少なくとも１」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素に関連するか関連しないかにかかわらず、具体的に特定された要素以外の要素が場合により存在する可能性を許容する。よって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａ及び／またはＢ」のうちの少なくとも１つ）は、一実施形態では、Ｂが存在しない（場合によりＢ以外の要素を含む）、少なくとも１つの、場合により複数を含むＡを指すことがあり、別の実施形態では、Ａが存在しない（場合によりＡ以外の要素を含む）、少なくとも１つの、場合により複数を含むＢを指すことがあり、さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、場合により複数を含むＡ、及び少なくとも１つの、場合により複数を含むＢ（場合により他の要素を含む）を指すことがある、などということである。

【0412】

また、相反することが明確に示されない限り、本書で特許請求される、複数のステップまたは行為を含む任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことを理解されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D-1】

【図5D-2】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【手続補正書】

【提出日】2023-02-13

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2023528415000001.app

【国際調査報告】