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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-06
(54)【発明の名称】ＩＬ－１０ムテイン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/24 20060101AFI20230629BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20230629BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230629BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230629BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230629BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230629BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20230629BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230629BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230629BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230629BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230629BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230629BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20230629BHJP
【ＦＩ】
C12N15/24
C07K14/54 ZNA
C07K19/00
C12N15/62 Z
C07K16/00
C07K14/705
A61K38/20
A61P29/00
A61P37/02
A61P1/04
A61P35/00
C12N15/63 Z
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022554913
(86)(22)【出願日】2021-03-10
(85)【翻訳文提出日】2022-11-02
(86)【国際出願番号】 GB2021050592
(87)【国際公開番号】W WO2021181091
(87)【国際公開日】2021-09-16
(31)【優先権主張番号】2003428.6
(32)【優先日】2020-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】510279918
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ダンディー
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＤＵＮＤＥＥ
(71)【出願人】
【識別番号】517007264
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】518338518
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・リール
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＩＬＬＥ
(71)【出願人】
【識別番号】522359811
【氏名又は名称】サントル オスピタリエ ルジョナル ユニヴェルシテール ドゥ リール
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＲＥＧＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＬＩＬＬＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100173473
【弁理士】
【氏名又は名称】高井良 克己
(72)【発明者】
【氏名】クレア ゴルビー
(72)【発明者】
【氏名】イグナシオ モラガ ゴンザレス
(72)【発明者】
【氏名】スーマン ミトラ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA53
4C084DA12
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZB071
4C084ZB072
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB261
4C084ZB262
4H045AA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、野生型ＩＬ－１０と比較して改善された特徴を示す、ＩＬ－１０の修飾形態またはムテインおよびその変異体に関するものである。本発明はさらに、治療方法を含む方法における、ＩＬ－１０のそのような修飾形態またはムテインおよびその変異体の使用に関するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
完全長成熟野生型ＩＬ－１０と比較して、１８位、９２位および９９位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ＩＬ－１０ムテイン。
【請求項2】
１８位、９２位および９９位に少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＩＬ－１０ムテイン。
【請求項3】
１８位、９２位および９９位の３つのすべての位置にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＩＬ－１０ムテイン。
【請求項4】
１８位に置換を含み、該置換はＹまたはＩ（承認された１文字アミノ酸コードに従ったレタリング）である、請求項１～３のいずれかに記載のＩＬ－１０ムテイン。
【請求項5】
９２位に置換を含み、該置換はＩである、請求項１～４のいずれかに記載のＩＬ－１０ムテイン。
【請求項6】
９９位に置換を含み、該置換はＮである、請求項１～５のいずれかに記載のＩＬ－１０ムテイン。
【請求項7】
１つまたは複数のさらなる置換を含むが、前記野生型ＩＬ－１０配列と比較して、典型的には１０、９、８、または７つ未満の置換である、請求項１～６のいずれかに記載のＩＬ－１０ムテイン。
【請求項8】
前記１つまたは複数のさらなる置換は、５５位、６９位、９７位、１１０位、１１１位および／または１４８位にある、請求項７に記載のＩＬ－１０ムテイン。
【請求項9】
前記ＩＬ－１０ムテインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、１１または１５の配列と少なくとも９７、９８、９９％または１００％同一であるが、対応する野生型ＩＬ－１０配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、１１または１５において同定されるアミノ酸置換を少なくとも含む、請求項１～８のいずれかに記載のＩＬ－１０ムテイン。
【請求項10】
さらに異なるタンパク質分子またはタンパク質分子の一部に融合した請求項１～９のいずれかに記載のＩＬ－１０ムテインを含む、融合タンパク質。
【請求項11】
前記さらなる分子は、インターロイキン（ＩＬ）分子などの異なるサイトカインである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記さらなるＩＬ分子は、野生型または変異体ＩＬ－４分子である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１９、２１、または２３において同定される配列と少なくとも９７、９８、９９％、または１００％同一であるが、前記野生型ＩＬ－１０配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１において同定されるアミノ酸置換を少なくとも含む配列を含む、請求項１０～１２に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記ＩＬ－１０分子は、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化および／またはグリコシル化によってさらに修飾される、請求項１～１３のいずれかに記載のＩＬ－１０ムテインまたは融合タンパク質。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれかに記載のＩＬ－１０ムテインまたは融合タンパク質を、薬学的に許容される賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項16】
抗がん剤、抗炎症剤、または免疫寛容促進剤などのさらなる医薬活性剤をともに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記さらなる医薬活性剤は、ＣＡＲ Ｔ細胞などの免疫細胞または抗がん剤もしくは抗炎症性抗体である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
治療方法において使用するための、請求項１～１７のいずれかに記載のＩＬ－１０ムテイン、融合タンパク質、または医薬組成物。
【請求項19】
炎症、自己免疫疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患／クローン病またはがんの治療方法において使用するための、請求項１８に記載のＩＬ－１０ムテイン、融合タンパク質、または医薬組成物。
【請求項20】
請求項１～１４に記載のＩＬ－１０ムテインまたは融合タンパク質をコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子などのポリヌクレオチド。
【請求項21】
請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド、ウイルス、細胞、脂質ナノ粒子、またはリポプレックス。
【請求項22】
前記ＩＬ－１０ムテインは、野生型ＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβへの結合と比較して１００倍、好ましくは１０００倍低いＫｄでＩＬ－１０Ｒβに結合する、請求項１～１４に記載のＩＬ－１０ムテインまたは融合タンパク質。
【請求項23】
前記ＩＬ－１０ムテインは二量体を形成する、請求項１～１４に記載のＩＬ－１０ムテインまたは融合タンパク質。
【請求項24】
前記ＩＬ－１０ムテインは、少なくとも１つのポリペプチド結合ドメイン、好ましくは抗体またはその断片、最も好ましくは単鎖抗体、例えばＶＨＨに融合している、請求項１０～１３に記載の融合タンパク質。
【請求項25】
前記ポリペプチド結合ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯｌ、ＩＤ０２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３および／またはＶＩＳＴＡ、好ましくはＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１から選択される少なくとも一つのチェックポイント分子に結合する、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項26】
前記ポリペプチド結合ドメインは、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１４１、ＣＤ２０６（ＭＲ）、ＣＤ２００７（ランゲリン）、ＢＤＣＡ－１、ＢＤＣＡ－２、ＢＤＣＡ－３、ＢＤＣＡ－４、ＣＡＤＭ１（Ｎｅｃｌ２）、Ｃｌｅｃ９Ａ、ＤＥＣ－２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＤＣＩＲ２（Ｃｌｅｃ４Ａ４）、ＬＳＰ－１、ＳＩＲＰアルファおよび／またはＸＣＲ１から選択される少なくとも１つの樹状細胞表面マーカーに結合する、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項27】
前記ポリペプチド結合ドメインは、アルファ（ｖ）インテグリン（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５およびαｖβ８など）、ＣＨＩ３Ｌ１（ＹＫＬ－４０）、ＣＸＣＲ４、Ｅ－セレクチン、ＦＡＰ、ＥＤＡおよびＥＤＢフィブロネクチン、ガレクチン－３、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ２Ｒ（ＣＩ－ＭＰＲ）、ＬＦＡ－１、ＭａｄＣＡＭ－１（アドレシン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＰＤＧＦＲアルファ、ＰＤＧＦＲベータ、ＰＳＧＬ－１、ＳＴＲＡ６（ＲＢＰ受容体）、ならびに／またはＶＣＡＭ－１から選択される少なくとも１つの炎症性組織マーカーに結合する、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項28】
前記ポリペプチド結合ドメインは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ＣＸ３ＣＲ１、ＥＭＲ１（Ｆ４／８０）、Ｉｂａ１および／またはＴＭＥＭ１９から選択される少なくとも１つのミクログリアマーカーに結合する、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項29】
前記ポリペプチド結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦｏＩＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＥＡ、５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７－Ｈ３、カドヘリン－６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ－３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ－１６Ｅ６、ＨＰＶ－１６Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｐ－カドヘリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、Ｔｒｏｐ２および／またはＷＴ１から選択される少なくとも１つの腫瘍抗原に結合する、請求項２４～２８に記載の融合タンパク質。
【請求項30】
前記ＩＬ－１０ムテインは、半減期延長分子、好ましくはＦｃ分子などの免疫グロブリン断片、または血清タンパク質、好ましくはアルブミンに対するポリペプチド結合ドメインに融合している、請求項２４～２９に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、野生型ＩＬ－１０と比較して改善された特徴を示す、ＩＬ－１０の修飾形態、つまりムテインと、その変異体に関するものである。本発明はさらに、治療方法を含む方法における、ＩＬ－１０のそのような修飾形態、つまりムテインと、その変異体の使用に関するものである。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）は、強力な抗炎症反応を誘発する免疫制御のための特徴的なサイトカインである。ＩＬ－１０は、自然細胞の表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レベルおよび共刺激分子を減少させて自然細胞の抗原提示能を低下させることにより、免疫反応の適応力を制御する（de Waal Malefyt et al., 1991b、Willems et al., 1994）。さらに、ＩＬ－１０は単球、マクロファージおよびＴ細胞を含む様々な細胞型からの炎症促進性サイトカインの産生を強力に抑制し(Fiorentino et al., 1991a, Fiorentino et al., 1991b)、抗炎症性環境にさらに寄与する。ＩＬ－１０の健全な免疫反応への重要な寄与は、ＩＬ－１０欠損のヒトがクローン病および大腸炎などの重度の自己免疫疾患を発症するという発見によってさらに強調される（Correa et al., 2009, Zhu et al., 2017）。ＩＬ－１０のヒトの健康との関連度にもかかわらず、ＩＬ－１０の広範な抗炎症活性の誘発を可能にする分子基盤は十分に理解されていない。
【0003】
ＩＬ－１０は、その強力な抗炎症特性から、自己免疫疾患を治療するための非常に魅力的な創薬標的と見なされていた。しかし、マウス研究での有効性にもかかわらず（Saxena et al., 2015, Cardoso et al., 2018）、ＩＬ－１０療法は臨床で有益な結果を得ることができず、いくつかの臨床試験においては、患者において軽度の有効性および偏った反応しか示さなかった（Colombel et al., 2001, Buruiana et al., 2010）。ＩＬ－１０の臨床有効性の低さを説明する主な仮説は、ＩＬ－１０療法中に低レベルの同サイトカインが消化管に到達するため、効果的な反応が得られないというものである。しかし、ＩＬ－１０の用量がその免疫調節能にどのように影響するかについては、現在に至るまで十分に理解されていない。より標的化されたＩＬ－１０送達のための戦略の開発は、まだ初期段階の研究ではあるが、臨床有効性の増強を示し、このモデルを裏付けている。（Cardoso et al., 2018, Steidler et al., 2000, Shigemori and Shimosato, 2017, Braat et al., 2006）。治療的に適切な用量で強い反応を誘発する能力を有するＩＬ－１０変異体は、非常に望ましいであろう。
【0004】
抗炎症活性に加えて、最近の研究においては、ＩＬ－１０がＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害性機能を高め、腫瘍を標的化する能力を増強し、抗がん反応を高めることが可能であることが示されている（Oft, 2019）。腫瘍の微小環境におけるＩＬ－１０は、おそらく抗原提示に対するＩＬ－１０の抑制効果が原因となって、腫瘍の免疫反応回避に関連しているため、これは逆説的に思われる（Yue et al., 1997, Mannino et al., 2015）。この逆説にもかかわらず、いくつかの研究は、ＩＬ－１０がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＣＤ８エフェクタ分子グランザイムＢおよびインターフェロンγの産生を改善することが可能であることを見事に実証している（Emmerich et al., 2012, Mumm et al., 2011, Mumm and Oft, 2013）。現在、ＩＬ－１０の抗腫瘍特性を試験する臨床試験がいくつかあり、すでに最初の有望な結果が得られている（Naing et al., 2019）。これらの試験においては、高用量のＰＥＧ化ＩＬ－１０（ペギロデカキン）が使用された結果、ＩＬ－１０の循環内での保持が延長されて有効性が保証され、効果的なｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ－１０反応にはＩＬ－１０が高濃度であり、かつレベルが維持されることが必要であることが再度強調されている。
【0005】
ＩＬ－１０は二量体サイトカインであり、２つのＩＬ－１０Ｒαおよび２つのＩＬ－１０Ｒβ受容体サブユニットから構成される表面受容体に結合することにより活性を発揮し、ＪＡＫ１／ＴＹＫ２／ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ１シグナル伝達経路の活性化と特定の遺伝子発現プログラムの誘導を引き起こす。動力学的には、ＩＬ－１０はまず高い親和性で２分子のＩＬ－１０Ｒαと結合し、第２ステップにおいては低い親和性で２分子のＩＬ－１０Ｒβをリクルートして、活性シグナルを発する六量体のＩＬ－１０複合体を形成する。他のサイトカインと比較した場合のＩＬ－１０系の顕著な特徴は、ＩＬ－１０が極めて弱い、高μＭ／低ｍＭ範囲の桁の親和性でＩＬ－１０Ｒβに結合することであり（Logsdon et al., 2002）、これによりこの系はリガンドおよび／または受容体の濃度のいずれかの変化に対して非常に感度が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本開示は、ＩＬ－１０のｉｎ ｖｉｖｏ活性の低さが、ＩＬ－１０Ｒβサブユニットに対する親和性の弱さに起因するという仮説に基づいている。ＩＬ－１０Ｒβとより高い親和性で結合するＩＬ－１０変異体は、このサイトカインのｉｎ ｖｉｖｏでの制限を克服し、ＩＬ－１０に基づく療法をレスキューする可能性を有する。この仮説を検証するために、本発明者らは、酵母表面ディスプレイ工学プラットフォームを使用して、ＩＬ－１０Ｒβに野生型ＩＬ－１０（ｗｔ）の１０００倍よく結合する、新しいＩＬ－１０変異体を作製した。
【0007】
第１の態様において、完全長成熟野生型ＩＬ－１０と比較して、１８位、９２位および９９位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ＩＬ－１０ムテインが提供される。言い換えれば、ＩＬ－１０ムテインは、１８位、９２位および９９位から選択される位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＩＬ－１０配列に関するが、同定された野生型およびムテインＩＬ－１０配列の最初の１８アミノ酸残基を構成するシグナルペプチド配列は除外されている。疑念を避けるために述べると、成熟野生型配列はＳｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙから始まる。さらなる疑念を避けるために述べると、本明細書で使用されるアミノ酸置換は、本明細書に例示されるように、アミノ酸を別の天然に存在するアミノ酸で置換することを指す。
【0008】
一実施形態において、ＩＬ－１０ムテインは、１８位、９２位および９９位から選択される位置、またはそれらの位置に少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。一実施形態においては、ＩＬ－１０ムテインは、１８位、９２位および９９位の３つのすべての位置にアミノ酸置換を含む。
【0009】
一実施形態において、１８位に置換があり、該置換はＹまたはＩである（承認された１文字アミノ酸コードに従ったレタリング）。
【0010】
一実施形態において、９２位に置換があり、該置換はＩである。
【0011】
一実施形態において、９９位に置換があり、該置換はＮである。
【0012】
任意に、ＩＬ－１０ムテインは、１つまたは複数のさらなる置換を含んでいてもよいが、典型的には、野生型ＩＬ－１０配列と比較して１０、９、８、または７つ未満の置換を含む。一実施形態において、前記１つまたは複数のさらなる置換は、５５位、６９位、９７位、１１０位、１１１位および／または１４８位にあってよい－ここでも、番号付けはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で同定されるｗｔＩＬ－１０配列との比較であり、野生型配列の最初の１８アミノ酸残基を構成するシグナルペプチド配列は除外されている。
【0013】
一実施形態において、ＩＬ－１０ムテインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、１１または１５の配列を含む、からなる、またはから本質的になる。この文脈においては、「～から本質的になる」とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、１１または１５の配列と少なくとも９７、９８または９９％同一であるが、野生型ＩＬ－１０配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、７、１１または１５において同定されるアミノ酸置換を少なくとも含むＩＬ－１０ムテインを指す。
【0014】
従って、上記の同定された変異に加えて、本発明のＩＬ－１０ムテインは、ＩＬ－１０ムテインの活性に実質的に悪影響を及ぼさない限り、１つまたは複数のさらなるアミノ酸修飾、例えば置換（保存的置換など）、挿入、欠失、または逆位を含んでいてもよい。
【0015】
ＩＬ－１０は、その機能的に活性な天然状態において、２つの同一の単量体から形成される二量体として見出される。本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインは、該して単量体配列で記載されるが、二量体が２つの単量体ＩＬ－１０ムテイン配列から形成されてもよいことが理解されよう。より詳細に記載されるように、本発明者らはまた、ＩＬ－１０ムテイン融合物を開発しており、これは、別の分子に融合された本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインを含む。さらに本発明者らは、記載のようなＩＬ－１０ムテインの五量体形態について記載する。
【0016】
野生型ＩＬ－１０は二量体形態で見出されるため、その操作は困難であり、本発明者らは、Ｗａｌｔｅｒグループによって以前に記載された単量体ＩＬ－１０変異体を工学的足場として使用した（Josephson et al., 2000）。本発明者らは、野生型と比較して親和性を高めた単量体ＩＬ－１０変異体を作製し、次にこれを天然の二量体立体構造に変換して、単量体および二量体形態のＩＬ－１０ムテインを得た。これらの分子によって、ＩＬ－１０受容体結合親和性およびＩＬ－１０受容体複合体化学量論のＩＬ－１０生物学への寄与を評価するユニークな機会が本発明者らに提供された。本明細書に提示されるデータは、ＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβに対する親和性を増加させることが、分子レベルおよび細胞レベルの両方でＩＬ－１０の既知の特性を増強させることを示している。定量的イメージング研究により、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインは、単量体形態または二量体などの多量体形態のいずれかで、受容体複合体会合の改善を示し、その結果、操作されたサイトカインによるＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３因子のより強力な活性化がもたらされることが明らかになった。親和性を増強させたＩＬ－１０変異体は、そのシグナル伝達プロファイルの改善に一致して、単球およびＣＤ８Ｔ細胞における野生型リガンドよりも強い遺伝子発現プログラムならびにより強い細胞反応を誘導した。提示されたデータはさらに、ＩＬ－１０の用量がどのように免疫調節活性を制御しているかについての新しい洞察を提供し、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインが、より幅広い用量範囲でより強い生理活性を誘発することにより、野生型ＩＬ－１０よりも明らかに治療上有利になることを示している。
【0017】
好都合なことに、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインは、野生型ＩＬ－１０と比較して、より高いＩＬ－１０受容体結合親和性および／または機能活性を示し得る。一実施形態において、前記ＩＬ－１０ムテインは、野生型ＩＬ－１０と比較して、より高い親和性でＩＬ－１０Ｒβに結合する。好都合なことに、親和性の増大は、当該技術分野において既知のＩＬ－１０親和性を決定するための適切なアッセイ（Moraga et al, 2015a参照）に従って、または本明細書に記載されているように決定することができる。典型的には、親和性（典型的にはＫｄを単位とする）の増大は、少なくとも２倍、例えば５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上であってよい。機能的活性の増大は、当業者に既知である適切なＩＬ－１０活性アッセイに関連して決定されてもよい。適切な活性アッセイは、例えば、ＳＴＡＴ１および／またはＳＴＡＴ３因子の活性化、遺伝子発現および／または細胞反応の増強を対象とし得る。ＩＬ－１０のそのような機能的活性を検出するための適切なアッセイは当業者に知られており、例えばMoore et al, 2001に記載されている。
【0018】
さらなる実施形態では、ＩＬ－４（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）などのさらに異なるＩＬ分子、または他の分子と融合した、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインが提供される。さらに異なるＩＬ分子は、野生型でもよいし変異ＩＬ分子でもよい。一実施形態では、共通ガンマ鎖またはＩＬ－１３Ｒα１と結合せず、従ってＩＬ４およびＩＬ－１３のアンタゴニストとして作用する変異ＩＬ－４分子と融合した、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインが提供される。一実施形態では、このようなＩＬ－１０ムテイン／ＩＬ－４融合体は、ＩＬ－１０Ｒα／ＩＬ－１０Ｒβ／ＩＬ－４Ｒαを含む三量体受容体複合体をリクルートし、抗炎症特性を示し得る。例示的な融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９において同定される配列と少なくとも９７、９８、９９％、または１００％同一であるが、野生型ＩＬ－１０配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１において同定されるアミノ酸置換を少なくとも含む配列を含む。
【0019】
本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインは、少なくとも１つのポリペプチド結合ドメイン、例えば抗体またはその断片、例えばＶＨＨのような単鎖抗体に融合してもよい。特定の教示においては、ポリペプチド結合ドメインは、以下のいずれかの１つまたは複数に結合することができる：
ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯｌ、ＩＤ０２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３および／またはＶＩＳＴＡ、好都合にはＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１から選択される少なくとも一つのチェックポイント分子；
ＣＤ１ｃ、ＣＤ１１ｃ、ＳＩＲＰａ、ＣＤ２０６／ＭＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１４１、ＸＣＲ１、Ｃｌｅｃ９ａ、ＣＡＤＭ１／Ｎｅｃｌ２（Saxena & Bhardwaj, 2017参照）、Ｃｌｅｃ９ａ、ＣＤ１４１、ＸＣＲ１、ＣＡＤＭ１、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１２３、ＢＤＣＡ－２、ＢＤＣＡ－４、ＣＤ１４１、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ａ、ランゲリン／ＣＤ２０７、ＣＤ１４（Rhodes et al., 2019参照）、ＣＤ１２３、ＢＤＣＡ－２、ＢＤＣＡ－４、ＣＤ１４１、ＢＤＣＡ－１、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１１ｃ、ランゲリン／ＣＤ２０７（Collin & Bigley, 2018参照）、ＤＥＣ－２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＤＣＩＲ２／Ｃｌｅｃ４Ａ４（ＤＥＣ－２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、またはＤＣＩＲ２／Ｃｌｅｃ４Ａ４（Moutel et al., 2020；国際公開第２０１８／０６９４８０号参照）参照）から選択される少なくとも１つの樹状細胞表面マーカー；
アルファ（ｖ）インテグリン（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５およびαｖβ８など）、ＣＨＩ３Ｌ１（ＹＫＬ－４０）、ＣＸＣＲ４、Ｅ－セレクチン、ＦＡＰ、ＥＤＡおよびＥＤＢフィブロネクチン、ガレクチン－３、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ２Ｒ（ＣＩ－ＭＰＲ）、ＬＦＡ－１、ＭａｄＣＡＭ－１（アドレシン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＰＤＧＦＲアルファ、ＰＤＧＦＲベータ、ＰＳＧＬ－１、ＳＴＲＡ６（ＲＢＰ受容体）、ＶＣＡＭ－１（Yazdani et al. , 2017; Jin et al., 2018; Lemanska-Perek & Adamik, 2019; Farkas et al., 2006; Mejias et al., 2010; Kelly et al., 2012; Siew et al., 2019; Gonen et al., 2018; Kircher et al., 2018参照）から選択される少なくとも１つの炎症性組織マーカー；
ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ＣＸ３ＣＲ１、ＥＭＲ１（Ｆ４／８０）、Ｉｂａ１、ＴＭＥＭ１９（Bennett et al., 2016参照）から選択される少なくとも１つのミクログリアマーカー；ならびに
ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦｏＩＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＥＡ、５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７－Ｈ３、カドヘリン－６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ－３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ－１６Ｅ６、ＨＰＶ－１６Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｐ－カドヘリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、Ｔｒｏｐ２、および／またはＷＴ１から選択される少なくとも１つの腫瘍抗原。
ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯｌ、ＩＤ０２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３および／またはＶＩＳＴＡ、好都合にはＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１から選択される少なくとも一つのチェックポイント分子；
ＣＤ１ｃ、ＣＤ１１ｃ、ＳＩＲＰａ、ＣＤ２０６／ＭＲ、ＣＤ１４、ＣＤ１４１、ＸＣＲ１、Ｃｌｅｃ９ａ、ＣＡＤＭ１／Ｎｅｃｌ２（Saxena & Bhardwaj, 2017参照）、Ｃｌｅｃ９ａ、ＣＤ１４１、ＸＣＲ１、ＣＡＤＭ１、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１２３、ＢＤＣＡ－２、ＢＤＣＡ－４、ＣＤ１４１、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１ａ、ランゲリン／ＣＤ２０７、ＣＤ１４（Rhodes et al., 2019参照）、ＣＤ１２３、ＢＤＣＡ－２、ＢＤＣＡ－４、ＣＤ１４１、ＢＤＣＡ－１、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１１ｃ、ランゲリン／ＣＤ２０７（Collin & Bigley, 2018参照）、ＤＥＣ－２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＤＣＩＲ２／Ｃｌｅｃ４Ａ４（ＤＥＣ－２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、またはＤＣＩＲ２／Ｃｌｅｃ４Ａ４（Moutel et al., 2020；国際公開第２０１８／０６９４８０号参照）参照）から選択される少なくとも１つの樹状細胞表面マーカー；
アルファ（ｖ）インテグリン（αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５およびαｖβ８など）、ＣＨＩ３Ｌ１（ＹＫＬ－４０）、ＣＸＣＲ４、Ｅ－セレクチン、ＦＡＰ、ＥＤＡおよびＥＤＢフィブロネクチン、ガレクチン－３、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ２Ｒ（ＣＩ－ＭＰＲ）、ＬＦＡ－１、ＭａｄＣＡＭ－１（アドレシン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＰＤＧＦＲアルファ、ＰＤＧＦＲベータ、ＰＳＧＬ－１、ＳＴＲＡ６（ＲＢＰ受容体）、ＶＣＡＭ－１（Yazdani et al. , 2017; Jin et al., 2018; Lemanska-Perek & Adamik, 2019; Farkas et al., 2006; Mejias et al., 2010; Kelly et al., 2012; Siew et al., 2019; Gonen et al., 2018; Kircher et al., 2018参照）から選択される少なくとも１つの炎症性組織マーカー；
ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ＣＸ３ＣＲ１、ＥＭＲ１（Ｆ４／８０）、Ｉｂａ１、ＴＭＥＭ１９（Bennett et al., 2016参照）から選択される少なくとも１つのミクログリアマーカー；ならびに
ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦｏＩＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＥＡ、５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７－Ｈ３、カドヘリン－６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ－３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ－１６Ｅ６、ＨＰＶ－１６Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｐ－カドヘリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、Ｔｒｏｐ２、および／またはＷＴ１から選択される少なくとも１つの腫瘍抗原。
【0020】
さらに、またはあるいは、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインは、半減期延長分子、例えばＦｃ分子などの免疫グロブリン断片、または血清タンパク質、例えばアルブミンに対するポリペプチド結合ドメインに融合していてもよい。
【0021】
代替のＩＬ－１０ムテイン／ＩＬ－４変異体融合体は、ＩＬ－４Ｒａにより低い親和性で結合することができる。従って、さらなる例示的な融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１において同定される配列と少なくとも９７、９８、９９％、または１００％同一であるが、野生型ＩＬ－１０配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１において同定されるアミノ酸置換を少なくとも含む配列を含む。このような融合分子は、完全に機能的なＩＬ－１０受容体複合体を発現する細胞においてのみＩＬ－１０およびＩＬ－４シグナル伝達反応を引き起こすことが可能であり得、全身的なＩＬ－４刺激に関連する毒性を制限し得る。
【0022】
さらに、本発明者らは、本発明のＩＬ－１０ムテインがＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害活性の増強をもたらすことを観察した。従って、本発明のＩＬ－１０ムテインは、ＣＡＲ Ｔ細胞に基づく療法の一助となり得ることが想定される。従って、さらなる教示において、本発明は、ＩＬ－１０ムテインの非存在下でＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性効果を増強するように、治療方法においてＣＡＲ Ｔ細胞と組み合わせて使用するための、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインを提供する。
【0023】
一実施形態において、ＩＬ－１０ムテインは、グリコシル化および／またはアミド化などの翻訳後修飾などによって、さらに修飾される。他の修飾としては、ＰＥＧなどのさらなる分子を本発明のＩＬ－１０ムテインに結合させることが挙げられる。野生型ＩＬ－１０がＰＥＧ化によってどのように修飾され得るか、およびいずれが本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインに採用され得るかについての詳細は、米国特許第９９２５２４５号明細書に記載されており、当業者はこれを参照し、その内容全体は参照によりここに組み込まれるものとする。
【0024】
また、提供される実施形態のいずれかの本明細書に記載のＩＬ－１０ムテイン、ならびに変異体および修飾形態、融合タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、核酸分子は合成核酸である。いくつかの実施形態においては、核酸分子はｃＤＮＡである。
【0025】
また、提供される実施形態のいずれかの核酸分子を含むベクターが提供される。いくつかの場合において、ベクターは発現ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは哺乳動物発現ベクターまたはウイルスベクターである。このようなベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスベクターまたはファージミドの形態であってもよい。
【0026】
さらに、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターは、脂質または非イオン性界面活性剤ベシクル、ナノ粒子、リポプレックスなどの適切な担体分子とともに提供されてもよい。
【0027】
また、提供される実施形態のいずれかのベクターを含む細胞が提供される。いくつかの例において、細胞は哺乳類細胞である。いくつかの態様においては、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態においては、細胞は免疫細胞またはリンパ球である。
【0028】
また、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテイン、ならびに変異体および修飾形態、融合タンパク質を作製する方法であって、提供される実施形態のいずれかの核酸分子または提供される実施形態のいずれかのベクターを、細胞内でタンパク質を発現する条件下で宿主細胞に導入することを含む方法が提供される。いくつかの例において、前記方法は、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテイン、ならびに変異体および修飾形態、融合タンパク質を細胞から単離または精製することをさらに含む。
【0029】
また、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテイン、ならびに変異体および修飾形態、融合タンパク質を発現する細胞を操作する方法であって、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテイン、ならびに変異体および修飾形態、融合タンパク質をコードする核酸分子を、細胞内でポリペプチドが発現する条件下で宿主細胞に導入することを含む方法が提供される。
【0030】
本発明のＩＬ－１０ムテイン、ならびに本明細書に記載の変異体および修飾形態、融合タンパク質、ならびに他の分子との組み合わせは、治療方法において特定の用途を見出すことができる。従って、一実施形態において、本発明のＩＬ－１０ムテイン、ならびに本明細書に記載の変異体および修飾形態、融合タンパク質、ならびに他の分子との組み合わせを、任意に薬学的に許容される賦形剤と共に含む、治療方法において使用するための医薬製剤が提供される。また、本発明のＩＬ－１０ムテイン、ならびに本明細書に記載の変異体および修飾形態、融合タンパク質、ならびに他の分子との組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法が提供される。
【0031】
本発明のＩＬ－１０ムテインを、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上、好ましくは１つまたは２つ、好ましくは１つの他の治療剤との併用療法で投与する場合、ＩＬ－１０ムテインは同時にまたは逐次的に投与することが可能である。逐次的に投与する場合、それらは、短い間隔（例えば５～１０分間にわたって）またはより長い間隔で（例えば１、２、３、４時間、もしくはそれ以上空けて、または必要であればさらに長い期間を空けて）投与することが可能であり、正確な投与計画は治療剤の特性に相応する。
【0032】
本発明のＩＬ－１０ムテインはまた、ＰＤ１抗体、または当該技術分野において既知の他の抗がん抗体、または炎症を防ぐように設計された抗ＴＮＦもしくは抗ＩＬ６抗体などのさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。対象は、典型的には動物、例えば哺乳類、特にヒトである。
【0033】
治療的または予防的に効果的な量とは、所望の反応を達成することが可能なものを意味し、典型的には、医師によって判断される。必要な量は、少なくとも該当の活性ＩＬ－１０ムテイン、患者、治療または防止が望まれる状態、および治療される患者の体重１ｋｇあたりの化合物が１μｇ～１ｇの桁である製剤のうちの、１つまたは複数に依存する。
【0034】
異なる投与計画が同様に管理されてもよいが、これも典型的には医師の裁量による。本発明のＩＬ－１０ムテインは、少なくとも毎日の投与が可能であるが、ＩＬ－１０ムテインがより低頻度で、例えば１日おき、毎週または隔週で投与される投与計画も、本発明によって包含される。
【0035】
治療とは、本明細書において、少なくとも患者が患っている状態の改善を意味し；治療は治癒的である（すなわち、状態の消失をもたらす）必要はない。同様に、本明細書における防止または予防への言及は、状態の完全な予防を示すものでも必要とするものでもなく；代わりに、本発明に従った予防または防止を介してその兆候が低減または遅延され得るものである。
【0036】
本発明の使用のために、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテインまたはその生理学的に許容される塩、溶媒和化合物、エステルもしくはアミドは、ＩＬ－１０ムテインまたはその生理学的に許容される塩、エステルもしくは他の生理学的機能的誘導体を、そのための１つまたは複数の薬学的に許容される担体ならびに任意に他の治療および／または予防成分とともに含む医薬製剤として提示され得る。製剤のその他の成分と適合し、その受容者に有害でないという意味において、任意の担体が許容される。適切なさらなる治療および／または予防剤としては、抗がん剤、抗炎症剤、または免疫寛容促進剤が挙げられる。
【0037】
医薬製剤には、経口投与、局所投与（経皮、頬側および舌下投与を含む）、直腸投与または非経口投与（皮下、皮内、筋肉内および静脈内投与を含む）、鼻腔投与および経肺投与、例えば吸入、に適切なものが含まれる。製剤は、適切な場合には、便宜的に離散的な用量単位で提示されてもよく、薬学の技術分野において周知の任意の方法によって調製され得る。方法は、典型的には、活性化合物を液体担体もしくは細かく分割された固体担体またはその両方と会合させるステップと、次に、必要ならば、生成物を所望の製剤に成形するステップとを含む。
【0038】
担体が固体である経口または直腸投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは、それぞれが所定量の活性化合物を含むボーラス、カプセルまたは錠剤などの単位用量製剤として提示される。錠剤は、任意に１つまたは複数の副成分とともに圧縮または成形により製造することができる。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの易流動性形態の活性化合物を、任意に結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤または分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、活性化合物を不活性液体希釈剤と共に成形することにより製造することができる。錠剤は、任意にコーティングされていてもよく、コーティングされていない場合は、任意に筋入れされてもよい。カプセルは、活性化合物を単独で、または１つもしくは複数の副成分と混合してカプセルシェルに充填し、次いで通常の方法で密封することによって調製することができる。
【0039】
経口投与用の製剤には、放出制御剤形、例えば、活性化合物が適切な放出制御マトリクス中に配合されるか、または適切な放出制御フィルムでコーティングされている錠剤が含まれる。このような製剤は、予防的な使用に特に好都合であり得る。
【0040】
担体が固体である直腸投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは、単位用量坐薬として提示される。適切な担体には、カカオ脂および当該技術分野において一般的に使用される他の材料が含まれる。坐剤は、活性化合物を軟化または融解した担体と混合し、次いで型に入れて冷却および成形することにより、好都合に形成することができる。
【0041】
非経口投与に適した医薬製剤には、水性または油性溶媒中の活性化合物の無菌溶液または懸濁液が含まれる。
【0042】
注射用調製物は、ボーラス注射または継続的注入に適応させることができる。このような調製物は、単位用量または複数回用量容器に入れて、製剤の導入後、使用に必要となるまで密封して好都合に提示される。
【0043】
あるいは、活性化合物は粉末形態であってもよく、これは使用前に無菌パイロジェンフリー水などの適切な溶媒と構成される。
【0044】
活性化合物は、長時間作用性のデポ調製物として製剤化することもでき、これは、筋肉内注射または移植、例えば、皮下もしくは筋肉内移植により投与することができる。デポ調製物は、例えば、適切な高分子もしくは疎水性材料、またはイオン交換樹脂を含んでもよい。このような長時間作用性製剤は、予防的な使用に特に好都合である。
【0045】
頬側口腔を経由する経肺投与に適した製剤は、活性化合物を含む、望ましくは０．５～７ミクロンの範囲の直径を有する粒子が、受容者の気管支樹内に送達されるように提示される。
【0046】
一つの可能性として、そのような製剤は細かく粉砕された粉末の形態であり、吸入装置において使用するための、適切には例えばゼラチンの突き刺し可能なカプセルに入れて、または代替的に、活性化合物、適切な液体または気体噴霧剤ならびに任意に界面活性剤および／または固体希釈剤などの他の成分を含む自己推進型製剤として、好都合に提示することができる。適切な液体噴霧剤としては、プロパンおよびクロロフルオロカーボンが挙げられ、適切な気体噴霧剤としては二酸化炭素が挙げられる。活性化合物が溶液または懸濁液の液滴の形態で分注される自己推進型製剤も採用され得る。
【0047】
このような自己推進型製剤は、当該技術分野において既知のものと同様であり、確立された手順によって調製することができる。適切には、それらは、所望の噴霧特徴を有する手動操作可能なまたは自動的に機能するバルブのいずれかを備えた容器に入れて提示され；有利には、バルブは、その各操作時に一定量、例えば２５～１００マイクロリットルを送達する計量型のものである。
【0048】
さらなる可能性として、活性化合物は、加速された気流または超音波攪拌を採用して吸入のための微細な液滴霧を生成するアトマイザまたはネブライザにおいて使用するための溶液または懸濁液の形態であってもよい。鼻腔投与に適した製剤には、経肺投与用に上記したものと一般に類似している製剤が含まれる。このような製剤は、分注時、鼻腔内での保持を可能にするために、望ましくは１０～２００ミクロンの範囲の粒子径を有するべきであり；これは、適宜、適切な粒子径の粉末の使用または適切なバルブの選択によって達成され得る。他の適切な製剤としては、鼻に近づけた容器から鼻道を通じて素早く吸入して投与するための２０～５００ミクロンの範囲の粒子径を有する粗粉末、および水性または油性の溶液または懸濁液中に活性化合物を０．２～５％ｗ／ｖ含む点鼻薬が挙げられる。
【0049】
前述の担体成分に加えて、上記の医薬製剤は、希釈剤、緩衝剤、着香剤、結合剤、表面活性剤、増粘剤、滑沢剤、および保存剤（抗酸化剤を含む）などの適切な１つまたは複数の追加の担体成分と、製剤を対象とする受容者の血液と等張にする目的で含まれる物質を含み得ることを理解されたい。
【0050】
薬学的に許容される担体は、当業者に周知であり、０．１Ｍ、および好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液、または０．８％生理食塩水を含むが、これらに限定されるものではない。さらに、薬学的に許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液であってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。非経口溶媒としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸化リンガーオイルまたは固定油が挙げられる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在してよい。局所製剤に適した製剤は、例えば、ゲル、クリームまたは軟膏として提供され得る。このような調製物は、例えば、創傷または潰瘍に塗布することができ、創傷もしくは潰瘍の表面に直接広げるか、または包帯、ガーゼ、もしくはメッシュなどの適切な支持体に載せて、治療すべき領域に当ててもよい。液体または粉末製剤もまた提供され得、治療すべき部位、例えば創傷または潰瘍に直接噴霧または散布することが可能である。あるいは、包帯、ガーゼ、またはメッシュなどの担体に製剤を噴霧または散布した後、治療すべき部位に当てることも可能である。
【0051】
獣医学的使用のための治療用製剤は、好都合に粉末または液体濃縮形態のいずれかであってもよい。標準的な獣医学的な製剤の慣行に従って、粉末にラクトースまたはスクロースのような通常の水溶性賦形剤を組み込んでその物理的特性を改善してもよい。従って、本発明の特に適切な粉末は、５０～１００％ｗ／ｗ、好ましくは６０～８０％ｗ／ｗの活性成分と、０～５０％ｗ／ｗ、好ましくは２０～４０％ｗ／ｗの通常の獣医学的賦形剤とを含む。これらの粉末は、例えば中間プレミックスとして動物の飼料に加えるか、または動物の飲料水に希釈することができる。
【0052】
本発明の液体濃縮物は、適切にはＩＬ－１０ムテインまたはその誘導体もしくは塩を含み、任意に獣医学的に許容される水混和性溶媒、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、グリセロールホルマルまたはこのような溶媒と最大３０％ｖ／ｖのエタノールを混合したものを含んでもよい。液体濃縮物は、動物の飲料水に投与することができる。
【0053】
また、関節リウマチ、移植片対宿主病および炎症性腸疾患／クローン病などの慢性炎症など、ＩＬ－１０の発現または機能の低減に関連する疾患の治療および／または防止のための方法において使用するための、本明細書に記載のＩＬ－１０ムテイン（および核酸組成物を含む組成物）、ならびに、変異体および修飾形態、融合タンパク質ならびに他の分子との組み合わせが提供される。本発明に従って治療され得るさらなる疾患には、炎症性疾患を含み、または自己免疫疾患が以下から選択される：関節炎（急性関節炎などの関節リウマチ、慢性関節リウマチ、痛風または痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変性性関節炎、ＩＩ型コラーゲン誘発性関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、椎骨関節炎、および全身性若年発症関節リウマチ、変形性関節症、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、原発性慢性多発性関節炎、反応性関節炎および強直性脊椎炎）、炎症性過増殖性皮膚疾患、尋常性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、爪乾癬などの乾癬、花粉症およびヨブ症候群などのアトピー性疾患を含むアトピー、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥離性皮膚炎。アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹などの蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎・皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症（全身性強皮症を含む）、全身性硬化症、脊髄視覚ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）などの多発性硬化症（ＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、失調性硬化症などの硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫介在性消化管疾患、潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、顕微鏡的大腸炎、膠原線維性大腸炎、ポリープ状大腸炎、壊死性腸炎、および全層性大腸炎などの大腸炎、ならびに自己免疫性炎症性腸疾患）、腸炎、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、ぶどう膜の全部または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様滑膜炎、遺伝性血管性浮腫、髄膜炎などにおける脳神経障害、妊娠性疱疹、妊娠性天疱瘡、陰嚢そう痒症、自己免疫性早発卵巣不全、自己免疫疾患による突発性難聴、アナフィラキシーならびにアレルギー性およびアトピー性鼻炎などのＩｇＥ介在性疾患、ラスムッセン脳炎ならびに辺縁系および／または脳幹脳炎などの脳炎、前部ぶどう膜炎、急性前部ぶどう膜炎、肉芽腫性ぶどう膜炎、非肉芽腫性ぶどう膜炎、水晶体抗原性ぶどう膜炎、後部ぶどう膜炎、または自己免疫性ぶどう膜炎などのぶどう膜炎、原発性ＧＮ、免疫介在性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮまたは特発性膜性腎症、Ｉ型およびＩＩ型を含む膜性または膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、ならびに急速進行性ＧＮ、増殖性腎炎など、慢性または急性糸球体腎炎などの、ネフローゼ症候群を伴うまたは伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、自己免疫性多腺内分泌失調、形質細胞限局性亀頭炎を含む亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定紅斑、多形紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮溶解性角化症、前がん性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー性疾患および反応、アレルギー応答、アレルギー性またはアトピー性湿疹、皮脂欠乏性湿疹、異汗性湿疹および小水疱性掌蹠湿疹を含む湿疹、喘息気管支炎、気管支喘息、および自己免疫性喘息などの喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症反応を伴う疾患、妊娠中の胎児Ａ－Ｂ－０血液型などの外来性抗原に対する免疫反応、慢性炎症性肺疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス。腎外ループス、円板状ループスおよび円板状エリテマトーデス、ループス脱毛症、皮膚ＳＬＥまたは亜急性皮膚ＳＬＥなどの全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、新生児期ループス症候群（ＮＬＥ）、ならびに播種性エリテマトーデスを含むループス、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年発症型（Ｉ型）糖尿病、および成人発症型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）および自己免疫性糖尿病。また、以下も考慮される：サイトカインおよびＴリンパ球介在性の急性および遅延性過敏症に関連する免疫反応、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎、大血管炎（リウマチ性多発筋痛症および巨細胞性（高安）動脈炎を含む）、中血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む）、顕微鏡的多発動脈炎、免疫血管炎、中枢神経系血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎などの壊死性血管炎、ならびにチャーグ・ストラウス血管炎または症候群（ＣＳＳ）およびＡＮＣＡ関連小血管炎などのＡＮＣＡ関連血管炎を含む血管炎症候群、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイヤモンドブラックファン貧血、溶血性貧血または自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、アジソン病、自己免疫性好中球減少、汎血球減少、白血球減少、白血球の血管外漏出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、敗血症、外傷または出血に続発する多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡および皮膚性類天疱瘡などの類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘液膜天疱瘡、および紅斑性天疱瘡を含む）、自己免疫性多腺内分泌障害、ライター病または症候群、熱傷、妊娠高血圧腎症、免疫複合体腎炎などの免疫複合体疾患、抗体介在性腎炎、多発神経炎、ＩｇＭ多発神経障害またはＩｇＭ介在性神経障害などの慢性神経障害、慢性もしくは急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの自己免疫または免疫介在性血小板減少症、特発性角強膜炎、上強膜炎などの強膜炎、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎などの甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫性多腺性症候群（または多腺内分泌障害症候群）などの多腺性症候群、ランバート・イートン筋無力症候群またはイートン・ランバート症候群などの神経性腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群、スティッフマンまたはスティッフ・パーソン症候群、アレルギー性脳脊髄炎またはアレルギー性脳脊髄炎および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的自己免疫脳脊髄炎などの脳脊髄炎、胸腺腫関連重症筋無力症などの重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋強直症、眼球クローヌスまたは眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、および感覚神経障害、多巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚症、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚症、一過性棘融解性皮膚症、原発性胆汁性肝硬変および肺硬変などの硬変、自己免疫性腸疾患症候群小児脂肪便症またはセリアック病、セリアックスプルー（グルテン性腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病)、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）などの自己免疫性耳疾患、自己免疫性難聴、難治性または再発もしくは再発性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、コーガン症候群／非梅毒性間質性角膜炎、ベル麻痺、スウィート病／症候群、自己免疫性酒さ、帯状疱疹関連痛、アミロイドーシス、非がん性リンパ球増加症、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症を含む一次リンパ球増加症（例えば、良性単クローン性免疫グロブリン血症および意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、ＭＧＵＳ）末梢神経障害、腫瘍随伴症候群、てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、難聴、失明、周期性四肢麻痺、およびＣＮＳのチャネル異常症などのチャネル異常症、自閉症、炎症性筋疾患、巣状もしくは分節性または巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼障害、ぶどう膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝障害、線維筋痛症、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期認知症、自己免疫性脱髄疾患および慢性炎症性脱髄性多発神経障害などの脱髄疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症、全脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、強指症、および毛細血管拡張症）、男性および女性の自己免疫性不妊症、例えば抗精子抗体によるもの、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ性血管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維化性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症などの寄生虫疾患、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心筋線維症、びまん性間質性肺繊維症、間質性肺繊維症、肺繊維症、特発性肺繊維症、嚢胞性繊維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎（急性または慢性）、またはフックス毛様体炎などの毛様体炎、ヘノッホ・シエーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＳＣＩＤ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、エコーウイルス感染症、敗血症、内毒素血症、膵炎、甲状腺中毒症、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタイン・バール・ウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エヴァン症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞性多発筋痛症、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型腎症、良性家族性および虚血再灌流傷害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節炎、気管支炎、慢性閉塞性気道／肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性疾患、精子形成欠如、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎、らい性結節性紅斑、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性発熱、ハマン・リッチ病、感音性難聴、発作性血色素尿症、性腺機能低下症、限局性回腸炎、白血球減少、伝染性単核症、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う疾患、白血球接着不全症、サイトカインおよびＴリンパ球介在性の急性および遅延性過敏症に関連する免疫反応、白血球の血管外漏出を伴う疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多腺内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、
膵島炎、多腺内分泌不全、自己免疫性多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、拡張型心筋症などの心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎または蝶形骨洞炎、好酸球増多症、肺浸潤性好酸球増多症、好酸球増多筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増多症などの好酸球関連障害、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギローマ、または好酸球含有肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多腺内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルトン症候群、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病関連自己免疫障害、リウマチ、神経疾患、リンパ節炎、血管機能障害、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、および血管新生に伴う疾患、アレルギー性過敏障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、虚血性再灌流障害、心筋または他の組織の再灌流傷害、リンパ腫性気管支炎、炎症性皮膚疾患、急性炎症性成分を有する皮膚疾患、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、眼球および眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導性毒性、ナルコレプシー、急性重篤炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜症、移植片対宿主病、接触過敏症、喘息性気道過敏症、ならびに子宮内膜症。
膵島炎、多腺内分泌不全、自己免疫性多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、拡張型心筋症などの心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎または蝶形骨洞炎、好酸球増多症、肺浸潤性好酸球増多症、好酸球増多筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増多症などの好酸球関連障害、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギローマ、または好酸球含有肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多腺内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルトン症候群、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病関連自己免疫障害、リウマチ、神経疾患、リンパ節炎、血管機能障害、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、および血管新生に伴う疾患、アレルギー性過敏障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、虚血性再灌流障害、心筋または他の組織の再灌流傷害、リンパ腫性気管支炎、炎症性皮膚疾患、急性炎症性成分を有する皮膚疾患、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、眼球および眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導性毒性、ナルコレプシー、急性重篤炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜症、移植片対宿主病、接触過敏症、喘息性気道過敏症、ならびに子宮内膜症。
【発明を実施するための形態】
【0054】
本明細書に記載のＩＬ－１０ムテイン（および組成物）、ならびに変異体および修飾形態、融合タンパク質ならびに他の分子との組み合わせは、ＣＤ８Ｔ細胞反応に対するその効果の観点から、がんの治療および／または防止のための方法における使用を見出すことができる。
【0055】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、一般に、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法および細胞培養、分子遺伝学、有機化学における実験手順は、当該技術分野において周知であり、一般的に採用されているものである。核酸およびペプチド合成には、標準的な技術が使用される。技術および手順は、一般に、当該技術分野における通常の方法、および本書を通じて提供される様々な一般的参考文献（一般に、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.参照、これは参照により本明細書に組み込まれるものとする）に従って実施される。本明細書で使用される命名法ならびに以下に記載される分析および合成有機化学の実験手順は、当該技術分野において周知であり、一般的に採用されているものである。化学合成および化学分析には、標準的な技術またはその修正が使用される。
【0056】
本明細書で使用される「野生型」は、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。「野生型ＩＬ－１０」とは、天然か組換え型かにかかわらず、１８アミノ酸のＩＬ－１０シグナルペプチドを含まない天然ヒトＩＬ－１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の、通常存在する１６０のアミノ酸配列を有するＩＬ－１０を意味する。
【0057】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」または「ペプチド」は、その長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）に関係なく、アミノ酸残基の任意の鎖を指す。
【0058】
本明細書で使用される「ムテイン」は、野生型ポリペプチドと比較して１つまたは複数の部位にアミノ酸の挿入、欠失、置換および修飾を含むポリペプチドを意味する。例示的なムテインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸の置換を含むことが可能である。
【0059】
本明細書に記載の定義された変異と同様に、本発明のムテインは、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列全体に保存的修飾および置換（例えば、ムテインの二次または三次構造に最小限の影響を与えるもの）もまた含むことができる。そのような保存的置換には、DayhoffによってThe Atlas of Protein Sequence and Structure 5(1978)に、およびArgosによってEMBO J.,8:779-785(1989)に記載されているものが含まれる。
【0060】
用語「治療する」または「治療」または「療法（therapy）」または「療法(therapies)」は、治療的処置および予防的または防止的措置の両方を指し、その目的は標的となる病的状態または障害を防止または減速（軽減）することである。
【0061】
次に、本発明は、例として、以下を示す図を参照してさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】図１Ａは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。ＩＬ－１０二量体（上段パネル）およびＩＬ－１０単量体（下段パネル）についてのＩＬ－１０段階的受容体会合の模式図。図１Ｂは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。（Walter, 2014, Josephson et al., 2000）によって記載されたＩＬ－１０二量体およびＩＬ－１０単量体の二次構造機構の模式図。拡張リンカー領域は青色で強調されている。図１Ｃは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。酵母細胞表面に表示されたＩＬ－１０および蛍光標識された組み換え型ＩＬ－１０Ｒβを使用したスクリーニングの表示。図１Ｄは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。酵母に表示された野生型ＩＬ－１０とのＩＬ－１０Ｒα結合（パネル２）およびＩＬ－１０Ｒαの非存在下（パネル３）または存在下（パネル４）でのＩＬ－１０Ｒβ結合。非染色コントロールはパネル１に示されている。図１Ｅは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。各酵母ディスプレイ選択ラウンドで使用されたリガンド条件の概要。選択ラウンドは、１μＭのＩＬ－１０Ｒβおよび１００ｎＭの非ビオチン化ＩＬ－１０Ｒαで開始し、２０ｎＭのＩＬ－１０Ｒβ単独で終了した。図１Ｆは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。ラウンド３選択、ラウンド６選択、およびラウンド８選択における、酵母に表示された野生型ＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβ結合（ＡＦ６４７）の代表的なヒストグラム。ライブラリ選択が進むにつれ、ＩＬ－１０Ｒβの染色性は改善している。図１Ｇは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。ＩＬ－１０Ｒβの最高濃度は、１／３倍段階希釈の７つの濃度のうち１μＭである。非ビオチン化ＩＬ－１０Ｒαを、協同的結合を改善するために１００ｎＭで加えた。図１Ｈは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。高親和性変異体に見出されるアミノ酸変化についての表。野生型配列は黄色で示されている。変異体間で保存された変化は青色で示されている。個々の変異は白色で示されている。図１Ｉは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。パネル１は、（Mendoza et al., 2017）によってＩＬ－１０Ｒβ結合部位であると予測された領域としてヘリックスＡおよびＤが赤色で強調された、野生型ＩＬ－１０構造を示す。パネル２は、変異が紫色で強調された、高親和性変異体Ｒ５Ａ１１の構造を示す。図１Ｉは、酵母表面ディスプレイによる高親和性ＩＬ－１０変異体の作製を示す図である。酵母ディスプレイライブラリからのＧ３クローンに対するＩＬ－１０Ｒβ結合についての用量反応。
【図2】図２Ａは、ＩＬ－１０Ｒβ結合親和性の増加がＩＬ－１０受容体の二量体化を増強することを示す図である。２色１分子共局在化および共追跡による細胞膜における受容体二量体化の定量化。それぞれ単量体ＥＣＦＰおよびＥＧＦＰのＮ末端融合変異体を有するＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβを、ナノボディＥＮＡＴ６４３およびＭＩＲｈｏ１１でそれぞれ標識した。図２Ｂは、ＩＬ－１０Ｒβ結合親和性の増加がＩＬ－１０受容体の二量体化を増強することを示す図である。ＩＬ－１０非存在下（左列）ならびにＷＴＤ存在下（中列）およびＲ５Ａ１１Ｄ存在下（右列）における、それぞれＩＬ－１０Ｒα（青）、ＩＬ－１０Ｒβ（赤）および共局在化ＩＬ－１０Ｒα：ＩＬ－１０Ｒβ（マゼンタ）のトラジェクトリ。図２Ｃは、ＩＬ－１０Ｒβ結合親和性の増加がＩＬ－１０受容体の二量体化を増強することを示す図である。共運動分析によって定量化された、二量体ＩＬ－１０変異体によって誘導されたＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβのヘテロ二量化（左）、ならびにＩＬ－１０Ｒα（中央）およびＩＬ－１０Ｒβ（右）のホモ二量化。各データ点は細胞を表し、各実験の細胞数は箱ひげ図に示されている。図２Ｄは、ＩＬ－１０Ｒβ結合親和性の増加がＩＬ－１０受容体の二量体化を増強することを示す図である。共運動分析によって定量化された、単量体ＩＬ－１０変異体によって誘導されたＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβのホモおよびヘテロ二量化。
【図3】図３Ａは、高親和性変異体が単球におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。ＣＤ１４陽性ＭＡＣＳ選択によりヒトバフィーコートサンプルから単球を単離した。細胞を、Ｍ－ＣＳＦを含む培地中に２日間静置した。その後、細胞を分析前にＩＬ－１０を用いて２４時間刺激した。図３Ｂは、高親和性変異体が単球におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。ＩＬ－１０処理した単球におけるｐＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ１の用量反応。細胞を野生型ＩＬ－１０および高親和性変異体を用いて１５分間刺激した。ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１の活性化を、ホスホフローサイトメトリによって分析した。シグモイド曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてフィッティングした。示したデータは５つの生物学的複製の平均であり、エラーバーは平均の標準誤差を示す。各生物学的複製は、最高濃度の最高ＭＦＩ値を１００％とし、非処理コントロールの最低ＭＦＩ値を０％とすることにより正規化してある。図３Ｃは、高親和性変異体が単球におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。図３Ｂの用量反応曲線からのｐＳＴＡＴ１およびｐＳＴＡＴ３のｌｏｇ１０ＥＣ５０値。各点は１つの生物学的複製を表し、線は平均値、エラーバーはすべての点のうち最小から最大を示す。図３Ｄは、高親和性変異体が単球におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。ＩＬ－１０で刺激した単球におけるｐＳＴＡＴ１対ｐＳＴＡＴ３の比率。比率は、５つの生物学的複製について４０ｎＭでのｐＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ１の活性化の割合を取り、ｐＳＴＡＴ１をｐＳＴＡＴ３の値で割ることによって算出した。各点は１つの生物学的複製を表し、線は平均値、エラーバーはすべての点のうち最小から最大を示す。図３Ｅは、高親和性変異体が単球におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。ＩＬ－１０によって誘導されるｐＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ１の動態。単球は固定前に、示された時間ＩＬ－１０を用いて刺激した。示したデータは４つの生物学的複製の平均であり、エラーバーは平均の標準誤差を示す。各生物学的複製は、１５分での最高ＭＦＩ値を１００％とし、非処理コントロールの最低ＭＦＩ値を０％とすることにより正規化してある。図３Ｆは、高親和性変異体が単球におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。２４時間のＩＬ－１０処理後の単球におけるＨＬＡ－ＤＲ細胞表面発現の測定。各点は１つの生物学的複製（ｎ＝４）を表し、エラーバーは標準偏差を示す。倍率変化は、処理したサンプルのＭＦＩを非ＩＬ－１０処理コントロール（非刺激）で割ることによって、各生物学的複製について算出される。図３Ｇは、高親和性変異体が単球におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。単球を、ＬＰＳを用いてＩＬ－１０の存在下で８時間刺激した。各点は１つの生物学的複製（ｎ＝３）を表し、エラーバーは平均の標準誤差を示す。Ｐ値は両側比率ペアｔ検定により算出。
【図4】図４Ａは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。単球刺激の模式図。ＣＤ１４陽性細胞は、ＭＡＣＳによって３つのヒトバフィーコートから単離し、野生型ＩＬ－１０および高親和性変異体を用いて２４時間刺激する前に、Ｍ－ＣＳＦを含む培地中に２日間静置した。図４Ｂは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。非ＩＬ－１０刺激細胞と比較して、ＩＬ－１０野生型二量体によってｌｏｇ２倍率変化０．６以上に有意にアップレギュレートされた（赤）、およびｌｏｇ２倍率変化－０．６以下に有意にダウンレギュレートされた単球遺伝子のボルカノプロット図。倍率変化は、各ドナーについてＷＴＤ５０ｎＭを非刺激の値で割ることによって算出した。平均倍率変化を算出し、この値のｌｏｇ２をプロットした。Ｐ値≦０．０５は、各ドナーについてＷＴＤ５０ｎＭ／非刺激遺伝子のｌｏｇ２倍率変化の両側不対ｔ検定によって算出した。有意な変化がない遺伝子、またはｌｏｇ２倍率変化が≦０．６≧－０．６の遺伝子は除外した。図４Ｃは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。非刺激細胞と比較して、ＷＴＤ５０ｎＭによってｌｏｇ２倍率変化≧０．６または≦－０．６に有意に制御された単球遺伝子の割合。図４Ｄは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。単球においてＷＴＤ５０ｎＭによって有意にアップ（赤）およびダウン（青）レギュレートされた上位２０個のタンパク質コード遺伝子のｌｏｇ２倍率変化。図４Ｅは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。高用量ＷＴＤと比較した低用量ＷＴＤの活性の割合。ＷＴＤ０．１ｎＭのｌｏｇ２倍率変化をＷＴＤ５０ｎＭで割り、１００を掛けた。高用量活性の≦７５％を示した遺伝子（１８３遺伝子）を赤色で強調している。挿入図は、これらの遺伝子のうち、活性がアップまたはダウンレギュレートされたものの割合を示している。図４Ｆは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＷＴＤ濃度変化への感度が高い１８３遺伝子の遺伝子オントロジー生物学的プロセス分析。図４Ｇは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＷＴＤ５０ｎＭおよび０．１ｎＭについて炎症性サイトカインおよびケモカイン遺伝子のｌｏｇ２倍率変化。図４Ｈは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＷＴＤ５０ｎＭによってｌｏｇ２倍率変化≧－０．６または≦０．６に有意にアップまたはダウンレギュレートされた遺伝子と、それらに対応する、非刺激コントロール細胞と比較したＲ５Ａ１１Ｄ５０ｎＭ、ＷＴＤ０．１ｎＭ、Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭ、Ｒ５Ａ１１Ｍ５０ｎＭおよびＷＴＭ５０ｎＭによるｌｏｇ２倍率変化の、ヒートマップ図。数値は３人のドナーの平均値である。ヒートマップクラスタ分析はＲ ｓｔｕｄｉｏで作成した。図４Ｉは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。それぞれ０．１ｎＭ濃度のＷＴＤ（青）およびＲ５Ａ１１Ｄ（緑）によって制御される遺伝子のボルカノプロット図。ＷＴＤ５０ｎＭによって有意にアップまたはダウンレギュレートされることが既に示されている遺伝子のみをプロットしている。図４Ｊは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭと比較して、ＷＴＤ０．１ｎＭによってアップおよびダウンレギュレートされた上位１０個の遺伝子のヒートマップ図。図４Ｋは、ヒト単球においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＷＴＤ５０ｎＭおよび０．１ｎＭならびにＲ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭによって制御される炎症性サイトカインおよびケモカイン遺伝子のヒートマップ図。
【図5】図５Ａは、高親和性変異体がヒトＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。ヒトバフィーコートサンプルからＰＢＭＣを単離し、ＣＤ８細胞をＣＤ８陽性ＭＡＣＳ選択により精製した。ＰＢＭＣまたは精製ＣＤ８細胞を、ＩＬ－１０の存在下または非存在下で、ＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍＬ）とともに可溶性抗ＣＤ３（１００ｎｇ／ｍＬ）（ＰＢＭＣ）または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（ＣＤ８細胞）を使用して３日間活性化させた。３日目に活性化培地を除去し、細胞集団をＩＬ－２＋／－ＩＬ－１０を含む培地中にさらに２～３日置いた後に分析した。図５Ｂは、高親和性変異体がヒトＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。ＰＢＭＣ集団中の活性化ＣＤ８細胞におけるｐＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ１の用量反応（ＩＬ－１０の非存在下で活性化）。細胞は、ＩＬ－１０野生型および変異体を用いて１５分間刺激する前に、ＩＬ－２を含まない培地中に一晩置いた。示したデータは４つの生物学的複製の平均であり、エラーバーは平均の標準誤差を示す。各生物学的複製は、最高濃度の最高ＭＦＩ値を１００％とし、非処理コントロールの最低ＭＦＩ値を０％とすることにより正規化してある。図５Ｃは、高親和性変異体がヒトＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。図５Ｂの用量反応曲線からのｐＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ１のｌｏｇＥＣ５０値。各点は１つの生物学的複製を表し、線は平均値、バーはすべての点のうち最小から最大を示す。図５Ｄは、高親和性変異体がヒトＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。ＰＢＭＣ集団中のＩＬ－１０刺激したＣＤ８細胞におけるｐＳＴＡＴ１対ｐＳＴＡＴ３の比率。比率は、４つの生物学的複製について４０ｎＭでのｐＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ１の活性化の割合を取り、ｐＳＴＡＴ１をｐＳＴＡＴ３の値で割ることによって算出した。各点は１つの生物学的複製を表し、線は平均値、エラーバーはすべての点のうち最小から最大を意味する。図５Ｅは、高親和性変異体がヒトＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。ＩＬ－１０によって誘導されるｐＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ１の動態。ＰＢＭＣ集団中の非活性化ＣＤ８細胞を固定前に、示した時間ＩＬ－１０を用いて刺激した。示したデータは３つの生物学的複製の平均であり、エラーバーは平均の標準誤差を示す。各生物学的複製は、１５分での最高ＭＦＩ値を１００％とし、非処理コントロールの最低ＭＦＩ値を０％とすることにより正規化してある。図５Ｆは、高親和性変異体がヒトＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０のシグナル伝達能力を改善することを示す図である。ＩＬ－１０存在下での活性化ＣＤ８Ｔ細胞におけるグランザイムＢタンパク質。ＰＢＭＣ集団中のＣＤ８Ｔ細胞を増殖させ、図５Ａに示したように刺激した。その後、細胞を固定し、透過処理し、グランザイムＢタンパク質をフローサイトメトリによって定量化した。各ドナーについて、非ＩＬ－１０処理コントロールに対して正規化することにより、倍率変化を算出した。各点は１つの生物学的複製（ｎ＝８）を表し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図6】図６Ａは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＣＤ８Ｔ細胞刺激の模式図。ＣＤ８Ｔ細胞はＭＡＣＳによって単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズおよびＩＬ－２を用いて、ＩＬ－１０ｗｔおよび変異体の存在下または非存在下で３日間活性化した。３日目に培地をＩＬ－１０ｗｔおよび変異体の存在下または非存在下でＩＬ－２に変更し、細胞をさらに３日間増殖させた。図６Ｂは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。非ＩＬ－１０刺激細胞と比較して、ＩＬ－１０野生型二量体によってｌｏｇ２倍率変化≧０．６に有意にアップレギュレートされた（赤）、およびｌｏｇ２倍率変化≦－０．６に有意にダウンレギュレートされたＣＤ８Ｔ細胞遺伝子のボルカノプロット図。倍率変化は、各ドナーについてＷＴＤ５０ｎＭを非刺激の値で割ることによって算出した。平均倍率変化を算出し、この値のｌｏｇ２をプロットした。Ｐ値≦０．０５は、各ドナーについてＷＴＤ５０ｎＭ／非刺激遺伝子のｌｏｇ２倍率変化の両側不対ｔ検定によって算出した。有意な変化がない遺伝子、またはｌｏｇ２倍率変化が≦０．６≧－０．６の遺伝子は除外した。図６Ｃは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。非刺激細胞と比較して、ＷＴＤ５０ｎＭによってｌｏｇ２倍率変化≧０．６または≦－０．６に有意に制御されたＣＤ８Ｔ細胞遺伝子の割合。図６Ｄは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＣＤ８Ｔ細胞においてＷＴＤ５０ｎＭによって有意にアップ（赤）およびダウン（青）レギュレートされた上位２０個のタンパク質コード遺伝子のｌｏｇ２倍率変化。図６Ｅは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。消耗したＴ細胞に存在することが以前に報告されている遺伝子のヒートマップ図。（Bengsch et al., 2018）からの消耗特異的遺伝子のリストを、ＷＴＤ５０ｎＭによって有意にアップまたはダウンレギュレートされた遺伝子の比較として使用した。以前に報告された遺伝子は、アップレギュレートされた遺伝子については１、ダウンレギュレートされた遺伝子については－１という名目値を与えた。ＷＴＤ５０ｎＭに対するｌｏｇ２倍率変化をプロットした。クラスタ１（Ｃ１）は、消耗した細胞でアップレギュレートされ、ＷＴＤ５０ｎＭによってアップレギュレートされた遺伝子を表す。Ｃ２は、消耗した細胞でアップレギュレートされ、ＷＴＤ５０ｎＭによってダウンレギュレートされた遺伝子を表す。Ｃ３は、消耗した細胞でダウンレギュレートされ、ＷＴＤ５０ｎＭによってアップレギュレートされた遺伝子を表す。Ｃ４は、消耗した細胞でダウンレギュレートされ、ＷＴＤ５０ｎＭによってダウンレギュレートされた遺伝子を表す。図６Ｆは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。各クラスタからの遺伝子のサンプルについて、ＷＴＤ５０ｎＭによって誘導されたｌｏｇ２倍率変化。図６Ｇは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。各ドナーのＩＬ２ＲＡ遺伝子についての、非刺激およびＷＴＤ５０ｎＭ条件でのＲＫＰＭ。図６Ｈは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＩＬ－２によって制御されることが以前に報告された遺伝子（Rollings et al., 2018）について、ＷＴＤ５０ｎＭによって誘導されたｌｏｇ２倍率変化を示すヒートマップ図。図６Ｉは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。高用量ＷＴＤと比較した低用量ＷＴＤの活性の割合。ＷＴＤ０．１ｎＭのｌｏｇ２倍率変化をＷＴＤ５０ｎＭで割り、１００を掛けた。高用量活性の≦７５％であった遺伝子（７８１遺伝子）を赤色で強調している。挿入図は、これらの遺伝子のうち、活性がアップまたはダウンレギュレートされたものの割合を示している。図６Ｊは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。５０ｎＭまたは０．１ｎＭ濃度でのＷＴＤの消耗またはＩＬ－２刺激およびその制御に関連する遺伝子のｌｏｇ２倍率変化。図６Ｋは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＷＴＤ５０ｎＭによってｌｏｇ２倍率変化≧０．６または≦－０．６に有意にアップまたはダウンレギュレートされた遺伝子と、それらに対応する、非刺激コントロール細胞と比較したＲ５Ａ１１Ｄ５０ｎＭ、ＷＴＤ０．１ｎＭ、Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭ、Ｒ５Ａ１１Ｍ５０ｎＭおよびＷＴＭ５０ｎＭによるｌｏｇ２倍率変化の、ヒートマップ図。数値は３人のドナーの平均値である。図６Ｌは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＣＤ８Ｔ細胞において、それぞれ０．１ｎＭ濃度のＷＴＤ（青）およびＲ５Ａ１１Ｄ（緑）によって制御される遺伝子のボルカノプロット図。ＷＴＤ５０ｎＭによって有意にアップまたはダウンレギュレートされることが既に示されている遺伝子のみをプロットしている。図６Ｊは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭおよびＷＴＤ０．１ｎＭによるＣＤ８Ｔ細胞遺伝子の制御の比較。Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化を、ＷＴＤ０．１ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化で割った。Ｒ５Ａ１１Ｄによって制御が増強される遺伝子の割合を赤色で、Ｒ５Ａ１１Ｄによって制御が減少する遺伝子の割合を青色で、Ｒ５Ａ１１ＤとＷＴＤの間で変化がない遺伝子を灰色で示す。図６Ｍは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭと比較して、ＷＴＤ０．１ｎＭによってアップおよびダウンレギュレートされた上位１０個のＣＤ８Ｔ細胞遺伝子のヒートマップ図。図６Ｎは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０および高親和性変異体によって誘導される転写活性の特徴を示す図である。ＷＴＤ５０ｎＭおよび０．１ｎＭならびにＲ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭによって制御される消耗またはＩＬ－２関連遺伝子のヒートマップ図。
【図7】図７Ａは、単球およびＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０による共通遺伝子制御の比較を示す図である。単球およびＣＤ８Ｔ細胞において野生型ＩＬ－１０（５０ｎＭ）によって有意にアップまたはダウンレギュレートされる遺伝子を比較したベン図。ベン図は「Ｖｅｎｎｙ」（Oliveros, 2007-2015）を使用して作成した。図７Ｂは、単球およびＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０による共通遺伝子制御の比較を示す図である。両方の細胞サブセットにおいてＩＬ－１０によって制御される１８１遺伝子の比較。ＣＤ８Ｔ細胞および単球の両方における、ＷＴＤ（５０ｎＭ）／非刺激の各遺伝子のｌｏｇ２倍率変化をプロットしている。両細胞型においてＩＬ－１０によってアップレギュレートされた遺伝子はクラスタ１（Ｃ１）と表記する。ＣＤ８Ｔ細胞ではＩＬ－１０によってアップレギュレートされるが、単球ではＩＬ－１０によってダウンレギュレートされる遺伝子は、クラスタ２（Ｃ２）に分類する。単球ではＩＬ－１０によってアップレギュレートされるが、ＣＤ８Ｔ細胞ではＩＬ－１０によってダウンレギュレートされる遺伝子は、クラスタ３（Ｃ３）に分類する。単球およびＣＤ８Ｔ細胞の両方においてＩＬ－１０によってダウンレギュレートされる遺伝子は、クラスタ４と表記する（Ｃ４）。図７Ｃは、単球およびＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０による共通遺伝子制御の比較を示す図である。各クラスタの遺伝子の例。ＣＤ８Ｔ細胞および単球の両方における、ＷＴＤ（５０ｎＭ）／非刺激のｌｏｇ２倍率変化をプロットしている。各点は１つの生物学的複製を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【図8】図８Ａは、野生型および高親和性ＩＬ－１０単量体および二量体変異体の組換え発現を示す図である。野生型ならびに変異体の単量体および二量体のＦＰＬＣクロマトグラム図。タンパク質はＳ２００ゲルろ過カラムにかけ、サイズ排除により分離した。図８Ｂは、野生型および高親和性ＩＬ－１０単量体および二量体変異体の組換え発現を示す図である。１０％ゲルにかけたＦＰＬＣ精製タンパク質のクマシゲル。
【図9】図９Ａは、高親和性ＩＬ－１０変異体の生物物理学的特徴を示す図である。ビアコア測定のために、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介してＩＬ－１０Ｒβをチップ表面上に固定化し、チップ上に溶液中のＩＬ－１０変異体を流した。図９Ｂおよび図９Ｇは、高親和性ＩＬ－１０変異体の生物物理学的特徴を示す図である。野生型および高親和性ＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβ結合の動態チャートならびに親和性曲線の挿入図。使用した濃度は曲線上に示した。図９Ｃは、高親和性ＩＬ－１０変異体の生物物理学的特徴を示す図である。野生型および高親和性変異体のＩＬ－１０Ｒβ結合のＫＤ値。図９Ｄは、高親和性ＩＬ－１０変異体の生物物理学的特徴を示す図である。ＩＬ－１０Ｒβをチップ表面に固定化し、チップ表面上に溶液中の、ＩＬ－１０Ｒαに予め結合されたＩＬ－１０変異体を流した。使用した濃度は曲線上に示した。図９Ｇは、高親和性ＩＬ－１０変異体の生物物理学的特徴を示す図である。ＩＬ－１０Ｒαの存在下でのＩＬ－１０Ｒβ結合動態。図９Ｆおよび図９Ｈは、高親和性ＩＬ－１０変異体の生物物理学的特徴を示す図である。ＩＬ－１０タンパク質がＩＬ－１０Ｒαに予め結合されている場合のＩＬ－１０Ｒβ結合のＫＤ値。
【図10】図１０Ａは、ＴＩＲＦ顕微鏡によるＩＬ－１０受容体の１分子イメージングを示す図である。異所性発現ＩＬ－１０Ｒα（青）およびＩＬ－１０Ｒβ（赤）の細胞表面受容体密度。ｎ＝２０細胞。図１０Ｂは、ＴＩＲＦ顕微鏡によるＩＬ－１０受容体の１分子イメージングを示す図である。ＩＬ－１０Ｒα（青）、ＩＬ－１０Ｒβ（赤）および共運動受容体（マゼンタ）の、二量体および単量体ＩＬ－１０変異体の非存在下または存在下での拡散係数。ＷＴＤ：ｎ＝２０細胞、Ｒ５Ａ１１Ｄ：ｎ＝１６細胞、ＷＴＭ：ｎ＝１９細胞、Ｒ５Ａ１１Ｍ：ｎ＝１８細胞、非刺激：ｎ＝１０細胞。
【図11】図１１は、ヒト単球におけるＩＬ－１０および変異体の拡張動態を示す図である。３日間の単球のｐＳＴＡＴ３／１動態。単球を固定前に、示された時間ＩＬ－１０を用いて刺激した。示したデータは４つの生物学的複製の平均であり、エラーバーは平均の標準誤差を示す。各生物学的複製は、１５分での最高ＭＦＩ値を１００％とし、非処理コントロールの最低ＭＦＩ値を０％とすることにより正規化してある。
【図12】図１２Ａは、ヒト単球においてＩＬ－１０野生型および高親和性変異体によって誘導された遺伝子発現プロファイルの分析を示す図である。ヒト単球において、ＷＴＤ５０ｎＭによってｌｏｇ２倍率変化≧０．６または≦－０．６に有意にアップまたはダウンレギュレートされた遺伝子のＫＥＧＧおよびＧＯ経路分析。経路分析は、ＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ機能アノテーションツール（Huang da et al., 2009a, Huang da et al., 2009b）を使用して行った。図１２Ｂは、ヒト単球においてＩＬ－１０野生型および高親和性変異体によって誘導された遺伝子発現プロファイルの分析を示す図である。選択された、代謝経路、サイトカインおよびケモカイン、ＣＤならびにインターフェロン関連遺伝子の、ＷＴＤ（５０ｎＭ）刺激によるｌｏｇ２倍率変化発現を示すヒートマップ図。図１２Ｃは、ヒト単球においてＩＬ－１０野生型および高親和性変異体によって誘導された遺伝子発現プロファイルの分析を示す図である。５０ｎＭのＷＴＤ、ＷＴＭ、およびＲ５Ａ１１Ｍ、ならびに０．１ｎＭ濃度のＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｄによる遺伝子の発現におけるｌｏｇ２倍率変化の比較。図１２Ｄは、ヒト単球においてＩＬ－１０野生型および高親和性変異体によって誘導された遺伝子発現プロファイルの分析を示す図である。Ｒ５Ａ１１Ｍ５０ｎＭおよびＷＴＤ５０ｎＭによる単球遺伝子の制御の比較。Ｒ５Ａ１１Ｍ５０ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化を、ＷＴＤ５０ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化で割った。Ｒ５Ａ１１Ｍによって制御が増強される遺伝子の割合を赤色で、Ｒ５Ａ１１Ｍによって制御が減少する遺伝子の割合を青色で、Ｒ５Ａ１１ＭとＷＴＤの間で変化がない遺伝子を灰色で示す。図１２Ｅは、ヒト単球においてＩＬ－１０野生型および高親和性変異体によって誘導された遺伝子発現プロファイルの分析を示す図である。Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭおよびＷＴＤ０．１ｎＭによる遺伝子の制御の比較。Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化を、ＷＴＤ０．１ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化で割った。Ｒ５Ａ１１Ｄによって制御が増強される遺伝子の割合を赤色で、Ｒ５Ａ１１Ｄによって制御が減少する遺伝子の割合を青で、Ｒ５Ａ１１ＤとＷＴＤの間で変化がない遺伝子を灰色で示す。
【図13】図１３Ａは、ＩＬ－１０処理ＣＤ８Ｔ細胞の表現型の特徴を示す図である。ＰＢＭＣ集団中のＣＤ８細胞および精製ＣＤ８細胞について、２４時間の活性化後にＣＤ６９を、６日間の活性化および増殖後にＣＤ７１を染色した。消耗マーカーＰＤ－１およびＬＡＧ３を、６日間の活性化および増殖後に分析した。各ドナーについて、ＩＬ－１０刺激ＭＦＩ値を非ＩＬ－１０刺激コントロールで割ることによって、倍率変化を算出した。各点は１人のドナーを表す。図１３Ｂは、ＩＬ－１０処理ＣＤ８Ｔ細胞の表現型の特徴を示す図である。ＰＢＭＣ集団中のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖について、６日間の活性化／増殖後に分析した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の細胞数を取り、ＩＬ－１０処理細胞を、同じドナーからの非ＩＬ－１０処理コントロール集団で割ることによって倍率変化を算出した。各点は１つの生物学的複製を表し、ｐ値は両側ペアｔ検定を使用して算出した。図１３Ｃは、ＩＬ－１０処理ＣＤ８Ｔ細胞の表現型の特徴を示す図である。精製集団中のＣＤ８Ｔ細胞について、グランザイムＢを染色した。ＰＢＭＣ集団中のＣＤ８細胞および精製ＣＤ８細胞の両方について、各生物学的複製内で非ＩＬ－１０処理コントロール（ＴＣＲ刺激）に対して正規化することによって、グランザイムＢの倍率変化を算出した。精製ＣＤ８細胞集団からｍＲＮＡを単離し、ｇｚｍｂ ｍＲＮＡをＲＴｑＰＣＲによって定量化した。倍率変化は、非ＩＬ－１０処理コントロールで割ることによって算出した。各点は１つの生物学的複製を表し、ｐ値は両側ペアｔ検定を使用して算出した。
【図14】図１４Ａは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０野生型および高親和性変異体によって誘導された遺伝子発現プロファイルの分析を示す図である。ヒトＣＤ８Ｔ細胞において、ＷＴＤ５０ｎＭによってｌｏｇ２倍率変化≧０．６または≦－０．６に有意にアップまたはダウンレギュレートされた遺伝子のＫＥＧＧおよびＧＯ経路分析。経路分析は、ＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ機能アノテーションツール（Huang da et al., 2009a, Huang da et al., 2009b）を使用して行った。図１４Ｂは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０野生型および高親和性変異体によって誘導された遺伝子発現プロファイルの分析を示す図である。５０ｎＭのＷＴＤ、ＷＴＭ、およびＲ５Ａ１１Ｍ、ならびに０．１ｎＭのＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｄによるサイトカインおよびケモカイン遺伝子、ＣＤマーカー遺伝子、ＩＬ－２関連遺伝子、ならびにＭＡＰＫシグナル伝達遺伝子の制御のヒートマップ比較。図１４Ｃは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０野生型および高親和性変異体によって誘導された遺伝子発現プロファイルの分析を示す図である。Ｒ５Ａ１１Ｍ５０ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化を、ＷＴＤ５０ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化で割った。Ｒ５Ａ１１Ｍによって制御が増強される遺伝子の割合を赤色で、Ｒ５Ａ１１Ｍによって制御が減少する遺伝子の割合を青色で、Ｒ５Ａ１１ＭとＷＴＤの間で変化がない遺伝子を灰色で示す。図１４Ｄは、ヒトＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０野生型および高親和性変異体によって誘導された遺伝子発現プロファイルの分析を示す図である。Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭおよびＷＴＤ０．１ｎＭによる遺伝子の制御の比較。Ｒ５Ａ１１Ｄ０．１ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化を、ＷＴＤ０．１ｎＭ／非刺激のｌｏｇ２倍率変化で割った。Ｒ５Ａ１１Ｄによって制御が増強される遺伝子の割合を赤色で、Ｒ５Ａ１１Ｄによって制御が減少する遺伝子の割合を青色で、Ｒ５Ａ１１ＤとＷＴＤの間で変化がない遺伝子を灰色で示す。
【実施例】
【0063】
材料および方法：
タンパク質発現および精製
単量体野生型ＩＬ－１０（Josephson et al., 2000）、単量体高親和性変異体およびＩＬ－１０Ｒα外部ドメイン（アミノ酸２２～２３５）を、（Martinez-Fabregas et al., 2019）に記載のようにクローニングし発現させた。簡潔には、タンパク質配列を、タンパク質分泌を駆動するＮ末端ｇｐ６７シグナル配列、およびＣ末端ヘキサヒスチジンタグとともにｐＡｃＧＰ６７－Ａベクター（ＣＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中にインフレームでクローニングした。（LaPorte et al., 2008）に概説されているように、タンパク質産生にはバキュロウイルス発現系を使用した。ＳＦ９００ＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９）細胞にトランスフェクトしてＰ０バキュロウイルス株を作製し、その後それをＳＦ９細胞中で増殖させてＰ１ウイルス株を作製した。タンパク質発現は、ＩｎｓｅｃｔＸｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ）中で増殖させた細胞を用いて、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ ｎｉ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）を使用して実施した。
タンパク質発現および精製
単量体野生型ＩＬ－１０（Josephson et al., 2000）、単量体高親和性変異体およびＩＬ－１０Ｒα外部ドメイン（アミノ酸２２～２３５）を、（Martinez-Fabregas et al., 2019）に記載のようにクローニングし発現させた。簡潔には、タンパク質配列を、タンパク質分泌を駆動するＮ末端ｇｐ６７シグナル配列、およびＣ末端ヘキサヒスチジンタグとともにｐＡｃＧＰ６７－Ａベクター（ＣＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中にインフレームでクローニングした。（LaPorte et al., 2008）に概説されているように、タンパク質産生にはバキュロウイルス発現系を使用した。ＳＦ９００ＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９）細胞にトランスフェクトしてＰ０バキュロウイルス株を作製し、その後それをＳＦ９細胞中で増殖させてＰ１ウイルス株を作製した。タンパク質発現は、ＩｎｓｅｃｔＸｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ）中で増殖させた細胞を用いて、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ ｎｉ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）を使用して実施した。
【0064】
精製は、Sprangler et al (2019)に記載された方法を使用して実施した。簡潔には、最終濃度２００ｍＭ、５０ｍＭおよび１ｍＭまでＴｒｉｓ ｐＨ８．０、ＣａＣｌ２およびＮｉＣｌを添加することによる沈殿ステップの前に、２０００ｒｐｍでの遠心分離を用いて細胞をペレット化した。その後、形成された沈殿物を６０００ｒｐｍで遠心分離して除去した。ニッケルＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、バッチ結合と、その後のＨＢＳ、２００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２でのカラム溶出を通じて標的タンパク質を精製した。標的タンパク質を濃縮し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＥＮｒｉｃｈ ＳＥＣ ６５０ ３００カラム（Ｂｉｏｒａｄ）上でサイズ排除クロマトグラフィによりさらに精製した。ＩＬ－１０Ｒαは、メーカーのプロトコルに従ってＥＺ＝Ｌｉｎｋ ＮＨＳビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してビオチン化した。
【0065】
ビオチン化ＩＬ－１０Ｒβの発現のために、外部ドメイン（アミノ酸２０～２２０）を、Ｃ末端ビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）－ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＷに続いてヘキサヒスチジンタグを有するｐＡｃＧＰ６７－Ａベクター中にクローニングした。精製タンパク質はＢｉｒＡリガーゼを用いてビオチン化した。
【0066】
二量体野生型ＩＬ－１０および二量体高親和性変異体の発現のために、合成遺伝子ブロック（ＩＤＴ）を、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグおよびｌａｃプロモータとともにインフレームでｐＥＴ２１ベクター中にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）を使用してタンパク質の産生を誘導し、その後３７℃で３～５時間インキュベートした。細胞は６０００ｘｇで１５分間遠心分離することにより回収した。細胞ペレットは、元の培養液１リットルあたり、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦに再懸濁し、－８０℃で一晩凍結させた。
【0067】
組換えタンパク質を封入体として発現させ、その精製を次のように実施した。細胞を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２５００単位ベンゾナーゼ、１０ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＰＭＳＦに溶解し、室温で撹拌しながら２０分間インキュベートした。その後、最終濃度１０ｍＭのＥＤＴＡを懸濁液に加え、細胞を氷浴中で超音波処理（１５秒間オン／オフを８～１０サイクル、１５ミクロン、Ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０）した。この溶液を７０００ｘｇで１５分間遠心分離し（４℃）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦに再懸濁した。このステップを、調製物が白く見えるようになるまで、少なくとも合計３回の洗浄を繰り返した。その後、最終ペレットを、界面活性剤を含まない緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）で１回洗浄した。
【0068】
精製した封入体を、元の培養液１リットルあたり１０ｍＬの６Ｍ ＧｕＨＣｌ中で、室温で３０分間可溶化した。この溶液を７０００ｒｃｆで１５分間遠心分離して清澄化し、可溶化したタンパク質を慎重にデカントした。リフォールディングは、リフォールディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ還元グルタチオン（ＧＳＨ）、および０．２ｍＭ酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ））に、可溶化タンパク質溶液を溶液：緩衝液が１：２０の比率で、４℃で滴下して実施し、その後穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベーションすることにより行った。
【0069】
その後溶液をろ過して沈殿物を除去し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して、１４ｋＤａ Ｍｗｔカットオフの透析膜を使用して透析を実施した。
【0070】
透析後、Ｎｉ－ＮＴＡビーズの使用、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除によって、タンパク質をさらに精製した。その後、エンドトキシンの除去を実施した。１ｍＬのＮｉ－ＮＴＡアガロースをｐｏｌｙｐｒｅｐカラムに加え、タンパク質を加える前に１０ｍＬのＨＢＳで平衡化した。５０カラム容量の氷冷ＨＢＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１１４（ｐＨ Ｘ）を用いてカラムを洗浄して、エンドトキシンを除去した。その後、さらに２０カラム容量のＨＢＳ、２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ Ｘ）を用いてカラムを洗浄した。エンドトキシンを含まなくなったタンパク質を、４カラム容量のＨＢＳ、２００ｍＭイミダゾール（ｐＨ Ｘ）を使用して溶出した。ＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に緩衝液交換した。エンドトキシンレベルは、ＰｉｅｒｃｅＬＡＬ発色性エンドトキシン定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、メーカーのプロトコルに従って測定した。すべてのタンパク質について、エンドトキシンレベルはキットの検出レベル未満であった。
【0071】
表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴を使用して、組換え産生された単量体ＩＬ－１０野生型および変異体の、ＩＬ－１０Ｒαの存在下または非存在下でのＩＬ－１０Ｒβへの結合親和性を求めた。ビオチン化ＩＬ－１０Ｒβを、ストレプトアビジンを介してチップ表面上に固定化した。シリーズＳセンサＳＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）チップは、ビオチン化受容体の固定化前に、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＴＷＥＥＮ－２０中でプライミングした。その後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ－２０、および０．５％ＢＳＡ中で分析ランを実施した。測定にはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｔ２００ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｈａｎｃｅｄ）を使用し、データ分析にはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．０を使用した。
表面プラズモン共鳴を使用して、組換え産生された単量体ＩＬ－１０野生型および変異体の、ＩＬ－１０Ｒαの存在下または非存在下でのＩＬ－１０Ｒβへの結合親和性を求めた。ビオチン化ＩＬ－１０Ｒβを、ストレプトアビジンを介してチップ表面上に固定化した。シリーズＳセンサＳＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）チップは、ビオチン化受容体の固定化前に、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＴＷＥＥＮ－２０中でプライミングした。その後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ－２０、および０．５％ＢＳＡ中で分析ランを実施した。測定にはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｔ２００ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｈａｎｃｅｄ）を使用し、データ分析にはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．０を使用した。
【0072】
細胞培養
ヒトバフィーコートはスコットランド国立輸血サービスから入手し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は密度勾配遠心分離（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって単離した。ＰＢＭＣは、ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ｖ／ｖＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）ならびに増殖および活性化用のサイトカイン中で増殖させた。ＩＬ－１０変異体の非存在下または存在下で３日間、培地に１００ｎｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（ヒトＵｌｔｒａＬＥＡＦ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を添加した。３日間の活性化後に細胞を遠心分離し、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２＋または－ＩＬ－１０変異体を添加した培地に再懸濁した。細胞集団は２～３日かけて増殖させた。
ヒトバフィーコートはスコットランド国立輸血サービスから入手し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は密度勾配遠心分離（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって単離した。ＰＢＭＣは、ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ｖ／ｖＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）ならびに増殖および活性化用のサイトカイン中で増殖させた。ＩＬ－１０変異体の非存在下または存在下で３日間、培地に１００ｎｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（ヒトＵｌｔｒａＬＥＡＦ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を添加した。３日間の活性化後に細胞を遠心分離し、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２＋または－ＩＬ－１０変異体を添加した培地に再懸濁した。細胞集団は２～３日かけて増殖させた。
【0073】
単球は、ＣＤ１４陽性選択を使用してＰＢＭＣ集団から単離した。抗ＣＤ１４ＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３６７１１６）を使用して細胞を染色し、メーカーのプロトコル（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に従って磁気分離により単離を行った。次に単球を、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加した完全なＲＰＭＩ（上記のとおり）中で培養した。その後、ＩＬ－１０変異体を用いて、分析前に２４時間細胞を刺激した。
【0074】
ＣＤ８Ｔ細胞は、抗ＣＤ８ａＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０９０６）を用いて染色した後、磁気分離（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によってＰＢＭＣから単離した。精製したＣＤ８Ｔ細胞の活性化には、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔヒトＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞アクティベータ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）をメーカーのプロトコルに従って使用するとともに、２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２およびＩＬ－１０変異体を加えた。細胞を３日間活性化した後、培地を２０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２およびＩＬ－１０変異体を添加した完全なＲＰＭＩに２～３日間交換した。
【0075】
フローサイトメトリ染色および抗体
ＨＬＡ－ＤＲＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０７６０５）の生細胞表面染色のために、非接着単球を遠心分離によって培養液から除去し、冷ＰＢＳに再懸濁した。接着単球は、アキュターゼ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を室温で５から１０分間使用して剥離させた。生細胞表面マーカー染色中、細胞は４℃または氷上に保ち、特に断らない限り染色は９６ウェルｖボトムプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ）中で行った。非接着細胞および剥離細胞を組み合わせ、１条件につき５０μＬの容量でＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に４℃で１０分間再懸濁した。細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄し、ＦｃＲブロッキング試薬で１／１００に希釈した抗体混合物５０μＬに再懸濁した。抗体のインキュベーションは４℃、暗所で３０から６０分間行った。細胞は２回洗浄後、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析するために、ウェルあたり１００μＬに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をすべての集団について定量化した。ＩＬ－１０処理細胞のＭＦＩを同じドナーの非ＩＬ－１０処理コントロールで割ることによって、各ドナー内でデータを正規化して倍率変化を算出した。
ＨＬＡ－ＤＲＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０７６０５）の生細胞表面染色のために、非接着単球を遠心分離によって培養液から除去し、冷ＰＢＳに再懸濁した。接着単球は、アキュターゼ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を室温で５から１０分間使用して剥離させた。生細胞表面マーカー染色中、細胞は４℃または氷上に保ち、特に断らない限り染色は９６ウェルｖボトムプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ）中で行った。非接着細胞および剥離細胞を組み合わせ、１条件につき５０μＬの容量でＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に４℃で１０分間再懸濁した。細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄し、ＦｃＲブロッキング試薬で１／１００に希釈した抗体混合物５０μＬに再懸濁した。抗体のインキュベーションは４℃、暗所で３０から６０分間行った。細胞は２回洗浄後、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析するために、ウェルあたり１００μＬに再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をすべての集団について定量化した。ＩＬ－１０処理細胞のＭＦＩを同じドナーの非ＩＬ－１０処理コントロールで割ることによって、各ドナー内でデータを正規化して倍率変化を算出した。
【0076】
グランザイムＢ細胞内染色のために、活性化６日目のＰＢＭＣまたはＣＤ８細胞のいずれかを室温で１０分間２％パラホルムアルデヒドを用いて固定した後、ＰＢＳで洗浄した。細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００／ＰＢＳ中で１０分間透過処理し、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄した。細胞は洗浄前に、１／１００希釈の抗ＣＤ８ａＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００９２０）、抗ＣＤ４ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３５７４０４）、抗ＣＤ３ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ５１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００４４８）および抗グランザイムＢＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃５１５４０３）を用いて１時間染色した。ＭＦＩをすべての集団について定量化し、正規化は上記のように行った。
【0077】
ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のホスホフロー分析のために、９６ウェルｖボトムプレートに細胞懸濁液５０μＬ／ウェル、密度２×１０４細胞／ウェルで細胞を蒔いた。用量反応試験のため、７倍段階希釈したＩＬ－１０変異体および非刺激コントロール（５０μＬ／ウェル）を用いて、細胞を３７℃で１５分間刺激した後、２％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。動態試験のために、細胞を飽和濃度のＩＬ－１０変異体（５０ｎＭ）を用いて規定の時点で刺激した後、２％パラホルムアルデヒドを用いて同時に固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷１００％メタノールで透過処理し、氷上で最低３０分間インキュベートした。細胞は、（Krutzik and Nolan, 2006; Martinez-Fabregas et al., 2019）に記載のように蛍光バーコード化した。簡潔には、２つのＮＨＳ－色素（Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｌｕｅおよびＤｙＬｉｇｈｔ８００、Ｔｈｅｒｍｏ）の１６の組み合わせのパネルを使用して、氷上で個々のウェルを３５分間染色した後、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄することによって反応を停止させた。バーコード化したらすぐに１６の集団を抗体染色のために合わせてプールした。ＰＢＭＣ、ＣＤ８細胞および単球を、上記の細胞表面マーカー、ならびに抗ｐＳＴＡＴ３Ａｌｅｘａ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃６５１００６）および抗ｐＳＴＡＴ１Ａｌｅｘａ６４７（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃８００９）を用いて染色した。取得中に、個々の集団をバーコードパターンに従って識別し、すべての集団についてｐＳＴＡＴ３Ａｌｅｘａ４８８およびｐＳＴＡＴ１Ａｌｅｘａ６４７のＭＦＩを定量化した。ＭＦＩをプロットし、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７、ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してシグモイド用量反応曲線をフィッティングした。データは、各ドナーグループ内で、すべての刺激の最高濃度の最高ＭＦＩを１００％とし、最低ＭＦＩを０％とすることにより正規化した。
【0078】
酵母ディスプレイライブラリ
酵母表面ディスプレイプロトコルは、以前のプロトコル（Boder and Wittrup, 1997; Martinez-Fabregas et al., 2019）から応用した。ＩＬ－１０酵母ディスプレイライブラリを作成するために、単量体ＩＬ－１０遺伝子（Josephson et al., 2000）を、（Mendoza et al., 2017）に記載されているように、エラープローンＰＣＲに供した。次いで、この生成物を増幅し、線形化ｐＣＴ３０２ベクターとともに出芽酵母株ＥＢＹ１００に形質転換し、選択的デキストロースカザミノ酸（ＳＤＣＡＡ）培地中で３０℃、２日間増殖させた。次いで、酵母細胞を、（Chao et al., 2006）に記載されているように、選択的ガラクトースカザミノ酸（ＳＧＣＡＡ）中に２０℃で２日間置いて、ＩＬ－１０変異体の細胞表面発現を誘導した。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、他の系について以前に記載されたように（Moraga et al., 2015b）、ＩＬ－１０Ｒβに対する結合親和性が高いＩＬ－１０変異体を選択した。簡潔には、高濃度のストレプトアビジンビーズを使用し第１の選択ラウンドを実施して、ストレプトアビジンと結合することが可能な変異体を表示する任意の酵母を除去した。第２の選択ラウンドでは、表示されたタンパク質が確実に適切に折り畳まれているようにしながら、Ｃ末端にｃ－ｍｙｃタグを有する変異体を表示する酵母を選択した。その後の選択ラウンドは、誘導された酵母を、組換え産生されたビオチン化ＩＬ－１０Ｒβの濃度を漸減させながらともに２時間インキュベートし、続いて、蛍光標識ストレプトアビジン（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）とともに１５分間インキュベートすることにより行った。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって、ＩＬ－１０Ｒβと結合することが可能なＩＬ－１０変異体を表示する酵母を選択した。結合に必要なＩＬ－１０Ｒβの濃度が野生型単量体ＩＬ－１０と比較して十分に低下したら、酵母をＳＤＣＡＡ寒天に蒔き、用量反応試験のために単一コロニーを単離して変異体のＥＣ５０値を求めた。
酵母表面ディスプレイプロトコルは、以前のプロトコル（Boder and Wittrup, 1997; Martinez-Fabregas et al., 2019）から応用した。ＩＬ－１０酵母ディスプレイライブラリを作成するために、単量体ＩＬ－１０遺伝子（Josephson et al., 2000）を、（Mendoza et al., 2017）に記載されているように、エラープローンＰＣＲに供した。次いで、この生成物を増幅し、線形化ｐＣＴ３０２ベクターとともに出芽酵母株ＥＢＹ１００に形質転換し、選択的デキストロースカザミノ酸（ＳＤＣＡＡ）培地中で３０℃、２日間増殖させた。次いで、酵母細胞を、（Chao et al., 2006）に記載されているように、選択的ガラクトースカザミノ酸（ＳＧＣＡＡ）中に２０℃で２日間置いて、ＩＬ－１０変異体の細胞表面発現を誘導した。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、他の系について以前に記載されたように（Moraga et al., 2015b）、ＩＬ－１０Ｒβに対する結合親和性が高いＩＬ－１０変異体を選択した。簡潔には、高濃度のストレプトアビジンビーズを使用し第１の選択ラウンドを実施して、ストレプトアビジンと結合することが可能な変異体を表示する任意の酵母を除去した。第２の選択ラウンドでは、表示されたタンパク質が確実に適切に折り畳まれているようにしながら、Ｃ末端にｃ－ｍｙｃタグを有する変異体を表示する酵母を選択した。その後の選択ラウンドは、誘導された酵母を、組換え産生されたビオチン化ＩＬ－１０Ｒβの濃度を漸減させながらともに２時間インキュベートし、続いて、蛍光標識ストレプトアビジン（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）とともに１５分間インキュベートすることにより行った。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって、ＩＬ－１０Ｒβと結合することが可能なＩＬ－１０変異体を表示する酵母を選択した。結合に必要なＩＬ－１０Ｒβの濃度が野生型単量体ＩＬ－１０と比較して十分に低下したら、酵母をＳＤＣＡＡ寒天に蒔き、用量反応試験のために単一コロニーを単離して変異体のＥＣ５０値を求めた。
【0079】
有望なＩＬ－１０変異体を表示する酵母コロニーをＺｙｍｏｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ）に供してプラスミドを単離し、これを次にコンピテントＤＨ５α大腸菌にヒートショックし、プラスミドを配列決定して単量体ＩＬ－１０遺伝子中のどこに変異が生じたかを観察した。次いで、これらの遺伝子をバキュロウイルス発現ベクターｐＡＣｇｐ６７ＢＮ中にクローニングし、上記のように組換え発現させた。
【0080】
ＩＬ－６分泌の測定
単球をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）（大腸菌Ｏ２６：Ｂ６、Ｓｉｇｍａ）＋様々な濃度のＩＬ－１０変異体を用いて８時間刺激した。次いで上清を除去し、ＩＬ－６検出のための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用した（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４３０５０１）。メーカーのプロトコルに従った。９６ウェルハーフエリアプレート（Ｓｉｇｍａ）に捕捉抗体をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄し、アッセイ希釈液で１時間ブロッキングし、洗浄した。上清をアッセイバッファで１対１０に希釈した後、プレートに加えた。プレートを室温で２時間振とうしながらインキュベートした。プレートを再度洗浄し、検出抗体とともに１時間インキュベートした。洗浄後、アビジン－ＨＲＰを加え、３０分間インキュベートし、続いてＴＭＢ基質溶液とともに１５分間インキュベートした。Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍおよび５７０ｎｍの吸光度を測定し、５７０ｎｍの吸光度を４５０ｎｍから差し引いた。
単球をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）（大腸菌Ｏ２６：Ｂ６、Ｓｉｇｍａ）＋様々な濃度のＩＬ－１０変異体を用いて８時間刺激した。次いで上清を除去し、ＩＬ－６検出のための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用した（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４３０５０１）。メーカーのプロトコルに従った。９６ウェルハーフエリアプレート（Ｓｉｇｍａ）に捕捉抗体をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートはＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄し、アッセイ希釈液で１時間ブロッキングし、洗浄した。上清をアッセイバッファで１対１０に希釈した後、プレートに加えた。プレートを室温で２時間振とうしながらインキュベートした。プレートを再度洗浄し、検出抗体とともに１時間インキュベートした。洗浄後、アビジン－ＨＲＰを加え、３０分間インキュベートし、続いてＴＭＢ基質溶液とともに１５分間インキュベートした。Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍおよび５７０ｎｍの吸光度を測定し、５７０ｎｍの吸光度を４５０ｎｍから差し引いた。
【0081】
ＲＮＡトランスクリプトーム配列決定
それぞれ３人のドナーから得たヒト初代単球およびＣＤ８Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、上記のように刺激した。細胞は、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、保存のため瞬間凍結した。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用してメーカーのプロトコルに従って単離した。すべてのＲＮＡの２６０／２８０比は１．９超であった。１サンプルあたり１μｇのＲＮＡを使用した。トランスクリプトーム分析はＮｏｖｏｇｅｎｅ社が次のように行った。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＵｌｔｒａＴＭ ＲＮＡＬｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（ＮＥＢ、アメリカ合衆国）を使用して、メーカーの推奨に従ってシーケンスライブラリを作成し、インデックスコードを加えて各サンプルに配列を帰属させた。簡潔には、ポリＴオリゴ結合磁性ビーズを使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｆｉｒｓｔ ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ反応バッファ（５Ｘ）中で、高温下で二価カチオンを使用して断片化を行った。ランダム六量体プライマおよびＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＲＮａｓｅ Ｈ－）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮａｓｅ Ｈを使用して第２鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。残ったオーバーハングはエキソヌクレアーゼ／ポリメラーゼ活性を介して平滑末端に変換した。ＤＮＡ断片の３′末端をアデニル化した後、ヘアピンループ構造を有するＮＥＢＮｅｘｔアダプタを連結して、ハイブリダイゼーションのために調製した。優先的に長さ１５０～２００ｂｐのｃＤＮＡ断片を選択するため、ＡＭＰｕｒｅＸＰシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ビバリー、アメリカ合衆国）を用いてライブラリ断片を精製した。次いで、３μＬのＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ、アメリカ合衆国）を、サイズ選択してアダプタを連結したｃＤＮＡとともに３７℃で１５分間、続いて９５℃で５分間、ＰＣＲの前に使用した。その後、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルＰＣＲプライマおよびインデックス（Ｘ）プライマを用いてＰＣＲを実施した。最後に、ＰＣＲ生成物を精製し（ＡＭＰｕｒｅＸＰシステム）、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザ２１００システムでライブラリの品質を評価した。
それぞれ３人のドナーから得たヒト初代単球およびＣＤ８Ｔ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、上記のように刺激した。細胞は、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、保存のため瞬間凍結した。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用してメーカーのプロトコルに従って単離した。すべてのＲＮＡの２６０／２８０比は１．９超であった。１サンプルあたり１μｇのＲＮＡを使用した。トランスクリプトーム分析はＮｏｖｏｇｅｎｅ社が次のように行った。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＵｌｔｒａＴＭ ＲＮＡＬｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（ＮＥＢ、アメリカ合衆国）を使用して、メーカーの推奨に従ってシーケンスライブラリを作成し、インデックスコードを加えて各サンプルに配列を帰属させた。簡潔には、ポリＴオリゴ結合磁性ビーズを使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｆｉｒｓｔ ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ反応バッファ（５Ｘ）中で、高温下で二価カチオンを使用して断片化を行った。ランダム六量体プライマおよびＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＲＮａｓｅ Ｈ－）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮａｓｅ Ｈを使用して第２鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。残ったオーバーハングはエキソヌクレアーゼ／ポリメラーゼ活性を介して平滑末端に変換した。ＤＮＡ断片の３′末端をアデニル化した後、ヘアピンループ構造を有するＮＥＢＮｅｘｔアダプタを連結して、ハイブリダイゼーションのために調製した。優先的に長さ１５０～２００ｂｐのｃＤＮＡ断片を選択するため、ＡＭＰｕｒｅＸＰシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ビバリー、アメリカ合衆国）を用いてライブラリ断片を精製した。次いで、３μＬのＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ、アメリカ合衆国）を、サイズ選択してアダプタを連結したｃＤＮＡとともに３７℃で１５分間、続いて９５℃で５分間、ＰＣＲの前に使用した。その後、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルＰＣＲプライマおよびインデックス（Ｘ）プライマを用いてＰＣＲを実施した。最後に、ＰＣＲ生成物を精製し（ＡＭＰｕｒｅＸＰシステム）、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザ２１００システムでライブラリの品質を評価した。
【0082】
ＲＮＡ配列データ分析
品質管理、基準ゲノムへのマッピングおよび定量化のための一次データ分析は、Ｎｏｖｏｇｅｎｅ社が以下に概説するように行った。
品質管理、基準ゲノムへのマッピングおよび定量化のための一次データ分析は、Ｎｏｖｏｇｅｎｅ社が以下に概説するように行った。
【0083】
品質管理：まずＦＡＳＴＱ形式の生データ（生リード）を、社内スクリプトを通じて処理した。このステップでは、生データからアダプタ配列およびポリＮ配列を含むリードならびに低品質のリードを除去することにより、クリーンデータ（クリーンリード）を得た。同時に、クリーンデータのＱ２０、Ｑ３０およびＧＣ含有量を算出した。下流の分析はすべて高品質のクリーンデータに基づいて行った。
【0084】
基準ゲノムへのマッピング：基準ゲノムおよび遺伝子モデルのアノテーションファイルは、ゲノムウェブサイトブラウザ（ＮＣＢＩ／ＵＣＳＣ／Ｅｎｓｅｍｂｌ）から直接ダウンロードした。ＨＩＳＡＴ２ソフトウェアを使用して、ペアエンドクリーンリードを基準ゲノムにマッピングした。ＨＩＳＡＴ２は、合わせるとゲノム全体を網羅する、小さなＧＦＭインデックスの大規模なセットを使用する。これらの小さなインデックス（ローカルインデックスと呼ばれる）をいくつかのアライメント戦略と組み合わせることで、シーケンシングリードの迅速かつ正確なアライメントが可能になる。
【0085】
定量化：ＨＴＳｅｑを使用して、既知および新規の遺伝子を含む各遺伝子のマッピングされたリード数を数えた。次いで、遺伝子の長さとその遺伝子にマップされたリード数に基づいて各遺伝子のＲＰＫＭを算出した。ＲＰＫＭ（リード／キロベースエキソンモデル／１００万マップリード）は、リード数に対するシーケンシングの深さおよび遺伝子長の効果を同時に考慮し、現在最も一般的に使用される遺伝子発現レベル推定法である。
【0086】
統計分析は筆者らがＥｘｃｅｌで行った。各ドナー内でＩＬ－１０刺激発現レベルを非刺激コントロールで割ることにより、倍率変化を算出した。平均の倍率変化を、３人のドナーにわたって各刺激について算出し、次いでこの平均のｌｏｇ２を算出した。有意に変化した遺伝子の算出のために、各ドナーのＩＬ－１０刺激と非刺激の発現レベル間の倍率変化のｌｏｇ２を別々に算出し、不対両側ｔ検定を使用してｐ値を生成した。その後このｐ値のｌｏｇ１０を、先に算出したｌｏｇ２平均倍率変化に対してプロットした。野生型ＩＬ－１０二量体（ＷＴＤ）５０ｎＭ条件で、ｌｏｇ２倍率変化０．６超または－０．６未満に有意に（ｐ≦０．０５）変化した遺伝子を遺伝子のセットリストとし、これに対して他のすべてのＩＬ－１０刺激を比較した。アップレギュレートされた遺伝子はｌｏｇ２倍率変化≧０．６、ダウンレギュレートされた遺伝子はｌｏｇ２倍率変化≦－０．６の遺伝子を意味する。ＷＴＤと他のＩＬ－１０変異体刺激の比較のために、変異体の平均ｌｏｇ２倍率変化をＷＴＤの平均ｌｏｇ２倍率変化で割った。存在量が検出限界に近い遺伝子を除去するために、２人以上のドナーにおいてＲＰＫＭが１未満の遺伝子は分析から除外した。
【0087】
遺伝子の機能アノテーション（ＫＥＧＧ経路、ＧＯ ｔｅｒｍｓ）は、ＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ機能アノテーションツール（Huang da et al., 2009a, b）を使用して行った。クラスタ化ヒートマップは、Ｒ Ｓｔｕｄｉｏ Ｐｈｅａｔｍａｐパッケージを使用して作成した。
【0088】
生細胞２色１分子イメージング研究
受容体ホモおよびヘテロ二量体化を、以前に記載されたように２色１分子共追跡によって定量化した（Moraga et al., 2015c, Wilmes et al., 2015, Wilmes et al., 2020）。受容体二量体化実験は、ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβを、それぞれ単量体ＥＣＦＰおよびＥＧＦＰのＮ末端融合変異体とともに一過性に発現するＨｅＬａ細胞において実施した。細胞表面の標識化は、操作したシステイン残基を介して光安定性フルオロフォアと部位特異的に結合した抗ＧＦＰナノボディミニマイザ（ＭＩ）およびエンハンサ（ＥＮ）をそれぞれ使用して達成した。受容体ヘテロ二量体化の定量化のために、ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβを、それぞれＭＩＲｈｏ１１（ＡＴＴＯＲｈｏ１１、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）およびＥＮＡＴ６４３（ＡＴＴＯ６４３、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）を用いて標識した。ホモ二量体化の定量化のためには、ＩＬ－１０ＲαをＭＩＲｈｏ１１およびＭＩＡＴ６４３を用いて標識するか、またはＩＬ－１０ＲβをＥＮＲｈｏ１１およびＥＮＡＴ６４３を用いて標識した。対応する他の受容体サブユニットの過剰発現は、それぞれＥＮＡＴ４８８またはＭＩＡＴ４８８（ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）を用いて標識することによって保証した。細胞膜における個々のＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβのタイムラプス２色イメージングは、５６１ｎｍおよび６４０ｎｍで励起し、画像分割器（ＱｕａｄＶｉｅｗ ＱＶ２、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して単一ＥＭＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ ｉＸｏｎ Ｕｌｔｒａ８９７、Ａｎｄｏｒ）を用いて検出する全反射蛍光顕微鏡によって行った。複数標的トレーシング（ＭＴＴ）アルゴリズム（Serge et al., 2008）を使用して分子を局在化させた。受容体二量体は、以前に詳細に記載されたように、少なくとも１０連続フレームについて１５０ｎｍの距離閾値内に共局在化した分子として同定した（Moraga et al., 2015c, Wilmes et al., 2015, Wilmes et al., 2020）。
受容体ホモおよびヘテロ二量体化を、以前に記載されたように２色１分子共追跡によって定量化した（Moraga et al., 2015c, Wilmes et al., 2015, Wilmes et al., 2020）。受容体二量体化実験は、ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβを、それぞれ単量体ＥＣＦＰおよびＥＧＦＰのＮ末端融合変異体とともに一過性に発現するＨｅＬａ細胞において実施した。細胞表面の標識化は、操作したシステイン残基を介して光安定性フルオロフォアと部位特異的に結合した抗ＧＦＰナノボディミニマイザ（ＭＩ）およびエンハンサ（ＥＮ）をそれぞれ使用して達成した。受容体ヘテロ二量体化の定量化のために、ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβを、それぞれＭＩＲｈｏ１１（ＡＴＴＯＲｈｏ１１、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）およびＥＮＡＴ６４３（ＡＴＴＯ６４３、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）を用いて標識した。ホモ二量体化の定量化のためには、ＩＬ－１０ＲαをＭＩＲｈｏ１１およびＭＩＡＴ６４３を用いて標識するか、またはＩＬ－１０ＲβをＥＮＲｈｏ１１およびＥＮＡＴ６４３を用いて標識した。対応する他の受容体サブユニットの過剰発現は、それぞれＥＮＡＴ４８８またはＭＩＡＴ４８８（ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ）を用いて標識することによって保証した。細胞膜における個々のＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβのタイムラプス２色イメージングは、５６１ｎｍおよび６４０ｎｍで励起し、画像分割器（ＱｕａｄＶｉｅｗ ＱＶ２、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して単一ＥＭＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ ｉＸｏｎ Ｕｌｔｒａ８９７、Ａｎｄｏｒ）を用いて検出する全反射蛍光顕微鏡によって行った。複数標的トレーシング（ＭＴＴ）アルゴリズム（Serge et al., 2008）を使用して分子を局在化させた。受容体二量体は、以前に詳細に記載されたように、少なくとも１０連続フレームについて１５０ｎｍの距離閾値内に共局在化した分子として同定した（Moraga et al., 2015c, Wilmes et al., 2015, Wilmes et al., 2020）。
【0089】
〔結果〕
ＩＬ－１０Ｒβに対する親和性を増強したＩＬ－１０変異体の操作
ＩＬ－１０はその四量体の受容体複合体と２段階の結合プロセスで結合する。第１段階では、１分子のＩＬ－１０が２つのＩＬ－１０Ｒαと高い親和性で結合し、第２段階では、２つのＩＬ－１０ＲβがＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒα四量体複合体にリクルートされて、シグナル伝達を開始する（図１Ａ、上段パネル）。ＩＬ－１０の顕著な特徴は、ＩＬ－１０Ｒβに対する結合親和性が非常に低い（～ｍＭ範囲）ことであり、我々はこのことがＩＬ－１０の生理活性の律速段階として作用すると仮定した。そこで、ＩＬ－１０Ｒβ親和性を増強したＩＬ－１０変異体が、幅広い範囲のリガンド濃度で強い反応を誘導することによって、このｉｎ ｖｉｖｏ律速段階を克服するか検討した。この疑問に取り組むため、酵母表面ディスプレイを使用してＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβに対する結合親和性を高め、親和性を増強したこれらの新しいＩＬ－１０変異体によって誘導されるシグナル伝達および活性プロファイルを調べた。ＩＬ－１０の操作において注意が必要なのは、このサイトカインが二量体的性質を有し、酵母表面に正しく表示することが困難であることである。この制限を克服するために、Ｗａｌｔｅｒグループによって以前に記載された単量体ＩＬ－１０変異体（Josephson et al., 2000）を工学的足場として使用した。単量体ＩＬ－１０は、ＩＬ－１０のヘリックスＤとＥの間の結合リンカーを６ペプチド延長し、その結果、ヘリックスＥおよびＦがそれ自身の疎水性コア中に折り畳まれてＩＬ－１０単量体を形成することにより、Ｗａｌｔｅｒグループによって作製された（図１Ｂおよび図８）。単量体のＩＬ－１０は、ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβをそれぞれ１分子ずつリクルートして、活性シグナルを発する三量体複合体を形成する（図１Ａ、下段パネル）。単量体ＩＬ－１０はＩＬ－１０介在性の反応を引き起こすことが可能であるが、その二量体対応物と比較して効力は著しく低い（Josephson et al., 2000, Logsdon et al., 2002）。
ＩＬ－１０Ｒβに対する親和性を増強したＩＬ－１０変異体の操作
ＩＬ－１０はその四量体の受容体複合体と２段階の結合プロセスで結合する。第１段階では、１分子のＩＬ－１０が２つのＩＬ－１０Ｒαと高い親和性で結合し、第２段階では、２つのＩＬ－１０ＲβがＩＬ－１０／ＩＬ－１０Ｒα四量体複合体にリクルートされて、シグナル伝達を開始する（図１Ａ、上段パネル）。ＩＬ－１０の顕著な特徴は、ＩＬ－１０Ｒβに対する結合親和性が非常に低い（～ｍＭ範囲）ことであり、我々はこのことがＩＬ－１０の生理活性の律速段階として作用すると仮定した。そこで、ＩＬ－１０Ｒβ親和性を増強したＩＬ－１０変異体が、幅広い範囲のリガンド濃度で強い反応を誘導することによって、このｉｎ ｖｉｖｏ律速段階を克服するか検討した。この疑問に取り組むため、酵母表面ディスプレイを使用してＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβに対する結合親和性を高め、親和性を増強したこれらの新しいＩＬ－１０変異体によって誘導されるシグナル伝達および活性プロファイルを調べた。ＩＬ－１０の操作において注意が必要なのは、このサイトカインが二量体的性質を有し、酵母表面に正しく表示することが困難であることである。この制限を克服するために、Ｗａｌｔｅｒグループによって以前に記載された単量体ＩＬ－１０変異体（Josephson et al., 2000）を工学的足場として使用した。単量体ＩＬ－１０は、ＩＬ－１０のヘリックスＤとＥの間の結合リンカーを６ペプチド延長し、その結果、ヘリックスＥおよびＦがそれ自身の疎水性コア中に折り畳まれてＩＬ－１０単量体を形成することにより、Ｗａｌｔｅｒグループによって作製された（図１Ｂおよび図８）。単量体のＩＬ－１０は、ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβをそれぞれ１分子ずつリクルートして、活性シグナルを発する三量体複合体を形成する（図１Ａ、下段パネル）。単量体ＩＬ－１０はＩＬ－１０介在性の反応を引き起こすことが可能であるが、その二量体対応物と比較して効力は著しく低い（Josephson et al., 2000, Logsdon et al., 2002）。
【0090】
まず、ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβ受容体サブユニットへの結合が酵母表面の状況で保たれるか検証するために、単量体のＩＬ－１０構築物を酵母にトランスフェクトした。ビオチン化ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβ受容体をＡｌｅｘａ－６４７蛍光標識ストレプトアビジンと組み合わせて使用して、フローサイトメトリによって受容体結合を測定した（図１Ｃ）。図１Ｄに示すように、単量体ＩＬ－１０はＩＬ－１０Ｒαへの結合を保持し、酵母の表面に正しく表示されていることが確認された。ＩＬ－１０Ｒαの存在下でも非存在下でも単量体ＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβへの結合は検出できず、この受容体サブユニットへの結合が弱いことが確認された（図１Ｄ）。部位特異的変異体ライブラリの設計の指針となる、ＩＬ－１０Ｒβに結合したＩＬ－１０の結晶構造がないため、ＩＬ－１０Ｒβに対する親和性を増強したＩＬ－１０変異体を作製するために、非バイアスでエラープローンな取り組みを試みた。単量体ＩＬ－１０変異体をエラープローンＰＣＲに供し、増幅したＰＣＲ生成物を、以前に記載されたプロトコル（Chao et al., 2006, Mendoza et al., 2017）に従ってサッカロミセス・セレビシエ株ＥＢＹ１００中に電気穿孔した。８回の選択ラウンドを実施して、ＩＬ－１０Ｒβの濃度を徐々に低下させて、ＩＬ－１０Ｒβとより高い親和性で結合するＩＬ－１０変異体を単離した（図１Ｅ）。最初の選択ラウンドは、高濃度のビオチン化ＩＬ－１０Ｒβを用いて非ビオチン化ＩＬ－１０Ｒαの存在下で行って表面複合体を安定化させ、低親和性結合体を回収した。ラウンド６の後には、ライブラリは、ＩＬ－１０Ｒαの非存在下でＩＬ－１０Ｒβと結合可能な変異体で構成されており、ラウンド８までにライブラリは低ナノモル範囲の濃度のＩＬ－１０Ｒβと結合可能になった（図１Ｅおよび１Ｆ）。この時点で個々の酵母コロニーをピックし、ＩＬ－１０野生型と比較してより高い親和性でＩＬ－１０Ｒβと結合するいくつかのクローン（Ａ１１、Ｂ１１、Ｒ５Ａ１１）を単離した（図１Ｆおよび１Ｇ）。これらの変異体において見出された変異をＩＬ－１０構造の文脈に置くと、重要なことに、それらはＩＬ－１０Ｒβと結合すると以前に予測されたヘリックスＡおよびＤに沿った領域に局在し（Mendoza et al., 2017）、我々の選択プロセスの正当性が認められた（図１Ｈおよび１Ｉ）。
【0091】
単離したＩＬ－１０変異体の生物物理学的特性評価
次に、単離したＩＬ－１０変異体を組換え発現させ、その生物物理学的特性を評価した。重要なことに、ＩＬ－１０変異体はゲルろ過カラムにかけると単量体として挙動し、その単量体的性質が確認された（図８Ａおよび８Ｂ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を行って、図１Ｇの酵母上結合滴定実験で見られた見かけの結合親和性の正当性を確認した。ビオチン化ＩＬ－１０Ｒβをチップ表面上に固定化し、ＩＬ－１０変異体Ａ１１、Ｂ１１およびＲ５Ａ１１を流した（図９Ａ）。この試験で使用した用量範囲（マイクロモル範囲）で野生型単量体ＩＬ－１０（ＷＴＭ）の結合は検出できず、ＩＬ－１０ｗｔが示すＩＬ－１０Ｒβに対する結合親和性の低さが確認された（図９Ｂのパネル１および９Ｃ）。親和性成熟ＩＬ－１０変異体はすべて低マイクロモル範囲のＫＤ値でＩＬ－１０Ｒβと結合することが可能であり（図９Ｂおよび９Ｃ）、その結合親和性の改善が確認された。
次に、単離したＩＬ－１０変異体を組換え発現させ、その生物物理学的特性を評価した。重要なことに、ＩＬ－１０変異体はゲルろ過カラムにかけると単量体として挙動し、その単量体的性質が確認された（図８Ａおよび８Ｂ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を行って、図１Ｇの酵母上結合滴定実験で見られた見かけの結合親和性の正当性を確認した。ビオチン化ＩＬ－１０Ｒβをチップ表面上に固定化し、ＩＬ－１０変異体Ａ１１、Ｂ１１およびＲ５Ａ１１を流した（図９Ａ）。この試験で使用した用量範囲（マイクロモル範囲）で野生型単量体ＩＬ－１０（ＷＴＭ）の結合は検出できず、ＩＬ－１０ｗｔが示すＩＬ－１０Ｒβに対する結合親和性の低さが確認された（図９Ｂのパネル１および９Ｃ）。親和性成熟ＩＬ－１０変異体はすべて低マイクロモル範囲のＫＤ値でＩＬ－１０Ｒβと結合することが可能であり（図９Ｂおよび９Ｃ）、その結合親和性の改善が確認された。
【0092】
ＩＬ－１０は、ＩＬ－１０Ｒαに予備結合すると、ＩＬ－１０Ｒβに対する親和性が増強されるという協同的な結合動態を示す（Walter, 2014）。そこで、我々の変異体がこの特性を保っているか調べた。そのために、可溶性ＩＬ－１０Ｒαに予め結合した高親和性ＩＬ－１０変異体を使用して、新たなＳＰＲ測定を実施した（図９Ｄ）。ＷＴＭ／ＩＬ－１０Ｒα複合体のＩＬ－１０Ｒβへの有意な結合は検出できず、ＩＬ－１０Ｒβに対する結合親和性が非常に低いことが再度強調された（図９Ｅのパネル１および９Ｆ）。ＩＬ－１０変異体はすべて、ＩＬ－１０Ｒαと複合体化するとＩＬ－１０Ｒβへの結合の増強を示し（ｎＭ範囲内）、それらの協同的結合が確認され、我々の新しい変異体に導入した変異によって、標準的なＩＬ－１０受容体複合体結合トポロジが攪乱されていないことを示唆した（図９Ｅおよび９Ｆ）。我々のＳＰＲデータから、そのｗｔ対応物の１０００倍高い結合親和性でＩＬ－１０Ｒβと結合する新しいＩＬ－１０変異体が単離されたことを確認した。
【0093】
ＩＬ－１０Ｒβ結合親和性の増強は、受容体複合体の会合を改善する。
これまで、使用するタンパク質操作方法に必要であったため、我々の高親和性ＩＬ－１０変異体の生物物理学的特性評価は、サイトカインの単量体立体構造で行ってきた。天然ＩＬ－１０／ＩＬ－１０受容体複合体の化学量論を再現するために、我々の高親和性ＩＬ－１０変異体Ｒ５Ａ１１を、単量体形態（Ｒ５Ａ１１Ｍ）に加えて二量体形態（Ｒ５Ａ１１Ｄ）でも組換え発現させた（図８Ａおよび８Ｂ）。これと野生型ＩＬ－１０二量体（ＷＴＤ）および野生型ＩＬ－１０単量体（ＷＴＭ）の比較により、ＩＬ－１０の分子活性および細胞活性に対する結合親和性の増加および化学量論の寄与効果を調べることが可能になった。
これまで、使用するタンパク質操作方法に必要であったため、我々の高親和性ＩＬ－１０変異体の生物物理学的特性評価は、サイトカインの単量体立体構造で行ってきた。天然ＩＬ－１０／ＩＬ－１０受容体複合体の化学量論を再現するために、我々の高親和性ＩＬ－１０変異体Ｒ５Ａ１１を、単量体形態（Ｒ５Ａ１１Ｍ）に加えて二量体形態（Ｒ５Ａ１１Ｄ）でも組換え発現させた（図８Ａおよび８Ｂ）。これと野生型ＩＬ－１０二量体（ＷＴＤ）および野生型ＩＬ－１０単量体（ＷＴＭ）の比較により、ＩＬ－１０の分子活性および細胞活性に対する結合親和性の増加および化学量論の寄与効果を調べることが可能になった。
【0094】
ＩＬ－１０Ｒβへの結合親和性を高めると、生細胞の細胞膜における受容体会合の動態がどのように変化するかを検証するために、２色全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡によって、両方の受容体鎖の拡散および相互作用を探った。この目的のために、非蛍光性（Ｙ６７Ｆ）ｍＥＧＦＰの操作した変異体を用いてタグ付けしたＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβを、ＨｅＬａ細胞において発現させた。タグは、２つの異なる抗ＧＦＰナノボディ（(Kirchhofer et al., 2010) ｐｄｂ：３ｋ１ｋおよび３Ｇ９Ａ）のいずれかを特異的に認識するように設計した。これらのナノボディ（ＮＢ）は、他のサイトカイン受容体系において以前に示されたように、生細胞の表面上のＩＬ－１０ＲαＤＹ６４９およびＩＬ－１０ＲβＲＨＯ１１の同時２色１分子追跡に適した光安定性有機フルオロフォアＲＨＯ１１およびＤｙ６４９に結合させた（Martinez-Fabregas et al., 2019, Wilmes et al., 2020, Moraga et al., 2015a）（図２Ａおよび１０Ａ）。
【0095】
細胞表面標識の後、両方の受容体サブユニットが細胞膜において自由に拡散していることを見出した。受容体は、２つの個々の粒子が１００ｎｍの近接で≧１０ステップ（～３２０ｍｓ）連続して両方のスペクトルチャネルで持続的に見出された場合、二量体化しているとみなした。これらの共局在化／共追跡の閾値により、密度依存的なランダムエンカウンタ共局在化を排除することが可能になった。ＩＬ－１０の非存在下では、バックグラウンドを超えるＩＬ－１０ＲαとＩＬ－１０Ｒβのヘテロ二量体化は観察されなかった（図２Ｂおよび２Ｃ）。飽和濃度のＷＴＤで刺激すると、ＩＬ－１０ＲαとＩＬ－１０Ｒβは有意に二量体化した。際立ったことに、Ｒ５Ａ１１Ｄは有意に高いレベルの受容体複合体会合を誘導した（図２Ｃ）。この発見は、二量体型で見られたよりも低いレベルではあるが、野生型および高親和性ＩＬ－１０変異体の両方の単量体型についても確認された（図３Ｄ）。リガンド刺激は、特にＩＬ－１０Ｒαについて拡散移動度の著しい低下をもたらし、これは以前の報告と一致する（図１０Ｂ）。（Moraga et al., 2015c, Wilmes et al., 2015）。また、ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβのホモ二量化を探った。この目的のために、二量体の半分のみが異なる色素で標識され、従って共追跡分析によってピックアップされることを考慮して、受容体鎖のいずれかを両方の色素を用いて確率的に標識した（図１０Ａ）。二量体ＩＬ－１０を用いて刺激すると、ＩＬ－１０Ｒαの強いホモ二量化が誘導されたが、ＩＬ－１０Ｒαの結合界面はＲ５Ａ１１で変化しなかったため、両方のサイトカイン変異体間で差異はなかった（図２Ｃ）。代わりに、ＩＬ－１０Ｒβのホモ二量化が、操作した変異体Ｒ５Ａ１１Ｄについて有意に増加した。単量体ＩＬ－１０変異体については、すべてのホモ二量体化実験において、リガンドの単量体的性質と一致して、受容体ホモ二量体を誘導できなかった（図２Ｄ）（Josephson et al., 2000）。まとめると、ＩＬ－１０Ｒβに対する親和性成熟界面が関与するすべての条件下で、Ｒ５Ａ１１について受容体会合の増加が観察された。
【0096】
ＩＬ－１０変異体はヒト初代単球においてシグナル伝達活性の増強を示す
ＩＬ－１０は単球を含む種々の自然細胞の活性を調節することにより、炎症プロセスを抑制する。次に、ヒト単球において一連のシグナル伝達および活性アッセイを実施して、我々の操作した変異体の抗炎症能を調べた。単球（ＣＤ１４＋細胞）をヒトバフィーコートから単離し、２日間静置してからＩＬ－１０ｗｔならびに高親和性の単量体および二量体を用いて刺激した（図３Ａ）。リガンド刺激時のＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３リン酸化のレベルを、これらの２つの転写因子はＩＬ－１０が関与する主要なシグナル伝達経路を表すことから、フローサイトメトリによって測定した（Wehinger et al., 1996, Finbloom and Winestock, 1995）。飽和濃度では、Ｒ５Ａ１１ＤおよびＷＴＤは同等のＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３レベルを活性化した（図３Ｂ）。しかし、Ｒ５Ａ１１Ｄは飽和濃度未満ではＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１の両方のリン酸化の増強を示し、これはＷＴＤと比較してＥＣ５０値の低下につながった（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＷＴＭが示したＳＴＡＴ３およびＴＡＴ１の活性化は弱く、活性化の振幅はＷＴＤによって誘発された活性化の振幅の５０％未満であった（図３Ｂ）。興味深いことに、ＷＴＭは偏ったシグナル伝達反応を引き起こした。ＷＴＤ、Ｒ５Ａ１１ＤおよびＲ５Ａ１１Ｍが１：１のｐＳＴＡＴ１対ｐＳＴＡＴ３比を示したのに対し、ＷＴＭはｐＳＴＡＴ３に対する明確な偏りを示し（図３Ｄ）、これは短命サイトカイン－受容体複合体による偏ったシグナル伝達について記載した我々の研究所の以前の観察に一致した（Martinez-Fabregas et al., 2019）。Ｒ５Ａ１１Ｍは、飽和用量で二量体サイトカインによって誘導されるものと同等のレベルまでＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１の両方の活性化を誘導し、ＷＴＭによって誘発されるシグナル伝達の欠陥は、受容体結合親和性の弱さに起因することを示唆した（図３Ｂおよび３Ｃ）。シグナル伝達動態試験により、用量反応試験で得られたシグナル伝達プロファイルは、異なるＩＬ－１０変異体によって誘発されるシグナル伝達動態の差異によって混乱することはないことが示された。４つのＩＬ－１０リガンドは、ヒト単球において同等のシグナル伝達動態を引き起こし（図３Ｅおよび図１１）、それらのシグナル伝達プロファイルの差異は、ＩＬ－１０Ｒβへの結合親和性の差異に起因することが確認された。
ＩＬ－１０は単球を含む種々の自然細胞の活性を調節することにより、炎症プロセスを抑制する。次に、ヒト単球において一連のシグナル伝達および活性アッセイを実施して、我々の操作した変異体の抗炎症能を調べた。単球（ＣＤ１４＋細胞）をヒトバフィーコートから単離し、２日間静置してからＩＬ－１０ｗｔならびに高親和性の単量体および二量体を用いて刺激した（図３Ａ）。リガンド刺激時のＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３リン酸化のレベルを、これらの２つの転写因子はＩＬ－１０が関与する主要なシグナル伝達経路を表すことから、フローサイトメトリによって測定した（Wehinger et al., 1996, Finbloom and Winestock, 1995）。飽和濃度では、Ｒ５Ａ１１ＤおよびＷＴＤは同等のＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３レベルを活性化した（図３Ｂ）。しかし、Ｒ５Ａ１１Ｄは飽和濃度未満ではＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１の両方のリン酸化の増強を示し、これはＷＴＤと比較してＥＣ５０値の低下につながった（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＷＴＭが示したＳＴＡＴ３およびＴＡＴ１の活性化は弱く、活性化の振幅はＷＴＤによって誘発された活性化の振幅の５０％未満であった（図３Ｂ）。興味深いことに、ＷＴＭは偏ったシグナル伝達反応を引き起こした。ＷＴＤ、Ｒ５Ａ１１ＤおよびＲ５Ａ１１Ｍが１：１のｐＳＴＡＴ１対ｐＳＴＡＴ３比を示したのに対し、ＷＴＭはｐＳＴＡＴ３に対する明確な偏りを示し（図３Ｄ）、これは短命サイトカイン－受容体複合体による偏ったシグナル伝達について記載した我々の研究所の以前の観察に一致した（Martinez-Fabregas et al., 2019）。Ｒ５Ａ１１Ｍは、飽和用量で二量体サイトカインによって誘導されるものと同等のレベルまでＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１の両方の活性化を誘導し、ＷＴＭによって誘発されるシグナル伝達の欠陥は、受容体結合親和性の弱さに起因することを示唆した（図３Ｂおよび３Ｃ）。シグナル伝達動態試験により、用量反応試験で得られたシグナル伝達プロファイルは、異なるＩＬ－１０変異体によって誘発されるシグナル伝達動態の差異によって混乱することはないことが示された。４つのＩＬ－１０リガンドは、ヒト単球において同等のシグナル伝達動態を引き起こし（図３Ｅおよび図１１）、それらのシグナル伝達プロファイルの差異は、ＩＬ－１０Ｒβへの結合親和性の差異に起因することが確認された。
【0097】
ＩＬ－１０は、単球および樹状細胞などの自然細胞における抗原提示を抑制することにより、抗炎症特性を発揮する（Mittal and Roche, 2015）。そこで次に、ＩＬ－１０のＩＬ－１０Ｒβへの結合親和性が、ヒト初代単球におけるＨＬＡ－ＤＲ発現を低下させるその能力に影響を与えるかを調べた。ＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｄは、それらのシグナル伝達プロファイルが同等であることに一致して、飽和用量でＨＬＡ－ＤＲ表面レベルを同程度（５０％）に低減させた（図３Ｆ）。しかし、飽和用量未満では、Ｒ５Ａ１１ＤはＷＴＤよりも有利であり、ＨＬＡ－ＤＲ発現のより強いダウンレギュレーションを誘導した（図３Ｆ）。ＷＴＭは、そのシグナル伝達効力の低さと同様に、ＨＬＡ－ＤＲの表面レベルの軽度の低減（２０％）を誘導した（図３Ｆ）。興味深いことに、Ｒ５Ａ１１Ｍは二量体リガンドと非常に類似した程度までＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ３を活性化するにもかかわらず、ＨＬＡ－ＤＲの表面レベルの低減を３０％しか誘導せず（図３Ｆ）、ＩＬ－１０がＨＬＡ－ＤＲ発現を制御するさらなるメカニズムを示唆した。次に、ＩＬ－１０Ｒβ結合親和性と、単球による炎症誘発性サイトカインの産生を抑制するＩＬ－１０の能力がどのように相関するかを調べた。このために、示した用量のＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｄの存在下でＬＰＳ刺激時に単球によって分泌されるＩＬ－６のレベルを測定した（図３Ｇ）。飽和濃度では、ＷＴＤおよびＲ５Ａ１１ＤはＩＬ－６分泌を同程度に効果的に抑制した（図３Ｇ）。しかし、飽和用量未満では、Ｒ５Ａ１１Ｄは再度ＷＴＤよりも顕著な改善を示した（図３Ｇ）。まとめると、我々のデータは、ＩＬ－１０Ｒβに対する結合の増強を示すＩＬ－１０変異体は、治療的介入中に見出されるような飽和用量未満で、機能的利点を得ることを強調している。
【0098】
受容体親和性の増加は単球におけるＩＬ－１０の転写活性を増強する
単球における我々の最初の研究は、ＩＬ－１０によって制御される２つの古典的なマーカー、すなわちＨＬＡ－ＤＲレベルおよびＩＬ－６発現に焦点を当てたものであった。我々の変異体がどのようにヒト単球の活性を制御しているかについてより広く理解を得るために、種々のＩＬ－１０リガンドを用いて２４時間刺激したヒト単球の詳細な転写分析を実施した。単球を単離し、図４Ａと同様に処理した。ＷＴＤ処理はヒト単球において強い転写制御を誘発し、７４１遺伝子のアップレギュレーションおよび１０８４遺伝子のダウンレギュレーションを誘導した（図４Ｂおよび４Ｃ）。高度にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子を、図５Ｄに示す。ＫＥＧＧ経路分析は、ＩＬ－１０処理によって制御される、代謝経路に関与する多数の遺伝子を示し（図１２Ａ）、その選択されたものを図１２Ｂに示す。ＷＴＤ処理は、解糖系におけるキー酵素であるヘキソキナーゼ－２およびヘキソキナーゼ－３の発現を制御した。アシル－ＣｏＡ合成に関連する遺伝子、ＡＣＳＳ２、ＡＣＳＬ４、ＡＣＳＬ１も有意にアップレギュレートされ、ＩＬ－１０による脂質生合成の制御の可能性が強調された（図１２Ｂ）。代謝関連遺伝子に加えて、ＷＴＤ処理は、サイトカイン、ケモカインおよびその受容体の発現を制御した（図１２Ｂ）。例えば、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－２１ＲαおよびＩＬ－４Ｒαなどのサイトカイン受容体はアップレギュレートされ、一方でＩＬ－８、ＩＬ－１８およびＩＬ－２４などのサイトカインはダウンレギュレートされた（図１２Ｂ）。ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ１８、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１ケモカインの発現もＩＬ－１０処理によって調節され、抗炎症性環境に寄与した。我々はまた、ＣＤ９３－単球の食作用に重要な受容体ならびにＣＤ４４およびＣＤ９－細胞表面接着に関与するマーカーを含む、ＣＤマーカーの雑多なコレクションのＷＴＤ処理による制御（図１２Ｂ）；ならびに以前の研究（Ito et al., 1999, Dallagi et al., 2015）と一致する、タイプＩ ＩＦＮ遺伝子シグネチャの抑制（図１２Ｂ）を観察した。全体として、我々の転写研究は、エネルギー恒常性、移動および輸送の微調整を包含する、単球の生物学のＩＬ－１０による広範な制御を明らかにした。注目すべきことに、飽和用量のＷＴＤによって制御される遺伝子の９０％は、飽和未満用量のＷＴＤを使用しても同程度に誘導され、ＩＬ－１０反応の強さが強調された（図４Ｅ）。しかし、興味深いことに、２つの用量のＷＴＤによって差次的に制御された１０％の遺伝子のうち、その９６％はＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた遺伝子に対応し、重要な炎症誘発性ケモカインおよびサイトカインを含む（図４Ｅおよび４Ｆ）。差次的に発現した遺伝子のリストを、図５Ｇに提示する。我々のデータは、低用量のＩＬ－１０処理が、炎症反応の増強に決定的に寄与するキーサイトカインおよびケモカインの発現を遮断するＩＬ－１０の能力を、特異的に妨害することを示す。
単球における我々の最初の研究は、ＩＬ－１０によって制御される２つの古典的なマーカー、すなわちＨＬＡ－ＤＲレベルおよびＩＬ－６発現に焦点を当てたものであった。我々の変異体がどのようにヒト単球の活性を制御しているかについてより広く理解を得るために、種々のＩＬ－１０リガンドを用いて２４時間刺激したヒト単球の詳細な転写分析を実施した。単球を単離し、図４Ａと同様に処理した。ＷＴＤ処理はヒト単球において強い転写制御を誘発し、７４１遺伝子のアップレギュレーションおよび１０８４遺伝子のダウンレギュレーションを誘導した（図４Ｂおよび４Ｃ）。高度にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子を、図５Ｄに示す。ＫＥＧＧ経路分析は、ＩＬ－１０処理によって制御される、代謝経路に関与する多数の遺伝子を示し（図１２Ａ）、その選択されたものを図１２Ｂに示す。ＷＴＤ処理は、解糖系におけるキー酵素であるヘキソキナーゼ－２およびヘキソキナーゼ－３の発現を制御した。アシル－ＣｏＡ合成に関連する遺伝子、ＡＣＳＳ２、ＡＣＳＬ４、ＡＣＳＬ１も有意にアップレギュレートされ、ＩＬ－１０による脂質生合成の制御の可能性が強調された（図１２Ｂ）。代謝関連遺伝子に加えて、ＷＴＤ処理は、サイトカイン、ケモカインおよびその受容体の発現を制御した（図１２Ｂ）。例えば、ＩＬ－１２Ｒβ２、ＩＬ－２１ＲαおよびＩＬ－４Ｒαなどのサイトカイン受容体はアップレギュレートされ、一方でＩＬ－８、ＩＬ－１８およびＩＬ－２４などのサイトカインはダウンレギュレートされた（図１２Ｂ）。ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ１８、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１ケモカインの発現もＩＬ－１０処理によって調節され、抗炎症性環境に寄与した。我々はまた、ＣＤ９３－単球の食作用に重要な受容体ならびにＣＤ４４およびＣＤ９－細胞表面接着に関与するマーカーを含む、ＣＤマーカーの雑多なコレクションのＷＴＤ処理による制御（図１２Ｂ）；ならびに以前の研究（Ito et al., 1999, Dallagi et al., 2015）と一致する、タイプＩ ＩＦＮ遺伝子シグネチャの抑制（図１２Ｂ）を観察した。全体として、我々の転写研究は、エネルギー恒常性、移動および輸送の微調整を包含する、単球の生物学のＩＬ－１０による広範な制御を明らかにした。注目すべきことに、飽和用量のＷＴＤによって制御される遺伝子の９０％は、飽和未満用量のＷＴＤを使用しても同程度に誘導され、ＩＬ－１０反応の強さが強調された（図４Ｅ）。しかし、興味深いことに、２つの用量のＷＴＤによって差次的に制御された１０％の遺伝子のうち、その９６％はＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた遺伝子に対応し、重要な炎症誘発性ケモカインおよびサイトカインを含む（図４Ｅおよび４Ｆ）。差次的に発現した遺伝子のリストを、図５Ｇに提示する。我々のデータは、低用量のＩＬ－１０処理が、炎症反応の増強に決定的に寄与するキーサイトカインおよびケモカインの発現を遮断するＩＬ－１０の能力を、特異的に妨害することを示す。
【0099】
次に、操作したＩＬ－１０変異体が、単球において遺伝子発現プログラムをどのように制御するかを調べた。ＷＴＭは、そのシグナル活性化プロファイルの弱さに一致して、非常に弱い転写反応を誘導した（図４Ｈおよび１２Ｃ）。興味深いことに、Ｒ５Ａ１１ＭはＷＴＭと比較してより強力な転写反応を引き起こしたが、二量体リガンドによって誘導されたのと同じ効力に達することはできなかった（図４Ｈおよび１２Ｃ）。ＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｍを直接比較すると、後者の単量体リガンドは、ＩＬ－１０によって制御される遺伝子の３９％において効果の減少を示した（図１２Ｄ）。これは、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３を二量体リガンドによって誘導されるのと同等のレベルまで活性化するその能力とは対照的であり、ＳＴＡＴ活性化がＩＬ－１０システムにおける転写活性と直接相関していないことを示唆している。我々のシグナル伝達研究と一致して、Ｒ５Ａ１１ＤはＷＴＤと比較して、飽和用量未満でより強い遺伝子発現プロファイルを誘導した（図４Ｈ）。Ｒ５Ａ１１Ｄは、０．１ｎＭでＷＴＤによって制御される遺伝子の１８％の発現を増強し、ＷＴＤによってＲ５Ａ１１Ｄよりも好ましい活性を示す遺伝子はわずか６％であった（図４Ｈおよび４Ｉ、１２Ｅ）。図４Ｊは、ＩＬ－１０に制御される上位１０個の遺伝子のうち、それらの大半がＲ５Ａ１１Ｄによる活性の増強を示したことを示す。このパターンは、遺伝子がファミリー、すなわちサイトカインおよびケモカイン、ＣＤマーカーならびにＭＡＰＫシグナル伝達によるグループである場合に当てはまる（図１２Ｃ）。重要なことに、低用量ではＷＴＤによって制御されなかったキー炎症誘発性サイトカインが、Ｒ５Ａ１１Ｄによっては依然として制御される（図４Ｋ）。全体として、我々の転写データは、ＩＬ－１０は種々のレベルで単球の生物学を制御しており、Ｒ５Ａ１１ＤはＩＬ－１０Ｒβに対する親和性の増強を示すことによってより広範な範囲のリガンド濃度でより強い反応を誘発し、炎症性疾患を標的とするＩＬ－１０に基づく療法をレスキューする可能性を有することを示している。
【0100】
ＩＬ－１０変異体はヒト初代ＣＤ８Ｔ細胞においてシグナル伝達活性の増強を示す
ＩＬ－１０は、その強力な抗炎症性効果に加えて、特定の状況下で細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞を刺激し、エフェクタ分子の産生を増強し、細胞傷害活性を増加させる（Oft, 2014）。次に、我々の親和性成熟変異体が単球において示す活性の増強が、ＣＤ８Ｔ細胞にもあてはまるかを調べた。ヒト初代ＣＤ８Ｔ細胞を図５Ａに示すように増殖および活性化し、示した濃度のＩＬ－１０変異体に反応したＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ３活性化レベルをフローサイトメトリによって測定した（図５Ｂ）。ＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｄは飽和用量で非常に類似したＳＴＡＴリン酸化レベルを誘導したが、Ｒ５Ａ１１Ｄは飽和用量未満でＥＣ５０値の低下およびより強いシグナル伝達を示し（図５Ｂ～Ｄ）、これは単球における我々の結果と一致した。興味深いことに、Ｒ５Ａ１１ＤはＳＴＡＴ３よりも強力なＳＴＡＴ１の活性化を示したが、これは単球では観察されず、このことは長命のＩＬ－１０受容体複合体が、ＣＤ８Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ１の活性化に有利であることを示唆している。ＷＴＭが示すＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３の活性化は弱く、二量体分子によって誘発される活性化振幅の２５％未満しか誘導せず、偏ったＳＴＡＴ３活性化を示した（図５Ｂ～Ｄ）。単球において観察されたのとは対照的に、Ｒ５Ａ１１ＭもまたＳＴＡＴ３に偏った反応を誘発し、ＳＴＡＴ３は二量体分子によって誘導されたレベルの８０％まで、ＳＴＡＴ１は二量体分子によって誘導されたレベルの６０％まで活性化し（図５Ｂ～Ｄ）、単球とＣＤ８Ｔ細胞間の基本的な差異がＩＬ－１０受容体複合体の下流のシグナル伝達に影響を与えることを示唆した。単球と同様に、観察された種々のＩＬ－１０リガンドによるシグナル伝達出力の差異は、シグナル伝達活性化動態の変化に起因するものではないことが、シグナル伝達動態試験によって明らかになった（図５Ｅ）。
ＩＬ－１０は、その強力な抗炎症性効果に加えて、特定の状況下で細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞を刺激し、エフェクタ分子の産生を増強し、細胞傷害活性を増加させる（Oft, 2014）。次に、我々の親和性成熟変異体が単球において示す活性の増強が、ＣＤ８Ｔ細胞にもあてはまるかを調べた。ヒト初代ＣＤ８Ｔ細胞を図５Ａに示すように増殖および活性化し、示した濃度のＩＬ－１０変異体に反応したＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ３活性化レベルをフローサイトメトリによって測定した（図５Ｂ）。ＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｄは飽和用量で非常に類似したＳＴＡＴリン酸化レベルを誘導したが、Ｒ５Ａ１１Ｄは飽和用量未満でＥＣ５０値の低下およびより強いシグナル伝達を示し（図５Ｂ～Ｄ）、これは単球における我々の結果と一致した。興味深いことに、Ｒ５Ａ１１ＤはＳＴＡＴ３よりも強力なＳＴＡＴ１の活性化を示したが、これは単球では観察されず、このことは長命のＩＬ－１０受容体複合体が、ＣＤ８Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ１の活性化に有利であることを示唆している。ＷＴＭが示すＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３の活性化は弱く、二量体分子によって誘発される活性化振幅の２５％未満しか誘導せず、偏ったＳＴＡＴ３活性化を示した（図５Ｂ～Ｄ）。単球において観察されたのとは対照的に、Ｒ５Ａ１１ＭもまたＳＴＡＴ３に偏った反応を誘発し、ＳＴＡＴ３は二量体分子によって誘導されたレベルの８０％まで、ＳＴＡＴ１は二量体分子によって誘導されたレベルの６０％まで活性化し（図５Ｂ～Ｄ）、単球とＣＤ８Ｔ細胞間の基本的な差異がＩＬ－１０受容体複合体の下流のシグナル伝達に影響を与えることを示唆した。単球と同様に、観察された種々のＩＬ－１０リガンドによるシグナル伝達出力の差異は、シグナル伝達活性化動態の変化に起因するものではないことが、シグナル伝達動態試験によって明らかになった（図５Ｅ）。
【0101】
グランザイムＢは、ＩＬ－１０刺激時にＣＤ８Ｔ細胞で増加することが示されている強力な細胞傷害性エフェクタ分子である（Naing et al., 2018）。次に、ＣＤ８Ｔ細胞によるグランザイムＢの産生が、種々のＩＬ－１０リガンドによってどのように制御されるかを調べた。そのために、ＰＢＭＣまたは単離したＣＤ８Ｔ細胞を図６Ａに図示するワークフローに従って活性化し、フローサイトメトリまたはｑＰＣＲによってグランザイムＢレベルを測定した。以前に報告されたように、ＩＬ－１０刺激は、古典的な初期および後期活性化マーカー、すなわちそれぞれＣＤ６９およびＣＤ７１に影響せず、抑制性受容体、すなわちＬＡＧ－３およびＰＤ－１の有意に高いアップレギュレーションも誘導せず、またＣＤ８細胞の増殖にも影響しなかった（図１３Ａおよび１３Ｂ）。一方、ＩＬ－１０刺激は、ＣＤ８Ｔ細胞がＰＢＭＣ集団または精製ＣＤ８Ｔ細胞集団のいずれの状況下で活性化されたかにかかわらず、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で単球におけるグランザイムＢレベルの強いアップレギュレーションをもたらした（図１３Ｃ）。我々のＩＬ－１０リガンドを比較すると、飽和濃度では、ＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｄは、ＴＣＲ刺激単独によって誘導されるグランザイムＢレベルより２．５倍高く、同程度にグランザイムＢ産生をアップレギュレートした（図５Ｆ）。ＷＴＭが示したグランザイムＢ産生は、そのＳＴＡＴ活性化の弱さと一致して、非常に低かった。飽和濃度未満でもＲ５Ａ１１Ｄによって誘導されたグランザイムＢレベルのより強いアップレギュレーションが観察された。興味深いことに、Ｒ５Ａ１１Ｍ刺激は２つの主要な集団をもたらし、ドナーの半分はＷＴＭによって誘導されるのと類似のレベルまでグランザイムＢをアップレギュレートし、その他の半分は二量体分子によって誘導されるのと同等のレベルまでグランザイムＢをアップレギュレートしていた。全体として、我々の結果は、ＩＬ－１０Ｒβに対する親和性の増強が、幅広い範囲のリガンド用量および免疫細胞サブセットにおいて、ＩＬ－１０に強い活性を与えることを示した。
【0102】
受容体親和性の増加はＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＬ－１０の転写活性を増強する
ＩＬ－１０がどのようにＣＤ８Ｔ細胞反応を制御しているかについてより完全な理解を得るため、次に、種々のＩＬ－１０リガンドを用いて処理したＣＤ８Ｔ細胞において転写試験を実施した。ヒトＣＤ８Ｔ細胞を陽性選択によって精製し、図６Ａに示すようにＩＬ－１０ｗｔおよび変異体の存在下で６日間にわたって活性化した。ＣＤ８Ｔ細胞においてＷＴＤによって誘導された転写変化は、単球においてこのサイトカインによって誘導された転写変化ほど劇的ではなかった。有意に制御された遺伝子はわずか１０００個であり、それらの遺伝子の７９％がダウンレギュレートされた（図６Ｂおよび６Ｃ）。より高度に制御された遺伝子を図７Ｄに示す。ＫＥＧＧ経路分析により、ＩＬ－１０に制御される遺伝子はサイトカイン－サイトカイン受容体相互作用に関与していることが示された（図１４Ａ）。際立ったことに、我々はＩＬ－１０がＣＤ８Ｔ細胞の消耗と古典的に関連する遺伝子のダウンレギュレーションを誘導することに気づいた（図６Ｅ）。ＩＬ－１０に制御される遺伝子を、以前に発表された、消耗特異的ＣＤ８Ｔ細胞遺伝子のリストと比較した（Bengsch et al., 2018）。ＩＬ－１０によって制御される消耗遺伝子の４つのクラスタを同定できた。クラスタ１は、消耗したＴ細胞およびＩＬ－１０を用いて処理したＴ細胞の両方においてアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスタ２は、最大のクラスタであり、消耗したＴ細胞においてアップレギュレートされたが、ＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた遺伝子を示す。クラスタ３は、消耗したＴ細胞においてダウンレギュレートされたが、ＩＬ－１０処理によってアップレギュレートされた遺伝子を表し、クラスタ４は、消耗したＴ細胞およびＩＬ－１０処理したＴ細胞の両方においてダウンレギュレートされた遺伝子で構成されている。各クラスタにおける制御された遺伝子の代表的なサンプルを図６Ｆに示す。これらの結果は、ＩＬ－１０が、ＣＤ８Ｔ細胞の消耗を防ぐことによってＣＤ８Ｔ細胞の活性を増強し得ることを示唆している。興味深いことに、ＩＬ－１０処理によるＩＬ－２Ｒαの有意なダウンレギュレーションもまた観察され、これは、ＩＬ－１３、ＬＩＦ、ＳＬＣ１Ａ４、ＮＦＩＬ３などの古典的なＩＬ－２依存性遺伝子の発現の低減と関連していた（図６Ｇおよび６Ｈ）（Rollings et al., 2018）。我々の結果は、ＩＬ－１０がＩＬ－２への感度を制限することによってＣＤ８の細胞傷害活性を制御し、その消耗を遅らせ得ることを示唆している。単球と同様に、飽和用量未満のＷＴＤは、ＩＬ－１０によって制御される遺伝子のサブセットに差次的に影響し、それらの遺伝子の大半がＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた（図６Ｉ）。興味深いことに、飽和用量未満では、ＷＴＤはＩＬ－１３およびＬＩＦのような古典的なＩＬ－２依存性遺伝子を制御できず、ＩＬ－１０によるＩＬ－２活性の制御には高用量のＩＬ－１０が必要であることが示唆された（図６Ｊ）。
ＩＬ－１０がどのようにＣＤ８Ｔ細胞反応を制御しているかについてより完全な理解を得るため、次に、種々のＩＬ－１０リガンドを用いて処理したＣＤ８Ｔ細胞において転写試験を実施した。ヒトＣＤ８Ｔ細胞を陽性選択によって精製し、図６Ａに示すようにＩＬ－１０ｗｔおよび変異体の存在下で６日間にわたって活性化した。ＣＤ８Ｔ細胞においてＷＴＤによって誘導された転写変化は、単球においてこのサイトカインによって誘導された転写変化ほど劇的ではなかった。有意に制御された遺伝子はわずか１０００個であり、それらの遺伝子の７９％がダウンレギュレートされた（図６Ｂおよび６Ｃ）。より高度に制御された遺伝子を図７Ｄに示す。ＫＥＧＧ経路分析により、ＩＬ－１０に制御される遺伝子はサイトカイン－サイトカイン受容体相互作用に関与していることが示された（図１４Ａ）。際立ったことに、我々はＩＬ－１０がＣＤ８Ｔ細胞の消耗と古典的に関連する遺伝子のダウンレギュレーションを誘導することに気づいた（図６Ｅ）。ＩＬ－１０に制御される遺伝子を、以前に発表された、消耗特異的ＣＤ８Ｔ細胞遺伝子のリストと比較した（Bengsch et al., 2018）。ＩＬ－１０によって制御される消耗遺伝子の４つのクラスタを同定できた。クラスタ１は、消耗したＴ細胞およびＩＬ－１０を用いて処理したＴ細胞の両方においてアップレギュレートされた遺伝子を含む。クラスタ２は、最大のクラスタであり、消耗したＴ細胞においてアップレギュレートされたが、ＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた遺伝子を示す。クラスタ３は、消耗したＴ細胞においてダウンレギュレートされたが、ＩＬ－１０処理によってアップレギュレートされた遺伝子を表し、クラスタ４は、消耗したＴ細胞およびＩＬ－１０処理したＴ細胞の両方においてダウンレギュレートされた遺伝子で構成されている。各クラスタにおける制御された遺伝子の代表的なサンプルを図６Ｆに示す。これらの結果は、ＩＬ－１０が、ＣＤ８Ｔ細胞の消耗を防ぐことによってＣＤ８Ｔ細胞の活性を増強し得ることを示唆している。興味深いことに、ＩＬ－１０処理によるＩＬ－２Ｒαの有意なダウンレギュレーションもまた観察され、これは、ＩＬ－１３、ＬＩＦ、ＳＬＣ１Ａ４、ＮＦＩＬ３などの古典的なＩＬ－２依存性遺伝子の発現の低減と関連していた（図６Ｇおよび６Ｈ）（Rollings et al., 2018）。我々の結果は、ＩＬ－１０がＩＬ－２への感度を制限することによってＣＤ８の細胞傷害活性を制御し、その消耗を遅らせ得ることを示唆している。単球と同様に、飽和用量未満のＷＴＤは、ＩＬ－１０によって制御される遺伝子のサブセットに差次的に影響し、それらの遺伝子の大半がＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた（図６Ｉ）。興味深いことに、飽和用量未満では、ＷＴＤはＩＬ－１３およびＬＩＦのような古典的なＩＬ－２依存性遺伝子を制御できず、ＩＬ－１０によるＩＬ－２活性の制御には高用量のＩＬ－１０が必要であることが示唆された（図６Ｊ）。
【0103】
単球で見られたように、ＷＴＭが示した遺伝子発現の誘導は非常に弱く（図６Ｋおよび１４Ｂ）、これはそのＳＴＡＴ活性が準最適であることと一致している。Ｒ５Ａ１１ＭはここでもＷＴＭと比較して転写反応を増強したが、非常に類似したシグナル伝達プロファイルを活性化したにもかかわらず、二量体リガンドによって誘導された発現レベルに達することはできなかった（図６Ｋおよび１４Ｂ）。実際、ＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｍによって誘導された発現レベルを直接比較すると、高親和性単量体はＩＬ－１０に制御される遺伝子の５６％の活性減少を示した（図１４Ｃ）。単球を用いて得られた結果に類似して、０．１ｎＭのＲ５Ａ１１ＤはＷＴＤ５０ｎＭとともにクラスタ化され、低濃度で効果的に作用するその能力を裏付けた（図６Ｋ）。飽和濃度未満のＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｄによって誘導された発現レベルを比較したところ、ＩＬ－１０に制御される遺伝子の３８％がＲ５Ａ１１Ｄによって増強されることが明らかになり、低用量のＷＴＤによって好ましい発現を示したのはわずか７％であった（図６Ｌおよび１４Ｄ）。このことは、０．１ｎＭのＷＴＤおよびＲ５Ａ１１Ｄによってアップおよびダウンレギュレートされる上位１０個の遺伝子の発現を比較すると明確に反映された（図６Ｍ）。重要なことに、低用量のＷＴＤによって制御されなかった古典的なＩＬ－２依存性遺伝子が、Ｒ５Ａ１１Ｄによっては依然として制御された（図６Ｎ）。まとめると、我々のデータから、ベータ受容体とより強く結合するＩＬ－１０変異体は、より幅広い範囲のリガンド濃度でより強い活性を示すことが確認され、ＩＬ－１０に基づく抗がん免疫療法を後押しする新しい道を開いた。
【0104】
単球およびＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０により制御される差次的遺伝子発現プログラム
我々の研究は、単球およびＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０によって誘導される転写変化についての高度で詳細な説明を提供する。この２つの細胞型がＩＬ－１０によって刺激される方法は明らかに異なるにもかかわらず、ＳＴＡＴ３転写活性を理解するための代理として、２つの細胞サブセットにおいてＩＬ－１０によって誘導される転写プログラムの類似性を調べることにした。種々の処理に起因する可変性を最小化するために、単球およびＣＤ８Ｔ細胞の両方においてＩＬ－１０処理によって制御される遺伝子に焦点を当てた。興味深いことに、１８１個の遺伝子が単球およびＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０によって制御された（図７Ａ）。ＩＬ－１０処理による制御に基づいて、４つの遺伝子クラスタを同定できた（図７Ｂ）。クラスタ１は、単球およびＣＤ８Ｔ細胞の両方においてＩＬ－１０処理によってアップレギュレートされた遺伝子を含む（図７Ｂ）。クラスタ２は、単球ではＩＬ－１０によってダウンレギュレートされたが、ＣＤ８Ｔ細胞ではＩＬ－１０によってアップレギュレートされた遺伝子に対応する。クラスタ３は、単球ではＩＬ－１０処理によってアップレギュレートされ、ＣＤ８Ｔ細胞ではＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた遺伝子を示す。クラスタ４は、単球およびＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた遺伝子を含む。各クラスタにおける制御された遺伝子の代表的なサンプルを図７Ｃに示す。全体として、ＩＬ－１０は単球およびＣＤ８Ｔ細胞間に共通の遺伝子発現プログラムを誘導するが、それらのＩＬ－１０に制御される遺伝子がＩＬ－１０処理によって誘導されるかまたは抑制されるかは、ＩＬ－１０刺激が行われる状況に依存し、サイトカインによるさらなるレベルの遺伝子制御を提供することを、我々の比較研究は強調する。
我々の研究は、単球およびＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０によって誘導される転写変化についての高度で詳細な説明を提供する。この２つの細胞型がＩＬ－１０によって刺激される方法は明らかに異なるにもかかわらず、ＳＴＡＴ３転写活性を理解するための代理として、２つの細胞サブセットにおいてＩＬ－１０によって誘導される転写プログラムの類似性を調べることにした。種々の処理に起因する可変性を最小化するために、単球およびＣＤ８Ｔ細胞の両方においてＩＬ－１０処理によって制御される遺伝子に焦点を当てた。興味深いことに、１８１個の遺伝子が単球およびＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０によって制御された（図７Ａ）。ＩＬ－１０処理による制御に基づいて、４つの遺伝子クラスタを同定できた（図７Ｂ）。クラスタ１は、単球およびＣＤ８Ｔ細胞の両方においてＩＬ－１０処理によってアップレギュレートされた遺伝子を含む（図７Ｂ）。クラスタ２は、単球ではＩＬ－１０によってダウンレギュレートされたが、ＣＤ８Ｔ細胞ではＩＬ－１０によってアップレギュレートされた遺伝子に対応する。クラスタ３は、単球ではＩＬ－１０処理によってアップレギュレートされ、ＣＤ８Ｔ細胞ではＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた遺伝子を示す。クラスタ４は、単球およびＣＤ８Ｔ細胞においてＩＬ－１０処理によってダウンレギュレートされた遺伝子を含む。各クラスタにおける制御された遺伝子の代表的なサンプルを図７Ｃに示す。全体として、ＩＬ－１０は単球およびＣＤ８Ｔ細胞間に共通の遺伝子発現プログラムを誘導するが、それらのＩＬ－１０に制御される遺伝子がＩＬ－１０処理によって誘導されるかまたは抑制されるかは、ＩＬ－１０刺激が行われる状況に依存し、サイトカインによるさらなるレベルの遺伝子制御を提供することを、我々の比較研究は強調する。
【0105】
五量体のＩＬ－１０ムテインとＩＬ－１０ムテイン／ＩＬ－４融合体の作製
我々のデータは、ＩＬ－１０／受容体複合体の安定化が、ＩＬ－１０によるより強力な免疫調節活性をもたらすことを示した。従って、ＩＬ－１０の結合価を増加させることによってＩＬ－１０／受容体複合体をさらに安定化させれば、このリガンドによって誘導される活性の著しい改善がもたらされると仮定する。そのために，ＫＣＴＤタンパク質の五量体ＢＴＢドメインを利用して、該五量体ＢＴＢドメインおよび単量体Ｒ５Ａ１１から構成される融合タンパク質を設計した（図ＸおよびＳｅｑ．ＩＤ．Ｙ）。このキメラタンパク質を高レベルで組換え発現させ、この手法の実現可能性を証明した（図Ｘ）。
我々のデータは、ＩＬ－１０／受容体複合体の安定化が、ＩＬ－１０によるより強力な免疫調節活性をもたらすことを示した。従って、ＩＬ－１０の結合価を増加させることによってＩＬ－１０／受容体複合体をさらに安定化させれば、このリガンドによって誘導される活性の著しい改善がもたらされると仮定する。そのために，ＫＣＴＤタンパク質の五量体ＢＴＢドメインを利用して、該五量体ＢＴＢドメインおよび単量体Ｒ５Ａ１１から構成される融合タンパク質を設計した（図ＸおよびＳｅｑ．ＩＤ．Ｙ）。このキメラタンパク質を高レベルで組換え発現させ、この手法の実現可能性を証明した（図Ｘ）。
【0106】
文献に記載されている抗炎症性リガンドはごくわずかである。その１つがＩＬ－１０であり、これは本発明において操作したものである。さらなる抗炎症性サイトカインはＩＬ－４である。ここでは、これらの２つの分子を含む合成サイトカインが特別な抗炎症特性を持つと仮定した。そのために、我々の単量体高親和性ＩＬ－１０変異体を足場として使用して、３つの異なるＩＬ－４変異体に融合させた。ＩＬ－４変異体１は野生型分子に対応する。ＩＬ－４変異体２は、ＧｃまたはＩＬ－１３Ｒａ１と結合せず、アンタゴニストとして作用するＩＬ－４変異体に対応する。変異体３は、ＩＬ－４Ｒａに対する親和性の低減を示すＩＬ－４変異体に対応する。これらの変異は、合成分子の生体内分布に影響し、興味深い免疫細胞サブセットがそれらの分子の標的になることが期待される。
【0107】
ＣＡＲ Ｔがん療法におけるＩＬ－１０
我々のデータは、ＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害活性を高める上でのＩＬ－１０の積極的な役割を裏付けている。ＩＬ－１０処理は、ＣＤ８Ｔ細胞によるグランザイムＢのアップレギュレーションを誘導し、その消耗遺伝子シグネチャを低減させ、全体として適応度を増加させた。この発見に基づき、次に、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を促進するためにＩＬ－１０を使用する可能性を探求することにした。ＣＡＲ Ｔ細胞は、人工受容体を発現するように操作されたＴ細胞であり、目的の腫瘍細胞を特異的に標的化することが可能である。近年、この療法は多くの可能性を示し、がん免疫療法を改革した。しかしＣＡＲ Ｔ細胞は、操作されたＣＡＲ Ｔ細胞の過剰活性化による消耗を含む、その有効性を低減させるいくつかの欠点を依然として有する。患者への投与前にＣＡＲ Ｔ細胞をＩＬ－１０とともにインキュベートすることで、その適応度を改善し、従ってその殺腫瘍能力を増強することが可能である。この仮説を裏付けるいくつかの予備的な結果をここに提供する。ＩＬ－１０ｗｔまたは我々の操作したＩＬ－１０変異体（Ｒ５Ａ１１）のいずれかを用いて処理したＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのより強い殺傷活性を示し（図１６Ａ）、古典的な細胞傷害性サイトカインであるＩＦＮγのより高度に誘導した（図１６Ｂ）。さらに、我々の高親和性変異体はＩＬ－１０ｗｔよりも強い効果を示し、ＩＬ－１０Ｒｂに対する親和性の増強がＩＬ－１０の免疫活性効力を高めることが再度強調された。
我々のデータは、ＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害活性を高める上でのＩＬ－１０の積極的な役割を裏付けている。ＩＬ－１０処理は、ＣＤ８Ｔ細胞によるグランザイムＢのアップレギュレーションを誘導し、その消耗遺伝子シグネチャを低減させ、全体として適応度を増加させた。この発見に基づき、次に、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を促進するためにＩＬ－１０を使用する可能性を探求することにした。ＣＡＲ Ｔ細胞は、人工受容体を発現するように操作されたＴ細胞であり、目的の腫瘍細胞を特異的に標的化することが可能である。近年、この療法は多くの可能性を示し、がん免疫療法を改革した。しかしＣＡＲ Ｔ細胞は、操作されたＣＡＲ Ｔ細胞の過剰活性化による消耗を含む、その有効性を低減させるいくつかの欠点を依然として有する。患者への投与前にＣＡＲ Ｔ細胞をＩＬ－１０とともにインキュベートすることで、その適応度を改善し、従ってその殺腫瘍能力を増強することが可能である。この仮説を裏付けるいくつかの予備的な結果をここに提供する。ＩＬ－１０ｗｔまたは我々の操作したＩＬ－１０変異体（Ｒ５Ａ１１）のいずれかを用いて処理したＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのより強い殺傷活性を示し（図１６Ａ）、古典的な細胞傷害性サイトカインであるＩＦＮγのより高度に誘導した（図１６Ｂ）。さらに、我々の高親和性変異体はＩＬ－１０ｗｔよりも強い効果を示し、ＩＬ－１０Ｒｂに対する親和性の増強がＩＬ－１０の免疫活性効力を高めることが再度強調された。
【産業上の利用可能性】
【0108】
考察：
ＩＬ－１０は、炎症反応を制御し、ＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強する重要な免疫調節サイトカインである（Moore et al., 2001; Oft, 2014; Walter, 2014）。免疫恒常性を保つその中心的な役割にもかかわらず、ＩＬ－１０がその機能を行う正確な分子メカニズムの知識は依然として乏しい。我々は、ＩＬ－１０が示すＩＬ－１０Ｒβに対する弱い結合親和性が、ＩＬ－１０の免疫調節能を完全に誘発する濃度範囲を制限することによって、その機能適応度に決定的に寄与していると仮定する。ここでは、ＩＬ－１０受容体複合体の安定性がＩＬ－１０の生理活性効力を決定するかを調べるために、ＩＬ－１０を操作してＩＬ－１０Ｒβに対する親和性を増強した。我々の研究からは、主に２つの発見が得られた：（１）親和性を増強したＩＬ－１０変異体は、幅広いリガンド濃度および野生型ＩＬ－１０と異なる免疫細胞サブセットにおいてより強い反応を引き起こすこと、ならびに（２）ＩＬ－１０－受容体複合体の化学量論は、ＳＴＡＴ活性化レベルの制御を超えてＩＬ－１０の生理活性効力に寄与していることである。より一般的に、本研究は、低受容体結合親和性サイトカインの効力を改善するための戦略を概説し、失敗したＩＬ－１０療法を再活性化する可能性を有する新しい分子データおよび細胞データを提示するものである。
ＩＬ－１０は、炎症反応を制御し、ＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強する重要な免疫調節サイトカインである（Moore et al., 2001; Oft, 2014; Walter, 2014）。免疫恒常性を保つその中心的な役割にもかかわらず、ＩＬ－１０がその機能を行う正確な分子メカニズムの知識は依然として乏しい。我々は、ＩＬ－１０が示すＩＬ－１０Ｒβに対する弱い結合親和性が、ＩＬ－１０の免疫調節能を完全に誘発する濃度範囲を制限することによって、その機能適応度に決定的に寄与していると仮定する。ここでは、ＩＬ－１０受容体複合体の安定性がＩＬ－１０の生理活性効力を決定するかを調べるために、ＩＬ－１０を操作してＩＬ－１０Ｒβに対する親和性を増強した。我々の研究からは、主に２つの発見が得られた：（１）親和性を増強したＩＬ－１０変異体は、幅広いリガンド濃度および野生型ＩＬ－１０と異なる免疫細胞サブセットにおいてより強い反応を引き起こすこと、ならびに（２）ＩＬ－１０－受容体複合体の化学量論は、ＳＴＡＴ活性化レベルの制御を超えてＩＬ－１０の生理活性効力に寄与していることである。より一般的に、本研究は、低受容体結合親和性サイトカインの効力を改善するための戦略を概説し、失敗したＩＬ－１０療法を再活性化する可能性を有する新しい分子データおよび細胞データを提示するものである。
【0109】
我々の研究において、ＩＬ－１０は単球の転写プログラムに重大な制御を及ぼし、以前の観察と一致した（Moore et al., 2001）。ＩＬ－１０処理は単球による抗原提示を抑制し、ケモカインおよびケモカイン受容体の発現の制御を通じて炎症性免疫細胞サブセットをリクルートする単球の能力を制限し、ＣＤ９３、ＣＤ４７、ＣＤ１６３などのスカベンジャー受容体およびＩＬ－２１Ｒαなどのサイトカイン受容体のアップレギュレーションを通じて食作用活性を高めた。加えて、ＩＬ－１０処理は、最近の研究（Ip et al., 2017）と一致して、単球の解糖能および脂質生合成能を変化させることによって単球の代謝活性を調節した。興味深いことに、ＩＬ－１０の効果は遺伝子抑制に対してわずかに偏っており、ＩＬ－１０によって制御される遺伝子の５９％がダウンレギュレートされた。実際、いくつかの研究は、他のＳＴＡＴによって誘導される転写を抑制するＳＴＡＴ３の能力を報告しており（Costa-Pereira et al., 2002; Ray et al., 2014; Yang et al., 2011）、ＳＴＡＴ３活性化サイトカインは、他のサイトカインによって誘導される転写プログラムを妨害することによってその機能を誘発し得ることが示唆されている。このモデルと一致して、我々は最近、別のＳＴＡＴ３活性化サイトカインであるＩＬ－６が、クロマチンへの強いＳＴＡＴ３結合を促進するが、遺伝子発現は低いことを報告した（Martinez-Fabregas et al., 2019）。
【0110】
ＩＬ－１０の活性について記載する文献の大多数は、骨髄細胞に焦点を当て、ＩＬ－１０の単回投与をしばしば飽和状態で使用している（de Waal Malefyt et al., 1991a; Ding et al., 1993; Fiorentino et al., 1991a）。しかし、このサイトカインが骨髄細胞において完全な反応を誘発するＩＬ－１０の用量範囲という、このサイトカインの臨床への応用を考慮する上で重要な側面に関しては、あまり理解されていない。ここで我々は、２つの異なる用量のＩＬ－１０を用いて刺激した単球からの転写データを提供し、１つは飽和、２つ目は飽和未満であり、後者はＩＬ－１０療法中に達成される用量により近い（Naing et al., 2018）。興味深いことに、ＩＬ－１０によって制御される遺伝子の２７％が、飽和用量未満のＩＬ－１０を使用したときに影響を受けた。影響を受けた遺伝子の大多数（９５％）は、ＩＬ－１０によってダウンレギュレートされた遺伝子であり、炎症性環境の確立に決定的に寄与するタンパク質、すなわちＩＬ－２４、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ２２などのキーケモカインおよびサイトカインをコードしていた。このデータは、ＩＬ－１０の抗炎症活性がその効果を完全に達成するためには、高用量であることおよび用量の維持が特に必要であることを示唆しており、ＩＬ－１０療法の失敗の一因となっている。我々の操作したＩＬ－１０変異体は、飽和量未満でより強い活性を示し、炎症誘発性ケモカインおよびサイトカイン、すなわちＩＬ－２４、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ２２の強力な抑制を誘導した。従って、我々の操作した変異体は、低リガンド用量で抗炎症活性を促進することにより、失敗したＩＬ－１０療法をレスキューすることが可能であると推測される。
【0111】
ＩＬ－１０によって誘発される抗炎症活性ならびに単球およびマクロファージに対するその効果は非常に十分に文書化されている。一方、ＩＬ－１０がどのようにＣＤ８Ｔ細胞の活性を制御するかは、より不明確であり、より議論の余地がある（Oft, 2014）。ＩＬ－１０がＣＤ８Ｔ細胞の機能および腫瘍細胞を死滅させる能力を増強すると報告する研究がある一方で（Emmerich et al., 2012）、腫瘍の微小環境におけるＩＬ－１０の存在はＴ細胞の活性化を抑制するため、弱い反応が予測されると報告する研究もある（Zhao et al., 2015）。我々の結果は、ＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害活性におけるＩＬ－１０処理の積極的な効果と一致する。ＩＬ－１０の存在下で刺激されたＣＤ８Ｔ細胞は、グランザイムＢなどのエフェクタ分子のレベルの増強を示し、これはＰＥＧ化ＩＬ－１０を用いて治療した患者の腫瘍反応の改善を示す最近の臨床試験と一致する（Naing et al., 2019）。しかし、ＩＬ－１０が抗腫瘍ＣＤ８Ｔ細胞反応を高める分子基盤は、十分に定義されていないままである。我々の転写研究は、ＩＬ－１０を用いて刺激されたＣＤ８Ｔ細胞が、消耗遺伝子シグネチャの低減を示し、より機能的に適応していることを強調した。また、ＩＬ－１０処理したＣＤ８Ｔ細胞はＩＬ－２Ｒαの発現レベルが低く、これらの細胞におけるＩＬ－２遺伝子シグネチャの低減と相関していた。まとめると、我々のデータは、ＩＬ－１０はＣＤ８Ｔ細胞のＩＬ－２への感度を低減させることによって、ＣＤ８Ｔ細胞の過剰活性化を防ぎ、消耗表現型への移行を低下させ得るというモデルと一致している。注目すべきことに、ＩＬ－１０はＣＤ８Ｔ細胞における遺伝子発現を優先的に抑制し、ＩＬ－１０によって制御される遺伝子の７９％がダウンレギュレートされ、ＩＬ－１０によるＳＴＡＴ３の活性化が、関連する遺伝子プロモータへの結合において他のＳＴＡＴと競合し、ＣＤ８Ｔ細胞の反応を微調整し得ることを示唆した。実際、以前の研究において、ＩＬ－２および炎症への細胞の感度に影響を与える遺伝子プロモータへの結合における、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５タンパク質間の競合が報告されている（Yang et al., 2011）。我々の操作したＩＬ－１０変異体は、飽和用量未満を使用した場合、検証したすべての読み取りにおいてＩＬ－１０野生型よりも優れており、単球における我々の観察結果を再現し、治療量で抗腫瘍反応を高める可能性を強調した。
【0112】
ＩＬ－１０の生物学的反応を発生させる上での二量体構造の重要性は、まだ十分に理解されていない。ＷＴＤはＷＴＭの６０倍よくＩＬ－１０Ｒαに結合し、シグナル伝達複合体へのＩＬ－１０Ｒβのより効率的なリクルートおよびより強力な活性に寄与する（参考文献）。逆説的に、Ｒ５Ａ１１ＭはＷＴＤよりも高い親和性でＩＬ－１０Ｒβに結合し、より効率的な受容体会合を誘発するが、ＷＴＤと非常に類似した程度までＳＴＡＴを活性化するにもかかわらず、引き起こす転写反応はより弱い。加えて、ウイルス性ＩＬ－１０（二量体リガンドも）は、ＷＴＭよりも低い親和性でＩＬ－１０Ｒαと結合するにもかかわらず、ＷＴＤと同じ特異的活性を誘導する（Tan et al., 1993）。全体として、これらの観察は、受容体結合親和性に加えてＩＬ－１０－受容体複合体の化学量論が、ＩＬ－１０生理活性効力の微調整に寄与していることを示唆している。我々は最近、サイトカイン受容体細胞内ドメインにおいて利用可能なホスホチロシンの数が、サイトカインによるシグナル伝達同一性の定義に決定的に寄与することを示した（Martinez-Fabregas et al., 2019）。ｇｐ１３０細胞内ドメインで利用可能なＴｙｒの部分的リン酸化を引き起こしたＩＬ－６変異体は、ＳＴＡＴ３対ＳＴＡＴ１活性化の偏りを示した（Martinez-Fabregas et al., 2019）。単量体および二量体ＩＬ－１０リガンド間の機能的差異を説明するために、類似のモデルが援用される可能性がある。二量体ＩＬ－１０変異体は、ＩＬ－１０ＲαおよびＩＬ－１０Ｒβの２分子に結合し、リン酸化に利用可能なＴｙｒを単量体リガンドの２倍提供する。この結果、リン酸化Ｔｙｒの局所濃度の増加がもたらされ、単量体リガンドにリクルートされないさらなるシグナル伝達分子と結合し、機能特異性を提供する可能性がある。このモデルと一致して、ＷＴＭおよびＲ５Ａ１１Ｍは、ＣＤ８Ｔ細胞において偏ったＳＴＡＴ３活性化を誘発した。さらなる研究において、ＷＴＤによって結合された六量体複合体において利用可能なＴｙｒの数が多いことが、そのシグナル伝達シグネチャおよび生物学的同一性の定義に寄与しているかどうかについて取り組む必要がある。
【0113】
我々の研究は、ＩＬ－１０の濃度が治療的介入中に達成されるような準最適なものであることが、どのように差次的にＩＬ－１０の免疫調節特性に影響するかを詳細に記載するものである。ＩＬ－１０の濃度が低下すると、このサイトカインによって誘導される重要な抗炎症活性が失われる。ＩＬ－１０療法は、幅広い範囲の炎症性疾患を有する患者に投与されているが、ほとんどの場合、思わしくない結果しか得られていない（Buruiana et al., 2010; Colombel et al., 2001）。療法中に患部組織において到達されたＩＬ－１０の局所濃度は、十分な抗炎症反応を引き起こすには低すぎると考えられている（Buruiana et al., 2010; Colombel et al., 2001）。加えて、ＩＬ－１０受容体のレベルは種々の骨髄細胞集団間で著しく変化し、そのＩＬ－１０への感度を変化させ、おそらくＩＬ－１０療法において観察される反応の弱さに寄与する（Ding et al., 2001）。重要なことに、ＩＬ－１０の投与は患者の許容性が高く、高用量のＩＬ－１０を使用した場合、いくつかの軽度の副作用しかない（Buruiana et al., 2010; Colombel et al., 2001）。我々の高親和性ＩＬ－１０変異体は、これらの制限を克服し、治療的に適切な用量、例えば１００ｐＭ～１０ｎＭで強い抗炎症および抗がん反応を誘発することにより、ＩＬ－１０療法を再活性化する可能性を有する。
【0114】
参考文献：
BENGSCH, B., OHTANI, T., KHAN, O., SETTY, M., MANNE, S., O'BRIEN, S., GHERARDINI, P. F., HERATI, R. S.,HUANG, A. C., CHANG, K. M., NEWELL, E. W., BOVENSCHEN, N., PE'ER, D., ALBELDA, S. M. & WHERRY, E. J. 2018. Epigenomic-Guided Mass Cytometry Profiling Reveals Disease-Specific Features of Exhausted CD8 T Cells. Immunity, 48, 1029-1045 e5.
Bennett ML, Bennett FC, Liddelow SA, Ajami B, Zamanian JL, Fernhoff NB, Mulinyawe SB, Bohlen CJ, Adil A, Tucker A, Weissman IL, Chang EF, Li G, Grant GA, Hayden Gephart MG, Barres BA. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Mar 22;113(12):E1738-46
BODER, E. T. & WITTRUP, K. D. 1997. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol, 15, 553-7.
CHAO, G., LAU, W. L., HACKEL, B. J., SAZINSKY, S. L., LIPPOW, S. M. & WITTRUP, K. D. 2006. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc, 1, 755-68.
Collin M, Bigley V. Humandendritic cell subsets: an update. Immunology. 2018 May;154(1):3-20.
COSTA-PEREIRA, A. P., TINININI, S., STROBL, B., ALONZI, T., SCHLAAK, J. F., IS'HARC, H., GESUALDO, I., NEWMAN, S. J., KERR, I. M. & POLI, V. 2002. Mutational switch of an IL-6 response to an interferon-gamma-like response. Proc Natl Acad Sci U S A,99, 8043-7.
DALLAGI, A., GIROUARD, J., HAMELIN-MORRISSETTE, J., DADZIE, R., LAURENT, L., VAILLANCOURT, C., LAFOND, J., CARRIER, C. & REYES-MORENO, C. 2015. The activating effect of IFN-gamma on monocytes/macrophages is regulated by the LIF-trophoblast-IL-10 axis via Stat1 inhibition and Stat3 activation. Cell Mol Immunol, 12, 326-41.
DE WAAL MALEFYT, R., ABRAMS, J., BENNETT, B., FIGDOR, C. G. & DE VRIES, J. E. 1991a. Interleukin 10(IL-10) inhibits cytokine synthesis by human monocytes: an autoregulatory role of IL-10 produced by monocytes. J Exp Med, 174, 1209-20.
DING, L., LINSLEY, P. S., HUANG, L. Y., GERMAIN, R. N. & SHEVACH, E. M. 1993. IL-10 inhibits macrophage costimulatory activity by selectively inhibiting the up-regulation of B7 expression. J Immunol, 151, 1224-34.
DING, Y., QIN, L., ZAMARIN, D., KOTENKO, S. V., PESTKA, S., MOORE, K. W. & BROMBERG, J. S. 2001. Differential IL-10R1 expression plays a critical role in IL-10-mediated immune regulation. J Immunol, 167, 6884-92.
Farkas S, Hornung M, Sattler C, Edtinger K, Steinbauer M, Anthuber M, Schlitt HJ, Herfarth H, Geissler EK. Blocking MAdCAM-1 in vivoreduces leukocyte extravasation and reverses chronic inflammation in experimental colitis. Int J Colorectal Dis. 2006 Jan;21(1):71-8.
FINBLOOM, D. S. & WINESTOCK, K. D. 1995. IL-10 induces the tyrosine phosphorylation of tyk2 and Jak1 and the differential assembly of STAT1 alpha and STAT3 complexes in human T cells and monocytes. J Immunol, 155, 1079-90.
FRAIETTA, J. A., LACEY, S. FORLANDO, E. J., PRUTEANU-MALINICI, I., GOHIL, M., LUNDH, S., BOESTEANU, A. C., WANG, Y., O'CONNOR, R. S., HWANG, W. T., PEQUIGNOT, E., AMBROSE, D. E., ZHANG, C., WILCOX, N., BEDOYA, F., DORFMEIER, C., CHEN, F., TIAN, L., PARAKANDI, H., GUPTA, M., YOUNG, R. M., JOHNSON, F. B., KULIKOVSKAYA, I., LIU, L., XU, J., KASSIM, S. H., DAVIS, M. M., LEVINE, B. L., FREY, N. V., SIEGEL, D. L., HUANG, A. C., WHERRY, E. J., BITTER, H., BROGDON, J. L., PORTER, D. L., JUNE, C. H. & MELENHORST, J. J. 2018. Determinants of response and resistance to CD19 chimericantigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med, 24, 563-571.
Gonen T, Guzel S, Keskinbora KH. YKL-40 is a local marker for inflammation in patients with pseudoexfoliation syndrome. Eye (Lond). 2019 May;33(5):772-776.
HUANG DA, W., SHERMAN, B. T. & LEMPICKI, R. A. 2009a. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res, 37,1-13.
HUANG DA, W., SHERMAN, B. T. & LEMPICKI, R. A. 2009b. Systematicand integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc,4, 44-57.
IP, W. K. E., HOSHI, N., SHOUVAL, D. S., SNAPPER, S. & MEDZHITOV, R. 2017. Anti-inflammatory effect of IL-10 mediated by metabolic reprogramming of macrophages. Science,356, 513-519.
ITO, S., ANSARI, P., SAKATSUME, M., DICKENSHEETS, H., VAZQUEZ, N., DONNELLY, R. P., LARNER, A. C. & FINBLOOM, D. S. 1999. Interleukin-10 inhibits expression of both interferon alpha- and interferon gamma- induced genes by suppressing tyrosine phosphorylation of STAT1. Blood, 93, 1456-63.
Jin K, Luo Z, Zhang B, Pang Z. Biomimetic nanoparticles for inflammation targeting. Acta Pharm Sin B. 2018 Jan;8(1):23-33.
JOSEPHSON, K., DIGIACOMOR., INDELICATO, S. R., IYO, A. H., NAGABHUSHAN, T. L., PARKER, M. H., WALTER, M. R. & AYO, A. H. 2000. Design and analysis of an engineered human interleukin-10 monomer. J Biol Chem, 275, 13552-7.
Kelly T, Huang Y, Simms AE, Mazur A. Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;297:83-116.
Kircher M, Herhaus P, Schottelius M, Buck AK, Werner RA, Wester HJ, Keller U, Lapa C. CXCR4-directed theranostics in oncology and inflammation. Ann Nucl Med. 2018 Oct;32(8):503-511.
KIRCHHOFER, A., HELMA, J., SCHMIDTHALS, K., FRAUER, C., CUI, S., KARCHER, A., PELLIS, M., MUYLDERMANS, S., CASAS-DELUCCHI, C. S., CARDOSO, M. C., LEONHARDT, H., HOPFNER, K. P. & ROTHBAUER, U. 2010. Modulation of protein properties in living cells using nanobodies. Nature Structural & Molecular Biology, 17, 133-U162.
KRUTZIK, P. O. & NOLAN, G. P. 2006. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods, 3, 361-8.
LAPORTE, S. L., JUO, Z. S., VACLAVIKOVA, J., COLF, L. A., QI, X., HELLER, N. M., KEEGAN, A. D. & GARCIA, K. C. 2008. Molecular and structural basis of cytokine receptor pleiotropy in the interleukin-4/13 system. Cell, 132, 259-72.
Lemanska-Perek A, Adamik B. Fibronectin and its soluble EDA-FN isoform as biomarkers for inflammation and sepsis. Adv Clin Exp Med. 2019 Nov;28(11):1561-1567.
MARTINEZ-FABREGAS, J., WILMES, S., WANG, L., HAFER, M., POHLER, E., LOKAU, J., GARBERS, C., COZZANI, A., FYFE, P. K., PIEHLER, J., KAZEMIAN, M., MITRA, S. & MORAGA, I. 2019. Kinetics of cytokine receptor trafficking determine signaling and functional selectivity. Elife, 8.
Mejias-Luque R, Linden SK, Garrido M, Tye H, Najdovska M, Jenkins BJ, Iglesias M, Ernst M, de Bolos C. Inflammation modulates the expression of the intestinal mucins MUC2 and MUC4 in gastric tumors. Oncogene. 2010 Mar 25;29(12):1753-62.
MENDOZA, J. L., SCHNEIDER, W. M., HOFFMANN, H. H., VERCAUTEREN, K., JUDE, K. M., XIONG, A., MORAGA, I., HORTON, T. M., GLENN, J. S., DE JONG, Y. P., RICE, C. M. & GARCIA, K. C. 2017. The IFN-λ-IFN-λR1-IL-10Rβ Complex Reveals Structural Features Underlying Type III IFN Functional Plasticity. Immunity, 46, 379-392.
MITTAL, S. K. & ROCHE, P. A. 2015. Suppression of antigen presentation by IL-10. Curr Opin Immunol, 34,22-7.
MOORE, K. W., DE WAAL MALEFYT, R., COFFMAN, R. L. & O'GARRA, A. 2001. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol, 19, 683-765.
MORAGA, I., RICHTER, D., WILMES, S., WINKELMANN, H., JUDE, K., THOMAS, C., SUHOSKI, M. M., ENGLEMAN, E. G., PIEHLER, J. & GARCIA, K. C. 2015a. Instructive roles for cytokine-receptor binding parameters in determining signaling and functional potency. Science Signaling, 8.
MORAGA, I., RICHTER, D., WILMES, S., WINKELMANN, H., JUDE, K., THOMAS, C., SUHOSKI, M. M., ENGLEMAN, E. G., PIEHLER, J. & GARCIA, K. C. 2015b. Instructive roles for cytokine-receptor binding parameters in determining signaling and functional potency. Sci Signal, 8, ra114.
MORAGA, I., WERNIG, G., WILMES, S., GRYSHKOVA, V., RICHTER, C. P., HONG, W. J., SINHA, R., GUO, F., FABIONAR, H., WEHRMAN, T. S., KRUTZIK, P., DEMHARTER, S., PLO, I., WEISSMAN, I. L., MINARY, P., MAJETI, R., CONSTANTINESCU, S. N., PIEHLER, J. & GARCIA, K. C. 2015c. Tuning cytokine receptor signaling by re-orienting dimer geometry with surrogate ligands. Cell, 160, 1196-208.
Moutel S, Beugnet A, Schneider A, Lombard B, Loew D, Amigorena S, Perez F, Segura E. Surface LSP-1 Is a Phenotypic Marker Distinguishing Human Classical versus Monocyte-Derived Dendritic Cells. iScience. 2020 Apr 24;23(4):100987
NAING, A., INFANTE, J. R., PAPADOPOULOS, K. P., CHAN, I. H., SHEN, C., RATTI, N. P., ROJO, B., AUTIO, K. A., WONG, D. J., PATEL, M. R., OTT, P. A., FALCHOOK, G. S., PANT, S., HUNG, A., PEKAREK, K. L., WU, V., ADAMOW, M., MCCAULEY, S., MUMM, J. B., WONG, P., VAN VLASSELAER, P., LEVEQUE, J., TANNIR, N. M. & OFT, M. 2018. PEGylated IL-10 (Pegilodecakin) Induces Systemic Immune Activation, CD8. Cancer Cell, 34,775-791.e3.
OFT, M. 2014. IL-10: master switch from tumor-promoting inflammation to antitumor immunity. Cancer Immunol Res, 2, 194-9.
RAY, J. P., MARSHALL, H. D., LAIDLAW, B. J., STARON, M. M., KAECH, S. M. & CRAFT, J. 2014. Transcription factor STAT3 and type I interferons are corepressive insulators for differentiation of follicular helper and T helper 1 cells. Immunity, 40, 367-77.
Rhodes JW, Tong O, Harman AN, Turville SG. Humandendritic Cell Subsets, Ontogeny, and Impact on HIV Infection. Front Immunol. 2019 May 16;10:1088.
ROLLINGS, C. M., SINCLAIR, L. V., BRADY, H. J. M., CANTRELL, D. A. & ROSS, S. H. 2018. Interleukin-2 shapes the cytotoxic T cell proteome and immune environment-sensing programs. Sci Signal, 11.
Saxena M, Bhardwaj N. Turbocharging vaccines: emerging adjuvants for dendritic cell based therapeutic cancer vaccines. Curr Opin Immunol. 2017 Aug;47:35-43.
Siew JJ, Chen HM, Chen HY, Chen HL, Chen CM, Soong BW, Wu YR, Chang CP, Chan YC, Lin CH, Liu FT, Chern Y. Galectin-3 is required for the microglia-mediated brain inflammation in a model of Huntington's disease. Nat Commun. 2019 Aug 2;10(1):3473.
Spangler, J.B., Moraga, I., Jude, K.M., Savvides, C.S., and Garcia, K.C. (2019). A strategy for the selection of monovalent antibodies that span protein dimer interfaces. J Biol Chem 294, 13876-13886.
Tan, J.C., Indelicato, S.R., Narula, S.K., Zavodny, P.J., and Chou, C.C. (1993). Characterization of interleukin-10 receptors on human and mouse cells. J Biol Chem 268, 21053-21059.
WALTER, M. R. 2014. The molecular basis of IL-10 function: from receptor structure to the onset of signaling. Curr Top Microbiol Immunol, 380, 191-212.
WEHINGER, J., GOUILLEUX, F., GRONER, B., FINKE, J., MERTELSMANN, R. & WEBER-NORDT, R. M. 1996. IL-10 induces DNA binding activity of three STAT proteins (Stat1, Stat3, and Stat5) and their distinct combinatorial assembly in the promoters of selected genes. FEBS Lett, 394, 365-70.
WILMES, S., BEUTEL, O., LI, Z., FRANCOIS-NEWTON, V., RICHTER, C. P., JANNING, D., KROLL, C., HANHART, P., HOTTE, K., YOU, C., UZE, G., PELLEGRINI, S. & PIEHLER, J. 2015. Receptor dimerization dynamics as a regulatory valve for plasticity of type I interferon signaling. J Cell Biol, 209, 579-93.
WILMES, S., HAFER, M., VUORIO, J., TUCKER, J. A., WINKELMANN, H., LOCHTE, S., STANLY, T. A., PULGAR PRIETO, K. D., POOJARI, C., SHARMA, V., RICHTER, C. P., KURRE, R., HUBBARD, S. R., GARCIA, K. C., MORAGA, I., VATTULAINEN, I., HITCHCOCK, I. S. & PIEHLER, J. 2020. Mechanism of homodimeric cytokine receptor activation and dysregulation by oncogenic mutations. Science, 367, 643-652.
YANG, X. P., GHORESCHI, K., STEWARD-THARP, S. M., RODRIGUEZ-CANALES, J., ZHU, J., GRAINGER, J. R., HIRAHARA, K., SUN, H. W., WEI, L., VAHEDI, G., KANNO, Y., O'SHEA, J. J. & LAURENCE, A. 2011. Opposing regulation of the locus encoding IL-17 through direct, reciprocal actions of STAT3 and STAT5. Nat Immunol, 12, 247-54.
Yazdani S, Bansal R, Prakash J. Drug targeting to myofibroblasts: Implications for fibrosis and cancer. Adv Drug Deliv Rev. 2017 Nov 1;121:101-116.
ZHAO, S., WU, D., WU, P., WANG, Z. & HUANG, J. 2015. Serum IL-10 Predicts Worse Outcome in Cancer Patients: A Meta-Analysis. PLoS One, 10, e0139598.
BENGSCH, B., OHTANI, T., KHAN, O., SETTY, M., MANNE, S., O'BRIEN, S., GHERARDINI, P. F., HERATI, R. S.,HUANG, A. C., CHANG, K. M., NEWELL, E. W., BOVENSCHEN, N., PE'ER, D., ALBELDA, S. M. & WHERRY, E. J. 2018. Epigenomic-Guided Mass Cytometry Profiling Reveals Disease-Specific Features of Exhausted CD8 T Cells. Immunity, 48, 1029-1045 e5.
Bennett ML, Bennett FC, Liddelow SA, Ajami B, Zamanian JL, Fernhoff NB, Mulinyawe SB, Bohlen CJ, Adil A, Tucker A, Weissman IL, Chang EF, Li G, Grant GA, Hayden Gephart MG, Barres BA. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Mar 22;113(12):E1738-46
BODER, E. T. & WITTRUP, K. D. 1997. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol, 15, 553-7.
CHAO, G., LAU, W. L., HACKEL, B. J., SAZINSKY, S. L., LIPPOW, S. M. & WITTRUP, K. D. 2006. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc, 1, 755-68.
Collin M, Bigley V. Humandendritic cell subsets: an update. Immunology. 2018 May;154(1):3-20.
COSTA-PEREIRA, A. P., TINININI, S., STROBL, B., ALONZI, T., SCHLAAK, J. F., IS'HARC, H., GESUALDO, I., NEWMAN, S. J., KERR, I. M. & POLI, V. 2002. Mutational switch of an IL-6 response to an interferon-gamma-like response. Proc Natl Acad Sci U S A,99, 8043-7.
DALLAGI, A., GIROUARD, J., HAMELIN-MORRISSETTE, J., DADZIE, R., LAURENT, L., VAILLANCOURT, C., LAFOND, J., CARRIER, C. & REYES-MORENO, C. 2015. The activating effect of IFN-gamma on monocytes/macrophages is regulated by the LIF-trophoblast-IL-10 axis via Stat1 inhibition and Stat3 activation. Cell Mol Immunol, 12, 326-41.
DE WAAL MALEFYT, R., ABRAMS, J., BENNETT, B., FIGDOR, C. G. & DE VRIES, J. E. 1991a. Interleukin 10(IL-10) inhibits cytokine synthesis by human monocytes: an autoregulatory role of IL-10 produced by monocytes. J Exp Med, 174, 1209-20.
DING, L., LINSLEY, P. S., HUANG, L. Y., GERMAIN, R. N. & SHEVACH, E. M. 1993. IL-10 inhibits macrophage costimulatory activity by selectively inhibiting the up-regulation of B7 expression. J Immunol, 151, 1224-34.
DING, Y., QIN, L., ZAMARIN, D., KOTENKO, S. V., PESTKA, S., MOORE, K. W. & BROMBERG, J. S. 2001. Differential IL-10R1 expression plays a critical role in IL-10-mediated immune regulation. J Immunol, 167, 6884-92.
Farkas S, Hornung M, Sattler C, Edtinger K, Steinbauer M, Anthuber M, Schlitt HJ, Herfarth H, Geissler EK. Blocking MAdCAM-1 in vivoreduces leukocyte extravasation and reverses chronic inflammation in experimental colitis. Int J Colorectal Dis. 2006 Jan;21(1):71-8.
FINBLOOM, D. S. & WINESTOCK, K. D. 1995. IL-10 induces the tyrosine phosphorylation of tyk2 and Jak1 and the differential assembly of STAT1 alpha and STAT3 complexes in human T cells and monocytes. J Immunol, 155, 1079-90.
FRAIETTA, J. A., LACEY, S. FORLANDO, E. J., PRUTEANU-MALINICI, I., GOHIL, M., LUNDH, S., BOESTEANU, A. C., WANG, Y., O'CONNOR, R. S., HWANG, W. T., PEQUIGNOT, E., AMBROSE, D. E., ZHANG, C., WILCOX, N., BEDOYA, F., DORFMEIER, C., CHEN, F., TIAN, L., PARAKANDI, H., GUPTA, M., YOUNG, R. M., JOHNSON, F. B., KULIKOVSKAYA, I., LIU, L., XU, J., KASSIM, S. H., DAVIS, M. M., LEVINE, B. L., FREY, N. V., SIEGEL, D. L., HUANG, A. C., WHERRY, E. J., BITTER, H., BROGDON, J. L., PORTER, D. L., JUNE, C. H. & MELENHORST, J. J. 2018. Determinants of response and resistance to CD19 chimericantigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med, 24, 563-571.
Gonen T, Guzel S, Keskinbora KH. YKL-40 is a local marker for inflammation in patients with pseudoexfoliation syndrome. Eye (Lond). 2019 May;33(5):772-776.
HUANG DA, W., SHERMAN, B. T. & LEMPICKI, R. A. 2009a. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res, 37,1-13.
HUANG DA, W., SHERMAN, B. T. & LEMPICKI, R. A. 2009b. Systematicand integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc,4, 44-57.
IP, W. K. E., HOSHI, N., SHOUVAL, D. S., SNAPPER, S. & MEDZHITOV, R. 2017. Anti-inflammatory effect of IL-10 mediated by metabolic reprogramming of macrophages. Science,356, 513-519.
ITO, S., ANSARI, P., SAKATSUME, M., DICKENSHEETS, H., VAZQUEZ, N., DONNELLY, R. P., LARNER, A. C. & FINBLOOM, D. S. 1999. Interleukin-10 inhibits expression of both interferon alpha- and interferon gamma- induced genes by suppressing tyrosine phosphorylation of STAT1. Blood, 93, 1456-63.
Jin K, Luo Z, Zhang B, Pang Z. Biomimetic nanoparticles for inflammation targeting. Acta Pharm Sin B. 2018 Jan;8(1):23-33.
JOSEPHSON, K., DIGIACOMOR., INDELICATO, S. R., IYO, A. H., NAGABHUSHAN, T. L., PARKER, M. H., WALTER, M. R. & AYO, A. H. 2000. Design and analysis of an engineered human interleukin-10 monomer. J Biol Chem, 275, 13552-7.
Kelly T, Huang Y, Simms AE, Mazur A. Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;297:83-116.
Kircher M, Herhaus P, Schottelius M, Buck AK, Werner RA, Wester HJ, Keller U, Lapa C. CXCR4-directed theranostics in oncology and inflammation. Ann Nucl Med. 2018 Oct;32(8):503-511.
KIRCHHOFER, A., HELMA, J., SCHMIDTHALS, K., FRAUER, C., CUI, S., KARCHER, A., PELLIS, M., MUYLDERMANS, S., CASAS-DELUCCHI, C. S., CARDOSO, M. C., LEONHARDT, H., HOPFNER, K. P. & ROTHBAUER, U. 2010. Modulation of protein properties in living cells using nanobodies. Nature Structural & Molecular Biology, 17, 133-U162.
KRUTZIK, P. O. & NOLAN, G. P. 2006. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods, 3, 361-8.
LAPORTE, S. L., JUO, Z. S., VACLAVIKOVA, J., COLF, L. A., QI, X., HELLER, N. M., KEEGAN, A. D. & GARCIA, K. C. 2008. Molecular and structural basis of cytokine receptor pleiotropy in the interleukin-4/13 system. Cell, 132, 259-72.
Lemanska-Perek A, Adamik B. Fibronectin and its soluble EDA-FN isoform as biomarkers for inflammation and sepsis. Adv Clin Exp Med. 2019 Nov;28(11):1561-1567.
MARTINEZ-FABREGAS, J., WILMES, S., WANG, L., HAFER, M., POHLER, E., LOKAU, J., GARBERS, C., COZZANI, A., FYFE, P. K., PIEHLER, J., KAZEMIAN, M., MITRA, S. & MORAGA, I. 2019. Kinetics of cytokine receptor trafficking determine signaling and functional selectivity. Elife, 8.
Mejias-Luque R, Linden SK, Garrido M, Tye H, Najdovska M, Jenkins BJ, Iglesias M, Ernst M, de Bolos C. Inflammation modulates the expression of the intestinal mucins MUC2 and MUC4 in gastric tumors. Oncogene. 2010 Mar 25;29(12):1753-62.
MENDOZA, J. L., SCHNEIDER, W. M., HOFFMANN, H. H., VERCAUTEREN, K., JUDE, K. M., XIONG, A., MORAGA, I., HORTON, T. M., GLENN, J. S., DE JONG, Y. P., RICE, C. M. & GARCIA, K. C. 2017. The IFN-λ-IFN-λR1-IL-10Rβ Complex Reveals Structural Features Underlying Type III IFN Functional Plasticity. Immunity, 46, 379-392.
MITTAL, S. K. & ROCHE, P. A. 2015. Suppression of antigen presentation by IL-10. Curr Opin Immunol, 34,22-7.
MOORE, K. W., DE WAAL MALEFYT, R., COFFMAN, R. L. & O'GARRA, A. 2001. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol, 19, 683-765.
MORAGA, I., RICHTER, D., WILMES, S., WINKELMANN, H., JUDE, K., THOMAS, C., SUHOSKI, M. M., ENGLEMAN, E. G., PIEHLER, J. & GARCIA, K. C. 2015a. Instructive roles for cytokine-receptor binding parameters in determining signaling and functional potency. Science Signaling, 8.
MORAGA, I., RICHTER, D., WILMES, S., WINKELMANN, H., JUDE, K., THOMAS, C., SUHOSKI, M. M., ENGLEMAN, E. G., PIEHLER, J. & GARCIA, K. C. 2015b. Instructive roles for cytokine-receptor binding parameters in determining signaling and functional potency. Sci Signal, 8, ra114.
MORAGA, I., WERNIG, G., WILMES, S., GRYSHKOVA, V., RICHTER, C. P., HONG, W. J., SINHA, R., GUO, F., FABIONAR, H., WEHRMAN, T. S., KRUTZIK, P., DEMHARTER, S., PLO, I., WEISSMAN, I. L., MINARY, P., MAJETI, R., CONSTANTINESCU, S. N., PIEHLER, J. & GARCIA, K. C. 2015c. Tuning cytokine receptor signaling by re-orienting dimer geometry with surrogate ligands. Cell, 160, 1196-208.
Moutel S, Beugnet A, Schneider A, Lombard B, Loew D, Amigorena S, Perez F, Segura E. Surface LSP-1 Is a Phenotypic Marker Distinguishing Human Classical versus Monocyte-Derived Dendritic Cells. iScience. 2020 Apr 24;23(4):100987
NAING, A., INFANTE, J. R., PAPADOPOULOS, K. P., CHAN, I. H., SHEN, C., RATTI, N. P., ROJO, B., AUTIO, K. A., WONG, D. J., PATEL, M. R., OTT, P. A., FALCHOOK, G. S., PANT, S., HUNG, A., PEKAREK, K. L., WU, V., ADAMOW, M., MCCAULEY, S., MUMM, J. B., WONG, P., VAN VLASSELAER, P., LEVEQUE, J., TANNIR, N. M. & OFT, M. 2018. PEGylated IL-10 (Pegilodecakin) Induces Systemic Immune Activation, CD8. Cancer Cell, 34,775-791.e3.
OFT, M. 2014. IL-10: master switch from tumor-promoting inflammation to antitumor immunity. Cancer Immunol Res, 2, 194-9.
RAY, J. P., MARSHALL, H. D., LAIDLAW, B. J., STARON, M. M., KAECH, S. M. & CRAFT, J. 2014. Transcription factor STAT3 and type I interferons are corepressive insulators for differentiation of follicular helper and T helper 1 cells. Immunity, 40, 367-77.
Rhodes JW, Tong O, Harman AN, Turville SG. Humandendritic Cell Subsets, Ontogeny, and Impact on HIV Infection. Front Immunol. 2019 May 16;10:1088.
ROLLINGS, C. M., SINCLAIR, L. V., BRADY, H. J. M., CANTRELL, D. A. & ROSS, S. H. 2018. Interleukin-2 shapes the cytotoxic T cell proteome and immune environment-sensing programs. Sci Signal, 11.
Saxena M, Bhardwaj N. Turbocharging vaccines: emerging adjuvants for dendritic cell based therapeutic cancer vaccines. Curr Opin Immunol. 2017 Aug;47:35-43.
Siew JJ, Chen HM, Chen HY, Chen HL, Chen CM, Soong BW, Wu YR, Chang CP, Chan YC, Lin CH, Liu FT, Chern Y. Galectin-3 is required for the microglia-mediated brain inflammation in a model of Huntington's disease. Nat Commun. 2019 Aug 2;10(1):3473.
Spangler, J.B., Moraga, I., Jude, K.M., Savvides, C.S., and Garcia, K.C. (2019). A strategy for the selection of monovalent antibodies that span protein dimer interfaces. J Biol Chem 294, 13876-13886.
Tan, J.C., Indelicato, S.R., Narula, S.K., Zavodny, P.J., and Chou, C.C. (1993). Characterization of interleukin-10 receptors on human and mouse cells. J Biol Chem 268, 21053-21059.
WALTER, M. R. 2014. The molecular basis of IL-10 function: from receptor structure to the onset of signaling. Curr Top Microbiol Immunol, 380, 191-212.
WEHINGER, J., GOUILLEUX, F., GRONER, B., FINKE, J., MERTELSMANN, R. & WEBER-NORDT, R. M. 1996. IL-10 induces DNA binding activity of three STAT proteins (Stat1, Stat3, and Stat5) and their distinct combinatorial assembly in the promoters of selected genes. FEBS Lett, 394, 365-70.
WILMES, S., BEUTEL, O., LI, Z., FRANCOIS-NEWTON, V., RICHTER, C. P., JANNING, D., KROLL, C., HANHART, P., HOTTE, K., YOU, C., UZE, G., PELLEGRINI, S. & PIEHLER, J. 2015. Receptor dimerization dynamics as a regulatory valve for plasticity of type I interferon signaling. J Cell Biol, 209, 579-93.
WILMES, S., HAFER, M., VUORIO, J., TUCKER, J. A., WINKELMANN, H., LOCHTE, S., STANLY, T. A., PULGAR PRIETO, K. D., POOJARI, C., SHARMA, V., RICHTER, C. P., KURRE, R., HUBBARD, S. R., GARCIA, K. C., MORAGA, I., VATTULAINEN, I., HITCHCOCK, I. S. & PIEHLER, J. 2020. Mechanism of homodimeric cytokine receptor activation and dysregulation by oncogenic mutations. Science, 367, 643-652.
YANG, X. P., GHORESCHI, K., STEWARD-THARP, S. M., RODRIGUEZ-CANALES, J., ZHU, J., GRAINGER, J. R., HIRAHARA, K., SUN, H. W., WEI, L., VAHEDI, G., KANNO, Y., O'SHEA, J. J. & LAURENCE, A. 2011. Opposing regulation of the locus encoding IL-17 through direct, reciprocal actions of STAT3 and STAT5. Nat Immunol, 12, 247-54.
Yazdani S, Bansal R, Prakash J. Drug targeting to myofibroblasts: Implications for fibrosis and cancer. Adv Drug Deliv Rev. 2017 Nov 1;121:101-116.
ZHAO, S., WU, D., WU, P., WANG, Z. & HUANG, J. 2015. Serum IL-10 Predicts Worse Outcome in Cancer Patients: A Meta-Analysis. PLoS One, 10, e0139598.
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図1-6】
【図1-7】
【図1-8】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図4-6】
【図4-7】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図6(K)】
【図6-6】
【図6-7】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図9-5】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12A-1】
【図12A-2】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13-1】
【図13-2】
【図14A-1】
【図14A-2】
【図14B-1】
【図14B-2】
【図14C】
【図14D】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】