知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧 ▶ ノバルティス アーゲーの特許一覧
特表2023-528801バリアントキャプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-06
(54)【発明の名称】バリアントキャプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/35 20060101AFI20230629BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230629BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230629BHJP
C07K 14/015 20060101ALI20230629BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230629BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230629BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230629BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20230629BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230629BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20230629BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230629BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230629BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20230629BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20230629BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230629BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20230629BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20230629BHJP
【ＦＩ】
C12N15/35 ZNA
C12N7/01
C12N15/09 Z
C07K14/015
A61P27/02
A61K35/76
A61K9/08
A61P27/06
A61K31/7088
A61K38/08
A61K38/10
C12N15/62 Z
C12N15/113 Z
C12N15/115 Z
C12N15/12
C12N15/54
C12N15/55
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022573159
(86)(22)【出願日】2021-05-27
(85)【翻訳文提出日】2023-01-06
(86)【国際出願番号】 US2021034624
(87)【国際公開番号】W WO2021243085
(87)【国際公開日】2021-12-02
(31)【優先権主張番号】63/032,206
(32)【優先日】2020-05-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/187,154
(32)【優先日】2021-05-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(71)【出願人】
【識別番号】504389991
【氏名又は名称】ノバルティス アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】フラナリー ジョン ジー．
(72)【発明者】
【氏名】ゲラー スコット エフ．
(72)【発明者】
【氏名】ゲーリン カレン アイ．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C076AA11
4C076BB24
4C076CC10
4C076FF11
4C076FF32
4C076FF34
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA18
4C084BA23
4C084MA01
4C084MA16
4C084MA58
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA33
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA16
4C086MA58
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA33
4C087AA01
4C087AA02
4C087CA12
4C087CA20
4C087MA01
4C087MA16
4C087MA58
4C087NA14
4C087ZA33
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA01
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、（ａ）バリアントキャプシドタンパク質と、（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供する。ｒＡＡＶビリオンは、遺伝子産物の網膜細胞への送達に有用である。本開示は、遺伝子産物を個体における網膜細胞に送達する方法を提供する。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、（ａ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１及び４～３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有し、前記バリアントキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含みかつ前記異種ペプチドを含まない対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した前記網膜細胞の感染性を付与する、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、及び
（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【請求項2】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、（ａ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号２及び３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有し、前記バリアントキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含みかつ前記異種ペプチドを含まない対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した前記網膜細胞の感染性を付与する、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、及び
（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【請求項3】
前記異種ペプチドは、７アミノ酸の長さを有する、請求項１または２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項4】
前記異種ペプチドは、１０アミノ酸、１６アミノ酸、または２０アミノ酸の長さを有する、請求項１または２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項5】
前記異種ペプチドは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１６アミノ酸の長さを有する、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項6】
前記異種ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項7】
前記異種ペプチドは、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有し、または
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する、
請求項２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項8】
前記異種ペプチドは、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸の長さを有する、請求項２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項9】
前記異種ペプチドは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸の長さを有する、請求項２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項10】
前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して少なくとも５倍増加した前記網膜細胞の感染性を示す、請求項１～９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項11】
前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して少なくとも１０倍増加した前記網膜細胞の感染性を示す、請求項１～９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項12】
前記異種ペプチドの前記挿入により、親ＡＡＶキャプシドタンパク質の連続した一続きの５アミノ酸～２０アミノ酸が置き換えられる、請求項１～９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項13】
前記挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及び６１１に対応するアミノ酸内、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置にある、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項14】
前記挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及び５８８に対応するアミノ酸の間、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置にある、請求項１３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項15】
前記挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８５及び５９８に対応するアミノ酸内、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置にある、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項16】
前記増加した感染性は、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる前記網膜細胞に対する特異性または選択性と比較して増加した前記網膜細胞に対する特異性または選択性を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項17】
前記バリアントキャプシドタンパク質は、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによって誘導される免疫原性のレベルと比較して低下した網膜細胞における免疫原性のレベルを誘導する、請求項１～１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項18】
前記１つ以上の異種遺伝子産物は、干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、請求項１～１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項19】
前記１つ以上の異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、請求項１～１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項20】
前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を高めるポリペプチドである、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項21】
前記ポリペプチドは、光反応性ポリペプチド、オプシン、短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）、中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）、ロドプシン、錐体オプシン、ヒトオプシン、非ヒトオプシン、ヒト化オプシン、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項22】
前記ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド、デアミナーゼ、逆転写酵素、またはその任意の組み合わせもしくは融合体である、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項23】
前記１つ以上の異種遺伝子産物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド及びガイドＲＮＡを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項24】
前記網膜細胞は、光受容体細胞である、請求項１～２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項25】
前記光受容体細胞は、錐体細胞である、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項26】
前記光受容体細胞は、桿体細胞である、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項27】
前記１つ以上のヌクレオチド配列は、プロモーターに動作的に結合されている、請求項１～２６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項28】
前記プロモーターは、網膜細胞特異的プロモーターである、請求項２７に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項29】
前記網膜細胞は、光受容体細胞ではない、請求項１～２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項30】
前記網膜細胞は、オン型双極細胞またはオフ型双極細胞である、請求項１～２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項31】
前記１つ以上のヌクレオチド配列は、オン型双極細胞特異的プロモーターまたはオフ型双極細胞特異的プロモーターに動作的に結合されている、請求項３０に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項32】
前記網膜細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である、請求項１～２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項33】
前記１つ以上のヌクレオチド配列は、ＲＧＣ特異的プロモーターに動作的に結合されている、請求項３２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項34】
前記網膜細胞は、アマクリン細胞である、請求項１～２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項35】
前記１つ以上のヌクレオチド配列は、アマクリン細胞特異的プロモーターに動作的に結合されている、請求項３４に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項36】
前記網膜細胞は、水平細胞である、請求項１～２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項37】
前記１つ以上のヌクレオチド配列は、水平細胞特異的プロモーターに動作的に結合されている、請求項３６に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項38】
請求項１～３７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンを含む組成物。
【請求項39】
（ａ）請求項１～３７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン、及び（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む、薬学的組成物。
【請求項40】
遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法であって、請求項１～３７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンを前記網膜細胞と接触させることを含む、前記方法。
【請求項41】
遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法であって、請求項３８または３９に記載の組成物を前記網膜細胞と接触させることを含む、前記方法。
【請求項42】
前記網膜細胞は、インビトロまたはエクスビボである、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項43】
前記網膜細胞は、インビボである、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項44】
対象における網膜病態または障害を治療する方法であって、請求項１～３７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンの治療的有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項45】
対象における網膜病態または障害を治療する方法であって、請求項３８または３９に記載の組成物の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項46】
前記投与することは、眼内注射または眼内注入を含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項47】
前記眼内注射は、硝子体内注射、網膜下注射、または脈絡膜上注射を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記眼内注入は、硝子体内注入、網膜下注入、または脈絡膜上注入である、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
前記網膜病態または障害は、緑内障、網膜変性症、光受容体機能または活性の喪失、光受容体細胞の喪失、網膜色素変性症、黄斑変性症、網膜分離症、レーバー先天性黒内障、糖尿病性網膜症、色覚異常、または色覚喪失である、請求項４４～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１及び４～３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有する、前記バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【請求項51】
バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号２及び３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有する、前記バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【請求項52】
請求項５０または５１に記載のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項53】
バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号３１及び３４～４５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸～１０アミノ酸の長さを有する、前記バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【請求項54】
バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号３２及び３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸～１０アミノ酸の長さを有する、前記バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【請求項55】
請求項５１または５２に記載のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項56】
前記ポリペプチドは、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）である、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項57】
前記ポリペプチドは、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、及びｍＧｌｕＲ８、またはその機能的断片もしくはバリアントからなる群から選択される代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）である、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項58】
前記ポリペプチドは、ｍＧｌｕＲ２、またはその機能的断片もしくはバリアントである、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項59】
前記ポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項60】
前記ポリペプチドは、親和性タグを含む融合ポリペプチドを含む、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項61】
前記ポリペプチドは、親和性タグを含む融合ポリペプチドを含み、前記親和性タグは、ＳＮＡＰ配列、ＣＬＩＰ配列、またはＨＡＬＯ配列を含む、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項62】
前記ポリペプチドは、親和性タグ配列及びｍＧｌｕＲ配列を含む融合ポリペプチドを含み、前記親和性タグ配列は、ＳＮＡＰ配列を含み、前記ｍＧｌｕＲ配列は、ｍＧｌｕＲ２配列を含む、請求項１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項63】
前記プロモーターは、ＳＮＣＧプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＮＥＦＨプロモーター、ＧＲＫ１プロモーター、ＲＬＢＰ１プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、Ｓｙｎ１プロモーター、及びＳｙｎ１（ｅｎｈＳｙｎ１）プロモーターからなる群から選択される、請求項２７に記載のｒＡＡＶビリオン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２０年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０３２，２０６号、及び２０２１年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１８７，１５４号の利益を主張し、これらの出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０３２，２０６号、及び２０２１年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１８７，１５４号の利益を主張し、これらの出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府支援の研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により付与されたＥＹ０２２９７５の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により付与されたＥＹ０２２９７５の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
序文
視覚は、目の後部に内張りされている薄い層状の構造である網膜に位置する細胞によって媒介される。網膜の後部に存在する光受容体は、光子の吸収に反応し、双極、水平及びアマクリン細胞を含む、網膜における二次及び三次ニューロンを通過するシグナル処理の流れを開始させる。光受容体の下にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、視覚サイクル経路を介して、光子検出分子である１１－ｃｉｓレチナールの再生を促進し、そのため、この光受容体機能の促進に必須である。内側網膜における網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、三次ニューロンからの視覚シグナルを受け取り、活動電位の形態で視覚シグナルを脳に伝達する。
視覚は、目の後部に内張りされている薄い層状の構造である網膜に位置する細胞によって媒介される。網膜の後部に存在する光受容体は、光子の吸収に反応し、双極、水平及びアマクリン細胞を含む、網膜における二次及び三次ニューロンを通過するシグナル処理の流れを開始させる。光受容体の下にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、視覚サイクル経路を介して、光子検出分子である１１－ｃｉｓレチナールの再生を促進し、そのため、この光受容体機能の促進に必須である。内側網膜における網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、三次ニューロンからの視覚シグナルを受け取り、活動電位の形態で視覚シグナルを脳に伝達する。
【0004】
光受容体、ＲＰＥ、双極細胞及び他の細胞における転写産物を含む、網膜細胞において発現した遺伝子における変異は、視覚シグナル処理の断絶及び網膜変性症をもたらす。網膜変性疾患の根底にある変異の多くは、光受容体及びＲＰＥ細胞の死をもたらす。
【0005】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科及びディペンドウイルス属に属しており、それらのメンバーは、複製を促進するためにアデノウイルス等のヘルパーウイルスとの共感染を必要とし、ＡＡＶは、ヘルパーの不在下で潜伏感染を確立する。ビリオンは、２つのオープンリーディングフレーム、ｒｅｐ及びｃａｐを有する４．７ｋｂの１本鎖ＤＮＡゲノムを包含する２５ｎｍの２０面体キャプシドから成る。非構造ｒｅｐ遺伝子が、ウイルス複製に不可欠な４つの調節タンパク質をコードする一方で、ｃａｐは、６０ｍｅｒのキャプシドシェルに組み立てられる３つの構造タンパク質（ＶＰ１～３）をコードする。このウイルスキャプシドは、細胞表面受容体結合、エンドサイトーシス、細胞内移動、及び核内アンパッケージングを含むウイルス形質導入の生物学的障壁の多くを克服するＡＡＶベクターの能力を媒介する。
【発明の概要】
【0006】
概要
本開示は、（ａ）バリアントキャプシドタンパク質と、（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供する。ｒＡＡＶビリオンは、遺伝子産物の網膜細胞への送達に有用である。本開示は、遺伝子産物を個体における網膜細胞に送達する方法を提供する。
本開示は、（ａ）バリアントキャプシドタンパク質と、（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供する。ｒＡＡＶビリオンは、遺伝子産物の網膜細胞への送達に有用である。本開示は、遺伝子産物を個体における網膜細胞に送達する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1A】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図1B】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図1C】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図1D】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図1E】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図1F】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図1G】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図1H】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図1I】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図1J】ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図2】様々なＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１０に対応するアミノ酸配列を提供する。
【図3A】ＡＡＶキャプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアラインメントを提供する。挿入部位は、太字及び下線で示される。
【図3B】ＡＡＶキャプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアラインメントを提供する。挿入部位は、太字及び下線で示される。
【図3C】ＡＡＶキャプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアラインメントを提供する。挿入部位は、太字及び下線で示される。
【図4A】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4B】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4C】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4D】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4E】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4F】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4G】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4H】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4I】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4J】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4K】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4L】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4M】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4N】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4O】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4P】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4Q】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4R】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4S】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4T】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4U】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4V】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図4W】例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を提供する。
【図5A】化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を提供する。
【図5B】化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図5C】化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図5D】化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図5E】化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図5F】化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図6】黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を提供する。
【図7A】野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）Ｃｐｆ１のアミノ酸配列を提供する。
【図7B】アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１のアミノ酸配列を提供する。
【図7C】バリアントＣｐｆ１のアミノ酸配列を提供する。
【図8】霊長類網膜におけるAAVの指向化進化の例示的なワークフローを示す一連の概略図である。
【図9A】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図9B】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図9C】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図9D】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図9E】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図9F】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図9G】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図9H】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図9I】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図9J】本明細書に記載されるバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示している。
【図10】Ａ～Ｃは、配列番号１６（バリアント１）に対応するバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜におけるインビボで観察された結果を提供する。
【図11】Ａ～Ｅは、配列番号１（バリアント２）に対応するバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜におけるインビボで観察された結果を提供する。
【図12】Ａ～Ｆは、配列番号５（バリアント３７）に対応するバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜におけるインビボで観察された結果を提供する。
【図13】Ａ～Ｂは、配列番号６（バリアント３８）に対応するバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜におけるインビボで観察された結果を提供する。
【図14】Ａ～Ｆは、配列番号２６（バリアント４５）に対応するバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜におけるインビボで観察された結果を提供する。
【図15】Ａ～Ｂは、配列番号１２（バリアント４８）に対応するバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜におけるインビボで観察された結果を提供する。
【図16】Ａ～Ｅは、配列番号１３（バリアント４９）に対応するバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜におけるインビボで観察された結果を提供する。
【図17】Ａ～Ｂは、配列番号２７（バリアント５８）に対応するバリアントキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの硝子体内注射後の非ヒト霊長類網膜におけるインビボで観察された結果を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0008】
定義
「網膜細胞」という用語は、本明細書において、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、桿体及び錐体を含む光受容体細胞、ミュラーグリア細胞、アストロサイト（例えば、網膜アストロサイト）、及び網膜色素上皮等の網膜を含む細胞型のうちのいずれかを指し得る。
「網膜細胞」という用語は、本明細書において、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、桿体及び錐体を含む光受容体細胞、ミュラーグリア細胞、アストロサイト（例えば、網膜アストロサイト）、及び網膜色素上皮等の網膜を含む細胞型のうちのいずれかを指し得る。
【0009】
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用されてもよい。本用語は、その他の点で要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。「ｒＡＡＶ」の略語は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される。「ＡＡＶ」という用語には、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ－６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ－７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ－８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ－９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ－１０）、ＡＡＶ１１型（ＡＡＶ－１１）、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶが含まれる。例えば、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３０：３７５を参照されたい。「ＡＡＶ」という用語にはまた、キメラＡＡＶが含まれる。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類から単離されたＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類哺乳動物から単離されたＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳動物（例えば、ウシ）等から単離されたＡＡＶを指す。
【0010】
本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ由来ではないポリヌクレオチド（すなわち、ＡＡＶと異種のポリヌクレオチド）配列、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための目的とする配列を含むＡＡＶベクターを指す。概して、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般的には２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子及びｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。
【0011】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質からなるウイルス粒子（典型的には、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質のすべてによる）及びキャプシド形成されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターを指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、これは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。したがって、ｒＡＡＶ粒子の生成は、ｒＡＡＶベクターの生成を必然的に含み、これは、このようなベクターが、ｒＡＡＶ粒子内に含有されるからである。
【0012】
「パッケージング」は、ＡＡＶ粒子の組立て及びキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。
【0013】
ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製及びキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書でＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
【0014】
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製及びパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びポックスウイルス、例えば、ワクシニアを含む、ＡＡＶのための多様なそのようなヘルパーウイルスが当技術分野で知られている。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物、及び鳥類由来の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣ等の受託者から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらもＡＴＣＣ等の受託者から入手可能である。
【0015】
「ヘルパーウイルス機能（複数可）」は、（本明細書に記載の複製及びパッケージングの他の要件と併せて）ＡＡＶ複製及びパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにおいてコードされた機能（複数可）を指す。本明細書に記載される「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば、必要な機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列をトランスにおいて産生細胞に提供することを含む、いくつかの方法で提供され得る。
【0016】
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、そのウイルス種が向性である細胞に送達することができるポリヌクレオチド構成成分を含むものである。本用語は、必ずしもそのウイルスの任意の複製能力を暗示しない。本明細書で使用される場合、「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、標的細胞に到達し得、標的細胞に感染し得、標的細胞において異種核酸を発現させ得るものである。したがって、「感染性」は、標的細胞に到達し、標的細胞に感染し、標的細胞において異種核酸を発現させるウイルス粒子の能力を指す。感染性は、インビトロ感染性またはインビボ感染性を指し得る。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイは、本開示において他の個所で及び当技術分野で記載されている。ウイルス感染性は、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比として表され得る。総ウイルス粒子は、ウイルスゲノム（ｖｇ）コピーの数として表され得る。ウイルス粒子が細胞において異種核酸を発現させる能力は、「形質導入」と称され得る。ウイルス粒子が細胞において異種核酸を発現する能力は、マーカー遺伝子の評価、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ（例えば、ウイルスがＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含む場合）（ＧＦＰは、ウイルス粒子に感染した細胞において生成され、検出及び／または測定される）、または例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、生成されたタンパク質の測定を含む多数の技術を使用してアッセイされ得る。ウイルス感染性を、全ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率で表すことができる。総ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比を決定する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイを記載している）、及びＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３を参照されたい。
【0017】
「複製コンピテント」ウイルス（例えば、複製コンピテントＡＡＶ）は、感染性であり、かつ感染細胞内で複製されることもできる（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）表現型的に野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製コンピテンスは、概して、機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。概して、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠失のため、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）において複製コンピテントではない。典型的には、そのようなｒＡＡＶベクターは、複製コンピテントＡＡＶがＡＡＶパッケージング遺伝子と入ってくるｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって生成される可能性を最小限に抑えるために、任意のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠失する。いくつかの場合において、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、例えあったとしてもわずかな複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも称される）を含有するものである（例えば、１０２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０４ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０８ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０１２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、またはｒｃＡＡＶなし）。
【0018】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の修飾ヌクレオチドを有し得、非ヌクレオチド構成成分によって妨害され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立て前または後に付与され得る。本明細書で使用されるポリヌクレオチドという用語は、同義に、一本鎖及び二本鎖分子を指す。別途明記または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態とその二本鎖形態を構成することで知られているか、または構成すると予想される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
【0019】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある「配列同一性」パーセントを有し、整列したときに、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが、それら２つの配列を比較したときに同一であることを意味する。配列類似性をいくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、配列は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法及びコンピュータプログラムを用いて整列することができる。別のアラインメントアルゴリズムは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃの完全所有子会社であるＭａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡからのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで利用可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡの部局）に記載されている。配列間のギャップを許容する整列プログラムが特に興味深い。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列整列におけるギャップを許容する一種のアルゴリズムである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ整列方法を用いたＧＡＰプログラムを利用して、配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）を参照されたい。
【0020】
配列同一性を決定するためのＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１））を用いたＢｅｓｔＦｉｔプログラムが興味深い。ギャップ生成ペナルティは一般に、１～５、通常は２～４の範囲であり、多くの実施形態では３である。ギャップ拡大ペナルティは一般に、約０．０１～０．２０の範囲であり、多くの例では０．１０である。このプログラムは、比較するために入力された配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、配列同一性は、このプログラムによって決定されるデフォルトパラメータを用いて決定される。このプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）からも入手可能である。
【0021】
興味深い別のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７－１４９，１９８８，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃに記載されている。配列同一率は、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される：
ミスマッチペナルティ：１．００、
ギャップペナルティ：１．００、
ギャップサイズペナルティ：０．３３、及び
接合ペナルティ：３０．０。
ミスマッチペナルティ：１．００、
ギャップペナルティ：１．００、
ギャップサイズペナルティ：０．３３、及び
接合ペナルティ：３０．０。
【0022】
「遺伝子」は、転写及び翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
【0023】
「ガイドＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）に結合し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドを活性化する「活性化因子」ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）標的核酸とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む「標的化因子」ヌクレオチド配列を含むＲＮＡを指す。「活性化因子」ヌクレオチド配列及び「標的化因子」ヌクレオチド配列は、別個のＲＮＡ分子（例えば、「二重ガイドＲＮＡ」）にあり得、または同一のＲＮＡ分子（「シングルガイドＲＮＡ」）にあり得る。
【0024】
「低分子干渉」もしくは「短干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、目的とする遺伝子（「標的遺伝子」）を標的とするヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対合によって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列がその標的化された遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的である遺伝子を標的とする。いくつかの場合において、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さは、３０ヌクレオチド未満である。いくつかの場合において、二本鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、二本鎖の長さは、１９～２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、その二本鎖を形成する２つの配列間に位置するループ部分を含有し得る。ループの長さは異なり得る。いくつかの場合において、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、３’または５’オーバーハング部分も含有し得る。いくつかの場合において、オーバーハングは、３’または５’オーバーハングであり、０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長である。
【0025】
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」という用語は、内因性マイクロＲＮＡ及び人工マイクロＲＮＡ（例えば、合成ｍｉＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない任意のタイプの干渉ＲＮＡを指す。内因性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの産生利用を調節することが可能なゲノムに天然にコードされる小さなＲＮＡである。人工マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの活性を調節することが可能な、内因性マイクロＲＮＡ以外の任意のタイプのＲＮＡ配列であり得る。マイクロＲＮＡ配列は、これらの配列のうちの任意の１つ以上から構成されるＲＮＡ分子であり得る。マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）配列は、Ｌｉｍ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，９９１－１００８、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１５４０、Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｍｂｒｏｓｅ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８５８－８６１、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５－７３９、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３－８５７、及びＬａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＲＮＡ，９，１７５－１７９等の刊行物に記載されている。マイクロＲＮＡの例には、より大きなＲＮＡの断片であり、またはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｃＲＮＡ、ｔｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、または他の小さなノンコーディングＲＮＡである任意のＲＮＡが含まれる。例えば、米国特許出願２００５０２７２９２３、２００５０２６６５５２、２００５０１４２５８１、及び２００５００７５４９２を参照されたい。「マイクロＲＮＡ前駆体」（または「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」）は、それに組み込まれたマイクロＲＮＡ配列を有するステムループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロＲＮＡ」（または「成熟ｍｉＲＮＡ」）は、マイクロＲＮＡ前駆体（「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」）から切断された、または合成された（例えば、無細胞合成によって実験室で合成された）マイクロＲＮＡを含み、約１９ヌクレオチド～約２７ヌクレオチドの長さを有し、例えば、成熟マイクロＲＮＡは、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、または２７ｎｔの長さを有し得る。成熟マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。
【0026】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、またはライゲーションステップの様々な組み合わせ、及び自然界に見られるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語は、それぞれ、初代のポリヌクレオチド構築物の複製及び最初のウイルス構築物の子孫を含む。
【0027】
「制御因子」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。この調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を与え得、本来、促進的または阻害的であり得る。当技術分野で既知の制御因子は、例えば、プロモーター及びエンハンサー等の転写調節配列である。プロモーターは、ある条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、かつ通常プロモーターから下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。
【0028】
「動作可能に結合される」または「動作的に結合される」は、遺伝エレメントの並列を指し、これらのエレメントは、それらが予想される様式で動作することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写を開始する助けとなる場合、コード領域に動作可能に結合される。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在し得る。
【0029】
「発現ベクター」は、目的とするポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、対象とする標的細胞におけるタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターは、その標的におけるタンパク質の発現を促進するためにコード領域に動作可能に結合される制御因子も含む。制御因子とそれらが発現のために動作的に結合される１つの遺伝子もしくは複数の遺伝子との組み合わせは、「発現カセット」と称されることもあり、その多くは、当技術分野で既知であり、かつ入手可能であるか、または当技術分野で入手可能な構成成分から容易に構成され得る。
【0030】
「異種」とは、比較される実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。その天然コード配列から除去され、かつ自然には結合されていないコード配列に動作可能に結合されるプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常は含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされた異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常コードされない遺伝子産物である。別の例として、キャプシドタンパク質のＧＨループに挿入された異種ペプチドを含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常含まれないペプチドの挿入を含むバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質である。
【0031】
「遺伝子改変」及び「遺伝子修飾」という用語（ならびにそれらの文法的変形）は、本明細書において、遺伝エレメント（例えば、ポリヌクレオチド）が、有糸分裂または減数分裂以外の方法で細胞に導入されるプロセスを指すために同義に使用される。このエレメントは、その細胞に対して異種であり得るか、または、その細胞中にすでに存在するエレメントのさらなるコピーもしくは改良型であり得る。遺伝子改変は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチドリポソーム複合体との接触等の当技術分野で既知の任意のプロセスを介して細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによって達成され得る。遺伝子改変は、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターでの形質導入あるいは感染によっても達成され得る。概して、遺伝エレメントは、細胞内の染色体またはミニ染色体内に導入されるが、その細胞及びその子孫の表現型及び／または遺伝子型を変化させる任意の改変がこの用語に包含される。
【0032】
配列がインビトロで細胞の長期培養中にその機能を発揮するために利用可能である場合、細胞は、遺伝子配列で「安定的に」改変された、形質導入された、遺伝子修飾された、または形質転換されたと称される。通常、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によって遺伝可能でもある遺伝子改変が導入されたという点で「遺伝的に」改変されている（遺伝子修飾されている）。
【0033】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。本用語は、修飾された（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識構成成分との接合）アミノ酸ポリマーも包含する。抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチド等のポリペプチドは、遺伝子産物及びその組成物を哺乳動物対象に送達するという文脈において論じられるとき、無傷のタンパク質の所望の生化学的機能を保持するそれぞれの無傷のポリペプチドまたはその任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、及び遺伝子産物の哺乳動物対象への送達に用いる他のそのような核酸（これは、受容細胞に送達される「導入遺伝子」と称され得る）への言及は、所望の生化学的機能を保持する無傷のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を含む。
【0034】
「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、または他の物質は、存在し得る他の構成成分のうちの少なくともいくつかを欠く物質の調製物を指し、その物質もしくは類似の物質は、天然に存在するか、あるいは最初に調製された形態である。したがって、例えば、単離された物質は、それをソース混合物から濃縮するための精製技法を用いて調製され得る。濃縮度を、溶液の体積当たりの重量等の絶対基準で測定することができるか、またはソース混合物中に存在する第２の干渉する可能性のある物質と関連させて測定することができる。物質の濃縮度の増加は、ますます単離された物質を生成する。いくつかの場合において、単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は精製され、例えば、約８０％～約９０％純粋であるか、少なくとも約９０％純粋であるか、少なくとも約９５％純粋であるか、少なくとも約９８％純粋であるか、または少なくとも約９９％以上純粋である。
【0035】
本明細書で使用される「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、その疾患または症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすいか、その疾患にかかる危険性を有し得るが、まだそれを有すると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発現を阻止すること、及び（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。
【0036】
「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書において同義に使用され、サル及びヒトを含むヒト及び非ヒト霊長類、哺乳動物スポーツ動物（例えば、ウマ、ラクダ等）、哺乳動物家畜動物（例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシ等）、哺乳動物ペット（例えば、イヌ、ネコ等）、ならびに齧歯類（例えば、マウス、ラット等）を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。いくつかの場合において、個体はヒトである。
【0037】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
【0038】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本明細書にも包含される。表示範囲が１つまたは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限定値の片方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【0039】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び物質は、これから説明される。本明細書で言及されるすべての刊行物は、それらの刊行物の引用と関連のある方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【0040】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上、明らかに別段に解される場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意されたい。このため、例えば、「ｒＡＡＶビリオン」への言及は、複数のそのようなビリオンを含み、「キャプシドタンパク質」への言及は、１つ以上のキャプシドタンパク質及び当業者に既知のそれらの同等物への言及を含む等である。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいことにさらに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して「単に」、「のみ」等の排他的な専門用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として役立つことが意図される。
【0041】
明確にするために別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特徴を、単一の実施形態において組み合わせで提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の好適な副組み合わせで提供することもできる。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明確に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素のすべての副組み合わせも本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個別にかつ明確に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
【0042】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【0043】
詳細な説明
本開示は、（ａ）バリアントキャプシドタンパク質と、（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供する。ｒＡＡＶビリオンは、遺伝子産物の網膜細胞への送達に有用である。本開示は、遺伝子産物を個体における網膜細胞に送達する方法を提供する。
本開示は、（ａ）バリアントキャプシドタンパク質と、（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供する。ｒＡＡＶビリオンは、遺伝子産物の網膜細胞への送達に有用である。本開示は、遺伝子産物を個体における網膜細胞に送達する方法を提供する。
【0044】
本開示は、改変されたキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンであって、ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内液と網膜細胞との間の障壁を通過するより高い能力、及びそれにより、野生型ＡＡＶと比較してより高い網膜細胞の感染性を示し、ｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、ｒＡＡＶビリオンを提供する。本開示は、遺伝子産物を個体における網膜細胞に送達する方法を提供する。本開示はまた、網膜細胞に存在する標的核酸を修飾する方法を提供する。
【0045】
本開示は、バリアントキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンであって、組換えｒＡＡＶビリオンは、野生型ＡＡＶと比較してより高い網膜細胞の感染性を示し、ｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、ｒＡＡＶビリオンを提供する。ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内液と網膜細胞との間の障壁を通過する増加した能力を示す。ｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞についての対応する野生型ＡＡＶの感染性と比較して、より高い網膜細胞の感染性を示す。網膜細胞は、光受容体（例えば、桿体、錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、ミュラー細胞（ミュラーグリア細胞）、アストロサイト（例えば、網膜アストロサイト）、双極細胞（例えば、オン型双極細胞、オフ型双極細胞）、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり得る。本開示は、遺伝子産物を個体における網膜細胞に送達する方法、及び眼疾患を治療する方法をさらに提供する。本開示は、改変されたキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンであって、いくつかの場合において、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、または網膜色素上皮への局在化の程度と比較して少なくとも５倍増加した、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの１つ以上への局在化を示し、ｒＡＡＶビリオンは、異種核酸を含む、ｒＡＡＶビリオンを提供する。
【0046】
バリアントＡＡＶキャプシドポリペプチド
本開示は、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する。上記したように、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型または他の参照（「親」）ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して改変されている。改変には、挿入及びスワップ（例えば、連続した一続きのアミノ酸の、連続した一続きの異なるアミノ酸での置き換え）が含まれる。
本開示は、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する。上記したように、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型または他の参照（「親」）ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して改変されている。改変には、挿入及びスワップ（例えば、連続した一続きのアミノ酸の、連続した一続きの異なるアミノ酸での置き換え）が含まれる。
【0047】
いくつかの場合において、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、親ＡＡＶキャプシドタンパク質の表面接触可能（例えば、溶媒接触可能）部分における挿入部位における７アミノ酸～１０アミノ酸長、または１０アミノ酸～２０アミノ酸長の異種ペプチドの挿入を含み、これにより、バリアントキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、特にＡＡＶビリオンが硝子体内に注射された場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した網膜細胞の感染性を付与する。したがって、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、ＡＡＶビリオンが硝子体内液（「硝子体液」）と網膜細胞との間の障壁を通過する増加した能力を付与し、そのような障壁には、例えば、内境界膜（ＩＬＭ）、網膜の細胞外マトリックス、網膜細胞の細胞膜自体、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮が含まれる。いくつかの場合において、網膜細胞は、ミュラー細胞である。他の網膜細胞には、アマクリン細胞、双極細胞、及び水平細胞が含まれる。「約１０アミノ酸～約２０アミノ酸の挿入」は、本明細書において、「ペプチド挿入」（例えば、異種ペプチド挿入）とも称される。「約７アミノ酸～約１０アミノ酸の挿入」は、本明細書において、「ペプチド挿入」（例えば、異種ペプチド挿入）とも称される。「対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質」は、異種ペプチド挿入なしの同一のＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。いくつかの例において、バリアントＡＡＶキャプシドは、１０アミノ酸～２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の単一の異種ペプチドインサートを含む。いくつかの例において、バリアントＡＡＶキャプシドは、７アミノ酸～１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）の単一の異種ペプチドインサートを含む。
【0048】
ＡＡＶキャプシドにおける改変はまた、スワップ、例えば、連続した一続きのアミノ酸の異種ペプチドでの置き換えであり得る。したがって、置き換えは、連続した一続きのアミノ酸に代わる異種ペプチドの挿入である。いくつかの場合において、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、親ＡＡＶキャプシドタンパク質の表面接触可能（例えば、溶媒接触可能）部分における部位における７アミノ酸～１０アミノ酸長、または１０アミノ酸～２０アミノ酸長の異種ペプチドでの連続した一続きのアミノ酸の置き換えを含み、これにより、バリアントキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、特にＡＡＶビリオンが硝子体内に注射された場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した網膜細胞の感染性を付与する。したがって、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、ＡＡＶビリオンが硝子体内液（「硝子体液」）と網膜細胞との間の障壁を通過する増加した能力を付与し、そのような障壁には、例えば、ＩＬＭ、網膜の細胞外マトリックス、網膜細胞の細胞膜自体、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮が含まれる。いくつかの場合において、網膜細胞は、ミュラー細胞である。他の網膜細胞には、アマクリン細胞、双極細胞、及び水平細胞が含まれる。「約７アミノ酸～約１０アミノ酸の置き換え」または「約１０アミノ酸～約２０アミノ酸の置き換え」は、本明細書で「ペプチドスワップ」（例えば、連続した一続きのアミノ酸の異種ペプチドでの置き換え）とも称される。「対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質」は、異種ペプチドなしの同一のＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。いくつかの例において、バリアントＡＡＶキャプシドは、７アミノ酸～１０アミノ酸（例えば、７アミノ酸、８、アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）または１０アミノ酸～２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の単一異種ペプチド置き換えを含む。
【0049】
以下の論述の目的のため、「挿入」は、連続した一続きのアミノ酸の置き換えを有しない異種ペプチドの挿入、及び連続した一続きのアミノ酸の置き換えがある異種ペプチドの挿入の両方を指す。
【0050】
挿入部位は、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ、例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの溶媒接触可能部分にある。ＡＡＶキャプシドのＧＨループ／ループＩＶについては、例えば、ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９、Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７、及びＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照されたい。例えば、挿入部位は、図３Ａ～３Ｃに示されるように、ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸４１１～６５０内にあり得る。例えば、挿入部位は、図２に示されるように、ＡＡＶ２のアミノ酸５７０～６１１内、ＡＡＶ１のアミノ酸５７１～６１２内、ＡＡＶ５のアミノ酸５６０～６０１内、ＡＡＶ６のアミノ酸５７１～６１２内、ＡＡＶ７のアミノ酸５７２～６１３内、ＡＡＶ８のアミノ酸５７３～６１４内、ＡＡＶ９のアミノ酸５７１～６１２内、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５７３～６１４内であり得る。いくつかの場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５８８及び５８９の間、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する挿入部位である。いくつかの場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５８７及び５８８の間にあり、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する挿入部位である。いくつかの場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５７５及び５７６の間にあり、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する挿入部位である。いくつかの場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５８４及び５８５の間にあり、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する挿入部位である。いくつかの場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５９０及び５９１の間にあり、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する挿入部位である。いくつかの場合において、挿入部位は、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質のアミノ酸５８４及び５８５の間にあり、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する挿入部位である。いくつかの場合において、挿入部位は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質のアミノ酸５７５及び５７６の間にあり、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する挿入部位である。いくつかの場合において、置き換えのための部位は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５８４及び５９８の間にあり、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する部位である。
【0051】
いくつかの場合において、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の異種ペプチドが、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶにおける挿入部位に挿入される。いくつかの場合において、約７アミノ酸～約１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）の異種ペプチドが、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶにおける挿入部位に挿入される。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７及び５８８の間、もしくはＡＡＶ２のアミノ酸５８８及び５８９の間、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドサブユニットの対応する位置であり得る。挿入部位５８７／５８８は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。１０アミノ酸～２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の異種ペプチドが、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）における対応する部位に挿入され得る。７アミノ酸～１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）の異種ペプチドがＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）における対応する部位に挿入され得る。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づいて、「ＡＡＶ２のアミノ酸５８７～５８８に対応する」挿入部位が、任意の所与のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のどこにあるかを理解するであろう。様々なＡＡＶ血清型におけるＡＡＶ２のキャプシドタンパク質ＶＰ１（図１Ｂを参照されたい）のアミノ酸５７０～６１１に対応する配列が図２に示されている。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ４についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４４９２７、ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ９５４５９、ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４、ＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３７、及びＡＡＶｒｈ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ８８２０８を参照されたい。例えば、祖先ＡＡＶキャプシドについてはＳａｎｔｉａｇｏ－Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：９３４を参照されたい。様々な血清型のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列は、図１Ａ～１Ｊに提供される。
【0052】
例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７及び５８８の間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０及び５９１の間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５及び５７６の間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０及び５９１の間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９及び５９０の間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０及び５９１の間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８及び５８９の間、ＡＡＶ１０のアミノ酸５８８及び５８９の間、またはＡＡＶ４のアミノ酸５８５及び５８６の間であり得る。挿入部位は、図２において下線が引かれており、アミノ酸付番は、図２において示される付番に基づいている。
【0053】
いくつかの場合において、主題のキャプシドタンパク質には、図３Ａ～３Ｃに示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１０アミノ酸～約２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の異種ペプチドの挿入を有するＧＨループが含まれる。いくつかの場合において、主題のキャプシドタンパク質には、図３Ａ～３Ｃに示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、７アミノ酸～約１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）の異種ペプチドの挿入を有するＧＨループが含まれる。
【0054】
いくつかの場合において、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、親ＡＡＶキャプシドの表面接触可能（例えば、溶媒接触可能）部分において連続アミノ酸のセグメント、または配列の置き換え、または置換を含み、これにより、バリアントキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、特にＡＡＶビリオンが硝子体内に注射された場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した網膜細胞の感染性を付与する。したがって、配列置換を含む主題のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、ＡＡＶビリオンが硝子体液と網膜細胞との間の障壁（そのような障壁には、例えば、内境界膜、網膜の細胞外マトリックス、及び網膜細胞の細胞膜自体が含まれる）を通過する増加した能力を付与する。「約７個の連続アミノ酸～約１０個の連続アミノ酸の置き換え」または「約１０個の連続アミノ酸～約２０個の連続アミノ酸の置き換え」は、本明細書で「ループスワップ」（すなわち、異種ペプチド置換）とも称される。「対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質」は、そのような場合では、主題のループスワップなしの同一のＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。いくつかの例において、バリアントＡＡＶキャプシドは、７アミノ酸～約１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）または１０アミノ酸～約２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の異種ペプチド置換を含む。
【0055】
いくつかの場合において、約７アミノ酸～約１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）の異種ペプチドが、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質における同等数の連続アミノ酸において置換される。いくつかの場合において、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の異種ペプチドが、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質における同等数の連続アミノ酸において置換される。いくつかの場合において、置換は、ＡＡＶ２のおよそアミノ酸５８８、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドサブユニットの対応する位置で始まり、ＡＡＶ２のおよそアミノ酸５９８または別のＡＡＶ血清型のキャプシドサブユニットの対応する位置で終了する。残基５８８～５９８は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。７アミノ酸～約１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）の異種ペプチドがＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）における対応する部位に置換され得る。１０アミノ酸～約２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の異種ペプチドが、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）における対応する部位に置換され得る。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づいて、「ＡＡＶ２のアミノ酸５８８～５９８に対応する」置換部位が、任意の所与のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のどこにあるかを理解するであろう。様々なＡＡＶ血清型におけるＡＡＶ２のキャプシドタンパク質ＶＰ１（図１Ｂを参照されたい）のアミノ酸５８８～５９８に対応するアミノ酸残基が図２に示されている。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ４についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４４９２７、ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ９５４５９、ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４、ＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３７、及びＡＡＶｒｈ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ８８２０８を参照されたい。様々な血清型のＡＡＶのＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列が図１Ａ～１Ｊに提供されている。
【0056】
いくつかの場合において、約７アミノ酸～約１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）の異種ペプチドが、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質における同等数の連続アミノ酸において置換される。いくつかの場合において、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の異種ペプチドが、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質における同等数の連続アミノ酸において置換される。いくつかの場合において、置換は、ＡＡＶ２のおよそアミノ酸５８５、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドサブユニットの対応する位置で始まり、ＡＡＶ２のおよそアミノ酸５９８または別のＡＡＶ血清型のキャプシドサブユニットの対応する位置で終了する。残基５８５～５９８は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。７アミノ酸～約１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）の異種ペプチドがＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）における対応する部位に置換され得る。１０アミノ酸～約２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）の異種ペプチドが、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）における対応する部位に置換され得る。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づいて、「ＡＡＶ２のアミノ酸５８５～５９８に対応する」置換部位が、任意の所与のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のどこにあるかを理解するであろう。様々なＡＡＶ血清型におけるＡＡＶ２のキャプシドタンパク質ＶＰ１（図１Ｂを参照されたい）のアミノ酸５８５～５９８に対応するアミノ酸残基が図２に示されている。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ４についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４４９２７、ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ９５４５９、ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４、ＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３７、及びＡＡＶｒｈ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ８８２０８を参照されたい。
【0057】
挿入／置き換えペプチド
上記したように、約７アミノ酸～約２０アミノ酸長の異種ペプチドが、ＡＡＶキャプシドのＧＨループに挿入され、または当該異種ペプチドによりＡＡＶキャプシドのＧＨループにおける同等数の連続アミノ酸が置き換えられる。単純化のため、「挿入ペプチド」という用語は、親ＡＡＶキャプシドに挿入されるペプチド及びＡＡＶキャプシドのＧＨループにおける連続アミノ酸のセグメントが置き換えられるペプチドの両方を記載するために以下で使用される。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、約７アミノ酸～約１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）である。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）である。
上記したように、約７アミノ酸～約２０アミノ酸長の異種ペプチドが、ＡＡＶキャプシドのＧＨループに挿入され、または当該異種ペプチドによりＡＡＶキャプシドのＧＨループにおける同等数の連続アミノ酸が置き換えられる。単純化のため、「挿入ペプチド」という用語は、親ＡＡＶキャプシドに挿入されるペプチド及びＡＡＶキャプシドのＧＨループにおける連続アミノ酸のセグメントが置き換えられるペプチドの両方を記載するために以下で使用される。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、約７アミノ酸～約１０アミノ酸長（例えば、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、または１０アミノ酸長）である。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、約１０アミノ酸～約２０アミノ酸長（例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長）である。
【0058】
いくつかの場合において、挿入ペプチドは、７アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、８アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、９アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１６アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、２０アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１１アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１２アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１３アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１４アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１５アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１７アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１８アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合において、挿入ペプチドは、１９アミノ酸の長さを有する。
【0059】
いくつかの場合において、ペプチドインサートは、式（Ｉ）のペプチドである：
Ｘ１ＡＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＴＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号４６）
（式中、Ｘ１＝ＬまたはＩ、Ｘ２＝Ｈ、Ｌ、Ｒ、またはＫ、Ｘ３＝Ｑ、Ｇ、Ｓ、またはＤ、Ｘ４＝Ｄ、Ｅ、またはＡ、Ｘ５＝ＴまたはＡ、Ｘ６＝Ｋ、Ｎ、またはＲ、Ｘ７＝Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、またはＡ、及びＸ８＝Ｓ、Ａ、またはＣ）。
Ｘ１ＡＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＴＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号４６）
（式中、Ｘ１＝ＬまたはＩ、Ｘ２＝Ｈ、Ｌ、Ｒ、またはＫ、Ｘ３＝Ｑ、Ｇ、Ｓ、またはＤ、Ｘ４＝Ｄ、Ｅ、またはＡ、Ｘ５＝ＴまたはＡ、Ｘ６＝Ｋ、Ｎ、またはＲ、Ｘ７＝Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、またはＡ、及びＸ８＝Ｓ、Ａ、またはＣ）。
【0060】
式（Ｉ）内のペプチドには、例えば、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＳ（配列番号１）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＡＡ（配列番号２）、ＬＡＨＱＤＴＴＲＰＡ（配列番号３）、ＬＡＲＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４）、ＬＡＨＱＤＳＴＫＮＡ（配列番号５）、ＬＡＨＱＤＡＴＫＮＡ（配列番号６）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＰＡ（配列番号７）、ＩＡＬＳＥＴＴＲＰＡ（配列番号８）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＣ（配列番号９）、ＬＡＬＧＥＡＴＲＰＡ（配列番号１０）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＴＡ（配列番号１１）、ＬＡＬＳＥＡＴＲＰＡ（配列番号１２）、ＬＡＫＤＥＴＫＮＳＡ（配列番号１３）、ＬＡＬＧＥＴＴＫＰＡ（配列番号１４）、及びＬＡＨＱＡＴＴＫＮＡ（配列番号１５）が含まれる。
【0061】
いくつかの場合において、ペプチドインサートは、式（ＩＩ）のペプチドである：
Ｘ１ＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＴＴＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号４７）
（式中、Ｘ１＝ＬまたはＩ、Ｘ２＝Ｈ、Ｌ、またはＲ、Ｘ３＝Ｑ、Ｇ、またはＳ、Ｘ４＝Ｄ、Ｅ、またはＡ、Ｘ５＝ＫまたはＲ、Ｘ６＝Ｎ、Ａ、Ｐ、Ｋ、またはＴ、及びＸ７＝Ｓ、Ａ、またはＣ）。
Ｘ１ＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＴＴＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号４７）
（式中、Ｘ１＝ＬまたはＩ、Ｘ２＝Ｈ、Ｌ、またはＲ、Ｘ３＝Ｑ、Ｇ、またはＳ、Ｘ４＝Ｄ、Ｅ、またはＡ、Ｘ５＝ＫまたはＲ、Ｘ６＝Ｎ、Ａ、Ｐ、Ｋ、またはＴ、及びＸ７＝Ｓ、Ａ、またはＣ）。
【0062】
式（ＩＩ）内のペプチドには、例えば、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＳ（配列番号１）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＡＡ（配列番号２）、ＬＡＨＱＤＴＴＲＰＡ（配列番号３）、ＬＡＲＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＰＡ（配列番号７）、ＩＡＬＳＥＴＴＲＰＡ（配列番号８）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＣ（配列番号９）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＴＡ（配列番号１１）、ＬＡＬＧＥＴＴＫＰＡ（配列番号１４）、及びＬＡＨＱＡＴＴＫＮＡ（配列番号１５）が含まれる。
【0063】
いくつかの場合において、ペプチドインサートは、式（ＩＩＩ）のペプチドである：
ＬＡＨＱＸ１Ｘ２ＴＸ３Ｘ４Ｘ５（配列番号４８）
（式中、Ｘ１は、ＤまたはＡであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ３は、ＫまたはＲであり、Ｘ４は、Ｎ、Ｐ、またはＫであり、Ｘ５は、Ｓ、Ａ、またはＣである）。
ＬＡＨＱＸ１Ｘ２ＴＸ３Ｘ４Ｘ５（配列番号４８）
（式中、Ｘ１は、ＤまたはＡであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ３は、ＫまたはＲであり、Ｘ４は、Ｎ、Ｐ、またはＫであり、Ｘ５は、Ｓ、Ａ、またはＣである）。
【0064】
式（ＩＩＩ）内のペプチドには、例えば、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＳ（配列番号１）、ＬＡＨＱＤＴＴＲＰＡ（配列番号３）、ＬＡＨＱＤＳＴＫＮＡ（配列番号５）、ＬＡＨＱＤＡＴＫＮＡ（配列番号６）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＰＡ（配列番号７）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＣ（配列番号９）、及びＬＡＨＱＡＴＴＫＮＡ（配列番号１５）が含まれる。
【0065】
いくつかの場合において、ペプチドインサートは、式（ＩＶ）のペプチドである：
ＬＡＬＸ１ＥＸ２ＴＸ３Ｘ４Ａ（配列番号４９）
（式中、Ｘ１は、ＧまたはＳであり、Ｘ２は、ＴまたはＡであり、Ｘ３は、ＲまたはＫであり、Ｘ４は、Ａ、Ｐ、またはＴである）。
ＬＡＬＸ１ＥＸ２ＴＸ３Ｘ４Ａ（配列番号４９）
（式中、Ｘ１は、ＧまたはＳであり、Ｘ２は、ＴまたはＡであり、Ｘ３は、ＲまたはＫであり、Ｘ４は、Ａ、Ｐ、またはＴである）。
【0066】
式（ＩＶ）内のペプチドには、例えば、ＬＡＬＧＥＴＴＲＡＡ（配列番号２）、ＬＡＬＧＥＡＴＲＰＡ（配列番号１０）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＴＡ（配列番号１１）、ＬＡＬＳＥＡＴＲＰＡ（配列番号１２）、及びＬＡＬＧＥＴＴＫＰＡ（配列番号１４）が含まれる。
【0067】
いくつかの場合において、ペプチドインサートは、式（Ｖ）のペプチドである：
ＬＸ１ＲＧＸ２ＲＱＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＶＮＸ９Ｘ１０（配列番号５０）
（式中、Ｘ１は、ＱまたはＨであり、Ｘ２は、Ｎ、Ｖ、またはＫであり、Ｘ３は、ＱまたはＶであり、Ｘ４は、Ｔ、Ａ、またはＰであり、Ｘ５は、Ｔ、Ａ、またはＳであり、Ｘ６は、ＴまたはＶであり、Ｘ７は、Ａ、Ｅ、またはＬであり、Ｘ８は、ＤまたはＥであり、Ｘ９は、Ｔ、Ｓ、Ｋ、Ｇ、またはＩであり、Ｘ１０は、ＱまたはＬである）。
ＬＸ１ＲＧＸ２ＲＱＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＶＮＸ９Ｘ１０（配列番号５０）
（式中、Ｘ１は、ＱまたはＨであり、Ｘ２は、Ｎ、Ｖ、またはＫであり、Ｘ３は、ＱまたはＶであり、Ｘ４は、Ｔ、Ａ、またはＰであり、Ｘ５は、Ｔ、Ａ、またはＳであり、Ｘ６は、ＴまたはＶであり、Ｘ７は、Ａ、Ｅ、またはＬであり、Ｘ８は、ＤまたはＥであり、Ｘ９は、Ｔ、Ｓ、Ｋ、Ｇ、またはＩであり、Ｘ１０は、ＱまたはＬである）。
【0068】
いくつかの場合において、ペプチドインサートは、式（ＶＩ）のペプチドである：
ＬＸ１ＲＧＮＲＱＸ２Ｘ３ＴＸ４ＤＶＮＸ５Ｘ６（配列番号５１）
（式中、Ｘ１は、ＱまたはＨであり、Ｘ２は、ＡまたはＴであり、Ｘ３は、ＡまたはＴであり、Ｘ４は、ＡまたはＥであり、Ｘ５は、Ｔ、Ｓ、Ｋ、またはＩであり、Ｘ６は、ＱまたはＬである）。
ＬＸ１ＲＧＮＲＱＸ２Ｘ３ＴＸ４ＤＶＮＸ５Ｘ６（配列番号５１）
（式中、Ｘ１は、ＱまたはＨであり、Ｘ２は、ＡまたはＴであり、Ｘ３は、ＡまたはＴであり、Ｘ４は、ＡまたはＥであり、Ｘ５は、Ｔ、Ｓ、Ｋ、またはＩであり、Ｘ６は、ＱまたはＬである）。
【0069】
いくつかの場合において、ペプチドインサートは、式（ＶＩＩ）のペプチドである：
ＳＸ１ＴＸ２Ｘ３ＰＳＸ４ＴＴＴＱＸ５Ｘ６ＬＱＦＳＱ（配列番号５２）
（式中、Ｘ１は、ＲまたはＫであり、Ｘ２は、ＮまたはＤであり、Ｘ３は、Ｔ、Ｓ、またはＩであり、Ｘ４は、ＧまたはＥであり、Ｘ５は、ＳまたはＰであり、Ｘ６は、Ｔ、Ｒ、またはＳである）。
ＳＸ１ＴＸ２Ｘ３ＰＳＸ４ＴＴＴＱＸ５Ｘ６ＬＱＦＳＱ（配列番号５２）
（式中、Ｘ１は、ＲまたはＫであり、Ｘ２は、ＮまたはＤであり、Ｘ３は、Ｔ、Ｓ、またはＩであり、Ｘ４は、ＧまたはＥであり、Ｘ５は、ＳまたはＰであり、Ｘ６は、Ｔ、Ｒ、またはＳである）。
【0070】
ペプチドの例は、以下の表１に提供されている。
【表1】
【0071】
いくつかの場合において、式Ｉ～ＶＩＩのいずれか１つのペプチドインサート、または表１に示されるペプチドは、ペプチドのＮ末端に１つまたは２つのリンカーアミノ酸及び／またはペプチドのＣ末端に１つ以上のアミノ酸をさらに含む。例えば、いくつかの場合において、ペプチドインサートは、Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－［式Ｉ～ＶＩＩのいずれか１つのペプチド］－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒを含む。別の例として、いくつかの場合において、ペプチドインサートは、Ｌｅｕ－Ａｌａ－［式Ｉ～ＶＩのいずれか１つのペプチド］－Ａｌａを含む。別の例として、いくつかの場合において、ペプチドインサートは、Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－［式Ｉ～ＶＩＩのいずれか１つのペプチド］－Ｇｌｎを含む。いくつかの場合において、ペプチドインサートは、いかなるリンカーアミノ酸も含まない。
【0072】
いくつかの場合において、ペプチドインサートは、式（ＶＩＩＩ）のペプチドである：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＴＸ５Ｘ６（配列番号５３）
（式中、Ｘ１＝Ｈ、Ｌ、Ｒ、またはＫであり、Ｘ２＝Ｑ、Ｇ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ３＝Ｄ、Ｅ、またはＡであり、Ｘ４＝ＴまたはＡであり、Ｘ５＝Ｋ、Ｎ、またはＲであり、Ｘ６＝Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、またはＡである）。
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＴＸ５Ｘ６（配列番号５３）
（式中、Ｘ１＝Ｈ、Ｌ、Ｒ、またはＫであり、Ｘ２＝Ｑ、Ｇ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ３＝Ｄ、Ｅ、またはＡであり、Ｘ４＝ＴまたはＡであり、Ｘ５＝Ｋ、Ｎ、またはＲであり、Ｘ６＝Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、またはＡである）。
【0073】
式（ＶＩＩＩ）内のペプチドには、例えば、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号３１）、ＬＧＥＴＴＲＡ（配列番号３２）、ＨＱＤＴＴＲＰ（配列番号３３）、ＲＱＤＴＴＫＮ（配列番号３４）、ＨＱＤＳＴＫＮ（配列番号３５）、ＨＱＤＡＴＫＮＡ（配列番号３６）、ＨＱＤＴＴＫＰ（配列番号３７）、ＬＳＥＴＴＲＰ（配列番号３８）、ＨＱＤＴＴＫＫ（配列番号３９）、ＬＧＥＡＴＲＰ（配列番号４０）、ＬＧＥＴＴＲＴ（配列番号４１）、ＬＳＥＡＴＲＰ（配列番号４２）、ＫＤＥＴＫＮＳ（配列番号４３）、ＬＧＥＴＴＫＰ（配列番号４４）、及びＨＱＡＴＴＫＮ（配列番号４５）が含まれる。これらのペプチドは、以下の表２に示されている。
【0074】
【表2】
【0075】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンキャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約２０アミノ酸（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の挿入以外に、任意の他のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含んでいない。他の場合において、主題のｒＡＡＶビリオンキャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約２０アミノ酸（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の挿入に加えて、親ＡＡＶキャプシドタンパクと比較して１～約２５アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。例えば、いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンキャプシドには、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約２０アミノ酸（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の挿入に加えて、親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して、１～約５、約５～約１０、約１０～約１５、約１５～約２０、または約２０～約２５アミノ酸の挿入、欠失、または置換が含まれる。ある特定の例では、親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の欠失が、ペプチド挿入の部位で生じる。
【0076】
いくつかの場合において、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含まない：Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、及びＹ７３０Ｆ。
【0077】
いくつかの場合において、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドは、上述の挿入ペプチドに加えて、以下のアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含む：Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、及びＹ７３０Ｆ。
【0078】
いくつかの場合において、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドは、キメラキャプシドであり、例えば、そのキャプシドは、第１のＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドの一部及び第２の血清型のＡＡＶキャプシドの一部を含み、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約１０アミノ酸～約２０アミノ酸（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の挿入を含む。いくつかの場合において、本開示のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドは、キメラキャプシドであり、例えば、そのキャプシドは、第１のＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドの一部及び第２の血清型のＡＡＶキャプシドの一部を含み、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約１０アミノ酸（例えば、７、８、９、または１０アミノ酸）の挿入を含む。
【0079】
組換えＡＡＶビリオン
本開示は、（ｉ）本開示のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチド（すなわち、非ＡＡＶポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。
本開示は、（ｉ）本開示のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチド（すなわち、非ＡＡＶポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。
【0080】
いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、図１Ａ～１Ｊのいずれか１つに提供されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約１０アミノ酸～約２０アミノ酸（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図４に提供されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び図１Ｂに示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸５８７及び５８８の間、または対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対する対応する部位に約１０アミノ酸～約２０アミノ酸（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。
【0081】
いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、図１Ａ～１Ｊのいずれか１つに提供されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約１０アミノ酸（例えば、７、８、９、または１０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図１Ｂに提供されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び図１Ｂに示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸５８７及び５８８の間、または対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対する対応する部位に約７アミノ酸～約１０アミノ酸（例えば、７、８、９、または１０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。
【0082】
いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、図１Ｂに提供されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約１０アミノ酸～約２０アミノ酸（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図１Ｂに提供されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び図１Ｂに示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸５８５及び５９８の間、または対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対する対応する部位に約１０アミノ酸～約２０アミノ酸（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。
【0083】
いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、図１Ｂに提供されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約１０アミノ酸（例えば、７、８、９、または１０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図１Ｂに提供されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び図１Ｂに示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸５８５及び５９８の間、または対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対する対応する部位に約７アミノ酸～約１０アミノ酸（例えば、７、８、９、または１０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。
【0084】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図１Ａ～１Ｊのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ約７アミノ酸～約１０アミノ酸（例えば、７、８、９、または１０アミノ酸）の挿入を含むＧＨループを含むキャプシドタンパク質を含み、挿入部位は、図２及び図３に示される太字及び下線のアミノ酸の間にある。いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図１Ａ～１Ｊのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ約７アミノ酸～約１０アミノ酸（例えば、７、８、９、または１０アミノ酸）の挿入を含むＧＨループを含むキャプシドタンパク質を含み、挿入部位は、図２及び図３に示される太字及び下線のアミノ酸の間にある。
【0085】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図１Ａ～１Ｊに提供されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及びＡＡＶ２のアミノ酸５８７及び５８８の間、または別のＡＡＶ遺伝子型に対する対応する部位で約１０アミノ酸～約２０アミノ酸（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。いくつかの場合において、対応する挿入部位は、図２または図３において太字及び下線によって示される部位である。いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図１Ａ～１Ｊに提供されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及びＡＡＶ２のアミノ酸５８７及び５８８の間、または別のＡＡＶ遺伝子型に対する対応する部位で約７アミノ酸～約１０アミノ酸（例えば、７、８、９、または１０アミノ酸）の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。いくつかの場合において、対応する挿入部位は、図２または図３において太字及び下線によって示される部位である。
【0086】
本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した網膜細胞の感染性を示す。
【0087】
所与のｒＡＡＶビリオンが、増加した網膜細胞の感染性を示すかどうかは、ｒＡＡＶビリオンの硝子体内投与後に、ｒＡＡＶビリオンによってコードされる異種遺伝子産物の網膜細胞における発現を検出することによって決定され得る。例えば、（ａ）上述したペプチドインサートまたはペプチド置き換えを含む本開示のバリアントキャプシド、及び（ｂ）異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む本開示のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に投与された場合、（ａ）ペプチドインサートまたはペプチド置き換えを含まない対照ＡＡＶキャプシド、及び（ｂ）異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む対照ｒＡＡＶビリオンが硝子体内に投与された場合に生じる網膜細胞における遺伝子産物のレベルよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い網膜細胞における異種遺伝子産物のレベルをもたらす。
【0088】
所与のｒＡＡＶビリオンが、増加した網膜細胞の感染性を示すかどうかは、網膜細胞におけるｒＡＡＶビリオンによってコードされる治療遺伝子産物の治療効果を評価することによって決定され得る。治療効果には、例えば、（ａ）視覚機能、例えば、視野、視力の喪失速度の低下、（ｂ）視覚機能、例えば、視野または視力の改善、（ｃ）光に対する感受性、すなわち、光恐怖症の軽減、眼振の減少等が含まれ得る。例えば、（ａ）上述したペプチドインサートまたはペプチド置き換えを含む本開示のバリアントキャプシド、及び（ｂ）異種治療遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む本開示のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に投与された場合、（ａ）ペプチドインサートまたはペプチド置き換えを含まない対照ＡＡＶキャプシド、及び（ｂ）異種治療遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含む対照ｒＡＡＶビリオンが硝子体内に投与された場合に生じる網膜細胞における治療効果よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い網膜細胞における治療遺伝子産物の治療効果をもたらす。視覚機能のための試験は、当技術分野で知られており、任意のそのような試験は、本開示のｒＡＡＶビリオンが網膜細胞の増加した感染性を示すかどうかを決定するために使用され得る。
【0089】
本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質（すなわち、インサートペプチドまたは置き換えペプチドを有しないＡＡＶキャプシドタンパク質）を含む対照ｒＡＡＶビリオンの能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、硝子体内液と網膜細胞との間の障壁を通過する能力を示す。
【0090】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した網膜細胞の感染性を示す。
【0091】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体細胞の感染性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した光受容体（桿体または錐体）細胞の感染性を示す。
【0092】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体細胞の感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した光受容体（桿体または錐体）細胞の感染性を示す。
【0093】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＧＣの感染性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＲＧＣの感染性を示す。
【0094】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＧＣの感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＲＧＣの感染性を示す。
【0095】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＰＥ細胞の感染性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＲＰＥ細胞の感染性を示す。
【0096】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＰＥ細胞の感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＲＰＥ細胞の感染性を示す。
【0097】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるミュラー細胞の感染性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したミュラー細胞の感染性を示す。
【0098】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるミュラー細胞の感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したミュラー細胞の感染性を示す。
【0099】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる双極細胞の感染性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した双極細胞の感染性を示す。
【0100】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる双極細胞の感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した双極細胞の感染性を示す。
【0101】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるアマクリン細胞の感染性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したアマクリン細胞の感染性を示す。
【0102】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるアマクリン細胞の感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したアマクリン細胞の感染性を示す。
【0103】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる水平細胞の感染性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した水平細胞の感染性を示す。
【0104】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる水平細胞の感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した水平細胞の感染性を示す。
【0105】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜アストロサイトの感染性と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した網膜アストロサイトの感染性を示す。
【0106】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜アストロサイトの感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した網膜アストロサイトの感染性を示す。
【0107】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが網膜の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を通過する能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、網膜のＥＣＭを通過する能力を示す。
【0108】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが網膜の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を通過する能力と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、網膜のＥＣＭを通過する能力を示す。
【0109】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが内境界膜（ＩＬＭ）を通過する能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、ＩＬＭを通過する能力を示す。
【0110】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンがＩＬＭを通過する能力と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＩＬＭを通過する能力を示す。
【0111】
主題のｒＡＡＶビリオンは、ＩＬＭを通過することができ、ミュラー細胞、アマクリン細胞等を含む細胞層を横断して、光受容体細胞及び／またはＲＰＥ細胞に到達することもできる。例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合、ＩＬＭを通過し得、また、ミュラー細胞、アマクリン細胞等を含む細胞層を横断して、光受容体細胞及びまたはＲＰＥ細胞に到達し得る。
【0112】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、または網膜色素上皮への局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの１つ以上の局在化を示す。
【0113】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射された場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む硝子体内に注射された対照ＡＡＶビリオンによるＩＬＭを越えた局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、ＩＬＭを越えた局在化を示す。例えば、いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射された場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む硝子体内に注射された対照ＡＡＶビリオンによるＲＰＥ層への局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、網膜色素上皮（ＲＰＥ）への局在化を示す。別の例として、いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射された場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む硝子体内に注射された対照ＡＡＶビリオンによるＰＲ層への局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、光受容体（ＰＲ）層への局在化を示す。別の例として、いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射された場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む硝子体内に注射された対照ＡＡＶビリオンによる内顆粒層への局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、内顆粒層への局在化を示す。別の例として、いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射された場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む硝子体内に注射された対照ＡＡＶビリオンによる外顆粒層への局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、外顆粒層への局在化を示す。別の例として、いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射された場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む硝子体内に注射された対照ＡＡＶビリオンによる神経節細胞層への局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した、神経節細胞層への局在化を示す。
【0114】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞に選択的に感染し、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、非網膜細胞、例えば、眼の外側の細胞よりも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性で網膜細胞に感染する。例えば、いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞に選択的に感染し、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、非網膜細胞、例えば、眼の外側の細胞よりも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性で光受容体細胞に感染する。
【0115】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、光受容体細胞に選択的に感染し、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、眼に存在する非光受容体細胞、例えば、網膜神経節細胞、ミュラー細胞等よりも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性で光受容体細胞に感染する。
【0116】
いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与された場合に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体細胞の感染性と比較して、硝子体内注射を介して投与された場合に少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した光受容体細胞の感染性を示す。
【0117】
遺伝子産物
本開示のｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の遺伝子産物（１つ以上の異種遺伝子産物）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ＲＮＡである。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、異種核酸遺伝子産物及び異種ポリペプチド遺伝子産物の両方をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物がＲＮＡである場合、いくつかの場合において、ＲＮＡ遺伝子産物は、ポリペプチドをコードする。遺伝子産物がＲＮＡである場合、いくつかの場合において、ＲＮＡ遺伝子産物は、ポリペプチドをコードしない。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、単一の異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が２つの異種遺伝子産物をコードする場合、いくつかの場合において、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同一のプロモーターに動作的に結合される。単一の異種核酸が２つの異種遺伝子産物をコードする場合、いくつかの場合において、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、２つの異なるプロモーターに動作的に結合される。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が３つの異種遺伝子産物をコードする場合、いくつかの場合において、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同一のプロモーターに動作的に結合される。単一の異種核酸が３つの異種遺伝子産物をコードする場合、いくつかの場合において、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、２つまたは３つの異なるプロモーターに動作的に結合される。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、２つの異種核酸を含み、各々は、異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む。
本開示のｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の遺伝子産物（１つ以上の異種遺伝子産物）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ＲＮＡである。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、異種核酸遺伝子産物及び異種ポリペプチド遺伝子産物の両方をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物がＲＮＡである場合、いくつかの場合において、ＲＮＡ遺伝子産物は、ポリペプチドをコードする。遺伝子産物がＲＮＡである場合、いくつかの場合において、ＲＮＡ遺伝子産物は、ポリペプチドをコードしない。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、単一の異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が２つの異種遺伝子産物をコードする場合、いくつかの場合において、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同一のプロモーターに動作的に結合される。単一の異種核酸が２つの異種遺伝子産物をコードする場合、いくつかの場合において、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、２つの異なるプロモーターに動作的に結合される。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が３つの異種遺伝子産物をコードする場合、いくつかの場合において、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同一のプロモーターに動作的に結合される。単一の異種核酸が３つの異種遺伝子産物をコードする場合、いくつかの場合において、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、２つまたは３つの異なるプロモーターに動作的に結合される。いくつかの場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、２つの異種核酸を含み、各々は、異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0118】
いくつかの場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドをコードするＲＮＡである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、アプタマーである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、治療ポリペプチド、例えば、臨床的利益を提供するポリペプチドである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、標的核酸の修飾を提供するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ｉ）標的核酸の修飾を提供するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）標的核酸における標的配列に結合する第１のセグメント及びＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントを含むガイドＲＮＡである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ｉ）標的核酸の修飾を提供するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、ｉｉ）標的核酸における第１の標的配列に結合する第１のセグメント及びＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントを含む第１のガイドＲＮＡ、及びｉｉｉ）標的核酸における第２の標的配列に結合する第１のセグメント及びＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントを含む第１のガイドＲＮＡである。
【0119】
干渉ＲＮＡ
遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、好適なＲＮＡｉには、細胞におけるアポトーシスまたは血管新生因子のレベルを低下させるＲＮＡｉが含まれる。例えば、ＲＮＡｉは、細胞におけるアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを減少させるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。自身の遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書で「プロアポトーシス遺伝子」と称され、それらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「プロアポトーシス遺伝子産物」と称される。プロアポトーシス遺伝子産物には、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、及びＢａｄ遺伝子産物が含まれる。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照されたい。
遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、好適なＲＮＡｉには、細胞におけるアポトーシスまたは血管新生因子のレベルを低下させるＲＮＡｉが含まれる。例えば、ＲＮＡｉは、細胞におけるアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを減少させるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。自身の遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書で「プロアポトーシス遺伝子」と称され、それらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「プロアポトーシス遺伝子産物」と称される。プロアポトーシス遺伝子産物には、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、及びＢａｄ遺伝子産物が含まれる。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照されたい。
【0120】
干渉ＲＮＡはまた、血管新生産物、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（例えば、Ｃａｎｄ５、例えば、米国特許公開第２０１１／０１４３４００号、米国特許公開第２００８／０１８８４３７号、及びＲｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０を参照されたい）、ＶＥＧＦ受容体－１（ＶＥＧＦＲ１）（例えば、Ｓｉｒｎａ－０２７、例えば、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５０：３３、及びＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：２２５を参照されたい）、またはＶＥＧＦ受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）（Ｋｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：１５０６４）に対するものであり得る。米国特許第６，６４９，５９６号、同第６，３９９，５８６号、同第５，６６１，１３５号、同第５，６３９，８７２号、及び同第５，６３９，７３６号、ならびに米国特許第７，９４７，６５９号及び同第７，９１９，４７３号も参照されたい。
【0121】
アプタマー
遺伝子産物がアプタマーである場合、目的とする例示的なアプタマーには、ＶＥＧＦに対するアプタマーが含まれる。例えば、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１２３、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１８９０２を参照されたい。例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、ヌクレオチド配列５’－ｃｇｃａａｕｃａｇｕｇａａｕｇｃｕｕａｕａｃａｕｃｃｇ－３’（配列番号５７）を含み得る。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）特異的アプタマー、例えば、Ｅ１００３０も使用するのに好適であり、例えば、Ｎｉ ａｎｄ Ｈｕｉ（２００９）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ ２２３：４０１、及びＡｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０７：４０７を参照されたい）。
遺伝子産物がアプタマーである場合、目的とする例示的なアプタマーには、ＶＥＧＦに対するアプタマーが含まれる。例えば、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１２３、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１８９０２を参照されたい。例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、ヌクレオチド配列５’－ｃｇｃａａｕｃａｇｕｇａａｕｇｃｕｕａｕａｃａｕｃｃｇ－３’（配列番号５７）を含み得る。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）特異的アプタマー、例えば、Ｅ１００３０も使用するのに好適であり、例えば、Ｎｉ ａｎｄ Ｈｕｉ（２００９）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ ２２３：４０１、及びＡｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０７：４０７を参照されたい）。
【0122】
ポリペプチド
遺伝子産物がポリペプチドである場合、いくつかの場合において、ポリペプチドは、網膜細胞の機能、例えば、桿体もしくは錐体光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞の機能を高めるポリペプチドである。例示的なポリペプチドには、神経保護ポリペプチド（例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、及びニュールツリン（ＮＴＮ））、抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ結合抗体、ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、一本鎖抗－ＶＥＧＦ抗体）、エンドスタチン、ツムスタチン、アンジオスタチン、可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９）、可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：１０を参照されたい）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、可溶性Ｔｉｅ－２受容体等）、メタロプロテイナーゼ－３（ＴＩＭＰ－３）の組織阻害剤、光反応性オプシン、例えば、ロドプシン、抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘｌ、ＸＩＡＰ）等が含まれる。好適なポリペプチドには、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン（ＮＴＮ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、例えば、図４Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号９１）の連続した一続きの約２００アミノ酸～２４７アミノ酸と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、上皮成長因子、ロドプシン、アポトーシスのＸ結合阻害剤、及びソニックヘッジホッグが含まれるが、これらに限定されない。
遺伝子産物がポリペプチドである場合、いくつかの場合において、ポリペプチドは、網膜細胞の機能、例えば、桿体もしくは錐体光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞の機能を高めるポリペプチドである。例示的なポリペプチドには、神経保護ポリペプチド（例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、及びニュールツリン（ＮＴＮ））、抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ結合抗体、ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、一本鎖抗－ＶＥＧＦ抗体）、エンドスタチン、ツムスタチン、アンジオスタチン、可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９）、可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：１０を参照されたい）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、可溶性Ｔｉｅ－２受容体等）、メタロプロテイナーゼ－３（ＴＩＭＰ－３）の組織阻害剤、光反応性オプシン、例えば、ロドプシン、抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘｌ、ＸＩＡＰ）等が含まれる。好適なポリペプチドには、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン（ＮＴＮ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、例えば、図４Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号９１）の連続した一続きの約２００アミノ酸～２４７アミノ酸と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、上皮成長因子、ロドプシン、アポトーシスのＸ結合阻害剤、及びソニックヘッジホッグが含まれるが、これらに限定されない。
【0123】
好適なポリペプチドには、オプシン、短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）、中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）、ロドプシン、錐体オプシン、ヒトオプシン、非ヒトオプシン、ヒト化オプシン等が含まれる。
【0124】
ＭＷ－オプシンポリペプチドは、以下のヒトＭＷ－オプシンアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
ＭＡＱＱＷＳＬＱＲＬ ＡＧＲＨＰＱＤＳＹＥ ＤＳＴＱＳＳＩＦＴＹ ＴＮＳＮＳＴＲＧＰＦ ＥＧＰＮＹＨＩＡＰＲ ＷＶＹＨＬＴＳＶＷＭ ＩＦＶＶＩＡＳＶＦＴ ＮＧＬＶＬＡＡＴＭＫ ＦＫＫＬＲＨＰＬＮＷ ＩＬＶＮＬＡＶＡＤＬ ＡＥＴＶＩＡＳＴＩＳ ＶＶＮＱＶＹＧＹＦＶ ＬＧＨＰＭＣＶＬＥＧ ＹＴＶＳＬＣＧＩＴＧ ＬＷＳＬＡＩＩＳＷＥ ＲＷＭＶＶＣＫＰＦＧ ＮＶＲＦＤＡＫＬＡＩ ＶＧＩＡＦＳＷＩＷＡ ＡＶＷＴＡＰＰＩＦＧ ＷＳＲＹＷＰＨＧＬＫ ＴＳＣＧＰＤＶＦＳＧ ＳＳＹＰＧＶＱＳＹＭ ＩＶＬＭＶＴＣＣＩＴ ＰＬＳＩＩＶＬＣＹＬ ＱＶＷＬＡＩＲＡＶＡ ＫＱＱＫＥＳＥＳＴＱ ＫＡＥＫＥＶＴＲＭＶ ＶＶＭＶＬＡＦＣＦＣ ＷＧＰＹＡＦＦＡＣＦ ＡＡＡＮＰＧＹＰＦＨ ＰＬＭＡＡＬＰＡＦＦ ＡＫＳＡＴＩＹＮＰＶ ＩＹＶＦＭＮＲＱＦＲ ＮＣＩＬＱＬＦＧＫＫ ＶＤＤＧＳＥＬＳＳＡ ＳＫＴＥＶＳＳＶＳＳ ＶＳＰＡ（配列番号５４）。
ＭＡＱＱＷＳＬＱＲＬ ＡＧＲＨＰＱＤＳＹＥ ＤＳＴＱＳＳＩＦＴＹ ＴＮＳＮＳＴＲＧＰＦ ＥＧＰＮＹＨＩＡＰＲ ＷＶＹＨＬＴＳＶＷＭ ＩＦＶＶＩＡＳＶＦＴ ＮＧＬＶＬＡＡＴＭＫ ＦＫＫＬＲＨＰＬＮＷ ＩＬＶＮＬＡＶＡＤＬ ＡＥＴＶＩＡＳＴＩＳ ＶＶＮＱＶＹＧＹＦＶ ＬＧＨＰＭＣＶＬＥＧ ＹＴＶＳＬＣＧＩＴＧ ＬＷＳＬＡＩＩＳＷＥ ＲＷＭＶＶＣＫＰＦＧ ＮＶＲＦＤＡＫＬＡＩ ＶＧＩＡＦＳＷＩＷＡ ＡＶＷＴＡＰＰＩＦＧ ＷＳＲＹＷＰＨＧＬＫ ＴＳＣＧＰＤＶＦＳＧ ＳＳＹＰＧＶＱＳＹＭ ＩＶＬＭＶＴＣＣＩＴ ＰＬＳＩＩＶＬＣＹＬ ＱＶＷＬＡＩＲＡＶＡ ＫＱＱＫＥＳＥＳＴＱ ＫＡＥＫＥＶＴＲＭＶ ＶＶＭＶＬＡＦＣＦＣ ＷＧＰＹＡＦＦＡＣＦ ＡＡＡＮＰＧＹＰＦＨ ＰＬＭＡＡＬＰＡＦＦ ＡＫＳＡＴＩＹＮＰＶ ＩＹＶＦＭＮＲＱＦＲ ＮＣＩＬＱＬＦＧＫＫ ＶＤＤＧＳＥＬＳＳＡ ＳＫＴＥＶＳＳＶＳＳ ＶＳＰＡ（配列番号５４）。
【0125】
ＬＷ－オプシンは、以下のヒトＬＷ－オプシンアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
ＭＡＱＱＷＳＬＱＲＬ ＡＧＲＨＰＱＤＳＹＥ ＤＳＴＱＳＳＩＦＴＹ ＴＮＳＮＳＴＲＧＰＦ ＥＧＰＮＹＨＩＡＰＲ ＷＶＹＨＬＴＳＶＷＭ ＩＦＶＶＴＡＳＶＦＴ ＮＧＬＶＬＡＡＴＭＫ ＦＫＫＬＲＨＰＬＮＷ ＩＬＶＮＬＡＶＡＤＬ ＡＥＴＶＩＡＳＴＩＳ ＩＶＮＱＶＳＧＹＦＶ ＬＧＨＰＭＣＶＬＥＧ ＹＴＶＳＬＣＧＩＴＧ ＬＷＳＬＡＩＩＳＷＥ ＲＷＭＶＶＣＫＰＦＧ ＮＶＲＦＤＡＫＬＡＩ ＶＧＩＡＦＳＷＩＷＡ ＡＶＷＴＡＰＰＩＦＧ ＷＳＲＹＷＰＨＧＬＫ ＴＳＣＧＰＤＶＦＳＧ ＳＳＹＰＧＶＱＳＹＭ ＩＶＬＭＶＴＣＣＩＩ ＰＬＡＩＩＭＬＣＹＬ ＱＶＷＬＡＩＲＡＶＡ ＫＱＱＫＥＳＥＳＴＱ ＫＡＥＫＥＶＴＲＭＶ ＶＶＭＩＦＡＹＣＶＣ ＷＧＰＹＴＦＦＡＣＦ ＡＡＡＮＰＧＹＡＦＨ ＰＬＭＡＡＬＰＡＹＦ ＡＫＳＡＴＩＹＮＰＶ ＩＹＶＦＭＮＲＱＦＲ ＮＣＩＬＱＬＦＧＫＫ ＶＤＤＧＳＥＬＳＳＡ ＳＫＴＥＶＳＳＶＳＳ ＶＳＰＡ（配列番号５５）。
ＭＡＱＱＷＳＬＱＲＬ ＡＧＲＨＰＱＤＳＹＥ ＤＳＴＱＳＳＩＦＴＹ ＴＮＳＮＳＴＲＧＰＦ ＥＧＰＮＹＨＩＡＰＲ ＷＶＹＨＬＴＳＶＷＭ ＩＦＶＶＴＡＳＶＦＴ ＮＧＬＶＬＡＡＴＭＫ ＦＫＫＬＲＨＰＬＮＷ ＩＬＶＮＬＡＶＡＤＬ ＡＥＴＶＩＡＳＴＩＳ ＩＶＮＱＶＳＧＹＦＶ ＬＧＨＰＭＣＶＬＥＧ ＹＴＶＳＬＣＧＩＴＧ ＬＷＳＬＡＩＩＳＷＥ ＲＷＭＶＶＣＫＰＦＧ ＮＶＲＦＤＡＫＬＡＩ ＶＧＩＡＦＳＷＩＷＡ ＡＶＷＴＡＰＰＩＦＧ ＷＳＲＹＷＰＨＧＬＫ ＴＳＣＧＰＤＶＦＳＧ ＳＳＹＰＧＶＱＳＹＭ ＩＶＬＭＶＴＣＣＩＩ ＰＬＡＩＩＭＬＣＹＬ ＱＶＷＬＡＩＲＡＶＡ ＫＱＱＫＥＳＥＳＴＱ ＫＡＥＫＥＶＴＲＭＶ ＶＶＭＩＦＡＹＣＶＣ ＷＧＰＹＴＦＦＡＣＦ ＡＡＡＮＰＧＹＡＦＨ ＰＬＭＡＡＬＰＡＹＦ ＡＫＳＡＴＩＹＮＰＶ ＩＹＶＦＭＮＲＱＦＲ ＮＣＩＬＱＬＦＧＫＫ ＶＤＤＧＳＥＬＳＳＡ ＳＫＴＥＶＳＳＶＳＳ ＶＳＰＡ（配列番号５５）。
【0126】
ＳＷ－オプシンポリペプチドは、以下のヒトＳＷ－オプシンアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
ＭＲＫＭＳＥＥＥＦＹ ＬＦＫＮＩＳＳＶＧＰ ＷＤＧＰＱＹＨＩＡＰ ＶＷＡＦＹＬＱＡＡＦＭＧＴＶＦＬＩＧＦＰ ＬＮＡＭＶＬＶＡＴＬ ＲＹＫＫＬＲＱＰＬＮ ＹＩＬＶＮＶＳＦＧＧ ＦＬＬＣＩＦＳＶＦＰ ＶＦＶＡＳＣＮＧＹＦ ＶＦＧＲＨＶＣＡＬＥ ＧＦＬＧＴＶＡＧＬＶ ＴＧＷＳＬＡＦＬＡＦ ＥＲＹＩＶＩＣＫＰＦ ＧＮＦＲＦＳＳＫＨＡ ＬＴＶＶＬＡＴＷＴＩ ＧＩＧＶＳＩＰＰＦＦ ＧＷＳＲＦＩＰＥＧＬ ＱＣＳＣＧＰＤＷＹＴ ＶＧＴＫＹＲＳＥＳＹ ＴＷＦＬＦＩＦＣＦＩ ＶＰＬＳＬＩＣＦＳＹ ＴＱＬＬＲＡＬＫＡＶ ＡＡＱＱＱＥＳＡＴＴ ＱＫＡＥＲＥＶＳＲＭ ＶＶＶＭＶＧＳＦＣＶ ＣＹＶＰＹＡＡＦＡＭ ＹＭＶＮＮＲＮＨＧＬ ＤＬＲＬＶＴＩＰＳＦ ＦＳＫＳＡＣＩＹＮＰ ＩＩＹＣＦＭＮＫＱＦ ＱＡＣＩＭＫＭＶＣＧ ＫＡＭＴＤＥＳＤＴＣ ＳＳＱＫＴＥＶＳＴＶ ＳＳＴＱＶＧＰＮ（配列番号５６）。
ＭＲＫＭＳＥＥＥＦＹ ＬＦＫＮＩＳＳＶＧＰ ＷＤＧＰＱＹＨＩＡＰ ＶＷＡＦＹＬＱＡＡＦＭＧＴＶＦＬＩＧＦＰ ＬＮＡＭＶＬＶＡＴＬ ＲＹＫＫＬＲＱＰＬＮ ＹＩＬＶＮＶＳＦＧＧ ＦＬＬＣＩＦＳＶＦＰ ＶＦＶＡＳＣＮＧＹＦ ＶＦＧＲＨＶＣＡＬＥ ＧＦＬＧＴＶＡＧＬＶ ＴＧＷＳＬＡＦＬＡＦ ＥＲＹＩＶＩＣＫＰＦ ＧＮＦＲＦＳＳＫＨＡ ＬＴＶＶＬＡＴＷＴＩ ＧＩＧＶＳＩＰＰＦＦ ＧＷＳＲＦＩＰＥＧＬ ＱＣＳＣＧＰＤＷＹＴ ＶＧＴＫＹＲＳＥＳＹ ＴＷＦＬＦＩＦＣＦＩ ＶＰＬＳＬＩＣＦＳＹ ＴＱＬＬＲＡＬＫＡＶ ＡＡＱＱＱＥＳＡＴＴ ＱＫＡＥＲＥＶＳＲＭ ＶＶＶＭＶＧＳＦＣＶ ＣＹＶＰＹＡＡＦＡＭ ＹＭＶＮＮＲＮＨＧＬ ＤＬＲＬＶＴＩＰＳＦ ＦＳＫＳＡＣＩＹＮＰ ＩＩＹＣＦＭＮＫＱＦ ＱＡＣＩＭＫＭＶＣＧ ＫＡＭＴＤＥＳＤＴＣ ＳＳＱＫＴＥＶＳＴＶ ＳＳＴＱＶＧＰＮ（配列番号５６）。
【0127】
好適な光反応性オプシンには、例えば、米国特許公開第２００７／０２６１１２７号（例えば、チャネルロドプシン－２、ＣｈＲ２、Ｃｈｏｐ２）、米国特許公開第２００１／００８６４２１号、米国特許公開第２０１０／００１５０９５号、米国特許公開第２０１６／０００２３０２号、米国特許公開第２０１３／０３４７１３７号、米国特許公開第２０１３／００１９３２５号、及びＤｉｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：３８７に記載される光反応性オプシンが含まれる。Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０（２６）：８７４５－８７５８、Ｌａｇａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１（６）：６６７－６７５、Ｄｏｒｏｕｄｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（７）：１２２０－１２２９、Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｖｉｓ．Ｒｅｓ．９：３７４、Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２：１４３４を参照されたい。
【0128】
好適なポリペプチドには、光駆動性イオンチャネルポリペプチドが含まれる。例えば、Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１：Ｅ５５７４を参照されたい。例えば、好適なポリペプチドは、光駆動性イオンチャネル型グルタミン酸受容体（ＬｉＧｌｕＲ）である。光異性化性化合物の存在下での網膜神経節細胞及びオン型双極細胞におけるＬｉＧｌｕＲの発現は、細胞を光に対して反応性とする。ＬｉＧｌｕＲは、Ｌ４３９Ｃ置換を含み、Ｃａｐｏｒａｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９：１２１２－１２１９、Ｖｏｌｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２：４７－５２、及びＧｏｒｏｓｔｉｚａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０４：１０８６５－１０８７０を参照されたい。光異性化性化合物には、例えば、４６０ｎｍでピーク効率を有するマレイミド－アゾベンゼン－グルタメート０が含まれる（ＭＡＧ０４６０）。ＭＡＧ０４６０は、以下の構造を有する：
【0129】
好適なポリペプチドには、レチノスキシン（例えば、図４Ａに示されるアミノ酸配列（配列番号９０）の連続した一続きの約２００アミノ酸～２２４アミノ酸と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）も含まれる。好適なポリペプチドには、例えば、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）相互作用タンパク質－１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９６ＫＮ７、Ｑ９ＥＰＱ２、及びＱ９ＧＬＭ３を参照されたい）（例えば、図４Ｆに示されるアミノ酸配列（配列番号９５）の連続した一続きの約１１５０アミノ酸～約１２００アミノ酸、または約１２００アミノ酸～１２８６アミノ酸と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ペリフェリン－２（Ｐｒｐｈ２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００３１３（例えば、図４Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号９３）の連続した一続きの約３００アミノ酸～３４６アミノ酸と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、及びＴｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：７３３を参照されたい）、ペリフェリン（例えば、図４Ｅに示されるアミノ酸配列（配列番号９４）の連続した一続きの約４００アミノ酸～約４７０アミノ酸と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、網膜色素上皮特異的タンパク質（ＲＰＥ６５）、（例えば、図４Ｃに示されるアミノ酸配列（配列番号９２）の連続した一続きの約２００アミノ酸～２４７アミノ酸と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ３９６６０、及びＭｏｒｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３０８８を参照されたい）、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）（例えば、図４Ｈ、４Ｉ、及び４Ｊのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）（例えば、図４Ｇに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）（例えば、図４Ｓ～４Ｖのうちの１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）等が含まれる。例えば、いくつかの場合において、好適なＲＰＧＲポリペプチドは、図４Ｓに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の例として、いくつかの場合において、好適なＲＰＧＲポリペプチドは、図４Ｔに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合において、好適なＲＰＧＲポリペプチドは、図４Ｕに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合において、好適なＲＰＧＲポリペプチドは、図４Ｖに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0130】
好適なポリペプチドにはまた、欠陥または欠如した場合、先天性脈絡膜欠如を引き起こすポリペプチドであるＣＨＭ（先天性脈絡膜欠如（Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）））（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１７、及びｖａｎ Ｂｏｋｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０４１を参照されたい）、及び欠陥または欠如した場合、レーバー先天性黒内障及び網膜色素変性症を引き起こすポリペプチドであるＣｒｕｍｂｓホモログ１（ＣＲＢ１）（例えば、ｄｅｎ Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２１７、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ２３３２８を参照されたい）が含まれる。例えば、好適なＲＥＰ１ポリペプチドは、図４Ｇに示されるアミノ酸配列セットと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
【0131】
好適なポリペプチドには、桿体ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼサブユニットアルファ（ＰＤＥ６α）、桿体ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム１（ＰＤＥ６βアイソフォーム１）、桿体ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム２（ＰＤＥ６βアイソフォーム２）、桿体ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム３（ＰＤＥ６βアイソフォーム３）が含まれる。例えば、好適なＰＤＥ６αポリペプチドは、図４Ｋに示されるアミノ酸配列セットと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なＰＤＥ６β６アイソフォーム１ポリペプチドは、図４Ｌに示されるアミノ酸配列セットと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なＰＤＥ６β６アイソフォーム２ポリペプチドは、図４Ｍに示されるアミノ酸配列セットと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なＰＤＥ６β６アイソフォーム３ポリペプチドは、図４Ｎに示されるアミノ酸配列セットと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
【0132】
好適なポリペプチドにはまた、欠陥または欠如した場合、色覚異常をもたらすポリペプチド（そのようなポリペプチドには、例えば、錐体光受容体ｃＧＭＰゲート化チャネルサブユニットアルファ（ＣＮＧＡ３）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２８９、及びＢｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１８：１６０－１６７を参照されたい）、錐体光受容体ｃＧＭＰゲート化カチオンチャネルベータ－サブユニット（ＣＮＧＢ３）（例えば、Ｋｏｈｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１３（３）：３０２を参照されたい）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、アルファ形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）（ＡＣＨＭ４）、及びＡＣＨＭ５が含まれる）、及び欠陥または欠如した場合、様々な形態の色覚喪失をもたらすポリペプチド（例えば、Ｌ－オプシン、Ｍ－オプシン、及びＳ－オプシン）が含まれる。Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６１（７２６５）：７８４－７８７を参照されたい。
【0133】
例えば、好適なＣＮＧＡ３（ＡＣＨＭ２としても知られている）アイソフォーム１ポリペプチドは、図４Ｏに示されるアミノ酸配列セットと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なＣＮＧＡ３（ＡＣＨＭ２としても知られている）アイソフォーム２ポリペプチドは、図４Ｐに示されるアミノ酸配列セットと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
【0134】
別の例として、好適なＣＮＧＢ３（ＡＣＨＭ３としても知られている）ポリペプチドは、図４Ｑに示されるアミノ酸配列セットと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、ＧＮＡＴ２（ＡＣＨＭ４としても知られている）は、図４Ｒに示されるアミノ酸配列セットと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
【0135】
他の好適なポリペプチドには、例えば、ヒトもしくは他の種に由来するＧ－タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、またはその機能的断片もしくはバリアントが含まれる。いくつかの場合において、ＧＰＣＲは、阻害性Ｇ－タンパク質（Ｇｉ）結合ＧＰＣＲである。いくつかの場合において、ＧＰＣＲは、刺激性Ｇ－タンパク質（Ｇｑ）結合ＧＰＣＲである。いくつかの場合において、ＧＰＣＲは、刺激性Ｇ－タンパク質（Ｇｓ）結合ＧＰＣＲである。いくつかの場合において、ＧＰＣＲは、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）を含む。より特定の実施形態において、ＧＰＲＣ配列は、ＧＰＲＣ配列の機能的断片またはバリアントを含む。他のより特定の実施形態において、その機能的断片またはバリアントは、野生型ＧＰＲＣの１つ以上の所望の活性を保持し、野生型ヒトＧＰＲＣの配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％またはそれを超える同一性を有する。
【0136】
好適なポリペプチドにはまた、ヒトもしくは他の種に由来する代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）、またはその機能的断片もしくはバリアントが含まれ得る。例えば、いくつかの場合において、ｍＧｌｕＲは、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７及びｍＧｌｕＲ８、またはその機能的断片もしくはバリアントのうちの１つ以上を含む。他のより特定の実施形態において、その機能的断片またはバリアントは、野生型ｍＧｌｕＲの１つ以上の所望の活性を保持し、野生型ヒトｍＧｌｕＲの配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％またはそれを超える同一性を有する。
【0137】
より特定の実施形態において、ポリペプチドは、ヒトｍＧｌｕＲ２ポリペプチド配列、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１４４１６またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００８３９．５に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるｍＧｌｕＲ２ポリペプチド配列である。他の特定の実施形態において、ポリペプチドは、ヒトｍＧｌｕＲ２ポリペプチド配列、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１４４１６またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００８３０．２に示されるポリペプチド配列である。また、ｍＧｌｕＲ２ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列はまた、その機能的断片またはバリアント、例えば、それと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有するものであり得る。例えば、いくつかの場合において、ポリペプチドは、図４Ｗに示されるアミノ酸配列の１９～８７２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0138】
本開示の追加の実施形態において、好適なポリペプチドは、上で論述されるもの等のポリペプチド配列を含有することに加えて、目的とする１つ以上の追加のポリペプチド配列もさらに含む融合ポリペプチドを含む。
【0139】
例えば、いくつかの場合において、好適なポリペプチドは、親和性タグ、例えば、ＳＮＡＰ配列、ＣＬＩＰ配列及び／またはＨＡＬＯ配列を含む融合ポリペプチドを含む。
【0140】
関連する実施形態において、ＳＮＡＰ配列は、以下のアミノ酸配列を含む：ＭＤＫＤＣＥＭＫＲＴＴＬＤＳＰＬＧＫＬＥＬＳＧＣＥＱＧＬＨＲＩＩＦＬＧＫＧＴＳＡＡＤＡＶＥＶＰＡＰＡＡＶＬＧＧＰＥＰＬＭＱＡＴＡＷＬＮＡＹＦＨＱＰＥＡＩＥＥＦＰＶＰＡＬＨＨＰＶＦＱＱＥＳＦＴＲＱＶＬＷＫＬＬＫＶＶＫＦＧＥＶＩＳＹＳＨＬＡＡＬＡＧＮＰＡＡＴＡＡＶＫＴＡＬＳＧＮＰＶＰＩＬＩＰＣＨＲＶＶＱＧＤＬＤＶＧＧＹＥＧＧＬＡＶＫＥＷＬＬＡＨＥＧＨＲＬＧＫＰＧＬＧ（配列番号／／）。
【0141】
他の関連する実施形態において、ＳＮＡＰ配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
ＤＫＤＣＥＭＫＲＴＴＬＤＳＰＬＧＫＬＥＬＳＧＣＥＱＧＬＨＥＩＫＬＬＧＫＧＴＳＡＡＤＡＶＥＶＰＡＰＡＡＶＬＧＧＰＥＰＬＭＱＡＴＡＷＬＮＡＹＦＨＱＰＥＡＩＥＥＦＰＶＰＡＬＨＨＰＶＦＱＱＥＳＦＴＲＱＶＬＷＫＬＬＫＶＶＫＦＧＥＶＩＳＹＱＱＬＡＡＬＡＧＮＰＡＡＴＡＡＶＫＴＡＬＳＧＮＰＶＰＩＬＩＰＣＨＲＶＶＳＳＳＧＡＶＧＧＹＥＧＧＬＡＶＫＥＷＬＬＡＨＥＧＨＲＬＧＫＰＧＬＧ（配列番号／／）。
ＤＫＤＣＥＭＫＲＴＴＬＤＳＰＬＧＫＬＥＬＳＧＣＥＱＧＬＨＥＩＫＬＬＧＫＧＴＳＡＡＤＡＶＥＶＰＡＰＡＡＶＬＧＧＰＥＰＬＭＱＡＴＡＷＬＮＡＹＦＨＱＰＥＡＩＥＥＦＰＶＰＡＬＨＨＰＶＦＱＱＥＳＦＴＲＱＶＬＷＫＬＬＫＶＶＫＦＧＥＶＩＳＹＱＱＬＡＡＬＡＧＮＰＡＡＴＡＡＶＫＴＡＬＳＧＮＰＶＰＩＬＩＰＣＨＲＶＶＳＳＳＧＡＶＧＧＹＥＧＧＬＡＶＫＥＷＬＬＡＨＥＧＨＲＬＧＫＰＧＬＧ（配列番号／／）。
【0142】
より特定の実施形態において、ＳＮＡＰポリペプチドは、本明細書に例示的に記載されているもの等の、ＳＮＡＰ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列であり、ＳＮＡＰ配列は、ベンジルグアニンに結合する配列である。
【0143】
本開示の別の特定の実施形態において、好適なポリペプチドは、ＳＮＡＰポリペプチド配列及びｍＧｌｕＲポリペプチド配列、例えば、ｍＧｌｕＲ２ポリペプチド配列、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む融合ポリペプチドである。
【0144】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド及び部位特異的エンドヌクレアーゼ
いくつかの場合において、目的とする遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドまたは部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする。例えば、優性対立遺伝子が、網膜構造タンパク質であり、及び／または正常な網膜機能を提供する遺伝子（野生型の場合）の欠陥のあるコピーをコードする場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドまたは部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠陥のある対立遺伝子を標的とし、かつその欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることができる。
いくつかの場合において、目的とする遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドまたは部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする。例えば、優性対立遺伝子が、網膜構造タンパク質であり、及び／または正常な網膜機能を提供する遺伝子（野生型の場合）の欠陥のあるコピーをコードする場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドまたは部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠陥のある対立遺伝子を標的とし、かつその欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることができる。
【0145】
欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドまたは部位特異的エンドヌクレアーゼを用いて、その欠陥のある対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡで相同組換えを刺激することもできる。したがって、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンを用いて、欠陥のある対立遺伝子をノックアウトするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドを送達することができ、その欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーも送達することができ、その欠陥のある対立遺伝子の修復をもたらし、それによって、機能的網膜タンパク質（例えば、機能的レチノスキシン、機能的ＲＰＥ６５、機能的ペリフェリン等）の産生をもたらす。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７５：２１７を参照されたい。いくつかの場合において、主題のｒＡＡＶビリオンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列、及び欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、この機能的コピーは、機能的網膜タンパク質をコードする。機能的網膜タンパク質は、例えば、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＧＰＲ）結合タンパク質－１、ペリフェリン、ペリフェリン－２、ＲｄＣＶＦ等を含む。
【0146】
使用に好適な部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれ、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは、天然に存在せず、特定の遺伝子を標的化するように修飾される。そのような部位特異的エンドヌクレアーゼを操作して、ゲノム内の特定の位置を切断することができ、その後、非相同末端結合は、いくつかのヌクレオチドを挿入または欠失しながらその破断を修復することができる。その後、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも称される）は、タンパク質を骨組みから追放し、遺伝子を効果的にノックアウトする。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。好適な部位特異的エンドヌクレアーゼには、操作されたメガヌクレアーゼ及び再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。好適なエンドヌクレアーゼには、Ｉ－Ｔｅｖｌヌクレアーゼが含まれる。好適なメガヌクレアーゼには、Ｉ－Ｓｃｅ１（例えば、Ｂｅｌｌａｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１０３７を参照されたい）、及びＩ－Ｃｒｅ１（例えば、Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：４６８を参照されたい）が含まれる。
【0147】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド
いくつかの場合において、遺伝子産物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ガイドＲＮＡ、例えば、シングルガイドＲＮＡである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、１）ガイドＲＮＡ、及び２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。ガイドＲＮＡは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドに結合するタンパク質結合領域、及び（ｂ）標的核酸に結合する領域を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、時に本明細書で「ゲノム編集ヌクレアーゼ」と称される。
いくつかの場合において、遺伝子産物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、ガイドＲＮＡ、例えば、シングルガイドＲＮＡである。いくつかの場合において、遺伝子産物は、１）ガイドＲＮＡ、及び２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。ガイドＲＮＡは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドに結合するタンパク質結合領域、及び（ｂ）標的核酸に結合する領域を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、時に本明細書で「ゲノム編集ヌクレアーゼ」と称される。
【0148】
好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドの例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）である。好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）である。いくつかの場合において、ゲノム標的化組成物には、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドが含まれる。いくつかの場合において、ゲノム標的化組成物には、クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）が含まれる。いくつかの場合において、ゲノム標的化組成物には、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、またはＣ２ｃ３タンパク質）が含まれる。いくつかの場合において、ゲノム標的化組成物には、クラス２ ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質、「Ｃａｓ１３ａ」タンパク質とも称される）が含まれる。ＣａｓＸタンパク質も使用するのに好適である。ＣａｓＹタンパク質も使用するのに好適である。
【0149】
いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも称される）に融合された融合タンパク質である。いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、細胞内局在化を提供するアミノ酸配列（融合パートナー）に融合され、すなわち、融合パートナーは、細胞内局在化配列（例えば、核への標的化のための１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、２つ以上のＮＬＳ、３つ以上のＮＬＳ等）である。
【0150】
いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドである。いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとのその関連により、標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）内の標的部位にガイドされる（例えば、標的部位で安定化される）。いくつかの場合において、Ｃａｓ９ポリペプチドは、図５Ａに示される化膿レンサ球菌Ｃａｓ９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示の組成物または方法において使用されるＣａｓ９ポリペプチドは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）ポリペプチドである。いくつかの場合において、ｓａＣａｓ９ポリペプチドは、図５Ｂに示されるｓａＣａｓ９アミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0151】
いくつかの場合において、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、ハイフィデリティ（ＨＦ）Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０。例えば、図５Ａに示されるアミノ酸配列のアミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６は、例えば、アラニンで置換される。例えば、ＨＦ Ｃａｓ９ポリペプチドは、図５Ａに示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、アミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６が、例えば、アラニンで置換されている、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合において、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、図５Ａ～５Ｆのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、図６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0152】
いくつかの場合において、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、改変されたＰＡＭ特異性を示す。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２３：４８１を参照されたい。
【0153】
いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの場合において、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｃｐｆ１タンパク質である。いくつかの場合において、Ｃｐｆ１タンパク質は、図７Ａ～７Ｃのいずれか１つに示されるＣｐｆ１アミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0154】
いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、ＣａｓＸまたはＣａｓＹポリペプチドである。ＣａｓＸ及びＣａｓＹポリペプチドは、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５４２：２３７に記載されている。
【0155】
酵素的に不活性なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ
減少した酵素活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドも使用するのに好適である。そのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、「死（ｄｅａｄ）」ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドと称され、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を実質的に示さないが、ガイドＲＮＡと複合体化した場合に標的核酸に依然として結合するように所定のアミノ酸置換を含むＣａｓ９ポリペプチドは、「死」Ｃａｓ９または「ｄＣａｓ９」と称される。いくつかの場合において、「死」Ｃａｓ９タンパク質は、二本鎖標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する減少した能力を有する。例えば、「ヌクレアーゼ欠陥性」Ｃａｓ９は、機能性ＲｕｖＣドメインを欠き（すなわち、二本鎖標的ＤＮＡの非相補的鎖を切断しない）、機能性ＨＮＨドメインを欠く（すなわち、二本鎖標的ＤＮＡの相補的鎖を切断しない）。非限定的な例として、いくつかの場合において、ヌクレアーゼ欠陥性Ｃａｓ９タンパク質は、ポリペプチドが標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する減少した能力（例えば、切断しない）を有するように、配列番号１５の残基Ｄ１０及びＨ８４０（またはＣａｓ９のホモログの対応する残基）に対応するアミノ酸位置で変異（例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ）を保有する。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的核酸（例えば、一本鎖または二本鎖標的核酸）を切断する減少した能力を有するが、標的核酸に結合する能力を保持する。標的核酸を切断することができない（例えば、例えば、ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの触媒ドメインにおける１つ以上の変異に起因する）Ｃａｓ９タンパク質は、「ヌクレアーゼ欠陥性Ｃａｓ９」、「死Ｃａｓ９」または単に「ｄＣａｓ９」と称される。他の残基は、上記の効果を達成する（すなわち、１つのまたは他のヌクレアーゼ部分を不活性化する）ように変異させられ得る。非限定的な例として、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７（またはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）が改変（すなわち、置換）され得る。いくつかの場合において、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、及びＤ９８６（またはホモログの対応するアミノ酸）のうちの２つ以上が置換される。いくつかの場合において、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＤ１０及びＮ８６３（またはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）は、Ａｌａで置換される。また、アラニン置換以外の変異は好適である。
減少した酵素活性を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドも使用するのに好適である。そのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、「死（ｄｅａｄ）」ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドと称され、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を実質的に示さないが、ガイドＲＮＡと複合体化した場合に標的核酸に依然として結合するように所定のアミノ酸置換を含むＣａｓ９ポリペプチドは、「死」Ｃａｓ９または「ｄＣａｓ９」と称される。いくつかの場合において、「死」Ｃａｓ９タンパク質は、二本鎖標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する減少した能力を有する。例えば、「ヌクレアーゼ欠陥性」Ｃａｓ９は、機能性ＲｕｖＣドメインを欠き（すなわち、二本鎖標的ＤＮＡの非相補的鎖を切断しない）、機能性ＨＮＨドメインを欠く（すなわち、二本鎖標的ＤＮＡの相補的鎖を切断しない）。非限定的な例として、いくつかの場合において、ヌクレアーゼ欠陥性Ｃａｓ９タンパク質は、ポリペプチドが標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する減少した能力（例えば、切断しない）を有するように、配列番号１５の残基Ｄ１０及びＨ８４０（またはＣａｓ９のホモログの対応する残基）に対応するアミノ酸位置で変異（例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ）を保有する。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的核酸（例えば、一本鎖または二本鎖標的核酸）を切断する減少した能力を有するが、標的核酸に結合する能力を保持する。標的核酸を切断することができない（例えば、例えば、ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの触媒ドメインにおける１つ以上の変異に起因する）Ｃａｓ９タンパク質は、「ヌクレアーゼ欠陥性Ｃａｓ９」、「死Ｃａｓ９」または単に「ｄＣａｓ９」と称される。他の残基は、上記の効果を達成する（すなわち、１つのまたは他のヌクレアーゼ部分を不活性化する）ように変異させられ得る。非限定的な例として、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７（またはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）が改変（すなわち、置換）され得る。いくつかの場合において、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、及びＤ９８６（またはホモログの対応するアミノ酸）のうちの２つ以上が置換される。いくつかの場合において、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＤ１０及びＮ８６３（またはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）は、Ａｌａで置換される。また、アラニン置換以外の変異は好適である。
【0156】
いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｃａｓ９相乗的活性化メディエーター（Ｃａｓ９－ＳＡＭ）として知られているＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（及びその対応するガイドＲＮＡ）である。Ｃａｓ９－ＳＡＭシステムのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、転写活性化ドメイン（好適な転写活性化ドメインには、例えば、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、及びＳＥＴ７／９が含まれる）または転写リプレッサードメイン（好適な転写リプレッサードメインには、例えば、ＫＲＡＢドメイン、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン、及びＳＩＤ４Ｘドメインが含まれる）に融合した「死」Ｃａｓ９である。Ｃａｓ９－ＳＡＭシステムのガイドＲＮＡは、転写活性化因子ドメイン（例えば、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、またはＳＥＴ７／９）または転写リプレッサードメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン、またはＳＩＤ４Ｘドメイン）に融合したアダプタータンパク質に結合するループを含む。例えば、いくつかの場合において、ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの１つまたは２つのループに挿入されたＭＳ２ ＲＮＡアプタマーを含むシングルガイドＲＮＡであり、ｄＣａｓ９は、ＶＰ６４に融合したｄＣａｓ９を含む融合ポリペプチドであり、アダプター／機能的タンパク質は、（ｉ）ＭＳ２、（ｉｉ）ｐ６５、及び（ｉｉｉ）ＨＳＦ１を含む融合ポリペプチドである。例えば、米国特許公開第２０１６／０３５５７９７号を参照されたい。
【0157】
（ａ）死ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド、及び（ｂ）異種融合ポリペプチドを含むキメラポリペプチドも使用するのに好適である。好適な異種融合ポリペプチドの例には、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組み込み活性、または核酸結合活性を有するポリペプチドが含まれる。
【0158】
ガイドＲＮＡ
クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質等）に結合し、かつ複合体を標的核酸内の特定の位置に標的化する核酸は、本明細書で「ガイドＲＮＡ」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸」または「ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、標的核酸の配列に相補的なヌクレオチド配列であるガイド配列（本明細書で標的化配列とも称される）を含む標的化セグメントを含めることによって複合体（ＲＮＰ複合体）に標的特異性を提供する。
クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質等）に結合し、かつ複合体を標的核酸内の特定の位置に標的化する核酸は、本明細書で「ガイドＲＮＡ」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸」または「ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、標的核酸の配列に相補的なヌクレオチド配列であるガイド配列（本明細書で標的化配列とも称される）を含む標的化セグメントを含めることによって複合体（ＲＮＰ複合体）に標的特異性を提供する。
【0159】
いくつかの場合において、ガイドＲＮＡには、２つの別個の核酸分子：「活性化因子」及び「標的化因子」が含まれ、本明細書で「二重ガイドＲＮＡ」、「二重分子ガイドＲＮＡ」、「２分子ガイドＲＮＡ」、または「ｄｇＲＮＡ」と称される。いくつかの場合において、ガイドＲＮＡは、１つの分子であり（例えば、いくつかのクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドの場合、対応するガイドＲＮＡは、単一分子であり、いくつかの場合において、活性化因子及び標的化因子は、互いに、例えば、介在ヌクレオチドを介して共有結合されている）、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「一分子ガイドＲＮＡ」、または単に「ｓｇＲＮＡ」と称される。
【0160】
遺伝子産物がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドであり、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド及びガイドＲＮＡの両方である場合、遺伝子産物は、標的核酸を修飾し得る。いくつかの場合において、例えば、標的核酸が、欠陥性対立遺伝子における有害な変異（例えば、網膜細胞標的核酸における有害な変異）を含む場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド／ガイドＲＮＡ複合体は、有害な変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナー核酸（例えば、欠損性対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするヌクレオチド配列を含むドナー核酸）と一緒に、例えば、相同指向性修復（ＨＤＲ）を介して有害な変異を修正するために使用され得る。
【0161】
いくつかの場合において、遺伝子産物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド及び２つの別個のｓｇＲＮＡであり、２つの別個のｓｇＲＮＡは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した標的核酸の欠失を提供する。
【0162】
いくつかの場合において、遺伝子産物は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド、及び（ｉｉ）１つのガイドＲＮＡである。いくつかの場合において、ガイドＲＮＡは、単一分子（または「シングルガイド」）ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）である。いくつかの場合において、ガイドＲＮＡは、二重分子（または「二重ガイド」）ガイドＲＮＡ（「ｄｇＲＮＡ」）である。
【0163】
いくつかの場合において、遺伝子産物は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド、及び（ｉｉ）２つの別個のｓｇＲＮＡであり、２つの別個のｓｇＲＮＡは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した標的核酸の欠失を提供する。いくつかの場合において、ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。いくつかの場合において、ガイドＲＮＡは、ｄｇＲＮＡである。
【0164】
いくつかの場合において、遺伝子産物は、（ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチド、及び（ｉｉ）ガイドＲＮＡ前駆体であり、これらの場合において、前駆体は、Ｃｐｆ１ポリペプチドによって切断されて２つ以上のガイドＲＮＡが生成され得る。
【0165】
本開示は、個体における網膜細胞における標的核酸を修飾する方法であって、標的核酸は、有害な変異を含み、方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンであって、ｒＡＡＶビリオンは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）有害な変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナーＤＮＡ鋳型をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、本開示のｒＡＡＶビリオンを個体に（例えば、眼内、硝子体内等の投与によって）投与することを含む、方法を提供する。ｒＡＡＶビリオンの投与は、ＨＤＲによって標的核酸における有害な変異の修正をもたらす。
【0166】
本開示は、個体における網膜細胞における標的核酸を修飾する方法であって、標的核酸は、有害な変異を含み、方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンであって、ｒＡＡＶビリオンは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）標的核酸における第１の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）標的核酸における第２の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、本開示のｒＡＡＶビリオンを個体に（例えば、眼内、硝子体内等の投与によって）投与することを含む、方法を提供する。ｒＡＡＶビリオンの投与は、ＮＨＥＪによって標的核酸における有害な変異の切除をもたらす。
【0167】
調節配列
いくつかの場合において、目的とする遺伝子産物（異種遺伝子産物（複数可））をコードするヌクレオチド配列は、転写制御因子に動作的に結合される。例えば、いくつかの場合において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに動作的に結合される。他の場合において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに動作的に結合される。いくつかの例において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞型特異的調節因子に動作的に結合される。例えば、いくつかの例において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、網膜細胞特異的プロモーターに動作的に結合される。例えば、いくつかの例において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的調節因子（例えば、光受容体特異的プロモーター）、例えば、光受容体細胞における動作的に結合された遺伝子の選択的発現をもたらす調節因子に動作的に結合される。好適な光受容体特異的調節因子には、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）、ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）、網膜色素変性症遺伝子プロモーター（上掲のＮｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７））、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（上掲のＮｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７））、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）が含まれる。
いくつかの場合において、目的とする遺伝子産物（異種遺伝子産物（複数可））をコードするヌクレオチド配列は、転写制御因子に動作的に結合される。例えば、いくつかの場合において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに動作的に結合される。他の場合において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに動作的に結合される。いくつかの例において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞型特異的調節因子に動作的に結合される。例えば、いくつかの例において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、網膜細胞特異的プロモーターに動作的に結合される。例えば、いくつかの例において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的調節因子（例えば、光受容体特異的プロモーター）、例えば、光受容体細胞における動作的に結合された遺伝子の選択的発現をもたらす調節因子に動作的に結合される。好適な光受容体特異的調節因子には、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）、ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）、網膜色素変性症遺伝子プロモーター（上掲のＮｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７））、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（上掲のＮｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７））、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）が含まれる。
【0168】
好適なプロモーターには、ＣＡＧプロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９：２６９）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、代謝型グルタミン酸受容体－６（ｇｒｍ６）プロモーター（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：１１７５）、プレイアデスプロモーター（Ｐｏｒｔａｌｅｓ－Ｃａｓａｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１６５８９）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモーター（Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０３９２）、小胞性グルタミン酸トランスポーター（Ｖ－ｇｌｕｔ）プロモーター（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１３７７：１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）プロモーター（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１４４：１９、Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１８：２７）、コレシストキニン（ＣＣＫ）プロモーター（Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１８：２７）、パルブアルブミン（ＰＶ）プロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、及び血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。好適なプロモーターには、赤色錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、及びＧｌｕＲプロモーター（例えば、ＧｌｕＲ６プロモーター、ｇｒｍ６とも称される）が含まれるが、これらに限定されない。好適なプロモーターには、卵黄状黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター、及び光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。Ｌ７プロモーター（Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３）、ｔｈｙ－１プロモーター、リカバリンプロモーター（Ｗｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２６：２５）、カルビンジンプロモーター、及びベータ－アクチンプロモーターも使用するのに好適である。好適なプロモーターには、合成（天然に存在しない）プロモーター／エンハンサーの組み合わせが含まれる。
【0169】
本開示に従って有用な他の好適なプロモーターには、例えば、ガンマ－シヌクレイン（ＳＮＣＧ）プロモーター（例えば、Ｃｈａｆｆｉｏｌ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（１１）２５４６）、ＣＢｈプロモーター（例えば、Ｇｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２（９）：１１４３－５３）、ミニＣＡＧプロモーター（例えば、Ｇｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２（９）：１１４３－５３）、ニューロフィラメント重（ＮＥＦＨ）プロモーター（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ－Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．１０：１６５１５）、Ｇタンパク質結合受容体キナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーター（例えば、Ｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４８（９）：３９５４－６１）、レチナールデヒド結合タンパク質１（ＲＬＢＰ１）プロモーター（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．２：１５０２２、Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４８，３８７２－３８７７）、卵黄状筋ジストロフィー－２（ＶＭＤ２）プロモーター（例えば、Ｃｏｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．２４，２３－２８）、シナプシンＩ（Ｓｙｎ１）プロモーター（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３））、ｅｎｈＳｙｎ１プロモーター（例えば、Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１１）：８７２－８２）、またはそれらの機能的断片もしくはバリアントが含まれる。
【0170】
薬学的組成物
本開示は、（ａ）上述した主題のｒＡＡＶビリオンと、（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝液とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの場合において、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝液は、ヒトにおける使用に好適である。
本開示は、（ａ）上述した主題のｒＡＡＶビリオンと、（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝液とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの場合において、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝液は、ヒトにおける使用に好適である。
【0171】
そのような賦形剤、担体、希釈剤、及び緩衝液は、過度の毒性を伴うことなく投与することができる任意の薬学的作用物質を含む。薬学的に許容される賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール等の液体が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩には、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等、及び有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等が含まれ得る。また、補助物質、例えば、浸潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等がそのようなビヒクルに存在し得る。多様な薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で知られており、本明細書において詳細に論述する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃを含む多様な刊行物において十分に記載されている。
【0172】
遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法及び治療方法
本開示は、遺伝子産物を個体における網膜細胞に送達する方法であって、方法は、上述した主題のｒＡＡＶビリオンを個体に投与することを含む、方法を提供する。遺伝子産物は、上述されるように、ポリペプチドもしくは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、アプタマー、または部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ）であり得る。遺伝子産物を網膜細胞に送達することは、網膜疾患の治療を提供し得る。網膜細胞は、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞であり得る。いくつかの場合において、網膜細胞は、光受容体細胞、例えば、桿体または錐体細胞である。
本開示は、遺伝子産物を個体における網膜細胞に送達する方法であって、方法は、上述した主題のｒＡＡＶビリオンを個体に投与することを含む、方法を提供する。遺伝子産物は、上述されるように、ポリペプチドもしくは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、アプタマー、または部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ）であり得る。遺伝子産物を網膜細胞に送達することは、網膜疾患の治療を提供し得る。網膜細胞は、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞であり得る。いくつかの場合において、網膜細胞は、光受容体細胞、例えば、桿体または錐体細胞である。
【0173】
本開示は、網膜細胞における標的核酸を修飾する方法であって、方法は、網膜細胞を（１）本開示のｒＡＡＶビリオンであって、ｒＡＡＶビリオンは、ガイドＲＮＡに結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、ｒＡＡＶビリオン、及び（２）ガイドＲＮＡと接触させることを含む、方法を提供する。本開示は、網膜細胞における標的核酸を修飾する方法であって、方法は、網膜細胞を本開示のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含み、ｒＡＡＶビリオンは、（ｉ）ガイドＲＮＡに結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド、及び（ｉｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、方法を提供する。いくつかの場合において、方法は、網膜細胞をドナーＤＮＡ鋳型と接触させることを含む。いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。いくつかの場合において、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。
【0174】
本開示は、眼疾患（例えば、網膜疾患）を治療する方法であって、方法は、有効量の上述した主題のｒＡＡＶビリオンをそれを必要とする個体に投与することを含む、方法を提供する。主題のｒＡＡＶビリオンは、眼内注射を介して、例えば、硝子体内注射によって、網膜下注射によって、脈絡膜上注射によって、または任意の他の好都合な投与様式もしくは経路によって投与され得る。他の好都合な投与様式もしくは経路には、例えば、静脈内、鼻腔内等が含まれる。
【0175】
「治療的有効量」は、実験及び／または臨床試験を介して決定され得る比較的広い範囲に入る。例えば、インビボ注射、すなわち、眼への直接的注射の場合、治療的に有効な用量は、約１０６～約１０１５のｒＡＡＶビリオン、例えば、約１０８～１０１２のｒＡＡＶビリオンのようなものとなる。例えば、インビボ注射の場合、すなわち、眼内への直接的注射の場合、治療的に有効な用量は、約１０６のウイルスゲノム（ｖｇ）～約１０１５ｖｇのｒＡＡＶビリオン、例えば、約１０８ｖｇ～１０１２ｖｇのようなものとなる。インビトロ形質導入の場合、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０８～約１０１３のｒＡＡＶビリオンのようなものとなる。例えば、インビトロ形質導入の場合、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０８～約１０１３ｖｇのｒＡＡＶビリオンのようなものとなる。別の例として、インビトロ形質導入の場合、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０ｖｇ／細胞～約１０４ｖｇ／細胞のようなものとなる。他の有効な投薬量は、用量反応曲線を確立する日常的な試行を介して当業者によって容易に確立され得る。
【0176】
いくつかの場合において、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回またはそれを超える投与）が、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために用いられ得る。いくつかの場合において、複数回の投与は、様々な間隔で、例えば、毎日、毎週、月２回、毎月、３ヶ月毎、６ヶ月毎、毎年等で投与される。いくつかの場合において、複数回の投与は、１ヶ月～２ヶ月、２ヶ月～４ヶ月、４ヶ月～８ヶ月、８ヶ月～１２ヶ月、１年～２年、２年～５年、または５年超の期間にわたって投与される。
【0177】
主題の方法を用いて治療することのできる眼疾患には、急性黄斑視神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜血管新生、糖尿病性ブドウ膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性症、例えば、急性黄斑変性症、加齢に関連した非滲出性黄斑変性症、及び加齢に関連した滲出性黄斑変性症、浮腫、例えば黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、及び糖尿病性黄斑浮腫、多巣性脈絡膜炎、後眼部位または位置に影響を及ぼす眼外傷、眼腫瘍、網膜障害、例えば、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ブドウ膜炎網膜疾患、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ブドウ膜拡散、眼レーザー治療によって引き起こされるか、または影響を受ける後眼疾患、光線力学療法によって引き起こされるか、または影響を受ける後眼疾患、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、非網膜症糖尿病性網膜機能不全、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病（黄色斑眼底）、遺伝性黄斑変性症、脈絡網膜変性、レーバー先天性黒内障、先天性固定夜盲症、先天性脈絡膜欠如、バルデー・ビードル症候群、黄斑毛細血管拡張症、レーベル遺伝性視神経症、未熟児網膜症、色覚異常、赤色覚異常、緑色覚異常、及び青色覚異常を含む色覚障害、ならびにビエッティ結晶ジストロフィーが含まれるが、これらに限定されない。
【0178】
本開示は、網膜疾患を治療する方法を提供する。方法は通常、本開示のｒＡＡＶビリオン、または本開示のｒＡＡＶビリオンを含む組成物を、それを必要とする個体の眼に投与することを伴う。網膜疾患の治療を評価するための非限定的な方法には、機能的変化、例えば、視力（例えば、ＢＣＶＡ）、視野（例えば、視野計測）、光及び闇に対する電気生理学的反応性（例えば、ＥＲＧ、ＶＥＰ）、色覚、及び／またはコントラスト感度の変化を測定すること、解剖学的及び／または写真測定、例えば、ＯＣＴ、眼底撮影、及び／または自己蛍光を使用して生体構造または健康の変化を測定すること、及び眼運動性（例えば、眼振、固定選好、及び安定性）を測定することが含まれる。
【0179】
例えば、当業者は、１つ以上のパラメータ、例えば、視力、視野、光及び闇に対する電気生理学的反応性、色覚、コントラスト感度、生体構造、網膜健康及び血管系、眼運動性、固定選好、及び安定性に対する効果についての試験によってｒＡＡＶビリオンの有効量を容易に決定し得る。いくつかの場合において、有効量の本開示のｒＡＡＶビリオンを投与することは、網膜機能、解剖学的全体性、または網膜健康の喪失速度の低下、例えば、喪失及びそれによる疾患の進行の速度の２倍、３倍、４倍、もしくは５倍またはそれ以上の低下、例えば、喪失及びそれによる疾患の進行の速度の１０倍の低下をもたらす。いくつかの場合において、有効量の本開示のｒＡＡＶビリオンを投与することは、網膜機能の獲得、網膜生体構造または健康の改善、及び／または眼運動性における安定化、例えば、網膜機能、網膜生体構造または健康、及び／または眼窩の安定性における２倍、３倍、４倍もしくは５倍の改善またはそれ以上、例えば、網膜機能、網膜生体構造または健康、及び／または眼窩の安定性における１０倍の改善またはそれ以上をもたらす。
【0180】
核酸及び宿主細胞
本開示は、上述した主題のバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約２０アミノ酸の挿入を含み、またはバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約２０アミノ酸の、約７アミノ酸～約２０アミノ酸の異種ペプチドでの置き換えを含み、バリアントキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した網膜細胞の感染性を提供する、核酸を提供する。主題の単離された核酸は、ＡＡＶベクター、例えば、組換えＡＡＶベクターであり得る。
本開示は、上述した主題のバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約２０アミノ酸の挿入を含み、またはバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約２０アミノ酸の、約７アミノ酸～約２０アミノ酸の異種ペプチドでの置き換えを含み、バリアントキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した網膜細胞の感染性を提供する、核酸を提供する。主題の単離された核酸は、ＡＡＶベクター、例えば、組換えＡＡＶベクターであり得る。
【0181】
挿入ペプチド
主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドのＧＨループに挿入された約７アミノ酸長～約１０アミノ酸長、または約１０アミノ酸長～約２０アミノ酸長の挿入ペプチドを有する。挿入ペプチドは、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸の長さを有する。好適な挿入ペプチドは、上述したとおりである。好適な挿入ペプチドには、上述した式Ｉ～ＶＩＩＩのいずれか１つのペプチドが含まれる。好適な挿入ペプチドには、上の表に示されるペプチドが含まれる。親ＡＡＶキャプシドへの挿入ペプチドの挿入により、いくつかの場合において、ＧＨループまたはループＩＶにおいて内因性の一続きの約７アミノ酸～約２０アミノ酸または約１０アミノ酸～約２０アミノ酸が置き換えられる。したがって、いくつかの場合において、主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約１０アミノ酸の約７アミノ酸～約１０アミノ酸の異種ペプチドでの置き換えを含み、好適な異種ペプチドには、上述したペプチドが含まれる。他の場合において、主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約１０アミノ酸～約２０アミノ酸の約１０アミノ酸～約２０アミノ酸の異種ペプチドでの置き換えを含み、好適な異種ペプチドには、上述したように、式Ｉ～ＶＩＩＩのいずれか１つのペプチド、または上記の表１または表２に示されるペプチドが含まれる。
主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドのＧＨループに挿入された約７アミノ酸長～約１０アミノ酸長、または約１０アミノ酸長～約２０アミノ酸長の挿入ペプチドを有する。挿入ペプチドは、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸の長さを有する。好適な挿入ペプチドは、上述したとおりである。好適な挿入ペプチドには、上述した式Ｉ～ＶＩＩＩのいずれか１つのペプチドが含まれる。好適な挿入ペプチドには、上の表に示されるペプチドが含まれる。親ＡＡＶキャプシドへの挿入ペプチドの挿入により、いくつかの場合において、ＧＨループまたはループＩＶにおいて内因性の一続きの約７アミノ酸～約２０アミノ酸または約１０アミノ酸～約２０アミノ酸が置き換えられる。したがって、いくつかの場合において、主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７アミノ酸～約１０アミノ酸の約７アミノ酸～約１０アミノ酸の異種ペプチドでの置き換えを含み、好適な異種ペプチドには、上述したペプチドが含まれる。他の場合において、主題の核酸によってコードされるバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約１０アミノ酸～約２０アミノ酸の約１０アミノ酸～約２０アミノ酸の異種ペプチドでの置き換えを含み、好適な異種ペプチドには、上述したように、式Ｉ～ＶＩＩＩのいずれか１つのペプチド、または上記の表１または表２に示されるペプチドが含まれる。
【0182】
主題の組換えＡＡＶベクターは、上述したように、主題の組換えＡＡＶビリオンを生成するために使用され得る。したがって、本開示は、好適な細胞に導入された場合に、主題の組換えＡＡＶビリオンの生成を提供し得る組換えＡＡＶベクターを提供する。
【0183】
本発明は、主題の核酸を含む宿主細胞、例えば、単離された（遺伝子修飾された）宿主細胞をさらに提供する。主題の宿主細胞は、単離細胞、例えば、インビトロ培養中の細胞であり得る。主題の宿主細胞は、後述されるように、主題のｒＡＡＶビリオンを生成するのに有用である。主題の宿主細胞が主題のｒＡＡＶビリオンを生成するために使用される場合、それは、「パッケージング細胞」と称される。いくつかの場合において、主題の宿主細胞は、主題の核酸で安定的に遺伝子修飾される。他の場合において、主題の宿主細胞は、主題の核酸で一時的に遺伝子修飾される。
【0184】
主題の核酸は、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トランスフェクション等を含むが、これらに限定されない確立された技法を用いて、安定的または一時的に宿主細胞に導入される。安定的な変換の場合、主題の核酸は、概して、選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシン耐性等のいくつかの周知の選択可能なマーカーのうちのいずれかをさらに含む。
【0185】
主題の宿主細胞は、主題の核酸を様々な細胞、例えば、マウス細胞及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）を含む、例えば、哺乳動物細胞のうちのいずれかに導入することによって生成される。好適な哺乳動物細胞には、初代細胞及び細胞株が含まれるが、これらに限定されず、好適な細胞株には、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞等が含まれるが、これらに限定されない。好適な宿主細胞の非限定的な例には、例えば、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等が含まれる。主題の宿主細胞を、ＡＡＶを産生するＳｆ９細胞等の昆虫細胞を感染させるバキュロウイルスを用いて作成することができる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号、米国特許出願第１２／２９７，９５８号を参照されたい）。
【0186】
いくつかの場合において、主題の遺伝子修飾された宿主細胞は、上述のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つ以上のＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の場合において、主題の宿主細胞は、ｒＡＡＶベクターをさらに含む。ｒＡＡＶビリオンを主題の宿主細胞を用いて生成することができる。ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は、米国特許公開第２００５／００５３９２２号及び米国特許公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。
【0187】
本開示の非限定的な態様の例
態様セットＡ
上に記載される本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の説明を制限することなく、本開示のある特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個々の番号が付けられた態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付けられた態様のうちのいずれかとともに使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせに対する支持を提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに制限されない。
態様セットＡ
上に記載される本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の説明を制限することなく、本開示のある特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個々の番号が付けられた態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付けられた態様のうちのいずれかとともに使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせに対する支持を提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに制限されない。
【0188】
態様１．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、
（ａ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１～３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有し、前記バリアントキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含みかつ前記異種ペプチドを含まない対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した前記網膜細胞の感染性を付与する、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、及び
（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
（ａ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１～３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有し、前記バリアントキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含みかつ前記異種ペプチドを含まない対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した前記網膜細胞の感染性を付与する、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、及び
（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸
を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【0189】
態様２．前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0190】
態様３．前記異種ペプチドは、１６アミノ酸の長さを有する、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0191】
態様４．前記異種ペプチドは、２０アミノ酸の長さを有する、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0192】
態様５．前記異種ペプチドは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１６アミノ酸の長さを有する、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0193】
態様６．前記異種ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0194】
態様７．前記異種ペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0195】
態様８．前記異種ペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0196】
態様９．前記ｒＡＡＶビリオンは、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して少なくとも５倍増加した前記網膜細胞の感染性を示す、態様１～８のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0197】
態様１０．前記ｒＡＡＶビリオンは、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して少なくとも１０倍増加した前記網膜細胞の感染性を示す、態様１～８のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0198】
態様１１．前記異種ペプチドの前記挿入により、親ＡＡＶキャプシドタンパク質の連続した一続きの５アミノ酸～２０アミノ酸が置き換えられる、態様１～８のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0199】
態様１２．前記挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及び６１１に対応するアミノ酸内、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置にある、態様１～１１のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0200】
態様１３．前記挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及び５８８に対応するアミノ酸の間、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置にある、態様１２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0201】
態様１４．前記挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８５及び５９８に対応するアミノ酸内、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置にある、態様１～１１のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0202】
態様１５．前記増加した感染性は、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる前記網膜細胞に対する特異性または選択性と比較して増加した前記網膜細胞に対する特異性または選択性を含む、態様１～１４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0203】
態様１６．前記バリアントキャプシドタンパク質は、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによって誘導される免疫原性のレベルと比較して低下した網膜細胞における免疫原性のレベルを誘導する、態様１～１４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0204】
態様１７．前記１つ以上の異種遺伝子産物は、干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、態様１～１６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0205】
態様１８．前記１つ以上の異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様１～１６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0206】
態様１９．前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を高めるポリペプチドである、態様１８に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0207】
態様２０．前記ポリペプチドは、光反応性ポリペプチド、オプシン、短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）、中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）、ロドプシン、錐体オプシン、ヒトオプシン、非ヒトオプシン、ヒト化オプシン、またはそれらの任意の組み合わせである、態様１８に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0208】
態様２１．前記ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド、デアミナーゼ、逆転写酵素、またはその任意の組み合わせもしくは融合体である、態様１８に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0209】
態様２２．前記１つ以上の異種遺伝子産物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド及びガイドＲＮＡを含む、態様１～１６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0210】
態様２３．前記網膜細胞は、光受容体細胞である、態様１～２２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0211】
態様２４．前記光受容体細胞は、錐体細胞である、態様２３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0212】
態様２５．前記光受容体細胞は、桿体細胞である、態様２３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0213】
態様２６．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、プロモーターに動作的に結合されている、態様１～２５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0214】
態様２７．前記プロモーターは、網膜細胞特異的プロモーターである、態様２６に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0215】
態様２８．前記網膜細胞は、光受容体細胞ではない、態様１～２２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0216】
態様２９．前記網膜細胞は、オン型双極細胞またはオフ型双極細胞である、態様１～２２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0217】
態様３０．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、オン型双極細胞特異的プロモーターまたはオフ型双極細胞特異的プロモーターに動作的に結合されている、態様２９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0218】
態様３１．前記網膜細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である、態様１～２２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0219】
態様３２．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、ＲＧＣ特異的プロモーターに動作的に結合されている、態様３３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0220】
態様３３．前記網膜細胞は、アマクリン細胞である、態様１～２２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0221】
態様３４．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、アマクリン細胞特異的プロモーターに動作的に結合されている、態様３３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0222】
態様３５．前記網膜細胞は、水平細胞である、態様１～２２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0223】
態様３６．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、水平細胞特異的プロモーターに動作的に結合されている、態様３５に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0224】
態様３７．態様１～３６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを含む組成物。
【0225】
態様３８．
（ａ）態様１～３６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン、及び
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む、薬学的組成物。
（ａ）態様１～３６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン、及び
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む、薬学的組成物。
【0226】
態様３９．遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法であって、態様１～３６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを前記網膜細胞と接触させることを含む、前記方法。
【0227】
態様４０．遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法であって、態様３７または３８に記載の組成物を前記網膜細胞と接触させることを含む、前記方法。
【0228】
態様４１．前記網膜細胞は、インビトロまたはエクスビボである、態様３９または４０に記載の方法。
【0229】
態様４２．前記網膜細胞は、インビボである、態様３９または４０に記載の方法。
【0230】
態様４３．対象における網膜病態または障害を治療する方法であって、態様１～３６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンの治療的有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【0231】
態様４４．対象における網膜病態または障害を治療する方法であって、態様３７または３８に記載の組成物の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【0232】
態様４５．前記投与することは、眼内注射または眼内注入を含む、態様４３または４４に記載の方法。
【0233】
態様４６．前記眼内注射は、硝子体内注射、網膜下注射、または脈絡膜上注射を含む、態様４５に記載の方法。
【0234】
態様４７．前記眼内注入は、硝子体内注入、網膜下注入、または脈絡膜上注入である、態様４５に記載の方法。
【0235】
態様４８．前記網膜病態または障害は、緑内障、網膜変性症、光受容体機能または活性の喪失、光受容体細胞の喪失、網膜色素変性症、黄斑変性症、網膜分離症、レーバー先天性黒内障、糖尿病性網膜症、色覚異常、または色覚喪失である、態様４３～４７のいずれか１つに記載の方法。
【0236】
態様４９．バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１～３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有する、前記バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【0237】
態様５０．態様４９に記載のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【0238】
態様セットＢ
上に記載される本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の説明を制限することなく、本開示のある特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個々の番号が付けられた態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付けられた態様のうちのいずれかとともに使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせに対する支持を提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに制限されない。
上に記載される本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の説明を制限することなく、本開示のある特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個々の番号が付けられた態様のそれぞれは、先行または後続の個々の番号が付けられた態様のうちのいずれかとともに使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせに対する支持を提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに制限されない。
【0239】
態様１．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、（ａ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１及び４～３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有し、前記バリアントキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含みかつ前記異種ペプチドを含まない対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した前記網膜細胞の感染性を付与する、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、及び（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【0240】
態様２．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、（ａ）バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号２及び３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有し、前記バリアントキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含みかつ前記異種ペプチドを含まない対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増加した前記網膜細胞の感染性を付与する、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質、及び（ｂ）１つ以上の異種遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【0241】
態様３．前記異種ペプチドは、７アミノ酸の長さを有する、態様１または２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0242】
態様４．前記異種ペプチドは、１０アミノ酸、１６アミノ酸、または２０アミノ酸の長さを有する、態様１または２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0243】
態様５．前記異種ペプチドは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１６アミノ酸の長さを有する、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0244】
態様６．前記異種ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0245】
態様７．前記異種ペプチドは、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有し、または（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する、態様２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0246】
態様８．前記異種ペプチドは、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸の長さを有する、態様２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0247】
態様９．前記異種ペプチドは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸の長さを有する、態様２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0248】
態様１０．前記ｒＡＡＶビリオンは、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して少なくとも５倍増加した前記網膜細胞の感染性を示す、態様１～９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0249】
態様１１．前記ｒＡＡＶビリオンは、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して少なくとも１０倍増加した前記網膜細胞の感染性を示す、態様１～９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0250】
態様１２．前記異種ペプチドの前記挿入により、親ＡＡＶキャプシドタンパク質の連続した一続きの５アミノ酸～２０アミノ酸が置き換えられる、態様１～９のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0251】
態様１３．前記挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及び６１１に対応するアミノ酸内、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置にある、態様１～１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0252】
態様１４．前記挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及び５８８に対応するアミノ酸の間、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置にある、態様１３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0253】
態様１５．前記挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８５及び５９８に対応するアミノ酸内、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置にある、態様１～１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0254】
態様１６．前記増加した感染性は、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる前記網膜細胞に対する特異性または選択性と比較して増加した前記網膜細胞に対する特異性または選択性を含む、態様１～１５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0255】
態様１７．前記バリアントキャプシドタンパク質は、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによって誘導される免疫原性のレベルと比較して低下した網膜細胞における免疫原性のレベルを誘導する、態様１～１５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0256】
態様１８．前記１つ以上の異種遺伝子産物は、干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、態様１～１７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0257】
態様１９．前記１つ以上の異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様１～１７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0258】
態様２０．前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を高めるポリペプチドである、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0259】
態様２１．前記ポリペプチドは、光反応性ポリペプチド、オプシン、短波長オプシン（ＳＷ－オプシン）、中波長オプシン（ＭＷ－オプシン）、長波長オプシン（ＬＷ－オプシン）、ロドプシン、錐体オプシン、ヒトオプシン、非ヒトオプシン、ヒト化オプシン、またはそれらの任意の組み合わせである、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0260】
態様２２．前記ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド、デアミナーゼ、逆転写酵素、またはその任意の組み合わせもしくは融合体である、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0261】
態様２３．前記１つ以上の異種遺伝子産物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド及びガイドＲＮＡを含む、態様１～１７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0262】
態様２４．前記網膜細胞は、光受容体細胞である、態様１～２３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0263】
態様２５．前記光受容体細胞は、錐体細胞である、態様２４に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0264】
態様２６．前記光受容体細胞は、桿体細胞である、態様２４に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0265】
態様２７．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、プロモーターに動作的に結合されている、態様１～２６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0266】
態様２８．前記プロモーターは、網膜細胞特異的プロモーターである、態様２７に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0267】
態様２９．前記網膜細胞は、光受容体細胞ではない、態様１～２３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0268】
態様３０．前記網膜細胞は、オン型双極細胞またはオフ型双極細胞である、態様１～２３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0269】
態様３１．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、オン型双極細胞特異的プロモーターまたはオフ型双極細胞特異的プロモーターに動作的に結合されている、態様３０に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0270】
態様３２．前記網膜細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である、態様１～２３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0271】
態様３３．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、ＲＧＣ特異的プロモーターに動作的に結合されている、態様３２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0272】
態様３４．前記網膜細胞は、アマクリン細胞である、態様１～２３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0273】
態様３５．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、アマクリン細胞特異的プロモーターに動作的に結合されている、態様３４に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0274】
態様３６．前記網膜細胞は、水平細胞である、態様１～２３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【0275】
態様３７．前記１つ以上のヌクレオチド配列は、水平細胞特異的プロモーターに動作的に結合されている、態様３６に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0276】
態様３８．態様１～３７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを含む組成物。
【0277】
態様３９．
（ａ）態様１～３７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン、及び
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む、薬学的組成物。
（ａ）態様１～３７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン、及び
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む、薬学的組成物。
【0278】
態様４０．遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法であって、態様１～３７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンを前記網膜細胞と接触させることを含む、前記方法。
【0279】
態様４１．遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法であって、態様３８または３９に記載の組成物を前記網膜細胞と接触させることを含む、前記方法。
【0280】
態様４２．前記網膜細胞は、インビトロまたはエクスビボである、態様４０または４１に記載の方法。
【0281】
態様４３．前記網膜細胞は、インビボである、態様４０または４１に記載の方法。
【0282】
態様４４．対象における網膜病態または障害を治療する方法であって、態様１～３７のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンの治療的有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【0283】
態様４５．対象における網膜病態または障害を治療する方法であって、態様３８または３９に記載の組成物の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【0284】
態様４６．前記投与することは、眼内注射または眼内注入を含む、態様４４または４５に記載の方法。
【0285】
態様４７．前記眼内注射は、硝子体内注射、網膜下注射、または脈絡膜上注射を含む、態様４６に記載の方法。
【0286】
態様４８．前記眼内注入は、硝子体内注入、網膜下注入、または脈絡膜上注入である、態様４６に記載の方法。
【0287】
態様４９．前記網膜病態または障害は、緑内障、網膜変性症、光受容体機能または活性の喪失、光受容体細胞の喪失、網膜色素変性症、黄斑変性症、網膜分離症、レーバー先天性黒内障、糖尿病性網膜症、色覚異常、または色覚喪失である、態様４４～４８のいずれか１つに記載の方法。
【0288】
態様５０．バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１及び４～３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有する、前記バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【0289】
態様５１．バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号２及び３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、１０アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有する、前記バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【0290】
態様５２．態様５０または５１に記載のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【0291】
態様５３．バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号３１及び３４～４５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸～１０アミノ酸の長さを有する、前記バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【0292】
態様５４．バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドであって、前記バリアントＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号３２及び３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む異種ペプチドの挿入を含み、前記異種ペプチドは、７アミノ酸～１０アミノ酸の長さを有する、前記バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【0293】
態様５５．態様５１または５２に記載のバリアントＡＡＶキャプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【0294】
態様５６．前記ポリペプチドは、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）である、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0295】
態様５７．前記ポリペプチドは、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、及びｍＧｌｕＲ８、またはその機能的断片もしくはバリアントからなる群から選択される代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）である、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0296】
態様５８．前記ポリペプチドは、ｍＧｌｕＲ２、またはその機能的断片もしくはバリアントである、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0297】
態様５９．前記ポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0298】
態様６０．前記ポリペプチドは、親和性タグを含む融合ポリペプチドを含む、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0299】
態様６１．前記ポリペプチドは、親和性タグを含む融合ポリペプチドを含み、前記親和性タグは、ＳＮＡＰ配列、ＣＬＩＰ配列、またはＨＡＬＯ配列を含む、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0300】
態様６２．前記ポリペプチドは、親和性タグ配列及びｍＧｌｕＲ配列を含む融合ポリペプチドを含み、前記親和性タグ配列は、ＳＮＡＰ配列を含み、前記ｍＧｌｕＲ配列は、ｍＧｌｕＲ２配列を含む、態様１９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【0301】
態様６３．前記プロモーターは、ＳＮＣＧプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＮＥＦＨプロモーター、ＧＲＫ１プロモーター、ＲＬＢＰ１プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、Ｓｙｎ１プロモーター、及びＳｙｎ１（ｅｎｈＳｙｎ１）プロモーターからなる群から選択される、態様２７に記載のｒＡＡＶビリオン。
【実施例】
【0302】
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製及び使用するかの完全なる開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験がすべてまたは唯一の実行される実験であると表すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐｌはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．は筋肉内の（に）、ｉ．ｐ．は腹腔内の（に）、ｓ．ｃは皮下の（に）等の標準的な略語を使用してもよい。
【0303】
実施例１：バリアントキャプシドを有するｒＡＡＶビリオンの特性化
ＡＡＶ２キャプシドにおけるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５８７及び５８８の間に挿入されたＬＡＬＧＥＴＴＲＡＡ（配列番号２、「バリアント３」）またはＬＡＨＱＤＴＴＲＰＡ（配列番号３、「バリアント６」）を有するキャプシドを含有する組換えＡＡＶビリオンを分析した。ビリオンを生成するために使用されたｒＡＡＶは、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲのＣ末端に融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列を含んでいた。
ＡＡＶ２キャプシドにおけるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５８７及び５８８の間に挿入されたＬＡＬＧＥＴＴＲＡＡ（配列番号２、「バリアント３」）またはＬＡＨＱＤＴＴＲＰＡ（配列番号３、「バリアント６」）を有するキャプシドを含有する組換えＡＡＶビリオンを分析した。ビリオンを生成するために使用されたｒＡＡＶは、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲのＣ末端に融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列を含んでいた。
【0304】
３～１０歳のカニクイザルを使用した。３０ｇの針を使用して両側硝子体内注射を１回実施して、５０μＬの体積で眼当たり５．０Ｅ＋１１のウイルスゲノムを送達した。Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴシステムの自己蛍光機能を使用して共焦点スキャニングレーザー検眼鏡検査（ｃＳＬＯ）画像化によってＧＦＰ発現の開始及び進行を週１回モニターした。硝子体内注射から６～８週後、その霊長類を安楽死させ、両方の眼（眼球全体）を慎重に採取した。摘出後、余剰の眼窩組織を慎重にトリミングし、除去した。縁から約２ｍｍに小さな（５ｍｍ）スリットを入れ、眼全体を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含有するバイアルに入れ、４℃で一晩インキュベートした。一晩の固定後、ＰＦＡをデカントし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で置き換えた。眼全体を切断して前部構造（角膜、水晶体、及び毛様体）を除去し、次いで組織がほぼ平らに横たわるように後眼部に４つの切り込みを入れた。蛍光切断顕微鏡を使用して、網膜全体におけるＧＦＰ発現を、フィルタリングされたＵＶ励起で直接蛍光によって可視化した。次いで網膜組織を中央及び周囲の片に切断し、下の組織から分離し、ＰＢＳで追加的にすすぎ、アガロースに埋め込み、切片化し、顕微鏡スライドに載せ、レーザースキャニング共焦点顕微鏡法によって試験した。切片化後、４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して細胞核を標識した。ＧＦＰ発現は、直接蛍光によって検出される。画像は、異なる細胞層における形質導入を評価するために異なる倍率で取得される。
【0305】
データは、図９Ａ～９Ｊにおいて示されている。
【0306】
図９Ｂ（バリアント３）は、内側網膜の細胞においてＧＦＰを発現する網膜を示している。神経節細胞層及び内顆粒層における解剖学的局在化に基づいて、ｒＡＡＶ粒子は、神経節、アマクリン、及びミュラー細胞に感染し、ＧＦＰを発現するようである。
【0307】
図９Ｄ（バリアント６）は、内側網膜の細胞においてＧＦＰを発現する網膜を示している。神経節細胞層及び内顆粒層における解剖学的局在化に基づいて、ｒＡＡＶ粒子は、神経節、アマクリン、及びミュラー細胞に感染し、ＧＦＰを発現するようである。
【0308】
実施例２：ＡＡＶビリオンの向上した網膜感染性に関連するキャプシドバリアント
プールされたＡＡＶライブラリの硝子体内投与、網膜細胞層からのウイルスゲノムＤＮＡの回収及び各ラウンド後の回収されたｃａｐバリアントＤＮＡの次世代シーケンシングを含む複数ラウンドのインビボ選択を非ヒト霊長類において行った。初期プラスミドライブラリ、初期ＡＡＶパッケージングライブラリ及び各ラウンドの選択後に回収されたｃａｐバリアントＤＮＡについてディープシーケンシングを実施した。キャプシドバリアントをアミノ酸レベルについて分析した（すなわち、同一のアミノ酸配列をコードする様々なＤＮＡ配列を有するバリアントを分析のために一緒にプールした）。次いで各アミノ酸配列についてのリードの数を選択のラウンドを通して計数した。
プールされたＡＡＶライブラリの硝子体内投与、網膜細胞層からのウイルスゲノムＤＮＡの回収及び各ラウンド後の回収されたｃａｐバリアントＤＮＡの次世代シーケンシングを含む複数ラウンドのインビボ選択を非ヒト霊長類において行った。初期プラスミドライブラリ、初期ＡＡＶパッケージングライブラリ及び各ラウンドの選択後に回収されたｃａｐバリアントＤＮＡについてディープシーケンシングを実施した。キャプシドバリアントをアミノ酸レベルについて分析した（すなわち、同一のアミノ酸配列をコードする様々なＤＮＡ配列を有するバリアントを分析のために一緒にプールした）。次いで各アミノ酸配列についてのリードの数を選択のラウンドを通して計数した。
【0309】
（１）初期プラスミドライブラリに対する最終ラウンドの選択における濃縮に基づくキャプシドバリアントの格付け、（２）初期プラスミドライブラリに対するパッケージングされたＡＡＶの比を測定することによるパッケージング効率の決定（選択基準：パッケージング因子＞２）、（３）最終ラウンドの選択における中央及び周囲の網膜の間のリードの分布の決定（選択基準：このラウンドについての総リードの少なくとも１０％が中央網膜からのものである）を含んでいた複数ステップの分析を使用して各ライブラリについての例示的なバリアントを特定した。同様のスコアを有するバリアントについて、アミノ酸配列において多様性を有するバリアントを選択した。
【0310】
以下の表３に示される以下のライブラリからの以下のキャプシドをさらなる評価のために選択した。
【0311】
【表3】
【0312】
Ａ．ＡＡＶ２親血清型と比較したキャプシドバリアントのパッケージング効率
組換えＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ）を生成するために使用されたウイルスゲノムは、微生物藻類オプシンＣｈｒｉｍｓｏｎＲのＣ末端に融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列を含んでいた。ｒＡＡＶを接着ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における三重プラスミドトランスフェクションによって生成し、イオジキサノール勾配超遠心分離によって精製し、続いて濃縮及び緩衝液交換をした。精製されたｒＡＡＶを、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８で補充されたＤＰＢＳ中にミリリットル当たり１－２Ｅ．０＋１３ウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）で配合した。表４に示されるように、すべてのキャプシドバリアントは、ＡＡＶ２親キャプシドよりも効率的にパッケージングされ得る。
組換えＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ）を生成するために使用されたウイルスゲノムは、微生物藻類オプシンＣｈｒｉｍｓｏｎＲのＣ末端に融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列を含んでいた。ｒＡＡＶを接着ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における三重プラスミドトランスフェクションによって生成し、イオジキサノール勾配超遠心分離によって精製し、続いて濃縮及び緩衝液交換をした。精製されたｒＡＡＶを、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８で補充されたＤＰＢＳ中にミリリットル当たり１－２Ｅ．０＋１３ウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）で配合した。表４に示されるように、すべてのキャプシドバリアントは、ＡＡＶ２親キャプシドよりも効率的にパッケージングされ得る。
【0313】
【表4】
【0314】
Ｂ．キャプシドバリアントはインビボでＡＡＶビリオンの網膜感染性を向上させる
３～１０歳のカニクイザル及びアフリカミドリサルを使用してインビボでキャプシドを評価した。３０ｇの針を使用して両側硝子体内注射を実施して、５０μＬの体積で眼当たり５．０Ｅ＋１１のウイルスゲノムを送達した。Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴシステムの自己蛍光機能を使用して共焦点スキャニングレーザー検眼鏡検査（ｃＳＬＯ）画像化によってＧＦＰ発現の開始及び進行を週１回モニターした。
３～１０歳のカニクイザル及びアフリカミドリサルを使用してインビボでキャプシドを評価した。３０ｇの針を使用して両側硝子体内注射を実施して、５０μＬの体積で眼当たり５．０Ｅ＋１１のウイルスゲノムを送達した。Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴシステムの自己蛍光機能を使用して共焦点スキャニングレーザー検眼鏡検査（ｃＳＬＯ）画像化によってＧＦＰ発現の開始及び進行を週１回モニターした。
【0315】
硝子体内注射から６～８週後、その霊長類を安楽死させ、両方の眼（眼球全体）を慎重に採取した。摘出後、余剰の眼窩組織を慎重にトリミングし、除去した。縁から約２ｍｍに小さな（５ｍｍ）スリットを入れ、眼全体を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含有するバイアルに入れ、４℃で一晩インキュベートした。一晩の固定後、ＰＦＡをデカントし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で置き換えた。眼全体を切断して前部構造（角膜、水晶体、及び毛様体）を除去し、次いで組織がほぼ平らに横たわるように後眼部に４つの切り込みを入れた。蛍光切断顕微鏡を使用して、網膜全体におけるＧＦＰ発現を、フィルタリングされたＵＶ励起で直接蛍光によって可視化した。次いで網膜組織を中央及び周囲の片に切断し、下の組織から分離し、ＰＢＳで追加的にすすぎ、アガロースに埋め込み、切片化し、顕微鏡スライドに載せ、レーザースキャニング共焦点顕微鏡法によって試験した。切片化後、４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して細胞核を標識した。ＧＦＰ発現を直接蛍光によって検出した。異なる細胞層における形質導入を評価するために異なる倍率で画像を取得した。
【0316】
これらの実験の結果が図１０～１７に示されている。
【0317】
図１０Ａ～１０Ｃは、配列番号１６（バリアント１）についてインビボで観察された結果を示している。図１０Ａ～１０Ｂは、５．０Ｅ＋１１ｖｇのｒＡＡＶの硝子体内注射から２週（Ａ）及び８週（Ｂ）後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴから取得したｃＳＬＯ画像を提供する。図１０Ｃは、直接蛍光画像化による中央及び周囲の網膜表面におけるＧＦＰ発現の程度を示している。これらの画像は、ｃＳＬＯ（Ｂ）及び全搭載（Ｃ）画像の両方における軸索跡の存在によって示されるように、窩及び網膜周囲における網膜神経節細胞の形質導入の証拠を提供する。
【0318】
図１１Ａ～１１Ｅは、配列番号１（バリアント２）についてインビボで観察された結果を示している。図１１Ａ～１１Ｂは、５．０Ｅ＋１１ｖｇのｒＡＡＶの硝子体内注射から２週（Ａ）及び８週（Ｂ）後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴから取得したｃＳＬＯ画像を提供する。図１１Ｃは、直接蛍光画像化による中央及び周囲の網膜表面におけるＧＦＰ発現の程度を示している。これらの画像は、ｃＳＬＯ（Ｂ）及び全搭載（Ｃ）画像の両方における軸索跡の存在によって示されるように、窩における網膜神経節細胞の形質導入の証拠を提供する。図１１Ｄ～１１Ｅは、ＲＧＣ及びミュラー細胞（Ｄ～Ｅ）の強固な形質導入を示す１００ｕｍの網膜切片から得られた共焦点像を提供する。
【0319】
図１２Ａ～１２Ｆは、配列番号５（バリアント３７）についてインビボで観察された結果を示している。図１２Ａ～１２Ｂは、５．０Ｅ＋１１ｖｇのｒＡＡＶの硝子体内注射から２週（Ａ）及び８週（Ｂ）後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴから取得したｃＳＬＯ画像を提供する。図１２Ｃは、直接蛍光画像化による中央及び周囲の網膜表面におけるＧＦＰ発現の程度を示している。これらの画像は、ｃＳＬＯ（Ｂ）及び全搭載（Ｃ）画像の両方における軸索跡の存在、ならびに最周囲（Ｃ）の形質導入によって示されるように、窩における網膜神経節細胞の形質導入の証拠を提供する。図１２Ｄ～１２Ｆは、ＲＧＣ（Ｄ）、内側ニューロン及びミュラー細胞（Ｅ～Ｆ）の強固な形質導入の証拠を示す１００ｕｍの網膜切片から得られた共焦点像を提供する。
【0320】
図１３Ａ～１３Ｂは、配列番号６（バリアント３８）についてインビボで観察された結果を示している。図１３Ａ～１３Ｂは、５．０Ｅ＋１１ｖｇのｒＡＡＶの硝子体内注射から２週（Ａ）及び８週（Ｂ）後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴから取得したｃＳＬＯ画像を提供する。これらの画像は、ｃＳＬＯ画像（Ｂ）における軸索跡の存在によって示されるように、窩における網膜神経節細胞の形質導入の証拠を提供する。
【0321】
図１４Ａ～１４Ｆは、配列番号２６（バリアント４５）についてインビボで観察された結果を示している。図１４Ａ～１４Ｂは、５．０Ｅ＋１１ｖｇのｒＡＡＶの硝子体内注射から２週（Ａ）及び８週（Ｂ）後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴから取得したｃＳＬＯ画像を提供する。図１４Ｃは、直接蛍光画像化による中央及び周囲の網膜表面におけるＧＦＰ発現の程度を示している。これらの画像は、ｃＳＬＯ（Ｂ）及び全搭載（Ｃ）画像の両方における軸索跡の存在、ならびに網膜周囲（Ｃ）の形質導入によって示されるように、中央及び耳側網膜における網膜神経節細胞の強固な形質導入の証拠を提供する。図１４Ｄ～１４Ｆは、中央網膜におけるＲＧＣ（Ｄ）及び内側ニューロン（Ｆ）、ならびに耳側網膜（Ｅ）におけるＲＧＣ及びミュラー細胞の強固な形質導入の証拠を示す１００ｕｍの網膜切片から得られた共焦点像を提供する。
【0322】
図１５Ａ～１５Ｂは、配列番号１２（バリアント４８）についてインビボで観察された結果を示している。図１５Ａ～１５Ｂは、５．０Ｅ＋１１ｖｇのｒＡＡＶの硝子体内注射から２週（Ａ）及び６週（Ｂ）後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴから取得したｃＳＬＯ画像を提供する。これらの画像は、軸索跡の存在によって示されるように、中央及び周囲の網膜における網膜神経節細胞の強固な形質導入の証拠を提供する。高レベルの形質導入が網膜血管系の近くで見られる。このキャプシドバリアントは、ｒＡＡＶ送達から２週後（Ａ）で中央及び周囲の網膜において見られたシグナルのレベル及び程度によって示されるように、網膜細胞を形質導入するのに非常に効率的である。
【0323】
図１６Ａ～１６Ｅは、配列番号１３（バリアント４９）についてインビボで観察された結果を示している。図１６Ａ～１６Ｂは、５．０Ｅ＋１１ｖｇのｒＡＡＶの硝子体内注射から２週（Ａ）及び８週（Ｂ）後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴから取得したｃＳＬＯ画像を提供する。これらの画像は、ｃＳＬＯ（Ｂ）及び全搭載（Ｃ）画像の両方における軸索跡の存在、ならびに網膜周囲（Ｃ）の形質導入によって示されるように、中央及び周囲の網膜における網膜神経節細胞の強固な形質導入の証拠を提供する。異常に高いレベルの形質導入が網膜周囲（Ｃ）で見られる。このキャプシドバリアントは、ｒＡＡＶ送達から２週後（Ａ）で中央及び周囲の網膜において見られたシグナルのレベル及び程度によって示されるように、網膜細胞を形質導入するのに非常に効率的である。図１６Ｃは、直接蛍光画像化による中央及び周囲の網膜表面におけるＧＦＰ発現の程度を示している。図１６Ｄは、中央網膜におけるＲＧＣ、内側ニューロン及びミュラー細胞の強固な形質導入を示す１００ｕｍの網膜切片から得られた共焦点像を提供する。図１６Ｅは、周囲網膜におけるＲＧＣの極めて高い形質導入を示す１００ｕｍの網膜切片から得られた共焦点像を提供する。
【0324】
図１７Ａ～１７Ｂは、配列番号２７（バリアント５８）についてインビボで観察された結果を示している。図１７Ａ～１７Ｂは、５．０Ｅ＋１１ｖｇのｒＡＡＶの硝子体内注射から２週（Ａ）及び６週（Ｂ）後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ／ＯＣＴから取得したｃＳＬＯ画像を提供する。これらの画像は、軸索跡の存在によって示されるように、中央及び周囲の網膜における網膜神経節細胞の強固な形質導入の証拠を提供する。
【0325】
本発明を、その特定の実施形態を参照して説明してきたが、当業者は、本発明の真の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われてもよく、均等物に置き換えられてもよいことを理解されたい。また、特定の状態、材料、物質の組成、プロセス、単数または複数のプロセスステップを、本発明の目的、主旨、及び範囲に適応させるために、多くの修正が行われてもよい。すべてのそのような修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図1J】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図4J】
【図4K】
【図4L】
【図4M】
【図4N】
【図4O】
【図4P】
【図4Q】
【図4R】
【図4S】
【図4T】
【図4U】
【図4V】
【図4W】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図9H】
【図9I】
【図9J】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】