(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-06
(54)【発明の名称】低酸素耐性ナチュラルキラー細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230629BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230629BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230629BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230629BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230629BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230629BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230629BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230629BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230629BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N5/0783
A61K35/17
A61P31/12
A61P31/18
A61P31/14
A61P35/00
A61P35/02
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022574225
(86)(22)【出願日】2020-06-02
(85)【翻訳文提出日】2023-01-27
(86)【国際出願番号】 EP2020065228
(87)【国際公開番号】W WO2021244733
(87)【国際公開日】2021-12-09
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ２０１９年６月２０日に「リサーチ・スクエア（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｑｕａｒｅ）」のウェブサイトにて発表 ２０１９年１０月１５日に「「リサーチ・スクエア（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｑｕａｒｅ）」のウェブサイトにて発表
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520179578
【氏名又は名称】オーエヌケイ セラピューティクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100182084
【弁理士】
【氏名又は名称】中道 佳博
(74)【代理人】
【識別番号】100150326
【弁理士】
【氏名又は名称】樋口 知久
(72)【発明者】
【氏名】オドワイアー，マイケル エイモン ピーター
(72)【発明者】
【氏名】フー，ジンソン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB64
4C087BB65
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZB33
(57)【要約】
ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株は、より細胞傷害性の表現型を持つように、即ちＳｒｃホモロジー２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）の機能が低下するように改変されている。改変された細胞及び細胞株を作製する方法、改変された細胞及び細胞株を含む組成物、並びに治療における前記細胞、細胞株及び組成物の使用も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｓｒｃホモロジー２ドメイン含有プロテインチロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）の機能を低下させるように改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項2】
前記改変が遺伝子改変である、請求項１に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項3】
前記改変が、ＳＨＰ－１発現を遺伝子的にノックダウンすることを含む、請求項１又は２に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項4】
前記改変が、ＳＨＰ－１発現を遺伝子的にノックアウトすることを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項5】
前記改変が一過性の改変である、請求項１～４のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項6】
前記一過性の改変が、ＳＨＰ－１発現のＲＮＡｉノックダウンである、請求項５に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項7】
前記改変が、ＳＨＰ－１の不活性型の発現を伴う一過性の改変である、請求項１又は２に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項8】
前記不活性型のＳＨＰ－１が染色体外核酸から発現する、請求項７に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株
【請求項9】
前記染色体外核酸がＲＮＡである、請求項８に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項10】
前記不活性型のＳＨＰ－１がｍＲＮＡベースのトランスフェクション系である、請求項７～９のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項11】
前記ｍＲＮＡベースのトランスフェクション系がＭａｘｃｙｔｅ ＧＴ系である、請求項１０に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項12】
前記改変が、ＳＨＰ－１のドミナントネガティブ型を発現することを含む、請求項１又は２に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項13】
前記ＳＨＰ－１のドミナントネガティブ型が、例えば、タンパク質ベースのスイッチによって誘導可能である、請求項１２に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項14】
前記ＳＨＰ－１のドミナントネガティブ型の発現が、抗体又はドキシサイクリンによって誘導される、請求項１３に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項15】
ＳＨＰ－１の機能がホスファターゼ阻害剤によって低下する、請求項１に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項16】
前記ホスファターゼ阻害剤が可逆的阻害剤である、請求項１５に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項17】
前記ホスファターゼ阻害剤は、チロシンホスファターゼ阻害剤１（ＴＰＩ－１）、スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳＧ）、オルトバナジン酸ナトリウム（ＳＯＶ）又はフッ化ナトリウム（ＮａＦ）である、請求項１５又は１６に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項18】
前記ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株が、自己ＮＫ細胞、同種他家ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、臍帯由来ＮＫ細胞、ＫＨＹＧ－１ ＮＫ細胞又はＮＫ－９２ ＮＫ細胞である、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項19】
前記ＮＫ細胞が、野生型ＴＲＡＩＬと比較して、ＴＲＡＩＬデス受容体に対する親和性が増加したＴＲＡＩＬバリアントを発現するように改変されている、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項20】
ＮＫ細胞が、１つ以上のチェックポイント阻害受容体の機能が低下するように改変されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項21】
前記ＮＫ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されている、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項22】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＭＵＣ１又はＣＤ３８に結合する、請求項２１に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項23】
治療に使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項24】
前記治療が、ウイルス感染、例えば、ＨＩＶ又はＣＯＶＩＤ－１９の治療である、請求項２３に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項25】
前記治療が、がん治療である、請求項２３に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項26】
前記がんの少なくとも一部が低酸素環境にある、請求項２５に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項27】
前記がんが、血液がん又は固形がんである、請求項２５又は２６に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項28】
前記血液がんが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、無症候性骨髄腫、多発性骨髄腫、活動性骨髄腫又は軽鎖骨髄腫である、請求項２７に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
【請求項29】
請求項１～２２のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を患者に投与することによりがんを治療する方法。
【請求項30】
前記がんの少なくとも一部が低酸素環境にある、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記がんが、血液がん又は固形がんである、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項32】
前記血液がんが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、無症候性骨髄腫、多発性骨髄腫、活動性骨髄腫又は軽鎖骨髄腫である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
請求項１～２２のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＮＫ細胞株を改変し、より細胞毒性の表現型を有するその誘導体を産生することに関する。さらに、本発明は、改変されたＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を産生する方法、前記細胞及び細胞株を含む組成物、並びに治療における前記組成物の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＮＫ細胞の細胞傷害性とは、例えば、細胞溶解性化合物を放出し、又はがん細胞膜上の受容体に結合し、標的細胞のアポトーシスを誘導することにより、ＮＫ細胞が標的細胞の死を誘導する能力を指す。細胞毒性は、細胞溶解性化合物の放出を誘導するシグナルだけでなく、それらの放出を阻害するシグナルによっても影響を受ける。従って、細胞毒性の増加は、標的細胞のより効率的な死滅に繋がり、標的細胞（特に、がん細胞の場合）がＮＫ細胞の細胞毒性活性を弱める可能性が低くなる。
【0003】
ＮＫ細胞の細胞毒性を活性化する細胞内シグナルは、主に、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）及びシグナルトランスデューサー及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）のタンパク質リン酸化を介して伝わることが知られている（Cacalano. “Regulation of Natural Killer Cell Function by Stat3” Front Immunol. Vol. 7, pp. 128, 2016; 及びJiangら、“Pivotal Role of Phosphoinositide-3 Kinase in Regulation of Cytotoxicity in Natural Killer Cells” Nat Immunol. Vol. 1, no. 5, pp. 419-25, 2000）。
【0004】
マウスモデルを使用して、ＮＫ細胞の細胞毒性に関する相当数の研究が行われている。一例として、パーフォリンとグランザイムＢのｍＲＮＡは、マウスＮＫ細胞で構成的に転写されるが、ＮＫ細胞が刺激又は活性化されるまで最小レベルのタンパク質が検出されるという知見がある（Fehnigerら、2007)。この研究及びマウスＮＫ細胞を使用した他の研究は興味深いものであるが、ヒトにおけるＮＫ細胞の細胞毒性の決定的な証拠として信頼することはできない。上記の例とは対照的に、ヒトＮＫ細胞は、刺激前に高レベルのパーフォリン及びグランザイムＢタンパク質を発現する（Leongら、2011）。その結果、マウスＮＫ細胞又はヒトＮＫ細胞を培養して新たに分離した場合、マウスＮＫ細胞の細胞溶解活性は弱いのに対して、ヒトＮＫ細胞は強い細胞溶解能力を示す。
【0005】
マウスとヒトのＮＫ細胞は、発現マーカー、シグナル伝達カスケード、及び組織分布も大きく異なる。例えば、ＣＤ５６はヒトＮＫ細胞のマーカーとして使用されるが、マウスＮＫ細胞はこのマーカーを全く発現しない。さらに、ＮＫ細胞の細胞毒性を調節するための十分に確立されたメカニズムは、リガンド結合ＮＫ活性化及び抑制性受容体によるものである。２つの最も顕著なヒトＮＫ活性化受容体は、ＮＫｐ３０とＮＫｐ４４であることが知られており、どちらもマウスＮＫ細胞では発現していない。ＮＫ阻害受容体に関して、ヒトＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩを認識して細胞傷害活性を弱めるＫＩＲを発現するが、マウスＮＫ細胞は、ＫＩＲをまったく発現せず、代わりにＬｙ４９を発現する（Trowsdaleら, 2001）。全体として、マウスＮＫ細胞は、自然な生理学的環境でヒトＮＫ細胞と同じ機能を達成しているにもかかわらず、この役割を果たすメカニズムは種によって大きく異なる。
【0006】
がん細胞は、例えば、抑制性受容体のリガンドを発現することやＴＲＡＩＬデコイ受容体を発現することにより、免疫応答を回避する独自の能力を有している。がん細胞は、標的の発現を低下させることにより、標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づく治療法に対する耐性を示すこともある。さらに、多くのがんは血液供給が制限された状態で腫瘍を形成し、免疫エフェクター細胞が抗がん作用を果たすのに苦労する低酸素環境を確立する。
【0007】
従って、代替の、好ましくは改善されたヒトＮＫ細胞及びヒトＮＫ細胞株、例えば、より細胞傷害性プロファイル及びがん細胞による回避に対する感受性が低下したものに対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、より細胞傷害性の表現型を有するＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を提供することである。さらなる目的は、改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を作製する方法、前記細胞又は細胞株を含む組成物、並びに治療における前記細胞及び組成物の使用を提供することである。より具体的な実施形態は、同定されたがん、例えば、血液がんや固形がんに対する治療を提供することを目的とする。特定の実施形態は、ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株の複数の改変を組み合わせて、改変細胞の細胞毒性をさらに増強し、及び／又はがんがＮＫ細胞ベースの治療を回避できる程度を低下させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、（特に、低酸素環境において）より細胞毒性の表現型を有する改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株、前記改変細胞及び細胞株を作製する方法、前記改変細胞及び細胞株を含む組成物、並びに治療における前記細胞及び細胞株、及び組成物の使用を提供する。
【0010】
本発明は、Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）の機能を低下させるように改変されたＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を提供する。さらなる改変も存在してもよく、より細胞毒性の表現型を有するＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を提供する。
【0011】
本発明はさらに、ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を使用する、がん、例えば、血液がんの治療方法も提供する。
【0012】
本発明に従って、具体的に治療可能な疾患には、がん、例えば、固形がんが挙げられる。特に、ヒトの腫瘍及びがんを治療することができる。本明細書において、腫瘍への言及は、新生物への言及を含む。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図3b】図ｂは、ＮＫ細胞におけるＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化レベルに対する低酸素状態の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
従って、本発明は、（特に、低酸素環境において）その細胞毒性を高めるように改変されたＮＫ細胞を提供する。
【0015】
本明細書において、ＮＫ細胞への言及には、自己ＮＫ細胞、臍帯由来ＮＫ細胞、同種他家ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、ならびにＫＨＹＧ－１及びＮＫ－９２などのＮＫ細胞株が含まれる。好ましくは、ＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞である。
【0016】
ＮＫ細胞の改変に起因する増加した又は増強した細胞毒性は、そのような改変を有さない野生型ＮＫ細胞の細胞毒性と比較することによって定義される。野生型細胞は、改変を含むが改変自体を有しない細胞と同じタイプの細胞として定義される。
【0017】
好ましくは、本発明のＮＫ細胞は、Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）の機能が低下するように改変される。改変は、好ましくは、遺伝子改変である。
【0018】
任意により、改変には、ＳＨＰ－１発現のノックアウトが含まれる。しかしながら、ＳＨＰ－１発現は（完全にノックアウトされるのではなく）ノックダウンされることが好ましい。ＳＨＰ－１の発現は、野生型のＮＫ細胞のＳＨＰ－１の発現と比較して、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％ノックダウンされる。そのため、ＮＫ細胞の改変後もＳＨＰ－１の発現がいくらか残っていることが好ましい。
【0019】
ＳＨＰ－１機能を低下させる改変は、一過性の改変であることが好ましく、例えば、改変は、一時的及び／又は可逆的である。これは、発生のためにＳＨＰ－１発現に依存する可能性がある未熟なＮＫ細胞を改変する場合に、特に有利である。
【0020】
好ましくは、一過性の改変は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを用いて達成される。
【0021】
任意により、ＳＨＰ－１の不活性型又は部分活性型を発現させることにより、ＳＨＰ－１機能を低下させる。この改変型は、野生型ＳＨＰ－１と競合するが、野生型に関連する同じレベルのチロシンリン酸化は行われない。好ましくは、不活性型は染色体外核酸から発現する。より好ましくは、染色体外核酸は、ＲＮＡである。ＳＨＰ－１の不活性型は、ｍＲＮＡベースのトランスフェクション系、例えば、Ｍａｘｃｙｔｅ ＧＴ系を介して発現することが好ましいが、他の系も適している。
【0022】
従って、ＳＨＰ－１のドミナントネガティブ型を発現させることによってＳＨＰ－１機能を低下させることが好ましい。ドミナントネガティブ型は、例えば、ドキシサイクリン又は抗体により、誘導可能であることが好ましい。遺伝子スイッチを使用して、発現のオンとオフを切り替えたり、発現レベルを調整したりしてもよい。
【0023】
ＮＫ細胞における遺伝物質の発現、例えば、ｓｈＲＮＡ及び／又はＳＨＰ－１のドミナントネガティブ型は、好ましくは薬物誘導性である。好ましくは、誘導は、ＮＫ細胞において１回限りの状態スイッチとして作用する遺伝子回路プラットフォームを介する。好ましくは、回路は、遺伝子発現レベルを維持するための長期間の薬物投与の必要性を低減する記憶能力を有する。好ましくは、オンスイッチ、オフスイッチ及び発現レベルスイッチを含む様々な回路が提供され、これは遺伝子活性が薬物投与量及び薬物曝露期間を介して調整され得ることを意味する。
【0024】
ホスファターゼ阻害剤を使用して、ＳＨＰ－１機能を低下させてもよい。好ましくは、阻害剤はチロシンホスファターゼに特異的である。ホスファターゼ阻害剤は可逆的であることが好ましい。適切なホスファターゼ阻害剤の例としては、チロシンホスファターゼ阻害剤１（ＴＰＩ－１）、スチボグルコン酸ナトリウム（ＳＳＧ）、オルトバナジン酸ナトリウム（ＳＯＶ）及びフッ化ナトリウム（ＮａＦ）が挙げられる。
【0025】
本発明のＮＫ細胞は、（ＮＫ細胞によって自然に発現する任意のＴＲＡＩＬリガンドに加えて）ＴＲＡＩＬリガンドを発現するように、及び／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにさらに改変されてもよい。
【0026】
ＣＡＲは、リーダー配列、ターゲティングドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ又は複数の細胞内ドメインを含む。リーダー配列は小胞体で切断されるため、細胞表面に発現した成熟ＣＡＲの一部を形成しない。ＣＡＲのターゲティングドメインは、多くの場合、抗体の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）に由来する。当技術分野で周知のように、ｓｃＦｖは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＣＡＲを細胞膜に固定するように機能する。ＣＡＲの細胞内ドメインは、免疫細胞シグナル伝達を介して効力を高めるように任意に機能する。そのため、ＣＡＲの構築に使用される一般的な細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ｚｅｔａに由来する。さらに、非常に強力なＣＡＲを提供するために、ＣＡＲに複数の細胞内ドメインを含めることが知られている。共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢやＣＤ２８）は、この目的のために優れた選択である。
【0027】
適切には、ＣＡＲは、１つ以上のがん細胞上で発現する抗原、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ－７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３－ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１（その異常なグリコシル化形態を含む)、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ－１、又はＨＥＲＶ－Ｋ、に結合する。本明細書において、ＣＡＲに言及する場合、標的抗原への言及はＣＡＲ機能を示す。従って、「ＣＤ１９ ＣＡＲ」は、標的細胞、通常はがん細胞の表面に発現するＣＤ１９に結合するＣＡＲである。
【0028】
好ましくは、ＣＲＡは、ＣＤ１９、ＭＵＣ－１又はＣＤ３８に結合する。
【0029】
本発明のＮＫ細胞は、野生型ＴＲＡＩＬリガンドを発現してもよく、その場合、野生型ＴＲＡＩＬリガンドを過剰発現することが好ましい。好ましくは、野生型ＴＲＡＩＬリガンドの発現は、野生型ＮＫ細胞における野生型ＴＲＡＩＬの発現と比較して、少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍増加する。
【0030】
本発明のＮＫ細胞は、変異ＴＲＡＩＬリガンド又はバリアントＴＲＡＩＬリガンド若しくは単にＴＲＡＩＬバリアントとも称される、を発現してもよい。これらの場合、ＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬデス受容体に対する野生型ＴＲＡＩＬリガンドの親和性を比較して、ＴＲＡＩＬデス受容体、例えば、ＤＲ４及び／又はＤＲ５に対する増加した親和性を有するＴＲＡＩＬ変異体／バリアントを発現することが好ましい。突然変異体／バリアントはまた、野生型ＴＲＡＩＬのデコイ受容体への結合と比較して、好ましくは「デコイ」受容体に対してより低い親和性を有する（又は実質的に親和性がない）。そのようなデコイ受容体は、ＴＲＡＩＬリガンドに結合するが細胞死を引き起こす能力を持たず、場合によっては、デスシグナル伝達経路に拮抗するように作用するＴＲＡＩＬ受容体のクラスを示す。
【0031】
野生型ＴＲＡＩＬは、通常、ＤＲ４では＞２ｎＭ、ＤＲ５では＞５ｎＭ、デコイ受容体ＤｃＲ１では＞２０ｎＭ（ＷＯ２００９／０７７８５７; 表面プラズモン共鳴で測定）、又はＤＲ４では５０～１００ｎＭ程度、ＤＲ５では１～１０ｎＭ、及びＤｃＲ１では１７５～２２５（Truneh, A.ら、2000; 等温滴定熱量測定、及びELISAで測定）のＫＤを有することが知られている。従って、ＤＲ４に対する親和性の増加は、それぞれ＜２ｎＭ、又は＜５０ｎＭのＫＤとして適切に定義され、一方、ＤＲ５に対する親和性の増加は、それぞれ＜５ｎＭ、又は＜１ｎＭのＫＤとして適切に定義される。デコイ受容体ＤｃＲ１に対する親和性の低下は、それぞれ＞５０ｎＭ、又は＞２２５ｎＭのＫＤとして適切に定義される。如何なる場合でも、ＴＲＡＩＬバリアント／変異体によって示される親和性の増加、又は減少は、野生型ＴＲＡＩＬによって示されるベースラインの親和性と比較される。親和性は、野生型ＴＲＡＩＬによって示されるものと比較して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも５００％増加する。
【0032】
特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬバリアントは、１３１、１４９、１５９、１６０、１８９、１９１、１９３、１９５、１９９、２００、２０１、２０３、２０４、２１２、２１３、２１４、２１５、２１８、２４０、２５１、２６１、２６４、２６６、２６７、２６９、及び２７０からなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0033】
特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬバリアントは、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｇ１６０Ｅ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｈ、Ｔ２００Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｄ２０３Ａ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｄ２１8Ａ、Ｙ２４０Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｑ、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ａ、Ｄ２６９Ｈ、及びＨ２７０Ｄからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む。
【0034】
特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬバリアントは、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｇ１６０Ｅ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｈ、Ｔ２００Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｄ２０３Ａ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｄ２１8Ａ、Ｙ２４０Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｑ、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ａ、Ｄ２６９Ｈ、及びＨ２７０Ｄからなる群から選択される少なくとも２つの置換を含む。
【0035】
特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬバリアントは、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｇ１６０Ｅ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｈ、Ｔ２００Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｄ２０３Ａ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｄ２１8Ａ、Ｙ２４０Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｑ、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ａ、Ｄ２６９Ｈ、及びＨ２７０Ｄからなる群から選択される少なくとも３つの置換を含む。
【0036】
特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬバリアントのアミノ酸置換は、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｇ１６０Ｅ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｈ、Ｑ１９３Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｈ、Ｔ２００Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｄ２０３Ａ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｄ２１８Ａ、Ｙ２４０Ａ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、２５１Ｑ、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ａ、Ｄ２６９Ｈ、Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２１４Ｒ／Ｅ１９５Ｒ、Ｔ２１４Ｒ／Ｄ２６９Ｈ、Ｙ１８９Ａ／Ｑ１９３Ｓ／Ｎ１９９Ｖ／Ｋ２０１Ｒ／Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｎ１９９Ｈ／Ｋ２０１Ｒ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３１Ｒ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３1Ｒ／Ｄ２１８Ｈ、Ｙ１８９Ｑ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３R／H２６４R／I２６６Ｌ／Ｄ２６７Ｑ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ、Ｔ２６１Ｌ／Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ／Ｈ２７０Ｄ、及びＴ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ／Ｈ２７０Ｄ／Ｔ２００Ｈ（「／」は、複数のアミノ酸置換を示す）からなる群から選択される。
【0037】
特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬバリアントのアミノ酸置換は、ＤＲ５に対して増加した親和性を有するバリアントに基づいて選択される。この種の置換は、Ｄ２６９Ｈ、Ｅ１９５Ｒ、Ｔ２１４Ｒ、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ、Ｔ２１４Ｒ／Ｅ１９５Ｒ、Ｔ２１４Ｒ／Ｄ２６９Ｈ、Ｎ１９９Ｖ、Ｙ１８９Ａ／Ｑ１９３Ｓ／Ｎ１９９Ｖ／Ｋ２０１Ｒ／Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、Ｙ２１３Ｗ／Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２６９Ａ及びＹ２４０Ａからなる群から選択されてもよい。
【0038】
特定の実施態様では、ＴＲＡＩＬバリアントのアミノ酸置換は、ＤＲ４に対して増加した親和性を有するバリアントに基づいて選択される。この種の置換は、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｋ、Ｒ１４９Ｉ、Ｒ１４９Ｍ、Ｒ１４９Ｎ、Ｒ１４９Ｋ、Ｓ１５９Ｒ、Ｑ１９３Ｈ、Ｗ１９３Ｋ、Ｎ１９９Ｒ、Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｎ１９９Ｈ／Ｋ２０１Ｒ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ、Ｇ１３１Ｒ／Ｎ１９９Ｒ／Ｋ２０１Ｈ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３１Ｒ／Ｒ１４９Ｉ／Ｓ１５９Ｒ／Ｓ２１５Ｄ、Ｇ１３１Ｒ／Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２０１Ｒ、Ｋ２０１Ｈ、Ｋ２０４Ｅ、Ｋ２０４Ｄ、Ｋ２０４Ｌ、Ｋ２０４Ｙ、Ｋ２１２Ｒ、Ｓ２１５Ｅ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｄ、Ｄ２１８Ｈ、Ｋ２５１Ｄ、Ｋ２５１Ｅ、Ｋ２５１Ｑ、及びＹ１８９Ｑ／Ｒ１９１Ｋ／Ｑ１９３Ｒ／Ｈ２６４Ｒ／Ｉ２６６Ｌ／Ｄ２６７Ｑからなる群から選択されてもよい。
【0039】
特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ変異体のアミノ酸置換は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対して低下した親和性を有するバリアントに基づいて選択される。この種の置換は、Ｔ２６１Ｌ、Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２００Ｈ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ、Ｔ２６１Ｌ／Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ／Ｈ２７０Ｄ、Ｔ２６１Ｌ／Ｇ１６０Ｅ／Ｈ２７０Ｄ／Ｔ２００Ｈ、Ｄ２０３Ａ、及びＤ２１８Ａからなる群から選択されてもよい。
【0040】
任意の実施形態では、ＴＲＡＩＬ及び／又はＴＲＡＩＬバリアントを発現する改変ＮＫ細胞を使用するがんの治療は、がん細胞上のＴＲＡＩＬデス受容体の発現をアップレギュレートすることができる薬剤を患者に投与することによって強化される。この薬剤は、改変ＮＫ細胞の投与前、一緒に、又は投与後に投与してもよい。しかし、改変ＮＫ細胞を投与する前に薬剤を投与することが好ましい。好ましい実施形態では、薬剤は、がん細胞上のＤＲ５及び／又はＤＲ４の発現をアップレギュレートする。薬剤は、任意により、化学療法剤、例えば、ボルテゾミブでもよく、そしてがんでのＴＲＡＩＬ受容体発現をアップレギュレートできる低用量で投与される。本発明は、ＴＲＡＩＬ受容体の発現をアップレギュレートすることができる任意の特定の薬剤に限定されないが、薬剤の例としては、ＳＭＡＣ模倣薬、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、ピペロングミン、ドキソルビシン、コハク酸アルファトコフェロール、及びＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる。
【0041】
発明の好ましい実施形態では、ＴＲＡＩＬリガンド／変異ＴＲＡＩＬリガンドは、１つ以上のＮＫ細胞共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、２Ｂ４、ＤＡＰ－１０、ＤＡＰ－１２、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）及び／又はＯＸ４０に連結される。従って、リガンドが標的細胞上のその受容体に結合すると、標的細胞内でアポトーシスシグナルが促進されるだけでなく、ＮＫ細胞内で細胞毒性シグナルが刺激される。
【0042】
また、ＣＡＲの細胞内ドメインが１つ以上の共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ３ｚｅｔａ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、２Ｂ４、ＤＡＰ－１０、ＤＡＰ－１２、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）及び／又はＯＸ４０を含むことが好ましい。
【0043】
本発明のＮＫ細胞はまた、ＴＲＡＩＬ誘導細胞死に対する耐性を増加させるように改変されてもよい。その結果、細胞は、ＴＲＡＩＬによって誘導される細胞死、又はフラトリサイド（fratricide）に対する脆弱性が低くなってもよい。
【0044】
ＮＫ細胞は、１つ以上のＴＲＡＩＬ受容体の機能が低下するように改変されてもよい。これは、任意により、遺伝子ノックアウト又はノックダウンを使用して（例えば、siRNAを使用して）、又は細胞小胞体内のＴＲＡＩＬ受容体の発現を制限することによって達成される。本発明のＮＫ細胞では、ＤＲ４及び／又はＤＲ５の機能が低下していることが好ましい。ＤＲ４及び／又はＤＲ５遺伝子がノックアウトされていることが特に好ましい。遺伝子の複数のコピーが存在する場合、全てがノックアウトされることが好ましい。
【0045】
ＮＫ細胞は、細胞のＴＲＡＩＬ誘導死を減少させ、より細胞毒性の表現型を細胞に提供するように改変されてもよい。好ましくは、同じ改変がこれらの利点の両方を達成し得る。ＮＫ細胞は、共刺激ドメインに連結されたＴＲＡＩＬ受容体を発現するように改変されることが好ましい。細胞は、１つ以上の共刺激ドメインに連結されたＴＲＡＩＬ受容体を発現してもよい。好ましくは、ＴＲＡＩＬ受容体はＤＲ４及びＤＲ５から選択される。好ましくは、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、２Ｂ４、ＤＡＰ－１０、ＤＡＰ－１２、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）及びＯＸ４０の１つ以上から選択される。より好ましくは、共刺激ドメインは、ＣＤ３ｚｅｔａに結合した４－１ＢＢである。
【0046】
ＴＲＡＩＬ誘導細胞死に対する改変ＮＫ細胞の耐性は、野生型ＮＫ細胞と比較して、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも５０％増加する。細胞死に対する耐性は、当業者に公知の多くの方法、例えば、細胞生存率アッセイを行うことによって測定することができる。好ましくは、細胞死に対する耐性の増加は、フローサイトメトリーヨウ化プロピジウム細胞生存率アッセイを使用して測定される。一例では、ＴＲＡＩＬ誘導細胞死に対して少なくとも１０％増加した耐性を示すように本発明に従って改変されたＮＫ細胞集団を、可溶性ＴＲＡＩＬを（１）改変細胞及び（２）野生型細胞とインキュベートするアッセイを通じて同定され、そして各細胞集団をヨウ化プロピジウムで染色した後、改変された細胞集団は、野生型集団よりも少なくとも１０％高い細胞生存率を持っていることが分かる。
【0047】
任意により、チェックポイント阻害受容体機能が低下するか、又は機能しないように、ＮＫ細胞をさらに改変する。好ましくは、これらの受容体は特異的チェックポイント阻害受容体である。さらに好ましくは、これらのチェックポイント阻害受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、及び／又はＴＩＧＩＴの１つ以上又は全てである。チェックポイント阻害受容体機能の低下、又は欠如は、例えば、１つ以上のチェックポイント阻害受容体遺伝子をノックダウン、又はノックアウトすることによって達成してもよい。
【0048】
ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞によって自然に発現する任意のＦｃ受容体に加えて、Ｆｃ受容体を発現するように、任意により、さらに改変される。好ましくは、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６である。より好ましくは、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６の高親和性バリアント、例えば、例えば、アミノ酸の１５８位にバリンを有するＣＤ１６である。
【0049】
細胞は、遺伝子改変によって改変してもよい。任意により、この改変は、細胞がＮＫ細胞に分化する前に起こる。例えば、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）は、ＮＫ細胞に分化する前に、ＴＲＡＩＬバリアントを発現するように遺伝子改変することができる。
【0050】
本発明の目的によれば、改変ＮＫ細胞、改変ＮＫ細胞株、又はその組成物は、治療に使用するためのものである。好ましくは、該細胞は、患者のがん、特に、血液がん及び固形がんを治療するために使用される。あるいは、ＮＫ細胞は、ウイルス感染、例えば、ＨＩＶ又はＣＯＶＩＤ－１９を治療するために使用されてもよい。
【0051】
本発明のＮＫ細胞は、低酸素状態に関連する疾患又は状態、例えば、低酸素環境の腫瘍を治療するために適切に使用される。低酸素環境が、ＮＫ細胞の細胞毒性を減少させることができることが本発明者らによって示されている。有利なことに、ＳＨＰ－１機能が低下した本発明のＮＫ細胞は、低酸素環境においてがん細胞に対する細胞毒性が増大することが示されている。換言すれば、本発明のＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の細胞毒性に対する低酸素状態の負の効果に対する耐性の増加を示す。
【0052】
好ましい実施形態では、改変ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株又は組成物は、乳がん、脳がん、結腸がん、頭頸部がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん及び腎臓がんを含む固形がんの治療に使用するためのものである。
【0053】
好ましい実施形態では、改変ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株又は組成物は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫及びＢ細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、活動性骨髄腫及び軽鎖骨髄腫の治療に使用するためのものである。好ましくは、がんはヒトがんである。
【0054】
改変ＮＫ細胞を、それを必要とする患者に投与する様々な経路が当業者に知られている。改変ＮＫ細胞の投与は、全身的又は局所的、例えば、腹腔内又は腫瘍内を介して（特に、固形腫瘍に適している）であり得る。
【0055】
有利なことに、好ましくは、その腫瘍原性を低下させるために処理されたＮＫ細胞は、例えば、それを死滅させる及び／又は分裂不能にすることによって、血液がん細胞株から得られ、がんを治療するために本発明の方法で使用され得る。
【0056】
がん由来細胞を治療用途により受け入れやすくするために、一般に、何らかの方法で処理又は前処理して、患者の腫瘍を形成する傾向を低減又は除去する。実施例で使用されている特定の改変ＮＫ細胞株は、分裂できなくなっているため安全である。それらは照射され、殺傷能力を保持しますが、約３～４日以内に死ぬ。従って、特定の細胞及び細胞株は、例えば、照射の結果、増殖できない。本明細書の方法で使用される可能性のあるＮＫ細胞の処理には、それらがｉｎ ｖｉｖｏで分裂して腫瘍を形成するのを防ぐための放射線照射、及び腫瘍原性を減らすための遺伝子改変、例えば、細胞がｉｎ ｖｉｖｏで分裂して腫瘍を形成するのを防ぐために活性化できる自殺遺伝子をコードする配列を挿入する。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に細胞死を引き起こす外因性物質、例えば、循環物質によって活性化される可能性があります。さらなる代替手段は、療法の特定のＮＫ細胞を標的とするモノクローナル抗体の使用である。例えば、ＣＤ５２はＫＨＹＧ－１細胞で発現し、このマーカーへのモノクローナル抗体の結合は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びＫＨＹＧ－１細胞死を引き起こす可能性がある。
【0057】
２００６年にＳｕｃｋらが発行した文献に説明されるように、例えば、ガンマセル３０００ Ｅｌａｎなどの照射器を使用すると、がん由来のＮＫ細胞及び細胞株に簡単に照射できる。セシウム１３７の線源を使用して放射線量を制御し、例えば、１Ｇｙと５０Ｇｙの間の線量応答曲線を使用して、増加した細胞毒性の利点を維持しながら、細胞の増殖能を排除するための最適な線量を決定できる。これは、放射線の各線量が投与された後、細胞毒性について細胞をアッセイすることによって達成される。
【0058】
十分に確立された自家又はＭＨＣ適合Ｔ細胞アプローチよりも、養子細胞免疫療法に照射ＮＫ細胞株を使用することには大きな利点がある。第一に、増殖性の高いＮＫ細胞株を使用するということは、改変したＮＫ細胞株の増殖をより簡単に商業レベルで達成できることを意味する。次に、改変ＮＫ細胞株の照射は、細胞を患者に投与する前に行うことができる。これらの照射された細胞は、有用な細胞毒性を保持しているが、寿命が限られており、改変されたＴ細胞とは異なり、長期間循環せず、永続的な副作用を引き起こす。
【0059】
また、同種他家改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を使用することは、患者のＭＨＣクラスＩ発現細胞が、自家ＮＫ細胞傷害性応答と同様にＮＫ細胞傷害性応答を阻害できないことを意味する。がん細胞を殺すための同種ＮＫ細胞及び細胞株の使用は、ＧＶＬ効果の恩恵を受け、Ｔ細胞とは異なり、同種他家ＮＫ細胞及び細胞株はＧＶＨＤの発症を刺激しないため、養子細胞免疫療法によるがんの治療に非常に好ましい選択肢となっている。
【実施例】
【0060】
本発明について、増加した細胞毒性活性を示すように改変されたＮＫ細胞の製造に関連して、より具体的に詳細に記載する。添付の図面を参照して特定の実施形態を示す。
【0061】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びアミノ酸配列を以下で参照する。
配列番号１は、ＤＲ５のｇＲＮＡの例である。
配列番号２は、ＤＲ４のｇＲＮＡの例である。
配列番号３は、ＤＲ４のｇＲＮＡの第２の例である。
配列番号１は、ＤＲ５のｇＲＮＡの例である。
配列番号２は、ＤＲ４のｇＲＮＡの例である。
配列番号３は、ＤＲ４のｇＲＮＡの第２の例である。
【0062】
（実施例１～３：詳細な図の概要）
（図１）
低酸素状態のＮＫ細胞は、腫瘍細胞に対してより低い細胞毒性を示す。（ａ－ｂ）腫瘍細胞に対するＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性のフローサイトメトリー分析。ＫＨＹＧ－１細胞をＫ５６２（ａ）又はＭＭ．１Ｓ（ｂ）腫瘍細胞と、正常酸素圧（２０％Ｏ２）及び低酸素（１％Ｏ２）条件で２４時間培養した後、異なるＥ：Ｔ比で４時間インキュベートした。左パネル: ３つの実験からの結果の表示。右パネル: ＮＫ細胞によって殺される腫瘍細胞の割合を示す統計分析（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）低酸素マーカーＨＩＦ－１αの発現に対する低酸素状態の影響のウェスタンブロッティング分析。ＮＫ細胞を２０％又は１％Ｏ２で２４時間培養した後、ウェスタンブロッティング分析を行った。（ｄ）アネキシンＶ－ＦＩＴＣ／７－ＡＡＤ染色を行うことによる、ＮＫ細胞の生存率に対する低酸素状態の影響のフローサイトメトリー分析。ＮＫ細胞を２０％又は１％Ｏ２で２４時間培養した後、フローサイトメトリー染色を行った（ｎ＝３、ｎｓ＝非有意）。
（図１）
低酸素状態のＮＫ細胞は、腫瘍細胞に対してより低い細胞毒性を示す。（ａ－ｂ）腫瘍細胞に対するＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性のフローサイトメトリー分析。ＫＨＹＧ－１細胞をＫ５６２（ａ）又はＭＭ．１Ｓ（ｂ）腫瘍細胞と、正常酸素圧（２０％Ｏ２）及び低酸素（１％Ｏ２）条件で２４時間培養した後、異なるＥ：Ｔ比で４時間インキュベートした。左パネル: ３つの実験からの結果の表示。右パネル: ＮＫ細胞によって殺される腫瘍細胞の割合を示す統計分析（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）低酸素マーカーＨＩＦ－１αの発現に対する低酸素状態の影響のウェスタンブロッティング分析。ＮＫ細胞を２０％又は１％Ｏ２で２４時間培養した後、ウェスタンブロッティング分析を行った。（ｄ）アネキシンＶ－ＦＩＴＣ／７－ＡＡＤ染色を行うことによる、ＮＫ細胞の生存率に対する低酸素状態の影響のフローサイトメトリー分析。ＮＫ細胞を２０％又は１％Ｏ２で２４時間培養した後、フローサイトメトリー染色を行った（ｎ＝３、ｎｓ＝非有意）。
【0063】
（図２）
低酸素状態は、ＮＫ細胞の細胞毒性関連分子の発現レベルを低下させる。（ａ）それぞれＫＨＹＧ－１（上部パネル）及びＮＫ９２（下部パネル）細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリン発現のフローサイトメトリー分析。ＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２を正常酸素圧（２０％ Ｏ２）と低酸素（１％ Ｏ２）で２４時間培養し、細胞内染色を行ってグランザイムとパーフォリンの発現を定量的に分析した。左パネル：ヒストグラム オーバーレイは、蛍光マイナス１（ＦＭＯ）コントロールと比較して、正常酸素圧、及び低酸素の細胞サンプルで分析されたグランザイムＢ及びパーフォリン発現の代表的な例を示す。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。（ｂ）正常酸素圧及び低酸素のＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞におけるIFN－γの細胞内レベルのフローサイトメトリー分析。左パネル：３つの代表的なフローサイトメトリー結果の１つ。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。（ｃ）正常酸素圧及び低酸素のＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞における脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの膜染色のフローサイトメトリー分析。左パネル：３つの代表的なフローサイトメトリー結果の１つ。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。（ｄ）正常酸素圧及び低酸素のＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞における活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、及びＮＫＧ２Ｄの膜染色のフローサイトメトリー分析。左パネル：３つの代表的なフローサイトメトリー結果の１つ。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。
低酸素状態は、ＮＫ細胞の細胞毒性関連分子の発現レベルを低下させる。（ａ）それぞれＫＨＹＧ－１（上部パネル）及びＮＫ９２（下部パネル）細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリン発現のフローサイトメトリー分析。ＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２を正常酸素圧（２０％ Ｏ２）と低酸素（１％ Ｏ２）で２４時間培養し、細胞内染色を行ってグランザイムとパーフォリンの発現を定量的に分析した。左パネル：ヒストグラム オーバーレイは、蛍光マイナス１（ＦＭＯ）コントロールと比較して、正常酸素圧、及び低酸素の細胞サンプルで分析されたグランザイムＢ及びパーフォリン発現の代表的な例を示す。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。（ｂ）正常酸素圧及び低酸素のＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞におけるIFN－γの細胞内レベルのフローサイトメトリー分析。左パネル：３つの代表的なフローサイトメトリー結果の１つ。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。（ｃ）正常酸素圧及び低酸素のＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞における脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの膜染色のフローサイトメトリー分析。左パネル：３つの代表的なフローサイトメトリー結果の１つ。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。（ｄ）正常酸素圧及び低酸素のＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞における活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、及びＮＫＧ２Ｄの膜染色のフローサイトメトリー分析。左パネル：３つの代表的なフローサイトメトリー結果の１つ。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。
【0064】
（図３）
低酸素症は、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化レベルを低下させる。（ａ－ｃ）ウエスタンブロット分析は、それぞれＫＨＹＧ－１（ａ）、ＮＫ９２（ｂ）、初代ＮＫ細胞（ｃ）におけるリン酸化ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の発現レベルを示す。（ｄ）ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の阻害は、ＮＫ細胞表面の活性化受容体の発現を減少させる。代表的なフローサイトメトリーの結果は、ＮＫ細胞表面の活性化受容体の発現に対するＳＴＡＴ３阻害剤クリプトタンシノン（ＣＰＴ）（上部パネル)とＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６（下部パネル）の効果を示す。左パネル：３つの代表的なフローサイトメトリー結果の１つ。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。ＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞をビヒクル、10μＭ ＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６、及び１０μＭ ＳＴＡＴ３阻害剤ＣＰＴで２４時間処理した。（ｅ）ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の阻害は、NK細胞の細胞毒性を低下させる。Ｋ５６２細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性に対するＥＲＫ及びＳＴＡＴ３阻害の効果を示す統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。ＫＨＹＧ－１細胞を１０μＭ Ｕ０１２６及び１０μＭ ＣＰＴで6時間前処理した後、様々なＥ：Ｔ比でＫ５６２と４時間インキュベートした。
低酸素症は、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化レベルを低下させる。（ａ－ｃ）ウエスタンブロット分析は、それぞれＫＨＹＧ－１（ａ）、ＮＫ９２（ｂ）、初代ＮＫ細胞（ｃ）におけるリン酸化ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の発現レベルを示す。（ｄ）ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の阻害は、ＮＫ細胞表面の活性化受容体の発現を減少させる。代表的なフローサイトメトリーの結果は、ＮＫ細胞表面の活性化受容体の発現に対するＳＴＡＴ３阻害剤クリプトタンシノン（ＣＰＴ）（上部パネル)とＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６（下部パネル）の効果を示す。左パネル：３つの代表的なフローサイトメトリー結果の１つ。右パネル：フローサイトメトリーデータの統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。ＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞をビヒクル、10μＭ ＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６、及び１０μＭ ＳＴＡＴ３阻害剤ＣＰＴで２４時間処理した。（ｅ）ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の阻害は、NK細胞の細胞毒性を低下させる。Ｋ５６２細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性に対するＥＲＫ及びＳＴＡＴ３阻害の効果を示す統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１)。ＫＨＹＧ－１細胞を１０μＭ Ｕ０１２６及び１０μＭ ＣＰＴで6時間前処理した後、様々なＥ：Ｔ比でＫ５６２と４時間インキュベートした。
【0065】
（図４）
低酸素状態は、ＮＫ細胞のＳＨＰ－１とＳＨＰ－２を活性化する。（ａ－ｃ）ウエスタンブロット分析は、正常酸素圧（２０％ Ｏ２）及び低酸素（１％ Ｏ２）でのＫＨＹＧ－１（ａ）、ＮＫ９２（ｂ）細胞、初代ＮＫ細胞（ｃ）のそれぞれにおけるＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２の発現を示す。（ｄ）ウェスタンブロッティング分析は、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化に対するＳＨＰ－１阻害剤ＴＰＩ－１の効果を示す。低酸素ＫＹＨＧ－１細胞を５μＭ ＴＰＩ－１で２時間前処理した後、ウェスタンブロッティング分析のために細胞を回収した。（ｅ）ＮＫ細胞の細胞毒性に対するＴＰＩ－１の効果のフローサイトメトリー分析。左パネル：ＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性に対するＴＰＩ－１の代表的なフローサイトメトリーの結果。ＫＨＹＧ－１細胞を５μＭ ＴＰＩ－１で２時間前処理した後、Ｋ５６２細胞と様々なＥ：Ｔ比で４時間インキュベートした。右パネル：Ｋ５６２細胞に対するＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性に対するＴＰＩ－１の効果の統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５)。
低酸素状態は、ＮＫ細胞のＳＨＰ－１とＳＨＰ－２を活性化する。（ａ－ｃ）ウエスタンブロット分析は、正常酸素圧（２０％ Ｏ２）及び低酸素（１％ Ｏ２）でのＫＨＹＧ－１（ａ）、ＮＫ９２（ｂ）細胞、初代ＮＫ細胞（ｃ）のそれぞれにおけるＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２の発現を示す。（ｄ）ウェスタンブロッティング分析は、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化に対するＳＨＰ－１阻害剤ＴＰＩ－１の効果を示す。低酸素ＫＹＨＧ－１細胞を５μＭ ＴＰＩ－１で２時間前処理した後、ウェスタンブロッティング分析のために細胞を回収した。（ｅ）ＮＫ細胞の細胞毒性に対するＴＰＩ－１の効果のフローサイトメトリー分析。左パネル：ＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性に対するＴＰＩ－１の代表的なフローサイトメトリーの結果。ＫＨＹＧ－１細胞を５μＭ ＴＰＩ－１で２時間前処理した後、Ｋ５６２細胞と様々なＥ：Ｔ比で４時間インキュベートした。右パネル：Ｋ５６２細胞に対するＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性に対するＴＰＩ－１の効果の統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５)。
【0066】
（図５）
ＳＨＰ－２の阻害は、ＮＫ細胞の細胞毒性には影響を及ぼさない。（ａ）ウェスタンブロッティングは、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化に対するＳＨＰ－２阻害剤ＳＨＰ０９９の効果を示す。低酸素のＫＹＨＧ－１細胞を５μＭ ＳＨＰ０９９で２時間前処理した後、ウェスタンブロッティング分析のために細胞を収集した。（ｂ）フローサイトメトリー分析は、ＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性に対するＳＨＰ０９９の効果を示す。ＫＨＹＧ－１細胞を５μＭ ＳＨＰ０９９で２時間前処理した後、さまざまなＥ：Ｔ比でＫ５６２細胞と４時間インキュベートした。（ｃ）Ｋ５６２細胞に対するＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性に対するＳＨＰ０９９の効果の統計分析（ｎ＝３、ｎｓ＝有意差なし）。
ＳＨＰ－２の阻害は、ＮＫ細胞の細胞毒性には影響を及ぼさない。（ａ）ウェスタンブロッティングは、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化に対するＳＨＰ－２阻害剤ＳＨＰ０９９の効果を示す。低酸素のＫＹＨＧ－１細胞を５μＭ ＳＨＰ０９９で２時間前処理した後、ウェスタンブロッティング分析のために細胞を収集した。（ｂ）フローサイトメトリー分析は、ＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性に対するＳＨＰ０９９の効果を示す。ＫＨＹＧ－１細胞を５μＭ ＳＨＰ０９９で２時間前処理した後、さまざまなＥ：Ｔ比でＫ５６２細胞と４時間インキュベートした。（ｃ）Ｋ５６２細胞に対するＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性に対するＳＨＰ０９９の効果の統計分析（ｎ＝３、ｎｓ＝有意差なし）。
【0067】
（図６）
ＳＨＰ－１の遺伝子サイレンシングが、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３シグナル伝達、並びにＮＫ細胞の細胞毒性に及ぼす影響。（ａ）ＫＨＹＧ－１細胞でのＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンにおけるＳＨＰ－１、ＥＲＫ、及びＳＴＡＴ３発現のウェスタンブロッティング分析。（ｂ）Ｋ５６２細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性に対するＳＨＰ－１のノックダウンの影響の統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５）。ＫＨＹＧ－１細胞に２μｇのｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＩＬ－２を含むＲＰＭＩ１６４０増殖培地で1２～１６時間培養した。前述のように、エレクトロポレーションした細胞をウェスタンブロッティング又は殺傷アッセイに使用した。（ｃ）模式図は、低酸素状態がＳＨＰ－１依存的にＮＫ細胞の細胞毒性をどのように損なうかを示している。
ＳＨＰ－１の遺伝子サイレンシングが、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３シグナル伝達、並びにＮＫ細胞の細胞毒性に及ぼす影響。（ａ）ＫＨＹＧ－１細胞でのＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンにおけるＳＨＰ－１、ＥＲＫ、及びＳＴＡＴ３発現のウェスタンブロッティング分析。（ｂ）Ｋ５６２細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性に対するＳＨＰ－１のノックダウンの影響の統計分析（ｎ＝３、*Ｐ＜０．０５）。ＫＨＹＧ－１細胞に２μｇのｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＩＬ－２を含むＲＰＭＩ１６４０増殖培地で1２～１６時間培養した。前述のように、エレクトロポレーションした細胞をウェスタンブロッティング又は殺傷アッセイに使用した。（ｃ）模式図は、低酸素状態がＳＨＰ－１依存的にＮＫ細胞の細胞毒性をどのように損なうかを示している。
【0068】
（実施例１～３：材料及び方法）
（抗体及び試薬）
Phospho-Stat3（#4113）、Stat3（#12640）、Phospho-p44/42 MAPK（ERK1/2）（#9106）、 p44/p42 MAPK（ERK1/2）（#9102）、Phosph-SHP-1（#8849）、Phospho-SHP-2（#5431）、SHP-1（#3759）、SHP-2（#3397）、HIF-1α（#14179）、及びβ-アクチン（#58169）に対するウェスタンブロッティング用抗体をCell Signalingから購入した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ IgG（#111-035-003）又はヤギ抗マウス IgG（#115-005-003）は、Jackson ImmunoResearchから購入した。フローサイトメトリー分析では、Alexa Fluor 647標識抗ヒト パーフォリン（#563576）をBD Biosciencesから購入した。FITC標識アネキシン V（#640945）、PE標識抗ヒトIFN-γ（#506506）、抗ヒト/マウス グランザイムＢ（#372207）、APC標識抗ヒトNKp46（#137607）、抗ヒトNKp30（#325209）、抗ヒトNKG2D（#320808）、抗ヒトCD2（#300214）、抗ヒトCD107a（#12-1079-42）抗体をBiolegendから購入した。CD3標識CD3（#560365）、PE標識CD56（#555516）をBD Biosciencesから購入した。Sytox（商標）Green Dead Cell Stainを、Molecular Probesから購入した（#S34860）。STAT3阻害剤であるクリプトタンシノンを、Selleck Chemicals（#35825-57-1）から購入した。SHP-1阻害剤TPI-1（#HY-100463）、SHP-2阻害剤SHP-099（#HY-100388）、ERK阻害剤U0126（#HY-12031）を、MedChemExpressから購入した。
（抗体及び試薬）
Phospho-Stat3（#4113）、Stat3（#12640）、Phospho-p44/42 MAPK（ERK1/2）（#9106）、 p44/p42 MAPK（ERK1/2）（#9102）、Phosph-SHP-1（#8849）、Phospho-SHP-2（#5431）、SHP-1（#3759）、SHP-2（#3397）、HIF-1α（#14179）、及びβ-アクチン（#58169）に対するウェスタンブロッティング用抗体をCell Signalingから購入した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ IgG（#111-035-003）又はヤギ抗マウス IgG（#115-005-003）は、Jackson ImmunoResearchから購入した。フローサイトメトリー分析では、Alexa Fluor 647標識抗ヒト パーフォリン（#563576）をBD Biosciencesから購入した。FITC標識アネキシン V（#640945）、PE標識抗ヒトIFN-γ（#506506）、抗ヒト/マウス グランザイムＢ（#372207）、APC標識抗ヒトNKp46（#137607）、抗ヒトNKp30（#325209）、抗ヒトNKG2D（#320808）、抗ヒトCD2（#300214）、抗ヒトCD107a（#12-1079-42）抗体をBiolegendから購入した。CD3標識CD3（#560365）、PE標識CD56（#555516）をBD Biosciencesから購入した。Sytox（商標）Green Dead Cell Stainを、Molecular Probesから購入した（#S34860）。STAT3阻害剤であるクリプトタンシノンを、Selleck Chemicals（#35825-57-1）から購入した。SHP-1阻害剤TPI-1（#HY-100463）、SHP-2阻害剤SHP-099（#HY-100388）、ERK阻害剤U0126（#HY-12031）を、MedChemExpressから購入した。
【0069】
（細胞株及び培地）
ＮＫ細胞株ＫＨＹＧ－１を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Biological Industries、#04-001-1ACS）、１０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－２（PeproTech、#200-02）、２ｍＭ Ｌ-グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０（BasalMedium、#L210KJ）で培養した。ＮＫ細胞株ＮＫ９２を、１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ヒト多発性骨髄腫細胞株ＭＭ．１Ｓ及び白血病細胞株Ｋ５６２を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で増殖させた。全ての細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で、３７℃で維持した。正常酸素又は低酸素の細胞培養条件は、それぞれ２０％Ｏ２、５％ＣＯ２、及び７５％Ｎ２の混合物、又は１％Ｏ２、５％ＣＯ２、及び９４％Ｎ２の混合物でフラッシュした密封されたインキュベーターで細胞を培養することによって取得した。
ＮＫ細胞株ＫＨＹＧ－１を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Biological Industries、#04-001-1ACS）、１０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－２（PeproTech、#200-02）、２ｍＭ Ｌ-グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０（BasalMedium、#L210KJ）で培養した。ＮＫ細胞株ＮＫ９２を、１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ヒト多発性骨髄腫細胞株ＭＭ．１Ｓ及び白血病細胞株Ｋ５６２を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０で増殖させた。全ての細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で、３７℃で維持した。正常酸素又は低酸素の細胞培養条件は、それぞれ２０％Ｏ２、５％ＣＯ２、及び７５％Ｎ２の混合物、又は１％Ｏ２、５％ＣＯ２、及び９４％Ｎ２の混合物でフラッシュした密封されたインキュベーターで細胞を培養することによって取得した。
【0070】
（ヒト初代ＮＫ細胞の濃縮と活性化）
初代ＮＫ細胞を、メーカーのプロトコルに従って、immunomagnetic negative selection strategy（EasySep Human NK cell Isolation Kit、Stemcell Technologies）を介して、健康なヒトドナーの末梢血単核細胞から分離した。精製したＮＫ細胞集団の純度を、ＣＤ３、ＣＤ５６に対する蛍光色素結合抗体を使用したフローサイトメトリーによって決定した。短期間の活性化のために、精製したＮＫ細胞（＞９０％純度）を、１０％ＦＢＳ、５％ヒト血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０に３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、上記の正常酸素圧又は低酸素条件下で、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で一晩培養した。
初代ＮＫ細胞を、メーカーのプロトコルに従って、immunomagnetic negative selection strategy（EasySep Human NK cell Isolation Kit、Stemcell Technologies）を介して、健康なヒトドナーの末梢血単核細胞から分離した。精製したＮＫ細胞集団の純度を、ＣＤ３、ＣＤ５６に対する蛍光色素結合抗体を使用したフローサイトメトリーによって決定した。短期間の活性化のために、精製したＮＫ細胞（＞９０％純度）を、１０％ＦＢＳ、５％ヒト血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０に３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、上記の正常酸素圧又は低酸素条件下で、ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で一晩培養した。
【0071】
（フローサイトメトリー）
ＮＫ細胞の細胞毒性エフェクター分子と活性化受容体の発現を、フローサイトメトリーによって分析した。膜染色のために、５×１０５個の細胞を回収し、染色バッファー（０．１％ＮａＮ３及び０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ)で３回洗浄した。次に、それぞれの抗体に付属の説明書に従って、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞染色バッファーで３回洗浄した後、死細胞をゲートアウトするために使用したＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ又は７－ＡＡＤの存在下で、細胞を３００μＬの染色バッファーに再懸濁した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、１反応あたり１０，０００個の細胞の取得を行った。Ｆｌｏｗｊｏ ｖ７．６．２（Tree Star）を使用してデータを分析した。細胞内染色のために、５×１０５個の細胞を回収し、ＰＢＳ中の１ｍＬの１％パラホルムアルデヒドで、室温にて１５分間固定した。細胞染色バッファーで３回洗浄した後、固定した細胞を２ｍＬの透過処理バッファー（細胞染色バッファー中、０．１％サポニン）に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離によって再度回収し、氷上で１５分間、透過処理バッファー中の最適作用濃度の抗体で染色した。透過処理バッファーで３回洗浄した後、最終的なフローサイトメトリー分析のために、細胞を３００μＬの細胞染色バッファーに再懸濁した。
ＮＫ細胞の細胞毒性エフェクター分子と活性化受容体の発現を、フローサイトメトリーによって分析した。膜染色のために、５×１０５個の細胞を回収し、染色バッファー（０．１％ＮａＮ３及び０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ)で３回洗浄した。次に、それぞれの抗体に付属の説明書に従って、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞染色バッファーで３回洗浄した後、死細胞をゲートアウトするために使用したＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ又は７－ＡＡＤの存在下で、細胞を３００μＬの染色バッファーに再懸濁した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、１反応あたり１０，０００個の細胞の取得を行った。Ｆｌｏｗｊｏ ｖ７．６．２（Tree Star）を使用してデータを分析した。細胞内染色のために、５×１０５個の細胞を回収し、ＰＢＳ中の１ｍＬの１％パラホルムアルデヒドで、室温にて１５分間固定した。細胞染色バッファーで３回洗浄した後、固定した細胞を２ｍＬの透過処理バッファー（細胞染色バッファー中、０．１％サポニン）に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離によって再度回収し、氷上で１５分間、透過処理バッファー中の最適作用濃度の抗体で染色した。透過処理バッファーで３回洗浄した後、最終的なフローサイトメトリー分析のために、細胞を３００μＬの細胞染色バッファーに再懸濁した。
【0072】
（ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ）
ＮＫ細胞由来の細胞傷害性内容物の脱顆粒を、フローサイトメトリーによる脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの分析によって測定した。簡単に説明すると、ＮＫ細胞と腫瘍細胞を２０％又は１％Ｏ２で１４～１６時間、個別にプレインキュベートし、その後２４ウェルのプレートで２０％又は１％Ｏ２のいずれかで１：１（Ｅ：Ｔ）の比率で組み合わせた。ＮＫ細胞と腫瘍細胞を合わせた後、５～１０分以内に５μＬのＡＰＣ標識抗ＣＤ１０７ａをウェルに添加した。その後、モネンシンとゴルジプラグ（１：１０００希釈；BD Biosciences）を加えた。合計４時間のインキュベーション時間の後、プレートを氷上に置いて反応を停止させた。次に、細胞を回収し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
ＮＫ細胞由来の細胞傷害性内容物の脱顆粒を、フローサイトメトリーによる脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの分析によって測定した。簡単に説明すると、ＮＫ細胞と腫瘍細胞を２０％又は１％Ｏ２で１４～１６時間、個別にプレインキュベートし、その後２４ウェルのプレートで２０％又は１％Ｏ２のいずれかで１：１（Ｅ：Ｔ）の比率で組み合わせた。ＮＫ細胞と腫瘍細胞を合わせた後、５～１０分以内に５μＬのＡＰＣ標識抗ＣＤ１０７ａをウェルに添加した。その後、モネンシンとゴルジプラグ（１：１０００希釈；BD Biosciences）を加えた。合計４時間のインキュベーション時間の後、プレートを氷上に置いて反応を停止させた。次に、細胞を回収し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【0073】
（フローサイトメトリー細胞毒性アッセイ）
アッセイの前に、ＮＫ細胞と腫瘍細胞を、最初に２０％又は１％Ｏ２で、５％ＣＯ２で２４時間、個別にプレインキュベートした。次に、ＮＫ細胞と標的細胞を、２４ウェルプレートで異なるＥ：Ｔ比で同等の条件下でインキュベートした。４時間のインキュベーション後、サンプルを回収して洗浄し、続いてＣＤ２－ＡＰＣ、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ、及びＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎを用いた組み合わせ染色を行い、ＣＤ２を使用してエフェクターを標的細胞から識別し、標的細胞死をアネキシンＶ－ＦＩＴＣとＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎで検出した。サンプルごとに最低１０，０００のターゲットイベントを収集し、Ｆｌｏｗｊｏ ｖ７．６．２を使用して、結果を分析した。
アッセイの前に、ＮＫ細胞と腫瘍細胞を、最初に２０％又は１％Ｏ２で、５％ＣＯ２で２４時間、個別にプレインキュベートした。次に、ＮＫ細胞と標的細胞を、２４ウェルプレートで異なるＥ：Ｔ比で同等の条件下でインキュベートした。４時間のインキュベーション後、サンプルを回収して洗浄し、続いてＣＤ２－ＡＰＣ、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ、及びＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎを用いた組み合わせ染色を行い、ＣＤ２を使用してエフェクターを標的細胞から識別し、標的細胞死をアネキシンＶ－ＦＩＴＣとＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎで検出した。サンプルごとに最低１０，０００のターゲットイベントを収集し、Ｆｌｏｗｊｏ ｖ７．６．２を使用して、結果を分析した。
【0074】
（ウェスタンブロッティング）
ウェスタンブロッティングでは、処理済み及び未処理のＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞を、氷上で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、1％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、及びプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーで３０分間溶解した。溶解物を１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（HEART Biotech、#WB003）によって決定した。等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルにロードして分離し、ＰＶＤＦメンブレン（Millipore、#IPVH00010）に転写した。室温で０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ中の５％脱脂乳で１時間ブロッキングした後、メンブレンを一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。免疫ブロットを、ＨＲＰ結合二次抗体とECL Western Blot Detection kit（Phygene Life Sciences、＃PH0353）を使用して可視化した。
ウェスタンブロッティングでは、処理済み及び未処理のＫＨＹＧ－１及びＮＫ９２細胞を、氷上で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、1％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、及びプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーで３０分間溶解した。溶解物を１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（HEART Biotech、#WB003）によって決定した。等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルにロードして分離し、ＰＶＤＦメンブレン（Millipore、#IPVH00010）に転写した。室温で０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ中の５％脱脂乳で１時間ブロッキングした後、メンブレンを一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。免疫ブロットを、ＨＲＰ結合二次抗体とECL Western Blot Detection kit（Phygene Life Sciences、＃PH0353）を使用して可視化した。
【0075】
（ＮＫ細胞におけるｓｉＲＮＡを介した遺伝子サイレンシング）
ｓｉＲＮＡトランスフェクションの前に、ＫＨＹＧ－１細胞を予熱したＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Life Technologies、Carlsbad、CA、USA）で洗浄し、同じ培地に再懸濁した。次に、エレクトロポレーターCUY21EDIT（BEX Co. Ltd、Japan）を使用して、０．２ｃｍキュベット内のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１００μＬ中の２μｇのｓｉＲＮＡで１０６個の細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションプログラムを、次のように設定した：ＰｐＶ＝２００Ｖ、Ｐｐ ｏｎ １０ｍｓ、Ｐｐ ｏｆｆ １０ｍｓ、ＰｄＶ＝２５Ｖ、Ｐｄ ｏｎ ５０ｍｓ、Ｐｄ ｏｆｆ ５０ ｍｓ；Ｐｄ Ｎ＝１０、ｃａｐａｃｉｔｙ＝９４０μＦ、及び指数関数的減衰波形。エレクトロポレーション後、細胞を２ｍＬの完全培地に再懸濁し、低酸素条件（１％Ｏ２）で培養した。エレクトロポレーションの１６～２４時間後、細胞をウェスタンブロッティング又は殺傷アッセイに使用した。トランスフェクション効率と生存率は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ｓｉＲＮＡ又は７－ＡＡＤの発現を定量的に測定することにより、エレクトロポレーションの２～６時間後にフローサイトメトリーで分析した。ＳＨＰ－１ ｍＲＮＡは、ＧｅｎｅＰｈａｒｍａの遺伝子特異的ｓｉＲＮＡプールを使用してサイレンシングした。
ｓｉＲＮＡトランスフェクションの前に、ＫＨＹＧ－１細胞を予熱したＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Life Technologies、Carlsbad、CA、USA）で洗浄し、同じ培地に再懸濁した。次に、エレクトロポレーターCUY21EDIT（BEX Co. Ltd、Japan）を使用して、０．２ｃｍキュベット内のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地１００μＬ中の２μｇのｓｉＲＮＡで１０６個の細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションプログラムを、次のように設定した：ＰｐＶ＝２００Ｖ、Ｐｐ ｏｎ １０ｍｓ、Ｐｐ ｏｆｆ １０ｍｓ、ＰｄＶ＝２５Ｖ、Ｐｄ ｏｎ ５０ｍｓ、Ｐｄ ｏｆｆ ５０ ｍｓ；Ｐｄ Ｎ＝１０、ｃａｐａｃｉｔｙ＝９４０μＦ、及び指数関数的減衰波形。エレクトロポレーション後、細胞を２ｍＬの完全培地に再懸濁し、低酸素条件（１％Ｏ２）で培養した。エレクトロポレーションの１６～２４時間後、細胞をウェスタンブロッティング又は殺傷アッセイに使用した。トランスフェクション効率と生存率は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ｓｉＲＮＡ又は７－ＡＡＤの発現を定量的に測定することにより、エレクトロポレーションの２～６時間後にフローサイトメトリーで分析した。ＳＨＰ－１ ｍＲＮＡは、ＧｅｎｅＰｈａｒｍａの遺伝子特異的ｓｉＲＮＡプールを使用してサイレンシングした。
【0076】
（統計分析）
統計分析を、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ ５．０（GraphPad Software、San Diego、CA、USA）を使用して行った。データを、少なくとも３つの独立した実験の平均 ± SEMとして表す。統計的有意性は、両側対応スチューデントｔ検定（two-tailed paired Student's t-test）によって評価した。Ｐ＜０．０５（*）、Ｐ＜０．０１（**）、又はＰ＜０．００１（***）を、統計的に有意であると見なした。
統計分析を、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ ５．０（GraphPad Software、San Diego、CA、USA）を使用して行った。データを、少なくとも３つの独立した実験の平均 ± SEMとして表す。統計的有意性は、両側対応スチューデントｔ検定（two-tailed paired Student's t-test）によって評価した。Ｐ＜０．０５（*）、Ｐ＜０．０１（**）、又はＰ＜０．００１（***）を、統計的に有意であると見なした。
【0077】
（実施例１－低酸素ＮＫ細胞の細胞毒性の減少）
ＮＫ細胞を介した腫瘍細胞の溶解に対する低酸素状態の影響を調べた。フローサイトメトリーにより細胞毒性を評価するために、ＫＨＹＧ－１細胞をＩＬ－２の存在下、低酸素（１％Ｏ２）又は正常酸素圧（２０％Ｏ２）条件下で２４時間培養し、続いて、細胞をがん細胞株Ｋ５６２又はＭＭ．１Ｓと異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間インキュベートした。図１ａ及び図１ｂに示すように、ＮＫ細胞の細胞毒性は、低酸素状態で有意に減少した。
ＮＫ細胞を介した腫瘍細胞の溶解に対する低酸素状態の影響を調べた。フローサイトメトリーにより細胞毒性を評価するために、ＫＨＹＧ－１細胞をＩＬ－２の存在下、低酸素（１％Ｏ２）又は正常酸素圧（２０％Ｏ２）条件下で２４時間培養し、続いて、細胞をがん細胞株Ｋ５６２又はＭＭ．１Ｓと異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間インキュベートした。図１ａ及び図１ｂに示すように、ＮＫ細胞の細胞毒性は、低酸素状態で有意に減少した。
【0078】
ウェスタンブロッティングにより、低酸素のＮＫ細胞（ＫＨＹＧ－１及びＮＫ－９２）における低酸素マーカーＨＩＦ－１αの有意な蓄積が明らかになったが、ＨＩＦ－１αは、正常酸素のＮＫ細胞では弱発現のみであった（図１ｃを参照）。
【0079】
低酸素サンプルと正常酸素サンプルの間でＮＫ細胞死に有意差がなかったため、低酸素ＮＫ細胞の細胞毒性の低下がＮＫ細胞生存率の低下によって引き起こされた可能性は排除された（図１ｄ）。
【0080】
低酸素状態がＮＫ細胞の細胞毒性をどのように低下させるかをさらに調べるために、細胞毒性エフェクターであるグランザイムＢとパーフォリンの発現レベルを測定した。図２ａに示すように、低酸素状態はグランザイムＢとパーフォリンの両方の分泌の減少をもたらした。また、低酸素状態のＮＫ細胞では、正常酸素のＮＫ細胞と比較して、サイトカインＩＦＮ－γの発現低下を観察した（図２ｂ）。脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａも、低酸素によって減少した（図２ｃ）。
【0081】
活性化受容体ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、及びＮＫＧ２Ｄの表面発現を、正常酸素のＮＫ細胞と低酸素のＮＫ細胞の両方で、フローサイトメトリーによって測定した。図２ｄに示すように、低酸素状態はＮＫ細胞表面のこれらの活性化受容体の発現を減少させた。
【0082】
（実施例２－ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３を介したＮＫ細胞活性化の低酸素減衰）
ＮＫ細胞の細胞毒性を活性化する細胞内シグナルは、主に細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）及びシグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）のタンパク質リン酸化を介して伝播されることが知られている。従って、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の活性化における低酸素状態の役割を調べた。
ＮＫ細胞の細胞毒性を活性化する細胞内シグナルは、主に細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）及びシグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）のタンパク質リン酸化を介して伝播されることが知られている。従って、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の活性化における低酸素状態の役割を調べた。
【0083】
低酸素状態は、ＫＨＹＧ－１細胞、ＮＫ－９２細胞、及び初代ＮＫ細胞のＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のチロシン部位でのリン酸化レベルを著しく低下させることが明らかになった（図３ａ、３ｂ及び３ｃ）。
【0084】
低酸素条件下でのＮＫ細胞の細胞毒性に対するＥＲＫ及びＳＴＡＴ３リン酸化の効果をさらに検証するために、特定の低分子阻害剤Ｕ０１２６及びクリプトタンシノンを使用して、ERK及びSTAT3シグナル伝達を、それぞれブロックした。図３ｄに示すように、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の阻害は、活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６及びＮＫＧ２Ｄ（ＫＨＹＧ－１）、並びにＮＫｐ４６及びＮＫＧ２Ｄ（ＮＫ－９２）の発現を大幅に減少させた。さらに、ＥＲＫ又はＳＴＡＴ３の阻害により、がん細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性が著しく損なわれた（図３ｅ）。
【0085】
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を持つ細胞表面受容体は、多くの場合、Ｓｒｃファミリーのタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）によってリン酸化され、タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２のドッキング部位を創出する。従って、低酸素によるＥＲＫ及びＳＴＡＴ３リン酸化の減少におけるＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２の関与を調べた。図４ａ、４ｂ、及び４ｃに示すように、低酸素状態は、２つのＮＫ細胞株及び初代ＮＫ細胞でＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２のリン酸化の有意な増加を誘発した。特定のＳＨＰ－１阻害剤であるＴＰＩ－１を使用すると、ＴＰＩ－１がＥＲＫ及びＳＴＡＴ３の両方のリン酸化の減少を逆転させることができることを観察した（図４ｄ）。さらに、ｐ－ＳＨＰ１阻害剤ＴＰＩ－１による前処理により、低酸素下でＮＫ細胞の細胞毒性が回復することも観察した（図４ｅ）。ＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化レベル、又はＮＫ細胞の細胞毒性に影響を与えなかった特定のＳＨＰ－２阻害剤ＳＨＰ０９９を使用した場合、同じ効果は観察されなかった（図５ａ、５ｂ、及び５ｃ）。
【0086】
従って、ＳＴＡＴ３及びＥＲＫのリン酸化レベルの低酸素誘発性減少は、ＳＨＰ－２とは対照的に、タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ－１の活性化によって介在されると結論付けた。
【0087】
（実施例３－ＳＨＰ－１のノックダウンによる低酸素状態でのＮＫ細胞の細胞毒性の回復）
ＮＫ細胞の細胞毒性の調節におけるＳＨＰ－１の役割をさらに検証するために、ＳＨＰ－１遺伝子発現をＫＨＹＧ－１細胞でサイレンシングした。ＳＨＰ－１のノックダウンにより、低酸素下でＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化レベルが上昇することが確認されました（図６ａ）。さらに、ＳＨＰ－１がサイレンシングされたＮＫ細胞は、低酸素条件下でコントロールＮＫ細胞よりもＫ５６２細胞に対してより大きな細胞傷害性を示すことを確認した（図６ｂ）。
ＮＫ細胞の細胞毒性の調節におけるＳＨＰ－１の役割をさらに検証するために、ＳＨＰ－１遺伝子発現をＫＨＹＧ－１細胞でサイレンシングした。ＳＨＰ－１のノックダウンにより、低酸素下でＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化レベルが上昇することが確認されました（図６ａ）。さらに、ＳＨＰ－１がサイレンシングされたＮＫ細胞は、低酸素条件下でコントロールＮＫ細胞よりもＫ５６２細胞に対してより大きな細胞傷害性を示すことを確認した（図６ｂ）。
【0088】
（実施例４－初代ＮＫ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲのノックイン）
使用した抗ＣＤ１９－ζ、抗ＣＤ１９－ＢＢ－ζ、及び抗ＣＤ１９切断型（コントロール）プラスミドは、以前に記載されている（Imaiら、2004. Leukemia. 18（4）: 676-84）。ヒトＤＡＰ１０及び４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）の細胞内ドメイン、並びにロングシグナルペプチドを含むインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）をコードするｃＤＮＡを、テンプレートとして使用されるヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってサブクローニングした。抗ＣＤ１９－ＤＡＰ１０プラスミドは、ＣＤ３ζをコードする配列を、ＤＡＰ１０をコードする配列に置き換え、ＰＣＲによるオーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ－ＰＣＲ）法により構築した。ＣＤ８αのシグナルペプチド、ＩＬ－１５の成熟ペプチド、及びＣＤ８αの膜貫通ドメインをコードするｃＤＮＡを、ＳＯＥ－ＰＣＲによって組み立てて、ＩＬ－１５の「膜結合」型をコードした。得られた発現カセットを、マウス幹細胞ウイルスの－内部リボソーム侵入部位－緑色蛍光タンパク質（ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。
使用した抗ＣＤ１９－ζ、抗ＣＤ１９－ＢＢ－ζ、及び抗ＣＤ１９切断型（コントロール）プラスミドは、以前に記載されている（Imaiら、2004. Leukemia. 18（4）: 676-84）。ヒトＤＡＰ１０及び４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）の細胞内ドメイン、並びにロングシグナルペプチドを含むインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）をコードするｃＤＮＡを、テンプレートとして使用されるヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってサブクローニングした。抗ＣＤ１９－ＤＡＰ１０プラスミドは、ＣＤ３ζをコードする配列を、ＤＡＰ１０をコードする配列に置き換え、ＰＣＲによるオーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ－ＰＣＲ）法により構築した。ＣＤ８αのシグナルペプチド、ＩＬ－１５の成熟ペプチド、及びＣＤ８αの膜貫通ドメインをコードするｃＤＮＡを、ＳＯＥ－ＰＣＲによって組み立てて、ＩＬ－１５の「膜結合」型をコードした。得られた発現カセットを、マウス幹細胞ウイルスの－内部リボソーム侵入部位－緑色蛍光タンパク質（ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。
【0089】
ＲＤ１１４－シュードタイプレトロウイルスを、先に記載したように生成した（Imaiら、2004. Leukemia. 18（4）: 676-84）。リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を使用して、抗ＣＤ１９－ζ、抗ＣＤ１９－ＤＡＰ１０、抗ＣＤ１９－ＢＢ－ζ、又は抗ＣＤ１９切断型；ｐＥＱ－ＰＡＭ３（－Ｅ）；及びｐＲＤＦを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後にレトロウイルスを含む馴化培地を回収し、直ちにドライアイスで凍結し、使用するまで－８０℃で保存した。
【0090】
Ｋ５６２細胞に、ＩＬ－１５の「膜結合」型をコードするコンストラクトを形質導入した。限界希釈法により細胞をクローニングし、GFP及び表面ＩＬ－１５を高発現する単一細胞クローン（Ｋ５６２－ｍｂ１５）を増殖させた。続いて、このクローンにヒト４－１ＢＢＬ（Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ）を形質導入した。野生型ＩＬ－１５（Ｋ５６２－ｗｔ１５）又は４－１ＢＢＬ（Ｋ５６２－４１ＢＢＬ）を発現するＫ５６２細胞を、同様の手順によって作製した。末梢血単核細胞（１．５×１０６）を、ＲＰＭＩ１６４０及び１０％ＦＣＳ中の１０ ＩＵ／ｍＬヒトＩＬ－２の存在下で、１０６のK５６２誘導体刺激細胞を含む又は含まない２４ウェル組織培養プレートでインキュベートした。
【0091】
Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬで刺激した単核細胞を、先に記載したように(Imaiら、2004. Leukemia. 18（4）: 676-84)、レトロウイルスで形質導入した。簡単に説明すると、１４ｍＬポリプロピレン遠心管をヒトフィブロネクチン（１００μｇ／ｍＬ）又はレトロネクチン（５０μｇ／ｍＬ）でコーティングした。事前に刺激した細胞（２×１０５）をチューブ内でポリブレン（４μｇ／ｍＬ）を含む２～３ｍＬのウイルス調整培地に再懸濁し、２４００ｇで２時間遠心分離した（レトロネクチンを使用した場合、遠心分離を省略した）。様々なＣＡＲの活性を比較する各実験において、感染多重度（４～６）は同一であった。遠心分離後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで２４時間静置した。形質導入処置を２日間連続して繰り返した。２回目の形質導入後、細胞を１０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２の存在下でＫ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬで再刺激した。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、及び１０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２で維持した。
【0092】
形質導入したＮＫ細胞を、ビオチン結合ヤギ抗マウス（Ｆａｂ）２ポリクローナル抗体で、続いて、ペリジニンクロロフィルタンパク質結合ストレプトアビジンで染色した。ウェスタンブロッティングでは、細胞を、３μｇ／ｍＬペプスタチン、３μｇ／ｍＬロイペプチン、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び５μｇ／ｍＬアプロチニンを含むＲＩＰＡバッファー（ＰＢＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））中で溶解した。遠心分離した溶解物上清を、０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）の有無にかかわらず、等量のローディングバッファーで煮沸し、プレキャスト１０～２０％勾配アクリルアミドゲルでのＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写し、これを一次マウス抗ヒトＣＤ３ζモノクローナル抗体（クローン８Ｄ３）とインキュベートした。次いで、メンブレンを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートし、増強化学発光システムを使用して発色させた。
【0093】
以下の抗体を、拡大及び形質導入した細胞の免疫表現型の特徴付けに使用した：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＰｅｒＣＰ、又はエネルギー結合色素（ＥＣＤ）に結合した抗ＣＤ３；フィコエリトリン（ＰＥ）に結合した抗ＣＤ１０；抗ＣＤ１９ＰＥ；抗ＣＤ２２ＰＥ；抗ＣＤ５６ＦＩＴＣ、ＰＥ又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）；抗ＣＤ１６ ＣｙＣｈｒｏｍｅ；並びに抗ＣＤ２５ＰＥ。ＫＩＲ及びＮＫ活性化分子の表面発現を、先に記載したように（Leungら、2004. Journal of Immunology. 172： 644-650）、ＦＩＴＣ又はＰＥに結合した特異的抗体を用いて測定した。ＦＡＣＳｃａｎ又はＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで抗体染色を検出した。
【0094】
（実施例５－ＮＫ細胞におけるＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントのノックイン）
ＫＨＹＧ－１細胞にＴＲＡＩＬとＴＲＡＩＬバリアントの両方をトランスフェクトし、トランスフェクション後のがん細胞の生存率と殺傷能力を評価した。
ＫＨＹＧ－１細胞にＴＲＡＩＬとＴＲＡＩＬバリアントの両方をトランスフェクトし、トランスフェクション後のがん細胞の生存率と殺傷能力を評価した。
【0095】
使用したＴＲＡＩＬバリアントは、ＷＯ２００９／０７７８５７に記載のものである。これは、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む野生型TRAIL遺伝子によってコードされる。この変異は、ＤＲ５に対するＴＲＡＩＬバリアントの親和性を大幅に増加させる一方で、両方のデコイ受容体（ＤｃＲ１及びＤｃＲ２）に対する親和性を低下させる。
【0096】
（ベースラインＴＲＡＩＬ発現）
ＫＨＹＧ－１細胞におけるベースラインＴＲＡＩＬ（ＣＤ２５３）発現を、フローサイトメトリーを使用してアッセイした。
ＫＨＹＧ－１細胞におけるベースラインＴＲＡＩＬ（ＣＤ２５３）発現を、フローサイトメトリーを使用してアッセイした。
【0097】
マウス抗ヒトＣＤ２５３－ＡＰＣ（Biolegend カタログ番号: 308210）及びアイソタイプコントロール（Biolegend カタログ番号: 400122）を使用して細胞サンプルを染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析した。
【0098】
ＫＨＹＧ－１細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍL）、及びＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。遠心分離（１５００ｒｐｍ×５分）により、０．５～１．０×１０６細胞／試験を回収し、上清を吸引した。細胞（シングルセル懸濁液）を４ｍＬの氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．５～１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３アジ化ナトリウム）で洗浄した。細胞を１００μＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５μＬの抗体を各チューブに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより３回洗浄した。その後、細胞を５００μＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、氷上で一時的に暗所に保管した。
【0099】
その後、細胞をフローサイトメーター（BD FACS Canto II）で分析し、生成されたデータをＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを使用して処理した。
【0100】
図７に見られるように、ＦＡＣＳ分析は、ＫＨＹＧ－１細胞表面上のＴＲＡＩＬの弱いベースライン発現を示した。
【0101】
（エレクトロポレーションによるＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントノックイン）
野生型ＴＲＡＩＬのｍＲＮＡ及びＴＲＡＩＬバリアント（Ｄ２６９Ｈ／１９５Ｒ）のｍＲＮＡを、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、分注し、－８０℃で保存した。マウス抗ヒトＣＤ２５３－ＡＰＣ（Biolegend カタログ番号: 308210）及びアイソタイプコントロール（Biolegend カタログ番号: 400122）、並びにマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＰＥ（eBioscience カタログ番号: 12-1079-42）及びアイソタイプコントロール（eBioscience カタログ 番号: 12-4714）抗体を使用して細胞サンプルを染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＤＮＡ色素ＳＹＴＯＸ－Ｇｒｅｅｎ（Life Technologies カタログ番号: S7020; ＤＭＳＯ中５ｍＭ溶液）を使用した。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭデバイス（Nucleofector II、Lonza）を使用してＫＨＹＧ－１細胞で最大９０％のトランスフェクション効率と高い細胞生存率を達成するために、ＬｏｎｚａのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｋｉｔ Ｔを使用した。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ後の培養には、１０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、及びＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む、抗生物質不含ＲＰＭＩ１６４０を使用した。
野生型ＴＲＡＩＬのｍＲＮＡ及びＴＲＡＩＬバリアント（Ｄ２６９Ｈ／１９５Ｒ）のｍＲＮＡを、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、分注し、－８０℃で保存した。マウス抗ヒトＣＤ２５３－ＡＰＣ（Biolegend カタログ番号: 308210）及びアイソタイプコントロール（Biolegend カタログ番号: 400122）、並びにマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ－ＰＥ（eBioscience カタログ番号: 12-1079-42）及びアイソタイプコントロール（eBioscience カタログ 番号: 12-4714）抗体を使用して細胞サンプルを染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＤＮＡ色素ＳＹＴＯＸ－Ｇｒｅｅｎ（Life Technologies カタログ番号: S7020; ＤＭＳＯ中５ｍＭ溶液）を使用した。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭデバイス（Nucleofector II、Lonza）を使用してＫＨＹＧ－１細胞で最大９０％のトランスフェクション効率と高い細胞生存率を達成するために、ＬｏｎｚａのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｋｉｔ Ｔを使用した。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ後の培養には、１０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、及びＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む、抗生物質不含ＲＰＭＩ１６４０を使用した。
【0102】
ＫＨＹＧ－１及びＮＫ－９２細胞を、細胞が対数増殖期にある必要があるため、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの１～２日前に継代した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を、５０ｍＬチューブ内で３７℃の血清及びサプリメントを含む培養液のアリコートと共に、室温に予熱した（サンプルあたり１００μｌ）。血清及びサプリメントを含む１．５ｍＬの培地を充填して６ウェルプレートを調製し、加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターでプレインキュベートした。細胞培養のアリコートを調製し、細胞を計数して細胞密度を決定した。上清を完全に廃棄する前に、必要な数の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、室温のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに再懸濁し、終濃度を２×１０６細胞／１００μｌにした（懸濁中の最大時間＝２０分）。１００μｌの細胞懸濁液を１０μｇのｍＲＮＡと混合した(ＲＮＡの量＜１０μＬ)。サンプルをＡｍａｘａ－ｃｅｒｔｉｆｉｅｄキュベットに移した（サンプルがキュベットの底を覆い、気泡が入らないようにした)。適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラムを選択した（即ち、ＫＨＹＧ－１細胞の場合はＵ－００１）。次いで、キュベットをキュベットホルダーに挿入した。５００μｌの予熱した培地をキュベットに加え、細胞への損傷を避けるために、プログラムが終了した直後にサンプルを準備済みの６ウェルプレートに移した。細胞を、加湿した３７℃／５％ ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。フローサイトメトリー分析及び細胞毒性アッセイを、エレクトロポレーションの１２～１６時間後に実施した。フローサイトメトリー染色を、上述のように行った。
【0103】
図８及び９に見られるように、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアント及びＣＤ１０７ａ（ＮＫ活性化マーカー）の発現はトランスフェクション後に増加し、ＴＲＡＩＬ遺伝子のＫＨＹＧ－１細胞へのノックインの成功を確認した。
【0104】
図１０は、エレクトロポレーションによるトランスフェクション前後のＫＨＹＧ－１細胞生存率の証拠を提供する。ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントを細胞にトランスフェクトした後、細胞生存率に統計的に有意な差は観察されないことが分かり、野生型又はバリアントＴＲＡＩＬの発現が細胞に対して毒性ではないことを確認した。この観察結果は、ＴＲＡＩＬバリアント遺伝子のノックインが細胞に対して毒性であることを示唆するＮＫ－９２細胞での対応する知見と矛盾している（データ不掲載）。それでもなお、これは、ＮＫ－９２細胞表面上のＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５の比較的高い発現レベルによって説明される可能性がある（図１１を参照）。
【0105】
（ＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性に対するＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントの影響）
マウス抗ヒトＣＤ２－ＡＰＣ抗体（BD Pharmingenカタログ番号：560642）を使用した。アネキシンＶ－ＦＩＴＣ抗体（ImmunoTools カタログ番号: 31490013）を使用しました。ＤＮＡ色素ＳＹＴＯＸ－Ｇｒｅｅｎ（Life Technologies カタログ番号：S7020）を使用した。２４ウェル細胞培養プレート（SARSTEDT AG カタログ番号: 83.3922）を使用した。骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６、及びＭＭ１．Ｓを標的細胞として使用した。Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１．Ｓを、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及びペニシリン（１００U／mL）/ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍL）を含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。
マウス抗ヒトＣＤ２－ＡＰＣ抗体（BD Pharmingenカタログ番号：560642）を使用した。アネキシンＶ－ＦＩＴＣ抗体（ImmunoTools カタログ番号: 31490013）を使用しました。ＤＮＡ色素ＳＹＴＯＸ－Ｇｒｅｅｎ（Life Technologies カタログ番号：S7020）を使用した。２４ウェル細胞培養プレート（SARSTEDT AG カタログ番号: 83.3922）を使用した。骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６、及びＭＭ１．Ｓを標的細胞として使用した。Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１．Ｓを、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及びペニシリン（１００U／mL）/ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍL）を含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。
【0106】
上で説明した通り、ＫＨＹＧ－１細胞にＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントをトランスフェクトした。
【0107】
標的細胞を洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化した。トランスフェクトしたＫＨＹＧ－１細胞を０．５×１０６／ｍＬに希釈しました。次いで、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を生成するために、予熱したＲＰＭＩ １６４０培地中で標的細胞密度を調整した。
【0108】
次に、０．５ｍＬのＫＨＹＧ－１細胞と０．５ｍＬの標的細胞を２４ウェル培養プレートで混合し、加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターに１２時間入れた。次に、フローサイトメトリー分析を使用して、ＫＨＹＧ－１細胞の細胞毒性をアッセイした。共培養細胞（異なる時点で）を洗浄し、ＣＤ２－ＡＰＣ抗体（５μＬ／テスト）、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ（５μＬ／テスト）、ＳＹＴＯＸ－Ｇｒｅｅｎ（５μＬ／テスト）でアネキシンV結合バッファーを使用して染色した。
【0109】
ＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを使用して、データをさらに分析した。ＣＤ２陽性及びＣＤ２陰性のゲートを設定し、そしてそれらは、それぞれＫＨＹＧ－１細胞及び標的細胞集団を表す。次いで、ＣＤ２陰性集団中のアネキシンＶ－ＦＩＴＣ及びＳＹＴＯＸ－Ｇｒｅｅｎ陽性細胞を、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスについて分析した。
【0110】
図１２、１３及び１４は、それぞれＫ５６２、ＲＰＭＩ８２２６及びＭＭ１．Ｓの３つの標的細胞株のアポトーシスに対する、ＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬバリアントを発現するＫＨＹＧ－１細胞の両方の効果を示す。全ての標的細胞集団について、ＫＨＹＧ－１細胞でのＴＲＡＩＬ発現が、正常なＫＨＹＧ－１細胞（ＴＲＡＩＬをトランスフェクトしていない）と比較して、アポトーシスのレベルを増加させたことは明らかである。さらに、ＫＨＹＧ－１細胞でのＴＲＡＩＬバリアントの発現は、野生型ＴＲＡＩＬをトランスフェクトしたＫＨＹＧ－１細胞と比較して、全ての標的細胞株でアポトーシスをさらに増加させた。
【0111】
（実施例６－初代ＮＫ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ及びＴＲＡＩＬバリアントのノックイン）
抗ＣＤ１９－ＣＤ２８（ＴＭ）－ＣＤ３ζ、抗ＣＤ１９－４１ＢＢ（ＴＭ）－ＣＤ３ζ、及び抗ＣＤ１９切断型（コントロール）プラスミドを使用した。ヒトＣＤ３ζ、ＣＤ２８又は４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）の膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ζの細胞内ドメインを有するＣＤ１９ ｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡを、テンプレートｍＲＮＡとして使用した。ＣＤ１９ ＣＡＲとＴＲＡＩＬバリアントの組み合わせを含む遺伝子カセットをｍＲＮＡとして合成した。ＣＤ１９ ＣＡＲ及び高親和性ＴＲＡＩＬ ＤＲ５バリアントを、同時に２つの別々のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡとしてＮＫ細胞に送達した。
抗ＣＤ１９－ＣＤ２８（ＴＭ）－ＣＤ３ζ、抗ＣＤ１９－４１ＢＢ（ＴＭ）－ＣＤ３ζ、及び抗ＣＤ１９切断型（コントロール）プラスミドを使用した。ヒトＣＤ３ζ、ＣＤ２８又は４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）の膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ζの細胞内ドメインを有するＣＤ１９ ｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡを、テンプレートｍＲＮＡとして使用した。ＣＤ１９ ＣＡＲとＴＲＡＩＬバリアントの組み合わせを含む遺伝子カセットをｍＲＮＡとして合成した。ＣＤ１９ ＣＡＲ及び高親和性ＴＲＡＩＬ ＤＲ５バリアントを、同時に２つの別々のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡとしてＮＫ細胞に送達した。
【0112】
使用したＴＲＡＩＬ変異体は、ＷＯ２００９／０７７８５７に記載のものである。これは、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む野生型ＴＲＡＩＬ遺伝子によってコードされる。この変異は、ＤＲ５に対するＴＲＡＩＬバリアントの親和性を大幅に増加させる一方で、両方のデコイ受容体（ＤｃＲ１及びＤｃＲ２）に対する親和性を低下させる。
【0113】
エレクトロポレーションしたＮＫ細胞を、ビオチン結合ヤギ抗マウス（Ｆａｂ）２ポリクローナル抗体、続いてＰＥ又はＦＩＴＣフルオロフォアに結合したストレプトアビジンで染色した。ウェスタンブロッティングでは、細胞を、３μｇ／ｍＬ ペプスタチン、３μｇ／ｍＬ ロイペプチン、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び５μｇ／ｍＬ アプロチニンを含む、ＲＩＰＡバッファー（ＰＢＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））中で溶解した。遠心分離した溶解物上清を、０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）の有無にかかわらず、等量のローディングバッファーで煮沸し、プレキャスト１０～２０％勾配アクリルアミドゲルでのＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写し、これを一次マウス抗ヒトＣＤ３ζモノクローナル抗体（クローン８Ｄ３）とインキュベートした。次いで、メンブレンを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートし、増強化学発光システムを使用して発色させた。
【0114】
以下の抗体を、拡大及び形質導入した細胞の免疫表現型の特徴付けに使用した：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＰｅｒＣＰ、又はエネルギー結合色素（ＥＣＤ）に結合した抗ＣＤ３；フィコエリトリン（ＰＥ）に結合した抗ＣＤ１０；抗ＣＤ１９ＰＥ；抗ＣＤ２２ＰＥ；抗ＣＤ５６ＦＩＴＣ、ＰＥ又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）；抗ＣＤ１６ ＣｙＣｈｒｏｍｅ；並びに抗ＣＤ２５ＰＥ。ＫＩＲ及びＮＫ活性化分子の表面発現を、先に記載したように（Ｌｅｕｎｇら、２００４．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１７２：６４４－６５０）、ＦＩＴＣ又はＰＥに結合した特異的抗体を用いて測定した。ＦＡＣＳｃａｎ又はＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで抗体染色を検出した。
【0115】
ナイーブ又は拡大したＮＫ細胞におけるベースラインＴＲＡＩＬ（ＣＤ２５３）発現を、フローサイトメトリーを使用してアッセイした。
【0116】
マウス抗ヒトＣＤ２５３－ＡＰＣ（Biolegend カタログ番号：308210）及びアイソタイプコントロール（Biolegend カタログ番号：400122）を使用して細胞サンプルを染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析した。
【0117】
初代ＮＫ細胞を、１０％ヒトＡＢ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－２（５００Ｕ／ｍＬ）を含むＭｉｌｔｅｎｙｉのNK細胞増殖培地で培養した。遠心分離（１５００ｒｐｍ×５分）により０．５～１．０×１０６細胞／試験を回収し、上清を吸引した。細胞（シングルセル懸濁液）を４ｍＬの氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．５～１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３アジ化ナトリウム）で洗浄した。細胞を１００μＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５μＬの抗体を各チューブに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより３回洗浄した。その後、細胞を５００μＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、氷上で一時的に暗所に保管した。
【0118】
その後、細胞をフローサイトメーター（BD FACS Canto II）で分析し、生成されたデータをＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを使用して処理した。
【0119】
ＦＡＣＳ分析は、ＮＫ細胞表面上のＴＲＡＩＬの弱いベースライン発現を示した。
【0120】
ＴＲＡＩＬバリアント（Ｄ２６９Ｈ／１９５Ｒ）ｍＲＮＡを、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、分注し、－８０℃で保存した。マウス抗ヒトＣＤ２５３－ＡＰＣ（Biolegend カタログ番号：308210）及びアイソタイプコントロール（Biolegend カタログ番号：400122）、抗体を使用して細胞サンプルを染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析した。ヨウ化プロピジウムを細胞生存率のために使用した。高いＮＫ細胞生存率で最大９０％のトランスフェクション効率を達成するために、Ｍａｘｃｙｔｅ ＧＴを使用してエレクトロポレーションベースの技術を行った。細胞を、エレクトロポレーションの前にＭａｘｃｙｔｅバッファーで処理し、細胞を５～１０μg／ｍｌの個々のｍＲＮＡ（即ち、５μｇ／ｍｌのＣＤ１９ ＣＡＲ及び５μｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬバリアント）でエレクトロポレーションした。
【0121】
ナイーブ又は拡大したＮＫ細胞を、細胞が対数増殖期にある必要があるため、エレクトロポレーションの１～２日前に継代培養した。血清及びサプリメントを含む１．５ｍＬの培地を充填して６ウェルプレートを調製し、加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターでプレインキュベートした。細胞培養のアリコートを調製し、細胞を計数して細胞密度を決定した。上清を完全に廃棄する前に、必要な数の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、室温のＭａｘｃｙｔｅバッファーに再懸濁し、終濃度を２×１０６細胞／１００μｌにした（懸濁中の最大時間＝２０分）。１００μｌの細胞懸濁液を５μｇのｍＲＮＡと混合した。サンプルを、Ｍａｘｃｙｔｅ－ｃｅｒｔｉｆｉｅｄキュベットＯＣ－１００ｘ２に移した（サンプルがキュベットの底を覆い、気泡が入らないようにした)。適切なエレクトロポレーションプログラムを選択した（即ち、ＮＫ－４）。次いで、キュベットをキュベットホルダーに挿入した。プログラムが終了した直後に、細胞への損傷を避けるために、細胞を６ウェルプレートに移し、３７℃で２０分間インキュベートした。フローサイトメトリー分析及び細胞毒性アッセイを、エレクトロポレーションの２０～２４時間後に行った。フローサイトメトリー染色を、上述のように行った。
【0122】
ＣＤ１９ ＣＡＲ及びＴＲＡＩＬバリアントの発現が、トランスフェクション後に増加することが示され、初代ＮＫ細胞へのＣＤ１９ ＣＡＲ及びＴＲＡＩＬバリアント遺伝子のノックインの成功を確認した。
【0123】
エレクトロポレーションを介したトランスフェクションの前後で、ＮＫ細胞の生存率の証拠があった。ＴＲＡＩＬバリアントによる細胞のトランスフェクション後、細胞生存率に統計的な有意差は観察されないことが分かり、バリアントＴＲＡＩＬの発現が細胞に対して毒性ではないことを確認した。
【0124】
ＮＫ細胞の細胞毒性に対するＴＲＡＩＬバリアントの効果も測定した。マウス抗ヒトＣＤ２－ＡＰＣ抗体（BD Pharmingenカタログ番号：560642）を使用した。アネキシンＶ－ＦＩＴＣ抗体（ImmunoTools カタログ番号：31490013）を使用した。９６ウェル細胞培養プレート（SARSTEDT AG カタログ番号：83.3922）を使用した。Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＯＣＩ－ＬＹ１０、ＲＩＶＡ、及びＳＵ－ＤＨＬ６を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及びペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。
【0125】
標的細胞を洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化した。トランスフェクトしたＮＫ細胞を希釈して、２×１０６細胞／ｍＬの濃度を達成した。次に、５：１、２．５、及び１．２５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を生成するために、予熱したＲＰＭＩ １６４０培地中で標的細胞密度を調整した。
【0126】
次に、エレクトロポレーションしたＮＫ細胞０．１ｍＬと標的細胞０．１ｍＬを９６ウェル培養プレートで混合し、加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターに１６時間入れた。次に、フローサイトメトリー分析を使用して、ＮＫ細胞の細胞毒性をアッセイした。共培養細胞（異なる時点で）を洗浄し、ＣＤ２－ＡＰＣ抗体（５μＬ／テスト）で染色し、ヨウ化プロピジウムを使用して、細胞生存率を評価した。
【0127】
ＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを使用して、データをさらに分析した。ＣＤ２陽性及びＣＤ２陰性のゲートを設定し、そしてそれらは、それぞれＮＫ細胞及び標的細胞集団を表す。次いで、ＣＤ２陰性集団中のＰＩ細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスについて分析した。
【0128】
アポトーシスに対するＴＲＡＩＬバリアントを発現するＮＫ細胞の効果を、それぞれＯＣＩ－ＬＹ１０、ＲＩＶＡ、及びＳＵ－ＤＨＬ６の３つの標的細胞株について評価した。正常なＮＫ細胞（ＴＲＡＩＬバリアントをトランスフェクトしていない）と比較した場合、ＮＫ細胞でのＴＲＡＩＬバリアントの発現がアポトーシスのレベルを増加させたことが、全ての標的細胞集団で明らかである。
【0129】
ＣＤ１９ ＣＡＲ及びＴＲＡＩＬバリアントの両方を発現する本発明の細胞は、高い親和性でがん細胞を特異的に標的とし、次いでデスレセプターＤＲ５を介してそれらの細胞を殺す能力により、がん治療において有意な利点を提供する。本発明の細胞によって攻撃された場合、がん細胞は、単一の経路を介して死を回避するための防御戦略の発揮を妨げられる。例えば、がんは、ＴＲＡＩＬデコイ受容体をアップレギュレートすることによって、ＴＲＡＩＬ誘導細胞死を効果的に回避することができない。なぜなら、本発明の細胞は、それらの状況において細胞毒性を維持するように改変されるからである。
【0130】
（実施例７－ＮＫ細胞ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５のノックアウト）
デス受容体５（ＤＲ５）及び／又はデス受容体４（ＤＲ４）機能を除去したＮＫ細胞を以下のように調製する。
デス受容体５（ＤＲ５）及び／又はデス受容体４（ＤＲ４）機能を除去したＮＫ細胞を以下のように調製する。
【0131】
ＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）及びＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＤＲ４）を標的とするｇＲＮＡコンストラクトを設計する（例：
配列番号１：ＣＣＣＡＵＣＵＵＧＡＡＣＡＵＡＣＣＡＧ（ＤＲ５）、
配列番号２：ＡＡＣＣＧＧＵＧＣＡＣＡＧＡＧＧＧＵＧＵ（ＤＲ４）及び
配列番号３：ＡＵＵＵＡＣＡＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＧＧＧ（ＤＲ４））
そしてＮＫ細胞のＤＲ５及びＤＲ４遺伝子をコードする内因性遺伝子を標的とするように調製する。次に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、ＤＲ５及び／又はＤＲ４標的遺伝子をノックアウトする。
配列番号１：ＣＣＣＡＵＣＵＵＧＡＡＣＡＵＡＣＣＡＧ（ＤＲ５）、
配列番号２：ＡＡＣＣＧＧＵＧＣＡＣＡＧＡＧＧＧＵＧＵ（ＤＲ４）及び
配列番号３：ＡＵＵＵＡＣＡＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＧＧＧ（ＤＲ４））
そしてＮＫ細胞のＤＲ５及びＤＲ４遺伝子をコードする内因性遺伝子を標的とするように調製する。次に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、ＤＲ５及び／又はＤＲ４標的遺伝子をノックアウトする。
【0132】
合計３つのｇＲＮＡ候補をＤＲ５遺伝子に対して選択し、ＲＰＭＩ８２２６細胞でのそれらの切断効率を決定する。合計３つのｇＲＮＡ候補をＤＲ４遺伝子に対して選択し、ＨＬ６０細胞でのそれらの切断効率を決定する。ＲＰＭＩ８２２６細胞とＨＬ６０を、Ｍａｘｃｙｔｅ（商標）ＧＴを使用してｇＲＮＡ：Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体でエレクトロポレーションし、続いてＤＲ５をノックアウトし、フローサイトメトリーで分析する。ｇＲＮＡの切断活性も、ｉｎ ｖｉｔｒｏミスマッチ検出アッセイを使用して決定する。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼは、完全に一致しないＤＮＡを認識して切断するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９トランスフェクション及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）後に、親のＤＲ５遺伝子／ＤＲ４遺伝子を変異遺伝子と比較できる。
【0133】
最高のＫＯ効率を持つｇＲＮＡを選択して、初代ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株、又はＣＤ３４＋前駆細胞でＤＲ５／ＤＲ４をノックアウトするためのさらなる実験を行う（その後の分化とＮＫ細胞への拡大のため）。ＤＲ４／ＤＲ５のノックアウトを、フローサイトメトリーに基づくアッセイによって決定する。
【0134】
（実施例８－ＮＫ細胞におけるＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５のノックダウン）
ＮＫ－９２細胞、ＫＨＹＧ－１細胞及び初代ＮＫ細胞におけるＤＲ４及び／又はＤＲ５のｓｉＲＮＡノックダウンを、エレクトロポレーションによって実施した。Ｍａｘｃｙｔｅ ＧＴシステムを使用して、ｓｉＲＮＡベースの送達を実施した。
ＮＫ－９２細胞、ＫＨＹＧ－１細胞及び初代ＮＫ細胞におけるＤＲ４及び／又はＤＲ５のｓｉＲＮＡノックダウンを、エレクトロポレーションによって実施した。Ｍａｘｃｙｔｅ ＧＴシステムを使用して、ｓｉＲＮＡベースの送達を実施した。
【0135】
次いで、ＤＲ４及び／又はＤＲ５ノックダウン分析が実施されるまで、加湿３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター内で細胞をインキュベートした。ＤＲ４及び／又はＤＲ５発現レベルを測定するために、エレクトロポレーションの７２時間後、及び（任意により）ＴＲＡＩＬバリアント（例：Ｅ１９５Ｒ／Ｄ２６９Ｈ）ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの直前に、フローサイトメトリー分析を実施した。このエレクトロポレーションプロトコルは、ＫＨＹＧ－１細胞、ＮＫ－９２細胞、初代ＮＫ細胞で確実にＤＲ４及びＤＲ５ノックダウンをもたらすことが分かっている。
【0136】
（実施例９－ＮＫ細胞のフラトリサイド耐性）
図１５に示されるように、以下の細胞におけるＮＫ細胞フラトリシドが評価された：（１）初代ＮＫ細胞、あるいはモック又は野生型ＮＫ細胞と称される、（２）高親和性膜結合ＴＲＡＩＬリガンドＤＲ５Ｅ１９５Ｒ；Ｄ２６９Ｈを発現する初代ＮＫ細胞、（３）ｓｉＲＮＡを介したＤＲ５ＫＤを持つ初代NK細胞、及び（４）ｓｉＲＮＡを介したＤＲ５ＫＤを持ち、高親和性膜結合ＴＲＡＩＬリガンドＤＲ５Ｅ１９５Ｒ；Ｄ２６９Ｈも発現する初代ＮＫ細胞。
図１５に示されるように、以下の細胞におけるＮＫ細胞フラトリシドが評価された：（１）初代ＮＫ細胞、あるいはモック又は野生型ＮＫ細胞と称される、（２）高親和性膜結合ＴＲＡＩＬリガンドＤＲ５Ｅ１９５Ｒ；Ｄ２６９Ｈを発現する初代ＮＫ細胞、（３）ｓｉＲＮＡを介したＤＲ５ＫＤを持つ初代NK細胞、及び（４）ｓｉＲＮＡを介したＤＲ５ＫＤを持ち、高親和性膜結合ＴＲＡＩＬリガンドＤＲ５Ｅ１９５Ｒ；Ｄ２６９Ｈも発現する初代ＮＫ細胞。
【0137】
ＤＲ５ノックダウンを受けた初代ＮＫ細胞を、拡大の９日目にＤＲ５ ｓｉＲＮＡでエレクトロポレーションした一方で、ＤＲ５ ＴＲＡＩＬバリアントを受けた初代ＮＫ細胞を、拡大の１２日目にバリアントｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。
【0138】
ＩＬ－２を含む増殖培地で初代ＮＫ細胞を長時間拡大した後、ＤＲ５の発現がアップレギュレートし、ＤＲ５ ＴＲＡＩＬバリアントが発現した場合にフラトリシドが増加することを観察した。
【0139】
このデータは、ｓｉＲＮＡを使用してＤＲ５発現をノックダウンすると、ＮＫ細胞が野生型ＴＲＡＩＬを発現するか高親和性ＤＲ５ ＴＲＡＩＬバリアントを発現するかに関係なく、初代の拡大されたＮＫ細胞をフラトリサイドから保護することを明確に示す。
【産業上の利用可能性】
【0140】
従って、本発明は、治療に使用するための細胞毒性の高いＮＫ細胞を提供する。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図4e】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】