特表 2023-528876 ２０１９年重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）（ＣＯＶＩＤ－１９）をスクリーニングするシステム及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-06

(54)【発明の名称】２０１９年重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）（ＣＯＶＩＤ－１９）をスクリーニングするシステム及び方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20230629BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230629BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230629BHJP

【ＦＩ】

G01N33/569 L

G01N33/53 D

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022574330

(86)(22)【出願日】2021-06-02

(85)【翻訳文提出日】2022-12-09

(86)【国際出願番号】 US2021035457

(87)【国際公開番号】W WO2021247712

(87)【国際公開日】2021-12-09

(31)【優先権主張番号】63/041,551

(32)【優先日】2020-06-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/033,276

(32)【優先日】2020-06-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591072086

【氏名又は名称】バテル メモリアル インスティチュート

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100221899

【弁理士】

【氏名又は名称】高倉 みゆき

(72)【発明者】

【氏名】メリシア アール ゲイニー

(72)【発明者】

【氏名】ダリア ナトゥール

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ10

4B063QR48

4B063QS33

4B063QX01

(57)【要約】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をスクリーニングするための代替抗体が開示されている。代替抗体の１つは、ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社、私書箱４８９、ノース・バーウィック、メイン州〒０３９０６、米国（「ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社」）のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５６（「Ｅ３－抗体」又は「Ｅ３」）である。別の代替抗体は、Ｅ３－抗体と、ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５７（「Ｅ１－抗体」又は「Ｅ１」）との組み合わせである（Ｅ１－抗体とＥ３－抗体との組み合わせを、「Ｅ１／Ｅ３－抗体」又は単に「Ｅ１／Ｅ３」と称する）。さらに別の代替抗体は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、４５－１ラムジーロード、シャーリー、ニューヨーク州〒１１９６７、米国（「Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社」）のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン４Ｂ２１、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２７（「Ｃ４－抗体」又は「Ｃ４」）と、同じくＣｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン７Ｇ２１、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２６（「Ｃ５－抗体」又は「Ｃ５」）との組み合わせである（Ｃ４－抗体とＣ５－抗体との組み合わせを、「Ｃ４／Ｃ５－抗体」又は単に「Ｃ４／Ｃ５」と称する）。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

プレートをＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単層でコーティングするステップと、
コーティングプレートに、所定量の５０％組織培養感染用量アッセイ／ミリリットル（ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を接種するステップと、
接種プレートを培養するステップと、
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞プレートを固定するステップと、
固定プレートに抗体を加えるステップであって、前記抗体が、
ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社、私書箱４８９、ノース・バーウィック、メイン州〒０３９０６、米国（「ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社」）のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５６（「Ｅ３」）、
Ｅ３－抗体と、ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５７（「Ｅ１」）との組み合わせ、
Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、４５－１ラムジーロード、シャーリー、ニューヨーク州〒１１９６７、米国（「Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社」）のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン４Ｂ２１、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２７（「Ｃ４」と）、同じくＣｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン４Ｂ２１、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２６（「Ｃ５」）との組み合わせ（「Ｃ４／Ｃ５」）、
からなる群から選択される、ステップと、
ＡＢＴＳ溶液を塗布するステップと、
洗浄した前記プレートに停止溶液を塗布するステップと、
前記プレートの光学濃度を読み取るステップと、
前記光学濃度が事前に定義した閾値より大きいか否かを判断するステップと、を含む、方法。

【請求項2】

前記接種プレートを培養するステップが、２４時間培養するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記接種プレートを培養するステップが、１６時間を超えて培養するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記プレートを固定してから一次抗体を適用するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

培養プレートに前記抗体を加える前に、前記抗体を希釈するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記抗体を希釈するステップが、前記抗体を初期濃度から１：４００の濃度に希釈するステップを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記抗体を希釈するステップが、前記抗体を初期濃度から１：８００の濃度に希釈するステップを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体を希釈するステップが、前記抗体を初期濃度から１：１６００の濃度に希釈するステップを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記接種プレートを洗浄してから前記Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を固定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記事前に定義した閾値が、細胞培養制御ウェル又はウイルス制御ウェルの光学濃度に基づく、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記所定量のＴＣＩＤ_５０／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、２，０００（又は２ｅ^３）ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以上である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

プレートをＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単層でコーティングするステップと、
コーティングプレートに所定量の血清含有接種材料を接種するステップであって、前記血清含有接種材料が、
患者からの希釈血清と、
所定量の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と、を含む、ステップと、
接種プレートを約１時間初期培養するステップと、
前記初期培養期間後に前記血清含有接種材料を除去するステップと、
前記血清含有接種材料を新しい接種培地に交換するステップと、
前記接種プレートをさらに全培養期間培養するステップと、
前記全培養期間後に前記接種培地を除去するステップと、
前記接種培地除去後に前記プレートをハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄するステップと、
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞プレートをアセトンで固定するステップと、
固定プレートに抗体を加えるステップと、
ＡＢＴＳ溶液を塗布するステップと、
洗浄した前記プレートに停止溶液を塗布するステップと、
前記プレートの光学濃度を読み取るステップと、
前記光学濃度が事前に定義した閾値より大きいか否かを判断するステップと、を含む、方法。

【請求項13】

前記全培養期間が約４８時間である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

培養プレートに前記抗体を加える前に、前記抗体を希釈するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記抗体を希釈するステップが、前記抗体を初期濃度から１：４００の濃度に希釈するステップを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記プレートをＨＢＳＳで洗浄するステップが、前記プレートをＨＢＳＳで約１５０マイクロリットル／ウェル（約１５０μＬ／ウェル）で洗浄するステップを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞プレートを固定するステップが、前記Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞プレートを８０％アセトンで固定するステップを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項18】

前記接種プレートを初期培養するステップが、
温度約３７±２℃及び二酸化炭素（ＣＯ_２）含有量約５±２％ＣＯ_２で培養するステップを含み、
前記接種プレートをさらに培養するステップが、
温度約３７±２℃及び二酸化炭素（ＣＯ_２）含有量約５±２％ＣＯ_２で培養するステップを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項19】

前記固定プレートに抗体を加えるステップが、前記固定プレートに一次抗体及び二次抗体を加えるステップを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

プレートをＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単層でコーティングするステップと、
コーティングプレートに所定量の血清含有接種材料を接種するステップであって、前記血清含有接種材料が、
患者からの希釈血清と、
所定量の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と、を含む、ステップと、
接種プレートを約１時間、温度約３７±２℃及び二酸化炭素（ＣＯ_２）含有量約５±２％ＣＯ_２で初期培養するステップと、
前記初期培養期間後に前記血清含有接種材料を除去するステップと、
前記血清含有接種材料を新しい接種培地に交換するステップと、
前記プレートを前記新しい接種培地で合計４８時間、温度約３７±２℃及び二酸化炭素（ＣＯ_２）含有量約５±２％ＣＯ_２でさらに培養するステップと、
前記全培養期間後に前記接種培地を除去するステップと、
前記接種培地除去後に前記プレートをハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で約１５０マイクロリットル／ウェル（約１５０μＬ／ウェル）で洗浄するステップと、
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞プレートを８０％アセトンで固定するステップと、
固定プレートに抗体を加えるステップと、
ＡＢＴＳ溶液を塗布するステップと、
洗浄した前記プレートに停止溶液を塗布するステップと、
前記プレートの光学濃度を読み取るステップと、
前記光学濃度が事前に定義した閾値より大きいか否かを判断するステップと、を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、一般に、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス２（ＣｏＶ－２）、及びより詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をスクリーニングするシステム及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

２０１９年の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）（ＣＯＶＩＤ－１９）等のウイルスのスクリーニングは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行うことができる。ＥＬＩＳＡでは、特定の抗原に対する特異性を持つ抗体が少なくとも１つ必要である。そのため、パンデミック（ＣＯＶＩＤ－１９パンデミック等）の際には、ＥＬＩＳＡに必要な供給量が不足することがある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をスクリーニングするシステム及び方法を提供する。簡単に説明すると、一実施形態は、ＥＬＩＳＡのための代替抗体を使用する方法を含む。いくつかの実施形態では、代替抗体は、ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社、私書箱４８９、ノース・バーウィック、メイン州〒０３９０６、米国（「Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏ社」）のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５６（「Ｅ３－抗体」又は「Ｅ３」）である。他の実施形態については、代替抗体は、Ｅ３－抗体と、ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５７（「Ｅ１－抗体」又は「Ｅ１」）との組み合わせである（Ｅ１－抗体とＥ３－抗体との組み合わせを、「Ｅ１／Ｅ３－抗体」又は単に「Ｅ１／Ｅ３」と称する）。さらに別の実施形態では、代替抗体は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、４５－１ラムジーロード、シャーリー、ニューヨーク州〒１１９６７、米国（「Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社」）のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン４Ｂ２１（Ｍｏｕｓｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ａｎｔｉ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ， ｃｌｏｎｅ ４Ｂ２１）、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２７（「Ｃ４－抗体」又は「Ｃ４」）と、同じくＣｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン７Ｇ２１（Ｍｏｕｓｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ａｎｔｉ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ， ｃｌｏｎｅ ７Ｇ２１）、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２６（「Ｃ５－抗体」又は「Ｃ５」）との組み合わせである（Ｃ４－抗体とＣ５－抗体との組み合わせを、「Ｃ４／Ｃ５－抗体」又は単に「Ｃ４／Ｃ５」と称する）。

【0004】

他のシステム、装置、方法、構成及び利点は、以下の図面及び詳細な説明を検討することにより当業者に明らかになるであろう。このような追加のシステム、方法、構成及び利点は全て、本明細書に含まれ、本開示の範囲内にあり、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】試験した異なる抗体パネルを示すチャートである。

【図2】酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のための固定前に、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞単層内で重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を１４時間培養した後の結果を示すチャートである。

【図3】ＥＬＩＳＡのための固定前に、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞単層内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を２４時間培養した後の結果を示すチャートである。

【図4】図３の結果について、信号対雑音比（ＳＮＲ）の尺度としての結合比を示すチャートである。

【図5】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性反応が出た入院患者から得られた非特定化血清について、２４時間培養した後に光学濃度を測定した結果を示すチャートである。

【図6】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性反応が出た入院患者から得られた非特定化血清について、４８時間培養した後に光学濃度を測定した結果を示すチャートである。

【図7】特定の一次抗体を使用した血清除去プロセスを用いたマイクロ中和（ＭＮ）アッセイ力価の結果を示すチャートであり、その結果は、２４時間培養、４８時間培養、及び約５日後の細胞変性効果（ＣＰＥ）の読み出し値について示している。

【発明を実施するための形態】

【0006】

本開示の多くの態様は、以下の図面を参照してよりよく理解することができる。図面中の構成要素は必ずしも縮尺通りではなく、本開示の原理を明確に示すことに重点を置いている。さらに、図面において、同様の符号は、複数の図面全体で対応する部分を示している。

【0007】

２０１９年の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）（ＣＯＶＩＤ－１９）等のウイルスのスクリーニングは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行うことができる。ＥＬＩＳＡは、特定の抗原に対する特異性を持つ抗体が少なくとも１つ必要である。パンデミックのような世界的な緊急事態が発生していない時には、ＥＬＩＳＡによるウイルススクリーニングプロセスを行うための材料は十分に供給されている。しかし、パンデミック（ＣＯＶＩＤ－１９パンデミック等）の際には、ＥＬＩＳＡスクリーニングプロセスのための材料の供給量をはるかに上回る需要が発生することは想像に難くない。ＥＬＩＳＡスクリーニング中は限られた数の適切な材料しか使用できないため、抗体－抗原特異性は需給問題をさらに悪化させる。さらに、パンデミックの原因が新型ウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９等）である時には、需要超過に伴う問題が増幅される。

【0008】

この問題を緩和するために、本開示は、ＥＬＩＳＡのための代替抗体を提供し、それによって、発生し得る（そして実際にＣＯＶＩＤ－１９パンデミック中に発生した）需給問題を軽減する。いくつかの実施形態では、１つの代替抗体は、ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社、私書箱４８９、ノース・バーウィック、メイン州〒０３９０６、米国（「Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏ社」）のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５６（「Ｅ３－抗体」又は「Ｅ３」）である。他の実施形態では、別の代替抗体は、Ｅ３－抗体と、ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５７（「Ｅ１－抗体」又は「Ｅ１」）との組み合わせである（Ｅ１－抗体とＥ３－抗体との組み合わせを、「Ｅ１／Ｅ３－抗体」又は単に「Ｅ１／Ｅ３」と称する）。他の実施形態では、さらに別の代替抗体は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、４５－１ラムジーロード、シャーリー、ニューヨーク州〒１１９６７、米国（「Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社」）のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン４Ｂ２１、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２７（「Ｃ４－抗体」又は「Ｃ４」）と、同じくＣｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン７Ｇ２１、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２６（「Ｃ５－抗体」又は「Ｃ５」）との組み合わせである（Ｃ４－抗体とＣ５－抗体との組み合わせを、「Ｃ４／Ｃ５－抗体」又は単に「Ｃ４／Ｃ５」と称する）。少なくとも３つの追加的な代替抗体（すなわち、Ｅ３、Ｅ１／Ｅ３、Ｃ４／Ｃ５）を提供することにより、本開示は、ＥＬＩＳＡベースのＣＯＶＩＤ－１９検査に使用できる材料の供給量を大幅に拡大する。

【0009】

技術的課題に対する広範な技術的解決法を提供したので、ここで、図面に示すように、実施形態の説明について詳細に言及する。具体的には、図１は、試験した異なる抗体パネルを示す。図２は、図１のパネルの各々について、プレートの固定及びＥＬＩＳＡの実施に先立ち１４～１５（１４～１５）時間培養した後の結果を示し、一方図３は、プレートの固定及びＥＬＩＳＡの実施に先立ち２４時間培養した後の結果を示す。図３の結果をより良く表示するために、図３の結果に対する信号対雑音比（ＳＮＲ）の尺度としての結合比を示すチャートを図４に示す。これらの図面に関連していくつかの実施形態が説明されているが、本明細書に開示されている実施形態のみに限定する意図はない。むしろ、全ての代替物、修正物、均等物を網羅することを意図している。

【0010】

特に、図１は試験した６つの異なる抗体パネルを示し、試験した各抗体パネルについての説明、略語、品種、供給者、カタログ番号もともに示している。抗体パネルは以下のものを含む。
（１）ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５６（「Ｅ３」）
（２）ＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５７（「Ｅ１」）と、同じくＥａｓｔＣｏａｓｔ Ｂｉｏ社のマウス種コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ）抗体、カタログ番号ＨＭ１０５８（「Ｅ２」）との組み合わせ（Ｅ１とＥ２との組み合わせを「Ｅ１／Ｅ２」と称する）
（３）Ｅ１とＥ３との組み合わせ（「Ｅ１／Ｅ３」と称する）
（４）Ｅ２とＥ３との組み合わせ（「Ｅ２／Ｅ３」と称する）
（５）Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン４Ｂ２１、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２７（「Ｃ４」）と、同じくＣｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のマウス種抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ｍＡｂ、クローン４Ｂ２１、カタログ番号ＣＡＢＴ－ＣＳ０２６（「Ｃ５」）との組み合わせ（Ｃ４とＣ５との組み合わせを「Ｃ４／Ｃ５」と称する）
（６）Ｅ１とＣ５との組み合わせ（「Ｅ１／Ｃ５」と称する）

【0011】

現場（ｉｎ ｓｉｔｕ）ＥＬＩＳＡを使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用できる抗体、又は抗体の組み合わせを決定するために、プレートをＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単層でコーティングした。次いで、Ｖｅｒｏ Ｅ６コーティングプレートに、２，０００（２ｅ^３）個の５０％組織培養感染用量アッセイ／ミリリットル（ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ、組織培養感染用量中央値とも称する）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種した。特に、各プレートを８０％アセトンの固定剤（ただし他の固定剤を使用してもよい）で固定して室温で培養した、２枚の９６ウェルマイクロタイターＶｅｒｏ Ｅ６プレートを調製した。９６ウェル構成のうち一方を１４～１５時間培養し、９６ウェル構成の他方を２４時間培養してから固定剤（例えば、アセトン、メタノール、ホルマリン）で固定した。ウェル当たりの容積は約１５０マイクロリットル（約１５０μＬ）であった。次いで、固定剤を除去し、プレートをクラスＩＩ生物学的安全性キャビネット（ＢＳＣ ＩＩ）内で空気乾燥させた。

【0012】

各プレートを洗浄毎に約３００μＬ／ウェルの洗浄バッファで少なくとも３回洗浄した。その後、一次抗体を加えた。具体的には、約２９７μＬのブロッキングバッファと約３μＬの抗体を一次抗体培養に使用した。複数の滴定を行い、各抗体パネルについて、１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００、１：６４００、１：１２８００の異なる連続２倍希釈で合計８つの濃度を得た。６種類の異なる抗体パネルとそれに対応する６種類の制御群（ブランク）を、それぞれ８種類の濃度で、合計９６ウェル（１２×８=９６）となった。一次抗体を加えた後、プレートを約３７±２℃で約６０±５分間培養した。

【0013】

二次抗体が存在する範囲で、各プレートを洗浄毎に約３００μＬの洗浄バッファで少なくとも３回洗浄した。その後、二次抗体を加え、約３７±２℃で約６０±５分間培養した。二次抗体については、各プレートのブロッキングバッファの容積は約１１ｍＬであり、抗マウス免疫グロブリンＧ複合体（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）の容積は約１１μＬであった。複合体（二次抗体）の最終希釈は約１：１０００であった。

【0014】

次いで、各プレートを洗浄毎に約３００μＬの洗浄バッファで少なくとも３回洗浄した。その後、ＡＢＴＳ溶液（２、２′－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸））を加え、約３７±２℃で約３０±５分間培養し、ＡＢＴＳ溶液での培養後直ちに停止溶液を塗布した。次いで、各プレートの光学濃度（ＯＤ）を４９０ｎｍの基準フィルタを用いて４０５ナノメートル（ｎｍ）で読み取った。図２は、約１４時間～１５時間培養についての第１の９６ウェルマイクロタイターＶｅｒｏ Ｅ６プレート構成における各ウェルのＯＤを示し、図３は、２４時間培養についての９６ウェルマイクロタイターＶｅｒｏ Ｅ６プレート構成における対応するＯＤを示す。

【0015】

図２に示すように、１４～１５時間後のＯＤ値はすべて０．７以下であった。言い換えれば、感染ウェル（左６列（１－６））のＯＤと非感染ウェル（右６列（７－１２））のＯＤは、全ての滴定（１：１００から１：１２８００）で低ＯＤを示した。少数の感染ウェルは、対応する非感染ウェルのＯＤよりも大きいＯＤを示したが、全ての感染ＯＤは、対応する非感染ウェルと比較したとき、２倍未満のＯＤを示した。別の言い方をすれば、ＣＯＶＩＤ－１９のウイルス感染は、１４時間の培養では容易に判定できなかった。

【0016】

図２とは異なり、図３は複数の結果が以下の両方を示した。（ａ）ＯＤが０．７より大きい。（ｂ）対応する非感染ウェルのＯＤと比較したとき、感染ウェルにおけるＯＤが２倍を超えて増加している。便宜上、図３の結合比（又は信号対雑音比（ＳＮＲ））を図４に示す。言い換えると、図４の各値は、感染ウェルのＯＤ（これを信号とする）を非感染ウェルのＯＤ（これを雑音とする）で単純に割ったものを表している。したがって、ＳＮＲ＝ＯＤ_感染／ＯＤ_非感染であり、これは図４に示すものとなる。

【0017】

図４に示すように、Ｃ４／Ｃ５組み合わせ、Ｅ１／Ｅ３組み合わせ、Ｅ３－抗体から高い結合比（及び結果として高いＳＮＲ）が観察された。これらの結果は、現在、感染から２４時間後にＶｅｒｏ Ｅ６単層においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用できる代替抗体パネルが存在することを示している。これらの代替抗体パネルによって、製造業者にさらなる選択肢が提供され、その結果、ＣＯＶＩＤ－１９スクリーニングに必要な試薬に関連する需給問題の一部が緩和されることになる。

【0018】

さらに他の実施形態では、現場ＥＬＩＳＡプロセスにおける具体的なステップを、ＴＣＩＤ_５０アッセイ及びマイクロ中和（ＭＮ）アッセイの両方で使用するために修正する。ＴＣＩＤ_５０に関するプロセス（接種材料に血清を含まない場合）について上記で議論した限りにおいて、以下の説明は、ＭＮアッセイに適用可能なプロセス（接種材料に血清とウイルスの両方を含む場合）に焦点を当てている。

【0019】

例として、ＭＮアッセイに適用可能なプロセスの１つの実施形態（本明細書では便宜上ＭＮアッセイプロセスと称する）は、プレートをＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単層でコーティングし、コーティングされたプレートに所定量の接種材料を接種するステップを含む。ＭＮアッセイに適用可能ないくつかの実施形態では、接種材料は、希釈血清（好ましくは患者からの）と、一定量のウイルス（この場合、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２））と、の両方を含む。実際の実験接種材料には、オハイオ州立大学（ＯＳＵ）の病院から入手した非特定化患者血清サンプルが含まれており、それらは（患者識別情報を除外するために）数値ラベルが付されていた（例：１８１７、１８１８、１８２７、１８９９、１９４２、又は患者情報から切り離されたいくつかの他の数値指定）。具体的には、非特定化された患者試料は、条件を満たしたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＣＯＶＩＤ－１９陽性であった患者から採取したものである。

【0020】

接種プレートを約１時間初期培養し、その時点で、血清含有接種材料をＶＥＲＯ Ｅ６細胞プレートに移した。その後、プレートをさらに合計で約４８時間培養した（すなわち、初期培養期間と追加の培養期間の合計が約４８時間）。実際の試験では、初期培養と追加培養の両方が、温度約３７±２℃及び二酸化炭素（ＣＯ_２）含有量約５±２％ＣＯ_２で行われた。

【0021】

全培養期間後、接種培地を除去し、プレートをハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で約１５０マイクロリットル／ウェル（約１５０μＬ／ウェル）で洗浄する。ＨＢＳＳ洗浄液を除去し、プレートを固定剤（例えば約８０％アセトン、メタノール、ホルマリン等）で固定する。このプロセスは、抗体（すなわち一次抗体）を固定プレートに加えるステップに続く。上記に列挙した抗体のいずれも使用することができるが、以下のデータは、Ｅ３とＥ１との組み合わせ（及び実質的に等しい割合）、特に１：４００に希釈したＥ３／Ｅ１組み合わせについての結果を示している。いくつかの実施形態では、二次抗体を加えてもよく、プレートを約３７±２℃で約６０±５分間培養する。二次抗体については、各プレートのブロッキングバッファの容積は約１１ｍＬであり、抗マウス免疫グロブリンＧ複合体（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）の容積は約１１μＬであった。上記と同様に、複合体（二次抗体）の最終希釈は約１：１０００であった。

【0022】

上記と同様に、ＡＢＴＳ溶液を塗布し、洗浄したプレートに停止溶液を塗布し、その後プレートの光学濃度を読み取るというプロセスを続ける。光学濃度が事前に定義した閾値（ここでは約０．７）を超えている場合、このプロセスは、試料が抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体に対して陽性であることを示す。

【0023】

いくつかの例の実験結果を、図５、図６、図７に示す。ここで、９６ウェルプレートの設定を以下のように構成した。（ａ）図５及び図６において１Ａから１Ｈ（１Ａ－１Ｈ）及び２Ａ－２Ｈと指定されたウェルには、ＯＳＵ－１８１７と指定された患者（個人識別情報を除外するため）からの希釈血清が含まれていた。（ｂ）ウェル３Ａ－３Ｈ及び４Ａ－４Ｈには、ＯＳＵ－１８２７患者からの希釈血清が含まれていた。（ｃ）ウェル５Ａ－５Ｈ及び６Ａ－６Ｈには、ＯＳＵ－１９４２患者からの希釈血清が含まれていた。（ｄ）ウェル７Ａ－７Ｈ及び８Ａ－８Ｈには、ＯＳＵ－１８９９患者からの希釈血清が含まれていた。（ｅ）ウェル９Ａ－９Ｈには、ＯＳＵ－１８１８患者からの希釈血清が含まれていた。（ｆ）ウェル１０Ａ－１０Ｈには、９Ａ－９Ｈと同じ接種培地が含まれていたが、ウイルスは含まれていなかった（ＮＶ（ウイルスなし、ｎｏ ｖｉｒｕｓ）と指定された）。（ｇ）ウェル１１Ａ－１１Ｄ及び１２Ａ－１２Ｄにはウイルス制御が含まれており、これはウイルスを含むが血清を含まない。（ｈ）ウェル１１Ｅ－１１Ｈ及び１２Ｅ－１２Ｈには細胞培養（ＣＣ）が含まれており、これは接種培地のみを含む（ウイルスなし及び血清なし）。

【0024】

このプレート設定、ＭＮアッセイプロセス（上述）、Ｅ１／Ｅ３抗体パネル（上述）を用いて、以下の両方でデータを集めた。（ａ）２４時間（図５に示す結果）。（ｂ）４８時間（図６に示す結果）。２４時間と４８時間の両方の結果を、約５日後の細胞変性効果（ＣＰＥ）の読み出し値と比較した（図７に示す比較）。

【0025】

図７に示すように、２４時間の結果は確定的ではなく、結果は判定不能（ＵＤ）とした。比較すると、４８時間（約１時間の初期培養期間後に接種材料を除去したとき）の結果は、ＣＰＥの読み出し値に対応し、それによってＭＮアッセイの現場ＥＬＩＳＡ読み出し値についてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在が確認された。これらの結果を考慮すると、１０Ａ－１０Ｈの数値がＣＣ制御ウェル（１１Ｅ－１１Ｈ及び１２Ｅ－１２Ｈ）と類似していることからも明らかなように、初期培養時間後に接種材料を除去し、アッセイ終了時の固定前にプレートを洗浄することで、一次抗体の非特異的結合（ここではＥ１／Ｅ３）が除去されたようである。このように、中和は、図５、図６、図７に示すように、４８時間培養したヒト患者からの臨床試料で観察される。

【0026】

フローチャートにおけるいかなるプロセスの説明又はブロックも、本開示の技術分野における当業者によって理解されるように、示された又は議論されたものから順序を離れて実行可能であり、関与する機能性に応じて実質的に同時又は逆順で実行されるものも含むと理解されるべきである。

【0027】

例示的な実施形態が示され、説明されてきたが、当業者であれば、説明されているような開示に対して多くの変更、修正又は改変をし得ることは明らかであろう。したがって、このような変更、修正及び改変は全て、本開示の範囲内であると考えるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】