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特表2023-528921ＧＬＰ１Ｒアゴニスト・ＮＭＤＡＲアンタゴニストコンジュゲート

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-06

(54)【発明の名称】ＧＬＰ１Ｒアゴニスト・ＮＭＤＡＲアンタゴニストコンジュゲート

(51)【国際特許分類】

C07K 14/605 20060101AFI20230629BHJP

A61K 47/55 20170101ALI20230629BHJP

A61K 47/64 20170101ALI20230629BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20230629BHJP

A61P 3/04 20060101ALI20230629BHJP

A61P 3/10 20060101ALI20230629BHJP

A61P 3/06 20060101ALI20230629BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20230629BHJP

A61K 31/55 20060101ALN20230629BHJP

A61K 31/13 20060101ALN20230629BHJP

A61K 38/08 20190101ALN20230629BHJP

A61K 38/10 20060101ALN20230629BHJP

A61K 38/26 20060101ALN20230629BHJP

【ＦＩ】

C07K14/605 ZNA

A61K47/55

A61K47/64

A61P1/16

A61P3/04

A61P3/10

A61P3/06

A61P43/00 111

A61K31/55

A61K31/13

A61K38/08

A61K38/10

A61K38/26

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022574779

(86)(22)【出願日】2021-06-03

(85)【翻訳文提出日】2023-01-24

(86)【国際出願番号】 EP2021064930

(87)【国際公開番号】W WO2021245199

(87)【国際公開日】2021-12-09

(31)【優先権主張番号】20178057.4

(32)【優先日】2020-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522471836

【氏名又は名称】ケブンハウンス、ウニバーシテート

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＥＢＥＮＨＡＶＮＳＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100107582

【弁理士】

【氏名又は名称】関根毅

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町洋

(72)【発明者】

【氏名】クリストファ、クレメンスン

(72)【発明者】

【氏名】アナス、ブーウ、クライン

(72)【発明者】

【氏名】ヨーナス、オズゴー、ピーダスン

(72)【発明者】

【氏名】ベンデ、フレンスボー、フレーロン

(72)【発明者】

【氏名】クレスチャン、ストラムゴー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076BB01

4C076CC16

4C076CC21

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA17

4C084BA18

4C084BA19

4C084BA20

4C084MA52

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA701

4C084ZC331

4C084ZC351

4C084ZC422

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB11

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086MA55

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA70

4C086ZA75

4C086ZC02

4C086ZC33

4C086ZC35

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA29

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA05

4C206NA14

4H045BA19

4H045BA50

4H045EA20

4H045FA33

4H045FA50

(57)【要約】

本発明は、天然グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）の少なくとも０．１％の活性をＧＬＰ－１受容体において示すペプチドと、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）アンタゴニストを含んでなるコンジュゲート分子であって、そのペプチドは、ＮＭＤＡＲアンタゴニストに直接的にまたは化学的リンカーを介して共有結合されている、コンジュゲート分子、療法において使用するためのそのコンジュゲート分子、そのコンジュゲート分子を含んでなる医薬組成物、そのコンジュゲート分子を哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物の体重を減少させる方法、ならびにそのコンジュゲート分子を哺乳動物に経口投与することを含んでなる哺乳動物の体重を減少させる非治療的方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

天然グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）の少なくとも０．１％の活性をＧＬＰ－１受容体において示すペプチドと、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）アンタゴニストとを含んでなるコンジュゲート分子であって、前記ペプチドが、前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストに直接的にまたは化学的リンカーを介して共有結合されている、コンジュゲート分子。

【請求項2】

遊離形態の前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストが、約０．５ｎＭ～１０００ｎＭの範囲のＮＭＤＡ受容体との解離定数Ｋ_ｄを有する、請求項１に記載のコンジュゲート分子。

【請求項3】

前記ペプチドがグルカゴンスーパーファミリーのものである、請求項１または２に記載のコンジュゲート分子。

【請求項4】

前記ペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。

【請求項5】

前記ペプチドが、少なくとも１０個のアミノ酸で、かつ６０個以下のアミノ酸からなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。

【請求項6】

前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストが、前記ペプチドのＣ末端領域で共有結合している、請求項１～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。

【請求項7】

前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストが前記ペプチドに切断可能な化学的リンカーを介して共有結合され、該切断可能な化学的リンカーが、酸切断可能なリンカー、酵素切断可能なリンカー、ペプチド切断可能なリンカー、およびジスルフィド基を含むリンカーから選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。

【請求項8】

前記化学的リンカーが式Ｒ_１－Ｒ_３－Ｓ－Ｓ－Ｒ_４－Ｒ_５－Ｏ－ＣＯ－Ｒ_２を有し、式中、Ｒ_１は前記ペプチドであり、Ｒ_２は前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストであり、Ｒ_３は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ_３）_２、ＣＨ_２－ＣＨ_２、またはＣＨ_２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、Ｒ_４は（ＣＨ_２）_ｎまたはＣ_６Ｈ_４であり、Ｒ_５は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ_３）_２、ＣＨ_２－ＣＨ_２、またはＣＨ_２から選択され、ｎは、１、２、３または４である、請求項７に記載のコンジュゲート分子。

【請求項9】

前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストがＭＫ８０１、ネラメキサンまたはメマンチンである、請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。

【請求項10】

療法において使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。

【請求項11】

肥満、過食性障害、インスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝炎、または非アルコール性脂肪肝疾患の処置において使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。

【請求項12】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子またはその薬学上許容可能な塩、および薬学上許容可能な担体を含んでなる、医薬組成物。

【請求項13】

哺乳動物の体重を減少させる方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１２に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、方法。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子を哺乳動物に経口投与することを含んでなる、体重を減少させるための哺乳動物の非治療的処置。

【請求項15】

前記哺乳動物が非病原性体格指数（ＢＭＩ）を有する、請求項１４に記載の体重を減少させるための哺乳動物の非治療的処置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、全体として、治療用コンジュゲートの分野に関し、より具体的には、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体活性およびＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）アンタゴニストを有するコンジュゲートに関する。

【背景技術】

【0002】

肥満は、豊かな社会においてヒトとイヌおよびネコなどの飼育動物に最も多く見られる栄養疾患であり、栄養欠乏症の数をはるかに上回っている。肥満外科手術の代替として、肥満処置用の減量薬を生成するための多くの試みがなされてきた。これにより、腸内でリパーゼ阻害剤として作用することによって脂肪の吸収を防ぐことにより、または視床下部での選択的セロトニン受容体２Ｃ作動作用を介して食物摂取を阻害することにより作用する薬物がもたらされた。

【0003】

グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）は、プログルカゴンペプチドの組織特異的な翻訳後プロセシングに由来する３０または３１アミノ酸長のペプチドホルモンである。これは脳の食欲調節中枢で作用するため、ＧＬＰ－１類似体の最近の適応は重量減少である。ＧＬＰ－１は、消化管に作用するだけでなく、食欲の調節に関与するＣＮＳに影響を与えるため、食欲および体重維持に関連している。また、ヒトにおける胃内容排出および腸運動性を遅らせ、食物摂取の調節に寄与する可能性がある。代謝性疾患の処置のためのＧＬＰ－１に基づいた療法は、先行技術から知られている。Parlevliet et al. (J Pharmacol Exp Ther. 2009 Jan;328(1):240-8)”および関連する特許出願ＥＰ１９６８６４５Ａ２、ＥＰ２１２５００３Ａ２、およびＥＰ１８４３７８８Ａ２には、肥満および肥満関連障害を治療するためのＧＬＰ－１ペプチドを含んでなるヒトＧＬＰ－１ミメティボディ（商標）の使用が記載されている。より具体的には、Parlevliet et al. (2009)には、特定のＧＬＰ－１ＣＮＴＯ７３６が記載されており、これは、高脂肪摂餌マウスにおいて、体脂肪量の減少により、食物摂取および体重を減少させることができる。

【0004】

ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、ＮＭＤＡ受容体の作用を阻害することによって作用し、ＮＭＤＡＲ拮抗作用が食欲減退および体重維持に関連している可能性を裏付けるいくつかの前臨床的証拠がある。Deng et al. (2019, Frontiers in Psychiatry, 10, Article 15)には、高脂肪食によって誘導された食餌誘発性肥満マウスにおける重量減少を駆動する、ＮＭＤＡＲアンタゴニストであるメマンチン塩酸塩の使用が記載されている。Smith et al. (Neuropsychopharmacology (2015) 40, 1163-1171)には、メマンチンは、選択的に、嗜好性の高い高糖食を受けたラットにおいて、用量依存的に過食様摂食を減少させ、食物探索行動および強迫性摂食を完全に妨げることができることが記載されている。また、Popik et al. (Amino Acids (2011) 40:477-485)には、ラットに慢性的に投与されたメマンチン塩酸塩は、標準餌の消費にはあまり影響を与えずに嗜好性の高い食物の消費を選択的に減らすことができること、およびこの効果は処置が中止された後も持続することが記載されている。

【0005】

ヒトの過食性障害の処置におけるメマンチンの効果もまた報告されている。Hermanussen and Tresguerres (Economics and Human Biology 3 (2005) 329-337)には、肥満の若い女性５人を対象とした治験で、メマンチン処置により、最初の２４時間以内に食欲が著しく低下し、過食性障害が抑制され、数日以内に体重が減少する可能性があると報告されている。Brennan et al. (Int J Eat Disord 2008; 41:520-526)には、メマンチンを１２週間毎日投与すると、ヒト被験者の過食が改善される可能性があることを示す予備研究が記載されている。

【0006】

有効性がより高く、安全性が高く（毒物学的影響が少ない）、便利で安全な投与選択肢も提供する新規な重量減少処置の必要性が高まっている。

【発明の概要】

【0007】

従って、上記の観点から、本発明の目的は、肥満のヒト対象において食物摂取を減少させ、体重を軽減するための効果的かつ安全な治療剤を提供することである。

【0008】

従って、本発明の第１の態様は、天然ＧＬＰ－１の少なくとも０．１％の活性をＧＬＰ－１受容体において示すペプチドと、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）アンタゴニストを含んでなるコンジュゲート分子であって、前記ペプチドは、前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストに直接的にまたは化学的リンカーを介して共有結合されている、コンジュゲート分子に関する。

【0009】

本発明者らは、意外にも、ＧＬＰ－１受容体作動作用およびＮＭＤＡＲ拮抗作用を伴うペプチドのコンジュゲーションが、肥満を効果的に逆転させるための新規な医療戦略に相当することを見出した。この戦略に基づくコンジュゲートは、食物摂取の抑制において、図３～１３に示されるように、ＧＬＰ－１ペプチド、メマンチンまたはＭＫ８０１単独と比較して優れている。また、ＧＬＰ－１ペプチドバリアントに基づくコンジュゲート、例えば、ＧＬＰ－１／胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）ペプチド（配列番号９）、および代替ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、食物摂取および体重減少に対して同様の有益な効果を有することが示されている。これは、それぞれ図３３～３４および図３６～３８に示されるように、ＧＬＰ－１／ＧＩＰ共アゴニストおよびＮＭＤＡＲアンタゴニストのネラメキサンを試験したさらなる発見によって裏付けられている。さらに、これらのコンジュゲートはＮＭＤＡＲ拮抗作用の重量減少に対する効果から恩恵を受けるが、ＮＭＤＡＲ拮抗作用の中枢神経系への影響はこの戦略によって回避される。特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、この効果は、ＧＬＰ－１受容体に対する前記ペプチドの親和性により、体内のＧＬＰ－１受容体の部位におよび／またはその近くに蓄積するＮＭＤＡＲアンタゴニストによって達成されると推測している。

【0010】

ペプチドには、アミノ末端およびカルボキシル末端がある。本発明の文脈において、アミノ末端およびカルボキシル末端は、それぞれＮ末端およびＣ末端、および対応する派生形と呼ばれることもある。

【0011】

ペプチドは、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸からなる場合もあれば、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸と、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ－アラニン（ｄＡｌａ）、およびＤ－グルタミンなどの遺伝子コードによってコードされない天然アミノ酸を含む場合もある。さらに、ペプチドは、Ｄ－アラニン、およびＤ－ロイシン、またはａ－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ｄ－セリン（ｄＳｅｒ）、Ｎ－メチル－セリンなどの合成アミノ酸を組み込んでいる場合もある。

【0012】

ある好ましい実施形態において、ペプチドの（Ｎ末端から数えて）２番目のアミノ酸は、ｄＳｅｒ、ｄＡｌａ、Ａｉｂ、グリシン、Ｎ－メチル－Ｓｅｒまたはバリンである。

【0013】

ペプチドはまた、ペプチドの１５番目のグルタミン酸と２０番目のリジンとの間の環化など、二次構造を安定化するための１以上の修飾を有してもよく、これらの位置はＮ末端から数えている。

【0014】

ペプチドはいずれの供給源からも得ることができ、または所望によりペプチドを生産することができる。例えば、ペプチドは組織から単離することができ、またはペプチドは、組換えによって生産し、もしくは当業者に周知の方法によって合成することができる。

【0015】

前記コンジュゲート分子は、ペプチドを含んでなり、このペプチドは（遊離形態で）天然ＧＬＰ－１の少なくとも０．１％の活性をＧＬＰ－１受容体において示す。本発明の文脈において、ＧＬＰ－１受容体活性は、ＧＬＰ－１活性化（ＧＬＰ－１Ｒ活性）とも呼ばれ、ＧＬＰ－１受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導を測定することにより、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイで測定することができる。具体的には、ＧＬＰ－１受容体をコードするＤＮＡとｃＡＭＰ応答エレメントに連結されたルシフェラーゼ遺伝子とで共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（レポーターアッセイ）を使用し得る。このアッセイは、Bech et al. (J. Med. Chem. 2017, 60, 17, 7434-7446)によって記載されたように、実施し得る。このアッセイを使用して、各コンジュゲートのＧＬＰ－１Ｒ活性を決定し、同じアッセイで天然ＧＬＰ－１（配列番号１）ペプチドによって得られた活性と比較して示すことができる。ある実施形態において、前記コンジュゲートのペプチドは、天然ＧＬＰ－１の少なくとも１％の活性、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または３０％の活性を示す。

【0016】

ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、ＮＭＤＡＲに結合し、ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、例えば、ＮＭＤＡＲアンタゴニストの遊離形態で、特定のＮＭＤＡ受容体との解離定数Ｋ_ｄを有すると記載されていることがある。ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、一般に、ナノモル範囲の解離定数を有し、例えば、異なる種のＮＭＤＡ受容体とのＭＫ８０１の解離定数は、ラットの脳膜ではＫ_ｄ＝６．３ｎＭ、マウスの脳ホモジネートではＫ_ｄ＝１０ｎＭ、ブタの脳ではＫ_ｄ１．３ｎＭである。解離定数の決定は当業者に周知である。一実施形態において、遊離形態の前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、ＮＭＤＡ受容体との解離定数Ｋ_ｄが０．５ｎＭ～１０００ｎＭの範囲、例えば、０．５ｎＭ～１００ｎＭの範囲である。そのＮＭＤＡ受容体は、例えば、ヒトＮＭＤＡ受容体であり得、例えば、そのＮＭＤＡＲアンタゴニストは、ヒトＮＭＤＡ受容体とのＫ_ｄが０．５ｎＭ～１００ｎＭの範囲である。本発明の文脈において、遊離形態の前記ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは、いかなる化学基にも結合（特に化学的連結）されておらず、従って、その天然の非修飾形態にあるアンタゴニストを指す。当業者は、ＮＭＤＡ受容体間のわずかな種のバリエーションのみが予想されることを理解するであろう。従って、マウスまたはラットなどの齧歯類で測定された、またはブタなどの高等哺乳動物で測定されたＫ_ｄ値は、ヒトＮＤＭＡ受容体または他の関連する動物または哺乳動物のＮＭＤＡ受容体で測定されたＫ_ｄ値と同様であると予想される。

【0017】

前記コンジュゲート分子のペプチドは、天然ＧＬＰ－１の少なくとも０．１％の活性をＧＬＰ－１受容体において有する任意のペプチドであり得る。ある実施形態において、前記コンジュゲートのペプチドは、グルカゴンスーパーファミリーのものである。グルカゴンスーパーファミリーは、Ｎ末端領域およびＣ末端領域の構造が関連するペプチドのグループである（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるSherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000)を参照）。このグループのメンバーには、総てのグルカゴン関連ペプチド、ならびに成長ホルモン放出ホルモン（配列番号２）、血管作動性腸管ペプチド（配列番号３）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（配列番号４）、セクレチン（配列番号５）、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）（配列番号６）、エキセンジン－４（配列番号７）、非修飾ＧＬＰ－１（配列番号８）、ＧＬＰ－１／ＧＩＰ共アゴニスト（配列番号９）およびそれらの天然ペプチドに対して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸修飾を有する類似体、誘導体またはコンジュゲートが含まれる。このようなペプチドは、好ましくは、グルカゴン受容体スーパーファミリーの受容体、好ましくはＧＬＰ－１受容体と（アゴニストとして）相互作用する能力を保持する。前記コンジュゲート分子のペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し得る。また、前記コンジュゲート分子のペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し得る。特定の実施形態において、前記コンジュゲート分子のペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態において、前記コンジュゲート分子のペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、本発明のペプチドは、エクセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、またはセマグルチドである。

【0018】

グルカゴン受容体スーパーファミリーの異なる受容体に結合する能力を示す共アゴニスト活性を有するペプチドも企図される。一実施形態において、そのような共アゴニストはＧＬＰ－１／ＧＩＰ受容体共アゴニストである。配列番号９の共アゴニストおよびＮＭＤＡＲアンタゴニストに基づくコンジュゲート分子の食物摂取および体重に対する効果は、図３３～３４に示している。

【0019】

ある実施形態において、前記コンジュゲートのペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。例えば、そのペプチドは、配列番号１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約９７％超の同一性を有し得る。ある特定の実施形態において、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。そのようなペプチドは、ＧＬＰ－１受容体における天然ＧＬＰ－１と比較して、有意に高いＧＬＰ－１活性をＧＬＰ－１受容体において有し得る。従って、そのペプチドは、ＮＭＤＡＲアンタゴニストにコンジュゲートされている場合、ＧＬＰ－１受容体の部位により高い速度で蓄積し、次に、ＮＭＤＡＲアンタゴニストの有効性が高まる可能性がある。配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するコンジュゲートのペプチドの一例を図３５に示し、このペプチドの効果は図３３～３４によって裏付けられている。ＧＬＰ－１／ＧＩＰＰｅｎ４０／ＭＫ８０１（配列番号９によるペプチド）とＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１（配列番号１によるペプチド）とのアラインメントを以下にさらに示す：

【化1】

【0020】

前記コンジュゲート分子のペプチドは、そのペプチドが（遊離形態で）天然ＧＬＰ－１の少なくとも０．１％の活性をＧＬＰ－１受容体において示すのに十分な長さを有する。一般に、これは、少なくとも１０個のアミノ酸を含んでなるペプチドで観察できるが、そのペプチドが６０個を超えるアミノ酸を含んでなる場合、その活性が示されない場合がある。従って、ある実施形態において、前記ペプチドは、１０～６０個のアミノ酸の範囲、例えば、２０～５０個のアミノ酸の長さを有する。他のペプチドの配列と一定のパーセンテージで同一である本発明のアミノ酸配列は、当業者による配列の手動評価によるか、またはＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)などのアルゴリズムを使用したコンピューターによる自動配列比較および同定による、そのペプチドの推定上の識別を提供するのに十分なペプチドのアミノ酸配列、例えば、少なくとも１０個のアミノ酸を十分に含んでなるべきである（総説については、Altschul, et al., Meth Enzymol. 266: 460,1996；およびAltschul, et al., Nature Genet. 6: 119, 1994を参照）。

【0021】

本発明の文脈において、ペプチドは、置換、天然もしくは合成アミノ酸の挿入および／またはアミノ酸欠失を有することにより、％同一性が異なり得る。一実施形態において、前記コンジュゲートのペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。

【0022】

ある実施形態において、前記ペプチドは、アセチル化、脂肪酸コンジュゲーション、二酸コンジュゲーション、アルブミンコンジュゲーション、小分子アルブミンバインダー、および／またはＰＥＧコンジュゲーションによって修飾される。抗体などの担体タンパク質に連結することによって修飾されたペプチドも企図される。修飾は、好ましくは、ペプチドの（Ｎ末端から数えて）１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０番目に、Ｃ末端領域内に、またはＣ末端アミノ酸にある。コンジュゲーションは、ジスルフィド、マレイミド、α－ケトン、またはクリックケミストリーに基づくコンジュゲーションによるなど、任意の好適なリンカーによって行うことができる。当業者は、そのようなコンジュゲートを調製する方法を知っている。好ましくは、ＰＥＧ分子は１ｋＤａよりも大きく、脂肪酸および二酸は１２個を超える炭素原子を含み得る。修飾（ＰＥＧ／脂肪酸／二酸）とペプチドとの間にスペーサーを付加することが一般に好ましく、リンカーは、好ましくは、γ－Ｇｌｕリンカー、短いＰＥＧ鎖である。

【0023】

前記コンジュゲート分子は、ＮＭＤＡＲアンタゴニストを含んでなる。任意のＮＭＤＡＲアンタゴニストが、前記コンジュゲートとともに使用され得る。しかしながら、前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、小分子、例えば、最大９００ｋＤａであることが好ましい。例えば、一実施形態において、前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、ＭＫ８０１、メマンチン、ケタミン、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、ネラメキサンおよびアマンタジンから選択される。ＭＫ８０１、ネラメキサンおよびメマンチンが好ましい。ＭＫ８０１およびメマンチンも好ましい。ネラメキサンは、メマンチンに関連する化合物の非限定的な例であり、ネラメキサンの効果は図３６～３８に示している。

【0024】

本発明のペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストは、共有結合される。本発明の文脈において、前記コンジュゲート分子は、ペプチド－薬物－コンジュゲート（ＰＤＣ）とも呼ばれる。前記ペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストは、直接的に結合され得る。例えば、ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、アミド結合を介して共有結合することができ、このアミド結合はＮＭＤＡＲアンタゴニストのアミノ基からペプチドのカルボン酸基へのものである。このようなアミド結合は、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、カルボン酸基を有する合成残基、またはＣ末端のカルボン酸などのカルボン酸基を有するペプチドの任意の残基に対して行うことができる。例えば、ＮＭＤＡＲアンタゴニストがＭＫ８０１である場合、ＭＫ８０１のアミンはペプチドのアミノ酸残基のカルボン酸に結合され得る。それに対応して、ＮＭＤＡＲアンタゴニストがメマンチンである場合、メマンチンのアミンはペプチドのアミノ酸残基のカルボン酸に結合され得る。

【0025】

本発明の文脈において、直接的に共有結合しているとは、ペプチドがＮＭＤＡＲアンタゴニストとの共有結合を有すること、例えば、２つの分子の間に、リンカー基などの追加の化学基が存在しないことを意味する。ペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストは、化学的リンカーを介しても結合され得る。いかなる化学的リンカーも使用し得る。しかしながら、化学的リンカーは最大３０個の原子の長さを有することが一般に好ましい。より長い鎖は、ペプチドがＧＬＰ－１受容体と相互作用する場合、ＮＭＤＡＲアンタゴニストがペプチドに対して立体障害が全くまたはほとんどないように、ＮＭＤＡＲアンタゴニストをペプチドから遠ざけるという利点を有し得る。ペプチドの立体障害がないかまたは低いと、ＧＬＰ－１受容体に対する親和性が高くなる。コンジュゲートのＧＬＰ－１受容体に対する親和性が高くなるほど、ＧＬＰ－１受容体の部位での蓄積が多くなる可能性が高い。化学的リンカーは、好ましくは切断可能なリンカー、例えば、酸切断可能なリンカー、酵素切断可能なリンカー、ペプチド切断可能なリンカー、またはジスルフィドリンカーであり、これらは、ペプチド－薬物コンジュゲートにおける使用に関して当技術分野で一般に周知である。そのような切断可能なリンカーの例は、グルクロニド、β－ガラクトシド、ジスルフィド、ヒドラゾンを含んでなる化合物であり、かつ／またはこれらの化合物は、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ピロホスファターゼ、ホスファターゼ、アリールスルファターゼ、プロテアーゼ、またはエステラーゼによって切断可能である。例えば、リンカーは、カテプシンによって切断可能なペプチド、例えば、ＧＦＬＧを含んでなり得る。リンカーは、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢ）をさらに含んでなり得、これは、アミド結合またはカルバメート結合を介してＮＭＤＡＲアンタゴニストのアミノ基に共有結合され得る。リンカーは、好ましくは、遊離形態のＮＭＤＡＲアンタゴニスト（すなわち、天然形態）を放出し、これは、本明細書に開示されるジスルフィドリンカーなどの多くの異なるリンカー化学によって達成され得る。これらのリンカー化学および追加のリンカー化学は、当業者に周知である。

【0026】

一実施形態において、前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、前記ペプチドのＣ末端領域で共有結合している。本発明の文脈において、Ｃ末端領域は、Ｃ末端から数えてアミノ酸の最大５０％、例えば、Ｃ末端から数えてアミノ酸の最大４０％、３０％、２５％、２０％、または１０％であり得る。例えば、配列番号１のＣ末端領域は、アミノ酸２１～４０番、２６～４０番、または３１～４０番（Ｎ末端から数えた番号）であり得る。従って、ＮＭＤＡＲアンタゴニスト、例えば、メマンチンまたはＭＫ８０１は、Ｃ末端から数えて１０個のアミノ酸のいずれか１つに、直接的にまたはリンカーを介して結合され得る。例えば、ＮＭＤＡＲアンタゴニスト、例えば、メマンチンまたはＭＫ８０１は、Ｃ末端から５アミノ酸以内のアミノ酸に直接的に結合され得る。それによって、ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、ペプチドのＮ末端において立体障害をほとんどまたは全く生じない。Ｎ末端はＧＬＰ－１受容体への結合に関与しているため、Ｎ末端の立体障害がないかまたは低いと、ＧＬＰ－１受容体に対する親和性が高くなり得る。コンジュゲートのＧＬＰ－１受容体に対する親和性が高くなるほど、ＧＬＰ－１受容体の部位での蓄積が多くなる可能性が高い。同じペプチド分子に２つ以上のＮＭＤＡＲアンタゴニストが結合され得ることも企図される。

【0027】

別の非常に好ましい実施形態において、前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、ジスルフィド基を含んでなる化学的リンカーを介して前記ペプチドに共有結合される。ジスルフィド基は、化学的に還元されると、ペプチドからＮＭＤＡＲアンタゴニストを放出させる。ジスルフィド基を含んでなる化学的リンカーは、ジスルフィドリンカーとしても知られ、体循環中、長期間にわたって、前記コンジュゲートのペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストがコンジュゲートしたままであることを保証する。ジスルフィドリンカーのジスルフィド基は細胞内環境などの還元環境で還元され、コンジュゲートのペプチド部分がコンジュゲートのＮＭＤＡＲアンタゴニスト部分から分離されるように、コンジュゲートが切断され得る。還元は、例えば、グルタチオンなどのチオール、または細胞内タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素などのレダクターゼとのジスルフィド交換によるものであり得る。化学的リンカーは、一般式Ｒ’－Ｓ－Ｓ－Ｒ’’（式中、Ｒ’およびＲ’’基は互いに同一であっても異なっていてもよい）を有する当技術分野で公知の化学的リンカーから選択され得る。実験により、ジスルフィド基を含んでなる化学的リンカーを介してコンジュゲートされたペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストのコンジュゲートは、図３に見られるように、ヒト血漿切断半減期が約０．５～１３時間であることが示された。有利には、前記コンジュゲートはＧＬＰ－１受容体に対する前記ペプチドの親和性により、体内のＧＬＰ－１受容体の部位におよび／またはその近くに蓄積し得、前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、ＧＬＰ－１受容体の部位におよび／またはその部位の近くに放出され得る。前記コンジュゲートのペプチド部分がない場合、前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、部位特異的ＮＭＤＡＲ結合として好適な効果を有し得る。前記コンジュゲートは、ＧＬＰ－１受容体を有する細胞に直接的に隣接する細胞外環境で切断され得るか、または前記コンジュゲートは、ＧＬＰ－１受容体を有する細胞によって内在化され、細胞の還元環境で切断され得ることが本発明者らによって推測される。

【0028】

一実施形態において、前記コンジュゲート分子は化学的リンカーを介してコンジュゲートされ、その化学的リンカーは式Ｒ_１－Ｒ_３－Ｓ－Ｓ－Ｒ_４－Ｒ_５－Ｏ－ＣＯ－Ｒ_２を有し、式中、Ｒ_１は前記ペプチドであり、Ｒ_２は前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストであり、Ｒ_３は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ_３）_２、ＣＨ_２－ＣＨ_２、またはＣＨ_２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、Ｒ_４は（ＣＨ_２）_ｎまたはＣ_６Ｈ_４であり、Ｒ_５は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ_３）_２、ＣＨ_２－ＣＨ_２、またはＣＨ_２から選択され、ｎは、１、２、または３である。化学的リンカーが還元されると、前記コンジュゲートの解放されたＮＭＤＡＲアンタゴニスト部分が分子内環化を受け、前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストが遊離形態で放出される、図１Ｂ参照。

【0029】

一実施形態において、前記化学的リンカーは式Ｒ_１－Ｒ_３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－ＣＯ－Ｒ_２を有し、式中、Ｒ_１は前記ペプチドであり、Ｒ_２は前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストであり、Ｒ_３は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ_３）_２、ＣＨ_２－ＣＨ_２、またはＣＨ_２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、ｎは１、２、または３である。

【0030】

一実施形態において、前記化学的リンカーは式Ｒ_１－Ｒ_４－Ｒ_３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－ＣＯ－Ｒ_２を有し、式中、Ｒ_１は前記ペプチドであり、Ｒ_２は前記ＮＭＤＡＲアンタゴニストであり、Ｒ_３は、任意選択であり、存在する場合、ＣＨ（ＣＨ_３）_２、ＣＨ_２－ＣＨ_２、またはＣＨ_２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、Ｒ_４は、任意選択であり、存在する場合、ＣＨ（ＣＨ_３）_２、ＣＨ_２－ＣＨ_２、またはＣＨ_２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、ｎは１、２、または３である。

【0031】

ある実施形態において、第２のラジカル結合は本発明のペプチドの主鎖に対するものである。

【0032】

別の実施形態において、第２のラジカル結合は本発明のペプチドの側鎖に対するものである。

【0033】

本発明の文脈において、Ｒ_１が前記ペプチドの主鎖に結合している場合、Ｃ（ＣＨ_３）_２（Ｌ－ペニシラミン）は、Ｐｅｎと呼ばれることがあり、ＣＨ_２－ＣＨ_２（Ｌ－ホモシステイン）は、ｈＣｙｓと呼ばれることがあり、ＣＨ_２（Ｌ－システイン）は、Ｃｙｓと呼ばれることがあり、図１Ａを参照されたい。

【0034】

本明細書で使用する場合、第１のおよび第２のラジカル結合は、本明細書に開示される化学的リンカーにおける少なくとも２つの自由な結合の存在を述べるために使用される。

【0035】

本発明は、化学的リンカーを介して付加されたペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストを含んでなるコンジュゲート分子のライブラリーの設計および合成を容易にする。図１は、そのようなコンジュゲート分子の設計方法を示している。図１Ａに示されるように、コンジュゲートは、ＮＭＤＡＲアンタゴニスト（図１のＭＫ８０１）をペプチドに化学的に結合させることによって調製し得る。当業者は、膨大な数の異なる化学的リンカーを本明細書に開示される方法によっても、文献で報告されている他の方法によっても調製し得、これらの化学的リンカーを使用して、本明細書に開示される方法に従って、また公知技術の他の場所で報告されているように、ペプチドおよびＮＭＤＡＲアンタゴニストを付加し得ることを理解するであろう。

【0036】

本発明者らは、意外にも、本発明のペプチドが減量薬および標的薬として二機能の役割を果たし得、そうでない場合、摂食を支配する脳の領域（限定されるものではないが、視床下部核、最後野、孤束核および腹側被蓋野であり得る）への、ＮＭＤＡＲアンタゴニストなどの非特異的な小分子の部位選択的送達を可能にすることを見出した。従って、本発明のコンジュゲート分子は、食物摂取を支配する脳領域におけるグルタミン酸作動性シグナル伝達を選択的に調節する手段を提供する一方で、脳全体にわたる自由なシグナル伝達からそれを回避する。本発明のペプチドのターゲティング特性は、ＮＭＤＡＲアンタゴニストの、例えば、内分泌の膵臓などの他の部位への送達も容易にし得ることが理解される。

【0037】

本明細書に開示されるコンジュゲート分子は、選択性を提供し、また標的の領域における薬物作用を強める。このコンジュゲート分子によって可能になるこのターゲティングは、治療指数の改善、すなわち、最小有効濃度の低下を可能にする。さらに、カップリングにより、ＧＬＰ－１受容体を標的とする医薬の有効性に別の代謝薬物作用を追加することが可能である。ＮＭＤＡＲの組織選択的ターゲティングは、摂食行動の管理に使用し得、より低い体重設定点でのシナプス可塑性の再固定化の結果として、処置中止後の再発を減少させ得る。

【0038】

本発明者らは、本発明のコンジュゲートの食欲、食物摂取、および体重に対する驚くべき相乗効果を実証しており、これは、ペプチドまたは薬物単独の投与で得られる効果と比較して有意に大きい。図４～１４を参照されたい。本発明のコンジュゲートの驚くべき相乗効果は、図２１～２８および図３３～３４および図３６～３８に示される発見によってさらに裏付けられる。

【0039】

本発明者らは、本発明のコンジュゲートの食物報酬および満腹感に対する驚くべき相乗効果をさらに実証しており、これは、ペプチドまたは薬物単独の投与で得られる効果と比較して有意に大きい。図３１を参照されたい。

【0040】

加えて、本発明のコンジュゲートの相乗効果は、糖尿病患者の処置に関連することが実証されている。図３２を参照されたい。

【0041】

従って、本発明のコンジュゲートの投与は、肥満動物の食物摂取および体重の予想外の減少をもたらす。

【0042】

本発明のある実施形態において、前記コンジュゲート分子は、療法において使用するためのものである。

【0043】

ある実施形態において、本発明のコンジュゲート分子は、肥満、過食性障害、インスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝炎、または非アルコール性脂肪肝疾患の処置において使用するためのものである。

【0044】

本発明の別の態様は、本発明によるコンジュゲート分子、および薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物に関する。前記コンジュゲート分子の任意の実施形態は、前記医薬組成物において使用し得る。

【0045】

さらなる態様において、本発明は、本発明によるコンジュゲート分子の、医薬組成物の製造における使用に関する。具体的には、前記医薬組成物は、肥満、過食性障害、インスリン抵抗性、２型糖尿病、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝炎、または非アルコール性脂肪肝疾患の処置において使用するためのものである。前記コンジュゲート分子の任意の実施形態は、前記医薬組成物の製造において使用し得る。

【0046】

本発明において開示されるデータは、マウスの研究で得られたものであるが、エネルギー代謝を支配する主要なホルモン経路は、マウスとヒトの間で、同等の受容体発現プロファイルを示す点で類似しているため、結論はヒトにも同様に関連する。

【0047】

本発明のコンジュゲートは、医薬組成物の形態で投与し得る。従って、本発明は、本発明のコンジュゲートまたはその薬学上許容可能な塩、および薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物をさらに提供する。医薬処方物は、従来の技術によって調製し得る。簡潔には、薬学上許容可能な担体は、固体または液体のいずれかであり得る。固形調製物には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒が含まれる。固体担体は、希釈剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、湿潤剤、錠剤崩壊剤または封入材料としても機能し得る１以上の賦形剤であり得る。

【0048】

医薬処方物に含まれるコンジュゲートは、滅菌固体の無菌分離によって、または好適なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水での使用前の構成のために、溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態であり得る。

【0049】

一実施形態において、前記医薬組成物は、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与にまたは経口投与に適している。従って、本発明の組成物は、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量輸液での単回投与形態でまたは複数回投与用容器で提供し得、場合により、保存剤が添加される。これらの組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり得る。

【0050】

本開示に従って、ＧＬＰ－１Ｒ活性を有するペプチドの・および食物摂取を低下させる効果が単一の様式でＮＭＤＡＲ拮抗作用と組み合わされる医薬組成物が提供される。ＧＬＰ－１Ｒ活性を有するペプチドを介した視床下部核、最後野、孤束核および腹側被蓋野および／または内分泌の膵臓への能動的送達は、例えば、解離的、精神病的、行動的影響などの、望ましくない原型的なＮＭＤＡＲ媒介性神経生物学的影響をプラスの代謝効果から分離する。ＮＭＤＡＲ拮抗作用によって引き起こされる望ましくない神経生物学的影響には、幻覚、偏執性妄想、精神錯乱、集中困難、動揺、情緒の変化、悪夢、緊張病、運動失調、感覚消失、学習および記憶障害が含まれ得る。ＮＭＤＡＲアンタゴニストのプラスの代謝効果には、グルコース代謝の改善、食物摂取の減少および過食性障害の抑制が含まれ得、これは、ヒトまたは哺乳動物における肥満および肥満関連代謝障害の軽減に有益であり得る。

【0051】

従って、本発明のペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストとの組合せの治療的有用性は、肥満およびその関連代謝障害の処置のための新しいアプローチを提供する。肥満の処置は、ヒトまたは哺乳動物への前記コンジュゲート分子の投与により、食物摂取および食物動機を減少させることによって、および過食エピソードを減少させることによって達成し得、従って、本発明のさらなる態様は、哺乳動物の体重を減少させる方法であって、本発明のコンジュゲート分子または本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、方法に関する。

【0052】

ある実施形態において、体重を軽減する方法は、本発明のコンジュゲート分子または本発明の医薬組成物を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物の食物摂取を減少させることを伴う。

【0053】

前記コンジュゲート分子または前記医薬組成物は、皮下、経口、筋肉内、腹腔内、または静脈内に投与し得る。

【0054】

前記コンジュゲート分子、従って、前記医薬組成物も、先行技術と比較して食物摂取の抑制に優れている。そのため、前記コンジュゲート分子および前記医薬組成物は、肥満の処置において任意のレベルで使用し得る。肥満は、体格指数（ＢＭＩ）として表すことができ、これは、体重を身長の２乗で割ったものとして定義され、例えば、ｋｇ／ｍ^２の単位で表される。理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、病原性肥満と非病原性肥満との間の限界値を規定するためにＢＭＩを使用することができると考えている。例えば、本発明の文脈において、ＢＭＩ３０ｋｇ／ｍ^２が、病原性肥満と非病原性肥満との間の限界値と解釈される場合がある。しかしながら、他のＢＭＩ値もまた、病原性肥満と非病原性肥満との間の限界値を規定すると考えることができる。従って、例えば、ＢＭＩ値２４ｋｇ／ｍ^２、２６ｋｇ／ｍ^２、２７ｋｇ／ｍ^２、２８ｋｇ／ｍ^２、２９ｋｇ／ｍ^２、３０ｋｇ／ｍ^２、３１ｋｇ／ｍ^２、３２ｋｇ／ｍ^２、３３ｋｇ／ｍ^２、３４ｋｇ／ｍ^２、および３５ｋｇ／ｍ^２は、病原性肥満と非病原性肥満との間の限界値を規定すると考えられる。さらなる態様において、本発明は、体重を減少させるための哺乳動物の非治療的処置であって、本発明によるコンジュゲート分子を前記哺乳動物に経口投与することを含んでなる処置に関する。例えば、哺乳動物は、非病原性ＢＭＩを有し得る。具体的には、この方法は、非病原性肥満を規定する限界値を下回るＢＭＩを有する対象に前記コンジュゲート分子を経口投与することを含んでなり得る。

【0055】

上記において、本発明は、主にいくつかの実施形態を参照して説明してきた。しかしながら、当業者には容易に理解されるように、上に開示したもの以外の実施形態も本発明の範囲内で等しく可能である。

【0056】

以下、非限定的な実施例により、本発明の他の態様および有利な特徴を詳細に説明する。

【0057】

一般に、本明細書で使用される総ての用語は、当技術分野での通常の意味に従って解釈されるべきであり、明示的に定義されるかまたは特に断りのない限り、本発明の総ての態様および実施形態に適用可能である。「１つの(a/an)／その(the)［コンジュゲート、分子、リンカー、ペプチドなど］」への総ての言及は、明示的に特に断りのない限り、前記コンジュゲート、薬剤、分子、リンカー、ペプチドなどの少なくとも１つの実例を指すものとしてオープンに解釈されるべきである。

【0058】

本発明の文脈において、用語「ＧＬＰ１」、「ＧＬＰ－１」または「ＧＬＰ１ペプチド」とは、グルカゴンスーパーファミリーのペプチド、特に、インクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド１を意味する。本発明のペプチドは、食物摂取調節ホルモンペプチドであると考えられ、本発明のコンジュゲート分子の視床下部および／または膵臓への能動的送達因子として機能すると考えられ得る。

【0059】

本発明の文脈において、用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された１０～６０個のアミノ酸のストレッチから構成される化合物を意味する

【0060】

本発明の文脈において、ＧＬＰ－１に由来するペプチドは、その起源となる天然ＧＬＰ－１ペプチド、すなわち、配列番号１とアミノ酸配列同一性を有するペプチドを意味する。

【0061】

ペプチドまたはアミノ酸に関して本明細書で使用される用語「誘導体」とは、化学的に修飾されたペプチドまたはアミノ酸を意味し、少なくとも１つの置換基は非修飾のペプチドまたはアミノ酸またはその類似体に存在しないもの、すなわち、共有結合により修飾されているペプチドまたはアミノ酸を意味する。典型的な修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステルなどである。

【0062】

本発明の文脈において、用語「パーセンテージ同一性」または「％同一性」とは、特に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、比較した２つのペプチド間で同一のアミノ酸の割合％を意味する。

【0063】

本明細書で使用される用語「ＮＭＤＡＲアンタゴニスト」とは、ＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）のアンタゴニストである化合物を意味する。ＮＭＤＡＲアンタゴニストの例としては、限定されるものではないが、メマンチン、メマンチン塩酸塩、アマンタジン、ケタミンまたはＭＫ８０１が挙げられる。ＮＭＤＡＲアンタゴニストのさらなる例としては、限定されるものではないが、ノルケタミンおよびネラメキサンが挙げられる。

【図面の簡単な説明】

【0064】

本発明の上記ならびに追加の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して、本発明の実施形態の以下の例示的かつ非限定的な詳細な説明によってよりよく理解される。

【0065】

【図1】図１は、ペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストのコンジュゲートの一例を示す。

【図2】図２は、図１のコンジュゲートからＭＫ８０１が放出される機構を示す。

【図3】図３は、図１および２のコンジュゲートの３つの型のｉｎｖｉｔｒｏでのヒト血漿安定性を示す。

【図4】図４は、配列番号１のペプチドとメマンチンのコンジュゲート（ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチン）の減量効果を示す。

【図5】図５は、マウスの累積食物摂取に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチンの効果を示す。

【図6】図６は、マウスの１日当たりの食物摂取に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチンの効果を示す。

【図7】図７は、マウスの体組成に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチンの効果を示す。

【図8】図８は、配列番号１のペプチドとＭＫ８０１のコンジュゲート（ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１）の減量効果を示す。

【図9】図９は、マウスの累積食物摂取に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図10】図１０は、マウスの１日当たりの食物摂取に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図11】図１１は、マウスの体組成に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図12】図１２は、配列番号１のペプチドとＭＫ８０１のコンジュゲート（ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１）であって、配列番号１のシステイン残基がＬ－ペニシラミンで置換されているものの減量効果を示す。

【図13】図１３は、マウスの１日当たりの食物摂取に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図14】図１４は、マウスの体重に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図15】図１５は、化学的リンカー誘導体化メマンチンの合成経路を示す。

【図16】図１６は、ペプチドとアミノ基を有する小分子とのコンジュゲーションのための合成経路の例を示す。

【図17】図１７は、化学的リンカー誘導体化ＭＫ８０１を合成するための合成経路を示す。

【図18】図１８は、リンカー誘導体化ＭＫ８０１とペプチド（配列番号１によって与えられるアミノ酸配列を有するペプチド）とのコンジュゲーション反応を示す。

【図19】図１９は、リンカー誘導体化ＭＫ８０１の化学合成のための合成経路を示す。

【図20】図２０は、配列番号１のアミノ酸配列を有しかつＰｅｎ４０修飾を有するペプチドと、リンカー誘導体化ＭＫ８０１とのコンジュゲーションのための反応を示す。

【図21】図２１は、マウスの体重に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの異なる用量の効果を示す。

【図22】図２２は、マウスの１日当たりの食物摂取に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの異なる用量の効果を示す。

【図23】図２３は、化合物負荷試験後のマウスの血糖に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの異なる用量の効果を示す。

【図24】図２４は、マウスの体重に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲート中の活性および不活性ＭＫ８０１の効果を示す。

【図25】図２５は、マウスの累積食物摂取に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲート中の活性および不活性ＭＫ８０１の効果を示す。

【図26】図２６は、コンジュゲートＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１に使用された活性および不活性ＭＫ８０１のｉｎｖｉｔｒｏでのヒト血漿安定性を示す。

【図27】図２７は、マウスの体重に対する、異なるリンカーを有するＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図28】図２８は、マウスの累積食物摂取に対する、異なるリンカーを有するＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図29】図２９は、１種類のリンカーを有するＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲートである。

【図30】図３０は、１種類のリンカーを有するＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲートである。

【図31】図３１は、マウスのスクロース摂取に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図32】図３２は、化合物負荷試験後のｄｂ／ｄｂマウスの血糖に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図33】図３３は、マウスの体重に対する共アゴニストＧＩＰ／ＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図34】図３４は、マウスの累積食物摂取に対する共アゴニストＧＩＰ／ＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲートの効果を示す。

【図35】図３５は、薬物コンジュゲートに使用される配列番号９の共アゴニストＧＬＰ－１／ＧＩＰと配列番号１のＧＬＰ－１ペプチドとのアミノ酸配列アラインメントを示し、式中、Ｘ_１はＤ－アラニン、Ｄ－セリン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチル－セリン、グリシン、またはバリンであり、Ｘ_２はシステイン（ｈＣｙｓ４０／Ｃｙｓ４０）またはＬ－ペニシラミン（Ｐｅｎ４０）である。

【図36】図３６は、マウスの体重に対する、ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０とコンジュゲートした異なるＮＤＭＡＲアンタゴニストの効果を示す。

【図37】図３７は、マウスの１日当たりの食物摂取に対する、ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０とコンジュゲートした異なるＮＤＭＡＲアンタゴニストの効果を示す。

【図38】図３８は、マウスの累積食物摂取に対する、ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０とコンジュゲートした異なるＮＤＭＡＲアンタゴニストの効果を示す。

【発明の具体的説明】

【0066】

図１は、化学的リンカー１０４を介して配列番号１のペプチド１０３のＣ末端システイン１０２に化学的に付加されたＭＫ８０１１０１からなる、化学的リンカー１０４がジスルフィド基１０５を含んでなる、ペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストのコンジュゲート１００の一例を示す。Ｃ末端システイン１０２の側鎖１０６は、場合により、側鎖１０６の長さｎが１または２個の炭素原子であり、かつ／またはＲが水素もしくはメチルであるように、誘導体化されてもよい。側鎖１０６のｈＣｙｓ４０と呼ばれる修飾は、ｎ＝２個の炭素原子の長さを有し、Ｒ＝水素である。側鎖１０６のｈＣｙｓ４０と呼ばれる修飾は、ｎ＝１個の炭素原子の長さを有し、Ｒ＝メチルである。通常のシステインはＣｙｓ４０と呼ばれる。

【0067】

図２は、図１のコンジュゲート１００からＭＫ８０１が放出される機構を示す。ジスルフィド基１０５を含んでなる化学的リンカー１０４は、自壊性であり、細胞内環境などの還元環境（示していない）で還元されてチオール基を生成し、コンジュゲート１０７のＭＫ８０１部分１０８からこのコンジュゲートのペプチド部分を分離し得る。この分子のＭＫ８０１部分１０８において、解放された求核性チオール１０９が自発的分子内環化を受けて、ＭＫ８０１を天然の非修飾ＭＫ８０１薬物（ＭＫ８０１の遊離形態）として放出する。

【0068】

図３は、図１および２のコンジュゲート１００の３つの型のｉｎｖｉｔｒｏでのヒト血漿安定性を示し、各型は、異なるシステイン誘導体または残基を有する。第１の型であるＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１はシステイン誘導体Ｐｅｎ４０を有し、第２の型であるＧＬＰ－１ｈＣｙｓ４０／ＭＫ８０１はシステイン誘導体ｈＣｙｓ４０を有し、第３の型であるＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１は非修飾のシステインＣｙｓ４０を有する。各型の血漿安定性は、経時的な回復パーセンテージとして示される。ＬＣＭＳ分析（示していない）は、コンジュゲートの分解への主な寄与が、リンカーのジスルフィド交換によるＭＫ８０１のデコンジュゲーションに起因する可能性が高いことを明らかにした。その結果、Ｃ末端システイン１０２（ｈＣｙｓ４０／Ｃｙｓ４０）のＬ－ペニシラミン（Ｐｅｎ４０）への単一置換は、立体障害の増加によるジスルフィド結合の接近可能性の低下により血漿安定性を劇的に増加させた。

【0069】

図４～１４は、実施例８に開示されるｉｎｖｉｖｏマウス研究の結果を示す。

【0070】

図４は、図１および２に示されるリンカーを介して化学的に付加された配列番号１のペプチドとメマンチンのコンジュゲートの減量効果を示し、システイン残基は、非修飾のシステイン（ＧＬＰ－１－Ｃｙｓ４０／メマンチン）（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）であり、配列番号１のペプチド（ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０）またはメマンチンの等モル用量は、８日間処置した食餌誘発性（ＤＩＯ）マウスの体重パーセンテージ（ＢＷ％）で測定している。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎは８である。ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０およびＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチンの両方がＤＩＯマウスにおいてＢＷ％の低下をもたらし、後者のコンジュゲートは、処置の８日後におよそ７％のＢＷ％低下をもたらした。

【0071】

図５は、８日間処置したＤＩＯマウスの累積食物摂取（ＦＩ累積値、１日当たりのグラム数）に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチンおよび等モル用量のＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０またはメマンチンの効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。処置の過程で、ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０およびＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチンで処置したマウスでは、対照（ビヒクル）およびメマンチンと比較して、累積食物摂取の低下が観察された。

【0072】

図６は、８日間処置したＤＩＯマウスの１日当たりの食物摂取（１日当たりのＦＩ、１日当たりのグラム数）に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチン（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０またはメマンチンの効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。８日の処置の間に、ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０およびＧＬＰＣｙｓ４０／メマンチンは、メマンチン処置したマウスおよび対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）と比較して、全体として、１日当たりの食物摂取の低下を示した。研究の終了時に、ＧＬＰ－１で処置したマウスは、対照群（ビヒクル）と比較して、食物摂取のわずかな減少しか示さなかった。

【0073】

図７は、８日間処置したＤＩＯマウスの体組成（脂肪および除脂肪体重の変化に関する）（Δ変化、ｇ）に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチン（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０またはメマンチンの効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。８日後、メマンチン、ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０、およびＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチンで処置したマウスは総て、体脂肪量の減少を示したが、除脂肪体重にはほとんど変化が見られなかった。ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチンは、体脂肪量の最大変化をもたらし、このコンジュゲートで処置したマウスにおいておよそ４ｇの体脂肪量の減少が観察された。

【0074】

図８は、１０日間処置したＤＩＯマウスにおけるＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０またはＭＫ８０１の減量効果（ＢＷ％）を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。ＭＫ８０１は、体重（ＢＷ）の変化率をほとんど示さなかったが、ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０およびＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１の両方で、１０日の処置後にそれぞれＢＷがおよそ８および１２％減少した。

【0075】

図９は、１０日間処置したＤＩＯマウスの累積食物摂取（ＦＩ累積値）に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０またはＭＫ８０１の効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。１０日の処置の過程で、ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０およびＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１で処置したマウスでは、対照（ビヒクル）およびＭＫ８０１と比較して、累積食物摂取の低下が観察された。ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１処置したマウスで最良の結果が観察され、累積食物摂取はおよそ１３ｇ／日であり、ビヒクル処置したマウス（およそ２３ｇ／日）よりもおよそ１０ｇ／日少ない。

【0076】

図１０は、１０日間処置したＤＩＯマウスの１日当たりの食物摂取（１日当たりのＦＩ）に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０またはＭＫ８０１の効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。全体として、１日当たりの食物摂取は、１０日の処置の間に様々な程度で変動したが、ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１で処置したマウスでは、対照群（ビヒクル）と比較して、１０日間総てで食物摂取の減少が観察された。

【0077】

図１１は、１０日間処置したＤＩＯマウスの体組成（脂肪および除脂肪体重の変化に関する）（Δ変化、ｇ）に対するＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０またはＭＫ８０１の効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。１０日の処置後、ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１処置したマウスの群は、脂肪および除脂肪体重の両方の減少を示し、体脂肪量の変化（ほぼ５ｇの減少）は最も顕著であった。

【0078】

図１２は、５日間処置したＤＩＯマウスの体重％に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０またはＭＫ８０１の効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。５日の処置後、ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１処置したマウスは、およそ１５％の体重減少を示した。比較して、ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０処置したマウスは、およそ４％の体重減少を示した。

【0079】

図１３は、５日間処置したＤＩＯマウスの食物摂取（ｇ／日）に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０またはＭＫ８０１の効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１で処置したマウスは、対照群（ビヒクル処置したマウス）と比較して、食物摂取の即時減少を示した。さらに、食物摂取の低下は５日の処置期間中、約０．２～０．７ｇ／日で維持された。

【0080】

図１４は、５日間処置したＤＩＯマウスの体重％に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０またはＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０の効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝７である。ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０またはＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０で処置したマウスは、体重％の同様の減少（およそ６％）を示し、ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１ではおよそ１２％の体重の減少を示した。加えて、処置が延長された場合、ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１では、曲線の傾きに基づいて、さらなる体重の減少が期待できるように思われる。

【0081】

図２１および２２は、５日間処置したＤＩＯマウスの体重（ＢＷ％、図２１）および１日当たりの食物摂取（グラム単位の１日当たりのＦＩ、図２２）に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの異なる用量（５０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の効果の対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）との比較を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝５～６である。処置の過程で、両方の用量（５０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処置したマウスでは、対照群と比較して、体重および１日当たりの食物摂取の低下が観察され、１００ｎｍｏｌ／ｋｇのコンジュゲートを毎日皮下注射されたマウスで最も有意な減少が観察された。

【0082】

図２３は、処置過程の７日目にｉｐＧＴＴを受けたＤＩＯマウスの血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートの異なる用量（５０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の効果の対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）との比較を示す。血糖値は１２０分間にわたって測定した。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝５～６である。全体として、コンジュゲートの両方の用量、すなわち、５０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび１００ｎｍｏｌ／ｋｇは、対照群と比較して、有意に低い初期上昇と全体的に低い血糖値をもたらす。

【0083】

図２４および２５は、７日間処置したＤＩＯマウスの体重（％単位のΔ体重、図２４）および累積食物摂取（グラム単位の累積ＦＩ、図２５）に対する、ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０とコンジュゲートした活性および不活性ＭＫ８０１の効果の対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）との比較を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。処置の過程で、活性ＭＫ８０１とコンジュゲートしたＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０で処置したマウスでは、体重および累積食物摂取の低下が観察された。不活性ＭＫ８０１とのコンジュゲートは、コンジュゲートされていないＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０と同様の結果を示した。ＭＫ８０１およびＧＬＰ－１は、マウスの体重と累積食物摂取の減少において相乗効果があると結論付けられている。

【0084】

図２６は、コンジュゲートＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１の活性および不活性ＭＫ８０１型のｉｎｖｉｔｒｏでのヒト血漿安定性のＰＢＳ対照との比較を示す。不活性および活性ＭＫ８０１の血漿安定性は、経時的な回復パーセンテージ（％）（時間）として示される。２つのコンジュゲートは、ＭＫ８０１が活性か不活性かに関係なく、ほぼ同一の血漿安定性を示す。

【0085】

図２７および２８は、７日間のＤＩＯマウスの体重（％単位のＢＷ、図２７）および累積食物摂取（グラム単位の累積ＦＩ、図２８）に対する、異なるリンカーを有するＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲート（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の効果の対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）との比較を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝５～６である。異なるリンカーを有するＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲートの構造は、図２０（ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１）、図２９（ＧＬＰ－１Ｌｙｓ４０－トリアゾール－ＰＥＧ_４－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＫ８０１））および図３０（ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０－ｍｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＫ８０１）に示される。処置の過程で、異なるリンカーを有するＧＬＰ－１／ＭＫ８０１のコンジュゲートで処置したマウスは、累積食物摂取の同様の減少を示した。ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートで処置したマウスの群で７日の処置での最も有意な体重の減少（およそ２０％減少）が観察された。

【0086】

図３１は、８日間処置したＤＩＯマウスのスクロース摂取（％単位）に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）および等モル用量のＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０、ＭＫ８０１またはセマグルチドの効果の対照群（ビヒクル、生理食塩水注射）との比較を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。セマグルチドおよびＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲートで処置したマウスで、対照群（ビヒクル）と比較して表されるスクロース摂取の最も有意な減少が観察された。本発明のコンジュゲート分子は、処置したマウスでの食物報酬および満腹効果の誘導に効果的であると結論付けられた。

【0087】

図３２は、処置過程の７日目にｉｐＧＴＴを受けたｄｂ／ｄｂ（糖尿病）マウスの血糖（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対するＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲート（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）および等モル用量のＭＫ８０１またはセマグルチドの効果を示す。血糖値は２４時間にわたって測定した。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。セマグルチドまたはコンジュゲートＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１のいずれかで処置したマウスは、対照群（ビヒクル）と比較して、全体的に低い血糖値を示し、本発明のコンジュゲート分子は糖尿病マウスの処置に好適であると結論付けられた。

【0088】

図３３および３４は、７日間処置したＤＩＯマウスの体重（％単位、図３３）および累積食物摂取（グラム単位の累積ＦＩ、図３４）に対する共アゴニストＧＩＰ／ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１コンジュゲート（配列番号９）（５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）および等モル用量のＧＬＰ－１／ＧＩＰの効果の対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水注射）との比較を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。ＧＩＰ／ＧＬＰ－１／ＭＫ８０１コンジュゲートで処置したマウスで最も有意な効果が観察され、これらのマウスは、対照群と比較しておよそ２５％の体重の全体的な減少と、対照群で観察された１５ｇの累積食物摂取に対しておよそ３ｇの累積食物摂取を示した。

【0089】

図３６～３８は、５日間処置したＤＩＯマウスの体重（％単位、図３６）、１日当たりの食物摂取（食物摂取、１日当たりのグラム数、図３７）、および累積食物摂取（グラム単位の累積ＦＩ、図３８）に対する、ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）とコンジュゲートした異なるＮＤＭＡＲアンタゴニスト、すなわち、ＭＫ－８０１、メマンチンおよびネラメキサンの効果の対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）との比較を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。処置の過程で、ＭＫ８０１、メマンチンまたはネラメキサンのいずれかとコンジュゲートしたＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０で処置したマウスは総て、対照群と比較して、体重の有意な減少、１日当たりの食物摂取および累積食物摂取の減少を示した。異なるＮＭＤＡＲアンタゴニストを本発明のペプチドとコンジュゲートして、マウスの体重および食物摂取に対して同じ有益な効果を得ることができると結論付けられる。

【0090】

結論
示されたデータは、ＧＬＰ－１類似体とＮＭＤＡＲアンタゴニストの化学的コンジュゲーションが肥満を効果的に逆転させるための新規な医療戦略を表すことを実証している。この戦略に基づくコンジュゲートは、ＧＬＰ－１ペプチド対照と比較して、食物摂取の抑制および体重の軽減において優れており、ＮＭＤＡＲ拮抗作用による中枢への悪影響という欠点はない。

【実施例】

【0091】

実施例１：ペプチドおよびペプチド－ＮＭＤＡＲアンタゴニストコンジュゲートの調製
材料：総ての溶媒および試薬は、商業的供給源から購入し、さらに精製することなく使用した。ペプチドの伸長には、Ｈ－ＲｉｎｋａｍｉｄｅＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂を使用した。特に明記しない限り、Ｆｍｏｃ保護（９－フルオレニルメチルカルバメート）アミノ酸は、Ｉｒｉｓ－ＢｉｏｔｅｃｈまたはＧｙｒｏｓＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、Ｈ－ＲｉｎｋａｍｉｄｅＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂、３５～１００メッシュ；ローディング０．４０～０．６０ｍｍｏｌ／ｇはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから購入した。市販のＮ^α－Ｆｍｏｃアミノ酸ビルディングブロックは、次の側鎖保護類似体として購入した：Ａｒｇ、Ｐｍｃ；Ａｓｐ、Ｏ^ｔＢｕ；Ｃｙｓ、Ｔｒｔ；Ｇｌｎ、Ｔｒｔ；Ｈｉｓ、Ｔｒｔ；Ｌｙｓ、Ｔｒｔ；Ｓｅｒ、^ｔＢｕ；およびＴｒｐ、Ｂｏｃ（Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８－ペンタメチルコマン－６－スルホニル、Ｏ^ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ－ブチルエステル、Ｔｒｔ＝トリチル、Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、および^ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ－ブチルエーテル）。

【0092】

総てのペプチドおよびペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストのコンジュゲートを、Ｃ１８カラム（ＺｏｒｂａｘＥｃｌｉｐｓｅ、ＸＢＤ－Ｃ１８、４．６×５０ｍｍ）使用のＡｇｉｌｅｎｔ６４１０トリプル四重極マスフィルターと連動した分析用逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＰＬＣ）（Ｗａｔｅｒｓ）およびエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ－ＬＣＭＳ）により特性評価した。ＥＳＩ－ＬＣＭＳは、Ｈ_２Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（Ａ：９５：５：０．１、Ｂ：５：９５：０．１）で構成される二成分バッファー系を用いた、０．７５ｍＬ／分の流量での溶出であった。純度は、Ｃ１８カラム（ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨＣ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）を備えたＲＰ－ＵＰＬＣによって決定し、Ｈ_２Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（Ａ：９５：５：０．１、Ｂ：５：９５：０．１）で構成される二成分バッファー系を用いて、０．４５ｍＬ／分の流量で溶出した。

【0093】

Ｆｍｏｃ保護スキームの自動ペプチド合成プロトコール：ペプチドは、１０ｍＬガラス容器を備えたＰｒｅｌｕｄｅＸ、誘導加熱使用によるペプチド合成装置（ＧｙｒｏｓＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、トゥーソン、ＡＺ、ＵＳＡ）を使用して、Ｃ末端がアミド化された誘導体として調製した。総ての試薬は、ＤＭＦ中のストック溶液として新たに調製した：Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（０．２Ｍ）、ＨＣＴＵ（０．５Ｍ）、ＤＩＰＥＡ（１．０Ｍ）およびピペリジン（２０％ｖ／ｖ）。ペプチドの伸長は、次のプロトコールを使用した連続合成操作によって達成した：脱保護（２×２分、室温、３００ｒｐｍでの振盪）およびカップリング（２×５分、７５℃、３００ｒｐｍでの振盪、ＡｒｇおよびＨｉｓの場合、２×５分、５０℃、３００ｒｐｍでの振盪）。ペプチドは、樹脂と比較して５倍過剰でＡＡ／ＨＣＴＵ／ＤＩＰＥＡ（比１：１．２５：２．５）からなるダブルおよびトリプルカップリングを使用して調製した。

【0094】

ペプチド切断：合成されたペプチドは、１００ｍｇペプチジル樹脂当たり１．５ｍＬの切断カクテル（ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％Ｈ_２Ｏ、２．５％ＴＩＰＳ、２．５％チオアニソール）を添加し、続いて、２時間撹拌することにより、ペプチジル樹脂から解放した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで沈殿させ、４℃、２５００×ｇで１０分間遠心分離し、ＭｅＣＮ：Ｈ_２Ｏ：ＴＦＡ（比１：１：０．０１）に再溶解し、濾過し、凍結乾燥した。

【0095】

精製：粗ペプチドまたはペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストのコンジュゲートを、精製前にＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳまたはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で分析した。精製は、逆相Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ、３００ＳＢ－Ｃ１８、２１．２×２５０ｍｍ）を備えた、Ｈ_２Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（Ａ：９５：５：０．１；Ｂ：５：９５：０．１）の二成分バッファー系を使用して線形勾配（流量２０ｍＬ／分）で溶出する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ）で実行した。画分を０．３分間隔で収集し、ＥＳＩ－ＬＣＭＳによる特性評価を行った。純度は、ＲＰ－ＵＰＬＣによって２１４ｎｍで決定し、純度＞９５％の画分をプールし、凍結乾燥した。最終凍結乾燥生成物をさらなる実験に使用した。

【0096】

ペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストのコンジュゲートのアセンブリーのためのコンジュゲーションプロトコール：純粋ペプチドおよび純粋チオピリジル活性化ＮＭＤＡＲアンタゴニストコンジュゲートを二成分溶媒系（Ａ：Ｈ_２Ｏ中、ＤＭＦ；６Ｍグアニジン、１．５Ｍイミダゾール、ｐＨ＝８）に溶解し（比７：１）、少なくとも２時間撹拌した。粗反応混合物を分析用ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳによって監視した。完了したら、反応混合物をバッファーＡおよびバッファーＢで希釈し、線形勾配で溶出するＲＰ－ＨＰＬＣを使用して直接的に精製した。

【0097】

脱塩：総てのペプチドを生物学的実験の前に脱塩した。脱塩は、ペプチドまたはペプチドとＮＭＤＡＲアンタゴニストのコンジュゲートを０．０１Ｍ希ＨＣｌ水溶液に連続的に再溶解し、続いて、凍結乾燥することによって行い、３回繰り返した。ペプチドまたはコンジュゲートの純度は、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ実験に使用するまで、ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳによって監視した。

【0098】

ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチン（システイン連結）の調製
配列番号１のアミノ酸配列を有するＧＬＰ－１ペプチドは、上に記載したＦｍｏｃプロトコールを使用して合成し、化学的リンカー誘導体化メマンチン類似体にコンジュゲートした。化学的リンカー誘導体化メマンチンの合成は、図１５に示される合成経路を介して行った。合成経路の第１工程は、ＭｅＯＨ中、室温で２時間行った。第２工程は、ＣＨ_２Ｃｌ_２中、ピリジンの存在下、０℃で２時間実施した。第３工程は、ＤＭＦ中、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下、５５℃で５日間実施した。最終工程（コンジュゲーション）は、６Ｍグアニジン、１．５Ｍイミダゾールのバッファー中、室温で２時間行った。

【0099】

２’－ピリジルジチオエタノール。磁気撹拌バーを備えた乾燥丸底フラスコ中、Ｎ_２雰囲気下で、２’－アルドリチオール（４．７１ｇ、２１．３ｍｍｏｌ、３当量）を乾燥ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、続いて、シリンジによって２－メルカプトエタノール（０．５６ｇ、７．１ｍｍｏｌ、０．５ｍＬ、１当量）の滴下を行った。反応物を周囲温度で２時間放置した後、真空濃縮した。黄色の粗油をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＣＨ_２Ｃｌ_２、２：８）によって精製し、２’－ピリジルジチオエタノールを透明な油（１．３３ｇ、１００％）として得た。R_f = 0.48; ¹H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 8.49 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.57 (td, J = 7.7, 1.8 Hz, 1H), 7.44 - 7.36 (m, 1H), 7.16 - 7.11 (m, 1H), 5.32 (s, 1H), 3.88 - 3.73 (m, 2H), 3.01 - 2.89 (m, 2H); ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ 159.31, 149.86, 137.00, 122.12, 121.57, 58.37, 42.83.

【0100】

４－ニトロフェニル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カーボネート。磁気撹拌バーを備えた乾燥丸底フラスコに、Ｎ_２雰囲気下で、２’－ピリジルジチオエタノール（１．３３ｇ、７．１ｍｍｏｌ、１当量）および乾燥ピリジン（０．５６ｇ、８．５ｍｍｏｌ、０．５７５ｍＬ、１．２当量）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）で希釈した。反応混合物を０℃に冷却し、クロロギ酸ニトロフェニル（１．７２ｇ、８．５ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度に加えた。反応物を１０分間撹拌し、周囲温度に到達させ、撹拌しながら２時間放置した。反応物を５０ｍＬに希釈し、３×Ｈ_２Ｏ（３０ｍＬ）およびブライン（３０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。粗油をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、２：１）により精製し、４－ニトロフェニル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カーボネートを透明な粘稠油（２．２１ｇ、８９％）として得た。Ｒ_ｆ＝０．３４；純度＞９５％（ＨＰＬＣ）、Ｒ_ｔ＝１５．９９分；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１４Ｈ_１２Ｎ_２Ｏ_５Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ］^＋についてのｍ／ｚ計算値＝３５３．０、測定値３５３．３ｍ／ｚ；¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 8.47 (ddd, J = 4.8, 1.9, 0.9 Hz, 1H), 8.35 - 8.26 (m, 2H), 7.84 (td, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 7.78 (dt, J = 8.1, 1.1 Hz, 1H), 7.58 - 7.48 (m, 2H), 7.26 (ddd, J = 7.3, 4.8, 1.1 Hz, 1H), 4.48 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.24 (t, J = 6.1 Hz, 2H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ 158.65, 155.17, 151.75, 149.66, 145.18, 137.80, 125.40, 122.53, 121.40, 119.52, 66.54, 36.42.

【0101】

２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル（３，５－ジメチルアダマンタン－１－イル）カルバメート。磁気撹拌バーを備えた乾燥丸底フラスコ中、Ｎ_２下で、４－ニトロフェニル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カーボネート（７０７ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、１当量）およびメマンチン塩酸塩（６５０ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、乾燥ＤＩＰＥＡ（２６０ｍｇ、６．００ｍｍｏｌ、０．３５ｍＬ、３当量）をシリンジによって添加した。メマンチンは完全には溶解せず、ＤＩＰＥＡを添加すると、反応物はすぐに黄色に変わった。反応物を５日間放置し、続いて、８０℃に加熱した。次いで、反応物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）とともに分液漏斗に移し、５×半飽和ブライン（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で徹底的に洗浄し、ＤＭＦを除去した。続いて、有機層を１ＭＮａＯＨ水溶液（５０ｍＬ）で５回抽出し（水層の黄色が消えるまで）、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。粗油を勾配（ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、９：１～３：１）で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル（３，５－ジメチルアダマンタン－１－イル）カルバメートをガラス状の粘稠油（５４０ｍｇ、５４％）として得た。Ｒ_ｆ＝０．２６；純度＞９５％（ＨＰＬＣ）、Ｒ_ｔ＝１９．３６分；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２０Ｈ_２８Ｎ_２Ｏ_２Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ］^＋についてのｍ／ｚ計算値＝３９３．２、測定値３９３．４ｍ／ｚ；¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 8.46 (ddd, J = 4.8, 1.9, 0.9 Hz, 1H), 7.85 - 7.75 (m, 2H), 7.25 (ddd, J = 7.2, 4.8, 1.2 Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 4.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.05 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.69 - 1.63 (m, 2H), 1.54 - 1.43 (m, 4H), 1.31 - 1.20 (m, 5H), 1.07 (s, 2H), 0.80 (s, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ 159.04, 153.78, 149.55, 137.79, 121.21, 119.23, 60.80, 51.40, 50.18, 47.07, 42.22, 37.46, 31.84, 30.05, 29.46.

【0102】

ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０およびＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／メマンチンは、上に記載したプロトコールを使用して調製した。ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳ分析により、純度は＞９５％であると決定された。

【0103】

ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／メマンチン（ペニシラミン連結）の調製。
化学的リンカー誘導体化メマンチンの合成は、図１５に開示される合成経路を使用して行った。ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０とメマンチンは、図１６に示される化学反応によってコンジュゲートし、これは、６Ｍグアニジン、１．５Ｍイミダゾールのバッファー中、室温で２時間実施した。

【0104】

ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１（システイン連結）の調製。
配列番号１の配列を有するペプチドは、上に開示したＦｍｏｃプロトコールを使用して合成し、化学的リンカー誘導体化ＭＫ８０１類似体とコンジュゲートした。化学的リンカー誘導体化ＭＫ８０１の合成は、図１７に開示される第２の合成経路を介して行った。この化学反応は、ＤＭＦ中、ＤＩＰＥＡの存在下、５５℃で５日間行った。

【0105】

リンカー誘導体化ＭＫ８０１は、図１８に示される化学反応によりＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０にコンジュゲートした。この反応は、６Ｍグアニジン、１．５Ｍイミダゾールのバッファー中、室温で２時間行った。

【0106】

２－（ピリジン－３－イルジスルファンイル）エチル５－メチル－１０，１１－ジヒドロ－５Ｈ－５，１０－エピミノジベンゾ［ａ，ｄ］［７］アヌレン－１２－カルボキシレート。磁気撹拌バーを備えた火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ_２雰囲気下で、ＭＫ８０１塩酸塩１９１ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ、１．２当量）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、続いて、４－ニトロフェニル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カーボネート（２５３ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。続いて、乾燥ＤＩＰＥＡ（３７５μＬ、２．１４ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加すると、溶液は黄色に変わった。反応物を油浴中で５５℃に加熱し、ＵＰＬＣ－ＭＳで出発材料が完全に消費されていることが示されるまで４日間撹拌した。反応物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、半飽和ブライン（５×６０ｍＬ）、０．５ＭＮａＯＨ水溶液（５×６０ｍＬ）およびブラインで十分に洗浄した。有機層を集め、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。分取ＨＰＬＣ（６０％Ｂで定組成溶出、１７ｍＬ／分以上）により精製し、続いて、凍結乾燥することにより、１１を透明な固体（２５０．２ｍｇ、８０．１％）として得た；純度＞９５％（ＨＰＬＣ）、Ｒ_ｔ＝１８．１７分；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２４Ｈ_２２Ｎ_２Ｏ_２Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ］^＋についてのｍ／ｚ計算値＝４３５．１、測定値４３５．４；¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 8.41 (dt, J = 4.8, 1.4 Hz, 1H), 7.68 (dt, J = 7.9, 4.1 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.38 - 7.31 (m, 1H), 7.25 - 7.15 (m, 4H), 7.15 - 7.06 (m, 2H), 7.01 - 6.87 (m, 1H), 5.38 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.27 - 4.13 (m, 2H), 3.59 (dd, J = 17.3, 5.7 Hz, 1H), 3.10 (s, 2H), 2.67 - 2.58 (m, 1H), 2.20 (s, 3H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO) δ 158.92, 149.56, 143.37, 139.04, 137.70, 131.78, 130.25, 127.42, 127.34, 127.31, 125.88, 122.12, 121.66, 121.20, 119.19, 65.33, 62.21, 59.20, 37.55.

【0107】

ＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１は、上に開示したプロトコールを使用して、２－（ピリジン－３－イルジスルファンイル）エチル５－メチル－１０，１１－ジヒドロ－５Ｈ－５，１０－エピミノジベンゾ［ａ，ｄ］［７］アヌレン－１２－カルボキシレートおよびＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０から調製した。ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳ分析により、生成物が確認され、純度は＞９５％であると決定された。

【0108】

ＧＬＰ－１ｈＣｙｓ４０／ＭＫ８０１（ホモシステイン連結）の調製
配列番号１のアミノ酸配列を有しかつｈＣｙｓ４０修飾を有するペプチドは、上に開示したＦｍｏｃプロトコールを使用して合成し、化学的リンカー誘導体化ＭＫ８０１類似体とコンジュゲートした。リンカー誘導体化ＭＫ８０１の化学合成は、図１９に示される合成経路を介して行った。この化学反応は、６Ｍグアニジン、１．５Ｍイミダゾールのバッファー中、室温で２時間行った。

【0109】

ＧＬＰ－１ｈＣｙｓ４０：配列番号１のアミノ酸配列を有しかつｈＣｙｓ４０修飾を有するペプチドは、上に開示したプロトコールを使用して調製した。ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳ分析により、純度は＞９５％であると決定された。ＧＬＰ－１ｈＣｙｓ４０／ＭＫ８０１は、上に開示したプロトコールを使用して調製した。ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳ分析により、純度は＞９５％であると決定された。

【0110】

ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１（ペニシラミン連結）の調製
ＧＬＰ－１ペプチド誘導体は、上に開示したＦｍｏｃプロトコールを使用して合成し、化学的リンカー誘導体化ＭＫ８０１類似体とコンジュゲートした。化学的リンカー誘導体化ＭＫ８０１の化学合成は、図１６に開示される経路を介して行った。

【0111】

ＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１：このコンジュゲートは、上に開示したプロトコールを使用して、図２０に示される化学反応により調製し、この化学反応は、６Ｍグアニジン、１．５Ｍイミダゾールのバッファー中、室温で２時間行った。ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳ分析により、純度は＞９５％であると決定された。

【0112】

実施例２：ｉｎｖｉｔｒｏでのヒト血漿安定性の調査
ｉｎｖｉｔｒｏヒト血漿安定性アッセイ：ペプチド安定性は、クエン酸リン酸デキストロース（３ＨＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ロットＰ２２）を含有する正常ヒト血漿を使用して決定した。ヒト血漿は、３７℃で１５分間予熱した。続いて、３６０μＬのヒト血漿に４０μＬのＧＬＰ－１Ｐｅｎ４０／ＭＫ８０１、ＧＬＰ－１ｈＣｙｓ４０／ＭＫ８０１、またはＧＬＰ－１Ｃｙｓ４０／ＭＫ８０１コンジュゲートストック溶液（１ｍＭ、ＤＭＳＯストック中１０ｍＭペプチドからＰＢＳバッファーで希釈することにより調製）を添加し、軽く振盪しながら３７℃でインキュベートした。４５μＬのアリコートをｔ＝０および追加の５時点で（コンジュゲートの安定性に応じて）集め、０℃で、尿素バッファー（５０μＬ、３０分）で前処理した後、アセトン中の２０％トリクロロ酢酸で処理し、－２０℃で一晩インキュベートした。遠心分離（１３４００ｒｐｍ、３０分）後、上清を濾過し、２１４ｎｍでのＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳにより分析した。曲線下面積（ＡＵＣ）を決定し、ｐｒｉｓｍ８．０を使用してプロットした。半減期（Ｔ_１／２）は、データを１フェーズ減衰式に当てはめることによって決定した。データは、３つの個別実験の平均として表される。

【0113】

実施例３：食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおけるｉｎｖｉｖｏ薬理学研究
Ｃ５７ＢＬ６Ｊ雄マウス（以下、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスと呼ぶ）は、高脂肪食（脂肪からのエネルギー５８％）で飼育し、各研究について、研究開始前に平均体重は４５グラムを超えていた。マウスは個別収容するかまたは二重収容した。マウスは、２１～２３℃で１２時間の明暗サイクルで飼育した。化合物を１日１回（午後２時～午後５時）皮下投与し、食物摂取（ＦＩ）および体重（ＢＷ）を対応する時間に測定した。体組成については、研究前（研究開始の１～３日前）および研究の最終日に、ＭＲＩスキャナー（ＥｃｈｏＭＲＩ）を使用して脂肪および除脂肪量の測定を行った。ビヒクル（生理食塩水）を注射したマウス群を対照群とした。

【0114】

実施例４：通常食マウスにおけるスクロース嗜好試験
Ｃ５７ＢＬ６Ｊ雄マウスをケージに単独収容し、通常食で飼育した。化合物は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与したセマグルチドを除き、総ての化合物について１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で１日１回皮下投与した。ビヒクル（生理食塩水）を注射したマウス群を対照群とした。各処置群に８匹のマウスを含めた。総てのケージには２本の飲用ボトルを設置し、研究開始前に最低５日間マウスを順応させた。研究開始時に、水のボトルを水の入った１本のボトルと１０％（ｗ／ｖ）のスクロース水溶液の入った１本のボトルに交換した。左右差を補正するために、スクロースのボトルを左右のボトルに均等に分配した。スクロース水の摂取量と水の摂取量は、２４時間後にボトルの重さを量ることによって測定した。

【図1】