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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-06
(54)【発明の名称】二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230629BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230629BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230629BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230629BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230629BHJP
C07H 21/00 20060101ALI20230629BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/713
A61K48/00
A61K47/54
A61P31/20
C07H21/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022575954
(86)(22)【出願日】2021-06-07
(85)【翻訳文提出日】2023-02-08
(86)【国際出願番号】 CN2021098682
(87)【国際公開番号】W WO2021249352
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】202010529520.7
(32)【優先日】2020-06-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202011524835.9
(32)【優先日】2020-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516089784
【氏名又は名称】チア タイ ティエンチン ファーマシューティカル グループ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉａ Ｔａｉ Ｔｉａｎｑｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３６９ Ｙｕｚｈｏｕ Ｓｏｕｔｈ Ｒｄ．，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２２２０６２ Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】518295266
【氏名又は名称】メドシャイン ディスカバリー インコーポレイティッド
(74)【代理人】
【識別番号】100115794
【弁理士】
【氏名又は名称】今下 勝博
(74)【代理人】
【識別番号】100119677
【弁理士】
【氏名又は名称】岡田 賢治
(74)【代理人】
【識別番号】100160495
【弁理士】
【氏名又は名称】畑 雅明
(74)【代理人】
【識別番号】100173716
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 真理
(72)【発明者】
【氏名】アン、クゥー
(72)【発明者】
【氏名】スゥン、フェイ
(72)【発明者】
【氏名】ディン、チャールズ ゼット．
(72)【発明者】
【氏名】チェン、シューフイ
【テーマコード（参考）】
4C057
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C057BB02
4C057CC03
4C057DD01
4C057MM02
4C057MM09
4C076AA95
4C076CC16
4C076CC35
4C076CC41
4C076DD66
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA75
4C084ZB33
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086GA13
4C086GA14
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA75
4C086ZB33
(57)【要約】
リバビリン誘導体が挿入された二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、それを含むコンジュゲート、及びその塩並びに用途を提供する。提供された二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、それを含むコンジュゲート及びその塩は、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ、ｐｇＲＮＡ、Ｓ抗原、Ｅ抗原など複数のウイルス指標を効果的に抑えることができ、Ｂ型肝炎の治療に効果的で実行可能な方法を提供している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩であって、前記アンチセンス鎖は配列番号２に示される配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含み、前記ｒは、【化1】
前記ｓｉＲＮＡ類似体のヌクレオチド及びｒのそれぞれは独立して修飾されているか又は修飾されていない二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項2】
前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体の７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上のヌクレオチド及びｒは修飾されており、任意に、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体の全てのヌクレオチド及びｒは修飾されている請求項１に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項3】
前記修飾は、メトキシ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート基結合、ヌクレオチドの（Ｓ）－グリセロール核酸への置き換え又はヌクレオチドの（Ｅ）－ビニルホスフェート（ｖｉｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）への置き換えを含む請求項１又は２に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項4】
アンチセンス鎖は、配列番号２に示される配列においてｒで１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含み、任意に、前記アンチセンス鎖は、配列番号２に示される配列においてｒで１個のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む請求項１～３のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項5】
前記ｒへの置き換えは、前記配列番号２の任意の位置に起こる請求項１～４のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項6】
前記配列番号２は、任意に、５’末端及び／又は３’末端のオーバーハングを含み、任意に、前記配列番号２は５’末端及び／又は３’末端の０個、１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチドのオーバーハングを含み、任意に、前記配列番号２は３’末端のオーバーハングを含み、前記オーバーハングは、修飾されている又は修飾されていないＵＵから選ばれる請求項１～５のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項7】
前記アンチセンス鎖は、配列番号４若しくは配列番号１７、配列番号６若しくは配列番号１９、配列番号７若しくは配列番号２０、配列番号８若しくは配列番号２１、配列番号９若しくは配列番号２２、配列番号１０若しくは配列番号２３、配列番号１１若しくは配列番号２４、配列番号２９若しくは配列番号３３、配列番号３０若しくは配列番号３４、配列番号３１若しくは配列番号３５、又は配列番号３２若しくは配列番号３６、配列番号３９若しくは配列番号４４、配列番号１０若しくは配列番号４５、配列番号４０若しくは配列番号４６、配列番号１０若しくは配列番号４７、又は配列番号１０若しくは配列番号４８に示される配列を含み、又はそれらからなる請求項１～６のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項8】
前記センス鎖は、配列番号１若しくは配列番号２８に示される配列を含み、又はそれらからなる請求項１～７のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項9】
前記センス鎖は、配列番号１に示される配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含み、任意に、前記センス鎖は、配列番号１に示される配列においてｒで１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む請求項１～８のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項10】
前記ｒへの置き換えは、配列番号１の５’末端の１～１９位に起こる請求項１～９のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項11】
前記センス鎖の配列は、配列番号５若しくは配列番号１８、配列番号３若しくは配列番号１６、配列番号１４若しくは配列番号２７、配列番号１３若しくは配列番号２６、配列番号１２若しくは配列番号２５、配列番号３７若しくは配列番号４２、又は配列番号３８若しくは配列番号４３に示される配列を含み、又はそれらからなる請求項１～１０のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項12】
前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は、Ｓ１８～Ｓ２８のいずれかであり、Ｓ１８：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号４若しくは配列番号１７であり、
Ｓ１９：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号６若しくは配列番号１９であり、
Ｓ２０：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号７若しくは配列番号２０であり、
Ｓ２１：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号８若しくは配列番号２１であり、
Ｓ２２：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号９若しくは配列番号２２であり、
Ｓ２３：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号１０若しくは配列番号２３であり、
Ｓ２４：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号１１若しくは配列番号２４であり、
Ｓ２５：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号２９若しくは配列番号３３であり、
Ｓ２６：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号３０若しくは配列番号３４であり、
Ｓ２７：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号３１若しくは配列番号３５であり、
Ｓ２８：センス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号３２若しくは配列番号３６であり、
又は、
前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は、Ｓ１～Ｓ１７のいずれかであり、
Ｓ１：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号４若しくは配列番号１７であり、
Ｓ２：センス鎖は配列番号５若しくは配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号４若しくは配列番号１７であり、
Ｓ３：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号６若しくは配列番号１９であり、
Ｓ４：センス鎖は配列番号５若しくは配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号６若しくは配列番号１９であり、
Ｓ５：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号７若しくは配列番号２０であり、
Ｓ６：センス鎖は配列番号５若しくは配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号７若しくは配列番号２０であり、
Ｓ７：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号８若しくは配列番号２１であり、
Ｓ８：センス鎖は配列番号５若しくは配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号８若しくは配列番号２１であり、
Ｓ９：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号９若しくは配列番号２２であり、
Ｓ１０：センス鎖は配列番号５若しくは配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号９若しくは配列番号２２であり、
Ｓ１１：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０若しくは配列番号２３であり、
Ｓ１２：センス鎖は配列番号５若しくは配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号１０若しくは配列番号２３であり、
Ｓ１３：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１１若しくは配列番号２４であり、
Ｓ１４：センス鎖は配列番号５若しくは配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号１１若しくは配列番号２４であり、
Ｓ１５：センス鎖は配列番号１２若しくは配列番号２５であり、アンチセンス鎖は配列番号４若しくは配列番号１７であり、
Ｓ１６：センス鎖は配列番号１３若しくは配列番号２６であり、アンチセンス鎖は配列番号４若しくは配列番号１７であり、
Ｓ１７：センス鎖は配列番号１４若しくは配列番号２７であり、アンチセンス鎖は配列番号４若しくは配列番号１７であり、
又は、
前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は、Ｓ２９～Ｓ３５のいずれかであり、
Ｓ２９：センス鎖は配列番号３７若しくは配列番号４２であり、アンチセンス鎖は配列番号１０若しくは配列番号２３であり、
Ｓ３０：センス鎖は配列番号３８若しくは配列番号４３であり、アンチセンス鎖は配列番号１０若しくは配列番号２３であり、
Ｓ３１：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号３９若しくは配列番号４４であり、
Ｓ３２：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０若しくは配列番号４５であり、
Ｓ３３：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号４０若しくは配列番号４６であり、
Ｓ３４：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０若しくは配列番号４７であり、
Ｓ３５：センス鎖は配列番号３若しくは配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０若しくは配列番号４８である請求項１～１１のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項13】
前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は薬学的に許容されるコンジュゲート基に結合されており、前記薬学的に許容されるコンジュゲート基はＧａｌＮＡｃ基を含み、任意に、前記薬学的に許容されるコンジュゲート基は１個から５個のＧａｌＮＡｃ基を含有する請求項１～１２のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲート又はその塩。
【請求項14】
前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は薬学的に許容されるコンジュゲート基に結合されており、前記薬学的に許容されるコンジュゲート基は、化合物基Ｄを含む【化2】
【請求項15】
前記薬学的に許容されるコンジュゲート基は、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖の３’末端に結合される請求項１３又は１４に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲート又はその塩。
【請求項16】
前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体又はそのコンジュゲートのホスホロチオエート部分は、（Ｒ）－及び（Ｓ）－エナンチオマー、ジアステレオマー、及び／又はそのラセミ混合物を含む請求項１～１５のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項17】
前記塩は、塩基付加塩、酸付加塩及びその組み合わせから選ばれ、任意に、前記塩基付加塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミン塩、マグネシウム塩及びその組み合わせから選ばれ、前記酸付加塩は、無機酸塩、有機酸塩及びその組み合わせから選ばれ、任意に、前記無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸水素イオン、リン酸、リン酸一水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸、硫酸水素イオン、ヨウ化水素酸、亜リン酸及びその組み合わせから選ばれ、前記有機酸は、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、（Ｅ）－２－ブテン二酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸及びその組み合わせから選ばれる請求項１～１６のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート又はその塩を含み、任意に、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項19】
Ｂ型肝炎を治療するための薬物の製造における請求項１～１７のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート若しくはその塩、又は請求項１８に記載の医薬組成物の用途。
【請求項20】
請求項１～１７のいずれか１項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、そのコンジュゲート若しくはその塩、又は請求項１８に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む対象のＢ型肝炎の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本願は、中国特許出願第ＣＮ２０２０１０５２９５２０．７号（出願日２０２０年６月１１日）、中国特許出願第ＣＮ２０２０１１５２４８３５．９号（出願日２０２０年１２月２１日）、中国特許出願第ＣＮ２０２０１０５２４５８４．８号（出願日２０２０年６月１０日）、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１３３９８２（出願日２０２０年１２月４日）、中国特許出願第ＣＮ２０２０１０５２２４０７．６号（出願日２０２０年６月１０日）、及び中国特許出願第ＣＮ２０２０１１５２４３０７．３号（出願日２０２０年１２月２１日）の優先権を主張する。
【技術分野】
【0002】
本開示は、バイオ医薬品分野に属し、ｒ’が挿入されたｓｉＲＮＡ類似体、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、それを含むコンジュゲート、及びその塩並びに用途に関し、具体的には、前記用途はＢ型肝炎ウイルスによる肝炎の治療薬物を製造するための用途である。
【背景技術】
【0003】
Ｂ型肝炎ウイルスによる肝炎は、Ｂ型肝炎と略称され、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ、略称ＨＢＶ）の感染によって引き起こされる疾患である。Ｂ型肝炎ウイルスは、主に肝細胞に存在し、肝細胞を損傷して肝細胞の炎症、壊死、線維化を引き起こす肝臓親和性ウイルスである。Ｂ型肝炎ウイルスによる肝炎は、急性及び慢性の２つに分かれている。急性Ｂ型肝炎は、成人ではたいていの場合、自身の免疫機構により自然に治る。一方、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）は既に世界的なヘルスケアにとって大きな課題となっており、慢性肝疾患、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）及び肝がん（ＨＣＣ）を引き起こす主な要因でもある（Ｅｄｗａｒｄ Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｏｒａｌ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－７ ａｇｏｎｉｓｔ ＧＳ－９６２０ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２０１５）；６３：３２０－３２８）。世界で２０億人が慢性Ｂ型肝炎ウイルスに感染しており、うち３億５０００万以上がＢ型肝炎に発展しており、毎年約６０万人は慢性Ｂ型肝炎による合併症で死亡していると推定されている（Ｅｄｗａｒｄ Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｏｒａｌ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７ ａｇｏｎｉｓｔ ＧＳ－９６２０ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２０１５））。我が国はＢ型肝炎の発生率の高い地域で、Ｂ型肝炎の既存患者が多いため、深刻な影響をもたらしている。関連データによると、中国では現在、Ｂ型肝炎ウイルス感染者が約９３００万おり、そのうち約２０００万の患者は慢性Ｂ型肝炎と確診されており、さらにその１０～２０％が肝硬変に、１～５％が肝がんに発展するという試算である（張春紅，干擾素在乙型肝炎治療中的応用（Ｂ型肝炎の治療におけるインターフェロンの使用）．中国医薬指南（２０１３）；１１：４７５－４７６）。
【0004】
Ｂ型肝炎の機能的治癒で肝心なのは、ＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）を除去し、表面抗体を生成させることである。ＨＢｓＡｇの定量は、非常に重要な生物学的指標の１つである。慢性感染患者では、現行治療のエンドポイントであるＨＢｓＡｇの減少とセロコンバージョンが観察されたのはごくまれである。
【0005】
現在販売が承認されている抗ＨＢＶ薬は、主に、免疫調節薬（インターフェロン－α、ペグインターフェロンα－２ａ）及び抗ウイルス薬（ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン、テノホビル、クレブジンなど）である。そのうち、抗ウイルス薬は核酸医薬品であり、作用機序はＨＢＶ ＤＮＡの合成を阻害することであるが、ＨＢｓＡｇレベルを直接低減させることはできない。核酸医薬品は、長期治療で自然に観察されたのと同等なＨＢｓＡｇクリアランスを示している（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ（２００５），３６５，１２３－１２９；Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００４），３５１，１２０６－１２１７；Ｂｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００７），４６，３８８－３９４）。
【0006】
臨床ではＨＢｓＡｇを低減させる治療法があるが、効果が満足できない。従って、遺伝子レベルでウイルス遺伝子の発現をサイレンシングして、ＨＢＶの生成及び複製、特にＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ（Ｂ型肝炎Ｓ抗原及びＥ抗原）の産生を遮断することができれば、ウイルスの代謝及び肝細胞への侵入を根本的に低減させることができる。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）という機序により、標的となる目的遺伝子の発現を配列特異的に阻害又は遮断することができ、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳というレベルにおいて阻害効果を発揮して、疾患治療の目的を果たすことができる（ＷＯ２０１６０７７３２１、ＷＯ２０１８１９５１６５）。Ｂ型肝炎の最も理想的な治療方式とされるこの技術では、ｓｉＲＮＡに安定化修飾を行い、目的器官及び細胞を標的とする対応する送達システムを添えることにより、代謝安定性を向上させる必要があるが、従来のｓｉＲＮＡはＢ型肝炎ウイルスＳ抗原及びＥ抗原の含有量を効果的に低減させることができない。
【0007】
また、ｓｉＲＮＡは、一部のｍＲＮＡ断片と部分的に相補的に対合することにより、当該ｍＲＮＡに対応する遺伝子の発現を調節することができる。特に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端のシード領域（ｓｅｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）と非標的遺伝子の相補的な対合は当該遺伝子の発現を部分的に又は完全にサイレンシングすることができ、この現象はインビボ又はインビトロでのｓｉＲＮＡのオフターゲットが生じる主な要因である（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ（２００６），１２，１１７９－１１８７．）。Ｂ型肝炎を治療するためのｓｉＲＮＡは臨床でも前臨床段階でも当該欠点を示している（ＷＯ２０２００３６８６２）。ヌクレオチドに対する一部の修飾はオフターゲットのリスクを低減できるが（Ｉｒｉｂｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ（２０１７），２，２０５５－２０６４；Ｊａｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８，９，７２３－７３２）、サイレンシングの有効性も低下してしまうため、治療の安全性ウィンドウを改善する必要がある。
【発明の概要】
【0008】
本開示は、リバビリン誘導体が挿入された二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、それを含むコンジュゲート、及びその塩並びに用途に関する。本開示に係る二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、それを含むコンジュゲート及びその塩は、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ、Ｓ抗原、Ｅ抗原など複数のウイルス指標を効果的に抑えることができ、Ｂ型肝炎（例えば、慢性Ｂ型肝炎）の治療（例えば、機能的治癒）に効果的で実行可能な手段を提供している。
【課題を解決するための手段】
【0009】
そこで、本開示の第１態様として、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体を提供し、アンチセンス鎖は配列番号２に示される配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含み、ｒは、
であり、
ただし、前記ｓｉＲＮＡ類似体のヌクレオチド及びｒのそれぞれは独立して修飾されているか又は修飾されていない。
【化1】
ただし、前記ｓｉＲＮＡ類似体のヌクレオチド及びｒのそれぞれは独立して修飾されているか又は修飾されていない。
【0010】
特定の実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ類似体のヌクレオチド及びｒの１つ又は複数は修飾されており、他のヌクレオチド及びｒは修飾されていない。前記修飾は、例えば、メトキシ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート基結合、又はヌクレオチドの（Ｓ）－グリセロール核酸への置き換えなどを含む。
【0011】
特定の実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ類似体のヌクレオチド及びｒの１つ又は複数は修飾されており、他のヌクレオチド及びｒは修飾されていない。前記修飾は、例えば、メトキシ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート基結合、ヌクレオチドの（Ｓ）－グリセロール核酸への置き換え、又はヌクレオチドの（Ｅ）－ビニルホスフェート（ｖｉｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）への置き換えによる修飾などを含む。
【0012】
特定の実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ類似体のほぼ全てのヌクレオチド及びｒは修飾されている。特定の実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ類似体の全てのヌクレオチド及びｒは修飾されている。
【0013】
特定の実施形態において、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体の７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上のヌクレオチド及びｒは修飾されている。特定の実施形態において、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体の全てのヌクレオチド及びｒは修飾されている。
【0014】
特定の実施形態において、前記配列番号２は、任意に、５’末端及び／又は３’末端のオーバーハングを含む。特定の実施形態において、前記配列番号２は、５’末端及び／又は３’末端の０個、１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチドのオーバーハングを含む。
【0015】
特定の実施形態において、前記配列番号２が５’末端及び／又は３’末端の２個のヌクレオチドのオーバーハングを含む場合に、末端の３個のヌクレオチドの間に、任意に、２つのホスホロチオエート基結合を有し、ただし、当該３個のヌクレオチドで２個のヌクレオチドはオーバーハングであり、もう１個のヌクレオチドはオーバーハングに隣接する対合ヌクレオチドである。特定の実施形態において、前記オーバーハングは修飾されている又は修飾されていないＵＵから選ばれることが好ましい。特定の実施形態において、前記オーバーハングはｕｕから選ばれることが好ましい。特定の実施形態において、前記オーバーハングｕｕとそれに隣接する１個の対合ヌクレオチドとの間に２つのホスホロチオエート基結合を有する。
【0016】
特定の実施形態において、前記配列番号２は３’末端のオーバーハングを含み、前記オーバーハングは修飾されている又は修飾されていないＵＵから選ばれることが好ましい。特定の実施形態において、前記配列番号２は３’末端のオーバーハングを含み、前記オーバーハングはｕｕから選ばれることが好ましい。特定の実施形態において、前記配列番号２は３’末端のオーバーハングを含み、前記オーバーハングｕｕとそれに隣接する１個の対合ヌクレオチドとの間に２つのホスホロチオエート基結合を有する（例えば、ｃ・ｕ・ｕ）。
【0017】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のアンチセンス鎖は配列番号２に示される配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む。例えば、アンチセンス鎖は配列番号２に示される配列においてｒで１個のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む。
【0018】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のアンチセンス鎖は配列番号２に示される配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む。例えば、アンチセンス鎖は配列番号２に示される配列においてｒで１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む。
【0019】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のアンチセンス鎖は配列番号２に示される配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含み、前記ｒへの置き換えは配列番号２の任意の位置に起こる。好ましくは、前記ｒへの置き換えは配列番号２の５’末端の１～２１位又は１～１９位に起こる。例えば、前記ｒへの置き換えは配列番号２の５’末端の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０又は２１位に起こる。好ましくは、前記ｒへの置き換えは配列番号２の５’末端の２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、１０位、１１位、１２位、１６又は１８位に起こる。
【0020】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のアンチセンス鎖は配列番号４若しくは配列番号１７、配列番号６若しくは配列番号１９、配列番号７若しくは配列番号２０、配列番号８若しくは配列番号２１、配列番号９若しくは配列番号２２、配列番号１０若しくは配列番号２３、配列番号１１若しくは配列番号２４、配列番号２９若しくは配列番号３３、配列番号３０若しくは配列番号３４、配列番号３１若しくは配列番号３５、又は配列番号３２若しくは配列番号３６に示される配列を含み、又はそれらからなる。特定の実施形態において、前記配列は、更なるヌクレオチド修飾として、例えば、メトキシ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート基結合又はヌクレオチドの（Ｓ）－グリセロール核酸への置き換えなどを含む。
【0021】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のアンチセンス鎖は配列番号４若しくは配列番号１７、配列番号６若しくは配列番号１９、配列番号７若しくは配列番号２０、配列番号８若しくは配列番号２１、配列番号９若しくは配列番号２２、配列番号１０若しくは配列番号２３、配列番号１１若しくは配列番号２４、配列番号２９若しくは配列番号３３、配列番号３０若しくは配列番号３４、配列番号３１若しくは配列番号３５、配列番号３２若しくは配列番号３６、配列番号３９若しくは配列番号４４、配列番号１０若しくは配列番号４５、配列番号４０若しくは配列番号４６、配列番号１０若しくは配列番号４７、又は配列番号１０若しくは配列番号４８に示される配列を含み、又はそれらからなる。特定の実施形態において、前記配列は、更なるヌクレオチド修飾として、例えば、メトキシ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート基結合、ヌクレオチドの（Ｓ）－グリセロール核酸への置き換え、又はヌクレオチドの（Ｅ）－ビニルホスフェートへの置き換えによる修飾などを含む。
【0022】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖は配列番号１若しくは配列番号２８に示される配列を含み、又はそれらからなる。
【0023】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖は配列番号１に示される配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む。例えば、センス鎖は配列番号１に示される配列においてｒで１個のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む。
【0024】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖は配列番号１に示される配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む。例えば、センス鎖は配列番号１に示される配列においてｒで１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む。
【0025】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖は配列番号１に示される配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含み、前記ｒへの置き換えは配列番号１の５’末端の１～１９位に起こる。例えば、前記ｒへの置き換えは配列番号１の５’末端の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、又は１９位に起こる。好ましくは、前記ｒへの置き換えは配列番号１の５’末端の２位、３位、７位、１２位、１５位、１７位又は１９位に起こる。
【0026】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖の配列は配列番号５若しくは配列番号１８、配列番号３若しくは配列番号１６、配列番号１４若しくは配列番号２７、配列番号１３若しくは配列番号２６、又は配列番号１２若しくは配列番号２５に示される配列を含み、又はそれらからなる。特定の実施形態において、前記配列は、更なるヌクレオチド修飾として、例えば、メトキシ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート基結合などを含む。
【0027】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖の配列は配列番号５若しくは配列番号１８、配列番号３若しくは配列番号１６、配列番号１４若しくは配列番号２７、配列番号１３若しくは配列番号２６、配列番号１２若しくは配列番号２５、配列番号３７若しくは配列番号４２、又は配列番号３８若しくは配列番号４３に示される配列を含み、又はそれらからなる。特定の実施形態において、前記配列は、更なるヌクレオチド修飾として、例えば、メトキシ修飾、フッ素修飾、ホスホロチオエート基結合、ヌクレオチドの（Ｓ）－グリセロール核酸への置き換え、又はヌクレオチドの（Ｅ）－ビニルホスフェートへの置き換えによる修飾などを含む。
【0028】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖及びアンチセンス鎖は配列においてｒで１個又は複数のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含み、アンチセンス鎖配列番号２に示される配列では、前記ｒへの置き換えが配列番号２の５’末端の２位に起こり、センス鎖配列番号１に示される配列では、前記ｒへの置き換えが５’末端の７位に起こる。
【0029】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体はＳ１８～Ｓ２８のいずれかである。
Ｓ１８：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ１９：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号６又は配列番号１９であり、
Ｓ２０：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号７又は配列番号２０であり、
Ｓ２１：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号８又は配列番号２１であり、
Ｓ２２：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号９又は配列番号２２であり、
Ｓ２３：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ２４：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号１１又は配列番号２４であり、
Ｓ２５：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号２９又は配列番号３３であり、
Ｓ２６：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号３０又は配列番号３４であり、
Ｓ２７：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号３１又は配列番号３５であり、
Ｓ２８：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号３２又は配列番号３６である。
Ｓ１８：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ１９：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号６又は配列番号１９であり、
Ｓ２０：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号７又は配列番号２０であり、
Ｓ２１：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号８又は配列番号２１であり、
Ｓ２２：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号９又は配列番号２２であり、
Ｓ２３：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ２４：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号１１又は配列番号２４であり、
Ｓ２５：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号２９又は配列番号３３であり、
Ｓ２６：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号３０又は配列番号３４であり、
Ｓ２７：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号３１又は配列番号３５であり、
Ｓ２８：センス鎖は配列番号１又は配列番号２８であり、アンチセンス鎖は配列番号３２又は配列番号３６である。
【0030】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体はＳ１～Ｓ１７のいずれかである。
Ｓ１：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ２：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ３：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号６又は配列番号１９であり、
Ｓ４：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号６又は配列番号１９であり、
Ｓ５：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号７又は配列番号２０であり、
Ｓ６：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号７又は配列番号２０であり、
Ｓ７：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号８又は配列番号２１であり、
Ｓ８：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号８又は配列番号２１であり、
Ｓ９：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号９又は配列番号２２であり、
Ｓ１０：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号９又は配列番号２２であり、
Ｓ１１：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ１２：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ１３：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１１又は配列番号２４であり、
Ｓ１４：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号１１又は配列番号２４であり、
Ｓ１５：センス鎖は配列番号１２又は配列番号２５であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ１６：センス鎖は配列番号１３又は配列番号２６であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ１７：センス鎖は配列番号１４又は配列番号２７であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７である。
Ｓ１：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ２：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ３：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号６又は配列番号１９であり、
Ｓ４：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号６又は配列番号１９であり、
Ｓ５：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号７又は配列番号２０であり、
Ｓ６：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号７又は配列番号２０であり、
Ｓ７：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号８又は配列番号２１であり、
Ｓ８：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号８又は配列番号２１であり、
Ｓ９：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号９又は配列番号２２であり、
Ｓ１０：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号９又は配列番号２２であり、
Ｓ１１：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ１２：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ１３：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１１又は配列番号２４であり、
Ｓ１４：センス鎖は配列番号５又は配列番号１８であり、アンチセンス鎖は配列番号１１又は配列番号２４であり、
Ｓ１５：センス鎖は配列番号１２又は配列番号２５であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ１６：センス鎖は配列番号１３又は配列番号２６であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７であり、
Ｓ１７：センス鎖は配列番号１４又は配列番号２７であり、アンチセンス鎖は配列番号４又は配列番号１７である。
【0031】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体はＳ２９～Ｓ３５のいずれかである。
Ｓ２９：センス鎖は配列番号３７又は配列番号４２であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ３０：センス鎖は配列番号３８又は配列番号４３であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ３１：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号３９又は配列番号４４であり、
Ｓ３２：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号４５であり、
Ｓ３３：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号４０又は配列番号４６であり、
Ｓ３４：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号４７であり、
Ｓ３５：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号４８である。
Ｓ２９：センス鎖は配列番号３７又は配列番号４２であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ３０：センス鎖は配列番号３８又は配列番号４３であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号２３であり、
Ｓ３１：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号３９又は配列番号４４であり、
Ｓ３２：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号４５であり、
Ｓ３３：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号４０又は配列番号４６であり、
Ｓ３４：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号４７であり、
Ｓ３５：センス鎖は配列番号３又は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号１０又は配列番号４８である。
【0032】
特定の実施形態において、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は、配列番号３であるセンス鎖と配列番号４であるアンチセンス鎖、配列番号５であるセンス鎖と配列番号４であるアンチセンス鎖、配列番号３であるセンス鎖と配列番号６であるアンチセンス鎖、配列番号５であるセンス鎖と配列番号６であるアンチセンス鎖、配列番号３であるセンス鎖と配列番号７であるアンチセンス鎖、配列番号５であるセンス鎖と配列番号７であるアンチセンス鎖、配列番号３であるセンス鎖と配列番号８であるアンチセンス鎖、配列番号５であるセンス鎖と配列番号８であるアンチセンス鎖、配列番号３であるセンス鎖と配列番号９であるアンチセンス鎖、配列番号５であるセンス鎖と配列番号９であるアンチセンス鎖、配列番号３であるセンス鎖と配列番号１０であるアンチセンス鎖、配列番号５であるセンス鎖と配列番号１０であるアンチセンス鎖、配列番号３であるセンス鎖と配列番号１１であるアンチセンス鎖、配列番号５であるセンス鎖と配列番号１１であるアンチセンス鎖、配列番号１２であるセンス鎖と配列番号４であるアンチセンス鎖、配列番号１３であるセンス鎖と配列番号４であるアンチセンス鎖、配列番号１４であるセンス鎖と配列番号４であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号４であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号６であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号７であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号８であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号９であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号１０であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号１１であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号２９であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号３０であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号３１であるアンチセンス鎖、配列番号１であるセンス鎖と配列番号３２であるアンチセンス鎖、配列番号３７であるセンス鎖と配列番号１０であるアンチセンス鎖、配列番号３８であるセンス鎖と配列番号１０であるアンチセンス鎖、配列番号３であるセンス鎖と配列番号３９であるアンチセンス鎖、配列番号３であるセンス鎖と配列番号１０であるアンチセンス鎖、又は配列番号３であるセンス鎖と配列番号４０であるアンチセンス鎖から選ばれ、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のヌクレオチド及びｒのそれぞれは独立して修飾されているか又は修飾されていない。
【0033】
特定の実施形態において、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は、以下から選ばれる。
【表A-1】
【表A-2】
【0034】
前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のヌクレオチド及びｒはそれぞれ独立して修飾されているか又は修飾されていない。
【0035】
特定の実施形態において、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は、配列番号１６であるセンス鎖と鎖配列番号１７であるアンチセンス、配列番号１８であるセンス鎖と配列番号１７であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号１９であるアンチセンス鎖、配列番号１８であるセンス鎖と配列番号１９であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号２０であるアンチセンス鎖、配列番号１８であるセンス鎖と配列番号２０であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号２１であるアンチセンス鎖、配列番号１８であるセンス鎖と配列番号２１であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号２２であるアンチセンス鎖、配列番号１８であるセンス鎖と配列番号２２であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号２３であるアンチセンス鎖、配列番号１８であるセンス鎖と配列番号２３であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号２４であるアンチセンス鎖、配列番号１８であるセンス鎖と配列番号２４であるアンチセンス鎖、配列番号２５であるセンス鎖と配列番号１７であるアンチセンス鎖、配列番号２６であるセンス鎖と配列番号１７であるアンチセンス鎖、配列番号２７であるセンス鎖と配列番号１７であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号１７であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号１９であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号２０であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号２１であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号２２であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号２３であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号２４であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号３３であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号３４であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号３５であるアンチセンス鎖、配列番号２８であるセンス鎖と配列番号３６であるアンチセンス鎖、配列番号４２であるセンス鎖と配列番号２３であるアンチセンス鎖、配列番号４３であるセンス鎖と配列番号２３であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号４４であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号４５であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号４６であるアンチセンス鎖、配列番号１６であるセンス鎖と配列番号４７であるアンチセンス鎖、又は配列番号１６であるセンス鎖と配列番号４８であるアンチセンス鎖から選ばれる。
【0036】
特定の実施形態において、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は、以下から選ばれる。
【表B-1】
【表B-2】
【0037】
本開示の第２態様として、本開示の第１態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体と、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体にコンジュゲートされた薬学的に許容されるコンジュゲート基とを含む二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートを提供する。
【0038】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートの薬学的に許容されるコンジュゲート基は、１個から５個のＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）基を含有する。好ましくは、前記薬学的に許容されるコンジュゲート基は１個、２個、３個、４個又は５個のＧａｌＮＡｃ基を含有する。より好ましくは、前記薬学的に許容されるコンジュゲート基は３個又は４個のＧａｌＮＡｃ基を含有する。
【0039】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートの薬学的に許容されるコンジュゲート基は化合物基Ｄを含む。
【化2】
【0040】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートの薬学的に許容されるコンジュゲート基は、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖の３’末端に結合される。
【0041】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体又は二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートのホスホロチオエート部分は、（Ｒ）－及び（Ｓ）－エナンチオマー、ジアステレオマー、及び／又はそのラセミ混合物を含む。
【0042】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートは、以下から選ばれる。
【表C-1】
【表C-2】
【0043】
前記Ｄは、上記のとおりである。
【0044】
本開示の第３態様として、本開示の第１態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体又は本開示の第２態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートの塩を提供する。
【0045】
特定の実施形態において、前記塩は、塩基付加塩、酸付加塩及びその組み合わせから選ばれる。
【0046】
特定の実施形態において、塩基付加塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミン塩、マグネシウム塩及びその組み合わせから選ばれ、酸付加塩は、無機酸塩、有機酸塩及びその組み合わせから選ばれる。
【0047】
特定の実施形態において、無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸水素イオン、リン酸、リン酸一水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸、硫酸水素イオン、ヨウ化水素酸、亜リン酸及びその組み合わせから選ばれ、有機酸は、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、（Ｅ）－２－ブテン二酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸及びその組み合わせから選ばれる。
【0048】
本開示の第４態様として、本開示の第１態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、本開示の第２態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲート、又は本開示の第３態様による塩と、薬学的に許容される担体若しくは賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0049】
本開示の第５態様として、Ｂ型肝炎を治療するための薬物の製造における本開示の第１態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、本開示の第２態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲート、又は本開示の第３態様による塩、又は本開示の第４態様による医薬組成物の用途を提供する。
【0050】
本開示の特定の実施形態において、対象のＢ型肝炎を治療するための、本開示の第１態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、本開示の第２態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲート、又は本開示の第３態様による塩、又は本開示の第４態様による医薬組成物を提供する。
【0051】
本開示の第６態様として、本開示の第１態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、本開示の第２態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲート、又は本開示の第３態様による塩、又は本開示の第４態様による医薬組成物を対象に投与するステップを含む対象のＢ型肝炎の治療方法を提供する。
【0052】
本開示の第７態様として、対象のＢ型肝炎を治療するための、本開示の第１態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体、本開示の第２態様による二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲート、又は本開示の第３態様による塩、又は本開示の第４態様による医薬組成物を提供する。
【0053】
本開示の特定の実施形態において、前記Ｂ型肝炎は、疾患の任意の段階であってもよい。例えば、急性Ｂ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、又はＢ型肝炎ウイルスの感染によって引き起こされる肝硬変若しくは肝がんである。特定の実施形態において、前記Ｂ型肝炎は慢性Ｂ型肝炎である。
【0054】
（定義と説明）
特に説明がない限り、本明細書で使用する下記の用語及び表現は次の意味を有する。特定の用語又は表現は、特に定義がなければ、確定しないもの又は不明瞭なものとしてではなく、当業者の理解している通常の意味を有する。本明細書で商品名が記載された場合、対応する商品又はその有効成分を指す。
特に説明がない限り、本明細書で使用する下記の用語及び表現は次の意味を有する。特定の用語又は表現は、特に定義がなければ、確定しないもの又は不明瞭なものとしてではなく、当業者の理解している通常の意味を有する。本明細書で商品名が記載された場合、対応する商品又はその有効成分を指す。
【0055】
本開示において、特に説明がない限り、用語「含む、含有する」又は同等な用語は開放的な表現であり、列挙された要素、成分又はステップの他に、明記していない他の要素、成分又はステップを含んでもよいということを意味する。
【0056】
本開示において、ＨＢＶ遺伝子とは、ＤＮＡ配列がＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３９７７．１に示されている遺伝子を指す。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３９７７．１に示されている遺伝子は、ＨＢＶの完全なゲノムである。
【0057】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は、ＨＢＶのＸオープン・リーディング・フレーム（Ｘ ｏｐｅｎｉｎｇ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、Ｘ ＯＲＦ）を標的とすることができる。
【0058】
本開示において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体とは、二本鎖構造を有し、逆平行で実質的に相補的な２本のリボヌクレオチド鎖を含むリボ核酸分子の複合体を指し、標的ＲＮＡに対して「センス」及び「アンチセンス」の方向性を有している。本開示において、「相補」は、二本鎖核酸分子で、一方の鎖の塩基が他方の鎖の塩基と相補的に対合するという当業者に周知されている意味を有する。プリン塩基アデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基ウラシル（Ｕ）に対合し、プリン塩基グアニン（Ｃ）は、常にピリミジン塩基シトシン（Ｇ）に対合する。塩基対はいずれも１個のプリンと１個のピリミジンを含む。１本の鎖のアデニンが常に他方の鎖のウラシルに対合し、且つグアニンが常にシトシンに対合している場合に、２本の鎖は互いに相補的であると見なされ、その相補鎖の配列から当該鎖の配列を推定することができる。
【0059】
本開示において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基構成を表す。小文字ｃ、ｇ、ｕ、ａは、それぞれ、対応する大文字によって表されるヌクレオチドがメトキシ基によって修飾されているものを表し、下線は、大文字によって表されるヌクレオチドがフッ素によって修飾されていることを表し、中黒「・」は、中黒「・」と左右に隣接する２個のヌクレオチド残基の間がホスホロチオエート基結合であることを表し、ＶＰは、文字ＶＰの右側の１個のヌクレオチドは（Ｅ）－ビニルホスフェートによって修飾されているヌクレオチドであることを表す。例えば、「ａ・ｇ」は、ａとｇ残基がホスホロチオエート基によって結合されていることを表す。
【0060】
本開示に言うヌクレオチドの「修飾」は、メトキシ修飾、フッ素修飾、（Ｅ）－ビニルホスフェート修飾、ホスホロチオエート基結合又はヌクレオチドの（Ｓ）－グリセロール核酸への置き換えなどを含み、ただしそれらに限定されない。本開示に言う配列は、下記の表１に記載された「さらに修飾されている配列」を含んでもよい。
【0061】
本開示に言うフッ素によって修飾されているヌクレオチドとは、ヌクレオチドのリボシル基の２’位のヒドロキシ基がフッ素によって置換されて形成されたヌクレオチドを指し、前記メトキシ基によって修飾されているヌクレオチドとは、リボシル基の２’－ヒドロキシ基がメトキシ基によって置換されて形成されたヌクレオチドを指す。
【0062】
本開示に言う（Ｅ）－ビニルホスフェートによって修飾されているヌクレオチドは、下記の構造単位を表し、
ここで、Ｅは、
から選ばれ、
Ｘは、ＯＣＨ３及びＦから選ばれる。
【化3】
【化4】
Ｘは、ＯＣＨ３及びＦから選ばれる。
【0063】
本開示に言う（Ｓ）－グリセロール核酸（Ａｇｎ）は、下記の構造単位を表し、
（Ａｇｎ）と他のヌクレオチド残基は、リン酸エステル又はホスホロチオエートによって互いに結合され、例えば、「ａ・（Ａｇｎ）」はａと（Ａｇｎ）残基がホスホロチオエート基によって結合されていることを表し、「ａ（Ａｇｎ）」は、ａと（Ａｇｎ）残基がリン酸エステル基によって結合されていることを表す。
【化5】
【0064】
特定の実施形態において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は、センス鎖又はｒ’が挿入されたセンス鎖とｒ’が挿入されたアンチセンス鎖とを含む。センス鎖、ｒ’が挿入されたセンス鎖及びｒ’が挿入されたアンチセンス鎖は、いずれもヌクレオチド基を基本構造単位として含有している。ヌクレオチド基はリン酸基、リボシル基及び塩基を含有しているということは当業者に周知されているため、ここで更なる説明を省略する。
【0065】
本開示に言うｒ’が挿入された配列とは、ｒに結合されているヌクレオチド残基が少なくとも１個存在する配列を指し、配列（例えば、配列番号２）においてｒで１個のヌクレオチド残基を置き換えた配列を含む。本開示に言うｒ’が挿入された配列は、ｒ’が挿入された二本鎖ｓｉＲＮＡ、ｒ’が挿入されたセンス鎖、ｒ’が挿入されたアンチセンス鎖を含み、ただしそれらに限定されない。例えば、５’－ａＧＵｒｒＡ・Ｃ－３’、５’－ｒＧｇＡＡＣ－３’、５’－ＡＧ・ＵｒＡＡｃＣｕＣｒ－３’はいずれもｒ’が挿入されたものに該当する。
【0066】
本開示に言うｒ’が挿入された二本鎖ｓｉＲＮＡとは、ｒに結合されているヌクレオチド残基が少なくとも１個存在する二本鎖ｓｉＲＮＡを指し、二本鎖ｓｉＲＮＡの配列においてｒで１個のヌクレオチド残基を置き換えた二本鎖ｓｉＲＮＡを含む。本開示に言うｒ’が挿入されたセンス鎖とは、ｒに結合されているヌクレオチド残基が少なくとも１個存在するセンス鎖を指し、センス鎖の１個又は複数のヌクレオチドがｒによって置き換えられるものを含む。本開示に言うｒ’が挿入されたアンチセンス鎖とは、ｒに結合されているヌクレオチド残基が少なくとも１個存在するアンチセンス鎖を指し、アンチセンス鎖の１個又は複数のヌクレオチドがｒによって置き換えられるものを含む。
【0067】
本開示に言うｒ’は、
であり（ここで、Ｘは、ＳＨ及びＯＨから選ばれる）、天然のヌクレオチド塩基の類似体であり、開示されている天然のヌクレオチド塩基のいずれとも違って、核酸配列に導入すると予期もしなかった活性をもたらす。
【化6】
【0068】
本開示に言うｒは、下記の構造単位を表し、
ｒと他のヌクレオチド残基はリン酸エステル又はホスホロチオエートによって互いに結合され、例えば、「ａ・ｒ」は、ａとｒ残基がホスホロチオエート基によって結合されていることを表し、「ａｒ」は、ａとｒ残基がリン酸エステル基によって結合されていることを表す。
【化7】
【0069】
本開示に言う「複数」とは、２以上の整数を指し、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９又は２０個を含み、ただしそれらに限定されない。前記ｓｉＲＮＡ類似体の理論的な上限までである。
【0070】
本開示において、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖又はアンチセンス鎖は、「オーバーハング」を含んでもよく、例えば、ＲＮＡ二重らせん構造に直接関与しない、対合せずはみ出しているヌクレオチドであり、ＲＮＡ二重らせん構造は一般に本明細書で定義されている「センス鎖」と「アンチセンス鎖」の対から形成されている。そのようなオーバーハングは、修飾されている又は修飾されていないＵ、Ｔ及びＡを１個又は複数含んでもよい。例えば、前記配列番号２は、５’及び／又は３’末端に修飾されている又は修飾されていないＵＵオーバーハングを含んでもよい。
【0071】
本開示において、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートは、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体と薬学的に許容されるコンジュゲート基が結合して形成された化合物であり、なおかつ二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体は薬学的に許容されるコンジュゲート基に共有結合されている。
【0072】
本開示において、薬学的に許容されるコンジュゲート基は二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のセンス鎖又はｒ’が挿入されたセンス鎖の３’末端に結合されてもよい。
【0073】
一般に、薬学的に許容されるコンジュゲート基は、薬学的に許容される標的化分子と、任意にリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む。例示的なコンジュゲート基、リンカー、標的化分子の種類は、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２の開示を参照することができる。例示的なコンジュゲート基は、Ｌ９６又は化合物基Ｄを含み、ただしそれらに限定されない。
【0074】
本開示の文脈では、特に説明がない限り、「コンジュゲートする」とは、それぞれ特定の機能を有する２個又は複数の化学的成分が共有結合によって互いに結合されていることを指し、さらに、「コンジュゲート」とは、当該各化学的成分が共有結合によって形成された化合物を指す。
【0075】
本開示に係る化合物には特定の幾何異性体又は立体異性体の形態が存在してもよい。本開示に係るこの種の化合物は、（Ｒ）－及び（Ｓ）－エナンチオマー、ジアステレオマー及びそのラセミ混合物、並びにその他の混合物であって、例えば、エナンチオマー又はジアステレオマーを大量に含有する混合物を含み、それらの混合物が全て本開示の範囲に含まれている。アルキル基などの置換基には他の不斉炭素原子が存在してもよい。それらの異性体及びそれらの混合物は、いずれも本開示の範囲に含まれる。
【0076】
特に説明がない限り、用語「エナンチオマー」又は「光学異性体」とは、互いに鏡像の関係である立体異性体を指す。
【0077】
特に説明がない限り、用語「ジアステレオマー」とは、２つ又はそれ以上のキラル中心を有する分子であって、分子同士が互いに非鏡像の関係である立体異性体を指す。
【0078】
特に説明がない限り、くさび形の実線結合
及びくさび形の破線結合
でキラル中心の絶対配置を表し、直線形の実線結合
及び直線形の破線結合
でキラル中心の相対配置を表し、波線
でくさび形の実線結合
若しくはくさび形の破線結合
を表し、又は波線
で直線形の実線結合
及び／若しくは直線形の破線結合
を表す。
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
【0079】
特に説明がない限り、用語「１種の異性体を大量に含有する」、「異性体の大量含有」、「１種のエナンチオマーを大量に含有する」又は「エナンチオマーの大量含有」とは、特定の１種の異性体又はエナンチオマーの含有量が６０％以上、又は７０％以上、又は８０％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上、又は９９．５％以上、又は９９．６％以上、又は９９．７％以上、又は９９．８％以上、又は９９．９％以上で、且つ１００％未満であることを指す。
【0080】
特に説明がない限り、用語「異性体過剰」又は「エナンチオマー過剰」とは、２種の異性体又は２種のエナンチオマーの相対パーセント含有量の差を指す。例えば、一方の異性体又はエナンチオマーの含有量が９０％で、他方の異性体又はエナンチオマーの含有量が１０％である場合に、異性体又はエナンチオマー過剰（ｅｅ値）は８０％である。
【0081】
不斉合成、不斉試薬又はその他の通常の技術で、光学活性を有する（Ｒ）－異性体と（Ｓ）－異性体、及びＤ異性体とＬ異性体を製造することができる。本開示に係る特定の化合物のエナンチオマーを得るためには、不斉合成又は不斉助剤での誘導合成を利用できる。ジアステレオマー混合物を分離させ、且つ補助的な基を脱去させることで所望の純粋なエナンチオマーを得る。又は、分子に塩基性官能基（例えば、アミノ基）又は酸性官能基（例えば、カルボキシ基）が含まれた場合に、光学活性を有する適切な酸又は塩基とジアステレオマーの塩を形成させた後、本分野で周知される通常の方法でジアステレオマーを分割し、その後、回収して純粋なエナンチオマーを得る。また、エナンチオマーとジアステレオマーの分離は一般にクロマトグラフィーによって実行され、クロマトグラフィーではキラルな固定相が用いられ、任意に化学的誘導法と組み合わせる（例えば、アミンからのカルバメート生成）。本開示に係る化合物は当該化合物を構成する１個又は複数の原子に非天然的な割合で同原子の同位体が含まれてもよい。例えば、化合物は三重水素（３Ｈ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）又は炭素－１４（１４Ｃ）などの放射能同位体で標識されてもよい。又は、重水素で水素を置換して重水素化薬物を生成させてもよく、重水素と炭素の結合が水素と炭素からなる通常の結合よりも堅牢で、非重水素化薬物と比べて、重水素化薬物は毒性と副作用が軽減され、薬物安定性と治療効果が改善され、薬物の生物学的半減期が延長されるなどの利点を有する。本開示に係る化合物の同位体を含むバリアントは、放射性があるかどうかに関らず、いずれも本開示の範囲に含まれる。
【0082】
用語「塩」とは、本開示に係る特定の置換基を有する化合物と相対的に毒性のない酸又は塩基から製造される本開示に係る化合物の塩である。本開示に係る化合物に相対的に酸性を示す官能基が含まれる場合に、不純物を含まない溶液又は適切な不活性溶媒において十分な量の塩基を当該化合物に接触させることで塩基付加塩を得る。薬学的に許容される塩基付加塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミン塩、マグネシウム塩又は類似する塩を含む。本開示に係る化合物に相対的に塩基性を示す官能基が含まれる場合に、不純物を含まない溶液又は適切な不活性溶媒において十分な量の酸を当該化合物に接触させることで酸付加塩を得る。薬学的に許容される酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸水素イオン、リン酸、リン酸一水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸、硫酸水素イオン、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無機酸の塩、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、（Ｅ）－２－ブテン二酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの有機酸の塩、アルギニンなどのアミノ酸の塩、及びグルクロン酸などの有機酸の塩を含む。本開示に係る一部の特定の化合物は塩基性又は酸性の官能基を含んでいるため、任意の塩基付加塩又は酸付加塩への変換が可能である。
【0083】
本開示に係る塩は、酸基又は塩基を含有している母体化合物から通常の化学的方法で合成できる。一般に、そのような塩は水、有機溶媒又は両者の混合物において、それらの化合物の遊離酸又は遊離塩基の形態と化学量論的に適切な塩基又は酸を反応させることによって製造する。
【0084】
本開示に係る化合物は、下記で挙げる特定の実施形態、他の化学的合成方法と組み合わせた実施形態及び当業者の熟知する均等な代替の形態を含み、好ましい実施形態は本開示の実施例を含み、ただしそれらに限定されない当業者の熟知する様々な合成方法で製造することができる。
【0085】
本開示で使用する溶媒は市販品であってもよい。
【0086】
特に説明がない限り、本開示において、カラムクロマトグラフィー、分取薄層シリカゲルクロマトグラフィーで使用する溶媒の比率はいずれも体積比である。
【0087】
【表D】
【0088】
化合物は、本分野の通常の命名規則に基づいて、又はソフトウェアＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）を用いて命名され、市販化合物はメーカーのカタログに記載の名称を使用する。
【図面の簡単な説明】
【0089】
【発明を実施するための形態】
【0090】
以下、実施例を用いて本開示を詳細に説明し、ただし、本開示に何らかの限定を加えることにはならない。本開示に係る化合物は、下記で挙げる特定の実施形態、他の化学的合成方法と組み合わせた実施形態及び当業者の熟知する均等な代替の形態を含み、好ましい実施形態は本開示の実施例を含み、ただしそれらに限定されない当業者の熟知する様々な合成方法で製造することができる。本開示の趣旨と範囲を逸脱することなく本開示の特定の実施形態に様々な変形や改善を行うことができ、これは当業者にとって自明である。
【実施例】
【0091】
〔実施例１：ホスホロアミダイトモノマーの合成〕
【化18】
【0092】
ステップＡ：（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３－アセチルアミノ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２，４，５－メチン三酢酸塩（式１－１）（３０ｇ、９４．２６ｍｍｏｌ）及び１，２，４－トリアゾール－３－カルボン酸メチル（１１．９８ｇ、９４．２６ｍｍｏｌ）を酢酸メチル（２２０ｍＬ）の溶液に溶解し、９０℃油浴中、圧力１ｂａｒでほぼ完全に乾燥するまで濃縮した。トリフルオロメタンスルホン酸（１４１．４６ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）の酢酸メチル溶液（２ｍＬ）を混合液に加え、圧力３０ｍｂａｒで、１２５℃油浴中で４時間撹拌した。反応液を７０℃に冷却し、エタノール（７０ｍＬ）を加えて、７０℃で撹拌し、均一な溶液を得たら、撹拌を停止して５０℃に冷却した。沈殿物が生成した後、静置して２５℃に冷却し、反応液を０℃で１６時間静置した。反応液をブフナー漏斗で濾過し、フィルターケーキを１８０ｍＬのエタノール（６０ｍＬ×３）で溶出し、真空乾燥して式１－２を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．４０（ｓ，１Ｈ），６．０４（ｄ，Ｊ＝３．４２Ｈｚ，１Ｈ），５．６９－５．８１（ｍ，１Ｈ），５．５４（ｔ，Ｊ＝５．３８Ｈｚ，１Ｈ），４．４２－４．５１（ｍ，２Ｈ），４．１６－４．３０（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），２．０５－２．１８（ｍ，９Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．４０（ｓ，１Ｈ），６．０４（ｄ，Ｊ＝３．４２Ｈｚ，１Ｈ），５．６９－５．８１（ｍ，１Ｈ），５．５４（ｔ，Ｊ＝５．３８Ｈｚ，１Ｈ），４．４２－４．５１（ｍ，２Ｈ），４．１６－４．３０（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），２．０５－２．１８（ｍ，９Ｈ）。
【0093】
ステップＢ：式１－２（１５ｇ、３８．９３ｍｍｏｌ）に示される化合物及びトリエチルアミン（４．１４ｇ、４０．８７ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）に溶解した。混合液を窒素保護下、５０℃で１７時間撹拌した。反応液を減圧濃縮して式１－３を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ８．８７（ｓ，１Ｈ），５．９３（ｄ，Ｊ＝３．４２Ｈｚ，１Ｈ），４．４８（ｄｄ，Ｊ＝３．４８，４．８３Ｈｚ，１Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝５．２６Ｈｚ，１Ｈ），４．１０－４．１６（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｄｄ，Ｊ＝３．２４，１２．２９Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｄｄ，Ｊ＝４．４６，１２．２９Ｈｚ，１Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ８．８７（ｓ，１Ｈ），５．９３（ｄ，Ｊ＝３．４２Ｈｚ，１Ｈ），４．４８（ｄｄ，Ｊ＝３．４８，４．８３Ｈｚ，１Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝５．２６Ｈｚ，１Ｈ），４．１０－４．１６（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｄｄ，Ｊ＝３．２４，１２．２９Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｄｄ，Ｊ＝４．４６，１２．２９Ｈｚ，１Ｈ）。
【0094】
ステップＣ：式１－３（１０ｇ、３８．５８ｍｍｏｌ）に示される化合物をピリジン（２５０ｍＬ）に溶解し、０℃で１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサン（１２．２９ｇ、３８．９７ｍｍｏｌ）を滴加した。混合液を徐々に２５℃に上げて１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、濃縮物を酢酸エチル（２５０ｍＬ）に懸濁して、ブフナー漏斗で濾過した。濾液を３Ｍ 塩酸７５０ｍＬ（２５０ｍＬ×３）及び飽和食塩水２５０ｍＬ（２５０ｍＬ×１）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、石油エーテル：ジクロロメタン：酢酸エチル＝３：１：１）で精製して式１－４を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．４３（ｓ，１Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ），４．７３（ｄｄ，Ｊ＝４．７５，８．００Ｈｚ，１Ｈ），４．４１（ｄ，Ｊ＝４．７５Ｈｚ，１Ｈ），４．０９－４．１９（ｍ，２Ｈ），３．９４－４．０３（ｍ，４Ｈ），２．７１－３．３４（ｍ，１Ｈ），１．０１－１．１５（ｍ，２８Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．４３（ｓ，１Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ），４．７３（ｄｄ，Ｊ＝４．７５，８．００Ｈｚ，１Ｈ），４．４１（ｄ，Ｊ＝４．７５Ｈｚ，１Ｈ），４．０９－４．１９（ｍ，２Ｈ），３．９４－４．０３（ｍ，４Ｈ），２．７１－３．３４（ｍ，１Ｈ），１．０１－１．１５（ｍ，２８Ｈ）。
【0095】
ステップＤ：式１－４（８．２３ｇ、１６．４０ｍｍｏｌ）に示される化合物、炭酸カリウム（１１．３４ｇ、８２．０２ｍｍｏｌ）及び酸化銀（Ｉ）（１９．０１ｇ、８２．０２ｍｍｏｌ）を含有しているＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）の混合液にヨードメタン（１１．６４ｇ、８２．０２ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈して、ブフナー漏斗で濾過した。濾液をチオ硫酸ナトリウムの水溶液２５０ｍＬ（２５０ｍＬ×１）、水２５０ｍＬ（２５０ｍＬ×１）及び飽和食塩水２５０ｍＬ（２５０ｍＬ×１）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、石油エーテル：酢酸エチル＝５：１）で精製して式１－５を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．５８（ｓ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），４．４６（ｄｄ，Ｊ＝４．２２，９．３５Ｈｚ，１Ｈ），４．１７－４．２８（ｍ，２Ｈ），３．９６－４．０６（ｍ，５Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），０．９９－１．１３（ｍ，２８Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．５８（ｓ，１Ｈ），５．９１（ｓ，１Ｈ），４．４６（ｄｄ，Ｊ＝４．２２，９．３５Ｈｚ，１Ｈ），４．１７－４．２８（ｍ，２Ｈ），３．９６－４．０６（ｍ，５Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），０．９９－１．１３（ｍ，２８Ｈ）。
【0096】
ステップＥ：０℃で、式１－５（３．２７ｇ、６．３４ｍｍｏｌ）に示される化合物のテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（２．２５ｇ、１３．９５ｍｍｏｌ）を滴加し、混合液を徐々に２５℃に上げて１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）で精製して式１－６を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ８．８８（ｓ，１Ｈ），６．０４（ｄ，Ｊ＝３．２６Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｔ，Ｊ＝５．３３Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄｄ，Ｊ＝３．３３，４．８３Ｈｚ，１Ｈ），４．０７－４．１４（ｍ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｄｄ，Ｊ＝３．２０，１２．３６Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｄｄ，Ｊ＝４．３９，１２．３０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｓ，３Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ８．８８（ｓ，１Ｈ），６．０４（ｄ，Ｊ＝３．２６Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｔ，Ｊ＝５．３３Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄｄ，Ｊ＝３．３３，４．８３Ｈｚ，１Ｈ），４．０７－４．１４（ｍ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｄｄ，Ｊ＝３．２０，１２．３６Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｄｄ，Ｊ＝４．３９，１２．３０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｓ，３Ｈ）。
【0097】
ステップＦ：０℃で、式１－６（１．３０ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）に示される化合物のピリジン（２０ｍＬ）溶液に４，４－ジメトキシトリチルクロリド（２．４２ｇ、７．１４ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１６時間撹拌した。反応液を酢酸エチル（７０ｍＬ）で希釈した後、２５℃で飽和炭酸水素ナトリウムの水溶液（２０ｍＬ）でクエンチして水（４０ｍＬ）で希釈した。分液した後、合わせた有機相を水６０ｍＬ（６０ｍＬ×１）及び飽和食塩水６０ｍＬ（６０ｍＬ×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後、減圧濃縮して粗生成物を得た。ｐ－ＨＰＬＣ（分離カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｌｕｎａ Ｃ１８（仕様：２５０ｍｍ×５０ｍｍ、粒径：１０μｍ）、移動相：［水（１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム）－アセトニトリル］、溶離勾配：３５％－６５％、２０分）で精製して式１－７を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．４４（ｓ，１Ｈ），７．３８－７．４５（ｍ，２Ｈ），７．２８－７．３４（ｍ，５Ｈ），７．１８－７．２７（ｍ，２Ｈ），６．７０－６．９２（ｍ，４Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝２．８８Ｈｚ，１Ｈ），４．３７－４．４３（ｍ，１Ｈ），４．３３（ｄｄ，Ｊ＝２．８８，５．００Ｈｚ，１Ｈ），４．１９－４．２５（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．５８（ｓ，３Ｈ），３．４３－３．４９（ｍ，１Ｈ），３．３３－３．４０（ｍ，１Ｈ），２．５５（ｄ，Ｊ＝６．８８Ｈｚ，１Ｈ）。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５７４．２［Ｍ－Ｈ］－。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ８．４４（ｓ，１Ｈ），７．３８－７．４５（ｍ，２Ｈ），７．２８－７．３４（ｍ，５Ｈ），７．１８－７．２７（ｍ，２Ｈ），６．７０－６．９２（ｍ，４Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝２．８８Ｈｚ，１Ｈ），４．３７－４．４３（ｍ，１Ｈ），４．３３（ｄｄ，Ｊ＝２．８８，５．００Ｈｚ，１Ｈ），４．１９－４．２５（ｍ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．５８（ｓ，３Ｈ），３．４３－３．４９（ｍ，１Ｈ），３．３３－３．４０（ｍ，１Ｈ），２．５５（ｄ，Ｊ＝６．８８Ｈｚ，１Ｈ）。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５７４．２［Ｍ－Ｈ］－。
【0098】
ステップＧ：０℃で、式１－７（１．１０ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）に示される化合物のジクロロメタン（８ｍＬ）溶液にＮ，Ｎ－ジイソプロピルアミドクロリド亜リン酸２－シアノエチル（６７８．４５ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを加え、２０℃で３０分間撹拌した。反応液を減圧濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、石油エーテル：酢酸エチル＝５０：１～１：２）で精製して式１化合物を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７７６．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７７６．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0099】
〔実施例２：Ｄ０１の合成〕
【化19】
【0100】
ステップＡ：１１－ドデイン－１－オール（２５ｇ、１３７．１４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１６．６５ｇ、１６４．５６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２５０ｍＬ）に溶解し、０℃でメタンスルホニルクロリド（１８．８５ｇ、１６４．５６ｍｍｏｌ）を加えた。混合液を０℃で２時間撹拌した。反応液を水（４００ｍＬ）で希釈して、ジクロロメタン８００ｍＬ（４００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機相を水４００ｍＬ（２００ｍＬ×２）及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後、減圧濃縮して式２－２を得た。
【0101】
ステップＢ：式２－３（２０ｇ、６７．２６ｍｍｏｌ）に示される化合物をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）に溶解し、０℃で水素化ナトリウム（純度６０％、４．０４ｇ、１００．８９ｍｍｏｌ）を加え、続いて式２－２（１９．２７ｇ、７３．９９ｍｍｏｌ）に示される化合物を加えた。混合液を２５℃で１６時間撹拌した。反応液を水（１Ｌ）でクエンチして、ジクロロメタン１．６Ｌ（８００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水８００ｍＬ（８００ｍＬ×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後、減圧濃縮して式２－４を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．６３－６．８９（ｍ，１０Ｈ），５．６４－５．５２（ｍ，２Ｈ），４．２７－４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９８－３．７７（ｍ，２Ｈ），３．７２－３．１８（ｍ，４Ｈ），２．２３－２．１４（ｍ，２Ｈ），１．９８－１．９２（ｍ，１Ｈ），１．５４－１．２３（ｍ，１６Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．６３－６．８９（ｍ，１０Ｈ），５．６４－５．５２（ｍ，２Ｈ），４．２７－４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９８－３．７７（ｍ，２Ｈ），３．７２－３．１８（ｍ，４Ｈ），２．２３－２．１４（ｍ，２Ｈ），１．９８－１．９２（ｍ，１Ｈ），１．５４－１．２３（ｍ，１６Ｈ）。
【0102】
ステップＣ：式２－４（４８ｇ、１０３．９８ｍｍｏｌ）に示される化合物をメタノール（８７０ｍＬ）に溶解し、塩化水素－メタノール溶液（４ｍｏｌ／Ｌ、４００ｍＬ、１．６ｍｏｌ）を加えた。混合液を３０℃で２時間撹拌した。反応液に塩化水素－メタノール溶液（４ｍｏｌ／Ｌ、３５０ｍＬ、１．４ｍｏｌ）を加えた。混合液を３０℃で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、クロロホルム２００ｍＬ（１００ｍＬ×２）を加え、白い固体が現れるまで減圧濃縮した。トルエン（１３０ｍＬ）及び石油エーテル（１３０ｍＬ）を加え、混合液を１５℃で１６時間撹拌した。反応液をブフナー漏斗で濾過し、フィルターケーキを回収して真空乾燥して白い固体を得た。白い固体をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、水酸化ナトリウム（６．５９ｇ、１６４．６６ｍｍｏｌ）の水溶液（５０ｍＬ）を加え、２０℃で１時間撹拌した。反応液を水（５００ｍＬ）で希釈して、ジクロロメタン１Ｌ（５００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮して式２－５を得た。
【0103】
ステップＤ：式２－５（２３ｇ、８０．５８ｍｍｏｌ）に示される化合物及び水酸化ナトリウム（３２２．３１ｍｇ、８．０６ｍｍｏｌ）のあるジメチルスルホキシド（７０ｍＬ）と水（６ｍＬ）の混合液にアクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（２２．７２ｇ、１７７．２８ｍｍｏｌ）を加え、窒素保護下、２５℃で１６時間撹拌した。反応液を水（５００ｍＬ）で希釈して、酢酸エチル１Ｌ（５００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、石油エーテル：酢酸エチル：エタノール（水酸化アンモニウムを０．１％含んでいる）＝３６：３：１～１６：３：１）で精製して式２－６を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ３．６０－３．５４（ｍ，４Ｈ），３．３２（ｂｒ ｓ，５Ｈ），３．１５（ｓ，５Ｈ），２．７４－２．６６（ｍ，１Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ），２．１８－２．１１（ｍ，２Ｈ），１．５８－１．３８（ｍ，２２Ｈ），１．３４－１．２３（ｍ，１２Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ３．６０－３．５４（ｍ，４Ｈ），３．３２（ｂｒ ｓ，５Ｈ），３．１５（ｓ，５Ｈ），２．７４－２．６６（ｍ，１Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ），２．１８－２．１１（ｍ，２Ｈ），１．５８－１．３８（ｍ，２２Ｈ），１．３４－１．２３（ｍ，１２Ｈ）。
【0104】
ステップＥ：式２－６（２４．５ｇ、４５．２２ｍｍｏｌ）に示される化合物のジクロロメタン（２５０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（９．１５ｇ、９０．４５ｍｍｏｌ）及び無水コハク酸（６．７９ｇ、６７．８３ｍｍｏｌ）を加え、２０℃で１６時間撹拌した。反応液にジクロロメタン（１Ｌ）及び塩酸（１ｍｏｌ／Ｌ、１Ｌ）を加え、分液した有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後、減圧濃縮して式２－７を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ６．４９－６．３７（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｓ，２Ｈ），３．７０－３．５７（ｍ，８Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．６９－２．５１（ｍ，４Ｈ），２．５０－２．３６（ｍ，４Ｈ），２．２２－２．１３（ｍ，２Ｈ），１．９６－１．９０（ｍ，１Ｈ），１．５７－１．４７（ｍ，４Ｈ），１．４６－１．４０（ｍ，１８Ｈ），１．４０－１．３１（ｍ，２Ｈ），１．３０－１．２１（ｍ，１０Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ６．４９－６．３７（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｓ，２Ｈ），３．７０－３．５７（ｍ，８Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．６９－２．５１（ｍ，４Ｈ），２．５０－２．３６（ｍ，４Ｈ），２．２２－２．１３（ｍ，２Ｈ），１．９６－１．９０（ｍ，１Ｈ），１．５７－１．４７（ｍ，４Ｈ），１．４６－１．４０（ｍ，１８Ｈ），１．４０－１．３１（ｍ，２Ｈ），１．３０－１．２１（ｍ，１０Ｈ）。
【0105】
ステップＦ：式２－７（２７．４ｇ、４２．６９ｍｍｏｌ）に示される化合物をギ酸（１４０ｍＬ）に溶解し、混合液を窒素保護下、２０℃で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエン３００ｍＬ（１５０ｍＬ×２）を加えて、減圧濃縮して式２－８を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ９．７９－９．２２（ｍ，３Ｈ），６．４４－６．２３（ｍ，１Ｈ），３．８８－３．４３（ｍ，１０Ｈ），３．３９－３．２０（ｍ，２Ｈ），２．７７－２．３１（ｍ，８Ｈ），２．１５－２．０６（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），１．４８－１．２８（ｍ，６Ｈ），１．２６－１．１２（ｍ，１０Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ９．７９－９．２２（ｍ，３Ｈ），６．４４－６．２３（ｍ，１Ｈ），３．８８－３．４３（ｍ，１０Ｈ），３．３９－３．２０（ｍ，２Ｈ），２．７７－２．３１（ｍ，８Ｈ），２．１５－２．０６（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），１．４８－１．２８（ｍ，６Ｈ），１．２６－１．１２（ｍ，１０Ｈ）。
【0106】
ステップＧ：式２－８（２２．６ｇ、４２．６７ｍｍｏｌ）に示される化合物、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３３．０９ｇ、２５６．０３ｍｍｏｌ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（５１．９２ｇ、１３６．５５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２５０ｍＬ）に溶解し、Ｎ－（３－アミノプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２９．７４ｇ、１７０．６９ｍｍｏｌ）を加えた。混合液を２０℃で１６時間撹拌した。反応液にジクロロメタン（１Ｌ）及び塩酸（１ｍｏｌ／Ｌ、１Ｌ）を加え、分液した有機相を水１Ｌ（１Ｌ×１）、炭酸水素ナトリウム水溶液１Ｌ（１Ｌ×１）、次に飽和食塩水１Ｌ（１Ｌ×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過した後、減圧濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、石油エーテル：酢酸エチル：エタノール＝４０：３：１～１０：３：１）で精製した式２－９を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ７．２２－６．７９（ｍ，３Ｈ），６．７７－６．４４（ｍ，１Ｈ），５．４５－５．００（ｍ，３Ｈ），３．８６－３．７３（ｍ，２Ｈ），３．７２－３．６３（ｍ，４Ｈ），３．６２－３．４５（ｍ，４Ｈ），３．４１－３．３２（ｍ，２Ｈ），３．３２－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１９－３．０３（ｍ，６Ｈ），２．５６－２．４７（ｍ，４Ｈ），２．４７－２．３９（ｍ，４Ｈ），２．２１－２．１２（ｍ，２Ｈ），１．９５－１．９０（ｍ，１Ｈ），１．７０－１．５７（ｍ，６Ｈ），１．５６－１．４７（ｍ，４Ｈ），１．４６－１．３８（ｍ，２９Ｈ），１．３０－１．２５（ｍ，１０Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ７．２２－６．７９（ｍ，３Ｈ），６．７７－６．４４（ｍ，１Ｈ），５．４５－５．００（ｍ，３Ｈ），３．８６－３．７３（ｍ，２Ｈ），３．７２－３．６３（ｍ，４Ｈ），３．６２－３．４５（ｍ，４Ｈ），３．４１－３．３２（ｍ，２Ｈ），３．３２－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１９－３．０３（ｍ，６Ｈ），２．５６－２．４７（ｍ，４Ｈ），２．４７－２．３９（ｍ，４Ｈ），２．２１－２．１２（ｍ，２Ｈ），１．９５－１．９０（ｍ，１Ｈ），１．７０－１．５７（ｍ，６Ｈ），１．５６－１．４７（ｍ，４Ｈ），１．４６－１．３８（ｍ，２９Ｈ），１．３０－１．２５（ｍ，１０Ｈ）。
【0107】
ステップＨ：式２－９（１５ｇ、１５．０３ｍｍｏｌ）に示される化合物をジクロロメタン（１１４ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（３８ｍＬ）を加えて、混合液を２０℃で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエン：アセトニトリル＝３：１混合液６００ｍＬ（２５０ｍＬ×３）を加えて減圧濃縮して式２－１０（トリ（トリフルオロ酢酸塩））を得た。
【0108】
ステップＩ：式２－１１（２２．１５ｇ、４９．５０ｍｍｏｌ）に示される化合物、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７．７５ｇ、６０．００ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（６．１２ｇ、４５．００ｍｍｏｌ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（２０．５３ｇ、５４．００ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（９０ｍＬ）に溶解し、当該混合液に式２－１０に示される化合物（トリ（トリフルオロ酢酸塩）、１５．６ｇ、１５．００ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２１．３２ｇ、１６５．００ｍｍｏｌ）のあるＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１２０ｍＬ）溶液を加えた。混合液を２０℃で１６時間撹拌した。反応液にジクロロメタン（１．２Ｌ）及び塩酸（１ｍｏｌ／Ｌ、１Ｌ）を加え、分液した有機相を水１Ｌ（１Ｌ×１）、炭酸水素ナトリウム水溶液１Ｌ（１Ｌ×１）、次に飽和食塩水１Ｌ（１Ｌ×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１～１０：１－ジクロロメタン：エタノール＝１：１）で精製して式２－１２を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．８７－７．６６（ｍ，９Ｈ），７．０９（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，３Ｈ），４．９６（ｄｄ，Ｊ＝３．４，１１．３Ｈｚ，３Ｈ），４．４８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，３Ｈ），４．０６－３．９８（ｍ，９Ｈ），３．９１－３．８２（ｍ，３Ｈ），３．７４－３．６６（ｍ，３Ｈ），３．５８－３．４６（ｍ，１２Ｈ），３．３１（ｂｒ ｓ，３Ｈ），３．０７－２．９８（ｍ，１２Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），２．３３－２．２２（ｍ，８Ｈ），２．１６－２．１２（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｓ，９Ｈ），２．０４（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），１．９９（ｓ，９Ｈ），１．８９（ｓ，９Ｈ），１．８１－１．７４（ｍ，９Ｈ），１．５４－１．３９（ｍ，２２Ｈ），１．３２（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝４．５，６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．２４（ｓ，１０Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．８７－７．６６（ｍ，９Ｈ），７．０９（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，３Ｈ），４．９６（ｄｄ，Ｊ＝３．４，１１．３Ｈｚ，３Ｈ），４．４８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，３Ｈ），４．０６－３．９８（ｍ，９Ｈ），３．９１－３．８２（ｍ，３Ｈ），３．７４－３．６６（ｍ，３Ｈ），３．５８－３．４６（ｍ，１２Ｈ），３．３１（ｂｒ ｓ，３Ｈ），３．０７－２．９８（ｍ，１２Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），２．３３－２．２２（ｍ，８Ｈ），２．１６－２．１２（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｓ，９Ｈ），２．０４（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ），１．９９（ｓ，９Ｈ），１．８９（ｓ，９Ｈ），１．８１－１．７４（ｍ，９Ｈ），１．５４－１．３９（ｍ，２２Ｈ），１．３２（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝４．５，６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．２４（ｓ，１０Ｈ）。
【0109】
ステップＪ：式２－１２（１．００ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）に示される化合物及びＮ－メチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ－ｎ－オクチルアンモニウムクロリド（２０．３５ｍｇ、５０．３５μｍｏｌ）を酢酸（２．７ｍＬ）とｎ－ペンタン（６．３ｍＬ）の混合液に溶解し、０℃で当該混合液に過マンガン酸カリウム（０．４０ｇ、２．５２ｍｍｏｌ）の水（９ｍＬ）溶液を滴加した。混合液を０～１５℃で２時間撹拌した。亜硫酸水素ナトリウム（１．２７ｇ）で反応をクエンチして、塩酸（２ｍｏｌ／Ｌ、５ｍＬ）及び水（３０ｍＬ）を加え、クロロホルム：イソプロパノール＝３：１混合液１２０ｍＬ（４０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮して、トルエン：アセトニトリル＝１：１混合液１８０ｍＬ（３０ｍＬ×６）を加え、減圧濃縮して式２－１３を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ５．３４（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，３Ｈ），５．０６（ｄｄ，Ｊ＝３．３，１１．２Ｈｚ，３Ｈ），４．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ），４．１９－４．０６（ｍ，９Ｈ），４．０４－３．９８（ｍ，３Ｈ），３．８７（ｔｄ，Ｊ＝５．７，９．９Ｈｚ，４Ｈ），３．７２－３．６４（ｍ，９Ｈ），３．５７－３．５０（ｍ，３Ｈ），３．３９（ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．２２（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１２Ｈ），２．５１－２．４０（ｍ，９Ｈ），２．２１（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ），２．１４（ｓ，９Ｈ），２．０３（ｓ，９Ｈ），１．９４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１８Ｈ），１．７２－１．５７（ｍ，２２Ｈ），１．３９（ｂｒ ｓ，１２Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ５．３４（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，３Ｈ），５．０６（ｄｄ，Ｊ＝３．３，１１．２Ｈｚ，３Ｈ），４．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ），４．１９－４．０６（ｍ，９Ｈ），４．０４－３．９８（ｍ，３Ｈ），３．８７（ｔｄ，Ｊ＝５．７，９．９Ｈｚ，４Ｈ），３．７２－３．６４（ｍ，９Ｈ），３．５７－３．５０（ｍ，３Ｈ），３．３９（ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．２２（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１２Ｈ），２．５１－２．４０（ｍ，９Ｈ），２．２１（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ），２．１４（ｓ，９Ｈ），２．０３（ｓ，９Ｈ），１．９４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１８Ｈ），１．７２－１．５７（ｍ，２２Ｈ），１．３９（ｂｒ ｓ，１２Ｈ）。
【0110】
ステップＫ：式２－１３（１．００ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）に示される化合物のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）溶液にＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．２６ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）及びＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（０．２３ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。混合液を撹拌した後、式２－１４（０．２３ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）に示される化合物を加えた。混合液を１５℃で１６時間撹拌した。反応液にジクロロメタン（５０ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）を加え、分液した有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５０ｍＬ（５０ｍＬ×１）、水５０ｍＬ（５０ｍＬ×１）、次に飽和食塩水５０ｍＬ（５０ｍＬ×１）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ジクロロメタン：メタノール（トリエチルアミンを０．１％含んでいる）＝２０：１～１０：１）で精製して式２－１５を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．９０－７．８２（ｍ，６Ｈ），７．７８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，３Ｈ），７．４０－７．２６（ｍ，１０Ｈ），６．９１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝３．１，９．０Ｈｚ，４Ｈ），５．２６（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，３Ｈ），５．０３－４．９９（ｍ，３Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ），４．４３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２３－４．１４（ｍ，１Ｈ），４．１２－４．０２（ｍ，９Ｈ），３．９２（ｔｄ，Ｊ＝９．０，１１．０Ｈｚ，３Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．７７－３．７１（ｍ，３Ｈ），３．６６－３．５１（ｍ，１３Ｈ），３．４９－３．４１（ｍ，４Ｈ），３．１１－３．０１（ｍ，１６Ｈ），２．３８－２．３７（ｍ，１Ｈ），２．３２（ｂｒ ｓ，９Ｈ），２．１４（ｓ，９Ｈ），２．０８（ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，７Ｈ），２．０４（ｓ，９Ｈ），１．９３（ｓ，９Ｈ），１．８２（ｓ，９Ｈ），１．５７－１．４６（ｍ，２２Ｈ），１．３１－１．２６（ｍ，１２Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．９０－７．８２（ｍ，６Ｈ），７．７８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，３Ｈ），７．４０－７．２６（ｍ，１０Ｈ），６．９１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝３．１，９．０Ｈｚ，４Ｈ），５．２６（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，３Ｈ），５．０３－４．９９（ｍ，３Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ），４．４３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２３－４．１４（ｍ，１Ｈ），４．１２－４．０２（ｍ，９Ｈ），３．９２（ｔｄ，Ｊ＝９．０，１１．０Ｈｚ，３Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．７７－３．７１（ｍ，３Ｈ），３．６６－３．５１（ｍ，１３Ｈ），３．４９－３．４１（ｍ，４Ｈ），３．１１－３．０１（ｍ，１６Ｈ），２．３８－２．３７（ｍ，１Ｈ），２．３２（ｂｒ ｓ，９Ｈ），２．１４（ｓ，９Ｈ），２．０８（ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，７Ｈ），２．０４（ｓ，９Ｈ），１．９３（ｓ，９Ｈ），１．８２（ｓ，９Ｈ），１．５７－１．４６（ｍ，２２Ｈ），１．３１－１．２６（ｍ，１２Ｈ）。
【0111】
ステップＬ：式２－１５（０．８０ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）に示される化合物のジクロロメタン（８ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（６７．２４ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．１２ｇ、１．００ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（８３．１３ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）をこの順に加えた。混合液を１０℃で１６時間撹拌した。反応液にジクロロメタン（５０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）及び飽和食塩水（３０ｍＬ）を加え、分液した有機相を水３０ｍＬ（３０ｍＬ×１）、次に飽和食塩水３０ｍＬ（３０ｍＬ×１）で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧濃縮して粗生成物を得た。ｐ－ＨＰＬＣ（分離カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８（仕様：１５０ｍｍ×５０ｍｍ、粒径：１０μｍ）、移動相：［水（１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム）－アセトニトリル］、溶離勾配：２７％－５７％、１１分）で精製して実施例２（化合物Ｄ０１）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．９６－７．６９（ｍ，９Ｈ），７．３３－７．０９（ｍ，１０Ｈ），６．９０－６．７８（ｍ，４Ｈ），５．２１（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，３Ｈ），４．９７（ｄｄ，Ｊ＝３．３，１１．２Ｈｚ，３Ｈ），４．４９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ），４．０６－３．９７（ｍ，９Ｈ），３．９１－３．８３（ｍ，３Ｈ），３．７９－３．６６（ｍ，１１Ｈ），３．６３－３．４５（ｍ，１８Ｈ），３．０２（ｂｒ ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１４Ｈ），２．４６－２．３７（ｍ，４Ｈ），２．３５－２．１４（ｍ，１２Ｈ），２．１０（ｓ，９Ｈ），２．０４（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），１．９９（ｓ，９Ｈ），１．８８（ｓ，９Ｈ），１．７７（ｓ，９Ｈ），１．５７－１．３７（ｍ，２２Ｈ），１．２２（ｂｒ ｓ，１２Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ ７．９６－７．６９（ｍ，９Ｈ），７．３３－７．０９（ｍ，１０Ｈ），６．９０－６．７８（ｍ，４Ｈ），５．２１（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，３Ｈ），４．９７（ｄｄ，Ｊ＝３．３，１１．２Ｈｚ，３Ｈ），４．４９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ），４．０６－３．９７（ｍ，９Ｈ），３．９１－３．８３（ｍ，３Ｈ），３．７９－３．６６（ｍ，１１Ｈ），３．６３－３．４５（ｍ，１８Ｈ），３．０２（ｂｒ ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１４Ｈ），２．４６－２．３７（ｍ，４Ｈ），２．３５－２．１４（ｍ，１２Ｈ），２．１０（ｓ，９Ｈ），２．０４（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），１．９９（ｓ，９Ｈ），１．８８（ｓ，９Ｈ），１．７７（ｓ，９Ｈ），１．５７－１．３７（ｍ，２２Ｈ），１．２２（ｂｒ ｓ，１２Ｈ）。
【0112】
〔実施例３：二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体又はそのコンジュゲートの合成〕
Ｄを含んでいる一本鎖オリゴリボヌクレオチドの合成：ホスホロアミダイト固相合成技術によりオリゴリボヌクレオチドを合成する。コントロールされた多孔質ガラス（アミノＣＰＧ、５００Å）とＤ０１を共有結合によって結合させて作製した固体支持体において合成した。全ての２’－修飾されたＲＮＡホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）及び補助試薬はいずれも市販試薬を使用してもよい。全てのアミドを無水アセトニトリルに溶解してモレキュラーシーブ（３Å）を加え、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）を活性化剤として使用し、カップリング時間は５分であった。５０ｍＭ ３－（（ジメチルアミノ－メチレン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）の無水アセトニトリル：ピリジン（ｖ：ｖ＝１：１）溶液を使用してホスホロチオエート結合を生成させ、反応時間は３分間であった。全ての配列は最後にＤＭＴ基を除去して得られた。
Ｄを含んでいる一本鎖オリゴリボヌクレオチドの合成：ホスホロアミダイト固相合成技術によりオリゴリボヌクレオチドを合成する。コントロールされた多孔質ガラス（アミノＣＰＧ、５００Å）とＤ０１を共有結合によって結合させて作製した固体支持体において合成した。全ての２’－修飾されたＲＮＡホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）及び補助試薬はいずれも市販試薬を使用してもよい。全てのアミドを無水アセトニトリルに溶解してモレキュラーシーブ（３Å）を加え、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）を活性化剤として使用し、カップリング時間は５分であった。５０ｍＭ ３－（（ジメチルアミノ－メチレン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）の無水アセトニトリル：ピリジン（ｖ：ｖ＝１：１）溶液を使用してホスホロチオエート結合を生成させ、反応時間は３分間であった。全ての配列は最後にＤＭＴ基を除去して得られた。
【0113】
Ｄを含まない一本鎖オリゴリボヌクレオチドの合成：ホスホロアミダイト固相合成技術によりオリゴリボヌクレオチドを合成する。通常のコントロールされた多孔質ガラスＣＰＧ（５００Å）において合成した。全ての２’－修飾されたＲＮＡホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）及び補助試薬はいずれも市販試薬を使用してもよい。全てのアミドを無水アセトニトリルに溶解してモレキュラーシーブ（３Å）を加え、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）を活性化剤として使用し、カップリング時間は５分であった。５０ｍＭ ３－（（ジメチルアミノ－メチレン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）の無水アセトニトリル：ピリジン（ｖ：ｖ＝１：１）溶液を使用してホスホロチオエート結合を生成させ、反応時間は３分間であった。全ての配列は最後にＤＭＴ基を除去して得られた。
【0114】
ＣＰＧに結合しているオリゴマーの切断と脱保護：固相合成を終了した後、ジエチルアミンを２０％含んでいるアセトニトリル溶液で３０分間処理して保護基を除去し、オリゴヌクレオチドはＣＰＧから切断されずに済む。続いて、乾燥したＣＰＧを４０℃で、濃水酸化アンモニウムで１８時間処理した。遠心分離した後、上清を新しいチューブに移して水酸化アンモニウムでＣＰＧを洗浄した。合わせた溶液を濃縮して固体混合物を得た。
【0115】
一本鎖オリゴリボヌクレオチドの精製：ＨＰＬＣで精製したオリゴマーをＮａｎｏＱ陰イオンを用いて交換する。バッファーＡは、１０ｍＭ 過塩素酸ナトリウム溶液、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ７．４）、及び２０％でアセトニトリルを含有しており、バッファーＢは、５００ｍＭ 過塩素酸ナトリウム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ７．４）、及び２０％でアセトニトリルを含有している。分離して目的生成物を得て、逆相Ｃ１８カラムで脱塩した。
【0116】
一本鎖オリゴリボヌクレオチドのアニーリングによるｓｉＲＮＡ生成：アニーリングされる一本鎖オリゴリボヌクレオチドを無菌ＲＮａｓｅフリー水（ＲＮＡ加水分解酵素なし）で２００μＭに調製した。次のようにアニーリング反応系を設定した。総量が１００μＬの混合液１０ｎｍｏｌを９５℃のウォーターバスで１０分間静置し（１００ｎｍｏｌ以上を必要とする場合に２０分間高温処理する必要がある）→直ちに６０℃水浴に入れて、自然に冷却させ→アニーリングが完了した溶液は高温で静置して保存することができない。一本鎖オリゴリボヌクレオチド溶液を等モルで合わせて相補鎖を形成させた。
【0117】
【表E-1】
【表E-2】
【表E-3】
【表E-4】
【0118】
＊：Ｄは、小分子断片Ｄ０１を化学反応させた後の残基であり、共有結合によって核酸に結合されており、構造は次のとおりである。
＊＊：ｒ’が挿入された配列のアンチセンス鎖配列は、コア配列の３’末端ＵＵを有しているアンチセンス鎖配列にｒ’を挿入して得られる。例えば、配列番号４は、３’末端ＵＵを有している配列番号２にｒ’を挿入して得られる。
＊＊＊：配列がＤを含有している場合に、前記Ｄはコンジュゲート基Ｄの結合位置を示す。例えば、
は、配列番号１６に示される配列
が３’末端でＤに結合していることを表す。
【化20】
＊＊＊：配列がＤを含有している場合に、前記Ｄはコンジュゲート基Ｄの結合位置を示す。例えば、
【化21】
【化22】
【0119】
〔実施例３：ＨＢＶインビトロ実験〕
１．実験目的：
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）でＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞培養上清中のＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ）の含有量を検出し、化合物のＥＣ５０値を指標として、ＨＢＶに対する化合物の阻害活性を評価し、また、Ｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏで細胞生存能力を検出して、化合物の細胞毒性を評価する。
１．実験目的：
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）でＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞培養上清中のＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ）の含有量を検出し、化合物のＥＣ５０値を指標として、ＨＢＶに対する化合物の阻害活性を評価し、また、Ｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏで細胞生存能力を検出して、化合物の細胞毒性を評価する。
【0120】
２．実験材料：
２．１ 細胞株：ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞
ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１３３００３２と、１０％血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１００９９１４１と、１００単位／ｍＬ ペニシリン及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、Ｈｙｃｌｏｎｅ－ＳＶ３００１０と、１％非必須アミノ酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１１４００５０と、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５０３００８１と、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、Ｇｉｂｃｏ－１１３６０－０７０と、５００μｇ／ｍＬ ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１０１３１０２７）
２．１ 細胞株：ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞
ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１３３００３２と、１０％血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１００９９１４１と、１００単位／ｍＬ ペニシリン及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、Ｈｙｃｌｏｎｅ－ＳＶ３００１０と、１％非必須アミノ酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１１４００５０と、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５０３００８１と、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、Ｇｉｂｃｏ－１１３６０－０７０と、５００μｇ／ｍＬ ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１０１３１０２７）
【0121】
２．２ 試薬：
トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５３０００６２）、ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ－２１０３１ＣＶＲ）、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ｄ２６５０－１００ＭＬ）、Ｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ－Ｇ７５７３）、Ｂ型肝炎表面抗原定量検出キット（安図生物－ＣＬ ０３１０）、Ｂ型肝炎ｅ抗原定量検出キット（安図生物－ＣＬ ０３１２）。
トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５３０００６２）、ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ－２１０３１ＣＶＲ）、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ｄ２６５０－１００ＭＬ）、Ｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ－Ｇ７５７３）、Ｂ型肝炎表面抗原定量検出キット（安図生物－ＣＬ ０３１０）、Ｂ型肝炎ｅ抗原定量検出キット（安図生物－ＣＬ ０３１２）。
【0122】
２．３ 消耗品及び器具：
９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－３５９９）、ＣＯ２インキュベーター（ＨＥＲＡ－ＣＥＬＬ－２４０）、
マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）。
９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－３５９９）、ＣＯ２インキュベーター（ＨＥＲＡ－ＣＥＬＬ－２４０）、
マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）。
【0123】
３．実験手順及び方法：
３．１ ０日目に、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞（７．５×１０４細胞／ウェル）を４８ウェルプレートに接種し、３７℃で、５％ＣＯ２で一晩培養した。
３．１ ０日目に、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞（７．５×１０４細胞／ウェル）を４８ウェルプレートに接種し、３７℃で、５％ＣＯ２で一晩培養した。
【0124】
３．２ １日目に、ＤＭＳＯを１％含んでいる培地を交換した。
【0125】
３．３ ２日目に、Ｄ型ＨＢＶ（ＨｅｐＧ２．２．１５細胞の培養上清から濃縮したもの）でＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ（２０００ＧＥ／細胞）を感染した。
【0126】
３．４ ３日目に、感染液を吸い取って、ＤＭＳＯを１％含んでいる新鮮な培地を加えた。
【0127】
３．５ ６日目に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の取扱説明に従って、ｓｉＲＮＡコンジュゲートをトランスフェクトした。コンジュゲートを５倍で段階希釈して７濃度を得て、３連ウェルであり、最終濃度は０．１６ｐＭであった。化合物はセンス鎖とアンチセンス鎖の組み合わせで、１つの化学実体であり、最大濃度は２．５ｎＭであった。
【0128】
３．６ １２日目に、培養ウェルから上清を回収して、ＥＬＩＳＡでＨＢＶ表面抗原及びｅ抗原を測定した。上清を回収した後、Ｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを加えて細胞生存能力を測定した。
【0129】
３．７ ＥＬＩＳＡでＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及びｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）を測定し、具体的な手順は取扱説明を参照し、手順を次のとおりに要約することができる。５０μＬのサンプル及び標準物質をそれぞれ反応プレートに加え、次に各ウェルにそれぞれ５０μＬの酵素複合体を加えて、振盪して均一に混合させ、３７℃で６０分間インキュベートし、次に洗浄液でプレートを５回洗浄し、さらに各ウェルに５０μＬの発光基質を加え、均一に混合して、暗所で室温下１０分間反応させ、最後にマイクロプレートリーダーを用いて化学発光強度を検出した。
【0130】
３．８ データ分析：
細胞生存率の計算：
％ｖｉａｂｉｌｉｔｙ＝（サンプルの発光値－培地対照の発光値）／（ＤＭＳＯ対照の発光値－培地対照の発光値）×１００。
細胞生存率の計算：
％ｖｉａｂｉｌｉｔｙ＝（サンプルの発光値－培地対照の発光値）／（ＤＭＳＯ対照の発光値－培地対照の発光値）×１００。
【0131】
ＨＢＶ表面抗原及びｅ抗原の阻害パーセントの計算：
％Ｉｎｈ．＝（１－サンプル中の抗原値／ＤＭＳＯ対照の抗原値）×１００。
％Ｉｎｈ．＝（１－サンプル中の抗原値／ＤＭＳＯ対照の抗原値）×１００。
【0132】
ＣＣ５０及びＥＣ５０の計算：ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて化合物のＣＣ５０及びＨＢＶに対する５０％阻害濃度（ＥＣ５０）値を計算する。
【0133】
４．実験結果：表２。
【0134】
【表F】
【0135】
＊被験サンプルは、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートであった。
【0136】
〔実施例４：組換え８型アデノ随伴ウイルスベクター媒介性Ｂ型肝炎ウイルスマウスモデル（ＡＡＶ－ＨＢＶ）における抗Ｂ型肝炎ウイルスの活性及び安全性実験〕
実験目的：
ＡＡＶベクター媒介性ＨＢＶトランスフェクションマウスモデルは、迅速で効率的なＨＢＶモデルである。ＡＡＶ８ベクターの高い肝臓親和性を利用し、１．３コピーのＨＢＶゲノムを担持している組換え８型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ）をマウスの尾静脈に注射することにより、担持されている１．３コピーのＨＢＶゲノムを効率よく肝細胞に導入することができる。ＡＡＶウイルスベクターの特性により、それによって媒介されるベクターは持続的に長時間に発現することができ、ＡＡＶ／ＨＢＶモデルを用いればマウスの肝臓内でＨＢＶ ＤＮＡを持続的に複製してＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを発現することができる。
実験目的：
ＡＡＶベクター媒介性ＨＢＶトランスフェクションマウスモデルは、迅速で効率的なＨＢＶモデルである。ＡＡＶ８ベクターの高い肝臓親和性を利用し、１．３コピーのＨＢＶゲノムを担持している組換え８型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ）をマウスの尾静脈に注射することにより、担持されている１．３コピーのＨＢＶゲノムを効率よく肝細胞に導入することができる。ＡＡＶウイルスベクターの特性により、それによって媒介されるベクターは持続的に長時間に発現することができ、ＡＡＶ／ＨＢＶモデルを用いればマウスの肝臓内でＨＢＶ ＤＮＡを持続的に複製してＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを発現することができる。
【0137】
ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルを用いて、被検化合物で治療した後のマウス血清中のＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＤＮＡ、ｐｇＲＮＡ及びマウス体重を検出することにより、そのインビボ抗ＨＢＶ効果及び安全性を評価する。
【0138】
実験材料：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＰＢＳ（ＲＮａｓｅなし）溶媒、被検化合物、組換えウイルスｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ。本実験の主な試薬は、ＱＩＡａｍｐ９６ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、５１１６２）、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ、０４９１４０５８００１）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原検出キット（安図生物、ＣＬ０３１０）、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原検出キット（安図生物、ＣＬ０９１８）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標） Ｐｒｏ ９６ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２２８０－０９６Ａ）、及びＦａｓｔＱｕａｎｔ ＲＴ Ｋｉｔ（ｇＤＮａｓｅあり）（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１０６－０２）を含む。主に器具は、遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ）、多目的マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）、蛍光定量ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ３８４）を含む。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＰＢＳ（ＲＮａｓｅなし）溶媒、被検化合物、組換えウイルスｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ。本実験の主な試薬は、ＱＩＡａｍｐ９６ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、５１１６２）、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ、０４９１４０５８００１）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原検出キット（安図生物、ＣＬ０３１０）、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原検出キット（安図生物、ＣＬ０９１８）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標） Ｐｒｏ ９６ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２２８０－０９６Ａ）、及びＦａｓｔＱｕａｎｔ ＲＴ Ｋｉｔ（ｇＤＮａｓｅあり）（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１０６－０２）を含む。主に器具は、遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ）、多目的マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）、蛍光定量ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ３８４）を含む。
【0139】
実験方法：
ａ）マウスにウイルスを注射した３４日目に、皮下注射投与を開始し、この日を０日目とした。投与前に全てのマウスは顎下採血して血漿を回収した。具体的な投与計画は表３を参照する。
ａ）マウスにウイルスを注射した３４日目に、皮下注射投与を開始し、この日を０日目とした。投与前に全てのマウスは顎下採血して血漿を回収した。具体的な投与計画は表３を参照する。
【0140】
ｂ）マウスへの投与後の０日目、１４日目、２１日目、２８日目及び３２日目に、顎下静脈から採血して血漿を回収し、回収した血液サンプルをＫ２－ＥＤＴＡで抗凝固し、４℃で、７０００ｇ／分の条件で１０分間遠心分離して血漿を回収した。具体的な採血日は表３を参照する。
【0141】
ｃ）３５日目又は４２日目に、全てのマウスは顎下静脈から採血して血漿を回収し、次にＣＯ２吸入で安楽死を実施し、心臓から採血して血漿サンプルを回収し、肝臓サンプルを回収した。
【0142】
ｄ）血漿サンプルを検出した。
【0143】
【表G】
【0144】
＊１：ＷＲＧ０１はコンジュゲートであり、センス鎖は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号２３であり、コンジュゲート基はＤであった。
＊２：ＷＲ００７はコンジュゲートであり、センス鎖は配列番号４２であり、アンチセンス鎖は配列番号２３であり、コンジュゲート基はＤであった。
＊３：ＷＲ０１２はコンジュゲートであり、センス鎖は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号４７であり、コンジュゲート基はＤであった。
／：エンドポイント未到達。
＊２：ＷＲ００７はコンジュゲートであり、センス鎖は配列番号４２であり、アンチセンス鎖は配列番号２３であり、コンジュゲート基はＤであった。
＊３：ＷＲ０１２はコンジュゲートであり、センス鎖は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号４７であり、コンジュゲート基はＤであった。
／：エンドポイント未到達。
【0145】
サンプル分析：
ＥＬＩＳＡによるマウス血清中ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇの含有量検出：実験手順は、ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ（安図生物、ＣＬ ０３１０）及びＨＢｅＡｇ ＥＬＩＳＡ（安図生物、ＣＬ０９１８）キットの取扱説明を参照する。
ＥＬＩＳＡによるマウス血清中ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇの含有量検出：実験手順は、ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ（安図生物、ＣＬ ０３１０）及びＨＢｅＡｇ ＥＬＩＳＡ（安図生物、ＣＬ０９１８）キットの取扱説明を参照する。
【0146】
ｑＰＣＲによるマウス血漿中ＨＢＶ ＤＮＡの含有量検出：血漿からＨＢＶ ＤＮＡを抽出し、実験手順はＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔの取扱説明を参照し、ｑＰＣＲでマウス血漿中のＨＢＶ ＤＮＡ含有量を検出した。
【0147】
ＲＴ－ｑＰＣＲによるマウス血漿中ＨＢＶ ｐｇＲＮＡの含有量検出：血漿からＨＢＶ ｐｇＲＮＡを抽出し、実験手順はＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標） Ｐｒｏ ９６ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｋｉｔの取扱説明を参照する。ＤＮＡを消化し、Ｂ型肝炎ウイルス特異性配列を含有している３’ＲＡＣＥプライマーでＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得て、実験手順はＦａｓｔＱｕａｎｔ ＲＴ Ｋｉｔ（ｇＤＮａｓｅあり）の取扱説明を参照する。最後に、ｑＰＣＲでｃＤＮＡの含有量を定量的に検出し、即ち、マウス血漿中ＨＢＶ ｐｇＲＮＡの含有量を検出することであった。
【0148】
各群のマウスのサンプルの平均±標準誤差で示し、特に説明がない限り、ｎ＝５であった。スチューデントのｔ検定で統計分析を行った。
【0149】
実験結果：
ａ）血清中ＨＢｓＡｇの含有量でＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおける被検化合物の抗ＨＢＶ活性を評価する。結果は表４、表４－１、図１及び図６に示している。マウス血漿のＨＢｓＡｇ含有量はＥＬＩＳＡ法で測定した。エラーバーは標準誤差を示している。０日目に、全てのマウスにビヒクル又は化合物を１回目に投与した。２９日目に、実験群のＷＲＧ０１マウス及び当回のブランク対照群のマウスにビヒクル又は化合物を２回目に接種した。
ａ）血清中ＨＢｓＡｇの含有量でＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおける被検化合物の抗ＨＢＶ活性を評価する。結果は表４、表４－１、図１及び図６に示している。マウス血漿のＨＢｓＡｇ含有量はＥＬＩＳＡ法で測定した。エラーバーは標準誤差を示している。０日目に、全てのマウスにビヒクル又は化合物を１回目に投与した。２９日目に、実験群のＷＲＧ０１マウス及び当回のブランク対照群のマウスにビヒクル又は化合物を２回目に接種した。
【0150】
【表H】
【0151】
【表I】
【0152】
ｂ）血清中ＨＢｅＡｇの含有量でＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおける被検化合物の抗ＨＢＶ活性を評価する。結果は表５、表５－１、図２及び図７に示している。マウス血漿のＨＢｅＡｇ含有量はＥＬＩＳＡ法で測定した。エラーバーは標準誤差を示している。０日目に、全てのマウスに１回目にビヒクル又は化合物を投与した。
【0153】
【表J】
【0154】
【表K】
【0155】
ｃ）血清中ＤＮＡの含有量でＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおける被検化合物の抗ＨＢＶ活性を評価する。結果は表６、表６－１、図３及び図８に示している。マウス血漿のＨＢＶ ＤＮＡ含有量は定量ＰＣＲで測定した。エラーバーは標準誤差を示している。０日目に、全てのマウスに１回目にビヒクル又は化合物を投与した。２９日目に、全てのマウスに２回目にビヒクル又は化合物を接種した。
【0156】
【表L】
【0157】
【表M】
【0158】
／：データ未取得。
【0159】
ｄ）血清中ｐｇＲＮＡの含有量でＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおける被検化合物の抗ＨＢＶ活性を評価する。結果は表７及び図４に示している。マウス血漿のＨＢＶ ｐｇＲＮＡの含有量は定量ＰＣＲで測定した。エラーバーは標準誤差を示している。０日目に、全てのマウスに１回目にビヒクル又は化合物を投与した。２９日目に、全てのマウスに２回目にビヒクル又は化合物を接種した。
【0160】
【表N】
【0161】
ｅ）体重変化は図５に示している。０日目の体重を基準として比較し、ＩＡＣＵＣの規定により、２０％体重減少を人道的エンドポイントとし、体重減少が２０％を超えているマウスは、いずれも実験から除外する。この実験では体重減少で除外されたマウスはなかった。
【0162】
実験結論：
本実験では、被検化合物がＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおいて、ＨＢｓＡｇ、ＤＮＡ及びｐｇＲＮＡを顕著に低減させていた。また、被検化合物はＨＢｅＡｇにもある程度は阻害効果を有している。被検化合物で治療するプロセスで、マウスに良好な忍容性が認められ、体重が徐々に増加していった。
本実験では、被検化合物がＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおいて、ＨＢｓＡｇ、ＤＮＡ及びｐｇＲＮＡを顕著に低減させていた。また、被検化合物はＨＢｅＡｇにもある程度は阻害効果を有している。被検化合物で治療するプロセスで、マウスに良好な忍容性が認められ、体重が徐々に増加していった。
【0163】
〔実施例５：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を用いるＨＢＶインビトロ実験〕
１．実験目的：
リアルタイム定量的ｑＰＣＲアッセイ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ｑＰＣＲ）でＨｅｐＧ２．２．１５細胞培養上清のＨＢＶ ＤＮＡの含有量を検出し酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）でＨＢＶ表面抗原及びｅ抗原含有量を検出し、ｑＲＴ－ＰＣＲで細胞内のＨＢＶ ＲＮＡの含有量を検出し、化合物のＥＣ５０値を指標として、ＨＢＶに対する化合物の阻害効果を評価し、また、ＣＣＫ８アッセイで細胞活性に対する被検化合物の影響を検出する。
１．実験目的：
リアルタイム定量的ｑＰＣＲアッセイ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ｑＰＣＲ）でＨｅｐＧ２．２．１５細胞培養上清のＨＢＶ ＤＮＡの含有量を検出し酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）でＨＢＶ表面抗原及びｅ抗原含有量を検出し、ｑＲＴ－ＰＣＲで細胞内のＨＢＶ ＲＮＡの含有量を検出し、化合物のＥＣ５０値を指標として、ＨＢＶに対する化合物の阻害効果を評価し、また、ＣＣＫ８アッセイで細胞活性に対する被検化合物の影響を検出する。
【0164】
２．実験材料：
２．４ 細胞株：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１３３００３２と、１０％血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ－ＳＶ３００８７．０と、１００単位／ｍＬ ペニシリン及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、Ｈｙｃｌｏｎｅ－ＳＶ３００１０と、１％非必須アミノ酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１１４００５０と、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５０３００８１と、３００μｇ／ｍＬ ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１０１３１０２７）。
２．４ 細胞株：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１３３００３２と、１０％血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ－ＳＶ３００８７．０と、１００単位／ｍＬ ペニシリン及び１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、Ｈｙｃｌｏｎｅ－ＳＶ３００１０と、１％非必須アミノ酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１１１４００５０と、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－２５０３００８１と、３００μｇ／ｍＬ ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１０１３１０２７）。
【0165】
２．５ 試薬
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ－３１９８５－０７０）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１３７７８－１５０）、ＣＣＫ８（上海李記生物－ＡＣ１１Ｌ０５７）、ハイスループットＤＮＡ精製キット（ＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ－５１１６２）、ＲＮＡ調製用ＲＮＥＡＳＹキット（ＲＮｅａｓｙ ９６ Ｋｉｔ（１２）、Ｑｉａｇｅｎ－７４１８２）、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ、Ｒｏｃｈｅ－０４９１４０５８００１、ＦａｓｔＫｉｎｇ ｃＤＮＡ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴｉａｎＧｅｎ－ＫＲ１０６－０２）、Ｂ型肝炎表面抗原定量検出キット（安図生物、ＣＬ ０３１０）、Ｂ型肝炎ｅ抗原定量検出キット（安図生物、ＣＬ ０３１２）。
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ－３１９８５－０７０）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－１３７７８－１５０）、ＣＣＫ８（上海李記生物－ＡＣ１１Ｌ０５７）、ハイスループットＤＮＡ精製キット（ＱＩＡａｍｐ ９６ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ－５１１６２）、ＲＮＡ調製用ＲＮＥＡＳＹキット（ＲＮｅａｓｙ ９６ Ｋｉｔ（１２）、Ｑｉａｇｅｎ－７４１８２）、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ、Ｒｏｃｈｅ－０４９１４０５８００１、ＦａｓｔＫｉｎｇ ｃＤＮＡ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴｉａｎＧｅｎ－ＫＲ１０６－０２）、Ｂ型肝炎表面抗原定量検出キット（安図生物、ＣＬ ０３１０）、Ｂ型肝炎ｅ抗原定量検出キット（安図生物、ＣＬ ０３１２）。
【0166】
２．６ 消耗品及び器具：
Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ９６ Ｗｅｌｌ Ｗｈｉｔｅ／Ｃｌｅａｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ ＴＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＢｉｏＣｏａｔ－３５６６５０）、ＣＯ２インキュベーター（ＨＥＲＡ－ＣＥＬＬ－２４０）、蛍光定量ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－７９００ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）、蛍光定量ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ）、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ－ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ）、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ －Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）。
Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ９６ Ｗｅｌｌ Ｗｈｉｔｅ／Ｃｌｅａｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ ＴＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＢｉｏＣｏａｔ－３５６６５０）、ＣＯ２インキュベーター（ＨＥＲＡ－ＣＥＬＬ－２４０）、蛍光定量ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－７９００ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）、蛍光定量ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ－ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ）、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ－ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ）、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ －Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）。
【0167】
３．実験手順及び方法：
３．１ 初日に、ｓｉＲＮＡトランスフェクションと細胞プレーティングを同時に行い、方法を次のとおりに要約することができる。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、０．０５％トリプシンで消化し、ＦＢＳを１０％含んでいるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で消化を終了し、遠心分離して再懸濁し、細胞を軽くピペッティングして単一の細胞になったらカウントした。所定の体積比率でトランスフェクション試薬を調製し（表８）、室温で１５分間インキュベートした。
３．１ 初日に、ｓｉＲＮＡトランスフェクションと細胞プレーティングを同時に行い、方法を次のとおりに要約することができる。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、０．０５％トリプシンで消化し、ＦＢＳを１０％含んでいるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で消化を終了し、遠心分離して再懸濁し、細胞を軽くピペッティングして単一の細胞になったらカウントした。所定の体積比率でトランスフェクション試薬を調製し（表８）、室温で１５分間インキュベートした。
【0168】
【表O】
【0169】
ｓｉＲＮＡを段階希釈して８濃度を得て、３倍で段階希釈し、２連ウェルであり、１５μＬのＲＮＡｉＭａｘ／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ混合液を１５μＬの異なる濃度のｓｉＲＮＡと均一に混合して、室温で１５分間インキュベートした。最初に１０μＬの前記混合溶液を９６ウェル細胞培養プレートに加え、次に９０μＬの細胞懸濁液を加え、最終細胞密度は１万５０００細胞／ウェルであり、最終容量は１００μＬ／ウェルであり、細胞を５％ＣＯ２×３７℃のインキュベーターに置いて培養した。
【0170】
３．２ ４日目に、化合物を含有している新鮮な培養液を交換し、初日と同じ方法でトランスフェクションした。
【0171】
３．３ ７日目に培養ウェルから培養液を回収し、一部のサンプルを取得してＥＬＩＳＡでＢ型肝炎ウイルスＳ抗原及びｅ抗原の含有量を測定し、また一部のサンプルを取得してハイスループットＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ－５１１６２）でＤＮＡを抽出し、上清を回収した後、ＣＣＫ－８キットの取扱説明に従って細胞生存能力を測定し、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ）で各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を検出し、ＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ－７４１８２）を用いて、キットの取扱説明に従って細胞培養からＨＢＶ ＲＮＡを抽出した。
【0172】
３．４ ＰＣＲ反応液の調製は、表９に示すとおりである。
【0173】
【表P】
【0174】
９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに８μＬの反応混合液を加え、次に、各ウェルに２μＬのＤＮＡサンプル又はＨＢＶ ＤＮＡの標準物質を加えた。
【0175】
ＰＣＲの反応条件は次のとおりであった。９５℃で１０分間加熱し、次に９５℃で１５秒間変性し、６０℃で１分間伸長させ、合計で４０サイクルであった。
【0176】
３．５ ＥＬＩＳＡでＢ型肝炎ウイルスＳ抗原及びｅ抗原の含有量を測定し、具体的な手順は取扱説明を参照し、手順を次のとおりに要約することができる。５０μＬのサンプル及び標準物質をそれぞれ反応プレートに加え、次に各ウェルにそれぞれ５０μＬの酵素複合体を加えて、振盪して均一に混合させ、３７℃温水浴において６０分間保持し、次に洗浄液でプレートを５回洗浄し、さらに各ウェルに５０μＬの発光基質を加え、均一に混合して、暗所で室温下１０分間反応させ、最後にマイクロプレートリーダーを用いて化学発光強度を検出した。
【0177】
３．６ ＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１８２）を用いて、キットの取扱説明に従って細胞培養からＨＢＶ ＲＮＡを抽出した。１５０μＬのＲＬＴを加えて細胞を溶解し、最後に５０μＬのＲＮａｓｅフリー水でＲＮＡを溶離した。逆転写キット（天根生化、ＫＲ１０６）の取扱説明に従って、ランダムプライマーを加えて逆転写してｃＤＮＡを得て、次にＨＢＶ特異的プライマーでサンプル中のトータルＲＮＡを検出し、同時に、ＧＡＰＤＨプライマー及びプローブでＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを特異的に検出し、ｑＰＣＲでサンプル中のＨＢＶ ｃＤＮＡを定量した。
【0178】
ｑＰＣＲ反応は次のとおりであった。９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間とし、４０サイクルであった。各サンプルのＣｔ値からサンプルのＨＢＶ ＲＮＡの含有量を計算した。
【0179】
各サンプルの目的遺伝子ＨＢＶ ｍＲＮＡの発現レベルはΔΔＣｔ相対定量法で計算する。目的遺伝子の相対発現量は２－ΔΔＣｔで表し、計算式は次のとおりであった。
ΔＣＴ＝目的遺伝子の平均Ｃｔ値－内部参照遺伝子の平均Ｃｔ値、
ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ群（投与群）－ΔＣＴ（ＲＮＡｉＭａｘ対照群）、
ＨＢＶ ｍＲＮＡ相対発現量＝２－ΔΔＣｔ
ΔＣＴ＝目的遺伝子の平均Ｃｔ値－内部参照遺伝子の平均Ｃｔ値、
ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ群（投与群）－ΔＣＴ（ＲＮＡｉＭａｘ対照群）、
ＨＢＶ ｍＲＮＡ相対発現量＝２－ΔΔＣｔ
【0180】
３．７ データ分析：
阻害パーセントの計算：
％Ｉｎｈ．＝（１－サンプルの値／ＰＢＳ対照の値）×１００。
細胞生存率％＝（サンプルの検出値－培養液バックグラウンドの平均検出値）／（対照群の平均検出値－培養液バックグラウンドの平均検出値）×１００。
阻害パーセントの計算：
％Ｉｎｈ．＝（１－サンプルの値／ＰＢＳ対照の値）×１００。
細胞生存率％＝（サンプルの検出値－培養液バックグラウンドの平均検出値）／（対照群の平均検出値－培養液バックグラウンドの平均検出値）×１００。
【0181】
ＥＣ５０及びＣＣ５０の計算：ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてＨＢＶに対する化合物の５０％阻害濃度（ＥＣ５０）値及び５０％細胞死に対応する薬物濃度（ＣＣ５０）値を計算する。
【0182】
【表Q】
【0183】
／：データ未取得。
＊被験サンプルは、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートであった。
＊被験サンプルは、二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲートであった。
【0184】
〔実施例６：ＡＡＶ－ＨＢＶマウスモデルにおける抗Ｂ型肝炎ウイルス活性用量の検討〕
ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルを用いて、異なる用量の被検化合物での治療後のマウス血清中のＨＢｓＡｇを検出することにより、そのインビボ抗ＨＢＶ効果を評価する。
ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルを用いて、異なる用量の被検化合物での治療後のマウス血清中のＨＢｓＡｇを検出することにより、そのインビボ抗ＨＢＶ効果を評価する。
【0185】
実験材料：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＰＢＳ（ＲＮａｓｅなし）溶媒、被検化合物、組換えウイルスｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ。本実験の主な試薬は、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ、０４９１４０５８００１）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原検出キット（安図生物、ＣＬ０３１０）を含む。主な器具は、遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ）、多目的マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ３８４）を含む。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＰＢＳ（ＲＮａｓｅなし）溶媒、被検化合物、組換えウイルスｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ。本実験の主な試薬は、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ、０４９１４０５８００１）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原検出キット（安図生物、ＣＬ０３１０）を含む。主な器具は、遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ）、多目的マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２）、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ３８４）を含む。
【0186】
実験方法：
ａ）全てのマウスはウイルス注射後の３４日目に皮下注射投与を開始し、この日を０日目とした。投与前に全てのマウスは顎下採血して血漿を回収した。０日目に１回投与した。具体的な投与計画は表１４を参照する。
ａ）全てのマウスはウイルス注射後の３４日目に皮下注射投与を開始し、この日を０日目とした。投与前に全てのマウスは顎下採血して血漿を回収した。０日目に１回投与した。具体的な投与計画は表１４を参照する。
【0187】
ｂ）全てのマウスは投与後の０日目、１４日目、２１日目、２８日目及び３５日目に、顎下静脈から採血して血漿を回収し、回収した血液サンプルをＫ２－ＥＤＴＡで抗凝固し、４℃で、７０００ｇ／分の条件で１０分間遠心分離して血漿を回収した。具体的な採血日は表１１を参照する。
【0188】
ｃ）４２日目に、全てのマウスは顎下静脈から採血して血漿を回収し、次にＣＯ２吸入で安楽死を実施し、心臓から採血して血漿サンプルを回収し、肝臓サンプルを回収した。
【0189】
ｄ）全ての血漿サンプルを検出した。
【0190】
【表R】
【0191】
＊：ＷＲＧ０１はコンジュゲートであり、センス鎖は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号２３であり、コンジュゲート基はＤであった。
／：エンドポイント未到達。
／：エンドポイント未到達。
【0192】
サンプル分析：
ＥＬＩＳＡによるマウス血清中ＨＢｓＡｇの含有量検出：実験手順は、ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ（安図生物、ＣＬ ０３１０）キットの取扱説明を参照する。
ＥＬＩＳＡによるマウス血清中ＨＢｓＡｇの含有量検出：実験手順は、ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ（安図生物、ＣＬ ０３１０）キットの取扱説明を参照する。
【0193】
各群のマウスのサンプルの平均±標準誤差で示し、特に説明がない限り、ｎ＝５であった。スチューデントのｔ検定で統計分析を行った。
【0194】
実験結果：
血清中ＨＢｓＡｇの含有量を検出してＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおける被検化合物の抗ＨＢＶ活性を評価する。結果は表１２、図９に示している。マウス血漿のＨＢｓＡｇ含有量はＥＬＩＳＡ法で測定した。エラーバーは標準誤差を示している。０日目に、全てのマウスに１回目にビヒクル又は化合物を投与した。
血清中ＨＢｓＡｇの含有量を検出してＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおける被検化合物の抗ＨＢＶ活性を評価する。結果は表１２、図９に示している。マウス血漿のＨＢｓＡｇ含有量はＥＬＩＳＡ法で測定した。エラーバーは標準誤差を示している。０日目に、全てのマウスに１回目にビヒクル又は化合物を投与した。
【0195】
【表S】
【0196】
実験結論：
本実験では、被検化合物ＷＲＧ０１はＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルで、ＨＢｓＡｇの低減に良好な用量依存効果を示しており、即ち、用量が増加するにつれてＨＢｓＡｇ低減活性が向上することであり、また、長期的なＨＢｓＡｇ阻害効果を示している。
本実験では、被検化合物ＷＲＧ０１はＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルで、ＨＢｓＡｇの低減に良好な用量依存効果を示しており、即ち、用量が増加するにつれてＨＢｓＡｇ低減活性が向上することであり、また、長期的なＨＢｓＡｇ阻害効果を示している。
【0197】
〔実施例７：マウスの血漿、肝臓、腎臓における薬物濃度試験〕
本実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに単回皮下注射で投与し、投与後、異なる時間で血漿及び組織サンプルを回収し、ＳＬ－ｑＰＣＲで血漿及び組織中のｓｉＲＮＡレベルを検出することによりマウスにおける化合物のインビボ代謝レベルを評価する。
本実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに単回皮下注射で投与し、投与後、異なる時間で血漿及び組織サンプルを回収し、ＳＬ－ｑＰＣＲで血漿及び組織中のｓｉＲＮＡレベルを検出することによりマウスにおける化合物のインビボ代謝レベルを評価する。
【0198】
【表T-1】
【表T-2】
【0199】
＊：ＷＲＧ０１はコンジュゲートであり、センス鎖は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号２３であり、コンジュゲート基はＤであった。
／：「非エンドポイント」では採血なし、採血はエンドポイントのみ。
／：「非エンドポイント」では採血なし、採血はエンドポイントのみ。
【0200】
実験結果：
ＳＬ－ｑＰＣＲ法（参考文献：Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７），４５，１０９６９－１０９７７）でマウスへの投与後の異なるタイミングでの血漿、肝臓、腎臓中のｓｉＲＮＡレベルを検出し、結果は図１０に示している。
ＳＬ－ｑＰＣＲ法（参考文献：Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７），４５，１０９６９－１０９７７）でマウスへの投与後の異なるタイミングでの血漿、肝臓、腎臓中のｓｉＲＮＡレベルを検出し、結果は図１０に示している。
【0201】
実験結論：
本実験では、被検化合物ＷＲＧ０１はＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて良好な組織分布及び代謝安定性を有している。ＷＲ－Ｇ０１の肝臓への暴露量が大きく、半減期が長く、肝臓中／血漿中濃度比は５００を超えていることから、ＷＲＧ０１は安定的に代謝しており、高い肝臓親和性を有することが証明されている。
本実験では、被検化合物ＷＲＧ０１はＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて良好な組織分布及び代謝安定性を有している。ＷＲ－Ｇ０１の肝臓への暴露量が大きく、半減期が長く、肝臓中／血漿中濃度比は５００を超えていることから、ＷＲＧ０１は安定的に代謝しており、高い肝臓親和性を有することが証明されている。
【0202】
〔実施例８：ＦＲＧ－ＫＯヒト化肝臓マウスを用いる血液生化学実験〕
ヒト化ＦＲＧマウスは最もよく利用されるヒト化肝臓モデルの１つであり、ヒト化率は一般に７０％に達している。マウス肝臓で定着しているのはヒト肝臓細胞であるため、ヒトのＨＢＶ自然感染とｃｃｃＤＮＡ複製プロセスをよりよくシミュレートすることができ、ヒトにおける薬物動態と肝臓毒性をよく予測することができる。
ヒト化ＦＲＧマウスは最もよく利用されるヒト化肝臓モデルの１つであり、ヒト化率は一般に７０％に達している。マウス肝臓で定着しているのはヒト肝臓細胞であるため、ヒトのＨＢＶ自然感染とｃｃｃＤＮＡ複製プロセスをよりよくシミュレートすることができ、ヒトにおける薬物動態と肝臓毒性をよく予測することができる。
【0203】
本実験では、ヒト化ＦＲＧマウスに複数回投与した後、異なるタイミングで血漿サンプルを回収し、血漿中のＡＬＴ、ＡＳＴ及びビリルビンレベルを検出することによりマウスに対する化合物の肝臓毒性及び副作用を評価する。本実験では、被検化合物はヒト化肝臓に明らかな炎症反応を生じなかったため、ヒトには良好な安全性を有することを示している。
【0204】
【表U】
【0205】
＊：ＷＲＧ０１はコンジュゲートであり、センス鎖は配列番号１６であり、アンチセンス鎖は配列番号２３であり、コンジュゲート基はＤであった。
／：エンドポイント未到達。
／：エンドポイント未到達。
【0206】
本開示は、予期もしなかったＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇへの優れた阻害活性を示しているだけでなく、ＨＢＶ ＤＮＡ及びｐｇＲＮＡの発現を効果的に阻害できることから、Ｂ型肝炎ウイルスの活性を阻害することができ、良好な組織分布と代謝安定性を有し、高い肝臓親和性を有することが示されており、マウスの肝機能への影響が小さいことも予測されるため、Ｂ型肝炎（例えば、慢性Ｂ型肝炎）に効率的な臨床治療手段を提供している。
【国際調査報告】