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特表2023-529051ＶＥＧＦ二量体分子およびＶＥＧＦ二量体分子を含むカラム、並びにそれらに関連する使用、調製方法、および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-07
(54)【発明の名称】ＶＥＧＦ二量体分子およびＶＥＧＦ二量体分子を含むカラム、並びにそれらに関連する使用、調製方法、および方法
(51)【国際特許分類】
C07K 17/04 20060101AFI20230630BHJP
C07K 14/71 20060101ALI20230630BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230630BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230630BHJP
C12N 1/11 20060101ALI20230630BHJP
C12N 1/13 20060101ALI20230630BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230630BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230630BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230630BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230630BHJP
C07K 1/16 20060101ALI20230630BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230630BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230630BHJP
【ＦＩ】
C07K17/04
C07K14/71 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/12
C12N1/11
C12N1/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K1/16
C12M1/00 A
C12P21/02 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022556549
(86)(22)【出願日】2021-03-18
(85)【翻訳文提出日】2022-11-21
(86)【国際出願番号】 EP2021057019
(87)【国際公開番号】W WO2021185996
(87)【国際公開日】2021-09-23
(31)【優先権主張番号】20164619.7
(32)【優先日】2020-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510086316
【氏名又は名称】ケルン大学
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＺＵ ＫＯＥＬＮ
【住所又は居所原語表記】Ａｌｂｅｒｔｕｓ－Ｍａｇｎｕｓ－Ｐｌａｔｚ ５０９２３ Ｋｏｅｌｎ Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110001807
【氏名又は名称】弁理士法人磯野国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハグマン、ヘニング
(72)【発明者】
【氏名】ベンツィング、トーマス
(72)【発明者】
【氏名】シルマー、ベルンハルト
(72)【発明者】
【氏名】コッホ、マヌエル
(72)【発明者】
【氏名】マーティン、マーサ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA21
4B029BB15
4B029CC01
4B029FA15
4B064AG20
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA03
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD50
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA60
4H045AA10
4H045BA09
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）二量体分子を含むカラム、そのようなカラムの調製方法、ＶＥＧＦ二量体分子、ＶＥＧＦ二量体をコードする発現ベクターおよび組換え宿主細胞、並びにそれらに関連する使用および方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第一血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分子と第二ＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ二量体分子を含むカラム。
【請求項2】
第一および第二ＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ二量体分子であって、前記第一および／または前記第二ＶＥＧＦ分子が１２２～２５０のアミノ酸長を有するＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項3】
前記ＶＥＧＦ二量体分子が真核細胞によって発現されることを特徴とする、請求項１に記載のカラムまたは請求項２に記載のＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項4】
前記第一および前記第二ＶＥＧＦ分子が同一であることを特徴とする、請求項１または３のいずれか一項に記載のカラムまたは請求項２～３に記載のＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項5】
前記第一および／または前記第二ＶＥＧＦ分子がＮ末端シグナルペプチドを欠くことを特徴とする、請求項１または３～４のいずれか一項に記載のカラムまたは請求項２～４のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項6】
前記第一および／または前記第二ＶＥＧＦ分子が１２２～２５０アミノ酸、好ましくは１２５～２２５アミノ酸、より好ましくは１４０～２００アミノ酸、さらに好ましくは１５０～１８０アミノ酸、特により好ましくは１６０～１７０アミノ酸、最も好ましくは１６５アミノ酸長を有することを特徴とする、請求項１または３～５のいずれか一項に記載のカラムまたは請求項２～５のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項7】
前記第一ＶＥＧＦ分子が配列番号：３と比較して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは配列番号：３と比較して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは配列番号：３と比較して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは配列番号：３と比較して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するか、および／または、前記第二ＶＥＧＦ分子が配列番号：４と比較して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは配列番号：４と比較して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは配列番号：４と比較して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは配列番号：４と比較して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有することを特徴とする、請求項１または３～６のいずれか一項に記載のカラムまたは請求項２～６のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項8】
前記第一および前記第二ＶＥＧＦ分子がリンカーによって連結されることを特徴とする、請求項１または３～７のいずれか一項に記載のカラムまたは請求項２～７のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項9】
前記リンカーが、１０～３０アミノ酸長、好ましくは１１～２５アミノ酸長、より好ましくは１２～２０アミノ酸長、特により好ましくは１３～１７アミノ酸長、最も好ましくは１４アミノ酸長を有する、請求項８に記載のカラムまたは請求項８に記載のＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項10】
前記ＶＥＧＦ二量体分子が共有結合によってマトリックスに固定化されることを特徴とする、請求項１または３～９のいずれか一項に記載のカラムまたは請求項２～９のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項11】
請求項１または３～１０のいずれか一項に記載のカラムの調製方法であって、ａ）第一血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分子と第二ＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ二量体分子を真核生物発現によって調製する工程と、
ｂ）工程ａ）の前記二量体をマトリックスに固定化する工程を含む方法。
【請求項12】
工程ｂ）において、前記ＶＥＧＦ二量体分子が共有結合によって前記マトリックスに固定化されることを特徴とする、請求項１１に記載のカラム調製方法。
【請求項13】
前記ＶＥＧＦ二量体分子がアフェレーシス用カラムに結合されることを特徴とする子癇前症の治療に用いるための請求項２～１０のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子。
【請求項14】
請求項２～１０のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子をコードする核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項15】
請求項２～１０のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子を含み、請求項１５に記載の発現ベクターを含み、および／または、請求項２～１０のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子をコードする核酸配列を含む組換え宿主細胞株。
【請求項16】
血液からｓＦｌｔ－１を分離するかおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出するための方法であって、請求項１または３～９のいずれか一項に記載のカラムまたは請求項２～９のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子を血液とインキュベートし、前記血液からｓＦｌｔ－１を分離することおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを前記血液中に放出させることを含む、方法。
【請求項17】
血液からｓＦｌｔ－１を分離するため、および／または、ｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出するための、請求項１または３～９のいずれか一項に記載のカラムまたは請求項２～９のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ二量体分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）二量体分子を含むカラム、そのようなカラムの調製方法、ＶＥＧＦ二量体分子、ＶＥＧＦ二量体コード化発現ベクターおよび組換え宿主細胞、並びにそれらに関連する使用および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーは、血小板由来増殖因子ファミリーのシスチンノット増殖因子と呼ばれる増殖因子サブファミリーである。ＶＥＧＦファミリーのメンバーには、ＶＥＧＦ－Ａ（しばしばＶＥＧＦと呼ばれる）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、および胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）がある。ＶＥＧＦファミリーメンバーは通常、細胞のＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＶＥＧＦＲ－３のうち少なくとも１つと相互作用するリガンドとして機能する。これにより、ＶＥＧＦファミリーメンバーは血管系形成（胚の循環器系がｄｅ ｎｏｖｏで形成されることによる胚での血管の形成）や血管新生（既存の血管から血管が形成されること）などの血管の形成に関わる重要なシグナル伝達タンパク質として働いている可能性がある。ＶＥＧＦファミリーメンバーとそのＶＥＧＦレセプターの相互作用レベルの欠陥は、妊婦の子癇前症などの重篤な疾病を引き起こす場合がある。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーは、血小板由来増殖因子ファミリーのシスチンノット増殖因子と呼ばれる増殖因子サブファミリーである。ＶＥＧＦファミリーのメンバーには、ＶＥＧＦ－Ａ（しばしばＶＥＧＦと呼ばれる）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、および胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）がある。ＶＥＧＦファミリーメンバーは通常、細胞のＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＶＥＧＦＲ－３のうち少なくとも１つと相互作用するリガンドとして機能する。これにより、ＶＥＧＦファミリーメンバーは血管系形成（胚の循環器系がｄｅ ｎｏｖｏで形成されることによる胚での血管の形成）や血管新生（既存の血管から血管が形成されること）などの血管の形成に関わる重要なシグナル伝達タンパク質として働いている可能性がある。ＶＥＧＦファミリーメンバーとそのＶＥＧＦレセプターの相互作用レベルの欠陥は、妊婦の子癇前症などの重篤な疾病を引き起こす場合がある。
【0003】
子癇前症は、妊娠２０週目以降の妊婦の４～８％が罹患する、生命を脅かす可能性のある多臓器疾患である（Ｓｉｂａｉ、１９９８年；Ｒｅｄｍａｎ、２００５年；Ｗａｌｋｅｒ、２０００年）（非特許文献１～３）。詳しくは、子癇前症は通常、新たに発症した高血圧と、尿中のタンパク質の減少（タンパク尿）で示される別の臓器系（最も一般的なのは腎臓）の障害と定義される。この状態は、生命を脅かす全身性内皮機能不全や発作、脳卒中、多臓器不全を伴う血栓性微小血管症（子癇やＨＥＬＬＰ症候群（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ Ｅｌｅｖａｔｅｄ Ｌｉｖｅｒ ｅｎｚｙｍｅｓ Ｌｏｗ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）とも呼ばれる）に進行する。
【0004】
子癇前症の病態生理の機構は、母体循環系における血管新生因子と抗血管新生因子のアンバランスであるとされている。現在の知見によると、胎盤虚血では、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ－１）の可溶性スプライス変異体であるｓＦｌｔ－１の発現と（おそらく絨毛細胞から放出される（Ｍａｙｎａｒｄら、２００３年）（非特許文献４））全身への放出が増加する。ｓＦｌｔ－１が強力なＶＥＧＦと胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）拮抗薬として作用するのは、これらの分子を除去・中和することによる。その結果、内皮の栄養シグナルが絶え間なく失われ、高血圧やタンパク尿を伴う全身性の内皮機能不全を引き起こす。これらは疾患の第一の特徴的な症状であって、母体やその結果としてその胎児にも深刻な影響を与える。
【0005】
子癇前症患者では、ｓＦｌｔ－１の上昇と循環ＰｌＧＦ血漿濃度の低下が、差し迫った疾患の強力な予測マーカーとしてますます進展し、症状発現の最大５週間前に検出可能である（Ｌｅｖｉｎｅら、２００４年）（非特許文献５）。
【0006】
今のところ、体外式アフェレーシス（デキストラン硫酸、Ｈ．Ｅ．Ｌ．Ｐ．）や、血漿分離に関する臨床試験第二相の小規模フィージビリティ・パイロットスタディがあるだけである。重篤な子癇前症に対する有効な治療・予防法は、妊娠の早期終了を除き、現在までのところ無い（ＡＣＯＧ、２０１９年）（非特許文献６）。この点が特に問題であるのは、推定妊娠（ＥＧＡ）３４週以前の早期子癇前症の患者である。この時期では、妊娠の延長が胎児には有益であるが、同時に母体には有害であり、解決できない治療上のジレンマが生じる可能性がある。
【0007】
治療法としては、例えば、ＶＥＧＦ１２１やＰｌＧＦなどの組換えタンパク質の全身投与が挙げられる。その結果、動物モデルでは子癇前症の症状を抑制することができた（Ｍａｋｒｉｓら、２０１６年；Ｌｉら、２００７年）（非特許文献７～８）。しかし、ＶＥＧＦとＰｌＧＦの投与には、ＶＥＧＦの場合は母体に重大な用量依存性の副作用があり、ＰｌＧＦの場合は半減期が短いため投与経路が制限される（Ｅｄｄｙら、２０１８年）（非特許文献９）。また、安定化ｓｉＲＮＡの投与は、マウスおよびヒヒの子癇前症モデルにおいて、Ｆｌｔ－１ ｍＲＮＡに影響を与えることなく、ｓＦｌｔ－１の胎盤過剰発現を抑制した（Ｔｕｒａｎｏｖら、２０１８年）（非特許文献１０）。
【0008】
治療法のさらなる開発には、子癇前症の複雑な病態生理を理解することが不可欠である。マウス実験やヒト胎盤のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験によると、トロフォブラスト由来のｓＦｌｔ－１は胎盤の血流低下や虚血に応答して放出される母体のＶＥＧＦから胎児を保護する（Ｆａｎら、２０１４年）（非特許文献１１）。このモデルによれば、胎盤のｓＦｌｔ－１が母体循環に過剰に流れ込むことは、主として生理的な反応の意図しない過剰を意味する。したがって、ｓＦｌｔ－１の発現を標的とした治療法は、胎盤におけるｓＦｌｔ－１の生理的機能を損ない、胎児を母体のＶＥＧＦレベルの上昇にさらす可能性があるため、注意が必要である（Ｔｕｒａｎｏｖら、２０１８年）（非特許文献１０）。母体の血流に循環するｓＦｌｔ－１は、ｓＦｌｔ－１全体の負荷にはほとんど寄与せず、その高い正電荷のために主に細胞外マトリックスに蓄積される。しかし、循環に少ない割合で存在するｓＦｌｔ－１だけが、内皮機能不全や多臓器疾患を引き起こすようである。胎盤におけるｓＦｌｔ－１の保護的役割と、循環しているｓＦｌｔ－１の有害な機能を考慮すると、ｓＦｌｔ－１の体外除去の原理は魅力的である。
【0009】
したがって、組換えタンパク質の全身投与以外に、ヒトの妊娠中にｓＦｌｔ－１を除去し、子癇前症妊娠の血管新生バランスを回復させる体外戦略が検討されている。ｓＦｌｔ－１の体外アフェレーシスは、主に循環しているｓＦｌｔ－１を対象とし、再分配後のｓＦｌｔ－１の組織や胎盤でのレベルには二次的にしか影響を与えない。
【0010】
その一つの方法は、重症初期子癇前症の妊婦でのアフェレーシスにおいて、デキストラン硫酸を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる循環ｓＦｌｔ－１の体外吸着である（Ｔｈａｄｈａｎｉら、２０１１年；Ｔｈａｄｈａｎｉら、２０１６年）（非特許文献１２～１３）。この方法では、正電荷を持つｓＦｌｔ－１が負電荷を持つデキストラン硫酸マトリックスに非特異的に保持される。しかし、デキストラン硫酸のような電荷依存性のリガンドは非常に非特異的であるため、他のタンパク質を不要に除去してしまう可能性もある。
【0011】
さらに、循環するｓＦｌｔ－１を体外吸着する方法として、ｓＦｌｔ－１を低減する抗体ベースのアプローチがある（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２４７６５０号明細書（特許文献１））。しかし、複合体化したＶＥＧＦとＰｌＧＦも同時に除去され、血管新生バランスの回復に関しては介入の効力が低下する。さらにまた、ｓＦｌｔ－１特異的抗体の免疫原性ならびにカラムからの抗体の漏出による副作用も不明である。
【0012】
別の方法では、ＰｌＧＦなどのリガンドをマトリックスに固定化し、子癇前症に罹患する妊婦でのアフェレーシスに適用する（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２４７６５０号明細書（特許文献１））。これにより、ＰｌＧＦカラムは受容部位に結合して、ｓＦｌｔ－１を除去する。しかし、ＰｌＧＦの親和性は低いため、捕獲に利用するＰｌＧＦ分子は複合体化したＶＥＧＦと競合することができない。したがって、ＰｌＧＦカラムは、遊離ｓＦｌｔ－１または循環するＰｌＧＦ－ｓＦｌｔ－１複合体からｓＦｌｔ－１を除去するだけである。ＰｌＧＦカラムはＶＥＧＦと複合体化したｓＦｌｔ－１を除去せず、ＶＥＧＦを遊離させない。したがって、この方法はｓＦｌｔ－１を部分的に除去するだけで、潜在的に競合的なアフェレーシスシステムと比較して、血管新生バランスを回復させることはできない。
【0013】
さらに、単量体切断型ＶＥＧＦを用いて機能付与した磁気ビーズをアフェレーシスに適用して、ｓＦｌｔ－１を捕獲するアプローチもある（Ｔｒａｐｉｅｌｌａ－Ａｌｆｏｎｓｏら、２０１９年）（非特許文献１４）。この方法では、細菌で発現させたＶＥＧＦの切断体（ＶＥＧＦ９５）とビオチン化ビーズを使用した。しかし、この方法はヒトでの適用には実施可能性がない。というのも、リガンドとマトリックスは非共有結合されており、アビジン－ビオチンベースの相互作用による免疫原性が許容できないからである（Ｊａｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ、２０１７年）（非特許文献１５）。また、バクテリアで発現させたＶＥＧＦ９５の適用には、別の制限がある。ＶＥＧＦの糖鎖修飾はＶＥＧＦの結合親和性や活性に影響を与えないことが報告されているが（Ｃｌａｆｆｅｙら、１９９５年；Ｐｅｒｅｔｚら、１９９２年）（非特許文献１６～１７）、細菌に特異的な翻訳後修飾は免疫原性を悪化させる可能性がある（Ｋｕｒｉａｋｏｓｅら、２０１６年）（非特許文献１８）。さらに、切断型ＶＥＧＦアイソフォームＶＥＧＦ９５は、受容体結合界面の残基を欠くため、ｓＦｌｔ－１との相互作用が低下している。また、この方法では、ＶＥＧＦ１６５と複合体化したｓＦｌｔ－１の除去には至らず、ＶＥＧＦ１６５の遊離も生じない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０１０／０２４７６５０号明細書
【非特許文献】
【0015】
【非特許文献1】Sibai BM. Prevention of preeclampsia: a big disappointment. Am J Obstet Gynecol. 1998;179:1275-1278.
【非特許文献2】Redman CW. Latest Advances in Understanding Preeclampsia. Science. 2005;308:1592-1594.
【非特許文献3】Walker JJ. Pre-eclampsia. Lancet. 2000;356:1260-1265.
【非特許文献4】Maynard SE, Min J-Y, Merchan J, Lim K-H, Li J, Mondal S, Libermann TA, Mor-gan JP, Sellke FW, Stillman IE, Epstein FH, Sukhatme VP, Karumanchi SA. Ex-cess placental soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may contribute to endo-thelial dysfunction, hypertension, and proteinuria in preeclampsia. J Clin Invest. 2003;111:649-658.
【非特許文献5】Levine RJ, Maynard SE, Qian C, Lim K-H, England LJ, Yu KF, Schisterman EF, Thadhani R, Sachs BP, Epstein FH, Sibai BM, Sukhatme VP, Karumanchi SA. Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia. N Engl J Med. 2004;350:672-683.
【非特許文献6】ACOG Practice Bulletin No. 202: Gestational Hypertension and Preeclampsia. Obstetrics & Gynecology. 2019;133:e1-e25.
【非特許文献7】Makris A, Yeung KR, Lim SM, Sunderland N, Heffernan S, Thompson JF, Ili-opoulos J, Killingsworth MC, Yong J, Xu B, Ogle RF, Thadhani R, Karumanchi SA, Hennessy A. Placental Growth Factor Reduces Blood Pressure in a Utero-placental Ischemia Model of Preeclampsia in Nonhuman Primates. Hyperten-sion. 2016;67:1263-1272.
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【非特許文献11】Fan X, Rai A, Kambham N, Sung JF, Singh N, Petitt M, Dhal S, Agrawal R, Sut-ton RE, Druzin ML, Gambhir SS, Ambati BK, Cross JC, Nayak NR. Endometrial VEGF induces placental sFLT1 and leads to pregnancy complications. Journal of Clinical Investigation. 2014;124:4941-4952.
【非特許文献12】Thadhani R, Kisner T, Hagmann H, Bossung V, Noack S, Schaarschmidt W, Jank A, Kribs A, Cornely OA, Kreyssig C, Hemphill L, Rigby AC, Khedkar S, Lindner TH, Mallmann P, Stepan H, Karumanchi SA, Benzing T. Pilot Study of Extracorporeal Removal of Soluble Fms-Like Tyrosine Kinase 1 in Preeclampsia. Circulation. 2011;124:940-950.
【非特許文献13】Thadhani R, Hagmann H, Schaarschmidt W, Roth B, Cingoez T, Karumanchi SA, Wenger J, Lucchesi KJ, Tamez H, Lindner T, Fridman A, Thome U, Kribs A, Danner M, Hamacher S, Mallmann P, Stepan H, Benzing T. Removal of Soluble Fms-Like Tyrosine Kinase-1 by Dextran Sulfate Apheresis in Preeclampsia. J Am Soc Nephrol. 2016;27:903-913.
【非特許文献14】Trapiella-Alfonso L, Alexandre L, Fraichard C, Pons K, Dumas S, Huart L, Gaucher JF, Hebert-Schuster M, Guibourdenche J, Fournier T, Vidal M, Broutin I, Lecomte-Raclet L, Malaquin L, Descroix S, Tsatsaris V, Gagey-Eilstein N, Lecarpentier E. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) Functionalized Magnetic Beads in a Microfluidic Device to Improve the Angiogenic Balance in Preeclampsia. Hypertension. 2019 Jul;74(1):145-153. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.118.12380. Epub 2019 May 13.
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【非特許文献18】Kuriakose A, Chirmule N, Nair P. Immunogenicity of Biotherapeutics: Causes and Association with Posttranslational Modifications. Journal of Immunology Research. 2016;2016:1-18.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
子癇前症の治療手段を提供する必要がある。特に、ヒトにおいて子癇前症を効率的に治療できるように、患者の血液からｓＦｌｔ－１を効率的に除去可能とする手段を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0017】
発明の概要
第一血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分子と第二ＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ二量体分子を含むカラムが提供される。
第一血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分子と第二ＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ二量体分子を含むカラムが提供される。
【0018】
本発明はさらに、第一および第二ＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ二量体分子に関するものであり、前記第一および／または前記第二ＶＥＧＦ分子は１２２～２５０のアミノ酸長を有する。
【0019】
さらにまた、本発明は、本発明のカラムの調製方法であって、
ａ）第一血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分子と第二ＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ二量体分子を真核生物発現によって調製する工程と、
ｂ）工程ａ）の前記二量体をマトリックスに固定化する工程を含む方法に関する。
ａ）第一血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分子と第二ＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ二量体分子を真核生物発現によって調製する工程と、
ｂ）工程ａ）の前記二量体をマトリックスに固定化する工程を含む方法に関する。
【0020】
さらに提供されるのは、ＶＥＧＦ二量体分子がアフェレーシス用カラムに結合されることを特徴とする子癇前症の治療に用いるための本発明のＶＥＧＦ二量体分子である。
【0021】
本発明はさらに、本発明のＶＥＧＦ二量体分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターに関する。
【0022】
さらにまた、本発明は、本発明のＶＥＧＦ二量体分子を含むか、本発明の発現ベクターを含むか、および／または本発明のＶＥＧＦ二量体分子をコードする核酸配列を含む、組換え宿主細胞株に関する。
【0023】
また提供されるのは、血液からｓＦｌｔ－１を分離するかおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出するための方法であって、本発明のカラムまたはＶＥＧＦ二量体分子を血液とインキュベートし、前記血液からｓＦｌｔ－１を分離することおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを前記血液中に放出させることを含む、方法である。
【0024】
さらに、本発明は、血液からｓＦｌｔ－１を分離するためおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出するための、本発明のカラムまたはＶＥＧＦ二量体分子の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
図の説明
【図1】図１は、ｓｃＶＥＧＦ１６５の分子モデリングとネガティブ染色電子顕微鏡観察を示す。Ａ）ｓｃＶＥＧＦ１６５発現プラスミドと分子間ジスルフィド結合で架橋された多量体への潜在的な集合様式を模式的に表したものである。Ｂ）２本の単鎖ＶＥＧＦ１６５－二量体が四量体ＶＥＧＦとして集合している様子をバンドとリボンで表現したものである。１４アミノ酸のリンカーが赤い球で表されている。Ｃ）精製した組換えｍｏＶＥＧＦ１６５とｓｃＶＥＧＦ１６５の分子構造をネガティブ染色電子顕微鏡観察で可視化した。ｍｏＶＥＧＦ１６５分子はダンベル状の二量体構造として現れ、少数の単量体の点がある。ｓｃＶＥＧＦ１６５は四量体構造と少数のダンベル状の単一のｓｃＶＥＧＦ１６５分子として出現した。拡大画像では、それぞれの分子の輪郭が自動画像処理によって描かれた。
【図2】図２は、ｓＦｌｔ－１捕獲分子の結合特性を示す。Ａ）ＶＥＧＦ－ｔｒａｐを用いた定量的ＥＬＩＳＡ。吸光度４５０ｎｍとＶＥＧＦ－ｔｒａｐ濃度の関係を［ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ］を対数にして半対数スケールでプロットしたもの。この曲線は平衡解離定数（Ｋｄ）を定義する。最も低いＫｄはｓｃＶＥＧＦ１６５のもので、最も強い相互作用があることを示している。各値は、３回実験を繰り返して計算した平均値（ｎ＝３）を示す。Ｂ）異なるＶＥＧＦ／ＰｌＧＦ変異体間の結合親和性を比較するために、３つの独立した反復実験から計算されたＫｄ値をまとめた。ｓｃＶＥＧＦ１６５は、最も低いＫｄ値、すなわち最も高い結合親和性を再現性よく得ることができる。３つの独立した実験からの平均値とＳＤ（＊ｐ＜０．０２）をプロットした。
【図3】図３は、ｓＦｌｔ－１捕獲アフェレーシスカラムの作製と基質マトリックスの評価を示す。Ａ）理想的なアフェレーシスセットアップの同定。等量の組換えｍｏＰｌＧＦ、ｍｏＶＥＧＦ１６５、またはｓｃＶＥＧＦ１６５をｓｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴ、臭化シアノ活性化セファロース、またはアミノ連結アガロース樹脂に結合させた。ヒト血清中濃度１６００ｐｇ／ｍｌのｓＦｌｔ－１に対する結合親和性を測定した。フロースルー中のｓＦｌｔ－１濃度を定量的ｓＦｌｔ－１ ＥＬＩＳＡで決定した。３つの結合化タンパク質すべてに関する測定では、アミノ連結アガロース系を用いた場合に最も顕著なｓＦｌｔ－１除去が見られた。Ｂ）ｓｃＶＥＧＦ１６５アガロースカラムの長期安定性を評価した。ヒト血清試料からの吸着試験を１、１５、３０、６０、９０日で実施した。９０日経つと、結合するｓＦｌｔ－１の減少がわずかに認められただけであった。
【図4】図４は、ヒト血清試料を用いたｓＦｌｔ－１捕獲分子の特徴解析を示す。Ａ）すべての固定化ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦ変異体とＦｌｔ－１特異的抗体（ｘ軸）に関して、アフェレーシス後のサンプル中のｓＦｌｔ－１濃度（ｐｇ／ｍｌ）（ｙ軸）を示す。Ｂ）すべての固定化ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦ変異体とＦｌｔ－１特異的抗体（ｘ軸）に関して、アフェレーシス後のサンプル中のＰｌＧＦ濃度（ｐｇ／ｍｌ）（ｙ軸）を示す。Ｃ）すべての固定化ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦ変異体とＦｌｔ－１特異的抗体（ｘ軸）に関して、アフェレーシス後のサンプル中のＶＥＧＦ濃度（ｐｇ／ｍｌ）（ｙ軸）を示す。
【図5】図５は、ｓｃＶＥＧＦ１６５カラムのｓＦｌｔ－１クリアランスとＶＥＧＦ／ＰｌＧＦ放出を検証したものである。子癇前症患者１０名の血清サンプル（ｘ軸）をｓｃＶＥＧＦ１６５アフェレーシスで処理した。ｓＦｌｔ－１（Ａ）、遊離ＰｌＧＦ（Ｂ）、遊離ＶＥＧＦ（Ｃ）レベル（ｙ軸）を吸着前後で測定した。
【図6】図６は、各種ＶＥＧＦとＰｌＧＦ依存性ｓＦｌｔ－１アフェレーシス戦略の特徴を抗体ベースのセットアップと比較したものを示す。Ｆｌｔ－１特異的抗体を用いたアフェレーシスシステムでは、ｓＦｌｔ－１レベルは低下するが、内因性ＰｌＧＦやＶＥＧＦは遊離しない（左端パネル）。ＰｌＧＦ含有吸着カラムはｓＦｌｔ－１を保持し、低量の内因性ＰｌＧＦを遊離するが、内因性ＶＥＧＦは遊離しない。単量体ＶＥＧＦ１６５カラムはｓＦｌｔ－１を捕獲し、ＰｌＧＦとＶＥＧＦも放出する。ｓＦｌｔ－１に対するｓｃＶＥＧＦ１６５の結合特性が向上した結果、ｓＦｌｔ－１を最も効率的に吸着し、ＰｌＧＦとＶＥＧＦを競合的に放出する（右端パネル）。
【図7】図７は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）をクーマシー染色して示される組換えタンパク質の精製を示す。ドキシサイクリン処理により発現が誘導された標記タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞の上清のクーマシー染色である。タンパク質を含む最初の培地をインプットと呼ぶことにした。洗浄液だけでなくフロースルーでも組換えタンパク質は検出されなかったが、溶出画分では各タンパク質の明確な精製プロファイルが検出できた。
【発明を実施するための形態】
【0026】
発明の詳細な説明
本発明の第一観点は、第一および第二の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分子を含むＶＥＧＦ二量体分子を含むカラムに関する。
本発明の第一観点は、第一および第二の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分子を含むＶＥＧＦ二量体分子を含むカラムに関する。
【0027】
驚くべきことに、実施例の結果、試験したすべての樹脂に結合させた場合、単量体ＰｌＧＦ（ｍｏＰｌＧＦ）または単量体（ｍｏＶＥＧＦ１６５）と比較して、ｓｃＶＥＧＦ１６５という本発明の切断型（truncated）ＶＥＧＦの二量体を含むカラムではヒト血清からのｓＦｌｔ－１の吸着量が有意に高いことが示された。特に、実施例によれば、本発明の二量体（ｓｃＶＥＧＦ１６５）をアガロースマトリックスに固定化したカラムを用いて、１回のランで最大８６．１６％のｓＦｌｔ－１の減少が達成された（図３Ａ）。ｓｃＶＥＧＦ１６５アガロースカラムの長期安定性を調べると、ｓＦｌｔ－１との結合がわずかに減少したのみであることがさらに分かった（図３Ｂ）。ＰｌＧＦの放出、したがって血中ＰｌＧＦ濃度の上昇は、本発明の二量体で最も顕著である一方、ｍｏＶＥＧＦ１６５を用いたアフェレーシスは、ｓｃＶＥＧＦ１６５の場合の半分のＰｌＧＦの放出しかもたらさなかった。注目すべきは、ｓＦｌｔ－１と結合していたＶＥＧＦの放出は、ｓｃＶＥＧＦ１６５で最も顕著であった（図４）。これは、結合親和性がより高いためｓＦｌｔ－１に対してｓｃＶＥＧＦ１６５が競合的に結合していることを示唆している。したがって、特に、ｍｏＰｌＧＦと比較してｓｃＰｌＧＦの結合親和性がほぼ等しいという事実を考慮すると、ｓｃＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ－ｔｒａｐへの結合親和性は、ｍｏＶＥＧＦ１６５の結合親和性と比べて予想外に１１％高いことが示された（図２）。
【0028】
一般に、以下に示す実施例の結果から、抗体を介したアフェレーシスや単量体のＶＥＧＦまたはＰｌＧＦを用いたアプローチと比較して、本発明のＶＥＧＦ二量体分子を用いたアフェレーシスのユニークな特性は、ｓＦｌｔ－１に対する親和性が向上し、したがってＶＥＧＦおよびＰｌＧＦを効率的に放出できることだと結論づけることができる（図６）。
【0029】
要約すると、本発明は、子癇前症を治療するための特異的ＶＥＧＦベースｓＦｌｔ－１アフェレーシスシステムであって、生体内で適用可能なものを初めて記述する。ＶＥＧＦ分子のユニークな分子特性を利用することで、ｓＦｌｔ－１を固定化すると同時に、複合体化したＶＥＧＦとＰｌＧＦを競合的に放出して、子癇前症の患者における血管新生バランスを回復させるための特異性の高いアフェレーシスカラムを作製することが可能になった。ＶＥＧＦ二量体は複雑な高次構造を持ち、受容体結合部位が露出しているため、短いペプチド配列よりも全長のＶＥＧＦ二量体を使用した方がより親和性が高くなる。
【0030】
アフェレーシスを行うためのカラムは当該技術分野で知られている（Ｔｈａｄｈａｎｉら、２０１１年；Ｔｈａｄｈａｎｉら、２０１６年）。本発明に係る用語「カラム」は、２つの開放端を有する内腔を含む任意のデバイスを表す。例えば、アフェレーシス用カラムの場合、患者からの血液を第一開放端からカラムの内腔に導き、内腔を通過した後、第二開放端から内腔外に導くことを意味する。
【0031】
本発明のカラムは、通常、クロマトグラフィー分離法のためのマトリックスを担持することができる。好ましくは、本発明のカラムは、血液または血漿のような混合物の成分を分離するのに適している。例えば、カラムは、アフィニティークロマトグラフィーに使用されるようなクロマトグラフィー用カラムであってもよい。
【0032】
カラムはさらに、当業者によってクロマトグラフィーカラムに適していることが知られている任意の素材、例えば、金属、ガラスおよび／またはプラスチック（例えば、ポリカーボネート）で作られていてもよい。一般的には、その素材はアフェレーシスなどの医療用途に適している。さらに、カラムの大きさや容積は問わない。好ましくは、カラムは、アフェレーシスで適用するのに適した容量（例えば、２０～３００ｍｌ）を有する。さらに、本発明のカラムは、当業者にクロマトグラフィー法に適することが知られている任意の形状、例えば、円筒形や管状を有していてもよい。通常、本発明に係るカラムの空洞部には、マトリックスが充填されている。
【0033】
このカラムは、体外療法、例えばアフェレーシスなどの医療方法に適用するのに適しており、人の血液または血漿をカラムに通すことにより、１つまたは複数の特定の成分を分離し、残りの１つまたは複数の成分を循環に戻すことができる。さらに、カラムは、例えば、ガンマ線照射、電子線照射、Ｘ線照射などの照射によって滅菌されてもよい。
【0034】
本発明のカラムは、第一および第二の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分子を含むＶＥＧＦ二量体分子を含む。
【0035】
ＶＥＧＦ分子は当該技術分野で既知である。ＶＥＧＦ二量体分子において本発明に従って構成されるＶＥＧＦ分子は、その切断型を含む当業者に公知の任意の血管内皮増殖因子タンパク質分子であってもよく、任意の種に由来するものであってもよい。例えば、ＶＥＧＦ分子は、マウス、ラットまたはヒトＶＥＧＦのような哺乳類ＶＥＧＦであってもよい。好ましくは、ＶＥＧＦ分子は、ヒトＶＥＧＦである。好ましくは、ＶＥＧＦ分子はＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－ＤまたはＰｌＧＦであり、より好ましくは、ＶＥＧＦ分子はＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－ＢまたはＰｌＧＦであり、さらに好ましくは、ＶＥＧＦ分子はＶＥＧＦ－ＡまたはＶＥＧＦ－Ｂであり、最も好ましくは、ＶＥＧＦ分子はＶＥＧＦ－Ａである。
【0036】
好ましくは、ＶＥＧＦ分子はヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＶＥＧＦ－Ｂ、ヒトＶＥＧＦ－Ｃ、ヒトＶＥＧＦ－ＤまたはヒトＰｌＧＦであり、より好ましくは、ＶＥＧＦ分子はヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＶＥＧＦ－ＢまたはヒトＰｌＧＦであり、さらにより好ましくは、ＶＥＧＦ分子はヒトＶＥＧＦ－ＡまたはヒトＶＥＧＦ－Ｂであり、最も好ましくは、ＶＥＧＦ分子はヒトＶＥＧＦ－Ａである。
【0037】
本発明の第一の観点のカラムのＶＥＧＦ二量体に含まれるＶＥＧＦ分子は、任意の長さであってよい。本発明の第一の観点のカラムのＶＥＧＦ二量体に含まれるＶＥＧＦ分子は、全長ＶＥＧＦであってもよく、好ましくは全長ＶＥＧＦ－Ａである。例えば、ＶＥＧＦ分子は、ヒト完全長ＶＥＧＦ－Ａの配列（配列番号：１）を含むか、またはその配列からなる場合がある。
【0038】
さらに、ＶＥＧＦ分子は、ＶＥＧＦの切断型、例えば、ＶＥＧＦ－Ａの切断型であってもよい。好ましくは、本発明の第一の観点のカラムのＶＥＧＦ分子は、ヒトＶＥＧＦの切断型、より好ましくはヒトＶＥＧＦ－Ａの切断型、例えば、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１３８、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１４５、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６２、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５ｂ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１８９またはヒトＶＥＧＦ－Ａ２０６（ここでは、番号は、天然型ヒトＶＥＧＦ－Ａの配列に基づいてそれぞれのタンパク質におけるタンパク質番号に相当する）であってもよい。
【0039】
特に好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５である。
【0040】
切断型ＶＥＧＦ分子は、切断された天然型ＶＥＧＦ分子配列または以下に述べるような付加的な拡張部分のみを含んでもよい。例えば、第一および／または第二のＶＥＧＦ分子は、１２２アミノ酸、好ましくは１６５アミノ酸の長さまでで切断されていてもよい。
【0041】
好ましくは、本発明の第一の観点のカラムのＶＥＧＦ二量体に含まれる第一のＶＥＧＦ分子は、Ｎ末端ヘリックス（２４～３５）、β３とβ４をつなぐループ（６９～７４）およびストランドβ７（１１１～１１４）を含み、第二のＶＥＧＦ分子は連結ターン（７９～９１）と共にストランドβ２（５４～５６）およびストランドβ５とβ６由来の残基を含む。その場合、第一および第二のＶＥＧＦ分子は逆平行方向に二量体化し、それによってＶＥＧＦ二量体分子を形成する際にｓＦｌｔ－１結合を担う領域を一緒に含む、すなわちｓＦｌｔ－１結合部位は両単量体からのそれぞれの残基で構成されていてもよい。
【0042】
また、本発明の第一の観点のカラムで用いられるようなＶＥＧＦ二量体分子の場合、切断型第一ＶＥＧＦ分子がアミノ酸１～１１４からなること、すなわちＮ末端ヘリックス（２４－３５）、β３とβ４をつなぐループ（６９－７４）およびストランドβ７（１１１－１１４）を含むｓＦｌｔ－１結合部位を含み、切断型第二ＶＥＧＦ単量体が連結ターン（７９－９１）と共にストランドβ２（５４－５６）およびストランドβ５とβ６由来の残基を含むアミノ酸１～９１を含む。
【0043】
また、好ましくは、第一および／または第二のＶＥＧＦ分子は、ＶＥＧＦアミノ酸残基Ａｓｐ６３、Ｇｌｕ６４およびＧｌｕ６７（番号は天然型ヒトＶＥＧＦ－Ａアミノ酸配列のものに相当）を含む。
【0044】
さらにまた、ＶＥＧＦ分子のアミノ酸配列は、天然型配列であってもよいし、変異していてもよい。ＶＥＧＦ分子は、０、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の変異を含んでいてもよい。変異はＶＥＧＦ分子のどのアミノ酸にも影響を及ぼす可能性がある。例えば、アミノ酸を変異させて、ＶＥＧＦ分子のｓＦｌｔ－１への結合親和性を高めることができる。また、変異は、１つまたは複数のアミノ酸を、同じまたは類似の電荷および／またはサイズを有するアミノ酸と置換することからなる場合もある。
【0045】
ＶＥＧＦ分子は、リン酸化、グリコシル化および／またはアセチル化など、当業者に知られている任意の形態の翻訳後修飾を含んでいてもよい。さらにまた、ＶＥＧＦ分子は、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の分子内ジスルフィド結合を含んでいてもよい。
【0046】
さらに、本発明のカラムにおいて、第一および第二のＶＥＧＦ分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）二量体分子の一部である。
【0047】
本発明に係る用語「ＶＥＧＦ二量体分子」は、少なくとも２つのＶＥＧＦ分子、好ましくは２つのＶＥＧＦ分子を含む任意の分子を表す。ＶＥＧＦ二量体分子の一部である少なくとも２つのＶＥＧＦ分子は、イオン結合、共有結合、ファンデルワース力、水素架橋結合、疎水性相互作用および／または静電相互作用によって１、２、３、または４以上のアミノ酸を介して相互作用可能である。
【0048】
好ましくは、ＶＥＧＦ二量体分子の一部である少なくとも２つのＶＥＧＦ分子は、少なくとも１つの共有結合によって連結されていてもよい。より好ましくは、ＶＥＧＦ二量体分子の一部である少なくとも２つのＶＥＧＦ分子は、一つの共有結合によって連結されていてもよく、例えば、単鎖分子を形成している場合がある。例えば、第一のＶＥＧＦ分子と第二のＶＥＧＦ分子の場合、両方のＶＥＧＦ分子をコードする核酸配列が１つの核酸配列分子に連結され、両方のＶＥＧＦ分子を含む１つのアミノ酸分子が発現するようにしてもよい。
【0049】
ＶＥＧＦ二量体分子における第一および第二のＶＥＧＦ分子は、さらに１、２、３、４またはそれ以上の分子間および／または分子内ジスルフィド結合によって連結されていてもよい。例えば、ＶＥＧＦ二量体分子は、一または複数の分子内ジスルフィド結合によって連結された２つのＶＥＧＦ分子（例、ｓｃＶＥＧＦ１６５分子）の開放構造を形成してもよい。
【0050】
あるいは、ＶＥＧＦ分子二量体における第一および第二のＶＥＧＦ分子は、任意の分子内ジスルフィド結合によって連結されている必要はない。
【0051】
上記の分子内または分子間のジスルフィド架橋のいずれかに関与する任意のアミノ酸、あるいは、直接または立体的に隣接している任意のアミノ酸は、変異していてもよい。
【0052】
ＶＥＧＦ二量体分子を形成するための第一および第二のＶＥＧＦ分子の二量化は、単一モノマー間の分子間ジスルフィド結合を利用して、逆平行のサイドバイサイド方式で起こり、受容体タンパク質（Ｆｌｔ－１／ｓＦｌｔ－１）との相互作用のための平面を形成する。Ｆｌｔ－１結合部位は、一方のモノマーでは３つのβシート（β３；β４；β７）とＮ末端ヘリックスの残基を含み、他方のモノマーでは３つの相補的なβシート（β２；β５；β６）の残基を含む場合がある。ｓＦｌｔ－１に対するＶＥＧＦの親和性を高めるための変異戦略では、これらの残基のいずれか一つに影響を与える可能性もあるし、それらのいずれにもまったく影響を与えない可能性もある。
【0053】
さらにまた、立体的な効果もＶＥＧＦとＰｌＧＦの多量体におけるｓＦｌｔ－１の親和性に影響を与える可能性があり、したがって、１つ以上の変異によって変化する可能性もある。
【0054】
さらにまた、ＶＥＧＦ二量体分子は、ＶＥＧＦ多量体分子（例、ＶＥＧＦ三量体、ＶＥＧＦ四量体、または任意の数のＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ多量体の任意の形態）の一部であってもよい。したがって、カラムは、ＶＥＧＦ三量体、ＶＥＧＦ四量体または任意の形態のＶＥＧＦ多量体を含む場合もある。さらに、カラムは、一種類の多量体型のみ（例、ＶＥＧＦ二量体のみ、ＶＥＧＦ三量体のみ、またはＶＥＧＦ四量体のみ）のＶＥＧＦ分子を含んでいてもよく、またはカラムは、任意の数のＶＥＧＦ分子を含む多量体の任意の混合物（例、ＶＥＧＦ二量体、ＶＥＧＦ三量体、ＶＥＧＦ四量体および／またはＶＥＧＦ多量体の混合物）を含む場合もある。
【0055】
さらにまた、ＶＥＧＦ二量体分子は、ＶＥＧＦ多量体構造の一部であってもよい。例えば、第一のＶＥＧＦ二量体分子は第二のＶＥＧＦ二量体分子と（例えば、分子間ジスルフィド結合を介して）相互作用し、ＶＥＧＦ分子の四量体、または多量体鎖を形成することができる。
【0056】
特に好ましい実施形態では、本発明のカラムのＶＥＧＦ二量体分子は、後述する本発明の第二の観点に係るＶＥＧＦ二量体分子である。
【0057】
本発明の第二の観点は、第一および第二ＶＥＧＦ分子を含むＶＥＧＦ二量体分子に関するものであり、前記第一および／または前記第二ＶＥＧＦ分子は１２２～２５０のアミノ酸長を有する。
【0058】
本発明の第一の観点によるＶＥＧＦ分子には制限がない一方で、第一および／または第二のＶＥＧＦ分子の長さは、本発明の第二の観点では１２２～２５０アミノ酸に制限されていることを除いては、本発明の第一の観点に係るカラムの第一および第二のＶＥＧＦ分子に関して上述した全ての実施形態および特徴は、この第二の観点にも適用される。例えば、第一および／または第二のＶＥＧＦ分子が切断型である場合、本発明の第二の観点のＶＥＧＦ分子は、好ましくは１２２～２５０アミノ酸長を有するヒトＶＥＧＦの切断型、より好ましくは１２２～２５０アミノ酸長を有するヒトＶＥＧＦ－Ａの切断型であってよい。例えば、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１３８、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１４５、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６２、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５ｂ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１８９またはヒトＶＥＧＦ－Ａ２０６（ここでは、番号は、天然型ヒトＶＥＧＦ－Ａの配列に基づいてそれぞれのタンパク質におけるタンパク質番号に相当する）であってもよい。
【0059】
さらに、第一および／または第二ＶＥＧＦ分子の長さに関する制限を除いては、本発明の第一の観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子に関して上述した全ての実施形態および特徴が、第二の観点にも適用される。
【0060】
以下の実施形態では、第一または第二の観点のみに関するものであることを示さない場合には、さらに、本発明の第一観点のカラムと本発明の第二観点のＶＥＧＦ二量体分子の両方について記載するものである。
【0061】
本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子は、常法により化学的に合成可能である。本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子を化学的に合成する方法は、当業者に周知である。
【0062】
さらにまた、ＶＥＧＦ二量体分子は、組換えタンパク質発現によって製造可能であり、例えば、真核細胞（例、ヒト細胞株（例、ＨＥＫ２９３Ｔ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ（ＥＢＮＡ）細胞株）、マウス細胞株、ラット細胞株、ハムスター細胞株、酵母細胞または昆虫細胞）で発現されてもよい。ＶＥＧＦ二量体分子の組換えタンパク質発現のための適切な方法は、当業者に周知である。例えば、ＶＥＧＦ二量体を表すヌクレオチド配列を含むクローニングされていない二本鎖直線ＤＮＡ断片を、例えばコドン最適化によってカスタマイズし、製造することができる。通常、ＤＮＡ断片は、プライマーを用いて増幅され、Ｎ末端ｓｔｒｅｐタグなどのタンパク質タグを持つ発現ベクター（例、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン発現ベクター）にクローン化される。一般に、安定細胞株は、トランスフェクション試薬やエレクトロポレーションを適用する等のトランスフェクション法を用いて、ベクターを細胞に導入することにより作製される。その後、上清または培養物全体を回収することにより、細胞からタンパク質を単離することができる（細胞からタンパク質が分泌されない場合）。
【0063】
引き続き、生成されたＶＥＧＦ二量体分子を通常、単離・精製する。本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子を分離・精製する方法は、当業者に周知である。例えば、ＶＥＧＦ二量体分子は、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過などのフィルター技術またはクロマトグラフィー技術、または他の既知の方法を用いて精製可能である。例えば、ＶＥＧＦ二量体分子は、タンパク質タグ（例、ＳｔｒｅｐタグまたはグルタチオンＳ－トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴ－タグ）、ヒスチジンタグ（ＨＩＳ－タグ））に連結して発現可能である。それにより、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（例、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴ（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉ－ｅｎｃｅ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ））またはグルタチオンまたはニッケルアフィニティークロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィーカラムを介して精製できる。アフィニティークロマトグラフィー中、あるいはその後、通常、プロテアーゼによってＶＥＧＦ二量体分子からタンパク質タグが切り離される。例えば、トロンビンプロテアーゼを用いてＶＥＧＦ二量体分子からＳｔｒｅｐタグを切り離すことができる。
【0064】
本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子は、一つの分子として合成または発現可能である。あるいは、本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子は、少なくとも二つの部分で合成または発現されて、その後連結されてもよい。例えば、本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体の第一および第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体の第一および第二ＶＥＧＦ分子は、別々に合成または発現され、その後、連結されてもよい。
【0065】
さらにまた、ＶＥＧＦ二量体分子あるいは第一および／または第二ＶＥＧＦ分子は、例えば、化学基を付加（例、翻訳後修飾）して化学的に修飾可能である。適切な化学修飾および化学修飾方法は当業者に周知であり、例えばリン酸化、グリコシル化および／またはアセチル化が挙げられる。
【0066】
好ましい実施形態では、本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子は、真核細胞によって発現される。
【0067】
本発明の第一観点に係るカラムの第一および第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および第二ＶＥＧＦ分子は、互いに異なっていてもよい。例えば、長さ、アミノ酸配列、翻訳後修飾が異なる場合がある。あるいは、本発明の第一観点に係るカラムの第一および第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および第二ＶＥＧＦ分子は、同一であってもよい。
【0068】
さらに好ましい実施形態では、本発明の第一観点に係るカラムの第一および第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および第二ＶＥＧＦ分子は、同一である。
【0069】
本発明の第一観点に係るカラムの第一および／または第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および／または第二ＶＥＧＦ分子は、ＶＥＧＦのＮ末端シグナル配列ＭＮＦＬＬＳＷＶＨＷＳＬＡＬＬＬＹＬＨＨＡＫＷＳＱＡ（配列番号：２）の一部または全部を欠いている場合がある。
【0070】
ＶＥＧＦのＮ末端シグナル配列の一部または全部は、発現ベクターに導入する前にＶＥＧＦ二量体配列あるいは第一および／または第二ＶＥＧＦ分子配列から切断してもよいし、組換え発現のために細胞に導入する前に発現ベクター中で切断してもよい。さらにまた、ＶＥＧＦのＮ末端シグナルペプチドの一部または全部は、合成または発現した第一および／または第二ＶＥＧＦ分子から切断した後にそれらを二量体として連結してもよいし、合成または発現した第二ＶＥＧＦ分子を第一ＶＥＧＦ分子に連結して二量体を形成させた後に第二ＶＥＧＦ分子から切断してもよい。ＶＥＧＦ核酸またはアミノ酸配列からＮ末端シグナル配列を切断する方法は、適切なヌクレアーゼまたはプロテアーゼと同様に、当業者に周知である。
【0071】
別の好ましい実施形態では、本発明の第一観点に係るカラムの第一および／または第二ＶＥＧＦ分子あるいは本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および／または第二ＶＥＧＦ分子は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く。
【0072】
さらにまた、本発明の第一観点に係るカラムの第一および／または第二ＶＥＧＦ分子あるいは本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および／または第二ＶＥＧＦ分子は、全長または切断型ＶＥＧＦ分子であって、追加的アミノ酸で伸長されている場合がある。詳細には、第一および／または第二ＶＥＧＦ分子は、そのＮ末端および／またはＣ末端が２５０アミノ酸の長さまで伸長されていてもよい。好ましくは、第一ＶＥＧＦ分子はそのＮ末端が伸長され、および／または、第二ＶＥＧＦモノマーはそのＣ末端が伸長されている。これにより、第一ＶＥＧＦ分子と第二ＶＥＧＦ分子のミスフォールディングを防ぐことができるという利点がある。例えば、第一および／または第二ＶＥＧＦ分子は、タンパク質タグ（例、ＧＳＴ－タグ、ＨＩＳ－タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ）によって、または任意のアミノ酸残基の配列の付加によって伸長可能である。さらにまた、第一および／または第二ＶＥＧＦ分子は、制限酵素部位など、その生成に元々必要であった残骸をまだ含んでいる場合がある。
【0073】
本発明の第一の観点に係るカラムの第一および／または第二のＶＥＧＦ分子、あるいは、本発明の第二の観点によるＶＥＧＦ二量体分子の第一および／または第二のＶＥＧＦ分子は、１２２～２５０アミノ酸、好ましくは１２５～２２５アミノ酸、より好ましくは１４０～２００アミノ酸、さらに好ましくは１５０～１８０アミノ酸、特により好ましくは１６０～１７０アミノ酸、最も好ましくは１６５アミノ酸長を有する場合がある。
【0074】
好ましい実施形態では、本発明の第一観点に係るカラムの第一および／または第二ＶＥＧＦ分子あるいは本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および／または第二ＶＥＧＦ分子は、１２２～２５０アミノ酸、好ましくは１２５～２２５アミノ酸、より好ましくは１４０～２００アミノ酸、さらに好ましくは１５０～１８０アミノ酸、特により好ましくは１６０～１７０アミノ酸、最も好ましくは１６５アミノ酸長を有している。
【0075】
さらにまた、本発明の第一観点に係るカラムの第一ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一ＶＥＧＦ分子は、配列番号：３に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％（例、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性があり、および／または、本発明の第一観点に係るカラムの第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第二ＶＥＧＦ分子は、配列番号：４に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％（例、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）のアミノ酸配列同一性がある。
【0076】
本明細書で使用される用語「少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性」が意味するのは、本発明の第一観点に係るカラムの第一および／または第二ＶＥＧＦ分子あるいは本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および／または第二ＶＥＧＦ分子のアミノ酸配列が、連続する１００アミノ酸内で、少なくとも５０アミノ酸残基が対応する配列（例、配列番号：３および／または配列番号：４）の配列とそれぞれ同一であることを特徴とするアミノ酸配列を有していることである。
【0077】
本開示の発明による配列の同一性は、例えば、配列比較の形式での配列アライメント方法によって決定することができる。配列アライメント方法は当該技術分野で周知であり、様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが含まれる。その上、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかのソースやインターネット上で利用可能であり、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｘと併せて使用可能である。例えば、配列番号：３または配列番号：４のアミノ酸配列に対する本開示の発明による変異体の同一性の割合は、典型的には、標準設定のＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｂｌａｓｔｐを使用して特徴解析される。配列の比較および２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は、以下のパラメータ（Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｏｐｅｎ ｇａｐ １１ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ；ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ５０；ｅｘｐｅｃｔ １０．０ ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ３；Ｆｉｌｔｅｒ ｎｏｎｅ）を有するプログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ｂｌａｓｔｐ）」（Ｔａｔｕｓｏｖａら、１９９９年）を用いても達成可能である。
【0078】
あるいは、標準的な設定でソフトウェアＧＥＮＥｉｏｕｓを用い、配列同一性が決定可能である。アライメント結果は、例えば、ソフトウェアＧｅｎｅｉｏｕｓ（バージョンＲ８）から、アライメントタイプとして自由端ギャップのグローバルアライメントプロトコルを使用し、コスト行列としてＢｌｏｓｕｍ６２を使用して得ることができる。
【0079】
好ましくは、本発明の第一観点に係るカラムの第一ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一ＶＥＧＦ分子は、配列番号：３のアミノ酸配列を有し、および／または、本発明の第一観点に係るカラムの第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第二ＶＥＧＦ分子は、配列番号：４のアミノ酸配列を有する。
【0080】
さらに好ましい実施形態では、本発明の第一観点に係るカラムの第一ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一ＶＥＧＦ分子は、配列番号：３と比較して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは配列番号：３と比較して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは配列番号：３と比較して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは配列番号：３と比較して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、および／または、本発明の第一観点に係るカラムの第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第二ＶＥＧＦ分子は、配列番号：４と比較して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは配列番号：４と比較して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは配列番号：４と比較して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは配列番号：４と比較して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0081】
本発明の第一観点に係るカラムの第一および第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および第二ＶＥＧＦ分子は、さらにリンカーによって連結可能である。
【0082】
あるいは、ＶＥＧＦ二量体分子は、いかなるリンカーも含んでいない場合もある。例えば、本発明の第一観点に係るカラムの第一および第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および第二ＶＥＧＦ分子は、リンカーによって連結されていなくてもよい。
【0083】
本発明に係る用語「リンカー」は、第一ＶＥＧＦ分子と第二ＶＥＧＦ分子とを連結するのに適した任意のスペーサーを説明する。
【0084】
リンカーは、第一および／または第二ＶＥＧＦ二量体の互いに対するフレキシビリティーを実現するのに十分な最小の長さを有している場合がある。これにより、例えば、ｓｃＶＥＧＦの分子間多量体化をもたらしたり、例えば、二量体や四量体のようなｓｃＶＥＧＦ多量体の形成につながる。リンカーは、ＶＥＧＦ－配列の分子内二量体化を妨げるのに適した長さを有していてもよい。
【0085】
リンカーは、２つのタンパク質分子を連結するのに適していることが当業者に知られている任意の材料を含むことができる。例えば、リンカーは、当業者に知られている有機化合物（例、アミノ酸、核酸、多糖類、ポリエチレングリコール）の任意のポリマーおよび／またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等での架橋部分を含む場合がある。好ましくは、リンカーはアミノ酸を含み、より好ましくは、リンカーはアミノ酸からなる。さらに、リンカーは、可撓性であっても剛性であってもよい。
【0086】
例えば、第一および第二ＶＥＧＦ分子の核酸配列は、リンカーのアミノ酸配列をコードする核酸を介して前もって連結されていてもよく、コンストラクト全体が上記のように１つのＶＥＧＦ二量体分子（例、配列番号：５）として一緒に発現されてもよい。
【0087】
本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子は、配列番号：５に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％（例、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性がある場合がある。好ましくは、本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子は、配列番号：５に比較して１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0088】
通常、第一および第二ＶＥＧＦ分子は、リンカーによって連結されていてもよく、それによって、リンカーの第一の端は、第一ＶＥＧＦ分子のＣ末端アミノ酸に連結され、リンカーの第二の端は、第二ＶＥＧＦ分子のＮ末端アミノ酸に連結される。さらに、第一および第二ＶＥＧＦ分子は、リンカーによって連結可能であり、その場合、リンカーの第一端および／または第二端は、Ｎ末端またはＣ末端ではない第一および／または第二ＶＥＧＦ分子配列のアミノ酸に連結される。
【0089】
好ましい実施形態では、本発明の第一観点に係るカラムの第一および第二ＶＥＧＦ分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の第一および第二ＶＥＧＦ分子は、リンカーによって連結される。
【0090】
リンカーが複数のアミノ酸を含む場合、リンカーは、好ましくは１０～３０アミノ酸長、好ましくは１１～２５アミノ酸長、より好ましくは１２～２０アミノ酸長、特により好ましくは１３～１７アミノ酸長、最も好ましくは１４アミノ酸長を有する。
【0091】
さらに、リンカーは、配列番号：６の配列（ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ）を含んでいてもよいし、または、配列番号：６と比較して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは配列番号：６と比較して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは配列番号：６と比較して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは配列番号：６と比較して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。例えば、配列番号：６の単一各アミノ酸を、同一または類似の電荷および／またはサイズを有するアミノ酸で置換することが可能である。好ましくは、リンカーは、配列番号：６の配列を含み、より好ましくは、リンカーは、配列番号：６の配列からなる。配列番号：６と比較してリンカーの配列同一性を決定する方法は、当業者に周知であり、配列番号：３および４に対する第一および第二ＶＥＧＦ分子の配列同一性をそれぞれ決定するために上述した方法と同等である。
【0092】
より好ましい実施形態では、リンカーは、１０～３０アミノ酸長、好ましくは１１～２５アミノ酸長、より好ましくは１２～２０アミノ酸長、特により好ましくは１３～１７アミノ酸長、最も好ましくは１４アミノ酸長を有する。
【0093】
本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子は、マトリックスに共有結合によって固定化可能である。
【0094】
マトリックスは、タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーに適していることが当業者に知られている任意の分子であってよい。通常、マトリックスは化学的に不活性な分子で構成される。特に、マトリックスの分子は、アフェレーシスなどの臨床応用に適している場合がある。例えば、生体内に適用した場合、免疫原性が低い場合がある。
【0095】
その上、マトリックスの分子は、一般にリガンドであるＶＥＧＦ二量体分子の共有結合を可能にする。従って、ＶＥＧＦ二量体分子にタンパク質タグなどのタグを連結し、このタグに共有結合させるマトリックスを用いてもよい。マトリックスの適切な分子の例は、当業者に周知であり、例えば、セファロース、アガロースおよび／またはグルタチオンなどが挙げられる。好ましくは、マトリックスはセファロースまたはアガロースであり、より好ましくはアガロースである。マトリックスは、さらに互いに異なる分子の混合物を含む場合がある。
【0096】
別の好ましい実施形態では、本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子は、マトリックスに共有結合によって固定化される。
【0097】
本発明の第三の観点は第一の観点に係るカラムを調製する方法であって、
ａ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）二量体分子を真核生物発現によって調製する工程であって、前記ＶＥＧＦ二量体分子が第一および第二ＶＥＧＦ分子を含む工程と、
ｂ）工程ａ）の前記二量体をマトリックスに固定化する工程を含む方法に関する。
ａ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）二量体分子を真核生物発現によって調製する工程であって、前記ＶＥＧＦ二量体分子が第一および第二ＶＥＧＦ分子を含む工程と、
ｂ）工程ａ）の前記二量体をマトリックスに固定化する工程を含む方法に関する。
【0098】
工程ａ）およびｂ）の特徴に関して、本発明の第一の観点のカラムおよび本発明の第二の観点に係るＶＥＧＦ二量体分子に関して上述したすべての実施形態および特徴は、この第三の観点にも適用される。
【0099】
工程ａ）
真核生物発現によるＶＥＧＦ二量体分子の調製方法は、当業者に周知であり、さらに上述したとおりである。特に、第一および第二ＶＥＧＦ分子とリンカーについても、上述したとおりである。
真核生物発現によるＶＥＧＦ二量体分子の調製方法は、当業者に周知であり、さらに上述したとおりである。特に、第一および第二ＶＥＧＦ分子とリンカーについても、上述したとおりである。
【0100】
工程ｂ）
さらに、本発明の第三の観点に係るカラム調製方法の工程ｂ）において、ＶＥＧＦ二量体分子は、共有結合によってマトリックスに固定化される。マトリックスに関する特徴は、本発明の第一の観点のカラムの好ましい実施形態の文脈で上述したものでもあり、本発明の第三の観点にも適用可能である。
さらに、本発明の第三の観点に係るカラム調製方法の工程ｂ）において、ＶＥＧＦ二量体分子は、共有結合によってマトリックスに固定化される。マトリックスに関する特徴は、本発明の第一の観点のカラムの好ましい実施形態の文脈で上述したものでもあり、本発明の第三の観点にも適用可能である。
【0101】
本発明に係る用語「工程ａ）の前記二量体をマトリックスに固定化する」は、ＶＥＧＦ二量体分子をマトリックスに固定化することを示す。二量体をマトリックスに固定化する方法は、当業者に周知である。例えば、ＶＥＧＦ二量体分子は、マトリックスが既にカラムにロードされているとき、またはマトリックスをカラムにロードする前にマトリックスに固定化することができる。最初の例では、まずマトリックスがカラムにロードされる。その後、ＶＥＧＦ二量体分子を含む溶液を提供し、カラム内のマトリックスに適用することにより、ＶＥＧＦ二量体分子をそのマトリックスに固定化することができる。ＶＥＧＦ二量体分子とマトリックスとの間の特異的な相互作用により、ＶＥＧＦ二量体分子は通常マトリックスに近接して留まり、あるいはマトリックスと結合することがあるが、溶液の残りの置換成分はマトリックス中を流れ通過するか、および／または、その後の洗浄工程によって除去される。あるいは、第二の例では、マトリックスをＶＥＧＦ二量体分子と接触させることで、両者の間に特異的な相互作用を生じさせることも可能である。引き続き、マトリックス－ＶＥＧＦ二量体コンストラクトを洗浄すると、特異的に結合するＶＥＧＦ二量体分子は除去されないが、非特異的に結合する成分が除去可能である。その後、ＶＥＧＦ二量体分子を固定化したマトリックスをカラムにロードすることもできる。
【0102】
さらに、工程ｂ）において、ＶＥＧＦ二量体分子は共有結合によってマトリックスに固定化されていてもよい。ＶＥＧＦ二量体分子の共有結合を可能にする可能なマトリックスの詳細は、当業者に周知であり、また、本発明の第一の観点に係るカラムについては上述したとおりである。
【0103】
本発明はさらに、本発明の第三の観点に係る方法によって得ることができるカラムに関する。
【0104】
好ましい実施形態では、本発明の第三の観点に係るカラム調製方法の工程ｂ）において、ＶＥＧＦ二量体分子を共有結合によってマトリックスに固定化する。
【0105】
本発明の第四の観点は、ＶＥＧＦ二量体分子がアフェレーシス用カラムに結合されていることを特徴とする子癇前症の治療に用いるための第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子である。
【0106】
本発明の第一および／または第二の観点に記載されるカラムとＶＥＧＦ二量体分子に関して上述した全ての実施形態および特徴は、この第四の観点にも適用される。
【0107】
さらに、本発明に係る用語「子癇前症の治療」は、すべてのタイプの子癇前症およびこの症状のすべての段階の治療を含む。例えば、妊娠中の女性も、最近出産してその後子癇前症になった女性も同様に、治療可能である。その上、子癇前症の治療は、子癇前症の症状を呈していない抗リン脂質症候群および／または高血圧症を患っている妊婦や、妊婦の血液または血清中の平均ｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比よりも高いｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比を有する妊婦など、子癇前症の発症リスクを有する妊婦に対する予防的治療も含む。
【0108】
本発明に係る用語「アフェレーシス」は、人の血液または血漿を、少なくともｓＦｌｔ－１などの一または複数の特定成分を分離し、残りを循環に戻す装置を通過させる体外医学療法を表す。これにより、ｓＦｌｔ－１の分離のほかに、ＶＥＧＦやＰｌＧＦなどのｓＦｌｔ－１と結合している成分が血液中に放出され、循環に戻る可能性がある。
【0109】
一般に、アフェレーシス法および必要なパラメータは、当業者に周知である。例えば、アフェレーシスでは、まず、血液へのアクセスを配置することを含む。そのため、患者の末梢静脈に針を刺す。例えば、内頸静脈、鎖骨下静脈、大腿静脈に、シングルまたはダブルルーメンのカテーテルが使用可能である。通常、この第一の血液へのアクセスからチューブやキャピラリーに血液を導き、その後ポンプでアフェレーシスのカラムに送り、血液からｓＦｌｔ－１を分離すると同時にＶＥＧＦとＰｌＧＦを血液中に放出させる。残りの血液成分は、さらにチューブやキャピラリーを経由して第二のポンプで第二の血液アクセスに送られ、その後患者の血液循環に戻される。その上、アフェレーシスカラムに導入する前に、血液を分離し、血漿のみをアフェレーシスカラムに適用することも可能である。その後、浄化した血漿を、血漿の調製時に先に分離した血球と合わせ、両者を患者の血液循環に戻してもよい。
【0110】
処理する血漿量は、通常、患者の推定血漿量（ＥＰＶ）である。ＥＰＶは通常、以下の式で算出される：
ＥＰＶ＝ＢＷ×１／１３×（１－Ｈｔ／１００）
ＢＷ：体重（ｋｇ）
Ｈｔ：ヘマトクリット値（％）
ＥＰＶ＝ＢＷ×１／１３×（１－Ｈｔ／１００）
ＢＷ：体重（ｋｇ）
Ｈｔ：ヘマトクリット値（％）
【0111】
さらに、アフェレーシスには通常、凝固を防止、中断、終了させる措置が含まれる。これらの措置は当業者に周知である。例えば、アフェレーシス中にクエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウムまたは酸性クエン酸デキストロース（例、ＡＣＤ－Ａ））またはヘパリンのような抗凝固剤を血液または血漿に添加することができる。適切な抗凝固剤および必要な投与量は当業者に周知であり、さらに患者の臨床的および身体的状態に依存する場合がある。
【0112】
１本のカラムを１回のアフェレーシス処理に使用することも、５回、１０回、１５回、２０回、２５回までのアフェレーシス処理用途に繰り返し使用することも可能である。
【0113】
本発明の第一の観点に係るカラムに関して記載したＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二の観点に係るＶＥＧＦ二量体分子に加えて、アフェレーシスカラムは、ｓＦｌｔ－１と相互作用し得るさらなるリガンドを含んでいてもよい。さらに、アフェレーシスカラムは、１回のアフェレーシス適用中にｓＦｌｔ－１以外の血液成分を除去するためのリガンドをさらに含んでいてもよい。例えば、血漿交換（例えば、有害物質を含む血液の液体部分を除去し、血漿を置換液と置換すること）を行ってもよいし、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）を除去してもよい。
【0114】
さらにまた、本発明は、本発明の第一観点に係るカラムのＶＥＧＦ二量体分子または本発明の第二観点に係るＶＥＧＦ二量体分子を含むカラムを使用して子癇前症を治療する方法に関する。
【0115】
また、本発明は、子癇前症を治療する方法であって、本発明の第一の観点に係るカラムまたは本発明の第二の観点に係るＶＥＧＦ二量体分子を用いてアフェレーシスを実施することを含む、方法にも関する。上記に開示されたすべての実施形態は、本発明のこれらの方法にも適用される。
【0116】
本発明の第五の観点は、本発明のＶＥＧＦ二量体分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターにさらに関する。
【0117】
適切な発現ベクターは、当業者に周知である。好ましくは、発現ベクターは、真核生物細胞におけるタンパク質の組換え発現に適している。
【0118】
例えば、発現ベクターは、哺乳類由来の発現ベクター（例、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦ－ＢＯＳ（ＭｉｚｕｓｈｉｍａとＮａｇａｔａ、１９９０年）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例、「Ｂａｃ－ｔｏ－ＢＡＣバキュロウイルス発現システム」（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２）または酵母由来の発現ベクター（例、「Ｐｉｃｈｉａ発現キット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ－Ｑ０１）が挙げられる。好ましくは、発現ベクターは、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン発現ベクターである。
【0119】
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞での発現を目的として、発現ベクターは通常、細胞内発現用プロモーターを含んでいる。細胞内発現に適したプロモーターは、当業者に周知である。例えば、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、１９７９年）、ＭＭＬＶ－ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（ＭｉｚｕｓｈｉｍａとＮａｇａｔａ、１９９０年）、またはＣＭＶプロモーターが使用可能である。
【0120】
その上、発現ベクターは、マーカー遺伝子をさらに含んでいてもよい。適切なマーカー遺伝子は、当業者に周知である。例えば、マーカー遺伝子は、形質転換細胞に対して、ネオマイシン、Ｇ４１８などの薬剤で選別可能な薬剤耐性遺伝子であってもよい。このような性質を有するベクターの例としては、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が挙げられる。
【0121】
本発明の第二の観点に係る本発明のＶＥＧＦ二量体分子を説明する全ての特徴は、本発明の第五の観点に係る発現ベクター中の核酸配列によってコードされるＶＥＧＦ二量体分子にも適用される。
【0122】
本発明の第六の観点は、本発明のＶＥＧＦ二量体分子を含むか、本発明の発現ベクターを含むか、および／または本発明のＶＥＧＦ二量体分子をコードする核酸配列を含む、組換え宿主細胞株に関する。
【0123】
適切な組換え宿主細胞株は、当業者に周知である。例えば、組換え宿主細胞株は、ヒト細胞株（例、ＨＥＫ２９３Ｔ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ（ＥＢＮＡ）細胞株）、マウス細胞株、ラット細胞株、ハムスター細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株等の真核細胞株であってもよい。
【0124】
本発明の第二の観点に係る本発明のＶＥＧＦ二量体分子を説明する全ての特徴または本発明の第五の観点に係る発現ベクターを説明する全ての特徴は、本発明の第六の観点に係る組換え宿主細胞株のＶＥＧＦ二量体分子または発現ベクターにも適用される。
【0125】
本発明は、さらに、本発明の第二の観点に係るＶＥＧＦ二量体を含むマトリックスまたはビーズに関する。
【0126】
本発明の第一の観点に係るカラムのマトリックスまたは本発明の第三の観点で使用されるマトリックスについて説明したすべての特徴は、本発明に係るマトリックスにも適用される。
【0127】
ビーズは、タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーに適していることが当業者に知られている任意のビーズであってよい。通常、ビーズは化学的に不活性な分子で構成される。特に、ビーズは、アフェレーシスなどの臨床応用に適している場合がある。例えば、生体内に適用した場合、ビーズは免疫原性が低い場合がある。
【0128】
ビーズはさらに、本発明の第一の観点に係るカラムに使用するのに適した、または、本発明で説明もしくは使用されるマトリックスに結合するのに適したことが知られている任意の分子であってもよい。通常、ビーズは多孔質表面を有し、アフェレーシスなどのアフィニティークロマトグラフィーに適した細孔径が当業者に周知である。
【0129】
ビーズは、アガロースなど、当業者に公知の任意の材料であってもよい。ビーズは、タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーに適していることが当業者に知られている任意のサイズのもの（例、マイクロビーズ）であってよい。さらに、ビーズは、本発明の第一または第二の観点について説明したように、ＶＥＧＦ二量体分子と結合または相互作用可能である。その上、ビーズは、本発明の第一または第三の観点で用いられるマトリックスと結合または相互作用してもよく、このマトリックス自体が、本発明の第一または第二の観点について説明したように、ＶＥＧＦ二量体分子と結合または相互作用する。一般に、ビーズに付着している各結合ＶＥＧＦ二量体分子またはマトリックス分子は、カラムを通して送られる溶質試料と１：１の比率で結合し、その後精製または分離が必要とされると仮定することができる。
【0130】
本発明の第七の観点は、血液からｓＦｌｔ－１を分離するかおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出するための方法であって、本発明の第一の観点に係るカラムまたは本発明の第二の観点に係るＶＥＧＦ二量体分子を血液とインキュベートし、前記血液からｓＦｌｔ－１を分離することおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを前記血液中に放出させることを含む、方法である。
【0131】
本発明の第七の観点に係る方法において、患者から血液を得て、その後、血液からｓＦｌｔ－１を分離し、および／または、ｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出してもよい。さらに、本発明の第七の観点に係る方法において、血液からｓＦｌｔ－１を分離し、および／または、ｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出させた後に、その血液を患者の血液循環に戻してもよい。好ましくは、本発明の第七の観点に係る方法は、例えば本発明の第四の観点の文脈で上述したように、アフェレーシスの文脈で適用される。アフェレーシスに関して、例えば本発明の第四の観点の文脈のように上述したすべての実施形態および特徴は、この第七の観点にも適用され得る。
【0132】
本発明の第七の観点に係る方法では、血中のｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比が低下するまで、好ましくは、血中のｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比が＜１１０、より好ましくは＜８５、特により好ましくは＜５０、最も好ましくは＜３８となるまで、血液からｓＦｌｔ－１を分離してもよく、および／または、ｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出させてもよい。
【0133】
その上、本発明の第七の観点に係る方法では、患者の血液中のｓＦｌｔ－１および／またはＶＥＧＦの量が、子癇前症の症状を示さない妊婦と同程度になるまで、ｓＦｌｔ－１を血液から分離し、および／または、ＶＥＧＦをｓＦｌｔ－１との複合体から血液中に放出させてもよい。
【0134】
さらに、本発明の第一、第二、第三、および／または第四の観点に関して上述したすべての実施形態および特徴は、この第七の観点にも適用され得る。
【0135】
さらにまた、本発明は、血液からｓＦｌｔ－１を分離するかおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出するための方法であって、本発明の第三の観点に係る方法によって得られるカラムと血液をインキュベートし、前記血液からｓＦｌｔ－１を分離することおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを前記血液中に放出させることを含む、方法にさらに関する。
【0136】
本発明の第八の観点は、血液からｓＦｌｔ－１を分離するためおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出するための、本発明の第一の観点に係るカラムまたは本発明の第二の観点に係るＶＥＧＦ二量体分子の使用に関する。
【0137】
好ましくは、本発明の第八の観点に係る使用は、例えば本発明の第四の観点の文脈で上述したように、アフェレーシスの文脈のものである。本発明の第一、第二、第三、第四および／または第七の観点に関して上述したすべての実施形態および特徴は、この第八の観点にも適用され得る。
【0138】
さらに、本発明は、血液からｓＦｌｔ－１を分離するためおよび／またはｓＦｌｔ－１との複合体からＶＥＧＦを血液中に放出するための、本発明の第三観点に係る方法によって得ることができるカラムの使用に関する。
【0139】
本発明は、本明細書中に記載される特定の方法論、手順、および試薬に限定されない。なぜなら、それらにはバリエーションがあるからである。さらにまた、本明細書中に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけであって、本発明の範囲を限定する意図は無い。本明細書と添付した特許請求の範囲に使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文章が明らかにそうでないと規定していない限り、複数形への言及も含む。同様に、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」、および「ｅｎｃｏｍｐａｓｓ」は排他的というよりはむしろ他のものも含めるように解釈される。
【0140】
定義がなされていない場合、本明細書中で使用する全ての技術的や科学的な用語および任意の頭字語は、本発明の分野の当業者により一般的に理解されると同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様または等価な任意の方法と物は本発明の実施に用いることができるが、好ましい方法や物を本明細書中に記載する。
【0141】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明されるが、これらは、本発明を説明することを意図しているが、限定するものではなく、そこからさらなる特徴、実施形態および利点を得ることができるものである。このように、議論された特定の改変は、本発明の範囲に対する制限として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な等価物、変更、および改変がなされ得ることは当業者には明らかであり、したがって、そのような等価な実施形態が本明細書に含まれることが理解される。
【実施例】
【0142】
実施例
材料および方法
クローニング、組換えタンパク質の発現と精製
ｓｃＶＥＧＦ１６５とｓｃＰｌＧＦのクローニングのために、各塩基配列を含むクローン化されていない二本鎖直線ＤＮＡ断片をＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）の形でカスタマイズし、注文した。設計された配列は、単量体ＶＥＧＦ１６５と同一のアミノ酸配列を二つ有しているが、第二単量体はシグナルペプチド配列を欠いている。２つのモノマーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧを有するリンカー（下線文字で以下に示す）で連結されている。ＤＮＡ断片はプライマー（表１参照）を用いて増幅し、Ｎ－末端のｓｔｒｅｐタグを持つｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン発現ベクターに（制限酵素ＮｈｅＩとＢａｍＨＩを用いて）クローン化した。
材料および方法
クローニング、組換えタンパク質の発現と精製
ｓｃＶＥＧＦ１６５とｓｃＰｌＧＦのクローニングのために、各塩基配列を含むクローン化されていない二本鎖直線ＤＮＡ断片をＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ドイツ）の形でカスタマイズし、注文した。設計された配列は、単量体ＶＥＧＦ１６５と同一のアミノ酸配列を二つ有しているが、第二単量体はシグナルペプチド配列を欠いている。２つのモノマーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧを有するリンカー（下線文字で以下に示す）で連結されている。ＤＮＡ断片はプライマー（表１参照）を用いて増幅し、Ｎ－末端のｓｔｒｅｐタグを持つｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン発現ベクターに（制限酵素ＮｈｅＩとＢａｍＨＩを用いて）クローン化した。
【0143】
【表1】
【0144】
ｓｃＶＥＧＦ１６５とｓｃＰｌＧＦのＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片の配列は以下の通りである（下線はリンカー配列）。
【0145】
ｓｃＶＥＧＦ１６５のＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片配列（配列番号：７）：
GCTAGCGCTCCTATGGCTGAAGGCGGAGGACAGAATCACCACGAGGTGGTCAAGTTCATGGACGTGTACCAGCGGAGCTACTGTCACCCCATCGAGACACTGGTGGACATCTTCCAAGAGTACCCCGACGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCCAGCTGCGTGCCCCTGATGAGATGTGGCGGCTGCTGCAATGACGAAGGCCTGGAATGTGTGCCCACCGAGGAATCCAACATCACCATGCAGATCATGCGGATCAAGCCCCACCAGGGCCAGCATATCGGCGAGATGTCTTTCCTGCAGCACAACAAGTGCGAGTGCAGACCCAAGAAGGACCGGGCCAGACAAGAGAATCCTTGCGGCCCTTGCAGCGAGCGGAGAAAGCACCTGTTTGTGCAGGACCCTCAGACCTGCAAGTGCTCCTGCAAGAACACCGACAGCCGGTGCAAAGCCAGACAGCTGGAACTGAACGAGCGGACCTGCAGATGCGACAAGCCTAGAAGAGGCAGCACAAGCGGCAGCGGCAAAAGCTCTGAAGGCAAGGGAACGCGTGCCCCAATGGCAGAAGGTGGCGGCCAGAACCACCATGAGGTCGTGAAGTTTATGGATGTCTATCAGCGGTCCTACTGCCATCCTATCGAAACCCTGGTCGATATTTTTCAAGAGTATCCGGATGAGATTGAGTATATTTTCAAACCCTCCTGTGTGCCGCTCATGCGCTGCGGCGGATGCTGTAATGATGAGGGACTTGAGTGCGTGCCAACCGAAGAGTCTAATATTACGATGCAGATTATGAGAATCAAACCGCATCAAGGGCAGCATATTGGGGAAATGAGCTTCCTCCAGCATAACAAATGTGAATGCCGGCCGAAGAAGGACAGAGCCCGGCAAGAAAACCCATGCGGCCCCTGTTCCGAGAGGCGGAAACATCTGTTCGTTCAAGATCCCCAGACCTGTAAATGTAGCTGTAAAAACACCGACTCCAGGTGCAAGGCCCGGCAACTCGAGCTGAACGAGAGAACATGTCGCTGCGATAAGCCCAGACGGGGATCCACA
GCTAGCGCTCCTATGGCTGAAGGCGGAGGACAGAATCACCACGAGGTGGTCAAGTTCATGGACGTGTACCAGCGGAGCTACTGTCACCCCATCGAGACACTGGTGGACATCTTCCAAGAGTACCCCGACGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCCAGCTGCGTGCCCCTGATGAGATGTGGCGGCTGCTGCAATGACGAAGGCCTGGAATGTGTGCCCACCGAGGAATCCAACATCACCATGCAGATCATGCGGATCAAGCCCCACCAGGGCCAGCATATCGGCGAGATGTCTTTCCTGCAGCACAACAAGTGCGAGTGCAGACCCAAGAAGGACCGGGCCAGACAAGAGAATCCTTGCGGCCCTTGCAGCGAGCGGAGAAAGCACCTGTTTGTGCAGGACCCTCAGACCTGCAAGTGCTCCTGCAAGAACACCGACAGCCGGTGCAAAGCCAGACAGCTGGAACTGAACGAGCGGACCTGCAGATGCGACAAGCCTAGAAGAGGCAGCACAAGCGGCAGCGGCAAAAGCTCTGAAGGCAAGGGAACGCGTGCCCCAATGGCAGAAGGTGGCGGCCAGAACCACCATGAGGTCGTGAAGTTTATGGATGTCTATCAGCGGTCCTACTGCCATCCTATCGAAACCCTGGTCGATATTTTTCAAGAGTATCCGGATGAGATTGAGTATATTTTCAAACCCTCCTGTGTGCCGCTCATGCGCTGCGGCGGATGCTGTAATGATGAGGGACTTGAGTGCGTGCCAACCGAAGAGTCTAATATTACGATGCAGATTATGAGAATCAAACCGCATCAAGGGCAGCATATTGGGGAAATGAGCTTCCTCCAGCATAACAAATGTGAATGCCGGCCGAAGAAGGACAGAGCCCGGCAAGAAAACCCATGCGGCCCCTGTTCCGAGAGGCGGAAACATCTGTTCGTTCAAGATCCCCAGACCTGTAAATGTAGCTGTAAAAACACCGACTCCAGGTGCAAGGCCCGGCAACTCGAGCTGAACGAGAGAACATGTCGCTGCGATAAGCCCAGACGGGGATCCACA
【0146】
ｓｃＰｌＧＦのＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片配列（配列番号：８）：
acagctagcCTGCCTGCTGTTCCTCCTCAACAATGGGCCCTGTCTGCCGGCAATGGCAGCTCTGAAGTTGAGGTGGTGCCCTTCCAAGAAGTGTGGGGCAGAAGCTACTGCAGAGCCCTGGAAAGACTGGTGGACGTGGTGTCTGAGTACCCCAGCGAGGTGGAACACATGTTCAGCCCTAGCTGCGTGTCCCTGCTGAGATGCACAGGCTGTTGCGGCGACGAGAATCTGCACTGCGTGCCAGTGGAAACCGCCAACGTGACAATGCAGCTGCTGAAAATCAGAAGCGGCGACAGACCCAGCTACGTGGAACTGACCTTCAGCCAGCACGTCCGCTGCGAGTGTAGACCCCTGCGGGAAAAGATGAAGCCCGAGAGATGCGGAGATGCCGTGCCTAGAAGAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAGAGCAGCGAAGGCAAGGGACTTCCTGCTGTGCCACCACAGCAGTGGGCACTGAGTGCCGGAAATGGCTCCTCTGAGGTGGAAGTCGTGCCTTTTCAAGAAGTCTGGGGACGCTCCTACTGTCGCGCTCTTGAGAGACTGGTCGATGTCGTCAGCGAGTACCCCTCCGAAGTCGAGCACATGTTTTCCCCATCCTGTGTGTCTCTGCTGCGGTGTACCGGATGCTGCGGGGATGAGAACCTGCATTGTGTGCCTGTCGAGACAGCCAATGTCACCATGCAGCTCCTCAAGATCAGATCCGGCGATCGGCCCTCCTACGTCGAGCTGACATTTTCTCAGCACGTTCGATGCGAATGCCGGCCTCTGCGCGAGAAAATGAAGCCTGAACGCTGTGGCGACGCCGTGCCTCGTAGAggatccaca
acagctagcCTGCCTGCTGTTCCTCCTCAACAATGGGCCCTGTCTGCCGGCAATGGCAGCTCTGAAGTTGAGGTGGTGCCCTTCCAAGAAGTGTGGGGCAGAAGCTACTGCAGAGCCCTGGAAAGACTGGTGGACGTGGTGTCTGAGTACCCCAGCGAGGTGGAACACATGTTCAGCCCTAGCTGCGTGTCCCTGCTGAGATGCACAGGCTGTTGCGGCGACGAGAATCTGCACTGCGTGCCAGTGGAAACCGCCAACGTGACAATGCAGCTGCTGAAAATCAGAAGCGGCGACAGACCCAGCTACGTGGAACTGACCTTCAGCCAGCACGTCCGCTGCGAGTGTAGACCCCTGCGGGAAAAGATGAAGCCCGAGAGATGCGGAGATGCCGTGCCTAGAAGAGGCAGCACATCTGGCTCTGGCAAGAGCAGCGAAGGCAAGGGACTTCCTGCTGTGCCACCACAGCAGTGGGCACTGAGTGCCGGAAATGGCTCCTCTGAGGTGGAAGTCGTGCCTTTTCAAGAAGTCTGGGGACGCTCCTACTGTCGCGCTCTTGAGAGACTGGTCGATGTCGTCAGCGAGTACCCCTCCGAAGTCGAGCACATGTTTTCCCCATCCTGTGTGTCTCTGCTGCGGTGTACCGGATGCTGCGGGGATGAGAACCTGCATTGTGTGCCTGTCGAGACAGCCAATGTCACCATGCAGCTCCTCAAGATCAGATCCGGCGATCGGCCCTCCTACGTCGAGCTGACATTTTCTCAGCACGTTCGATGCGAATGCCGGCCTCTGCGCGAGAAAATGAAGCCTGAACGCTGTGGCGACGCCGTGCCTCGTAGAggatccaca
【0147】
ｓｃＰｌＧＦタンパク質配列（下線はリンカー部分）（配列番号：９）：
TASLPAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKIRSGDRPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVPRRGSTSGSGKSSEGKGLPAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKIRSGDRPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVPRRGST
TASLPAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKIRSGDRPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVPRRGSTSGSGKSSEGKGLPAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKIRSGDRPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVPRRGST
【0148】
組換えタンパク質の製造のために、ＨＥＫ２９３Ｔ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス核抗原（ＥＢＮＡ）安定細胞株をｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムを用いて作製し、タンパク質を既報（Ａｇａｒｗａｌら、２０１２年）のように精製した。簡単に説明すると、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）を用いて、牛胎児血清（ＦＢＳ）フリー培地で３日間、ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクションした。翌日に細胞の上清を回収して濾過し、Ｓｔｒｅｐタグを持つタンパク質をＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴ（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）樹脂を介して室温（ＲＴ）にて精製した。その後、ビオチン含有Ｔｒｉｓ緩衝液（ＴＢＳ）－緩衝液（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）でタンパク質を溶出し、画分を－８０℃で保存した。
【0149】
ネガティブ染色電子顕微鏡観察
単量体および二量体ＶＥＧＦの構造を、既報（Ｂｏｂｅｒら、２０１０年）のように、ネガティブ染色電子顕微鏡観察によって可視化した。簡単に説明すると、サンプル（通常濃度１０～２０ｎＭ）をカーボンコートされたグリッド上で１分間インキュベートし、洗浄した後、０．７５％ギ酸ウラニルで１分間染色を行った。グリッドは大気中の低圧グロー放電により親水化された。試料をＰｈｉｌｉｐｓ／ＦＥＩ ＣＭ １００ ＴＷＩＮ透過電子顕微鏡で、加速電圧６０ｋＶで検証した。画像は、側面に設置したオリンパス社製Ｖｅｌｅｔａカメラ（解像度２０４８×２０４８ピクセル、２ｋ×２Ｋ）とＩＴＥＭアクイジションソフトウェアを使って記録した。
単量体および二量体ＶＥＧＦの構造を、既報（Ｂｏｂｅｒら、２０１０年）のように、ネガティブ染色電子顕微鏡観察によって可視化した。簡単に説明すると、サンプル（通常濃度１０～２０ｎＭ）をカーボンコートされたグリッド上で１分間インキュベートし、洗浄した後、０．７５％ギ酸ウラニルで１分間染色を行った。グリッドは大気中の低圧グロー放電により親水化された。試料をＰｈｉｌｉｐｓ／ＦＥＩ ＣＭ １００ ＴＷＩＮ透過電子顕微鏡で、加速電圧６０ｋＶで検証した。画像は、側面に設置したオリンパス社製Ｖｅｌｅｔａカメラ（解像度２０４８×２０４８ピクセル、２ｋ×２Ｋ）とＩＴＥＭアクイジションソフトウェアを使って記録した。
【0150】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞培養とマイトジェン処理
継体数３のＨＵＶＥＣを、５％ＦＢＳ、ヒドロコルチゾン、ＶＥＧＦ、ｈＦＧＦ－Ｂ、Ｒ３－ＩＧＦ－１、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、ＧＡ－１０００（Ｐａｎ ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂａｖａｒｉａ、ドイツ）を含むＥｎｄｏｐａｎ３キット培地で８０％コンフルエントになるまでコラーゲンＩＩコート６穴プレート上で培養した。細胞を、３％ＦＢＳを添加するがその他の成長因子サプリメントを添加せずに２４時間飢餓状態にした。翌日、細胞を示される組換えタンパク質で刺激した。３７℃で１０分間インキュベートした後、３０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を用いてプレート上で直接細胞を溶解し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルにロードし、その後ウェスタンブロットに供した。
継体数３のＨＵＶＥＣを、５％ＦＢＳ、ヒドロコルチゾン、ＶＥＧＦ、ｈＦＧＦ－Ｂ、Ｒ３－ＩＧＦ－１、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、ＧＡ－１０００（Ｐａｎ ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂａｖａｒｉａ、ドイツ）を含むＥｎｄｏｐａｎ３キット培地で８０％コンフルエントになるまでコラーゲンＩＩコート６穴プレート上で培養した。細胞を、３％ＦＢＳを添加するがその他の成長因子サプリメントを添加せずに２４時間飢餓状態にした。翌日、細胞を示される組換えタンパク質で刺激した。３７℃で１０分間インキュベートした後、３０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を用いてプレート上で直接細胞を溶解し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルにロードし、その後ウェスタンブロットに供した。
【0151】
固相酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）様式アッセイ
ＥＬＩＳＡ式結合アッセイは、既報（Ａｇａｒｗａｌら、２０１２年）のように行った。簡単に記載すると、１０μｇ／ｍｌの組換えＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、およびそれらの変異体をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに９６穴プレート（Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｔａｎｄａｒｄｍｏｄｕｌｅ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、デンマーク）に個別に固定化し、一方、ＢＳＡのみをロードしたマトリックスをコントロールとした。ＶＥＧＦＲ１／Ｒ２トラップの濃度を０．１～７５０ｎＭの範囲まで増加させながら添加して結合飽和曲線を作成し、その後ＶＥＧＦＲ１／Ｒ２トラップのマウスＦｃドメインに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体を用いてリガンド－受容体複合体の検出を行った。発光は分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ、フィンランド）を用いて、吸光度（ＯＤ）４５０ｎｍで定量化した。
ＥＬＩＳＡ式結合アッセイは、既報（Ａｇａｒｗａｌら、２０１２年）のように行った。簡単に記載すると、１０μｇ／ｍｌの組換えＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、およびそれらの変異体をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに９６穴プレート（Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｔａｎｄａｒｄｍｏｄｕｌｅ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、デンマーク）に個別に固定化し、一方、ＢＳＡのみをロードしたマトリックスをコントロールとした。ＶＥＧＦＲ１／Ｒ２トラップの濃度を０．１～７５０ｎＭの範囲まで増加させながら添加して結合飽和曲線を作成し、その後ＶＥＧＦＲ１／Ｒ２トラップのマウスＦｃドメインに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体を用いてリガンド－受容体複合体の検出を行った。発光は分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ、フィンランド）を用いて、吸光度（ＯＤ）４５０ｎｍで定量化した。
【0152】
ＥＬＩＳＡ測定
ヒトｓＦｌｔ－１、遊離型ＶＥＧＦ、およびＰｌＧＦレベルは、特定の市販ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国）を使用して定量化した。アッセイは製造元の指定に従って実施した。蛍光は分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＭｕｌ－ｔｉｓｋａｎ ＧＯ、フィンランド）を用いて定量した。データはＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、米国）を用いて解析した。
ヒトｓＦｌｔ－１、遊離型ＶＥＧＦ、およびＰｌＧＦレベルは、特定の市販ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国）を使用して定量化した。アッセイは製造元の指定に従って実施した。蛍光は分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＭｕｌ－ｔｉｓｋａｎ ＧＯ、フィンランド）を用いて定量した。データはＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、米国）を用いて解析した。
【0153】
特異的ＶＥＧＦ／ＰｌＧＦカラムの作製
Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴマトリックス（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）への組換えタンパク質の固定化は、Ｐｏｌｙｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）上で製造元の説明書に従って実施した。Ｓｔｒｅｐタグを含む組換えタンパク質は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝８）中で推奨量の樹脂と一晩インキュベートした。
Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴマトリックス（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）への組換えタンパク質の固定化は、Ｐｏｌｙｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）上で製造元の説明書に従って実施した。Ｓｔｒｅｐタグを含む組換えタンパク質は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝８）中で推奨量の樹脂と一晩インキュベートした。
【0154】
Ｐｏｌｙｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）上の臭化シアノゲン活性化樹脂（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）に組換えタンパク質を固定化するために、前記タンパク質は１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝８．３）を含むカップリングバッファーで２日間透析した。そのビーズを３０ｍｌの冷えた１ｍＭのＨＣｌで１５分間活性化した。推奨量の樹脂を、透析したタンパク質と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ビーズの未結合面を０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで２時間、室温でブロックした。
【0155】
組換えタンパク質のアガロースマトリックス（ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ（商標）Ｐｌｕｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）への固定化は、製造元の指示に従った。簡単に説明すると、組換えタンパク質をカップリングバッファー（ｐＨ＝１０）中でインキュベートし、樹脂に加え、５０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３と共にカップリングバッファー（ｐＨ＝７．２）中で４時間インキュベートした。樹脂の未結合表面は、クエンチングバッファー中で５０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３とインキュベーションすることによりブロックした。
【0156】
いずれの場合も、カップリングの前後でタンパク質濃度を測定し、カップリング効率を決定した。約５００ｍｇ／ｍｌの等濃度の各組換えタンパク質を対応する樹脂に固定化するために使用した。
【0157】
ｓｃＶＥＧＦ１６５アガロースカラムの長期安定性評価のため、ＶＥＧＦ結合アガロース樹脂１．８ｍｌを作製し、３００μｌのアリコート６個に分割して４℃で保存した。１日、１５日、３０日、６０日、９０日後に吸着試験を実施した。
【0158】
フロースルーからのＳｔｒｅｐタグ付きタンパク質の沈殿
Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴ（ＩＢＡライフサイエンス社製）ビーズを添加することによって、血清サンプルのアフェレーシス処理後のフロースルーからＳｔｒｅｐタグ付きタンパク質を沈殿させた。ポジティブコントロールとして、組換え型Ｓｔｒｅｐタグ付きＶＥＧＦを血清フロースルーに添加した。５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝８）でビーズを２回洗浄後、３０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を直接ビーズに加え、その後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびＳｔｒｅｐタグ特異抗体を用いたイムノブロットブロッティングを実施した。
Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴ（ＩＢＡライフサイエンス社製）ビーズを添加することによって、血清サンプルのアフェレーシス処理後のフロースルーからＳｔｒｅｐタグ付きタンパク質を沈殿させた。ポジティブコントロールとして、組換え型Ｓｔｒｅｐタグ付きＶＥＧＦを血清フロースルーに添加した。５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝８）でビーズを２回洗浄後、３０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を直接ビーズに加え、その後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびＳｔｒｅｐタグ特異抗体を用いたイムノブロットブロッティングを実施した。
【0159】
倫理承認とインフォームドコンセント
ケルン大学病院の倫理委員会が審査・承認したプロトコル１０－２３８および０９－２５８に従って、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。子癇前症は、ＥＧＡ≦３２週における１４０／９０ｍｍＨｇより高い高血圧、０．３ｇ／ｇクレアチニンより高い蛋白尿、およびｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ＞８５の新規発症と定義した。
ケルン大学病院の倫理委員会が審査・承認したプロトコル１０－２３８および０９－２５８に従って、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。子癇前症は、ＥＧＡ≦３２週における１４０／９０ｍｍＨｇより高い高血圧、０．３ｇ／ｇクレアチニンより高い蛋白尿、およびｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ＞８５の新規発症と定義した。
【0160】
実施例１－一本鎖ＶＥＧＦ
１６５
二量体の分子モデリングと構造解析
分子間ジスルフィド結合は、ＶＥＧＦとＰｌＧＦのホモダイマーの構造を安定化させ、受容体結合部位を展開させる。これらのユニークな性質を利用して、ｓＦｌｔ－１との結合親和性を高めたＶＥＧＦとＰｌＧＦの高次多量体を設計することが可能となった。
分子間ジスルフィド結合は、ＶＥＧＦとＰｌＧＦのホモダイマーの構造を安定化させ、受容体結合部位を展開させる。これらのユニークな性質を利用して、ｓＦｌｔ－１との結合親和性を高めたＶＥＧＦとＰｌＧＦの高次多量体を設計することが可能となった。
【0161】
Ｎ末端配列を欠いたＶＥＧＦ１６５に短い不活性な１４アミノ酸のリンカーが続くものと、Ｎ末端のシグナルペプチドを欠いた第二のＶＥＧＦ１６５（一本鎖ＶＥＧＦダイマー＝ｓｃＶＥＧＦ１６５）を含み、精製用に切断可能なＳｔｒｅｐタグ（登録商標）を備えた発現コンストラクトを設計した（図１Ａ）（配列番号：７）。１４アミノ酸の短いリンカーが、ｓｃＶＥＧＦ１６５の４０ｋＤａの二量体への組み立てを妨げていると推測された。一方、２つ以上のｓｃＶＥＧＦ１６５分子が分子間のジスルフィド結合で連結された開放構造では、ＶＥＧＦの四量体、つまり多量体鎖を形成することが可能になる。ｓｃＶＥＧＦ１６５の四量体４次集合体の分子モデリングアプローチは、１４アミノ酸リンカーによる構造的制限とネガティブ染色電子顕微鏡写真に基づいて行われた（図１Ｂ＋Ｃ）。
【0162】
単量体野生型ＶＥＧＦ１６５（ｍｏＶＥＧＦ１６５、Ｎ末端配列を欠いた全長ＶＥＧＦ１６５）コンストラクトおよびｓｃＶＥＧＦ１６５コンストラクトを上記のようにクローニングし（表１も参照）、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）で発現し、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）技術を使用して生理的条件下で対応するタンパク質を精製した（図７）。これらのコンストラクトは、培養中のＨＵＶＥＣ細胞におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰ）－キナーゼ活性化を調べる実験（図９）で評価されたように、生物学的に機能的であった。Ｍａｐキナーゼ経路の活性化は、組換えＶＥＧＦおよびＰＬＧＦ変異体で処理した後に検出可能である。ＶＥＧＦとｓＦｌｔ－１の共処理により、ＭＡＰの活性化は消失した（図９）。
【0163】
ｍｏＶＥＧＦ１６５と比較してｓｃＶＥＧＦ１６５の４次分子構造を可視化するために、ネガティブ染色電子顕微鏡観察を採用した（図１Ｃ）。単量体発現型ＶＥＧＦで予想されるように、ｍｏＶＥＧＦ１６５はダンベル状の二量体複合体に組み立てられ、少数の単量体分子は一点の点として表された（左パネル図１Ｃ）。特にそれに対して、ｓｃＶＥＧＦ１６５は、２：２配置のｓｃＶＥＧＦ１６５の複合体、すなわちＶＥＧＦ１６５の四量体として均一に配列したクローバーリーフ状の構造で現れた。
【0164】
ｍｏＶＥＧＦ１６５およびｓｃＶＥＧＦ１６５に加えて、単量体ＰｌＧＦ（ｍｏＰｌＧＦ）および単鎖ＰｌＧＦ二量体（ｓｃＰｌＧＦ）コンストラクトを作製し、先に述べたように発現させて試験した（図７右上および右下）。
【0165】
その後、ｍｏＶＥＧＦ１６５、ｓｃＶＥＧＦ１６５、ｍｏＰｌＧＦ、およびｓｃＰｌＧＦの結合特性を調査した。強い相互作用体をスクリーニングするために、ＶＥＧＦとＰｌＧＦコンストラクトのＶＥＧＦ－ｔｒａｐへの結合親和性と静的結合能を、それぞれＥＬＩＳＡに基づく連続希釈実験と高過剰のタンパク質負荷により平衡解離定数（Ｋｄ）として定量化した。本願で使用するＶＥＧＦ－Ｔｒａｐは、ＶＥＧＦＲ－１受容体の第二結合ドメインとＶＥＧＦＲ－２受容体の第三ドメインがヒトＩｇＧ骨格のＦｃセグメントに融合して含まれるキメラタンパク質であり、非常に高いＶＥＧＦ結合親和性（Ｋｄ≒１ｐＭ）を有している。
【0166】
以前の報告から予想されるように、ｍｏＶＥＧＦ１６５はｍｏＰｌＧＦ（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒら、２００４年）と比較して高い親和性（２．６倍）を示した。しかし注目すべきは、ｓｃＶＥＧＦ１６５はｍｏＶＥＧＦ１６５と比較して１１％高い親和性を示したことである。興味深いことに、ｓｃＰｌＧＦの親和性はｍｏＰｌＧＦと比較して有意な差はなかった（図２Ａ＋Ｂ）。
【0167】
結果：特に、ｓｃＰｌＧＦとｍｏＰｌＧＦの結合親和性がほぼ等しいことを考えると、ｓｃＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ－ｔｒａｐへの結合親和性がｍｏＶＥＧＦ１６５に比べて１１％高いことは非常に驚くべき知見である。さらに、互いに異なるコンストラクトに見られる結合能の驚くべき大きなばらつきは特に注目に値する。
【0168】
実施例２－基質マトリックスの評価とｓＦｌｔ－１捕獲アフェレーシスカラムの安定性
各種樹脂への組換えタンパク質のカップリング効率を解析するために、その樹脂へのカップリング前後の組換えタンパク質濃度を測定した。結果を表２に示す。
各種樹脂への組換えタンパク質のカップリング効率を解析するために、その樹脂へのカップリング前後の組換えタンパク質濃度を測定した。結果を表２に示す。
【0169】
【表2】
【0170】
アフェレーシスカラムの動的結合特性を最適化するため、リガンドの固定化にＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴ（登録商標）、臭化シアノゲン活性化セファロース、またはアルデヒド活性化アガロースを用いて固定化ｍｏＰｌＧＦとｍｏＶＥＧＦ１６５によるヒト血清からのｓＦｌｔ－１吸着をテストした。ｍｏＰｌＧＦとｍｏＶＥＧＦ１６５ベースのカラムのいずれにおいても、すべての樹脂でｓＦｌｔ－１の有意な吸着が認められた。しかし、ｓＶＥＧＦ１６５をアガロースマトリックスに固定化したカラムでは、１回のランで８６．１６％という最大のｓＦｌｔ－１減少率を達成した（図３Ａ）。ｓｃＶＥＧＦ１６５ベースのアガロースカラムの安定性を、作製後１、１５、３０、６０、９０日で評価したところ、親和性の著しい損失は認められなかった（図３Ｂ）。
【0171】
結果：アガロースマトリックスへのリガンドの結合は、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴ（登録商標）マトリックスやセファロースマトリックスへの結合と比較して、すべてのリガンド（ｍｏＰｌＧＦ、ｍｏＶＥＧＦ１６５、ｓｃＶＥＧＦ１６５）でヒト血清からのｓＦｌｔ－１の最大の吸着をもたらした。さらに、ヒト血清からのｓＦｌｔ－１吸着量は、ｍｏＰｌＧＦやｍｏＶＥＧＦ１６５と比較して、ｓｃＶＥＧＦ１６５で有意に高かった（ｍｏＶＥＧＦ１６５はｍｏＰｌＧＦと比較して、ヒト血清からのｓＦｌｔ－１吸着量がわずかに優れていた）。ｓＶＥＧＦ１６５をアガロースマトリックスに固定化したカラムでは、１回のランで８６．１６％という最大のｓＦｌｔ－１減少率を達成した。その上、ｓｃＶＥＧＦ１６５アガロースカラムの長期安定性を調べると、ｓＦｌｔ－１との結合がわずかに減少したのみであることが分かった。
【0172】
実施例３－ｓＦｌｔ－１捕獲用リガンドの特徴解析
次のステップでは、アガロースアフェレーシスカラムに固定化した各種ＶＥＧＦ－およびＰｌＧＦ－変異体について、患者血清からのｓＦｌｔ－１減少の実効性を評価した。
次のステップでは、アガロースアフェレーシスカラムに固定化した各種ＶＥＧＦ－およびＰｌＧＦ－変異体について、患者血清からのｓＦｌｔ－１減少の実効性を評価した。
【0173】
アルデヒド活性化アガロースを担持したミニカラムに、ＶＥＧＦ変異体またはＰｌＧＦ変異体を等量ロードした（表２）。また、抗体ベースのアフェレーシスカラムを１本作製して、参照コントロールとした。ｓＦｌｔ－１、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ濃度は、コントロールカラムまたはそれぞれのＶＥＧＦ変異体、ＰｌＧＦ変異体、Ｆｌｔ－１特異抗体を備えたカラムでの一回のラン前後で、市販ＥＬＩＳＡキットを用いて子癇前症の患者の血清サンプルで測定した。コントロールカラムにサンプルを掛けた後でもｓＦｌｔ－１濃度、ＰｌＧＦ濃度、ＶＥＧＦ濃度に差がないのに対し、ｓＦｌｔ－１レベルは特定のリガンドに依存して様々な量に減少した（図４Ａ）。ｍｏＶＥＧＦ１６５をカラムに固定化した場合、患者血清を１回通すことでｓＦｌｔ－１が７７．１５％減少し、これは抗体カラムで得られた減少率と同じであった。一方、ｍｏＶＥＧＦ１６５と比較してｍｏＰｌＧＦの結合親和性と容量が低いため、予想通り（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒら、２００４年）、ｍｏＰｌＧＦカラムを用いた吸着では、ｓＦｌｔ－１が４６．１８％しか減少しなかった。ｍｏＶＥＧＦカラムではＰｌＧＦとＶＥＧＦの遊離が認められたが、ｍｏＰｌＧＦカラムではＰｌＧＦの遊離のみが検出されＶＥＧＦの遊離はなく、抗体カラムではＶＥＧＦもＰｌＧＦも遊離しなかった（図４Ｂ＋Ｃ）。
【0174】
注目すべきことに、患者血清を用いた吸着実験では、改変型一本鎖ＶＥＧＦ二量体（ｓｃＶＥＧＦ１６５）は一回のランでｓＦｌｔ－１を８９．８７％減少させ（図４Ａ）、同時にＶＥＧＦとＰｌＧＦを大量に放出した（図４Ｂ＋Ｃ）。興味深いことに、ＰｌＧＦについては、最適化された多量体化方法では、ｓＦｌｔ－１結合とＰｌＧＦ放出に同程度にしか影響を与えなかった（図４Ａ）。ｓｃＰｌＧＦカラムでは、ｍｏＰｌＧＦカラムと比較して、ｓＦｌｔ－１結合がわずかに増強されただけで、ＰｌＧＦ放出に有意差は認められなかった（図４Ａ＋Ｂ）。予想通り、ｍｏＰｌＧＦと同様に、ｓｃＰｌＧＦカラムは内因性ＶＥＧＦを放出しなかった（図４Ｃ）。
【0175】
フロースルー中のＶＥＧＦまたはＰｌＧＦレベルの増加は、カラムからの組換えタンパク質の漏出を表しているかもしれないという考えは、血清サンプルを通した後にＳｔｒｅｐタグ付きＶＥＧＦまたはＰｌＧＦを有するカラムのフロースルーからＳｔｒｅｐタグ付きタンパク質を精製する検証により否定された。テストしたすべてのコンストラクトについて、Ｓｔｒｅｐ特異的一次抗体を用いたウェスタンブロット分析では、漏出したタンパク質は検出されなかった（図９）。
【0176】
結果：ＶＥＧＦとＰｌＧＦの変異体を固定化したカラムおよびＦｌｔ－１特異的抗体を用いたカラムでは、いずれもサンプル中のｓＦｌｔ－１が減少した。ｓＦｌｔ－１の減少はｓｃＶＥＧＦ１６５カラムで最も大きく（ｐ＜０．０００１）、他のすべてのＶＥＧＦとＰｌＧＦの変異体およびＦｌｔ－１特異的抗体は、ｓＦｌｔ－１をより低い効率で減少させた（図４Ａ）。ＶＥＧＦとＰｌＧＦのカラムを用いたアフェレーシスの結果、ｓｃＶＥＧＦ１６５で最も顕著にＰｌＧＦを放出したが（ｐ＜０．０００１）、ｍｏＶＥＧＦ１６５を用いたアフェレーシスではｓｃＶＥＧＦ１６５の半分の量しかＰｌＧＦが放出されなかった。ｓＦｌｔ－１抗体を用いたアフェレーシスでは、有意なＰｌＧＦの放出が起きなかった（図４Ｂ）。ＶＥＧＦの放出は、ＶＥＧＦ変異体を含むアフェレーシスカラムでのみ起こり、やはりｓｃＶＥＧＦ１６５で最も顕著であった（ｐ＜０．０００１）。ＰｌＧＦ変異体やＦｌｔ－１特異的抗体を用いたカラムを使用して血清サンプルをアフェレーシスした結果、ＶＥＧＦの遊離は起きなかった（図４Ｃ）。
【0177】
実施例４－独立した患者サンプルにおけるｓｃＶＥＧＦ
１６５
ベースのアフェレーシスの検証
臨床的に子癇前症が疑われ、ｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比が高い、妊娠年齢の異なる１０名の独立した患者の血清サンプルにおいて、ｓＶＥＧＦ１６５カラムによるｓＦｌｔ－１減少率およびＶＥＧＦ／ＰｌＧＦ放出が立証された。
臨床的に子癇前症が疑われ、ｓＦｌｔ－１／ＰｌＧＦ比が高い、妊娠年齢の異なる１０名の独立した患者の血清サンプルにおいて、ｓＶＥＧＦ１６５カラムによるｓＦｌｔ－１減少率およびＶＥＧＦ／ＰｌＧＦ放出が立証された。
【0178】
結果：すべての患者サンプルにおいて、ｓＦｌｔ－１が８８％（平均）（中央値９２．２％；ＳＤ５．２７）が減少し（図５Ａ）、ＰｌＧＦが初期レベルの２０倍（平均）（中央値１４．５７倍；ＳＤ５．４０）放出され（図５Ｂ）、ＶＥＧＦが初期レベルの９．０７倍（平均）（中央値８．７４；ＳＤ４．１５）放出される（図５Ｃ）ことがｓｃＶＥＧＦ１６５カラムの１回のランで達成された。
【0179】
Ｆｌｔ－１特異的抗体を用いたアフェレーシスシステムでは、ｓＦｌｔ－１レベルは低下するが、内因性ＰｌＧＦやＶＥＧＦは遊離しない（図６Ａ）。ＰｌＧＦを含む吸着カラムはｓＦｌｔ－１を保持し、低量の内因性ＰｌＧＦを遊離するが、内因性ＶＥＧＦは遊離しない（図６Ｂ）。単量体ＶＥＧＦ１６５カラムはｓＦｌｔ－１を捕獲し、大量のＰｌＧＦとＶＥＧＦも放出する（図６Ｃ）。ｓＦｌｔ－１に対するｓｃＶＥＧＦ１６５の結合特性が向上した結果、ｓＦｌｔ－１を最も効率的に吸着し、ＰｌＧＦとＶＥＧＦを競合的に放出し、子癇前症における血管新生バランスを回復させることにつながる（図６Ｄ）。
【0180】
一般に、抗体を介したアフェレーシスやｍｏＶＥＧＦまたはＰｌＧＦベースのアプローチと比較して、ｓｃＶＥＧＦ１６５ベースのアフェレーシスのユニークな特徴は、ｓＦｌｔ－１に対する親和性が高く、したがってＶＥＧＦやＰｌＧＦを効率的に放出できることだ（図６）。
【0181】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】