▶ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-07
(54)【発明の名称】遺伝子治療を使用して心不全を回復するための方法
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20230630BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20230630BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230630BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230630BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230630BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61P9/04
A61K31/7088
A61K35/76
A61P43/00 105
【審査請求】有
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022561512
(86)(22)【出願日】2021-04-07
(85)【翻訳文提出日】2022-10-07
(86)【国際出願番号】 US2021026131
(87)【国際公開番号】W WO2021207327
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】63/007,229
(32)【優先日】2020-04-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/088,123
(32)【優先日】2020-10-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
２．ＴＲＩＴＯＮ
３．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】399047002
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100188374
【弁理士】
【氏名又は名称】一宮 維幸
(72)【発明者】
【氏名】ホーン，ティンティン
(72)【発明者】
【氏名】ショー，ロビン・マーク
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA36
4C084ZC01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZC01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087CA20
4C087NA14
4C087ZA36
4C087ZC01
(57)【要約】
本明細書では、ウイルスベクターを含む組成物について記載する。ウイルスベクターは、ｃａｒｄｉａｃ ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ１（ｃＢＩＮ１）等のｔ管組織化タンパク質又はペプチドをコードし得る。また、本明細書では、それを必要とする対象における心不全の治療又は予防のための方法が開示される。治療又は予防の方法は、心不全を経験したか又は慢性的な心筋ストレスを有する対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるために、ｃＢＩＮ１を含むベクターを対象に投与することを含み得る。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
心不全を経験したか又は慢性ストレス下の対象において心臓組織を回復するか又は心不全の症状を改善するための方法であって、対象において心不全又は心筋ストレスを診断すること、及び心不全を経験した対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含む、方法。
【請求項2】
前記心不全又は心筋ストレスの診断が、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
心不全を経験した対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるための方法であって、対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子が心臓組織に送達され発現した後に、心臓の収縮機能が回復又は増大する、方法。
【請求項4】
前記導入遺伝子が、前記対象が心不全と診断された後に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記心不全の診断が、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
心筋に前記導入遺伝子を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記導入遺伝子が注入によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記導入遺伝子が、ｃＢＩＮ１をコードする導入遺伝子を含むベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記導入遺伝子が、約１×１０１０～約５×１０１０のベクターゲノムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
ｃＢＩＮ１の発現が、損傷した心筋を再構築する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
ｃＢＩＮ１の発現が、心筋におけるカルシウム処理機構の細胞内分布を安定化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
ｃＢＩＮ１の発現が、心筋における求心性肥大を低減させる、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
ｃＢＩＮ１の発現が、心筋におけるｔ管マイクロフォールド又はマイクロドメインを回復又は増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
ｃＢＩＮ１の発現が、心筋におけるリアノジン受容体２（ＲｙＲ２）の過リン酸化を回復又は減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
ｃＢＩＮ１の発現が、心収縮性及びルシトロピーを回復又は改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
ｃＢＩＮ１の発現が、心臓弛緩及び拡張期機能を回復又は改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
ｃＢＩＮ１の発現が、心筋に対するさらなる損傷に対して予防的である、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記導入遺伝子が少なくとも１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記対象がマウス又はイヌである、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記対象が、駆出率の低下（ＨＦｒＥＦ）を経験する、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象において心筋組織を回復するか又は心筋損傷を修復するための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用。
【請求項24】
心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月８日に出願された米国仮特許出願第６３／００７，２２９号及び２０２０年１０月６日に出願された第６３／０８８，１２３号の優先権を主張し、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年４月８日に出願された米国仮特許出願第６３／００７，２２９号及び２０２０年１０月６日に出願された第６３／０８８，１２３号の優先権を主張し、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府出資研究
本発明は、国立衛生研究所の助成金番号ＨＬ１３３２８６、ＨＬ０９４４１４、及びＨＬ１３８５７７の下、米国政府の支援を受けて行われたものである。米国政府は、本発明について一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所の助成金番号ＨＬ１３３２８６、ＨＬ０９４４１４、及びＨＬ１３８５７７の下、米国政府の支援を受けて行われたものである。米国政府は、本発明について一定の権利を有する。
【0003】
技術分野
本明細書に記載されるのは、ウイルスベクターを含む組成物である。ウイルスベクターは、ｃａｒｄｉａｃ ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ１（ｃＢＩＮ１）等のｔ管組織化タンパク質又はペプチドをコードしていてもよい。また、本明細書では、それを必要とする対象における心不全の治療又は予防のための方法が開示されている。治療又は予防の方法は、心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるために、ｃＢＩＮ１を含むベクターを対象に投与することを含み得る。
本明細書に記載されるのは、ウイルスベクターを含む組成物である。ウイルスベクターは、ｃａｒｄｉａｃ ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ１（ｃＢＩＮ１）等のｔ管組織化タンパク質又はペプチドをコードしていてもよい。また、本明細書では、それを必要とする対象における心不全の治療又は予防のための方法が開示されている。治療又は予防の方法は、心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるために、ｃＢＩＮ１を含むベクターを対象に投与することを含み得る。
【背景技術】
【0004】
心不全（ＨＦ）は、世界で２０００万人以上、米国では６２０万人が罹患している、最も急速に増加している心血管系疾患である［１－２］。ＨＦに関連する死亡率の大部分は、心筋の強心及び弛緩機能障害による心臓ポンプ不全、並びに不全心による不整脈負荷の増加による心臓突然死と関連している。さらに、駆出率が保たれているＨＦ（ＨＦｐＥＦ）患者の５０％近くでは［２］、不整脈のリスクがさらに高い重度の拡張期不全が起こり、これは臨床結果がさらに悪くなる上、有効な薬物療法が存在しない。したがって、心不全の進行を制限し、逆転させることができる新しい治療戦略の開発が急務となっている。
【0005】
ＨＦ発症中の、不全心室筋細胞の病態生理学的細胞特徴は、細胞内カルシウム恒常性が損なわれたカルシウムトランジェントの異常であり［３］、これは興奮－収縮（ＥＣ）カップリングを妨害し［４］、電気的安定性を損ない［５］、ミトコンドリア代謝を妨害する［６］。正常な心拍間隔のカルシウムトランジェントは、カルシウム誘導カルシウム放出（ＣＩＣＲ）として知られる一連の細胞内事象に依存しており［７］、ここで、ｔ管Ｌ型カルシウムチャネル（ＬＴＣＣ）を介した最初のカルシウム流入は、その後、筋小胞体（ＳＲ）貯蔵部からリアノジン受容体（ＲｙＲ）を介して大量のカルシウム放出を誘導する。弛緩時には、次いで、蓄積されたカルシウムは、主にＳＲ Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）を介したＳＲへの再吸収、及び細胞外空間へのカルシウム排出によって細胞質から除去される［７］。ＨＦでは、ｔ管の異常なリモデリング［８－１０］により、ＬＴＣＣ－ＲｙＲのカップリング及び同調的なＣＩＣＲ［３、１１］が損なわれ、これによって収縮期放出が減少し、ＥＣのアンカップリング、及びそれによる収縮低下がもたらされる。一方、ＨＦ関連漏出性ＲｙＲ［１２］及びＳＥＲＣＡ２ａの機能異常［１３］は、ＳＲ枯渇及び拡張期カルシウムの上昇［１４］をもたらし、これは、重度の拡張期不全及び電気的不安定性をもたらす［１５］。さらに、カルシウム恒常性異常は、ミトコンドリア膜電位の損失［１６］及び透過性の増加［１７］を引き起こし、これは、ミトコンドリア主導の細胞死［１８－１９］及びＨＦ進行［１８、２０］の危険性を促進する。まとめると、カルシウム恒常性異常は、正常な心臓ポンプ機能、電気的安定性及び代謝を制御する上で重要であり、これが妨害されると、ポンプ不全、致死的不整脈及び重度の代謝障害につながることになる。
【0006】
心筋横管（ｔ管）は、カルシウムトランジェントの開始及び効率的な興奮－収縮（ＥＣ）カップリングの維持に重要である。病理学的なｔ管リモデリングは、ＨＦにおけるβ－アドレナリン刺激の結果である［２１－２３］。さらに、ｔ管のマイクロドメインの障害は、ＨＦ進行に関与している［２４－２７］。実際、ｔ管のリモデリングは、肥大から不全への転換点となり得る［１０］。正常なカルシウムトランジェント［２８］は、Ｌ型カルシウムチャネル（ＬＴＣＣ）がｔ管マイクロドメインに存在することを必要とし、これは心収縮及び弛緩に極めて重要である。ｔ管膜足場タンパク質ｃａｒｄｉａｃ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）［２９］は、ＬＴＣＣのトラフィッキング［３０］及び二分子組織化のためのクラスタリングを促進し、また、β－アドレナリン受容体（β－ＡＲ）シグナル伝達の制御下にある［３１］。さらに、ＨＦではｃＢＩＮ１が減少し［３１－３３］、その結果、ｃＢＩＮ１－マイクロドメインの破壊は正常なストレス応答を損ない、収縮力を制限し、不整脈を促進する。ｃＢＩＮ１－マイクロドメインを保存する治療的アプローチは、カルシウム処理機構を保護することによってストレス下の心臓に利点をもたらし、ＨＦの進行を遅延化させ得る。
【0007】
したがって、個々の心室筋細胞内のリモデリングを防止して、全体的な心臓リモデリングを改善し、不全心臓の治療的利点を有することは必要とされたままである。
【発明の概要】
【0008】
本明細書に記載される一実施形態は、心不全を経験したか又は慢性ストレス下の対象において心臓組織を回復するか又は心不全の症状を改善するための方法であって、対象において心不全又は心筋ストレスを診断すること、及び心不全を経験した対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含む、方法である。一態様では、心不全又は心筋ストレスの診断は、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む。
【0009】
本明細書に記載される他の実施形態は、心不全を経験した対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるための方法であって、対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子が心臓組織に送達され発現した後に、心臓の収縮機能が回復又は増大する、方法である。一態様では、導入遺伝子は、対象が心不全と診断された後に投与される。他の態様では、心不全の診断は、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む。他の態様では、方法は、心筋に導入遺伝子を投与することを含む。他の態様では、導入遺伝子は、注入によって投与される。他の態様では、導入遺伝子は、ｃＢＩＮ１をコードする導入遺伝子を含むベクターを含む。他の態様では、導入遺伝子は、約１×１０１０～約５×１０１０のベクターゲノムを含む。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、損傷した心筋を再構築する。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋におけるカルシウム処理機構の細胞内分布を安定化させる。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋における求心性肥大を低減させる。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋におけるｔ管マイクロフォールド又はマイクロドメインを回復又は増大させる。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋におけるリアノジン受容体２（ＲｙＲ２）の過リン酸化を回復又は減少させる。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心収縮性及びルシトロピーを回復又は改善する。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心臓弛緩及び拡張期機能を回復又は改善する。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋に対するさらなる損傷に対して予防的である。他の態様では、導入遺伝子は少なくとも１回投与される。他の態様では、対象は哺乳動物である。他の態様では、対象は、マウス又はイヌである。他の態様では、対象は、ヒトである。他の態様では、対象は、駆出率の低下（ＨＦｒＥＦ）を経験する。
【0010】
本明細書に記載される他の実施形態は、心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象において心筋組織を回復するか又は心筋損傷を修復するための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用である。
【0011】
本明細書に記載される他の実施形態は、心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用である。
【0012】
特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む特許又は特許出願公開のコピーは、要求及び必要な料金の支払いに応じて、特許庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１Ａ～Ｂは、大動脈収縮（ＴＡＣ）を受けたマウスにおけるｃａｒｄｉａｃ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）後処理に関する実験プロトコルを示す。図１Ａは、模式的なプロトコルを示す；４７匹のマウスを３群に無作為化した：ｓｈａｍ（Ｎ＝１２）又はＴＡＣ５週後にＡＡＶ９－ＧＦＰ（Ｎ＝１７）及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１（Ｎ＝１８）を投与された後処理ＴＡＣマウス。図１Ｂは、３群における経大動脈圧力勾配（ＴＡＰ）の心エコー分析である。
【図2】図２Ａ～Ｂは、外因性ｃＢＩＮ１による後処理が、ＴＡＣ後マウスの生存率を改善することを示す。図２Ａは、マウスの３群全て：ｓｈａｍ対照（Ｎ＝１２）、ＧＦＰ（Ｎ＝１７）又はｃＢＩＮ１（Ｎ＝１８）を導入したＡＡＶ９－ＣＭＶウイルスで処理したＴＡＣ後のマウスについてのカプラン－マイヤー生存曲線を示す。３群間の比較のために、ログランク検定を使用した。図２Ｂは、ＡＡＶ９－ＧＦＰ（Ｎ＝１６）又はＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１（Ｎ＝１５）の後処理後、ＡＡＶ９注入前の疾患の末期（ＴＡＣ後５週のＴＡＣ ＥＦ≧３０％）ではないＴＡＣ後マウスのカプラン－マイヤー生存曲線を示す。ＡＡＶ９－ＧＦＰ群とＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１群との間の生存率の比較のためにログランク検定を使用した。
【図3】図３Ａ～Ｃは、外因性ｃＢＩＮ１がＴＡＣ誘導性肥大及び肺浮腫を減少させることを示す。図３Ａは、Ｈ＆Ｅ染色による縦断的な心臓切片を示す（スケールバー、１ｍｍ）。図３Ｂは、ＴＡＣ後２０週における、脛骨長に対する心臓重量の比（ＨＷ／ＴＬ）を示し、図３Ｃは、脛骨長に対する肺重量（ＬＷ／ＴＬ）を示す。データは平均±ＳＥＭで示され、統計解析にはフィッシャーのＬＳＤ検定による二元配置ＡＮＯＶＡが用いられた。＊、＊＊＊は、ｓｈａｍに対するｐ＜０．０５、０．００１；†は、ＧＦＰ群とｃＢＩＮ１群の間を比較したｐ＜０．０５。
【図4-1】図４Ａは、ｃＢｉｎ１遺伝子導入が、圧力過負荷心臓において心筋の収縮期及び拡張期機能を維持することを示す。（Ａ）ＴＡＣ後５週（ＡＡＶ９注入前）及びＴＡＣ後２０週（ＡＡＶ９注入後１５週）における各群（ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１）の代表的な左心室（ＬＶ）短軸Ｍモード画像。図４Ｂ～Ｄは、ＴＡＣ後５週（ＡＡＶ９前）及び２０週（ＡＡＶ９後）における、心エコー測定した（図４Ｂ）左心室駆出率（ＥＦ）、（図４Ｃ）拡張末期容積、及び（図４Ｄ）左心室質量を示す。図４Ｅは、ＴＡＣ後２０週（ＡＡＶ９注入後１５週）における代表的な僧帽弁流入パルス波ドップラー画像（上）及び中隔僧帽弁輪（ｅ’）の組織ドップラー画像（下）を示す。図４Ｆは、ＴＡＣ後５週（ＡＡＶ９前）及び２０週（ＡＡＶ９後）における各群からのＥ／ｅ’の定量化を示す。図４Ｇ～Ｈは、各マウスの（図４Ｇ）一回拍出量（ＳＶ）及び（図４Ｈ）心拍出量（ＣＯ）における５週から２０週へのΔ変化（ΔＳＶ＝ＳＶ２０ｗ－ＳＶ５ｗ；ΔＣＯ＝ＣＯ２０ｗ－ＣＯ５ｗ）を示す。データは平均±ＳＥＭで示し、統計解析にはフィッシャーのＬＳＤ検定による二元配置ＡＮＯＶＡを用いた。＊、＊＊、＊＊＊は、ｓｈａｍに対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１；†、††、†††は、各時点でＡＡＶ９－ＧＦＰ群と－ｃＢＩＮ１群を比較した、ｐ＜０．０５、０．０１、０．００１。‡‡は、各群のＡＡＶ９処理前と処理後を比較したｐ＜０．０１である。
【図4-2】図４Ａは、ｃＢｉｎ１遺伝子導入が、圧力過負荷心臓において心筋の収縮期及び拡張期機能を維持することを示す。（Ａ）ＴＡＣ後５週（ＡＡＶ９注入前）及びＴＡＣ後２０週（ＡＡＶ９注入後１５週）における各群（ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１）の代表的な左心室（ＬＶ）短軸Ｍモード画像。図４Ｂ～Ｄは、ＴＡＣ後５週（ＡＡＶ９前）及び２０週（ＡＡＶ９後）における、心エコー測定した（図４Ｂ）左心室駆出率（ＥＦ）、（図４Ｃ）拡張末期容積、及び（図４Ｄ）左心室質量を示す。図４Ｅは、ＴＡＣ後２０週（ＡＡＶ９注入後１５週）における代表的な僧帽弁流入パルス波ドップラー画像（上）及び中隔僧帽弁輪（ｅ’）の組織ドップラー画像（下）を示す。図４Ｆは、ＴＡＣ後５週（ＡＡＶ９前）及び２０週（ＡＡＶ９後）における各群からのＥ／ｅ’の定量化を示す。図４Ｇ～Ｈは、各マウスの（図４Ｇ）一回拍出量（ＳＶ）及び（図４Ｈ）心拍出量（ＣＯ）における５週から２０週へのΔ変化（ΔＳＶ＝ＳＶ２０ｗ－ＳＶ５ｗ；ΔＣＯ＝ＣＯ２０ｗ－ＣＯ５ｗ）を示す。データは平均±ＳＥＭで示し、統計解析にはフィッシャーのＬＳＤ検定による二元配置ＡＮＯＶＡを用いた。＊、＊＊、＊＊＊は、ｓｈａｍに対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１；†、††、†††は、各時点でＡＡＶ９－ＧＦＰ群と－ｃＢＩＮ１群を比較した、ｐ＜０．０５、０．０１、０．００１。‡‡は、各群のＡＡＶ９処理前と処理後を比較したｐ＜０．０１である。
【図4-3】図４Ａは、ｃＢｉｎ１遺伝子導入が、圧力過負荷心臓において心筋の収縮期及び拡張期機能を維持することを示す。（Ａ）ＴＡＣ後５週（ＡＡＶ９注入前）及びＴＡＣ後２０週（ＡＡＶ９注入後１５週）における各群（ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１）の代表的な左心室（ＬＶ）短軸Ｍモード画像。図４Ｂ～Ｄは、ＴＡＣ後５週（ＡＡＶ９前）及び２０週（ＡＡＶ９後）における、心エコー測定した（図４Ｂ）左心室駆出率（ＥＦ）、（図４Ｃ）拡張末期容積、及び（図４Ｄ）左心室質量を示す。図４Ｅは、ＴＡＣ後２０週（ＡＡＶ９注入後１５週）における代表的な僧帽弁流入パルス波ドップラー画像（上）及び中隔僧帽弁輪（ｅ’）の組織ドップラー画像（下）を示す。図４Ｆは、ＴＡＣ後５週（ＡＡＶ９前）及び２０週（ＡＡＶ９後）における各群からのＥ／ｅ’の定量化を示す。図４Ｇ～Ｈは、各マウスの（図４Ｇ）一回拍出量（ＳＶ）及び（図４Ｈ）心拍出量（ＣＯ）における５週から２０週へのΔ変化（ΔＳＶ＝ＳＶ２０ｗ－ＳＶ５ｗ；ΔＣＯ＝ＣＯ２０ｗ－ＣＯ５ｗ）を示す。データは平均±ＳＥＭで示し、統計解析にはフィッシャーのＬＳＤ検定による二元配置ＡＮＯＶＡを用いた。＊、＊＊、＊＊＊は、ｓｈａｍに対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１；†、††、†††は、各時点でＡＡＶ９－ＧＦＰ群と－ｃＢＩＮ１群を比較した、ｐ＜０．０５、０．０１、０．００１。‡‡は、各群のＡＡＶ９処理前と処理後を比較したｐ＜０．０１である。
【図5-1】図５Ａ～Ｃは、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１後処理が、ＴＡＣ後のマウス心臓におけるＥＦをレスキューすることを示す。図５Ａは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ及び－ｃＢＩＮ１処理群におけるＡＡＶ前からＡＡＶ９注入後３、６、８、１０、及び１５週（対応すると、ＴＡＣ後８、１１、１３、１５、及び２０週）までの心エコーモニターによるΔＥＦ変化（ΔＥＦ）を示す。図５Ｂ～Ｃは、ガウス分布フィット曲線を有するＡＡＶ９処理後６週（図５Ｂ）及び８週（図５Ｃ）におけるΔＥＦのヒストグラム分布を示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図5-2】図５Ａ～Ｃは、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１後処理が、ＴＡＣ後のマウス心臓におけるＥＦをレスキューすることを示す。図５Ａは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ及び－ｃＢＩＮ１処理群におけるＡＡＶ前からＡＡＶ９注入後３、６、８、１０、及び１５週（対応すると、ＴＡＣ後８、１１、１３、１５、及び２０週）までの心エコーモニターによるΔＥＦ変化（ΔＥＦ）を示す。図５Ｂ～Ｃは、ガウス分布フィット曲線を有するＡＡＶ９処理後６週（図５Ｂ）及び８週（図５Ｃ）におけるΔＥＦのヒストグラム分布を示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【図6-1】図６Ａ～Ｆは、外因性ｃＢＩＮ１前処理が心筋の圧力－容積（ＰＶ）ループを改善することを示す図である。図６Ａは、模式的なプロトコルを示す：ＴＡＣの３週間前に投与されたＡＡＶ９－ＧＦＰ（Ｎ＝１０）又はｃＢＩＮ１（Ｎ＝１０）の前処理を伴うｓｈａｍ（Ｎ＝５）又はＴＡＣ。図６Ｂ～Ｆは、ＴＡＣ外科手術後８週におけるｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ及び－ｃＢＩＮ１心臓の代表的なＰＶループ（図６Ｂ）、ＥＦ（図６Ｃ）、ｄｐ／ｄｔ最大値（図６Ｄ）、ｄｐ／ｄｔ最小値（図６Ｅ）及びＴａｕ（図６Ｆ）を示す。データは平均±ＳＥＭとして示され、フィッシャーのＬＳＤ検定による一元配置ＡＮＯＶＡが統計解析に使用された。＊＊、＊＊＊は、ｓｈａｍに対するｐ＜０．０１、０．００１；†、††はＡＡＶ９－ＧＦＰ群とＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１群の間で比較した、ｐ＜０．０５、０．０１。
【図6-2】図６Ａ～Ｆは、外因性ｃＢＩＮ１前処理が心筋の圧力－容積（ＰＶ）ループを改善することを示す図である。図６Ａは、模式的なプロトコルを示す：ＴＡＣの３週間前に投与されたＡＡＶ９－ＧＦＰ（Ｎ＝１０）又はｃＢＩＮ１（Ｎ＝１０）の前処理を伴うｓｈａｍ（Ｎ＝５）又はＴＡＣ。図６Ｂ～Ｆは、ＴＡＣ外科手術後８週におけるｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ及び－ｃＢＩＮ１心臓の代表的なＰＶループ（図６Ｂ）、ＥＦ（図６Ｃ）、ｄｐ／ｄｔ最大値（図６Ｄ）、ｄｐ／ｄｔ最小値（図６Ｅ）及びＴａｕ（図６Ｆ）を示す。データは平均±ＳＥＭとして示され、フィッシャーのＬＳＤ検定による一元配置ＡＮＯＶＡが統計解析に使用された。＊＊、＊＊＊は、ｓｈａｍに対するｐ＜０．０１、０．００１；†、††はＡＡＶ９－ＧＦＰ群とＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１群の間で比較した、ｐ＜０．０５、０．０１。
【図7-1】図７Ａ～Ｃは、ＴＡＣ後の心臓におけるｃＢＩＮ１－マイクロドメインの減少が、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理により正規化され得ることを示す。図７Ａ～Ｂは、ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理したＴＡＣ後の心臓ライセートからの（図７Ａ）ｃＢＩＮ１、（図７Ｂ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）、及びＣａｖ１．２のウェスタンブロットを示す。定量化は、下部の棒グラフに含まれる（ｃＢＩＮ１については、ｎ＝１群当たり８心臓、ｃＢＩＮ１については、ｎ＝１群当たり６心臓）。図７Ｃは、ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理したＴＡＣ後の心臓からのＢＩＮ１標識（抗ＢＡＲドメイン；上パネル）、ＲｙＲ（中パネル）、及びＣａｖ１．２（下パネル）の代表的な心筋免疫蛍光回転ディスク共焦点画像を示す。挿入図は、対応するボックス領域の拡大画像を含む。下段（左から右）：ＴＡＣ外科手術後８週のｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ及びｃＢＩＮ１前処理した心臓におけるＢＩＮ１、ＲｙＲ及びＣａｖ１．２分布のピークパワー密度（ｎ＝１群当たり５心臓から１５～２０画像）。データは平均±ＳＥＭで示し、統計解析にはフィッシャーのＬＳＤ検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。＊、＊＊、＊＊＊は、ｓｈａｍに対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１；†、††は、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群と－ｃＢＩＮ１群の間で比較した、ｐ＜０．０５、０．０１。
【図7-2】図７Ａ～Ｃは、ＴＡＣ後の心臓におけるｃＢＩＮ１－マイクロドメインの減少が、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理により正規化され得ることを示す。図７Ａ～Ｂは、ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理したＴＡＣ後の心臓ライセートからの（図７Ａ）ｃＢＩＮ１、（図７Ｂ）リアノジン受容体（ＲｙＲ）、及びＣａｖ１．２のウェスタンブロットを示す。定量化は、下部の棒グラフに含まれる（ｃＢＩＮ１については、ｎ＝１群当たり８心臓、ｃＢＩＮ１については、ｎ＝１群当たり６心臓）。図７Ｃは、ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理したＴＡＣ後の心臓からのＢＩＮ１標識（抗ＢＡＲドメイン；上パネル）、ＲｙＲ（中パネル）、及びＣａｖ１．２（下パネル）の代表的な心筋免疫蛍光回転ディスク共焦点画像を示す。挿入図は、対応するボックス領域の拡大画像を含む。下段（左から右）：ＴＡＣ外科手術後８週のｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ及びｃＢＩＮ１前処理した心臓におけるＢＩＮ１、ＲｙＲ及びＣａｖ１．２分布のピークパワー密度（ｎ＝１群当たり５心臓から１５～２０画像）。データは平均±ＳＥＭで示し、統計解析にはフィッシャーのＬＳＤ検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。＊、＊＊、＊＊＊は、ｓｈａｍに対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１；†、††は、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群と－ｃＢＩＮ１群の間で比較した、ｐ＜０．０５、０．０１。
【図8-1】図８Ａ～Ｈは、外因性ｃＢＩＮ１がイソプロテレノール（ＩＳＯ）後マウス心臓の求心性肥大を減少させることを示す。図８Ａは、実験プロトコルを示す：５６匹のマウスを４つの実験群に無作為化した：ＡＡＶ９－ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ（ｎ＝１４／群）。図８Ｂは、４群におけるマウス心臓重量／体重比（ＨＷ／ＢＷ）を示す。図８Ｃは、ＰＢＳ又はＩＳＯ輸注後４週における拡張末期及び収縮末期の両方における左心室の縦軸図の代表的な画像を示す。図８Ｄ～Ｇは、拡張末期容積、ＬＶ質量、及び相対的壁厚（図８Ｄ）、駆出率（図８Ｅ）、Ｅ／ｅ’（図８Ｆ）、一回拍出量（図８Ｇ）の心エコー分析を示し、及び心拍出量（図８Ｈ）も含まれる。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊、＊＊、＊＊＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し；＃＃、＃＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０１、０．００１を示す。
【図8-2】図８Ａ～Ｈは、外因性ｃＢＩＮ１がイソプロテレノール（ＩＳＯ）後マウス心臓の求心性肥大を減少させることを示す。図８Ａは、実験プロトコルを示す：５６匹のマウスを４つの実験群に無作為化した：ＡＡＶ９－ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ（ｎ＝１４／群）。図８Ｂは、４群におけるマウス心臓重量／体重比（ＨＷ／ＢＷ）を示す。図８Ｃは、ＰＢＳ又はＩＳＯ輸注後４週における拡張末期及び収縮末期の両方における左心室の縦軸図の代表的な画像を示す。図８Ｄ～Ｇは、拡張末期容積、ＬＶ質量、及び相対的壁厚（図８Ｄ）、駆出率（図８Ｅ）、Ｅ／ｅ’（図８Ｆ）、一回拍出量（図８Ｇ）の心エコー分析を示し、及び心拍出量（図８Ｈ）も含まれる。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊、＊＊、＊＊＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し；＃＃、＃＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０１、０．００１を示す。
【図9-1】図９Ａ～Ｃは、イソプロテレノールがｃＢＩＮ１を減少させ、ｃＢＩＮ１－マイクロフォールドを崩壊させ、これがＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によって正規化されることを示す。図９Ａは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓からの心臓ライセート及び免疫沈降した心臓ライセートからのｃＢＩＮ１及びＧＡＰＤＨのウェスタンブロットを示す。右側の棒グラフに定量化を示す（Ｎ＝６～７心臓／群）。図９Ｂは、Ｄｉ－８－ＡＮＮＥＰｓ標識（上パネル）（スケールバー、１０μｍ）及び上記の対応する目的のボックス領域のパワースペクトル（下パネル）の代表的な心筋細胞画像を示す。ピークパワー密度の定量化は、左側の棒グラフに含まれている。（Ｎ＝１群当たり３－４心臓から２６～３１細胞）。データは平均±ＳＥＭで示した。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊、＊＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてｐ＜０．０５、０．０１を示し；及び＃、＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてｐ＜０．０５、０．０１を示す。図９Ｃは、４群全てからの心筋組織からのｔ管マイクロフォールドの透過型電子顕微鏡画像化を示す（スケールバー、１μｍ）。各群からのｔ管（ＴＴ）の輪郭の程度の定量化は、左側の棒グラフに含まれる（Ｎ＝各群からの５～６の心筋切片及び２～３の心臓の６０～１００画像から２３２～３０５ＴＴ）。群間のＴＴ輪郭の比較にカイ二乗検定を用い、ＧＦＰ＋ＰＢＳ対ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ対ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ、及びｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ対他群の比較についてのｐ＜０．００１である。
【図9-2】図９Ａ～Ｃは、イソプロテレノールがｃＢＩＮ１を減少させ、ｃＢＩＮ１－マイクロフォールドを崩壊させ、これがＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によって正規化されることを示す。図９Ａは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓からの心臓ライセート及び免疫沈降した心臓ライセートからのｃＢＩＮ１及びＧＡＰＤＨのウェスタンブロットを示す。右側の棒グラフに定量化を示す（Ｎ＝６～７心臓／群）。図９Ｂは、Ｄｉ－８－ＡＮＮＥＰｓ標識（上パネル）（スケールバー、１０μｍ）及び上記の対応する目的のボックス領域のパワースペクトル（下パネル）の代表的な心筋細胞画像を示す。ピークパワー密度の定量化は、左側の棒グラフに含まれている。（Ｎ＝１群当たり３－４心臓から２６～３１細胞）。データは平均±ＳＥＭで示した。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊、＊＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてｐ＜０．０５、０．０１を示し；及び＃、＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてｐ＜０．０５、０．０１を示す。図９Ｃは、４群全てからの心筋組織からのｔ管マイクロフォールドの透過型電子顕微鏡画像化を示す（スケールバー、１μｍ）。各群からのｔ管（ＴＴ）の輪郭の程度の定量化は、左側の棒グラフに含まれる（Ｎ＝各群からの５～６の心筋切片及び２～３の心臓の６０～１００画像から２３２～３０５ＴＴ）。群間のＴＴ輪郭の比較にカイ二乗検定を用い、ＧＦＰ＋ＰＢＳ対ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ対ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ、及びｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ対他群の比較についてのｐ＜０．００１である。
【図10-1】図１０Ａ～Ｄは、ｃＢＩＮ１が、ｔ管へのＣａｖ１．２局在化を増加させることを示す。図１０Ａは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓からの心臓ライセートにおけるＣａｖ１．２のウェスタンブロットを示す。定量化（Ｃａｖ１．２／ＧＡＰＤＨ及びＣａｖ１．２／トロポニン）は、右側の棒グラフに含まれる（ｎ＝１群当たり５～７心臓）。図１０Ｂは、各群からのマウス心筋における抗Ｃａｖ１．２標識の代表的な共焦点画像（１００×）を示す（上、２パネル）（スケールバー、１０μｍ）。第３のパネルは、パワースペクトルを含み、第４のパネルは、心筋細胞長手軸に沿ったボックス領域内の蛍光強度プロファイルを含む。図１０Ｃは、各群におけるｔ管におけるＣａｖ１．２ピークパワー密度及び免疫蛍光強度の定量化を示す（ｎ＝１群当たり３～４心臓から１５～３２細胞画像）。スケールバー：１０μｍ。図１０Ｄは、各群からの代表的なカルシウムトランジェントトレース及びピーク振幅（△Ｆ／Ｆ０）の定量化を示す（ｎ＝１群当たり６心臓から６１～８８細胞）。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続き、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が使用された。＊＊＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．００１を示し；＃＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．００１を示す。
【図10-2】図１０Ａ～Ｄは、ｃＢＩＮ１が、ｔ管へのＣａｖ１．２局在化を増加させることを示す。図１０Ａは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓からの心臓ライセートにおけるＣａｖ１．２のウェスタンブロットを示す。定量化（Ｃａｖ１．２／ＧＡＰＤＨ及びＣａｖ１．２／トロポニン）は、右側の棒グラフに含まれる（ｎ＝１群当たり５～７心臓）。図１０Ｂは、各群からのマウス心筋における抗Ｃａｖ１．２標識の代表的な共焦点画像（１００×）を示す（上、２パネル）（スケールバー、１０μｍ）。第３のパネルは、パワースペクトルを含み、第４のパネルは、心筋細胞長手軸に沿ったボックス領域内の蛍光強度プロファイルを含む。図１０Ｃは、各群におけるｔ管におけるＣａｖ１．２ピークパワー密度及び免疫蛍光強度の定量化を示す（ｎ＝１群当たり３～４心臓から１５～３２細胞画像）。スケールバー：１０μｍ。図１０Ｄは、各群からの代表的なカルシウムトランジェントトレース及びピーク振幅（△Ｆ／Ｆ０）の定量化を示す（ｎ＝１群当たり６心臓から６１～８８細胞）。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続き、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が使用された。＊＊＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．００１を示し；＃＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．００１を示す。
【図11-1】図１１Ａ～Ｄは、ｃＢＩＮ１が、イソプロテレノール後の心臓におけるＳＥＲＣＡ２ａの細胞内分布を組織化することを示す。図１１Ａは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓からの心臓ライセートにおけるＳＥＲＣＡ２ａのウェスタンブロットを示す。図１１Ｂは、定量化（ＳＥＲＣＡ２ａ／アクチン）が棒グラフに含まれることを示す（ｎ＝１群当たり６～８心臓）。図１１Ｃは、各群からのマウス心筋における抗ＳＥＲＣＡ２ａ標識の代表的な共焦点画像を示す（上、２パネル）。スケールバー：１０μｍ。第３のパネルは、上記のボックス領域のＳＥＲＣＡ２ａのパワースペクトルを含む。図１１Ｄは、ＳＥＲＣＡ２ａのピークパワー密度の定量化を示す（ｎ＝１群当たり３～４心臓から１１～１５細胞画像）。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続き、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が使用された。＊＊、＊＊＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０１、０．００１を示し；＃＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．００１を示す。
【図11-2】図１１Ａ～Ｄは、ｃＢＩＮ１が、イソプロテレノール後の心臓におけるＳＥＲＣＡ２ａの細胞内分布を組織化することを示す。図１１Ａは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓からの心臓ライセートにおけるＳＥＲＣＡ２ａのウェスタンブロットを示す。図１１Ｂは、定量化（ＳＥＲＣＡ２ａ／アクチン）が棒グラフに含まれることを示す（ｎ＝１群当たり６～８心臓）。図１１Ｃは、各群からのマウス心筋における抗ＳＥＲＣＡ２ａ標識の代表的な共焦点画像を示す（上、２パネル）。スケールバー：１０μｍ。第３のパネルは、上記のボックス領域のＳＥＲＣＡ２ａのパワースペクトルを含む。図１１Ｄは、ＳＥＲＣＡ２ａのピークパワー密度の定量化を示す（ｎ＝１群当たり３～４心臓から１１～１５細胞画像）。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続き、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が使用された。＊＊、＊＊＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０１、０．００１を示し；＃＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．００１を示す。
【図12】図１２Ａ～Ｂは、心筋ミクロソームのスクロース勾配分画を示す。図１２Ａは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓からの心臓ミクロソームのＦ４（ＴＴ）画分におけるＣａｖ１．２及びｃＢＩＮ１の代表的なウェスタンブロット（１レーン当たり２．５μｇタンパク質ローディング）を示す。定量化は、棒グラフに含まれる（ｎ＝１群当たり３心臓）。図１２Ｂは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓からの心臓ミクロソームのＦ２（縦ＳＲ濃縮）及びＦ３（ｊＳＲ濃縮）画分におけるＲｙＲ、ホスホランバン（ＰＬＮ）、及びＳＥＲＣＡ２ａの代表的なウェスタンブロットを示す（１レーン当たり２５μｇのタンパク質ローディング）。Ｆ２及びＦ３におけるＳＥＲＣＡ２ａの定量化は、右側の棒グラフに含まれている（ｎ＝１群当たり３心臓）。データは平均±ＳＤで示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続き、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が使用された。＊、＊＊、＊＊＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し；＃、＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０５、０．０１を示す。
【図13-1】図１３Ａ～Ｄは、外因性ｃＢＩＮ１が、心筋細胞においてＣａｖ１．２－ＲｙＲ及びＳＥＲＣＡ２ａ－ｃＢＩＮ１分子を一緒にすることを示す。ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓から単離した心筋細胞におけるＣａｖ１．２－ＲｙＲ（図１３Ａ～Ｂ）及びＳＥＲＣＡ２ａ－ｃＢＩＮ１（図１３Ｃ～Ｄ）分子の超解像ＳＴＯＲＭ画像化及び最隣接部解析。図１３Ａ、Ｃは、上から下へ、代表的な２Ｄ－ＳＴＯＲＭ細胞画像；カップロンの代表的な３Ｄ－ＳＴＯＲＭ画像；及びフルセル３Ｄ－ＳＴＯＲＭ画像から得られた最隣接部距離分布のヒストグラムを示す。図１３Ｂ、Ｄは、フルセル画像解析を用いた最隣接部距離分布ヒストグラムの第１ピークの定量化を示す（Ｎ＝１群当たり２～３匹の動物から７～１７細胞）。データは、平均±ＳＤとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳとＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０５を示し；＃、＃＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰとｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０５、０．００１を示す。
【図13-2】図１３Ａ～Ｄは、外因性ｃＢＩＮ１が、心筋細胞においてＣａｖ１．２－ＲｙＲ及びＳＥＲＣＡ２ａ－ｃＢＩＮ１分子を一緒にすることを示す。ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓から単離した心筋細胞におけるＣａｖ１．２－ＲｙＲ（図１３Ａ～Ｂ）及びＳＥＲＣＡ２ａ－ｃＢＩＮ１（図１３Ｃ～Ｄ）分子の超解像ＳＴＯＲＭ画像化及び最隣接部解析。図１３Ａ、Ｃは、上から下へ、代表的な２Ｄ－ＳＴＯＲＭ細胞画像；カップロンの代表的な３Ｄ－ＳＴＯＲＭ画像；及びフルセル３Ｄ－ＳＴＯＲＭ画像から得られた最隣接部距離分布のヒストグラムを示す。図１３Ｂ、Ｄは、フルセル画像解析を用いた最隣接部距離分布ヒストグラムの第１ピークの定量化を示す（Ｎ＝１群当たり２～３匹の動物から７～１７細胞）。データは、平均±ＳＤとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳとＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０５を示し；＃、＃＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰとｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０５、０．００１を示す。
【図14-1】図１４Ａ～Ｈは、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、ｃＢＩＮ１、ＢＩＮ１、ＢＩＮ１＋１７、及びＢＩＮ１＋１３を受けたイソプロテレノール後の心臓の心エコーを示す。図１４Ａは、ベースライン（上）及びイソプロテレノール処理後４週（下）における各群からの代表的ＬＶ短軸Ｍ－モード画像を示す。全ての４週後ＩＳＯ画像において、乳頭筋は矢印で示されている。図１４Ｂ～Ｄは、各群（Ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）からのＬＶ質量（図１４Ｂ）、相対的壁厚（図１４Ｃ）、及び駆出率（図１４Ｄ）の定量的分析を示す。図１４Ｅは、代表的な僧帽弁流入パルス波ドップラー画像（上）及びイソプロテレノール処置後４週の中隔僧帽弁輪の組織ドップラー画像（下）を示す。図１４Ｆ～Ｈは、各群（Ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）からのＥ／ｅ’（図１４Ｆ）、一回拍出量（図１４Ｇ）、及び心拍出量（図１４Ｈ）の定量的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊、＊＊、＊＊＊はベースラインに対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し；＃、＃＃、＃＃＃はＩＳＯ後４週におけるＧＦＰ群に対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示す。
【図14-2】図１４Ａ～Ｈは、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、ｃＢＩＮ１、ＢＩＮ１、ＢＩＮ１＋１７、及びＢＩＮ１＋１３を受けたイソプロテレノール後の心臓の心エコーを示す。図１４Ａは、ベースライン（上）及びイソプロテレノール処理後４週（下）における各群からの代表的ＬＶ短軸Ｍ－モード画像を示す。全ての４週後ＩＳＯ画像において、乳頭筋は矢印で示されている。図１４Ｂ～Ｄは、各群（Ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）からのＬＶ質量（図１４Ｂ）、相対的壁厚（図１４Ｃ）、及び駆出率（図１４Ｄ）の定量的分析を示す。図１４Ｅは、代表的な僧帽弁流入パルス波ドップラー画像（上）及びイソプロテレノール処置後４週の中隔僧帽弁輪の組織ドップラー画像（下）を示す。図１４Ｆ～Ｈは、各群（Ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）からのＥ／ｅ’（図１４Ｆ）、一回拍出量（図１４Ｇ）、及び心拍出量（図１４Ｈ）の定量的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊、＊＊、＊＊＊はベースラインに対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し；＃、＃＃、＃＃＃はＩＳＯ後４週におけるＧＦＰ群に対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示す。
【図14-3】図１４Ａ～Ｈは、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、ｃＢＩＮ１、ＢＩＮ１、ＢＩＮ１＋１７、及びＢＩＮ１＋１３を受けたイソプロテレノール後の心臓の心エコーを示す。図１４Ａは、ベースライン（上）及びイソプロテレノール処理後４週（下）における各群からの代表的ＬＶ短軸Ｍ－モード画像を示す。全ての４週後ＩＳＯ画像において、乳頭筋は矢印で示されている。図１４Ｂ～Ｄは、各群（Ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）からのＬＶ質量（図１４Ｂ）、相対的壁厚（図１４Ｃ）、及び駆出率（図１４Ｄ）の定量的分析を示す。図１４Ｅは、代表的な僧帽弁流入パルス波ドップラー画像（上）及びイソプロテレノール処置後４週の中隔僧帽弁輪の組織ドップラー画像（下）を示す。図１４Ｆ～Ｈは、各群（Ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）からのＥ／ｅ’（図１４Ｆ）、一回拍出量（図１４Ｇ）、及び心拍出量（図１４Ｈ）の定量的分析を示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊、＊＊、＊＊＊はベースラインに対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し；＃、＃＃、＃＃＃はＩＳＯ後４週におけるＧＦＰ群に対するｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示す。
【図15-1】図１５Ａ～Ｊは、ｃＢＩＮ１遺伝子導入が、ＴＡＣ後マウスにおける無心不全生存を改善することを示す。図１５Ａは、ＴＡＣ試験のための模式的プロトコルを示す。図１５Ｂは、外科手術後５日の全マウスにおける経大動脈圧力勾配測定を示す。図１５Ｃは、ＷＴ対Ｂｉｎ１ ＨＴマウス（左）、及びＡＡＶ９－ＧＦＰ又はｃＢＩＮ１前処理マウス（右）における無心生存（非生存は死亡又はＥＦ＜３５％）についてのカプラン－マイヤー生存曲線を示す。生存率の比較にはログランク検定を用いた。ＴＡＣ後８週における全マウスのＨＷ／ＢＷ（図１５Ｄ）及びＬＷ／ＢＷ（図１５Ｅ）。（図１５Ｆ）外科手術後８週の全マウスの代表的なＭモード心エコー画像。ＴＡＣ後８週の全マウスについて、心エコー測定した左心室駆出率（図１５Ｇ）、拡張末期容積（図１５Ｈ）、ＬＶ質量（図１５Ｉ）、及びＥ／ｅ’（図１５Ｊ）。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ＡＡＶ９処理群における代表的なＥ及びｅ’の画像は、（図１５Ｊ）の右パネルに含まれる。ＷＴとＢｉｎ１ ＨＴとの間の比較に使用される対応のないＴ－検定（又はノンパラメトリックマンホイットニー検定）。Ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１間の比較に、一元配置ＡＮＯＶＡ又はクラスカル－ワリス検定に続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が使用された。＊、＊＊、＊＊＊は、ＷＴ又はＳｈａｍとの比較についてのｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し、＃、＃＃は、ＡＡＶ９－ＧＦＰとＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０５、０．０１を示す。
【図15-2】図１５Ａ～Ｊは、ｃＢＩＮ１遺伝子導入が、ＴＡＣ後マウスにおける無心不全生存を改善することを示す。図１５Ａは、ＴＡＣ試験のための模式的プロトコルを示す。図１５Ｂは、外科手術後５日の全マウスにおける経大動脈圧力勾配測定を示す。図１５Ｃは、ＷＴ対Ｂｉｎ１ ＨＴマウス（左）、及びＡＡＶ９－ＧＦＰ又はｃＢＩＮ１前処理マウス（右）における無心生存（非生存は死亡又はＥＦ＜３５％）についてのカプラン－マイヤー生存曲線を示す。生存率の比較にはログランク検定を用いた。ＴＡＣ後８週における全マウスのＨＷ／ＢＷ（図１５Ｄ）及びＬＷ／ＢＷ（図１５Ｅ）。（図１５Ｆ）外科手術後８週の全マウスの代表的なＭモード心エコー画像。ＴＡＣ後８週の全マウスについて、心エコー測定した左心室駆出率（図１５Ｇ）、拡張末期容積（図１５Ｈ）、ＬＶ質量（図１５Ｉ）、及びＥ／ｅ’（図１５Ｊ）。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ＡＡＶ９処理群における代表的なＥ及びｅ’の画像は、（図１５Ｊ）の右パネルに含まれる。ＷＴとＢｉｎ１ ＨＴとの間の比較に使用される対応のないＴ－検定（又はノンパラメトリックマンホイットニー検定）。Ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１間の比較に、一元配置ＡＮＯＶＡ又はクラスカル－ワリス検定に続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が使用された。＊、＊＊、＊＊＊は、ＷＴ又はＳｈａｍとの比較についてのｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し、＃、＃＃は、ＡＡＶ９－ＧＦＰとＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０５、０．０１を示す。
【図15-3】図１５Ａ～Ｊは、ｃＢＩＮ１遺伝子導入が、ＴＡＣ後マウスにおける無心不全生存を改善することを示す。図１５Ａは、ＴＡＣ試験のための模式的プロトコルを示す。図１５Ｂは、外科手術後５日の全マウスにおける経大動脈圧力勾配測定を示す。図１５Ｃは、ＷＴ対Ｂｉｎ１ ＨＴマウス（左）、及びＡＡＶ９－ＧＦＰ又はｃＢＩＮ１前処理マウス（右）における無心生存（非生存は死亡又はＥＦ＜３５％）についてのカプラン－マイヤー生存曲線を示す。生存率の比較にはログランク検定を用いた。ＴＡＣ後８週における全マウスのＨＷ／ＢＷ（図１５Ｄ）及びＬＷ／ＢＷ（図１５Ｅ）。（図１５Ｆ）外科手術後８週の全マウスの代表的なＭモード心エコー画像。ＴＡＣ後８週の全マウスについて、心エコー測定した左心室駆出率（図１５Ｇ）、拡張末期容積（図１５Ｈ）、ＬＶ質量（図１５Ｉ）、及びＥ／ｅ’（図１５Ｊ）。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ＡＡＶ９処理群における代表的なＥ及びｅ’の画像は、（図１５Ｊ）の右パネルに含まれる。ＷＴとＢｉｎ１ ＨＴとの間の比較に使用される対応のないＴ－検定（又はノンパラメトリックマンホイットニー検定）。Ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１間の比較に、一元配置ＡＮＯＶＡ又はクラスカル－ワリス検定に続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が使用された。＊、＊＊、＊＊＊は、ＷＴ又はＳｈａｍとの比較についてのｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し、＃、＃＃は、ＡＡＶ９－ＧＦＰとＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０５、０．０１を示す。
【図15-4】図１５Ａ～Ｊは、ｃＢＩＮ１遺伝子導入が、ＴＡＣ後マウスにおける無心不全生存を改善することを示す。図１５Ａは、ＴＡＣ試験のための模式的プロトコルを示す。図１５Ｂは、外科手術後５日の全マウスにおける経大動脈圧力勾配測定を示す。図１５Ｃは、ＷＴ対Ｂｉｎ１ ＨＴマウス（左）、及びＡＡＶ９－ＧＦＰ又はｃＢＩＮ１前処理マウス（右）における無心生存（非生存は死亡又はＥＦ＜３５％）についてのカプラン－マイヤー生存曲線を示す。生存率の比較にはログランク検定を用いた。ＴＡＣ後８週における全マウスのＨＷ／ＢＷ（図１５Ｄ）及びＬＷ／ＢＷ（図１５Ｅ）。（図１５Ｆ）外科手術後８週の全マウスの代表的なＭモード心エコー画像。ＴＡＣ後８週の全マウスについて、心エコー測定した左心室駆出率（図１５Ｇ）、拡張末期容積（図１５Ｈ）、ＬＶ質量（図１５Ｉ）、及びＥ／ｅ’（図１５Ｊ）。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ＡＡＶ９処理群における代表的なＥ及びｅ’の画像は、（図１５Ｊ）の右パネルに含まれる。ＷＴとＢｉｎ１ ＨＴとの間の比較に使用される対応のないＴ－検定（又はノンパラメトリックマンホイットニー検定）。Ｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１間の比較に、一元配置ＡＮＯＶＡ又はクラスカル－ワリス検定に続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が使用された。＊、＊＊、＊＊＊は、ＷＴ又はＳｈａｍとの比較についてのｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示し、＃、＃＃は、ＡＡＶ９－ＧＦＰとＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０５、０．０１を示す。
【図16】図１６は、マウス心筋細胞におけるＡＡＶ９導入外因性ＧＦＰ－Ｖ５及びｃＢＩＮ１－Ｖ５タンパク質発現を示す。対照（左）、ＡＡＶ９－ＧＦＰ－Ｖ５（中）、又はＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１－Ｖ５（右）処理マウスからの透過光（上）又は広視野蛍光灯（ウサギ抗Ｖ５標識、下）下の代表的な成体マウス心室心筋細胞の画像。
【図17】図１７は、ＡＡＶ９導入された外因性ｃＢＩＮ１が、ＴＡＣ後の心臓において心筋細胞のｔ管マイクロフォールドを正規化させることを示す。ｓｈａｍ、ＡＡｖ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１処理したＴＡＣ後の心臓から新たに単離した心筋細胞の代表的なライブセル膜標識（Ｄｉ－８－ＡＮＮＥＰｓ）画像。ｔ管のＤｉ－８－ＡＮＮＥＰｓ強度の定量化は、右側の棒グラフに含まれている（ｎ＝１群当たり５心臓から１０画像）。全てのデータは、平均±ＳＥＭとして示される。統計解析には、ＬＳＤ後検定と共にクラスカル－ウォリスを使用した。＊＊＊は、Ｓｈａｍ群と比較したｐ＜０．００１；†は、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群とＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１群との間で比較したｐ＜０．０５。
【図18】図１８Ａは、ＧＦＰ－Ｖ５又はｃＢＩＮ１－Ｖ５を導入するＡＡＶ９を注入後７週のマウス、又はＡＡＶ９を注入しない対照心臓（陰性対照）から得られた心筋凍結切片におけるＶ５及びＷＧＡ標識の代表的な蛍光共焦点画像（２０×）である。陽性Ｖ５シグナルは、ＡＡＶ９－ＧＦＰ－Ｖ５又はＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１－Ｖ５（３×１０１０ｖｇ）の眼窩後注入後７週の心臓からのそれぞれ６３％及び５７％の細胞で検出される。スケールバー、１００μｍ。図１８Ｂは、検出可能なＶ５シグナルを有する心筋面積のパーセントの定量化を示す。Ｎ＝各群からの２～３匹の動物からの４～６の心筋切片。データは、平均±ＳＥＭとして示される。クラスカル－ウォリス検定に続いて、多重比較のためにダンズ検定が用いられた。＊は、ＡＡＶ９なし陰性対照に対するｐ＜０．０５を示す。
【図19】図１９Ａは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯの心臓におけるＬＶリモデリングの心エコーに基づく分類を示す。図１９Ｂは、各群からの心臓におけるα－平滑筋アクチンの代表的なウェスタンブロット及び定量化を示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０５を示し；＃＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０１を示す。
【図20】図２０Ａは、マウスにおける総ＲｙＲ２タンパク質発現の代表的なウェスタンブロットを、定量化と共に示す。図２０Ｂは、各群からのマウス心筋細胞におけるＲｙＲ２の代表的な共焦点画像（１００×）、続いてパワースペクトル解析（ｎ＝１群当たり３～４心臓から３３～３６細胞）を示す。スケールバー：１０μｍ。
【図21-1】図２１は、ＲｙＲ２（総量及びリン酸化ｐＳ２８１４、ｐＳ２８０８）、Ｃａｖ１．２、ＣＡＭＫＩＩδ（総量及びリン酸化ｐＴ２８７）、及びホスホランバン（ＰＬＮ、総量及びリン酸化ｐＳ１６、ｐＴ１７）の代表的ウェスタンブロットを示す。定量化は右側の棒グラフに含まれている。データは平均±ＳＥＭで示される。Ｎ＝１群当たり４～７心臓。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０５を示し；＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０５を示す。
【図21-2】図２１は、ＲｙＲ２（総量及びリン酸化ｐＳ２８１４、ｐＳ２８０８）、Ｃａｖ１．２、ＣＡＭＫＩＩδ（総量及びリン酸化ｐＴ２８７）、及びホスホランバン（ＰＬＮ、総量及びリン酸化ｐＳ１６、ｐＴ１７）の代表的ウェスタンブロットを示す。定量化は右側の棒グラフに含まれている。データは平均±ＳＥＭで示される。Ｎ＝１群当たり４～７心臓。二元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊は、各ＡＡＶ９処理群内のＰＢＳ対ＩＳＯの比較についてのｐ＜０．０５を示し；＃は、各薬物輸注群内のＧＦＰ対ｃＢＩＮ１の比較についてのｐ＜０．０５を示す。
【図22】図２２Ａは、心臓ミクロソーム（心臓当たり３～６ｍｇ）のショ糖勾配分画の模式的プロトコルを示す。各画分Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４から回収された総量タンパク質の収量は、それぞれ心臓プレップ当たり０．００１～０．０２、０．４～０．８、０．０４～０．０６、及び＜０．００８ｍｇの間である。図２２Ｂは、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、及びｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓からのＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、及びペレットからのミクロソームインプット（Ｍ）及び回収画分からのＣａｖ１．２、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ、ＳＥＲＣＡ２ａ、ｃＢＩＮ１、及びカベオリン３の代表的ウェスタンブロットを示す。
【図23-1】図２３Ａ～Ｅは、ｃＢＩＮ１が、イソプロテレノール後マウス心臓においてＬＴＣＣ及びＳＥＲＣＡ２ａを組織化することを示す。図２３Ａは、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、ｃＢＩＮ１、ＢＩＮ１、ＢＩＮ１＋１７、及びＢＩＮ１＋１３によって処理したイソプロテレノール後のマウス心臓におけるＣａｖ１．２及びＳＥＲＣＡ２ａの代表的なウェスタンブロットを示す。定量化は、右側の棒グラフに含まれる（ｎ＝１群当たり３心臓）。図２３Ｂ～Ｃは、各群からのマウス心筋における抗Ｃａｖ１．２（図２３Ｂ）及び抗ＳＥＲＣＡ２ａ（図２３Ｃ）標識の代表的な共焦点画像（１００×）を示す。スケールバー：５μｍ。図２３Ｄは、各群からのｔ管Ｃａｖ１．２蛍光強度の定量化を示す。Ｎ＝各群からの３心臓から１６～２２細胞。図２３Ｅは、各群からのＳＥＲＣＡ２ａピークパワー密度の定量化を示す。Ｎ＝各群からの２～３心臓から２０細胞画像。データは、平均±ＳＥＭとして示される。一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊、＊＊、＊＊＊は、対照ＧＦＰ群と比較した、ｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示す。
【図23-2】図２３Ａ～Ｅは、ｃＢＩＮ１が、イソプロテレノール後マウス心臓においてＬＴＣＣ及びＳＥＲＣＡ２ａを組織化することを示す。図２３Ａは、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、ｃＢＩＮ１、ＢＩＮ１、ＢＩＮ１＋１７、及びＢＩＮ１＋１３によって処理したイソプロテレノール後のマウス心臓におけるＣａｖ１．２及びＳＥＲＣＡ２ａの代表的なウェスタンブロットを示す。定量化は、右側の棒グラフに含まれる（ｎ＝１群当たり３心臓）。図２３Ｂ～Ｃは、各群からのマウス心筋における抗Ｃａｖ１．２（図２３Ｂ）及び抗ＳＥＲＣＡ２ａ（図２３Ｃ）標識の代表的な共焦点画像（１００×）を示す。スケールバー：５μｍ。図２３Ｄは、各群からのｔ管Ｃａｖ１．２蛍光強度の定量化を示す。Ｎ＝各群からの３心臓から１６～２２細胞。図２３Ｅは、各群からのＳＥＲＣＡ２ａピークパワー密度の定量化を示す。Ｎ＝各群からの２～３心臓から２０細胞画像。データは、平均±ＳＥＭとして示される。一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、多重比較のためにフィッシャーのＬＳＤ検定が用いられた。＊、＊＊、＊＊＊は、対照ＧＦＰ群と比較した、ｐ＜０．０５、０．０１、０．００１を示す。
【図24】図２４Ａ～Ｄは、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１がｄｂ／ｄｂマウスにおける糖尿病性ＨＦｐＥＦをレスキューすることを示す。心エコーによってＥ／Ａ（図２４Ａ）、Ｅ／ｅ’（図２４Ｂ）、及びＳＶ（図２４Ｃ）；並びに（図２４Ｄ）対照ｄｂ／ｍマウス（ｄｂ／ｍ＋ＧＦＰ）及びＡＡＶ９－ＧＦＰ又はｃＢＩＮ１（ｄｂ／ｄｂ＋ＧＦＰ又はｄｂ／ｄｂ＋ｃＢＩＮ１）で処理した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスのマウストレッドミル上での最大走行距離を測定した。Ｎ＝１群当たり１０動物。一元配置ＡＮＯＶＡに続いて、ＬＳＤフィッシャーの正確性検定を使用して、群間の差を比較した。＊、＊＊＊は、ｄｂ／ｍ＋ＧＦＰ群と比較した、それぞれｐ＜０．０５又は０．００１を示す。†、†††は、ｄｂ／ｄｂ＋ＧＦＰ群対ｄｂ／ｄｂ＋ｃＢＩＮ１群の比較についての、ｐ＜０．０５又は０．００１を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
細胞内カルシウム処理機構の再組織化は、そのｃａｒｄｉａｃ ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）により組織化されたｔ管膜マイクロドメインを標的とすることにより達成することができる［３４］。ｃＢＩＮ１－マイクロドメインは、細胞内トラフィッキング［１３］及びＬＴＣＣの表面クラスター化を促進し［１４，３５］、ｔ管内腔に細胞外イオンに対する保護低速拡散領域を形成することによってＬＴＣＣ間の電気化学勾配に影響を与え［１２］、ＬＴＣＣと結合するためにｊＳＲにＲｙＲをリクルートする［１４］ことによってＬＴＣＣ－ＲｙＲ二分子を組織化する［１２，１４］ことが以前に明らかにされた。さらに最近、ｃＢＩＮ１－マイクロドメインは、拡張期カルシウム調節のためにＳＥＲＣＡ２ａの細胞内分布を組織化するのにも重要であることが明らかにされた［３４］。ＨＦでは、ｃＢＩＮ１－マイクロドメインは、ｃＢＩＮ１の転写減少により破壊され［１６，３６，３７］、二分子形成、カルシウムトランジェント制御、及び心収縮性が損なわれる。心筋のｃＢＩＮ１の減少は、ｃＢＩＮ１膜のターンオーバー及び微粒子放出の結果として、ヒトの血液中に検出されることがある［３８］。ヒトでは、血漿ＣＳ（ｃＢＩＮ１スコア）は心筋細胞ｃＢＩＮ１レベルの指標であり、これは心筋構造リモデリングを同定し、ＨＦ診断及び予後を容易にする［３９］。慢性ストレスにさらされたマウス心臓において、外因性ｃＢＩＮ１による前処理は、Ｃａｖ１．２とＳＥＲＣＡ２ａのマイクロドメイン－組織化分布を維持し、正常なイノトロピー及びルシトロピーを維持する。これらのデータは、ｃＢＩＮ１の補充が既存のＨＦを持つ心臓の心筋機能を回復させる可能性を持つ有効なＨＦ治療となり得ることを示す。
【0015】
後負荷の増大はＨＦの重要な一次及び二次原因であるため［４０］、本研究では大動脈収縮（ＴＡＣ）により誘導される後負荷上昇のマウスモデルを使用する。ＴＡＣマウスでは、ｃＢＩＮ１前処置がＨＦ発症を予防することが報告されている。さらに、ＡＡＶ９介在性遺伝子導入を、既存のＨＦを有するＴＡＣ後マウス心臓に外因性ｃＢＩＮ１を導入するために使用した。ｃＢＩＮ１後処理は、ＴＡＣ誘導性病理学的リモデリングを低減させ、並びにＨＦの発症と死亡を低減させる。既存のＴＡＣ誘導性ＨＦを有するマウス心臓において、ｃＢＩＮ１は機能回復を誘導する。また、本開示では、ｉｎ ｖｉｖｏの外因性ｃＢＩＮ１を過剰発現させることにより、心筋のリモデリング及び機能障害を制限できるかどうかを検討した。イソプロテレノールの持続輸注は、心筋のｃＢＩＮ１発現低下及びカルシウム処理タンパク質の細胞内分布の乱れを引き起こし、拡張期機能障害を伴う病理学的求心性肥大も誘発する。本発明者らは、アデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）介在性遺伝子導入によるｃＢＩＮ１の正規化が、イノトロピーの増加及びルシトロピーの維持を両立し、病理学的肥大が抑制されることを見出した。心筋細胞内では、外因性ｃＢＩＮ１が、ｔ管におけるＬＴＣＣの細胞内分布、及び筋小胞体（ＳＲ）カルシウムＡＴＰａｓｅ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）の局在を保持することを見出した。ｃＢＩＮ１の保護作用はアイソフォーム特異的であり、また、大動脈収縮（ＴＡＣ）誘導性の心肥大及びＨＦの第２のモデルで有効であることが確認され、このことは、外因性ｃＢＩＮ１介在性ｔ管マイクロドメインの保持が慢性ストレス下の心臓の心筋機能を改善する治療アプローチとなる可能性があることを示している。
【0016】
心筋内のＡＡＶ９ウイルス導入外因性ｃＢＩＮ１は、駆出率が低下した後に投与すると、慢性圧力過負荷ストレスを受けたマウスの心臓の収縮機能をレスキューし、さらに心室拡張及びＨＦ発症を制限し得る。
【0017】
継続的な圧力過負荷下では、心筋リモデリングは適応的な肥大化応答から始まり、その後、不適応な心臓拡張に移行し、ＨＦの悪化につながる［４１～４３］。これまでの研究で、ＴＡＣ外科手術前にＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１を投与すると、心筋の収縮期及び拡張期機能が維持されることが証明され、これは、ＨＦ予防におけるｃＢｉｎ１遺伝子療法の有効性を示している。本開示では、外因性ｃＢＩＮ１投与は、ＴＡＣストレスを受けた心臓のさらなるＨＦの発症を制限するだけでなくレスキューし、マウスにおける心肥大が減弱し、肺浮腫が軽減し、全生存期間が改善することを見出した。さらに、遺伝子導入により導入した外因性ｃＢＩＮ１は、心エコーで測定した心筋リモデリング及び心機能を改善する。最も驚くべきことに、ｃＢｉｎ１遺伝子療法後には、既存の重度のＨＦを有するマウスがＥＦの回復を示しており、このことは、外因性ｃＢＩＮ１の保護効果が、既存の構造的リモデリング及びＨＦの診断を受けている患者に対する形質転換性の治療法として役立つ可能性を示している。
【0018】
最近、ＡＡＶ介在性遺伝子療法がＨＦの治療として有望な様式であることが示された［４４－４５］。現在、β－アドレナリン系、Ｃａ２＋循環タンパク質、及び細胞死経路、並びに幹細胞のホーミング等の様々な経路を標的としたＨＦ遺伝子療法の臨床試験がいくつか完了又は進行中である［４６］。本発明者らは最近、ｔ管のカルシウム制御マイクロドメインを標的とすることは、必須マイクロドメイン組織化タンパク質であるｃＢＩＮ１を導入することで効果的に達成できることを見出した［３４］。ｔ管マイクロドメインを安定化することにより、ｃＢＩＮ１は潜在的に細胞質カルシウムの恒常性を回復し、収縮期カルシウム放出の増加、拡張期再吸収の改善、電気的安定性維持のためのＳＲ漏出の制限、並びにミトコンドリア関連細胞死を制限するためのミトコンドリア機能保持に寄与する。この結果は、このマイクロドメイン標的化アプローチが、機能保持の効率を改善し、全ＨＦ生存率を改善する新たな治療戦略として機能し得ることを示している。さらに、観察されたｃＢＩＮ１介在性の全生存の改善は、ポンプ機能の改善及び不整脈の減少による複合効果であると考えられ、これらはいずれもｃＢＩＮ１－マイクロドメインによって制御されている［７、１２、３６］。ｃＢＩＮ１療法が不全心における不整脈負荷にどのように影響するかについては、今後の研究においてｉｎ ｖｉｖｏ遠隔測定モニタリングを用いたさらなる解析が必要である。さらに、ＴＡＣ誘導性ＨＦはミトコンドリア障害に関連した筋細胞死を伴うため［４７］、ｃＢＩＮ１補充療法がミトコンドリア機能を維持し、不全心におけるミトコンドリア関連細胞死を制限できるかどうかを調べることは、今後の研究において未だ興味深いものである。
【0019】
機能回復に関して、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１治療の最初からモニタリングされたＥＦ変化は、ＡＡＶ９後６週に回復の高いピークを示し、その後治療効率が下降するが、レスキュー効果はＡＡＶ９注入後１５週において維持されている。これらのデータは、比較的低用量のＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の単回投与（３×１０１０ｖｇ）でも、心機能を保持するのに十分であることを示している。治療効果を最大にするためには、投与量を増やして外因性ｃＢＩＮ１の複数回の投与が必要であるかどうかは、未だ検証されていない。しかしながら、現在のレスキューデータは、既存のＨＦを有する患者に対して、ｃＢｉｎ１遺伝子療法が潜在的にＨＦ進行の悪化サイクルを断ち切り、不全心機能の回復をもたらす可能性があることを示している。
【0020】
本研究は、圧力過負荷を与えた後の既存のＨＦを有するマウス心臓における外因性ｃＢＩＮ１が保護的役割を果たすことを明らかにするものである。この最初の概念実証研究では、一貫した導入効率及び確立された心臓向性により、遺伝子送達にＣＭＶプロモーターで駆動するＡＡＶ９ベクターを使用した。より効率的な心臓特異的プロモーターを有するＡＡＶ９にパッケージされたｃＢｉｎ１を用いたマウス及び大型哺乳動物でのさらなる試験が、ＨＦ患者におけるｃＢｉｎ１遺伝子療法の有効性及び効率を検証する臨床試験の前に必要とされるであろう。また、ｃＢＩＮ１がｔ管、ＳＲ、及びミトコンドリア近傍の細胞質マイクロドメイン間でカルシウム恒常性の均衡化する細胞内機構についても、今後の研究が必要である。また、ｃＢＩＮ１遺伝子療法及びＨＦ病態生理の相互作用の理解を深めるために、ｃＢＩＮ１の下流標的分子及びシグナル伝達経路のさらなる理解が必要とされるであろう。
【0021】
本開示は、ストレス下の心臓におけるＬＶ肥大及び心機能不全の予防における外因性ｃＢＩＮ１の有益な効果も示している。イソプロテレノールの継続的な輸注を受けたマウスにおいて、外因性ｃＢＩＮ１は、心臓のイノトロピー及びルシトロピーのアイソフォーム特異的な改善をもたらし、ＬＶ肥大の発症を制限する。外因性ｃＢＩＮ１の心臓保護効果は、圧力過負荷誘導性ＨＦにさらしたマウス心臓でさらに確認された。
【0022】
慢性的に上昇したカテコールアミンレベルと心臓のβ－アドレナリン受容体（β－ＡＲ）の活性化は、ＨＦの病態形成に重要な役割を有している。交感神経を持続的に活性化させた動物では、心筋の構造及び機能が損なわれていることが観察されている［４８～４９］。合成カテコールアミンであり、非選択的β－ＡＲアゴニストであるイソプロテレノールは、ＬＶ肥大及び機能不全のモデルを誘発する研究において使用されてきた［５０］。ここでは、高用量のイソプロテレノールを用いて、収縮機能は保持したままＬＶ求心性肥大を誘導した。慢性的な過剰な心臓の作業負荷によるＬＶ肥大は、心血管事象の高いリスクと関連しており［５１］、心臓の拡張期機能を保持したまま心室肥大を防止又は逆転させることは、ストレス下の心臓から不全心臓への進行を防止するために極めて重要である。ここで、本発明者らは、ｃＢＩＮ１が慢性的なイソプロテレノール誘導性肥大を減弱すると同時に、収縮期機能が保持された肥大心臓において、アイソフォーム特異的な一回拍出量及び心拍出量の改善をもたらすことを見出した。ｃＢＩＮ１心臓におけるＬＶ容積の増大はポンプ不全及び拡張型心筋症に起因するものではなく、むしろ内在性心筋収縮性（イノトロピー）の増大と並行して心筋ルシトロピー（Ｅ／ｅ’）の改善を反映するものである。ｃＢＩＮ１心臓のこの表現型は、チャンバー拡大及びＬＶ容積、一回拍出量及び心拍出量の増加によって特徴付けられる、適応耐久トレーニングにおける運動選手の心臓の典型である［５２～５４］。有酸素運動トレーニングは、動物モデル［５５～５６］並びに高血圧［５７］及び拡張期不全［５８］の患者の両方において、心筋機能並びにイノトロピー及びルシトロピー応答を改善することが報告されている。したがって、外因性ｃＢＩＮ１は、心不全患者にさらなる運動様の利点をもたらし、運動能力及びＱＯＬを改善する可能性がある。
【0023】
これらのイソプロテレノール後の心臓は、収縮機能が保持されたまま肥大段階にあり、外因性ｃＢＩＮ１は、心臓に対する要求の増加を機能的効果に効果的に変換することができる。その結果、これらの機能的及び効率的なｃＢＩＮ１心臓は肥大の発症が制限され、臨床条件で起こるような次の工程の疾患進行及びＨＦ発症を防ぎ得ると考えられる。次に、既に減圧した心臓における外因性ｃＢＩＮ１の機能的保護効果は、ＴＡＣ誘導性の肥大及びＨＦのマウスモデルにおいても観察される。圧力過負荷下では、代償性肥大は適応的な応答である。適応応答は時間と共に心臓拡張に移行し、それに伴うリモデリングは不適応となり、ＨＦの悪化につながる。本発明者らは、圧力過負荷ストレス下の心臓における拡張型心筋症発症の運命は、心筋のｃＢＩＮ１タンパク質の量によって必然的に決定されることを見出した。圧力過負荷後の、遺伝学的に欠失したＢｉｎ１ＨＴ－ＴＡＣ心臓における心臓ＢＩＮ１の低下は、より重度の拡張型心筋症に関連しており、一方、遺伝子導入によるｃＢＩＮ１の増加は、心臓収縮及び拡張期機能を改善し、ＨＦを制限し、無ＨＦ生存が改善する。外因性ｃＢＩＮ１がＴＡＣ後の心臓におけるＬＶ拡張の一因でもある心筋細胞死を減少させるかどうかは未だ不明である。今後、ストレス下の心臓における心筋細胞の生存に対するｃＢＩＮ１の効果を調査する研究が必要であろう。しかしながら、本発明者のデータは、外因性ｃＢＩＮ１がストレス下の心臓における肥大の発症を制限するだけでなく、ＴＡＣマウスにおける肥大から拡張型心筋症及びＨＦへの心筋の移行を防止することを示す。
【0024】
ｃＢＩＮ１による心筋イノトロピー機能の改善機構は、ニ分子組織化及び効率的なＥＣカップリングに必要なｔ管マイクロドメインを組織化するｃＢＩＮ１の既知の作用と関連している。ｃＢＩＮ１はｔ管マイクロフォールドを形成し、細胞外ｔ管管腔イオンを捕捉する低速拡散領域を組織化し、ｔ管に前方トラフィックするＬＴＣＣを引き付け［３０］、既に細胞表面に送達されているＬＴＣＣをクラスター化し［３５］、二分子でＬＴＣＣとカップリングするＲｙＲｓをリクルートする［３１］。ここでは、他のＢＩＮ１アイソフォームではなく、外因性のｃＢＩＮ１がｉｎ ｖｉｖｏでｔ管へのＣａｖ１．２局在を増加させることを確認した。これらの結果は、組織化されたＬＴＣＣ分布を有するｃＢＩＮ１－マイクロドメインが、交感神経過剰駆動のｃＢＩＮ１心臓で観察された正のイノトロピー効果に関与していることを支持するものである。ｃＢＩＮ１－マイクロドメインがＬＴＣＣのリン酸化を制御し、よく確立されたβ－サブユニット調節Ｃａｖ１．２チャネル応答［５９～６０］を含む、交感神経ストレスに対する機能的応答を制御しているかどうかは、今後の実験的探究が待たれる。さらに、ＲｙＲはイノトロピーに重要であり、高リン酸化された漏出ＲｙＲはＨＦの進行に関与している［１４］。イソプロテレノールモデル及びヒトのＨＦにおける以前の報告と一致しているが［１４、６１］、本発明者らは、慢性的イソプロテレノールがＰＫＡ及びＣＡＭＫＩＩ誘導性のＲｙＲの過リン酸化を活性化することを見出した。ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１は、これらの経路を鈍らせ、慢性的な交感神経活性化後のＲｙＲリン酸化を正規化し、ＳＲ漏出を防止する。
【0025】
本開示によるさらなる新規知見は、外因性ｃＢＩＮ１が、その細胞内分布を組織化することによってＳＥＲＣＡ２ａ機能を増大させるというものである。収縮機能は保持されたまま、慢性的なイソプロテレノール誘導性の求心性肥大は、ＳＥＲＣＡ２ａの細胞内分布の乱れと関連しており、全体的なタンパク質発現は増加している。ＳＥＲＣＡ２ａ活性は末期ＨＦで低下することはよく知られている。本発明者らのデータは、発現低下及びＰＬＮによる制御障害に加えて、ＳＥＲＣＡ２ａの細胞内分布がＨＦにおけるＳＲカルシウム再取込活性の異常にも寄与し得ることを示している。さらに、α受容体アゴニストであるフェニレフリン誘導性肥大化を有する成体ラットの心室心筋細胞で報告されているように、拡張期カルシウム誘導性のカルシニューリン／ＮＦＡＴ活性化の上昇によってＳＥＲＣＡ２ａタンパク質発現の適応的増加が起こり得る［６２］。したがって、ここでのＳＥＲＣＡ２ａタンパク質発現の増加は、ＣＡＭＫＩＩのＴ２８７でのカルシウム依存性リン酸化の上昇に示されるように、拡張期カルシウム濃度の上昇によって誘導される適応応答の可能性がある。このように、ＳＥＲＣＡ２ａの一過性増加は、機能を保持しながら全てのＬＶ肥大の初期段階で起こり得る。疾患の進行中、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の総発現におけるこの適応的な増加は、末期のＨＦで起こるように、レベルが水平になり、さらには減少し、これは重度の拡張期及び収縮期不全をもたらす。ｃＢＩＮ１心臓では、ＳＲに沿った組織化ＳＥＲＣＡ２ａは、より良いカルシウム再吸収を示し、したがって、未だに代償期にある心臓では拡張期のカルシウム過負荷はより少ない。これらの結果は、ＢＩＮ１発現の増加がＳＥＲＣＡ２ａの発現と関連していることを同定したＨＦのラットモデルにおける以前の研究と一致している［６３］。疾患進行中のＳＥＲＣＡ２ａ発現及び活性を調節する上でのその役割をさらに理解するために、拡張期カルシウム濃度及びカルシニューリン／ＮＴＡＴ経路のｃＢＩＮ１調節を探求する今後の研究が必要であろう。ＳＥＲＣＡ２ａ組織化に対する効果はｃＢＩＮ１特異的ではなく、他のＢＩＮ１アイソフォーム、特にＢＩＮ１＋１７によって部分的に誘導され得ることに留意されたい。このことは、心肥大及び拡張期機能に対するＢＩＮ１＋１７による部分的なｉｎ ｖｉｖｏ保護効果と一致する。ＢＩＮ１アイソフォームが正常及び疾患の心筋細胞におけるＳＥＲＣＡ２ａの分布を組織化するために協働するかどうか、またどのように協働するかについては、今後の研究においてさらなる探求が必要である。さらに、ＳＥＲＣＡ２ａの分布及びＲｙＲのリン酸化を含む、ＳＲにおけるカルシウム処理機構の調節を通じて、ｃＢＩＮ１は正常なＳＲカルシウム負荷の維持を補助し得る。本研究の限界として、慢性ストレス下にある心臓におけるＳＲカルシウム負荷、カルシウム放出及び再吸収動態、及び不整脈誘発性自発的カルシウム放出に対するｃＢＩＮ１の効果を定量化するための今後の実験が必要である。
【0026】
しかしながら、交感神経過剰駆動心臓における最もロバストなイノトロピー及びルシトロピー両方の保護はｃＢＩＮ１群でのみ観察され、ｃＢＩＮ１依存性のＬＴＣＣの局在及び二分子組織化の改善からルシトロピーにさらなる有益な効果が得られる可能性を示している。ニ分子組織化におけるアイソフォーム特異的な改善により、二分子の外側に蓄積するオーファン漏出ＲｙＲが減少し［３１］、ＳＲからのカルシウム漏出が制限され、拡張期における細胞質カルシウム濃度が減少する。ＳＥＲＣＡ２ａ組織化に関する特定された新しい役割と合わせて、本発明者らのデータは、ｃＢＩＮ１－マイクロドメインに関連した制御が、イノトロピー効果に加えて、心臓ルシトロピーを保護する特有の利益を提供することを示している。一方、ｃＢＩＮ１過剰発現は、β－ＡＲシグナル伝達の制御、及び二次メッセンジャー及びカルシウム処理チャネル及びポンプの区画化を増強することによって、イソプロテレノール刺激による病理学的効果も抑制し得る。このように、ｃＢＩＮ１は、ｔ管マイクロドメインを安定化させ、カルシウム処理の全ての局面を制御することにより、効率的な細胞内の心拍間隔のカルシウム循環のための正のフィードフォワード機構を産生する。今後の研究では、慢性的な交感神経活性化後に、外因性ｃＢＩＮ１がβ－ＡＲ発現、細胞内分布、及び機能制御を変化させるかどうかを特定することは興味深い。
【0027】
結論として、本発明者らは、外因性ｃＢＩＮ１の過剰発現が、慢性的なβ－ＡＲ活性化誘導性求心性肥大、並びに圧力過負荷誘導性肥大及びＨＦにさらされるマウス心臓において保護的であることを見出した。今後、高血圧及び糖尿病等の一般的な自然心不全を併発した大型哺乳類での実験が必要である。心筋細胞におけるウイルス感染性を改善することは、さらに、全ての心筋細胞におけるイソプロテレノール誘導性の膜破壊を制限又は防止し、心臓全体に対する保護効果を高めるのに役立つ可能性がある。ｃＢｉｎ１遺伝子療法の有効性及び効率を試験する臨床試験の前に、全心筋細胞で十分な外因性タンパク質発現を誘導するために、効率的及び心臓特異的なプロモーターを有するＡＡＶ９にパッケージされたｃＢｉｎ１を用いたさらなる実験が必要であろう。ｃＢＩＮ１が全身の血行動態及び血圧に影響を与えるかどうかを確立するためには、今後の研究が必要である。最後に、ｃＢＩＮ１－マイクロドメインが、細胞内カルシウム処理機構の組織、ＥＣカップリング、ＳＲカルシウム負荷及び放出、拡張期カルシウム濃度及びその下流のカルシウムシグナル伝達経路、病理学的及び生理学的肥大リモデリングのシグナル伝達経路間の相互作用、並びに補償型肥大から代償型心筋症への分子移行を制御する方法を探る今後の研究が必要である。
【0028】
本明細書に記載の一実施形態は、心不全を経験したか又は慢性ストレス下の対象において心臓組織を回復するか又は心不全の症状を改善するための方法であって、対象において心不全又は心筋ストレスを診断すること、及び心不全を経験した対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含む、方法である。一態様では、心不全又は心筋ストレスの診断は、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む。
【0029】
本明細書に記載される他の実施形態は、心不全を経験した対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるための方法であって、対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子が心臓組織に送達され発現した後に、心臓の収縮機能が回復又は増大する、方法である。一態様では、導入遺伝子は、対象が心不全と診断された後に投与される。他の態様では、心不全の診断は、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む。他の態様では、方法は、心筋に導入遺伝子を投与することを含む。他の態様では、導入遺伝子は、注入によって投与される。他の態様では、導入遺伝子は、ｃＢＩＮ１をコードする導入遺伝子を含むベクターを含む。他の態様では、導入遺伝子は、約１×１０１０～約５×１０１０のベクターゲノムを含む。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、損傷した心筋を再構築する。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋におけるカルシウム処理装置の細胞内分布を安定化させる。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋における求心性肥大を低減させる。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋におけるｔ管マイクロフォールド又はマイクロドメインを回復又は増加させる。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋におけるリアノジン受容体２（ＲｙＲ２）の過リン酸化を回復又は減少させる。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心収縮性及びルシトロピーを回復又は改善する。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心臓弛緩及び拡張期機能を回復又は改善する。他の態様では、ｃＢＩＮ１の発現は、心筋に対するさらなる損傷に対して予防的である。他の態様では、導入遺伝子は少なくとも１回投与される。他の態様では、対象は哺乳動物である。他の態様では、対象は、マウス又はイヌである。他の態様では、対象は、ヒトである。他の態様では、対象は、駆出率の低下（ＨＦｒＥＦ）を経験する。
【0030】
本明細書に記載される他の実施形態は、心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象において心筋組織を回復するか又は心筋損傷を修復するための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用である。
【0031】
本明細書に記載される他の実施形態は、心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用である。
【0032】
本明細書に記載される組成物、製剤、方法、プロセス、器具、アセンブリ、及び用途に対する適切な変更及び適応が、その任意の実施形態又は態様の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、関連技術分野における通常の当業者には明らかであろう。提供される組成物、器具、アセンブリ、及び方法は例示的なものであり、開示された実施形態の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に開示された全ての様々な実施形態、態様、及び選択肢は、任意の変形又は反復で組み合わせることができる。本明細書に記載される組成物、製剤、方法、器具、アセンブリ、及びプロセスの範囲は、本明細書に記載される実施形態、態様、選択肢、例、及び嗜好の全ての実際の又は潜在的な組合せを含む。本明細書に記載される組成物、製剤、器具、アセンブリ、又は方法は、本明細書に開示される任意の成分又は工程を省略してもよく、本明細書に開示される任意の成分又は工程を代替してもよく、本明細書の他の場所に開示される任意の成分又は工程を含んでもよい。本明細書に開示された組成物又は製剤のいずれかの成分の質量と、製剤中の他の成分の質量又は製剤中の他の成分の合計質量との比は、あたかも明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。参照により組み込まれる特許又は刊行物のいずれかにおける用語の意味が、本開示において使用される用語の意味と矛盾する場合、本開示における用語又は語句の意味が優先される。本明細書で引用された全ての特許及び刊行物は、その特定の教示について本明細書に参照により組み込まれる。
【0033】
本明細書に記載される発明の様々な実施形態及び態様は、以下の項によって要約される：
項１． 心不全を経験したか又は慢性ストレス下の対象において心臓組織を回復するか又は心不全の症状を改善するための方法であって、対象において心不全又は心筋ストレスを診断すること、及び心不全を経験した対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含む、方法。
項２． 心不全又は心筋ストレスの診断が、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む、項１に記載の方法。
項３． 心不全を経験した対象の心臓において収縮機能を回復又は増大させるための方法であって、対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子が心臓組織に送達され発現した後に、心臓の収縮機能が回復又は増大する、方法。
項４． 導入遺伝子が、対象が心不全と診断された後に投与される、項３に記載の方法。
項５． 心不全の診断が、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む、項４に記載の方法。
項６． 心筋に導入遺伝子を投与することを含む、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
項７． 導入遺伝子が注入によって投与される、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
項８． 導入遺伝子が、ｃＢＩＮ１をコードする導入遺伝子を含むベクターを含む、項１～７のいずれか一項に記載の方法。
項９． 導入遺伝子が、約１×１０１０～約５×１０１０のベクターゲノムを含む、項１～８のいずれか一項に記載の方法。
項１０． ｃＢＩＮ１の発現が、損傷した心筋を再構築する、項１～９のいずれか一項に記載の方法。
項１１． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋におけるカルシウム処理機構の細胞内分布を安定化させる、項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項１２． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋における求心性肥大を低減させる、項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項１３． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋におけるｔ管フォールド又はマイクロドメインを回復又は増大させる、項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
項１４． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋におけるリアノジン受容体２（ＲｙＲ２）の過リン酸化を回復又は減少させる、項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
項１５． ｃＢＩＮ１の発現が、心収縮性及びルシトロピーを回復又は改善する、項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
項１６． ｃＢＩＮ１の発現が、心臓弛緩及び拡張期機能を回復又は改善する、項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
項１７． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋に対するさらなる損傷に対して予防的である、項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
項１８． 導入遺伝子が少なくとも１回投与される、項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
項１９． 対象が哺乳動物である、項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
項２０． 対象がマウス又はイヌである、項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
項２１． 対象がヒトである、項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
項２２． 対象が、駆出率の低下（ＨＦｒＥＦ）を経験する、項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
項２３． 心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象において心筋組織を回復するか又は心筋損傷を修復するための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用。
項２４． 心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用。
項１． 心不全を経験したか又は慢性ストレス下の対象において心臓組織を回復するか又は心不全の症状を改善するための方法であって、対象において心不全又は心筋ストレスを診断すること、及び心不全を経験した対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含む、方法。
項２． 心不全又は心筋ストレスの診断が、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む、項１に記載の方法。
項３． 心不全を経験した対象の心臓において収縮機能を回復又は増大させるための方法であって、対象の心臓組織にＣａｒｄｉａｃ Ｂｒｉｄｇｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ １（ｃＢＩＮ１）をコードする導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子が心臓組織に送達され発現した後に、心臓の収縮機能が回復又は増大する、方法。
項４． 導入遺伝子が、対象が心不全と診断された後に投与される、項３に記載の方法。
項５． 心不全の診断が、低下したｃＢＩＮ１血中レベルを測定することを含む、項４に記載の方法。
項６． 心筋に導入遺伝子を投与することを含む、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
項７． 導入遺伝子が注入によって投与される、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
項８． 導入遺伝子が、ｃＢＩＮ１をコードする導入遺伝子を含むベクターを含む、項１～７のいずれか一項に記載の方法。
項９． 導入遺伝子が、約１×１０１０～約５×１０１０のベクターゲノムを含む、項１～８のいずれか一項に記載の方法。
項１０． ｃＢＩＮ１の発現が、損傷した心筋を再構築する、項１～９のいずれか一項に記載の方法。
項１１． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋におけるカルシウム処理機構の細胞内分布を安定化させる、項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項１２． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋における求心性肥大を低減させる、項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項１３． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋におけるｔ管フォールド又はマイクロドメインを回復又は増大させる、項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
項１４． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋におけるリアノジン受容体２（ＲｙＲ２）の過リン酸化を回復又は減少させる、項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
項１５． ｃＢＩＮ１の発現が、心収縮性及びルシトロピーを回復又は改善する、項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
項１６． ｃＢＩＮ１の発現が、心臓弛緩及び拡張期機能を回復又は改善する、項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
項１７． ｃＢＩＮ１の発現が、心筋に対するさらなる損傷に対して予防的である、項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
項１８． 導入遺伝子が少なくとも１回投与される、項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
項１９． 対象が哺乳動物である、項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
項２０． 対象がマウス又はイヌである、項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
項２１． 対象がヒトである、項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
項２２． 対象が、駆出率の低下（ＨＦｒＥＦ）を経験する、項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
項２３． 心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象において心筋組織を回復するか又は心筋損傷を修復するための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用。
項２４． 心不全を経験したか又は慢性心筋ストレスを有する対象の心臓において収縮（収縮期）機能又は弛緩（拡張期）機能を回復又は増大させるための医薬におけるｃＢＩＮ１の使用。
【実施例】
【0034】
実施例１
材料及び方法
機能的レスキュー試験のための動物手順。成体雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用した。全てのマウスを８～１０週齢で麻酔し、開胸ｓｈａｍ又は大動脈収縮（ＴＡＣ）外科手術に供した。ＴＡＣは、大動脈弓の第１の枝と第２の枝の間に２７ゲージの針に対して７－０の絹糸を結んで行った。ｓｈａｍ対照として、年齢を適合させたマウスを、ＴＡＣを行わずに開胸モック手術に供した。遺伝子療法では、ＴＡＣ開始後５週目に、ｃＢＩＮ１－Ｖ５又はＧＦＰ－Ｖ５を導入したＡＡＶ９ウイルス（Ｗｅｌｇｅｎ．Ｉｎｃ）の３×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）１００μＬをマウスに眼窩後注入した［６４］。
材料及び方法
機能的レスキュー試験のための動物手順。成体雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用した。全てのマウスを８～１０週齢で麻酔し、開胸ｓｈａｍ又は大動脈収縮（ＴＡＣ）外科手術に供した。ＴＡＣは、大動脈弓の第１の枝と第２の枝の間に２７ゲージの針に対して７－０の絹糸を結んで行った。ｓｈａｍ対照として、年齢を適合させたマウスを、ＴＡＣを行わずに開胸モック手術に供した。遺伝子療法では、ＴＡＣ開始後５週目に、ｃＢＩＮ１－Ｖ５又はＧＦＰ－Ｖ５を導入したＡＡＶ９ウイルス（Ｗｅｌｇｅｎ．Ｉｎｃ）の３×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）１００μＬをマウスに眼窩後注入した［６４］。
【0035】
イソプロテレノール試験のための動物手順。イソプロテレノール試験のために、成体雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＧＦＰ又はＢＩＮ１アイソフォームを導入したＡＡＶ９の３×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）（Ｗｅｌｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を眼窩後注射で投与した［６４］。ｖｇ投与３週間後に、ＰＢＳ又はイソプロテレノール（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を放出する浸透圧ミニポンプをマウスに皮下埋込した。５６匹のマウスをＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、又はｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ群に無作為化した（Ｎ＝１４／群）。他の５０匹のマウスは、イソプロテレノールの前にＡＡＶ９－ＧＦＰ、ｃＢＩＮ１、ＢＩＮ１、ＢＩＮ１＋１７、又はＢＩＮ１＋１３（Ｎ＝１０／群）の投与に無作為化された。ＡＡＶ９は、有望な遺伝子療法ビヒクルであり、最も高い心臓向性［６５］を示すので、使用された。ＣＭＶプロモーターは、心臓への遺伝子導入における効率及び安全性から使用した［６６］。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰは、心筋細胞毒性を誘発せず、心血管疾患の動物モデルを用いた多くの遺伝子療法研究において陰性対照ウイルスとしての使用が成功しているため、陰性対照ウイルスとして使用された［６７］。ＴＡＣ試験では、成体雄の心臓特異的Ｂｉｎ１ヘテロ接合体（Ｂｉｎ１ ＨＴ；Ｂｉｎ１ｆｌｏｘ／＋、Ｍｙｈ６－ｃｒｅ＋）とその野生型（ＷＴ； Ｂｉｎ１ｆｌｏｘ／＋、Ｍｙｈ６－ｃｒｅ－）同腹子のいずれか［２９］、又は成体雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用した。全てのマウスは８～１０週齢で麻酔し、開胸ＴＡＣ又はモック手術（Ｓｈａｍ）に供した。遺伝子療法では、イソプロテレノール試験と同様に、ＴＡＣ開始３週間前にｃＢＩＮ１－Ｖ５又はＧＦＰ－Ｖ５を導入したＡＡＶ９ウイルス３×１０１０ｖｇをマウスに眼窩後注射した。
【0036】
イソプロテレノールミニポンプ試験。５６匹のマウスを、マウスを酸素中の１％イソフルランで麻酔した状態で、眼窩後注射によりＶ５タグ付きＧＦＰ又はｃＢＩＮ１を導入したＡＡＶ９の３×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）の投与量を受けるように無作為化した［６８］。ウイルス注入から３週間後、マウスにイソプロテレノール又はＰＢＳを放出する浸透圧ミニポンプを埋込んだ（ＡＡＶ９－ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯの４つの試験群のそれぞれについて、Ｎ＝１群当たり１４）。ＡＡＶは最も有望な遺伝子療法ビヒクルであり［２１、６９］、ＡＡＶ９はマウスで最も高い心臓向性（４～６）を示すため、本試験ではＡＡＶ９を使用した。ＡＡＶ９－ＣＭＶは効率的及び安全に心臓への遺伝子導入を行うことができることが確立されているため、ＣＭＶプロモーターを使用した［２５］。ＡＡＶ９－ＣＭＶＧＦＰは、心臓損傷及び心筋細胞毒性を誘発せず［２５～２６］、ＧＦＰ ＡＡＶ９は、肥大及び心筋症のマウスモデルを含む、心血管疾患の動物モデルを用いた多数の遺伝子療法研究において陰性対照ウイルスとしての使用が成功した［２６～２９］ため、陰性対照ウイルスとしてＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰが用いられた。このプロトコルは、第２のセットの動物でも繰り返された。同様に、イソプロテレノールミニポンプ埋込の３週前に、５０匹のマウスを、眼窩後注入によりＶ５タグ付きＧＦＰ、ＢＩＮ１、ＢＩＮ１＋１３、ＢＩＮ１＋１７、又はｃＢＩＮ１を導入するＡＡＶ９の３×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）の投与を受けるように無作為化した（ｎ＝１群当たり１０）。ＡＡＶ９注入の３週間後、マウスに以前に確立した手順に従いイソプロテレノールを連続的に放出する皮下ＡＬＺＥＴ浸透圧ミニポンプ（Ｍｏｄｅｌ １００４，Ｄｕｒｅｃｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を埋込んだ［３０］。簡潔には、イソフルラン吸入による軽い麻酔下で、３０ｍｇ／ｋｇ／日のイソプロテレノールを連続的に放出する浸透圧ミニポンプをマウス背部の皮下に埋込んだ。
【0037】
大動脈収縮（ＴＡＣ）試験。ｃＢＩＮ１欠損研究のために、８～１０週齢の心臓特異的Ｂｉｎ１ヘテロ接合体欠失雄マウス（Ｂｉｎ１ ＨＴ；Ｂｉｎ１ｆｌｏｘ／＋、Ｍｙｈ６－Ｃｒｅ＋）とその野生型 （ＷＴ；Ｂｉｎ１ｆｌｏｘ／＋、Ｍｙｈ６－Ｃｒｅ－）同腹子（ＷＴ）に対してＴＡＣが実施された。Ｂｉｎ１ ＨＴ及びＷＴマウスは、既述のように作製した。具体的には、ヘテロ接合体ｌｏｘｐ部位隣接Ｂｉｎ１（Ｂｉｎ１遺伝子のエクソン３周辺のｌｏｘＰ部位）マウスをＭｙｈ６－ｃｒｅ＋マウスと交配し、心筋細胞特異的Ｂｉｎ１ ＨＴ（Ｎ＝１０）及びＷＴ同腹子対照（ｎ＝１４）を作製した。遺伝子型は、以前に確立された方法に従って、Ｂｉｎ１＋、Ｂｉｎ１ｆｌｏｘ、及びＣｒｅ＋アレルを区別するためにＰＣＲによって確認された。ＡＡＶ９介在性過剰発現試験では、５～７週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、ｃＢＩＮ１－Ｖ５（Ｎ＝１８）又はＧＦＰ－Ｖ５（Ｎ＝１８）を導入したＡＡＶ９ウイルス（３×１０１０ｖｇ）の眼窩後注入を行った。３週間後、８～１０週齢のマウスを麻酔し、開胸ＴＡＣ外科手術に供した。ＴＡＣを行わずに開胸モック手術に供した年齢を適合したマウスをｓｈａｍ対照として使用した（Ｎ＝１０）。ＴＡＣは、先に記載したように、圧力過負荷を誘導するために行った。簡潔には、８～１２週齢の雄マウスを３％イソフルランのフェイスマスク投与により麻酔し、挿管して、補助Ｏ２及び１．５％イソフルランを用いて、０．２ｍＬの潮量及び１２０呼吸／分の呼吸数で人工呼吸器（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に配置した。胸腔は胸骨上縁の第２の肋間に小切開で入り、大動脈弓から離れた第１の枝と第２の枝の間に２７ゲージの針に対して７－０ナイロン縫合結紮糸を結んで大動脈収縮を行った。鎮痛のためブプレノルフィン（０．８ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与し、１００％Ｏ２の加温チャンバーでマウスを回復した。ＴＡＣの８週後、動物を安楽死させ、解析のために組織を採取した。
【0038】
アデノ随伴ウイルス９（ＡＡＶ９）の作製及び投与。ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰ－Ｖ５、ＢＩＮ１－Ｖ５、ＢＩＮ１＋１３－Ｖ５、ＢＩＮ１＋１７－Ｖ５、及びｃＢＩＮ１－Ｖ５（ＢＩＮ１＋１３＋１７－Ｖ５）を発現する５つのＡＡＶ９ベクターは全てカスタムメイドであり、Ｗｅｌｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）で産生された。Ｖ５タグ付きＧＦＰとマウスＢＩＮ１アイソフォームの既報のゲートウェイ発現クローン［３１］を使用し、配列決定した後、その後のＡＡＶベクターへのクローニング及びウイルス調製のためにＷｅｌｇｅｎへ送った。次に、これらの遺伝子インサート（ＧＦＰ－Ｖ５又はＢＩＮ１－Ｖ５）をｐＡＡＶ－ＣＭＶベクター（Ｗｅｌｇｅｎ，Ｉｎｃ．， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）にサブクローンし、制限酵素消化により陽性クローンを選択した。ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－（ＧＦＰ／ＢＩＮ１）－Ｖ５プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。全てのＡＡＶウイルスはＨＥＫ２９３細胞で作製した。３つのプラスミド、ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－（ＧＦＰ／ＢＩＮ１）－Ｖ５、ｐＡＡＶ－ｒｅｐ／ｃａｐ９、及びｐＨｅｌｐｅｒベクターをポリエチレンイミンを使用して２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後、上清及び細胞を採取した。ＡＡＶウイルスは、３回の凍結融解によりＨＥＫ２９３細胞から放出された。培地中のウイルスは、ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて沈殿させた。細胞ライセートとペレット化した上清沈殿物を合わせ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）により３７℃で１時間処理した。ウイルスはヨウジキサノール勾配遠心により精製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）により濃縮した。
【0039】
機能的レスキュー試験のための心エコー。ｉｎ ｖｉｖｏ収縮期及び拡張期左心室（ＬＶ）機能を、ベースライン、手術前、及びその後試験プロトコルの終了まで隔週で、Ｖｅｖｏ ７７００を用いて麻酔したマウスで心エコーによりモニタリングした。経大動脈圧力勾配は、外科手術後２週目に修正ベルヌーイ方程式（Δ圧較差（ｍｍＨｇ）＝４×ピーク速度２（ｍ／ｓ）２）を用いて記録した。ＴＡＣ後５週目に生存している全てのマウスを試験に含めた。
【0040】
イソプロテレノール試験のための心エコー。心エコーは、７０ＭＨｚのトランスデューサを備えたＶｅｖｏ－３１００超音波システム（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ）を用いて記録した。タンパク質相互作用は、免疫蛍光イメージング及び生化学的共沈法により解析した。ｔ管におけるＣａｖ１．２のピーク強度は、既報の通りＩｍａｇｅ Ｊで定量化した［３０］。パワースペクトル解析は、ＭａｔｌａｂでＦＦＴ変換を使用して解析した［１０、３０］。細胞内タンパク質の分布は、以前に確立された方法でショ糖勾配分画により解析した［７０］。カルシウムトランジェント測定には、Ｃａｌ－５２０－ＡＭ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を既述のように使用した［３１］。ＬＴＣＣ－ＲｙＲとＳＥＲＣＡ２ａ－ｃＢＩＮ１分子間の最隣接部解析のために、３次元超解像確率的光学再構成顕微鏡（ＳＴＯＲＭ）画像を得た［３１］。
【0041】
無重度ＨＦ生存対非生存、及びＨＦ分類の主要評価項目。全生存率は全群で解析した。さらに、無重度心不全（ＨＦ）－生存率も分析し、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群とＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１群の間で比較した。無重度ＨＦ生存については、主要評価項目は心エコーで測定した駆出率（ＥＦ）≧３５％の生存である。非生存はＴＡＣ後２０週間以内の死亡又はＥＦ＜３５％である。プロトコルの最後に、生存ＴＡＣマウスは、脛骨長（ＴＬ）、肺重量（ＬＷ）、及び心臓重量（ＨＷ）を測定した。
【0042】
免疫蛍光標識及び共焦点画像化。心筋細胞膜の蛍光標識のために、ＧＦＰ－ＴＡＣ及びｃＢＩＮ１－ＴＡＣマウスから新たに単離した心室心筋細胞をＤｉ－８－ＡＮＮＥＰｓと共に室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。その後、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、残存色素を除去した後ライブセル画像化を行った。固定細胞Ｖ５画像化（１０×）のために、単離心筋細胞を－２０℃のメタノール中で５分間固定し、透過処理し、ＰＢＳ中の０．５％トリトンＸ－１００及び５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）でＲＴで１時間ブロッキングを行った。細胞をウサギ抗Ｖ５（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で一晩インキュベートし、Ａｌｅｘａ５５５コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧで検出した。組織免疫蛍光画像化のために、心筋の凍結切片を氷冷アセトンで５分間固定した。使用した一次抗体は、マウス抗ＢＩＮ１－ＢＡＲ（２Ｆ１１、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、マウス抗ＲｙＲ（Ａｂｃａｍ）、又はウサギ抗Ｃａｖ１．２（Ａｌｏｍｏｎｅ）であった。一次抗体とのインキュベート及び１×ＰＢＳでの数回の洗浄後、細胞及び組織切片を、Ａｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ５５５コンジュゲートヤギ抗マウス又はウサギ二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とインキュベートし、ＰｒｏＬｏｎｇ金を含むＤＡＰＩでマウントした。全ての共焦点画像化は、１００×１．４９の開口数（ＮＡ）と６０×１．１又は１０×の対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡で実施された。高解像度心筋細胞画像は、レーザマージモジュール５（Ｓｐｅｃｔｒａｌ ａｐｐｌｉｅｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＡ）から発生するダイオード励起固体（ＤＰＳＳ）レーザ（４８６ｎｍ、５６１ｎｍ、６４７ｎｍ）を用いた回転ディスク共焦点ユニット（Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＳＵ１０）を用いて得られた。Ｔ管膜標識蛍光強度プロファイルはＩｍａｇｅＪで生成し、Ｔ管におけるピーク強度は既報のように定量化した［２９］。パワースペクトル解析は、ＭａｔｌａｂでＦＦＴ変換を用いて解析し、ｔ管での正規化ピークパワー密度を群間で比較した［１０、３０］。
【0043】
免疫蛍光標識及び回転ディスク共焦点顕微鏡による画像化。心筋組織切片は１００％ＯＣＴ媒体に包埋し、エタノールと共にドライアイス上で瞬間凍結し、－８０℃の冷凍庫で保存した後、既報のように１０μｍで切片化した［３２］。アセトンによる固定後、組織凍結切片をＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１時間ＲＴで透過させた。Ｖ５、ＣａＶ１．２、及びＳＥＲＣＡ２ａの染色については、組織切片を、ウサギ抗Ｖ５（１：５００，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ウサギ抗ＣａＶ１．２（１：２５０，Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）、又はマウス抗ＳＥＲＣＡ２ａ（１：２５０，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）の一次抗体と共に４℃において一晩インキュベートした。１×ＰＢＳで数回洗浄した後、組織切片をそれぞれＡｌｅｘａ ４＃８８及び５５５にコンジュゲートしたヤギ抗マウス及び抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートした。組織切片は、ＤＡＰＩ含有Ｐｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ媒体でマウントした。全ての画像化は、４０×１．１又は１００×１．４９の開口数を持つ全内部反射蛍光対物レンズとＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡で行われた。レーザマージモジュール５（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ Ｈｉｌｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）から発生するダイオード励起固体レーザ（４８６ｎｍ、５６１ｎｍ）を用いて、同じＴｉ顕微鏡に接続した回転ディスク型共焦点ユニット（Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＳＵ１０，Ｓｕｇａｒ Ｌａｎｄ，Ｔａｘａｓ，ＵＳＡ）でＺステップ積層の０．５μｍの共焦点Ｚスタックを集め、高解像度ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ ４．０デジタルＣＭＯＳカメラで捕捉した。ｔ管Ｃａｖ１．２蛍光強度プロファイルはＩｍａｇｅＪで作成し、ｔ管でのピーク強度は既報のように定量化した［３０］。カルシウムトランジェントは、以前に記載されたプロトコルに従って実施された［３１］。簡潔には、新鮮に単離された心筋細胞は、通常のＴｙｒｏｄｅ緩衝液中の０．４％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７中の１０μｍｏｌ／Ｌ Ｃａｌ－５２０－ＡＭ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）で３０分間負荷された。１ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシドを含む緩衝液で３回洗浄後、細胞を画像化チャンバーに入れ、フィールドスティミュレータ（Ｉｏｎｆｌｕｘ）で１Ｈｚでペーシングした。画像は回転ディスク共焦点顕微鏡を用いて６７ｆｐｓで収集し、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。Ｆ０（ベースライン蛍光）とＦｍａｘ（カルシウムトランジェントのピーク時の最大蛍光）の蛍光シグナルを最初にバックグラウンド補正し、次にΔＦ／Ｆ０＝（Ｆｍａｘ－Ｆ０）／Ｆ０の比率計算を行って群間で比較した。
【0044】
パワースペクトル解析。心筋細胞免疫蛍光サブセクションの頻度領域パワースペクトルは、ＦＦＴ変換を用いてＭａｔｌａｂで生成した［１０、３０］。最大成分に正規化したパワースペクトルを生成し、距離（１／頻度、μｍ）上にプロットした。正規化ピークパワー密度［７１］を定量化し、群間で比較した。
【0045】
超解像確率的光学再構成顕微鏡（ＳＴＯＲＭ）画像化及び最隣接部解析。ＳＴＯＲＭ画像化のために、心筋細胞は以前に報告されたように準備された［３１］。画像化当日、新鮮なＳＴＯＲＭ画像化緩衝液（０．５ｍｇ／ｍＬグルコースオキシダーゼ、４０μｇ／ｍＬカタラーゼ、メルカプトエチルアミン入り１０％グルコース）をディッシュに添加した。ＳＴＯＲＭ画像は、レーザ（音響光学チューナブルフィルタを備えた自己完結型４ラインレーザモジュールからの４８８ｎｍ、５６１ｎｍ）を備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡で収集し、高速ｉＸｏｎ ＤＵ８９７ Ｕｌｔｒａ ＥＭＣＣＤカメラで捕捉した。ＳＴＯＲＭモジュールを用いて画像を取得及び解析し、Ｃａｖ１．２／ＲｙＲとｃＢＩＮ１／ＳＥＲＣＡ２ａの画像をナノスケールの分解能で３次元（３Ｄ）投影を作成した。最隣接部解析のために、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアで利用可能なガウスレンダリングアルゴリズムでネイティブ３Ｄ ＳＴＯＲＭ画像を表示し、分子リストテキストファイル形式の３Ｄ ＳＴＯＲＭ画像（１回の取得で２チャンネル、Ｃａｖ１．２／ＲｙＲ又はｃＢＩＮ１／ＳＥＲＣＡ２ａ）をｚ間隔１０ｎｍで深さ５００ｎｍの範囲で３Ｄスタックを取得した。分子リストテキストファイルをＩｍａｇｅＪで読み込み、２つのチャンネルからの分子間の最隣接部距離（最隣接部距離）を算出した。最隣接部距離は頻度分布ヒストグラムとしてユーザー定義の範囲とビン幅で構築及び表示し、最初のピーク値を検出して１５次多項式曲線でフィッティングを行った。対応する第１のピーク位置におけるＣａｖ１．２－ＲｙＲとＳＥＲＣＡ２ａ－ｃＢＩＮ１分子間の距離を定量化し、群間で比較した。
【0046】
透過型電子顕微鏡。全ての透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）作業は、ＵＣＬＡのＴｈｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒの中核施設によって行われた。組織の調製は、以前に報告された方法を用いて行った［７２］。簡潔には、マウスの心臓を新鮮な固定溶液（１×ＰＢＳ中の２％グルタルアルデヒド及び２％パラホルムアルデヒド）２０ｍＬで灌流した。左心室組織（１ｍｍ３）を１％四酸化オスミウムで後固定し、３％酢酸ウラニルでインキュベートした。エタノールで脱水後、試料を酸化プロピレンで処理、Ｓｐｕｒｒ樹脂（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）に包埋し、ウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を用いて切片化した。切片をグリッドにマウントし、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した後、ＪＥＭ１２００－ＥＸ、ＪＥＯＬ顕微鏡（Ｇａｔａｎ）を用いて画像を取得した。輪郭のあるｔ管の程度は、以前に確立された修正したスコアリングシステムを用いて定量化した［２９］。
【0047】
機能的レスキュー試験のためのウェスタンブロッティング。液体窒素で瞬間凍結した心臓から組織ライセートを作製した。凍結組織は、以前に記載されたように、放射免疫沈降法（ＲＩＰＡ）溶解緩衝液中でホモジナイズした［４１］。ライセートは、４℃で４０分間、頭からつま先まで回転させ、超音波処理を行い、その後、遠心分離（１６，０００×ｇ、４℃で２５分間）して細胞残屑を除去した。次に、タンパク質ライセートを、５％β－メルカプトエタノールを含む２×サンプルバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を調製し、ＲＴで３０分間インキュベートし、８～１２％勾配ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で分離させた。タンパク質はポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に電気泳動した。転写後、膜をメタノールで固定し、１×Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の５％ＢＳＡで１時間ＲＴでブロックし、１×ＴＢＳ中の５％ＢＳＡで４℃で一晩一次抗体とインキュベートし、続いてＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とＲＴで１時間インキュベートした。一次抗体は、カスタムメイドのポリクローナルウサギ抗ＢＩＮ１エクソン１３（Ａｎａｓｐｅｃ）［２９］、マウス抗ＲｙＲ（Ａｂｃａｍ）、ウサギＣａｖ１．２抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ）、及びマウス抗ＧＡＰＤＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）からなっていた。
【0048】
イソプロテレノール試験のためのウェスタンブロッティング。凍結心臓組織をプロテアーゼ阻害剤入りＲＩＰＡ溶解緩衝液を用いてホモジナイズし、ブラッドフォードアッセイを使用してタンパク質濃度を決定した。試料はＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓで分離した後、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。１×ＴＮＴ緩衝液中、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキングした後、膜はウサギ抗ＧＡＰＤＨ又はアクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ウサギ抗ＣａＶ１．２（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）、又はマウス抗ＳＥＲＣＡ２ａ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、その後、二次抗体（ヤギ抗ウサギ又はマウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ ６４７）と共に室温（ＲＴ）で１．５時間インキュベートした。免疫反応性バンドはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（登録商標）Ｇｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で画像化し、バンド強度はＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で定量した。
【0049】
心臓ミクロソームの調製及びスクロース勾配分画。ミクロソームのショ糖勾配分画は、修正を加えた確立されたプロトコルに従って調製した［７０］。心筋膜ミクロソームは、各試験群について１個の心臓の出発物質から調製した。凍結心臓組織を２ｍＬのホモジナイザー緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、２５０ｍＭスクロース、ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤で補った１ｍＭ ＥＤＴＡ）中でポリトロンハンドヘルドホモジナイザーを用いてホモジナイズした。次に、ホモジネートを１２，０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ）で４℃、２０分間遠心分離し、上清（Ｓ１）を予め計量した管に集め、氷上で保存した。ペレットを同緩衝液１ｍＬに懸濁し、ホモジナイズし、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。上清（Ｓ２）を回収し、前の工程からのＳ１と合わせた。次に、合わせたミクロソーム上清（Ｓ１＋Ｓ２）を１１０，０００×ｇ、４℃で２時間の超遠心分離にかけた。超遠心後、上清を捨て、ペレットを秤量し、適量の緩衝液（約１ｍＬ）を添加し、ミクロソームの最終濃度が約２５ｍｇ／ｍＬとなるようにした。再懸濁したミクロソーム中の総タンパク質濃度を、各試料についてＮａｎｏｄｒｏｐ ２０００を用いて測定し、４群間で正規化した。各試料からの全ミクロソームの同量（０．５ｍＬ中３～６ｍｇ）を不連続スクロース勾配［５２、５８、７３］、及び４５％、ｖ／ｗホモジナイザー緩衝液、各２ｍＬ）の上に慎重に置き、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｍａｘ ＸＰ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを用いて固定角ＭＬＡ－５５ローターで１５０，０００×ｇ、１６時間超遠心した。その後、以下の画分から試料を回収した：Ｆ１、２７％；Ｆ２、２７／３２％；Ｆ３、３２／３８％；及びＦ４、３８／４５％；並びに管の底部からのペレット（Ｐ）。各画分について、約１ｍＬを採取し、ホモジナイズ緩衝液で４倍に希釈し、１２０，０００×ｇ、４℃で２時間超遠心した。ペレットを１００μＬのホモジナイズ緩衝液に再懸濁し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００でタンパク質濃度を測定した。各画分Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４から回収したタンパク質の総量の収量は、それぞれ心臓当たり０．００１～０．０２、０．４～０．８、０．０４～０．０６、＜０．００８ｍｇであった。サンプルバッファーを、添加した後、試料を凍結し、その後のウェスタンブロット解析の前に－２０℃で保存した。
【0050】
統計解析。全てのデータは、指定されたように平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）又は標準偏差（ＳＤ）として表される。正規性は、シャピロ・ウィルク検定を用いて評価した。カプランマイヤー生存分析を使用して、ログランク検定を用いて２群間で比較し、ログランク傾向検定を用いて３群間で比較した。連続変数は、ｔ検定／マン・ホイットニーのＵ及び一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）／クラスカル・ワリス検定を用いて比較した。二元配置ＡＮＯＶＡは、２つの異なる時点における２群間の差異を決定するために使用された。二元配置ＡＮＯＣＡは、異なる薬剤輸注を行った２つのＡＡＶ９群間の差異を決定するために使用され、その後、複数のペアワイズ比較のためにフィッシャーの最小有意差（ＬＳＤ）ポストホック調整が行われた。カテゴリー変数は、フィッシャーの正確性検定又はカイ二乗検定を使用して分析した。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン７．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。両側ｐ値を使用し、ｐ＜０．０５が統計的に有意であると考える。
【0051】
実施例２
圧力過負荷誘導性心不全を有するマウス心臓における外因性ｃＢＩＮ１による機能的レスキュー
ｃＢＩＮ１－マイクロドメインを標的とすることがＨＦの新しい治療法となり得るかどうかを調べるために、心臓のｃＢＩＮ１が圧力過負荷ストレスを受けたマウスのＨＦ発症にどのように影響するかを調査した。８～１０週齢の成熟雄マウスにおいて大動脈収縮（ＴＡＣ）又はモック外科手術（ｓｈａｍ）を行い、その後、心エコーモニタリングによって全生存率並びに無重度収縮期ＨＦ生存率（死亡又は駆出率、ＥＦ＜３５％としての非生存率）を測定した。図１Ａの実験プロトコルに示されるように、マウスは、ｃＢＩＮ１－Ｖ５又は対照ＧＦＰ－Ｖ５を導入したＡＡＶ９の眼窩後注射の前に、最初に５週間ＴＡＣに供され、その後、ウイルス注入後さらに１５週間（ＴＡＣ後２０週）心エコーモニタリングを行った。開胸モック外科手術を受けたマウス群（ｓｈａｍ対照、Ｎ＝１０）に加えて、３６匹のマウスをＴＡＣ外科手術に供した。１匹のマウスは０時点（ＴＡＣ後５週）に達する前に死亡し、残りの３５匹の生存マウスは、３×１０１０ｖｇのＡＡＶ９－ＧＦＰ（Ｎ＝１７）又はｃＢＩＮ１（Ｎ＝１８）の投与に無作為化した。ＡＡＶ９注入の１５週間後にマウスから単離した心筋細胞の抗Ｖ５標識は、正のＶ５シグナルを同定し、心筋細胞における外因性タンパク質の導入が成功したことを示した（図１６）。ＡＡＶ９注入前のＬＶ拡張末期容積（ＥＤＶ）の増加を伴う左心室（ＬＶ）ＥＦの減少（表１）によって証明されるように、ＴＡＣ後２週間における同等の経大動脈圧力勾配（図１Ｂ）及びＴＡＣ後５週間の心筋機能不全がこれらのマウスで観察された。
圧力過負荷誘導性心不全を有するマウス心臓における外因性ｃＢＩＮ１による機能的レスキュー
ｃＢＩＮ１－マイクロドメインを標的とすることがＨＦの新しい治療法となり得るかどうかを調べるために、心臓のｃＢＩＮ１が圧力過負荷ストレスを受けたマウスのＨＦ発症にどのように影響するかを調査した。８～１０週齢の成熟雄マウスにおいて大動脈収縮（ＴＡＣ）又はモック外科手術（ｓｈａｍ）を行い、その後、心エコーモニタリングによって全生存率並びに無重度収縮期ＨＦ生存率（死亡又は駆出率、ＥＦ＜３５％としての非生存率）を測定した。図１Ａの実験プロトコルに示されるように、マウスは、ｃＢＩＮ１－Ｖ５又は対照ＧＦＰ－Ｖ５を導入したＡＡＶ９の眼窩後注射の前に、最初に５週間ＴＡＣに供され、その後、ウイルス注入後さらに１５週間（ＴＡＣ後２０週）心エコーモニタリングを行った。開胸モック外科手術を受けたマウス群（ｓｈａｍ対照、Ｎ＝１０）に加えて、３６匹のマウスをＴＡＣ外科手術に供した。１匹のマウスは０時点（ＴＡＣ後５週）に達する前に死亡し、残りの３５匹の生存マウスは、３×１０１０ｖｇのＡＡＶ９－ＧＦＰ（Ｎ＝１７）又はｃＢＩＮ１（Ｎ＝１８）の投与に無作為化した。ＡＡＶ９注入の１５週間後にマウスから単離した心筋細胞の抗Ｖ５標識は、正のＶ５シグナルを同定し、心筋細胞における外因性タンパク質の導入が成功したことを示した（図１６）。ＡＡＶ９注入前のＬＶ拡張末期容積（ＥＤＶ）の増加を伴う左心室（ＬＶ）ＥＦの減少（表１）によって証明されるように、ＴＡＣ後２週間における同等の経大動脈圧力勾配（図１Ｂ）及びＴＡＣ後５週間の心筋機能不全がこれらのマウスで観察された。
【0052】
【表1】
【0053】
次に、全群の全生存率（非生存は死亡）を調査した。図２のカプラン－マイヤー曲線に示すように、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１処理ＴＡＣマウス（生存率７７．８％、１４／１８）の全生存は、ｓｈａｍ（生存率１００％、１０／１０）及びＡＡＶ９－ＧＦＰ処理ＴＡＣマウス（生存率５８．８％、１０／１７）（３群間で比較すると傾向についてログランク検定でｐ＝０．０２０２）（図２Ａ）の中ほどに位置する。次に、時点０（ＴＡＣ５週後、ウイルス注入前）においてＥＦ≧３５％の生存した全てのＴＡＣマウスにおいて、追跡心エコーモニタリング中の２つのウイルス群間の無収縮期ＨＦ生存（死亡又はＥＦ＜３５％としての非生存）をさらに分析した。無収縮期ＨＦ生存は、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によって有意に改善される（ＡＡＶ９－ＧＦＰ群と比較した場合、ログランク検定によってｐ＝０．０２２５）（図２Ｂ）。０時点においてＥＦ≧３５％の１１匹のＡＡＶ９－ＧＦＰマウスのうち、９匹がＴＡＣ後２０週間以内にＥＦ＜３５％を発症し、２匹が早期死亡し、及び７匹が進行性ＥＦ減少を伴っていた。一方、０時点においてＥＦ≧３５％の１３匹のＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１マウスのうち、５匹だけがＴＡＣ後２０週間以内にＥＦ＜３５％を発症し、１匹が早期死亡した。さらに、カプランマイヤー曲線解析で非生存とカウントされたこれら５匹のうち、早期死亡した１匹を除く残りの非生存ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１処理動物４匹のうち３匹は、ＴＡＣ後２０週目にＥＦが３５％以上に回復した。その後、生存マウスを屠殺し、ＨＷ／ＴＬ及びＬＷ／ＴＬの比率を評価した。ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１マウスは、ｓｈａｍ対照マウスと比較した場合、ＡＡＶ９－ＧＦＰマウスで生じたようなＨＷ／ＴＬ及びＬＷ／ＴＬの著しい増加を有さなかった（図３Ａ～Ｂ）。これらのデータは、ｃＢｉｎ１遺伝子療法が心機能を保護し、全生存及び無ＨＦ生存期間を効果的に増加させ、ＨＦ進行の悪化サイクルを阻止、延期、又は逆転さえさせることを示す。
【0054】
ＴＡＣ後２０週目に生存していた全てのマウスのうち、心エコーで測定した心筋機能及び生理学的パラメータを、ＡＡＶ９処理の前後の両方でさらに群間で比較した（表１）。ＴＡＣ語２０週目に、ＡＡＶ９－ＧＦＰマウスは、著しいＬＶ収縮機能不全（ＥＦ減少）及びチャンバー拡張（ＥＤＶ上昇、図４Ａ～Ｃ、表１）を発症し、これらはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１処理により正規化された。ＴＡＣ後２０週目におけるＬＶ質量の増加は、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群と比較して、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１処理マウスで有意に減少した（図４Ｄ）。さらに、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群で観察された一回拍出量及び心拍出量のΔ減少は、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１処理群でも減少した（図４Ｅ～Ｆ）。これらの結果は、ｃＢｉｎ１遺伝子療法が、不全心臓に投与された場合、心筋機能を維持することを示す。
【0055】
０時点（ＡＡＶ９前、ＴＡＣ後５週）でのウイルス注入後のＴＡＣ後の心臓における収縮機能不全の進行をさらに調べるために、ＡＡＶ前からＡＡＶ９注入後３、６、８、１０、１５週（ＴＡＣ後８、１１、１３、１５、２０週に対応）までのΔＥＦ変化（ΔＥＦ）を心エコーによりモニタリングした（図５Ａ）。外因性ｃＢＩＮ１誘導性のＥＦの回復は、ＡＡＶ９注入後６～８週でピークに達し、その後の週でＥＦの継続的な改善が見られたが、一方ＡＡＶ９－ＧＦＰ群では進行性のＥＦの減少が認められた。観察されたＥＦの回復は、ガウスフィッティングによるΔＥＦのヒストグラム分布上で示された（図５Ｂ～Ｃ）。ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１は、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群と比較して、ΔＥＦのヒストグラム分布が右シフトしていた。例えば、ＡＡＶ９後６週目で、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群では－１５．０という中程度のＥＦ（％）の減少があるのに対し、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１群ではＥＦ（％）において＋６．９という中程度の回復が観察された。これらのデータは、外因性ｃＢＩＮ１をＴＡＣ後５週目に投与すると、ＴＡＣ誘導性ＨＦの心臓において心筋収縮機能をレスキューできることを示す。
【0056】
本発明者らは最近、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理（ＴＡＣ外科手術の３週間前に３×１０１０ｖｇ；図６Ａ）を受けたマウスにおいて、ＴＡＣ誘導性ＨＦの発生が有意に減少し、その結果としてＴＡＣ後８週目における無ＨＦ生存が向上することを報告した［３４］。これらのデータは、ＡＡＶ９がＴＡＣ外科手術後に投与されたときに観察された心筋保護と一致する。ＴＡＣマウスにおける外因性－ｃＢＩＮ１の心臓保護効果をさらに確立するために、侵襲的ＰＶループ記録を用いて、ＡＡＶ９前処理したマウスにおいて心臓内血行動態を取得した。図６Ｂは、ＴＡＣ外科手術の８週間後のｓｈａｍ、ＡＡＶ９－ＧＦＰ、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処置心臓の代表的なＰＶループを含む（図６Ｂ）。収縮期のＥＦ及び圧力変化の最大速度（ｄｐ／ｄｔ最大値）は、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群において減少し、これらは外因性ｃＢＩＮ１によって正規化された（図６Ｃ～Ｄ）。弛緩動態への影響を調査すると、圧力減衰の最大速度（ｄｐ／ｄｔ分）は、ＡＡＶ９－ＧＦＰ群において減少したが、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によって正規化されたことが見出された（図６Ｅ）。ＡＡＶ９－ＧＦＰ群における等容弛緩の時定数（Ｔａｕ）の増加も、ｃＢｉｎ１遺伝子導入によりレスキューされ（図６Ｆ）、これは、心弛緩が改善されたことを示す。合わせると、これらのデータは、外因性ｃＢＩＮ１が、圧力過負荷の心臓の心臓イノトロピー及びルシトロピーを改善することを示す。
【0057】
本発明者らは以前、ｃＢＩＮ１がｔ管マイクロドメインを形成し、ＬＴＣＣ－ＲｙＲ二分子を組織化し、心機能及びＥＣカップリングを効率的且つダイナミックに制御することを明らかにした［２５］。より最近、本発明者らは、交感神経過剰駆動した拡張期機能障害を発症したマウス心臓では、ｃＢＩＮ１－マイクロドメインが破壊され、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によってレスキューされることを見出した。ここでは、本発明者らはまた、ＴＡＣ後の心臓のｔ管ｃＢＩＮ１－マイクロドメインの変化及び外因性ｃＢＩＮ１の効果についても検討した。ウェスタンブロッティング（図７Ａ）は、心筋ｃＢＩＮ１タンパク質がＴＡＣ後８週間のマウス心臓で著しく減少することを特定し（ｓｈａｍ対照より２７％減少、ｐ＜０．０５）、これはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理によって正規化される。ｃＢＩＮ１レスキューと共に、Ｄｉ－８－ＡＮＮＥＰｓによる膜標識（図１７）は、ｓｈａｍ心筋細胞と比較して、ＴＡＣ後８週間の心筋細胞は、著しく減少したｔ管ｃＢＩＮ１－マイクロドメイン強度を有することを特定するが、これはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理を行ったマウスからの心筋細胞において正規化される。次に、免疫蛍光画像化を用いて、心筋細胞レベルでのｃＢＩＮ１－マイクロドメイン及び二分子の構成を解析した。ＢＩＮ１シグナルのパワースペクトル分析により、ｓｈａｍ心筋におけるｃＢＩＮ１のよく組織化されたｔ管分布が、ＴＡＣ後の心臓において破壊されており、これはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理により保持されることが同定された（図７Ｃ）。総ＬＴＣＣ及びＲｙＲタンパク質レベルは、ウェスタンブロッティングによって群間で有意に変化しないが（図７Ｂ）、ＬＴＣＣ及びＲｙＲの心筋分布（図７Ｃ）は、ＴＡＣ後の心臓で無秩序になり、これはまたＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理の心臓で有意に改善する（ｐ＜０．０５）。これらのデータは、外因性ｃＢＩＮ１がＴＡＣ誘導性の心筋ｃＢＩＮ１の減少を正規化し、ｔ管におけるｃＢＩＮ１によって作成されたマイクロドメインの保存をもたらすことを示している。このように、ｃＢＩＮ１補充療法は、圧力負荷された心臓においてｔ管マイクロドメインを正規化することにより、心拍感覚のカルシウム循環及び効率的なＥＣカップリングに必要な心臓のＬＴＣＣ－ＲｙＲカップロンを再組織化する。
【0058】
実施例３
外因性ｃＢＩＮ１は、イソプロテレノール輸注後のマウス心臓における求心性肥大を低減させる
４週間のイソプロテレノール輸注を受けた動物における心筋機能に対するｃＢＩＮ１の効果を調査した（図８Ａ）。ＡＡＶ９を使用して、イソプロテレノールの開始の３週間前に、外因性のＶ５タグ付きＧＦＰ又はｃＢＩＮ１［７４］の心筋の発現を導入した。抗Ｖ５標識は、ＡＡＶ９注入後７週目に検出可能なＶ５シグナルを有する心筋領域の同様のパーセントを同定し（ＧＦＰ、６２．４＋１０．５％；ｃＢＩＮ１、５７．９．２＋７．８％）、心筋細胞の半分以上において外因性タンパク質の導入に成功していることを示している（図１８）。陰性に染色された心筋細胞の残りの約４０％は、免疫蛍光の検出閾値未満の低レベルで外因性タンパク質を発現し得る。全てのマウスにおいて、イソプロテレノールは、心臓肥大を示す、体重に対する心臓重量比（ＨＷ／ＢＷ）を有意に増加させた（図８Ｂ）。心臓のジオメトリー及び機能は、心エコーによって評価した（図８Ｃ～Ｈ）。ＡＡＶ９－ＧＦＰ前処理動物において、イソプロテレノールは、拡張末期容積（ＥＤＶ）を変化させずに、ＬＶ質量及び相対的壁厚（ＲＷＴ）の著しい増加を誘導し、これは、心エコーに基づく求心性肥大の分類と一致した［７５］。ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理動物において、ＬＶ質量のイソプロテレノール増加は、正常なＲＷＴ及び増加したＥＤＶで減衰し、これは、以前に報告された方法［７５］を用いて心エコー分類された「生理学的肥大様ＬＶリモデリング」と類似していた（図１９Ａ）。さらに、α－平滑筋アクチンは、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓において増加したが、ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓においては増加せず（図１９Ｂ）、これは、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１がイソプロテレノール誘導性ＬＶ肥大を制限することが示された。ＡＡＶ９－ＧＦＰ前処理マウスにおいて、イソプロテレノールはＥＦの小さな増加をもたらしたが（ＧＦＰ＋ＰＢＳに対するｐ＝０．０５０及びｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ群に対するｐ＝０．００７）、ＬＶ受動充填の発症（Ｅ）対心筋緩和（ｅ’）比（Ｅ／ｅ’）が強く増加し、これは、拡張期機能障害の発症を示唆するものであった。ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１で前処理したマウスでは、イソプロテレノールは依然として収縮機能を増加させ、重要なことに、Ｅ／ｅ’が正常に維持し、これは、ルシトロピーを維持しながら正のイノトロピーを示す。さらに、血圧測定は行わなかったが、イソプロテレノールは全ての動物で心拍数（ＨＲ）を有意に増加させ、血行力学的ストレスを引き起こすことにおけるイソプロテレノールの有効性が示された。しかし、イソプロテレノール後のＨＲはＧＦＰ＋ＩＳＯマウスとｃＢＩＮ１＋ＩＳＯマウスの間で差がなく（表２）、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１マウスにおけるイソプロテレノール後の心拍出量のさらなる改善は、筋効率によるものであり、拍数の増加によるものではないことが確認された。
外因性ｃＢＩＮ１は、イソプロテレノール輸注後のマウス心臓における求心性肥大を低減させる
４週間のイソプロテレノール輸注を受けた動物における心筋機能に対するｃＢＩＮ１の効果を調査した（図８Ａ）。ＡＡＶ９を使用して、イソプロテレノールの開始の３週間前に、外因性のＶ５タグ付きＧＦＰ又はｃＢＩＮ１［７４］の心筋の発現を導入した。抗Ｖ５標識は、ＡＡＶ９注入後７週目に検出可能なＶ５シグナルを有する心筋領域の同様のパーセントを同定し（ＧＦＰ、６２．４＋１０．５％；ｃＢＩＮ１、５７．９．２＋７．８％）、心筋細胞の半分以上において外因性タンパク質の導入に成功していることを示している（図１８）。陰性に染色された心筋細胞の残りの約４０％は、免疫蛍光の検出閾値未満の低レベルで外因性タンパク質を発現し得る。全てのマウスにおいて、イソプロテレノールは、心臓肥大を示す、体重に対する心臓重量比（ＨＷ／ＢＷ）を有意に増加させた（図８Ｂ）。心臓のジオメトリー及び機能は、心エコーによって評価した（図８Ｃ～Ｈ）。ＡＡＶ９－ＧＦＰ前処理動物において、イソプロテレノールは、拡張末期容積（ＥＤＶ）を変化させずに、ＬＶ質量及び相対的壁厚（ＲＷＴ）の著しい増加を誘導し、これは、心エコーに基づく求心性肥大の分類と一致した［７５］。ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理動物において、ＬＶ質量のイソプロテレノール増加は、正常なＲＷＴ及び増加したＥＤＶで減衰し、これは、以前に報告された方法［７５］を用いて心エコー分類された「生理学的肥大様ＬＶリモデリング」と類似していた（図１９Ａ）。さらに、α－平滑筋アクチンは、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓において増加したが、ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓においては増加せず（図１９Ｂ）、これは、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１がイソプロテレノール誘導性ＬＶ肥大を制限することが示された。ＡＡＶ９－ＧＦＰ前処理マウスにおいて、イソプロテレノールはＥＦの小さな増加をもたらしたが（ＧＦＰ＋ＰＢＳに対するｐ＝０．０５０及びｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ群に対するｐ＝０．００７）、ＬＶ受動充填の発症（Ｅ）対心筋緩和（ｅ’）比（Ｅ／ｅ’）が強く増加し、これは、拡張期機能障害の発症を示唆するものであった。ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１で前処理したマウスでは、イソプロテレノールは依然として収縮機能を増加させ、重要なことに、Ｅ／ｅ’が正常に維持し、これは、ルシトロピーを維持しながら正のイノトロピーを示す。さらに、血圧測定は行わなかったが、イソプロテレノールは全ての動物で心拍数（ＨＲ）を有意に増加させ、血行力学的ストレスを引き起こすことにおけるイソプロテレノールの有効性が示された。しかし、イソプロテレノール後のＨＲはＧＦＰ＋ＩＳＯマウスとｃＢＩＮ１＋ＩＳＯマウスの間で差がなく（表２）、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１マウスにおけるイソプロテレノール後の心拍出量のさらなる改善は、筋効率によるものであり、拍数の増加によるものではないことが確認された。
【0059】
【表2】
【0060】
実施例４
慢性的なイソプロテレノールによって破壊されたｃＢＩＮ１－マイクロドメインはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によって正規化し得る
心筋のイノトロピーとルシトロピーの両方が心筋細胞のカルシウム循環と関連していることはよく知られている［７６］。二分子マイクロドメインの構造オーガナイザーであるｃＢＩＮ１は［３１］、細胞外Ｃａ２＋拡散を制限するｔ管のマイクロフォールドを作製し［２９］、Ｌ型カルシウムチャネル（ＬＴＣＣ）のマイクロチューブ依存性前方トラフィッキング［３０］及び既にｔ管膜に送達されたＬＴＣＣのクラスタリングを促進する。そこで、慢性のイソプロテレノール輸注後の肥大化した心臓において、ｃＢＩＮ１－マイクロドメインがどのようにリモデリングし得るかを検討した。心臓ライセートのウェスタンブロットから、イソプロテレノールはｃＢＩＮ１タンパク質の著しい減少を誘導し、これはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によって正規化されることが示される（図９Ａ）。抗ＢＩＮ１－エクソン１７抗体による免疫沈降と、それに続く抗ＢＩＮ１－エクソン１３抗体によるウェスタンブロット検出により、調べたタンパク質バンドがｃＢＩＮ１（ＢＩＮ１＋１３＋１７）アイソフォームであることを確認することに留意されたい。膜色素Ｄｉ－８－ＡＮＮＥＰｓで標識した単離心筋細胞において、総体的なｔ管ネットワーク構築もまた調べた（図９Ｂ）。ライブセル画像化とそれに続くパワースペクトル解析により、全体的なｔ管組織（正規化ピークパワー密度）がＧＦＰ＋ＩＳＯマウスにおいて同様であり、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１により増加することが示された。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像化を使用して、総ｔ管ネットワークが組織化されたままであっても、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓においてｔ管マイクロフォールドの減少があることが留意され、これはｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓において保持された（図９Ｃ）。以前に確立された修正されたスコアリングシステムを用いたｔ管の輪郭の程度の定量化［２９］（１、折り目のない円形又は拡張したｔ管管腔；２、折り目のない非円形輪郭のｔ管管腔；３、折り目の２～３層を有するｔ管；又は４、折り目の＞３層を有するｔ管）は、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓におけるｔ管の輪郭における著しい減少を確認したが、これはｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓において正規化された（ｐ＜０．００１、カイ二乗検定）。ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ心臓では、ｃＢＩＮ１が生理的なレベルより多く存在する結果として、マイクロフォールドが誇張されている（３層以上の折り目、スコア４）ことに注意されたい。これらのデータは、ｃＢＩＮ１がｔ管マイクロフォールドの形成に重要であること、慢性的な交感神経過剰駆動下で折り目が下方制御されていること、ｃＢＩＮ１外因性療法により折り目が回復することを示す。
慢性的なイソプロテレノールによって破壊されたｃＢＩＮ１－マイクロドメインはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によって正規化し得る
心筋のイノトロピーとルシトロピーの両方が心筋細胞のカルシウム循環と関連していることはよく知られている［７６］。二分子マイクロドメインの構造オーガナイザーであるｃＢＩＮ１は［３１］、細胞外Ｃａ２＋拡散を制限するｔ管のマイクロフォールドを作製し［２９］、Ｌ型カルシウムチャネル（ＬＴＣＣ）のマイクロチューブ依存性前方トラフィッキング［３０］及び既にｔ管膜に送達されたＬＴＣＣのクラスタリングを促進する。そこで、慢性のイソプロテレノール輸注後の肥大化した心臓において、ｃＢＩＮ１－マイクロドメインがどのようにリモデリングし得るかを検討した。心臓ライセートのウェスタンブロットから、イソプロテレノールはｃＢＩＮ１タンパク質の著しい減少を誘導し、これはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によって正規化されることが示される（図９Ａ）。抗ＢＩＮ１－エクソン１７抗体による免疫沈降と、それに続く抗ＢＩＮ１－エクソン１３抗体によるウェスタンブロット検出により、調べたタンパク質バンドがｃＢＩＮ１（ＢＩＮ１＋１３＋１７）アイソフォームであることを確認することに留意されたい。膜色素Ｄｉ－８－ＡＮＮＥＰｓで標識した単離心筋細胞において、総体的なｔ管ネットワーク構築もまた調べた（図９Ｂ）。ライブセル画像化とそれに続くパワースペクトル解析により、全体的なｔ管組織（正規化ピークパワー密度）がＧＦＰ＋ＩＳＯマウスにおいて同様であり、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１により増加することが示された。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像化を使用して、総ｔ管ネットワークが組織化されたままであっても、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓においてｔ管マイクロフォールドの減少があることが留意され、これはｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓において保持された（図９Ｃ）。以前に確立された修正されたスコアリングシステムを用いたｔ管の輪郭の程度の定量化［２９］（１、折り目のない円形又は拡張したｔ管管腔；２、折り目のない非円形輪郭のｔ管管腔；３、折り目の２～３層を有するｔ管；又は４、折り目の＞３層を有するｔ管）は、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓におけるｔ管の輪郭における著しい減少を確認したが、これはｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓において正規化された（ｐ＜０．００１、カイ二乗検定）。ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ心臓では、ｃＢＩＮ１が生理的なレベルより多く存在する結果として、マイクロフォールドが誇張されている（３層以上の折り目、スコア４）ことに注意されたい。これらのデータは、ｃＢＩＮ１がｔ管マイクロフォールドの形成に重要であること、慢性的な交感神経過剰駆動下で折り目が下方制御されていること、ｃＢＩＮ１外因性療法により折り目が回復することを示す。
【0061】
続いて、心筋細胞におけるＣａｖ１．２の発現及び細胞内分布を探索した。イソプロテレノール後の心臓では、Ｃａｖ１．２の正味の心筋タンパク質発現量は同程度であった（図１０Ａ）。しかしながら、Ｃａｖ１．２の心筋組織免疫蛍光標識は、ｔ管に沿ったチャネル密度がＧＦＰ＋ＩＳＯ心筋細胞において著しく減少し、これはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１（図１０Ｂ～Ｃ）、パワースペクトル及び蛍光プロファイル分析）によって正規化されることを明らかにした。これらのデータは、同様の総タンパク質レベルにもかかわらず、変化したＣａｖ１．２タンパク質分布の以前の観察と一致する［３２］。ｔ管へのＣａｖ１．２局在化の減少に伴い、カルシウムトランジェントのピーク振幅（ΔＦ／Ｆ０）は、対照ＧＦＰ＋ＰＢＳ心筋細胞由来のものと比較すると、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心筋細胞において著しく減少し（図１０Ｄ）、これは外因性ｃＢＩＮ１によって正規化された。ライノジン受容体２（ＲｙＲ）総タンパク質発現及び細胞内分布は、全ての群間で差がなかった（図２０）。しかしながら、ＲｙＲは、以前の報告［６１］と一致して、ＰＫＡ依存性のＳ２８０８及びＣＡＭＫＩＩ依存性のＳ２８１４の両方で高リン酸化されるようになった。ＣＡＭＫＩＩδのＴ２８７でのリン酸化の増加と共に、これらのデータは、ＰＫＡ及びＣＡＭＫＩＩ活性化誘導性のＲｙＲの過リン酸化がイソプロテレノールの慢性的輸注後に起こることを示唆している。重要なことに、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理が、これらの経路をうまく鈍らせ、ＲｙＲ過リン酸化を減少させる（図２１）。
【0062】
実施例５
外因性ｃＢＩＮ１は、ＳＲに沿ったＳＥＲＣＡ２ａの分布を改善する
心臓ルシトロピーは、ＳＥＲＣＡ２ａを介したカルシウム再吸収に最も直接的に関連している。驚くべきことに、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓では拡張期機能不全が損なわれているにもかかわらず、ＳＥＲＣＡ２ａの総タンパク質発現はイソプロテレノール輸注後に有意に増加した（図１１Ａ－Ｂ）。ホスホランバン（ＰＬＮ）及びそのリン酸化体（ｐＳ１６及びｐＴ１７）の総タンパク質レベルは変化しなかった（図２１）。以前の研究では、急性のイソプロテレノール誘導性ＰＬＮリン酸化は、慢性的なイソプロテレノール輸注後に正規化され、セリン／スレオニンホスファターゼＰＰ１及びＰＰ２Ａの活性化によりＰＬＮ脱リン酸化も起こり得ることが示された［７３、７７］。これらの報告と一致して、今回の結果は、４週間のイソプロテレノール輸注後にＰＬＮのリン酸化が変化しないのは、キナーゼとホスファターゼの両方の均衡のとれた局所活性化の正味の結果である可能性があることを証明した。これらのデータは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質と活性の両方がイソプロテレノール後の心臓で減少していないことを示す。Ｃａｖ１．２の局在に対するｃＢＩＮ１の効果を考慮し、ＳＥＲＣＡ２ａの局在を検討した。ＳＥＲＣＡ２ａ標識した心筋組織切片を回転ディスク共焦点顕微鏡で画像化し、群間で比較した（図１１Ｃ）。ＧＦＰ＋ＰＢＳ心臓では、ＳＥＲＣＡ２ａの亜集団はｔ管／ｊＳＲ領域に集中し、サルコメアの全長に相当する１．８～２μｍに主要なパワースペクトルのピークを有する組織的分布を生じさせている。ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳの心臓でｃＢＩＮ１を過剰発現させると、ｔ管／ｊＳＲ付近のＳＥＲＣＡ２ａシグナルがさらに増加した。ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓では、ＳＥＲＣＡ２ａの細胞内分布はピークパワー密度の著しい減少と共に乱れ、これはｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓で正規化された（図１１Ｄにおける定量化）。
外因性ｃＢＩＮ１は、ＳＲに沿ったＳＥＲＣＡ２ａの分布を改善する
心臓ルシトロピーは、ＳＥＲＣＡ２ａを介したカルシウム再吸収に最も直接的に関連している。驚くべきことに、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓では拡張期機能不全が損なわれているにもかかわらず、ＳＥＲＣＡ２ａの総タンパク質発現はイソプロテレノール輸注後に有意に増加した（図１１Ａ－Ｂ）。ホスホランバン（ＰＬＮ）及びそのリン酸化体（ｐＳ１６及びｐＴ１７）の総タンパク質レベルは変化しなかった（図２１）。以前の研究では、急性のイソプロテレノール誘導性ＰＬＮリン酸化は、慢性的なイソプロテレノール輸注後に正規化され、セリン／スレオニンホスファターゼＰＰ１及びＰＰ２Ａの活性化によりＰＬＮ脱リン酸化も起こり得ることが示された［７３、７７］。これらの報告と一致して、今回の結果は、４週間のイソプロテレノール輸注後にＰＬＮのリン酸化が変化しないのは、キナーゼとホスファターゼの両方の均衡のとれた局所活性化の正味の結果である可能性があることを証明した。これらのデータは、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質と活性の両方がイソプロテレノール後の心臓で減少していないことを示す。Ｃａｖ１．２の局在に対するｃＢＩＮ１の効果を考慮し、ＳＥＲＣＡ２ａの局在を検討した。ＳＥＲＣＡ２ａ標識した心筋組織切片を回転ディスク共焦点顕微鏡で画像化し、群間で比較した（図１１Ｃ）。ＧＦＰ＋ＰＢＳ心臓では、ＳＥＲＣＡ２ａの亜集団はｔ管／ｊＳＲ領域に集中し、サルコメアの全長に相当する１．８～２μｍに主要なパワースペクトルのピークを有する組織的分布を生じさせている。ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳの心臓でｃＢＩＮ１を過剰発現させると、ｔ管／ｊＳＲ付近のＳＥＲＣＡ２ａシグナルがさらに増加した。ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓では、ＳＥＲＣＡ２ａの細胞内分布はピークパワー密度の著しい減少と共に乱れ、これはｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓で正規化された（図１１Ｄにおける定量化）。
【0063】
Ｃａｖ１．２及びＳＥＲＣＡ２ａの細胞内分布を、心臓ミクロソームの生化学的スクロース勾配ベースの画分を用いてさらに探索した［７０］。図２２Ａに示されるように、画分Ｆ４は、他の画分と比較して、最も低い回収収率を有する。しかしながら、低い収率であっても、Ｃａｖ１．２及びｃＢＩＮ１は、限られたＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ及び枯渇したＳＥＲＣＡ２ａと共にＦ４において検出可能であり、Ｆ４がｔ管由来のミクロソームで濃縮されていることを示す（図２２Ｂ）。全ての試料（レーン当たり２．５μｇのタンパク質をロードした）に渡ってＦ４についてｔ管タンパク質濃度を正規化すると、ＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓は、対照ＧＦＰ＋ＰＢＳ心臓と比較して、単位ｔ管当たりｃＢＩＮ１及びＣａｖ１．２タンパク質の両方において有意な減少を有し、これはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理によって正規化された（図１２Ａ）。これらのデータは、イソプロテレノール輸注後のＣａｖ１．２チャネルのｔ管局在の減少、及びＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１による回復を同定した免疫蛍光画像化と一致する。一方、ＳＲタンパク質は画分Ｆ２及びＦ３にのみ検出された。Ｆ２及びＦ３についてＳＲタンパク質濃度を正規化すると（レーンあたり２５μｇのタンパク質をロードした）、Ｆ３はＦ２よりも相対的にＲｙＲが多く、ＰＬＮが少なく（図１２Ｂ）、より重いＦ３画分に向かってｊＳＲが濃縮されていることが示された。Ｆ２及びＦ３におけるＳＥＲＣＡ２ａ発現の定量化は、ＡＡＶ９－ＧＦＰと比較した場合、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１は、より重い、よりｊＳＲに富むＦ３へのＳＥＲＣＡ２ａ分布の有意な増加を引き起こしたが、縦ＳＲに富むＦ２画分は引き起こさない（図１２Ｂ）。注目すべきことに、イソプロテレノール単独では、ＡＡＶ９－ＧＦＰマウス心臓のＦ３におけるＳＥＲＣＡ２ａ発現が増加したが、これはおそらくイソプロテレノール後の心臓におけるＳＥＲＣＡ２ａの総タンパク質発現の全体的な増加によるものである（図１１Ａ）。これらのデータは、イソプロテレノール輸注後の心臓において、外因性ｃＢＩＮ１は、Ｃａｖ１．２及びＳＥＲＣＡ２ａをその機能部位に局在させるためにｔ管マイクロドメインを維持できることを示す。
【0064】
ｔ管／ｊＳＲ領域でのＣａｖ１．２及びＳＥＲＣＡ２ａの減少を考慮して、ＳＴＯＲＭ画像化を用いてＣａｖ１．２－ＲｙＲ及びＳＥＲＣＡ２ａ－ｃＢＩＮ１のナノスケールタンパク質－タンパク質共局在を分析した（図１３）。最隣接部解析により、個々のＣａｖ１．２分子とその最も近いＲｙＲ分子との間の距離を定量化した。全細胞画像からのＣａｖ１．２－ＲｙＲ分子間の距離のヒストグラム分布により、ＧＦＰ＋ＰＢＳ、ＧＦＰ＋ＩＳＯ、ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心筋細胞では４０ｎｍ付近に最初のピークが特定され、これは、二分子カップロンに相当する。収縮機能が維持されたＧＦＰ＋ＩＳＯ心臓では、分布ヒストグラムは右にシフトする傾向があったが、最初のピークの位置は維持されたままであった（図１３Ｂ）。興味深いことに、ｃＢＩＮ１＋ＰＢＳ筋細胞は、左シフトしたヒストグラム分布を持ち、Ｃａｖ１．２－ＲｙＲピーク距離が著しく減少し、これは、ＴＥＭ画像化で観察されたように、ｃＢＩＮ１－マイクロフォールドの誇張によって近接したと考えられる密接なカップロンを示す。一方、ｔ管におけるＳＥＲＣＡ２ａとその最隣接部のｃＢＩＮ１との間の距離は、ＡＡＶ９－ＧＦＰ前処理動物においてイソプロテレノール後に増加する傾向を示し（ｐ＝０．０６３、ＧＦＰ＋ＰＢＳ対ＧＦＰ＋ＩＳＯ）、これはＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理動物において著しく減少した（ｐ＜０．００１、ＧＦＰ＋ＩＳＯ対ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ）（図１３Ｃ～Ｄ）。これらのデータは、ｃＢＩＮ１－マイクロフォールドが、ＥＣカップリングとカルシウム処理タンパク質との間の共局在化及び相互作用を調節し得ることを示す。
【0065】
実施例６
ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓の表現型は、アイソフォーム特異的であり、ｃＢＩＮ１に固有のものである
ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓の観察された表現型がアイソフォーム特異的効果であるかどうかをさらに調べるために、ＧＦＰ及びｃＢＩＮ１、並びに小ＢＩＮ１、ＢＩＮ１＋１７、及びＢＩＮ１＋１３を含むＢＩＮ１アイソフォームを発現する他の３つのマウス心筋細胞を形質導入したＡＡＶ９を投与されるように無作為化した５０匹以上のマウスでイソプロテレノールのプロトコルを繰り返した。同様に、ウイルス投与３週間後に、マウスにイソプロテレノールを３０ｍｇ／ｋｇ／日で４週間連続的に皮下輸注を行った。ＧＦＰ又はＢＩＮ１アイソフォームを形質導入したマウスの５群間で比較した場合、イソプロテレノール後の心臓におけるＣａｖ１．２及びＳＥＲＣＡ２ａのタンパク質発現は、有意差はなかった（図２３Ａ）。Ｃａｖ１．２チャネルの心筋組織免疫蛍光標識は、ｔ管に沿ったチャネル密度がｃＢＩＮ１発現心臓においてのみ有意に増加し、他のＢＩＮ１アイソフォームでは増加しないことを明らかにした（図２３Ｂ、定量化は図２３Ｄに示す）。免疫蛍光イメージ化により、ＡＡＶ９によって導入された外因性ｃＢＩＮ１がＳＥＲＣＡ２ａ分布を組織化することが明らかになり（図２３Ｃ、定量化は図２３Ｅに示す）、図１１からのデータと一致した。
ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓の表現型は、アイソフォーム特異的であり、ｃＢＩＮ１に固有のものである
ｃＢＩＮ１＋ＩＳＯ心臓の観察された表現型がアイソフォーム特異的効果であるかどうかをさらに調べるために、ＧＦＰ及びｃＢＩＮ１、並びに小ＢＩＮ１、ＢＩＮ１＋１７、及びＢＩＮ１＋１３を含むＢＩＮ１アイソフォームを発現する他の３つのマウス心筋細胞を形質導入したＡＡＶ９を投与されるように無作為化した５０匹以上のマウスでイソプロテレノールのプロトコルを繰り返した。同様に、ウイルス投与３週間後に、マウスにイソプロテレノールを３０ｍｇ／ｋｇ／日で４週間連続的に皮下輸注を行った。ＧＦＰ又はＢＩＮ１アイソフォームを形質導入したマウスの５群間で比較した場合、イソプロテレノール後の心臓におけるＣａｖ１．２及びＳＥＲＣＡ２ａのタンパク質発現は、有意差はなかった（図２３Ａ）。Ｃａｖ１．２チャネルの心筋組織免疫蛍光標識は、ｔ管に沿ったチャネル密度がｃＢＩＮ１発現心臓においてのみ有意に増加し、他のＢＩＮ１アイソフォームでは増加しないことを明らかにした（図２３Ｂ、定量化は図２３Ｄに示す）。免疫蛍光イメージ化により、ＡＡＶ９によって導入された外因性ｃＢＩＮ１がＳＥＲＣＡ２ａ分布を組織化することが明らかになり（図２３Ｃ、定量化は図２３Ｅに示す）、図１１からのデータと一致した。
【0066】
次に、異なるＡＡＶ９－ＢＩＮ１アイソフォーム前処理の機能的結果を、心エコーを用いて探索した。ｃＢＩＮ１発現マウスは、ＧＦＰ群と比較すると、ＬＶ壁厚、ＬＶ質量、及びＲＷＴにおけるイソプロテレノール誘導性増加を減少させた（図１４Ａ～Ｄ、表３）。全ての動物において、イソプロテレノール後の心拍出量は、ベースラインでのレベルから有意に増加し、これは、イソプロテレノール誘導性の心拍ＲＷＴにおける増加の結果であった（表３）。しかし、ｃＢＩＮ１心臓のみがまた、イソプロテレノール後のＧＦＰ心臓と比較した場合、収縮機能の改善、Ｅ／ｅ’の正規化、一回拍出量の増加、及び心拍出量のさらなる増加を有する（図１４Ｅ～Ｈ）。注目すべきは、ＢＩＮ１＋１７で前処理したマウスで部分的なｃＢＩＮ１様効果が起こり、これは、ＬＶ質量、Ｅ／ｅ’を有意に減少させ、イソプロテレノールで増加したＲＷＴを減少させた。ＢＩＮ１＋１７から観察された部分的な拡張期機能レスキューは、免疫蛍光画像化によるＳＥＲＣＡ２ａの細胞内分布の部分的レスキューと一致した（図２３Ｃ）。しかしながら、ＢＩＮ１＋１７がｔ管でのＣａｖ１．２分布を増加させることができないため、イソプロテレノール輸注後のＡＡＶ９－ＢＩＮ１＋１７前処理心臓において正のイノトロピー効果は見られなかった。
【0067】
【表3】
【0068】
実施例７
ＴＡＣ誘発性ＨＦにおけるＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の心筋保護効果が確認される
ｃＢＩＮ１の心筋保護効果を、ＴＡＣによって誘導された圧力過負荷の別のマウスモデルにおいてさらに調査した。ｃＢＩＮ１の遺伝的欠損又はＡＡＶ９－形質導入ｃＢＩＮ１過剰発現のいずれかを有するマウスを、この試験において試験した（図１５Ａ）。欠損試験では、心臓特異的Ｂｉｎ１ ＨＴマウス及びＷＴ同腹子対照を含み［２９］、これらを共に８週間ＴＡＣに供した。過剰発現試験は、ｃＢＩＮ１－Ｖ５又はＡＡＶ９－ＧＦＰ－Ｖ５を形質導入したＡＡＶ９を事前に注入した８週間のＴＡＣに供したマウス、及び開胸モック外科手術（ｓｈａｍ）に供したマウスを含んでいた。マウスをモニタリングし、外科手術後８週目に終了させた。ウイルス（ＡＡＶ９－ＧＦＰ／ｃＢＩＮ１－Ｖ５）、投与量（３×１０１０ｖｇ）、投与時期（外科手術の３週間前）、経路（眼窩後注射）は、イソプロテレノールの試験で用いたものと同じであった。全てのＴＡＣマウスにおける大動脈収縮は、経大動脈圧力勾配の上昇によって確認され（図１５Ｂ）、ＴＡＣを受けた全てのマウスにおける血行力学的後負荷の同様の増加を確立した。無重度ＨＦ（ＥＦ≧３５％）生存率を要約したカプラン－マイヤー曲線は、図１５Ｃに含まれた。Ｂｉｎ１ ＨＴマウスの生存率は、２０．０％（１０匹中８匹、２匹死亡、６匹ＥＦ＜３５％）であり、ＷＴマウスの７１．４％（１４匹中４匹非生存、１匹死亡、３匹ＥＦ＜３５％）から減少した（ログランク検定によるｐ＝０．０３８）。予想通り、全てのｓｈａｍマウスは実験プロトコル全体を通して生存した（１０匹中１０匹、黒の点線）。ＡＡＶ９－ＧＦＰマウスでは生存率が６４．３％に低下し（１４匹中５匹非生存、５匹ＥＦ＜３５％）、これは、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１群では９３．７％に有意に改善した（１６匹中１匹非生存、１匹ＥＦ＜３５％）（ログランク検定によるｐ＝０．０２０）。これらのデータは、心臓におけるより高いｃＢＩＮ１タンパク質含量が、圧力過負荷後に収縮期ＨＦを発症することのないより良い生存と関連していることを示している。
ＴＡＣ誘発性ＨＦにおけるＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の心筋保護効果が確認される
ｃＢＩＮ１の心筋保護効果を、ＴＡＣによって誘導された圧力過負荷の別のマウスモデルにおいてさらに調査した。ｃＢＩＮ１の遺伝的欠損又はＡＡＶ９－形質導入ｃＢＩＮ１過剰発現のいずれかを有するマウスを、この試験において試験した（図１５Ａ）。欠損試験では、心臓特異的Ｂｉｎ１ ＨＴマウス及びＷＴ同腹子対照を含み［２９］、これらを共に８週間ＴＡＣに供した。過剰発現試験は、ｃＢＩＮ１－Ｖ５又はＡＡＶ９－ＧＦＰ－Ｖ５を形質導入したＡＡＶ９を事前に注入した８週間のＴＡＣに供したマウス、及び開胸モック外科手術（ｓｈａｍ）に供したマウスを含んでいた。マウスをモニタリングし、外科手術後８週目に終了させた。ウイルス（ＡＡＶ９－ＧＦＰ／ｃＢＩＮ１－Ｖ５）、投与量（３×１０１０ｖｇ）、投与時期（外科手術の３週間前）、経路（眼窩後注射）は、イソプロテレノールの試験で用いたものと同じであった。全てのＴＡＣマウスにおける大動脈収縮は、経大動脈圧力勾配の上昇によって確認され（図１５Ｂ）、ＴＡＣを受けた全てのマウスにおける血行力学的後負荷の同様の増加を確立した。無重度ＨＦ（ＥＦ≧３５％）生存率を要約したカプラン－マイヤー曲線は、図１５Ｃに含まれた。Ｂｉｎ１ ＨＴマウスの生存率は、２０．０％（１０匹中８匹、２匹死亡、６匹ＥＦ＜３５％）であり、ＷＴマウスの７１．４％（１４匹中４匹非生存、１匹死亡、３匹ＥＦ＜３５％）から減少した（ログランク検定によるｐ＝０．０３８）。予想通り、全てのｓｈａｍマウスは実験プロトコル全体を通して生存した（１０匹中１０匹、黒の点線）。ＡＡＶ９－ＧＦＰマウスでは生存率が６４．３％に低下し（１４匹中５匹非生存、５匹ＥＦ＜３５％）、これは、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１群では９３．７％に有意に改善した（１６匹中１匹非生存、１匹ＥＦ＜３５％）（ログランク検定によるｐ＝０．０２０）。これらのデータは、心臓におけるより高いｃＢＩＮ１タンパク質含量が、圧力過負荷後に収縮期ＨＦを発症することのないより良い生存と関連していることを示している。
【0069】
ＴＡＣ後８週目に、生存マウスを屠殺し、ＨＷ／ＢＷ及びＬＷ／ＢＷの比率について評価した（表４、図１５Ｄ～Ｅ）。Ｂｉｎ１ ＨＴマウスはＷＴマウスに比べＨＷ／ＢＷ、ＬＷ／ＢＷが共に有意に高く、ＢＩＮ１欠損によるＬＶ肥大、肺浮腫の悪化が示唆された。遺伝子療法に関しては、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１はＬＷ／ＢＷを対照のＧＦＰ－ＴＡＣ群からｓｈａｍ心臓のレベルまで著しく減少させ、これは、ＴＡＣ誘導性の肺浮腫の顕著な減少を表している。ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の心臓では、より少ない程度ではあるが、依然として肥大が起こった。これらのデータは、外因性ｃＢＩＮ１がＴＡＣ誘導性肥大を減少させ、ＨＦへの悪化を防止することを示した。さらに、心エコー解析（図１５Ｆ～Ｊ、表５）により、ＷＴ－ＴＡＣマウスと比較すると、Ｂｉｎ１ ＨＴ－ＴＡＣ心臓ではＥＦの有意な減少及びＥＤＶの増加が認められ、ＢＩＮ１欠損による拡張型心筋症の悪化が示唆された。一方、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１はＴＡＣ誘導性ＬＶ拡張（ＥＤＶ）及び収縮機能不全（ＥＦ）を有意に低下させ、拡張型心筋症の発症を制限した。その結果、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１による前処理は、ＴＡＣ後の心臓を拡張させることなく、一回拍出量及び心拍出量を維持した。さらに、組織ドップラーにより、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１前処理心臓では、側壁及び中隔壁の両方の拡張期パラメータＥ／ｅ’値が有意に改善されたことが明らかになり、外因性ｃＢＩＮ１マウスにおいて拡張期機能が改善されることを示す。これらのデータは、ｃＢｉｎ１遺伝子療法がストレス下の心臓における心筋収縮期及び拡張期機能を維持し、圧力過負荷にさらされたマウスの心臓における拡張型心筋症の発症を効果的に予防することを示す。
【0070】
【表4】
【0071】
【表5】
【0072】
実施例８
マウス糖尿病性心筋症（ＨＦｐＥＦ）試験
糖尿病性心筋症を発症したｄｂ／ｄｂマウスにおいて、心筋機能を調べると共に、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の治療可能性を検討した。２型糖尿病のモデルマウスとして確立されたＤｂ／ｄｂマウス系統（Ｌｅｐｒｄｂのホモ接合体Ｄｏｃｋ７ｍ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、糖尿病性心筋症及び駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）のモデルとして使用されてきた［７８］。９週齢の雄及び雌のｄｂ／ｄｂマウス及びその同腹子の対照ｄｂ／ｍマウスに、１用量（１×１０１１ｖｇ）のＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１又は対照ＧＦＰを眼窩後注射により投与した［７９、８０］。心機能及び生理学的パラメータは、ＡＡＶ注入前及び注入８週間後の両方において、動物が１７週齢の時に測定された［７９］。心機能は、心エコーで測定した収縮期パラメータ（駆出率及び画分短縮）、拡張期パラメータ（Ｅ／Ａ、Ｅ／ｅ’）、並びに一回拍出量（ＳＶ）によって評価した。また、マウストレッドミルでの最大走行距離を測定することによって、これらの動物の運動負荷試験でのパフォーマンスを評価した。運動耐性は、心機能予備能の低下とＨＦｐＥＦの重要な生理学的パラメータである。
マウス糖尿病性心筋症（ＨＦｐＥＦ）試験
糖尿病性心筋症を発症したｄｂ／ｄｂマウスにおいて、心筋機能を調べると共に、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の治療可能性を検討した。２型糖尿病のモデルマウスとして確立されたＤｂ／ｄｂマウス系統（Ｌｅｐｒｄｂのホモ接合体Ｄｏｃｋ７ｍ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、糖尿病性心筋症及び駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）のモデルとして使用されてきた［７８］。９週齢の雄及び雌のｄｂ／ｄｂマウス及びその同腹子の対照ｄｂ／ｍマウスに、１用量（１×１０１１ｖｇ）のＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１又は対照ＧＦＰを眼窩後注射により投与した［７９、８０］。心機能及び生理学的パラメータは、ＡＡＶ注入前及び注入８週間後の両方において、動物が１７週齢の時に測定された［７９］。心機能は、心エコーで測定した収縮期パラメータ（駆出率及び画分短縮）、拡張期パラメータ（Ｅ／Ａ、Ｅ／ｅ’）、並びに一回拍出量（ＳＶ）によって評価した。また、マウストレッドミルでの最大走行距離を測定することによって、これらの動物の運動負荷試験でのパフォーマンスを評価した。運動耐性は、心機能予備能の低下とＨＦｐＥＦの重要な生理学的パラメータである。
【0073】
心エコーで測定した心筋機能パラメータは、ｄｂ／ｄｂマウスでは９週齢という早い時期に拡張期不全の発症に成功していることを示す。左心室駆出率が未だ維持されている１７週齢のｄｂ／ｄｂマウスでは、減少したＥ／Ａ（図２３Ａ）及び上昇したＥ／ｅ’（図２４Ｂ）を含む拡張期パラメータに有意な変化が見られる。これら全ての異常な拡張期パラメータは、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の処理によりレスキューされ、正規化され得る。ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１の改善された拡張期機能により、ｄｂ／ｄｂマウスの減少した左心室一回拍出量は正常化される（図２４Ｃ）。改善された心エコーパラメータと共に、これらの疾患ｄｂ／ｄｂマウスにおける運動不耐性（トレッドミル上の最大走行距離の減少）もまた、ＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１によって有意に改善される（図２４Ｄ）。全てのｄｂ／ｄｂマウスの体重は、ＡＡＶ９－ＧＦＰ又はｃＢＩＮ１処理のいずれかを有する両群に渡って類似しており、肥満及び２型糖尿病の類似のレベルを示していることに留意されたい。心エコーで測定された拡張期パラメータのレスキューと合わせて考えると、これらのデータは、運動耐性に対するＡＡＶ９－ｃＢＩＮ１介在性のレスキュー効果は、改善された心筋機能予備能に起因することを示すものである。
【0074】
実施例９
イヌ虚血性心筋症（ＨＦｒＥＦ）試験のまとめ
虚血性心筋症を有する心臓において低下した心機能をレスキューするためのｃＢＩＮ１遺伝子療法の効果について検討した。成犬ハウンド犬（２５～３０ｋｇ）を開胸し、左前下行（ＬＡＤ）冠動脈の近位部を永久結紮した。犬を心エコー、血行動態パラメータ、及び生理学的パラメータで結紮後８～９週間追跡し、動物を麻酔し、左心室内膜にＡＡＶ９ウイルスでパッケージされたｃＢＩＮ１を注入した。ＮＯＧＡ ＸＰ（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ Ｗｅｂｓｔｅｒ／Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）を用いて、ＬＶ心内室の３次元電気解剖学的マッピングを実施した。同じＮＯＧＡ ＸＰシステムを用いて、２７ゲージのニチノール針を持つＭｙｏｓｔａｒカテーテルで心筋に注入する。各心臓の、左心室心内室全体の２０の注入部位に注入された。各注入は、２５０μＬのＰＢＳに混合した２．５×１０１１ｖｇからなり、動物の心臓当たり合計５×１０１２ｖｇであった。その後、動物を心エコー、血行力学、及び生理学的パラメータによってモニタリングを続けた。
イヌ虚血性心筋症（ＨＦｒＥＦ）試験のまとめ
虚血性心筋症を有する心臓において低下した心機能をレスキューするためのｃＢＩＮ１遺伝子療法の効果について検討した。成犬ハウンド犬（２５～３０ｋｇ）を開胸し、左前下行（ＬＡＤ）冠動脈の近位部を永久結紮した。犬を心エコー、血行動態パラメータ、及び生理学的パラメータで結紮後８～９週間追跡し、動物を麻酔し、左心室内膜にＡＡＶ９ウイルスでパッケージされたｃＢＩＮ１を注入した。ＮＯＧＡ ＸＰ（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ Ｗｅｂｓｔｅｒ／Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）を用いて、ＬＶ心内室の３次元電気解剖学的マッピングを実施した。同じＮＯＧＡ ＸＰシステムを用いて、２７ゲージのニチノール針を持つＭｙｏｓｔａｒカテーテルで心筋に注入する。各心臓の、左心室心内室全体の２０の注入部位に注入された。各注入は、２５０μＬのＰＢＳに混合した２．５×１０１１ｖｇからなり、動物の心臓当たり合計５×１０１２ｖｇであった。その後、動物を心エコー、血行力学、及び生理学的パラメータによってモニタリングを続けた。
【0075】
図２５に示すように、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）の対試験週の測定値を報告する。２匹の動物についてのデータが含められた。０時点は、ＬＡＤ結紮時に対応する。矢印は、ｃＢＩＮ１療法の時間を示した。ＬＶＥＦはｃＢＩＮ１治療前に半分に減少し、その後注射後１～２週間以内に軽度の機能不全のみに回復していることに注目されたい。１匹目の犬は回復を続けている。２匹目の犬は１２週目に異物を飲み込み虚血性大腸となったため、処置を中止した。
【0076】
両方の動物において、ｃＢＩＮ１遺伝子療法は虚血性心筋症（ＨＦｒＥＦ）を有する心臓の心筋機能の劇的なレスキューをもたらした。レスキューは少なくとも５週間続いた。この試験は現在進行中であり、単一エピソードのｃＢＩＮ１注入後の治療期間は未だ決定されていない。
【0077】
参考文献
【0078】
【表6-1】
【0079】
【表6-2】
【0080】
【表6-3】
【0081】
【表6-4】
【0082】
【表6-5】
【0083】
【表6-6】
【0084】
【表6-7】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図15-4】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21-1】
【図21-2】
【図22】
【図23-1】
【図23-2】
【図24】
【図25】
【国際調査報告】