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特表2023-529281ＰＩＷＩを高発現する癌におけるＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の診断と治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-10
(54)【発明の名称】ＰＩＷＩを高発現する癌におけるＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の診断と治療
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20230703BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20230703BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230703BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230703BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230703BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230703BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230703BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230703BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230703BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230703BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230703BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61K45/06
A61K49/00
A61P35/00
C07K16/18
C12Q1/02
G01N33/574 A
G01N33/50 Z
G01N33/53 D
G01N33/15 Z
C12N15/11 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022566191
(86)(22)【出願日】2021-04-28
(85)【翻訳文提出日】2022-12-23
(86)【国際出願番号】 CN2021090591
(87)【国際公開番号】W WO2021219009
(87)【国際公開日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】202010359757.5
(32)【優先日】2020-04-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518222745
【氏名又は名称】上海科技大学
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＴＥＣＨ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３９３ Ｍｉｄｄｌｅ Ｈｕａｘｉａ Ｒｏａｄ， Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】リン ハイファン
(72)【発明者】
【氏名】シ シュオ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン チェンチェン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045CB01
2G045FB02
2G045FB03
4B063QA19
4B063QA20
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS33
4C084AA17
4C084AA20
4C084NA14
4C084ZB26
4C085HH20
4C085KB82
4C085LL18
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、胃がんなどのＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の治療における薬物、医薬組成物の使用を提供する。本発明の薬物、医薬組成物をＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌、特に胃がんの治療に適用した場合、癌、特に胃がんの治療に有効なだけでなく、特異性が高く、正常細胞及び生体機能に害を与えないことである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること、（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること、
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること、
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること、
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること、
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること、
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること、
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること、
中の一つ又は複数に使用されるＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質の結合を阻害する薬物。
【請求項2】
前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、
及び／又は、前記薬物は、前記ＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質の結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物であり、好ましくは前記ＰＩＷＩ上の前記ＮＭＤ複合体タンパク質に結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物であり、及び／又は好ましくは前記ＮＭＤ複合体上の前記ＰＩＷＩに結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物である、
ことを特徴とする請求項１に記載の薬物。
【請求項3】
前記薬物は、前記ＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質の結合部位に設計された阻害剤であり、好ましくは、ＰＩＷＩ上の前記ＮＭＤ複合体タンパク質に結合する結合部位に設計された阻害剤、例えばＰＩＷＩＬ１阻害剤、ＰＩＷＩＬ２阻害剤、ＰＩＷＩＬ３阻害剤及び／又はＰＩＷＩＬ４阻害剤であり、及び／又は、ＮＭＤ複合体タンパク質上の前記ＰＩＷＩに結合する結合部位に設計された阻害剤、例えばＵＰＦ１阻害剤、ＵＰＦ２阻害剤、ＳＭＧ１阻害剤、ＵＰＦ３阻害剤、ＳＭＧ５阻害剤、ＳＭＧ６阻害剤及び／又はＳＭＧ７阻害剤であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１阻害剤であり、及び／又は、前記薬物は小分子物質であり、例えば、小分子化合物などの小分子化学物質、又は小分子活性ペプチドなどの小分子生物学的物質であり；前記小分子化合物は、好ましくは、化合物の薬学的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在し、
及び／又は、前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質であり、
及び／又は、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである、
ことを特徴とする請求項２に記載の薬物。
【請求項4】
（ａ）ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること、（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること、
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること、
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること、
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること、
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること、
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること、
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること、
中の一つ又は複数に使用されるＰＩＷＩを標的とする薬物及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を標的とする薬物。
【請求項5】
前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、
及び／又は、前記ＰＩＷＩを標的とする薬物はＰＩＷＩ阻害剤であり、例えばＰＩＷＩＬ１阻害剤、ＰＩＷＩＬ２阻害剤、ＰＩＷＩＬ３阻害剤及び／又はＰＩＷＩＬ４阻害剤であり、
及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質を標的とする薬物はＮＭＤ複合体タンパク質阻害剤であり、例えばＵＰＦ１阻害剤、ＵＰＦ２阻害剤、ＳＭＧ１阻害剤、ＵＰＦ３阻害剤、ＳＭＧ５阻害剤、ＳＭＧ６阻害剤及び／又はＳＭＧ７阻害剤であり、例えばＮＭＤＩ－１４、ＮＭＤＩ１及び／又はＶＧ１であり、
及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、
及び／又は、前記薬物は小分子物質であり、例えば、小分子化合物などの小分子化学物質、又は小分子活性ペプチドなどの小分子生物学的物質であり；前記小分子化合物は、好ましくは、化合物の薬学的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在し、
及び／又は、前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質であり、
及び／又は、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである、
ことを特徴とする請求項４に記載の薬物。
【請求項6】
（ａ）ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること、（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること、
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること、
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること、
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること、
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること、
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること、
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること、
中の一つ又は複数に使用されるＰＩＷＩの発現量を低下させる薬物及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の発現量を低下させる薬物。
【請求項7】
前記ＰＩＷＩの発現量を低下させる薬物は、ＰＩＷＩ遺伝子をサイレンシングし、ダウンレギュレーションし、及び／又はノックアウトする薬物であり、及び／又は、ＮＭＤ複合体タンパク質の発現量を低下させる薬物は、ＮＭＤ複合体タンパク質の遺伝子をサイレンシングし、ダウンレギュレーションし、及び／又はノックアウトする薬物であり、
及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、
及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、
及び／又は、前記薬物は小分子物質であり、例えば、小分子化合物などの小分子化学物質、又は小分子活性ペプチドなどの小分子生物学的物質であり；小分子化合物は、好ましくは、化合物の薬学的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在し、
及び／又は、前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質であり、
及び／又は、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである、
を特徴とする請求項６に記載の薬物。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物を含む医薬組成物。
【請求項9】
（ａ）ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること、（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること、
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること、
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること、
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること、
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること、
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること、
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること、
中の一つ又は複数に使用され、
好ましくは、
前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくは、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんであることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記医薬組成物は、ｐｉＲＮＡ阻害剤などのｐｉＲＮＡを標的とする薬物を含まず、及び／又は、前記医薬組成物は、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する薬物を含まず、好ましくは、
前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合をブロックする薬物は、前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物、好ましくは前記ＰＩＷＩ上のｐｉＲＮＡとの結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物、及び／又は、好ましくは、前記ｐｉＲＮＡ上のＰＩＷＩとの結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物であり、
より好ましくは、
前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合をブロックする薬物は、前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合部位に設計された阻害剤、好ましくは、ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡとの結合部位に設計された阻害剤、及び／又はｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩとの結合部位に設計された阻害剤である、
ことを特徴とする請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記医薬組成物は、医薬補助剤をさらに含み、及び／又は、前記医薬組成物は、他の薬物をさらに含み、前記他の薬物は、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療する薬物であり、
及び／又は、前記医薬組成物は、請求項１～７のいずれか一項に記載の一つ又は複数の薬物から構成される、
ことを特徴とする請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療する方法であって、前記方法は、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物及び／又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物を使用することにより診断及び／又は治療することを含み、
好ましくは、
前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんであり、及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む、
ことを特徴とする。
【請求項13】
前記薬物及び／又は医薬組成物は、（ａ）がん細胞の増殖を阻害すること、
（ｂ）がん細胞周期のランニングを阻害すること、
（ｃ）がん細胞の移動を阻害すること、
（ｄ）がんの腫瘍形成能を阻害すること、
（ｅ）がんの生体内での転移能を阻害すること、
（ｆ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること、
（ｇ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること、
中の一つ又は複数の機序によって診断及び／又は治療することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の診断及び／又は治療における、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物及び／又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、
前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、
及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
及び／又は、前記薬物及び／又は医薬組成物は、
（ａ）がん細胞の増殖を阻害すること、
（ｂ）がん細胞周期のランニングを阻害すること、
（ｃ）がん細胞の移動を阻害すること、
（ｄ）がんの腫瘍形成能を阻害すること、
（ｅ）がんの生体内での転移能を阻害すること、
（ｆ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること、
（ｇ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること、
中の一つ又は複数の機序によって診断及び／又は治療する使用。
【請求項15】
ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の診断及び／又は治療する薬物の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物及び／又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、
前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、
及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
及び／又は、前記薬物及び／又は医薬組成物は、
（ａ）がん細胞の増殖を阻害すること、
（ｂ）がん細胞周期のランニングを阻害すること、
（ｃ）がん細胞の移動を阻害すること、
（ｄ）がんの腫瘍形成能を阻害すること、
（ｅ）がんの生体内での転移能を阻害すること、
（ｆ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること、
（ｇ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること、
中の一つ又は複数の機序によって診断及び／又は治療する使用。
【請求項16】
癌細胞の増殖阻害、癌細胞周期のランニング阻害、癌細胞の移動阻害、癌の腫瘍形成能の阻害、癌の生体内での転移能の阻害、癌のシグナル伝達経路調節、及び／又は癌細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路調節の方法であって、前記方法は、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物及び／又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物を使用して阻害及び／又は調節することを含み、
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
ことを特徴とする使用。
【請求項17】
癌細胞の増殖阻害、癌細胞周期のランニング阻害、癌細胞の移動阻害、癌の腫瘍形成能の阻害、癌の生体内での転移能の阻害、癌のシグナル伝達経路調節、及び／又は癌細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路調節における、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物及び／又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む使用。
【請求項18】
癌細胞の増殖阻害、癌細胞周期のランニング阻害、癌細胞の移動阻害、癌の腫瘍形成能の阻害、癌の生体内での転移能の阻害、癌のシグナル伝達経路調節、及び／又は癌細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路調節の薬物の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物及び／又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む使用。
【請求項19】
請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物及び／又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物のスクリーニングにおける、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の使用であって、好ましくは、
前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である使用。
【請求項20】
請求項１～７のいずれか一項に記載の薬物及び／又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物のスクリーニングにおける、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する細胞株の使用であって、好ましくは、
前記薬物は小分子物質であり、例えば、小分子化合物などの小分子化学物質、又は小分子活性ペプチドなどの小分子生物学的物質であり；前記小分子化合物は、好ましくは、化合物の薬学的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在し、
及び／又は、前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質であり、
及び／又は、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスであり、
及び／又は、前記細胞株は胃がん細胞株であり、好ましくはＳＮＵ－１、ＳＮＵ－１６及び／又はＡＧＳであり、
及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１を含む使用。
【請求項21】
ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌のバイオマーカー及び／又は治療標的としてのＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の使用であって、好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１を含み、及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんである使用。
【請求項22】
ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の検出及び／又は診断に使用されるバイオマーカーであって、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を含み、
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであるマーカー。
【請求項23】
ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を検出及び／又は診断するキットであって、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を検出する抗体を含み、
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであるキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本出願は、出願日が２０２０／４／２９である中国特許出願２０２０１０３５９７５７５の優先権を主張する。本願は、当該中国特許出願の全文を引用する。
［技術分野］
本発明は、ＰＩＷＩ、特にＰＩＷＩＬ１及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質が、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌、特に胃がんにおける診断及び治療に関する。
［技術分野］
本発明は、ＰＩＷＩ、特にＰＩＷＩＬ１及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質が、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌、特に胃がんにおける診断及び治療に関する。
【0002】
［背景技術］
胃がんは最も一般的な悪性腫瘍の一つであり、予後が比較的悪く、人々の健康に深刻な脅威をもたらす。国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）の統計によると、２０１２年の世界の胃がん新規発生数は約９５万１千人、胃がんによる死亡数は約７２万３千人で、それぞれは悪性腫瘍の発生率では５位、死亡率では３位にランクされている。２０１２年、中国における胃がんの新規発生数は約４２万４千件、死亡数は約２９万８千件で、悪性腫瘍の中では２番目に多い発生率となっている（１）。胃がんは手術と化学療法を中心とした集学的治療が中心で、胃全摘術や胃亜全摘術にＤ２リンパ節郭清を組み合わせた治療法が、胃がんの標準術式として徐々に受け入れられてきている。根治手術ができない進行胃がんの患者には、化学療法が生存期間を延長するための主な手段である（２）。ネオアジュバント化学療法後の全生存率は向上しているものの、総合効率は低く、患者の予後は不良である。そこで近年、胃がん、特に進行胃がんの治療に対する新しいアプローチとして遺伝子標的治療が注目されている。現在、米国ＦＤＡによって承認された胃がん標的治療薬はトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）という３つのモノクローナル抗体である。ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂはＨＥＲ２（３、４）を標的とし、ＲａｍｕｃｉｒｕｍａｂはＶＥＧＦＲ２（５－７）を標的とし、ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂはＰＤ－１（８）を標的としている。これらの標的薬物は、他のがん種の標的治療において一定のブレークスルーを果たしたものの、胃がん、特に進行性胃がんに対しては有効ではなく、臨床使用にはまだ大きな限界がある。また、これらの薬物の標的遺伝子は、正常な細胞や生体内で広く発現し、重要な生理的機能を担っているため、これを標的とすると、必然的に正常な細胞や生体機能に害を与えることになる。したがって、胃がん治療において、正常な胃の細胞や組織では発現していない、あるいはほとんど発現していない、より特異的に胃がん細胞で発現している標的を発見し同定することが急務であり、この遺伝子を標的とすることにより、正常組織や細胞へのダメージを最小限に抑えながら胃がん細胞を効果的に殺傷することが可能となる。
胃がんは最も一般的な悪性腫瘍の一つであり、予後が比較的悪く、人々の健康に深刻な脅威をもたらす。国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）の統計によると、２０１２年の世界の胃がん新規発生数は約９５万１千人、胃がんによる死亡数は約７２万３千人で、それぞれは悪性腫瘍の発生率では５位、死亡率では３位にランクされている。２０１２年、中国における胃がんの新規発生数は約４２万４千件、死亡数は約２９万８千件で、悪性腫瘍の中では２番目に多い発生率となっている（１）。胃がんは手術と化学療法を中心とした集学的治療が中心で、胃全摘術や胃亜全摘術にＤ２リンパ節郭清を組み合わせた治療法が、胃がんの標準術式として徐々に受け入れられてきている。根治手術ができない進行胃がんの患者には、化学療法が生存期間を延長するための主な手段である（２）。ネオアジュバント化学療法後の全生存率は向上しているものの、総合効率は低く、患者の予後は不良である。そこで近年、胃がん、特に進行胃がんの治療に対する新しいアプローチとして遺伝子標的治療が注目されている。現在、米国ＦＤＡによって承認された胃がん標的治療薬はトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）という３つのモノクローナル抗体である。ＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂはＨＥＲ２（３、４）を標的とし、ＲａｍｕｃｉｒｕｍａｂはＶＥＧＦＲ２（５－７）を標的とし、ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂはＰＤ－１（８）を標的としている。これらの標的薬物は、他のがん種の標的治療において一定のブレークスルーを果たしたものの、胃がん、特に進行性胃がんに対しては有効ではなく、臨床使用にはまだ大きな限界がある。また、これらの薬物の標的遺伝子は、正常な細胞や生体内で広く発現し、重要な生理的機能を担っているため、これを標的とすると、必然的に正常な細胞や生体機能に害を与えることになる。したがって、胃がん治療において、正常な胃の細胞や組織では発現していない、あるいはほとんど発現していない、より特異的に胃がん細胞で発現している標的を発見し同定することが急務であり、この遺伝子を標的とすることにより、正常組織や細胞へのダメージを最小限に抑えながら胃がん細胞を効果的に殺傷することが可能となる。
【0003】
ＰＩＷＩ（Ｐ－ｅｌｅｍｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｍｐｙ ｔｅｓｔｉｓ）タンパク質は、Ａｒｇｏｎａｕｔスーパーファミリーのブランチで、ヒトではＰＩＷＩＬ１（ｐｉｗｉ ｌｉｋｅ ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ １）、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及びＰＩＷＩＬ４という四つのメンバーが含まれ、マウスではＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２及びＰＩＷＩＬ４が含まれ、ショウジョウバエではＰＩＷＩが含まれている。ＰＩＷＩは１９９７年に林海帆教授によってショウジョウバエで初めて同定され、そのよく知られた変異体表現型‐Ｐ因子トランスポゾン誘発精巣不活化（Ｐ－ｅｌｅｍｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｍｐｙ ｔｅｓｔｉｓ）にちなんで命名された（９）。ＰＩＷＩは生殖幹細胞の維持と自己複製に重要な役割を果たしている。ＰＩＷＩタンパク質はＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡｓ、ｐｉＲＮＡ）と呼ばれる非コードｓｍａｌｌＲＮＡと結合する（１０－１３）。ＰＩＷＩの既知の古典的な調節方式は、ＰＩＷＩがｐｉＲＮＡと結合してエフェクター複合体、即ちｐｉＲＮＡ誘導サイレンシングを形成し、エピジェネティック制御、転写後制御など様々な分子制御に関与し、生殖細胞発生、配偶子形成、幹細胞自己複製、トランスポゾン阻害、ゲノム完全性などに必要である（１４－１９）。ＰＩＷＩタンパク質は、海綿動物からヒトまで幅広い生物で発現しており、これらの生物では、ＰＩＷＩタンパク質とｐｉＲＮＡは生殖細胞系に優位に発現し、ヒトのＰＩＷＩタンパク質はすべて雄の生殖細胞系に優位に発現し、生殖細胞系以外の体組織にはほとんど発現していない。ＰＩＷＩＬ１などのＰＩＷＩは、胃がん組織を含む様々な腫瘍組織で高発現していることが文献で報告された（２０－２３）。しかし、ＰＩＷＩが動物のｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍、特に胃腫瘍の形成と転移の両方を促進するように機能することは先行技術のどこにも開示されておらず、癌におけるＰＩＷＩの調節メカニズム、及びそれがｐｉＲＮＡ依存的又はｐｉＲＮＡ非依存的にその生物学的機能を発揮するかは不明であるため、癌標的治療におけるＰＩＷＩの適用モードを明確にすることは不可能である。
【0004】
［発明の概要］
本発明が解決しようとする技術的課題は、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌（例えば胃がん）を効果的に治療できる薬物が存在しないなどの従来技術の欠点を克服し、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌（例えば胃がん）の治療における薬物、医薬組成物の使用を提供することである。本発明に記載の薬物、医薬組成物を、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌（例えば胃がん）の治療に使用すると、癌、特に胃がんの治療に有効なだけでなく、特異性が高く、正常細胞や身体機能にも害を与えないことができる。
本発明が解決しようとする技術的課題は、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌（例えば胃がん）を効果的に治療できる薬物が存在しないなどの従来技術の欠点を克服し、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌（例えば胃がん）の治療における薬物、医薬組成物の使用を提供することである。本発明に記載の薬物、医薬組成物を、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌（例えば胃がん）の治療に使用すると、癌、特に胃がんの治療に有効なだけでなく、特異性が高く、正常細胞や身体機能にも害を与えないことができる。
【0005】
先行技術では、ＰＩＷＩＬ１などのＰＩＷＩが胃がん組織を含む様々な腫瘍組織で高発現していることが報告されているだけであるが、ＰＩＷＩＬ１などのＰＩＷＩが高発現するがん、特に胃がんにおいて生体内で腫瘍形成及び転移を促進する機能を有することは当業者にとって明らかでない。先行技術で知られているＰＩＷＩの古典的な調節方式は、ＰＩＷＩがｐｉＲＮＡと結合してエフェクター複合体、即ちｐｉＲＮＡ誘導サイレンシングを形成することである。ＰＩＷＩ阻害の目的を達成するために、当業者は通常、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの両方を標的とする阻害剤の製造を検討するが、ｐｉＲＮＡはあまりにも多様で、その配列は比較的短く、ｓｍａｌｌＲＮＡのカテゴリーに属するため、ｐｉＲＮＡを標的とする阻害剤の設計が非常に困難である。本発明者は、幅広い実験により、ＰＩＷＩの高発現する癌細胞、特に胃がん細胞ではｐｉＲＮＡがほとんど存在しないこと、ＰＩＷＩＬ１などのＰＩＷＩが、ｐｉＲＮＡに依存せず、ＮＭＤ複合体と相乗的な制御によりＰＩＷＩの高発現する癌細胞、特に胃がん細胞の増殖・移動を制御できることを発見し、従来の現場の見方や技術的な偏りから脱却した。したがって、ＰＩＷＩを標的とする薬物及び／又はＮＭＤ複合体を標的とする薬物等を設計し、ＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質の結合を阻害する薬物を設計し、ＰＩＷＩの発現を低減する薬物及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の発現を低減する薬物等を設計すれば、非常に難しいｐｉＲＮＡ等を標的とする阻害剤の設計を必要とせずにＰＩＷＩの高発現する癌、特に胃がんを有効に治療できる可能性がある。
【0006】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第一様態において、以下の一つ又は複数の用途に使用されるＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質の結合を阻害する薬物を提供する。
（ａ）ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること。
（ａ）ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること。
【0007】
（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること。
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること。
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること。
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること。
【0008】
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること。
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること。
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
【0009】
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
【0010】
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
【0011】
好ましくは、前記薬物は、前記ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質の結合部位を変異及び／又は阻害することにより、（ＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質の結合）をブロックする薬物である。より好ましくは、前記薬物は、前記ＰＩＷＩ上の前記ＮＭＤ複合体タンパク質と結合する結合部位を変異及び／又は阻害することにより、（ＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質の結合）をブロックする薬物である。より好ましくは、前記薬物は、前記ＮＭＤ複合体上の前記ＰＩＷＩと結合する結合部位を変異及び／又は阻害することにより、（ＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質の結合）をブロックする薬物である。
【0012】
好ましくは、前記薬物は、前記ＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質との結合部位に設計された阻害剤である。より好ましくは、前記薬物は、ＰＩＷＩ上の前記ＮＭＤ複合体タンパク質に結合する部位に設計されたＰＩＷＩＬ１阻害剤、ＰＩＷＩＬ２阻害剤、ＰＩＷＩＬ３阻害剤及び／又はＰＩＷＩＬ４阻害剤などの阻害剤である。より好ましくは、前記薬物は、ＮＭＤ複合体タンパク質上の前記ＰＩＷＩに結合する結合部位に設計されたＵＰＦ１阻害剤、ＵＰＦ２阻害剤、ＳＭＧ１阻害剤、ＵＰＦ３阻害剤、ＳＭＧ５阻害剤、ＳＭＧ６阻害剤及び／又はＳＭＧ７阻害剤の阻害剤であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１阻害剤である。
【0013】
好ましくは、前記薬物は、低分子物質（低分子阻害剤であってもよく、一般に競合低分子阻害剤である）、例えば、低分子化合物のような低分子化学物質、又は低分子活性ペプチドのような低分子生物学的物質である。ここで、前記低分子化合物は、好ましくは化合物の薬学的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在する。
【0014】
好ましくは、前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質である。
好ましくは、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである。
好ましくは、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである。
【0015】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第二様態において、以下の一つ又は複数の用途に使用されるＰＩＷＩを標的とする薬物及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を標的とする薬物を提供する。
【0016】
（ａ）ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること。
（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること。
（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること。
【0017】
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること。
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
【0018】
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること。
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
【0019】
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
【0020】
好ましくは、前記ＰＩＷＩを標的とする薬物は、例えばＰＩＷＩＬ１阻害剤、ＰＩＷＩＬ２阻害剤、ＰＩＷＩＬ３阻害剤及び／又はＰＩＷＩＬ４阻害剤のようなＰＩＷＩ阻害剤である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質を標的とする薬物は、ＮＭＤ複合体タンパク質阻害剤、例えば、ＵＰＦ１阻害剤、ＵＰＦ２阻害剤、ＳＭＧ１阻害剤、ＵＰＦ３阻害剤、ＳＭＧ５阻害剤、ＳＭＧ６阻害剤及び／又はＳＭＧ７阻害剤であり、例えばＮＭＤＩ－１４、ＮＭＤＩ１及び／又はＶＧ１である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質を標的とする薬物は、ＮＭＤ複合体タンパク質阻害剤、例えば、ＵＰＦ１阻害剤、ＵＰＦ２阻害剤、ＳＭＧ１阻害剤、ＵＰＦ３阻害剤、ＳＭＧ５阻害剤、ＳＭＧ６阻害剤及び／又はＳＭＧ７阻害剤であり、例えばＮＭＤＩ－１４、ＮＭＤＩ１及び／又はＶＧ１である。
【0021】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記薬物は、低分子物質（低分子阻害剤であってもよく、一般に競合低分子阻害剤である）、例えば、低分子化合物のような低分子化学物質、又は低分子活性ペプチドのような低分子生体物質であり、前記低分子化合物は、好ましくは化合物の医薬的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の医薬的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在する。
好ましくは、前記薬物は、低分子物質（低分子阻害剤であってもよく、一般に競合低分子阻害剤である）、例えば、低分子化合物のような低分子化学物質、又は低分子活性ペプチドのような低分子生体物質であり、前記低分子化合物は、好ましくは化合物の医薬的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の医薬的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在する。
【0022】
好ましくは、前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質である。
好ましくは、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである。
好ましくは、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである。
【0023】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第三様態において、以下の一つ又は複数の用途に使用されるＰＩＷＩの発現量を低下させる薬物及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の発現量を低下させる薬物を提供する。
【0024】
（ａ）ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること。
（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること。
（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること。
【0025】
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること。
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
【0026】
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること。
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
【0027】
好ましくは、前記ＰＩＷＩの発現量を低下させる薬物は、ＰＩＷＩの遺伝子をサイレンシング、ダウンレギュレーション及び／又はノックアウトする薬物である。
好ましくは、ＮＭＤ複合体タンパク質の発現量を低下させる薬物は、ＮＭＤ複合体タンパク質の遺伝子をサイレンシング、ダウンレギュレーション及び／又はノックアウトする薬物である。
好ましくは、ＮＭＤ複合体タンパク質の発現量を低下させる薬物は、ＮＭＤ複合体タンパク質の遺伝子をサイレンシング、ダウンレギュレーション及び／又はノックアウトする薬物である。
【0028】
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
【0029】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記薬物は、低分子物質（低分子阻害剤であってもよく、一般に競合低分子阻害剤である）、例えば、低分子化合物のような低分子化学物質、又は低分子活性ペプチドのような低分子生体物質であり、前記低分子化合物は、好ましくは化合物の医薬的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の医薬的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在する。
好ましくは、前記薬物は、低分子物質（低分子阻害剤であってもよく、一般に競合低分子阻害剤である）、例えば、低分子化合物のような低分子化学物質、又は低分子活性ペプチドのような低分子生体物質であり、前記低分子化合物は、好ましくは化合物の医薬的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の医薬的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在する。
【0030】
好ましくは、前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質である。
好ましくは、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである。
好ましくは、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである。
【0031】
上記第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物において、ｐｉＲＮＡ阻害剤等のｐｉＲＮＡを標的とする薬物を含まない薬物であってもよく；及び／又は、前記医薬組成物が、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する薬物を含まない薬物であってもよい。
【0032】
好ましくは、
ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する前記薬物は、前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物であり、好ましくは前記ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡと結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物、及び／又は好ましくは前記ｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩと結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物である。
ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する前記薬物は、前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物であり、好ましくは前記ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡと結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物、及び／又は好ましくは前記ｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩと結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物である。
【0033】
より好ましくは、
ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する前記薬物は、前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合部位に設計された阻害剤であり、好ましくは、ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡに結合する結合部位に設計された阻害剤、及び／又はｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩに結合する結合部位に設計された阻害剤である。
ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する前記薬物は、前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合部位に設計された阻害剤であり、好ましくは、ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡに結合する結合部位に設計された阻害剤、及び／又はｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩに結合する結合部位に設計された阻害剤である。
【0034】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第四様態において、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物を含有する医薬組成物を提供する。
好ましくは、前記医薬組成物は、以下の一つ又は複数の用途に使用される。
好ましくは、前記医薬組成物は、以下の一つ又は複数の用途に使用される。
【0035】
（ａ）ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること。
（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること。
（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること。
【0036】
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること。
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
【0037】
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること。
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
【0038】
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
【0039】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記医薬組成物は、ｐｉＲＮＡ阻害剤などのｐｉＲＮＡを標的とする薬物を含まない。
好ましくは、前記医薬組成物は、ｐｉＲＮＡ阻害剤などのｐｉＲＮＡを標的とする薬物を含まない。
【0040】
好ましくは、前記医薬組成物は、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する薬物を含まない。
ここで、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する前記薬物は、前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物、好ましくは前記ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡに結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物であり、及び／又は好ましくは前記ｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩと結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物である。
ここで、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する前記薬物は、前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物、好ましくは前記ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡに結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物であり、及び／又は好ましくは前記ｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩと結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによってブロックする薬物である。
【0041】
ここで、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合を阻害する前記薬物は、前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合部位に設計された阻害剤であり、好ましくは、ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡに結合する結合部位に設計された阻害剤であり、及び／又はｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩに結合する結合部位に設計された阻害剤である。
【0042】
好ましくは、前記医薬組成物は、医薬補助剤をさらに含む。
好ましくは、前記医薬組成物は、他の薬物をさらに含み；前記他の薬物は、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療する薬物である。
好ましくは、前記医薬組成物は、他の薬物をさらに含み；前記他の薬物は、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療する薬物である。
【0043】
好ましくは、前記医薬組成物は、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物の一つ又は複数から構成される。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第五様態において、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物及び／又は本発明の第四様態に記載の医薬組成物によって診断及び／又は治療することを含むＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療する方法を提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第五様態において、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物及び／又は本発明の第四様態に記載の医薬組成物によって診断及び／又は治療することを含むＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療する方法を提供する。
【0044】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
【0045】
好ましくは、前記薬物及び／又は医薬組成物は、以下の一つ又は複数の機序によって診断及び／又は治療を行う。
（ａ）がん細胞の増殖を阻害すること。
（ａ）がん細胞の増殖を阻害すること。
【0046】
（ｂ）がん細胞周期のランニングを阻害すること。
（ｃ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｄ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
（ｃ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｄ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
【0047】
（ｅ）がんの体内での転移能を阻害すること。
（ｆ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｇ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
（ｆ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｇ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
【0048】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第六様態においてＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の診断及び／又は治療における、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物、及び／又は本発明の第四様態に記載の医薬組成物の使用を提供する。
【0049】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
【0050】
好ましくは、前記薬物及び／又は医薬組成物は、以下の一つ又は複数の機序によって診断及び／又は治療を行う。
（ａ）がん細胞の増殖を阻害すること。
（ａ）がん細胞の増殖を阻害すること。
【0051】
（ｂ）がん細胞周期のランニングを阻害すること。
（ｃ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｄ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
（ｃ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｄ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
【0052】
（ｅ）がんの体内での転移能を阻害すること。
（ｆ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｇ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
（ｆ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｇ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
【0053】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第七様態において、胃がんの診断及び／又は治療の薬物の製造における、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物及び／又は本発明の第四様態に記載の医薬組成物の使用を提供する。具体的には、胃がんの診断及び／又は治療の薬物の製造における、ＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質の結合を阻害する薬物（第一様態に記載）及び／又は前記薬物を含む医薬組成物（第四様態に記載）の使用であり；胃がんの診断及び／又は治療の薬物の製造における、ＰＩＷＩを標的とする薬物及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を標的とする薬物（第二様態に記載）及び／又は前記薬物を含む医薬組成物（第四様態に記載）の使用である。胃がんの診断及び／又は治療の薬物の製造における、ＰＩＷＩの発現量を低下させる薬物及び／又はＮＭＤ複合タンパクの発現量を低下させる薬物（第三様態に記載）、及び／又は前記薬物を含む医薬組成物（第四様態に記載）の使用である。
【0054】
好ましくは、前記胃がんは、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
【0055】
好ましくは、前記薬物及び／又は薬物組成物は、以下の一つ又は複数の機序によって診断及び／又は治療を行う。
（ａ）がん細胞の増殖を阻害すること。
（ａ）がん細胞の増殖を阻害すること。
【0056】
（ｂ）がん細胞周期のランニングを阻害すること。
（ｃ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｄ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
（ｃ）がん細胞の移動を阻害すること。
（ｄ）がんの腫瘍形成能を阻害すること。
【0057】
（ｅ）がんの体内での転移能を阻害すること。
（ｆ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｇ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
（ｆ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること。
（ｇ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること。
【0058】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第八様態において、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物及び／又は本発明の第四様態に記載の医薬組成物によって阻害及び／又は調節を行うこと含むステップを特徴とする癌細胞増殖の阻害、癌細胞周期のランニングの阻害、癌細胞移動の阻害、癌の腫瘍形成能の阻害、癌の生体内での転移能の阻害、癌細胞周期のシグナル伝達経路の調節、及び／又は癌細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路の調節する方法を提供する。
【0059】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
【0060】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第九様態において、癌細胞増殖の阻害、癌細胞周期のランニングの阻害、癌細胞移動の阻害、癌の腫瘍形成能の阻害、癌の生体内での転移能の阻害、癌細胞周期のシグナル伝達経路の調節、及び／又は癌細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路の調節における、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物及び／又は本発明の第四様態に記載の医薬組成物の使用を提供する。
【0061】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
【0062】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十様態において、癌細胞増殖の阻害、癌細胞周期のランニングの阻害、癌細胞移動の阻害、癌の腫瘍形成能の阻害、癌の生体内の転移能の阻害、癌細胞周期のシグナル伝達経路の調節、及び／又は癌細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路の調節する薬物の製造における、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物及び／又は本発明の第四様態に記載の医薬組成物の使用を提供する。
【0063】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
【0064】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十一様態において、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物及び／又は本発明の第四様態に記載の医薬組成物のスクリーニングにおける、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の使用を提供する。
【0065】
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
【0066】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十二様態において、本発明の第一様態、第二様態及び／又は第三様態に記載の薬物及び／又は本発明の第四様態に記載の医薬組成物のスクリーニングにおける、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する細胞株の使用を提供する。
【0067】
好ましくは、前記薬物は、低分子物質（低分子阻害剤であってもよく、一般に競合低分子阻害剤である）、例えば、低分子化合物のような低分子化学物質、又は低分子活性ペプチドのような低分子生体物質であり、前記低分子化合物は好ましくは、化合物の医薬的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の医薬的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形での形態で存在する。
【0068】
好ましくは、前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質である。
好ましくは、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである。
好ましくは、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである。
【0069】
好ましくは、前記細胞株は胃がん細胞株であり、好ましくはＳＮＵ－１、ＳＮＵ－１６及び／又はＡＧＳである。本出願人は、ＳＮＵ－１、ＳＮＵ－１６等の細胞株がＰＩＷＩＬ１を高発現する細胞株であることを初めて発見した。
【0070】
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
【0071】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十三様態において、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質がＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌のバイオマーカー及び／又は治療標的としての使用を提供する。
【0072】
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
【0073】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十四様態において、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を含むことを特徴とする、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の検出及び／又は診断のためのバイオマーカーを提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十四様態において、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を含むことを特徴とする、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の検出及び／又は診断のためのバイオマーカーを提供する。
【0074】
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
【0075】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十五様態において、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を検出する抗体を含むことを特徴とする、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の検出及び／又は診断する試薬キットを提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第十五様態において、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を検出する抗体を含むことを特徴とする、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の検出及び／又は診断する試薬キットを提供する。
【0076】
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含む。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
好ましくは、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である。
【0077】
好ましくは、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんである。
本発明において、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ、ＮＭＤ）は、転写物の品質（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｑｕａｌｉｔｙ）及び存在量を調節する真核生物の必須プロセスであり、胚発生や癌の進行を含む様々なプロセスに関連している。ＮＭＤタンパク質複合体は、ＵＰＦ１（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ １）、ＵＰＦ２（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ２）及びＵＰＦ３（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ３）の３つのコアコンポーネントから構成される。ＳＭＧ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＳＭＧ１）によるコアＮＭＤコンポーネントＵＰＦ１のリン酸化は、ＮＭＤにとって重要である。
本発明において、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ、ＮＭＤ）は、転写物の品質（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｑｕａｌｉｔｙ）及び存在量を調節する真核生物の必須プロセスであり、胚発生や癌の進行を含む様々なプロセスに関連している。ＮＭＤタンパク質複合体は、ＵＰＦ１（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ １）、ＵＰＦ２（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ２）及びＵＰＦ３（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ３）の３つのコアコンポーネントから構成される。ＳＭＧ１（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＳＭＧ１）によるコアＮＭＤコンポーネントＵＰＦ１のリン酸化は、ＮＭＤにとって重要である。
【0078】
本発明において、ＮＭＤ複合体タンパク質を標的とする前記薬物は、ＮＭＤ複合体タンパク質阻害剤であってもよく、例えば、ＮＭＤＩ－１４（エチル２－（（（６，７－ジメチル－３－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロ－２－キノキサリニル）アセチル）アミノ）－４，５－ジメチル－３－チオペネカルボキシレート，ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊の阻害剤１４、Ｅｔｈｙｌ２－（（（６，７－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－３－ｏｘｏ－１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２－ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｙｌ）ａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏ）－４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－３－ｔｈｉｏｐｈｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ，Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｃａｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １４）、ＮＭＤＩ１４はＳＭＧ７タンパク質のポケットを標的にして、ＳＭＧ７－ＵＰＦ１相互作用を阻害する；例えば、ＮＭＤＩ１（ＵＰＦ１のＳＭＧ５とのインターカレーションを阻害）及び／又は例えばＶＧ１（ＵＰＦ１のＳＭＧ５とのインターカレーションを阻害）（Ｖｉｃｔｏｒｉａ Ｊ． Ｂ． Ｇｏｔｈａｍ，ｅｔｃ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ，Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，１４，１５５９－１５６３）である。
【0079】
本発明において、前記ＰＩＷＩタンパク質ファミリーは、ヒトではＰＩＷＩＬ１（ｐｉｗｉ ｌｉｋｅ ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ １［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ｈｕｍａｎ）］、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／９２７１，ｇｅｎｅＩＤ：９２７１）、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及びＰＩＷＩＬ４という四つのメンバーがあり、マウスではＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ４のみがあり、ショウジョウバエではＰＩＷＩのみ（詳細はｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／？ｔｅｒｍ＝ＰＩＷＩ参照）がある。
【0080】
本発明において、前記「特定の物質（例えばタンパク質）を標的とする薬物」は、特定の物質（例えばタンパク質）と結合する薬物として理解される。前記「特定の物質（例えばＰＩＷＩタンパク質又はＮＭＤ複合体タンパク質）を標的とする阻害剤」は、特定の物質（例えばＰＩＷＩタンパク質又はＮＭＤ複合体タンパク質）に結合することによって阻害効果を有する製剤として理解される。
【0081】
本発明において、「包括、含む、含有」とは、後に挙げられた成分に加えて他の成分を含有することを意味してもよく、「．．．．．．からなる」、即ち後に挙げた成分のみを含み、他の成分を含有しないことを意味してもよい。
【0082】
当分野の常識に基づくと、上記の好ましい各条件を任意に組み合わせて、本発明の好ましい実施例を得ることができる。
本発明で使用する試薬や原料は、すべて市販されているものである。
本発明で使用する試薬や原料は、すべて市販されているものである。
【0083】
本発明の積極的な進歩的効果は、本明細書に記載の薬物、医薬組成物をＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌、特に胃がんの治療に適用した場合、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌の治療に有効なだけでなく、特異性が高く、正常細胞及び生体機能に害を与えないことである。
【図面の簡単な説明】
【0084】
【図1】六つの異なる胃がん細胞株と一つの正常胃上皮細胞株におけるＰＩＷＩＬ１のｍＲＮＡ発現を示す。
【図2】六つの異なる胃がん細胞株、一つの正常胃上皮細胞株及び陽性対照マウスの精巣におけるＰＩＷＩＬ１のタンパク質発現を示す。
【図3】免疫蛍光測定の結果から、ＰＩＷＩＬ１のタンパク質は主に胃がん細胞の細胞質に局在していることがわかる。
【図4】胃がん患者の正常組織とがん組織のペア９７組の臨床サンプルにおけるＰＩＷＩＬ１のｍＲＮＡ発現を示す。
【図5】胃がん組織マイクロアレイのペア１０４サンプルにおけるＰＩＷＩＬ１タンパク質の発現とＰＩＷＩＬ１のタンパク質発現部位を示す。
【図6】ＰＩＷＩＬ１の発現が腫瘍のグレードや転移と正の相関があり、腫瘍組織の分化度と負の相関があることを示す。
【図7】ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を用いて、胃がん細胞ＳＮＵ－１においてＰＩＷＩＬ１が成功にノックアウトされたことを示す。
【図8】ＰＩＷＩＬ１を正常の血清濃度又は低血清濃度の飢餓状態でノックアウトすると、胃がん細胞ＳＮＵ－１の増殖が有意に阻害され、５％ＦＢＳの低血清濃度ではより顕著に阻害されることを示す。
【図9】ＰＩＷＩＬ１をノックアウトすることで、胃がん細胞の細胞周期のＧ１／Ｓ期移行が阻害されることを示す。
【図10】ＰＩＷＩＬ１をノックアウトすることで、胃がん細胞の細胞移動が阻害されることを示す。
【図11】ＰＩＷＩＬ１をノックアウトすることで、ヌードマウスにおける胃がん細胞の皮下腫瘍形成が阻害されることを示す。
【図12】ＰＩＷＩＬ１をノックアウトすることで、ヌードマウスにおける胃がん細胞のがん転移が阻害されることを示す。
【図13】野生型ＰＩＷＩＬ１細胞とノックアウトＰＩＷＩＬ１細胞の複数セットのディープＲＮＡシーケンシングとバイオインフォーマティックＷＧＣＮＡ解析により、ＰＩＷＩＬ１によって制御される４１のモジュラー遺伝子グループがあることを発見したことを示す。
【図14】ＰＩＷＩＬ１によって制御されるすべての遺伝子グループの中、ブルーモジュールとターコイズモジュールの遺伝子グループが、ＰＩＷＩＬ１のこの特徴に最も関連し、ＰＩＷＩＬ１によって最も有意に制御される二つの遺伝子グループであることを示す。これら二つの遺伝子グループのシグナル伝達経路を解析した結果、最も重要なクラスターが、細胞周期と細胞フォーカルアドヒージョンの細胞間接着に関連するシグナル伝達経路であることを示す。
【図15】細胞周期に関連するいくつかの重要な癌促進遺伝子のｍＲＮＡ発現がＰＩＷＩＬ１ノックアウトによって阻害されたこと、及び細胞移動に関連するいくつかの重要な腫瘍阻害遺伝子のｍＲＮＡ発現がＰＩＷＩＬ１ノックアウトによって上昇したことを示す。
【図16】ＰＩＷＩタンパク質を高発現する胃がん細胞ＳＮＵ－１では、ｐｉＲＮＡの発現がほとんど検出されず、ＰＩＷＩＬ１の濃縮したｐｉＲＮＡも検出できないことを示す。
【図17】ｐｉＲＮＡとの結合能を欠いたＰＩＷＩＬ１変異体でも、野生型ＰＩＷＩＬ１と同様にＰＩＷＩＬ１下流標的遺伝子を制御し、胃がんにおける発がん性生物機能を発揮できることを示す。
【図18】ＰＩＷＩＬ１共免疫沈降結合タンパク質プロファイルの実験結果は、ＰＩＷＩＬ１がＵＰＦ１タンパク質と結合できることを示す。
【図19】ＰＩＷＩＬ１がナンセンスｍＲＮＡ分解経路（ＮＭＤ）複合体タンパク質ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１及び活性化ＵＰＦ１（リン酸化ＵＰＦ１）を共免疫沈降させることを示す。
【図20】免疫蛍光の結果は、ＮＭＤ経路が働くオルガネラＰボディにおいて、ＰＩＷＩＬ１がＵＰＦ１と共局在化できることを示す。
【図21】ＵＰＦ１への結合を担うＰＩＷＩＬ１の特異的結合領域、及びこの結合領域の破壊がＰＩＷＩＬ１のＵＰＦ１への結合を著しく阻害すること、一方、ｐｉＲＮＡの結合部位の破壊はＰＩＷＩＬ１のＵＰＦ１への結合に影響を与えないことを示す。
【図22】ＵＰＦ１への結合能力の喪失が、細胞移動に関連するいくつかの下流腫瘍阻害遺伝子でのＰＩＷＩＬ１の発現と調節に大きく影響し、胃がん細胞の細胞移動でのＰＩＷＩＬ１の調節に大きく影響することを示す。
【図23】パターン図は生殖器系ＰＩＷＩタンパク質とは異なり、ｐｉＲＮＡとともにＰＩＷＩ－ｐｉＲＮＡ複合体を形成して重要な生物機能を発揮していることを示す。胃がん細胞には、ＰＩＷＩＬ１の古典的なパートナーであるｐｉＲＮＡがほとんど存在せず、ＰＩＷＩＬ１はＮＭＤ経路など他の経路を通じて胃がん細胞の増殖、移動、腫瘍形成、腫瘍の生体内での転移の制御を実現する。
【発明を実施するための形態】
【0085】
［具体的な実施方式］
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれによって実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、特定の条件が示されていない実験方法は、従来の方法及び条件に従うか、又は取引説明書に従って選択される。
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれによって実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、特定の条件が示されていない実験方法は、従来の方法及び条件に従うか、又は取引説明書に従って選択される。
【0086】
実施例１ 胃がん細胞及び胃がん組織におけるＰＩＷＩＬ１の高発現
１．１ 胃がん細胞におけるＰＩＷＩＬ１のｍＲＮＡ発現
六つの異なる胃がん細胞株（ＡＧＳ、ＨＧＣ－２７、Ｎ８７、ＳＮＵ－５、ＳＮＵ－１６、ＳＮＵ－１）及び一つの正常胃上皮細胞（ＧＥＳ－１）からＲＮＡを抽出し、逆転写により対応するｃＤＮＡを得て、定量ＰＣＲによりＰＩＷＩＬ１及びβ－ＡｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現量を測定した。各サンプルについて、β－Ａｃｔｉｎの発現量を内部基準としてＰＩＷＩＬ１の相対発現量を算出した
１．１ 胃がん細胞におけるＰＩＷＩＬ１のｍＲＮＡ発現
六つの異なる胃がん細胞株（ＡＧＳ、ＨＧＣ－２７、Ｎ８７、ＳＮＵ－５、ＳＮＵ－１６、ＳＮＵ－１）及び一つの正常胃上皮細胞（ＧＥＳ－１）からＲＮＡを抽出し、逆転写により対応するｃＤＮＡを得て、定量ＰＣＲによりＰＩＷＩＬ１及びβ－ＡｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現量を測定した。各サンプルについて、β－Ａｃｔｉｎの発現量を内部基準としてＰＩＷＩＬ１の相対発現量を算出した
【0087】
【数1】
【0088】
【数2】
【0089】
【数3】
【0090】
【数4】
【0091】
１．２ 胃がん細胞におけるＰＩＷＩＬ１のタンパク質発現と局在性
六つの異なる胃がん細胞株（ＡＧＳ、ＨＧＣ－２７、Ｎ８７、ＳＮＵ－５、ＳＮＵ－１６、ＳＮＵ－１）及び一つの正常胃上皮細胞（ＧＥＳ－１）からタンパク質を抽出した。ＰＩＷＩＬ１及びβ－Ａｃｔｉｎのタンパク質発現は、免疫ブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）で検出した。図２は、ＰＩＷＩＬ１の異なる胃がん細胞におけるタンパク質発現が、正常胃上皮細胞よりも高いことを示す。
六つの異なる胃がん細胞株（ＡＧＳ、ＨＧＣ－２７、Ｎ８７、ＳＮＵ－５、ＳＮＵ－１６、ＳＮＵ－１）及び一つの正常胃上皮細胞（ＧＥＳ－１）からタンパク質を抽出した。ＰＩＷＩＬ１及びβ－Ａｃｔｉｎのタンパク質発現は、免疫ブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）で検出した。図２は、ＰＩＷＩＬ１の異なる胃がん細胞におけるタンパク質発現が、正常胃上皮細胞よりも高いことを示す。
【0092】
ＰＩＷＩＬ１抗体を一次抗体として、ＰＩＷＩＬ１のｍＲＮＡとタンパク質発現量が最も高い細胞株であるＳＮＵ－１について免疫蛍光実験を実施した。図３の濃い蛍光シグナルがＰＩＷＩＬ１のタンパク質シグナルであり、薄い蛍光シグナルが細胞核ＤＡＰＩのシグナルであり、図３から、ＰＩＷＩＬ１が主に胃がん細胞の細胞質に大量に発現していることがわかった。
【0093】
１．３ 胃がん組織におけるＰＩＷＩＬ１のｍＲＮＡ発現
腫瘍組織と正常組織の臨床サンプル９７組を採取し、ＲＮＡを抽出し、逆転写により対応するｃＤＮＡを得た後、定量ＰＣＲによりＰＩＷＩＬ１及びβ－ＡｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現量を測定した。各サンプルについて、β－Ａｃｔｉｎの発現量を内部参照として各サンプルのＰＩＷＩＬ１の相対発現量
腫瘍組織と正常組織の臨床サンプル９７組を採取し、ＲＮＡを抽出し、逆転写により対応するｃＤＮＡを得た後、定量ＰＣＲによりＰＩＷＩＬ１及びβ－ＡｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現量を測定した。各サンプルについて、β－Ａｃｔｉｎの発現量を内部参照として各サンプルのＰＩＷＩＬ１の相対発現量
【0094】
【数5】
【0095】
【数6】
【0096】
【数7】
【0097】
【数8】
【0098】
１．４ 胃がん組織におけるＰＩＷＩＬ１のタンパク質発現と局在性
胃がん患者１０４人の組織マイクロアレイにおけるＰＩＷＩＬ１タンパク質の発現を免疫組織化学（ＩＨＣ）染色で調べ、茶色のシグナルはＰＩＷＩＬ１の陽性シグナルである。マッチした正常組織と比較して、図５の左図（Ａ）はＰＩＷＩＬ１免疫組織化学法の代表的な図であり、当該図には、胃がん組織におけるＰＩＷＩＬ１タンパク質の発現がマッチした正常組織よりも有意に高く、ＰＩＷＩＬ１シグナルのほとんどが細胞質内に存在することを示した。図５右上のボックスプロット（Ｂ）は、胃がんのペア１０４組の腫瘍と正常組織におけるＰＩＷＩＬ１発現に基づくＩＨＣスコアの組織マイクロアレイであり、染色強度（０～３の範囲）とＰＩＷＩＬ１陽性細胞の割合に基づいて組織マイクロアレイ上の各組織点を０～４でスコアリングした。ＩＨＣスコア＝染色強度スコア×ＰＩＷＩＬ１陽性細胞数パーセンテージのスコアである。ＰＩＷＩＬ１免疫組織化学染色陽性スコアをスコア化することにより、胃がん組織では対応する正常組織に比べてＰＩＷＩＬ１スコアが有意に高いことが判明された。図５右下（Ｃ）は、胃がん組織（Ｔ）のＰＩＷＩＬ１ ＩＨＣスコアが対応する正常組織（Ｎ）のスコアより高い、等しい又は低いサンプル数を統計することで、がん組織のＰＩＷＩＬ１発現スコアが正常組織より高いペアサンプル数（Ｔ＞Ｎ）が、正常組織より低いサンプル数（Ｔ＜Ｎ）よりはるかに高いことがわかった。
胃がん患者１０４人の組織マイクロアレイにおけるＰＩＷＩＬ１タンパク質の発現を免疫組織化学（ＩＨＣ）染色で調べ、茶色のシグナルはＰＩＷＩＬ１の陽性シグナルである。マッチした正常組織と比較して、図５の左図（Ａ）はＰＩＷＩＬ１免疫組織化学法の代表的な図であり、当該図には、胃がん組織におけるＰＩＷＩＬ１タンパク質の発現がマッチした正常組織よりも有意に高く、ＰＩＷＩＬ１シグナルのほとんどが細胞質内に存在することを示した。図５右上のボックスプロット（Ｂ）は、胃がんのペア１０４組の腫瘍と正常組織におけるＰＩＷＩＬ１発現に基づくＩＨＣスコアの組織マイクロアレイであり、染色強度（０～３の範囲）とＰＩＷＩＬ１陽性細胞の割合に基づいて組織マイクロアレイ上の各組織点を０～４でスコアリングした。ＩＨＣスコア＝染色強度スコア×ＰＩＷＩＬ１陽性細胞数パーセンテージのスコアである。ＰＩＷＩＬ１免疫組織化学染色陽性スコアをスコア化することにより、胃がん組織では対応する正常組織に比べてＰＩＷＩＬ１スコアが有意に高いことが判明された。図５右下（Ｃ）は、胃がん組織（Ｔ）のＰＩＷＩＬ１ ＩＨＣスコアが対応する正常組織（Ｎ）のスコアより高い、等しい又は低いサンプル数を統計することで、がん組織のＰＩＷＩＬ１発現スコアが正常組織より高いペアサンプル数（Ｔ＞Ｎ）が、正常組織より低いサンプル数（Ｔ＜Ｎ）よりはるかに高いことがわかった。
【0099】
１．５ 胃がん組織におけるＰＩＷＩＬ１の発現は、胃がんの臨床病理学的進行と密接に関連する。
ペアとなった９７組の臨床サンプルにおけるＰＩＷＩＬ１のｍＲＮＡ発現を、胃がん組織の病理情報（腫瘍期、ＴＮＭ転移、分化度）と相関させて分析し、図５からＰＩＷＩＬ１の発現は胃がんの腫瘍期及び転移と正の相関があり、ＰＩＷＩＬ１の発現が高いほど、患者の胃がんの病期が高くなり、転移が多くなり、腫瘍の悪性度が高くなることが示された。ＰＩＷＩＬ１の発現は胃がんの分化度とも負の相関があり、ＰＩＷＩＬ１の発現が高いほど、胃がんの分化度が低く、腫瘍の悪性度が高い。この結果は、ＰＩＷＩＬ１の発現が胃がんの悪性度や腫瘍の進行と密接に関係していることを示唆している。図６において、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶは腫瘍のステージ１～４を示す。Ｎ０：リンパ節転移がない。Ｎ：リンパ節転移があり、Ｎ１、Ｎ２及びＮ３を含む；Ｍ：遠位転移がある。ｐ：低分化であり、Ｍ：中分化であり、Ｈ：高分化である。ＳＥは標準エラー値を示す。
ペアとなった９７組の臨床サンプルにおけるＰＩＷＩＬ１のｍＲＮＡ発現を、胃がん組織の病理情報（腫瘍期、ＴＮＭ転移、分化度）と相関させて分析し、図５からＰＩＷＩＬ１の発現は胃がんの腫瘍期及び転移と正の相関があり、ＰＩＷＩＬ１の発現が高いほど、患者の胃がんの病期が高くなり、転移が多くなり、腫瘍の悪性度が高くなることが示された。ＰＩＷＩＬ１の発現は胃がんの分化度とも負の相関があり、ＰＩＷＩＬ１の発現が高いほど、胃がんの分化度が低く、腫瘍の悪性度が高い。この結果は、ＰＩＷＩＬ１の発現が胃がんの悪性度や腫瘍の進行と密接に関係していることを示唆している。図６において、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶは腫瘍のステージ１～４を示す。Ｎ０：リンパ節転移がない。Ｎ：リンパ節転移があり、Ｎ１、Ｎ２及びＮ３を含む；Ｍ：遠位転移がある。ｐ：低分化であり、Ｍ：中分化であり、Ｈ：高分化である。ＳＥは標準エラー値を示す。
【0100】
以上より、本実施例では、ＰＩＷＩＬｌが胃がん患者の臨床組織や様々な胃がん細胞株において、正常組織や細胞株と比較して特異的に高発現していることが示された。本発明により、胃がん細胞株ＳＮＵ－１がＰＩＷＩＬ１の発現量が非常に高い細胞株であることが初めて示された。ＰＩＷＩＬ１の高い存在量発現の胃がん細胞株ＳＮＵ－１は、ＰＩＷＩＬ１を治療標的とする新規薬物のスクリーニングに有効なツールとなり得る。スクリーニングされる分子は、タンパク質、抗体、化学的低分子、漢方薬、植物や動物エキスである（これらに限定されない）。さらに、本実施例では、胃がん患者の病理病期が高いほどＰＩＷＩＬｌの発現が高く、転移の程度が高いほどＰＩＷＩＬｌの発現が高く、組織分化の程度が低いほどＰＩＷＩＬｌの発現が高いことを反映して、ＰＩＷＩＬｌの発現が胃がん臨床経過の悪性度と密接に関連し、ＰＩＷＩＬ１が胃がん診断ステージングのための分子マーカーとしを期待されることがわかった。
【0101】
［材料方法］
ＲＮＡ抽出と定量ＰＣＲ
１．１及び１．２のサンプルのＲＮＡ抽出法では、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡを単離し、特定の方法はメーカーの指示に従う。ＲＮＡはＡＢＩ大容量ｃＤＮＡ逆転写キットを用いてｃＤＮＡに逆転写した（ＡＢＩ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３６８８１４）。定量的ＲＴ－ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ－ＲａｄリアルタイムＰＣＲシステム（ｉＱＴＭ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＳｕｐｅｒｍｉｘとＣＦＸ９６ＴＭリアルタイムシステム）のプロトコルにしたがって行った。定量的ＰＣＲプライマー配列を表１に示された。
ＲＮＡ抽出と定量ＰＣＲ
１．１及び１．２のサンプルのＲＮＡ抽出法では、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡを単離し、特定の方法はメーカーの指示に従う。ＲＮＡはＡＢＩ大容量ｃＤＮＡ逆転写キットを用いてｃＤＮＡに逆転写した（ＡＢＩ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４３６８８１４）。定量的ＲＴ－ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ－ＲａｄリアルタイムＰＣＲシステム（ｉＱＴＭ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＳｕｐｅｒｍｉｘとＣＦＸ９６ＴＭリアルタイムシステム）のプロトコルにしたがって行った。定量的ＰＣＲプライマー配列を表１に示された。
【0102】
細胞培養と臨床サンプル
ＳＮＵ－５細胞株は、２０％牛胎児血清を添加したＩＭＤＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１９８００３０）で培養した。ＳＮＵ－１、ＳＮＵ－１６、Ｎ８７及びＨＧＣ－２７細胞株は、１０％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、６１８７００３６）で培養した。ＡＧＳ細胞株は、１０％牛胎児血清を添加したＡＴＣＣ製造Ｆ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ、３０－２００４）で培養した。ＧＥＳ－１細胞株は、１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１９９５０６５）で培養した。これらの細胞株はすべて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
ＳＮＵ－５細胞株は、２０％牛胎児血清を添加したＩＭＤＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１９８００３０）で培養した。ＳＮＵ－１、ＳＮＵ－１６、Ｎ８７及びＨＧＣ－２７細胞株は、１０％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、６１８７００３６）で培養した。ＡＧＳ細胞株は、１０％牛胎児血清を添加したＡＴＣＣ製造Ｆ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ、３０－２００４）で培養した。ＧＥＳ－１細胞株は、１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１９９５０６５）で培養した。これらの細胞株はすべて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0103】
９７組の臨床サンプルは、中国科学院健康科学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組織バンクから購入した。この研究は、現地の倫理委員会の承認を得て、その規定に従ったものである。
【0104】
タンパク質インプリンティング解析
トータルタンパク質は、溶解バッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ＃Ｉ８８９６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ ｍＭ ＤＴＴ、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ－ ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号４６９３１３２００１）とＰｈｏｓＳｔｏｐタブレット（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号４９０６８３７００１）］で抽出した。タンパク質サンプルを４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｃａｔ＃１６１０７４７）で（３：１に）希釈し、９８℃、５分間加熱した。ＴＧＸ Ｆａｓｔ Ｃａｓｔアクリルアミドキット（７．５％或いは１０％（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１６１０１７３ＴＡ））を用いて１２０Ｖでタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＰＶＨ０００１０）に０．３Ａで１．５時間電解転写した。膜は室温で５％ ＤｉｆｃｏＴＭ Ｓｋｉｍ 脱脂乳（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３２１００）で２時間密閉した後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０添加のＴＢＳ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１７０６４３５）で希釈した（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２９１１３）。ＰＩＷＩＬ１ 抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１０５６）は１：１０００希釈で使用した。
トータルタンパク質は、溶解バッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ＃Ｉ８８９６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ ｍＭ ＤＴＴ、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ－ ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号４６９３１３２００１）とＰｈｏｓＳｔｏｐタブレット（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号４９０６８３７００１）］で抽出した。タンパク質サンプルを４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｃａｔ＃１６１０７４７）で（３：１に）希釈し、９８℃、５分間加熱した。ＴＧＸ Ｆａｓｔ Ｃａｓｔアクリルアミドキット（７．５％或いは１０％（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１６１０１７３ＴＡ））を用いて１２０Ｖでタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＰＶＨ０００１０）に０．３Ａで１．５時間電解転写した。膜は室温で５％ ＤｉｆｃｏＴＭ Ｓｋｉｍ 脱脂乳（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３２１００）で２時間密閉した後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０添加のＴＢＳ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１７０６４３５）で希釈した（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－２９１１３）。ＰＩＷＩＬ１ 抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１０５６）は１：１０００希釈で使用した。
【0105】
免疫蛍光
２×１０５個の細胞を２４ウェルプレートのカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ、１２－５４５－８３）に接種した。２４時間後、細胞をＰＢＳで三回洗浄し、４％ホルムアルデヒド（ポリオキシメチレン粉末、９５％、１５８１２７－２．５ ＫＧ、Ｓｉｇｍａ）で１５分間、室温で固定した。固定された細胞を氷冷したＰＢＳＴ（１％ Ｔｗｅｅｎ ２０添加ＰＢＳ）で三回洗浄（各洗浄５分間）し、ＰＢＳＴ中の３％ ＢＳＡで室温で２時間閉じた後、ＰＢＳＴで一回洗浄し、抗ＰＩＷＩＬ１（Ａｂｃａｍ、カタログ番号 ａｂ１８１０５６、１：１００希釈）、抗ｈＤｃｐ１ａ（５６－Ｙ）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－１００７０６、１：５００希釈）及び抗ＵＰＦ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、３％ＢＳＡで４℃で一晩、Ｃａｔ ＃１２０４０１：２００希釈）をインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳＴで５回、それぞれ５分間洗浄した。細胞を、３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴに溶解された二次抗体：ＦＩＴＣに結合されたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１５－０９５－００３、１：１００希釈）又はＦＩＴＣに結合されたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１１－０９５－００３、１：１００希釈）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４がカップリングされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１１５－５８５－００３、Ｃａｔ＃１：４００希釈）又はロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度交差吸着二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃Ａ１００４３、１：５００希釈）を室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで５分間の洗浄を一回行った。次にＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄ１３０６、１：５０００希釈）をＰＢＳＴバッファに加え、室温で１０分間インキュベートし、その後ＰＢＳＴで５分間ずつ三回洗浄した。カバースリップを一回剥がし、ＦｌｕｏｒＰｒｅｓｅｒｖｅＴＭ（Ｍｅｒｃｋ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号３４５７８７－２５ＭＬＣＮ）を１滴加え、スライドにマウントして軽く押し、マニキュアでシールして４℃で一晩保管してから共焦点免疫蛍光顕微鏡検査に供した（Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ７１０）。
２×１０５個の細胞を２４ウェルプレートのカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ、１２－５４５－８３）に接種した。２４時間後、細胞をＰＢＳで三回洗浄し、４％ホルムアルデヒド（ポリオキシメチレン粉末、９５％、１５８１２７－２．５ ＫＧ、Ｓｉｇｍａ）で１５分間、室温で固定した。固定された細胞を氷冷したＰＢＳＴ（１％ Ｔｗｅｅｎ ２０添加ＰＢＳ）で三回洗浄（各洗浄５分間）し、ＰＢＳＴ中の３％ ＢＳＡで室温で２時間閉じた後、ＰＢＳＴで一回洗浄し、抗ＰＩＷＩＬ１（Ａｂｃａｍ、カタログ番号 ａｂ１８１０５６、１：１００希釈）、抗ｈＤｃｐ１ａ（５６－Ｙ）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－１００７０６、１：５００希釈）及び抗ＵＰＦ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、３％ＢＳＡで４℃で一晩、Ｃａｔ ＃１２０４０１：２００希釈）をインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳＴで５回、それぞれ５分間洗浄した。細胞を、３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴに溶解された二次抗体：ＦＩＴＣに結合されたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１５－０９５－００３、１：１００希釈）又はＦＩＴＣに結合されたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１１－０９５－００３、１：１００希釈）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４がカップリングされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１１５－５８５－００３、Ｃａｔ＃１：４００希釈）又はロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度交差吸着二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃Ａ１００４３、１：５００希釈）を室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで５分間の洗浄を一回行った。次にＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄ１３０６、１：５０００希釈）をＰＢＳＴバッファに加え、室温で１０分間インキュベートし、その後ＰＢＳＴで５分間ずつ三回洗浄した。カバースリップを一回剥がし、ＦｌｕｏｒＰｒｅｓｅｒｖｅＴＭ（Ｍｅｒｃｋ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号３４５７８７－２５ＭＬＣＮ）を１滴加え、スライドにマウントして軽く押し、マニキュアでシールして４℃で一晩保管してから共焦点免疫蛍光顕微鏡検査に供した（Ｚｅｉｓｓ、ＬＳＭ７１０）。
【0106】
免疫組織化学
ヒト胃がん組織マイクロアレイ（Ｃａｔ＃ＨＳｔｍ－Ｃａｎ０９０ＰＴ－０１）はＳｈａｎｇｈａｉ ＳｕｐｅｒＣｈｉｐ社から購入した。免疫組織化学用のマウス腫瘍は、異種移植マウスから採取し、厚さ１０μｍの連続切片に切り出し、スライドに固定した。脱ろう、再水和、抗原修復、内因性ペルオキシダーゼのブロッキング後、切片又は組織マイクロアレイをＰＢＳで５分ずつ三回洗浄し、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び５％正常ヤギ血清を添加した０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳで１時間ブロッキングを行った。その後、抗ＰＩＷＩＬ１抗体（Ａｔｌａｓ抗体、ＨＰＡ０１８７９８、１：１０００希釈）、又は抗ＰＣＮＡ抗体（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、ＧＢ１１０１０－１、１：１０００希釈）又は抗Ｋｉ６７抗体（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、ＧＢ１３０３０－２、１：３００希釈）を４℃で一晩添加した。０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳで簡単に洗浄した後、切片をホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギ免疫グロブリンＧ（１：５００）を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳに２時間暴露し、その後、トリス－塩酸（ｐＨ７．６）中の０．００３％ Ｈ２Ｏ２と０．０３％ ３，－ジアミノベンジジンを追加した。各サンプルの免疫組織化学は、少なくとも三回独立な時間で実施し、すべての切片をヘマトキシリンで再染色した。
ヒト胃がん組織マイクロアレイ（Ｃａｔ＃ＨＳｔｍ－Ｃａｎ０９０ＰＴ－０１）はＳｈａｎｇｈａｉ ＳｕｐｅｒＣｈｉｐ社から購入した。免疫組織化学用のマウス腫瘍は、異種移植マウスから採取し、厚さ１０μｍの連続切片に切り出し、スライドに固定した。脱ろう、再水和、抗原修復、内因性ペルオキシダーゼのブロッキング後、切片又は組織マイクロアレイをＰＢＳで５分ずつ三回洗浄し、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び５％正常ヤギ血清を添加した０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳで１時間ブロッキングを行った。その後、抗ＰＩＷＩＬ１抗体（Ａｔｌａｓ抗体、ＨＰＡ０１８７９８、１：１０００希釈）、又は抗ＰＣＮＡ抗体（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、ＧＢ１１０１０－１、１：１０００希釈）又は抗Ｋｉ６７抗体（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、ＧＢ１３０３０－２、１：３００希釈）を４℃で一晩添加した。０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳで簡単に洗浄した後、切片をホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギ免疫グロブリンＧ（１：５００）を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳに２時間暴露し、その後、トリス－塩酸（ｐＨ７．６）中の０．００３％ Ｈ２Ｏ２と０．０３％ ３，－ジアミノベンジジンを追加した。各サンプルの免疫組織化学は、少なくとも三回独立な時間で実施し、すべての切片をヘマトキシリンで再染色した。
【0107】
実施例２ ＰＩＷＩＬ１は生体内で胃がん細胞の増殖、移動、腫瘍形成及び転移を促進
２．１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９テクノロジーによる胃がん細胞ＳＮＵ－１でのＰＩＷＩＬ１のノックアウトの成功
ＰＩＷＩＬ１遺伝子配列を標的とする一対のｓｇＲＮＡをｐＧＬ３－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ－ＰＧＫ－プリノマイシンベクターにクローニングした。ｐＧＬ３－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ－ＰＧＫ－プリノマイシン及びｐＳＴ１３７４－Ｎ－ＮＬＳ－ｆｌａｇ－ｌｉｎｋｅｒ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａは黄行許教授から贈られた（Ａｄｇｅｎｅプラスミド＃５１１３３；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：５１１３３；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ：５１１３３）。黄行許教授のＮａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓの文章の方法（２４）に基づいて、構築したＰＩＷＩＬ１－ｓｇＲＮＡプラスミドとＣａｓ９プラスミドをＳＮＵ－１細胞に共導入し、トランスフェクション後４８時間に、プリノマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）とブラストサイジンＳ（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ）によるダブルキルによって細胞モノクローン選択を実施した。選択したモノクローナルクローンからゲノムを抽出し、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト同定のためにゲノムＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を配列決定して野生型ＰＩＷＩＬ１遺伝子配列を比較し、クローン化したＰＩＷＩＬ１遺伝子配列に欠失があるか又は挿入変異によりＰＩＷＩＬ１タンパク質をコードするアミノ酸がシフトし、早期停止コドンが発生してＰＩＷＩＬ１タンパク質の翻訳が停止していないかを調べた。ＰＩＷＩＬ１抗体認識のためのイムノブロッティング実験とＰＩＷＩＬ１変異クローンのシークエンスにより、胃がん細胞ＳＮＵ－１においてＰＩＷＩＬ１のノックアウトに成功したことを明らかにした（図７）。ｓｇＲＮＡとＰＩＷＩＬ１ノックアウトゲノムＰＣＲプライマーを表２に示す。
２．１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９テクノロジーによる胃がん細胞ＳＮＵ－１でのＰＩＷＩＬ１のノックアウトの成功
ＰＩＷＩＬ１遺伝子配列を標的とする一対のｓｇＲＮＡをｐＧＬ３－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ－ＰＧＫ－プリノマイシンベクターにクローニングした。ｐＧＬ３－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ－ＰＧＫ－プリノマイシン及びｐＳＴ１３７４－Ｎ－ＮＬＳ－ｆｌａｇ－ｌｉｎｋｅｒ－Ｃａｓ９－Ｄ１０Ａは黄行許教授から贈られた（Ａｄｇｅｎｅプラスミド＃５１１３３；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：５１１３３；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ：５１１３３）。黄行許教授のＮａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓの文章の方法（２４）に基づいて、構築したＰＩＷＩＬ１－ｓｇＲＮＡプラスミドとＣａｓ９プラスミドをＳＮＵ－１細胞に共導入し、トランスフェクション後４８時間に、プリノマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）とブラストサイジンＳ（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ）によるダブルキルによって細胞モノクローン選択を実施した。選択したモノクローナルクローンからゲノムを抽出し、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト同定のためにゲノムＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を配列決定して野生型ＰＩＷＩＬ１遺伝子配列を比較し、クローン化したＰＩＷＩＬ１遺伝子配列に欠失があるか又は挿入変異によりＰＩＷＩＬ１タンパク質をコードするアミノ酸がシフトし、早期停止コドンが発生してＰＩＷＩＬ１タンパク質の翻訳が停止していないかを調べた。ＰＩＷＩＬ１抗体認識のためのイムノブロッティング実験とＰＩＷＩＬ１変異クローンのシークエンスにより、胃がん細胞ＳＮＵ－１においてＰＩＷＩＬ１のノックアウトに成功したことを明らかにした（図７）。ｓｇＲＮＡとＰＩＷＩＬ１ノックアウトゲノムＰＣＲプライマーを表２に示す。
【0108】
２．２ ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによる胃がん細胞増殖の阻害
ＭＴＳ細胞増殖モニタリング実験は、ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト細胞クローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウト細胞クローン＃３７をそれぞれ、正常血清濃度１０％及び飢餓血清濃度５％の二つの条件下で実施した。ＰＩＷＩＬ１非ノックアウト細胞とノックアウト細胞の細胞増殖の差異を比較した。図８は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトが胃がん細胞の増殖を有意に阻害し、特に血清飢餓条件下ではこの差が顕著になることを示す。
ＭＴＳ細胞増殖モニタリング実験は、ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト細胞クローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウト細胞クローン＃３７をそれぞれ、正常血清濃度１０％及び飢餓血清濃度５％の二つの条件下で実施した。ＰＩＷＩＬ１非ノックアウト細胞とノックアウト細胞の細胞増殖の差異を比較した。図８は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトが胃がん細胞の増殖を有意に阻害し、特に血清飢餓条件下ではこの差が顕著になることを示す。
【0109】
２．３ ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによる胃がん細胞の周期ランニング阻害
ＰＩ染色による細胞周期アッセイ実験は、ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト細胞クローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウト細胞クローン＃３７をそれぞれフローサイトメトリーで測定して実施した。図９は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトが胃がん細胞ＳＮＵ－１の細胞周期Ｇ１／Ｓ期移行を有意に阻害することを示す。
ＰＩ染色による細胞周期アッセイ実験は、ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト細胞クローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウト細胞クローン＃３７をそれぞれフローサイトメトリーで測定して実施した。図９は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトが胃がん細胞ＳＮＵ－１の細胞周期Ｇ１／Ｓ期移行を有意に阻害することを示す。
【0110】
２．４ ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによる胃がん細胞の移動阻害
トランスウェル細胞移動アッセイにより、ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃３７の細胞をそれぞれ写真観察しながら緑色蛍光色素で移動する細胞数を計数した。図１０は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトが胃がん細胞ＳＮＵ－１の細胞移動を有意に阻害することを示す。
トランスウェル細胞移動アッセイにより、ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃３７の細胞をそれぞれ写真観察しながら緑色蛍光色素で移動する細胞数を計数した。図１０は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトが胃がん細胞ＳＮＵ－１の細胞移動を有意に阻害することを示す。
【0111】
２．５ ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによる胃がん細胞の生体内の腫瘍形成能阻害
ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃３７の細胞を各群５匹ずつヌードマウスに皮下投与し、体重と腫瘍の成長を週一回観察した。図１１は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞は、野生型ＰＩＷＩＬ１胃がん細胞に比べて、マウスの皮下で腫瘍になる能力が非常に低いことを示す。
ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃３７の細胞を各群５匹ずつヌードマウスに皮下投与し、体重と腫瘍の成長を週一回観察した。図１１は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞は、野生型ＰＩＷＩＬ１胃がん細胞に比べて、マウスの皮下で腫瘍になる能力が非常に低いことを示す。
【0112】
２．６ ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによる胃がん細胞の生体内の転移阻害
ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃３７の細胞に、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）とＧＦＰ緑色蛍光を共に持つウイルスを感染させ、フローサイトメトリーソーティングによりルシフェラーゼとＧＦＰの二重陽性細胞を取得した。これら４群の陽性標識細胞群をヌードマウスの胃に尾静脈注射した。各群５匹である。週間隔で写真を撮影し、マウスの腫瘍転移の大きさを表すルシフェラーゼの蛍光強度をモニターした。図１２は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞は、野生型ＰＩＷＩＬ１胃がん細胞に比べて、マウス体内での転移能が非常に低いことを示す。
ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃２０及びＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃３７の細胞に、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）とＧＦＰ緑色蛍光を共に持つウイルスを感染させ、フローサイトメトリーソーティングによりルシフェラーゼとＧＦＰの二重陽性細胞を取得した。これら４群の陽性標識細胞群をヌードマウスの胃に尾静脈注射した。各群５匹である。週間隔で写真を撮影し、マウスの腫瘍転移の大きさを表すルシフェラーゼの蛍光強度をモニターした。図１２は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞は、野生型ＰＩＷＩＬ１胃がん細胞に比べて、マウス体内での転移能が非常に低いことを示す。
【0113】
以上、本実施例により、胃がん細胞におけるＰＩＷＩＬｌのノックアウトが、細胞増殖、周期ランニング、細胞移動を有意に阻害し、胃がんの腫瘍原性能及びマウスでの生体内の転移能を強く阻害することが実証された。
【0114】
［材料方法］
細胞増殖アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６＿ＡＱｕｅｏｕｓ ＭＴＳ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－ｙｒ）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈテトラゾリウム（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｒ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、内塩）試薬粉末（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１１１１）を用い、メーカーの指示に従って細胞増殖率を測定した。ＥｎＳｐｉｒｅ＿ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、４９０ｎｍの吸光度を読み取った。
トランスウェル移動アッセイ
クロスウェルアッセイは、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋＴＭ 細胞培養インサート（Ｆａｌｃｏｎ、３５１１５２）を用いて、メーカーのプロトコルに従って実施した。各ウェルに１×１０５個の細胞を接種し、３時間後に細胞を染色し、写真を撮った。
細胞増殖アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６＿ＡＱｕｅｏｕｓ ＭＴＳ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－ｙｒ）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈテトラゾリウム（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｒ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、内塩）試薬粉末（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１１１１）を用い、メーカーの指示に従って細胞増殖率を測定した。ＥｎＳｐｉｒｅ＿ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、４９０ｎｍの吸光度を読み取った。
トランスウェル移動アッセイ
クロスウェルアッセイは、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋＴＭ 細胞培養インサート（Ｆａｌｃｏｎ、３５１１５２）を用いて、メーカーのプロトコルに従って実施した。各ウェルに１×１０５個の細胞を接種し、３時間後に細胞を染色し、写真を撮った。
【0115】
生体内腫瘍形成能アッセイ
５週齢の雄ヌードマウスを標準的な条件下で飼育した。ＳＮＵ－１胃がん細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。この細胞５×１０６個をヌードマウスの右腹部皮下に注射した。腫瘍の成長を７日ごとに測定し、腫瘍の体積を推定した（体積＝長さ×幅×高さ×０．５２３６）。腫瘍はエーテル麻酔をかけたマウスから採取した。すべての手順は『実験動物の飼育と使用の手引き』（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ８０－２３、１９９６年改訂版）に準じ、上海科技大学動物管理と使用委員会の承認を得ている。
５週齢の雄ヌードマウスを標準的な条件下で飼育した。ＳＮＵ－１胃がん細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。この細胞５×１０６個をヌードマウスの右腹部皮下に注射した。腫瘍の成長を７日ごとに測定し、腫瘍の体積を推定した（体積＝長さ×幅×高さ×０．５２３６）。腫瘍はエーテル麻酔をかけたマウスから採取した。すべての手順は『実験動物の飼育と使用の手引き』（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ８０－２３、１９９６年改訂版）に準じ、上海科技大学動物管理と使用委員会の承認を得ている。
【0116】
生体内転移能アッセイ
ＳＮＵ－１胃がん細胞株を、独立したＧＦＰオープンリーディングフレームを含むルシフェラーゼｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するレンチウイルスで標識した。ルシフェラーゼの発現は、蛍光剤（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）と生体内イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて測定した。ルシフェラーゼを発現するＰＩＷＩＬ１－ＷＴ又はＰＩＷＩＬ１－ＫＯのＳＮＵ－１細胞を尾静脈から注射した（１００μｌＰＢＳ中での１×１０６）後、マウスの全身状態及び体重をモニターした。転移は隔週でモニターした。撮影の１０分前に蛍光剤の水溶液（１５０ ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を注射し、その後マウスをＦｏｒａｎｅ（Ａｂｂｏｔｔ社）で麻酔をかけた。マウスをＣＣＤカメラシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）上の不透明なチャンバーに入れ、動物内のルシフェラーゼ発現細胞から放出される光子を、イゴール（Ｉｇｏｒ）（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、シアトル、ワシントン）オーバーレイ用ソフトウェアプログラムＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて１分間検出した。すべての手順は『実験動物の飼育と使用の手引き』（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ８０－２３、１９９６年改訂版）に準じ、上海科技大学動物管理と使用委員会の承認を得ている。
ＳＮＵ－１胃がん細胞株を、独立したＧＦＰオープンリーディングフレームを含むルシフェラーゼｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するレンチウイルスで標識した。ルシフェラーゼの発現は、蛍光剤（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）と生体内イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて測定した。ルシフェラーゼを発現するＰＩＷＩＬ１－ＷＴ又はＰＩＷＩＬ１－ＫＯのＳＮＵ－１細胞を尾静脈から注射した（１００μｌＰＢＳ中での１×１０６）後、マウスの全身状態及び体重をモニターした。転移は隔週でモニターした。撮影の１０分前に蛍光剤の水溶液（１５０ ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を注射し、その後マウスをＦｏｒａｎｅ（Ａｂｂｏｔｔ社）で麻酔をかけた。マウスをＣＣＤカメラシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）上の不透明なチャンバーに入れ、動物内のルシフェラーゼ発現細胞から放出される光子を、イゴール（Ｉｇｏｒ）（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、シアトル、ワシントン）オーバーレイ用ソフトウェアプログラムＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて１分間検出した。すべての手順は『実験動物の飼育と使用の手引き』（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ８０－２３、１９９６年改訂版）に準じ、上海科技大学動物管理と使用委員会の承認を得ている。
【0117】
実施例３ ＰＩＷＩＬ１が多くの腫瘍関連シグナル伝達経路、特に細胞周期シグナル伝達経路とフォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節
３．１ ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃２０、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃３７の細胞からＲＮＡを抽出
ＷＴ／ＫＯ２０＃、ＫＯ－Ｃｏｎ／ＫＯ－３７＃、ＷＴ／３７＃、ＫＯ－Ｃｏｎ／ＫＯ－２０＃、ＷＴ／ＫＯ２０＃で選別し、５群をＲＮＡディープシーケンシングに供した。５群の細胞のＲＮＡディープシーケンシングのデータをバイオインフォーマティックにＷＧＣＮＡ解析した結果、ＰＩＷＩＬ１によって制御される遺伝子群のモジュールが４１個あることが図１３に示された。ＰＩＷＩＬ１発現モジュールエイジゲンを持つ遺伝子又は持たない遺伝子と形質との相関を分析し、図１３のヒートマップ中の赤はモジュールと形質との正の相関、青は負の相関を表し、各セルには対応する相関値及び有意Ｐ値を記載し、これに基づいて図１４のヒートマップでブルーモジュール（ｂｌｕｅ ｍｏｄｕｌｅ）とターコイズモジュール（ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ ｍｏｄｕｌｅ）はＰＩＷＩＬ１によって有意に調節されており、ブルーモジュール遺伝子はＰＩＷＩＬ１によって有意に正に調節され、ターコイズモジュール遺伝子はＰＩＷＩＬ１によって有意に負に調節された。両モジュール遺伝子群のｋＭＥ≧０．９コア遺伝子（ｈｕｂ ｇｅｎｅ）のＫＥＧＧシグナル経路解析の結果、ブルーモジュールのコア遺伝子は細胞周期とＤＮＡ複製経路に高度に濃縮され、ターコイズモジュールのコア遺伝子はフォーカルアドヒージョン接着と細胞接着のシグナル経路に高度に濃縮されていることが判明した。
３．１ ＰＩＷＩＬ１野生型（ＷＴ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトコントロール（ＫＯ－Ｃｏｎ）、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃２０、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトセルクローン＃３７の細胞からＲＮＡを抽出
ＷＴ／ＫＯ２０＃、ＫＯ－Ｃｏｎ／ＫＯ－３７＃、ＷＴ／３７＃、ＫＯ－Ｃｏｎ／ＫＯ－２０＃、ＷＴ／ＫＯ２０＃で選別し、５群をＲＮＡディープシーケンシングに供した。５群の細胞のＲＮＡディープシーケンシングのデータをバイオインフォーマティックにＷＧＣＮＡ解析した結果、ＰＩＷＩＬ１によって制御される遺伝子群のモジュールが４１個あることが図１３に示された。ＰＩＷＩＬ１発現モジュールエイジゲンを持つ遺伝子又は持たない遺伝子と形質との相関を分析し、図１３のヒートマップ中の赤はモジュールと形質との正の相関、青は負の相関を表し、各セルには対応する相関値及び有意Ｐ値を記載し、これに基づいて図１４のヒートマップでブルーモジュール（ｂｌｕｅ ｍｏｄｕｌｅ）とターコイズモジュール（ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ ｍｏｄｕｌｅ）はＰＩＷＩＬ１によって有意に調節されており、ブルーモジュール遺伝子はＰＩＷＩＬ１によって有意に正に調節され、ターコイズモジュール遺伝子はＰＩＷＩＬ１によって有意に負に調節された。両モジュール遺伝子群のｋＭＥ≧０．９コア遺伝子（ｈｕｂ ｇｅｎｅ）のＫＥＧＧシグナル経路解析の結果、ブルーモジュールのコア遺伝子は細胞周期とＤＮＡ複製経路に高度に濃縮され、ターコイズモジュールのコア遺伝子はフォーカルアドヒージョン接着と細胞接着のシグナル経路に高度に濃縮されていることが判明した。
【0118】
３．２これまで多くの文献がブルーモジュールの八つの癌遺伝子と、ターコイズモジュールの１０の癌遺伝子のｍＲＮＡ発現を定量ＰＣＲで定量した。図１５は、ＰＩＷＩＬ１のノックアウトにより、細胞周期に関連する八つの遺伝子のｍＲＮＡ発現が阻害され、細胞接着に関連する１０の癌遺伝子のｍＲＮＡ発現が促進されていることを示す。
【0119】
本実施例は、トランスクリプトーム研究によって、ＰＩＷＩＬｌが胃がんにおけるその生物学的表現型に関連する細胞周期及びフォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を制御し、胃がんの進行に関連する多くのがん遺伝子の発現を促進し、多くのがん遺伝子の発現を阻害することを実証している。
【0120】
［材料方法］
リボソーム除去全トランスクリプトームＲＮＡディープシーケンスとＷＧＣＮＡ分析
各細胞サンプルから１００ｎｇのトータルＲＮＡを採取し、リボソーム全トランスクリプトームのディープシーケンスによりライブラリーを構築した。ライブラリー構築に使用したキットは、ＮＥＢ社のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標） Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）で、ライブラリー構築方法はキットの説明書に忠実に従った。ライブラリーは品質管理のためにシークエンス会社に送られた。ライブラリーはＩｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑＸ装置で１５０ｂｐダブルエンドで配列決定した。その後、シークエンスデータから通り道や低品質のデータを取り除き、解析用のクリーンデータを得た。クリーンデータをＨｉｓａｔ２（２５）ソフトウェアを用いてヒトゲノム （ＧＲＣｈ３８、ＮＣＢＩ）と比較し、比較対象の遺伝子数をＨｔｓｅｑ（２６）で計算し、遺伝子発現量をＲＰＫＭに変換して求めた。ＷＧＣＮＡ発現パターン解析は、１７乗の標準的な方法ですべてのサンプルに実施した。ＷＧＣＮＡ（２７）を用いて、公開データセットで独立してネットワークを構築し、各データセットについて中心遺伝子の独立リスト（ｋＭＥ＞０．９）を生成した。バッチ間補正にはＲＵＶｓｅｑアルゴリズムが使用された。
リボソーム除去全トランスクリプトームＲＮＡディープシーケンスとＷＧＣＮＡ分析
各細胞サンプルから１００ｎｇのトータルＲＮＡを採取し、リボソーム全トランスクリプトームのディープシーケンスによりライブラリーを構築した。ライブラリー構築に使用したキットは、ＮＥＢ社のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標） Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）で、ライブラリー構築方法はキットの説明書に忠実に従った。ライブラリーは品質管理のためにシークエンス会社に送られた。ライブラリーはＩｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑＸ装置で１５０ｂｐダブルエンドで配列決定した。その後、シークエンスデータから通り道や低品質のデータを取り除き、解析用のクリーンデータを得た。クリーンデータをＨｉｓａｔ２（２５）ソフトウェアを用いてヒトゲノム （ＧＲＣｈ３８、ＮＣＢＩ）と比較し、比較対象の遺伝子数をＨｔｓｅｑ（２６）で計算し、遺伝子発現量をＲＰＫＭに変換して求めた。ＷＧＣＮＡ発現パターン解析は、１７乗の標準的な方法ですべてのサンプルに実施した。ＷＧＣＮＡ（２７）を用いて、公開データセットで独立してネットワークを構築し、各データセットについて中心遺伝子の独立リスト（ｋＭＥ＞０．９）を生成した。バッチ間補正にはＲＵＶｓｅｑアルゴリズムが使用された。
【0121】
定量的ＰＣＲプライマー配列を表１に示す。
実施例４ ＰＩＷＩＬ１はｐｉＲＮＡに非依存する方法で胃がんにおいてその機能と調節を発揮
４．１ ＰＩＷＩＬ１を高発現する胃がん細胞におけるｐｉＲＮＡの欠失
ＰＩＷＩタンパク質ファミリーのメンバーは、ｐｉＲＮＡと機能的な複合体として生物学的機能を発揮することが知られているため、ＰＩＷＩＬ１がｐｉＲＮＡに非依存する調節及び生物学的機能を有するかどうかを調べるために、ＰＩＷＩＬ１を高発現する胃がん細胞株ＳＮＵ－１でｐｉＲＮＡの発現を調査した。ＰＩＷＩＬ１を高発現する胃がん細胞においてＰＩＷＩＬ１に結合した真のｐｉＲＮＡの有無は、野生型ＰＩＷＩＬ１胃がん細胞とＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞のｓｍａｌｌ ＲＮＡディープシーケンシングを通じて、ＰＩＷＩＬ１抗体の共免疫沈降によるｐｉＲＮＡの濃縮、過沃素酸ナトリウム酸化によるｐｉＲＮＡの濃縮を組み合わせて、判定した。図１６は、全身性陽性対照マウスの精巣ではｐｉＲＮＡがかなり発現しているのに対し、ＰＩＷＩＬ１を高発現する胃がん細胞ではｐｉＲＮＡの存在がほとんど検出されないことを示す。
実施例４ ＰＩＷＩＬ１はｐｉＲＮＡに非依存する方法で胃がんにおいてその機能と調節を発揮
４．１ ＰＩＷＩＬ１を高発現する胃がん細胞におけるｐｉＲＮＡの欠失
ＰＩＷＩタンパク質ファミリーのメンバーは、ｐｉＲＮＡと機能的な複合体として生物学的機能を発揮することが知られているため、ＰＩＷＩＬ１がｐｉＲＮＡに非依存する調節及び生物学的機能を有するかどうかを調べるために、ＰＩＷＩＬ１を高発現する胃がん細胞株ＳＮＵ－１でｐｉＲＮＡの発現を調査した。ＰＩＷＩＬ１を高発現する胃がん細胞においてＰＩＷＩＬ１に結合した真のｐｉＲＮＡの有無は、野生型ＰＩＷＩＬ１胃がん細胞とＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞のｓｍａｌｌ ＲＮＡディープシーケンシングを通じて、ＰＩＷＩＬ１抗体の共免疫沈降によるｐｉＲＮＡの濃縮、過沃素酸ナトリウム酸化によるｐｉＲＮＡの濃縮を組み合わせて、判定した。図１６は、全身性陽性対照マウスの精巣ではｐｉＲＮＡがかなり発現しているのに対し、ＰＩＷＩＬ１を高発現する胃がん細胞ではｐｉＲＮＡの存在がほとんど検出されないことを示す。
【0122】
４．２ ｐｉＲＮＡ結合能を失ったＰＩＷＩＬ１タンパク質は、胃がんにおいて野生型ＰＩＷＩＬ１タンパク質と同様にがんを促進する生物学的機能及び調節を継続
既存の文献研究に基づいて、ヒトＰＩＷＩＬ１の５７２位のリジン、５８４位のグルタミン、６０７位のグルタミンの三つのアミノ酸部位は、進化的に保存されたｐｉＲＮＡ結合部位と推定されている（２８－２９）。これらの三つのアミノ酸をアラニンに変異させ、ｐｉＲＮＡ結合能が欠損されたＰＩＷＩＬ１発現プラスミドを構築した。野生型ＰＩＷＩＬ１発現プラスミドとｐｉＲＮＡ結合能欠損型ＰＩＷＩＬ１発現プラスミドをそれぞれＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞ＳＮＵ－１にトランスフェクトし、バックコンプリメント実験を行い、ｐｉＲＮＡ結合能欠損がＰＩＷＩＬ１の下流標的遺伝子、特に腫瘍の進行に関連する遺伝子の調節への影響を調べ、ｐｉＲＮＡ結合能欠損がＰＩＷＩＬ１のがん細胞の細胞周期への影響、及びがん細胞の細胞移動能力への影響を調べた。図１７は、ＰＩＷＩＬ１がｐｉＲＮＡ結合能を失った場合でも、野生型ＰＩＷＩＬ１と同様に、細胞周期に関わるがん遺伝子や細胞間接着に関わるがん遺伝子を調節できることを示す。さらに、図１７は、ｐｉＲＮＡ結合能を失ったＰＩＷＩＬ１でも、野生型ＰＩＷＩＬ１と同様に、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによる細胞周期停止や細胞移動阻害を回復できることを示す。
既存の文献研究に基づいて、ヒトＰＩＷＩＬ１の５７２位のリジン、５８４位のグルタミン、６０７位のグルタミンの三つのアミノ酸部位は、進化的に保存されたｐｉＲＮＡ結合部位と推定されている（２８－２９）。これらの三つのアミノ酸をアラニンに変異させ、ｐｉＲＮＡ結合能が欠損されたＰＩＷＩＬ１発現プラスミドを構築した。野生型ＰＩＷＩＬ１発現プラスミドとｐｉＲＮＡ結合能欠損型ＰＩＷＩＬ１発現プラスミドをそれぞれＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞ＳＮＵ－１にトランスフェクトし、バックコンプリメント実験を行い、ｐｉＲＮＡ結合能欠損がＰＩＷＩＬ１の下流標的遺伝子、特に腫瘍の進行に関連する遺伝子の調節への影響を調べ、ｐｉＲＮＡ結合能欠損がＰＩＷＩＬ１のがん細胞の細胞周期への影響、及びがん細胞の細胞移動能力への影響を調べた。図１７は、ＰＩＷＩＬ１がｐｉＲＮＡ結合能を失った場合でも、野生型ＰＩＷＩＬ１と同様に、細胞周期に関わるがん遺伝子や細胞間接着に関わるがん遺伝子を調節できることを示す。さらに、図１７は、ｐｉＲＮＡ結合能を失ったＰＩＷＩＬ１でも、野生型ＰＩＷＩＬ１と同様に、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによる細胞周期停止や細胞移動阻害を回復できることを示す。
【0123】
以上より、本実施例は、ＰＩＷＩＬ１が胃がんの細胞周期動作や細胞移動をｐｉＲＮＡ非依存的に調節できること、一方、ＰＩＷＩＬ１が多くの重要な癌遺伝子や癌阻害遺伝子の発現、特に細胞周期や細胞移動の表現型に関連する遺伝子をｐｉＲＮＡ非依存的に調節できることを明らかにした。したがって、ＰＩＷＩＬ１のこれらのｐｉＲＮＡ非依存的の生物学的機能及び遺伝子発現調節は、ＰＩＷＩＬ１を胃がん標的治療の優れたターゲットにすることが期待され、特に腫瘍の成長及び転移が速い胃がん患者に対いて、ＰＩＷＩＬ１を標的とするのにｐｉＲＮＡの効果はもはや必要ないものと思われる。
【0124】
［材料方法］
Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーの構築とシーケンシング
メーカーの説明書に従って、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリキット（ＮＥＢ、カタログ番号Ｅ７３００Ｓ）を用いて、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーを作製した。細胞から抽出した１ｕｇのトータルＲＮＡ、又は１００ｎｇのＰＩＷＩＬ１抗体で濃縮したＲＮＡを用いて、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーの作製を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑＸプラットフォームでライブラリーにダブルエンド１５０ｂｐシーケンシングを行った。
Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーの構築とシーケンシング
メーカーの説明書に従って、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリキット（ＮＥＢ、カタログ番号Ｅ７３００Ｓ）を用いて、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーを作製した。細胞から抽出した１ｕｇのトータルＲＮＡ、又は１００ｎｇのＰＩＷＩＬ１抗体で濃縮したＲＮＡを用いて、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーの作製を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑＸプラットフォームでライブラリーにダブルエンド１５０ｂｐシーケンシングを行った。
【0125】
過ヨウ素酸ナトリウムＮａＩＯ４酸化とβ脱離のｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの構築とシーケンシング
２０ｍＭ ＮａＩＯ４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃３１１４４８）を含む総体積４０μｌの２００ｍＭリジン－ＨＣｌバッファ（ｐＨ ８．５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃６２９２９）で２０ｕｇのトータルＲＮＡを処理し、３７℃で３０分間暗いチューブで振ってβ脱離を達成した。反応を２μｌのエチレングリコールでクエンチした。ＲＮＡをカラム精製し（ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５、Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｒ１０１５）、８μｌの分子生物学グレードのＲＮａｓｅフリー水で溶出した。６ｕｌの溶出ＲＮＡは、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ライブラリキット（ＮＥＢ、カタログ番号Ｅ７３００Ｓ）によってＳｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーを作製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑＸプラットフォームでライブラリーにダブルエンド１５０ｂｐシーケンシングを行った。
２０ｍＭ ＮａＩＯ４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃３１１４４８）を含む総体積４０μｌの２００ｍＭリジン－ＨＣｌバッファ（ｐＨ ８．５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃６２９２９）で２０ｕｇのトータルＲＮＡを処理し、３７℃で３０分間暗いチューブで振ってβ脱離を達成した。反応を２μｌのエチレングリコールでクエンチした。ＲＮＡをカラム精製し（ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５、Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｒ１０１５）、８μｌの分子生物学グレードのＲＮａｓｅフリー水で溶出した。６ｕｌの溶出ＲＮＡは、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ライブラリキット（ＮＥＢ、カタログ番号Ｅ７３００Ｓ）によってＳｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーを作製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑＸプラットフォームでライブラリーにダブルエンド１５０ｂｐシーケンシングを行った。
【0126】
Ｓｍａｌｌ ＲＮＡシーケンシングデータ分析
Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑは、ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅ（バージョン０．４．４＿ｄｅｖ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／）を使用して処理され、デフォルトのアダプタートリミングモードを使用して、１５０ｂｐの長さのシーケンスでアダプターを自動的に検出した。１７ｂｐから４２ｂｐのサイズカットオフを使用して、適切な長さのｓｍａｌｌ ＲＮＡリードを保持した。コマンドは、“ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ －－ｐｈｒｅｄ３３ －－ｇｚｉｐ －ｑ ２０ －－ｆａｓｔｑｃ －－ｏｕｔｐｕｔ＿ｄｉｒ ｔｒｉｍｍｅｄ＿ｆｑｃ＿ｏｕｔ －－ｌｅｎｇｔｈ １７ －－ｍａｘ＿ｌｅｎｇｔｈ ４２ －－ｔｒｉｍ－ｎ ＄ｒｅａｄ”である。続いて、トリミングされた読み取りは、対応するゲノム［ヒト（ｈｇ３８）又はマウス（ｍｍ１０）］にマッピングされ、ｂｏｗｔｉｅ１（バージョン１．２．１．１）（３０）を使用して、コマンドは“ｂｏｗｔｉｅ －Ｓ －ｐ ５ －ｖ ０ －ｎ ０ －ｌ １８ －ｋ １ －－ｎｏ－ｕｎａｌ －－ａｌ ＄ＧＭＡＰＰＥＤ＿ＦＱ Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ． ＧＲＣｈ３８．ｄｎａ．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ｆａ ＄ｒｅａｄ ＞ ＄ＧＭＡＰＰＥＤ＿ＳＡＭ”である。ゲノムマッピングされたリードは、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、及び反復エレメントのライブラリに順次マッピングされた。ｍｉＲＮＡライブラリーはｍｉＲＢａｓｅから入手した（２０１８年３月１１日）（３１）。ｔＲＮＡリファレンスＦａｓｔａは、ＧｔＲＮＡｄｂ（３２）のｔＲＮＡ配列とゲノム注釈ｔＲＮＡ配列を組み合わせて作成された。ｒＲＮＡライブラリーはＲＮＡｃｅｎｔｒａｌ（２０１９年１月）（３３）から作成された。ｓｎＲＮＡ及びｓｎｏＲＮＡｃＤＮＡライブラリーは、ゲノム注釈及びＲＮＡｃｅｎｔｒａｌ（２０１９年１月）から入手した。ｐｉＲＮＡはｄｅ ｎｏｖｏ及び既知として分類され、前者はｐｒｏＴＲＡＣ（バージョン２．４．２）（３４）によって識別され、後者はｐｉＲＮＡＢａｎｋのｐｉＲＮＡにマッピングすることによって識別される。ｐｒｏＴＲＡＣのコマンドは、“ｐｅｒｌ ｐｒｏＴＲＡＣ＿２．４．２．ｐｌ －ｇｅｎｏｍｅ Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ． ＧＲＣｈ３８．ｄｎａ．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ｈｅａｄｅｒ．ｓｉｍｐｌｅ．ｆａ －ｍａｐ ＄ｍａｐ＿ｆｉｌｅ －ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ ｈｇ３８．ｒｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｍａｔｃｈｅｄ．ｇｔｆ －ｇｅｎｅｓｅｔ Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｍ３８．９５．ｃｈｒ．ｇｔｆ －ｐｉｍｉｎ ２５ －ｐｉｍａｘ ３１”である。＄ ｍａｐｆｉｌｅは、ｓＲＮＡｍａｐｐｅｒ（バージョン１．０．４）（３５）を使用したマップ出力である。反復配列のｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーは、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒアノテーションから取得された。
Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑは、ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅ（バージョン０．４．４＿ｄｅｖ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／）を使用して処理され、デフォルトのアダプタートリミングモードを使用して、１５０ｂｐの長さのシーケンスでアダプターを自動的に検出した。１７ｂｐから４２ｂｐのサイズカットオフを使用して、適切な長さのｓｍａｌｌ ＲＮＡリードを保持した。コマンドは、“ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ －－ｐｈｒｅｄ３３ －－ｇｚｉｐ －ｑ ２０ －－ｆａｓｔｑｃ －－ｏｕｔｐｕｔ＿ｄｉｒ ｔｒｉｍｍｅｄ＿ｆｑｃ＿ｏｕｔ －－ｌｅｎｇｔｈ １７ －－ｍａｘ＿ｌｅｎｇｔｈ ４２ －－ｔｒｉｍ－ｎ ＄ｒｅａｄ”である。続いて、トリミングされた読み取りは、対応するゲノム［ヒト（ｈｇ３８）又はマウス（ｍｍ１０）］にマッピングされ、ｂｏｗｔｉｅ１（バージョン１．２．１．１）（３０）を使用して、コマンドは“ｂｏｗｔｉｅ －Ｓ －ｐ ５ －ｖ ０ －ｎ ０ －ｌ １８ －ｋ １ －－ｎｏ－ｕｎａｌ －－ａｌ ＄ＧＭＡＰＰＥＤ＿ＦＱ Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ． ＧＲＣｈ３８．ｄｎａ．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ｆａ ＄ｒｅａｄ ＞ ＄ＧＭＡＰＰＥＤ＿ＳＡＭ”である。ゲノムマッピングされたリードは、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、及び反復エレメントのライブラリに順次マッピングされた。ｍｉＲＮＡライブラリーはｍｉＲＢａｓｅから入手した（２０１８年３月１１日）（３１）。ｔＲＮＡリファレンスＦａｓｔａは、ＧｔＲＮＡｄｂ（３２）のｔＲＮＡ配列とゲノム注釈ｔＲＮＡ配列を組み合わせて作成された。ｒＲＮＡライブラリーはＲＮＡｃｅｎｔｒａｌ（２０１９年１月）（３３）から作成された。ｓｎＲＮＡ及びｓｎｏＲＮＡｃＤＮＡライブラリーは、ゲノム注釈及びＲＮＡｃｅｎｔｒａｌ（２０１９年１月）から入手した。ｐｉＲＮＡはｄｅ ｎｏｖｏ及び既知として分類され、前者はｐｒｏＴＲＡＣ（バージョン２．４．２）（３４）によって識別され、後者はｐｉＲＮＡＢａｎｋのｐｉＲＮＡにマッピングすることによって識別される。ｐｒｏＴＲＡＣのコマンドは、“ｐｅｒｌ ｐｒｏＴＲＡＣ＿２．４．２．ｐｌ －ｇｅｎｏｍｅ Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ． ＧＲＣｈ３８．ｄｎａ．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ｈｅａｄｅｒ．ｓｉｍｐｌｅ．ｆａ －ｍａｐ ＄ｍａｐ＿ｆｉｌｅ －ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ ｈｇ３８．ｒｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ．ｍａｔｃｈｅｄ．ｇｔｆ －ｇｅｎｅｓｅｔ Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｍ３８．９５．ｃｈｒ．ｇｔｆ －ｐｉｍｉｎ ２５ －ｐｉｍａｘ ３１”である。＄ ｍａｐｆｉｌｅは、ｓＲＮＡｍａｐｐｅｒ（バージョン１．０．４）（３５）を使用したマップ出力である。反復配列のｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリーは、ＵＣＳＣゲノムブラウザのＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒアノテーションから取得された。
【0127】
野生型ＰＩＷＩＬ１及びｐｉＲＮＡ結合変異体ＰＩＷＩＬ１クローンの構築
メーカーの指示に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ＿ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８００４４）によってトータルＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。このｃＤＮＡは、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０５３０Ｌ）によるＰＣＲでの増幅のテンプレートとして使用され、ＰＩＷＩＬ１はｐｃＤＮＡ３．１－３ｘＦｌａｇにクローン化された。
メーカーの指示に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ＿ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８００４４）によってトータルＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。このｃＤＮＡは、Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０５３０Ｌ）によるＰＣＲでの増幅のテンプレートとして使用され、ＰＩＷＩＬ１はｐｃＤＮＡ３．１－３ｘＦｌａｇにクローン化された。
【0128】
ｐｉＲＮＡ結合変異体ＰＩＷＩＬ１遺伝子は、メーカーの説明に従って、ｐｃＤＮＡ３．１－３ｘＦｌａｇ－ＰＩＷＩＬ１ ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－突然変異誘発キット（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）（ＴＯＹＯＢＯ、ＳＭＫ－１０１）によってクローン化された。ＰＣＲプライマーリストを表２に示す。
【0129】
実施例５ ＰＩＷＩＬ１は、ＵＰＦ１を介したナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解経路（ＮＭＤ経路）によって、胃がんにおけるｐｉＲＮＡに非依存する方法での生物学的機能と調節を発揮
５．１ ＰＩＷＩＬ１とＵＰＦ１を介したＮＭＤ複合体との相互作用
ＰＩＷＩＬ１抗体の共免疫沈降結合質量分析により、ナンセンスｍＲＮＡ分解経路のコアタンパク質であるＵＰＦ１タンパク質を同定した（３６－３７）（図１８）。図１９の共免疫沈降の実験結果は、ＰＩＷＩＬ１とＵＰＦ１が互いに結合し、ＰＩＷＩＬ１がＮＭＤ経路のコア複合体（ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、及び活性化ＵＰＦ１（リン酸化ＵＰＦ１））と相互作用できることをさらに示す。図２０の蛍光抗体法実験の結果は、ＰＩＷＩＬ１とＵＰＦ１がナンセンスｍＲＮＡ分解経路で機能する細胞小器官であるＰボディに共局在できることを示す。
５．１ ＰＩＷＩＬ１とＵＰＦ１を介したＮＭＤ複合体との相互作用
ＰＩＷＩＬ１抗体の共免疫沈降結合質量分析により、ナンセンスｍＲＮＡ分解経路のコアタンパク質であるＵＰＦ１タンパク質を同定した（３６－３７）（図１８）。図１９の共免疫沈降の実験結果は、ＰＩＷＩＬ１とＵＰＦ１が互いに結合し、ＰＩＷＩＬ１がＮＭＤ経路のコア複合体（ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、及び活性化ＵＰＦ１（リン酸化ＵＰＦ１））と相互作用できることをさらに示す。図２０の蛍光抗体法実験の結果は、ＰＩＷＩＬ１とＵＰＦ１がナンセンスｍＲＮＡ分解経路で機能する細胞小器官であるＰボディに共局在できることを示す。
【0130】
５．２ ＰＩＷＩＬ１はｐｉＲＮＡ非依存でＵＰＦ１に結合し、ＵＰＦ１に特異的に結合する領域を持つ
ＰＩＷＩＬ１がＵＰＦ１に特異的に結合してＮＭＤ経路に参加する方法を見つけるには、ＵＰＦ１に特異的に結合するＰＩＷＩＬ１の結合領域を見つける必要がある。タンパク質モデリングによるＰＩＷＩＬ１のＵＰＦ１への結合モード（３８－４０）の予測に基づいて、ＵＰＦ１に結合するＰＩＷＩＬ１の能力を欠くドメイン変異体を構築した。図２１は、ＰＩＷＩＬ１の２５１～３８３位のアミノ酸領域と６２５～７５８位のアミノ酸領域が、ＵＰＦ１への結合に関与するＰＩＷＩＬ１の重要な領域であり、この領域をノックアウトすると、ＰＩＷＩＬ１のＵＰＦ１への結合が大幅に破壊され、ｐｉＲＮＡへの結合能力を失うだけであるＰＩＷＩＬ１変異体はＵＰＦ１への結合に影響を与えず、ＮＭＤ経路と協力するＰＩＷＩＬ１のＵＰＦ１への結合がｐｉＲＮＡに非依存することを示す。
ＰＩＷＩＬ１がＵＰＦ１に特異的に結合してＮＭＤ経路に参加する方法を見つけるには、ＵＰＦ１に特異的に結合するＰＩＷＩＬ１の結合領域を見つける必要がある。タンパク質モデリングによるＰＩＷＩＬ１のＵＰＦ１への結合モード（３８－４０）の予測に基づいて、ＵＰＦ１に結合するＰＩＷＩＬ１の能力を欠くドメイン変異体を構築した。図２１は、ＰＩＷＩＬ１の２５１～３８３位のアミノ酸領域と６２５～７５８位のアミノ酸領域が、ＵＰＦ１への結合に関与するＰＩＷＩＬ１の重要な領域であり、この領域をノックアウトすると、ＰＩＷＩＬ１のＵＰＦ１への結合が大幅に破壊され、ｐｉＲＮＡへの結合能力を失うだけであるＰＩＷＩＬ１変異体はＵＰＦ１への結合に影響を与えず、ＮＭＤ経路と協力するＰＩＷＩＬ１のＵＰＦ１への結合がｐｉＲＮＡに非依存することを示す。
【0131】
５．３ ＰＩＷＩＬ１のＵＰＦ１への特異的結合は、胃がんにおけるＰＩＷＩＬ１の重要な生物学的機能と調節に重要
ＵＰＦ１への結合能を失ったＰＩＷＩＬ１変異体と野生型ＰＩＷＩＬ１変異体をそれぞれＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞ＳＮＵ－１に移し、野生型ＰＩＷＩＬ１は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによって引き起こされる下流の腫瘍抑制遺伝子発現のアップレギュレーション及び癌細胞の移動の阻害を十分に回復することができるが、ＵＰＦ１へのＰＩＷＩＬ１結合能力の喪失は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによって引き起こされる下流の標的遺伝子発現の調節不全と細胞移動への影響を回復できない（図２２）。
ＵＰＦ１への結合能を失ったＰＩＷＩＬ１変異体と野生型ＰＩＷＩＬ１変異体をそれぞれＰＩＷＩＬ１ノックアウト胃がん細胞ＳＮＵ－１に移し、野生型ＰＩＷＩＬ１は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによって引き起こされる下流の腫瘍抑制遺伝子発現のアップレギュレーション及び癌細胞の移動の阻害を十分に回復することができるが、ＵＰＦ１へのＰＩＷＩＬ１結合能力の喪失は、ＰＩＷＩＬ１ノックアウトによって引き起こされる下流の標的遺伝子発現の調節不全と細胞移動への影響を回復できない（図２２）。
【0132】
以上より、本実施例では、ＰＩＷＩＬ１がｐｉＲＮＡ非依存でＵＰＦ１を介したナンセンスｍＲＮＡ崩壊（ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ ＮＭＤ）経路を介して胃がん細胞の移動の調節、及び細胞移動能力に関連する癌抑制遺伝子の調節を実現できることを発見した。したがって、ＰＩＷＩＬ１のｐｉＲＮＡに非依存する調節、特にＮＭＤ複合体との協調的な調節は、胃がんを標的とした治療におけるＰＩＷＩＬ１の新しい治療法になると期待され、従来のＰＩＷＩＬ１ｐｉＲＮＡに依存する治療法とは異なる。
【0133】
［材料方法］
共免疫沈降
共免疫沈降溶解バッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｖ ／ ｖ）ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ＃Ｉ８８９６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤混合錠剤（ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ）（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号４６９３１３２００１）及びＰｈｏｓＳｔｏｐタブレット（ＭＥＲＣＫ、４９０６０８７００１）］で細胞を溶解し、１４０００ｒｐｍで１０分間回転させて破片を除去した。１０μＬの空のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ磁気ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０００４Ｄ）をライセートに添加し、事前にクリアランスするために０．５時間インキュベートした。５０μＬの空のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ磁気ビーズをクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ ５．０）で洗浄し、５ｕｇのマウスモノクローナル抗ＰＩＷＩＬ１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＩＧＭＡ、カタログ番号ＳＡＢ４２００３６５）又は５ｕｇの正常のマウスＩｇＧポリクローン抗体（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号１２－３７１）と一緒にインキュベートした。５０μＬの空のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＡをクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ ５．０）で洗浄し、１５ｕｌのウサギ抗ＵＰＦ１モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、カタログ番号１２０４０）又は５ｕｇのウサギポリクローナル抗－リン酸化Ｕｐｆ１（Ｓｅｒ１１２７）抗体（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号０７－１０１６）又は５ｕｇのウサギポリクローナル抗ＵＰＦ２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５７１０８）又は５ｕｇの正常ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号１２－３７０）とインキュベートした。これらのインキュベーションはすべて、回転させながら４℃で４時間行った。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ／Ａ磁気ビーズ－Ｉｇ複合体はＩＰ洗浄バッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０、０．５ ｍＭ ＤＴＴ、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤及びＰｈｏｓＳｔｏｐタブレット］で三回洗浄した。事前に洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ／Ａ磁気ビーズ－Ｉｇ複合体を、事前に清澄化したライセートとともに４℃で一晩回転させながらインキュベートした。次に、ＩＰ洗浄バッファ及びＩＰ高塩洗浄バッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０、０．５ ｍＭ ＤＴＴ、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤混合錠剤及びＰｈｏｓＳｔｏｐタブレット］で二回洗浄した。免疫沈降物を７．５％ＴＧＸ Ｆａｓｔ Ｃａｓｔアクリルアミドゲルで電気泳動し、ウエスタンブロッティングに関連する抗体でプローブし、又はメーカーの指示に従ってクマシーブリリアントブルー染色液を使用してプローブした。
共免疫沈降
共免疫沈降溶解バッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｖ ／ ｖ）ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ＃Ｉ８８９６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤混合錠剤（ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ）（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号４６９３１３２００１）及びＰｈｏｓＳｔｏｐタブレット（ＭＥＲＣＫ、４９０６０８７００１）］で細胞を溶解し、１４０００ｒｐｍで１０分間回転させて破片を除去した。１０μＬの空のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ磁気ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０００４Ｄ）をライセートに添加し、事前にクリアランスするために０．５時間インキュベートした。５０μＬの空のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ磁気ビーズをクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ ５．０）で洗浄し、５ｕｇのマウスモノクローナル抗ＰＩＷＩＬ１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＩＧＭＡ、カタログ番号ＳＡＢ４２００３６５）又は５ｕｇの正常のマウスＩｇＧポリクローン抗体（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号１２－３７１）と一緒にインキュベートした。５０μＬの空のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＡをクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ ５．０）で洗浄し、１５ｕｌのウサギ抗ＵＰＦ１モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、カタログ番号１２０４０）又は５ｕｇのウサギポリクローナル抗－リン酸化Ｕｐｆ１（Ｓｅｒ１１２７）抗体（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号０７－１０１６）又は５ｕｇのウサギポリクローナル抗ＵＰＦ２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５７１０８）又は５ｕｇの正常ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＭＥＲＣＫ、カタログ番号１２－３７０）とインキュベートした。これらのインキュベーションはすべて、回転させながら４℃で４時間行った。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ／Ａ磁気ビーズ－Ｉｇ複合体はＩＰ洗浄バッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０、０．５ ｍＭ ＤＴＴ、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤及びＰｈｏｓＳｔｏｐタブレット］で三回洗浄した。事前に洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ／Ａ磁気ビーズ－Ｉｇ複合体を、事前に清澄化したライセートとともに４℃で一晩回転させながらインキュベートした。次に、ＩＰ洗浄バッファ及びＩＰ高塩洗浄バッファ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０、０．５ ｍＭ ＤＴＴ、ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤混合錠剤及びＰｈｏｓＳｔｏｐタブレット］で二回洗浄した。免疫沈降物を７．５％ＴＧＸ Ｆａｓｔ Ｃａｓｔアクリルアミドゲルで電気泳動し、ウエスタンブロッティングに関連する抗体でプローブし、又はメーカーの指示に従ってクマシーブリリアントブルー染色液を使用してプローブした。
【0134】
質量分析
共免疫沈降した産物を７．５％ＴＧＸ Ｆａｓｔ Ｃａｓｔアクリルアミドキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１６１０１７３ＴＡ）を使用して電気泳動した後、クマシーブリリアントブルー染色を行った。次に、タンパク質バンドを別々に切り出した。切除されたゲルバンドを、前述のように最初にゲルで消化させた（４１）。得られたペプチドを脱塩した後、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＭＳデータは、ナノ－ＥＡＳＹ ＬＣとＥａｓｙｓｐｒａｙカラム（７５μｍ×５０ ｃｍ、ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８カラム、２μｍ、１００Å、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎＭＳを使用して取得した。ＬＣ勾配は５～３５％Ｂ（ＣＨ３ＣＮ中での０．１％ギ酸）、流速３００ＮＬ／ｍｉｎ、６０分で、カラム温度は５０℃に設定した。ＭＳデータはデータ相関モードで取得された。簡単に説明すると、６０Ｋの解像度でサーベイスキャンを実行した後、Ｏｒｂｉｔｒａｐで１５Ｋの解像度で１０回のＨＣＤ ＭＳ／ＭＳスキャンを実行した。
共免疫沈降した産物を７．５％ＴＧＸ Ｆａｓｔ Ｃａｓｔアクリルアミドキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１６１０１７３ＴＡ）を使用して電気泳動した後、クマシーブリリアントブルー染色を行った。次に、タンパク質バンドを別々に切り出した。切除されたゲルバンドを、前述のように最初にゲルで消化させた（４１）。得られたペプチドを脱塩した後、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＭＳデータは、ナノ－ＥＡＳＹ ＬＣとＥａｓｙｓｐｒａｙカラム（７５μｍ×５０ ｃｍ、ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８カラム、２μｍ、１００Å、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＯｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎＭＳを使用して取得した。ＬＣ勾配は５～３５％Ｂ（ＣＨ３ＣＮ中での０．１％ギ酸）、流速３００ＮＬ／ｍｉｎ、６０分で、カラム温度は５０℃に設定した。ＭＳデータはデータ相関モードで取得された。簡単に説明すると、６０Ｋの解像度でサーベイスキャンを実行した後、Ｏｒｂｉｔｒａｐで１５Ｋの解像度で１０回のＨＣＤ ＭＳ／ＭＳスキャンを実行した。
【0135】
ＵＰＦ１への結合能力を欠くＰＩＷＩＬ１突然変異体の構築
メーカーの指示に従って、ＰＩＷＩＬ１ドメイン突然変異体は、Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ超忠実度ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｖａｚｙｍｅ、Ｐ５０５－ｄ１）及びＭｕｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＭｕｌｔｉＳ迅速突然変異誘発キットＶ２（Ｖａｚｙｍｅ、Ｃ２１５－０１）によって、クローン化された。プライマー（２－２５０）／（２－６２４）－Ｆ’及びプライマー（２－２５０）－Ｒ’を使用してフラグメント（２－２５０）を取得し、プライマー（３８４－８６１）／（３８４－６２４）－ Ｆ’及びプライマー（３８４－８６１）／（７５９－８６１）－Ｒ’を使用してフラグメント（３８４－８６１）を取得し、プライマー（２－２５０）／（２－６２４）－Ｆ’及びプライマー（２－６２４）／（３８４ －６２４）－Ｒ’を使用してフラグメント（２－６２４）を取得し、プライマー（７５９－８６１）－Ｆ’及びプライマー（３８４－８６１）／（７５９－８６１）－Ｒ’を使用してフラグメント（７５９－８６１）を取得し、プライマー（３８４－８６１）／（３８４－６２４）－Ｆ’及びプライマー（２－６２４）／（３８４－６２４）－Ｒ’を使用してフラグメント（３８４－６２４）を取得した。フラグ－ＰＩＷＩＬ１－ΔＮ突然変異体ｃＤＮＡ（２５１－３８３の欠失）は、フラグメント（２－２５０）とフラグメント（３８４－８６１）をライゲーションすることによって構築された。フラグ－ＰＩＷＩＬ１－ΔＣ突然変異体ｃＤＮＡ（６２５－７５８の欠失）は、フラグメント（２－６２４）とフラグメント（７５９－８６１）をライゲーションすることによって構築された。フラグ－ＰＩＷＩＬ１－ΔＮΔＣ突然変異体ｃＤＮＡ（２５１－３８３及び６２５－７５８を削除）は、フラグメント（２－２５０）をフラグメント（３８４－６２４）及びフラグメント（７５９－８６１）にライゲーションすることによって構築された。ＰＣＲプライマーを表２に示す。定量的ＰＣＲ法及び細胞移動アッセイ法は上記のとおりである。
メーカーの指示に従って、ＰＩＷＩＬ１ドメイン突然変異体は、Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ超忠実度ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｖａｚｙｍｅ、Ｐ５０５－ｄ１）及びＭｕｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＭｕｌｔｉＳ迅速突然変異誘発キットＶ２（Ｖａｚｙｍｅ、Ｃ２１５－０１）によって、クローン化された。プライマー（２－２５０）／（２－６２４）－Ｆ’及びプライマー（２－２５０）－Ｒ’を使用してフラグメント（２－２５０）を取得し、プライマー（３８４－８６１）／（３８４－６２４）－ Ｆ’及びプライマー（３８４－８６１）／（７５９－８６１）－Ｒ’を使用してフラグメント（３８４－８６１）を取得し、プライマー（２－２５０）／（２－６２４）－Ｆ’及びプライマー（２－６２４）／（３８４ －６２４）－Ｒ’を使用してフラグメント（２－６２４）を取得し、プライマー（７５９－８６１）－Ｆ’及びプライマー（３８４－８６１）／（７５９－８６１）－Ｒ’を使用してフラグメント（７５９－８６１）を取得し、プライマー（３８４－８６１）／（３８４－６２４）－Ｆ’及びプライマー（２－６２４）／（３８４－６２４）－Ｒ’を使用してフラグメント（３８４－６２４）を取得した。フラグ－ＰＩＷＩＬ１－ΔＮ突然変異体ｃＤＮＡ（２５１－３８３の欠失）は、フラグメント（２－２５０）とフラグメント（３８４－８６１）をライゲーションすることによって構築された。フラグ－ＰＩＷＩＬ１－ΔＣ突然変異体ｃＤＮＡ（６２５－７５８の欠失）は、フラグメント（２－６２４）とフラグメント（７５９－８６１）をライゲーションすることによって構築された。フラグ－ＰＩＷＩＬ１－ΔＮΔＣ突然変異体ｃＤＮＡ（２５１－３８３及び６２５－７５８を削除）は、フラグメント（２－２５０）をフラグメント（３８４－６２４）及びフラグメント（７５９－８６１）にライゲーションすることによって構築された。ＰＣＲプライマーを表２に示す。定量的ＰＣＲ法及び細胞移動アッセイ法は上記のとおりである。
【0136】
【表1】
【0137】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-23
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を発現する癌の診断及び／又は治療に使用するための、ＰＩＷＩを標的とする、あるいはＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の発現を低減させる薬物。
【請求項2】
前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、
及び／又は、前記薬物は、前記ＰＩＷＩとＮＭＤ複合体タンパク質との結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物であり、好ましくは前記ＰＩＷＩ上の前記ＮＭＤ複合体タンパク質に結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物であり、及び／又は好ましくは前記ＮＭＤ複合体上の前記ＰＩＷＩに結合する結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物である、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用のための薬物。
【請求項3】
前記薬物は、前記ＰＩＷＩ及び前記ＮＭＤ複合体タンパク質の結合部位に設計された阻害剤であり、好ましくは、ＰＩＷＩ上の前記ＮＭＤ複合体タンパク質に結合する結合部位に設計された阻害剤、例えばＰＩＷＩＬ１阻害剤、ＰＩＷＩＬ２阻害剤、ＰＩＷＩＬ３阻害剤及び／又はＰＩＷＩＬ４阻害剤であり、及び／又は、ＮＭＤ複合体タンパク質上の前記ＰＩＷＩに結合する結合部位に設計された阻害剤、例えばＵＰＦ１阻害剤、ＵＰＦ２阻害剤、ＳＭＧ１阻害剤、ＵＰＦ３阻害剤、ＳＭＧ５阻害剤、ＳＭＧ６阻害剤及び／又はＳＭＧ７阻害剤であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１阻害剤であり、及び／又は、前記薬物は小分子物質であり、例えば、小分子化合物などの小分子化学物質、又は小分子活性ペプチドなどの小分子生物学的物質であり、前記小分子化合物は、好ましくは、化合物の薬学的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在し、
前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質であり、
及び／又は、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスである、
ことを特徴とする請求項２に記載の使用のための薬物。
【請求項4】
前記薬物は、
（ａ）ＮＭＤ複合体タンパク質を発現し、ＰＩＷＩタンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療すること、
（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること、
（ｃ）がん細胞周期の進行を阻害すること、
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること、
（ｅ）がん細胞の腫瘍形成能を阻害すること、
（ｆ）がん細胞の生体内での転移能を阻害すること、
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること、
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること、
の中の一つ又は複数に使用される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための薬物。
【請求項5】
前記薬物は、ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質の結合を阻害する、あるいはＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の発現を低減させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための薬物。
【請求項6】
前記癌は、ＮＭＤを発現し、ＰＩＷＩ複合体タンパク質を高発現する癌であり、好ましくは、前記癌は、ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌である、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための薬物。
【請求項7】
ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を発現する癌の診断及び／又は治療に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬物を含む医薬組成物。
【請求項8】
（ａ）ＮＭＤ複合体タンパク質を発現し、ＰＩＷＩを高発現する癌を診断及び／又は治療すること、（ｂ）がん細胞の増殖を阻害すること、
（ｃ）がん細胞周期のランニングを阻害すること、
（ｄ）がん細胞の移動を阻害すること、
（ｅ）がんの腫瘍形成能を阻害すること、
（ｆ）がんの生体内での転移能を阻害すること、
（ｇ）がん細胞周期シグナル伝達経路を調節すること、
（ｈ）がん細胞フォーカルアドヒージョンの接着シグナル伝達経路を調節すること、
の中の一つ又は複数に使用され、
好ましくは、
前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７を含み、好ましくは、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば、早期胃がん又は進行胃がんであることを特徴とする、請求項７に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項9】
前記医薬組成物は、ｐｉＲＮＡ阻害剤などのｐｉＲＮＡを標的とする薬物を含まず、及び／又は、前記医薬組成物は、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡとの結合を阻害する薬物を含まず、好ましくは、
前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡとの結合をブロックする薬物は、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡとの結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物であり、好ましくは前記ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡとの結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物であり、及び／又は、好ましくは、前記ｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩとの結合部位を変異及び／又は阻害することによりブロックする薬物であり、
より好ましくは、
前記ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡの結合をブロックする薬物は、ＰＩＷＩとｐｉＲＮＡとの結合部位に設計された阻害剤であり、好ましくは、ＰＩＷＩ上の前記ｐｉＲＮＡとの結合部位に設計された阻害剤であり、及び／又はｐｉＲＮＡ上の前記ＰＩＷＩとの結合部位に設計された阻害剤である、
ことを特徴とする、請求項７又は８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項10】
前記医薬組成物は、医薬補助剤をさらに含み、及び／又は、前記医薬組成物は、他の薬物をさらに含み、前記他の薬物は、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌を診断及び／又は治療するための薬物であり、
及び／又は、前記医薬組成物は、請求項１～６のいずれか一項に記載の一つ又は複数の薬物から構成される、
ことを特徴とする、請求項７～９のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための薬物及び／又は請求項７～１０のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物のスクリーニングにおける、ＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の使用であって、好ましくは、
前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１である使用。
【請求項12】
請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための薬物及び／又は請求項７～１０のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物のスクリーニングのための、ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を発現する細胞株の使用であって、好ましくは、
前記薬物は小分子物質であり、例えば、小分子化合物などの小分子化学物質、又は小分子活性ペプチドなどの小分子生物学的物質であり、前記小分子化合物は、好ましくは、化合物の薬学的に許容される塩、化合物の溶媒和物、化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物、又は化合物の結晶形の形態で存在し、
及び／又は、前記薬物は高分子物質であり、例えば、多糖類、抗体のようなタンパク質、核酸のような高分子生体物質、又は高分子化合物のような高分子化学物質であり、
及び／又は、前記薬物は、漢方薬エキス及び／又は動植物エキスであり、
及び／又は、前記細胞株は胃がん細胞株であり、好ましくはＳＮＵ－１、ＳＮＵ－１６及び／又はＡＧＳであり、
及び／又は、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、
及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１を含み、
より好ましくは、前記細胞株は、ＮＭＤを発現し、ＰＩＷＩ複合体タンパク質を高発現する細胞株であり、
好ましくは、前記細胞株は、ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する細胞株である、使用。
【請求項13】
ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を発現する癌のバイオマーカー及び／又は治療標的としてのＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質の使用であって、好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、
より好ましくは、前記癌は、ＮＭＤを発現し、ＰＩＷＩ複合体タンパク質を高発現する癌であり、
さらにより好ましくは、前記癌は、ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌である、使用。
【請求項14】
ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を発現する癌の検出及び／又は診断に使用するためのバイオマーカーであって、前記バイオマーカーはＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を含み、
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、
より好ましくは、前記癌は、ＮＭＤを発現し、ＰＩＷＩ複合体タンパク質を高発現する癌であり、
さらにより好ましくは、前記癌は、ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌である、マーカー。
【請求項15】
ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を発現する癌を検出及び／又は診断するためのキットであって、前記キットはＰＩＷＩ及び／又はＮＭＤ複合体タンパク質を検出する抗体を含み、
好ましくは、前記ＰＩＷＩは、ＰＩＷＩＬ１、ＰＩＷＩＬ２、ＰＩＷＩＬ３及び／又はＰＩＷＩＬ４を含み、及び／又は、前記ＮＭＤ複合体タンパク質は、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＳＭＧ１、ＵＰＦ３、ＳＭＧ５、ＳＭＧ６及び／又はＳＭＧ７であり、好ましくはＵＰＦ１、ＵＰＦ２及び／又はＳＭＧ１であり、及び／又は、前記癌は胃がんであり、例えば早期胃がん又は進行胃がんであり、
より好ましくは、前記癌は、ＮＭＤを発現し、ＰＩＷＩ複合体タンパク質を高発現する癌であり、
さらにより好ましくは、前記癌は、ＰＩＷＩ及びＮＭＤ複合体タンパク質を高発現する癌である、キット。
【国際調査報告】