特表 2023-529300 フミン質を伴ったセグメント細菌の投与

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-10

(54)【発明の名称】フミン質を伴ったセグメント細菌の投与

(51)【国際特許分類】

   A23K 10/16 20160101AFI20230703BHJP

   A23K 10/30 20160101ALI20230703BHJP

【ＦＩ】

A23K10/16

A23K10/30

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022572394

(86)(22)【出願日】2021-05-04

(85)【翻訳文提出日】2023-01-20

(86)【国際出願番号】 US2021030640

(87)【国際公開番号】W WO2021242484

(87)【国際公開日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】63/031,190

(32)【優先日】2020-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522456464

【氏名又は名称】ケント コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ステッツァー，ダグラス エー．

【テーマコード（参考）】

2B150

【Ｆターム（参考）】

2B150AA02

2B150AA03

2B150AA05

2B150AB03

2B150AB10

2B150AC01

2B150AD04

2B150CJ03

2B150DD13

2B150DD31

2B150DD62

(57)【要約】

動物において免疫応答を誘発又は強化するのに有用であると企図される動物飼養製品及び動物飼養方法が開示される。動物飼養製品は、通常、セグメント細菌及びフミン質を含む。標的動物を飼養する方法も企図され、方法は、約０．０１ｇ／頭／日～約１００ｇ／頭／日のフミン質を標的動物に投与する工程、及び少なくとも約１×１０１ＣＦＵという用量のセグメント細菌を標的動物に投与する工程を含む。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも約１０ＣＦＵのセグメント細菌、及び
少なくとも約０．０１ｇのフミン質
を含む、動物用飼料製品。

【請求項2】

約０．０１ｇ～約１００ｇの前記フミン質を含む、請求項１に記載の動物用飼料製品。

【請求項3】

前記フミン質が、リードセッジピートに由来する、請求項１に記載の動物用飼料製品。

【請求項4】

約１×１０^２～約１×１０^１０ＣＦＵのセグメント細菌を含む、請求項１に記載の動物用飼料製品。

【請求項5】

約０．０１ｇ～約１００ｇの前記フミン質を含む、請求項４に記載の動物用飼料製品。

【請求項6】

標的動物を飼養する方法であって、前記方法は、
数日間にわたって約０．０１ｇ／日～約１００ｇ／日のフミン質を前記標的動物に投与する工程、及び
少なくとも約１０ＣＦＵという用量のセグメント細菌を前記標的動物に投与する工程を含む、方法。

【請求項7】

前記フミン質が、約３日間～約７日間の範囲の期間にわたって前記標的動物に投与される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記用量のセグメント細菌が、前記期間の最終日に又は最終日の後に前記標的動物に投与される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記用量のセグメント細菌が、前記期間の初日に前記標的動物に投与される、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記動物が、反芻動物であり、前記方法が、
約０．５ｇ／日～約８０ｇ／日の前記フミン質を前記標的動物に投与する工程
を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記動物が、家禽種であり、前記方法が、
約０．０２ｇ／日～約０．５ｇ／日の前記フミン質を前記動物に投与する工程
を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記動物が、ブタであり、前記方法が、
約０．１ｇ／日～約８．５ｇ／日の前記フミン質を前記標的動物に投与する工程
を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項13】

前記セグメント細菌及びフミン質が、経口的に投与される、請求項８に記載の方法。

【請求項14】

前記フミン質が、リードセッジピートの形態で投与される、請求項８に記載の方法。

【請求項15】

動物飼養製品を調製する方法であって、セグメント細菌をフミン質とブレンドする工程を含む、方法。

【請求項16】

前記セグメント細菌が、
セグメント細菌がコロニー形成している土壌を回収すること、
前記土壌を溶液中でホモジナイズすること、
前記溶液を遠心分離して、残屑を回収すること、及び
前記残屑をペレット化すること
によって調製されたものである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記溶液が、リン酸緩衝食塩水溶液である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記セグメント細菌が、
前記残屑を第２の溶液に再懸濁すること、
前記溶液を勾配培地の上に層化させること、及び
前記勾配培地からセグメント細菌のフィラメントを回収すること
によってさらに調製されたものである、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記第２の溶液が、リン酸緩衝食塩水溶液である、請求項１８に方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
[0001] 本願は、２０２０年５月２８日出願の米国仮特許出願第６３／０３１，１９０号の利益を主張する。この仮特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

[0002] 本開示は、概して、セグメント細菌を含む食品、より詳細には、セグメント細菌をフミン質とともに組み込んでいる動物飼養製品及び動物飼養方法に関する。

【背景技術】

【0003】

[0003] セグメント細菌（「ＳＦＢ」）は、脊椎動物及び無脊椎動物の宿主の上皮に付着している共生生物の一群である。Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａ（ＳＦＢ）ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｎ．Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｅｃｏｌ．８１，３９５－４０６（２０１２）．ＳＦＢは、動物宿主の上皮にコロニー形成するグラム陽性胞子形成細菌を含む。ＳＦＢは、動物の内壁細胞及び粘膜細胞に結合することにより、食道、消化管及び場合によっては結腸への接着を引き起こすことが知られている。ＳＦＢが動物宿主に存在することにより、自然免疫及び適応免疫が促進され、健康な腸の確立に役立ち、病原体から動物を守り得る。ＳＦＢ Ｅｄｕｃａｔｅ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｙ．Ｋ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｖｏｌ．４０，４５７－４５９（２０１４年４月１７日）、Ｇｕｔ ｉｍｍｕｎｅ ｂａｌａｎｃｅ ｉｓ ａｓ ｅａｓｙ ａｓ Ｓ－Ｆ－Ｂ，Ｓ．Ｋ．Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｖｏｌ．３１，５３６－５３８（２００９年１０月１６日）．したがって、ＳＦＢは、商業的に飼育されている動物の免疫を強化して、かかる動物を病原体から守るのに有用であると考えられている。この強化された免疫は、例えば肉質及び体重増加によって評価されるように、罹患率の低下及び生産力の増大に寄与し得る。

【0004】

[0004] フミン酸などのフミン質は、腸の形態、特に小腸の内側を覆っている絨毛の形態に影響を与えることがある。フミン酸は、経口摂取されると、絨毛の高さ又は陰窩の深さを大きくし、それにより、一般に絨毛の表面積が増加することがある。Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ｇｌｕｃｏｍａｎｎａｎ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂｒｏｉｌｅｒ ｃｈｉｃｋｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｓ．Ｍ．Ｔａｋｌｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．５，６６３－６６８（２０１２）．

【発明の概要】

【0005】

[0005] 本開示は、動物において免疫応答を誘発又は強化し得る動物飼養方法及び動物飼養製品に関する。ＳＦＢを投与する工程及びフミン質を標的動物に投与する工程を含む動物飼養方法が本明細書中に提供される。また、ＳＦＢ及びフミン質を含む動物飼養製品及び動物飼養キットも本明細書中に提供される。有利なことには、本明細書中で説明される動物飼養方法及び動物飼養製品を用いることにより、標的動物の腸におけるＳＦＢのコロニー形成が強化されて、ＳＦＢによって誘発される免疫応答が増強され得る。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】[0006] ＳＦＢ及びフミン質を含む動物飼養製品を作製するための例示的な方法の模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0007】

[0007] フミン質には、フミン酸、フミン酸の共役塩基、並びにフミン酸の塩が含まれ得る。フミン質は、フメートなどの天然に存在する物質中に存在する。フメートは、フミン酸の塩並びにフルボ酸の塩を含む天然に存在する物質である。フメートは、天然物質であるので、フメートに存在するフミン質の量は変化することがある。フメートの他の成分としては、ウルミン酸、及びフメートの不溶性成分であるフミンが挙げられ得る。フミンは、植物の腐敗性有機物を含み、土壌に保水力を提供する。

【0008】

[0008] ピート、例えばリードセッジピート（ｒｅｅｄ ｓｅｄｇｅ ｐｅａｔ）は、フミン質を含む多くのフメートのうちの１つである。リードセッジピートは、湿地に発生するアシ、スゲ、草及びいくつかのハイゴケの混合物から形成される部分的に腐敗した天然の植物材料であり、３分の１～３分の２のピート繊維を含む。リードセッジピートは、約１．２～約７０重量パーセントのフミン質、約３０～約７０重量パーセントのフミン質又は約４０～約６０重量パーセントのフミン質を含み得る。リードセッジピートを動物に与えるとき、リードセッジピートは多くとも１５重量パーセントの水分という水分含有量まで脱水され得、有害な微生物を含まない形態であり得る。

【0009】

[0009] 本開示は、フミン酸又は他のフミン質が、標的動物にＳＦＢと一緒に又はほぼ同時に投与され得、フミン質が宿主の絨毛を伸ばすか又は絨毛陰窩の深さを大きくし、それによりＳＦＢの接着を増大させることを企図する。フミン質がＳＦＢの前に投与されてもよいし、ＳＦＢがフミン質の前に投与されてもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、フミン酸などのフミン質をＳＦＢと共に投与することにより、消化管内の絨毛の高さ又は陰窩の深さ、面積が増加し、それにより、内皮表面積が増加して、ＳＦＢが接着しやすい身体領域の表面積が増加し得ると企図される。これは上皮細胞へのＳＦＢの接着を改善させることを意図しており、これにより、ＳＦＢのコロニー形成が強化され、改善された免疫応答がもたらされ得る。

【0010】

[0010] ＳＦＢ及びフミン質は、動物用飼料製品、飼料添加物、サプリメント、薬剤、プロバイオティクス、プレバイオティクス、シンバイオティクス又は他の形態の栄養分もしくは他の適切な製品の形態で標的動物に投与され得る。動物飼養製品は、液体又は乾燥形態などの様々な形態で標的動物に投与され得、粉末化、ペレット化又は押し出し成形され得る。動物飼養製品は、錠剤、ペレット、丸剤又はカプセル剤の形態で投与され得る。標的動物としては、ブタ、反芻動物、魚類又は家禽などの商業的に飼育される食用動物が挙げられ得る。ＳＦＢ及びフミン質は、ヒトに投与され得ることがさらに企図される。

【0011】

[0011] ＳＦＢ及びフミン質のうちの１つ以上が、単回投与、複数回投与、又は例えば、毎年、半年ごと、毎月、隔週、毎週もしくは毎日といった周期的な投与で投与され得る。ＳＦＢ又はフミン質は、エピジェネティクスが腸内マイクロバイオームにどのように影響するかに基づいて、複数回投与されてもよい。さらにＳＦＢ又はフミン質は、病原体の季節的な蔓延を考慮して、複数回投与されてもよい。ある特定の病原体は、暖かい季節に蔓延しやすく、他の病原体は、施設内で空気が循環するときなどの寒い季節に蔓延しやすいことがある。ＳＦＢは、季節によって異なる抗原を獲得することがあり、標的動物の免疫系が、それらの抗原を腸内で発現することがある。

【0012】

[0012] 例示的な飼養プロトコルにおいて、フミン質は、ある期間にわたって、例えば数日間又は数週間にわたって、標的動物に投与され得る。例えば、フミン質は、約３～約７日間の範囲の期間、標的動物に投与され得、ＳＦＢの投与と一緒に、すなわち単一の組成物として投与され得るか、又は同日にもしくはほぼ同時に（１０日以内の投与が企図される）投与され得る。ＳＦＢは、フミン質が標的動物に投与される期間の開始時、例えば初日に標的動物に投与され得る。またＳＦＢは、フミン質が標的動物に投与される期間の終了時、例えば最終日又はそれ以降に投与され得る。

【0013】

[0013] ＳＦＢ及びフミン質は、他の動物管理実務と併用して投与されてもよい。例えば、妊娠中の母体にＳＦＢ及びフミン質のうちの１つ以上を投与して、胎盤を通じて胎児に免疫を移し、出生の一定期間後に仔に追加投与して免疫を高めてもよい。またＳＦＢ及びフミン質のうちの１つ以上を、仔が群れに入る前の出生の一定期間後に投与してもよい。

【0014】

[0014] ＳＦＢは、免疫応答を誘発するのに有効な量で標的動物に投与され得る。ＳＦＢの量は、標的動物における免疫応答の目標レベルに基づいて調整され得る。ＳＦＢの用量は、１頭あたり少なくとも約１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＳＦＢを含み得る。ＳＦＢは、約１×１０^１から無制限の上限範囲までの量でも標的動物に投与され得るが、好ましくは約１×１０^２～約１×１０^１０ＣＦＵ／頭又は約１×１０^２～約１×１０^８ＣＦＵ／頭である。投与されるＳＦＢの量は、標的動物の種に基づいて調整され得る。一般に、小動物は大動物よりも呼吸数が多い。したがって、小動物は、大動物よりも体重１キログラムあたりのＳＦＢ量が少なくて済む場合がある。

【0015】

[0015] １つ以上のフミン質が、標的動物におけるＳＦＢのコロニー形成を強化するのに有効な量又は絨毛の形態に影響を与えるのに有効な量で標的動物に投与され得る。また１つ以上のフミン質が、約０．００１ｇ／頭／日～約５００ｇ／頭／日又は約０．０１ｇ／頭／日～約１００ｇ／頭／日の範囲の量で標的動物に投与されてもよい。フミン質の量は、標的動物の種に基づいて調整され得る。標的動物が反芻動物であるとき、飼養製品は約０．５ｇ／頭／日～約８０ｇ／頭／日のフミン質を含み得る。標的動物が家禽であるとき、飼養製品は約０．０２ｇ／頭／日～約０．５ｇ／頭／日のフミン質を含み得る。標的動物がブタであるとき、飼養製品は約０．１ｇ／頭／日～約８．５ｇ／頭／日のフミン質を含み得る。これらの量はフミン質の総乾燥重量に基づく。ＳＦＢ及びフミン質は、単一の動物に投与されてもよいが、より一般的には、同様の動物の群れに投与されることが企図される。

【0016】

[0016] 表１は、いくつかの実施形態に係る、フミン質及びフメートの投与が標的動物に基づいてどのように変化し得るかの例を提供している。

【0017】

[0017]

【表1】

【0018】

[0018] フミン質がリードセッジピートに由来するとき、リードセッジピートは、目標範囲内の所望のフミン質含有量に到達するために、必要に応じて、標的動物の少なくとも約０．０００１重量％という量、場合によっては、標的動物の体重につき約０．０００１％～約５％の範囲の量のリードセッジピートで投与され得る。いくつかの場合において、リードセッジピートは、標的動物の１日の総食物配給量の約１０％と等しいか又はそれ未満、いくつかの態様においては、標的動物の１日の総食物配給量の約５％と等しいか又はそれ未満の量で投与され得る。

【0019】

[0019] ＳＦＢ及びフミン質の用量は、動物飼養キットとして提供されてもよい。動物飼養キットは、１回分以上の用量のフミン質及び１回分以上の用量のＳＦＢを含み得る。動物飼養キットは、上で説明した１つ以上の投与プロトコルに従った投与にとって十分なＳＦＢ及びフミン質の用量を含み得る。動物飼養キットに含まれる用量は、標的動物又は免疫応答の目標レベルに基づいて変化し得る。動物飼養キットは、単一の動物のための用量又は同様の動物の群れのための用量を含み得る。場合によっては、ＳＦＢ及びフミン質は、単一の錠剤又はペレット又は他の動物用飼料製品の形態で提供され得る。この動物用飼料製品は、単一の動物への投与に適していてもよいし、動物群への投与に好適であるのに十分なＳＦＢ及びフミン質含有量を有していてもよい。

【0020】

[0020] 図１を参照すると、土壌からＳＦＢを得るにあたり、工程５においてＳＦＢがコロニー形成している土壌を回収する。土壌を、工程１０において、溶液、例えばリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）中でホモジナイズする。ホモジナイズしたら、次いで工程１５において、溶液を遠心分離して、その細菌を含む残屑から上清を除去する。残屑から上清を除去するために、溶液を低速遠心分離に数回かけてもよい。次いで工程２０において、細菌を、例えば１ペレットあたり約４０００ｇで、ペレット化し、例えばＰＢＳで洗浄する。細菌を遠心分離によってペレット化してもよいが、他の好適なペレット化の方法を用いてもよい。洗浄後、工程２５においてペレットを溶液に再懸濁し、６０ｗ／ｖ％ナイコデンツ勾配などの勾配培地の上に層化させる。工程３０において、相間にあるＳＦＢフィラメントを回収する。次いで工程３５において、ＳＦＢフィラメントをＰＢＳで洗浄し、オートクレーブする。

【0021】

[0021] 工程４０において、ＳＦＢを、フミン質を含む１つ以上の製品とブレンドして、最終的な飼養製品を作製してもよい。ＳＦＢを、リードセッジピートなどのフメートとブレンドしてもよく、上で説明した投与量に従って、最終的な飼養製品において様々な希釈度で使用してもよい。注目すべきことに、図面にはいくつかの工程が示されているが、本発明の方法の１つは、ＳＦＢをフミン質とブレンドすることを企図しており、そのチャートに示されている本明細書中で説明された他の工程は自由選択である。これらの工程は、異なる実体によって行われた先行の工程であってよく、ＳＦＢが、商業的に入手されたものであったとしても、入手され、フミン質とブレンドされるＳＦＢは、前述の工程によって得られたものである。

【0022】

[0022] 実施例１
[0023] １００頭のスターターブタの群れに、５０％のフミン酸を含むリードセッジピートを１．４ｇ／頭／日で７日間投与する。７日目に、１×１０^３ＣＦＵ／頭という用量のＳＦＢをその群れに投与する。

【0023】

[0024] 実施例２
[0025] ５０羽のスターターシチメンチョウの群れに、１日目に１×１０^８ＣＦＵ／頭という用量を、０．３ｇ／頭の、６０％のフミン酸を含むリードセッジピートと同時に投与する。２日目から開始して５日間、０．３ｇ／頭／日の、６０％のフミン酸を含むリードセッジピートをその群れに投与する。

【0024】

[0026] 実施例３
[0027] ２００頭の成熟した乳牛の群れに、５５％のフミン酸を含む１１０ｇのリードセッジピート及び約１×１０^１０ＣＦＵのＳＦＢを含む錠剤をその群れの各牛に投与する。

【0025】

[0028] 本明細書中で説明された方法はすべて、本明細書中に別段示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書中に提供される任意の及びすべての例又は例を説明する文言（例えば「など」）の使用は、本発明を明らかにすることを意図しており、本発明の範囲に限定をもたらさない。本発明又は好ましい実施形態の性質又は利点に関する本明細書中のいかなる記載も、限定を意図しない。本発明は、適用される法律によって許可される、本明細書中に記載された主題のすべての変更及び等価物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上で説明した要素の任意の組み合わせが、別段本明細書中に示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。任意の参考文献又は特許に関する本明細書中の説明は、たとえ「先行」と特定されていたとしても、かかる参考文献又は特許が本発明に対する先行技術として利用可能であるという譲歩を構成すると意図していない。特許請求されていない文言は、本発明の範囲を限定するものと見なしてはならない。ある特定の特徴が、特許請求された発明の構成要素を構成するという本明細書中の任意の記述又は示唆は、添付の請求項に反映されない限り、限定を意図しない。任意の製品への特許番号の表示も、任意のサービスに関連した特許番号の特定も、本明細書中で説明されたすべての実施形態が、かかる製品又はサービスに組み込まれていることを示すものと見なしてはならない。

【図1】

【手続補正書】

【提出日】2023-01-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも約１０ＣＦＵのセグメント細菌、及び
少なくとも約０．０１ｇのフミン質
を含む、動物用飼料製品。

【請求項2】

前記セグメント細菌が、土壌に由来する、請求項１に記載の動物用飼料製品。

【請求項3】

前記フミン質が、リードセッジピートに由来する、請求項１又は２に記載の動物用飼料製品。

【請求項4】

標的動物を飼養する方法であって、前記方法は、
数日間にわたって約０．０１ｇ／日～約１００ｇ／日のフミン質を前記標的動物に投与する工程、及び
少なくとも約１０ＣＦＵという用量のセグメント細菌を前記標的動物に投与する工程
を含む、方法。

【請求項5】

前記セグメント細菌及び前記フミン質が、異なる季節において複数回投与される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記フミン質が、約３日間～約７日間の範囲の期間にわたって前記標的動物に投与される、請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

前記用量のセグメント細菌が、前記期間の初日に前記標的動物に投与される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記セグメント細菌が、土壌に由来する、請求項４から７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記フミン質が、リードセッジピートの形態で投与される、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記リードセッジピートが、多くとも１５重量パーセントの水分という水分含有量まで脱水されている、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

動物飼養製品を調製する方法であって、セグメント細菌をフミン質とブレンドする工程を含む、方法。

【請求項12】

前記セグメント細菌が、
セグメント細菌がコロニー形成している土壌を回収すること、
前記土壌を溶液中でホモジナイズすること、
前記溶液を遠心分離して、残屑を回収すること、及び
前記残屑をペレット化すること
によって調製されたものである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記溶液が、リン酸緩衝食塩水溶液である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記セグメント細菌が、
前記残屑を第２の溶液に再懸濁すること、
前記溶液を勾配培地の上に層化させること、及び
前記勾配培地からセグメント細菌のフィラメントを回収すること
によってさらに調製されたものである、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

前記第２の溶液が、リン酸緩衝食塩水溶液である、請求項１４に方法。

【国際調査報告】