特表 2023-529399 ディスバイオーシスの処置に有用なＡＴＰ加水分解酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-10

(54)【発明の名称】ディスバイオーシスの処置に有用なＡＴＰ加水分解酵素

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20230703BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230703BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20230703BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230703BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230703BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230703BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230703BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230703BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 1/12 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230703BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 13/04 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230703BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20230703BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230703BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20230703BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230703BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20230703BHJP

   A61K 31/513 20060101ALI20230703BHJP

   A61K 31/43 20060101ALI20230703BHJP

   A61K 31/546 20060101ALI20230703BHJP

   A61K 31/4164 20060101ALI20230703BHJP

   A61K 38/14 20060101ALI20230703BHJP

   A61K 47/46 20060101ALN20230703BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55 ZNA

C12N15/63 Z

C12N9/22

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N7/01

C12N1/20 E

A61P1/12

A61P43/00 121

A61K45/00

A61P1/04

A61P3/04

A61P3/10

A61P35/00

A61P31/04

A61P25/18

A61P13/04

A61P37/02

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P17/00

A61P37/06

A61P9/00

A61P37/08

A61P11/06

A61K48/00

A61K38/47

A61K35/76

A61K35/744

A61K31/513

A61K31/43

A61K31/546

A61K31/4164

A61K38/14

A61K47/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022575307

(86)(22)【出願日】2021-06-08

(85)【翻訳文提出日】2023-02-03

(86)【国際出願番号】 EP2021065315

(87)【国際公開番号】W WO2021250010

(87)【国際公開日】2021-12-16

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2020/065849

(32)【優先日】2020-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522470840

【氏名又は名称】エムヴィ バイオセラピューティクス エスエー

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】グラッシ，ファビオ

(72)【発明者】

【氏名】ペルーザ，リサ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA26X

4B065AA46X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA27

4B065CA44

4C076CC01

4C076CC03

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC18

4C076CC21

4C076CC27

4C076CC31

4C076EE56

4C076EE57

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084AA19

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA44

4C084DC22

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA181

4C084ZA361

4C084ZA591

4C084ZA661

4C084ZA701

4C084ZA731

4C084ZA811

4C084ZA891

4C084ZA961

4C084ZB051

4C084ZB081

4C084ZB131

4C084ZB151

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB312

4C084ZB351

4C084ZC351

4C084ZC751

4C086AA01

4C086BC38

4C086BC43

4C086CC04

4C086CC12

4C086CC15

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

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4C086ZA59

4C086ZA66

4C086ZA70

4C086ZA73

4C086ZA81

4C086ZA89

4C086ZA96

4C086ZB05

4C086ZB08

4C086ZB13

4C086ZB15

4C086ZB26

4C086ZB35

4C086ZC35

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4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC55

4C087BC83

4C087CA10

4C087CA12

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA18

4C087ZA36

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZA70

4C087ZA73

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZA96

4C087ZB05

4C087ZB08

4C087ZB13

4C087ZB15

4C087ZB26

4C087ZB35

4C087ZC35

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、ＡＴＰ加水分解酵素、ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または宿主細胞、細菌などの微生物、またはＡＴＰ加水分解酵素をコードする、かかる核酸を含むウイルス粒子を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、
ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記核酸を含む宿主細胞、前記核酸を含む微生物、前記核酸を含む（組換え）細菌、または前記核酸を含むウイルス粒子。

【請求項2】

ディスバイオーシスの間または後の、マイクロバイオームのバランスの回復または改善における使用のための、
ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記核酸を含む宿主細胞、前記核酸を含む微生物、前記核酸を含む（組換え）細菌、または前記核酸を含むウイルス粒子。

【請求項3】

ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、ＡＴＰ加水分解酵素。

【請求項4】

前記ＡＴＰ加水分解酵素が、可溶性ＡＴＰ加水分解酵素である、請求項１から３のいずれかに記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素。

【請求項5】

前記ＡＴＰ加水分解酵素が、アピラーゼである、請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素。

【請求項6】

前記アピラーゼが、細菌由来のアピラーゼまたは植物由来のアピラーゼである、請求項５に記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素。

【請求項7】

前記ＡＴＰ加水分解酵素が、配列番号１で表されるアミノ酸配列、または少なくとも７０％、８０％、または９０％の配列同一性を有する、その配列変異体を含む、請求項１から６のいずれかに記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素。

【請求項8】

ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、請求項４から７のいずれかに定義される前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、核酸。

【請求項9】

前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸が、ベクターである、請求項１、２、または７に記載の使用のための核酸。

【請求項10】

前記核酸が、前記ＡＴＰ加水分解酵素の（異種）発現のための異種エレメントをさらに含む、請求項１、２、７、または８のいずれかに記載の使用のための核酸。

【請求項11】

ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、請求項８から１０のいずれかに定義される前記核酸を含むことを特徴とする、宿主細胞。

【請求項12】

前記宿主細胞が、原核細胞または真核細胞である、請求項１、２、または１１に記載の使用のための宿主細胞。

【請求項13】

前記宿主細胞が、前記ＡＴＰ加水分解酵素を異種発現する組換え宿主細胞である、請求項１、２、１１、または１２に記載の使用のための宿主細胞。

【請求項14】

ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、請求項８から１０のいずれかに定義される前記核酸を含むことを特徴とする、微生物。

【請求項15】

前記微生物が、古細菌、細菌、および真核生物から選択される、請求項１、２、または１４に記載の使用のための微生物。

【請求項16】

前記微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．からなる群から選択される、請求項１、２、１４、または１５に記載の使用のための微生物。

【請求項17】

前記微生物が、プロバイオティクスとして提供される、請求項１、２、および１４から１６のいずれかに記載の使用のための微生物。

【請求項18】

前記微生物の病原性が、弱毒化されている、請求項１、２、および１４から１７のいずれかに記載の使用のための微生物。

【請求項19】

前記微生物が、前記ＡＴＰ加水分解酵素を異種発現する組換え微生物である、請求項１、２、および１４から１７のいずれかに記載の使用のための微生物。

【請求項20】

ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、請求項８から１０のいずれかに定義される前記核酸を含むことを特徴とする、（組換え）細菌。

【請求項21】

前記細菌が、前記ＡＴＰ加水分解酵素を異種発現する、請求項１、２、または２０に記載の使用のための細菌。

【請求項22】

前記細菌が、グラム陽性菌、グラム陰性菌、およびＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａから選択される、請求項１、２、２０、または２１のいずれかに記載の使用のための細菌。

【請求項23】

前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉからなる群から選択される、請求項１、２、及び２０から２２のいずれかに記載の使用のための細菌。

【請求項24】

前記細菌が、Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株のＥ．ｃｏｌｉである、請求項２３に記載の使用のための細菌。

【請求項25】

ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、請求項８から１０のいずれかに定義される前記核酸を含むことを特徴とする、ウイルス粒子。

【請求項26】

前記ウイルス粒子が、バクテリオファージである、請求項１、２、または２５に記載の使用のためのウイルス粒子。

【請求項27】

ディスバイオーシスが、抗生物質、化学療法剤、食事、または母体のディスバイオーシスによって誘発される、請求項１から２６のいずれかに記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素、核酸、宿主細胞、微生物、細菌、又はウイルス粒子。

【請求項28】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子が、組成物に含まれている、請求項１から２７のいずれかに記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素、核酸、宿主細胞、微生物、細菌、又はウイルス粒子。

【請求項29】

前記組成物が、薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤をさらに含む医薬組成物である、請求項２８に記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素、核酸、宿主細胞、微生物、細菌、又はウイルス粒子。

【請求項30】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、又は前記ウイルス粒子が、経腸投与経路を介して、好ましくは経口投与を介して投与される、請求項１から２９のいずれかに記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素、核酸、宿主細胞、微生物、細菌、又はウイルス粒子。

【請求項31】

前記ディスバイオーシス関連疾患が、炎症性疾患、胃腸管関連障害、代謝性障害、ＣＮＳ関連障害、癌、及び自己免疫疾患から選択される、請求項１から３０のいずれかに記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素、核酸、宿主細胞、微生物、細菌、又はウイルス粒子。

【請求項32】

前記ディスバイオーシス関連疾患が、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、セリアック病、結腸直腸癌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症、自閉症スペクトラム障害、尿路結石症（ＵＳＤ）、エリテマトーデス、関節リウマチ、全身性強皮症、シェーグレン症候群、抗リン脂質症候群、心血管症候群、アレルギー、及び喘息から選択される、請求項１から３１のいずれかに記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素、核酸、宿主細胞、微生物、細菌、又はウイルス粒子。

【請求項33】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、又は前記ウイルス粒子が、ディスバイオーシス誘発剤と組み合わせて投与される、請求項１から３２のいずれかに記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素、核酸、宿主細胞、微生物、細菌、又はウイルス粒子。

【請求項34】

前記ディスバイオーシス誘発剤が、抗生物質である；好ましくは、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、キノロン、リンコサミド、マクロライド、スルホンアミド、グリコペプチド、アミノグリコシド、カルバペネム、アンサマイシン、カルバセフェム、リポペプチド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリジノン、およびポリペプチドからなる群から選択される；より好ましくは、前記抗生物質が、バンコマイシン、アンピシリン、メトロニダゾール、及びセフォペラゾンからなる群から選択される、請求項３３に記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素、核酸、宿主細胞、微生物、細菌、又はウイルス粒子。

【請求項35】

前記ディスバイオーシス誘発剤が、化学療法剤である；好ましくは、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩの阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体および前駆体類似体、白金ベース剤、レチノイド、並びにビンカアルカロイドおよび誘導体から選択される；例えば、前記化学療法剤が、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）である、請求項３３又は３４に記載の使用のためのＡＴＰ加水分解酵素、核酸、宿主細胞、微生物、細菌、又はウイルス粒子。

【請求項36】

（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細菌と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
の組合せ。

【請求項37】

コードされた前記ＡＴＰ加水分解酵素が、請求項４から７のいずれかに定義されるものである、請求項３６に記載の組合せ。

【請求項38】

前記細菌に含まれる前記核酸が、請求項８から１０のいずれかに定義されるものである、請求項３６または３７に記載の組合せ。

【請求項39】

前記細菌が、請求項２０から２４のいずれかに定義されるものである、請求項３６から３８のいずれかに記載の組合せ。

【請求項40】

前記ディスバイオーシス誘発剤が、抗生物質である；好ましくは、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、キノロン、リンコサミド、マクロライド、スルホンアミド、グリコペプチド、アミノグリコシド、カルバペネム、アンサマイシン、カルバセフェム、リポペプチド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリジノン、およびポリペプチドからなる群から選択される；より好ましくは、前記抗生物質が、バンコマイシン、アンピシリン、メトロニダゾール、及びセフォペラゾンからなる群から選択される、請求項３６から３９のいずれかに記載の組合せ。

【請求項41】

前記ディスバイオーシス誘発剤が、化学療法剤である；好ましくは、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩの阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体および前駆体類似体、白金ベース剤、レチノイド、並びにビンカアルカロイドおよび誘導体から選択される；例えば、前記化学療法剤が、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）である、請求項３６から４０のいずれかに記載の組合せ。

【請求項42】

前記細菌および／または前記ディスバイオーシス誘発剤が、組成物に含まれる、請求項３６から４１のいずれかに記載の組合せ。

【請求項43】

医学における使用のための、請求項３６から４２のいずれかに記載の組合せ。

【請求項44】

ディスバイオーシスの処置における使用のための、請求項３６から４３のいずれかに記載の組合せ。

【請求項45】

（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤；および／または（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子が、繰り返し投与される、請求項３３から３５、４３、および４４のいずれかに記載の使用のための組合せ。

【請求項46】

（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤；および（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子が、同日に投与される、請求項３３から３５及び４３から４５のいずれかに記載の使用のための組合せ。

【請求項47】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子が、前記ディスバイオーシス誘発剤の投与後に投与される、請求項３３から３５及び４３から４６のいずれかに記載の使用のための組合せ。

【請求項48】

（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細菌と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
を含むことを特徴とする、キット。

【請求項49】

コードされた前記ＡＴＰ加水分解酵素が、請求項４から７のいずれかに定義されるものである、請求項４８に記載のキット。

【請求項50】

前記細菌に含まれる前記核酸が、請求項８から１０のいずれかに定義されるものである、請求項４８または４９に記載のキット。

【請求項51】

前記細菌が、請求項２０から２４のいずれかに定義されるものである、請求項４８から５０のいずれかに記載のキット。

【請求項52】

前記ディスバイオーシス誘発剤が、抗生物質である；好ましくは、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、キノロン、リンコサミド、マクロライド、スルホンアミド、グリコペプチド、アミノグリコシド、カルバペネム、アンサマイシン、カルバセフェム、リポペプチド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリジノン、およびポリペプチドからなる群から選択される；より好ましくは、前記抗生物質が、バンコマイシン、アンピシリン、メトロニダゾール、及びセフォペラゾンからなる群から選択される、請求項４８から５１のいずれかに記載のキット。

【請求項53】

前記ディスバイオーシス誘発剤が、化学療法剤である；好ましくは、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩの阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体および前駆体類似体、白金ベース剤、レチノイド、並びにビンカアルカロイドおよび誘導体から選択される；例えば、前記化学療法剤が、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）である、請求項４８から５２のいずれかに記載のキット。

【請求項54】

前記細菌および／または前記ディスバイオーシス誘発剤が、組成物に含まれる、請求項４８から５３のいずれかに記載のキット。

【請求項55】

前記キットが、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸を含む前記細菌との組合せを使用することによって、ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患を処置するための指示が記載されたパッケージインサート又はラベルを含む、請求項４８から５４のいずれかに記載のキット。

【請求項56】

医学における使用、好ましくは、ディスバイオーシスの処置における使用のための、請求項４８から５５のいずれかに記載のキット。

【請求項57】

それを必要とする対象において、ディスバイオーシス及びディスバイオーシス関連疾患の発症リスクを低減する、又はディスバイオーシス及びディスバイオーシス関連疾患を処置する、改善する、若しくは低減するための方法であって、前記対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、
を投与することを含むことを特徴とする、方法。

【請求項58】

それを必要とする対象において、腸内微生物叢のバランスを回復又は改善するための方法であって、前記対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、
を投与することを含むことを特徴とする、方法。

【請求項59】

前記微生物叢のバランスが、ディスバイオーシスの間または後に回復または改善される、請求項５８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ディスバイオーシスの処置、およびディスバイオーシスの処置に有用な剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトの胃腸（ＧＩ）管は、複雑な生態学的ニッチであり、ここでは、生命の３つのドメイン（古細菌、細菌、及び真核生物）及びウイルスが、宿主と密接に関連して共存している（非特許文献１～３）。腸内微生物叢と呼ばれるこの複雑な微生物群集は、宿主と相利共生の関係で共進化しており、エネルギーの獲得、免疫系の発達および機能性などの多くの生理学的機能に影響を与えている（非特許文献４～６）。腸内微生物叢と宿主との間の微妙な平衡は、ヒトの健康における重要な要素である。事実、ディスバイオーシスと呼ばれる、微生物群集構造の組成の変化は、代謝障害（例えば、糖尿病、肥満）（非特許文献７～９）、血圧の変化および心臓病（非特許文献１０）、及び自己免疫（非特許文献１１）などの症例数の増加に関連している。

【0003】

病原体の９０％超が、粘膜表面を通ってヒトに感染する（非特許文献１２）。腸内微生物叢は、直接阻害、バリア維持、免疫調節、及び細菌代謝の４つのメカニズムを通して感染症に対する耐性をもたらす（非特許文献１３）。まとめると、これらのメカニズムは、「コロニー形成抵抗性」を構成する（非特許文献１４）。腸管感染症の保護におけるコロニー形成抵抗性の重要性は、抗生物質で処置されたマウスを感染させるのに必要なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの量が、１００，０００倍減少したことによって示されている（非特許文献１５）。

【0004】

腸内マイクロバイオームのバランスの取れた構造は、宿主の代謝恒常性にとって基本的に重要である。マウスとヒトにおける様々な研究により、肥満が微生物叢の多様性及び量の変化に関連することが示されている。さらに、腸内ディスバイオーシスが、肥満およびインスリン抵抗性の発症に因果関係を有することが示唆されている。事実、コンベンショナルマウスから無菌（ＧＦ）マウスへの糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）により、体脂肪量とインスリン抵抗性が有意に上昇し（非特許文献１６）、これらは、脂肪組織における炎症およびマクロファージの蓄積に関連する（非特許文献１７）。腸内微生物叢は、宿主よりも用途の広いメタボロームをコードしており、健康な微生物叢は、宿主との、安定な機能的代謝相互作用に必要な要件である。

【0005】

肝臓および脂肪酸酸化に関与するその下流の標的におけるＡＭＰプロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）活性を調節することにより（非特許文献１８）、腸内微生物叢は、小腸でのグルコースの取り込みと、遠位腸での短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の生成を促進する（非特許文献１９）。抗生物質処置などによって誘発されるディスバイオーシスは、血清グルコースレベルを低下させ、インスリン感受性を改善する。広範な組織リモデリングと短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の利用可能性の低下は、結腸細胞のエネルギー利用をＳＣＦＡからグルコースにシフトさせることにより、グルコースの恒常性を変化させる（非特許文献２０）。さらに、トリメチルアミンＮ－オキシド（ＴＭＡＯ）レベル、腸内微生物叢依存性代謝産物、および関連するＮ－オキシド（ＴＭＡＯ）生成経路は、肥満及びエネルギー代謝に関連しおり（非特許文献２１及び非特許文献２２）、代謝障害の病因における腸内微生物叢の重要性を強調している。

【0006】

要約すると、ヒトの微生物叢のディスバイオーシスは、多くの疾患に関連している。したがって、ディスバイオーシスを予防または治療するために、いくつかの選択肢が研究されている。長年、抗生物質は、腸の生態系に留めるべき細菌を選択するために投与された（非特許文献２３）。しかし、このストラテジーは、その選択圧と抗生物質耐性菌の出現リスクのために、現在、積極的に回避されている。他のストラテジーとしては、糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）が挙げられ、これは現在、他の治療法に耐性があることが証明されている、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症患者の治療に使用されている（非特許文献２４）。しかし、この治療法はまだ研究段階にあり、特にプロセスが無菌ではなく、汚染物質がドナーから患者に移る可能性があるので、懸念がある。その観点から、プロバイオティクスとプレバイオティクスが、最近、ディスバイオーシスの治療のための有望なツールとして登場した。しかし、特定の状況下では、その効果が制限される場合がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ａｒｕｍｕｇａｍ， Ｍ．， Ｒａｅｓ， Ｊ．， Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ， Ｅ．， Ｌｅ Ｐａｓｌｉｅｒ， Ｄ．， Ｙａｍａｄａ， Ｔ．， Ｍｅｎｄｅ， Ｄ．Ｒ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ， Ｇ．Ｒ．， Ｔａｐ， Ｊ．， Ｂｒｕｌｓ， Ｔ．， Ｂａｔｔｏ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｅｎｔｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４７３， １７４－１８０

【非特許文献2】Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｃ． （２０１２）． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４８６， ２０７－２１４

【非特許文献3】Ｒｅｙｅｓ， Ａ．， Ｈａｙｎｅｓ， Ｍ．， Ｈａｎｓｏｎ， Ｎ．， Ａｎｇｌｙ， Ｆ．Ｅ．， Ｈｅａｔｈ， Ａ．Ｃ．， Ｒｏｈｗｅｒ， Ｆ．， ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ， Ｊ．Ｉ． （２０１０）． Ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｆ ｍｏｎｏｚｙｇｏｔｉｃ ｔｗｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｏｔｈｅｒｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４６６， ３３４－３３８

【非特許文献4】Ｋａｍａｄａ， Ｎ．， Ｓｅｏ， Ｓ．Ｕ．， Ｃｈｅｎ， Ｇ．Ｙ．， ａｎｄ Ｎｕｎｅｚ， Ｇ． （２０１３）． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３， ３２１－３３５

【非特許文献5】Ｍａｓｌｏｗｓｋｉ， Ｋ．Ｍ．， ａｎｄ Ｍａｃｋａｙ， Ｃ．Ｒ． （２０１１）． Ｄｉｅｔ， ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２， ５－９

【非特許文献6】Ｓａｍｐｓｏｎ， Ｔ．Ｒ．， ａｎｄ Ｍａｚｍａｎｉａｎ， Ｓ．Ｋ． （２０１５）． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ． Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ ＆ ｍｉｃｒｏｂｅ １７， ５６５－５７６

【非特許文献7】Ｈｏｌｍｅｓ， Ｅ．， Ｌｏｏ， Ｒ．Ｌ．， Ｓｔａｍｌｅｒ， Ｊ．， Ｂｉｃｔａｓｈ， Ｍ．， Ｙａｐ， Ｉ．Ｋ．， Ｃｈａｎ， Ｑ．， Ｅｂｂｅｌｓ， Ｔ．， Ｄｅ Ｉｏｒｉｏ， Ｍ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｉ．Ｊ．， Ｖｅｓｅｌｋｏｖ， Ｋ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２００８）． Ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｅｔ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４５３， ３９６－４００

【非特許文献8】Ｌａｒｓｅｎ， Ｎ．， Ｖｏｇｅｎｓｅｎ， Ｆ．Ｋ．， ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ， Ｆ．Ｗ．， Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｄ．Ｓ．， Ａｎｄｒｅａｓｅｎ， Ａ．Ｓ．， Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｂ．Ｋ．， Ａｌ－Ｓｏｕｄ， Ｗ．Ａ．， Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， Ｓ．Ｊ．， Ｈａｎｓｅｎ， Ｌ．Ｈ．， ａｎｄ Ｊａｋｏｂｓｅｎ， Ｍ． （２０１０）． Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｄｉｆｆｅｒｓ ｆｒｏｍ ｎｏｎ－ｄｉａｂｅｔｉｃ ａｄｕｌｔｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５， ｅ９０８５

【非特許文献9】Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ， Ｐ．Ｊ．， Ｈａｍａｄｙ， Ｍ．， Ｙａｔｓｕｎｅｎｋｏ， Ｔ．， Ｃａｎｔａｒｅｌ， Ｂ．Ｌ．， Ｄｕｎｃａｎ， Ａ．， Ｌｅｙ， Ｒ．Ｅ．， Ｓｏｇｉｎ， Ｍ．Ｌ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｗ．Ｊ．， Ｒｏｅ， Ｂ．Ａ．， Ａｆｆｏｕｒｔｉｔ， Ｊ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ａ ｃｏｒｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｉｎ ｏｂｅｓｅ ａｎｄ ｌｅａｎ ｔｗｉｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４５７， ４８０－４８４

【非特許文献10】Ｂｌａｓｅｒ， Ｍ．Ｊ． （２００６）． Ｗｈｏ ａｒｅ ｗｅ？ Ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ． ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ７， ９５６－９６０

【非特許文献11】Ｄｉｃｋｓｖｅｄ， Ｊ．， Ｈａｌｆｖａｒｓｏｎ， Ｊ．， Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ， Ｍ．， Ｊａｒｎｅｒｏｔ， Ｇ．， Ｔｙｓｋ， Ｃ．， Ａｐａｊａｌａｈｔｉ， Ｊ．， Ｅｎｇｓｔｒａｎｄ， Ｌ．， ａｎｄ Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｊ．Ｋ． （２００８）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｗｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． ＩＳＭＥ Ｊ ２， ７１６－７２７

【非特許文献12】Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ， Ｐ． （２０１０）． Ｔｈｅ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄｓ． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １５６， Ｓ８－１５

【非特許文献13】ＭｃＫｅｎｎｅｙ， Ｐ．Ｔ．， ａｎｄ Ｐａｍｅｒ， Ｅ．Ｇ． （２０１５）． Ｆｒｏｍ Ｈｙｐｅ ｔｏ Ｈｏｐｅ： Ｔｈｅ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ １６３， １３２６－１３３２

【非特許文献14】Ｌａｗｌｅｙ， Ｔ．Ｄ．， ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ， Ａ．Ｗ． （２０１３）． Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３８， １－１１

【非特許文献15】Ｂｏｈｎｈｏｆｆ， Ｍ．， Ｄｒａｋｅ， Ｂ．Ｌ．， ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｃ．Ｐ． （１９５４）． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｏｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ ｔｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ８６， １３２－１３７

【非特許文献16】Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ， Ｐ．Ｊ．， Ｌｅｙ， Ｒ．Ｅ．， Ｍａｈｏｗａｌｄ， Ｍ．Ａ．， Ｍａｇｒｉｎｉ， Ｖ．， Ｍａｒｄｉｓ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ， Ｊ．Ｉ． （２００６）． Ａｎ ｏｂｅｓｉｔｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｏｒ ｅｎｅｒｇｙ ｈａｒｖｅｓｔ． Ｎａｔｕｒｅ ４４４， １０２７－１０３１

【非特許文献17】Ｃａｅｓａｒ， Ｒ．， Ｒｅｉｇｓｔａｄ， Ｃ．Ｓ．， Ｂａｃｋｈｅｄ， Ｈ．Ｋ．， Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ， Ｃ．， Ｋｅｔｏｎｅｎ， Ｍ．， Ｌｕｎｄｅｎ， Ｇ．Ｏ．， Ｃａｎｉ， Ｐ．Ｄ．， ａｎｄ Ｂａｃｋｈｅｄ， Ｆ． （２０１２）． Ｇｕｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｕｇｍｅｎｔｓ ａｄｉｐｏｓｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｒ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｇｕｔ ６１， １７０１－１７０７

【非特許文献18】Ｂａｃｋｈｅｄ， Ｆ．， Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ， Ｊ．Ｋ．， Ｓｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈ， Ｃ．Ｆ．， ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ， Ｊ．Ｉ． （２００７）． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｂｅｓｉｔｙ ｉｎ ｇｅｒｍ－ｆｒｅｅ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４， ９７９－９８４

【非特許文献19】Ｗｏｌｉｎ， Ｍ．Ｊ． （１９８１）． Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｕｍｅｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１３， １４６３－１４６８

【非特許文献20】Ｚａｒｒｉｎｐａｒ， Ａ．， Ｃｈａｉｘ， Ａ．， Ｘｕ， Ｚ．Ｚ．， Ｃｈａｎｇ， Ｍ．Ｗ．， Ｍａｒｏｔｚ， Ｃ．Ａ．， Ｓａｇｈａｔｅｌｉａｎ， Ａ．， Ｋｎｉｇｈｔ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐａｎｄａ， Ｓ． （２０１８）． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｌｔｅｒｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｂｙ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｇｕｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９， ２８７２

【非特許文献21】Ｏｒｇ， Ｅ．， Ｂｌｕｍ， Ｙ．， Ｋａｓｅｌａ， Ｓ．， Ｍｅｈｒａｂｉａｎ， Ｍ．， Ｋｕｕｓｉｓｔｏ， Ｊ．， Ｋａｎｇａｓ， Ａ．Ｊ．， Ｓｏｉｎｉｎｅｎ， Ｐ．， Ｗａｎｇ， Ｚ．， Ａｌａ－Ｋｏｒｐｅｌａ， Ｍ．， Ｈａｚｅｎ， Ｓ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ， ｐｌａｓｍａ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ， ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＭＥＴＳＩＭ ｃｏｈｏｒｔ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １８， ７０

【非特許文献22】Ｓｃｈｕｇａｒ， Ｒ．Ｃ．， Ｓｈｉｈ， Ｄ．Ｍ．， Ｗａｒｒｉｅｒ， Ｍ．， Ｈｅｌｓｌｅｙ， Ｒ．Ｎ．， Ｂｕｒｒｏｗｓ， Ａ．， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｄ．， Ｂｒｏｗｎ， Ａ．Ｌ．， Ｇｒｏｍｏｖｓｋｙ， Ａ．Ｄ．， Ｈｅｉｎｅ， Ｍ．， Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｔｈｅ ＴＭＡＯ－Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｆｌａｖｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ３ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｂｅｉｇｉｎｇ ｏｆ Ｗｈｉｔｅ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １９， ２４５１－２４６１

【非特許文献23】Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｗ． Ｅ．， Ｊｒ．， Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｃ． Ｃ．： Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｆｌｏｒａ ｂｙ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｉｎ： Ｋｏｏｔ， Ｒ． Ｋ．， Ｓａｎｄｅ， Ｍ． Ａ． （ｅｄ．）： Ｎｅｗ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８４， ｐ． ２１７－２４１

【非特許文献24】Ｓｍｉｔｈ ＭＢ， Ｋｅｌｌｙ Ｃ， Ａｌｍ ＥＪ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１４）． “Ｐｏｌｉｃｙ： Ｈｏｗ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｆａｅｃａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ”． Ｎａｔｕｒｅ． ５０６ （７４８８）： ２９０－２９１． ｄｏｉ：１０．１０３８／５０６２９０ａ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

前記に鑑みて、本発明の目的は、先行技術の欠点を克服し、ディスバイオーシスおよび／またはディスバイオーシス関連疾患の処置または予防に有用な新規薬剤を提供することである。

【0009】

これらの目的は、以下及び添付の特許請求の範囲に示す発明主題によって達成される。

【0010】

以下、本発明を詳細に説明するが、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬は変わる可能性あり、因って、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。特段の断りがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。

【0011】

以下に、本発明の要素について説明する。これら要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の方式で任意の数組み合わせて更なる実施形態を形成することができることが理解されるべきである。記載される様々は実施例及び好ましい実施形態は、明示的に記載した実施形態にのみ、本発明を限定するものではない。この記載は、明示的に記載された実施形態と、任意の数の開示された及び／又は好ましい要素とを組み合わせる実施形態をサポート及び包含すると理解すべきである。更に、特に指定しない限り、本願において記載された全ての要素の任意の入れ換え及び組合せが、本願の記載によって開示されるとみなすべきである。

【0012】

本明細書及びその後に続く特許請求の範囲全体を通して、特に必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、言及された部材、整数、又は工程を含むことを意味するが、その他の言及されていない部材、整数、又は工程を除外することを意味するものではない。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」は、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程が除外される、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の具体的な形態である。本発明において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、用語「からなる（ｃｏｍｓｉｓｔ ｏｆ）」を包含する。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘからなっていてもよく、追加の何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

【0013】

用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の説明（特に、特許請求の範囲）において使用される同様の参照は、本明細書に指定されているか又は文脈上明示的に否定されていない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内の各別個の値を個別に参照する簡易的な方法として機能することを意図する。本明細書において特に指定しない限り、各個別の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。明細書中のいずれの言語も、請求の範囲に記載されていないが、本発明を実施するのに必須である要素であることを示すと解釈されるべきではない。

【0014】

用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含んでいなくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略されることもある。

【0015】

数値ｘに関する用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。

【0016】

ディスバイオーシスの処置のためのＡＴＰ加水分解酵素
第１の態様においては、本発明は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、を提供する。

【0017】

特に、本発明は、例えば、本明細書に記載される、ディスバイオーシス誘発剤によって誘発されるディスバイオーシスの間または後の、マイクロバイオームのバランスの回復または改善における使用のための、ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記核酸を含む宿主細胞、前記核酸を含む微生物、前記核酸を含む（組換え）細菌、または前記核酸を含むウイルス粒子、を提供する。

【0018】

本発明者らは驚くべきことに、ＡＴＰ加水分解酵素（または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞／微生物）の投与が、ディスバイオーシス（の誘発）に対して、効果的に対抗することを見出した。特に、添付の実施例に示されるように、腸内微生物多様性の向上、有用微生物のブルーミング、コロニー形成耐性の維持／回復、および代謝改善が見られた。さらに、実験データは、ＡＴＰ加水分解酵素（または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞／微生物）の投与により、ディスバイオーシスに関連する症状および疾患が効果的に処置されることを示している。したがって、ＡＴＰ加水分解酵素－またはＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸；または、かかる核酸を含む（したがって、ＡＴＰ加水分解酵素を発現する）宿主細胞、微生物、またはウイルス粒子－の投与は、ディスバイオーシスおよびディスバイオーシスに関連する（それによって引き起こされる）疾患を効果的に予防または処置することができる。

【0019】

ディスバイオーシスおよびディスバイオーシス関連疾患
前記ＡＴＰ加水分解酵素－または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸；または、かかる核酸を含む（したがって、ＡＴＰ加水分解酵素を発現する）宿主細胞、微生物、またはウイルス粒子－は、ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患の処置のために使用される、又はディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患の処置のために（そのための医薬の調製のために）使用される。

【0020】

本明細書に使用される用語「ディスバイオーシス」は、微生物群集の分類学的組成およびメタゲノム機能に影響を与える、異常なマイクロバイオーム構造を意味する。したがって、ディスバイオーシスは、微生物叢、特に、ヒトの微生物叢の組成の不均衡である。本明細書に使用される用語「微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）」は、これまでに植物から動物に至るまで研究されたあらゆる多細胞生物中又は上に存在する、片利共生微生物を意味する。特に、微生物叢は、宿主の免疫学的、ホルモン的、代謝的恒常性にとって重要であることが分かっている。特に、微生物叢は、非病原性である。換言すれば、微生物叢は、（通常のバランスの取れた組成では）通常、宿主に疾患を引き起こさない（引き起こすことができない）および／または宿主にとって有害ではない。したがって、微生物叢とそれらの宿主との間の相互作用は、通常、片利共生または相利共生である。微生物叢は、細菌、古細菌、原生生物、真菌、ウイルス、及びファージを含む。解剖学的には、微生物叢は、胃腸管（ＧＩ）、特に、腸（及び口腔、特に、口腔粘膜）、皮膚、結膜、乳腺、膣、胎盤、精液、子宮、卵巣濾胞、肺、及び唾液を含む、多くの組織及び体液のいずれかの上又は中に存在する。ディスバイオーシスは、胃腸管における状態、例えば、小腸の細菌の異常増殖（ＳＩＢＯ）又は小腸の真菌の異常増殖（ＳＩＦＯ）として最も多く報告されている。ある態様では、微生物叢は、胃腸管（ＧＩ）の微生物叢であり、したがって、ディスバイオーシスは、胃腸のディスバイオーシスである。ＧＩ微生物叢は、腸内微生物叢および口腔内微生物叢から選択することができ、したがって、ＧＩディスバイオーシスは、腸内ディスバイオーシスおよび口腔内ディスバイオーシスから選択することができる。腸内ディスバイオーシスは、腸内の微生物叢種の正常なバランスの乱れである。腸内ディスバイオーシスの症状としては、胃のむかつき、吐き気、便秘、下痢、及び膨満感が挙げられる。

【0021】

ディスバイオーシスは、外的因子（例えば、抗生物質または化学療法剤の投与、食事中の一部の物質、身体的および心理的ストレス）および宿主関連因子を含む様々な因子によって誘発され得る。ディスバイオーシスの主因としては、食物由来の障害（高タンパク高脂質食、糖分が多く繊維が少ない食事；食物アレルギー；炭水化物の吸収不良および消化障害）、消化液分泌不良、ストレス、抗生物質／薬物療法、免疫機能の低下、吸収不良、腸感染症、及び胃腸管のｐＨの変化が挙げられる。ある態様では、ディスバイオーシスは、抗生物質によって誘発される。他の実施形態では、ディスバイオーシスは、化学療法剤によって誘発される。

【0022】

要約すると、「ディスバイオーシス」は、微生物叢のバランスが崩れ、その結果、その正常な機能が失われることを意味する。これにより、微生物叢の一部の種が選択的に抑制され、宿主にとって危険なものとなり得る、微生物由来の生成物または代謝産物の生成が制御されず、局所的、全身的、またはより離れた器官にさえも、様々な障害を引き起こし得る。したがって、ディスバイオーシスは、様々な疾患の発現に因果関係がある、異常な微生物の生態学的状態である。

【0023】

ディスバイオーシスでは、通常優勢な微生物叢種が減少する一方で、通常競合するまたは含有される種が増加してボイドを埋めることがある。通常優勢な微生物叢種は通常良性または有用であり、消化を助ける、病原性微生物からの保護を提供するなどの、一連の有用且つ必要な機能を行うので、ディスバイオーシスにおける有用な微生物叢種の選択的抑制により、宿主にとって危険なものとなり得る、微生物由来の生成物または代謝産物の生成が制御されず、局所的、全身的、またはより離れた器官にさえも、様々な障害を引き起こし得る。したがって、ディスバイオーシスは、様々な方法で慢性疾患の発症を引き起こし得る。例えば、病原体とその機能は、ディスバイオーシスにおいて獲得される、又は日和見的に異常増殖することがあり、これにより、コレラ又は連鎖球菌性咽頭炎などの感染症をもたらすが、慢性炎症にもつながる可能性がある。さらに、健康を守る細菌とその機能が失われる、又は抑制されることがあり、その後、特に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尿路結石症（ＵＳＤ）、肥満などの慢性疾患などの疾患の発症を促す。

【0024】

炎症性疾患、胃腸管関連障害、代謝性障害、ＣＮＳ関連障害、癌、及び自己免疫疾患を含む、様々な疾患がディスバイオーシスに関連していることが知られている。したがって、ディスバイオーシス関連疾患は、炎症性疾患、感染症、胃腸管関連障害、代謝障害、ＣＮＳ関連障害、癌、および自己免疫疾患から選択することができる。

【0025】

炎症性疾患の非限定的な例としては、膵炎、歯肉炎、歯周炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、胃炎、腸炎、食道炎、憩室炎、関節リウマチ、および感染性大腸炎が挙げられる。

【0026】

感染症の非限定的な例としては、胃腸感染症、呼吸器感染症、腎臓感染症、並びにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染症などの特定の病原体による感染症が挙げられる。

【0027】

胃腸管関連障害および代謝障害の非限定的な例としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、胃炎、腸炎、食道炎、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、セリアック病、潰瘍、過敏性腸症候群、肥満、糖尿病、及びメタボリックシンドロームが挙げられる。

【0028】

一般に、ディスバイオーシスによって誘発されるまたはそれに関連する疾患の非限定的な例としては、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、セリアック病、結腸直腸癌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症、自閉症スペクトラム障害、尿路結石症（ＵＳＤ）、エリテマトーデス、関節リウマチ、全身性強皮症、シェーグレン症候群、抗リン脂質症候群、心血管症候群、アレルギー、及び喘息が挙げられる。したがって、ディスバイオーシス関連疾患は、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、セリアック病、結腸直腸癌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症、自閉症スペクトラム障害、尿路結石症（ＵＳＤ）、エリテマトーデス、関節リウマチ、全身性強皮症、シェーグレン症候群、抗リン脂質症候群、心血管症候群、アレルギー、及び喘息から選択することができる。

【0029】

ある態様では、ディスバイオーシス関連疾患は、クローン病（ＣＤ）および／または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。ＩＢＤは、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む、結腸および小腸の一群の炎症状態である。ＩＢＤに罹患した個体は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（即ち、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの減少など、片利共生細菌の生物多様性が３０～５０％低下していることが分かっている。

【0030】

ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の「処置」は、予防的処置（例えば、発症リスクの低減）または治療的処置であり得る。本明細書に使用される用語「治療的処置」は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の発症後の処置を意味し、「予防的処置」は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の発症前、または最初の症状の発症前の処置を意味する。特に、「治療的処置」は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の発症前に適用される予防的措置を含まない。ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の発症は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の症状と関連していることが多いため、ヒトまたは動物の対象は、前記対象が、特定のディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患に罹患しているという診断または少なくとも（強い）想定の後に、「治療的に」処置されることが多い。治療的処置は、特に、（１）疾患（状態）を緩和、軽減、改善、または治癒すること、または（２）疾患の進行を阻害または遅延させることを目的とする。しかし、疾患の発症の予防は、通常、治療的処置によって達成することはできない。予防的処置は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の発生のリスクを低減すること、または（発症した場合）ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の程度を予防的に低減することを含む。例えば、ディスバイオーシスの（予防的または治療的）処置は、ディスバイオーシスによって誘発される疾患の予防的処置と考えることができる。

【0031】

本明細書に使用される用語「疾患」は、（病状において）用語「障害」および「状態」と、通常同義であり、相互変換可能に使用されることが意図され（いずれも、ヒトまたは動物の体の異常な状態、又はその部分の、正常な機能を損なっている１つの異常な状態を反映する）、通常、徴候及び症状を区別することによって明らかとなり、ヒトまたは動物の寿命または生活の質を低下させる。

【0032】

ＡＴＰ加水分解酵素およびＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸
本発明の第１の態様によれば、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置に使用することができる。

【0033】

本明細書において、用語「ＡＴＰ加水分解酵素」は、ＡＴＰからＡＤＰへの加水分解、ＡＴＰからＡＭＰへの加水分解、及び／又はＡＤＰからＡＭＰへの加水分解を触媒するあらゆる酵素を意味する。前記酵素としては、アピラーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＡＴＰ－ジホスファターゼ、アデノシンジホスファターゼ、ＡＤＰアーゼ、ＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼ、及びＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＮＴＰＤ１）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の文脈において、いかなるＡＴＰ加水分解酵素が用いられてもよい。

【0034】

ある態様では、前記ＡＴＰ加水分解酵素は内在性ＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＮＴＰＤ１）ではない。内在性ＣＤ３９は、カルシウム及びマグネシウム依存性に、ＡＴＰ及びＡＤＰを加水分解し、ＡＭＰを産生する膜内在性タンパク質である。グルコシル化及び細胞表面膜への局在変化により活性化され、エクトヌクレオチダーゼとしての酵素活性を示す。ＣＤ３９は２つの膜貫通型ドメインにより形質膜に付着する（Ｇｒｉｎｔｈａｌ Ａ，Ｇｕｉｄｏｔｔｉ Ｇ．ＣＤ３９、ＮＴＰＤａｓｅ １、ｉｓ ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｙ ｔｗｏ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｗｈｙ？．Ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ Ｓｉｇｎａｌ．２００６；２（２）：３９１－３９８．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１３０２－００５－５９０７－８）。しかし、上述のように、本発明の文脈においては、可溶性（膜結合性ではない）ＡＴＰ加水分解酵素が好ましい。膜結合性の内在性ＣＤ３９とは異なり、ＣＤ３９を可溶形態のＣＤ３９を得るように改変することができる（Ｇａｙｌｅ ＲＢ ３ｒｄ、Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ ＣＲ，Ｇｉｍｐｅｌ ＳＤ，Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ ＭＡ，Ｃａｓｐａｒｙ ＲＧ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｃ，Ｂｒａｓｅｌ Ｋ，Ｐｒｉｃｅ Ｖ，Ｄｒｏｓｏｐｏｕｌｏｓ ＪＨ，Ｉｓｌａｍ Ｎ，Ａｌｙｏｎｙｃｈｅｖａ ＴＮ，Ｂｒｏｅｋｍａｎ ＭＪ，Ｍａｒｃｕｓ ＡＪ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｃｔｏ－ＡＤＰａｓｅ／ＣＤ３９．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８ Ｍａｙ １；１０１（９）：１８５１－９．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ１７５３）。

【0035】

好ましくは、前記ＡＴＰ加水分解酵素は可溶性であり（分泌されたものであり）、即ち、（形質）膜に結合又は付着していない。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本願発明者は、膜結合酵素と比較し、可溶性ＡＴＰ加水分解酵素は様々な箇所（例えば、体内における様々な箇所）により効率的に到達することができると考える。特に、いかなる理論にも拘束されるものではないが、腸管腔において、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、（ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患に対する）その有益な効果を媒介すると考えられ、即ち、腸内の微生物叢から放出された細胞外ＡＴＰを分解することにより、前記効果を媒介すると考えられる。内在性ＣＤ３９等の膜結合ＡＴＰ加水分解酵素は、該膜結合ＡＴＰ加水分解酵素が存在する組織という限られた範囲にしか活性を示さないため、腸内微生物叢から放出された（大部分の）細胞外ＡＴＰには影響を与えることができず、よって、前記ＡＴＰ加水分解酵素は（形質）膜に付着していないことが好ましい。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素は好ましくは可溶性ＡＴＰ加水分解酵素である。

【0036】

可溶性ＡＴＰ加水分解酵素の例としては、細菌由来（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、特に、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、又はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、特に、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ.、及びポテト由来アピラーゼ、並びに、（組換え）可溶性ＣＤ３９が挙げられる。

【0037】

好ましくは、前記ＡＴＰ加水分解酵素はアピラーゼである。アピラーゼは、ＡＴＰからＡＤＰへの及びＡＤＰからＡＭＰへの一連の加水分解を触媒し、無機リン酸塩を放出するＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼである。特に、アピラーゼは、ＡＴＰに加えて、ＡＤＰ及び他のヌクレオシド三リン酸及びヌクレオシド二リン酸に作用してもよい。アピラーゼは、膜結合状態及び／又は分泌された可溶性の状態で、様々な真核生物中に見つけることができる。

【0038】

一般的に、前記アピラーゼは、あらゆる生体からの自然発生するアピラーゼ配列を有してもよい。ある態様では、前記アピラーゼは内在性アピラーゼではない。言い換えると、前記アピラーゼは、投与対象である生体の内在性アピラーゼとは異なる。ある態様では、前記アピラーゼはヒト内在性アピラーゼではなく、例えば、前記アピラーゼは、非ヒトアピラーゼであってもよい。ある態様では、前記アピラーゼは哺乳類アピラーゼではない。好ましくは、前記アピラーゼは細菌又は植物由来のアピラーゼである。本発明に有用な強力なＡＴＰ加水分解酵素の非限定的な例としては、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．，特に、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、特に、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、 Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．、及びＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ポテト）のアピラーゼ及び可溶性ＣＤ３９が挙げられる。例えば、前記アピラーゼはＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉのアピラーゼ又はＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ポテト）のアピラーゼであってもよい。また、前記アピラーゼは、自然界に存在するアピラーゼと、少なくとも５０％又は６０％、好ましくは少なくとも７０％又は７５％、より好ましくは少なくとも８０％又は８５％、更により好ましくは少なくとも９０％又は９５％、それよりも更により好ましくは少なくとも９７％又は９８％、例えば、少なくとも９９％の配列同一性を示す自然発生アピラーゼの配列変異体であってもよい。特に、前記配列変異体は機能性を示すものであってもよく、即ち、前記配列変異体において、前記アピラーゼのＡＴＰ加水分解機能が保持されている。当業者は、アピラーゼを含み、且つ、特定のアピラーゼのＡＴＰ加水分解機能に重要な活性部位、ドメイン、及び領域（ヌクレオチド結合領域等）を認識する、アノテーションされたタンパク質の配列を提供する多様なバイオインフォマティクスのツールを認識している。したがって、当業者は、ＡＴＰ加水分解機能を保持するためには、アピラーゼにおいてアミノ酸の位置が保持されるべきであることはよく承知している。好ましくは、前記アピラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を含む。また、上述したように、配列番号１の機能性配列変異体を含むみ、即ち、自然界に存在するアピラーゼと、少なくとも５０％又は６０％、好ましくは少なくとも７０％又は７５％、より好ましくは少なくとも８０％又は８５％、更により好ましくは少なくとも９０％又は９５％、それよりも更により好ましくは少なくとも９７％又は９８％、例えば、少なくとも９９％の配列同一性を示す配列番号１の機能性配列変異体を含む。配列番号１の配列変異体において、機能を確実なものとするためＲ１９２は保持されなければならない。

【0039】

前記ＡＴＰ加水分解酵素は如何なる方法により得られたものでもよい。好ましくは、前記ＡＴＰ－加水分解酵素は組換えにより生成される。好ましくは、前記ＡＴＰ－加水分解酵素は組換えにより生成されたアピラーゼである。好ましくは、前記アピラーゼは、組換えにより生成された配列番号１の配列を有するアピラーゼ、又は、上述のように、例えば、少なくとも７０％又は７５％、より好ましくは少なくとも８０％又は８５％、更により好ましくは少なくとも９０％又は９５％、それより更により好ましくは少なくとも９７％又は９８％、例えば、少なくとも９９％の配列同一性を有する前記アピラーゼの配列変異体であって、Ｒ１９２が好ましくは保持されている。組換え体生成のため、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、自然界において前記ＡＴＰ加水分解酵素を発現する細胞又は生体には存在しない核酸によりコードされてもよい。例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素の組換え体生成は、（１）異種発現（前記アピラーゼ配列が、発現に使用される生体とは別の生体に由来する）、（２）発現ベクターに基づく発現（自然界には存在しない；例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素の過剰発現のために）、（３）自然界には存在しないＡＴＰ加水分解酵素（例えば、上述の機能性配列変異体）、又は（１）から（３）のいかなる組合せにより行われてもよい。例えば、ＡＴＰ加水分解酵素を発現する（異種）細胞は、天然の状態では存在していない前記ＡＴＰ加水分解酵素に翻訳後修飾（ＰＴＭ；例えば、グルコシル化）を付与してもよい。かかるＰＴＭは、機能的差異（例えば、低減された免疫原性）を引き起こす。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、自然界に存在するＡＴＰ加水分解酵素とは異なる、翻訳後修飾を有していてもよい。或いは、前記アピラーゼは自然界の原材量から直接使用されてもよい。前記アピラーゼは植物源、動物源、又は細菌源から得られてもよい。前記アピラーゼは精製されたものであってもよく、細胞抽出物（細菌細胞のペリプラズム抽出物）が用いられてもよい。

【0040】

前記ＡＴＰ加水分解酵素はタンパク質／ポリペプチドとして用いられてもよく、また、本明細書において記載されている前記ＡＴＰ加水分解酵素は、核酸に含まれるポリヌクレオチドによりコードされるものでもよい。したがって、本発明は、ディスバイオーシスの処置における使用のための、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子も提供する。核酸（分子）は、核酸成分を含む分子である。通常、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を意味する。核酸分子は、用語「ポリヌクレオチド」と同義語として用いられてもよく、即ち、前記核酸分子は、前記ＡＴＰ加水分解酵素コードするポリヌクレオチドのみからなっていてもよい。或いは、前記核酸分子は、前記ＡＴＰ加水分解酵素コードするポリヌクレオチドと併せて更なる要素を含んでいてもよい。通常、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステルによりそれぞれ共有結合しているヌクレオチドモノマーを含む又はからなるポリマーである。前記用語「核酸分子」は、また、改変された塩基、改変された糖、又は改変された骨格等からなるＤＮＡ又はＲＮＡ等の、改変された核酸分子をも意味する。核酸分子及び／又はポリヌクレオチドの例としては、例えば、組換えポリヌクレオチド、ベクター、オリゴヌクレオチド、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びａｔＲＮＡ等のＲＮＡ分子、及びｃＤＮＡ等のＤＮＡ分子が挙げられる。

【0041】

遺伝コードの冗長性のため、本発明はまた、同じアミノ酸配列をコードする核酸配列の配列変異体を含んでいてもよい。例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列を有するアピラーゼをコードするポリヌクレオチドは、同配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号３のヌクレオチド配列又はその配列変異体を（遺伝コードの冗長性のため）有していてもよい。

【0042】

前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド（又は核酸分子全体）は、前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現のために最適化されていてもよい。例えば、前記ヌクレオチド配列のコドン最適化を行って、前記ＡＴＰ加水分解酵素の作成のための発現システムにおける翻訳の効率を向上してもよい。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化されたものであってもよい。当業者は、コドン最適化の多様なツール、例えば、Ｊｕ Ｘｉｎ Ｃｈｉｎ， Ｂｅｖａｎ Ｋａｉ－Ｓｈｅｎｇ Ｃｈｕｎｇ， Ｄｏｎｇ－Ｙｕｐ Ｌｅｅ， Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ＯｎＬｉｎｅ （ＣＯＯＬ）： ａ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉ－ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ３０， Ｉｓｓｕｅ １５， １ Ａｕｇｕｓｔ ２０１４， Ｐａｇｅｓ ２２１０－２２１２に開示のもの；又はＧｒｏｔｅ Ａ， Ｈｉｌｌｅｒ Ｋ， Ｓｃｈｅｅｒ Ｍ， Ｍｕｎｃｈ Ｒ， Ｎｏｒｔｅｍａｎｎ Ｂ， Ｈｅｍｐｅｌ ＤＣ， Ｊａｈｎ Ｄ， ＪＣａｔ： ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｔｏ ａｄａｐｔ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｔｏ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈｏｓｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００５ Ｊｕｌ １；３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５２６－３１に開示のもの；又は、例えば、ジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ^ＴＭアルゴリズム（ＵＳ ２０１１／００８１７０８ Ａ１に開示）を認識している。

【0043】

また、前記核酸分子は、例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現（異種発現）のために、異種の要素（即ち、前記ＡＴＰ加水分解酵素のためのコード配列として、自然界では同じ核酸分子に存在しない要素）を含んでいてもよい。例えば、核酸分子は、異種プロモーター、異種エンハンサー、異種非翻訳領域（異種ＵＴＲ）（例えば、最適翻訳／発現のための）、異種ポリＡテール等を含んでいてもよい。ある態様では、前記核酸分子は、抗生物質に対する耐性を付与する要素を含んでいてもよい。他の態様では、前記核酸分子は、抗生物質に対する耐性を付与する要素を含んでいない。

【0044】

一般的に、前記核酸分子は、特定の核酸配列を挿入、削除、又は変更するように操作されたものであってもよい。かかる操作による改変としては、これらに限定されるものではないが、制限酵素切断部位を導入する改変、コドン使用頻度を修正する改変、転写及び／又は翻訳調整配列を追加又は最適化する改変等が挙げられる。また、コードされたアミノ酸を変更するように前記核酸を改変させることもできる。例えば、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）のアミノ酸置換、削除及び／又は挿入を前記ＡＴＰ加水分解酵素のアミノ酸配列に行うことも好適である。このような点変異は、安定性、翻訳後修飾、発現量等を変更することができ；共有結合基の付加（例えば、ラベル）のためのアミノ酸を導入することができ；又はタグ（例えば、精製のための）を導入することができる。或いは、核酸配列における変異は、「サイレント」、即ち、上述したように遺伝コードの冗長性のため、アミノ酸配列に反映されていなくてもよい。一般的に、変異は特定の部位に導入され、又は任意に導入され、その後、選択（例えば、分子進化）される。例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸は、任意に又方向性をもって変異させ、前記コードされたアミノ酸に異なる特性を付与してもよい。かかる改変は、最初の改変が保持され、新たな改変が他のヌクレオシド部位に導入される反復プロセスの結果であってもよい。更には、単独の工程により得られた改変が組み合わされてもよい。

【0045】

ある態様では、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、例えば、発現ベクター等のベクターであってもよい。ベクターは、通常、組換え核酸分子、即ち、自然界では存在しない核酸分子である。したがって、前記ベクターは、異種要素（即ち、自然界の他の起源の配列要素）を含んでいてもよい。例えば、前記ベクターは、マルチクローニングサイト、異種プロモーター、異種エンハンサー、（ベクターを含んでいない細胞と比較し、該ベクターを含む細胞を識別する）異種選択マーカー等を含んでいてもよい。本発明の文脈において、ベクターは、所望の核酸配列を組み込む又は保持するのに好適なものである。かかるベクターとしては、収納ベクター、発現ベクター、クローニングベクター、転写ベクター等であってもよい。収納ベクターは、核酸分子を便利に収納することができるベクターである。したがって、前記ベクターは、例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素に対応する配列を含んでいてもよい。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質等の発現物を作成するのに用いられてもよい。例えば、発現ベクターは、（異種）プロモーター配列等の、前記ベクターの一連の配列の転写に必要な配列を含んでいてもよい。クローニングベクターは、通常、核酸配列をベクターに組み込むのに用いられるクローニングサイトを含むベクターである。例えば、クローニングベクターは、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってもよい。転写ベクターは、例えば、ウイルスベクター等、細胞又は生体に核酸分子を転写するのに好適なベクターであってもよい。本発明の文脈において、ベクターは、例えば、ＲＮＡベクター又はＤＮＡベクターであってもよい。例えば、本願の文脈において、ベクターは、クローニングサイト、選択マーカー、及び複製起点のようなベクターの増殖に好適な配列を含んでいてもよい。本願の文脈において、ベクターはプラスミドベクターであってもよい。

【0046】

ある態様において、前記ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、ベクター内に挿入された又はクローニングされた１つ以上のポリヌクレオチドの発現を増強できるものであってもよい。かかる発現ベクターの例としては、バクテリオファージ、自律複製起点（ＡＲＳ）、セントロメア、及びインビトロ又は細胞内で複製できる又は複製させることができる、或いは、動物又は人間の細胞内の特定の位置に核酸セグメントを運ぶことができる他の配列が挙げられる。本発明に使用される発現ベクターとしては、染色体誘導ベクター、エピソーム誘導ベクター、及びウイルス誘導ベクター（例えば、細菌プラスミド又はバクテリオファージから誘導されたベクター、及びコスミド、ファージミド等の、それらの組合せから誘導されたベクター）；及びアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。

【0047】

前記発現ベクターは、プラスミドであってもよい。ホスト（宿主）内で複製及び生存できる如何なるプラスミド発現ベクターが使用されてもよい。

【0048】

細菌における前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現のために、前記発現ベクターは、細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質発現に最適化されたベクターであることが好ましい。かかる発現ベクターは、公知であり、市販されている。例えば、細菌において組換えタンパク質を発現するのに信頼性があり調節可能なシステムを提供するｐＢＡＤベクターシステムを用いてもよい。前記システムは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ－アラビノースの代謝を調節するａｒａＢＡＤオペロンに基づく。前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドは、ｐＢＡＤベクターのａｒａＢＡＤプロモーターの下流に配置され、Ｌ－アラビノースに応答して前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現を発動させ、グルコースにより阻害される。

【0049】

ある態様では、前記発現ベクターは、ミニサークルＤＮＡであってもよい。ミニサークルＤＮＡは、持続的に高いレベルの核酸に有用である。前記サークルベクターは、発現－サイレンシングの細菌配列が欠けていることにより特徴付けられる。例えば、ミニサークルベクターは、複製起点が欠けている点、及び、例えば、β－ラクタマーゼ、ｔｅｔ等の一般的に細菌プラスミドにみられる薬剤選択マーカーが欠ける点において、細菌プラスミドベクターとは異なっている。したがって、ミニサークルＤＮＡはサイズが小さくなり、より効率的な送達を可能とする。

【0050】

ある態様において、前記発現ベクターは、ベクターであってもよい。いかなるウイルスに基づくいかなるウイルスベクターが試剤の担体として用いられてもよい。遺伝子治療に用いられるウイルスシステムの典型的に用いられるクラスは、そのゲノムが宿主細胞のクロマチンに挿入されるか（オンコレトロウイルス及びレンチウイルス）、又は主に染色体外のエピソームとして細胞核中に存続するか（アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、及びヘルペスウイルス）に基づき、２つのグループに分類することができる。したがって、前記ウイルスベクターは、上述のように、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターであってもよい。また、前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルスのいずれかから誘導されたものであってもよい。

【0051】

前記ウイルスベクターは、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターであってもよい。アデノウイルスは、２６Ｋｂｐから４８Ｋｂｐの線状ゲノムを有する、中型２本鎖の非エンベロープＤＮＡである。アデノウイルスは、受容体を介した結合及び内部移行により標的細胞に侵入し、非分割細胞及び分割細胞の両方の核に侵入する。アデノウイルスは、その生存及び複製を宿主細胞に大きく依存し、ホスト（宿主）の複製機構を用いて脊椎動物の細胞の核中で複製することができる。

【0052】

前記ウイルスベクターは、パルボウイルス科のものであってもよい。前記パルボウイルスは、約５，０００ヌクレオチドの長さのゲノムを有する、小さい１本鎖の非エンベロープＤＮＡウイルスの科である。前記ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であってもよい。ＡＡＶは、一般的に、生産的な感染サイクルを開始及び維持するためには他のウイルス（通常、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）と共感染する依存性パルボウイルスである。かかるヘルパーウイルスが不在であっても、ＡＡＶは依然として受容体を介した結合及び内部移行により標的細胞を感染又は形質導入することができ、非分割細胞及び分割細胞の両方の核に侵入する。ヘルパーウイルスが不在ではＡＡＶ感染から子孫ウイルスは生成されないことから、形質導入の範囲は、前記ウイルスが感染した最初の細胞のみに限られる。レトロウイルス、アデノウイルス、及び単純ヘルペスウイルスとは異なり、ＡＡＶはヒト病原性及び毒性がないようである。

【0053】

レトロウイルス科のウイルスに基づくウイルスベクターが用いられてもよい。レトロウイルスは、２つの独特な特徴に特徴付けられる１本鎖のＲＮＡ動物ウイルスを含む。第一に、レトロウイルスのゲノムは、ＲＮＡの２つのコピーからなる二倍体である。第二に、前記ＲＮＡはウイルス粒子内在酵素である逆転写酵素により２本鎖ＤＮＡに転写される。前記２本鎖ＤＮＡ、すなわちプロウイルス、は宿主ゲノムに組み込まれ、前記宿主ゲノムに安定して組込まれた成分として親細胞から子孫細胞へ移される。

【0054】

好ましくは、前記発現ベクターはプラスミドである。或いは、前記発現ベクターは好ましくはバクテリオファージである。前記発現ベクターがプラスミド又はバクテリオファージである場合、前記発現ベクターは細菌細胞及び本発明の組成物に含まれる前記細菌細胞中に形質転換される。前記細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよい。或いは、前記細菌担体は弱毒化されたサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）であってもよい。前記弱毒サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）は、チフス菌（ｓｅｒｏｖａｒ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のものであってもよい。

【0055】

ある態様では、上述のＡＴＰ－加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡ）であってもよい。言い換えると、前記ＡＴＰ－加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＴＰ－加水分解酵素を（異種）発現する生体の遺伝子に組み込まれてもよい。

【0056】

ある態様では、ＤＮＡ断片は、例えば、細菌等の宿主細胞／微生物のゲノムに組み込まれるために、細菌等の宿主細胞／微生物に導入されてもよい。このため、前記ＤＮＡ断片は、例えば、細菌等の宿主細胞／微生物のゲノムに組み込むため、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素の発現するヌクレオチド、特にアピラーゼ（例えば、フレキシネル菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｐｈｏＮ２遺伝子、又はその配列変異体）を含んでいてもよい。例えば、かかるＤＮＡ断片は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＥｃＮ））ゲノムにおけるフレキシネル菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｐｈｏＮ２遺伝子に組み込まれるものであってもよい。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＥｃＮ））ゲノムにおけるフレキシネル菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｐｈｏＮ２遺伝子への組み込むためのＤＮＡ断片の例示は、図５２に示されている。ある態様では、前記ＤＮＡ断片は、マルトデキストリンホスホリラーゼ（ｍａｌＰ）のためのＥｃＮ遺伝子を含んでいてもよく；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）のためのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子を含んでいてもよく；アピラーゼのためのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ遺伝子（ｐｈｏＮ２）を含んでいてもよく；マルトース及びマルトデキストリンオペロンの転写活性剤（ｍａｌＴ）ためのＥｃＮ遺伝子を含んでいてもよく；フリッパーゼ認識標的（Ｆｌｉｐｐａｓｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ［ＦＲＴ］）配列を含んでいてもよく；前記ｃａｔ遺伝子のプロモーター（Ｐ_ｃａｔ）を含んでいてもよく；前記ｐｈｏＮ２遺伝子のプロモーター（Ｐ_ｐｒｏＤ）を含んでいてもよく；前記ｐｈｏＮ２遺伝子のリボソーム結合部位（ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳ）を含んでいてもよく；及び／又は前記ｐｈｏＮ２遺伝子の転写ターミネーター（Ｔ_{ｐｈｏＮ２}）を含んでいてもよい。ある態様では、前記ＥｃＮ ｍａｌＰ遺伝子部位のヌクレオチドは、配列番号６によるもの又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。ある態様では、前記ＥｃＮ ｍａｌＴ遺伝子部位のヌクレオチドは、配列番号７によるもの、又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するその配列変異体である。ある態様では、前記Ｐ_ｐｒｏＤプロモーター、ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子、又はｐｈｏＮ２転写ターミネーターを含む前記ＤＮＡ断片は、配列番号８によるもの又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するその配列変異体であってもよい。ある態様では、前記ＦＲＴ配列に隣接するＥ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片は配列番号９によるもの、又は少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するその配列変異体であってもよい。

【0057】

宿主細胞、微生物、及びウイルス粒子
さらなる態様では、本発明はまた、ディスバイオーシスの処置における使用のための、本明細書に記載の核酸分子、すなわち、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞を提供する。

【0058】

宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってもよい。かかる細胞の例としては、真核細胞（例えば、酵母細胞、動物細胞、又は植物細胞等）及び原核細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ．等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある態様では、前記細胞は、哺乳類細胞株等の哺乳類細胞であってもよい。例としては、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、ヒト肝細胞、及び骨髄腫細胞が挙げられる。

【0059】

前記細胞は、上述のように、（発現）ベクター等の核酸により形質転換又はトランスフェクションされてもよい。前記用語「トランスフェクション」は真核動物／ヒト細胞にＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、プラスミド）等の核酸分子を導入することを意味し、前記用語「形質転換」は、通常、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞又は真菌細胞にＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、プラスミド）等の核酸分子を導入することを意味する。本発明の文脈において、前記用語「トランスフェクション」及び「形質転換」は、例えば、哺乳類細胞及び細菌細胞等の細胞に核酸分子を導入する、当業者に公知の方法のいかなる方法をも包含する。前記方法としては、例えば、エレクトロポレーション、例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づくリポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーに基づくトランスフェクション等を含む。ある態様では、前記導入は非ウイルス性である。細菌細胞の場合、コンピテント細菌を形質転換に使用することができる。

【0060】

また、本発明の細胞は、前記核酸（ベクター）、例えば、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素を発現する核酸により安定的に又は一時的にトランスフェクション又は形質転換されてもよい。ある態様では、前記細胞は、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸（ベクター）により安定的にトランスフェクションされる。他の態様では、前記細胞は、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸（ベクター）により一時的にトランスフェクション／形質転換される。

【0061】

したがって、本発明は、ディスバイオーシスの処置における使用のための、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素を異種発現する組換え宿主細胞を提供する。例えば、前記細胞は、前記ＡＴＰ加水分解酵素とは異なる種の細胞であってもよい。ある態様では、前記細胞の細胞種は、自然界では（かかる）ＡＴＰ加水分解酵素を発現しない。また、前記宿主細胞は、天然の状態では存在していない前記ＡＴＰ加水分解酵素に翻訳後修飾（ＰＴＭ；例えば、グルコシル化）を付与してもよい。かかるＰＴＭは、機能的差異（例えば、低減された免疫原性）を引き起こす。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、自然発生したＡＴＰ加水分解酵素とは異なる、翻訳後修飾を有していてもよい。

【0062】

さらなる態様では、本発明はまた、ディスバイオーシスの処置における使用のための、本明細書に記載の核酸分子、すなわち、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物を提供する。微生物は、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素を異種発現する組換え微生物であってもよい。例えば、微生物は、ＡＴＰ加水分解酵素とは別の種のものであってもよい。ある態様では、微生物は、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素を過剰発現する組換え微生物であり得る。微生物は、生きた微生物であってもよい。

【0063】

本明細書において用いられる用語「微生物」は、単独の細胞形状で又は細胞のコロニーとして存在していてもよい微生物を意味する。通常、用語「微生物」は全ての単細胞生物を含む。したがって、前記微生物は、古細菌及び細菌等の原核生物、並びに、単細胞原生生物、原生動物、菌類、及び植物等の真核生物から選択されてもよい。

【0064】

好ましくは、前記微生物は、細菌等の原核微生物、又は酵母等の真核微生物である。ある態様では、前記微生物は、エンテロバクター属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エルシニア属菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）、リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）、ラクトコッカス属菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、シゲラ属菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、赤痢菌）、シアノ細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、及びサッカロミケス属菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ.）からなる群から選択される。本明細書中で使用される、微生物に関連する表現「属菌（ｓｐｐ．）」は、種、亜種、及びその他等、記載された属に含まれる全てのものを包含することを意図している。

【0065】

ある態様において、前記微生物は、プロバイオティクス（例えば、生菌のプロバイオティクス）として提供されてもよい。本明細書中で使用される用語「プロバイオティクス」は、細菌及び酵母等の生きた微生物であって、消費されることにより、例えば、腸内フローラを改善又は回復することにより健康上の利益を提供するものを意味する。提供される健康上の利益から、上記生菌は食品添加物として用いることができる。例えば、前記生菌は、顆粒、錠剤、又はカプセル中の凍結乾燥されたものであってもよく、或いは、消費される乳製品に直接混合することができる。健康上の利益があることが示された微生物の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、特に、Ｆｉｊａｎ Ｓ． Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｃｌａｉｍｅｄ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｃｅｎｔ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ． Ｉｎｔ Ｊ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｒｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ． ２０１４；１１（５）：４７４５－４７６７． ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｅｒｐｈ１１０５０４７４５、に記載されたそれらのプロバイオティクス株が挙げられ、参照により本明細書に援用する。

【0066】

有毒微生物の場合、前記微生物の毒性を弱毒化させていてもよい。細菌の毒性を弱毒化させる方法としては、公知であり、例えば、ＷＯ２０１８／０８９８４１に記載されている。通常、毒性の弱毒化は、毒性病原体から毒性因子を変異することにより達成することができる。

【0067】

特に、本発明は、ディスバイオーシスの処置における使用のための、本明細書に記載の核酸分子、すなわち、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細菌（細菌細胞）を提供する。したがって、前記宿主細胞は細菌細胞であってもよく、前記微生物は細菌であってもよい。

【0068】

前記細菌は、組換え細菌、即ち、自然界で発生しない細菌、であってもよい。特に、前記組換え細菌は、例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素の異種発現又は過剰発現のための、自然界の細菌には存在しない核酸配列を含んでいてもよい。したがって、前記細菌は前記ＡＴＰ加水分解酵素を異種発現してもよく（即ち、発現されたＡＴＰ加水分解酵素は細菌において自然には存在しないものであってもよく、異なる株や系統等に由来するものでもよい）；又は前記細菌は前記ＡＴＰ加水分解酵素を過剰発現してもよい。本明細書において用いられる用語「過剰発現」は、標的とする（例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする）遺伝子の人工的な増量された発現を意味する。過剰発現は、例えば、標的とする遺伝子をコードする（例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする）核酸分子の数を増やすことにより、及び／又は発現を増加させる調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、又は遺伝子調節要素）を用いることにより等、多様な方法により行うことができる。

【0069】

前記細菌としては、生きた細菌であってもよい。前記細菌が病原体の場合、前記細胞の毒性は、上述のように弱毒化させてもよい。一般的に、前記細菌は、グラム陽性菌又はグラム陰性菌により選択されてもよい。ある態様では、前記細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エルシニア属菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）、及びシゲラ属菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、赤痢菌）から選択された細菌等のグラム陰性菌であってもよく、又は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、エルシニア・エンテロコイチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、及び赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）から選択された細菌等のシアノ細菌であってもよい。ある態様では、前記細菌はグラム陽性菌であってもよい。グラム陽性菌の例としては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）が挙げられる。好ましくは、前記細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、又はサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であってもよい。特に好ましくは、前記細菌は、特に、アピラーゼを（異種）発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、又はサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であってもよい。

【0070】

前記細菌は、上述のように、プロバイオティクス特性を提供するものであってもよい。特に、前記プロバイオティクス・細菌は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、又は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ （ＥｃＮ））等の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のプロバイオティクス株であってもよい。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７）は、便秘（Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋａ Ａ．， Ｓｚａｊｅｗｓｋａ Ｈ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌｓ： Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２０１０；１６：６９－７５）及び炎症性腸疾患（Ｂｅｈｎｓｅｎ Ｊ．， Ｄｅｒｉｕ Ｅ．， Ｓａｓｓｏｎｅ－Ｃｏｒｓｉ Ｍ．， Ｒａｆｆａｔｅｌｌｕ Ｍ． Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｅｘａｍｐｌｅｓ， ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｍｅｄ． ２０１３；３ ｄｏｉ： １０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１００７４）を治療し、消化器疾患、潰瘍性大腸炎、及びクローン病（Ｘｉａ Ｐ．， Ｚｈｕ Ｊ．， Ｚｈｕ Ｇ． Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ａｓ ｓａｆｅ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ－Ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｓｉｎ． ２０１３；５３：５３８－５４４）を緩和することが示されている。

【0071】

さらなる態様では、本発明はまた、ディスバイオーシスの処置における使用のための、本明細書に記載の核酸分子、すなわち、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子を提供する。ウイルス粒子は、組換え微生物、例えば、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素を異種発現するものであってもよい。本明細書に使用される用語「ウイルス粒子」は、ウイルス様粒子だけでなくビリオンも含む。「ビリオン」（「ウイルス」）は、通常、ある細胞から別の細胞に核酸を移すことができる構造体であり、「エンベロープ型」または「非エンベロープ型」であり得る。

【0072】

本明細書で使用される用語「ウイルス様粒子」（又は「ＶＬＰ」）は、特に、様々なウイルスに由来する非複写性のウイルス殻を意味する。ＶＬＰは、ウイルス複製に必要なウイルス成分が欠如しており、よって、ウイルスが高度に弱毒化した状態を示している。ＶＬＰは、一般的に、１つ以上のウイルスタンパク質からなっており、前記タンパク質としては、これらに限定されるものではないが、カプシド、外皮、殻、表面等と称されるタンパク質、及び／又はエンベロープタンパク質、或いは、これらタンパク質から誘導された粒子形成ポリペプチドが挙げられる。ＶＬＰは、適切な発現システムにおいて、タンパク質の組換え発現によって自発的に形成される。ウイルス様粒子及びその製造方法は、公知であり、当業者は熟知しており、複数のウイルスから得られるウイルスタンパク質がＶＬＰを形成するとして知られており、前記ウイルスとしては、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８０： ３５３－６４ （１９９９））、セムリキ森林熱ウイルス（Ｎｏｔｋａ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８０： ３４１－５２ （１９９９））、ヒト・ポリオーマウイルス（Ｇｏｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： ４４６５－９ （１９９９））、ロタウイルス（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、 Ｖａｃｃｉｎｅ １７： １００５－１３ （１９９９））、パルボウイルス（Ｃａｓａｌ、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｖｏｌ ２９、 Ｐａｒｔ ２、 ｐｐ １４１－ １５０ （１９９９））、犬パルボウイルス （Ｈｕｒｔａｄｏ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｖｉｒａｌ． ７０： ５４２２－９ （１９９６））、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｖｉｒａｌ． ７１： ３５ ７２０７－１３ （１９９７））、及びニューカッスル病ウイルスが挙げられる。上記ＶＬＰの形成は、好適な方法により検知することができる。媒体中のＶＬＰを検知する公知の好適な方法の例としては、例えば、電子顕微鏡技術、動的光拡散法（ＤＬＳ）、選択的クロマトグラフィー分離法（例えば、ＶＬＰのイオン交換、疎水性相互作用、及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー）及び密度勾配遠心分離法が挙げられる。更には、ＶＬＰは、公知の方法で分離することができ、例えば、密度勾配遠心分離法により分離し、特徴的な密度での帯形成により特定される。例えば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６０： １４４５－１４５６；及びＨａｇｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒａｌ． ６８：４５０３－４５０５； Ｖｉｎｃｅｎｔｅ、 Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．、 ２０１１； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ－Ｏｈｒｕｍ ａｎｄ Ｒｏｓｓ、 Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ３５４： ５３０７３ （２０１２）を参照。

【0073】

前記ウイルス粒子はヒトに感染性のものでないことが望ましい。特に、バクテリオファージ等の、細菌において感染及び複製するウイルスベクターが用いられてもよい。したがって、本発明は、ディスバイオーシスの処置における使用のための、本明細書に記載の核酸分子、すなわち、本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むバクテリオファージも提供する。バクテリオファージは、細菌及び古細菌中で感染を起こし、複製をするウイルスである。バクテリオファージは、通常、ＤＮＡ又はＲＮＡゲノムをカプセル化したタンパク質からなり、単純または精巧な、様々な異なる構造で存在する。ファージは抗細菌効果を提供するものであってもよい。前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む前記核酸を含むバクテリオファージは、細菌により前記ＡＴＰ加水分解酵素が発現されるように、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を細菌に容易に運ぶことができる。

【0074】

組成物
前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、及び前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子は、それぞれ、組成物中に提供することができる。組成物は、ワクチンであってもよい。したがって、本発明はまた、ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、及び前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子のいずれかを含む（医薬）組成物を提供する。

【0075】

例えば、前記組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を任意に含む医薬組成物であってもよい。前記担体、希釈剤、又は賦形剤は投与を容易にするものであるが、これらは、前記組成物の授与対象にとって有害又は有毒なものであってはならない。通常、担体、希釈剤、及び賦形剤は、前記組成物の「有効」成分ではない。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含むウイルス粒子は、前記組成物の単独有効成分（即ち、特に、治療される病気に対して、薬学的に活性を有する）であってもよい。好ましい担体としては、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウイルス粒子等の、分子量が大きく、ゆっくりと代謝される高分子が挙げられる。

【0076】

薬学的に許容される塩が使用でき、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩等の鉱酸塩、又は、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩等の有機酸塩が使用できる。

【0077】

前記組成物は、媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）を含んでいてもよい。媒介物は、通常、薬学的に許容される化合物等の化合物を保存、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であると理解されている。例えば、前記媒介物は、薬学的に活性な化合物を保存、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であり、生理学的許容される液体であってもよい。前記組成物が処方されると、前記組成物は直接投与対象に投与することができる。ある態様では、組成物は、哺乳類（例えば、投与対象人）に投与するために調整される。

【0078】

ある態様では、前記医薬組成物は、特に複数の投与容量でパッケージ化されている場合、抗菌剤を含んでいてもよい。前記医薬組成物は、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）のような界面活性剤を含んでいてもよい。通常、界面活性剤は低レベル、例えば０．０１％以下で存在している。組成物は、強壮性を付与するためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）をも含んでいてもよい。例えば、１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＣｌが典型的である。

【0079】

更に、医薬組成物は、特に凍結乾燥される場合又は凍結乾燥された材料を戻して得られた材料を含む場合、糖アルコール（例えば、マンニトール）又は二糖類（例えば、スクロース又はトレハロース）を、例えば、１５～３０ｍｇ／ｍｌ程度（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）を含んでいてもよい。凍結乾燥する組成物のｐＨは、凍結乾燥前に、５から８の間、又は５．５から７の間、又は６．１程度に調節されてもよい。

【0080】

医薬組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、更に、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノール等の液体を含んでいてもよい。更に、湿潤又は乳化剤、或いは、ｐＨ緩衝剤等の補助剤が前記組成物に存在していてもよい。前記担体は、投与対象が摂取するため、前記医薬組成物が錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方されるのを可能とする。薬学的に許容される担体の細論はＧｅｎｎａｒｏ（２０００） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、 ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２に開示されている。

【0081】

医薬組成物は、多様な形状で用意されてもよく、多数の経路により投与されてもよい。前記投与経路としては、これらに限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、皮下、経腸、舌下、及び経直腸が挙げられる。好ましくは、前記医薬組成物は、経口投与のために錠剤、カプセル等として用意されてもよく、注射可能なように、例えば、液状溶液又は懸濁液として用意されてもよい。注射前の液状媒介物における溶液又は懸濁液に好適な個体形状が更に含まれ、例えば、前記医薬組成物は凍結乾燥された形状のものであってもよい。

【0082】

前記組成物は、例えば、錠剤又はカプセルとして、スプレーとして、又は（任意に風味付けされた）シロップとして経口投与用に調整されてもよい。経口的に許容される剤形としては、これに限定されるものではないが、カプセル、錠剤、水性懸濁液又は溶液が挙げられる。経口用の錠剤の場合、典型的に用いられる担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤も添加されていてもよい。カプセル形状での経口投与のための好適な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口用に水性懸濁液が必要な場合、有効成分、即ち、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子は、乳化及び懸濁剤と併用されてもよい。必要に応じて、特定の甘味料、香味料又は着色料が添加されていてもよい。前記有効成分は、それ自体では、胃腸管において分解されやすいものであることがある。したがって、前記組成物が胃腸管を用いる経路で投与されるものである場合、前記組成物は、前記ＡＴＰ加水分解酵素が分解されることを防止するが、一度胃腸管から吸収されると前記ＡＴＰ加水分解酵素を放出する成分を含んでいてもよい。前記組成物は、組合せられた組成物が、投与対象に投与させる直前に再構成されるように設計されたキット形状のものでもよい。例えば、凍結乾燥されたＡＴＰ加水分解酵素が、滅菌水又は滅菌緩衝剤と共にキット形状で提供されてもよい。

【0083】

様々な投与経路のために調整された多数の形状の組成物が本発明の範囲含まれ、前記形状としては、これらに限定されるものではないが、注射又は注入等、例えば、ボーラス投与による注射又は持続注入等の非経口投与に好適な形状が含まれる。前記製品が注射又は注入のためのものである場合、油性又は水性媒介物中で懸濁液または乳化液の形状を取っていてもよく、懸濁剤、保存剤、安定剤及び／又は分散剤等の調合剤を含んでいてもよい。或いは、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、乾燥状態のもので、適当な減菌液と共に用いると再構成可能なものであってもよい。ある態様では、前記組成物は注射可能な溶液又は懸濁液として調整されてもよい。液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な、注射前の固体形状として調整することもできる（例えば、保存剤を含む減菌水で戻される凍結乾燥組成物）。例えば、静脈注射、皮膚注射、又は皮下注射、或いは、疾病部位への注射等の注射のため、前記有効成分は、パイロジェンフリーで好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する許容される非経口水性溶液の形状であってもよい。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液等の等張性媒介物を用いて好適な溶液を調整することが十分可能である。必要であれば、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤が含まれていてもよい。注射用としては、前記医薬組成物は、例えばシリンジ中にあらかじめ準備した状態で提供されてもよい。

【0084】

医薬組成物は、通常、ｐＨが５．５から８．５の間であるものであってもよく、ある態様では、ｐＨは６から８の間であってもよく、例えば、７であってもよい。前記ｐＨは、緩衝剤を用いることにより保持されていてもよい。前記組成物は無菌及び／又はパイロジェンフリーであってもよい。前記組成物はグルテンフリーであってもよい。前記組成物は人間に対して等張のものであってもよい。ある態様では、医薬組成物は、密封容器で提供されてもよい。

【0085】

対象に与えられるのが上述のタンパク質、ペプチド、核酸分子、宿主細胞、微生物、ウイルス粒子、又は他の医薬的に有用な化合物である場合、投与は、通常、有効量である、例えば、「予防有効量」又は「治療有効量」（場合により）投与され、これら量は個人に効果を発現させるのに十分な量である。実際の投与量、及び投与の速度及び経時変化は、治療対象の特徴及び重度により異なる。したがって、１つ以上の有効成分の「有効」量は、通常、対象疾患又は症状を治療、改善、減弱、低減、又は予防するのに十分な量、又は検出可能な治療効果を示すのに十分な量である。治療効果としては、病原体の効力又は身体症状の低減又は減弱をも含む。特定の対象に対する厳密な有効量は、対象のサイズ、体重、健康状態、症状の特徴及び程度、並びに投与のために選択された治療法又は治療法の組合せによる。特定の状況における有効量は、日常的に行われる試験によって決定され、医療従事者の判断に委ねられる。

【0086】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子は、更なる活性成分と同一の医薬組成物中に含まれていてもよいし、別の医薬組成物中に含まれていてもよい。したがって、更なる活性成分は、ぞれぞれ、異なる医薬組成物に含まれていてもよい。かかる異なる医薬組成物は、組み合わせて／同時に、又は異なる時に、又は異なる箇所（例えば、人体の異なる箇所）に投与することができる。

【0087】

ある態様では、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、前記組成物中のタンパク質の合計の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）を占めていてもよい。

【0088】

ある態様では、前記組成物は、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸ウイルス粒子を精製した形態で含んでいてもよい。

【0089】

ある場合においては、前記組成物は、前記ＡＴＰ加水分解酵素又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、細胞抽出物を含んでいてもよい。例えば、前記組成物は、前記ＡＴＰ加水分解酵素を発現する細胞、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞からの細胞抽出物を含んでいてもよい。かかる細胞は、前述のように、細菌細胞であってもよい。例えば、前記組成物は、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細菌のペリプラズム抽出物を含んでいてもよい。この文脈において、好ましい細菌（細菌細胞）は上述の通りである。

【0090】

ある態様では、前記組成物はナノカプセルでの投与のために処方されてもよい。好ましくは、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含むウイルス粒子を含む前記組成物は、ナノカプセルでの投与のために処方されてもよい。したがって、本発明は、本明細書に記載の組成物を含むナノカプセルも提供する。特に、本発明は、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド含む核酸を含むウイルス粒子（を含む組成物）を含むナノカプセルを提供する。

【0091】

ナノカプセルは、通常、無毒のポリマー／脂質から形成され、成分を有害な環境から守ることができる。ナノカプセルは、通常、ナノスケールで内部の液体コアをカプセル化するポリマー膜からなる小胞系である。カプセル化の方法は公知であり、前記カプセル化の方法としては、ナノ沈殿、エマルジョン拡散、及び溶媒蒸発が挙げられる。ある態様では、前記ナノカプセルは、経腸投与、特に、経口投与のためのものであってもよい。ナノカプセル及びナノカプセルの作成方法は公知であり、例えば、Ｅｒｄｏｇａｒ Ｎ、 Ａｋｋｉｎ Ｓ、 Ｂｉｌｅｎｓｏｙ Ｅ． Ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ａｎ Ｕｐｄａｔｅｄ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｓｔ Ｄｅｃａｄｅ． Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｆｏｒｍｕｌ． ２０１８；１２（４）：２５２－２６６． ｄｏｉ： １０．２１７４／１８７２２１１３１３６６６１９０１２３１５３７１１に記載されており、その全体を本明細書に援用する。

【0092】

本発明はまた、（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子用意する工程と、（ｉｉ）１つ以上の薬学的に許容される担体と混合する工程とを含む、（医薬）組成物を調製する方法も提供する。

【0093】

ディスバイオーシス及びディスバイオーシス関連疾患の処置
前記したように、本発明は、ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、を提供する。

【0094】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子は、添付の実施例に示されるように、ディスバイオーシス及びディスバイオーシス関連疾患の症状に対抗することができ、且つ、阻害又は軽減することができる。

【0095】

したがって、本発明はまた、それを必要とする対象において、ディスバイオーシス及びディスバイオーシス関連疾患の発症リスクを低減する、又はディスバイオーシス及びディスバイオーシス関連疾患を処置する、改善する、若しくは低減するための方法であって、前記対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、
を投与することを含む方法を提供する。

【0096】

さらに、本発明はまた、それを必要とする対象において、腸内微生物叢のバランスを回復するための方法であって、前記対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、
（ｂ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）前記核酸を含む微生物、または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、
を投与することを含む方法を提供する。

【0097】

ディスバイオーシス及びディスバイオーシス関連疾患は、前記した通りである。

【0098】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子は、１回又は繰り返し（同一治療サイクルで）投与することができる。前記投与は、少なくとも２回、繰り返すことができる。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子は、繰り返し又は継続的に投与されてもよい。前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子は、少なくとも１、２、３、若しくは４週間；２、３、４、５、６、８、１０、若しくは１２か月間；或いは２、３、４、若しくは５年間、繰り返し又は継続的に投与されてもよい。例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子は、１日に２回、１日に１回（例えば、毎日）、２日毎、３日毎、１週間に１回、２週間毎、３週間毎、１月に１回、又は２か月毎、投与されてもよい。

【0099】

ある態様では、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子を、毎日、例えば、（連続して）３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１日以上、投与することができる。他の実施形態では、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子を、１週間に１回または２回、例えば、２又は３週間、投与することができる。

【0100】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子は、様々な経路、例えば、全身的又は局所的に投与することができる。全身的投与の経路としては、一般に、経腸および非経口経路が挙げられ、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、および腹腔内経路を含む。好ましくは、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子は、経腸投与経路を介して投与される。経腸投与経路は、胃腸管を介した投与を意味し、胃管を介した投与と共に、例えば、経口、舌下、及び直腸投与を含む。前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子の経口投与が好ましい。いかなる理論にも拘束されるものではないが、前記ＡＴＰ加水分解酵素は、腸管腔において、すなわち、腸内の微生物叢から放出される細胞外ＡＴＰを分解することによって、その有利な効果を媒介すると考えられる。前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子の経腸投与が前記ＡＴＰ加水分解酵素を胃腸管（腸）に送達するため、この投与経路は、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子にとって好ましい。

【0101】

例えば、（コードされた）ＡＴＰ加水分解酵素は、可溶性ＡＴＰ加水分解酵素であることができ；前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子は、経腸投与経路を介して投与することができる。

【0102】

ある態様では、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患は、または前記対象が、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患に罹患しているという診断又は強い想定の後に、例えば、その症状の検出後に、治療的に処置される。他の実施形態では、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患は、対象が、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患を発症するリスクがある場合、例えば、ディスバイオーシス誘発剤が対象に投与される場合、予防的に処置することができる。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子（ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置用）は、ディスバイオーシス誘発剤と組み合わせて投与して、ディスバイオーシスを誘発する前記薬剤の（副）作用を阻害または低減することができる。

【0103】

特定の実施形態では、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子（ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置用）は、ディスバイオーシス誘発剤の投与の終了後に投与することができる。特に、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子（ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の治療用）の投与は、ディスバイオーシス誘発剤がその主要な薬理作用を示さなくなったときに開始することができる。例えば、抗生物質、化学療法剤、または他の薬物によって誘発されるディスバイオーシスは、通常、ディスバイオーシス誘発剤がその主要な作用（抗生物質、化学療法剤、またはその他の薬物として）を誘発しなくなった後でも、長期間継続する。かかる場合、ディスバイオーシス誘発剤と、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子（ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置用）との有効なタイムウインドウが重複しないので、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子（ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置用）は、ディスバイオーシス誘発剤と「組み合わせ」られない。それにより、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子（ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置用）の作用は、ディスバイオーシス誘発剤の（他の）薬理学的作用（即ち、ディスバイオーシスの誘発以外のディスバイオーシス誘発剤の薬理学的作用）と干渉しない。ディスバイオーシス誘発剤は、通常、ディスバイオーシスを誘発する目的ではなく、他の薬理学的作用のために投与されるが、ディスバイオーシスの誘発は、通常、望ましくない副作用である。

【0104】

一般に、ディスバイオーシスは、外的因子（ディスバイオーシス誘発剤、例えば、抗生物質又は化学療法剤の投与など）、食餌、身体的および心理的ストレス、ならびに内因性／宿主関連因子など、ディスバイオーシスを誘発する任意の因子によって誘発され得る。ディスバイオーシスは、食餌障害（糖分が豊富で繊維が少ない高タンパク高脂質食；食物アレルギー；炭水化物の吸収不良および消化障害）、消化液分泌不良、ストレス、抗生物質／薬理学療法、免疫機能の低下、吸収不良、腸感染症、及び胃腸管のｐＨに起因し得る。ある態様では、ディスバイオーシスは、本明細書に記載のディスバイオーシス誘発剤（例えば、抗生物質または化学療法剤）、食餌、または母体のディスバイオーシスによって誘発され得る。

【0105】

母体のディスバイオーシスは、その子孫に大きな影響を与える可能性がある。したがって、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子は、ディスバイオーシスを患う母親の新生児および乳児の処置にも用いることができる。ある態様では、これは、（ヒトの乳児の場合）１歳までの乳児および新生児を含む。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、１歳までの乳児または新生児に投与することができる。ある態様では、これは、授乳中（および授乳終了後４週間まで）の新生児および乳児を含む。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、授乳中（および授乳終了後４週間まで）の新生児または乳児に投与することができる。

【0106】

特に、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、抗生物質または化学療法による処置、食餌、または母体のディスバイオーシス（新生児および１歳までの乳児）によって引き起こされるディスバイオーシスなどのディスバイオーシス中またはその後のマイクロバイオームのバランスを回復または改善／向上させるために使用することができる。

【0107】

ある態様では、本明細書に記載の（使用のための）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、病原体による感染症のディスバイオーシス誘発作用のリスクの低減、又は、病原体による感染症のディスバイオーシス誘発作用の阻害、予防、改善、若しくは減少のために使用することができる。したがって、本発明はまた、病原体による感染症のディスバイオーシス誘発作用の発生リスクを低減させる、又は、病原体による感染症のディスバイオーシス誘発作用を処置、改善、阻害、または減少させる方法であって、対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、特に、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素；
（ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、特に、本明細書に記載の前記核酸；
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、特に、本明細書に記載の前記宿主細胞；
（ｄ）前記核酸を含む微生物、特に、本明細書に記載の前記微生物；または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、特に、本明細書に記載の前記ウイルス粒子、を投与することを含む方法を提供する。

【0108】

好ましくは、前記感染症は、細菌感染症であり、例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染症である。

【0109】

ある態様では、本明細書に記載の（使用のための）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、低血糖症及び／又は体重減少のディスバイオーシス誘発作用のリスクを低減させる、又は、低血糖症及び／又は体重減少のディスバイオーシス誘発作用を阻害、予防、改善、若しくは減少させるために使用することができる。したがって、本発明はまた、低血糖症及び／又は体重減少のディスバイオーシス誘発作用の発生リスクを低減させる、又は、低血糖症及び／又は体重減少のディスバイオーシス誘発作用を処置、改善、阻害、若しくは減少させる方法であって、対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、特に、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素；
（ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、特に、本明細書に記載の前記核酸；
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、特に、本明細書に記載の前記宿主細胞；
（ｄ）前記核酸を含む微生物、特に、本明細書に記載の前記微生物；または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、特に、本明細書に記載の前記ウイルス粒子、を投与することを含む方法を提供する。

【0110】

ある態様では、本明細書に記載の（使用のための）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、微生物叢の多様性のディスバイオーシスによって誘発される減少のリスクを低減、阻害、予防、改善、又は減少させるために使用することができる。したがって、本発明はまた、微生物叢の多様性のディスバイオーシスによって誘発される減少の発生リスクを低減させる、又は、微生物叢の多様性のディスバイオーシスによって誘発される減少を処置、改善、阻害、若しくは減少させるための方法であって、対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、特に、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素；
（ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、特に、本明細書に記載の前記核酸；
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、特に、本明細書に記載の前記宿主細胞；
（ｄ）前記核酸を含む微生物、特に、本明細書に記載の前記微生物；または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、特に、本明細書に記載の前記ウイルス粒子、を投与することを含む方法を提供する。

【0111】

ある態様では、本明細書に記載の（使用のための）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、ディスバイオーシスによって誘発される腸管内細菌の移行のリスクを低減、阻害、予防、改善、又は減少させるために使用することができる。したがって、本発明はまた、ディスバイオーシスによって誘発される腸管内細菌の移行の発生リスクを低減させる、又は、ディスバイオーシスによって誘発される腸管内細菌の移行を処置、改善、阻害、若しくは減少させるための方法であって、対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、特に、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素；
（ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、特に、本明細書に記載の前記核酸；
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、特に、本明細書に記載の前記宿主細胞；
（ｄ）前記核酸を含む微生物、特に、本明細書に記載の前記微生物；または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、特に、本明細書に記載の前記ウイルス粒子、を投与することを含む方法を提供する。

【0112】

ある態様では、本明細書に記載の（使用のための）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、ディスバイオーシスによって誘発される盲腸の肥大のリスクを低減、阻害、予防、改善、又は減少させるために使用することができる。したがって、本発明はまた、ディスバイオーシスによって誘発される盲腸の肥大の発生リスクを低減させる、又は、ディスバイオーシスによって誘発される盲腸の肥大を処置、改善、阻害、若しくは減少させるための方法であって、対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、特に、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素；
（ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、特に、本明細書に記載の前記核酸；
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、特に、本明細書に記載の前記宿主細胞；
（ｄ）前記核酸を含む微生物、特に、本明細書に記載の前記微生物；または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、特に、本明細書に記載の前記ウイルス粒子、を投与することを含む方法を提供する。

【0113】

ある態様では、本明細書に記載の（使用のための）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、ディスバイオーシスによって誘発される腸の（慢性）炎症のリスクを低減、阻害、予防、改善、又は減少させるために使用することができる。したがって、本発明はまた、ディスバイオーシスによって誘発される腸の（慢性）炎症の発生リスクを低減させる、又は、ディスバイオーシスによって誘発される腸の（慢性）炎症を処置、改善、阻害、若しくは減少させるための方法であって、対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、特に、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素；
（ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、特に、本明細書に記載の前記核酸；
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、特に、本明細書に記載の前記宿主細胞；
（ｄ）前記核酸を含む微生物、特に、本明細書に記載の前記微生物；または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、特に、本明細書に記載の前記ウイルス粒子、を投与することを含む方法を提供する。

【0114】

ある態様では、本明細書に記載の（使用のための）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、ディスバイオーシスによって誘発される腸バリアの破壊のリスクを低減、阻害、予防、改善、又は減少させるために使用することができる。したがって、本発明はまた、ディスバイオーシスによって誘発される腸バリアの破壊の発生リスクを低減させる、又は、ディスバイオーシスによって誘発される腸バリアの破壊を処置、改善、阻害、若しくは減少させるための方法であって、対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、特に、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素；
（ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、特に、本明細書に記載の前記核酸；
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、特に、本明細書に記載の前記宿主細胞；
（ｄ）前記核酸を含む微生物、特に、本明細書に記載の前記微生物；または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、特に、本明細書に記載の前記ウイルス粒子、を投与することを含む方法を提供する。

【0115】

ある態様では、本明細書に記載の（使用のための）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、前記細菌、または前記ウイルス粒子は、ディスバイオーシスによって誘発される代謝機能障害のリスクを低減、阻害、予防、改善、又は減少させるために使用することができる。したがって、本発明はまた、ディスバイオーシスによって誘発される代謝機能の低下の発生リスクを低減させる、又は、ディスバイオーシスによって誘発される代謝機能の低下を処置、改善、阻害、若しくは減少させるための方法であって、対象に、
（ａ）ＡＴＰ加水分解酵素、特に、本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素；
（ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、特に、本明細書に記載の前記核酸；
（ｃ）前記核酸を含む宿主細胞、特に、本明細書に記載の前記宿主細胞；
（ｄ）前記核酸を含む微生物、特に、本明細書に記載の前記微生物；または
（ｅ）前記核酸を含むウイルス粒子、特に、本明細書に記載の前記ウイルス粒子、を投与することを含む方法を提供する。

【0116】

ディスバイオーシスにより低減又は低下され得る（したがって、前記したように処置され得る）代謝機能としては、インスリン抵抗性、肝脂肪沈着、脂肪組織の発達、関節リウマチ、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。

【0117】

ディスバイオーシス誘発剤との併用
特定の状況においては、例えば、特定の疾患および状態を治療するために、ディスバイオーシス誘発剤が投与される。ディスバイオーシス誘発剤の非限定的な例としては、ディスバイオーシスを誘発する、抗生物質および化学療法剤が挙げられるが、経口鉄補給、ならびに他のディスバイオーシス誘発薬物も挙げられる。添付の実施例に示されるように、ディスバイオーシス誘発剤を、ＡＴＰ加水分解酵素またはＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞／微生物と組み合わせて投与すると、ディスバイオーシスを低減または回避することができる。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、またはＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子を、ディスバイオーシス誘発剤と組み合わせることができる。かかる組み合わせにおいて、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子は、ディスバイオーシス誘発剤によって誘発されるディスバイオーシスに対抗する、それを低減、改善、減少、阻害する、又はディスバイオーシス誘発剤によって誘発されるディスバイオーシスのリスクを低減するために用いられることが理解される。

【0118】

したがって、本発明はまた、
（ｉ）本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
の組合せを提供する。

【0119】

本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の核酸と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
の組合せを提供する。

【0120】

本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の宿主細胞と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
の組合せを提供する。

【0121】

本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の微生物と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
の組合せを提供する。

【0122】

本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載のウイルス粒子と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
の組合せを提供する。

【0123】

特に、本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の細菌と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
の組合せを提供する。
特に、前記細菌は、前記ＡＴＰ加水分解酵素、好ましくはアピラーゼを異種発現する組換え細菌である。

【0124】

したがって、本発明は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、
（ｉ）ａ）本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素、
ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の核酸、
ｃ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の宿主細胞；
ｄ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の微生物；
ｅ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載のウイルス粒子；または
ｆ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の細菌と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
の組合せを提供する。

【0125】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、微生物、またはウイルス粒子（例えば、細菌）の詳細な説明は、ディスバイオーシス誘発剤との組合せについても同様に適用される。さらに、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子は、前記組成物に含まれ得る。同様に、ディスバイオーシス誘発剤は、組成物に含まれていてもよい。前記組成物の詳細な説明は、ディスバイオーシス誘発剤を含む組成物についても同様に適用される。さらに、この組合せは、特に、本明細書に記載されるように、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置のために、医学において使用することができる。

【0126】

ディスバイオーシス誘発剤は、例えば、Ｌｅ Ｂａｓｔａｒｄ Ｑ， Ａｌ－Ｇｈａｌｉｔｈ ＧＡ， Ｇｒｅｇｏｉｒｅ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ： ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｏｎ－ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ． Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１８；４７（３）：３３２－３４５． ｄｏｉ：１０．１１１１／ａｐｔ．１４４５１に記載されている。ディスバイオーシス誘発剤としては、ディスバイオーシスを誘発する、抗生物質、化学療法剤、プロトンポンプ阻害剤、スタチン、免疫抑制薬（例えば、糖質コルチコイド）、メトホルミン、抗精神病薬（例えば、非定型抗精神病薬）、および経口鉄補給剤が挙げられる。

【0127】

ある態様では、ディスバイオーシス誘発剤は、抗生物質であり得る。他の実施形態では、ディスバイオーシス誘発剤は、非抗生物質の薬剤であってもよい。ディスバイオーシスを誘発する非抗生物質薬物の例としては、化学療法剤、プロトンポンプ阻害剤、スタチン、免疫抑制剤（例えば、糖質コルチコイド）、メトホルミン、および抗精神病薬（例えば、非定型抗精神病薬）が挙げられる。好ましくは、ディスバイオーシスを誘発する非抗生物質薬物は、化学療法剤またはプロトンポンプ阻害剤である。特に、ディスバイオーシスを誘発する化学療法剤は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤であり得る。ある態様では、ディスバイオーシスを誘発する化学療法剤は、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩの阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体および前駆体類似体、白金ベース剤、レチノイド、並びにビンカアルカロイドおよび誘導体からなる群から選択することができる。ディスバイオーシスを誘発する化学療法剤の具体的な非限定的な例としては、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）およびイリノテカンが挙げられる。

【0128】

ディスバイオーシスを誘発する抗生物質は、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、キノロン、リンコサミド、マクロライド、スルホンアミド、グリコペプチド、アミノグリコシド、カルバペネム、アンサマイシン、カルバセフェム、リポペプチド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリジノン、およびポリペプチドからなる群から選択することができる。

【0129】

ある態様では、前記抗生物質は、アミノグリコシドであることができる。アミノグリコシドの非限定的な例としては、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、およびスペクチノマイシンが挙げられる。

【0130】

ある態様では、前記抗生物質は、アンサマイシンであってもよい。アンサマイシンの非限定的な例としては、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、およびリファキシミンが挙げられる。

【0131】

ある態様では、前記抗生物質は、ロラカルベフなどのカルバセフェムであってもよい。

【0132】

ある態様では、前記抗生物質は、カルバペネムであってもよい。 カルバペネムの非限定的な例としては、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、およびメロペネムが挙げられる。

【0133】

ある態様では、前記抗生物質は、セファロスポリン（例えば、第１、第２、第３、第４、または第５世代）であってもよい。第１世代のセファロスポリンの非限定的な例としては、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、およびセファレキシンが挙げられる。第２世代のセファロスポリンの非限定的な例としては、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、およびセフロキシムが挙げられる。第３世代のセファロスポリンの非限定的な例としては、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、およびセフトリアキソンが挙げられる。第４世代のセファロスポリンの非限定的な例としては、セフェピムが挙げられる。第５世代のセファロスポリンの非限定的な例としては、セフタロリン、フォサミル、およびセフトビプロールが挙げられる。

【0134】

ある態様では、前記抗生物質は、糖ペプチド抗生物質であってもよい。糖ペプチド抗生物質の非限定的な例としては、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、およびオリタバンシンが挙げられる。

【0135】

ある態様では、前記抗生物質は、リンコサミドであってもよい。リンコサミドの非限定的な例としては、クリンダマイシンおよびリンコマイシンが挙げられる。

【0136】

ある態様では、前記抗生物質は、ダプトマイシンなどのリポペプチド抗生物質であってもよい。

【0137】

ある態様では、前記抗生物質は、マクロライドであってもよい。マクロライドの非限定的な例としては、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、およびフィダキソマイシンが挙げられる。

【0138】

ある態様では、前記抗生物質は、アズトレオナムなどのモノバクタムであってもよい。

【0139】

ある態様では、前記抗生物質は、ニトロフランであってもよい。ニトロフランの非限定的な例としては、フラゾリドンおよびニトロフラントインが挙げられる。

【0140】

ある態様では、前記抗生物質は、オキサゾリジノンであってもよい。オキサゾリジノンの非限定的な例としては、リネゾリド、ポジゾリド、ラデゾリド、およびトレゾリドが挙げられる。

【0141】

ある態様では、前記抗生物質は、ペニシリンであってもよい。ペニシリンの非限定的な例としては、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ペニシリンＧ、テモシリン、およびチカルシリンが含まれる。

【0142】

ある態様では、前記抗生物質は、ポリペプチド抗生物質であってもよい。ポリペプチド抗生物質の非限定的な例としては、バシトラシン、コリスチン、およびポリミキシンＢが挙げられる。

【0143】

ある態様では、前記抗生物質は、キノロン／フルオロキノロンであってもよい。キノロン／フルオロキノロンの非限定的な例としては、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、およびテマフロキサシンが挙げられる。

【0144】

ある態様では、前記抗生物質は、スルホンアミドであってもよい。スルホンアミドの非限定的な例としては、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム－スルファメトキサゾール、およびスルホンアミドクリソイジンが挙げられる。

【0145】

ある態様では、前記抗生物質は、テトラサイクリンであってもよい。テトラサイクリンの非限定的な例としては、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびテトラサイクリンが挙げられる。

【0146】

したがって、抗生物質の非限定的な例としては、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、フィダキソマイシン、アズトレオナム、フラゾリドン、ニトロフラントイン、リネゾリド、ポジゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ペニシリンＧ、テモシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム－スルファメトキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン、チニダゾール、およびトリメトプリムが挙げられる。

【0147】

ある態様では、前記抗生物質は、アンピシリンなどのペニシリンであってもよい。ある態様では、前記抗生物質は、セフォペラゾンなどの（第３世代の）セファロスポリンであってもよい。いくつかの例では、前記抗生物質は、バンコマイシンなどの糖ペプチド抗生物質であってもよい。特定の実施形態では、前記抗生物質は、メトロニダゾールであってもよい。特に好ましくは、前記抗生物質は、バンコマイシン、アンピシリン、メトロニダゾール、およびセフォペラゾンからなる群から選択することができ；特に、前記抗生物質は、アンピシリンまたはセフォペラゾンであることができる。

【0148】

ある態様では、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子は、抗生物質と組み合わせて投与されない。

【0149】

一般に、ディスバイオーシス誘発剤は、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、またはウイルス粒子と組み合わせることができる。前記核酸によってコードされるＡＴＰ加水分解酵素は、組み合わされたときにその効果を発揮する、作用の場（例えば、ヒトまたは動物の体内）で、ディスバイオーシス誘発剤が前記ＡＴＰ加水分解酵素と組み合わされるように発現され得る。

【0150】

一般的に、（ｉ）本明細書に記載の前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ－加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子との「組合せ」は、組み合わされた状態で両成分がそれぞれの効果を発揮することができることを意味する。このため、両成分の効果の時間窓は通常重なり合っている。したがって、両成分の効果は、人体又は動物体内で同時に現れる（１つ又は両方の成分が物理的にもはや存在していないとしても）。ある態様では、両成分は、人体又は動物体内で同時に（物理的に）存在していてもよい。

【0151】

したがって、（ｉ）本明細書に記載の前記ディスバイオーシス誘発剤による処置は、（ｉｉ）本明細書に記載の、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子による処置と重複し得る。一方の成分（ｉ）または（ｉｉ）が他方の成分（（ｉ）または（ｉｉ）の他方）と、例えば同日に投与されない場合でも、それらの処置スケジュールは、通常、関連し合っている。これは、本発明の文脈における「組合せ」は、成分（ｉ）および（ｉｉ）のうちの他の成分による処置が既に終了している場合、特に、一方の成分（ｉ）または（ｉｉ）による処置の開始を含まないことを意味する。

【0152】

ある態様では、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、もしくはウイルス粒子の最初の投与は、前記ディスバイオーシス誘発剤による（最後の）処置（例えば、前記ディスバイオーシス誘発剤の最後の投与）の後、１週間以内（好ましくは３日以内、より好ましくは２日以内、さらにより好ましくは１日以内）に開始することができる。ある態様では、前記ディスバイオーシス誘発剤の最初の投与は、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、またはウイルス粒子による（最後の）処置（例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、またはウイルス粒子の最後の投与）の後、１週間以内（好ましくは３日以内、より好ましくは２日以内、さらにより好ましくは１日以内）に開始する。

【0153】

例えば、（ｉ）本明細書に記載の前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子との組合せにおいて、一方の成分（（ｉ）または（ｉｉ））を、１週間に１回または２回投与することができ（例えば、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤）、他方の成分を、１日１回投与することができる（例えば、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子）。この例では、一方の成分の１日１回の投与の数日に、他方の成分も投与される。しかし、別の例では、両成分が１週間に１回投与される場合、いくつかの週では、両成分が投与される場合がある（同日に投与されなくても、処置スケジュールが重複する）。成分の一方が１回だけ投与され、他方の成分が繰り返し投与される場合、通常、一方の成分の１回の投与は、他方の成分の処置サイクル内にある（同日に投与されなくても）。
他の実施形態では、両成分は、重複する期間、すなわち、両成分が投与される少なくとも数日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間、またはそれ以上）、両成分が１日１回投与される。一般に、組合せを達成するために、一方の成分の作用が他方の成分の作用と重複する限り、一方の成分を投与することができる。

【0154】

（ｉ）本明細書に記載の前記ディスバイオーシス誘発剤および／または（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子の投与は、繰り返し（複数回、すなわち、２回以上）の投与、例えば、複数回の注射および／または複数回の経口投与を必要とすることがある。したがって、前記投与は、少なくとも２回、または、例えば１日１回繰り返してもよい。したがって、（ｉ）本明細書に記載の前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、もしくはウイルス粒子とは、繰り返しまたは継続的に投与されてもよい。本明細書に記載の前記ディスバイオーシス誘発剤、および前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、もしくはウイルス粒子は、少なくとも１、２、３、若しくは４週間；２、３、４、５、６、８、１０、若しくは１２か月間；或いは２、３、４、若しくは５年間、繰り返し又は継続的に投与されてもよい。例えば、前記ディスバイオーシス誘発剤モジュレーターは、１日に２回、１日に１回、２日毎、３日毎、１週間に１回、２週間毎、３週間毎、１月に１回、又は２か月毎、投与されてもよい。例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸を含む宿主細胞、微生物、若しくはウイルス粒子は、１日に２回、１日に１回、２日毎、３日毎、１週間に１回、２週間毎、３週間毎、１月に１回、又は２か月毎、投与されてもよい。

【0155】

ある態様では、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤；および／または（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物または、前記ウイルス粒子は、同日に投与される。ある態様では、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤；および／または（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子は、繰り返し投与される。例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子は、１日１回投与されてもよく、前記ディスバイオーシス誘発剤は、他方の成分（前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子）が投与される日に、１週間に１回または２回、投与される。

【0156】

ある態様では、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子とは、略同時に投与してもよい。本願明細書中、「略同時に」とは、特に、同時投与、或いは、成分（ｉ）の投与直後に成分（ｉｉ）投与されること、又はその逆を意味する。当業者であれば、「直後」が第二の投与を準備するのに必要な時間、例えば、「投与器具」（例えば、注射器、ポンプ等）の適切な準備と共に、第二の投与を行う部位を露出させ殺菌するのに必要な時間、を含むことを理解するであろう。同時投与は、また、両成分の投与の期間が重複する場合、又は、例えば、一方の成分が、例えば、注入により、３０分、１時間、２時間、又はそれ以上等長時間にわたって投与され、他方の成分が前記長時間内に投与される場合を含む。

【0157】

好ましくは、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子とは、連続的に投与される。より好ましくは、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤は、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子が投与される前に投与されてもよい。或いは、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤は、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子が投与された後に投与されてもよい。連続投与では、両成分（ｉ）および（ｉｉ）の投与間の時間間隔は、両成分（ｉ）および（ｉｉ）の投与間として、好ましくは１週間以内、より好ましくは３日以内、さらにより好ましくは２日以内、最も好ましくは２４時間以内である。（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子が同日に投与されることが特に好ましい。両成分（ｉ）及び（ｉｉ）の投与間の時間は、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内、例えば、２時間以内または１時間以内であってもよい。

【0158】

前記ディスバイオーシス誘発剤と、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子とは、様々な投与経路、例えば、全身的又は局所的に投与することができる。全身的投与の経路としては、一般に、経腸および非経口経路が挙げられ、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、および腹腔内経路を含む。前記ディスバイオーシス誘発剤と、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子とは、同一または異なる投与経路を介して投与されてもよい。

【0159】

前記したように、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、又は前記ウイルス粒子は、好ましくは、経腸投与経路を介して投与される。同様に、前記ディスバイオーシス誘発剤は、経腸投与経路を介して投与されてもよい。経腸投与経路としては、例えば、経口、舌下、および直腸投与、ならびに胃管を介した投与が挙げられる。経口投与が好ましい場合もある。しかし、前記ディスバイオーシス誘発剤は、非経口投与経路を介して投与されてもよい（例えば、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子を経腸投与経路を介して投与する場合）。非経口投与の非限定的な例としては、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、結節内、腹腔内、および皮下投与経路が挙げられる。ある態様では、前記ディスバイオーシス誘発剤は、静脈内または皮下に投与することができる。

【0160】

特定の実施形態では、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子とは、前記の経腸または非経口経路のいずれかなどの同一投与経路を介して投与される。

【0161】

前記ディスバイオーシス誘発剤と、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子とは、同一組成物中または異なる組成物中に設けられてもよい。好ましくは、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子は、例えば、前記したように、異なる組成物中に設けられてもよい。これにより、異なる他の成分、例えば、異なるビヒクルを、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤、および（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子のために用いることができる。さらに、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子は、異なる投与経路および用量（特に、各用量の関係）で、実際の必要性に応じて調整することができる。

【0162】

キット
本発明はまた、
（ｉ）本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
を含むキットを提供する。

【0163】

本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の核酸と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
を含むキットを提供する。

【0164】

本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の宿主細胞と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
を含むキットを提供する。

【0165】

本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の微生物と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
を含むキットを提供する。

【0166】

本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載のウイルス粒子と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
を含むキットを提供する。

【0167】

特に、本発明はまた、
（ｉ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の細菌と、
（ｉｉ）ディスバイオーシス誘発剤と、
を含むキットを提供する。
特に、前記細菌は、前記ＡＴＰ加水分解酵素、好ましくはアピラーゼを異種発現する組換え細菌である。

【0168】

したがって、本発明は、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置における使用のための、
（ｉ）ａ）本明細書に記載のＡＴＰ加水分解酵素、
ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の核酸、
ｃ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の宿主細胞；
ｄ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の微生物；
ｅ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載のウイルス粒子；または
ｆ）ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、本明細書に記載の細菌と、
（ｉｉ）本明細書に記載のディスバイオーシス誘発剤と、
を含むキットを提供する。

【0169】

前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、微生物、またはウイルス粒子（例えば、細菌）の詳細な説明は、前記キットについても同様に適用される。同様に、前記ディスバイオーシス誘発剤の詳細な説明も、前記キットについて適用される。更に、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む宿主細胞、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む微生物、または前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むウイルス粒子は、前記組成物に含まれ得る。同様に、前記ディスバイオーシス誘発剤は、前記したように、組成物に含まれていてもよい。前記組成物の詳細な説明は、前記ディスバイオーシス誘発剤を含む組成物についても同様に適用される。さらに、前記キットは、特に、本明細書に記載されるように、ディスバイオーシスまたはディスバイオーシス関連疾患の処置のために、医学において使用することができる。

【0170】

ある態様では、かかるキットは、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素とを含む。ある態様では、かかるキットは、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする、前記核酸とを含む。ある態様では、かかるキットは、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、前記宿主細胞とを含む。ある態様では、かかるキットは、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、前記微生物とを含む。ある態様では、かかるキットは、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、前記ウイルス粒子とを含む。したがって、前記ディスバイオーシス誘発剤の詳細な実施形態は、本発明に係るキットにも適用される。したがって、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする前記核酸、または前記宿主細胞、前記微生物、若しくは前記ウイルス粒子の詳細な実施形態は、本発明に係るキットにも適用される。

【0171】

前記キットの様々な成分は、１以上の容器にパッケージすることができる。ある態様では、異なる成分；特に、成分（ｉ）および（ｉｉ）、すなわち、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）本明細書に記載の前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記核酸、前記宿主細胞、前記微生物、または前記ウイルス粒子は、別々の容器中に設けられる。前記各成分を含む別々の容器は、例えば、箱／容器内に一緒に設けてもよい。前記成分は、凍結乾燥または乾燥形態で提供されてもよく、または好適な緩衝液に溶解されていてもよい。例えば、前記キットは、前記ディスバイオーシス誘発剤を含む（医薬）組成物と、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする核酸、又は前記宿主細胞、前記微生物、若しくは前記ウイルス粒子のいずれかを含む（医薬）組成物とを、例えば、各組成物を別々の容器に含んでもよい。前記キットはまた、前記ディスバイオーシス誘発剤と、前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする前記核酸、又は前記宿主細胞、前記微生物、若しくは前記ウイルス粒子のいずれかとの両方を含む（医薬）組成物を含んでもよい。

【0172】

前記キットはまた、例えば、前記成分の保存および／または再構成のための緩衝液、洗浄溶液などを含む、更なる試薬を含んでもよい。

【0173】

さらに、キットオブパーツは、任意に、使用説明書を含んでもよい。好ましくは、前記キットはさらに、（ｉ）前記ディスバイオーシス誘発剤と、（ｉｉ）前記ＡＴＰ加水分解酵素、前記ＡＴＰ加水分解酵素をコードする前記核酸、または前記宿主細胞、前記微生物、若しくは前記ウイルス粒子との組合せを使用することによって、ディスバイオーシス又はディスバイオーシス関連疾患を処置するための指示が記載されたパッケージインサート又はラベルを含む。例えば、前記した本発明に係る組合せを使用するための指示は、投与レジメンを含んでもよい。

【0174】

以下では、添付図面の簡単な説明が与えられる。これらの図面は、本発明をより詳細に説明することを意図している。しかし、これらの図面は、本発明の主題を何ら限定することを意図しない。

【図面の簡単な説明】

【0175】

【図1】図１は、ペリプラズムＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）をコードするｐｈｏＮ２遺伝子を有するｐＨＮＤ１０プラスミドのマップを示す。

【図2】図２は、野生型ｐｈｏｎ２タンパク質のアミノ酸配列（アピラーゼ；配列番号１）を示し、機能喪失型アイソフォームにおけるＲ１９２Ｐ置換の位置（配列番号２）を示す。

【図3】図３は、ｐＨＮＤ１０プラスミドの作成に用いられるｐｈｏＮ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。

【図4】図４は、実施例２において、抗生物質誘発性ディスバイオーシスのマウスモデルにおける処置スケジュールを示す。

【図5】図５は、実施例２において、本明細書に記載されるように処置されたマウスからの盲腸サンプルの１６Ｓシークエンシングによるメタゲノム分析を示す。コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、及びＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスの盲腸サンプルにおける細菌科レベルでのシャノン多様性指数。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図6】図６は、実施例２において、アピラーゼ発現細菌による処置が、ディスバイオーシスの誘発後にベータ多様性を保存することを示す。重み付けされていないＵｎｉｆｒａｃ非類似性マトリックスに基づく細菌のベータ多様性の主座標分析（ＰＣｏＡ）。ＰＥＲＭＡＮＯＶＡを用いた。ｐ＜０．００１。

【図7】図７は、実施例２において、アピラーゼ発現細菌による処置が、ディスバイオーシスからのマイクロバイオームの回復を促進することを示す。ヒートマップは、実験群、即ち、未処置（コントロール）；ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスを区別する盲腸の微生物叢における細菌種を示す。種は、ＤＥＳｅｑ２リードカウントの規格化後のＦＤＲ ｐ値補正を使用するＷａｌｄ検定で、ｐ＜０．０５にしたがって選択した。各行は、１つの種を表し、各列は個々のマウスを表す。未処置（コントロール）、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で検出された種の平均相対存在量（ｌｏｇ１０）を示す。

【図8-1】図８－１は、実施例２において、ＤＥＳｅｑ２リードカウントの規格化後のＦＤＲ ｐ値補正を使用するＷａｌｄ検定で計算される、図７に示されるヒートマップに関連するｐ値を示す。

【図8-2】図８－２は、実施例２において、ＤＥＳｅｑ２リードカウントの規格化後のＦＤＲ ｐ値補正を使用するＷａｌｄ検定で計算される、図７に示されるヒートマップに関連するｐ値を示す。

【図9】図９は、実施例３において、ディスバイオーシスの誘発後のＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染のマウスモデルにおける処置スケジュールを示す。

【図10】図１０は、実施例３において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに感染させたマウスにおける体重変化（％）を示す。平均±ＳＥＭが示される。双方向ＡＮＯＶＡを用いた。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【0176】

【図11】図１１は、実施例３において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに感染させたマウスにおける、感染後６日目の盲腸粘膜固有層における、（ＣＤ４５^＋Ｇｒ１^＋ＣＤ１１ｂ^＋としてゲーティングされる）ＰＭＮ細胞の浸潤の統計分析を示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置し、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに感染させたマウスの盲腸粘膜固有層におけるＰＭＮ細胞の浸潤が低減される。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５。

【図12】図１２は、実施例３において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに感染させたマウスにおける、感染後６日目の盲腸粘膜固有層における、（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６ｃ^＋Ｌｙ６ｇ^－としてゲーティングされる）炎症性単球の浸潤の統計分析を示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置し、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍに感染させたマウスの盲腸粘膜固有層における単球の浸潤が低減される。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図13】図１３は、実施例４において、ディスバイオーシスの誘発後のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染のマウスモデルにおける処置スケジュールを示す。連続４日間、毎日、ＡＢＸを経口経管投与することにより、ディスバイオーシスを誘発させた。抗生物質処置後、回復期に、マウスに、ＰＢＳ（コントロール）または１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を、４日間、経口経管投与した。４日目に、１０^５個のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＶＰＩ １０４６３胞子を、マウスに経口感染させた。

【図14】図１４は、実施例４において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスにおける体重変化（％）を示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置により、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの腸感染による体重減少が緩和される。平均±ＳＥＭが示される。双方向ＡＮＯＶＡを用いた。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図15】図１５は、実施例４において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスにおける臨床スコアの変化を示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置により、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染したマウスの臨床スコアが改善される。平均±ＳＥＭが示される。双方向ＡＮＯＶＡを用いた。^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図16】図１６は、実施例４において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスの生存率（％）を示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置により、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスの生存期間が改善される。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いた。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図17】図１７は、実施例４において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスにおける腸の長さを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置により、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染により誘発される大腸炎が緩和される。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図18】図１８は、実施例４において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスにおける、感染後７２時間での便中リポカイン２レベルを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置により、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染により誘発される腸の炎症が緩和される。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図19】図１９は、実施例４において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスにおける、感染後７２時間での血清中リポカイン２レベルを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置により、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染により誘発される全身性の炎症が緩和される。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図20】図２０は、実施例５において、セフォペラゾンによるディスバイオーシスの誘発後のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染のマウスモデルにおける処置スケジュールを示す。ディスバイオーシスは、５日間、夜に、セフォペラゾン（２．５ｍｇ／マウス）を経口経管投与することにより誘発した。セフォペラゾン処置と共に、１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を朝に、経口経管投与した。６日目に、セフォペラゾン処置を中止し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の経口経管投与は、さらに３日間延長した。次いで、マウスに、１０^５のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＶＰＩ １０４６３胞子を経口感染させた。腸の炎症を評価するために、感染後７２時間でマウスを分析した。

【0177】

【図21】図２１は、実施例５において、図２０に示されるディスバイオーシス／Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染接種モデルにおけるマウスの生存率を示す。感染前、マウスに、２．５ｍｇ／マウスのセフォペラゾンを夜に、１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を朝に、毎日、経口経管投与した。６日目に、セフォペラゾン処置を中止し、細菌による処置のみを、さらに３日間連続して行った。次いで、マウスに、１０^５のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＶＰＩ １０４６３胞子を経口感染させた。未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスの生存率（％）。同図は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置により、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスにおける生存期間が改善されることを示す。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いた。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図22】図２２は、実施例５において、未処置マウス（コントロール）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で前処置し、次いで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスにおける、感染後２４時間での臨床スコアを示す。データから、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置により、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染させたマウスにおける臨床スコアが改善されることを示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ≦０．０５、^＊＊ｐ≦０．０１、^＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。

【図23】図２３は、実施例６において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} 又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を有するＣ５７ＢＬ／６ＧＦマウスの単コロニー形成（ｍｏｎｏｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）のスケジュールを示す。無菌マウスに、５×１０^９ＣＦＵ／マウスのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} 又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経口経管投与し、２８日後、トランスクリプトーム分析を行うために、腸上皮細胞を精製した。

【図24】図２４は、実施例６において、単コロニー形成動物の腸上皮細胞における遺伝子転写を示す。Ｖｏｌｃａｎｏプロットは、各遺伝子（ドット）に関し、ノトバイオートのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} ｖｓＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} ＷＴマウスにおける差次的発現変動［ｌｏｇ_２倍率変化（ｌｏｇ_２ＦＣ）］およびそれに関連する統計的有意性（ｌｏｇ_１０ｐ値）を示す。濃い灰色のドットは、ＦＤＲ補正されたｐ値＜０．０５および｜ｌｏｇ_２ＦＣ｜＞１を有する遺伝子を示す。また、７９個のダウンレギュレートされた遺伝子及び５３個のアップレギュレートされた遺伝子（ＦＤＲ補正されたｐ値＜１０^－５及び｜ｌｏｇ_２ＦＣ｜＞１．５）が、２つの長方形で強調される。

【図25】図２５は、実施例６において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} ｖｓＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} 単コロニー形成マウスにおける遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析による、差次的に発現する遺伝子（ＦＤＲ補正されたｐ値＜０．０５及び｜ｌｏｇ_２ＦＣ｜＞１）の相対発現レベル（Ｚ－スコア）を示す。Ｚ－スコアは、下記式の通り、アップレギュレートされた遺伝子の数からダウンレギュレートされた遺伝子の数を減じ、分析された遺伝子の総数の平方根で除して計算した。

【数1】

【図26】図２６は、実施例６において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} ｖｓＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} 腸上皮細胞における差次的に発現する遺伝子（ＦＤＲ補正されたｐ値＜０．０５及びｌｏｇ_２ＦＣ＞１）の遺伝子オントロジー分析を示す。

【図27】図２７は、実施例７において、コントロール（ＰＢＳ処置）、抗生物質（ＡＢＸ）処置、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける４日間の抗生物質処置および４日間の回復後の血糖変化を示す（図４の図を参照）。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図28】図２８は、実施例８において、セフォペラゾン媒介性ディスバイオーシスのマウスモデルにおける実験スケジュール、および回復プロトコルを示す。セフォペラゾン（２．５ｍｇ／マウス）を、５日間、夜に、経口経管投与することにより、ディスバイオーシスを誘発した。同時に、１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を、朝に、経口経管投与した。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置を、図示されるように、セフォペラゾンによる処置後も行った。

【図29】図２９は、実施例８において、コントロール（ＰＢＳ処置）、セフォペラゾン処置、セフォペラゾン＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびセフォペラゾン＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける実験後の体重変化を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図30】図３０は、実施例８において、コントロール（ＰＢＳ処置）、セフォペラゾン処置、セフォペラゾン＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびセフォペラゾン＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、マウスの体重を基準とする白色脂肪組織沈着のパーセントを示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【0178】

【図31】図３１は、実施例９において、抗生物質誘発性ディスバイオーシスのマウスモデルにおける実験スケジュールを示す。コントロールマウスを除き、４日間連続して、ＡＢＸを毎日、経口経管投与することにより、ディスバイオーシスを誘発した。抗生物質処置と同日に、マウスに、１２時間ごとに、ＰＢＳまたは４０μｇの精製組換えアピラーゼを経口経管投与した。

【図32】図３２は、実施例９において、コントロール（ＰＢＳ処置）、抗生物質（ＡＢＸ）処置、ＡＢＸ＋アピラーゼ処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血糖変化を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図33】図３３は、実施例９において、コントロール（ＰＢＳ処置）、抗生物質（ＡＢＸ）処置、ＡＢＸ＋アピラーゼ処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＷＡＴ沈着（％）を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図34】図３４は、実施例６において、単コロニー形成Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ 動物の腸上皮細胞における遺伝子転写を示す。Ｖｏｌｃａｎｏプロットは、各遺伝子（ドット）に関し、ノトバイオートのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} ｖｓＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスにおける差次的発現［ｌｏｇ_２倍率変化（ｌｏｇ_２ＦＣ）］およびそれに関連する統計的有意性（ｌｏｇｉｃ ｐ値）を示す。２つの象限は、図２４に示されるＷＴマウスで行った実験と同一の実験で最も顕著に制御された遺伝子を強調するために使用される、ＦＤＲ補正されたｐ値＜１０^－５および｜ｌｏｇ_２ＦＣ｜＞１．５に対応する領域を表す。

【図35】図３５は、実施例６において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける体重変化を示す。平均±ＳＥＭが示される。双方向ＡＮＯＶＡを用いた。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図36】図３６は、実施例６において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＧＦマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成されたマウスにおいて測定された空腹時血糖値を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図37】図３７は、実施例６において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＧＦマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成されたマウスにおける血清インスリン量を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５。

【図38】図３８は、実施例６において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＧＦマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成されたマウスにおける白色脂肪組織（ＷＡＴ）沈着の量を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１。

【図39】図３９は、実施例６において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＧＦマウス、又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成されたマウスにおけるグルコース負荷試験（ＧＴＴ）によって決定したグルコース恒常性を示す。平均±ＳＥＭが示される。双方向ＡＮＯＶＡを用いた。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図40】図４０は、実施例６において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成されたＣ５７Ｂｌ／６Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスにおける体重変化を示す。平均±ＳＥＭが示される。双方向ＡＮＯＶＡは、２群間に統計的有意差を示さなかった。

【0179】

【図41】図４１は、実施例６において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成されたＣ５７Ｂｌ／６Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスにおいて測定された空腹時血糖値を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定は、２群間に統計的有意差を示さなかった。

【図42】図４２は、実施例６において、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成されたＣ５７Ｂｌ／６Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスにおけるグルコース負荷試験（ＧＴＴ）によって決定したグルコース恒常性を示す。平均±ＳＥＭが示される。双方向ＡＮＯＶＡ検定は、２群間に統計的有意差を示さなかった。

【図43】図４３は、実施例７において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、総体重を基準とするＷＡＴ沈着を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図44】図４４は、実施例７において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} Ｃ５７ＢＬ／６Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスにおける４日間の抗生物質処置および４日間の回復後の血糖変化を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５。

【図45】図４５は、実施例７において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} Ｃ５７ＢＬ／６Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスにおける、総体重を基準とするＷＡＴ沈着を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図46】図４６は、実施例１０において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおける、総体重を基準とする盲腸の重量を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図47】図４７は、実施例１０において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスのＭＬＮから回収した好気性細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図48】図４８は、実施例１０において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスのＭＬＮから回収した嫌気性細菌のＣＦＵを示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図49】図４９は、実施例１０において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスにおける、総体重を基準とする盲腸の重量を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊＊ｐ＜０．０１。

【図50】図５０は、実施例１０において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７Ｂｌ／６Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスのＭＬＮから回収した好気性細菌のＣＦＵを示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊＊ｐ＜０．０１。

【0180】

【図51】図５１は、実施例１０において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７Ｂｌ／６Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスのＭＬＮから回収した嫌気性細菌のＣＦＵを示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図52】図５２は、実施１１における、ＥｃＮゲノムにおけるＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子の組み込みのためのＤＮＡ断片挿入を示す。ｍａｌＰは、マルトデキストリンホスホリラーゼのためのＥｃＮ遺伝子であり；ｃａｔは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのためのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子であり；ｐｈｏＮ２は、アピラーゼのためのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ遺伝子であり；ｍａｌＴは、マルトース及びマルトデキストリンオペロンの転写活性剤のためのＥｃＮ遺伝子であり；ＦＲＴは、フリッパーゼ認識標的配列であり；Ｐ_ｃａｔは、ｃａｔ遺伝子のプロモーターであり；Ｐ_ｐｒｏＤは、ｐｈｏＮ２遺伝子のプロモーターであり；ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳは、ｐｈｏＮ２遺伝子のリボソーム結合部位であり；Ｔ_{ｐｈｏＮ２}は、ｐｈｏＮ２遺伝子の転写ターミネーターである。

【図53】図５３は、実施例１１におけるＥｃＮ ｍａｌＰ遺伝子部位のヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。ｍａｌＰ終止コドンは太字で示されている。

【図54】図５４は、実施例１１における、ＥｃＮ ｍａｌＴ遺伝子部位のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。ｍａｌＴ開始コドンは太字で示されている。

【図55】図５５は、実施例１１において、前記Ｐ_ｐｒｏＤプロモーター、前記ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳ、前記Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子、及び前記ｐｈｏＮ２転写ターミネーターを含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。前記Ｐ_ｐｒｏＤ配列には下線が付与されている。前記ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳはイタリック体で示されている。前記ｐｈｏＮ２開始及び終止コドンは太字で示されている。前記ｐｈｏＮ２転写ターミネーターは太字のイタリック体で示されている。

【図56】図５６は、実施例１１において、ＦＲＴ配列が隣接（ｆｌａｎｋｅｄ）されたＥ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。前記ｃａｔ開始及び終止コドンは太字で示されている。前記ＦＲＴ配列はイタリック体で示されている。

【図57】図５７は、実施例１１において、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２のｍａｌＰ－ｐｈｏＮ２－ｍａｌＴ組換え遺伝子部位を示す。ｍａｌＰはマルトデキストリンホスホリラーゼのためのＥｃＮ遺伝子を示し；ｐｈｏＮ２はアピラーゼのためのＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ遺伝子を示し；ｍａｌＴはマルトース及びマルトデキストリンオペロンの転写活性剤のためのＥｃＮ遺伝子を示し；ＦＲＴはフリッパーゼ認識標的配列を示し；Ｐ_ｐｒｏＤはｐｈｏＮ２遺伝子のプロモーターを示し；ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳはｐｈｏＮ２遺伝子のリボソーム結合部位を示し；Ｔ_{ｐｈｏＮ２}はｐｈｏＮ２遺伝子の転写ターミネーターを示す。

【図58】図５８は、実施例１１において、非組換えＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｅｌ（ＥｃＮ）抽出物と比較した、組換えＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｅｌ（ＥｃＮ）ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２ペリプラズム抽出物におけるアピラーゼ検出を示す。ＥｃＮ及びＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２クローン１（ｃｌ １）菌は、ＬＢ培地において３７℃で２．５時間培養され、遠心分離により集菌された。各培養菌のペリプラズム断片は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で分離及び沈殿され、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で安定化され、ポリクローナル抗アピラーゼ・ウサギ血清を用いたウェスタンブロット法により分析された。

【図59】図５９は、実施例１１において、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２ペリプラズム抽出物によるＡＴＰの用量依存分解性を示す。ＥｃＮ及びＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２クローン１（ｃｌ １）菌は、ＬＢ培地において３７℃で６時間培養され、遠心分離により集菌された。各培養菌のペリプラズム断片は、分離され、１倍（１×）のリン酸緩衝生理食塩水で透析され、１倍（１×）のリン酸緩衝生理食塩水で段階希釈された。ペリプラズム抽出物（ＰＥ）におけるアピラーゼ活性は、１倍（１×）のリン酸緩衝生理食塩水対する５０μＭのＡＴＰの分解のパーセンテージとして計測された。ＰＥにおけるアピラーゼ活性は、組換えホタルルシフェラーゼ及びその基質であるＤ－ルシフェリンを用いたＡＴＰ依存性生物発光アッセイにより、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．）に従って評価された。

【図60】図６０は、実施例１２において、抗生物質誘発性ディスバイオーシスのモデルを示す実験レイアウトを示す。８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウスを、４つの異なる実験群に無作為に割り当てた：即ち、未処置（コントロール）、抗生物質（ＡＢＸ：マウス１頭当たり、滅菌水２００μｌ中、バンコマイシン１．２５ｍｇ、アンピシリン２．５ｍｇ、およびメトロニダゾール１．２５ｍｇ）で処置、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥｃＮで処置、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２で処置。

【0181】

【図61】図６１は、実施例１２において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋ＥｃＮ、又はＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２処置Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスにおける４日間の抗生物質処置および４日間の回復後（図６０の図を参照）の血糖変化を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図62】図６２は、実施例１２において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋ＥｃＮ、又はＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２処置Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスにおける、総体重を基準とするＷＡＴ沈着を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図63】図６３は、実施例１３において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋ＥｃＮ、又はＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２処置Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスにおける、総体重を基準とする盲腸の重量を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図64】図６４は、実施例１３において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋ＥｃＮ、又はＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２処置Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスのＭＬＮから回収した好気性細菌のＣＦＵを示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図65】図６５は、実施例１３において、コントロール、ＡＢＸ、ＡＢＸ＋ＥｃＮ、又はＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２処置Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスのＭＬＮから回収した嫌気性細菌のＣＦＵを示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図66】図６６は、実施例１４において、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを形質転換するために使用される、アピラーゼをコードするｐｈｏＮ２遺伝子を有するｐＮＺ－Ａｐｙｒプラスミドのマップを示す。Ｐ_ｎｉｓＡ、ｎｉｓｉｎＡ誘導性プロモーター；ＳＰ ｕｓｐ４５：ｕｓｐ４５遺伝子のシグナル配列；ｐｈｏＮ２：Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉアピラーゼ遺伝子；ｒｅｐＣ：複製遺伝子Ｃ；ｒｅｐＡ：複製遺伝子Ａ；ｃａｍＲ（ｃａｔ）：クロラムフェニコール耐性遺伝子。

【図67】図６７は、実施例１５において、総カロリーのパーセンテージとして表される各食餌の各成分の概略図を示す：通常の食餌（ＮＤ：タンパク質２０％および脂肪１５％）およびディスバイオーシスを誘発可能な改変された食餌（ＤＩＤ：タンパク質７％および脂肪５％）。

【図68】図６８は、実施例１５において、５週齢マウスにおけるＤＩＤ用実験レイアウトを示す。５週齢で、雌性Ｃ６７ＢＬ／６マウスを、通常の食餌（ＮＤ：タンパク質２０％および脂肪１５％）またはディスバイオーシスを誘発可能な改変された食餌（ＤＩＤ：タンパク質７％および脂肪５％）のいずれかを摂取するように無作為に割り当てた。この期間中、ＤＩＤマウスに、ＰＢＳまたは１０^１０のＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ またはＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} を、毎日、経口経管投与した。８週間後、ＤＩＤに対するアピラーゼの効果を評価するために、マウスを殺処分し分析した。

【図69】図６９は、実施例１５において、図示される通り、マウスに、所定の食餌を８週間与え、ＰＢＳ又は１０^１０のＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 又はＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＡｐｙｒ} を、毎日、経口経管投与した後、デキストラン－ＦＩＴＣ経口投与後４時間で測定した、血清中のＦＩＴＣ濃度を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図70】図７０は、実施例１５において、ＮＤ、ＤＩＤ、ＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} 処置成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＬＮから回収した好気性細菌のＣＦＵを示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５。

【0182】

【図71】図７１は、実施例１５において、ＮＤ、ＤＩＤ、ＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} 処置成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＬＮから回収した嫌気性細菌のＣＦＵを示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５。

【図72】図７２は、実施例１５において、マウスに、所定の食餌を８週間与え、ＰＢＳ又は１０^１０のＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 又はＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＡｐｙｒ} を、毎日、経管投与した後、測定された便中ＬＣＮ－２濃度を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５。

【図73】図７３は、実施例１６において、ＤＩＤの新生仔モデル用実験レイアウトを示す。８週齢で、雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、通常の食餌（ＮＤ：タンパク質２０％および脂肪１５％）またはディスバイオーシスを誘発可能な改変された食餌（ＤＩＤ：タンパク質７％および脂肪５％）のいずれかを摂取するように無作為に割り当てた。１５日後、ＮＤ及びＤＩＤマウスを、雄性マウスと交配させた。生誕直後から開始して、ＤＩＤの新生仔に、ＰＢＳまたは１０^８のＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ またはＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} を、生誕後２１日目まで、１週間に２回、経口経管投与した。体重、尾の長さ、及び挙動について、毎日、新生仔をモニターした。

【図74】図７４は、実施例１６において、生誕後２１日での、ＮＤ、ＤＩＤ、ＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} マウスにおけるデキストラン－ＦＩＴＣ経口投与後４時間で測定した、血清中のＦＩＴＣ濃度を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図75】図７５は、実施例１６において、ＮＤ、ＤＩＤ、ＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} 処置２１日齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＬＮから回収した好気性細菌のＣＦＵを示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【図76】図７６は、実施例１６において、ＮＤ、ＤＩＤ、ＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} 処置２１日齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＬＮから回収した嫌気性細菌のＣＦＵを示す。破線は、検出下限を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５。

【図77】図７７は、実施例１７において、ＮＤ、ＤＩＤ、ＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、生誕後２１日で測定した体重変化を示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図78】図７８は、実施例１７において、ＮＤ、ＤＩＤ、ＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、生誕後２１日で測定した尾の長さを示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図79】図７９は、実施例１７において、ＮＤ、ＤＩＤ、ＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、生誕後２１日で測定した小腸の長さを示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図80】図８０は、実施例１７において、ＮＤ、ＤＩＤ、ＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、生誕後２１日で測定した結腸の長さを示す。平均±ＳＥＭが示される。両側マンホイットニーＵ検定を使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。実施例

【0183】

以下に、本発明の様々な実施形態及び態様を説明する具体例を提示する。しかし、本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施することができるように与えられるものである。しかし、本発明は、例示される実施形態によって範囲が限定されるものではなく、前記実施形態は、本発明の１つの態様を説明することのみを意図し、機能的に等価な方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載するものに加えて本発明の様々な変形例は、上述の記載、添付図面、及び以下の実施例から当業者に容易に明らかになる。すべてのかかる変形例は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。

【0184】

実施例１：アピラーゼ発現細菌の設計及び作成
アピラーゼを発現する細菌を得るため、ヘマグルチニン（ＨＡ）断片をタグとして有するＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（配列番号１）のペリプラズムＡＴＰジホスホヒドラーゼ（アピラーゼ）を発現する、ｐｈｏＮ２：：ＨＡ融合の全長を、ＰＢＡＤ Ｌ－アラビノース誘導プロモーターの制御下で、プラスミドｐＢＡＤ２８（ＡＴＣＣ ８７３９３８７４０２）のポリリンカー部位にクローニングした。これにより、概ね、下記の論文に従って作成された。Ｓａｎｔａｐａｏｌａ， Ｄ．， Ｄｅｌ Ｃｈｉｅｒｉｃｏ， Ｆ．， Ｐｅｔｒｕｃｃａ， Ａ．， Ｕｚｚａｕ， Ｓ．， Ｃａｓａｌｉｎｏ， Ｍ．， Ｃｏｌｏｎｎａ， Ｂ．， Ｓｅｓｓａ， Ｒ．， Ｂｅｒｌｕｔｔｉ， Ｆ．， ａｎｄ Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ， Ｍ． （２００６）；Ａｐｙｒａｓｅ， ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｐｌａｓｍｉｄ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｈｏＮ２ （ａｐｙ） ｇｅｎｅ， ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｐｒｏｐｅｒ ｕｎｉｐｏｌａｒ ＩｃｓＡ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｒｅａｄ； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８８， ｐ。１６２０－１６２７．

【0185】

コントロールとして、ｐＨＮＤ１９プラスミドを概ね下記の論文に従って作成した。Ｓｃｒｉｂａｎｏ、 Ｄ．、 Ｐｅｔｒｕｃｃａ、 Ａ．、 Ｐｏｍｐｉｌｉ、 Ｍ．、 Ａｍｂｒｏｓｉ、 Ｃ．、 Ｂｒｕｎｉ、 Ｅ．、 Ｚａｇａｇｌｉａ、 Ｃ．、 Ｐｒｏｓｓｅｄａ、 Ｇ．、 Ｎｅｎｃｉｏｎｉ、 Ｌ．、 Ｃａｓａｌｉｎｏ、 Ｍ．、 Ｐｏｌｔｉｃｅｌｌｉ、 Ｆ．、 ｅｔ ａｌ． （２０１４）；Ｐｏｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｈｏＮ２， ａ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ， ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｐｅｒ ＩｃｓＡ ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｏｌｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｌｅ．；ＰｌｏＳ ｏｎｅ ９、 ｅ９０２３０。ｐＨＮＤ１０プラスミドとは異なり、ｐＨＮＤ１９プラスミド（コントロール）は、Ｒ１９２Ｐ置換を有するアピラーゼの機能喪失型アイソフォームをコードするｐｈｏＮ２ _{Ｒ１９２Ｐ}：：ＨＡ融合を含む。

【0186】

図１は、ペリプラズムＡＴＰ－ジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）をコードするｐｈｏＮ２遺伝子を有するｐＨＮＤ１０プラスミドのマップを示す。このマップは、通常、ｐＨＮＤ１９コントロールプラスミドにも適用され、唯一の違いは、Ｒ１９２Ｐ置換を有するアピラーゼの機能喪失型アイソフォームが、野生型アピラーゼの代わりにコードされていることである。図２は野生型ｐｈｏｎ２タンパク質のアミノ酸配列（アピラーゼ；配列番号１）を示し、機能喪失型アイソフォーム（配列番号２）におけるＲ１９２Ｐ置換の位置を示す。ｐＨＮＤ１０プラスミドを生成するのに用いられるｐｈｏＮ２遺伝子のヌクレオチド配列が図３に示される（配列番号３）。

【0187】

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂは、ｐＨＮＤ１０（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ}）又はｐＨＮＤ１９_{Ｒ１９２Ｐ}（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９}）で形質転換され、Ｌ－アラビノース（０．０３％）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）が添加されたＬＢ培地で増殖された。

【0188】

実施例２：アピラーゼ発現細菌の投与は、微生物叢の多様性の、ディスバイオーシスに誘発される減少を軽減する。
ディスバイオーシスからの回復におけるアピラーゼの有利な効果の可能性を調査するために、ディスバイオーシスを誘発したマウスモデルを使用した。抗生物質のミックス（ＡＢＸ：バンコマイシン１．２５ｍｇ、アンピシリン２．５ｍｇ、およびメトロニダゾール１．２５ｍｇ）を、４日間、毎日、経口経管投与することにより、ディスバイオーシスを誘発した。抗生物質による処置後、回復期に、マウスに、ＰＢＳ（コントロール）、または、実施例１に記載される、１０^１０ＣＦＵ（コロニー形成単位）のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 若しくはＲ１９２Ｐアミノ酸置換を有するアピラーゼの機能喪失アイソフォームを発現するＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} ）を、４日間、経口経管投与した。

【0189】

処置スケジュールを図４に示す。８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、４つの異なる実験群に無作為に割り当てた：即ち、未処置（コントロール）、抗生物質（ＡＢＸ：マウス１頭当たり、滅菌水２００μｌ中、バンコマイシン１．２５ｍｇ、アンピシリン２．５ｍｇ、およびメトロニダゾール１．２５ｍｇ）で処置、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} で処置；及び、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置。実験後、マウスをＣＯ_２吸入によって殺処分し、盲腸サンプルを回収した。

【0190】

製造業者の推奨にしたがって、Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、抽出、溶解、およびＤＮＡ単離を行った。０．６ｇの０．１ｍｍガラスビーズを含む２ｍｌのスクリューキャップチューブ中、ｆａｓｔｐｒｅｐ２４装置（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；速度４で４５秒を４サイクル（４ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ ４５ｓ ａｔ ｓｐｅｅｄ ４ ｆｏｌｌｏｗｅｄ））で、ビーズ式破砕を行った。２００μｌの生抽出物を、ＤＮＡ単離用に調製した。単離したＤＮＡの濃度を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ測定（Ｑｕａｎｔ－ｉＴＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＴ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で評価し、完全性を、ランダムサンプル用アガロースゲル電気泳動によって確認した。

【0191】

細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅には、Ｖ３－Ｖ４超可変領域に特異的な、プライマーセットを使用した（Ｆｗ：５’－ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＧＮ ＧＧＣ ＷＧＣ ＡＧ－３’（配列番号４）；及びＲｅｖ：５’－ＧＡＣ ＴＡＣ ＨＶＧ ＧＧＴ ＡＴＣ ＴＡＡ ＴＣＣ－３’（配列番号５））。続いて、イルミナＭｉＳｅｑのプラットフォームと、ｖ２ ５００サイクルキットとを使用して、ＰＣＲライブラリーをシーケンスした。イルミナのｃｈａｓｔｉｔｙフィルターを通った、生成されたペアエンドリードを、ＭｉＳｅｑレポーターソフトウェア ｖ２．６に含まれるイルミナのリアルタイム分析ソフトウェアを使用して、イルミナアダプターレジデュアル（ｒｅｓｉｄｕａｌｓ）のデマルチプレクシング及びトリミングに付した（精製も選択もこれ以上は行わなかった）。読み取りの品質を、ソフトウェア ＦａｓｔＱＣ バージョン０．１１．８で確認した。配列を、Ｑｉｉｍｅ２バーチャル環境で分析した（Ｂｏｌｙｅｎ Ｅ， Ｒｉｄｅｏｕｔ ＪＲ， Ｄｉｌｌｏｎ ＭＲ， ｅｔ ａｌ． ２０１９． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ， ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ， ｓｃａｌａｂｌｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｄａｔａ ｓｃｉｅｎｃｅ ｕｓｉｎｇ ＱＩＩＭＥ ２． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７： ８５２－８５７． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８７－０１９－０２０９－９）。生配列は、合計で、４’８９６’７７０（メジアン＝７１９４２、平均＝７２’０１１．３、ＳＤ＝１５’８９１．２）であった。最初の７塩基と最後の２５塩基のトリミング工程と、読み取りろ過（ｒｅａｄｓ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）とによって、優れた品質の配列（Ｐｈｒｅｄ＞３０）が得られた。デノイジングアルゴリズム（ＤＡＤＡ２ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ； Ｃａｌｌａｈａｎ ＢＪ， ＭｃＭｕｒｄｉｅ ＰＪ， Ｒｏｓｅｎ ＭＪ， Ｈａｎ ＡＷ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＪ， Ｈｏｌｍｅｓ ＳＰ． ＤＡＤＡ２： Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓａｍｐｌｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ａｍｐｌｉｃｏｎ ｄａｔａ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１６；１３（７）：５８１－５８３． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３８６９）を、これらの高品質配列に対して行った。プロジェクトに使用される非キメラ読み取りを取得するために、重複領域Ｒ１とＲ２とを結合させた。これらは、合計で、１’１４５’６７１（メジアン＝１６’２７７、平均＝１６’８４８．１、ＳＤ＝３’８９７．６）であった。

【0192】

分類の割り当ては、ＢＬＡＳＴ機能分類子によって行った。これは、クエリと参照読み取りとの間で、ＢＬＡＳＴ＋ローカルアライメントを行う。次いで、これは、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅの最後のデータベースバージョン（ｇｇ＿１２＿１０）の各クエリ配列にコンセンサス分類法を割り当てる。

【0193】

大規模な系統発生データの最尤分析を可能にする、ＩＱ－ＴＲＥＥ確率論的アルゴリズムに基づいて有根系統樹を構築した（Ｎｇｕｙｅｎ ＬＴ， Ｓｃｈｍｉｄｔ ＨＡ， ｖｏｎ Ｈａｅｓｅｌｅｒ Ａ， Ｍｉｎｈ ＢＱ． ＩＱ－ＴＲＥＥ： ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｍａｘｉｍｕｍ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ． ２０１５；３２（１）：２６８－２７４． ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｕ３００）。

【0194】

アルファ多様性（シャノン指数；サンプル内リッチネス）を、メイン指数を用いて計算し、リッチネスとイーブンネスの観点からデータを調べた。アルファ多様性の推定値は、ｐｈｙｌｏｓｅｑ Ｒパッケージを用いて計算した（ＭｃＭｕｒｄｉｅ ＰＪ， Ｈｏｌｍｅｓ Ｓ． ｐｈｙｌｏｓｅｑ： ａｎ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｇｒａｐｈｉｃｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｃｅｎｓｕｓ ｄａｔａ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３；８（４）：ｅ６１２１７． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１３ Ａｐｒ ２２． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６１２１７）。アルファ多様性の統計的に有意な変化は、マンホイットニーの符号順位検定によって決定した。

【0195】

結果を図５に示す。メタゲノム解析により、ＡＢＸおよびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} で処置したコントロールマウスにおいて、シャノン指数として表されるアルファ多様性の大幅な減少が明らかとなり、強力なディスバイオーシスが示された。しかし、ディスバイオーシス誘発後のＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置により、このパラメーターの大幅な改善がもたらされた。

【0196】

異なる実験群における細菌組成の類似性を判定するために、重み付けされていないＵｎｉｆｒａｃアルゴリズムによって得られた非類似性テーブルを使用して、主座標分析（ＰＣｏＡ）でベータ多様性（サンプル間非類似性）を分析した（Ｌｏｚｕｐｏｎｅ Ｃ， Ｋｎｉｇｈｔ Ｒ． ＵｎｉＦｒａｃ： ａ ｎｅｗ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００５；７１（１２）：８２２８－８２３５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．７１．１２．８２２８－８２３５．２００５）。ベータ多様性の推定値は、ｐｈｙｌｏｓｅｑ Ｒ パッケージを使用して計算した（ＭｃＭｕｒｄｉｅ ＰＪ， Ｈｏｌｍｅｓ Ｓ． ｐｈｙｌｏｓｅｑ： ａｎ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｇｒａｐｈｉｃｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｃｅｎｓｕｓ ｄａｔａ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３；８（４）：ｅ６１２１７． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１３ Ａｐｒ ２２． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６１２１７）。順列ＭＡＮＯＶＡ（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）を、９９９の順列を有するビーガンＲパッケージのａｄｏｎｉｓ（）関数を使用して、重み付けされていないＵｎｉＦｒａｃ距離に対して行った。

【0197】

結果を図６に示す。各抗生物質処置群は未処置コントロール（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ＜０．００１）とは離れてクラスターを形成したが、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置マウスはコントロール群のより近くにクラスターを形成しており、生理学的な微生物叢組成の回復が改善されたことを示す。

【0198】

全集団間の微生物叢組成の違いは、ＤＥＳｅｑ２リードカウントの規格化（１遺伝子当たりの幾何平均に対する、遺伝子数のメジアン比によって決定されるサンプル固有のサイズ係数で除したカウント； Ａｎｄｅｒｓ， Ｓ．， Ｈｕｂｅｒ， Ｗ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｕｎｔ ｄａｔａ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １１， Ｒ１０６ （２０１０）． ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｇｂ－２０１０－１１－１０－ｒ１０６）の後に、ＦＤＲ ｐ値補正を使用するＷａｌｄ検定を使用して決定した。微生物叢種は、ＤＥＳｅｑ２リードカウントの規格化後のＦＤＲ ｐ値補正を使用するＷａｌｄ検定で、ｐ＜０．０５にしたがって選択された。図７は、異なる実験群：即ち、コントロール、ＡＢＸ処置、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスの盲腸の微生物叢を区別する、差次的に表現されるアンプリコン配列バリアント（ＡＳＶ）のヒートマップを示す。図８は、ＤＥＳｅｑ２リードカウントの規格化後のＦＤＲ ｐ値補正を使用するＷａｌｄ検定で計算される、差次的に表現されるＡＳＶのｐ値を示す。

【0199】

これらの結果は、アピラーゼ発現細菌の投与により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓの科に属する４１の種が選択的に保存された、微生物群集構造の改善を示す。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓのうち、Ｍｕｒｉｂａｃｕｌｕｍ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅが、複数のＡＳＶによって検出された。この細菌種の減少は、回腸炎に対するより高い感受性と相関することが示された（Ｄｏｂｒａｎｏｗｓｋｉ， Ｐ．Ａ．， Ｔａｎｇ， Ｃ．， Ｓａｕｖｅ， Ｊ．Ｐ．， Ｍｅｎｚｉｅｓ， Ｓ．Ｃ．， ａｎｄ Ｓｌｙ， Ｌ．Ｍ． （２０１９）． Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｌｅａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｐｒｅｃｅｄｅ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｉｌｅｉｔｉｓ ｉｎ ＳＨＩＰ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ １０， ５７８－５９８）。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与は、二次胆汁酸であるデオキシコール酸（ＤＣＡ）およびリトコール酸（ＬＣＡ）の生成を通して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染から保護することが示された細菌である、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓの保存に有利にであった。Ｃ．ｓｃｉｎｄｅｎｓ単独または細菌コンソーシアム内での再構成は、抗生物質で処置されたマウスを、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ腸内コロニー形成から保護した（Ｂｕｆｆｉｅ， Ｃ．Ｇ．， Ｂｕｃｃｉ， Ｖ．， Ｓｔｅｉｎ， Ｒ．Ｒ．， ＭｃＫｅｎｎｅｙ， Ｐ．Ｔ．， Ｌｉｎｇ， Ｌ．， Ｇｏｂｏｕｒｎｅ， Ａ．， Ｎｏ， Ｄ．， Ｌｉｕ， Ｈ．， Ｋｉｎｎｅｂｒｅｗ， Ｍ．， Ｖｉａｌｅ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５１７， ２０５－２０８）。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ科に属する各種も、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置マウスにおいて有意に濃縮された。特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉとＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉが有意に濃縮された。これらの２つの株は、プロバイオティクスとして一般的に使用されており、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（Ｍａｃｋｏｓ， Ａ．Ｒ．， Ｅｕｂａｎｋ， Ｔ．Ｄ．， Ｐａｒｒｙ， Ｎ．Ｍ．， ａｎｄ Ｂａｉｌｅｙ， Ｍ．Ｔ． （２０１３）． Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓｏｒ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ８１， ３２５３－３２６３）及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（Ｂｅｒｅｓｗｉｌｌ， Ｓ．， Ｅｋｍｅｋｃｉｕ， Ｉ．， Ｅｓｃｈｅｒ， Ｕ．， Ｆｉｅｂｉｇｅｒ， Ｕ．， Ｓｔｉｎｇｌ， Ｋ．， ａｎｄ Ｈｅｉｍｅｓａａｔ， Ｍ．Ｍ． （２０１７）． Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ， ｅｘｔｒａ－ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｍｕｒｉｎｅ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７， ２１３８）の感染に対する保護を与えることが示された。

【0200】

実施例３：アピラーゼ発現細菌の投与は、ディスバイオーシス誘発後のＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染の影響を低減する。
哺乳動物の胃腸管には、腸内病原体に対するコロニー形成耐性を与える数百もの微生物種が定着している。ディスバイオーシスは、コロニー形成耐性および腸管感染症に対する感受性の喪失をもたらす。腸管出血性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍは、付着および脱落（ａｔｔａｃｈｉｎｇ ａｎｄ ｅｆｆａｃｉｎｇ）（Ａ／Ｅ）病変形成細菌の科に属するＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅである。ＥＨＥＣ及びＥＰＥＣは、重度の腸の炎症と下痢を引き起こし得る。さらに、非常に強力なＳｈｉｇａ毒素（Ｓｔｘ）を発現するＥＨＥＣ株は、感染個体の死亡に至る重篤な症例をもたらす腎毒性を引き起こす（Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｊ．Ｗ．， Ｋｅｅｎｅｙ， Ｋ．Ｍ．， Ｃｒｅｐｉｎ， Ｖ．Ｆ．， Ｒａｔｈｉｎａｍ， Ｖ．Ａ．， Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｋ．Ａ．， Ｆｉｎｌａｙ， Ｂ．Ｂ．， ａｎｄ Ｆｒａｎｋｅｌ， Ｇ． （２０１４）． Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ： ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２， ６１２－６２３）。ヒトのＥＨＥＣおよびＥＰＥＣは、抗生物質で処置された成体マウスで中等度の病原性を誘発するだけであるので、マウスにおいてこれらの感染症を模倣するために、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍが頻繁に使用される（Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｊ．Ｗ．， Ｋｅｅｎｅｙ， Ｋ．Ｍ．， Ｃｒｅｐｉｎ， Ｖ．Ｆ．， Ｒａｔｈｉｎａｍ， Ｖ．Ａ．， Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｋ．Ａ．， Ｆｉｎｌａｙ， Ｂ．Ｂ．， ａｎｄ Ｆｒａｎｋｅｌ， Ｇ． （２０１４）． Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ： ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２， ６１２－６２３； Ｂｈｉｎｄｅｒ， Ｇ．， Ｓｈａｍ， Ｈ．Ｐ．， Ｃｈａｎ， Ｊ．Ｍ．， Ｍｏｒａｍｐｕｄｉ， Ｖ．， Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｋ．， ａｎｄ Ｖａｌｌａｎｃｅ， Ｂ．Ａ． （２０１３）． Ｔｈｅ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ： ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ． Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ， ｅ５０２２２； Ｍａｌｌｉｃｋ， Ｅ．Ｍ．， ＭｃＢｅｅ， Ｍ．Ｅ．， Ｖａｎｇｕｒｉ， Ｖ．Ｋ．， Ｍｅｌｔｏｎ－Ｃｅｌｓａ， Ａ．Ｒ．， Ｓｃｈｌｉｅｐｅｒ， Ｋ．， Ｋａｒａｌｉｕｓ， Ｂ．Ｊ．， Ｏ’Ｂｒｉｅｎ， Ａ．Ｄ．， Ｂｕｔｔｅｒｔｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｌｅｏｎｇ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｓｃｈａｕｅｒ， Ｄ．Ｂ． （２０１２）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｕｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２２， ４０１２－４０２４）。

【0201】

アピラーゼ発現細菌によって誘発された微生物叢群集構造がＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染からの保護を与えることができるかどうかを調べるために、実施例２に記載されるように、ＡＢＸをＣ５７ＢＬ／６マウスに４日間投与した。処置スケジュールを図９に示す。８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、４つの異なる実験群に無作為に割り当てた：即ち、未処置（コントロール）、抗生物質（ＡＢＸ：バンコマイシン１．２５ｍｇ、アンピシリン２．５ｍｇ、およびメトロニダゾール１．２５ｍｇ；マウス１頭当たり滅菌水２００μｌ中）で処置、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１} で処置；並びに、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置。実施例２と同様に、抗生物質による処置後、マウスに、ＰＢＳ（コントロール）；又は１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} ；若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を、４日間、経口経管投与した。

【0202】

その後、マウスに、１０^８ＣＦＵ／マウスのＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍを経口感染させた（未処置コントロール群を除く）。感染実験では、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ ＡＴＣＣ（登録商標）５１４５９（ＤＢＳ１００株）を、ＬＢ寒天プレートで培養し、次いで、Ｌｕｒｉａブロス中で３７℃にて一晩増殖させた。

【0203】

感染後０、１、２、３、４、および５日目に、動物の体重を評価した。結果を図１０に示す。Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染後の体重減少率（％）の分析により、ＡＢＸ単独またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置した群と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経口経管投与したマウスの体重減少が低減されたことが明らかとなった。このことは、アピラーゼ発現細菌の投与が、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に対するマウスの耐性を改善することを示す。

【0204】

腸の炎症を評価するために、マウスを、感染後６日目に殺処分した。盲腸を取り出し、縦方向に開き、盲腸内容物と慎重に分離し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。盲腸を、５ｍＭのＥＤＴＡを添加したＲＰＭＩで２回、３７℃で３０分間消化した。次いで、ろ過した断片を、ＲＰＭＩ５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＩ型、４０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ－Ｉ中で、４０分間消化した。盲腸固有層細胞を含むろ過された懸濁液を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＲＰＭＩ完全培地に再懸濁した。盲腸固有層からの単細胞懸濁液を、氷上で２０分間、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで希釈した標識抗体で染色した。次のマウス抗体（ｍＡｂ）を実験に使用した：ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５（１：２００，クローン：３０Ｆ１１，Ｃａｔ．＃：１０３１０８，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７コンジュゲート抗マウスＣＤ１１Ｂ（１：２００，クローン：Ｎ４１８，Ｃａｔ．＃：１１７３１８，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ビオチン化抗マウスＬｙ６Ｃ（１：２００，クローン：ＨＫ１．４，Ｃａｔ．＃：１２８００４，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅコンジュゲート抗マウスＬｙ６Ｇ（１：２００，クローン：１Ａ８，Ｃａｔ．＃：１２７６１２Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥコンジュゲート抗マウスＧｒ１（１：２００，クローン：ＲＢ６－８Ｃ５，Ｃａｔ．＃：５０－５９３１－Ｕ１００，ＴＯＭＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ストレプトアビジンＡＰＣ（１：２００，Ｃａｔ．＃：４０５２０７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。サンプルは、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ、ＵＳＡ）フローサイトメーターで得た。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）またはＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ、ＵＳＡ）を使用してデータを分析した。

【0205】

異なる実験群の盲腸固有層におけるＣＤ４５^＋Ｇｒ１^＋ＣＤ１１ｂ^＋多形核（ＰＭＮ）細胞の頻度の統計分析を行った。結果を図１１に示す。これらのデータは、ＡＢＸ単独、またはＡＢＸとＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} との組合せで処置した群と比較して、ＡＢＸで処置し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経管投与したマウスのＰＭＮ細胞の有意な減少を示す。この結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与が、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に応答した、ディスバイオーシス媒介性ＰＭＮ浸潤を軽減させることを示す。

【0206】

さらに、異なる実験群の盲腸固有層におけるＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６ｃ^＋Ｌｙ６ｇ^－炎症性単球の頻度の統計分析を行った。結果を図１２に示す。これらのデータは、ＡＢＸ単独、またはＡＢＸとＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} との組合せで処置した群と比較して、ＡＢＸで処置し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経管投与したマウスの炎症性単球の有意な減少を示す。ＰＭＮ浸潤の低減の観察と同様に、この結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与が、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染に応答した、腸固有層のディスバイオーシス媒介性炎症性浸潤を軽減させることを示す。

【0207】

実施例４：アピラーゼ発現細菌の投与は、ディスバイオーシス誘発後のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の影響を低減する。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、抗生物質に関連する下痢の主因であり、細菌群集の多様性の低減及び重要な分類群の枯渇など、腸内微生物のディスバイオーシスと関連していることが示されている。

【0208】

アピラーゼ発現細菌によって誘発される微生物叢群集構造がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸内侵入に対抗できるかどうかを調べるために、実施例２および３に記載されるように、ＡＢＸをＣ５７ＢＬ／６マウスに４日間投与して、微生物叢の枯渇およびディスバイオーシスを誘発した。処置スケジュールを図１３に示す。８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、４つの異なる実験群に無作為に割り当てた：即ち、未処置（コントロール）、抗生物質（ＡＢＸ：バンコマイシン１．２５ｍｇ、アンピシリン２．５ｍｇ、およびメトロニダゾール１．２５ｍｇ；マウス１頭当たり滅菌水２００μｌ中）で処置、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１} で処置；並びに、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置。実施例２及び３と同様に、抗生物質による処置後、マウスに、ＰＢＳ（コントロール）；又は１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} ；若しくはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を、４日間、経口経管投与した。

【0209】

その後、マウスに、１０^５のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＶＰＩ １０４６３胞子を経口感染させた（未処置コントロール群を除く）。この目的のために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＡＴＣＣ（登録商標）４３２５５ＴＭ（ＶＰＩ １０４６３ Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^－）胞子を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中、－８０℃、１０^８／ｍｌでストックした。胞子の力価は、５ｇ／ｌの酵母抽出物と、発芽を誘導する０．１％タウロコール酸を添加したブレインハートインフュージョン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）寒天プレート上に、ストックの段階希釈物をプレーティングすることによって確認した。プレートは、Ｏｘｏｉｄ Ａｎａｅｒｏｇｅｎ^ＴＭを備えた気密性キャニスター内で、少なくとも２４時間維持した。

【0210】

感染後０、１、２、および３日目に、動物の体重、臨床スコア、および生存期間を評価した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染において使用される臨床スコアを表１に示す。

【表1】

表１：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染において使用される臨床スコア

【0211】

結果を、図１４（体重）、図１５（臨床スコア）、および図１６（生存期間）に示す。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染後の体重減少率（％）の分析により、ＡＢＸ単独またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置した群と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経口経管投与したマウスの体重減少が有意に低減されたことが明らかとなった。このことは、アピラーゼ発現細菌の投与が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染からマウスを保護することを示す。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染中の経時での臨床スコアの評価により、ＡＢＸで処置し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経管投与したマウスは、ＡＢＸ単独、またはＡＢＸとＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} との組合せで処置したマウスと比較して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染による影響が少ないことが確認された。異なる実験群における生存期間の分析により、ＡＢＸ単独、またはＡＢＸをＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置したマウスと比較して、ＡＢＸで処置し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経管投与したマウスの生存期間が改善されることが明らかとなった。この結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置が、抗生物質処置後のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの侵襲性を大幅に軽減することを示す。

【0212】

腸の炎症を評価するために、マウスを、感染後７２時間で殺処分し、結腸の長さを測定した。結果を図１７に示す。ＡＢＸで処置し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経管投与したマウスにおける結腸の長さ（腸炎のスコア化するための重要なパラメーター）の測定値は、感染していないマウス（コントロール）と同様の値を示した。一方、ＡＢＸ単独、またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置したマウスでは、腸の長さは、大幅に短縮された。これらのデータは、アピラーゼ発現細菌による処置が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染によって誘発された腸炎を軽減することを示す。

【0213】

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ誘発性腸炎はまた、便中および血清中リポカリン２（ＬＣＮ－２）（上皮損傷および好中球浸潤に関係する腸炎症のマーカー）を、殺処分前に、感染後７２時間で測定することによって評価した。マウスの炎症状態は、便上清中のリポカリン－２（ＬＣＮ－２）のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ マウス リポカリン－２／ＮＧＡＬ）で測定することにより評価した。簡単に説明すれば、製造業者の指示にしたがって、便を、１００μｌのＰＢＳ中に０．０１ｇ再懸濁し、最大速度で１０分間、遠心分離し、ＥＬＩＳＡアッセイを行う前に希釈した。血清リポカリン２（ＬＣＮ－２）レベルの測定のために、マウスから採血し、血清中のＬＣＮ－２レベルを、前記したＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。

【0214】

糞中ＬＣＮ－２レベルの結果を図１８に示す。ＡＢＸで処置し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経管投与したマウスは、ＡＢＸ単独、またはＡＢＸをＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置したマウスと比較して、ＬＣＮ－２レベルが低いと特徴付けられ、このことは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを媒介する腸炎症を軽減できることを更に裏付ける。

【0215】

血清中ＬＣＮ－２レベルの結果を図１９に示す。異なる実験群における血清中ＬＣＮ－２の定量により、ＡＢＸ単独、またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置したマウスと比較して、ＡＢＸで処置し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経管投与したマウスにおけるＬＣＮ－２レベルが低いことが明らかとなった。この結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置が、病原体の全身性拡散を制限することを示す。

【0216】

実施例５：アピラーゼ発現細菌の投与は、異なる接種モデルにおけるディスバイオーシス誘発後のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の影響を低減する。
ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の異なる接種モデルにおけるアピラーゼ発現細菌の影響の可能性に対処するために、抗生物質セフォペラゾン（２．５ｍｇ／マウス）を、夜に、５日間連続して経管投与することにより、ディスバイオーシスを誘発した。同日の朝に、１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経口経管投与した。６日目に、セフォペラゾン処置を中止し、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置を、さらに３日間連続して行った。次いで、本質的に前記した通りに（実施例４）、マウスに、１０^５のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＶＰＩ １０４６３胞子を経口感染させた。処置スケジュールを図２０に示す。

【0217】

図２１は、図２０に示すように処置したマウスの生存率を示す。異なる実験群におけるマウスの生存期間の分析により、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の経口経管投与は、セフォペラゾン単独、またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置したマウスと比較して、死亡率が低下することが明らかとなった。この結果は、アピラーゼ発現細菌の投与が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ媒介死から効果的に保護するという考えをさらに支持する。

【0218】

臨床スコアは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染後２４時間で、前記したように（実施例４、表１）評価した。結果を図２２に示す。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染後２４時間での臨床スコアの分析により、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を経管投与したマウスは、セフォペラゾン単独、またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置されたマウスと比較して、感染の兆候がより低いことによって特徴付けられることが示された。したがって、アピラーゼ発現細菌の投与は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染したマウスの臨床スコアを改善する。

【0219】

実施例６：アピラーゼ発現細菌による無菌マウスの単コロニー形成
腸上皮細胞（ＩＥＣ）の転写制御は、免疫系と、腸上皮と、腸内微生物叢との間の複雑な相互作用において、微生物叢の組成と宿主代謝恒常性の調節に重要な役割を果たす（Ｓｈｕｌｚｈｅｎｋｏ， Ｎ．， Ｍｏｒｇｕｎ， Ａ．， Ｈｓｉａｏ， Ｗ．， Ｂａｔｔｌｅ， Ｍ．， Ｙａｏ， Ｍ．， Ｇａｖｒｉｌｏｖａ， Ｏ．， Ｏｒａｎｄｌｅ， Ｍ．， Ｍａｙｅｒ， Ｌ．， Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ， Ａ．Ｊ．， ＭｃＣｏｙ， Ｋ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１）． Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ， ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｇｏｖｅｒｎｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｅｒｓｕｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｔ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １７， １５８５－１５９３）。

【0220】

Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で単コロニー形成した無菌（ＧＦ）マウスは、空のベクターを有する細菌で単コロニー形成したマウスと比較して、腸内のＡＴＰが有意に低減した（Ｐｅｒｒｕｚｚａ， Ｌ．， Ｇａｒｇａｒｉ， Ｇ．， Ｐｒｏｉｅｔｔｉ， Ｍ．， Ｆｏｓｓｏ， Ｂ．， Ｄ’Ｅｒｃｈｉａ， Ａ．Ｍ．， Ｆａｌｉｔｉ， Ｃ．Ｅ．， Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ－Ｊｏｓｔ， Ｔ．， Ｓｃｒｉｂａｎｏ， Ｄ．， Ｍａｕｒｉ， Ｌ．， Ｃｏｌｏｍｂｏ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｔ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｈｅｌｐｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｍｏｔｅ ａ Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ Ｇｕｔ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｈｏｓｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｂｙ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １８， ２５６６－２５７５）。小腸のパイエル板（ＰＰ）における卵胞ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞数および胚中心（ＧＣ）反応の制御における管腔内ＡＴＰの役割と一致して（Ｐｒｏｉｅｔｔｉ， Ｍ．， Ｃｏｒｎａｃｃｈｉｏｎｅ， Ｖ．， Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ Ｊｏｓｔ， Ｔ．， Ｒｏｍａｇｎａｎｉ， Ａ．， Ｆａｌｉｔｉ， Ｃ．Ｅ．， Ｐｅｒｒｕｚｚａ， Ｌ．， Ｒｉｇｏｎｉ， Ｒ．， Ｒａｄａｅｌｌｉ， Ｅ．， Ｃａｐｒｉｏｌｉ， Ｆ．， Ｐｒｅｚｉｕｓｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． ＡＴＰ－ｇａｔｅｄ ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ Ｐ２Ｘ７ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ Ｐｅｙｅｒ’ｓ ｐａｔｃｈｅｓ （ＰＰ） ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｈｏｓｔ－ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｍｕｔｕａｌｉｓｍ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１， ７８９－８０１）、Ｔｆｈ細胞とＧＣ Ｂ細胞の両方が、アピラーゼ発現細菌がコロニー形成した動物で増加した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で単コロニー形成したＧＦマウスは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成したマウスと比較して、より多くの量のＥ．ｃｏｌｉ特異的ＩｇＡを示した（Ｐｅｒｒｕｚｚａ， Ｌ．， Ｇａｒｇａｒｉ， Ｇ．， Ｐｒｏｉｅｔｔｉ， Ｍ．， Ｆｏｓｓｏ， Ｂ．， Ｄ’Ｅｒｃｈｉａ， Ａ．Ｍ．， Ｆａｌｉｔｉ， Ｃ．Ｅ．， Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ－Ｊｏｓｔ， Ｔ．， Ｓｃｒｉｂａｎｏ， Ｄ．， Ｍａｕｒｉ， Ｌ．， Ｃｏｌｏｍｂｏ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｔ Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｈｅｌｐｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｍｏｔｅ ａ Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ Ｇｕｔ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｈｏｓｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｂｙ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １８， ２５６６－２５７５．）。これらのデータは、共生微生物叢によって放出された細胞外ＡＴＰが、小腸における分泌型ＩｇＡ応答を制限することを示す。

【0221】

アピラーゼが腸上皮細胞（ＩＥＣ）における遺伝子転写を制御することによって宿主の代謝に影響を与えるかどうかを調べるために、アピラーゼによって調整された単コロニー形成マウスを生成した。この目的のため、アピラーゼによって調整された又は調整されていない単コロニー形成マウスを生成するために、無菌（ＧＦ）マウスに、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} を、１回、経口経管投与した。２８日後、マウスを殺処分し、ゲノム全体の発現プロファイリングを行って、差次的にコロニー形成した動物の、エキソビボで単離されたＩＥＣを比較した。実験スケジュールを図２３に示した。

【0222】

ＩＥＣは、Ｒｏｍａｇｎａｎｉ， Ａ．， Ｖｅｔｔｏｒｅ， Ｖ．， Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏ－Ｊｏｓｔ， Ｔ．， Ｈａｍｐｅ， Ｓ．， Ｒｏｔｔｏｌｉ， Ｅ．， Ｎａｄｏｌｎｉ， Ｗ．， Ｐｅｒｏｔｔｉ， Ｍ．， Ｍｅｉｅｒ， Ｍ．Ａ．， Ｈｅｒｍａｎｎｓ， Ｃ．， Ｇｅｉｇｅｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． ＴＲＰＭ７ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｔ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８， １９１７に記載の方法で単離した。Ｔｒｉｚｏｌ沈殿（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によりＩＥＣから全ＲＮＡを抽出し、次いで、３７℃で１５分間、ＤＮａｓｅＩで消化して、混入しているＤＮＡを除去した。全ＲＮＡの品質をまず、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて評価した。全ＲＮＡ１５０ｎｇから始めて、ビオチン標識ｃＤＮＡターゲットを合成した。二本鎖ｃＤＮＡ合成および関連するｃＲＮＡは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＷＴ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて行った。センス鎖ｃＤＮＡは、同一キットで事前に合成し、断片化して標識した。標識化プロトコルの全工程は、ｓｓＤＮＡ５．５μｇから始めて、キットの製造業者の記載にしたがって行った。各真核生物のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイは、分析したサンプルに存在しなかった、いくつかのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子（ｌｙｓ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、およびｄａｐ）のプローブセットを含んでいた。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｐｏｌｙ－Ａ ＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイのユーザーがアッセイの全体的な成功を評価できるように、様々な濃度でプレミックスした、これらのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子の、インビトロで合成されたポリアデニル化転写産物を含んでいた。各ターゲットのポリＡ ＲＮＡコントロールの最終濃度は、ｌｙｓ １：１００，０００、ｐｈｅ １：５０，０００、ｔｈｒ １：２５，０００、およびｄａｐ １：６，６６７であった。ハイブリダイゼーションは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを用いて行った。このキットは、ターゲット希釈用ミックス、最終濃度７％のＤＭＳＯ、並びにプレミックスされたビオチン標識コントロールｏｌｉｇｏＢ２およびｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、およびｃｒｅコントロール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｃａｔ ＃９００２９９）を、それぞれ最終濃度５０ｐＭ、１．５ｐＭ、５ｐＭ、２５ｐＭ、及び１００ｐＭで含む。断片化および標識されたｓｓｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションバッファー中、２３ｎｇ／μｌの濃度（合計２．３μｇ）に希釈し、９９℃で５分間変性させ、４５℃で５分間インキュベートし、最大速度で１分間、遠心分離した後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）カートリッジに導入した。次いで、１つのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓを、各ビオチン標識センスターゲットとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、ロティサリーオーブンにて４５℃で１６時間行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）カートリッジは、ＦＳ４５０＿０００７標準プロトコルにしたがって、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０中、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔで洗浄および染色した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイを、デフォルトのパラメーターを使用するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇを使用してスキャンした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェア（ＡＧＣＣ）を使用して、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）画像を取得して、．ＤＡＴおよび．ＣＥＬファイルを生成し、これらを、専用ソフトウェアによる後続の分析に用いた。生データを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）法の分位正規化を使用して正規化した。差次的に発現した転写産物の同定とユークリッド距離による階層クラスター分析は、市販のソフトウェアＰａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（ｖ６．６）を使用して行った。

【0223】

差次的発現分析の結果を図２４に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} で単コロニー形成したノトバイオートマウスで行った差次的発現分析は、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} ＷＴマウスに対するＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} から単離されたＩＥＣにおいて、５３個のアップレギュレートされた遺伝子および７９個のダウンレギュレートされた遺伝子（図２４において長方形で強調）の転写シグネチャーをもたらし（ＦＤＲ≦５％および絶対倍数変化≧１．５）、このことは、細胞外ＡＴＰ（ｅＡＴＰ）の欠如が、ＩＥＣの遺伝子転写に大きな影響を与えたことを示唆している。

【0224】

次に、差次的に発現する遺伝子の相対発現レベル（Ｚ－スコア）を、遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析によって決定した。この目的のため、ＧＯエンリッチメント解析のために、差次的に発現する遺伝子のリストを、ＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ｖ６．８； Ｈｕａｎｇ ｄａ， Ｗ．， Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｂ．Ｔ．， ａｎｄ Ｌｅｍｐｉｃｋｉ， Ｒ．Ａ． （２００９）． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｇｅｎｅ ｌｉｓｔｓ ｕｓｉｎｇ ＤＡＶＩＤ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ４， ４４－５７）にロードし、ＲパッケージＧＯｐｌｏｔ（Ｗａｌｔｅｒ， Ｗ．， Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｃａｂｏ， Ｆ．， ａｎｄ Ｒｉｃｏｔｅ， Ｍ． （２０１５）． ＧＯｐｌｏｔ： ａｎ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｖｉｓｕａｌｌｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３１， ２９１２－２９１４）とｇｐｌｏｔｓを用いて視覚化した。Ｚ－スコアは、下記式の通り、アップレギュレートされた遺伝子の数からダウンレギュレートされた遺伝子の数を減じ、分析された遺伝子の総数の平方根で除して計算した。

【数2】

【0225】

結果を図２５に示す。Ｚ－スコアとして測定された遺伝子の相対発現レベルから、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置が、細胞周期および分裂に関連する遺伝子のダウンレギュレーションと、脂質代謝プロセスおよび酸化還元プロセスに関連する遺伝子のアップレギュレーションを誘導することが示された。これら２つの遺伝子群は、栄養素の吸収と、化学物質に起因する酸化損傷に対する保護にとって重要である。さらに、酸化還元プロセスに関連する遺伝子のアップレギュレーションは、生理学的プロセスをサポートし、酸化的ストレスに対する酵素反応のネットワークを調整する環境を維持するため重要である（Ｃｉｒｃｕ， Ｍ．Ｌ．， ａｎｄ Ａｗ， Ｔ．Ｙ． （２０１１）． Ｒｅｄｏｘ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ ４５， １２４５－１２６６）。

【0226】

図２６は、単コロニー形成したマウスのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} ｖｓＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} 腸上皮細胞における差次的に発現する遺伝子の遺伝子オントロジー分析を示す。機能的オーバーリプレゼンテーション分析により、ＤＮＡ複製に関連する遺伝子セットがＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} マウスのＩＥＣに豊富に含まれており、一方で、主に脂質、脂肪酸、及びビタミンＡ代謝を支配する代謝機能のシグネチャー、カルニチンの溶質担体、低分子ペプチド、およびイオンは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} マウスで豊富であることが明らかとなった。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 単コロニー形成マウスは、薬物代謝だけでなく、ステロイド、胆汁酸、脂肪酸、プロスタグランジン、生体アミン、及びレチノイドなどの内因性化合物の酸化的、過酸化的、および還元的代謝においても重要であることが示された、ＣＹＰファミリーに属する遺伝子のアップレギュレーションも示した（Ｃｈａｎｇ， Ｇ．Ｗ．， ａｎｄ Ｋａｍ， Ｐ．Ｃ． （１９９９）． Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ． Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ ５４， ４２－５０； Ｔｈｅｌｅｎ， Ｋ．， ａｎｄ Ｄｒｅｓｓｍａｎ， Ｊ．Ｂ． （２００９）． Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｗａｌｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６１， ５４１－５５８）。これらの結果は、腸管腔でのｅＡＴＰの枯渇が、コロニー形成細菌の腸上皮細胞との相互作用を変化させ、それによって、それらの機能と宿主の代謝をコンディショニングすることを示唆する。

【0227】

腸上皮の転写活性の観察されたコンディショニングに対する、アピラーゼ媒介性ＩｇＡ生成の向上の役割を評価するために、Ｉｇ重鎖の遺伝子座におけるＪセグメント欠失（Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウス）のために抗体応答の生成が起こらない単コロニー形成マウスからの腸上皮におけるゲノムワイド転写を分析した。驚くべきことに、図３４のｖｏｌｃａｎｏプロットに示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の単コロニー形成Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスと、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} の単コロニー形成Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスとの間に検出される遺伝子発現は、非常に小さい差であった。これらのデータは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} が単コロニー形成した野生型マウスにおける向上したＩｇＡ生成が、腸上皮細胞において、免疫機能よりも代謝機能が優位になることに寄与していることを示す。

【0228】

したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} が単コロニー形成した野生型マウスは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} が単コロニー形成したマウスと比較して、体重変化（図３５）、血糖（図３６）、血清インスリン（図３７）、および白色脂肪組織（ＷＡＴ）沈着（図３８）の上昇、並びにグルコース負荷試験の改善（図３９）を示した。対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＢＡＤ２８} またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} のいずれかで単コロニー形成したＩｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスでは、体重変化（図４０）、血糖（図４１）、およびグルコース負荷試験における応答（図４２）に違いは見られなかった。これらのデータは、アピラーゼによる管腔内ＡＴＰの調節が、共生微生物の分泌型ＩｇＡコンディショニングを介して、宿主の代謝適応を促進できることを示唆する。

【0229】

実施例７：アピラーゼ発現細菌の投与は、ディスバイオーシス誘発性低血糖を低減する。
抗生物質媒介性ディスバイオーシスによる低血糖に対するアピラーゼの効果を調べるために、実施例２（図４に示される実験スケジュール）に記載されるように、ディスバイオーシスを誘発し、アピラーゼ発現細菌を投与した。４日間の抗生物質処置と４日間の回復後に、血糖値を分析した（図４を参照）。

【0230】

結果を図２７に示す。抗生物質処置によって誘発されたディスバイオーシスは、血糖の顕著な低下（低血糖）をもたらした。しかし、アピラーゼ発現細菌で処置したマウスは、ＡＢＸまたはＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} で処置したマウスと比較して、より高い血清グルコースレベルを示した。これらのデータは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与が、低血糖の抗生物質媒介性誘発を軽減することを示す。

【0231】

さらに、白色脂肪組織（ＷＡＴ）を採取し、抗生物質媒介性ＷＡＴ損失に対するアピラーゼの効果を評価するために定量した。結果を図４３に示す。総体重のパーセンテージとしてのＷＡＴの定量により、ＡＢＸ誘発性ディスバイオーシス（ＡＢＸ単独、またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置した両方のマウス）におけるＷＡＴの有意な減少が明らかとなり、ＡＢＸ誘発性ディスバイオーシスは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与によって有意に軽減された。

【0232】

共生細菌によって誘発される分泌型ＩｇＡ応答の制御による、抗生物質処置中の宿主代謝のコンディショニングにおけるアピラーゼの機能と一致して、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置されたＩｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスでは、ＡＢＸ処置後の血糖値（図４４）およびＷＡＴ沈着（図４５）に関し、ＡＢＸ、またはＡＢＸとＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} との組合せで処置された対応するマウスと比較して、改善が観察されなかった。

【0233】

実施例８：セフォペラゾン媒介性ディスバイオーシスおよび回復のマウスモデル
ディスバイオーシスによる代謝障害に対抗するアピラーゼ処置の有効性をさらに評価するために、セフォペラゾンを、５日間連続して毎日投与することにより、マウスモデルにディスバイオーシスを誘発させた。実験スケジュールを図２８に示す。

【0234】

ディスバイオーシスを誘発するために、マウスを、５日間連続して、夜に、セフォペラゾン（２．５ｍｇ／マウス）で処置した。同時に、１０^１０ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 又はＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} を、朝に、経口経管投与した。Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} 及びＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} による処置を、セフォペラゾンによる処置後、更に３日間、行った。

【0235】

実験終了後、動物の体重を評価した。結果を図２９に示す。データから、セフォペラゾン誘発性ディスバイオーシスが、有意な体重減少をもたらすことが明らかである（セフォペラゾン単独、またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置したマウスと比較したコントロールマウス）。対照的に、セフォペラゾンとアピラーゼ発現細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} ）とで処置したマウスは、未処置動物と有意には異ならない体重増加を示した一方で、セフォペラゾン単独、またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置したマウスよりも有意に高かった。これらのデータは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与が、セフォペラゾン媒介性ディスバイオーシスによって誘発される体重減少を軽減することを示す。

【0236】

実験終了後、マウスを殺処分し、性腺周囲の白色脂肪組織を採取し定量した。結果を図３０に示す。総体重のパーセンテージとして白色脂肪組織（ＷＡＴ）を定量したところ、セフォペラゾン誘発性ディスバイオーシスにおけるＷＡＴの有意な減少が明らかとなった（セフォペラゾン単独、またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮＤ１９} と組み合わせて処置したマウスと比較したコントロールマウス）。一方、コントロールマウスと、セフォペラゾンおよびアピラーゼ発現細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} ）で処置したマウスとの間に有意な変化は見られなかった。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} 処置は、セフォペラゾン媒介性ディスバイオーシスによって誘発されるＷＡＴの減少を軽減する。

【0237】

実施例９：抗生物質誘発性ディスバイオーシスのマウスモデルにおけるアピラーゼ投与の効果
次に、アピラーゼの投与の効果を、抗生物質誘発性ディスバイオーシスのマウスモデルで調べた。この目的のために、４日間連続して、毎日、ＡＢＸを経口経管投与することにより、ディスバイオーシスを誘発した。抗生物質処置と共に、マウスに、１２時間ごとに、ＰＢＳ、または４０μｇの精製組換えアピラーゼを、経口経管投与した。

【0238】

実験終了後、血糖値を分析した。結果を図３２に示す。４日間の抗生物質処置後、ＡＢＸとアピラーゼを経口経管投与したマウスの血糖値を分析すると、未処置マウスに匹敵する値と、アピラーゼなしでＡＢＸ処置したマウスよりも有意に高い血糖値とを示すことが明らかとなった。したがって、アピラーゼタンパク質の投与は、抗生物質誘発性ディスバイオーシスにおけるこの代謝変化を軽減するのに十分であり、アピラーゼは、抗生物質媒介性ディスバイオーシスによって引き起こされる低血糖の誘発を軽減する。

【0239】

実験終了後、マウスを殺処分し、性腺周囲の白色脂肪組織を採取し定量した。結果を図３３に示す。ＷＡＴ重量を定量したところ、抗生物質媒介性ディスバイオーシスによる有意な減少が示された一方、この効果は、アピラーゼで処置した動物では観察されず、アピラーゼで処置されていない抗生物質誘発性ディスバイオーシスを有する動物よりも有意に高いＷＡＴ重量を示す。したがって、アピラーゼ処置は、抗生物質誘発性ディスバイオーシスによって誘発されるＷＡＴの低下を軽減する。

【0240】

実施例１０：アピラーゼは、抗生物質媒介性ディスバイオーシスによって引き起こされる盲腸肥大および細菌の腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）への移行を軽減する。
抗生物質処置によって引き起こされる腸内ディスバイオーシスは、細菌量と多様性の低減、微生物叢組成の変化、及び腸バリア完全性の低下によって特徴付けられる。抗生物質処置後の細菌量の減少を示す宿主の特徴は、盲腸のサイズ、長さ、および重量を評価することで調べることができ、無菌動物では大幅に大きくなると報告されている（Ｄｅｖｋｏｔａ， Ｓ．， Ｗａｎｇ， Ｙ．， Ｍｕｓｃｈ， Ｍ．Ｗ．， Ｌｅｏｎｅ， Ｖ．， Ｆｅｈｌｎｅｒ－Ｐｅａｃｈ， Ｈ．， Ｎａｄｉｍｐａｌｌｉ， Ａ．， Ａｎｔｏｎｏｐｏｕｌｏｓ， Ｄ．Ａ．， Ｊａｂｒｉ， Ｂ．， ａｎｄ Ｃｈａｎｇ， Ｅ．Ｂ． （２０１２）． Ｄｉｅｔａｒｙ－ｆａｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐａｔｈｏｂｉｏｎｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｉｌ１０－／－ ｍｉｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４８７， １０４－１０８； Ｐｏｔｅｒｅｓ， Ｅ．， Ｈｕｂｅｒｔ， Ｎ．， Ｐｏｌｕｄａｓｕ， Ｓ．， Ｂｒｉｇａｎｄｏ， Ｇ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｊ．， Ｋｅｅｌｅｒ， Ｋ．， Ｉｓａｂｅｌｌｉ， Ａ．， Ｉｂａｙ， Ｉ．Ｃ．Ｖ．， Ａｌｔ， Ｌ．， Ｐｙｔｙｎｉａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０２０）． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｂｙ Ｄｉｅｔ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１， ７９７）。抗生物質媒介性ディスバイオーシスによって引き起こされる盲腸肥大に対するアピラーゼの効果を調べるために、アピラーゼ発現細菌を、実施例２（図４に示される実験スケジュール）に記載されるように投与した。４日間の抗生物質処置と４日間の回復後に盲腸重量を分析した（図４参照）。結果を図４６に示す。抗生物質によって誘発されたディスバイオーシスは、盲腸重量の顕著な増加をもたらした。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置したマウスは、ＡＢＸ、またはＡＢＸとＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮ１９} とで処置したマウスと比較して、大幅に低い盲腸重量を示した。これらのデータから、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与が、抗生物質に誘発される盲腸肥大を軽減することを示す。

【0241】

抗生物質処置は、腸バリア完全性の破壊と、共生生細菌の腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）への移行を誘発し、炎症反応を促進する（Ｋｎｏｏｐ ＫＡ， ＭｃＤｏｎａｌｄ ＫＧ， Ｋｕｌｋａｒｎｉ ＤＨ， Ｎｅｗｂｅｒｒｙ ＲＤ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｃｏｍｍｅｎｓａｌ ｃｏｌｏｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ． （２０１６） Ｇｕｔ ６５， １１００－９． ｄｏｉ： １０．１１３６／ｇｕｔｊｎｌ－２０１４－３０９０５９）。ＭＬＮへの抗生物質媒介性細菌移行に対するアピラーゼの影響を調べるために、実験終了後、マウスを殺処分し（図４を参照）、ＭＬＮを無菌的にＲＰＭＩに回収し、機械的にホモジナイズした。ホモジネートの希釈物を、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ寒天（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にプレーティングした。コロニー数をカウントする前に、プレートを、好気性または嫌気性培養条件下にて、３７℃で２４～７２時間、増殖させた。結果を図４７と図４８に示す。好気性と嫌気性の両条件で、ＭＬＮのＣＦＵの定量により、未処置動物と比較して、ＡＢＸ、またはＡＢＸとＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮ１９} とで処置したマウスに、有意な増加が明らかとなった。しかし、ＡＢＸとＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} との組合せで処置したマウスは、未処置動物と、有意には異ならないＭＬＮのＣＦＵ数を示した一方、ＡＢＸ単独、またはＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮ１９} と組み合わせて処置したマウスよりも有意に低かった。これらのデータは、Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} の投与が、抗生物質媒介性ディスバイオーシスによって誘発される腸内細菌の移行を軽減することを示す。

【0242】

分泌型ＩｇＡが、抗生物質によるディスバイオーシスへのアピラーゼ媒介性腸内適応に関与しているかどうかを理解するために、図４に示される実験と同一の実験を、Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスを使用して行った。４日間の抗生物質処置および４日間の回復後に、盲腸重量を分析した。結果を図４９に示す。ＡＢＸ、ＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮ１９} 、およびＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置したＩｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスでは、未処置動物と比較して、抗生物質によって誘発されたディスバイオーシスが、盲腸重量の顕著な増加をもたらした。Ｉｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスのＭＬＮにおけるＣＦＵの定量により、好気性と嫌気性の両条件で、未処置群と比較して、３つの異なる群全てにおいて、細菌の顕著な移行が明らかとなった（図５０および図５１）。驚くべきことに、ＡＢＸ、またはＡＢＸ＋Ｅ．ｃｏｌｉ ^{ｐＨＮ１９} で処置したＩｇｈ－Ｊ ^－／－ マウスと比較して、ＡＢＸをＥ．ｃｏｌｉ ^{ｐＡｐｙｒ} と組み合わせて処置した動物でこの特徴の改善は見られなかった。これらのデータは、ＡＢＸ処置によって媒介される腸バリア破壊の制御において、アピラーゼによって誘発される分泌型ＩｇＡの重要性を示す。

【0243】

実施例１１：ゲノム中にアピラーゼ遺伝子を組み込んだ、アピラーゼを異種発現する組換え細菌（ＥｃＮ：：ｐｈｏｎ２）の生成
実施例１に記載されるように設計及び生成されたアピラーゼ発現細菌は、アピラーゼを発現するプラスミドで細菌を形質転換することにより得られた。かかるプラスミドは、形質転換体の選択のため、抗菌耐性を有していてもよい。このような形質転換体である細菌は、通常、アピラーゼを発現するプラスミドの複数のコピーを有する（抗生物質耐性のために選択されてもよい）。異種のアピラーゼをコードする組換え細菌において、染色体外プラスミドの複数コピーではなく、ゲノム中の単一コピーで同様の効果が得られるかどうかを調べるために、（非伝達性）細菌染色体（抗生物質耐性無し）に、（異種）アピラーゼ（ｐｈｏＮ２）遺伝子の単一コピーを有する細菌を生成した。

【0244】

このため、ＥｃＮゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ００７７９９．１）への赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｐｈｏＮ２アピラーゼコード遺伝子の染色体組み込みが、λ Ｒｅｄ組換えのアプローチ（λ Ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ）により行われた（Ｄａｔｓｅｎｋｏ Ｋ．Ａ． ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ Ｂ．Ｌ． ２０００ Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９７， ６６４０）。

【0245】

図５２は組換えに用いられるＤＮＡ断片を概略的に示しており、前記ＤＮＡ断片は下記のものを含む：
・マルトデキストリンホスホリラーゼ酵素をコードするＥｃＮ ｍａｌＰ遺伝子の一部；
・抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を与えるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするＥ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子と、それに隣接するフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）配列；
・上流ではＰ_ｐｒｏＤ合成プロモーター（Ｄａｖｉｓ Ｊ．Ｈ．， Ｒｕｂｉｎ Ａ．Ｊ． ａｎｄ Ｓａｕｅｒ Ｒ．Ｔ． ２０１１ Ｄｅｓｉｇｎ， ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９， １１３１）及びＢＢａ＿ＢＢ００３２リボソーム結合部位（ＲＢＳ； ｉＧＥＭ Ｐａｒｔｓ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）と融合され、下流ではｐｈｏＮ２転写ターミネーターと融合されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２アピラーゼコード遺伝子；
・マルトース及びマルトデキストリンオペロンの転写活性化因子をコードするＥｃＮ ｍａｌＴ遺伝子の一部。

【0246】

図５３及び図５４は、それぞれ、ＥｃＮ ｍａｌＰ及びｍａｌＴ遺伝子部分のヌクレオチド配列を示す（それぞれ、配列番号６及び配列番号７）。図５５は、Ｐ_ｐｒｏＤプロモーター、ＢＢａ＿ＢＢ００３２ ＲＢＳ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子、及びｐｈｏＮ２転写ターミネーターを含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す（配列番号８）。図５６は、ＦＲＴ配列が隣接したＥ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す（配列番号９）。

【0247】

ＥｃＮゲノムにおいて遺伝子組み換えを行うため、挿入ＤＮＡ断片は、ｐＫＤ４６プラスミドを有するＥｃＮ株において形質転換され、前記ｐＫＤ４６プラスミドはファージλ Ｒｅｄリコンビナーゼを発現するものである。ｍａｌＰ及びｍａｌＴ部位におけるλ Ｒｅｄ仲介相同組換えは、ＥｃＮのｍａｌＰ－ｍａｌＴ遺伝子間領域への挿入ＤＮＡ断片の組み込みを促進した。ｐＫＤ４６除去後、ゲノムに前記挿入ＤＮＡ断片を有するＥｃＮクローンは、クロラムフェニコール耐性の点から選択され、ゲノムにおいて正しい組み込みが行われたかＰＣＲで確認された。ＤＮＡ断片の正しい組み込みの点から選択されたＥｃＮクローンは、酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ（フリッパーゼ）を発現するｐＣＰ２０プラスミドで形質転換され、ゲノムからクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。ｐＣＰ２０の除去後、ゲノムにクロラムフェニコールカセットを含まない組換えＥｃＮクローンは、クロラムフェニコール感受性の点から選択され、ゲノムから正しくカセットが切除されているかＰＣＲで確認された。上述により得られた、ｍａｌＰ－ｍａｌＴ遺伝子間領域にＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｐｈｏＮ２遺伝子を有する組換えＥｃＮクローンはＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２と命名された。図５７は、得られたＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２クローンのｍａｌＰ－ｐｈｏＮ２－ｍａｌＴ組換えゲノム領域を概略的に示す。図５８は、ペリプラズム抽出物のウェスタンブロットにおける、選択された１つＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２クローン（ｃｌ １）でのアピラーゼの発現を示す。また、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２ ｃｌ １における酵素の活性が確認された。図５９は、インビトロＡＴＰ－分解アッセイにおける、ペリプラズム抽出物による用量依存のＡＴＰ分解を示す。両アッセイにおいて、ＥｃＮ野生型株（ＥｃＮ）はネガティブコントロールとして用いられた。ＥｃＮ野生型及びＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２細菌株はＬＢ培地で培養された。

【0248】

実施例１２：異種発現のための、アピラーゼをゲノムにコードする組換え細菌は、ディスバイオーシス誘発性低血糖およびＷＡＴ体重減少を改善する。
ｐｈｏＮ２遺伝子がゲノムに組み込まれた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）プロバイオティクス細菌（前記した実施例１１のように得られる）の投与が、抗生物質媒介性ディスバイオーシスによる低血糖症の改善に有効であったかどうかを調べるために、抗生物質（マウス１頭当たり２００μｌの滅菌水中、バンコマイシン１．２５ｍｇ、アンピシリン２．５ｍｇ、およびメトロニダゾール１．２５ｍｇ）をＣ５７ＢＬ／６マウスに投与し、続いて、ＥｃＮまたはＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２株を経管投与した（図６０に示す実験スケジュール）。４日間の抗生物質処置と４日間の回復後に、血糖を分析した（それぞれ、図６０の－４日目と３日目）。図６１に示すように、抗生物質処置により、血糖が有意に低下した（低血糖）。注目すべきことに、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２で処置したマウスは、未処置マウスと同様の血清グルコースレベルを示し、ＡＢＸ、およびＡＢＸ＋ＥｃＮ処置マウスと比較して有意に高かった。これらのデータは、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２の投与により、抗生物質処置によって損なわれた血糖値が回復することを示す。

【0249】

ＷＡＴの抗生媒介性喪失に対するＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２の効果を評価するために、白色脂肪組織を採取し定量した。図６２に示すように、ＷＡＴ重量は、抗生物質誘発性ディスバイオーシスにより有意に減少した一方、この効果は、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２で処置した動物では軽減され、ＡＢＸ、またはＡＢＸ＋ＥｃＮで処置した動物よりも有意に増加したＷＡＴ重量を示した。これらのデータは、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２の投与が、抗生物質誘発性ＷＡＴ喪失を緩和することを示す。

【0250】

実施例１３：異種発現のための、アピラーゼをゲノムにコードする組換え細菌は、ディスバイオーシスによって引き起こされる盲腸肥大および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）への細菌移行を軽減する。
ディスバイオーシスからの回復における、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２の有利な効果の可能性を調べるために、抗生物質誘発性ディスバイオーシスのマウスモデルを用いた。処置スケジュールを図６０に示す。８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウスを、４つの異なる実験群に無作為に割り当てた：即ち、未処置（コントロール）、抗生物質（ＡＢＸ：マウス１頭当たり、滅菌水２００μｌ中、バンコマイシン１．２５ｍｇ、アンピシリン２．５ｍｇ、およびメトロニダゾール１．２５ｍｇ）で処置、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥｃＮで処置、ＡＢＸおよび１０^１０ＣＦＵのＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２で処置。実験後、マウスをＣＯ_２吸入によって殺処分し、盲腸と腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を回収し分析した。

【0251】

４日間の抗生物質処置と４日間の回復後に、盲腸重量を分析した（図６０を参照）。結果を図６３に示す。抗生物質処置によって誘発されたディスバイオーシスは、盲腸重量の顕著な増加をもたらした。しかし、Ｅｃｎ：：ｐｈｏＮ２で処置したマウスは、ＡＢＸ、またはＡＢＸ＋ＥｃＮで処置したマウスと比較して、有意に低い盲腸重量を示した。これらのデータは、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２の投与が、抗生物質媒介性盲腸肥大の誘導を軽減することを示す。

【0252】

細菌移行の制御における、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２の効果を調べるために、ＭＬＮを無菌的にＲＰＭＩに回収し、機械的にホモジナイズした。希釈物を、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ寒天（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にプレーティングした。コロニー数をカウントする前に、プレートを、好気性と嫌気性の両条件下にて、３７℃で２４～７２時間、増殖させた。結果を図６４と図６５に示す。好気性と嫌気性の両条件で、ＭＬＮのＣＦＵの定量により、コントロール動物と比較して、有意な増加が明らかとなった。しかし、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２で処置したマウスは、ＡＢＸ、またはＡＢＸ＋ＥｃＮとで処置したマウスと比較して、好気性と嫌気性の両条件にて、有意に減少したＣＦＵを示した。これらのデータは、ＥｃＮ：：ｐｈｏＮ２の投与が、抗生物質媒介性ディスバイオーシスによって誘発される細菌移行を軽減することを示す。

【0253】

実施例１４：アピラーゼ発現Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの設計および産生
アピラーゼ発現生物学的製剤のプラットフォームをさらに拡大するために、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓをグラム陽性株として選択した。その非侵襲性および非病原性の特性により、Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、機能性タンパク質の腸内送達の有望な候補であることが示されている（Ｖａｒｍａ， Ｎ．Ｒ．， Ｔｏｏｓａ， Ｈ．， Ｆｏｏ， Ｈ．Ｌ．， Ａｌｉｔｈｅｅｎ， Ｎ．Ｂ．， Ｎｏｒ Ｓｈａｍｓｕｄｉｎ， Ｍ．， Ａｒｂａｂ， Ａ．Ｓ．， Ｙｕｓｏｆｆ， Ｋ．， ａｎｄ Ａｂｄｕｌ Ｒａｈｉｍ， Ｒ． （２０１３）． Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｒａｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ： Ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ｇｒａｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ＥＶ７１． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ２０１３， ４３１３１５）。インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）を発現する遺伝的にエンジニアードされたＬ．ｌａｃｔｉｓは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置に使用された（Ｂｒａａｔ， Ｈ．， Ｒｏｔｔｉｅｒｓ， Ｐ．， Ｈｏｍｍｅｓ， Ｄ．Ｗ．， Ｈｕｙｇｈｅｂａｅｒｔ， Ｎ．， Ｒｅｍａｕｔ， Ｅ．， Ｒｅｍｏｎ， Ｊ．Ｐ．， ｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒ， Ｓ．Ｊ．， Ｎｅｉｒｙｎｃｋ， Ｓ．， Ｐｅｐｐｅｌｅｎｂｏｓｃｈ， Ｍ．Ｐ．， ａｎｄ Ｓｔｅｉｄｌｅｒ， Ｌ． （２００６）． Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ４， ７５４－７５９）。さらに、膵炎関連タンパク質（ＰＡＰ）を発現する組換えＬ．ｌａｃｔｉｓ株は、化学療法誘発性粘膜炎における腸の恒常性を効率的に維持することが示されている（Ｃａｒｖａｌｈｏ， Ｒ．， Ｖａｚ， Ａ．， Ｐｅｒｅｉｒａ， Ｆ．Ｌ．， Ｄｏｒｅｌｌａ， Ｆ．， Ａｇｕｉａｒ， Ｅ．， Ｃｈａｔｅｌ， Ｊ．Ｍ．， Ｂｅｒｍｕｄｅｚ， Ｌ．， Ｌａｎｇｅｌｌａ， Ｐ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ， Ｇ．， Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄａｉｒｙ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＰＡＰ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８， １５０７２）。

【0254】

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓＮＺ９００株におけるＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉアピラーゼの発現のために、アピラーゼをコードする遺伝子ｐｈｏＮ２を、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉゲノムからＰＣＲ増幅し、ｐＮＺ８１２３プラスミドにクローニングし、ｐＮＺ－Ａｐｙｒプラスミドを生成した（図６６）。ｐＮＺ－Ａｐｙｒプラスミドでのアピラーゼ発現は、ナイシン抗菌ペプチドによって誘導される、ＰｎｉｓＡプロモーターによって制御される。ｐｈｏＮ２遺伝子は、アピラーゼ分泌を可能にするＬ．ｌａｃｔｉｓ主要分泌タンパク質Ｕｓｐ４５のシグナル配列と共にインフレームでクローニングした。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ とＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の各株を、グルコース（０．５％ｗ／ｖ）とナイシン（４ｎｇ／ｍｌ）を添加したＭ１７培地で生育させた。

【0255】

実施例１５：Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の投与は、成体マウスにおける食餌誘発性ディスバイオーシスによって引き起こされる腸バリア破壊およびＭＬＮへの細菌移行に対抗する。
腸バリアは、腸粘膜の防御に関与する形態機能単位を定義し、腸内微生物叢と、腸上皮細胞（ＩＥＣ）と、サイトカイン、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）、代謝産物、及び多数の調節分子の複雑なネットワークを介して緊密に連携した粘膜免疫とからなる（Ｍｅｎｇ， Ｍ．， Ｋｌｉｎｇｅｎｓｍｉｔｈ， Ｎ．Ｊ．， ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒｓｍｉｔｈ， Ｃ．Ｍ． （２０１７）． Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｕｔ ａｓ ｔｈｅ ｄｒｉｖｅｒ ｏｆ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｌｌｎｅｓｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｆａｉｌｕｒｅ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ ２３， １４３－１４８）。腸粘膜は、感染の脅威のリスクに曝されている最大の体表面であり、腸バリアの解剖学的且つ機能的恒常性は、人体の抗感染防御における重要なステップである。腸内微生物叢は、腸バリアの防御の最前線である。微生物叢は、胃腸管にコロニーを形成する何百万もの微生物を伴い、その大部分が細菌である。この多数の微生物は、人体との共生関係により、不利な腸内生息環境に耐えている。これらの共生宿主－共生関係は生誕後に発達し、微生物叢が腸の恒常性に寄与する代謝、免疫、および抗感染の各プロセスを可能にする（Ｏ’Ｈａｒａ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｓｈａｎａｈａｎ， Ｆ． （２００６）． Ｔｈｅ ｇｕｔ ｆｌｏｒａ ａｓ ａ ｆｏｒｇｏｔｔｅｎ ｏｒｇａｎ． ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ７， ６８８－６９３）。共生集団の構造的且つ機能的安定性は、多数のシグナル伝達分子（クオラムセンシング）および細胞調節因子（ｍｉＲＮＡ）、ならびに他の生理学的および病理学的因子によって調節される。ディスバイオーシスとして広く定義されるこの微生物群集の質的または量的変化は、宿主と共生種との間の関係を損なわせ、共生生物と病原体との間のバランスを変化させ、腸のバリア保護を低下させ、感染性病原体にとって有利となる（ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｄ．， Ａｃｋｅｒｍａｎｎ， Ｇ．， Ｋｈａｉｌｏｖａ， Ｌ．， Ｂａｉｒｄ， Ｃ．， Ｈｅｙｌａｎｄ， Ｄ．， Ｋｏｚａｒ， Ｒ．， Ｌｅｍｉｅｕｘ， Ｍ．， Ｄｅｒｅｎｓｋｉ， Ｋ．， Ｋｉｎｇ， Ｊ．， Ｖｉｓ－Ｋａｍｐｅｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｉｎ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｉｌｌｎｅｓｓ． ｍＳｐｈｅｒｅ １： ｅ００１９９－１６． ｄｏｉ： １０．１１２８／ｍＳｐｈｅｒｅ．００１９９－１６）。食事は、腸内微生物叢に影響を及ぼす主要な要素である。食物摂取量の自然な変動は、微生物組成の一過性変化をもたらすが、肉、魚、及び繊維などの主要成分は、微生物叢に永続的な影響を及ぼし、特定の細菌群の変化によって特徴付けられる典型的な特徴をもたらす（Ｓｃｏｔｔ， Ｋ．Ｐ．， Ｇｒａｔｚ， Ｓ．Ｗ．， Ｓｈｅｒｉｄａｎ， Ｐ．Ｏ．， Ｆｌｉｎｔ， Ｈ．Ｊ．， ａｎｄ Ｄｕｎｃａｎ， Ｓ．Ｈ． （２０１３）． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｅｔ ｏｎ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｓ ６９， ５２－６０）。食物組成の変化、及び食物不足または過剰供給は、腸内微生物叢に影響を及ぼす。非経口摂取において生じる、腸内に栄養素が存在しない状態は、粘膜壁の炎症を促進し、最終的に上皮バリアの破壊を引き起こす、プロテオバクテリアのレベルを上昇させる（Ｄｅｍｅｈｒｉ， Ｆ．Ｒ．， Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｍ．， ａｎｄ Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ， Ｄ．Ｈ． （２０１５）． Ｃｈａｎｇｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｗｉｔｈ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ： Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｎｕｔｒ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ ３０， ７９８－８０６）。微生物叢の組成に対する食事の影響は、初期のコロニー形成段階中に示される。即ち、母乳で育てられた乳児は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｐ．のレベルが高くなる一方、粉ミルクで育てられた乳児は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．のレベルが高く、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓとＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．も増加する（Ｆａｌｌａｎｉ， Ｍ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｄ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｊ．， Ｎｏｒｉｎ， Ｅ．， Ａｍａｒｒｉ， Ｓ．， Ａｄａｍ， Ｒ．， Ａｇｕｉｌｅｒａ， Ｍ．， Ｋｈａｎｎａ， Ｓ．， Ｇｉｌ， Ａ．， Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１０）． Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｆ ６－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ ｉｎｆａｎｔｓ ａｃｒｏｓｓ Ｅｕｒｏｐｅ： ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｂｅｙｏｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｏｄｅ， ｂｒｅａｓｔ－ｆｅｅｄｉｎｇ， ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ ５１， ７７－８４）。生後期間後も、微生物叢は、生涯を通じて比較的安定していると考えられていた。しかし、いくつかの最近の研究は、食事因子が微生物群集を変化させ、宿主に生物学的変化をもたらすことを示している。事実、マウスの腸内微生物叢の形成とメタボリックシンドロームの表現型の調節における、宿主の遺伝学と食事との相対的な寄与を評価する研究によって示されるように、腸内微生物叢の組成は食事と強く相関している（Ｚｈａｎｇ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｓ．， Ｈａｎ， Ｒ．， Ｃａｏ， Ｙ．， Ｈｕａ， Ｗ．， Ｍａｏ， Ｙ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ．， Ｐａｎｇ， Ｘ．， Ｗｅｉ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０１０）． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ， ｈｏｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｄｉｅｔ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． ＩＳＭＥ Ｊ ４， ２３２－２４１）。

【0256】

食物は、栄養素の供給源であるだけでなく、体の生理機能のいくつかの調整もし得る。このことは、腸と食物抗原との継続的な相互作用から、特に、腸管に当てはまる（Ｕｌｌｕｗｉｓｈｅｗａ， Ｄ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｒ．Ｃ．， ＭｃＮａｂｂ， Ｗ．Ｃ．， Ｍｏｕｇｈａｎ， Ｐ．Ｊ．， Ｗｅｌｌｓ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｒｏｙ， Ｎ．Ｃ． （２０１１）． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｄｉｅｔａｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ １４１， ７６９－７７６）。最近の研究により、食物とＩＥＣとの間の相互作用の影響が示された。事実、食物抗原は、トランスポーターの活性、タイトジャンクションの透過性、代謝酵素の発現、免疫機能、および微生物叢を調節することができる（Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｍ． （２０１０）． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｏｏｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７４， ２３２－２４１）。胃腸管に入る食物は、生物に栄養を与える。さらに、宿主酵素または腸内微生物叢による栄養素の酵素的変換によって、または腸バリアの変化を含む多様な機能に影響を及ぼす非酵素分子の放出を刺激することによって、生成される多くの代謝産物が存在する。

【0257】

内腔で生成された代謝産物は血流に入り、体の器官の機能に影響を及ぼすのに十分な濃度に達し得る（Ｄｏｄｄ， Ｄ．， Ｓｐｉｔｚｅｒ， Ｍ．Ｈ．， Ｖａｎ Ｔｒｅｕｒｅｎ， Ｗ．， Ｍｅｒｒｉｌｌ， Ｂ．Ｄ．， Ｈｒｙｃｋｏｗｉａｎ， Ａ．Ｊ．， Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｔｏｍ， Ｓ．Ｋ．， Ｌｅ， Ａ．， Ｃｏｗａｎ， Ｔ．Ｍ．， Ｎｏｌａｎ， Ｇ．Ｐ．， Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ａ ｇｕｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｓ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｎｉｎｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５５１， ６４８－６５２）。食事と、消化と、微生物叢と、腸バリアとの間のこれらの相互作用は、腸の恒常性に影響を及ぼし得る（Ｆａｒｒｅ， Ｒ．， Ｆｉｏｒａｎｉ， Ｍ．， Ａｂｄｕ Ｒａｈｉｍａｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｍａｔｔｅｏｌｉ， Ｇ． （２０２０）． Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ． Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ １２：１１８５． ｄｏｉ： １０．３３９０／ｎｕ１２０４１１８５）。

【0258】

食事誘発性ディスバイオーシスも、腸の恒常性のバランスを崩し、炎症をもたらすメカニズムを引き起こす。腸上皮を横断する細菌の移行は、ディスバイオーシスで増加する（Ｓａｔｏ， Ｊ．， Ｋａｎａｚａｗａ， Ａ．， Ｉｋｅｄａ， Ｆ．， Ｙｏｓｈｉｈａｒａ， Ｔ．， Ｇｏｔｏ， Ｈ．， Ａｂｅ， Ｈ．， Ｋｏｍｉｙａ， Ｋ．， Ｋａｗａｇｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｔ．， Ｏｇｉｈａｒａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ｇｕｔ ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ “ｌｉｖｅ ｇｕｔ ｂａｃｔｅｒｉａ” ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ３７， ２３４３－２３５０）。健康なヒトの腸内で行われるように、少数の移行共生細菌は、特に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．の多糖類（Ｍａｚｍａｎｉａｎ， Ｓ．Ｋ．， ａｎｄ Ｋａｓｐｅｒ， Ｄ．Ｌ． （２００６）． Ｔｈｅ ｌｏｖｅ－ｈａｔｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６， ８４９－８５８）及び粘膜付着性セグメント糸状菌（ＳＦＢ）（Ｉｖａｎｏｖ， ＩＩ， Ａｔａｒａｓｈｉ， Ｋ．， Ｍａｎｅｌ， Ｎ．， Ｂｒｏｄｉｅ， Ｅ．Ｌ．， Ｓｈｉｍａ， Ｔ．， Ｋａｒａｏｚ， Ｕ．， Ｗｅｉ， Ｄ．， Ｇｏｌｄｆａｒｂ， Ｋ．Ｃ．， Ｓａｎｔｅｅ， Ｃ．Ａ．， Ｌｙｎｃｈ， Ｓ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｈ１７ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｃｅｌｌ １３９， ４８５－４９８）によって誘導されるＴｈ１およびＴｈ１７細胞の作用によって除去される。反対に、多数の侵入細菌はＴＬＲを活性化し、炎症誘発性サイトカインの過剰発現を引き起こし、これにより、腸上皮が損傷して、慢性腸炎症に至る（Ｋａｒｃｚｅｗｓｋｉ， Ｊ．， Ｐｏｎｉｅｄｚｉａｌｅｋ， Ｂ．， Ａｄａｍｓｋｉ， Ｚ．， ａｎｄ Ｒｚｙｍｓｋｉ， Ｐ． （２０１４）． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｎ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ４７， ４９４－５０４）。腸バリアの破壊、腸透過性の上昇、および代謝が活性な組織への細菌抗原の移行は、慢性的な炎症状態と、インスリン抵抗性、肝臓の脂肪沈着、過剰な脂肪組織の発達などの代謝機能障害（Ｔｅｈｒａｎｉ， Ａ．Ｂ．， Ｎｅｚａｍｉ， Ｂ．Ｇ．， Ｇｅｗｉｒｔｚ， Ａ．， ａｎｄ Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ， Ｓ． （２０１２）． Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ？ Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｍｏｔｉｌ ２４， ３０５－３１１； Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ， Ｍ． （２０１９）． Ｌｅａｋｙ ｇｕｔ： ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ， ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｇｕｔ ６８， １５１６－１５２６）、関節リウマチ（Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ， Ｃ．Ｓ．， Ｃａｌａｄｏ， Ａ．， Ｓｏｕｓａ， Ｊ．， ａｎｄ Ｆｏｎｓｅｃａ， Ｊ．Ｅ． （２０１８）． Ｄｉｅｔ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ， ａｎｄ Ｇｕｔ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ－Ｔｈｅ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｔｒｉａｄ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｍｅｄ （Ｌａｕｓａｎｎｅ） ５， ３４９）、及び潰瘍性大腸炎（Ｄｅｎ Ｈｏｎｄ， Ｅ．， Ｈｉｅｌｅ， Ｍ．， Ｅｖｅｎｅｐｏｅｌ， Ｐ．， Ｐｅｅｔｅｒｓ， Ｍ．， Ｇｈｏｏｓ， Ｙ．， ａｎｄ Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ， Ｐ． （１９９８）． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｕｔｙｒａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｃ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１５， ５８４－５９０）をもたらす。

【0259】

この状態に対するアピラーゼの有利な効果を調べるために、食餌誘発性ディスバイオーシス（ＤＩＤ）のマウスモデルを作製した。７％のタンパク質、５％の脂肪、および８８％の炭水化物を特徴とする食餌をマウスに与えることにより、ディスバイオーシスを誘発した。２０％のタンパク質、１５％の脂肪、および６５％の炭水化物を特徴とする通常の食餌（ＮＤ）をコントロールとして用いた。各食餌の成分の概略図を、図６７に示す。図６８に示す実験レイアウトは、５週齢のマウスのＤＩＤモデルを示す。５週齢で、雌性Ｃ６７ＢＬ／６マウスを、ＮＤまたはＤＩＤの食餌のいずれかに無作為に割り当てた。この期間中、ＤＩＤ給餌マウスに、１０^１０のＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ またはＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} を、毎日、経口経管投与した。８週間後、それぞれの食餌の効果を評価するために、マウスを殺処分し分析した。

【0260】

ＤＩＤは、腸粘膜の腸バリア機能を損なわせ得る腸内微生物叢の変化を特徴とし、粘膜透過性の向上と、それに続く、共生細菌および／または細菌産物の血液循環への移行をもたらす（Ｆｕｋｕｉ， Ｈ． （２０１９）． Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｇｕｔ Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｗｈａｔ Ｈａｖｅ Ｗｅ Ｌｅａｒｎｅｄ Ｓｏ Ｆａｒ？ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ７： ５８ ｄｏｉ： １０．３３９０／ｄｉｓｅａｓｅｓ７０４００５８）。

【0261】

Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} が腸の完全性を維持できるかどうかを調べるために、ディスバイオーシスを誘発し、アピラーゼ発現細菌を前記したように（図６８に示される実験スケジュール）投与した。ＮＤまたはＤＩＤの食餌の８週間後、マウスに、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識デキストランを経口経管投与し、続いて、血清中のＦＩＴＣレベルを測定した。結果を図６９に示す。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ で処置または未処置のＤＩＤマウスは、ＮＤマウスと比較して、血清中のＦＩＴＣの有意に高い濃度を特徴とした。対照的に、ＤＩＤを給餌され、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置されたマウスは、ＮＤ動物に匹敵する血清中ＦＩＴＣレベルを示し、ＤＩＤ単独又はＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ と共に与えられたマウスに対して有意に低かった。これらのデータは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の投与が、ＤＩＤによって引き起こされる腸バリア破壊を軽減することを示す。更に、ＭＬＮへの細菌移行の軽減におけるアピラーゼの効果を調べるために、実験終了後にマウスを殺処分し（図６８を参照）、ＭＬＮを無菌的にＲＰＭＩに回収し、機械的にホモジナイズした。希釈物を、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ寒天（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にプレーティングした。コロニー数をカウントする前に、プレートを、好気性と嫌気性の両培養条件下にて、３７℃で２４～７２時間、増殖させた。結果を図７０と図７１に示す。好気性と嫌気性の両条件で、ＭＬＮのＣＦＵの定量により、ＮＤ動物と比較して、ＤＩＤ食、またはＤＩＤ食＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 処置マウスにおけるＭＬＮのＣＦＵの有意な増加が明らかとなった。対照的に、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} で処置したＤＩＤマウスは、ＮＤ動物と有意に異ならず、ＤＩＤ食、およびＤＩＤ食＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ マウスに対して有意に低いＭＬＮにおけるＣＦＵ数を示した。これらのデータは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の投与が、ＤＩＤによって誘発される細菌移行を軽減することを示す。これと共に、ＤＩＤ、およびＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ マウスは、ＮＤマウスと比較して、便中のリポカリン－２（ＬＣＮ－２）レベルの増加として定量される腸炎症の軽度の徴候を示した。驚くべきことに、ＤＩＤ食を与えられ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＡｐｙｒ} で処置されたマウスは、ＮＤ動物に有意に異ならず、ＤＩＤ食単独又はＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ と共に与えられたマウスに対して有意に低い便中ＬＣＮ－２レベルを示した。これらのデータは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の投与が、ＤＩＤによって引き起こされる腸炎症を軽減することを示す（結果を図７２に示す）。

【0262】

実施例１６：Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の投与は、新生仔マウスにおける食事誘発性ディスバイオーシスによって引き起こされる腸バリア破壊およびＭＬＮへの細菌移行に対抗する。
母から子への代謝性疾患の伝染は、多因子性であり、遺伝的、エピジェネティック、及び環境的影響が挙げられる。齧歯類、ヒト、および非ヒト霊長類における証拠は、妊娠中の食事誘発性ディスバイオーシスへの曝露が、乳児の免疫系および幼若微生物叢に対する長期に亘る代謝的特徴を形成し、それが子孫の肥満および代謝性疾患の素因となるという科学的前提を支持する。新生児では、母を通じて導入された胃腸管微生物は、乳児免疫系の直接誘導因子／調節因子として機能する能力を有することが知られている。新生児の免疫応答開始能力は限られている。したがって、初期の新生児期に、微生物のコロニー形成が損なわれると、出生後の免疫応答が損なわれる。メカニズムは十分に理解されていないが、妊娠中の食事誘発性ディスバイオーシスが、門脈系を介した直接的な連絡、代謝産物の産生、腸バリア完全性および造血免疫細胞軸（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ａｘｉｓ）における変化を通じて、乳児の微生物叢組成、肝臓、およびその他の臓器の発達と調節とに影響を及ぼすことを示唆する証拠が増えている（Ｃｏｌｌａｄｏ， Ｍ．Ｃ．， Ｉｓｏｌａｕｒｉ， Ｅ．， Ｌａｉｔｉｎｅｎ， Ｋ．， ａｎｄ Ｓａｌｍｉｎｅｎ， Ｓ． （２０１０）． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｏｔｈｅｒ’ｓ ｗｅｉｇｈｔ ｏｎ ｉｎｆａｎｔ’ｓ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ， ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｉｎｆａｎｃｙ： ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｓｔｕｄｙ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ． Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ９２， １０２３－１０３０； Ｃｏｌｌａｄｏ， Ｍ．Ｃ．， Ｌａｉｔｉｎｅｎ， Ｋ．， Ｓａｌｍｉｎｅｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｉｓｏｌａｕｒｉ， Ｅ． （２０１２）． Ｍａｔｅｒｎａｌ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｗｅｉｇｈｔ ｇａｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｍｏｄｉｆｙ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｍｉｌｋ． Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ ７２， ７７－８５）。

【0263】

新生仔におけるＤＩＤに対するアピラーゼの有利な効果を調べるために、食餌誘発性ディスバイオーシス（ＤＩＤ）の新生仔モデルを作製した。７％のタンパク質、５％の脂肪、および８８％の炭水化物を特徴とする食事を母親マウスに与えることにより、ディスバイオーシスを誘発した。２０％のタンパク質、１５％の脂肪、および６５％の炭水化物を特徴とする通常の食餌（ＮＤ）をコントロールとして用いた。各食餌の成分の概略図を、図６７に示す。図７３に示す実験レイアウトは、ＤＩＤの新生仔モデルを示す。８週齢で、雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＮＤ食またはＤＩＤ食のいずれかを摂取するように無作為に割り当てた。１５日後、ＮＤおよびＤＩＤの雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＮＤ雄性マウスと交配させた。生誕直後から開始して、ＤＩＤの新生仔に、１０^８のＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ またはＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} を、生誕後２１日目まで、１週間に２回、経口経管投与した。体重、尾の長さ、及び挙動について、毎日、新生仔をモニターした。

【0264】

Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} が腸の完全性を維持できるかどうかを調べるために、２１日齢のＤＩＤ又はＮＤマウスに、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識デキストランを経口経管投与し、続いて、血清中のＦＩＴＣレベルを測定した。結果を図７４に示す。ＤＩＤ、及びＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ マウスは、ＮＤマウスと比較して、血清中のＦＩＴＣの有意に高い濃度を特徴とした。対照的に、ＤＩＤ食を給餌され、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} で処置されたマウスは、ＮＤ動物と有意に異ならない血清中ＦＩＴＣレベルを示した一方、ＤＩＤ食単独又はＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ と共に与えられたマウスに対して有意に低かった。これらのデータは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の投与が、食事誘発性ディスバイオーシスによって引き起こされる腸バリア破壊を軽減することを示す。

【0265】

更に、ＭＬＮへの細菌移行の軽減におけるアピラーゼの効果を調べるために、実験終了後にマウスを殺処分し（図７３を参照）、ＭＬＮを無菌的にＲＰＭＩに回収し、機械的にホモジナイズした。希釈物を、Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ寒天（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にプレーティングした。コロニー数をカウントする前に、プレートを、好気性又は嫌気性培養条件下にて、３７℃で２４～７２時間、増殖させた。結果を図７５と図７６に示す。好気性と嫌気性の両条件で、ＭＬＮのＣＦＵの定量により、ＮＤ動物と比較して、ＤＩＤ、またはＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ マウスにおけるＣＦＵの有意な増加が明らかとなった。対照的に、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} で処置したＤＩＤマウスは、コントロール動物と非常に類似しており、ＤＩＤ、およびＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ マウスに対して有意に低いＭＬＮにおけるＣＦＵ数を示した。これらのデータは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の投与が、食事誘発性ディスバイオーシスによって誘発される細菌移行に対抗することを示す。

【0266】

実施例１７：Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の投与は、新生仔マウスにおける食餌誘発性ディスバイオーシスの影響を受ける成長パラメーターを改善する。
母体のタンパク質欠乏症は、胎児の発育遅延や成体期の疾患の素因となる、重度のディスバイオーシスを引き起こす（Ｒｅｅｓ， Ｗ．Ｄ．， Ｈａｙ， Ｓ．Ｍ．， Ｂｕｃｈａｎ， Ｖ．， Ａｎｔｉｐａｔｉｓ， Ｃ．， ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ， Ｒ．Ｍ． （１９９９）． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｆｅｔｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｐｐｌｙ． Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ ８１， ２４３－２５０．）。アピラーゼが子孫の成長パラメーターに影響を及ぼすかどうかを理解するために、ＮＤおよびＤＩＤの雌親から生まれた新生仔に、生誕後２１日目まで、１週間に２回、１０^８のＬ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ またはＬ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} を経口経管投与した（図７３を参照）。生誕後２１日目に、体重、尾の長さ、小腸および結腸の長さを評価した。母親の食事誘発性ディスバイオーシスは、ＤＩＤ、およびＤＩＤ＋Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^ｐＮＺ 新生児の両方で、体重変化（図７７）、尾の長さ（図７８）、小腸の長さ（図７９）、および結腸の長さ（図８０）に有意な影響を及ぼした。特に、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} で処置したＤＩＤ新生仔は、他のＤＩＤ群と比較して、各種成長パラメーター全ての改善を示した。したがって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ^{ｐＮＺ－Ａｐｙｒ} の投与は、ＤＩＤによって引き起こされる成長遅延を改善する。

【0267】

配列及び配列番号表（配列表）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図78】

【図79】

【図80】

【配列表】

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【国際調査報告】