特表2023-529432新型コロナウイルス感染症の経口ワクチン及びその調製と応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-10
(54)【発明の名称】新型コロナウイルス感染症の経口ワクチン及びその調製と応用
(51)【国際特許分類】
A61K 39/215 20060101AFI20230703BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20230703BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20230703BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230703BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230703BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230703BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230703BHJP
【ＦＩ】
A61K39/215
C07K14/165 ZNA
C12N15/50
C12N15/63 Z
C12N1/19
A61P31/14
A61P37/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022575467
(86)(22)【出願日】2021-04-21
(85)【翻訳文提出日】2022-12-26
(86)【国際出願番号】 CN2021088592
(87)【国際公開番号】W WO2021249031
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】202010529961.7
(32)【優先日】2020-06-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505245449
【氏名又は名称】天津大学
【氏名又は名称原語表記】Ｔｉａｎ Ｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【住所又は居所原語表記】９２， Ｗｅｉｊｉｎ Ｒｏａｄ， Ｎａｎｋａｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７２ ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100130111
【弁理士】
【氏名又は名称】新保 斉
(72)【発明者】
【氏名】黄 金海
(72)【発明者】
【氏名】張 麗琳
(72)【発明者】
【氏名】郭 艶余
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA72X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA45
4C085AA03
4C085BA71
4C085BB11
4C085CC08
4C085CC21
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】 新型コロナウイルス感染症のＳタンパク質を発現する経口組換え酵母及びその調製と応用を提供することを課題とする。
【解決手段】 本発明は、新型コロナウイルス感染症のＳタンパク質を発現する経口組換え酵母及びその調製と応用を開示し、Ｓタンパク質の１６番目から１０３５番目までのアミノ酸を含み、好ましくはＲＢＤドメイン及びＦＰ融合ペプチドを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＳタンパク質切断体の完全転写ユニットＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを相同組換えにより酵母ゲノムに組み込み、Ａｇａ１－Ａｇａ２表面提示系を利用してＳタンパク質を酵母細胞表面に提示し、Ｓタンパク質表面提示型の組換え酵母菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を得、得られた菌株を用いて経口組換え酵母を調製する。本発明の経口組換え酵母は、コストが低く、生産と使用において安全で、操作が簡単で、安全で効果的で、免疫保護作用を有し、ＣＯＶＩＤ－１９新型コロナウイルス感染の防止・制御のための選択肢を提供する。
【選択図】 図１
【解決手段】 本発明は、新型コロナウイルス感染症のＳタンパク質を発現する経口組換え酵母及びその調製と応用を開示し、Ｓタンパク質の１６番目から１０３５番目までのアミノ酸を含み、好ましくはＲＢＤドメイン及びＦＰ融合ペプチドを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＳタンパク質切断体の完全転写ユニットＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを相同組換えにより酵母ゲノムに組み込み、Ａｇａ１－Ａｇａ２表面提示系を利用してＳタンパク質を酵母細胞表面に提示し、Ｓタンパク質表面提示型の組換え酵母菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を得、得られた菌株を用いて経口組換え酵母を調製する。本発明の経口組換え酵母は、コストが低く、生産と使用において安全で、操作が簡単で、安全で効果的で、免疫保護作用を有し、ＣＯＶＩＤ－１９新型コロナウイルス感染の防止・制御のための選択肢を提供する。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｓタンパク質の１６番目から１０３５番目までのアミノ酸を含む新型コロナウイルス感染症のＳタンパク質を発現する経口組換え酵母ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）。
【請求項2】
３００番目から１０００番目までのアミノ酸であることが好ましく、配列の特徴は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で、３３０番目から５２１番目までのＲＢＤドメイン及び８１６番目から８３３番目までのＦＰ融合ペプチドを含む新型コロナウイルスのＳタンパク質の切断体。
【請求項3】
請求項２に記載のタンパク質の切断体を発現する遺伝子であって、スパイクプロテインＳの９９１番目から１５６３番目までの塩基であるＲＢＤドメイン及び２４４９番目から２４９９番目までの塩基であるＦＰドメインを含み、塩基配列はＳＥＱＩＤ Ｎｏ．２であることを特徴とする、タンパク質の切断体を発現する遺伝子。
【請求項4】
請求項１に記載の組換え酵母のプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを構築し、配列の特徴は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３であり、請求項３に記載の遺伝子断片及びＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターからなる、組換え酵母のプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ。
【請求項5】
新型コロナウイルスのＳタンパク質組換え酵母の調製方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＳタンパク質切断体の完全転写ユニットＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを相同組換えにより酵母ゲノムに組み込み、Ａｇａ１－Ａｇａ２表面提示系を利用してＳタンパク質を酵母細胞表面に提示し、Ｓタンパク質表面提示型の組換え酵母菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を得、得られた菌株を用いて経口組換え酵母を調製することを特徴とする、新型コロナウイルスのＳタンパク質組換え酵母の調製方法。
【請求項6】
具体的には、次のステップ：（１） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス遺伝子配列ＮＣ＿０４５５１２．２を参照し、Ｓ遺伝子を合成し、配列の特徴はＳＥＱ Ｎｏ．２であり、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドをテンプレートとして、プライマーを設計して酵母ベクター接続用のＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅するステップ、
（２） Ａｇａ２遺伝子とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）とのタンデム：ＢａｍＨＩシングル酵素ダイジェストを通じてＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターを線形化し、Ｓ遺伝子断片をシームレスクローニングにより表面ディスプレイ発現ベクターＧＰＤ－ＰＯＴ－ＴＵに接続し、組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵが得られ、配列の特徴はＳＥＱＮｏ．３で、組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換し、Ｓ遺伝子検出プライマーでＰＣＲ及びシーケンシング検証を行い、陽性クローンを得るステップ、及び、
（３） Ｓタンパク質酵母組換え菌株の構築：組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ、ホモロジーアームＵＲＲｓ、スクリーニングタグＬｅｕコード配列を消化し、スプライシングし、Ｓ遺伝子配列を含む完全な組換え遺伝子を得、サッカロミセス・セレビシエゲノムに形質転換し、栄養要求性プレートでのスクリーニング後に組換え菌株を得、検出プライマーで遺伝子レベル検出を行い、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫蛍光法でタンパク質発現レベル検証を行うステップ
を含むことを特徴とする、請求項５に記載の新型コロナウイルスのＳタンパク質組換え酵母の調製方法。
【請求項7】
抗新型コロナウイルス薬の調製における新型コロナウイルスのＳタンパク質の組換え酵母の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物遺伝子工学の技術分野に属し、新型コロナウイルス感染症のＳタンパク質を発現する経口組換え酵母及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
新型コロナウイルス感染症（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）は、新型コロナウイルス （Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の感染による急性呼吸器感染症である。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、プラス１本鎖ＲＮＡウイルスであり、ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）コロナなウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）オルトコロナウイルス亜科（Ｏｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）に分類され、ＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＭＥＲＳ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と同じβコロナウイルスに属している。ゲノムは、２９，９０３ ｂｐであり、スパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅｎｖｅｌｏｐ、Ｅ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ）、膜タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍ）などを含む主要な構造タンパク質をコードしている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＭＥＲＳ－ＣｏＶでは、スパイクタンパク質Ｓが異なる受容体結合ドメイン（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ、ＲＢＤｓ）を通じて宿主細胞と結合する。ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質は、宿主細胞の宿主細胞のジペプチジルペプチダーゼIV（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ４，ＤＰＰ－４，ａｌｓｏ ｋｎｏｗｎ ａｓ ＣＤ２６）と結合し［１］、ＳＡＲＳ－ＣｏＶがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と一致し、細胞表面のアンギオテンシン変換酵素２（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２， ＡＣＥ２）はＳタンパク質ＲＢＤの結合部位［２， ３］である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ領域、主にＣ末端３１８－５０７ａａ［４］に違いがあり、両者は完全に防御するわけではないことが研究により示されているため特異性の抗新型コロナウイルス剤を開発する必要がある。
【0004】
より成熟した異種タンパク質発現系には、酵母細胞、原核細胞発現系、及びバキュロウイルス昆虫細胞発現系が含まれる。後者の２つと比較して、酵母細胞は成熟な翻訳後修飾能、短い培養周期、安全性、利便性、生産コストが低いという利点を有する［５］。酵母表面ディスプレイ技術（Ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ、ＹＳＤ）を利用して外来タンパク質を酵母細胞表面に提示すると、経口抗ウイルス剤を調製できる。同時に、酵母の細胞壁多糖類は体の免疫システムに対し調節作用があり、ウイルスに抵抗し、免疫機能を高め、免疫器官の発達を促進することができるため、酵母の経口製剤の開発は良好な応用の見通しを持っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の第１の目的の１つは、特に経口製剤の開発に用いられ、新型コロナウイルススパイクタンパク質Ｓの表面提示組換え酵母及びその応用を提供することである。
【0006】
本発明の第２の目的は、経口組換え酵母の調製方法を提供することである。
【0007】
本発明の第３の目的は、経口組換え酵母の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の目的は、次のような技術的手段によって達成される。
【0009】
新型コロナウイルス感染症のＳタンパク質を発現する経口組換え酵母ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）であって、Ｓタンパク質の１６番目から１０３５番目までのアミノ酸を含む。
【0010】
新型コロナウイルスのＳタンパク質の切断体であって、３００番目から１０００番目までのアミノ酸が好ましく、配列の特徴は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で、３３０番目から５２１番目までのＲＢＤドメイン及び８１６番目から８３３番目までのＦＰ融合ペプチドを含む。
【0011】
前記タンパク質の切断体を発現する遺伝子は、スパイクプロテインＳの９９１番目から１５６３番目までの塩基であるＲＢＤドメイン及び２４４９番目から２４９９番目までの塩基であるＦＰドメインを含み、塩基配列はＳＥＱＩＤ Ｎｏ．２である。
【0012】
前記組換え酵母のプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを構築し、配列の特徴は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３であり、請求項３に記載の遺伝子断片及びＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターからなる。
【0013】
新型コロナウイルスのＳタンパク質組換え酵母の調製方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＳタンパク質切断体の完全転写ユニットＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを相同組換えにより酵母ゲノムに組み込み、Ａｇａ１－Ａｇａ２表面提示系を利用してＳタンパク質を酵母細胞表面に提示し、Ｓタンパク質表面提示型の組換え酵母菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を得、得られた菌株を用いて経口組換え酵母を調製する。
【0014】
具体的には、次のステップを含み、
（１） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス遺伝子配列ＮＣ＿０４５５１２．２を参照し、Ｓ遺伝子を合成し、配列の特徴はＳＥＱ Ｎｏ．２であり、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドをテンプレートとして、プライマーを設計して酵母ベクター接続用のＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅するステップ、
（２） Ａｇａ２遺伝子とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）とのタンデム：ＢａｍＨＩシングル酵素ダイジェストを通じてＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターを線形化し、Ｓ遺伝子断片をシームレスクローニングにより表面ディスプレイ発現ベクターＧＰＤ－ＰＯＴ－ＴＵに接続し、組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵが得られ、配列の特徴はＳＥＱＮｏ．３で、組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換し、Ｓ遺伝子検出プライマーでＰＣＲ及びシーケンシング検証を行い、陽性クローンを得るステップ、及び
（３） Ｓタンパク質酵母組換え菌株の構築：組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ、ホモロジーアームＵＲＲｓ、スクリーニングタグＬｅｕコード配列を消化し、スプライシングし、Ｓ遺伝子配列を含む完全な組換え遺伝子を得、サッカロミセス・セレビシエゲノムに形質転換し、栄養要求性プレートでのスクリーニング後に組換え菌株を得、検出プライマーで遺伝子レベル検出を行い、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫蛍光法でタンパク質発現レベル検証を行うステップ。
（１） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス遺伝子配列ＮＣ＿０４５５１２．２を参照し、Ｓ遺伝子を合成し、配列の特徴はＳＥＱ Ｎｏ．２であり、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドをテンプレートとして、プライマーを設計して酵母ベクター接続用のＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅するステップ、
（２） Ａｇａ２遺伝子とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）とのタンデム：ＢａｍＨＩシングル酵素ダイジェストを通じてＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターを線形化し、Ｓ遺伝子断片をシームレスクローニングにより表面ディスプレイ発現ベクターＧＰＤ－ＰＯＴ－ＴＵに接続し、組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵが得られ、配列の特徴はＳＥＱＮｏ．３で、組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換し、Ｓ遺伝子検出プライマーでＰＣＲ及びシーケンシング検証を行い、陽性クローンを得るステップ、及び
（３） Ｓタンパク質酵母組換え菌株の構築：組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ、ホモロジーアームＵＲＲｓ、スクリーニングタグＬｅｕコード配列を消化し、スプライシングし、Ｓ遺伝子配列を含む完全な組換え遺伝子を得、サッカロミセス・セレビシエゲノムに形質転換し、栄養要求性プレートでのスクリーニング後に組換え菌株を得、検出プライマーで遺伝子レベル検出を行い、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫蛍光法でタンパク質発現レベル検証を行うステップ。
【0015】
抗新型コロナウイルス薬の調製における新型コロナウイルスのＳタンパク質の組換え酵母の応用。
【発明の効果】
【0016】
本発明は、新型コロナウイルスが宿主細胞のＡＣＥ２受容体と結合する際に侵入開始の引き金が引かれるスパイクタンパク質Ｓに基づいて、受容体結合領域及びウイルスの病原性に関連するＦＰドメインを含むＳタンパク質切断体の表面提示型経口組換え酵母製剤を製造した。経口経路を通じて体を守る免疫反応を刺激し、体の自然免疫系に対する酵母細胞壁多糖類の調節作用の助けを借りて、より効果的な免疫保護を発揮する。 新しいアデノウイルスワクチン、ｍＲＮＡワクチンと比較して、経口組換え酵母製剤のコストが低く、大規模なスケールアップ生産を実現でき、安全で信頼性が高く、良好な応用・開発の見通しがあり、新型コロナウイルスの免疫と感染の防止・制御のための選択肢を提供する。
【0017】
本発明に記載の新型コロナウイルスのＳタンパク質の経口組換え酵母製剤は、中国で初めて報告されたものであり、表面ディスプレイ菌株の構築及び製剤の調製には一定の革新性があり、ＣＯＶＩＤ－１９感染の防止・制御のために新しい構想と製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】新型コロナウイルスのＳタンパク質をコードする遺伝子の構造の模式図である。
【図2】Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子ＰＣＲ増幅結果を示す図である。
【図3】ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵプラスミドを大腸菌に形質転換した後の形質転換体の検出を示す図（レーン１～１０は、異なる大腸菌形質転換体コロニーのＰＣＲ検出結果を表し、ＣＫ＋はテンプレートとしてのＳ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子ＰＣＲ産物の増幅で、ＣＫ－はｄｄＨ２Ｏコントロールである。）である。
【図4】ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵの完全転写ユニットのスプライシング概略図である。
【図5】酵母の形質転換後ＳＤ－ｌｅｕ培地でのＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ生育状況である。
【図6】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）組換え酵母の遺伝子型検証を示す図（それぞれ大腸菌の２号及び３号形質転換体に対応して酵母形質転換を行った後、遺伝子型を検証した。レーン１－６は、６つの異なる酵母形質転換体、ＣＫ＋はテンプレートとしてのプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵのＰＣＲ増幅、ＣＫ－はテンプレートとしてのｄｄＨ２Ｏテンプレートの陰性コントロールである。）である。
【図7】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）酵母菌株のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検証（Ｓタンパク質切断体がＨｉｓ抗体によって検出された後、２つのバンドが現れた。分子量の大きいものはグリコシル化された修飾Ｓタンパク質切断体、分子量の小さいものはタンパク質消化後の産物であり、レーン３－１、３－４及び３－６は３株の異なる酵母形質転換体に対応する。）である。
【図8】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）組換え酵母中Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）タンパク質の免疫蛍光法による観察図（ＳＴ１８１４Ｇ空菌株をコントロールとした）である。
【図9a】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）組換え酵母の生育曲線及びタンパク質発現傾向との関係を示す図（菌体の生育曲線で、ＳＴ１８１４Ｇをコントロールとし、タンパク質を発現する株の生育傾向が対照群と同じである）である。
【図9b】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）組換え酵母の生育曲線及びタンパク質発現傾向との関係を示す図（不異なる培養時点でのタンパク質発現状況の分析であり、レーン１～５はそれぞれ培養１ｄ～培養５ｄを表す）である。
【図10】酵母組換え菌を経口投与した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中特異的ＩｇＡ及びＩｇＧの検出（Ａ：ＥＬＩＳＡ法で検出した非経口群（Ｂｌａｎｋ）、オリジナルブランク酵母（Ｈｏｓｔ）の経口投与及び組換え酵母（ＦＰ）の経口投与後の血清中ＩｇＧの状況、Ｂ：ＥＬＩＳＡ法で非経口群（Ｂｌａｎｋ）、オリジナルブランク酵母（Ｈｏｓｔ）の経口投与及び組換え酵母（ＦＰ）の経口投与後のＩｇＡの状況。）である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、実施例を参照しつつ本発明をさらに説明し、その中の内容は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例内に記載の試薬は、特記しない限りすべて市販の試薬である。
【実施例1】
【0020】
（ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵベクターの構築）
（１）Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子の増幅
Ｓタンパク質をコードする遺伝子は、Ｓ１サブユニットとＳ２サブユニットの２つの部分からなる。Ｓ１サブユニットには、宿主細胞ＡＣＥ２受容体のＰＤドメイン（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ）に結合できるＲＢＤドメインが含まれ、Ｓ２サブユニットにはウイルスが宿主細胞膜に接近して融合するのを助ける融合ペプチドＦＰ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）配列が含まれ、類似の構造はＳＡＲＳ－ＣｏＶにも存在する［８， ９］。Ｓ遺伝子配列構造（図１）に基づいて、プライマー、ＣｏＶ－Ｓ－Ｆ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４：ＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＴ）及びＣｏＶ－Ｓ－Ｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５：ｇａａｔｔｃｃａｃｃａｃａｃｔｇｇａｔｃｃＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＣＣＴＡＴ）を設計並びに合成し、報告されているウイルスゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＭＴ４０７６５８．１）に従って、Ｓタンパク質の遺伝子断片人工合成し、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドを構築し、該プラスミドをテンプレートとし、ＲＢＤとＦＰドメインのＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅した。ＰＣＲ増幅システムとしては、
ＰＣＲ産物のサイズは、２１０６ｂｐである。
（１）Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子の増幅
Ｓタンパク質をコードする遺伝子は、Ｓ１サブユニットとＳ２サブユニットの２つの部分からなる。Ｓ１サブユニットには、宿主細胞ＡＣＥ２受容体のＰＤドメイン（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ）に結合できるＲＢＤドメインが含まれ、Ｓ２サブユニットにはウイルスが宿主細胞膜に接近して融合するのを助ける融合ペプチドＦＰ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）配列が含まれ、類似の構造はＳＡＲＳ－ＣｏＶにも存在する［８， ９］。Ｓ遺伝子配列構造（図１）に基づいて、プライマー、ＣｏＶ－Ｓ－Ｆ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４：ＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＴ）及びＣｏＶ－Ｓ－Ｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５：ｇａａｔｔｃｃａｃｃａｃａｃｔｇｇａｔｃｃＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＣＣＴＡＴ）を設計並びに合成し、報告されているウイルスゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＭＴ４０７６５８．１）に従って、Ｓタンパク質の遺伝子断片人工合成し、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドを構築し、該プラスミドをテンプレートとし、ＲＢＤとＦＰドメインのＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅した。ＰＣＲ増幅システムとしては、
【0021】
ＰＣＲの結果を図２に示し、一番右側のレーンは、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子の増幅結果である。
【0022】
（２）ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵベクターの構築
Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子を実験室で構築されたＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターに接続する［７］。ＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターをＢａｍＨＩ消化によって線性化した後、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子に接続し、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子のＮ末端をＡｇａ２に接続し、タンデムに融合発現し、遺伝子Ｃ末端にベクター上のＨｉｓタグがある。シームレスクローニングキット（Ｃ１１２－０１，Ｖａｚｙｍｅ）を利用してライゲーション産物を得、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。大腸菌形質転換体をＡｍｐ耐性プレートでスクリーニングし、Ｓ遺伝子検出プライマー（Ｓ－Ｆ３３１：ａａｔａｔｔａｃａａａｃｔｔｇｔｇｃｃｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）及びＳ－Ｒ５２４：ａａｃａｇｔｔｇｃｔｇｇｔｇｃａｔｇｔａｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７））でＰＣＲ検証及びシーケンシングを行なった。
Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子を実験室で構築されたＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターに接続する［７］。ＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターをＢａｍＨＩ消化によって線性化した後、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子に接続し、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子のＮ末端をＡｇａ２に接続し、タンデムに融合発現し、遺伝子Ｃ末端にベクター上のＨｉｓタグがある。シームレスクローニングキット（Ｃ１１２－０１，Ｖａｚｙｍｅ）を利用してライゲーション産物を得、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。大腸菌形質転換体をＡｍｐ耐性プレートでスクリーニングし、Ｓ遺伝子検出プライマー（Ｓ－Ｆ３３１：ａａｔａｔｔａｃａａａｃｔｔｇｔｇｃｃｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）及びＳ－Ｒ５２４：ａａｃａｇｔｔｇｃｔｇｇｔｇｃａｔｇｔａｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７））でＰＣＲ検証及びシーケンシングを行なった。
【0023】
結果を図３に示す。ＰＣＲ増幅産物のサイズは、５７９ｂｐで、陽性の形質転換体はＮｏ．１～８と９で、そのうちの２番と３番を選んでシーケンシングし、予想される結果と一致し、ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵプラスミドの構築に成功したことを示す。
【実施例2】
【0024】
（新型コロナウイルス酵母組換え菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）の構築及び検出）
（１）酵母形質転換断片の構築
ベクターＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵをＢｓａＩで消化し、同時にホモロジーアームプラスミド（ＵＲＲ１とＵＲＲ２）、及び選択マーカープラスミド（ＬＥＵ）をＢｓｍＢ Ｉで消化した。Ｄａｉ研究群の実験手順［６］を参照して、ＵＲＲｓホモロジーアーム、ＬＥＵ選択マーカー、ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ転写ユニットを特異なプレフィックスとサフィックス配列に従ってスプライシングし、Ｔ４リガーゼ１６℃一晩ライゲーションした後、スプライシング産物（図４）を酵母の形質転換に使用した。
（１）酵母形質転換断片の構築
ベクターＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵをＢｓａＩで消化し、同時にホモロジーアームプラスミド（ＵＲＲ１とＵＲＲ２）、及び選択マーカープラスミド（ＬＥＵ）をＢｓｍＢ Ｉで消化した。Ｄａｉ研究群の実験手順［６］を参照して、ＵＲＲｓホモロジーアーム、ＬＥＵ選択マーカー、ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ転写ユニットを特異なプレフィックスとサフィックス配列に従ってスプライシングし、Ｔ４リガーゼ１６℃一晩ライゲーションした後、スプライシング産物（図４）を酵母の形質転換に使用した。
【0025】
（２）ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）組換えサッカロミセス・セレビシエ菌株の構築
１）菌株の活性化：ＳＴ１８１４Ｇのシングルコロニーを採取し、３ ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した菌液を１：５０の比率で５ｍＬの新鮮なＹＰＤ培地に移し、初期ＯＤが０．１～０．２になるようにし、３０℃、２２０ｒｐｍでＯＤ６００が０．５～０．８になるまで培養した。２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５ｍＬの菌液の菌体を収集し、１ｍＬの滅菌水で細胞を洗浄し、上清を捨てた。
１）菌株の活性化：ＳＴ１８１４Ｇのシングルコロニーを採取し、３ ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した菌液を１：５０の比率で５ｍＬの新鮮なＹＰＤ培地に移し、初期ＯＤが０．１～０．２になるようにし、３０℃、２２０ｒｐｍでＯＤ６００が０．５～０．８になるまで培養した。２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５ｍＬの菌液の菌体を収集し、１ｍＬの滅菌水で細胞を洗浄し、上清を捨てた。
【0026】
２）酵母の形質転換：遠心分離した菌体ペレットに０．１Ｍ酢酸リチウムを１００μＬ加えて細胞を再懸濁し、１２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離し、上清を捨てた。０．１Ｍ酢酸リチウムを５０μＬ加えて細胞を再懸濁し、１２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離し、菌体を収集する。その後、遠心管に２４０μＬの５０％ＰＥＧ４０００、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１００μｇのサケ精子ＤＮＡ、２μｇの断片されたＤＮＡを加え、完全に混合するまで激しく振った。３０℃ ２００ｒｐｍで３０分間、４２℃で２５分間、６０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離して菌体を収集し、形質転換液を除去し、１ｍＬのＹＰＤ液体培地を加え、３０℃で２時間インキュベートし、２５００ ｒｐｍで１５分間遠心分離して菌体を収集し、５０μＬの脱イオン水で細胞を再懸濁し、できるだけ穏やかに混合し、菌体をＳＤ－ｌｅｕ固体培地の表面に広げ、３０℃のインキュベーターで典型的なコロニーが形成されるまで ２～３日間培養した。シングルコロニーを採取し、ＳＤ－ｌｅｕプレートにストリークして精製し、同時に３ｍＬ ＹＰＤ液液体培地に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで一晩培養して、遺伝子型検証に使用した。
【0027】
３）ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の遺伝子型検証
ＳＤ－ｌｅｕ培地で生育した酵母を選択し、そのゲノムをＰＣＲ用に抽出して、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子がゲノムにうまく組み込まれているかどうかを検証した。酵母ゲノムの抽出方法は、文献を参照して行った［１０］。１００μＬの培養後の菌液を取り、６０００ｒｐｍで１ 分間遠心分離して上清を捨て、１００μＬ溶解液（２００ｍＭ ＬｉＯＡｃ，１％ ＳＤＳ）で細胞を再懸濁し、７０℃で５分間インキュベートし、３００μＬの無水エタノールを加えて均一に混ぜ、１５０００ｇで３分間遠心分離して細胞破片を集めた。７０％エタノールで洗浄した後、５０～１００μＬのｄｄＨ２Ｏを加えてペレットを再懸濁した。１５０００ｇで１５秒間遠心分離した後、上清をゲノムテンプレートとして吸引してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅システムは、次の通りであり、
ＳＤ－ｌｅｕ培地で生育した酵母を選択し、そのゲノムをＰＣＲ用に抽出して、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子がゲノムにうまく組み込まれているかどうかを検証した。酵母ゲノムの抽出方法は、文献を参照して行った［１０］。１００μＬの培養後の菌液を取り、６０００ｒｐｍで１ 分間遠心分離して上清を捨て、１００μＬ溶解液（２００ｍＭ ＬｉＯＡｃ，１％ ＳＤＳ）で細胞を再懸濁し、７０℃で５分間インキュベートし、３００μＬの無水エタノールを加えて均一に混ぜ、１５０００ｇで３分間遠心分離して細胞破片を集めた。７０％エタノールで洗浄した後、５０～１００μＬのｄｄＨ２Ｏを加えてペレットを再懸濁した。１５０００ｇで１５秒間遠心分離した後、上清をゲノムテンプレートとして吸引してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅システムは、次の通りであり、
【0028】
ゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、同時にプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを陽性コントロール、ｄｄＨ２Ｏを陰性コントロールとした。
【0029】
実験結果を図５に示す。プラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵの２番と３番の大腸菌形質転換体は、消化され、ライゲーションされた後酵母細胞を形質転換し、どちらもＳＤ－ｌｅｕ選択培地で生育できるが、３番のプラスミドのみが遺伝子型の正しい組換え酵母菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を得ることができる。正しい組換え酵母番号は、Ｎｏ．１、Ｎｏ．４及びＮｏ．６である（図６）。
【0030】
４）ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の表現型検証
ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵベクターインサート断片Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＣ末端にはＨｉｓタグがあるため、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの抗Ｈｉｓ抗体を利用して標的遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）の発現状況を検出し、レーザー共焦点顕微鏡でタンパク質ディスプレイ状況を観察した。
ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵベクターインサート断片Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＣ末端にはＨｉｓタグがあるため、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの抗Ｈｉｓ抗体を利用して標的遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）の発現状況を検出し、レーザー共焦点顕微鏡でタンパク質ディスプレイ状況を観察した。
【0031】
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法：
４８時間ＹＰＤ培養液２ｍＬを収集し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離して菌体を収集し、酸洗浄済みガラスビーズ、６０μＬ ＰＥＢバッファーを加えて菌体を再懸濁し、ガラスビーズ法で壁を５回壊し、１５μＬ ５×ＳＤＳローディングバッファーを加え、沸騰水浴中で５分間加温し、４℃下、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、慎重に上清を吸引し、８μＬの上清を１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に使用する。
４８時間ＹＰＤ培養液２ｍＬを収集し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離して菌体を収集し、酸洗浄済みガラスビーズ、６０μＬ ＰＥＢバッファーを加えて菌体を再懸濁し、ガラスビーズ法で壁を５回壊し、１５μＬ ５×ＳＤＳローディングバッファーを加え、沸騰水浴中で５分間加温し、４℃下、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、慎重に上清を吸引し、８μＬの上清を１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に使用する。
【0032】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動後、タンパク質分離ゲルを湿式転写法により同サイズのＰＶＤＦ膜に転写し、膜転写条件は３００ｍＡ、１００分間とし、膜転写終了後、室温下で、５％スキムミルクでＰＶＤＦ膜１時間ブロックした。膜を５％のＢＳＡで１：２０００に希釈したマウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（ＨＴ５０１， Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）に完全に浸し、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を回収し、ＴＢＳＴバッファーでＰＶＤＦ膜を３回、毎回１０分間すすぎ、５％のＢＳＡで１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ標識二次抗体（ＬＫ２００３，Ｓｕｎｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ） を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴバッファーでＰＶＤＦ膜を３回すすぎ、暗所で化学発光発色基質（３４０７５， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＰＶＤＦ膜の前面に滴下し、Ｂｉｏ－ｒａｄ化学発光イメージャーに露出させて、タンパク質の発現を観察した。
【0033】
免疫蛍光法：
４８時間誘導されたＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌液５００μＬを収集し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を収集した。４８時間誘導した後のＳＴ１８１４Ｇを陰性コントロールとして取り、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。それぞれ２００μＬのＰＢＳＴで１：２０００に希釈した６＊Ｈｉｓ－Ｔａｇ抗体で菌体を再懸濁し、４℃で１時間回転結合させた。一次抗体を回収し、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、上述と同じように遠心分離して上清を捨て、２００μＬのＰＢＳＴで１：５０００に希釈した ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス二次抗体を加え、３７℃ の暗所で３０分間インキュベートし、二次抗体を回収し、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、上述と同じように遠心分離して上清を捨て、５０μＬのＰＢＳで菌体を再懸濁し、１０μＬの菌液を取り、きれいなガラススライドに滴下し、カバースリップで覆い、周囲にマニキュアを塗ってカバースリップを固定し、レーザー共焦点顕微鏡で観察した。
４８時間誘導されたＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌液５００μＬを収集し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を収集した。４８時間誘導した後のＳＴ１８１４Ｇを陰性コントロールとして取り、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。それぞれ２００μＬのＰＢＳＴで１：２０００に希釈した６＊Ｈｉｓ－Ｔａｇ抗体で菌体を再懸濁し、４℃で１時間回転結合させた。一次抗体を回収し、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、上述と同じように遠心分離して上清を捨て、２００μＬのＰＢＳＴで１：５０００に希釈した ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス二次抗体を加え、３７℃ の暗所で３０分間インキュベートし、二次抗体を回収し、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、上述と同じように遠心分離して上清を捨て、５０μＬのＰＢＳで菌体を再懸濁し、１０μＬの菌液を取り、きれいなガラススライドに滴下し、カバースリップで覆い、周囲にマニキュアを塗ってカバースリップを固定し、レーザー共焦点顕微鏡で観察した。
【0034】
結果を図７に示す。組換え酵母菌株Ｎｏ．１、Ｎｏ．４及びＮｏ．６は、いずれもＳタンパク質を発現することができる。Ｓタンパク質の理論上の分子量は、７８ＫＤａであるが、実際の観測結果は１３５ＫＤａ及び２３ ＫＤａ ２つのバンドである。Ｓタンパク質は複数のグリコシル化部位を持ち、分子量の増加はグリコシル化によるものである。分子量が小さいのは、おそらくプロテアーゼによる切断によるものと考えられる。免疫蛍光の結果を図８に示し、対照群ＳＴ１８１４Ｇでは蛍光がない（図８の上半分）。実験群ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）では明らかな緑色蛍光がある（図８の下半分）。Ｓタンパク質が正常に発現され、組換えサッカロミセス・セレビシエ細胞の表面に局在化されたことを示している。
【0035】
５）ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の生育及び蛋白発現のリズム
ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の４番形質転換体のシングルコロニーを採取し、２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２４時間間隔で２ｍＬのサンプルを採取して、ＯＤ６００測定ヲ行い、最初の時点での菌体量の最低値を基準として、菌体量を同じになるように調整し、異なる時点でのタンパク質サンプルを調整してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検を行った。
ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の４番形質転換体のシングルコロニーを採取し、２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２４時間間隔で２ｍＬのサンプルを採取して、ＯＤ６００測定ヲ行い、最初の時点での菌体量の最低値を基準として、菌体量を同じになるように調整し、異なる時点でのタンパク質サンプルを調整してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検を行った。
【0036】
結果を図９に示す。図９ａの生育曲線の分析から、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）タンパク質の切断体の発現は菌体の生育に影響を与えず、菌体の生育傾向が対照群と同じで、培養時間の延長とともに菌体量を徐々に増加した。同時に蛋白の発現量も培養時間の延長とともに増加し、発現量は培養５日目で最も高かった（図９ｂ）。
【実施例3】
【0037】
（新型コロナウイルスのＳタンパク質組換え酵母の調製）
ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４菌株を種としてシングルコロニーを採取し、２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した後、一晩培養した種液を採取し、１：１００で希釈して、新鮮な１ＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３～４日培養後、遠心分離により菌体を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、真空吸引・冷凍乾燥を経た後組換え菌株の乾燥粉末を得た。
ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４菌株を種としてシングルコロニーを採取し、２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した後、一晩培養した種液を採取し、１：１００で希釈して、新鮮な１ＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３～４日培養後、遠心分離により菌体を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、真空吸引・冷凍乾燥を経た後組換え菌株の乾燥粉末を得た。
【実施例4】
【0038】
（新型コロナウイルスのＳタンパク質酵母組換え菌株の応用）
ＳＰＦグレードのＢＡＬＢ／ｃマウスを３群に分け、各群に６匹ずつ、１日目、６日目、１１日目及び２３日目にそれぞれＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４酵母菌株を投与し、１０７ｃｆｕ／マウスは、ＳＴ１８１４Ｇブランク酵母菌株をコントロールとした。４回目の免疫後、眼血を採取してＩｇＧ及びＩｇＡ抗体レベルを検出した。
ＳＰＦグレードのＢＡＬＢ／ｃマウスを３群に分け、各群に６匹ずつ、１日目、６日目、１１日目及び２３日目にそれぞれＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４酵母菌株を投与し、１０７ｃｆｕ／マウスは、ＳＴ１８１４Ｇブランク酵母菌株をコントロールとした。４回目の免疫後、眼血を採取してＩｇＧ及びＩｇＡ抗体レベルを検出した。
【0039】
応用試験は、原核発現ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ Ｓタンパク質ＲＢＤドメインを設計し、タンパク質の精製、抗体調製、ＲＢＤタンパク質の精製、ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡ－ＨＲＰ酵素コンジュゲートを得、間接的にＥＬＩＳＡでＩｇＧ及びＩｇＡレベルを検出した。
【0040】
結果を図１０に示す。ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４組換え酵母組を投与した的血清中のＳタンパク質特異的ＩｇＧ（図１０Ａ）及びＩｇＡ（図１０Ｂ）のレベルが有意に上昇し、組換えサッカロミセス・セレビシエ菌株は体の体液性免疫と粘膜免疫を十分に刺激することができ、新型免疫保護製剤として、新型コロナウイルスの防控提供選擇。新型コロナウイルス感染の防止・制御のための選択肢を提供できることを示している。
【0041】
以上、本発明の内容について上記実施例を参照しつつ説明したが、本発明の実施形態は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によって限定される。限定された範囲内で行われた様々な変更又は潤色は、均等物による置換に属し、本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図10】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-12-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物遺伝子工学の技術分野に属し、新型コロナウイルス感染症のＳタンパク質を発現する経口ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
新型コロナウイルス感染症（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）は、新型コロナウイルス （Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の感染による急性呼吸器感染症である。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、プラス１本鎖ＲＮＡウイルスであり、ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）コロナなウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）オルトコロナウイルス亜科（Ｏｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）に分類され、ＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＭＥＲＳ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と同じβコロナウイルスに属している。ゲノムは、２９，９０３ ｂｐであり、スパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅｎｖｅｌｏｐ、Ｅ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ）、膜タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍ）などを含む主要な構造タンパク質をコードしている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＭＥＲＳ－ＣｏＶでは、スパイクタンパク質Ｓが異なる受容体結合ドメイン（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ、ＲＢＤｓ）を通じて宿主細胞と結合する。ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質は、宿主細胞の宿主細胞のジペプチジルペプチダーゼIV（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ４，ＤＰＰ－４，ａｌｓｏ ｋｎｏｗｎ ａｓ ＣＤ２６）と結合し［１］、ＳＡＲＳ－ＣｏＶがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と一致し、細胞表面のアンギオテンシン変換酵素２（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２， ＡＣＥ２）はＳタンパク質ＲＢＤの結合部位［２， ３］である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ領域、主にＣ末端３１８－５０７ａａ［４］に違いがあり、両者は完全に防御するわけではないことが研究により示されているため特異性の抗新型コロナウイルス剤を開発する必要がある。
【0004】
より成熟した異種タンパク質発現系には、酵母細胞、原核細胞発現系、及びバキュロウイルス昆虫細胞発現系が含まれる。後者の２つと比較して、酵母細胞は成熟な翻訳後修飾能、短い培養周期、安全性、利便性、生産コストが低いという利点を有する［５］。酵母表面ディスプレイ技術（Ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ、ＹＳＤ）を利用して外来タンパク質を酵母細胞表面に提示すると、経口抗ウイルス剤を調製できる。同時に、酵母の細胞壁多糖類は体の免疫システムに対し調節作用があり、ウイルスに抵抗し、免疫機能を高め、免疫器官の発達を促進することができるため、酵母の経口製剤の開発は良好な応用の見通しを持っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の第１の目的の１つは、特に経口製剤の開発に用いられ、新型コロナウイルススパイクタンパク質Ｓの表面提示ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン及びその応用を提供することである。
【0006】
本発明の第２の目的は、経口ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの調製方法を提供することである。
【0007】
本発明の第３の目的は、経口ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の目的は、次のような技術的手段によって達成される。
【0009】
新型コロナウイルス感染症のＳタンパク質を発現する経口ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）であって、Ｓタンパク質の１６番目から１０３５番目までのアミノ酸を含む。
【0010】
新型コロナウイルスのＳタンパク質の切断体であって、３００番目から１０００番目までのアミノ酸が好ましく、配列の特徴は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で、３３０番目から５２１番目までのＲＢＤドメイン及び８１６番目から８３３番目までのＦＰ融合ペプチドを含む。
【0011】
前記タンパク質の切断体を発現する遺伝子は、スパイクプロテインＳの９９１番目から１５６３番目までの塩基であるＲＢＤドメイン及び２４４９番目から２４９９番目までの塩基であるＦＰドメインを含み、塩基配列はＳＥＱＩＤ Ｎｏ．２である。
【0012】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンのプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを構築し、配列の特徴は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３であり、請求項３に記載の遺伝子断片及びＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターからなる。
【0013】
新型コロナウイルスのＳタンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの調製方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＳタンパク質切断体の完全転写ユニットＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを相同組換えにより酵母ゲノムに組み込み、Ａｇａ１－Ａｇａ２表面提示系を利用してＳタンパク質を酵母細胞表面に提示し、Ｓタンパク質表面提示型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を得、得られた菌株を用いて経口ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを調製する。
【0014】
具体的には、次のステップを含み、
（１） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス遺伝子配列ＮＣ＿０４５５１２．２を参照し、Ｓ遺伝子を合成し、配列の特徴はＳＥＱ Ｎｏ．２であり、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドをテンプレートとして、プライマーを設計して酵母ベクター接続用のＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅するステップ、
（２） Ａｇａ２遺伝子とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）とのタンデム：ＢａｍＨＩシングル酵素ダイジェストを通じてＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターを線形化し、Ｓ遺伝子断片をシームレスクローニングにより表面ディスプレイ発現ベクターＧＰＤ－ＰＯＴ－ＴＵに接続し、組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵが得られ、配列の特徴はＳＥＱＮｏ．３で、組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換し、Ｓ遺伝子検出プライマーでＰＣＲ及びシーケンシング検証を行い、陽性クローンを得るステップ、及び
（３） Ｓタンパク質酵母組換え菌株の構築：組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ、ホモロジーアームＵＲＲｓ、スクリーニングタグＬｅｕコード配列を消化し、スプライシングし、Ｓ遺伝子配列を含む完全な組換え遺伝子を得、サッカロミセス・セレビシエゲノムに形質転換し、栄養要求性プレートでのスクリーニング後に組換え菌株を得、検出プライマーで遺伝子レベル検出を行い、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫蛍光法でタンパク質発現レベル検証を行うステップ。
（１） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス遺伝子配列ＮＣ＿０４５５１２．２を参照し、Ｓ遺伝子を合成し、配列の特徴はＳＥＱ Ｎｏ．２であり、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドをテンプレートとして、プライマーを設計して酵母ベクター接続用のＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅するステップ、
（２） Ａｇａ２遺伝子とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）とのタンデム：ＢａｍＨＩシングル酵素ダイジェストを通じてＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターを線形化し、Ｓ遺伝子断片をシームレスクローニングにより表面ディスプレイ発現ベクターＧＰＤ－ＰＯＴ－ＴＵに接続し、組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵが得られ、配列の特徴はＳＥＱＮｏ．３で、組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換し、Ｓ遺伝子検出プライマーでＰＣＲ及びシーケンシング検証を行い、陽性クローンを得るステップ、及び
（３） Ｓタンパク質酵母組換え菌株の構築：組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ、ホモロジーアームＵＲＲｓ、スクリーニングタグＬｅｕコード配列を消化し、スプライシングし、Ｓ遺伝子配列を含む完全な組換え遺伝子を得、サッカロミセス・セレビシエゲノムに形質転換し、栄養要求性プレートでのスクリーニング後に組換え菌株を得、検出プライマーで遺伝子レベル検出を行い、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫蛍光法でタンパク質発現レベル検証を行うステップ。
【0015】
抗新型コロナウイルス薬の調製における新型コロナウイルスのＳタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの応用。
【発明の効果】
【0016】
本発明は、新型コロナウイルスが宿主細胞のＡＣＥ２受容体と結合する際に侵入開始の引き金が引かれるスパイクタンパク質Ｓに基づいて、受容体結合領域及びウイルスの病原性に関連するＦＰドメインを含むＳタンパク質切断体の表面提示型経口ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン製剤を製造した。経口経路を通じて体を守る免疫反応を刺激し、体の自然免疫系に対する酵母細胞壁多糖類の調節作用の助けを借りて、より効果的な免疫保護を発揮する。 新しいアデノウイルスワクチン、ｍＲＮＡワクチンと比較して、経口ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン製剤のコストが低く、大規模なスケールアップ生産を実現でき、安全で信頼性が高く、良好な応用・開発の見通しがあり、新型コロナウイルスの免疫と感染の防止・制御のための選択肢を提供する。
【0017】
本発明に記載の新型コロナウイルスのＳタンパク質の経口ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン製剤は、中国で初めて報告されたものであり、表面ディスプレイ菌株の構築及び製剤の調製には一定の革新性があり、ＣＯＶＩＤ－１９感染の防止・制御のために新しい構想と製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】新型コロナウイルスのＳタンパク質をコードする遺伝子の構造の模式図である。
【図2】Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子ＰＣＲ増幅結果を示す図である。
【図3】ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵプラスミドを大腸菌に形質転換した後の形質転換体の検出を示す図（レーン１～１０は、異なる大腸菌形質転換体コロニーのＰＣＲ検出結果を表し、ＣＫ＋はテンプレートとしてのＳ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子ＰＣＲ産物の増幅で、ＣＫ－はｄｄＨ２Ｏコントロールである。）である。
【図4】ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵの完全転写ユニットのスプライシング概略図である。
【図5】酵母の形質転換後ＳＤ－ｌｅｕ培地でのＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ生育状況である。
【図6】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの遺伝子型検証を示す図（それぞれ大腸菌の２号及び３号形質転換体に対応して酵母形質転換を行った後、遺伝子型を検証した。レーン１－６は、６つの異なる酵母形質転換体、ＣＫ＋はテンプレートとしてのプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵのＰＣＲ増幅、ＣＫ－はテンプレートとしてのｄｄＨ２Ｏテンプレートの陰性コントロールである。）である。
【図7】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）酵母菌株のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検証（Ｓタンパク質切断体がＨｉｓ抗体によって検出された後、２つのバンドが現れた。分子量の大きいものはグリコシル化された修飾Ｓタンパク質切断体、分子量の小さいものはタンパク質消化後の産物であり、レーン３－１、３－４及び３－６は３株の異なる酵母形質転換体に対応する。）である。
【図8】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン中Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）タンパク質の免疫蛍光法による観察図（ＳＴ１８１４Ｇ空菌株をコントロールとした）である。
【図9a】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの生育曲線及びタンパク質発現傾向との関係を示す図（菌体の生育曲線で、ＳＴ１８１４Ｇをコントロールとし、タンパク質を発現する株の生育傾向が対照群と同じである）である。
【図9b】ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの生育曲線及びタンパク質発現傾向との関係を示す図（不異なる培養時点でのタンパク質発現状況の分析であり、レーン１～５はそれぞれ培養１ｄ～培養５ｄを表す）である。
【図10】酵母組換え菌を経口投与した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中特異的ＩｇＡ及びＩｇＧの検出（Ａ：ＥＬＩＳＡ法で検出した非経口群（Ｂｌａｎｋ）、オリジナルブランク酵母（Ｈｏｓｔ）の経口投与及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（ＦＰ）の経口投与後の血清中ＩｇＧの状況、Ｂ：ＥＬＩＳＡ法で非経口群（Ｂｌａｎｋ）、オリジナルブランク酵母（Ｈｏｓｔ）の経口投与及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（ＦＰ）の経口投与後のＩｇＡの状況。）である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、実施例を参照しつつ本発明をさらに説明し、その中の内容は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例内に記載の試薬は、特記しない限りすべて市販の試薬である。
【実施例1】
【0020】
（ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵベクターの構築）
（１）Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子の増幅
Ｓタンパク質をコードする遺伝子は、Ｓ１サブユニットとＳ２サブユニットの２つの部分からなる。Ｓ１サブユニットには、宿主細胞ＡＣＥ２受容体のＰＤドメイン（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ）に結合できるＲＢＤドメインが含まれ、Ｓ２サブユニットにはウイルスが宿主細胞膜に接近して融合するのを助ける融合ペプチドＦＰ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）配列が含まれ、類似の構造はＳＡＲＳ－ＣｏＶにも存在する［８， ９］。Ｓ遺伝子配列構造（図１）に基づいて、プライマー、ＣｏＶ－Ｓ－Ｆ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４：ＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＴ）及びＣｏＶ－Ｓ－Ｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５：ｇａａｔｔｃｃａｃｃａｃａｃｔｇｇａｔｃｃＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＣＣＴＡＴ）を設計並びに合成し、報告されているウイルスゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＭＴ４０７６５８．１）に従って、Ｓタンパク質の遺伝子断片人工合成し、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドを構築し、該プラスミドをテンプレートとし、ＲＢＤとＦＰドメインのＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅した。ＰＣＲ増幅システムとしては、
ＰＣＲ産物のサイズは、２１０６ｂｐである。
（１）Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子の増幅
Ｓタンパク質をコードする遺伝子は、Ｓ１サブユニットとＳ２サブユニットの２つの部分からなる。Ｓ１サブユニットには、宿主細胞ＡＣＥ２受容体のＰＤドメイン（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ）に結合できるＲＢＤドメインが含まれ、Ｓ２サブユニットにはウイルスが宿主細胞膜に接近して融合するのを助ける融合ペプチドＦＰ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）配列が含まれ、類似の構造はＳＡＲＳ－ＣｏＶにも存在する［８， ９］。Ｓ遺伝子配列構造（図１）に基づいて、プライマー、ＣｏＶ－Ｓ－Ｆ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４：ＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＴ）及びＣｏＶ－Ｓ－Ｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５：ｇａａｔｔｃｃａｃｃａｃａｃｔｇｇａｔｃｃＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＡＣＣＴＡＴ）を設計並びに合成し、報告されているウイルスゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＭＴ４０７６５８．１）に従って、Ｓタンパク質の遺伝子断片人工合成し、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドを構築し、該プラスミドをテンプレートとし、ＲＢＤとＦＰドメインのＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅した。ＰＣＲ増幅システムとしては、
【0021】
ＰＣＲの結果を図２に示し、一番右側のレーンは、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子の増幅結果である。
【0022】
（２）ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵベクターの構築
Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子を実験室で構築されたＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターに接続する［７］。ＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターをＢａｍＨＩ消化によって線性化した後、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子に接続し、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子のＮ末端をＡｇａ２に接続し、タンデムに融合発現し、遺伝子Ｃ末端にベクター上のＨｉｓタグがある。シームレスクローニングキット（Ｃ１１２－０１，Ｖａｚｙｍｅ）を利用してライゲーション産物を得、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。大腸菌形質転換体をＡｍｐ耐性プレートでスクリーニングし、Ｓ遺伝子検出プライマー（Ｓ－Ｆ３３１：ａａｔａｔｔａｃａａａｃｔｔｇｔｇｃｃｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）及びＳ－Ｒ５２４：ａａｃａｇｔｔｇｃｔｇｇｔｇｃａｔｇｔａｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７））でＰＣＲ検証及びシーケンシングを行なった。
Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子を実験室で構築されたＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターに接続する［７］。ＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターをＢａｍＨＩ消化によって線性化した後、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子に接続し、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子のＮ末端をＡｇａ２に接続し、タンデムに融合発現し、遺伝子Ｃ末端にベクター上のＨｉｓタグがある。シームレスクローニングキット（Ｃ１１２－０１，Ｖａｚｙｍｅ）を利用してライゲーション産物を得、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。大腸菌形質転換体をＡｍｐ耐性プレートでスクリーニングし、Ｓ遺伝子検出プライマー（Ｓ－Ｆ３３１：ａａｔａｔｔａｃａａａｃｔｔｇｔｇｃｃｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）及びＳ－Ｒ５２４：ａａｃａｇｔｔｇｃｔｇｇｔｇｃａｔｇｔａｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７））でＰＣＲ検証及びシーケンシングを行なった。
【0023】
結果を図３に示す。ＰＣＲ増幅産物のサイズは、５７９ｂｐで、陽性の形質転換体はＮｏ．１～８と９で、そのうちの２番と３番を選んでシーケンシングし、予想される結果と一致し、ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵプラスミドの構築に成功したことを示す。
【実施例2】
【0024】
（新型コロナウイルス酵母組換え菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）の構築及び検出）
（１）酵母形質転換断片の構築
ベクターＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵをＢｓａＩで消化し、同時にホモロジーアームプラスミド（ＵＲＲ１とＵＲＲ２）、及び選択マーカープラスミド（ＬＥＵ）をＢｓｍＢ Ｉで消化した。Ｄａｉ研究群の実験手順［６］を参照して、ＵＲＲｓホモロジーアーム、ＬＥＵ選択マーカー、ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ転写ユニットを特異なプレフィックスとサフィックス配列に従ってスプライシングし、Ｔ４リガーゼ１６℃一晩ライゲーションした後、スプライシング産物（図４）を酵母の形質転換に使用した。
（１）酵母形質転換断片の構築
ベクターＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵをＢｓａＩで消化し、同時にホモロジーアームプラスミド（ＵＲＲ１とＵＲＲ２）、及び選択マーカープラスミド（ＬＥＵ）をＢｓｍＢ Ｉで消化した。Ｄａｉ研究群の実験手順［６］を参照して、ＵＲＲｓホモロジーアーム、ＬＥＵ選択マーカー、ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ転写ユニットを特異なプレフィックスとサフィックス配列に従ってスプライシングし、Ｔ４リガーゼ１６℃一晩ライゲーションした後、スプライシング産物（図４）を酵母の形質転換に使用した。
【0025】
（２）ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）組換えサッカロミセス・セレビシエ菌株の構築
１）菌株の活性化：ＳＴ１８１４Ｇのシングルコロニーを採取し、３ ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した菌液を１：５０の比率で５ｍＬの新鮮なＹＰＤ培地に移し、初期ＯＤが０．１～０．２になるようにし、３０℃、２２０ｒｐｍでＯＤ６００が０．５～０．８になるまで培養した。２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５ｍＬの菌液の菌体を収集し、１ｍＬの滅菌水で細胞を洗浄し、上清を捨てた。
１）菌株の活性化：ＳＴ１８１４Ｇのシングルコロニーを採取し、３ ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した菌液を１：５０の比率で５ｍＬの新鮮なＹＰＤ培地に移し、初期ＯＤが０．１～０．２になるようにし、３０℃、２２０ｒｐｍでＯＤ６００が０．５～０．８になるまで培養した。２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５ｍＬの菌液の菌体を収集し、１ｍＬの滅菌水で細胞を洗浄し、上清を捨てた。
【0026】
２）酵母の形質転換：遠心分離した菌体ペレットに０．１Ｍ酢酸リチウムを１００μＬ加えて細胞を再懸濁し、１２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離し、上清を捨てた。０．１Ｍ酢酸リチウムを５０μＬ加えて細胞を再懸濁し、１２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離し、菌体を収集する。その後、遠心管に２４０μＬの５０％ＰＥＧ４０００、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１００μｇのサケ精子ＤＮＡ、２μｇの断片されたＤＮＡを加え、完全に混合するまで激しく振った。３０℃ ２００ｒｐｍで３０分間、４２℃で２５分間、６０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離して菌体を収集し、形質転換液を除去し、１ｍＬのＹＰＤ液体培地を加え、３０℃で２時間インキュベートし、２５００ ｒｐｍで１５分間遠心分離して菌体を収集し、５０μＬの脱イオン水で細胞を再懸濁し、できるだけ穏やかに混合し、菌体をＳＤ－ｌｅｕ固体培地の表面に広げ、３０℃のインキュベーターで典型的なコロニーが形成されるまで ２～３日間培養した。シングルコロニーを採取し、ＳＤ－ｌｅｕプレートにストリークして精製し、同時に３ｍＬ ＹＰＤ液液体培地に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで一晩培養して、遺伝子型検証に使用した。
【0027】
３）ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の遺伝子型検証
ＳＤ－ｌｅｕ培地で生育した酵母を選択し、そのゲノムをＰＣＲ用に抽出して、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子がゲノムにうまく組み込まれているかどうかを検証した。酵母ゲノムの抽出方法は、文献を参照して行った［１０］。１００μＬの培養後の菌液を取り、６０００ｒｐｍで１ 分間遠心分離して上清を捨て、１００μＬ溶解液（２００ｍＭ ＬｉＯＡｃ，１％ ＳＤＳ）で細胞を再懸濁し、７０℃で５分間インキュベートし、３００μＬの無水エタノールを加えて均一に混ぜ、１５０００ｇで３分間遠心分離して細胞破片を集めた。７０％エタノールで洗浄した後、５０～１００μＬのｄｄＨ２Ｏを加えてペレットを再懸濁した。１５０００ｇで１５秒間遠心分離した後、上清をゲノムテンプレートとして吸引してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅システムは、次の通りであり、
ＳＤ－ｌｅｕ培地で生育した酵母を選択し、そのゲノムをＰＣＲ用に抽出して、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）遺伝子がゲノムにうまく組み込まれているかどうかを検証した。酵母ゲノムの抽出方法は、文献を参照して行った［１０］。１００μＬの培養後の菌液を取り、６０００ｒｐｍで１ 分間遠心分離して上清を捨て、１００μＬ溶解液（２００ｍＭ ＬｉＯＡｃ，１％ ＳＤＳ）で細胞を再懸濁し、７０℃で５分間インキュベートし、３００μＬの無水エタノールを加えて均一に混ぜ、１５０００ｇで３分間遠心分離して細胞破片を集めた。７０％エタノールで洗浄した後、５０～１００μＬのｄｄＨ２Ｏを加えてペレットを再懸濁した。１５０００ｇで１５秒間遠心分離した後、上清をゲノムテンプレートとして吸引してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅システムは、次の通りであり、
【0028】
ゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、同時にプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを陽性コントロール、ｄｄＨ２Ｏを陰性コントロールとした。
【0029】
実験結果を図５に示す。プラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵの２番と３番の大腸菌形質転換体は、消化され、ライゲーションされた後酵母細胞を形質転換し、どちらもＳＤ－ｌｅｕ選択培地で生育できるが、３番のプラスミドのみが遺伝子型の正しいＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を得ることができる。正しいＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン番号は、Ｎｏ．１、Ｎｏ．４及びＮｏ．６である（図６）。
【0030】
４）ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の表現型検証
ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵベクターインサート断片Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＣ末端にはＨｉｓタグがあるため、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの抗Ｈｉｓ抗体を利用して標的遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）の発現状況を検出し、レーザー共焦点顕微鏡でタンパク質ディスプレイ状況を観察した。
ＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵベクターインサート断片Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＣ末端にはＨｉｓタグがあるため、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの抗Ｈｉｓ抗体を利用して標的遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）の発現状況を検出し、レーザー共焦点顕微鏡でタンパク質ディスプレイ状況を観察した。
【0031】
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法：
４８時間ＹＰＤ培養液２ｍＬを収集し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離して菌体を収集し、酸洗浄済みガラスビーズ、６０μＬ ＰＥＢバッファーを加えて菌体を再懸濁し、ガラスビーズ法で壁を５回壊し、１５μＬ ５×ＳＤＳローディングバッファーを加え、沸騰水浴中で５分間加温し、４℃下、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、慎重に上清を吸引し、８μＬの上清を１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に使用する。
４８時間ＹＰＤ培養液２ｍＬを収集し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離して菌体を収集し、酸洗浄済みガラスビーズ、６０μＬ ＰＥＢバッファーを加えて菌体を再懸濁し、ガラスビーズ法で壁を５回壊し、１５μＬ ５×ＳＤＳローディングバッファーを加え、沸騰水浴中で５分間加温し、４℃下、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、慎重に上清を吸引し、８μＬの上清を１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に使用する。
【0032】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動後、タンパク質分離ゲルを湿式転写法により同サイズのＰＶＤＦ膜に転写し、膜転写条件は３００ｍＡ、１００分間とし、膜転写終了後、室温下で、５％スキムミルクでＰＶＤＦ膜１時間ブロックした。膜を５％のＢＳＡで１：２０００に希釈したマウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（ＨＴ５０１， Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）に完全に浸し、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を回収し、ＴＢＳＴバッファーでＰＶＤＦ膜を３回、毎回１０分間すすぎ、５％のＢＳＡで１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ標識二次抗体（ＬＫ２００３，Ｓｕｎｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ） を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴバッファーでＰＶＤＦ膜を３回すすぎ、暗所で化学発光発色基質（３４０７５， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＰＶＤＦ膜の前面に滴下し、Ｂｉｏ－ｒａｄ化学発光イメージャーに露出させて、タンパク質の発現を観察した。
【0033】
免疫蛍光法：
４８時間誘導されたＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌液５００μＬを収集し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を収集した。４８時間誘導した後のＳＴ１８１４Ｇを陰性コントロールとして取り、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。それぞれ２００μＬのＰＢＳＴで１：２０００に希釈した６＊Ｈｉｓ－Ｔａｇ抗体で菌体を再懸濁し、４℃で１時間回転結合させた。一次抗体を回収し、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、上述と同じように遠心分離して上清を捨て、２００μＬのＰＢＳＴで１：５０００に希釈した ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス二次抗体を加え、３７℃ の暗所で３０分間インキュベートし、二次抗体を回収し、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、上述と同じように遠心分離して上清を捨て、５０μＬのＰＢＳで菌体を再懸濁し、１０μＬの菌液を取り、きれいなガラススライドに滴下し、カバースリップで覆い、周囲にマニキュアを塗ってカバースリップを固定し、レーザー共焦点顕微鏡で観察した。
４８時間誘導されたＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌液５００μＬを収集し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を収集した。４８時間誘導した後のＳＴ１８１４Ｇを陰性コントロールとして取り、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てた。それぞれ２００μＬのＰＢＳＴで１：２０００に希釈した６＊Ｈｉｓ－Ｔａｇ抗体で菌体を再懸濁し、４℃で１時間回転結合させた。一次抗体を回収し、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、上述と同じように遠心分離して上清を捨て、２００μＬのＰＢＳＴで１：５０００に希釈した ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス二次抗体を加え、３７℃ の暗所で３０分間インキュベートし、二次抗体を回収し、５００μＬのＰＢＳＴで菌体を３回洗浄し、上述と同じように遠心分離して上清を捨て、５０μＬのＰＢＳで菌体を再懸濁し、１０μＬの菌液を取り、きれいなガラススライドに滴下し、カバースリップで覆い、周囲にマニキュアを塗ってカバースリップを固定し、レーザー共焦点顕微鏡で観察した。
【0034】
結果を図７に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン菌株Ｎｏ．１、Ｎｏ．４及びＮｏ．６は、いずれもＳタンパク質を発現することができる。Ｓタンパク質の理論上の分子量は、７８ＫＤａであるが、実際の観測結果は１３５ＫＤａ及び２３ ＫＤａ ２つのバンドである。Ｓタンパク質は複数のグリコシル化部位を持ち、分子量の増加はグリコシル化によるものである。分子量が小さいのは、おそらくプロテアーゼによる切断によるものと考えられる。免疫蛍光の結果を図８に示し、対照群ＳＴ１８１４Ｇでは蛍光がない（図８の上半分）。実験群ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）では明らかな緑色蛍光がある（図８の下半分）。Ｓタンパク質が正常に発現され、組換えサッカロミセス・セレビシエ細胞の表面に局在化されたことを示している。
【0035】
５）ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の生育及び蛋白発現のリズム
ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の４番形質転換体のシングルコロニーを採取し、２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２４時間間隔で２ｍＬのサンプルを採取して、ＯＤ６００測定ヲ行い、最初の時点での菌体量の最低値を基準として、菌体量を同じになるように調整し、異なる時点でのタンパク質サンプルを調整してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検を行った。
ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）菌株の４番形質転換体のシングルコロニーを採取し、２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、２４時間間隔で２ｍＬのサンプルを採取して、ＯＤ６００測定ヲ行い、最初の時点での菌体量の最低値を基準として、菌体量を同じになるように調整し、異なる時点でのタンパク質サンプルを調整してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検を行った。
【0036】
結果を図９に示す。図９ａの生育曲線の分析から、Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）タンパク質の切断体の発現は菌体の生育に影響を与えず、菌体の生育傾向が対照群と同じで、培養時間の延長とともに菌体量を徐々に増加した。同時に蛋白の発現量も培養時間の延長とともに増加し、発現量は培養５日目で最も高かった（図９ｂ）。
【実施例3】
【0037】
（新型コロナウイルスのＳタンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの調製）
ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４菌株を種としてシングルコロニーを採取し、２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した後、一晩培養した種液を採取し、１：１００で希釈して、新鮮な１ＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３～４日培養後、遠心分離により菌体を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、真空吸引・冷凍乾燥を経た後組換え菌株の乾燥粉末を得た。
ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４菌株を種としてシングルコロニーを採取し、２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した後、一晩培養した種液を採取し、１：１００で希釈して、新鮮な１ＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３～４日培養後、遠心分離により菌体を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、真空吸引・冷凍乾燥を経た後組換え菌株の乾燥粉末を得た。
【実施例4】
【0038】
（新型コロナウイルスのＳタンパク質酵母組換え菌株の応用）
ＳＰＦグレードのＢＡＬＢ／ｃマウスを３群に分け、各群に６匹ずつ、１日目、６日目、１１日目及び２３日目にそれぞれＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４酵母菌株を投与し、１０７ｃｆｕ／マウスは、ＳＴ１８１４Ｇブランク酵母菌株をコントロールとした。４回目の免疫後、眼血を採取してＩｇＧ及びＩｇＡ抗体レベルを検出した。
ＳＰＦグレードのＢＡＬＢ／ｃマウスを３群に分け、各群に６匹ずつ、１日目、６日目、１１日目及び２３日目にそれぞれＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４酵母菌株を投与し、１０７ｃｆｕ／マウスは、ＳＴ１８１４Ｇブランク酵母菌株をコントロールとした。４回目の免疫後、眼血を採取してＩｇＧ及びＩｇＡ抗体レベルを検出した。
【0039】
応用試験は、原核発現ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ Ｓタンパク質ＲＢＤドメインを設計し、タンパク質の精製、抗体調製、ＲＢＤタンパク質の精製、ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡ－ＨＲＰ酵素コンジュゲートを得、間接的にＥＬＩＳＡでＩｇＧ及びＩｇＡレベルを検出した。
【0040】
結果を図１０に示す。ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）のＮｏ．４ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組を投与した的血清中のＳタンパク質特異的ＩｇＧ（図１０Ａ）及びＩｇＡ（図１０Ｂ）のレベルが有意に上昇し、組換えサッカロミセス・セレビシエ菌株は体の体液性免疫と粘膜免疫を十分に刺激することができ、新型免疫保護製剤として、新型コロナウイルスの防控提供選擇。新型コロナウイルス感染の防止・制御のための選択肢を提供できることを示している。
【0041】
以上、本発明の内容について上記実施例を参照しつつ説明したが、本発明の実施形態は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によって限定される。限定された範囲内で行われた様々な変更又は潤色は、均等物による置換に属し、本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
、Ｓタンパク質の１６番目から１０３５番目までのアミノ酸を含む新型コロナウイルス感染症のＳタンパク質を発現する経口ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）。
【請求項2】
３００番目から１０００番目までのアミノ酸であることが好ましく、配列の特徴は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で、３３０番目から５２１番目までのＲＢＤドメイン及び８１６番目から８３３番目までのＦＰ融合ペプチドを含む新型コロナウイルスのＳタンパク質の切断体。
【請求項3】
請求項２に記載のタンパク質の切断体を発現する遺伝子であって、スパイクプロテインＳの９９１番目から１５６３番目までの塩基であるＲＢＤドメイン及び２４４９番目から２４９９番目までの塩基であるＦＰドメインを含み、塩基配列はＳＥＱＩＤ Ｎｏ．２であることを特徴とする、タンパク質の切断体を発現する遺伝子。
【請求項4】
請求項１に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンのプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを構築し、配列の特徴は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３であり、請求項３に記載の遺伝子断片及びＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターからなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンのプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ。
【請求項5】
新型コロナウイルスのＳタンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの調製方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＳタンパク質切断体の完全転写ユニットＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵを相同組換えにより酵母ゲノムに組み込み、Ａｇａ１－Ａｇａ２表面提示系を利用してＳタンパク質を酵母細胞表面に提示し、Ｓタンパク質表面提示型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン菌株ＳＴ１８１４Ｇ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を得、得られた菌株を用いて経口ワクチンを調製することを特徴とする、新型コロナウイルスのＳタンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの調製方法。
【請求項6】
具体的には、次のステップ：（１） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子のＰＣＲ増幅：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス遺伝子配列ＮＣ＿０４５５１２．２を参照し、Ｓ遺伝子を合成し、配列の特徴はＳＥＱ Ｎｏ．２であり、ｐｃＤＮＡ３．１－ＣｏＶ－Ｓプラスミドをテンプレートとして、プライマーを設計して酵母ベクター接続用のＳタンパク質をコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）を増幅するステップ、
（２） Ａｇａ２遺伝子とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質Ｓをコードする遺伝子Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）とのタンデム：ＢａｍＨＩシングル酵素ダイジェストを通じてＰＯＴ－ＧＰＤ－ＴＵベクターを線形化し、Ｓ遺伝子断片をシームレスクローニングにより表面ディスプレイ発現ベクターＧＰＤ－ＰＯＴ－ＴＵに接続し、組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵが得られ、配列の特徴はＳＥＱＮｏ．３で、組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換し、Ｓ遺伝子検出プライマーでＰＣＲ及びシーケンシング検証を行い、陽性クローンを得るステップ、及び、
（３） Ｓタンパク質酵母組換え菌株の構築：組換えプラスミドＧＰＤ－Ｓ（ＲＢＤ－ＦＰ）－ＴＵ、ホモロジーアームＵＲＲｓ、スクリーニングタグＬｅｕコード配列を消化し、スプライシングし、Ｓ遺伝子配列を含む完全な組換え遺伝子を得、サッカロミセス・セレビシエゲノムに形質転換し、栄養要求性プレートでのスクリーニング後に組換え菌株を得、検出プライマーで遺伝子レベル検出を行い、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫蛍光法でタンパク質発現レベル検証を行うステップ
を含むことを特徴とする、請求項５に記載の新型コロナウイルスのＳタンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの調製方法。
【請求項7】
抗新型コロナウイルス薬の調製における新型コロナウイルスのＳタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの応用。【国際調査報告】