(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-10
(54)【発明の名称】ＰＳＤ－９５の環状ペプチド阻害剤およびそれらの用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230703BHJP
C07K 4/00 20060101ALI20230703BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230703BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230703BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230703BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230703BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230703BHJP
A61K 38/12 20060101ALI20230703BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230703BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230703BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230703BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230703BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230703BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230703BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20230703BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230703BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C07K4/00 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12N5/10
A61K38/10
A61K38/16
A61K38/12
A61P9/10
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/12
A61K45/00
A61P17/02
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/14
A61P25/28
A61P29/00
A61P25/04
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022575477
(86)(22)【出願日】2021-06-11
(85)【翻訳文提出日】2022-12-07
(86)【国際出願番号】 EP2021065734
(87)【国際公開番号】W WO2021250226
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】20179519.2
(32)【優先日】2020-06-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】508335820
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ コペンハーゲン
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】バルボア，ハビエル，ロドリゲス
(72)【発明者】
【氏名】ストロムガ－ド，クリスチアン
(72)【発明者】
【氏名】オステルガード，ソレン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA19
4C084BA23
4C084BA24
4C084CA53
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA081
4C084ZA082
4C084ZA161
4C084ZA162
4C084ZA211
4C084ZA212
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA401
4C084ZA402
4C084ZA542
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZC75
4C087AA01
4C087BB65
4C087BC83
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA02
4C087ZA08
4C087ZA16
4C087ZA21
4C087ZA36
4C087ZA40
4C087ZB21
4C087ZC75
4H045AA10
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA30
4H045BA53
4H045BA57
4H045BA70
4H045BA71
4H045EA20
4H045FA33
(57)【要約】
本発明は、蛋白質／蛋白質相互作用の阻害剤として働くことができる、具体的には、ＰＳＤ－９５のＰＤＺ２ドメインを阻害することによって、阻害剤として働くことができる新規環状ペプチド、ならびに興奮毒性関連疾患および神経因性疼痛の治療におけるそれらの用途に関するものである。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９Ｑ（配列番号：１）のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であって、ここで
Ｘ１が、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２が、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３が、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４が、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５が、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６が、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７が、ＥまたはＤであり；
Ｘ８が、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９が、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである、
ポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩。
【請求項2】
請求項１のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが環状化部分に共有結合で連結される、ポリペプチド。
【請求項3】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該環化部分がアミノ酸配列ｐＧＸ１０を含み、ここでＸ１０がＣ、ＱまたはＥである、ポリペプチド。
【請求項4】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であって、ここで該ポリペプチドがアミノ酸配列ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９ＱｐＧＸ１０（配列番号：２）を含み、あるいは配列番号：２のアミノ酸配列から成り；ここで
Ｘ１が、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２が、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３が、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４が、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５が、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６が、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７が、ＥまたはＤであり；
Ｘ８が、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９が、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０が、Ｃ、ＱまたはＥである、
ポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩。
【請求項5】
請求項１～３のいずれかに記載のポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であって、ここで該ポリペプチドは、アミノ酸配列ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９Ｑ（配列番号：３）を含み、あるいは配列番号：３のアミノ酸配列から成り；ここで
Ｘ１が、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２が、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３が、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ５が、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６が、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７が、ＥまたはＤであり；
Ｘ８が、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９が、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである、
ポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩。
【請求項6】
請求項１のポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であって、ここで該ポリペプチドが、アミノ酸配列ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９ＱｐＧＸ１０（配列番号：４）を含み、あるいは配列番号：４のアミノ酸配列から成り；ここで
Ｘ１が、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２が、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３が、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ５が、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６が、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７が、ＥまたはＤであり；
Ｘ８が、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９が、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０が、Ｃ、ＱまたはＥである、
ポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩。
【請求項7】
請求項１のポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であって、ここで該ポリペプチドがアミノ酸配列ＴＸ１ＬＥＴＴＦＸ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９ＱｐＧＸ１０（配列番号：５）を含み、あるいは配列番号：５のアミノ酸配列から成り；ここで
Ｘ１が、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ４が、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５が、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６が、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７が、ＥまたはＤであり；
Ｘ８が、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９が、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０が、Ｃ、ＱまたはＥである、
ポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩。
【請求項8】
請求項１のポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であって、ここで該ポリペプチドがアミノ酸配列ＴＸ１ＬＥＴＴＦＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９ＱｐＧＸ１０（配列番号：６）を含み、あるいは配列番号：６のアミノ酸配列から成り；ここで
Ｘ１が、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ５が、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６が、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７が、ＥまたはＤであり；
Ｘ８が、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９が、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０が、Ｃ、ＱまたはＥである、
ポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩。
【請求項9】
請求項１のポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であって、ここで該ポリペプチドがアミノ酸配列ＴＸ１ＬＥＴＴＦＸ４ＧＤＧＸ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９Ｑ（配列番号：７）を含み、あるいは配列番号：７のアミノ酸配列から成り；ここで
Ｘ１が、ＨまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ４が、ＷまたはＮａｌであり；
Ｘ７が、ＥまたはＤであり；
Ｘ８が、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９が、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである、
ポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩。
【請求項10】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが環状である、ポリペプチド。
【請求項11】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが主鎖で環化している、ポリペプチド。
【請求項12】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１がＨである、ポリペプチド。
【請求項13】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１がＨ－３Ｍｅである、ポリペプチド。
【請求項14】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１がＰｙＡ－４である、ポリペプチド。
【請求項15】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ２がＴである、ポリペプチド。
【請求項16】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ２がＳである、ポリペプチド。
【請求項17】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ２がＤである、ポリペプチド。
【請求項18】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ２がＥである、ポリペプチド。
【請求項19】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ３がＦである、ポリペプチド。
【請求項20】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ３がＦ－２－Ｂｒである、ポリペプチド。
【請求項21】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ３がＦ－２－Ｃｌである、ポリペプチド。
【請求項22】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ３がＦ－３－Ｆである、ポリペプチド。
【請求項23】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ４がＷである、ポリペプチド。
【請求項24】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ４がＮａｌである、ポリペプチド。
【請求項25】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ５がＤである、ポリペプチド。
【請求項26】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ５がＮ－Ｍｅ－Ｄである、ポリペプチド。
【請求項27】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ６がＧである、ポリペプチド。
【請求項28】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ６がＡである、ポリペプチド。
【請求項29】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ６がＰである、ポリペプチド。
【請求項30】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ７がＥである、ポリペプチド。
【請求項31】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ７がＤである、ポリペプチド。
【請求項32】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ８がＫである、ポリペプチド。
【請求項33】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ８がＮ－Ｍｅ－Ｋである、ポリペプチド。
【請求項34】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ９がＴである、ポリペプチド。
【請求項35】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ９がＮ－Ｍｅ－Ｔである、ポリペプチド。
【請求項36】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１０がＣである、ポリペプチド。
【請求項37】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１０がＱである、ポリペプチド。
【請求項38】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１０がＥである、ポリペプチド。
【請求項39】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１がＨであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＦであり、Ｘ４がＷであり、Ｘ５がＤであり、かつＸ６がＧである、ポリペプチド。
【請求項40】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１がＨであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＦであり、Ｘ４がＷであり、Ｘ５がＤであり、Ｘ６がＧであり、かつＸ７がＥである、ポリペプチド。
【請求項41】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１がＨであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＦであり、Ｘ４がＷであり、Ｘ５がＤであり、Ｘ６がＧであり、かつＸ７がＤである、ポリペプチド。
【請求項42】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１がＨであり、Ｘ２がＴであり、Ｘ３がＦであり、Ｘ４がＮａｌであり、Ｘ５がＤであり、Ｘ６がＧであり、かつＸ７がＥである、ポリペプチド。
【請求項43】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここでＸ１がＨであり、Ｘ２がＰｙＡ－４であり、Ｘ３がＦであり、Ｘ４がＷであり、Ｘ５がＤであり、Ｘ６がＧであり、かつＸ７がＥである、ポリペプチド。
【請求項44】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが：ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：８）；
ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＤ（配列番号：９）；
ＴＨＬＥＴＴＦ（Ｎａｌ）ＧＤＧＥ（配列番号：１０）；
および
Ｔ（ＰｙＡ－４）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：１１）、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項45】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがアミノ酸配列ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：８）を含む、ポリペプチド。
【請求項46】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがアミノ酸配列ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＤ（配列番号：９）を含む、ポリペプチド。
【請求項47】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがアミノ酸配列ＴＨＬＥＴＴＦ（Ｎａｌ）ＧＤＧＥ（配列番号：１０）を含む、ポリペプチド。
【請求項48】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがアミノ酸配列Ｔ（ＰｙＡ－４）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：１１）を含む、ポリペプチド。
【請求項49】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩であって、ここで該ポリペプチドが、アミノ酸配列ＴＸ１ＬＥＴＴＦＸ４ＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＸ１０（配列番号：１３）を含む環状ポリペプチドまたは配列番号：１３のアミノ酸配列から成る環状ポリペプチドであり、ここで
Ｘ１がＨまたはＨ－３Ｍｅであり；
Ｘ４がＷまたは非存在であり；
Ｘ１０がＣ、ＱまたはＥである、
ポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩。
【請求項50】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、アミノ酸配列ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４１９）を含む環状ポリペプチド、または配列番号：４１９のアミノ酸配列から成る環状ポリペプチドである、ポリペプチド。
【請求項51】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、アミノ酸配列ＴＨＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２０）を含む環状ポリペプチド、または配列番号：４２０のアミノ酸配列から成る環状ポリペプチドである、ポリペプチド。
【請求項52】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、アミノ酸配列ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２１）を含む環状ポリペプチド、または配列番号：４２１のアミノ酸配列から成る環状ポリペプチドである、ポリペプチド。
【請求項53】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、アミノ酸配列ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２２）を含む環状ポリペプチド、または配列番号：４２２のアミノ酸配列から成る環状ポリペプチドである、ポリペプチド。
【請求項54】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが少なくとも２０アミノ酸残基を含むポリペプチドであって、少なくとも２１アミノ酸残基など、少なくとも２２アミノ酸残基など、少なくとも２３アミノ酸残基など、少なくとも２４アミノ酸残基など、少なくとも２５アミノ酸残基など、少なくとも２６アミノ酸残基など、少なくとも２７アミノ酸残基など、少なくとも２８アミノ酸残基など、少なくとも２９アミノ酸残基など、少なくとも３０アミノ酸残基など、少なくとも３１アミノ酸残基など、少なくとも３２アミノ酸残基など、少なくとも３３アミノ酸残基など、少なくとも３４アミノ酸残基など、少なくとも３５アミノ酸残基など、少なくとも３６アミノ酸残基など、少なくとも３７アミノ酸残基などを含む、ポリペプチド。
【請求項55】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが５０アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、４５アミノ酸残基以下など、４０アミノ酸残基以下など、３５アミノ酸残基以下など、３０アミノ酸残基以下など、２９アミノ酸残基以下など、２８アミノ酸残基以下など、２７アミノ酸残基以下など、２６アミノ酸残基以下など、２５アミノ酸残基以下など、２４アミノ酸残基以下など、２３アミノ酸残基以下など、２２アミノ酸残基以下など、２１アミノ酸残基以下など、２０アミノ酸残基以下などを含む、ポリペプチド。
【請求項56】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが１９～５０の範囲のアミノ酸残基を含むポリペプチドであって、１９～４５の範囲のアミノ酸残基など、１９～４０の範囲のアミノ酸残基など、１９～３５の範囲のアミノ酸残基など、１９～３０の範囲のアミノ酸残基など、１９～２５の範囲のアミノ酸残基など、１９～２３の範囲のアミノ酸残基など、２０～２３の範囲のアミノ酸残基など、２０～２２の範囲のアミノ酸残基などを含む、ポリペプチド。
【請求項57】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがＰＳＤ－９５に結合可能である、ポリペプチド。
【請求項58】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、ＰＳＤ－９５のＰＤＺ２ドメインに対するｎＮＯＳの結合を阻害することができる、ポリペプチド。
【請求項59】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが１００μＭ未満のＫｄでＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に結合し、７５μＭ未満など、５０μＭ未満など、２５μＭ未満など、２０μＭ未満など、１５μＭ未満など、１０μＭ未満など、５μＭ未満など、４μＭ未満など、３μＭ未満など、２μＭ未満など、１μＭ未満などのＫｄでＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に結合する、ポリペプチド。
【請求項60】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここでＰＳＤ－９５がＰＤＺ２ドメインに対するｎＮＯＳの結合を阻害する該化合物のＫｉ値が１００μＭ未満であり、７５μＭ未満など、５０μＭ未満など、１０μＭ未満など、５μＭ未満など、２．５μＭ未満など、１μＭ未満などである、ポリペプチド。
【請求項61】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがある１部分にさらに共役（結合）している、ポリペプチド。
【請求項62】
請求項６１のポリペプチドであって、ここで該１部分が：ＰＥＧ、単糖類、蛍光色素分子、発色団、放射性化合物、および細胞透過ペプチドから成る群から選択される、ポリペプチド。
【請求項63】
請求項６１のポリペプチドであって、ここで該１部分が検出可能部分である、ポリペプチド。
【請求項64】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、グリコシル化、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化および／またはアルキル化によって、さらに修飾されている、ポリペプチド。
【請求項65】
前記請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここでアミノ酸残基の１つ以上が、メチル化など、アルキル化されている、ポリペプチド。
【請求項66】
請求項１、１０、１１、または５４～６５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドは、配列番号：１４～１３６および配列番号：１３９～４３３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、あるいは配列番号：１４～１３６および配列番号：１３９～４３３から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド。
【請求項67】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがシクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｅα））（配列番号：４２３）である、ポリペプチド。
【請求項68】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがシクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｅα））（配列番号：４２４）である、ポリペプチド。
【請求項69】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがシクロ－（ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｅα））（配列番号：４２５）である、ポリペプチド。
【請求項70】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがシクロ－（ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｅα））（配列番号：４２６）である、ポリペプチド。
【請求項71】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがシクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｑα））（配列番号：１４）である、ポリペプチド。
【請求項72】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがシクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｑα））（配列番号：１５）である、ポリペプチド。
【請求項73】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがシクロ－（ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｑα））（配列番号：１６）である、ポリペプチド。
【請求項74】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドがシクロ－（ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｑα））（配列番号：１７）である、ポリペプチド。
【請求項75】
前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項76】
請求項７５の組成物であって、ここで該組成物が医薬組成物である、組成物。
【請求項77】
請求項１～７４のいずれか１項に規定されるようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項78】
請求項７７に規定されるようなポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項79】
請求項７７のポリヌクレオチドまたは請求項７８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項80】
請求項７９の宿主細胞であって、ここで該宿主細胞が細菌性細胞である、宿主細胞。
【請求項81】
請求項７９の宿主細胞であって、ここで該宿主細胞が哺乳動物細胞である、宿主細胞。
【請求項82】
請求項７９の宿主細胞であって、ここで該宿主細胞がヒト細胞である、宿主細胞。
【請求項83】
薬剤治療として用いられる、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞。
【請求項84】
対象において興奮毒性関連疾患の予防および／または治療に用いる、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞。
【請求項85】
請求項８４にしたがって用いられる、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞であって、ここで該興奮毒性関連疾患が虚血性脳卒中などの脳卒中である、ポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞。
【請求項86】
請求項８５にしたがって用いられる、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞であって、ここで血栓溶解剤の投与との組み合わせなど、再灌流療法との組み合わせで該ポリペプチドが投与される、ポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞。
【請求項87】
請求項８４にしたがって用いられる、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞であって、ここで該興奮毒性関連疾患が、脊髄損傷および外傷性脳損傷などの、ＣＮＳの虚血性または外傷である、ポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞。
【請求項88】
請求項８４にしたがって用いられる、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞であって、ここで該興奮毒性関連疾患がてんかんである、ポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞。
【請求項89】
請求項８４にしたがって用いられる、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞であって、ここで該興奮毒性関連疾患がＣＮＳの神経変性疾患である、ポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞。
【請求項90】
請求項８４にしたがって用いられる、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞であって、ここでＣＮＳの神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病から成る群から選択される、ポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞。
【請求項91】
対象において神経因性疼痛の予防および／または治療に用いられる、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞。
【請求項92】
興奮毒性関連疾患および／または神経因性疼痛を予防および／または治療する方法であって、該方法が、治療有効量の請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項93】
請求項９２の方法であって、ここで請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞が、血栓溶解剤の投与との組み合わせなどの、再灌流療法との組み合わせで投与される、方法。
【請求項94】
請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞の用途であって、対象において興奮毒性関連疾患および／または神経因性疼痛の治療および／または予防のための治療薬剤の製造のための用途。
【請求項95】
少なくとも２種類の異なる単位剤形（Ａ）および（Ｂ）を含むパーツのキットであって；ここで
（Ａ）が、請求項１～７４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７５の組成物、請求項７７のポリヌクレオチド、請求項７８のベクター、または請求項７９の宿主細胞を含み；
かつ
（Ｂ）が血栓溶解剤を含む、
キット。
【請求項96】
請求項９５のパーツのキットであって、興奮毒性関連疾患および／または疼痛を治療する、予防する、軽減する、および／または発生を遅延させる用途のキットであるが、ここで該対象に（Ａ）および（Ｂ）を、同時に、逐次的に、または個別に投与する、キット。
【請求項97】
請求項１～７４のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、該方法が：（ａ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕによるペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）を用いてペプチドを調製する工程、
および
（ｂ）天然の化学ライゲーション（ＮＣＬ）を介する該ペプチドの環化工程、
を含む、方法。
【請求項98】
請求項９７の方法であって、ここで工程（ｂ）が、Ｃ末端ヒドラジン基をアジドに酸化すること、および該アジドをＮ末端Ｃｙｓのチオール基と反応させることを含み、その後にトランスチオエステル化によってアミド結合を形成させることを含む、方法。
【請求項99】
請求項９７の方法であって、工程（ｂ）後にさらに工程を含み、ここで蛍光色素分子が該ポリペプチドに共役（結合）される、方法。
【請求項100】
請求項１～７４のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、該方法が：（ａ）セルロース膜を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）で提供されるセルロース膜に、ＰＥＧスペーサーを共役（結合）させて、Ｆｍｏｃ／Ｂｏｃ－Ｇｌｙの混合物を付加する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で調製される膜を無水酢酸でキャッピングする工程；
（ｄ）工程（ｃ）の産物に準直交性保護ＡＡを付加する工程；
（ｅ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕによるペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）を用いて残りのポリペプチドを、工程（ｄ）のＡＡ上に調製する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で生成したポリペプチドから準直交性保護基を除去し、該ポリペプチドを環化する工程；
（ｇ）工程（ｆ）で生成したポリペプチドから側鎖保護基を切断する工程；
および
（ｈ）該セルロース膜から該ポリペプチドを切断する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛋白質／蛋白質相互作用の阻害剤として働くことができる、具体的には、ＰＳＤ－９５のＰＤＺ１ドメインおよび／またはＰＤＺ２ドメインを阻害することによって、阻害剤として働くことができる新規環状ペプチド、ならびに興奮毒性関連疾患および神経因性疼痛の治療におけるそれらの用途に関するものである。
【背景技術】
【0002】
毎年、世界中で１３００万人が脳卒中に罹患し、これは第２の主要な死因および障害の原因となっている。Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）、後シナプス肥厚蛋白質９５（ＰＳＤ－９５）および神経性一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の三者間の三重複合体は、細胞死の興奮毒性機序において重要な役割を担っている（図１）。
【0003】
ＰＳＤ－９５は、ＤＬＧ４（ディスクスラージホモログ４）遺伝子によってコードされるヒトの蛋白質である。ＰＳＤ－９５は、膜結合性グアニル酸キナーゼ（ＭＡＧＵＫ）ファミリーの構成員であり、ＰＳＤ－９３と共に同一のＮＭＤＡ受容体およびカリウムチャンネルクラスターに動員される。
【0004】
ＰＳＤ－９５は、ほぼ例外なくニューロン後シナプス肥厚に存在しシナプス蛋白質の固定に関連する。その直接および間接の結合パートナーとしては、ニューロギン、ｎＮＯＳ、ＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体、およびカリウムチャンネルが挙げられる。
【0005】
ＰＳＤ－９５は、リンカー領域で連結される３つのＰＤＺドメイン、１つのＳＨ３ドメイン、および１つのグアニル酸キナーゼ様（ＧＫ）ドメインを含む。ＰＳＤ－９５のＰＤＺ１およびＰＤＺ２ドメインは、複数の蛋白質と相互作用し、そのような相互作用としてはイオンチャンネル型グルタミン酸受容体のＮＭＤＡ受容体型および一酸化窒素（ＮＯ）産生酵素ｎＮＯＳへの同時結合が挙げられる。
【0006】
ＮＭＤＡ受容体は、興奮毒性、すなわちグルタミン酸媒介性神経毒性の主要なメディエーターであり、このような興奮毒性は神経変性疾患および急性脳損傷に関係している。ＮＭＤＡ受容体の拮抗薬は、グルタミン酸媒介性イオン束を阻止することによって、効率的に興奮毒性を低下させるのであるが、それらは生理学的に重要な過程をも阻害する。すなわち、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬は、忍容性が低い、および効力が欠如しているなどの理由で、臨床試験（例えば、脳卒中の臨床試験）において不成功であった。代わりに、ＰＳＤ－９５阻害剤を用いて細胞内ｎＮＯＳ／ＰＳＤ－９５／ＮＭＤＡ受容体複合体形成を阻害することにより、興奮毒性の特異的阻害を達成することができる。
【0007】
現在、複数の点で、一部のＰＤＺドメインが内部の結合モチーフをも認識可能であることが示唆される（低探索ＰＤＺ結合モード）。一例を挙げれば、ＰＳＤ－９５のＰＤＺ２ドメインと神経性一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）との間で、そのような相互作用が起こる。分子レベルにおいて、この相互作用には、自由Ｃ末端を持たず、拡がったβヘアピンフォールドをとるｎＮＯＳ内の３０残基の並びが含まれる。
【0008】
虚血性脳卒中後の神経保護を誘導する目的で、ｎＮＯＳ阻害剤またはＮＭＤＡ受容体阻害剤を設計する試みが数多く成されている。しかしながら、これに関しては、副作用、効力低下、選択性の欠如および低い血液脳関門浸透性によって未だに成功には至っていない。したがって、この分野においては、上記のような蛋白質／蛋白質相互作用を効率的に阻害する阻害剤の必要性が依然として存在しているのである。
【発明の概要】
【0009】
ＰＳＤ－９５のＰＤＺドメインを特異的な標的とすることによって蛋白質／蛋白質相互作用の阻害剤を提供するという上記の課題を達成する目的において、本開示は、ＰＳＤ－９５のＰＤＺ１および／またはＰＤＺ２ドメインに対して非標準的結合の可能な新しいタイプの環状ペプチドであって、虚血性脳卒中および神経因性疼痛の治療を目的としてｎＮＯＳとの蛋白質／蛋白質相互作用を阻害する環状ペプチドについて説明し、また該ペプチドの製造法と用途についても説明する。
【0010】
一局面において、本発明は、ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９Ｑ（配列番号：１）のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩に関し；
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
および
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
および
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
【0011】
一実施態様においては、該ポリペプチドは環状ポリペプチドである。
【0012】
一局面においては、本発明は、薬剤治療の用途において本明細書中に定義されるようなポリペプチド（環状ポリペプチドなど）に関する。
【0013】
一局面においては、本発明は、対象における興奮毒性関連疾患の予防および／または治療の用途において本明細書に定義されるようなポリペプチド（環状ポリペプチドなど）に関する。
【0014】
一局面においては、本発明は、対象における神経因性疼痛の予防および／または治療の用途において本明細書に定義されるようなポリペプチド（環状ポリペプチドなど）に関する。
【0015】
一局面においては、本発明は、本明細書に定義されるようなポリペプチドを製造する方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕによるペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）を用いてペプチドを調製する工程、
および
（ｂ）天然の化学ライゲーション（ＮＣＬ）を介する該ペプチドの環化工程。
（ａ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕによるペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）を用いてペプチドを調製する工程、
および
（ｂ）天然の化学ライゲーション（ＮＣＬ）を介する該ペプチドの環化工程。
【0016】
このプロジェクトは、マリア・スクウォドフスカ＝キュリー研究支援基金番号６７５３４１の下で、欧州連合ホライズン２０２０研究およびイノベーション計画から研究資金援助を受けたものである。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ１に結合しているＮＭＤＡ受容体を介した後シナプスへのＣａ＋２異常流入を示す虚血性脳卒中経過中の興奮毒性についての模式表現である。ｎＮＯＳが内部ヘアピンモチーフを介してＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に結合することにより、興奮毒性の原因となるＮＯの過剰産生が起こる。
【図2】２５℃における環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドおよび直鎖状ｎＮＯＳペプチドとＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２とのＩＴＣの生ヒートシグネチャー（上部パネル）および結合等温線（下部パネル）。データ取得を三回行い、結合定数の値（Ｋａ）値をＫｄに変換した。値は、Ｋｄ値の平均±標準誤差で表す。
【図3】組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対して、ＦＰ競争実験で測定した異なる環状ｎＮＯＳβヘアピン足場のＫｉ値。異なる閉環構造を右側に示す。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。
【図4】ＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２でスクリーニングしたＳＰＯＴアレイのｎＮＯＳβヘアピンモチーフの網羅的突然変異スキャンヒートマップ。蛍光値は、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドのＷＴ値に対して正規化した。残基は側鎖の特性にしたがって分類し、上部のｎＮＯＳβヘアピンのスキーム内に天然残基を示す。ＷＴ残基は、網掛けで塗りつぶしたセルとして表している。
【図5】Ａ）正規化ＦＰ阻害定数とＳＰＯＴペプチドアレイの正規化蛍光値との間のアラニンスキャン相関。Ｂ）正規化ＦＰ阻害定数とＳＰＯＴペプチドアレイの正規化蛍光値との間の突然変異分析相関。
【図6】Ａ）組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対してＦＰ競争実験で測定した、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドのＡｌａスキャンのＫｉ値。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。Ｂ）環状ｎＮＯＳβヘアピン／ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ドメインのモデルであり、関与するＨ結合および残基が強調表示されている。Ｃ）Ｅ１０８とＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２のＴ１９２およびＳ１７３との間のＨ結合相互作用。Ｄ）環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドのＴ１０９およびＴ１１９とＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２のＨ２２５との間のＨ結合側鎖相互作用。（Ｅ）ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ドメインの疎水性ポケット内部へのＦ１１１側鎖の突出。結合しない（Ｎ．Ｂ．）。
【図7】（Ａ）組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対してＦＰ競争実験で測定した、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドのＮ－ＭｅスキャンのＫｉ値。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。（Ｂ）モデル構造における主鎖Ｈ結合および関与する残基の強調表示。
【図8】（Ａ）環状ｎＮＯＳβフィンガーおよびＧｌｕＮ２Ｂの配列。関与する位置は上部に示している。（Ｂ）組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２のＡｌａ変異体に対してＦＰ飽和実験で測定した、環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブの変化倍数（ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ ＷＴのＫｄ＝１．０±０．１μＭ）。（Ｃ）組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２のＡｌａ変異体に対して、ＦＰ飽和実験で測定したＣ末端ＧｌｕＮ２Ｂ ＴＡＭＲＡプローブの変化倍数（ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ ＷＴのＫｄ＝４．０±０．１μＭ）。モデル構造において関与する残基は強調表示している。
【図9】ホモジナイズした神経組織（成獣マウス）から分離した蛋白質の膜画分における濃縮度を比較するボルケーノプロット。環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドで標識したダイナビーズ（商標）Ｍ－２７０によって濃縮した蛋白質をプロットの左側に示し、他方、ＧｌｕＮ２ＢのＣ末端ペプチドで標識したダイナビーズ（商標）Ｍ－２７０によって濃縮した蛋白質については、プロットの右側に示している。
【図10】ホモジナイズした神経組織（成獣マウス）から分離した蛋白質の細胞質画分における濃縮度を比較するボルケーノプロット。環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドで標識したダイナビーズ（商標）Ｍ－２７０によって濃縮した蛋白質をプロットの左側に示し、他方、ＧｌｕＮ２ＢのＣ末端ペプチドで標識したダイナビーズ（商標）Ｍ－２７０によって濃縮した蛋白質については、プロットの右側に示している。
【図11】以下についてのＩＴＣの生ヒートシグネチャー（上部パネル）および結合等温線（下部パネル）：（Ａ）野生型環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチド；（Ｂ）突然変異Ｔ１１２ＷおよびＴ１１６Ｅを有する環状ｎＮＯＳβフィンガー模倣ペプチド；（Ｃ）突然変異ΔＴ１１２およびＴ１１６Ｅを有する環状ｎＮＯＳβフィンガー模倣ペプチド；（Ｄ）突然変異Ｈ１０６Ｈ（３－Ｍｅ）、Ｔ１１２ＷおよびＴ１１６Ｅを有する環状ｎＮＯＳβフィンガー模倣ペプチド；（Ｅ）突然変異Ｈ１０６Ｈ（３－Ｍｅ）、ΔＴ１１２およびＴ１１６Ｅを有する環状ｎＮＯＳβフィンガー模倣ペプチド。各滴定曲線の上部には、ペプチド構造をリボンダイアグラムで示しており、置換側鎖についてはスティックダイアグラムで示している。
【図12】プラスミン安定性アッセイで判定した環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチド類似体の半減期。データは平均値として表されているｎ＝３。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明は、「特許請求の範囲」において規定されるものである。
【0019】
定義
本明細書においては、蛋白質新生「アミノ酸（ＡＡ）」の名称はＩＵＰＡＣの推奨にしたがい、その１文字コードまたは３文字コードのいずれかを用いて表している（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ／ＡｍｉｎｏＡｃｉｄ／を参照のこと）。大文字略号はｌ－アミノ酸を示し、他方、小文字略号はｄ－アミノ酸を示す。他で特段に明記しない限り、アミノ酸は、α－アミノ酸、すなわち、α－炭素原子に結合したアミン基およびカルボン酸基を有するα－アミノ酸である。
本明細書においては、蛋白質新生「アミノ酸（ＡＡ）」の名称はＩＵＰＡＣの推奨にしたがい、その１文字コードまたは３文字コードのいずれかを用いて表している（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｐａｃ／ＡｍｉｎｏＡｃｉｄ／を参照のこと）。大文字略号はｌ－アミノ酸を示し、他方、小文字略号はｄ－アミノ酸を示す。他で特段に明記しない限り、アミノ酸は、α－アミノ酸、すなわち、α－炭素原子に結合したアミン基およびカルボン酸基を有するα－アミノ酸である。
【0020】
用語「細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）」は、哺乳動物細胞の細胞膜を通過する能力、およびそれに連結される積み荷分子（ペプチド、蛋白質またはオリゴヌクレオチドなど）の細胞内送達を促進する能力によって特徴付けられるペプチドを指す。
【0021】
用語「検出可能部分」は、分析手段で検出可能な部分を指す。検出可能部分は、蛍光色素分子、放射線造影剤、ＭＲＩ造影剤および放射性同位体から成る群から選択されるのであってもよい。
【0022】
本明細書中の用語「有効量」は、所望の結果を達成する、または望ましくない病態に効果を示すのに充分な量を指す。例えば、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成する、または望ましくない症状に対して効果を示すのに充分な量であるが、有害な副作用を引き起こすには一般的に不充分な量を指す。
【0023】
用語「Ｋｄ」は解離定数を指し、ある分子の他の分子に対する親和性の尺度である。Ｋｄが低ければ低いほど、ペプチドのその結合部位への親和性はより高くなる。
【0024】
用語「非蛋白質新生アミノ酸」は、本明細書中では非標準的非コード、非標準、非同系、非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌまたはｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ）のアミノ酸ともよばれ、遺伝子暗号によってコードされないアミノ酸である。非蛋白質新生アミノ酸を非網羅的であるが、リストとして示せば：
α－アミノ－ｎ－酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン、α－アミノ－ｎ－ヘプタン酸、ピペコリン酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、オルニチン、アロトレオニン、ホモシステイン、ホモセリン、β－アラニン、β－アミノ－ｎ－酪酸、β－アミノイソ酪酸、γ－アミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、イソバリン、サルコシン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－プロピルグリシン、Ｎ－イソプロピルグリシン、Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－エチルアラニン、Ｎ－メチルβアラニン、Ｎ－エチルβ－アラニン、イソセリンおよびα－ヒドロキシ－γ－アミノ酪酸が挙げられる。
α－アミノ－ｎ－酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン、α－アミノ－ｎ－ヘプタン酸、ピペコリン酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、オルニチン、アロトレオニン、ホモシステイン、ホモセリン、β－アラニン、β－アミノ－ｎ－酪酸、β－アミノイソ酪酸、γ－アミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、イソバリン、サルコシン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－プロピルグリシン、Ｎ－イソプロピルグリシン、Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－エチルアラニン、Ｎ－メチルβアラニン、Ｎ－エチルβ－アラニン、イソセリンおよびα－ヒドロキシ－γ－アミノ酪酸が挙げられる。
【0025】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」または「蛋白質」は、アミノ酸残基のポリマー、好ましくは、天然であるか合成によって作成されるかを問わず、専らペプチド結合で連結しているアミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書中の用語「ポリペプチド」は、蛋白質、ペプチドおよびポリペプチドを含み、ここで該蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドは、翻訳後修飾されていても、されていなくてもよい。ペプチドは通常、その長さが蛋白質よりも短く、一本鎖である。
【0026】
用語「ＰＤＺ」は、後シナプス肥厚蛋白質９５（ＰＳＤ－９５）、ショウジョウバエの相同体ディスクスラージ腫瘍抑制因子（ＤｌｇＡ）、閉鎖帯－１蛋白質（ｚｏ－１）を指す。
【0027】
用語「ＰＳＤ－９５」は、蛋白質ＰＳＤ－９５（後シナプス肥厚蛋白質９５）を指すが、これはＳＡＰ－９０（シナプス関連蛋白質９０）としても知られ、ＤＬＧ４（ディスクスラージホモログ４）遺伝子（おそらくはヒトのＰＳＤ－９５であろう）によってコードされるヒトの蛋白質である（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ７８３５２）。
【0028】
「それを必要とする対象」は、本発明の恩恵を受け得る個体を指す。一実施態様においては、前記「それを必要とする対象」は、興奮毒性関連疾患および／または神経因性疼痛に罹患している個体である。治療を受けるべき該対象は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。しかし、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジおよびブタなどの動物の治療も、本発明の範囲内にある。
【0029】
本明細書中の用語「治療」および「治療する」は、病態、疾患または障害と闘う目的の、患者の管理とケアを指す。この用語は、患者が罹患している特定の病態に対するあらゆる治療を含むことを意図し、該ペプチドまたは組成物の投与など、等しく、治癒的療法、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃまたはｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）療法ならびに緩和療法または一時療法を指し、ここでその目的は：
症状または合併症を軽減または緩和すること；病態の進行を遅らせること、部分的に臨床症状、疾患または障害を止めること；病態、疾患または障害を治癒させる、または取り除くこと；病態または症状の改善または緩和、および検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず寛解（部分的であるか完全であるかにかかわらず）；および／または病態、疾患または障害を予防すること、または病態、疾患または障害に罹患するリスクを低減することであるが、ここで「予防すること」または「予防的」とは、病態、疾患または障害の発生を阻止する目的の患者の管理とケアを指し、症状または合併症の発症リスクを予防または低減するために該活性化合物の投与を含むものと理解されたい。本明細書中の用語「緩和」およびその表現の変形は、本発明の組成物を投与しないときと比較して、生理的な状態または症状の度合いおよび／または望ましくない症状が減少する、および／または進行の経過が遅延される、または延長されることを意味する。
症状または合併症を軽減または緩和すること；病態の進行を遅らせること、部分的に臨床症状、疾患または障害を止めること；病態、疾患または障害を治癒させる、または取り除くこと；病態または症状の改善または緩和、および検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず寛解（部分的であるか完全であるかにかかわらず）；および／または病態、疾患または障害を予防すること、または病態、疾患または障害に罹患するリスクを低減することであるが、ここで「予防すること」または「予防的」とは、病態、疾患または障害の発生を阻止する目的の患者の管理とケアを指し、症状または合併症の発症リスクを予防または低減するために該活性化合物の投与を含むものと理解されたい。本明細書中の用語「緩和」およびその表現の変形は、本発明の組成物を投与しないときと比較して、生理的な状態または症状の度合いおよび／または望ましくない症状が減少する、および／または進行の経過が遅延される、または延長されることを意味する。
【0030】
用語「治療する」および「治療」の定義を構成する基準に基づいて判定した場合に、治療している病態に変化が現れるのであれば、「治療効果（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔ）」または「治療効果（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）」が現れることになる。少なくとも５％の改善、好ましくは１０％の改善、より好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％（少なくとも７５％など）、および最も好ましくは少なくとも１００％の改善があれば、治療している病態に変化が現れることになる。その変化は、個体において治療している病態の重症度が改善することに基づくもの、または生物活性物質、または本発明の医薬組成物と組み合わせた生物活性物質による治療を受けた個体、および受けていない個体の集団における、病態改善の頻度の差に基づくものであり得る。
【0031】
ポリペプチド
一局面においては、本発明は、ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９Ｑ（配列番号：１）のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩に関し；
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
一局面においては、本発明は、ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９Ｑ（配列番号：１）のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩に関し；
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
【0032】
一実施態様においては、配列番号：１のポリペプチドは、環状化部分に共有結合で連結される。一実施態様においては、該環化部分は、ｐＧＸ１０のアミノ酸配列を含むが、ここでＸ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。すなわち、一実施態様においては、該ポリペプチドは、アミノ酸配列ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９ＱｐＧＸ１０（配列番号：２）または薬学的に許容可能なその塩を含む、または配列番号：２のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩から成るが；
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
【0033】
一実施態様においては、Ｘ４は非存在である。すなわち、一実施態様においては、ポリペプチドは、ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９Ｑ（配列番号：３）のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩を含む、または配列番号：３のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩から成るが；
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
【0034】
一実施態様においては、ポリペプチドは、ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９ＱｐＧＸ１０（配列番号：４）のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩を含む、または配列番号：４のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩から成るが；
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
【0035】
一実施態様においては、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＦである。すなわち、一実施態様においては、ポリペプチドは、ＴＸ１ＬＥＴＴＦＸ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９ＱｐＧＸ１０（配列番号：５）のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩を含む、または配列番号：５のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩から成るが；
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
【0036】
一実施態様においては、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＦであり、かつＸ４は非存在である。すなわち、一実施態様においては、ポリペプチドは、ＴＸ１ＬＥＴＴＦＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９ＱｐＧＸ１０（配列番号：６）のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩を含む、または配列番号：６のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩から成るが；
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔであり；
かつ
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
【0037】
一実施態様においては、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＦであり、Ｘ５はＤであり、かつＸ６はＧである。すなわち、一実施態様においては、ポリペプチドは、ＴＸ１ＬＥＴＴＦＸ４ＧＤＧＸ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９Ｑ（配列番号：７）のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩を含む、または配列番号：７のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩から成るが；
ここで
Ｘ１は、ＨまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ４は、ＷまたはＮａｌであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
ここで
Ｘ１は、ＨまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ４は、ＷまたはＮａｌであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
【0038】
一実施態様においては、Ｘ１はＨである。一実施態様においては、Ｘ１はＨ－３Ｍｅである。一実施態様においては、Ｘ１はＰｙＡ－４である。
【0039】
一実施態様においては、Ｘ２はＴである。一実施態様においては、Ｘ２はＳである。一実施態様においては、Ｘ２はＤである。一実施態様においては、Ｘ２はＥである。
【0040】
一実施態様においては、Ｘ３はＦである。一実施態様においては、Ｘ３はＦ－２－Ｂｒである。一実施態様においては、Ｘ３はＦ－２－Ｃｌである。一実施態様においては、Ｘ３はＦ－３－Ｆである。
【0041】
一実施態様においては、Ｘ４はＷである。一実施態様においては、Ｘ４はＮａｌである。
【0042】
一実施態様においては、Ｘ５はＤである。一実施態様においては、Ｘ５はＮ－Ｍｅ－Ｄである。
【0043】
一実施態様においては、Ｘ６はＧである。一実施態様においては、Ｘ６はＡである。一実施態様においては、Ｘ６はＰである。
【0044】
一実施態様においては、Ｘ７はＥである。一実施態様においては、Ｘ７はＤである。
【0045】
一実施態様においては、Ｘ８はＫである。一実施態様においては、Ｘ８はＮ－Ｍｅ－Ｋである。
【0046】
一実施態様においては、Ｘ９はＴである。一実施態様においては、Ｘ９はＮ－Ｍｅ－Ｔである。
【0047】
一実施態様においては、Ｘ１０はＣである。一実施態様においては、Ｘ１０はＱである。一実施態様においては、Ｘ１０はＥである。
【0048】
一実施態様においては、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＦであり、Ｘ４はＷであり、Ｘ５はＤであり、かつＸ６はＧである。一実施態様においては、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＦであり、Ｘ４はＷであり、Ｘ５はＤであり、Ｘ６はＧであり、かつＸ７はＥである。一実施態様においては、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＦであり、Ｘ４はＷであり、Ｘ５はＤであり、Ｘ６はＧであり、かつＸ７はＤである。一実施態様においては、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＦであり、Ｘ４はＮａｌであり、Ｘ５はＤであり、Ｘ６はＧであり、かつＸ７はＥである。一実施態様においては、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＰｙＡ－４であり、Ｘ３はＦであり、Ｘ４はＷであり、Ｘ５はＤであり、Ｘ６はＧであり、かつＸ７はＥである。
【0049】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、以下から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む：ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：８）、ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＤ（配列番号：９）、ＴＨＬＥＴＴＦ（Ｎａｌ）ＧＤＧＥ（配列番号：１０）、およびＴ（ＰｙＡ－４）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：１１）。
【0050】
一実施態様においては、該ポリペプチドは環状ポリペプチドである。一実施態様においては、該ポリペプチドは、ＴＸ１ＬＥＴＴＦＸ４ＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＸ１０（配列番号：１３）のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩を含む、または、配列番号：１３のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩から成る環状ポリペプチドであるが、
ここで
Ｘ１はＨまたはＨ－３Ｍｅであり；
Ｘ４はＷまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
ここで
Ｘ１はＨまたはＨ－３Ｍｅであり；
Ｘ４はＷまたは非存在であり；
Ｘ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。
【0051】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、アミノ酸配列ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４１９）を含む、またはアミノ酸配列ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４１９）から成る環状ポリペプチドである。
【0052】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、アミノ酸配列ＴＨＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２０）を含む、またはアミノ酸配列ＴＨＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２０）から成る環状ポリペプチドである。
【0053】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、アミノ酸配列ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２１）を含む、またはアミノ酸配列ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２１）から成る環状ポリペプチドである。
【0054】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、アミノ酸配列ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２２）を含む、またはアミノ酸配列ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２２）から成る環状ポリペプチドである。
【0055】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、シクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＥ）（配列番号：４２３）である。一実施態様においては、該ポリペプチドは、シクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＥ）（配列番号：４２４）である。一実施態様においては、該ポリペプチドは、シクロ－（ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＥ）（配列番号：４２５）である。一実施態様においては、該ポリペプチドは、シクロ－（ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＥ）（配列番号：４２６）である。
【0056】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、シクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＱ）（配列番号：１４）である。一実施態様においては、該ポリペプチドは、シクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＱ）（配列番号：１５）である。一実施態様においては、該ポリペプチドは、シクロ－（ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＱ）（配列番号：１６）である。一実施態様においては、該ポリペプチドは、シクロ－（ＴＨ（３－Ｍｅ）ＬＥＴＴＦＧＤＧＥＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧＱ）（配列番号：１７）である。
【0057】
一実施態様においては、該ポリペプチドは少なくとも２０アミノ酸残基を含むものであり、少なくとも２１アミノ酸残基など、少なくとも２２アミノ酸残基など、少なくとも２３アミノ酸残基など、少なくとも２４アミノ酸残基など、少なくとも２５アミノ酸残基など、少なくとも２６アミノ酸残基など、少なくとも２７アミノ酸残基など、少なくとも２８アミノ酸残基など、少なくとも２９アミノ酸残基など、少なくとも３０アミノ酸残基など、少なくとも３１アミノ酸残基など、少なくとも３２アミノ酸残基など、少なくとも３３アミノ酸残基など、少なくとも３４アミノ酸残基など、少なくとも３５アミノ酸残基など、少なくとも３６アミノ酸残基など、少なくとも３７アミノ酸残基などを含む。
【0058】
一実施態様においては、該ポリペプチドは５０アミノ酸残基以下を含むものであり、４５アミノ酸残基以下など、４０アミノ酸残基以下など、３５アミノ酸残基以下など、３０アミノ酸残基以下など、２９アミノ酸残基以下など、２８アミノ酸残基以下など、２７アミノ酸残基以下など、２６アミノ酸残基以下など、２５アミノ酸残基以下など、２４アミノ酸残基以下など、２３アミノ酸残基以下など、２２アミノ酸残基以下など、２１アミノ酸残基以下など、２０アミノ酸残基以下などを含む。
【0059】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、１９～５０の範囲のアミノ酸残基を含むものであり、１９～４５の範囲のアミノ酸残基など、１９～４０の範囲のアミノ酸残基など、１９～３５の範囲のアミノ酸残基など、１９～３０の範囲のアミノ酸残基など、１９～２５の範囲のアミノ酸残基など、１９～２３の範囲のアミノ酸残基など、２０～２３の範囲のアミノ酸残基など、２０～２２の範囲のアミノ酸残基などを含む。
【0060】
環状ポリペプチド
好ましい一実施態様においては、該ポリペプチドは、環化によって環状ポリペプチドを形成する。例えば、ポリペプチドは、側鎖と側鎖、尾部と側鎖、側鎖と頭部、および頭部と尾部で環化してもよい。通常の環化方略としては、２つのシステイン（側鎖と側鎖）間のジスルフィド架橋、チオエーテル架橋、例えばＮ末端およびシステインへのブロモ酢酸付加（頭部と側鎖）によるチオエーテル架橋、および塩基性残基（Ｌｙｓ）と酸性残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）との間のカップリング反応または天然の化学ライゲーション（ＮＣＬ）のいずれかを用いるラクタム化が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。これらの方略のほとんどは、ＦｍｏｃおよびｔＢｕ／Ｂｏｃに対する準直交性保護基を用いるが、そのような保護基としては、Ｌｙｓについてのトリチル（Ｔｒｔ）またはアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、Ｃｙｓについての４－モノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）、ＡｓｐまたはＧｌｕについてのアリル（Ａｌｌ）または２－フェニルイソプロピル（２－ＰｈｉＰｒ）エステル類などが挙げられ、これらはそれぞれ、アミノ基、チオール、およびカルボン酸塩を選択的に脱保護する目的である。
好ましい一実施態様においては、該ポリペプチドは、環化によって環状ポリペプチドを形成する。例えば、ポリペプチドは、側鎖と側鎖、尾部と側鎖、側鎖と頭部、および頭部と尾部で環化してもよい。通常の環化方略としては、２つのシステイン（側鎖と側鎖）間のジスルフィド架橋、チオエーテル架橋、例えばＮ末端およびシステインへのブロモ酢酸付加（頭部と側鎖）によるチオエーテル架橋、および塩基性残基（Ｌｙｓ）と酸性残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）との間のカップリング反応または天然の化学ライゲーション（ＮＣＬ）のいずれかを用いるラクタム化が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。これらの方略のほとんどは、ＦｍｏｃおよびｔＢｕ／Ｂｏｃに対する準直交性保護基を用いるが、そのような保護基としては、Ｌｙｓについてのトリチル（Ｔｒｔ）またはアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、Ｃｙｓについての４－モノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）、ＡｓｐまたはＧｌｕについてのアリル（Ａｌｌ）または２－フェニルイソプロピル（２－ＰｈｉＰｒ）エステル類などが挙げられ、これらはそれぞれ、アミノ基、チオール、およびカルボン酸塩を選択的に脱保護する目的である。
【0061】
本明細書中の用語「頭部と尾部で環化したペプチド」は、用語「主鎖環化ペプチド」の同義語として用いられる。一実施態様においては、該環状ペプチドは主鎖環化ペプチドである。一実施態様においては、該環状ペプチドは、そのＮ末端とＣ末端の部分間にアミン結合を形成させる、すなわち頭部と尾部の間の環化により形成される。
【0062】
いくつかの実施態様においては、環状ポリペプチドの調製にリンクアミド樹脂を用いる（実施例１および４を参照のこと）。すなわち、樹脂からポリペプチドを切断する場合には、Ｘ１０位のアミノ酸残基Ｅをアミノ酸残基Ｑに変換する。
【0063】
一局面においては、本発明は、ＬＥＴＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号：４３６）のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩を含む環状ポリペプチドに関するが；
ここで
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
かつ
Ｘ７は、ＥまたはＤである。
ここで
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
かつ
Ｘ７は、ＥまたはＤである。
【0064】
一実施態様においては、該環状ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドを含む、または該ポリペプチドから成る。一実施態様においては、該環状ポリペプチドは、１９～５０の範囲のアミノ酸残基を含み、２０～２２の範囲のアミノ酸残基などを含む。
【0065】
一実施態様においては、該環状ペプチドは、ＴＸ１ＬＥＴＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７ＰＸ８ＴＩＲＶＸ９Ｑ（配列番号：１）のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩を含む、または配列番号：１のアミノ酸配列または薬学的に許容可能なその塩から成るが；
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
ここで
Ｘ１は、Ｈ、Ｈ－３ＭｅまたはＰｙＡ－４であり；
Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、ＤまたはＥであり；
Ｘ３は、Ｆ、Ｆ－２－Ｂｒ、Ｆ－２－ＣｌまたはＦ－３－Ｆであり；
Ｘ４は、Ｗ、Ｎａｌ、または非存在であり；
Ｘ５は、ＤまたはＮ－Ｍｅ－Ｄであり；
Ｘ６は、Ｇ、ＡまたはＰであり；
Ｘ７は、ＥまたはＤであり；
Ｘ８は、ＫまたはＮ－Ｍｅ－Ｋであり；
かつ
Ｘ９は、ＴまたはＮ－Ｍｅ－Ｔである。
【0066】
一実施態様においては、該環状ポリペプチドは、以下から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む：
ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：８）、ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＤ（配列番号：９）、ＴＨＬＥＴＴＦ（Ｎａｌ）ＧＤＧＥ（配列番号：１０）、およびＴ（ＰｙＡ－４）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：１１）。
ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：８）、ＴＨＬＥＴＴＦＷＧＤＧＤ（配列番号：９）、ＴＨＬＥＴＴＦ（Ｎａｌ）ＧＤＧＥ（配列番号：１０）、およびＴ（ＰｙＡ－４）ＬＥＴＴＦＷＧＤＧＥ（配列番号：１１）。
【0067】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、本明細書において規定されるような配列番号：１４～１３６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施態様においては、該ポリペプチドは、配列番号：１４～１３６から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る。一実施態様においては、該ポリペプチドは、本明細書において規定されるような配列番号：１３９～４３３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施態様においては、該ポリペプチドは、配列番号：１３９～４３３から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る。表現「配列番号：１３９～４３３から成る群」は、１３９～４３３の配列番号を有する各配列全てを含む。同様に、「配列番号：１～５から成る群」という表現は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５を含む。
【0068】
塩およびプロドラッグ
本明細書において規定されるようなポリペプチドは、該ポリペプチドの薬学的に許容可能な塩またはプロドラッグの形態であり得る。本発明の一実施態様においては、本明細書において規定されるようなポリペプチドは、該化合物の薬学的に許容可能な付加塩または水和物（Ｋ＋、Ｎａ＋、ならびに非塩、例えばＨ＋などが挙げられるが、これらにのみに限定されるものではない）として製剤化することができる。
本明細書において規定されるようなポリペプチドは、該ポリペプチドの薬学的に許容可能な塩またはプロドラッグの形態であり得る。本発明の一実施態様においては、本明細書において規定されるようなポリペプチドは、該化合物の薬学的に許容可能な付加塩または水和物（Ｋ＋、Ｎａ＋、ならびに非塩、例えばＨ＋などが挙げられるが、これらにのみに限定されるものではない）として製剤化することができる。
【0069】
ＰＳＤ－９５に対する親和性
一実施態様においては、該ポリペプチドはＰＳＤ－９５に結合することができる。一実施態様においては、該ポリペプチドはＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に結合するが、そのＫｄ値は、１００μＭ未満であり、７５μＭ未満など、５０μＭ未満など、２５μＭ未満など、２０μＭ未満など、１５μＭ未満など、１０μＭ未満など、５μＭ未満など、４μＭ未満など、３μＭ未満など、２μＭ未満など、１μＭ未満などである。該Ｋｄ値は、実施例１に記載のような蛍光分極（ＦＰ）アッセイまたは等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）アッセイを用いて判定するのであってもよい。
一実施態様においては、該ポリペプチドはＰＳＤ－９５に結合することができる。一実施態様においては、該ポリペプチドはＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に結合するが、そのＫｄ値は、１００μＭ未満であり、７５μＭ未満など、５０μＭ未満など、２５μＭ未満など、２０μＭ未満など、１５μＭ未満など、１０μＭ未満など、５μＭ未満など、４μＭ未満など、３μＭ未満など、２μＭ未満など、１μＭ未満などである。該Ｋｄ値は、実施例１に記載のような蛍光分極（ＦＰ）アッセイまたは等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）アッセイを用いて判定するのであってもよい。
【0070】
一実施態様においては、該ポリペプチドはｎＮＯＳのＰＳＤ－９５のＰＤＺ２ドメインに対する結合を阻害することができる。一実施態様においては、ｎＮＯＳのＰＳＤ－９５のＰＤＺ２ドメインに対する結合を阻害する該化合物のＫｉ値は、１００μＭ未満であり、７５μＭ未満など、５０μＭ未満など、１０μＭ未満など、５μＭ未満など、２．５μＭ未満など、１μＭ未満などである。該Ｋｉ値は、蛍光分極（ＦＰ）競争アッセイを用いて判定するのであってもよい。該Ｋｄ値は、実施例１に記載のような蛍光分極（ＦＰ）アッセイまたは等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）アッセイを用いて判定するのであってもよい。
【0071】
膜透過性
ＰＳＤ－９５は細胞内に存在することから、ＰＳＤ－９５を標的とするいずれの薬剤も効率よく細胞膜を透過することが必須となる。本明細書に規定されるような化合物の細胞透過性および細胞質への送達を評価する目的で、細胞クロロアルカン透過アッセイ（ＣＡＰＡ）を用いるのであってもよい（Ｐｅｒａｒｏら、２０１８）。このアッセイでは、クロロアルカン（ＣＡ）分子に共有結合するように設計した修飾ハロアルカン脱ハロゲン化酵素を利用する。細胞質送達を調べるためには、ＨａｌｏＴａｇ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）およびミトコンドリア標的ペプチドを含む融合蛋白質を発現するＨｅＬａ細胞株を用いる。ＣＡＰＡの一般的な方法はパルスチェイスアッセイである（ＤｅｐｒｅｙとＫｒｉｔｚｅｒ、２０２０）。ＨａｌｏＴａｇ酵素を発現する細胞を、ＣＡタグ付加ペプチドと共にインキュベートする。これらＣＡペプチドが細胞膜を透過して細胞質に到達すると、ＨａｌｏＴａｇに結合して反応する（パルス工程）。洗浄工程後に、ＣＡタグを付加した色素と共に細胞をインキュベートするが、この色素は細胞膜に定量的に浸透して残りの未反応ＨａｌｏＴａｇ部位に反応する（チェイス工程）。フローサイトメトリーを用いて、細胞の蛍光強度を測定するが、測定した蛍光は、透過細胞に到達したＣＡペプチドの量に逆比例するので、細胞質送達の評価に利用できる。取得したデータは通常ＣＰ５０値で表すが、このＣＰ５０値は、５０％の細胞に透過が認められた濃度である。化合物のＣＰ５０値は、実施例１６に記載するような方法で測定するのであってもよい。実施例１６は、記載の環状ペプチドの細胞取り込みが医学的利用にとって好適な細胞取り込みであることを示唆している。
ＰＳＤ－９５は細胞内に存在することから、ＰＳＤ－９５を標的とするいずれの薬剤も効率よく細胞膜を透過することが必須となる。本明細書に規定されるような化合物の細胞透過性および細胞質への送達を評価する目的で、細胞クロロアルカン透過アッセイ（ＣＡＰＡ）を用いるのであってもよい（Ｐｅｒａｒｏら、２０１８）。このアッセイでは、クロロアルカン（ＣＡ）分子に共有結合するように設計した修飾ハロアルカン脱ハロゲン化酵素を利用する。細胞質送達を調べるためには、ＨａｌｏＴａｇ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）およびミトコンドリア標的ペプチドを含む融合蛋白質を発現するＨｅＬａ細胞株を用いる。ＣＡＰＡの一般的な方法はパルスチェイスアッセイである（ＤｅｐｒｅｙとＫｒｉｔｚｅｒ、２０２０）。ＨａｌｏＴａｇ酵素を発現する細胞を、ＣＡタグ付加ペプチドと共にインキュベートする。これらＣＡペプチドが細胞膜を透過して細胞質に到達すると、ＨａｌｏＴａｇに結合して反応する（パルス工程）。洗浄工程後に、ＣＡタグを付加した色素と共に細胞をインキュベートするが、この色素は細胞膜に定量的に浸透して残りの未反応ＨａｌｏＴａｇ部位に反応する（チェイス工程）。フローサイトメトリーを用いて、細胞の蛍光強度を測定するが、測定した蛍光は、透過細胞に到達したＣＡペプチドの量に逆比例するので、細胞質送達の評価に利用できる。取得したデータは通常ＣＰ５０値で表すが、このＣＰ５０値は、５０％の細胞に透過が認められた濃度である。化合物のＣＰ５０値は、実施例１６に記載するような方法で測定するのであってもよい。実施例１６は、記載の環状ペプチドの細胞取り込みが医学的利用にとって好適な細胞取り込みであることを示唆している。
【0072】
一実施態様においては、該化合物は、２５０μＭ以下のＣＰ５０値を有しており、２００μＭ以下など、１５０μＭ以下など、１００μＭ以下など、８０μＭ以下など、７０μＭ以下など、６０μＭ以下など、５０μＭ以下など、４０μＭ以下など、３０μＭ以下など、２０μＭ以下など、１５μＭ以下など、１０μＭ以下など、５μＭ以下などを有している。好ましくは、該化合物は６０μＭ以下のＣＰ５０値を有している。
【0073】
プラスミン安定性
虚血性脳卒中（「脳虚血（ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）」または「脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）」ともよばれる）は通常、脳へ血液を供給する動脈の閉塞に起因する。この閉塞によって脳への血流と酸素が減少するので、脳細胞が損傷または死に至る。様々な機械装置を用いて、あるいは「静脈内または動脈内へ送達した血栓溶解薬」を用いて、この血管閉塞を除去することが可能である。そのような血栓溶解薬には、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）が含まれるが、これによってプラスミノーゲンからプラスミンが生成する。組換えｔＰＡの例としてはアルテプラーゼ、レテプラーゼおよびテネクテプラーゼが挙げられるが、また血栓を破壊する他の血栓溶解剤としては、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびデスモテプラーゼを含む。
虚血性脳卒中（「脳虚血（ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）」または「脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）」ともよばれる）は通常、脳へ血液を供給する動脈の閉塞に起因する。この閉塞によって脳への血流と酸素が減少するので、脳細胞が損傷または死に至る。様々な機械装置を用いて、あるいは「静脈内または動脈内へ送達した血栓溶解薬」を用いて、この血管閉塞を除去することが可能である。そのような血栓溶解薬には、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）が含まれるが、これによってプラスミノーゲンからプラスミンが生成する。組換えｔＰＡの例としてはアルテプラーゼ、レテプラーゼおよびテネクテプラーゼが挙げられるが、また血栓を破壊する他の血栓溶解剤としては、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびデスモテプラーゼを含む。
【0074】
一実施態様においては、本発明のポリペプチドは、ＡＩＳの標準的治療であるｔＰＡまたは組換えｔＰＡによる処置を受ける対象に投与する。したがって、該ポリペプチドは、プラスミン（セリンプロテアーゼ）の生成を含むｔＰＡの投与に適合性であることが必須である。
【0075】
本発明のポリペプチドの、インビトロにおけるプラスミン安定性については、実施例１５で評価した。一実施態様において、実施例１５に記載のプラスミン安定性アッセイの場合には、該化合物の半減期はプラスミン存在下で、少なくとも１０分であり、少なくとも３０分など、少なくとも１時間など、少なくとも２時間など、少なくとも３時間など、少なくとも４時間など、少なくとも５時間など、少なくとも６時間など、少なくとも７時間など、少なくとも８時間など、少なくとも９時間など、少なくとも１０時間など、少なくとも１５時間など、少なくとも２０時間など、少なくとも３０時間などである。
【0076】
ポリペプチド修飾
一実施態様においては、ポリペプチドは、グリコシル化、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化および／またはアルキル化によってさらに修飾される。一実施態様においては、該ポリペプチド中のアミノ酸残基の１つ以上がアルキル化（メチル化など）される。例えば、Ｘ５はＮ－Ｍｅ－Ｄであってもよく、Ｘ８はＮ－Ｍｅ－Ｋであってもよく、および／またはＸ９はＮ－Ｍｅ－Ｔであってもよい。一実施態様においては、該ポリペプチドは、ある部分にさらに共役（結合）している。一実施態様においては、該部分は、ＰＥＧ、単糖類、蛍光色素分子、発色団、放射性化合物、および細胞透過性ペプチドから成る群から選択される。一実施態様においては、該部分は検出可能部分である。一実施態様においては、配列番号：１のポリペプチドは環状化部分に共有結合で連結される。一実施態様においては、該環化部分は、ｐＧＸ１０のアミノ酸配列を含み、ここでＸ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。一実施態様においては、ポリペプチドは、以下の構造を有するクロロアルカンタグ（ＣＡ）に共役（結合）している：
一実施態様においては、ポリペプチドは、グリコシル化、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化および／またはアルキル化によってさらに修飾される。一実施態様においては、該ポリペプチド中のアミノ酸残基の１つ以上がアルキル化（メチル化など）される。例えば、Ｘ５はＮ－Ｍｅ－Ｄであってもよく、Ｘ８はＮ－Ｍｅ－Ｋであってもよく、および／またはＸ９はＮ－Ｍｅ－Ｔであってもよい。一実施態様においては、該ポリペプチドは、ある部分にさらに共役（結合）している。一実施態様においては、該部分は、ＰＥＧ、単糖類、蛍光色素分子、発色団、放射性化合物、および細胞透過性ペプチドから成る群から選択される。一実施態様においては、該部分は検出可能部分である。一実施態様においては、配列番号：１のポリペプチドは環状化部分に共有結合で連結される。一実施態様においては、該環化部分は、ｐＧＸ１０のアミノ酸配列を含み、ここでＸ１０は、Ｃ、ＱまたはＥである。一実施態様においては、ポリペプチドは、以下の構造を有するクロロアルカンタグ（ＣＡ）に共役（結合）している：
【化1】
【0077】
ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞
本発明の一局面においては、本明細書に規定されるようなアミノ酸配列を含むペプチドをコードし、発現することのできる核酸構築物を提供する。「核酸構築物によって」とは、遺伝子操作した核酸であることを理解されたい。該核酸構築物は、非複製型の直鎖状核酸、環状発現ベクターまたは自己複製プラスミドであってもよい。一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるような環状ペプチドに対応する直鎖状配列をコードするポリヌクレオチドに関する。一局面においては、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一局面においては、本発明は、該ポリヌクレオチドまたは該ベクターを含む宿主細胞に関する。一実施態様においては、該宿主細胞は細菌性細胞である。一実施態様においては、該宿主細胞は哺乳動物細胞である。一実施態様においては、該宿主細胞はヒト細胞である。
本発明の一局面においては、本明細書に規定されるようなアミノ酸配列を含むペプチドをコードし、発現することのできる核酸構築物を提供する。「核酸構築物によって」とは、遺伝子操作した核酸であることを理解されたい。該核酸構築物は、非複製型の直鎖状核酸、環状発現ベクターまたは自己複製プラスミドであってもよい。一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるような環状ペプチドに対応する直鎖状配列をコードするポリヌクレオチドに関する。一局面においては、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一局面においては、本発明は、該ポリヌクレオチドまたは該ベクターを含む宿主細胞に関する。一実施態様においては、該宿主細胞は細菌性細胞である。一実施態様においては、該宿主細胞は哺乳動物細胞である。一実施態様においては、該宿主細胞はヒト細胞である。
【0078】
ポリペプチドの調製法
本発明のポリペプチドは、当該技術分野における任意の公知の方法で調製されるのであってもよい。すなわち、該ポリペプチドは、溶液合成またはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型固相合成などの標準的なペプチド調製技術によって、調製されるのであってもよい。
本発明のポリペプチドは、当該技術分野における任意の公知の方法で調製されるのであってもよい。すなわち、該ポリペプチドは、溶液合成またはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型固相合成などの標準的なペプチド調製技術によって、調製されるのであってもよい。
【0079】
一実施態様においては、本発明のポリペプチドは、合成によって作成または生産される。ペプチドの合成による生産法は、当該技術分野において公知である。合成ポリペプチド生産に関する詳細な説明と実践的アドバイスについては、Ｇｒａｎｔ Ｇ．Ａ．編集の「合成ペプチド：ユーザー・ガイド（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ）」（（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００２）またはＦｒｏｋｊａｅｒとＨｏｖｇａａｒｄ編集の「医薬製剤：ペプチドと蛋白質の開発（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ、１９９９）に記載がある。一実施態様においては、発明のポリペプチドまたはポリペプチドの配列は、合成によって、特に配列支援ペプチド合成（ＳＡＰＳ）法によって、溶液合成によって、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型固相合成などの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって、組換え技術（該ポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含む宿主細胞による生産であって、ここで該第１の核酸配列が、該宿主細胞において発現を指令することのできる第２の核酸に制御可能に結合されている、該宿主細胞による生産）または酵素合成によって、作成される。これらは当業者に周知である。
【0080】
直鎖状ポリペプチドを、逆相ＨＰＬＣなどによって精製した後に、該直鎖ポリペプチドをさらに処理して環状ペプチドに変換する。ポリペプチド環化技術および環状ポリペプチドを取得する技術（例えば、固体支持体を用いる技術）は、当業者にとっては公知である。
【0081】
一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるようなポリペプチドを製造する方法に関するが、該方法は、該ポリペプチドを組換え技術によって発現させる、または合成によって生産する工程を含む。一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるような環状ポリペプチドを製造する方法に関するが、該方法は、対応する直鎖状ポリペプチドを組換え技術によって発現させ、または合成によって生産した後に、環化させる工程を含む。
【0082】
一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるようなポリペプチドを製造する方法に関するが、ここで該方法は以下の工程を含む：
（ａ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕによるペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）を用いてペプチドを調製する工程、
および
（ｂ）天然の化学ライゲーション（ＮＣＬ）を介する該ペプチドの環化工程。
（ａ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕによるペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）を用いてペプチドを調製する工程、
および
（ｂ）天然の化学ライゲーション（ＮＣＬ）を介する該ペプチドの環化工程。
【0083】
一実施態様においては、ＳＰＰＳおよびＮＣＬは実施例１の概説のように実施する。一実施態様においては、工程（ｂ）は、Ｃ末端ヒドラジン基をアジドに酸化し、および該アジドをＮ末端Ｃｙｓのチオール基に反応させた後、トランスチオエステル化によって、アミド結合を形成させることを含む。
【0084】
一実施態様においては、該製造法は、工程（ｂ）後の工程であって、ここで蛍光色素分子を該ポリペプチドに結合させる工程をさらに含む。
【0085】
一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるようなポリペプチドを製造する方法に関するが、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）セルロース膜を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）で提供されるセルロース膜に、ＰＥＧスペーサーを共役（結合）させて、Ｆｍｏｃ／Ｂｏｃ－Ｇｌｙの混合物を付加する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で調製される膜を無水酢酸でキャッピングする工程；
（ｄ）工程（ｃ）の産物に準直交性保護ＡＡを付加する工程；
（ｅ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕによるペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）を用いて残りのポリペプチドを、工程（ｄ）のＡＡ上に調製する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で生成したポリペプチドから準直交性保護基を除去し、該ポリペプチドを環化する工程；
（ｇ）工程（ｆ）で生成したポリペプチドから側鎖保護基を切断する工程；
および
（ｈ）該セルロース膜から該ポリペプチドを切断する工程。
（ａ）セルロース膜を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）で提供されるセルロース膜に、ＰＥＧスペーサーを共役（結合）させて、Ｆｍｏｃ／Ｂｏｃ－Ｇｌｙの混合物を付加する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で調製される膜を無水酢酸でキャッピングする工程；
（ｄ）工程（ｃ）の産物に準直交性保護ＡＡを付加する工程；
（ｅ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕによるペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）を用いて残りのポリペプチドを、工程（ｄ）のＡＡ上に調製する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で生成したポリペプチドから準直交性保護基を除去し、該ポリペプチドを環化する工程；
（ｇ）工程（ｆ）で生成したポリペプチドから側鎖保護基を切断する工程；
および
（ｈ）該セルロース膜から該ポリペプチドを切断する工程。
【0086】
一実施態様においては、該ポリペプチドは、実施例１に記載されるようなＳＰＯＴペプチドアレイ合成を行い、該セルロース膜から該ポリペプチドをさらに切断することによって調製される。
【0087】
一実施態様においては、本明細書に規定されるような環状ポリペプチドを、セルロース膜などの樹脂上に合成する。この場合、膜に載せる量を減少させ、それによって個々のペプチドスポットの濃度を低下させて、また標的蛋白質への非特異的結合のリスクを低下させる目的で、Ｆｍｏｃ／Ｂｏｃ－Ｇｌｙの混合物を添加することによって合成を開始するのであってもよい。次いで、膜（スポット）に存在する官能基部分のみがＦｍｏｃ－Ｇｌｙ混合物に反応するように、無水酢酸を用いて膜のキャッピングを行う。Ｆｍｏｃ基除去後に、ブロモフェノールブルー（ＢＰＰ）によって、キャッピング能を定性的に制御してもよい。続いて、Ｆｍｏｃ基除去後に、準直交性保護基を有するＡＡ（例えば、Ｃｙｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐ）を共役（結合）させる。ペプチドの残りのＡＡについては、標準的な通常のＦｍｏｃ処理にしたがって共役させる。ペプチド合成の完了時に、官能基（例えば、カルボキシル基）を「自由」にするために、直交性保護基を除去するが、これは脱保護Ｎ末端を環化させるためである。該ペプチドが環化されれば、一時的側鎖保護基を除去するために、ＴＦＡおよびスカベンジャー混合物で膜を処理する。さらに、該生成したペプチドを樹脂から切断してもよい。
【0088】
医薬用途
一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるようなポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の薬剤治療における用途に関する。一実施態様においては、本発明は、本明細書に規定されるような環状ポリペプチドの薬剤治療における用途に関する。
一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるようなポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の薬剤治療における用途に関する。一実施態様においては、本発明は、本明細書に規定されるような環状ポリペプチドの薬剤治療における用途に関する。
【0089】
一局面においては、本発明は、興奮毒性関連疾患および／または神経因性疼痛を予防および／または治療する方法に関するものであるが、ここで該方法は、本明細書に規定されるようなポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を治療有効量で、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0090】
一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるようなポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の、治療薬剤製造における用途に関するものであるが、ここで該治療薬剤は対象において興奮毒性関連疾患および／または神経因性疼痛を治療および／または予防するためのものである。
【0091】
一実施態様においては、本明細書に記載の「対象」は、ヒトなどの哺乳動物である。
【0092】
興奮毒性関連疾患
本発明のポリペプチドはＰＳＤ－９５阻害剤であり、そのため興奮毒性を阻害することができる。すなわち、本発明の化合物は、様々な疾患、特に神経疾患、および特に、部分的には興奮毒性媒介性である疾患の治療に有用である。一局面においては、本発明は、対象における興奮毒性関連疾患の予防および／または治療に用いる、本明細書に規定されるようなポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞に関する。一実施態様においては、本発明は、対象における興奮毒性関連疾患の予防および／または治療に用いる、本明細書に規定されるような環状ポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチドはＰＳＤ－９５阻害剤であり、そのため興奮毒性を阻害することができる。すなわち、本発明の化合物は、様々な疾患、特に神経疾患、および特に、部分的には興奮毒性媒介性である疾患の治療に有用である。一局面においては、本発明は、対象における興奮毒性関連疾患の予防および／または治療に用いる、本明細書に規定されるようなポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞に関する。一実施態様においては、本発明は、対象における興奮毒性関連疾患の予防および／または治療に用いる、本明細書に規定されるような環状ポリペプチドに関する。
【0093】
Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）、後シナプス肥厚蛋白質－９５（ＰＳＤ－９５）および神経性一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）間の三重複合体は、細胞死の興奮毒性機序に重要な役割を果たす。本発明のポリペプチドはｎＮＯＳのＰＳＤ－９５に対する結合を阻害可能であり、神経興奮を引き起こす過剰ＮＯの生成を予防／阻止できるので、該ポリペプチドは、興奮毒性関連疾患の治療に有用なものであり得る。
【0094】
虚血、外傷、てんかんおよび慢性神経変性疾患など、多数の症状が、興奮毒性に関係付けられている（Ｇａｒｄｏｎｉ、Ｆ．ら、２００６年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、５４５、２－１０）。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患は、虚血性脳卒中などの脳卒中である。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患は、脊髄損傷および外傷性脳損傷などの、ＣＮＳの虚血または外傷である。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患は、てんかんである。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患は、ＣＮＳの神経変性疾患である。一実施態様においては、ＣＮＳの神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病から成る群から選択される。
【0095】
一局面においては、本発明は、興奮毒性関連疾患の予防、治療、軽減および／または発生遅延に用いる、本明細書に規定されるようなポリペプチドに関する。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患は脳卒中である。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患は虚血性脳卒中である。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患は脳虚血である。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患は急性虚血性脳卒中である。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患はくも膜下出血である。
【0096】
一局面においては、本発明は、興奮毒性関連疾患の予防、治療、軽減および／または発生遅延のための治療薬剤の製造における、本明細書に規定されるようなポリペプチドの用途に関する。
【0097】
一局面においては、本発明は、興奮毒性関連疾患の予防、治療、軽減および／または発生遅延のための方法に関するものであるが、ここで該方法は、本明細書に規定されるようなポリペプチドを治療有効量で投与することを含む。
【0098】
一局面においては、本発明は、興奮毒性の損傷効果の軽減および／または損傷効果に対する保護における、本明細書に規定されるようなポリペプチドの用途に関する。一実施態様においては、該ポリペプチドを、脳卒中の損傷効果の軽減に用いる。一実施態様においては、該ポリペプチドを、急性虚血性脳卒中の損傷効果に対する治療に用いる。一実施態様においては、該ポリペプチドを、くも膜下出血の損傷効果に対する治療に用いる。
【0099】
一局面においては、本発明は、興奮毒性の損傷効果に対して対象の脳または脊髄を保護する、および／または損傷効果を軽減する方法に関するものであるが、該方法は、損傷効果に対して保護および／または軽減する目的で、有効量の、本明細書に規定されるようなポリペプチドを対象に投与する工程を含む。
【0100】
一局面においては、本発明は、興奮毒性によって媒介される病態を治療する、軽減する、またはその発生を遅延させる方法に関するものであるが、ここで該方法は、該病態に罹患している、または該病態のリスクを有するヒト対象に、本明細書に規定されるようなポリペプチドを投与することを含む。
【0101】
一局面においては、本発明は、対象において興奮毒性によって媒介される病態の少なくとも１種類の徴候または症状を治療する、または阻害する、または遅延させる方法に関するものであるが、ここで該方法は、該病態に罹患している、または該病態に関連するリスク因子を有している対象に、本明細書に規定されるようなポリペプチドを投与することを含む。一実施態様においては、該病態は、脳卒中またはＣＮＳの外傷である。一実施態様においては、興奮毒性関連疾患はＣＮＳに対する／における／の虚血または外傷である。
【0102】
一局面において、本発明は、脳卒中に罹患した対象における脳卒中の損傷効果を軽減する方法に関するものであるが、ここで該方法は、脳卒中の損傷効果を軽減する目的で、本明細書に規定されるようなポリペプチドを有効量で該対象に投与することを含む。
【0103】
本明細書中の「脳卒中」は、脳の１種類以上の栄養血管における閉塞または出血によって引き起こされる病態であって、それによって細胞死に至らしめる病態を指す一般的用語である。本明細書中の「虚血性脳卒中」は、脳の１種類以上の栄養血管における閉塞によって起こる脳卒中を指す。虚血性脳卒中の種類としては、例えば、塞栓性脳卒中、心原性脳塞栓症、血栓性脳卒中、大血管の血栓形成、ラクナ梗塞、遠位動脈塞栓に起因する脳卒中および潜因性脳卒中が挙げられる。「脳虚血（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）」は、酸素に富む血液を脳に送ることを制限する動脈の阻害であり、それによって、脳組織に損傷を与える病態である。脳虚血（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）は、 脳虚血（ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ）または脳血管虚血とよばれることもある。
【0104】
本明細書中の「出血性脳卒中」は、脳の１種類以上の栄養血管における出血によって起こる脳卒中を指す。血性脳卒中の種類としては、例えば、硬膜下脳卒中、実質内脳卒中、硬膜外脳卒中およびくも膜下脳卒中が挙げられる。
【0105】
一実施態様においては、本発明の化合物によって治療可能な疾患は、ＣＮＳの虚血または外傷である。一局面においては、本発明は、対象の脳または脊髄に対する外傷または虚血の損傷効果を軽減する方法に関するものであるが、ここで該方法は、該軽減効果を得るために、本明細書に規定されるようなポリペプチドで該対象を治療することを含む。
【0106】
一局面においては、本発明は、血管内手術に起因する脳虚血を阻止する方法に関するものであるが、ここで該方法は、脳虚血の阻止に有効なレジメンにおいて、血管内手術を受ける対象に、本明細書に規定されるようなポリペプチドを投与することを含む。
【0107】
一局面においては、本発明は、動脈瘤の治療、診断用血管造影または頸動脈ステント処置のための血管内手術による虚血性損傷を阻止する方法に関するものであるが、ここで該方法は、動脈瘤または診断用血管造影の処置として血管内手術を受ける対象に、本明細書に規定されるようなポリペプチドの有効なレジメンを用いることを含む。
【0108】
一局面においては、本発明は、神経外科手術に起因する虚血性損傷の阻止に用いる、本明細書に規定されるようなポリペプチドに関する。一実施態様においては、該神経外科手術は、脳の診断用血管造影または動脈瘤を治療する血管内手術である。
【0109】
いくつかの実施態様においては、該ポリペプチドは、再灌流療法と組み合わせて投与する。一実施態様においては、該ポリペプチドの投与および再灌流を、同時に、逐次的に、または個別に、該対象に対して実施する。
【0110】
本明細書中の用語「再灌流療法」は、閉塞した動脈それ自体、またはその動脈の近傍のいずれかで、血流を回復する医学的処置を指す。再灌流療法は、医薬薬剤と機械的再灌流を含む。該医薬薬剤は、血栓溶解とよぶプロセスにおいて用いる血栓溶解剤または線維素溶解剤であってもよい。いくつかの実施態様においては、再灌流療法は、プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ｔＰＡなどの血栓溶解剤を投与することによって、実施する。一実施態様においては、本明細書に規定されるようなポリペプチドを、プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ｔＰＡと組み合わせて投与する。
【0111】
いくつかの実施態様においては、該再灌流療法は外科手術を含む機械的灌流である。実施される外科手術は、最小侵襲性の血管内処置であってもよい。
【0112】
機械的再灌流装置としては、動脈内カテーテル、バルーン、ステント、および各種の血栓回収デバイスが挙げられる。
【0113】
一実施態様においては、該ポリペプチドを、血栓溶解剤と組み合わせて投与し、該化合物および血栓溶解剤は、同時に、逐次的に、または個別に該対象に投与する。
【0114】
一局面においては、本発明は、中枢神経系に対する虚血の損傷効果に対する治療を実施する方法に関し、ここで該方法は以下の工程を含む：
（ａ）虚血のリスクを有する対象に、本明細書に規定されるようなポリペプチドを投与する工程；
および
（ｂ）該対象において再灌流療法を実施する工程、
ここで該ポリペプチドおよび再灌流療法は、該対象の中枢神経系に対する虚血の損傷効果について、治療を行うものである。
（ａ）虚血のリスクを有する対象に、本明細書に規定されるようなポリペプチドを投与する工程；
および
（ｂ）該対象において再灌流療法を実施する工程、
ここで該ポリペプチドおよび再灌流療法は、該対象の中枢神経系に対する虚血の損傷効果について、治療を行うものである。
【0115】
一局面においては、本発明は、虚血または虚血リスクを有する対象において、中枢神経系に対する虚血の損傷効果の治療に用いる、本明細書に規定されるようなポリペプチドに関するものであるが、ここで該対象において再灌流療法が実施され、該ポリペプチドおよび再灌流療法は、該対象の中枢神経系に対する虚血の損傷効果について治療を行う。
【0116】
一実施態様においては、該方法は、血栓溶解剤を同時に、逐次的に、または個別に該対象に投与することをさらに含む。
【0117】
一局面においては、本発明は、少なくとも２種類の異なる単位剤形（Ａ）および（Ｂ）を含むパーツのキットに関するものであるが；
ここで
（Ａ）は、本明細書に規定されるようなポリペプチドを含み；
および
（Ｂ）は、血栓溶解剤を含む。
ここで
（Ａ）は、本明細書に規定されるようなポリペプチドを含み；
および
（Ｂ）は、血栓溶解剤を含む。
【0118】
一局面においては、本明細書に規定されるようなパーツのキットは、中枢神経系に対する虚血の損傷効果の治療に用いられるが、ここで（Ａ）および（Ｂ）は、同時に、逐次的に、または個別に該対象に投与される。
【0119】
一局面においては、本発明は、くも膜下出血の損傷効果に対する治療に用いる、本明細書に規定されるようなポリペプチドに関する。本明細書中の用語「くも膜下出血」は、くも膜下腔における出血状態を指す。
【0120】
一局面においては、本発明は、対象においてくも膜下出血を治療する方法に関するものであるが、ここで該方法は、くも膜下出血に罹患した対象に、本明細書に規定されるようなポリペプチドを投与することを含み、ここで該対象において神経認知障害の発症が阻止される。
【0121】
一局面においては、本発明は、対象においてくも膜下出血の神経障害または神経認知障害の発症を阻止する方法に関するものであるが、ここで該方法は、くも膜下出血に罹患した対象に、本明細書に規定されるようなポリペプチドを投与することを含み、ここで該対象において神経障害または神経認知障害の発症が阻止される。
【0122】
神経因性疼痛
本発明のポリペプチドによって治療可能な他の神経性疾患であって、興奮毒性との関連が知られてはいない神経性疾患としては、不安および疼痛が挙げられる。一局面においては、本発明は、対象における神経因性疼痛の予防および／または治療に用いる、本明細書に規定されるようなポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞に関する。一実施態様においては、本発明は、対象における神経因性疼痛の予防および／または治療に用いる、本明細書に規定されるような環状ポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチドによって治療可能な他の神経性疾患であって、興奮毒性との関連が知られてはいない神経性疾患としては、不安および疼痛が挙げられる。一局面においては、本発明は、対象における神経因性疼痛の予防および／または治療に用いる、本明細書に規定されるようなポリペプチド、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞に関する。一実施態様においては、本発明は、対象における神経因性疼痛の予防および／または治療に用いる、本明細書に規定されるような環状ポリペプチドに関する。
【0123】
神経因性疼痛は、複数種類の慢性疼痛を含み、体細胞組織よりも神経の機能不全に起因する疼痛のカテゴリーである。中枢神経系または末梢神経系の機能不全に由来する疼痛である神経因性疼痛は、末梢神経または中枢神経系の領域への損傷の結果のこともあり、疾患に由来することもあり、あるいは特発性のこともある。神経因性疼痛の症状としては、灼熱感、チクチクする感覚、ビリビリする感覚、痺れてピリピリする感覚、知覚障害、感覚異常、筋肉の凝り、四肢の痺れ、身体的歪みの感覚、異痛症（刺激によって惹起する疼痛であるが通常無害）、痛覚過敏症（痛みに対する異常過敏）、痛覚過敏（疼痛刺激が止んだ後も長引く過剰疼痛反応）、幻肢痛、および自発性疼痛が挙げられる。
【0124】
ＰＳＤ－９５は、神経因性疼痛の中心機構に関与することが示されている（Ｔａｏ、Ｆ．ら、２００３、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、７３１－７３９； Ｆｌｏｒｉｏ、Ｓ． Ｋ．ら、２００９、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１５８、４９４－５０６）。本発明のポリペプチドはＰＳＤ－９５を阻害するので、このポリペプチドは神経因性疼痛の治療に有用であり得る。
【0125】
投与
本発明に基づけば、本明細書に規定されるようなペプチドまたはペプチドを含む組成物は、薬学的に有効用量または治療有効量で、治療を必要とする個体に投与される。その必要用量は、用いた特定薬剤組成物、投与経路および治療中の特定対象に応じて異なり、障害の重症度および種類ならびに対象の体重と一般的状態に応じて異なる。ペプチド化合物の各投与の最適量および投与間隔は、治療中の病態の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療中の特定患者を考慮して決定され、そのような最適値が従来技術によって決定され得ることは、当業者であれば理解するであろう。治療の最適な進め方、すなわち、１日当たりに化合物を何回投与するのか、何日間投与するのかについては、治療判定の通常の進め方に基づいて確認可能であることもまた、当業者であれば理解するであろう。
本発明に基づけば、本明細書に規定されるようなペプチドまたはペプチドを含む組成物は、薬学的に有効用量または治療有効量で、治療を必要とする個体に投与される。その必要用量は、用いた特定薬剤組成物、投与経路および治療中の特定対象に応じて異なり、障害の重症度および種類ならびに対象の体重と一般的状態に応じて異なる。ペプチド化合物の各投与の最適量および投与間隔は、治療中の病態の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療中の特定患者を考慮して決定され、そのような最適値が従来技術によって決定され得ることは、当業者であれば理解するであろう。治療の最適な進め方、すなわち、１日当たりに化合物を何回投与するのか、何日間投与するのかについては、治療判定の通常の進め方に基づいて確認可能であることもまた、当業者であれば理解するであろう。
【0126】
医薬組成物
本発明のポリペプチドをそのままのペプチドで投与することも可能であるが、医薬製剤の形態でそれらを提供することが好ましい。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩、およびそれらについての薬学的に許容され得る担体を含む医薬製剤をさらに提供する。すなわち、一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるようなポリペプチドを含む医薬組成物などの組成物に関する。該医薬製剤は、従来技術、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの「製剤の科学と実際２００５（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２００５）」、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されるような技術で調製されるのであってもよい。
本発明のポリペプチドをそのままのペプチドで投与することも可能であるが、医薬製剤の形態でそれらを提供することが好ましい。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩、およびそれらについての薬学的に許容され得る担体を含む医薬製剤をさらに提供する。すなわち、一局面においては、本発明は、本明細書に規定されるようなポリペプチドを含む医薬組成物などの組成物に関する。該医薬製剤は、従来技術、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの「製剤の科学と実際２００５（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２００５）」、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されるような技術で調製されるのであってもよい。
【0127】
実施例
実施例１：材料と方法
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）
９－フルオロメチル（Ｆｍｏｃ）／ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）方略を用いてペプチドを合成した。
実施例１：材料と方法
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）
９－フルオロメチル（Ｆｍｏｃ）／ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）方略を用いてペプチドを合成した。
【0128】
Ｆｍｏｃ－ＧｌｙまたはＦｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｗａｎｇを予め付加した樹脂（１００～２００メッシュ）を用いて直鎖状ペプチドを合成した。試薬は、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ホルムアミド（ＤＭＦ）溶液で調製した。環状ペプチド合成については、環化の準直交性構成要素（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＰＰ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＰＰ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＰＰ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨ）をｒｉｎｋアミド－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂に予め付加した。すなわち、１．５当量の選択構成要素の溶液、４当量のＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、および４当量のＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標））を連続振盪しながら室温で３時間保存した。その後、過剰の試薬を除去し、２０当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）および２０当量の無水酢酸の溶液を用いて、樹脂のキャッピングを行った。樹脂を保存のために真空条件下で乾燥した。４当量のＦｍｏｃ－ＡＡ－ＯＨ、４当量のＤＩＣ、および４当量のＯｘｙｍａ Ｐｕｒを用いて、室温で１時間、ＳＰＰＳを実施した。２０％ピペリジンを含むＤＭＦで１０分間、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。樹脂上の直鎖状ペプチド合成が完了した時点で、樹脂を真空条件下で３時間乾燥させた。準直交性保護基を確実に除去するため、直交性保護基を含むペプチドを合成した樹脂を、９５％ジクロロメタン（ＤＣＭ）、３％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）および２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で２０分間４回処理した。その後、５ｍＬのＤＣＭで樹脂を５回洗浄してから、５％ＤＩＰＥＡを含むＤＣＭで中和した。次いで、ＤＭＦで樹脂を５回洗浄し、４当量の（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＡＯＰ、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および４当量のＤＩＰＥＡを含むＤＭＦ溶液を用いて、樹脂に結合しているペプチドの環化を３時間または一晩行った。次いで、樹脂を３時間乾燥させた。
【0129】
準直交性Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）－ＯＨを用いて、ＣＡタグを付加したペプチドを調製した。良好に環化が成された後に、０．２当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４および２０当量のＰｈＳｉＨ３を含むＤＣＭを用いて、準直交性保護基の処理を１５分間２回実施した。Ａｌｌｏｃ保護基を完全に除去した後に、脱保護Ｌｙｓ残基の側鎖アミンをクロロアルカンタグ（ＣＡ）で官能基化した。ＣＡ：ＰｙＢＯＰ：ＤＩＰＥＡの混合物を含むＤＭＦ（３：３：１０）を用いた処理を１６時間行い、環化プチドのＬｙｓの窒素基に、ＣＡタグを結合した。
【0130】
９５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏおよび２．５％ＴＩＰＳを含む開裂カクテルを用いて、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドを樹脂から切断する処理を３時間実施した。ＴＦＡの除去およびペプチドの沈殿は、冷エーテルを用いて行った。次いで、ペプチドを酸性化ＭＱ Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）に溶解し、Ｗａｔｅｒｓ ｐｒｅｐ １５０ＬＣシステムおよび逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ１８、２１．２ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により精製した（５％～３５％Ｂの直線勾配、３０分間）。二成分溶媒系［Ａ：Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ ９９．９／０．１およびＢ：アセトニトリル（ＭｅＣＮ）／ＴＦＡ ９９．９／０．１］を用いた。最終産物を凍結乾燥した。精製後に、質量分析法によりペプチドをもう一度分析したが、これにはＱＤａ質量検出器モジュールを備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを用いた（［Ａ： Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ ９９．９／０．１およびＢ： ＭｅＣＮ／ＴＦＡ ９９．９／０．１］、５～６０％Ｂの直線勾配、６分間）。
【0131】
天然の化学的ライゲーション（ＮＣＬ）による環化
４当量の９－カルバジン酸フルオレニルメチル、４当量のＤＩＣ、および４当量のＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅを予め２－Ｃｌ－トリチル樹脂に一晩付加処理することにより、ＮＣＬのヒドラジドペプチドを合成した。次いで、ペプチド配列の残りを合成し、上記のＳＰＰＳの節に記載の方法を用いて精製した。次に、精製した最終的な直鎖状ペプチドヒドラジドを、塩入り氷浴上で、６Ｍ塩化グアニジン（ＧｎＨＣｌ）０．２Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む緩衝液（ｐＨ３．０）に溶解した。次いで、ペプチドヒドラジドを酸化するために、１０当量の亜硝酸ナトリウムをペプチド溶液に添加した。溶液を３０分間反応させた。その後、室温で、０．１ＭのＮａＯＨ溶液を用いて溶液のｐＨを６．８に調整し、最後に、ペプチドチオエステルを形成させるために、１００当量の４－メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）を混合物に添加した。溶液を室温で２時間反応し、ペプチド環化を完了させた。２時間後、溶液を酸性化Ｈ２Ｏで希釈し、Ｗａｔｅｒｓ ｐｒｅｐ １５０ＬＣシステムおよび逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ１８、２１．２ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）で、二成分溶媒系［Ａ： Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ ９９．９／０．１およびＢ： ＭｅＣＮ／ＴＦＡ ９９．９／０．１］（１０％～４０％Ｂの直線勾配、３０分間）により、精製を行った。最終産物を凍結乾燥した。精製後に、質量分析法によりペプチドを分析したが、これにはＱＤａ質量検出器モジュールを備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを用いた（［Ａ： Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ ９９．９／０．１および Ｂ： ＭｅＣＮ／ＴＦＡ ９９．９／０．１］、５～６０％Ｂの直線勾配、６分間）。
４当量の９－カルバジン酸フルオレニルメチル、４当量のＤＩＣ、および４当量のＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅを予め２－Ｃｌ－トリチル樹脂に一晩付加処理することにより、ＮＣＬのヒドラジドペプチドを合成した。次いで、ペプチド配列の残りを合成し、上記のＳＰＰＳの節に記載の方法を用いて精製した。次に、精製した最終的な直鎖状ペプチドヒドラジドを、塩入り氷浴上で、６Ｍ塩化グアニジン（ＧｎＨＣｌ）０．２Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む緩衝液（ｐＨ３．０）に溶解した。次いで、ペプチドヒドラジドを酸化するために、１０当量の亜硝酸ナトリウムをペプチド溶液に添加した。溶液を３０分間反応させた。その後、室温で、０．１ＭのＮａＯＨ溶液を用いて溶液のｐＨを６．８に調整し、最後に、ペプチドチオエステルを形成させるために、１００当量の４－メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）を混合物に添加した。溶液を室温で２時間反応し、ペプチド環化を完了させた。２時間後、溶液を酸性化Ｈ２Ｏで希釈し、Ｗａｔｅｒｓ ｐｒｅｐ １５０ＬＣシステムおよび逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ１８、２１．２ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）で、二成分溶媒系［Ａ： Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ ９９．９／０．１およびＢ： ＭｅＣＮ／ＴＦＡ ９９．９／０．１］（１０％～４０％Ｂの直線勾配、３０分間）により、精製を行った。最終産物を凍結乾燥した。精製後に、質量分析法によりペプチドを分析したが、これにはＱＤａ質量検出器モジュールを備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを用いた（［Ａ： Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ ９９．９／０．１および Ｂ： ＭｅＣＮ／ＴＦＡ ９９．９／０．１］、５～６０％Ｂの直線勾配、６分間）。
【0132】
蛋白質発現
（７ｘＨｉｓ）－ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２野生型および（７ｘＨｉｓ）－ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２－Ｖ１７８Ｃ配列をコードするｐＲＳＥＴプラスミドは、以前に報告された方法３８で取得した。ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２変異体（Ｋ１６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｆ１７２Ａ、Ｆ１７２Ｉ、Ｓ１７３Ａ、Ｎ１８０Ａ、Ｔ１９２Ａ、Ｋ１９３Ａ、Ｈ２２５Ａ、Ｅ２２６Ａ、Ｖ２２９Ａ、Ｋ２３３Ａ）をコードするＤＮＡ構築物は、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キットおよび表１に挙げたプライマーを用いて野生型ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２のｐＲＳＥＴプラスミド上で作成した。以前に報告された方法３８により、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２変異体を形質変換し、３７℃で０．５ｍＭのイソプロピル－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて大腸菌Ｂ２１ ｐＬｙｓ細胞で発現させた。３７℃での発現２時間後に、細胞を回収しＢ－ＰＥＲ細菌蛋白質抽出試薬を用いて溶解を行った。洗浄緩衝液（５０ｎＭ ＮａＰｉ、２０ｍＭイミダゾール）で平衡化したＨｉｓタグカラムを用いて蛋白質を精製し、その溶出は、溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰｉ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）を用いて行った。その後、サイズ排除精製により、蛋白質をさらに精製したが、この精製には、ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇの事前充填カラムを搭載したＡｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ Ａｉｒを用い、５０ｍＭ ＮａＰｉ、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液を１ｍＬ／分の流速で流した。蛋白質濃度の測定はＮａｎｏＤｒｏｐ１０００で行い、蛋白質の質量決定は、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌカラム３００ＳＢ－Ｃ１８ ２．１ ｘ ７５ｍｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６４１０トリプル四重極ＬＣ－ＭＳによる分析によって行い、二成分溶媒系 ［Ａ： Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＴＦＡ、９４．９／５／０．１およびＢ： Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＴＦＡ、５／９４．９／０．１］（５％～６０％Ｂの直線勾配）を用いて０．７５ｍＬ／分の流速で流した。蛋白質の質量に関する評価は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒソフトウェアを用いるデコンボリューション処理で行った。最終的な蛋白質純度の評価には、ＢＥＨ Ｃ８カラム、１．７μｍ ２．１ ｘ ５０ ｍｍを備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣを用いた。蛋白質の分析には、以下の勾配を用いた：５％～６０％Ｂ、４分間；および６０～１００％Ｂ、４～４．５分間。
（７ｘＨｉｓ）－ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２野生型および（７ｘＨｉｓ）－ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２－Ｖ１７８Ｃ配列をコードするｐＲＳＥＴプラスミドは、以前に報告された方法３８で取得した。ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２変異体（Ｋ１６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｆ１７２Ａ、Ｆ１７２Ｉ、Ｓ１７３Ａ、Ｎ１８０Ａ、Ｔ１９２Ａ、Ｋ１９３Ａ、Ｈ２２５Ａ、Ｅ２２６Ａ、Ｖ２２９Ａ、Ｋ２３３Ａ）をコードするＤＮＡ構築物は、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キットおよび表１に挙げたプライマーを用いて野生型ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２のｐＲＳＥＴプラスミド上で作成した。以前に報告された方法３８により、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２変異体を形質変換し、３７℃で０．５ｍＭのイソプロピル－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて大腸菌Ｂ２１ ｐＬｙｓ細胞で発現させた。３７℃での発現２時間後に、細胞を回収しＢ－ＰＥＲ細菌蛋白質抽出試薬を用いて溶解を行った。洗浄緩衝液（５０ｎＭ ＮａＰｉ、２０ｍＭイミダゾール）で平衡化したＨｉｓタグカラムを用いて蛋白質を精製し、その溶出は、溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰｉ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）を用いて行った。その後、サイズ排除精製により、蛋白質をさらに精製したが、この精製には、ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇの事前充填カラムを搭載したＡｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ Ａｉｒを用い、５０ｍＭ ＮａＰｉ、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液を１ｍＬ／分の流速で流した。蛋白質濃度の測定はＮａｎｏＤｒｏｐ１０００で行い、蛋白質の質量決定は、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌカラム３００ＳＢ－Ｃ１８ ２．１ ｘ ７５ｍｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６４１０トリプル四重極ＬＣ－ＭＳによる分析によって行い、二成分溶媒系 ［Ａ： Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＴＦＡ、９４．９／５／０．１およびＢ： Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＴＦＡ、５／９４．９／０．１］（５％～６０％Ｂの直線勾配）を用いて０．７５ｍＬ／分の流速で流した。蛋白質の質量に関する評価は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒソフトウェアを用いるデコンボリューション処理で行った。最終的な蛋白質純度の評価には、ＢＥＨ Ｃ８カラム、１．７μｍ ２．１ ｘ ５０ ｍｍを備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣを用いた。蛋白質の分析には、以下の勾配を用いた：５％～６０％Ｂ、４分間；および６０～１００％Ｂ、４～４．５分間。
【0133】
【表1】
【0134】
蛋白質およびペプチドのチオール標識
緩衝液としてＰＢＳ緩衝液を選択し、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＰＢＳ錠剤をＭＱ Ｈ２Ｏに溶解して調製した。ｐＨは、０．１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ６．７に調整した。緩衝液は、Ｎ２ガス流下で３０分間脱気した。蛋白質またはペプチドを、１ｍＬの脱気緩衝液に溶解して、連続的撹拌し、隔壁板で覆いをして、かつＮ２ガスを定常的に流しながら１５ｍＬのファルコンに入れた。一方、１５当量のテトラメチルローダミン－５－（および－６）Ｃ２マレイミド（ＴＡＭＲＡマレイミド）色素を２００μＬのＤＭＳＯに溶解し隔壁板を通して注射筒で混合物に加えた。光を避け、連続的撹拌を行いながら２時間、反応させた。
緩衝液としてＰＢＳ緩衝液を選択し、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＰＢＳ錠剤をＭＱ Ｈ２Ｏに溶解して調製した。ｐＨは、０．１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ６．７に調整した。緩衝液は、Ｎ２ガス流下で３０分間脱気した。蛋白質またはペプチドを、１ｍＬの脱気緩衝液に溶解して、連続的撹拌し、隔壁板で覆いをして、かつＮ２ガスを定常的に流しながら１５ｍＬのファルコンに入れた。一方、１５当量のテトラメチルローダミン－５－（および－６）Ｃ２マレイミド（ＴＡＭＲＡマレイミド）色素を２００μＬのＤＭＳＯに溶解し隔壁板を通して注射筒で混合物に加えた。光を避け、連続的撹拌を行いながら２時間、反応させた。
【0135】
標識蛋白質の脱塩精製は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５のＰＤ－１０（ＭＷＣＯ ３０００Ｄａ）脱塩カラムを用いて行った。Ａｇｉｌｅｎｔ ６５５０ ＬＣ－ＭＳ Ｑ－ＴＯＦを用いて、蛋白質の質を評価した。次いで、Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒソフトウェアを用いたデコンボリューション処理により、蛋白質の総質量を決定した。
【0136】
二成分溶媒系［Ａ： Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ ９９．９／０．１およびＢ： ＭｅＣＮ／ＴＦＡ ９９．９／０．１］の５％～４５％Ｂの直線勾配を用いた逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ１８、２１．２ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ）で４０分間処理して、標識環状ペプチドの精製を行った。最終産物の分析は、ＱＤＡ質量検出器モジュールを備えるＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで行った（［Ａ： Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ ９９．９／０．１およびＢ： ＭｅＣＮ／ＴＦＡ ９９．９／０．１］、５～６０％Ｂの直線勾配、６分間）。
【0137】
ＳＰＯＴペプチドアレイの合成
Ｉｎｔａｖｉｓ ＭｕｌｔｉＰｅｐスポッター （Ｉｎｔａｖｉｓ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、環状ｎＮＯＳβヘアピンアレイを作成した。このアッセイに用いた膜は、ＳｙｎｔｈｏＰｌａｎ ＡＰＥＧ ＣＥ（ＰＥＧ－スペーサーを有し、標準的なアミノ修飾を施した酸安定セルロース膜；１０ ｘ １５ｃｍ；負荷は４００ｎｍｏｌ／ｃｍ２）である。０．３ＭのＦｍｏｃ－ＡＡ－ＯＨの溶液および０．３ＭのＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅの溶液は、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）で調製した。活性化因子溶液は、０．３ＭのＤＩＣおよび０．３Ｍの２，４，６－トリメチルピリジン（Ｃｏｌｌｉｄｉｎｅ）を含むＮＭＰから成るものであった。キャッピング溶液は、１Ｍ無水酢酸溶液および０．０５Ｍの４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含むＮＭＰから成るものであった。脱保護溶液は、２０％ピペリジンを含むＮＭＰから成るものであった。ＡＡ共役結合反応は、１時間の反応を４回行った。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、１５分間の反応を２回行った。共役反応間または脱保護間の膜洗浄には、ＮＭＰおよびエタノールを用いた。膜ヘの総負荷量を減らすために、まず、Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ（９）－ＯＨ（Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の共役反応を行い、その後Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（２５％）およびＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（７５％）の混合物で共役反応を行うことによって、セルロース膜上のペプチド伸長を開始した。その後、キャッピング溶液で樹脂のキャッピングを行い充分に洗浄してから、官能性アミノ基を有するＳＰＯＴＳを検出するための品質管理として、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）に浸漬した。次いで、準直交性基Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＰＰの共役反応を行ってから、ペプチド完成まで残りの合成を実施した。セルロース結合直鎖状ペプチドは、最終的に、準直交性基を除去するため、９５％ＤＣＭ、３％ＴＩＰＳおよび２％ＴＦＡの溶液で２０分間の処理を３回行った。その後、ＤＣＭで膜を５回洗浄し、５％ＤＩＰＥＡを含むＤＣＭで中和した。次いで、膜をさらに５回ＤＣＭで洗浄しＮＭＰで５回洗浄してから、０．３ＭのＰｙＡＯＰおよび０．３ＭのＤＩＰＥＡを含むＤＭＦで３時間または一晩環化反応を行った。最後に、ＤＣＭで膜を乾燥させ、標準脱保護カクテル（９５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏおよび２．５％ＴＩＰＳ）または試薬Ｋ［８２．５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％Ｈ２Ｏ、５％チオアニソールおよび２．５％の１，２－エタンジチオール（ＥＤＴ）］で３時間反応させることにより、側鎖保護基の切断を行った。
Ｉｎｔａｖｉｓ ＭｕｌｔｉＰｅｐスポッター （Ｉｎｔａｖｉｓ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、環状ｎＮＯＳβヘアピンアレイを作成した。このアッセイに用いた膜は、ＳｙｎｔｈｏＰｌａｎ ＡＰＥＧ ＣＥ（ＰＥＧ－スペーサーを有し、標準的なアミノ修飾を施した酸安定セルロース膜；１０ ｘ １５ｃｍ；負荷は４００ｎｍｏｌ／ｃｍ２）である。０．３ＭのＦｍｏｃ－ＡＡ－ＯＨの溶液および０．３ＭのＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅの溶液は、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）で調製した。活性化因子溶液は、０．３ＭのＤＩＣおよび０．３Ｍの２，４，６－トリメチルピリジン（Ｃｏｌｌｉｄｉｎｅ）を含むＮＭＰから成るものであった。キャッピング溶液は、１Ｍ無水酢酸溶液および０．０５Ｍの４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含むＮＭＰから成るものであった。脱保護溶液は、２０％ピペリジンを含むＮＭＰから成るものであった。ＡＡ共役結合反応は、１時間の反応を４回行った。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、１５分間の反応を２回行った。共役反応間または脱保護間の膜洗浄には、ＮＭＰおよびエタノールを用いた。膜ヘの総負荷量を減らすために、まず、Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ（９）－ＯＨ（Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の共役反応を行い、その後Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（２５％）およびＢｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（７５％）の混合物で共役反応を行うことによって、セルロース膜上のペプチド伸長を開始した。その後、キャッピング溶液で樹脂のキャッピングを行い充分に洗浄してから、官能性アミノ基を有するＳＰＯＴＳを検出するための品質管理として、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）に浸漬した。次いで、準直交性基Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＰＰの共役反応を行ってから、ペプチド完成まで残りの合成を実施した。セルロース結合直鎖状ペプチドは、最終的に、準直交性基を除去するため、９５％ＤＣＭ、３％ＴＩＰＳおよび２％ＴＦＡの溶液で２０分間の処理を３回行った。その後、ＤＣＭで膜を５回洗浄し、５％ＤＩＰＥＡを含むＤＣＭで中和した。次いで、膜をさらに５回ＤＣＭで洗浄しＮＭＰで５回洗浄してから、０．３ＭのＰｙＡＯＰおよび０．３ＭのＤＩＰＥＡを含むＤＭＦで３時間または一晩環化反応を行った。最後に、ＤＣＭで膜を乾燥させ、標準脱保護カクテル（９５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏおよび２．５％ＴＩＰＳ）または試薬Ｋ［８２．５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％Ｈ２Ｏ、５％チオアニソールおよび２．５％の１，２－エタンジチオール（ＥＤＴ）］で３時間反応させることにより、側鎖保護基の切断を行った。
【0138】
ＳＰＯＴ膜のスクリーニング
膜を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間、インキュベートした。インキュベーション経過後に、膜を乾燥させてから、Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーを４００Ｖ、Ｃｙ３の波長（５３２ｎｍ）で用いてスキャンを行った。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔソフトウェアを用いて、スクリーニングのＴＩＦファイルおよびブランク値のファイルを作成した。その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）＋０．５％ＢＳＡを用いて、５０ｎＭのＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ドメインの溶液を調製し、それを膜に添加した。遮光しながらＰｏｌｙｍａｘ１０４０揺動テーブル上で、１時間、膜のインキュベーションを行った。インキュベーション経過後に、膜をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄することにより過剰の標識蛋白質を除去した。最後に、Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーを、４００Ｖ、Ｃｙ３の波長（５３２ｎｍ）で用いて、膜の蛍光値を測定した。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔソフトウェアを用いて、スクリーニングのＴＩＦ画像およびＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２を有するペプチドの蛍光値についてのファイルを作成した。次いで、ＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に対してスクリーニングしたペプチドの蛍光値から、ブランクを減算した。
膜を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間、インキュベートした。インキュベーション経過後に、膜を乾燥させてから、Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーを４００Ｖ、Ｃｙ３の波長（５３２ｎｍ）で用いてスキャンを行った。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔソフトウェアを用いて、スクリーニングのＴＩＦファイルおよびブランク値のファイルを作成した。その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）＋０．５％ＢＳＡを用いて、５０ｎＭのＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ドメインの溶液を調製し、それを膜に添加した。遮光しながらＰｏｌｙｍａｘ１０４０揺動テーブル上で、１時間、膜のインキュベーションを行った。インキュベーション経過後に、膜をＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄することにより過剰の標識蛋白質を除去した。最後に、Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーを、４００Ｖ、Ｃｙ３の波長（５３２ｎｍ）で用いて、膜の蛍光値を測定した。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔソフトウェアを用いて、スクリーニングのＴＩＦ画像およびＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２を有するペプチドの蛍光値についてのファイルを作成した。次いで、ＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に対してスクリーニングしたペプチドの蛍光値から、ブランクを減算した。
【0139】
蛍光分極（ＦＰ）
３８４穴プレートの形態でＦＰアッセイを実施した。Ｓａｆｉｒｅ２プレートリーダーを用いて蛍光分極を測定した。各アッセイについて、機器のＺ因子を最適化した。各Ｇ因子は、初期のミリ分極値２０に較正した。環状ｎＮＯＳβヘアピンＴＡＭＲＡプローブについての波長は：ｅｘ：５３０ｎｍおよびｅｍ：５８０ｎｍであった。各測定は、ｐＨ７．２、２５℃で、５０ｍＭのＮａＰＩ、５０ｍＭのＮａＣｌおよび１％ＢＳＡを含む溶液を用いて行った。５０ｎＭの環状ｎＮＯＳβヘアピンＴＡＭＲＡのプローブを滴定して選択蛋白質の１：１希釈曲線を作成することにより、蛍光分極飽和アッセイを実施した。この曲線を３回作成した。次いで、Ｐｒｉｓｍソフトウェア８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、分極を１部位結合モデルにフィッティングさせた；これによって、Ｋｄを測定することができる。予め調製した蛋白質／プローブ複合体を既定濃度（５０μＭ／５０ｎＭ）で、０．１～２５２μＭの範囲で異なる濃度の非標識ペプチドと混合することにより、蛍光分極の競争実験を実施した。ミリ分極（ｍＰ）値をペプチド濃度の関数としてプロットし、Ｐｒｉｓｍソフトウェア８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてＳ字状用量応答曲線にフィッティングさせた。Ｋｉ値を、Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ－Ｃｏｌｅｓｋａ Ｚ．ら４０－４１にしたがって算出した。
３８４穴プレートの形態でＦＰアッセイを実施した。Ｓａｆｉｒｅ２プレートリーダーを用いて蛍光分極を測定した。各アッセイについて、機器のＺ因子を最適化した。各Ｇ因子は、初期のミリ分極値２０に較正した。環状ｎＮＯＳβヘアピンＴＡＭＲＡプローブについての波長は：ｅｘ：５３０ｎｍおよびｅｍ：５８０ｎｍであった。各測定は、ｐＨ７．２、２５℃で、５０ｍＭのＮａＰＩ、５０ｍＭのＮａＣｌおよび１％ＢＳＡを含む溶液を用いて行った。５０ｎＭの環状ｎＮＯＳβヘアピンＴＡＭＲＡのプローブを滴定して選択蛋白質の１：１希釈曲線を作成することにより、蛍光分極飽和アッセイを実施した。この曲線を３回作成した。次いで、Ｐｒｉｓｍソフトウェア８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、分極を１部位結合モデルにフィッティングさせた；これによって、Ｋｄを測定することができる。予め調製した蛋白質／プローブ複合体を既定濃度（５０μＭ／５０ｎＭ）で、０．１～２５２μＭの範囲で異なる濃度の非標識ペプチドと混合することにより、蛍光分極の競争実験を実施した。ミリ分極（ｍＰ）値をペプチド濃度の関数としてプロットし、Ｐｒｉｓｍソフトウェア８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてＳ字状用量応答曲線にフィッティングさせた。Ｋｉ値を、Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ－Ｃｏｌｅｓｋａ Ｚ．ら４０－４１にしたがって算出した。
【0140】
等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）
細孔径０．２２μＭのコーニング（登録商標）ボトルトップ真空フィルターシステムで濾過した５０ｎＭのＮａＰｉ、５０ｎＭのＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．２）を用いてペプチドを溶解し、ＩＴＣアッセイを実施した。蛋白質を、この緩衝液に対して透析したが、その際に、ＭＷＣＯ ３０００ＤａのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニットを用いた。ＩＴＣ２００で、このアッセイを実施した。その機器の電力差分（ＤＰ）を１０に設定し、注射筒回転速度は６００ＲＰＭに設定した。アッセイの準備は、セルの内部に蛋白質を入れ、注射筒にペプチド（滴定剤）をセットする工程から成るものであった。２５℃にて熱量測定を行った。各分析を３回繰り返した。さらに、注入余熱を除去する目的で、ペプチドを緩衝液に送る操作を複数回に分けて行った。各回の分析は、Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）を用いて行った。
細孔径０．２２μＭのコーニング（登録商標）ボトルトップ真空フィルターシステムで濾過した５０ｎＭのＮａＰｉ、５０ｎＭのＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．２）を用いてペプチドを溶解し、ＩＴＣアッセイを実施した。蛋白質を、この緩衝液に対して透析したが、その際に、ＭＷＣＯ ３０００ＤａのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニットを用いた。ＩＴＣ２００で、このアッセイを実施した。その機器の電力差分（ＤＰ）を１０に設定し、注射筒回転速度は６００ＲＰＭに設定した。アッセイの準備は、セルの内部に蛋白質を入れ、注射筒にペプチド（滴定剤）をセットする工程から成るものであった。２５℃にて熱量測定を行った。各分析を３回繰り返した。さらに、注入余熱を除去する目的で、ペプチドを緩衝液に送る操作を複数回に分けて行った。各回の分析は、Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）を用いて行った。
【0141】
結晶学的スクリーニング
環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチド（ＷＴ）および２か所に置換を有する変異体（Ｔ１１２Ｗ Ｔ１１６Ｅ）と共に、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２蛋白質を４℃で共インキュベートした。ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２の濃度は常に１５ｍｇ／ｍＬに設定し、異なる比率の環状ペプチド（１．５、５または１０当量）をスクリーニングした。スクリーニングは、３：１の１μＬコニカル平底を有する９６穴ＣＯＣ蛋白質結晶化マイクロプレートを用いるシッティングドロップ法で実施した。スクリーニングで形成された結晶は、液体窒素による瞬間凍結の前に、ポリエチレングリコール４００ ＰＥＧ４００）に浸漬した。回折データの取得は、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、ビームラインＳＬＳ ＰＸ Ｘ０６Ｓで行い、Ａｉｍｌｅｓｓ（ＣＣＰ４スイート）で処理した４２。分子置換および構造精密化には、ＰＨＡＳＥＲを用いた（Ｐｈｅｎｉｘソフトウェア）４３。ｎＮＯＳ－ＰＤＺ／シントロフィン－１－ＰＤＺ の結晶構造（ＰＤＢ：１ＱＡＶ）４４を用い、Ｃｈｉｍｅｒａソフトウェア（ＵＳＣＦ Ｃｈｉｍｅｒａ） ４５で探索モデルを作成した。ＰＤＢ ＯｎｅＤｅｐ検証サーバーで、結晶構造を検証した。
環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチド（ＷＴ）および２か所に置換を有する変異体（Ｔ１１２Ｗ Ｔ１１６Ｅ）と共に、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２蛋白質を４℃で共インキュベートした。ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２の濃度は常に１５ｍｇ／ｍＬに設定し、異なる比率の環状ペプチド（１．５、５または１０当量）をスクリーニングした。スクリーニングは、３：１の１μＬコニカル平底を有する９６穴ＣＯＣ蛋白質結晶化マイクロプレートを用いるシッティングドロップ法で実施した。スクリーニングで形成された結晶は、液体窒素による瞬間凍結の前に、ポリエチレングリコール４００ ＰＥＧ４００）に浸漬した。回折データの取得は、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、ビームラインＳＬＳ ＰＸ Ｘ０６Ｓで行い、Ａｉｍｌｅｓｓ（ＣＣＰ４スイート）で処理した４２。分子置換および構造精密化には、ＰＨＡＳＥＲを用いた（Ｐｈｅｎｉｘソフトウェア）４３。ｎＮＯＳ－ＰＤＺ／シントロフィン－１－ＰＤＺ の結晶構造（ＰＤＢ：１ＱＡＶ）４４を用い、Ｃｈｉｍｅｒａソフトウェア（ＵＳＣＦ Ｃｈｉｍｅｒａ） ４５で探索モデルを作成した。ＰＤＢ ＯｎｅＤｅｐ検証サーバーで、結晶構造を検証した。
【0142】
円偏光二色性（ＣＤ）
１ｍｍ光路長の石英セルを用いたＪａｓｃｏ Ｊ－１５００円偏光二色性分光法測定装置により、全ＣＤスペクトルを収集した。蛋白質試料は、５０ｍＭ ＮａＰｉ、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．２）中で、約２０μＭの濃度とした。データを楕円率ミリ度で取得してから、平均残基楕円率に変換した。
１ｍｍ光路長の石英セルを用いたＪａｓｃｏ Ｊ－１５００円偏光二色性分光法測定装置により、全ＣＤスペクトルを収集した。蛋白質試料は、５０ｍＭ ＮａＰｉ、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．２）中で、約２０μＭの濃度とした。データを楕円率ミリ度で取得してから、平均残基楕円率に変換した。
【0143】
非天然アミノ酸（ＵＡＡ）のインシリコ選択
ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２の結合ポケットに環状ｎＮＯＳβヘアピンを格納するため、ｎＮＯＳ／シントロフィン－１複合体（ＰＤＢ：１ＱＡＶ）４４をＰＳＤ－９５－ＰＤＺ１－２の構造（ＰＤＢ：３ＧＬＳ）に重ね合わせた４６。シントロフィンの２つのＰＤＺドメインを、ＰＤＳ－９５－ＰＤＺ－２の２つのＰＤＺドメインに交換した。ｎＮＯＳペプチドを、Ｍａｅｓｔｒｏ２０１８－４の３Ｄビルダーツールで環化し、環化に関与する残基を最小化した。ＯＰＬＳ３ｅ力場を用いたＴＩＰ３Ｐ水モデルにより、３００Ｋでの１μｓ分子動力学シミュレーションを実施した；これには、Ｄｅｓｍｏｎｄ５．６を用いた。まず、２００ｎｓの軌道については、平衡状態を得るために利用してから切り捨てた。ＧＲＯＭＡＣＳ２０１８－３のｇｒｏｍｏｓクラスタリングを用いて、ＲＭＳＤカットオフを０．０８ｎｍとし、残りの８００ｎｓのフレームをクラスター化した。ＵＡＡスキャンのために、３つの最大クラスターの代表的な構造を選択した。
ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２の結合ポケットに環状ｎＮＯＳβヘアピンを格納するため、ｎＮＯＳ／シントロフィン－１複合体（ＰＤＢ：１ＱＡＶ）４４をＰＳＤ－９５－ＰＤＺ１－２の構造（ＰＤＢ：３ＧＬＳ）に重ね合わせた４６。シントロフィンの２つのＰＤＺドメインを、ＰＤＳ－９５－ＰＤＺ－２の２つのＰＤＺドメインに交換した。ｎＮＯＳペプチドを、Ｍａｅｓｔｒｏ２０１８－４の３Ｄビルダーツールで環化し、環化に関与する残基を最小化した。ＯＰＬＳ３ｅ力場を用いたＴＩＰ３Ｐ水モデルにより、３００Ｋでの１μｓ分子動力学シミュレーションを実施した；これには、Ｄｅｓｍｏｎｄ５．６を用いた。まず、２００ｎｓの軌道については、平衡状態を得るために利用してから切り捨てた。ＧＲＯＭＡＣＳ２０１８－３のｇｒｏｍｏｓクラスタリングを用いて、ＲＭＳＤカットオフを０．０８ｎｍとし、残りの８００ｎｓのフレームをクラスター化した。ＵＡＡスキャンのために、３つの最大クラスターの代表的な構造を選択した。
【0144】
Ｍａｅｓｔｒｏの残基スキャニングプロトコルを用いて、精緻化距離カットオフを４．５Åとし、主鎖最小化による側鎖予測で、選択構造のＵＡＡスキャンを実施した。ＭｏｌＰｏｒｔ（２０１９－０３－０１）において利用可能な全てのＦｍｏｃ保護アミノ酸を含むライブラリーを用いて、Ｃαの立体化学を特定した。プロトン化状態を評価するため、残基を付加する前に、ｐＨ７．４＋／－２．０のＬｉｇＰｒｅｐを用いた。ライブラリーの最終サイズには異なる５４２アミノ酸が含まれていた。３種類の代表的構造のうち少なくとも２種類において、ΔΔＧ親和性の値＜－５ｋＪｍｏｌ－１Ｋ－１およびΔΔＧ安定性＜０ｋＪｍｏｌ－１Ｋ－１であるＵＡＡスキャンのヒットは、目視検査に基づいて選択した。
【0145】
ダイナビーズ（商標）Ｍ－２７０アミンのペプチド標識
チオエーテル結合により、ペプチドをダイナビーズ（商標）Ｍ－２７０アミンに結合させた。１．５ｍＬの安全ロック付きチューブ中で、ＤＭＦ（２ｘ１ｍＬ）を用いてダイナビーズ（商標）（プルダウン実験当たりの懸濁液１０μＬ）を洗浄した。その後、０．１Ｍ無水ブロモ酢酸および５％ＤＩＰＥＡを含むＤＭＦ中で、ダイナビーズ（商標）を室温で１時間インキュベートした。ダイナビーズ（商標）をＤＭＦ（２ｘ１ｍＬ）で洗浄し、ＤＭＦ中の可溶化ペプチドと共に（１ｍＬのＤＭＦ中で、２００μＬのダイナビーズ（商標）懸濁液当たり１２０μｇのペプチド）室温で３時間インキュベートした。その上清を除去しビーズをＤＭＦ（２ｘ１ｍＬ）で洗浄してから、０．１Ｍのβメルカプトエタノールおよび５％ＤＩＰＥＡを含むＤＭＦ（１ｍＬ）中で室温１時間のインキュベーションを行った。その後、上清を除去しビーズをＤＭＦ（２回、１ｍＬ）およびＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（３回、１ｍＬ）で洗浄した。標識ペプチドダイナビーズ（商標）をＰＢＳ緩衝液に入れ（１０μＬの出発懸濁液につき１０μＬのＰＢＳ緩衝液）、４℃で保存した。
チオエーテル結合により、ペプチドをダイナビーズ（商標）Ｍ－２７０アミンに結合させた。１．５ｍＬの安全ロック付きチューブ中で、ＤＭＦ（２ｘ１ｍＬ）を用いてダイナビーズ（商標）（プルダウン実験当たりの懸濁液１０μＬ）を洗浄した。その後、０．１Ｍ無水ブロモ酢酸および５％ＤＩＰＥＡを含むＤＭＦ中で、ダイナビーズ（商標）を室温で１時間インキュベートした。ダイナビーズ（商標）をＤＭＦ（２ｘ１ｍＬ）で洗浄し、ＤＭＦ中の可溶化ペプチドと共に（１ｍＬのＤＭＦ中で、２００μＬのダイナビーズ（商標）懸濁液当たり１２０μｇのペプチド）室温で３時間インキュベートした。その上清を除去しビーズをＤＭＦ（２ｘ１ｍＬ）で洗浄してから、０．１Ｍのβメルカプトエタノールおよび５％ＤＩＰＥＡを含むＤＭＦ（１ｍＬ）中で室温１時間のインキュベーションを行った。その後、上清を除去しビーズをＤＭＦ（２回、１ｍＬ）およびＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（３回、１ｍＬ）で洗浄した。標識ペプチドダイナビーズ（商標）をＰＢＳ緩衝液に入れ（１０μＬの出発懸濁液につき１０μＬのＰＢＳ緩衝液）、４℃で保存した。
【0146】
マウス全脳の溶解
成獣マウスの脳（平均質量：０．４ｇ）を均一化緩衝液に入れ、１５ｍＬ組織破砕機を用いて、氷上でホモジナイズした［１０ｍＭ ＮａＣｌ、３２０ｍＭスクロースならびにＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤およびＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）ホスファターゼ阻害剤を含むＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）；脳当たり１ｍＬ］。ホモジネートを、４℃、１０００ｇ（ＭＵＬＴＩＦＵＧＥ ３Ｌ－Ｒ）で１０分間遠心分離し、その上清を新しいチューブに移した。上清を、４℃、１８５００ｇで４５分間遠心分離した。上清Ｓ－Ｆｒａｃを回収した（注記：「Ｓ－Ｆｒａｃ」は、細胞質蛋白質を含む）。濃度測定を行い、２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、１ｍＬずつ分注したものを－８０℃で保存した。沈殿物については、除去した上清１ｍＬ当たり、１ｍＬの５０％均一化緩衝液および５０％界面活性剤緩衝液［１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８）、２％（ｗ／ｖ）デソキシコール酸ナトリウム］に再懸濁してから、４℃で１時間インキュベートした。４℃、２０８１７ｇで４５分間の遠心分離（エッペンドルフ遠心チューブ５４２７Ｒ）により、不溶性蛋白質を除去した。上清Ｍ－Ｆｒａｃ（注記：「Ｍ－Ｆｒａｃ」は、膜結合蛋白質および膜貫通蛋白質ならびに膜結合蛋白質複合体を含む）を回収し、その濃度を測定した；２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈してから、１ｍＬずつ分注したものを－８０℃で保存した。
成獣マウスの脳（平均質量：０．４ｇ）を均一化緩衝液に入れ、１５ｍＬ組織破砕機を用いて、氷上でホモジナイズした［１０ｍＭ ＮａＣｌ、３２０ｍＭスクロースならびにＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤およびＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）ホスファターゼ阻害剤を含むＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）；脳当たり１ｍＬ］。ホモジネートを、４℃、１０００ｇ（ＭＵＬＴＩＦＵＧＥ ３Ｌ－Ｒ）で１０分間遠心分離し、その上清を新しいチューブに移した。上清を、４℃、１８５００ｇで４５分間遠心分離した。上清Ｓ－Ｆｒａｃを回収した（注記：「Ｓ－Ｆｒａｃ」は、細胞質蛋白質を含む）。濃度測定を行い、２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、１ｍＬずつ分注したものを－８０℃で保存した。沈殿物については、除去した上清１ｍＬ当たり、１ｍＬの５０％均一化緩衝液および５０％界面活性剤緩衝液［１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８）、２％（ｗ／ｖ）デソキシコール酸ナトリウム］に再懸濁してから、４℃で１時間インキュベートした。４℃、２０８１７ｇで４５分間の遠心分離（エッペンドルフ遠心チューブ５４２７Ｒ）により、不溶性蛋白質を除去した。上清Ｍ－Ｆｒａｃ（注記：「Ｍ－Ｆｒａｃ」は、膜結合蛋白質および膜貫通蛋白質ならびに膜結合蛋白質複合体を含む）を回収し、その濃度を測定した；２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈してから、１ｍＬずつ分注したものを－８０℃で保存した。
【0147】
親和性精製
２０μｇのペプチド標識ダイナビーズ（商標）を５００μＬのＰＢＳ緩衝液に添加した。上清を除去し、２ｍｇ／ｍＬの脳溶解物（Ｓ－ＦｒａｃまたはＭ－Ｆｒａｃ）１ｍＬと共に、４～１０℃で２時間インキュベートした。上清を除去し、洗浄緩衝液Ｉ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＨ２Ｏ；２回、１ｍＬ］および洗浄緩衝液ＩＩ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＨ２Ｏ；２回、１ｍＬ］で洗浄した。次いで、２０μＬの２ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁してチューブに入れ、９５℃で１０分間インキュベートした。
２０μｇのペプチド標識ダイナビーズ（商標）を５００μＬのＰＢＳ緩衝液に添加した。上清を除去し、２ｍｇ／ｍＬの脳溶解物（Ｓ－ＦｒａｃまたはＭ－Ｆｒａｃ）１ｍＬと共に、４～１０℃で２時間インキュベートした。上清を除去し、洗浄緩衝液Ｉ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＨ２Ｏ；２回、１ｍＬ］および洗浄緩衝液ＩＩ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＨ２Ｏ；２回、１ｍＬ］で洗浄した。次いで、２０μＬの２ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁してチューブに入れ、９５℃で１０分間インキュベートした。
【0148】
ＭＳによるプルダウン実験の分析
プルダウン／２ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液混合物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ ｘ １２ウェル）に載せた。その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＭＯＰＳ緩衝液およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｎｏｖｅｘミニセルを用いて、試料がゲル内に入るまで（おおよそ５分）、８０ＶでＳＤＳゲルの泳動を行った。次いで、ゲルをＨ２Ｏ（５０ｍＬ）で５分間洗浄し、次に、Ｉｍｐｅｒｉａｌ（商標）蛋白質染色（５０ｍＬ）と共に一晩インキュベートした。このゲルをＨ２Ｏで洗浄した（３回、５０ｍＬで各３０分間）。バンドの抽出を行い、それぞれ別々に９６穴プレートに移した。最初に２回の洗浄を行ったが、この洗浄は０．１Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（５０：５０、１００μＬ／ウェル）でそれぞれ１０分間インキュベートすることによって実施した。その後、まず０．１Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ（５０μＬ／ウェル）でゲルをインキュベートした。５分後に、ＭｅＣＮ（５０μＬ／ウェル）を添加して、さらに１５分間インキュベートした。Ｉｍｐｅｒｉａｌ（商標）染色が消えるまで、この洗浄処理を繰り返した。次いで、ゲルを１０ｍＭのＤＴＴと共にインキュベートして、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（１００μＬ／ウェル）を含むＨ２Ｏに溶解した。これを、５６℃のＥｃｈｏｔｅｒｍ（商標）加熱プレート上で４５分間インキュベートした。その後、この溶液を、０．２５Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏに溶解した５５ｍＭヨードアセトアミド（１００μＬ／ウェル）で迅速に置換して、遮光下で３０分間インキュベートした。その後、０．２５Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（５０：５０、１００μＬ／ウェル）で各５分間、ゲルを洗浄した。次に、１２．５ｎｇの修飾トリプシン（ブタ）および０．２５Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏを添加した（７５μＬ／ウェル；１２．５ｎｇ／μＬ）。次いで、まずプレートを氷上で１５分間インキュベートし、次に、３７℃で一晩インキュベートした。消化を行うために、５％のギ酸を含むＨ２Ｏ（７５μＬ／ウェル）を添加し、Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ（商標）超音波浴中で５分間インキュベートした。その上清を０．５ｍＬの安全ロック付きチューブに移した。その後、５％のギ酸を含むＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（４０：６０、７５μＬ／ウェル）でゲルを２回抽出した。画分を組み合わせてから凍結乾燥した。この試料を、０．１％ＴＦＡと４％ＭｅＣＮの混合液に再可溶化し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析計、前段カラムＰｅｐＭａｐ（商標）１００（１００μｍ ｘ ２ｃｍ、ｎａｎｏＶｉｐｅｒ、Ｃ１８，５μｍ、１００Å）およびカラムＰｅｐＭａｐ（商標）ＲＳＬＣ Ｃ１８（２μｍ、１００Å、７５μｍ ｘ ５０ｃｍ、３７℃）を備えたＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ＵＨＰＬＣシステムで分析した。この分離法は、二成分緩衝液系［Ａ：ＴＦＡ／ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ、０．５／２／９７．５およびＢ：ギ酸／ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ、０．１／２０／７９．９］を用いて０．３ｍＬ／分の流速で実施した。２段階直線勾配（４～２５％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ； ０．１％ギ酸、４０分間、および２５～５０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ； ０．１％ギ酸、１０分間）で分析カラムからペプチドを溶出した。
プルダウン／２ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液混合物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ ｘ １２ウェル）に載せた。その後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＭＯＰＳ緩衝液およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｎｏｖｅｘミニセルを用いて、試料がゲル内に入るまで（おおよそ５分）、８０ＶでＳＤＳゲルの泳動を行った。次いで、ゲルをＨ２Ｏ（５０ｍＬ）で５分間洗浄し、次に、Ｉｍｐｅｒｉａｌ（商標）蛋白質染色（５０ｍＬ）と共に一晩インキュベートした。このゲルをＨ２Ｏで洗浄した（３回、５０ｍＬで各３０分間）。バンドの抽出を行い、それぞれ別々に９６穴プレートに移した。最初に２回の洗浄を行ったが、この洗浄は０．１Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（５０：５０、１００μＬ／ウェル）でそれぞれ１０分間インキュベートすることによって実施した。その後、まず０．１Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ（５０μＬ／ウェル）でゲルをインキュベートした。５分後に、ＭｅＣＮ（５０μＬ／ウェル）を添加して、さらに１５分間インキュベートした。Ｉｍｐｅｒｉａｌ（商標）染色が消えるまで、この洗浄処理を繰り返した。次いで、ゲルを１０ｍＭのＤＴＴと共にインキュベートして、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（１００μＬ／ウェル）を含むＨ２Ｏに溶解した。これを、５６℃のＥｃｈｏｔｅｒｍ（商標）加熱プレート上で４５分間インキュベートした。その後、この溶液を、０．２５Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏに溶解した５５ｍＭヨードアセトアミド（１００μＬ／ウェル）で迅速に置換して、遮光下で３０分間インキュベートした。その後、０．２５Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（５０：５０、１００μＬ／ウェル）で各５分間、ゲルを洗浄した。次に、１２．５ｎｇの修飾トリプシン（ブタ）および０．２５Ｍ重炭酸アンモニウムを含むＨ２Ｏを添加した（７５μＬ／ウェル；１２．５ｎｇ／μＬ）。次いで、まずプレートを氷上で１５分間インキュベートし、次に、３７℃で一晩インキュベートした。消化を行うために、５％のギ酸を含むＨ２Ｏ（７５μＬ／ウェル）を添加し、Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ（商標）超音波浴中で５分間インキュベートした。その上清を０．５ｍＬの安全ロック付きチューブに移した。その後、５％のギ酸を含むＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ（４０：６０、７５μＬ／ウェル）でゲルを２回抽出した。画分を組み合わせてから凍結乾燥した。この試料を、０．１％ＴＦＡと４％ＭｅＣＮの混合液に再可溶化し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析計、前段カラムＰｅｐＭａｐ（商標）１００（１００μｍ ｘ ２ｃｍ、ｎａｎｏＶｉｐｅｒ、Ｃ１８，５μｍ、１００Å）およびカラムＰｅｐＭａｐ（商標）ＲＳＬＣ Ｃ１８（２μｍ、１００Å、７５μｍ ｘ ５０ｃｍ、３７℃）を備えたＵｌｔｉＭａｔｅ（商標）３０００ＵＨＰＬＣシステムで分析した。この分離法は、二成分緩衝液系［Ａ：ＴＦＡ／ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ、０．５／２／９７．５およびＢ：ギ酸／ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ、０．１／２０／７９．９］を用いて０．３ｍＬ／分の流速で実施した。２段階直線勾配（４～２５％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ； ０．１％ギ酸、４０分間、および２５～５０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ； ０．１％ギ酸、１０分間）で分析カラムからペプチドを溶出した。
【0149】
実施例２：環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの開発
まず、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドであるシクロ－（Ｃ１０５ＴＨＬＥＴＴＦＴＧＤＧＴＰＫＴＩＲＶＴＱ１２４ｐＧ）（配列番号：４２８）を、上記のように天然の化学ライゲーション（ＮＣＬ）を用いて合成した。次いで、このペプチドを、そのシステインの遊離チオール基を介してＴＡＭＲＡマレイミドで標識した。次に、組換え技術によって発現させた３種類のＰＳＤ－９５－ＰＤＺ１、２および３ドメインに対して、環化蛍光色素分子結合ペプチドを上記のようなＦＰ飽和アッセイで試験した。その結果、環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドは、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ１および２に結合し、そのＫｄはそれぞれ３．４ ± ０．３μＭおよび１．０±０．１μＭであったが、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ３に対しては弱い結合親和性（Ｋｄ＝５２．０±１０．５μＭ）を示すのみであることが、明らかになった。
まず、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドであるシクロ－（Ｃ１０５ＴＨＬＥＴＴＦＴＧＤＧＴＰＫＴＩＲＶＴＱ１２４ｐＧ）（配列番号：４２８）を、上記のように天然の化学ライゲーション（ＮＣＬ）を用いて合成した。次いで、このペプチドを、そのシステインの遊離チオール基を介してＴＡＭＲＡマレイミドで標識した。次に、組換え技術によって発現させた３種類のＰＳＤ－９５－ＰＤＺ１、２および３ドメインに対して、環化蛍光色素分子結合ペプチドを上記のようなＦＰ飽和アッセイで試験した。その結果、環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドは、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ１および２に結合し、そのＫｄはそれぞれ３．４ ± ０．３μＭおよび１．０±０．１μＭであったが、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ３に対しては弱い結合親和性（Ｋｄ＝５２．０±１０．５μＭ）を示すのみであることが、明らかになった。
【0150】
すなわち、ＴＡＭＲＡで標識した環状ペプチドシクロ－（ＣＴＨＬＥＴＴＦＴＧＤＧＴＰＫＴＩＲＶＴＱｐＧ）（配列番号：４２８）は、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ１および２に結合するが、ここで、配列ＴＨＬＥＴＴＦＴＧＤＧＴＰＫＴＩＲＶＴＱ（配列番号：４２９）は、天然ｎＮＯＳの１０５～１２４位に対応している。
【0151】
実施例３：環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドは、直鎖状ペプチドと比較して、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に対して優れた親和性を有している
ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの環化が、ＰＤＺ２に対する結合親和性の保持に必要であるか否かを調べるために、自由Ｃ末端を有する直鎖型ｎＮＯＳペプチドを合成した。環状および直鎖状ｎＮＯＳペプチド類似体（図２）の両方に関して、上記のような方法でＩＴＣ実験を行った。その結果、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドは、２．２±０．３μＭの親和性でＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に結合し、これはＦＰによる測定と同一範囲内にあることが示された。対照的に直鎖ペプチドは、いずれの試験濃度（最大で１００μＭ）においても結合を示さなかった。
ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの環化が、ＰＤＺ２に対する結合親和性の保持に必要であるか否かを調べるために、自由Ｃ末端を有する直鎖型ｎＮＯＳペプチドを合成した。環状および直鎖状ｎＮＯＳペプチド類似体（図２）の両方に関して、上記のような方法でＩＴＣ実験を行った。その結果、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドは、２．２±０．３μＭの親和性でＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に結合し、これはＦＰによる測定と同一範囲内にあることが示された。対照的に直鎖ペプチドは、いずれの試験濃度（最大で１００μＭ）においても結合を示さなかった。
【0152】
実施例４：ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの環化に関する様々な方略
ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの環化に関する４種類の方略について試験を行ったが、これらは、チオエーテル架橋型類似体などの側鎖、ラクタムＧｌｕ側鎖、ラクタムＡｓｐ側鎖、およびＧｌｕ主鎖環化ペプチドを用いることを含むものであった。ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの環状ｎＮＯＳβヘアピン変異体を樹脂上で合成し、上記のようなＦＰ競争アッセイを用いて評価した。興味深いことに、試験した環化方略のうち３種類では、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ドメインに対する結合親和性が僅かに減少する結果となった；表Ｅ１および図３を参照のこと。
ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの環化に関する４種類の方略について試験を行ったが、これらは、チオエーテル架橋型類似体などの側鎖、ラクタムＧｌｕ側鎖、ラクタムＡｓｐ側鎖、およびＧｌｕ主鎖環化ペプチドを用いることを含むものであった。ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの環状ｎＮＯＳβヘアピン変異体を樹脂上で合成し、上記のようなＦＰ競争アッセイを用いて評価した。興味深いことに、試験した環化方略のうち３種類では、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ドメインに対する結合親和性が僅かに減少する結果となった；表Ｅ１および図３を参照のこと。
【0153】
【表2】
【0154】
チオエーテル架橋型類似体などの側鎖、ラクタムＧｌｕ側鎖およびＡｓｐ側鎖を用いる方略では、いずれもＮＣＬペプチドと比較してペプチド結合親和性が２倍～３倍低下した。Ｇｌｕ主鎖環化ペプチドについては、ＮＣＬペプチドと同一範囲の結合親和性（Ｋｉ＝１．５±０．２μＭ）を示した。
【0155】
実施例５：ＳＰＯＴアレイにおけるβヘアピン領域の網羅的突然変異スキャン
ＳＰＯＴペプチドアレイを用いて、ＮＯＳβヘアピン領域（１０５ＴＨＬＥＴＴＦＴＧＤＧＴＰＫＴＩＲＶＴＱ１２４、配列番号：４２９）の各ＡＡの重要度を検索した。
ＳＰＯＴペプチドアレイを用いて、ＮＯＳβヘアピン領域（１０５ＴＨＬＥＴＴＦＴＧＤＧＴＰＫＴＩＲＶＴＱ１２４、配列番号：４２９）の各ＡＡの重要度を検索した。
【0156】
実施例４に記載の、得られた結果に基づいて、野生型（ＷＴ）足場についてラクタムＧｌｕ主鎖を選択した。用いた樹脂はＲｉｎｋアミドＣＭ樹脂であった；すなわち、環化に用いたＧｌｕ残基は、樹脂から切断後にＧｌｎに変換した。最初のＡＡは、作業の単純化のために配列（Ｅα）に残したままにした。
【0157】
ＷＴ足場について、残りの１９個のＬ－ＡＡを各ＡＡに交換することによって、網羅的突然変異スキャンを実施した。技術的な観点から重複測定として、各アレイには個々のペプチドを３コピー含めた。さらに、その設計には３種類の対照を含めた：すなわち、環状ｎＮＯＳβヘアピンＷＴ対照（陽性対照）、直鎖状ｎＮＯＳペプチド（環化対照）、およびＦ１１１Ｖ置換を有する環状ｎＮＯＳβヘアピン（上記のＦＰ競争アッセイで試験した陰性対照）である。アレイスクリーニングについては、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２の残基Ｖ１７８に突然変異（ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２－Ｖ１７８Ｃ）を導入した後、ＴＡＭＲＡマレイミドで標識した。次いで、ＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２－Ｖ１７８Ｃドメインで合成ペプチドアレイをスクリーニングし、個々のペプチドについて得られた蛍光強度をＷＴペプチドの値に対して正規化した。最終データを、網羅的突然変異スキャンのペプチド変異体に関する正規化蛍光強度ヒートマップで表す（図４）。
【0158】
ＳＰＯＴについて得られた蛍光強度に基づいて、最も有望な５７種類の環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチド類似体について合成を再び行い、また特徴付けも行った（下の表２）。
【0159】
ＦＰによる個々のペプチドのＫｉ値を、ＷＴペプチドのＫｉデータに対して正規化した（図５Ａ～Ｂ）。次いで、このデータを正規化ＳＰＯＴ蛍光値に相関させた。ＦＰ結合およびＳＰＯＴ蛍光値は、アラニンスキャンに関して良好に相関した（ピアソンの相関係数の２乗値である決定係数Ｒ２は７５％）。しかし、試験した全ての異なる置換（異なる位置の異なる修飾に対応する５７ペプチド）を含めた場合には、ピアソンＲ２は５２％に低下した。観察されたこのような低下は、支持体上で環化が起こった時の環化収量の差によって説明することもできる。例えば、導入したＡＡ側鎖の性質（大きさ、正に荷電した／負に荷電した、等々）、挿入したＡＡの保護基の大きさおよび／またはヘアピン構造内の突然変異位置（例えば、ループ領域内）は、環化収量に影響を与え得る。ＳＰＯＴアレイの結果は粗ペプチドのスクリーニングおよび蛍光強度に基づくものであるため、予見できない不純物／切断物が、偽陽性または偽陰性（ＷＴよりも環化収量が高い／低い変異）を与える可能性もある。したがって、ＳＰＯＴの結合データを精製ペプチドのＫｉ値と比較する場合には、ある程度の矛盾が予想される。
【0160】
【表3】
【0161】
結論としては、１０７ＬＥＴＴＦ１１１（配列番号：４３４）、Ｇ１１３、Ｐ１１７およびＴ１１９をホットスポット残基として同定し、またＴ１１２Ｗ、Ｇ１１５Ａ／ＰおよびＴ１１６Ｅ／Ｄを環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの最も有望な置換として同定した。
【0162】
実施例６：環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドに関するホットスポット残基のアラニンスキャニングおよび突然変異試験
実施例５の網羅的突然変異スキャンの結果を検証する目的、および非標準結合機序についての見通しをさらに得る目的で、アラニンスキャンを実施し、またそのスキャンから最も妥当な残基におけるさらなる選択的置換を判定した。上記のような方法で、ペプチドを合成してＦＰアッセイを行った。
実施例５の網羅的突然変異スキャンの結果を検証する目的、および非標準結合機序についての見通しをさらに得る目的で、アラニンスキャンを実施し、またそのスキャンから最も妥当な残基におけるさらなる選択的置換を判定した。上記のような方法で、ペプチドを合成してＦＰアッセイを行った。
【0163】
実施したＡｌａスキャン（下の表３を参照のこと）についてのＦＰ（競争）結果を、網羅的位置スキャンの結果に沿って図６に示す。Ｅ１０８、Ｔ１０９、Ｆ１１１およびＴ１１９は、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に結合する際の最も重要な側鎖相互作用であることが示される。Ｅ１０８は、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２のβＢおよびβＣの、Ｔ１９２またはＳ１７３などのＡＡに結合している（図６Ｃ）。Ｔ１０９は、内部結合モチーフ（－Ｔ－ｘ－Ｆ－）の一部であり、Ｈ結合によってｎＮＯＳβヘアピンの逆平行β鎖に位置するＴ１１９の側鎖と分子間相互作用する（図６Ｄ）。これは、右方向の配向を取るＴ１０９がその側鎖によって、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ αＢのＨ２２５との相互作用を可能にし、Ｔ１１９Ａが親和性を僅かに減少させる（Ｋｉ＝１７．００±１．６７μＭ）のであるが、他方Ｔ１０９Ａは環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチド／ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２結合を消失させることの理由を説明する。
【0164】
【表4】
【0165】
さらに、Ｓｅｒ、ＡｓｎまたはＴｈｒ立体異性体Ａｌｌｏ－Ｔｈｒなどの複数の置換を導入することにより、分子内Ｔ１０９－Ｔ１１９相互作用を調べた。Ｔ１０９位におけるＳｅｒ置換およびＡｓｎ置換は、環状ペプチドの親和性をそれぞれ７倍および１９倍低下させたが、一方で、Ｔ１１９におけるＳｅｒ置換は親和性を２５倍低下させた。興味深いことに、Ｔ１０９位におけるＡｌｌｏ－Ｔｈｒ置換は、相互作用を消失させることが可能であった（下の表４）。最後に、Ｆ１１１の側鎖は、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２の複数の残基（カルボン酸ループ内のＦ１７２ならびにαＢ内のＶ２２９およびＬ２３２）によって形成される疎水性ポケットの内部に面している（図６Ｅ）。
【0166】
【表5】
【0167】
残基Ｅ１０８、Ｔ１０９、Ｔ１１１およびＴ１１９が、環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの結合に最も重要であると結論付けられる。
【0168】
実施例７：環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドのＮ－Ｍｅスキャン
環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドのＮ－Ｍｅ類似体を、上記のようなＦＰ競争アッセイで試験した（図７Ａおよび下の表５）。Ｔ１０５のＮ－メチル化によって結合親和性が５倍減少したが（Ｋｉ＝４．８±０．１μＭ）、Ｈ１０６～Ｅ１０８のＮ－Ｍｅ変異体は相互作用を消失させた。これは、ペプチドのヘアピン折り目を安定化させる鎖間Ｈ結合が理由であると考えられる（図７Ｂ）。
環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドのＮ－Ｍｅ類似体を、上記のようなＦＰ競争アッセイで試験した（図７Ａおよび下の表５）。Ｔ１０５のＮ－メチル化によって結合親和性が５倍減少したが（Ｋｉ＝４．８±０．１μＭ）、Ｈ１０６～Ｅ１０８のＮ－Ｍｅ変異体は相互作用を消失させた。これは、ペプチドのヘアピン折り目を安定化させる鎖間Ｈ結合が理由であると考えられる（図７Ｂ）。
【0169】
【表6】
【0170】
Ｎ－Ｍｅ－Ｔ１０９もまた、内部結合モチーフ（－Ｔ－ｘ－Ｆ－）の相互作用を消失させた。Ｎ－Ｍｅ－Ｆ１１１もまた相互作用を消失させた；その理由は、相互作用に関与する主鎖Ｈ結合であって、ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２のβＢのＧ１７１とのＨ結合が喪失したからである。一方、Ｎ－Ｍｅ－Ｇ１１３の結合親和性（Ｋｉ＝６．２±０．１μＭ）に対する影響は、さほど大きなものではなかった；理由としては、その柔軟性を低下させるＧｌｙ残基のメチル基の立体障害に起因して、Ｈ結合が形成されていた可能性が考えられる。Ｔ１１９のＮ－メチル化では結合親和性が減少した（Ｋｉ＝４．９±０．１μＭ）が、Ｔ１１９は主鎖Ｈ結合には関与しないので、導入した立体障害に起因する可能性が考えられる（図７Ｂ）。対照的に、Ｎ－Ｍｅ－Ｖ１２２はＨ１０６との鎖間Ｈ結合を壊すものであるが、それはそれほど強いものではなかった（Ｋｉ＝６．２±０．１μＭ）。興味深いことに、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドの逆平行β鎖のいくつかの残基については、Ｎ－メチル化によって結合親和性が増加した；
Ｎ－Ｍｅ－Ｋ１１８（Ｋｉ＝０．５±０．１μＭ）およびＮ－Ｍｅ－Ｔ１２３（Ｋｉ＝０．６±０．１μＭ）は結合親和性を２倍改善した。
Ｎ－Ｍｅ－Ｋ１１８（Ｋｉ＝０．５±０．１μＭ）およびＮ－Ｍｅ－Ｔ１２３（Ｋｉ＝０．６±０．１μＭ）は結合親和性を２倍改善した。
【0171】
実施例８：ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２のアラニンスキャニング突然変異
この試験においては、非標準βヘアピンペプチドの結合様式を、イオンチャンネル型グルタミン酸型ＮＭＤＡＲサブユニットＧｌｕＮ２Ｂ（ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ－ＣＯＯＨ、配列番号：４３５）の標準的なＣ末端尾部と比較した。そのため、一連のＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ Ａｌａ変異体を発現させた。変異は、以下の部位に導入した：Ｋ１６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｆ１７２Ａ、Ｓ１７３Ａ、Ｎ１８０Ａ、Ｔ１９２Ａ、Ｋ１９３Ａ、Ｈ２２５Ａ、Ｅ２２６Ａ、Ｖ２２９ＡおよびＫ２３３Ａ。
この試験においては、非標準βヘアピンペプチドの結合様式を、イオンチャンネル型グルタミン酸型ＮＭＤＡＲサブユニットＧｌｕＮ２Ｂ（ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ－ＣＯＯＨ、配列番号：４３５）の標準的なＣ末端尾部と比較した。そのため、一連のＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ Ａｌａ変異体を発現させた。変異は、以下の部位に導入した：Ｋ１６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｆ１７２Ａ、Ｓ１７３Ａ、Ｎ１８０Ａ、Ｔ１９２Ａ、Ｋ１９３Ａ、Ｈ２２５Ａ、Ｅ２２６Ａ、Ｖ２２９ＡおよびＫ２３３Ａ。
【0172】
２種類の結合様式を比較するために、ＦＰ飽和アッセイにおいて、ＴＡＭＲＡ標識Ｃ末端ＧｌｕＮ２ＢペプチドおよびＴＡＭＲ標識環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドをプローブとして用いた。各突然変異について変化倍数を得るため、それぞれのＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ Ａｌａ変異体について取得した結合親和性（Ｋｄ値）をＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２ ＷＴ値に対して正規化した（図８）。
【0173】
興味深いことに、環状ペプチドは、標準的なＧｌｕＮ２Ｂ標準ペプチドとは完全に異なる結合プロファイルを示した。例えば、Ｈ２２５Ａ突然変異は、環状ｎＮＯＳβヘアピンのＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２に対する相互作用を完全に消失させた。対照的に、標準的ＧｌｕＮ２Ｂペプチドのみが、同一の突然変異で親和性について５倍の低下を示した。
【0174】
突然変異Ｖ２２９Ａもまた、ＧｌｕＮ２Ｂの標準ペプチド（親和性の２倍低下）と比較して、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドの結合に対して有害効果を示した（親和性の６倍低下）。
【0175】
Ｋ１６５突然変異は、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチド（親和性の４倍低下）ならびにＧｌｕＮ２Ｂの標準ペプチド（５倍）の結合親和性を低下させた。
【0176】
実施例９：環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドのＧｌｕＮ２ＢのＣ末端領域に対するプルダウン選択性の比較
ＧｌｕＮ２ＢのＣ末端領域（ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ－ＣＯＯＨ、配列番号：４３５）に対する環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドの選択性を比較する目的で、親和性に基づくプルダウンアッセイを実施例１に記載の方法で実施した。ダイナビーズ（商標）Ｍ－２７０アミンビーズに、両方の化合物を固定化し、マウス（ハツカネズミ）脳溶解物と共にインキュベートした。勾配遠心分離によって、溶解物を膜および細胞質の２画分に分離した。トリプシン消化後に、タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）に連結した液体クロマトグラフィーで、濃縮蛋白質を定性的および定量的に分析した。
ＧｌｕＮ２ＢのＣ末端領域（ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ－ＣＯＯＨ、配列番号：４３５）に対する環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドの選択性を比較する目的で、親和性に基づくプルダウンアッセイを実施例１に記載の方法で実施した。ダイナビーズ（商標）Ｍ－２７０アミンビーズに、両方の化合物を固定化し、マウス（ハツカネズミ）脳溶解物と共にインキュベートした。勾配遠心分離によって、溶解物を膜および細胞質の２画分に分離した。トリプシン消化後に、タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）に連結した液体クロマトグラフィーで、濃縮蛋白質を定性的および定量的に分析した。
【0177】
ボルケーノプロット（図９および１０）によってその結果を視覚化した；標準的な結合ＧｌｕＮ２Ｂペプチドよりも環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドによって、Ｘ軸の負の領域の蛋白質が有意に濃縮された。膜画分では（図９）、ＧｌｕＮ２Ｂによって、それ自身ＰＤＺドメインを有していない複数の蛋白質が濃縮された。環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドでもＧｌｕＮ２Ｂでも、ＰＤＺを含む蛋白質が有意に濃縮されることはない。
【0178】
Ｎ末端パルミトイル化のためにＰＳＤ－９５が低濃度で存在すると考えられる細胞質画分では（図１０）、直鎖状ペプチドは、複数ＰＤＺドメイン蛋白質膜結合グアニル酸キナーゼの逆位ＭＡＧＵＫ（Ｍａｇｉ１およびＭａｇｉ２）を顕著に濃縮する。興味深いことには、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドは、ＰＳＤ－９５を大幅に濃縮したが（ディスクラージホモログ４、Ｄｌｇ４）、これはＰＳＤ－９５に対して非常に選択的な相互作用による可能性がある；一方で、直鎖状ＧｌｕＮ２Ｂペプチドは、非選択的に相互作用する。
【0179】
実施例１０：ｎＮＯＳβヘアピンモチーフのリン酸化
蛍光分極競争実験を用いてリン酸化の効果を評価した。
蛍光分極競争実験を用いてリン酸化の効果を評価した。
【0180】
材料と方法
標準的Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ方法論を利用し、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）－ＯＨを構成要素として用いて、Ｔｈｒ残基のリン酸化を行った；Ｔｈｒ残基はいずれも個々にリン酸化した。ＳＰＰＳ後に、組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対して、蛍光分極競争実験でペプチドの測定を実施例１に記載の方法で行った。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。
標準的Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ方法論を利用し、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）－ＯＨを構成要素として用いて、Ｔｈｒ残基のリン酸化を行った；Ｔｈｒ残基はいずれも個々にリン酸化した。ＳＰＰＳ後に、組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対して、蛍光分極競争実験でペプチドの測定を実施例１に記載の方法で行った。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。
【0181】
結果
環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドを、野生型ｎＮＯＳの残基位置１０５、１０９、１１０、１１２、１１６、１１９および１２３に対応する位置でリン酸化した。残基１０９、１１０および１１９に加えられた変異は破壊的効果をもたらしたが、残基１１６に加えられた変異は相乗的結合効果を与えることが、明らかになった。まとめを下の表６に示す。
環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドを、野生型ｎＮＯＳの残基位置１０５、１０９、１１０、１１２、１１６、１１９および１２３に対応する位置でリン酸化した。残基１０９、１１０および１１９に加えられた変異は破壊的効果をもたらしたが、残基１１６に加えられた変異は相乗的結合効果を与えることが、明らかになった。まとめを下の表６に示す。
【0182】
【表7】
【0183】
これらの知見は、Ｔ１１６Ｄ／Ｅ置換も同程度に結合親和性を増加させたという上記の観察および修飾に整合するものであり、これは、環状ペプチドのこの位置における負電荷の選択性を示唆している。
【0184】
実施例１１：ｎＮＯＳβヘアピンモチーフ中のＨｉｓ残基のＮ－メチル化
蛍光分極競争実験を用いてＨｉｓに対するＮ－メチル化効果を評価した。
蛍光分極競争実験を用いてＨｉｓに対するＮ－メチル化効果を評価した。
【0185】
材料と方法
標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ方法論を用いるペプチド合成の前に、Ｈｉｓの２種類の可能なイミダゾール窒素を予めメチル化した。出発構成要素は、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（τ－Ｍｅ）－ＯＨ［Ｈｉｓ（１－Ｍｅ）］またはＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（π－Ｍｅ）－ＯＨ［Ｈｉｓ（３－Ｍｅ）］であった。ＳＰＰＳ後に、組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対して、蛍光分極競争実験でペプチドの測定を実施例１に記載の方法で行った。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。
標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ方法論を用いるペプチド合成の前に、Ｈｉｓの２種類の可能なイミダゾール窒素を予めメチル化した。出発構成要素は、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（τ－Ｍｅ）－ＯＨ［Ｈｉｓ（１－Ｍｅ）］またはＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（π－Ｍｅ）－ＯＨ［Ｈｉｓ（３－Ｍｅ）］であった。ＳＰＰＳ後に、組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対して、蛍光分極競争実験でペプチドの測定を実施例１に記載の方法で行った。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。
【0186】
結果
Ｈｉｓのイミダゾール窒素に対するメチル化の影響を評価した。これを下の表７に示す。
Ｈｉｓのイミダゾール窒素に対するメチル化の影響を評価した。これを下の表７に示す。
【0187】
Ｎ１（Ｎπ）のメチル化により、環状の鋳型と比較して親和性（Ｋｉ＝２．９±０．１μＭ）が僅かに減少するが、Ｎ３（Ｎτ）のメチル化では、親和性が有意に増加する（Ｋｉ＝０．４０±０．０５μＭ）ことが、この結果から明らかになった。
【0188】
【表8】
【0189】
ＨｉｓのＮ３位にある水素は極性を有しており、Ｈ１０６に対してＬ１０７とＶ１２２との間に形成される疎水性表面に面するような位置にあるという仮説が考え得る。この位置のメチル化は、疎水性表面に安定化効果を提供しペプチド立体構造が安定化されるので、親和性が増強する。
【0190】
実施例１２：ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドのｄ－ＡＡスキャン
蛍光分極競争実験を用いてｄ－アミノ酸置換の効果を評価した。
蛍光分極競争実験を用いてｄ－アミノ酸置換の効果を評価した。
【0191】
材料と方法
ｌ－アミノ酸（Ｇｌｙについては除外）をｄ－類似体で置換して、１８種類の類似体を得た。これらは、市販のＦｍｏｃ－ｄ－ＡＡ－ＯＨ構成要素と標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ方法論を用いて合成した。ＳＰＰＳ後に、組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対して、蛍光分極競争実験でペプチドの測定を実施例１に記載の方法で行った。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。
ｌ－アミノ酸（Ｇｌｙについては除外）をｄ－類似体で置換して、１８種類の類似体を得た。これらは、市販のＦｍｏｃ－ｄ－ＡＡ－ＯＨ構成要素と標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ方法論を用いて合成した。ＳＰＰＳ後に、組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対して、蛍光分極競争実験でペプチドの測定を実施例１に記載の方法で行った。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。
【0192】
結果
結果のまとめを下の表８に示す。
結果のまとめを下の表８に示す。
【0193】
【表9】
【0194】
この結果は、環状ペプチドの実質的にいずれの位置においてもｄ－ＡＡを導入することが、結合親和性にとって有害であることを示すものであった。Ｄ１１４ｄ置換では、結合親和性に僅かの増加（Ｋｉ＝０．５９±０．０４μＭ）が認められる事実は、Ｄ１１４の近くに複数のＬｙｓ残基が存在し、これらＬｙｓ残基の１つに結合するにはｄ－Ａｓｐが位置的により良好であるということで説明されるかもしれない。
【0195】
実施例１３：ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２の高親和性環状ペプチド阻害剤の開発
実施例１０～１２に示す良好な単一点突然変異に基づいて、複数の変異を相加的効果および／または相乗効果について分析した。
実施例１０～１２に示す良好な単一点突然変異に基づいて、複数の変異を相加的効果および／または相乗効果について分析した。
【0196】
材料と方法
標準的ＳＰＰＳ方法論を用いて、ペプチドを上記の方法で合成した。ＳＰＰＳ後に、組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対して、蛍光分極競争実験でペプチドの測定を実施例１に記載の方法で行った。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。まとめを表９に示す。有望な環状ペプチド候補について、実施例１に記載の方法にしたがい、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）を用いてさらに分析を行った。
標準的ＳＰＰＳ方法論を用いて、ペプチドを上記の方法で合成した。ＳＰＰＳ後に、組換え技術によって発現させたＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２および環状ｎＮＯＳ ＴＡＭＲＡプローブに対して、蛍光分極競争実験でペプチドの測定を実施例１に記載の方法で行った。データ取得を三回行い、Ｋｉ値の平均±標準誤差で表した。まとめを表９に示す。有望な環状ペプチド候補について、実施例１に記載の方法にしたがい、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）を用いてさらに分析を行った。
【0197】
結果
蛍光分極競争実験に基づいて、複数の点突然変異を含む２種類の非常に強力な環状ペプチドが同定された；一方は、Ｔ１１２Ｗ、Ｔ１１６Ｅの置換（Ｋｉ＝０．１１±０．０２μＭ）であり、他方は、ΔＴ１１２、Ｔ１１６Ｅ（Ｋｉ＝０．１６±０．０２μＭ）の置換であった。次いで、これら２つを等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）でさらに評価した。
蛍光分極競争実験に基づいて、複数の点突然変異を含む２種類の非常に強力な環状ペプチドが同定された；一方は、Ｔ１１２Ｗ、Ｔ１１６Ｅの置換（Ｋｉ＝０．１１±０．０２μＭ）であり、他方は、ΔＴ１１２、Ｔ１１６Ｅ（Ｋｉ＝０．１６±０．０２μＭ）の置換であった。次いで、これら２つを等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）でさらに評価した。
【0198】
野生型環状ｎＮＯＳ模倣ペプチド（図２Ａ）と比較しながら、ＩＴＣ測定（下の表１０）の結果を蛍光分極アッセイの結果と並べてみると、Ｋｄ値が、Ｔ１１２Ｗ、Ｔ１１６Ｅ（図１１Ｂ）については１３８．８±０．２ｎＭ、およびΔＴ１１２、Ｔ１１６Ｅ（図１１Ｃ）については１１８．８±１３．１ｎＭであることが分かった。このことは、野生型ペプチドと比較して、結合親和性がそれぞれ１６倍および１８倍改善していることを示すものである。
【0199】
【表10】
【0200】
これら２種類のペプチド候補のうちのいずれかのＨｉｓ（３－Ｍｅ）にさらなる置換を導入すると、相加効果を示し結合親和性のさらなる改善が得られた（表１０）；このことは、３種類の置換、Ｈ１０６Ｈ（３－Ｍｅ）、Ｔ１１２ＷおよびＴ１１６Ｅ、を有する環状ペプチドは、顕著に改善した親和性（Ｋｄが２９．４±７．３ｎＭ）を示し（図１１Ｄ）、その元となる足場よりも７５倍強力であった。同様に、２つの変異および欠失を含む同一の足場（Ｈ１０６Ｈ（３－Ｍｅ）、ΔＴ１１２、Ｔ１１６Ｅ）のＫｄは４６．５±１２．５ｎＭであり（図１１Ｅ）、野生型ペプチドと比較して親和性が４７倍増加していた。
【0201】
【表11】
【0202】
実施例１４：環状ｎＮＯＳβヘアピン模倣ペプチドの非蛋白質新生ＳＰＯＴアレイスクリーニング
環状βヘアピンペプチド配列に取り込まれることでもたらされる潜在的相乗効果について、非蛋白質新生アミノ酸をスキャンした。そのような効果は、結合親和性の増強、安定性改善などを含み得る。
環状βヘアピンペプチド配列に取り込まれることでもたらされる潜在的相乗効果について、非蛋白質新生アミノ酸をスキャンした。そのような効果は、結合親和性の増強、安定性改善などを含み得る。
【0203】
材料と方法
この試験では、野生型環状ｎＮＯＳペプチドの残基１０５～１１６に対応するアミノ酸を含むペプチドを足場として選択した。２つの変異を含む同一セグメント（Ｔ１１２ＷおよびＴ１１６Ｅ）も、既に最適化されている足場ペプチドに導入した。残基１０５～１１６を変異の基本的なものとして選択した；その理由は、これらが親和性の増加に影響与える可能性が最も高いからである。実施例１において既に記載した方法で、スポットアレイにペプチドを合成した。その後、アレイをＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２と共にインキュベートした。
この試験では、野生型環状ｎＮＯＳペプチドの残基１０５～１１６に対応するアミノ酸を含むペプチドを足場として選択した。２つの変異を含む同一セグメント（Ｔ１１２ＷおよびＴ１１６Ｅ）も、既に最適化されている足場ペプチドに導入した。残基１０５～１１６を変異の基本的なものとして選択した；その理由は、これらが親和性の増加に影響与える可能性が最も高いからである。実施例１において既に記載した方法で、スポットアレイにペプチドを合成した。その後、アレイをＴＡＭＲＡ標識ＰＳＤ－９５－ＰＤＺ２と共にインキュベートした。
【0204】
結果
蛍光データについては、下の表１１および表１２で詳細に説明する。まとめると、Ｐｈｅ－２－Ｆ、Ｐｈｅ－２－Ｃｌ、Ｐｈｅ－３－ＦおよびＰｈｅ－２－Ｂｒなどのハロゲン化類似体によるＦ１１１の置換は、結合親和性の増加をもたらすようであり、これは蛍光出力がより大きいことで証明される。残基１０６については、ＰｙＡ－４またはＰｈｅ－３－ＣＨ２ＮＨ２などの正の芳香族残基によって、結合親和性が増加した。残基１０６のＨのメチル化もまた、上記の実施例１１に示されるような相加効果を与えた。この傾向は、野生型足場および最適化した環状ペプチド足場の両方に認められた。
蛍光データについては、下の表１１および表１２で詳細に説明する。まとめると、Ｐｈｅ－２－Ｆ、Ｐｈｅ－２－Ｃｌ、Ｐｈｅ－３－ＦおよびＰｈｅ－２－Ｂｒなどのハロゲン化類似体によるＦ１１１の置換は、結合親和性の増加をもたらすようであり、これは蛍光出力がより大きいことで証明される。残基１０６については、ＰｙＡ－４またはＰｈｅ－３－ＣＨ２ＮＨ２などの正の芳香族残基によって、結合親和性が増加した。残基１０６のＨのメチル化もまた、上記の実施例１１に示されるような相加効果を与えた。この傾向は、野生型足場および最適化した環状ペプチド足場の両方に認められた。
【0205】
野生型足場に関しては、Ｐｒｏ、Ａｒｇまたはモノメチル化Ａｒｇおよびジメチル化Ａｒｇによる残基１１５の置換もまた、結合親和性を増加させる傾向があるように見える。
【0206】
【表12】
【0207】
【表13】
【0208】
実施例１５：リガンドのインビトロにおけるプラスミン安定性
プラスミン（１０μｇ／ｍＬ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて、１００μＭのリガンドを３７℃で０～３６０分間インキュベートすることにより、配列番号：１２、６８、９９および１６３のペプチドのインビトロのプラスミン安定性を判定した。インキュベーション経過中の選択時点で、８０μＬの５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）で処理することにより、８０μＬのアッセイマトリックスからリガンドを抽出した。残存するリガンドの量を決定するために、この試料を濾過してＵＰＬＣで分析した。ＬＣ－ＭＳ分析を実施し、リガンドの完全性の確認と開裂部位の同定を行った。その結果を表１３および図１２に示す。
プラスミン（１０μｇ／ｍＬ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて、１００μＭのリガンドを３７℃で０～３６０分間インキュベートすることにより、配列番号：１２、６８、９９および１６３のペプチドのインビトロのプラスミン安定性を判定した。インキュベーション経過中の選択時点で、８０μＬの５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）で処理することにより、８０μＬのアッセイマトリックスからリガンドを抽出した。残存するリガンドの量を決定するために、この試料を濾過してＵＰＬＣで分析した。ＬＣ－ＭＳ分析を実施し、リガンドの完全性の確認と開裂部位の同定を行った。その結果を表１３および図１２に示す。
【0209】
【表14】
【0210】
この実施例では、環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドのインビトロにおけるプラスミン安定性を判定する方法について説明する。結論としては、易分解性残基Ｒ１２１およびＫ１１８を置換することにより、プラスミン安定性を有意に改善することができる。さらに、ＰＳＤ－９５（Ｔ１１２Ｗ）に対する化合物親和性を有意に改善する置換は安定性を損なうものではない。
【0211】
実施例１６：リガンドの膜透過性および細胞取り込みのＣＡＰＡによる判定
専ら細胞質に存在するＨａｌｏＧＦＰを安定発現するＨｅＬａ細胞において、シクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＴＧＤＧＴＰ（Ｋ－ＣＡ）ＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｑα））（配列番号：４２７）の膜透過性を判定した。細胞を、実験の前日に４００００細胞／ウェルの密度で播種した。増殖培地を吸引し、１００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに交換した後に、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで段階的希釈して調製したリガンドを２５μＬ、細胞（一定ＤＭＳＯ濃度）に添加し、そのプレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。ウェルの内容物を吸引し、細胞を新鮮なＯｐｔｉ－ＭＥＭで１５分間、洗浄した。洗浄液を吸引後、細胞をＴＡＭＲＡ－ＣＡ（５μＭ）と共に１５分間、インキュベートした。チェイス溶液を吸引後、細胞をＯｐｔｉ ＭＥＭで３０分間洗浄した。洗浄液の除去後に、細胞をトリプシン処理してＰＢＳ（２％ＦＢＳ）に再懸濁した；実験台据え置き型フローサイトメーターを用いて分析を行った。得られた蛍光強度データを、リガンド不含かつＴＡＭＲＡ－ＣＡ不含の対照ウェルを用いて正規化し、用量応答曲線としてプロットした。
専ら細胞質に存在するＨａｌｏＧＦＰを安定発現するＨｅＬａ細胞において、シクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＴＧＤＧＴＰ（Ｋ－ＣＡ）ＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｑα））（配列番号：４２７）の膜透過性を判定した。細胞を、実験の前日に４００００細胞／ウェルの密度で播種した。増殖培地を吸引し、１００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに交換した後に、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで段階的希釈して調製したリガンドを２５μＬ、細胞（一定ＤＭＳＯ濃度）に添加し、そのプレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。ウェルの内容物を吸引し、細胞を新鮮なＯｐｔｉ－ＭＥＭで１５分間、洗浄した。洗浄液を吸引後、細胞をＴＡＭＲＡ－ＣＡ（５μＭ）と共に１５分間、インキュベートした。チェイス溶液を吸引後、細胞をＯｐｔｉ ＭＥＭで３０分間洗浄した。洗浄液の除去後に、細胞をトリプシン処理してＰＢＳ（２％ＦＢＳ）に再懸濁した；実験台据え置き型フローサイトメーターを用いて分析を行った。得られた蛍光強度データを、リガンド不含かつＴＡＭＲＡ－ＣＡ不含の対照ウェルを用いて正規化し、用量応答曲線としてプロットした。
【0212】
この実施例では、ＣＡタグを付加した環状ｎＮＯＳβヘアピンペプチドの膜透過性および細胞取り込みを判定する方法について説明する。膜透過性および細胞取り込み量（ＣＰ５０）の値は、リガンドの細胞透過に逆比例する赤色蛍光の半値幅を表す。シクロ－（ＴＨＬＥＴＴＦＴＧＤＧＴＰ（Ｋ－ＣＡ）ＴＩＲＶＴＱｐＧ（Ｑα））（配列番号：４２７）のＣＰ５０値は、３１．１±２．１μＭであった。結論として、提示の環状ペプチドは医学的利用に関して好適な細胞取り込みを示した。
【0213】
【表15】
１． Ｆａｄｅｎ， Ａ．， Ｄｅｍｅｄｉｕｋ， Ｐ．， Ｐａｎｔｅｒ， Ｓ． ＆ Ｖｉｎｋ， Ｒ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４， ７９８－８００ （１９８９）．
２． Ｓａｔｔｌｅｒ， Ｒ． ＆ Ｔｙｍｉａｎｓｋｉ， Ｍ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ． Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２４， １０７－１２９ （２００１）．
３． Ｍｅｈｔａ， Ｓ． Ｌ．， Ｍａｎｈａｓ， Ｎ． ＆ Ｒａｇｈｕｂｉｒ， Ｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｂｒａｉｎ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ． ５４， ３４－６６ （２００７）．
４． Ｊｉ， Ｈ．； Ｌｉ， Ｈ．； Ｍａｒｔａｓｅｋ， Ｐ．； Ｒｏｍａｎ， Ｌ． Ｊ．； Ｐｏｕｌｏｓ， Ｔ． Ｌ．； Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， Ｒ． Ｂ．， Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｈｏｐｐｉｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００９， ５２ （３）， ７７９－７９７．
５． Ｊｉ， Ｈ．； Ｔａｎ， Ｓ．； Ｉｇａｒａｓｈｉ， Ｊ．； Ｌｉ， Ｈ．； Ｄｅｒｒｉｃｋ， Ｍ．； Ｍａｒｔａｓｅｋ， Ｐ．； Ｒｏｍａｎ， Ｌ． Ｊ．； Ｖａｓｑｕｅｚ－Ｖｉｖａｒ， Ｊ．； Ｐｏｕｌｏｓ， Ｔ． Ｌ．； Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， Ｒ． Ｂ．， Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｐａｌｓｙ． Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２００９， ６５ （２）， ２０９－２１７．
６． Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， Ｒ． Ｂ．， Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２００９， ４２ （３）， ４３９－４５１．．
７． Ｄｉｅｎｅｒ， Ｈ． Ｃ．； ＡｌＫｈｅｄｒ， Ａ．； Ｂｕｓｓｅ， Ｏ．； Ｈａｃｋｅ， Ｗ．； Ｚｉｎｇｍａｒｋ， Ｐ． Ｈ．； Ｊｏｎｓｓｏｎ， Ｎ．； Ｂａｓｕｎ， Ｈ．， Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈａｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ， ｕｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＮＭＤＡ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ＡＲ－Ｒ１５８９６ＡＲ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２００２， ２４９ （５）， ５６１－５６８．
８． Ｈａｒｄｉｎｇｈａｍ， Ｇ． Ｅ．； Ｂａｄｉｎｇ， Ｈ．， Ｔｈｅ Ｙｉｎ ａｎｄ Ｙａｎｇ ｏｆ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００３， ２６ （２）， ８１－８９．
９． Ｈｏｙｔｅ， Ｌ．； Ｂａｒｂｅｒ， Ｐ． Ａ．； Ｂｕｃｈａｎ， Ａ． Ｍ．； Ｈｉｌｌ， Ｍ． Ｄ．， Ｔｈｅ ｒｉｓｅ ａｎｄ ｆａｌｌ ｏｆ ＮＭＤＡ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｆｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ． Ｃｕｒｒ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ２００４， ４ （２）， １３１－１３６．
１０． Ｍｉｌａｎｉ， Ｄ．； Ｃｒｏｓｓ， Ｊ． Ｌ．； Ａｎｄｅｒｔｏｎ， Ｒ． Ｓ．； Ｂｌａｃｋｅｒ， Ｄ． Ｊ．； Ｋｎｕｃｋｅｙ， Ｎ． Ｗ．； Ｍｅｌｏｎｉ， Ｂ． Ｐ．， Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｐｏｌｙ－ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｒ１８ ａｎｄ ＮＡ－１ （ＴＡＴ－ＮＲ２Ｂ９ｃ） ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ２０１７， １１４， ９－１５．
１１． Ｈｉｌｌ， Ｍ． Ｄ．； Ｇｏｙａｌ， Ｍ．； Ｍｅｎｏｎ， Ｂ． Ｋ．； Ｎｏｇｕｅｉｒａ， Ｒ． Ｇ．； ＭｃＴａｇｇａｒｔ， Ｒ． Ａ．； Ｄｅｍｃｈｕｋ， Ａ． Ｍ．； Ｐｏｐｐｅ， Ａ． Ｙ．； Ｂｕｃｋ， Ｂ． Ｈ．； Ｆｉｅｌｄ， Ｔ． Ｓ．； Ｄｏｗｌａｔｓｈａｈｉ， Ｄ．， Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｎｅｒｉｎｅｔｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈａｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ （ＥＳＣＡＰＥ－ＮＡ１）： ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ， ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ， ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ２０２０， ３９５ （１０２２７）， ８７８－８８７．
１２． Ｂａｃｈ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ－ｓｔａｂｌｅ ｄｉｍｅｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＳＤ－９５－ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００９， ４８ （５１）， ９６８５－９６８９．
１３． Ｂａｃｈ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ， ｄｉｍｅｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＰＳＤ－９５ ｂｉｖａｌｅｎｔｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＰＤＺ１－２ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０９， ３３１７－３３２２ （２０１２）．
１４． Ａａｒｔｓ， Ｍ．； Ｌｉｕ， Ｙ．； Ｌｉｕ， Ｌ．； Ｂｅｓｓｈｏｈ， Ｓ．； Ａｒｕｎｄｉｎｅ， Ｍ．； Ｇｕｒｄ， Ｊ． Ｗ．； Ｗａｎｇ， Ｙ． Ｔ．； Ｓａｌｔｅｒ， Ｍ． Ｗ．； Ｔｙｍｉａｎｓｋｉ， Ｍ．， Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｂｙ ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ ＰＳＤ－９５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２， ２９８ （５５９４）， ８４６－８５０．
１５． Ｑｕ， Ｗ．； Ｌｉｕ， Ｎ． Ｋ．； Ｗｕ， Ｘ．； Ｗａｎｇ， Ｙ．； Ｘｉａ， Ｙ．； Ｓｕｎ， Ｙ．； Ｌａｉ， Ｙ．； Ｌｉ， Ｒ．； Ｓｈｅｋｈａｒ， Ａ．； Ｘｕ， Ｘ． Ｍ．， Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｎＮＯＳ－ＰＳＤ９５ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ． Ｃｅｒｅｂ． Ｃｏｒｔｅｘ． ２０２０．
１６． Ｏｓｃｈｋｉｎａｔ， Ｈ．， Ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １９９９， ６ （５）， ４０８－４１０．
１７． Ｓｏｎｇｙａｎｇ， Ｚ．； Ｆａｎｎｉｎｇ， Ａ． Ｓ．； Ｆｕ， Ｃ．； Ｘｕ， Ｊ．； Ｍａｒｆａｔｉａ， Ｓ． Ｍ．； Ｃｈｉｓｈｔｉ， Ａ． Ｈ．； Ｃｒｏｍｐｔｏｎ， Ａ．； Ｃｈａｎ， Ａ． Ｃ．； Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｍ．； Ｃａｎｔｌｅｙ， Ｌ． Ｃ．， Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｑｕｅ ｃａｒｂｏｘｙｌ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍｏｔｉｆｓ ｂｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７， ２７５ （５２９６）， ７３－７７．
１８． Ｂｅｚｐｒｏｚｖａｎｎｙ， Ｉ．； Ｍａｘｉｍｏｖ， Ａ．， Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎｓ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２００１， ５０９ （３）， ４５７－４６２．
１９． Ｔｏｎｉｋｉａｎ， Ｒ．； Ｚｈａｎｇ， Ｙ．； Ｓａｚｉｎｓｋｙ， Ｓ． Ｌ．； Ｃｕｒｒｅｌｌ， Ｂ．； Ｙｅｈ， Ｊ． Ｈ．； Ｒｅｖａ， Ｂ．； Ｈｅｌｄ， Ｈ． Ａ．； Ａｐｐｌｅｔｏｎ， Ｂ． Ａ．； Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ， Ｍ．； Ｗｕ， Ｙ．； Ｘｉｎ， Ｘ．； Ｃｈａｎ， Ａ． Ｃ．； Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ， Ｓ．； Ｌａｓｋｙ， Ｌ． Ａ．； Ｓａｎｄｅｒ， Ｃ．； Ｂｏｏｎｅ， Ｃ．； Ｂａｄｅｒ， Ｇ． Ｄ．； Ｓｉｄｈｕ， Ｓ． Ｓ．， Ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｍａｐ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２００８， ６ （９）， ｅ２３９．
２０． Ｋａｌｙｏｎｃｕ， Ｓ．； Ｋｅｓｋｉｎ， Ｏ．； Ｇｕｒｓｏｙ， Ａ．， Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎｓ． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ． ２０１０， １１， ３５７．
２１． Ｌｉｍ， Ｉ． Ａ．； Ｈａｌｌ， Ｄ． Ｄ．； Ｈｅｌｌ， Ｊ． Ｗ．， Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＰＳＤ－９５ ａｎｄ ｓｙｎａｐｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １０２． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００２， ２７７ （２４）， ２１６９７－２１７１１．
２２． Ｓｋｅｌｔｏｎ， Ｎ． Ｊ．； Ｋｏｅｈｌｅｒ， Ｍ． Ｆ．； Ｚｏｂｅｌ， Ｋ．； Ｗｏｎｇ， Ｗ． Ｌ．； Ｙｅｈ， Ｓ．； Ｐｉｓａｂａｒｒｏ， Ｍ． Ｔ．； Ｙｉｎ， Ｊ． Ｐ．； Ｌａｓｋｙ， Ｌ． Ａ．； Ｓｉｄｈｕ， Ｓ． Ｓ．， Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｒｂｉｎ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００３， ２７８ （９）， ７６４５－７６５４．
２３． Ｊｏｈｎｓｏｎ－Ｌｅｇｅｒ， Ｃ．； Ｐｏｗｅｒ， Ｃ． Ａ．； Ｓｈｏｍａｄｅ， Ｇ．； Ｓｈａｗ， Ｊ． Ｐ．； Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， Ａ． Ｅ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ａｎｄ ａ ｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ． Ｅｘｐｅｒｔ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２００６， ６ （１）， １－７．
２４． Ａｎｔｏｓｏｖａ， Ｚ．； Ｍａｃｋｏｖａ， Ｍ．； Ｋｒａｌ， Ｖ．； Ｍａｃｅｋ， Ｔ．， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｅｖｅｒ？ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００９， ２７ （１１）， ６２８－６３５．
２５． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｊ． Ａ．， β－Ｈａｉｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ： ｄｅｓｉｇｎ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２００８， ４１ （１０）， １２７８－１２８８．
２６． Ｊｈａ， Ａ．； Ｋｕｍａｒ， Ｍ． Ｇ．； Ｇｏｐｉ， Ｈ． Ｎ．； Ｐａｋｎｉｋａｒ， Ｋ． Ｍ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ－Ａｍｙｌｏｉｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂｅｔａ－Ｈａｉｒｐｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ． Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０１８， ３４ （４）， １５９１－１６００．
２７． Ｃｈｏ， Ｐ． Ｙ．； Ｊｏｓｈｉ， Ｇ．； Ｂｏｅｒｓｍａ， Ｍ． Ｄ．； Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ． Ａ．； Ｍｕｒｐｈｙ， Ｒ． Ｍ．， Ａ Ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｉｃ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ－ａｍｙｌｏｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｎ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０１５， ６ （５）， ７７８－７８９．
２８． Ｄａｎｅｌｉｕｓ， Ｅ．； Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ， Ｍ．； Ｂｒｅｄ， Ｍ．； Ｍｉｎ， Ｊ．； Ｗａｄｄｅｌｌ， Ｍ． Ｂ．； Ｇｕｙ， Ｒ． Ｋ．； Ｇｒｏｔｌｉ， Ｍ．； Ｅｒｄｅｌｙｉ， Ｍ．， Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｉｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＤＭ２／ｐ５３ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｙｃｌｉｃ ｂｅｔａ－ｈａｉｒｐｉｎｓ． Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０１６， １４ （４４）， １０３８６－１０３９３．
２９． ＤｅＭａｒｃｏ， Ｓ． Ｊ．； Ｈｅｎｚｅ， Ｈ．； Ｌｅｄｅｒｅｒ， Ａ．； Ｍｏｅｈｌｅ， Ｋ．； Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ， Ｒ．； Ｒｏｍａｇｎｏｌｉ， Ｂ．； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｊ． Ａ．； Ｂｒｉａｎｚａ， Ｆ．； Ｇｏｍｂｅｒｔ， Ｆ． Ｏ．； Ｌｏｃｉｕｒｏ， Ｓ．， Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ， ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ β－ｈａｉｒｐｉｎ ｍｉｍｅｔｉｃ ＣＸＣＲ４ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ａｎｔｉ－ＨＩＶ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００６， １４ （２４）， ８３９６－８４０４．
３０． Ｌｅｓｎｉａｋ， Ｗ． Ｇ．； Ｓｉｋｏｒｓｋａ， Ｅ．； Ｓｈａｌｌａｌ， Ｈ．； Ｂｅｈｎａｍ Ａｚａｄ， Ｂ．； Ｌｉｓｏｋ， Ａ．； Ｐｕｌｌａｍｂｈａｔｌａ， Ｍ．； Ｐｏｍｐｅｒ， Ｍ． Ｇ．； Ｎｉｍｍａｇａｄｄａ， Ｓ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ－ｈａｉｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＸＣＲ４ ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１５， １２ （３）， ９４１－９５３．
３１． Ｇｅｅ， Ｓ． Ｈ．； Ｓｅｋｅｌｙ， Ｓ． Ａ．； Ｌｏｍｂａｒｄｏ， Ｃ．； Ｋｕｒａｋｉｎ， Ａ．； Ｆｒｏｅｈｎｅｒ， Ｓ． Ｃ．； Ｋａｙ， Ｂ． Ｋ．， Ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｎｏｎ－ｃａｒｂｏｘｙｌ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ２７３ （３４）， ２１９８０－２１９８７．
３２． ＬｅＢｌａｎｃ， Ｂ． Ｗ．； Ｉｗａｔａ， Ｍ．； Ｍａｌｌｏｎ， Ａ． Ｐ．； Ｒｕｐａｓｉｎｇｈｅ， Ｃ． Ｎ．； Ｇｏｅｂｅｌ， Ｄ． Ｊ．； Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｊ．； Ｓｐａｌｌｅｒ， Ｍ． Ｒ．； Ｓａａｂ， Ｃ． Ｙ．， Ａ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＰＳＤ－９５ ｂｌｏｃｋｓ ｃｅｎｔｒａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｔｈｅｒｍａｌ ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０， １６７ （２）， ４９０－５００．
３３． Ｐｉｓｅｒｃｈｉｏ， Ａ．； Ｓａｌｉｎａｓ， Ｇ． Ｄ．； Ｌｉ， Ｔ．； Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｊ．； Ｓｐａｌｌｅｒ， Ｍ． Ｒ．； Ｍｉｅｒｋｅ， Ｄ． Ｆ．， Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＰＳＤ－９５． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２００４， １１ （４）， ４６９－４７３．
３４． Ｕｄｕｇａｍａｓｏｏｒｉｙａ， Ｇ．； Ｓａｒｏ， Ｄ．； Ｓｐａｌｌｅｒ， Ｍ． Ｒ．， Ｂｒｉｄｇｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ ａｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ２００５， ７ （７）， １２０３－１２０６．
３５． Ｈａｍｍｏｎｄ， Ｍ． Ｃ．； Ｈａｒｒｉｓ， Ｂ． Ｚ．； Ｌｉｍ， Ｗ． Ａ．； Ｂａｒｔｌｅｔｔ， Ｐ． Ａ．， Ｂｅｔａ ｓｔｒａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｌｉｇａｎｄｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２００６， １３ （１２）， １２４７－１２５１．
３６． Ｈｏｐｐｍａｎｎ， Ｃ．； Ｓｅｅｄｏｒｆｆ， Ｓ．； Ｒｉｃｈｔｅｒ， Ａ．； Ｆａｂｉａｎ， Ｈ．； Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ， Ｐ．； Ｒｕｃｋ‐Ｂｒａｕｎ， Ｋ．； Ｂｅｙｅｒｍａｎｎ， Ｍ．， Ｌｉｇｈｔ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ β‐ｓｈｅｅｔ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００９， ４８ （３６）， ６６３６－６６３９．
３７． Ｓｅｅｄｏｒｆｆ， Ｓ．； Ａｐｐｅｌｔ， Ｃ．； Ｂｅｙｅｒｍａｎｎ， Ｍ．； Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ， Ｐ．， Ｄｅｓｉｇｎ， ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＰＤＺ ｂｉｎｄｉｎｇ， ｃｙｃｌｉｃ ｂｅｔａ－ｆｉｎｇｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１０， ３９５ （４）， ５３５－５３９．
３８． Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｓ． Ｗ．； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｓ． Ｂ．； Ａｎｋｅｒ， Ｌ．； Ｈｕｌｔｑｖｉｓｔ， Ｇ．； Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ａ． Ｓ．； Ｊｅｍｔｈ， Ｐ．； Ｓｔｒｏｍｇａａｒｄ， Ｋ．， Ｐｒｏｂｉｎｇ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｉｎ ＰＤＺ／ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｍｉｄｅ－ｔｏ－ｅｓｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１４， ５， ３２１５
３９． Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｓ． Ｗ．； Ｍｏｒａｎ， Ｇ． Ｅ．； Ｓｅｒｅｉｋａｉｔｅ， Ｖ．； Ｈａｕｇａａｒｄ－Ｋｅｄｓｔｒｏｍ， Ｌ． Ｍ．； Ｓｔｒｏｍｇａａｒｄ， Ｋ．， ｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｌｙｓ／Ａｒｇ ｒｅｓｉｄｕｅ ｆｏｒ ｌｉｇａｎｄ／ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ２０１６， １７ （２０）， １９３６－１９４４．
４０． Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ－Ｃｏｌｅｓｋａ， Ｚ．； Ｗａｎｇ， Ｒ．； Ｆａｎｇ， Ｘ．； Ｐａｎ， Ｈ．； Ｔｏｍｉｔａ， Ｙ．； Ｌｉ， Ｐ．； Ｒｏｌｌｅｒ， Ｐ． Ｐ．； Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ， Ｋ．； Ｓａｉｔｏ， Ｎ． Ｇ．； Ｓｔｕｃｋｅｙ， Ｊ． Ａ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ＸＩＡＰ ＢＩＲ３ ｄｏｍａｉｎ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００４， ３３２ （２）， ２６１－２７３．
４１． Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ－Ｃｏｌｅｓｋａ， Ｚ．； Ｍｅａｇｈｅｒ， Ｊ． Ｌ．； Ｊｉａｎｇ， Ｓ．； Ｋａｗａｍｏｔｏ， Ｓ． Ａ．； Ｇａｏ， Ｗ．； Ｙｉ， Ｈ．； Ｑｉｎ， Ｄ．； Ｒｏｌｌｅｒ， Ｐ． Ｐ．； Ｓｔｕｃｋｅｙ， Ｊ． Ａ．； Ｗａｎｇ， Ｓ．， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｓｍａｃ－ｂａｓｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ＸＩＡＰ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＸＩＡＰ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｏｔｈ ＢＩＲ２ ａｎｄ ＢＩＲ３ ｄｏｍａｉｎｓ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００８， ３７４ （１）， ８７－９８．
４２． Ｗｉｎｎ， Ｍ．； Ｂａｌｌａｒｄ， Ｃ．； Ｃｏｗｔａｎ， Ｋ．； Ｄｏｄｓｏｎ， Ｅ．； Ｅｍｓｌｅｙ， Ｐ．； Ｅｖａｎｓ， Ｐ．； Ｋｅｅｇａｎ， Ｒ．； Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ， Ｅ．； Ｌｅｓｌｉｅ， Ａ．； ＭｃＣｏｙ， Ａ．， Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ， Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ２０１１， ６７ （４）， ２３５－２４２．
４３． ＭｃＣｏｙ， Ａ． Ｊ．； Ｇｒｏｓｓｅ－Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ， Ｒ． Ｗ．； Ａｄａｍｓ， Ｐ． Ｄ．； Ｗｉｎｎ， Ｍ． Ｄ．； Ｓｔｏｒｏｎｉ， Ｌ． Ｃ．； Ｒｅａｄ， Ｒ． Ｊ．， Ｐｈａｓｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ２００７， ４０ （４）， ６５８－６７４．
４４． Ｈｉｌｌｉｅｒ， Ｂ． Ｊ．， Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｍｏｄｅｓ ｏｆ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｎＮＯＳ－Ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９， ２８４ （５４１５）， ８１２－８１５．
４５． Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ， Ｅ． Ｆ．； Ｇｏｄｄａｒｄ， Ｔ． Ｄ．； Ｈｕａｎｇ， Ｃ． Ｃ．； Ｃｏｕｃｈ， Ｇ． Ｓ．； Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ， Ｄ． Ｍ．； Ｍｅｎｇ， Ｅ． Ｃ．； Ｆｅｒｒｉｎ， Ｔ． Ｅ．， ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ－ａ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． ２００４， ２５ （１３）， １６０５－１６１２．
４６． Ｓａｉｎｌｏｓ， Ｍ．； Ｔｉｇａｒｅｔ， Ｃ．； Ｐｏｕｊｏｌ， Ｃ．； Ｏｌｉｖｉｅｒ， Ｎ． Ｂ．； Ｂａｒｄ， Ｌ．； Ｂｒｅｉｌｌａｔ， Ｃ．； Ｔｈｉｏｌｏｎ， Ｋ．； Ｃｈｏｑｕｅｔ， Ｄ．； Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ， Ｂ．， Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｄｉｖａｌｅｎｔ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎａｐｔｉｃ ＡＭＰＡＲ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ ２０１１， ７ （２）， ８１．
４７． Ｈａｒｒｉｓ， Ｂ． Ｚ．； Ｈｉｌｌｉｅｒ， Ｂ． Ｊ．； Ｌｉｍ， Ｗ． Ａ．， Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍｏｔｉｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２００１， ４０ （２０）， ５９２１－５９３０．
４８． Ｗａｌｍａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＰＴＰ－ＢＬ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１６， １１０１－１１１０ （２００２）．
４９． Ｍａｄｓｅｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ＰＩＣＫ１． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０， ２０５３９－２０５４８ （２００５）．
５０． Ｖｅｌｔｈｕｉｓ， Ａ．， Ｓａｋａｌｉｓ， Ｐ．， Ｆｏｗｌｅｒ， Ｄ． ＆ Ｂａｇｏｗｓｋｉ， Ｃ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｉｎｈｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｖｅｒｌａｐ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ＰＤＺ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６， ｅ１６０４７ （２０１１）．
５１． Ｃａｒｓｏｎ， Ｍ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｄ．， ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｈ．， Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔｔｅ， Ｃ． ＆ ＤｅＬｕｃａｓ， Ｌ． Ｈｉｓ－ｔａｇ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ， Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６３， ２９５－３０１ （２００７）．
５２． Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｐｅｔｉｔ， Ｃ．， Ｋｉｎｇ， Ｄ． ＆ Ｌｅｅ， Ａ． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ－９５ （ＰＳＤ－９５） ｐｒｏｔｅｉｎ， ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｕａｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ （ＭＡＧＵＫ）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８６， ４１７７６－４１７８５ （２０１１）．
５３． Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＳＤ－９５ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｆｉｎｅ－ｔｕｎｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １２， ２３１３－２３２３ （２０１７）．
５４． Ｇａｒｃｉａ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｔｙｒ－Ｍｅｔ－Ｘ－Ｍｅｔ ｍｏｔｉｆｓ ｂｙ ｎｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， ２５１４６－２５１５１ （１９９３）．
５５． Ｂｌｏｍ， Ｎ．； Ｇａｍｍｅｌｔｏｆｔ， Ｓ．； Ｂｒｕｎａｋ， Ｓ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． １９９９， ２９４ （５）， １３５１－１３６２．
５６． Ｂｌｏｍ， Ｎ．； Ｓｉｃｈｅｒｉｔｚ‐Ｐｏｎｔｅｎ， Ｔ．； Ｇｕｐｔａ， Ｒ．； Ｇａｍｍｅｌｔｏｆｔ， Ｓ．； Ｂｒｕｎａｋ， Ｓ．， Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｔ‐ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００４， ４ （６）， １６３３－１６４９．
５７． Ｈｏｒｎｂｅｃｋ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４０， Ｄ２６１－Ｄ２７０ （２０１２）．
５８． Ｇｎａｄ， Ｆ．， Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ， Ｊ． ＆ Ｍａｎｎ， Ｍ． ＰＨＯＳＩＤＡ ２０１１： ｔｈｅ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９， Ｄ２５３－Ｄ２６０ （２０１０）．
５９． Ｎｙｍａｎ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＭｅＨ７３ ｉｎ ａｃｔｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ＡＴＰ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１７， ５７７－５８９ （２００２）．
６０． Ｗｅｂｂ， Ｋ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ３－ｍｅｔｈｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｐｌ３ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｐｏｎ ｔｈｅ ＹＩＬ１１０Ｗ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８５， ３７５９８－３７６０６ （２０１０）．
６１． Ｂｅｕｍｉｎｇ， Ｔ．， Ｆａｒｉｄ， Ｒ． ＆ Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｗ． Ｈｉｇｈ‐ｅｎｅｒｇｙ ｗａｔｅｒ ｓｉｔｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １８， １６０９－１６１９ （２００９）．
６２． Ｌｉｎｄｓａｙ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｗｏｒｌｄ Ｓｔｒｏｋｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ （ＷＳＯ）： Ｇｌｏｂａｌ ｓｔｒｏｋｅ ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ ２０１９． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｔｒｏｋｅ １４， ８０６－８１７ （２０１９）．
６３． Ｓｏｒｉａｎｏ， Ｆ． Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏ－ｄｅａｔｈ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｒｅｌｉａｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ＮＲ２Ｂ ＰＤＺ ｌｉｇａｎｄ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ２８， １０６９６－１０７１０ （２００８）．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A-B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図12】
【手続補正書】
【提出日】2022-12-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】