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特表2023-529457治療用ポリヌクレオチドに使用するためのグアノシン類似体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-10
(54)【発明の名称】治療用ポリヌクレオチドに使用するためのグアノシン類似体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230703BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230703BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230703BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230703BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230703BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/06 20060101ALI20230703BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20230703BHJP
A61P 25/22 20060101ALI20230703BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230703BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230703BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/12
A61P25/00
A61P21/02
A61P25/28
A61P9/00
A61P35/00
A61P3/00
A61P25/08
A61P25/06
A61P21/04
A61P25/04
A61P25/16
A61P25/24
A61P25/22
A61K31/7088
A61K31/713
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022575711
(86)(22)【出願日】2021-06-08
(85)【翻訳文提出日】2023-01-20
(86)【国際出願番号】 EP2021065266
(87)【国際公開番号】W WO2021249993
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】20179011.0
(32)【優先日】2020-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515129320
【氏名又は名称】ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】アルベク ナンナ
(72)【発明者】
【氏名】ハーゲドルン ペーター
(72)【発明者】
【氏名】ラディフォギッド メッテ
(72)【発明者】
【氏名】ペデルセン リッケ
(72)【発明者】
【氏名】ラヴィン ヤコブ
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA44
4C086MA56
4C086MA58
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA02
4C086ZA05
4C086ZA06
4C086ZA08
4C086ZA12
4C086ZA15
4C086ZA16
4C086ZA36
4C086ZA94
4C086ZB26
4C086ZC21
(57)【要約】
本発明は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合と、式（Ｉ）および式（ＩＩ）からなる群から選択されるグアニン核酸塩基類似体を含む少なくとも１つのグアノシン類似体と、を含むポリヌクレオチドに関する。このようなグアノシン類似体を含むポリヌクレオチドは、天然グアノシンを含むポリヌクレオチドと比較して相対的に低下した神経毒性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
－少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合と、－以下：
を含むポリヌクレオチド。
【請求項2】
一本鎖である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
二本鎖である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記２’糖修飾ヌクレオシドが、ロックド核酸および２’糖置換ヌクレオシドからなる群から独立して選択される、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記２’糖修飾ヌクレオシドの１つ以上が、【請求項9】
１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、【請求項10】
前記グアノシン類似体が【請求項11】
前記グアノシン類似体が（Ｉａ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
前記グアノシン類似体が（Ｉａ１）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項13】
前記グアノシン類似体が（Ｉａ２）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項14】
前記グアノシン類似体が（Ｉｂ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項15】
前記グアノシン類似体が（ＩＩａ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
前記グアノシン類似体が（ＩＩａ１）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
前記グアノシン類似体が（ＩＩａ２）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項18】
前記グアノシン類似体が（ＩＩｂ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項19】
前記グアノシン類似体が（Ｉｃ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項20】
前記グアノシン類似体が（ＩＩｃ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項21】
前記グアノシン類似体が（Ｉｄ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項22】
前記グアノシン類似体が（ＩＩｄ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項23】
前記グアノシン類似体が（Ｉｅ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項24】
前記グアノシン類似体が（ＩＩｅ）である、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項25】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがギャップマーである、請求項２～３または６～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項26】
修飾リボースを有する少なくとも１つのさらなるヌクレオシドを含み、前記リボース修飾が、ロックド核酸または２’修飾からなる群から選択される、請求項２～３または６～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項27】
前記グアノシン類似体が前記ギャップマーのギャップ領域にあり、かつ式Ｉａまたは式ＩＩｂのものであり、式中、ＲがＨである、請求項２５～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項28】
前記グアノシン類似体が前記ギャップマーのフランクに無い、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項29】
請求項１～２８のいずれか一項に記載のグアノシン類似体を１つ含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項30】
請求項１～２４のいずれか一項に記載のグアノシン類似体を２つ含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項31】
請求項１～２４のいずれか一項に記載のグアノシン類似体を３つ含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項32】
天然グアノシンを含まない、請求項１～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項33】
前記ポリヌクレオチドが、ＣＴＣＡａｃｔｔｇオキソｃｔｔｔａＡＴ（配列番号４）；
ＣＴＣＡｔａｃｔｔｇＮｃｔｔｔａＡＴ（配列番号５）；
ＣＴＣＡｔａｃｔｔｇＰＰＧｃｔｔｔａＡＴ（配列番号６）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＣ（配列番号９）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＰＰＧＣ（配列番号１０）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇオキソＣ（配列番号１１）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＮＣ（配列番号１３）；
ＡＣＡｇオキソｇオキソａｔｔａｇオキソｔｔＣＴＡ（配列番号１５）；および
ＡＣＡｇＰＰＧｇＰＰＧａｔｔａｇＰＰＧｔｔＣＴＡ（配列番号１６）
からなる群から選択され、これらの配列中の大文字はＬＮＡ修飾リボースを有するヌクレオシドを示し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、これらの配列中の小文字はＤＮＡを示し、
ｇＰＰＧは７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシンであり、
ｇＮは８－アミノ－ｄＧであり、
ｇオキソは８－オキソ－デオキシグアノシンである、
請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項34】
医薬として使用するための、請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項35】
中枢神経系に投与するため、または神経障害、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アンジェルマン、アルツハイマー病、動脈瘤、背痛、ベル麻痺、脳および脊髄の先天性欠損、脳損傷、脳腫瘍、脳性麻痺、慢性疲労症候群、脳震盪、認知症、頸部および腰背部の椎間板疾患、浮動性めまい、てんかん、ギラン・バレー症候群、頭痛および片頭痛、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経障害、神経筋および関連疾患、パーキンソン病、精神医学的症状（重度のうつ病、強迫性障害）、脊柱側弯症、発作、脊髄損傷、脊椎変形および障害、脊椎腫瘍、脳卒中および回転性めまいからなる群から選択されるＣＮＳ障害を処置するためのものである、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項36】
髄腔内注射を介した投与のためのものである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項37】
Ｕｂｅ３Ａの調節が有益である医学的症状を処置するための医薬として使用するための、例えば、アンジェルマンを処置するための、請求項１～３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項38】
ＡＴＸＮ２の調節が有益である医学的症状を処置するための医薬として使用するための、請求項１～３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項39】
ＡＴＸＮ３の調節が有益である医学的症状を処置するための医薬として使用するための、請求項１～３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項40】
神経毒性の低下が必要とされる医薬として使用される、請求項１～３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項41】
請求項１～３４のいずれか一項に記載の、毒性が低下したポリヌクレオチドを合成するための方法であって、さらなるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにホスホロアミダイトなどのヌクレオチドモノマーをカップリングさせることを含み、前記ヌクレオチドモノマーが、請求項１～２４のいずれか一項に記載のグアノシン類似体を含む、前記方法。
【請求項42】
参照ポリヌクレオチドよりも毒性が低下したポリヌクレオチドを選択するための方法であって、前記ポリヌクレオチドが請求項１～２４のいずれか一項に記載されており、前記神経毒性の低いポリヌクレオチドが前記参照ポリヌクレオチドと比較して少なくとも１つのグアノシン類似体を含むという違いを伴って、前記参照ポリヌクレオチドおよび神経毒性の低いアンチセンスオリゴヌクレオチドが、同じヌクレオチド配列を有し、かつ少なくとも１つのグアノシンを含む、前記方法。
【請求項43】
ポリヌクレオチドの製造における、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）および（ＩＩｅ）からなる群から選択されるグアノシン類似体を含有する化合物の使用。
【請求項44】
Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳを発現している標的細胞におけるＵｂｅ３ａ発現を上方制御するための方法であって、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳを標的とする請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有効量で前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項45】
インビボ方法またはインビトロ方法である、請求項３８に記載の方法。
【請求項46】
神経障害に罹患しているかまたは罹患する可能性があるヒトなどの対象における神経障害を処置または予防するための方法であって、前記神経障害を予防または緩和するなどのために、治療有効量または予防有効量の請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、医薬有効成分として使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのポリヌクレオチドに関する。より詳細には、本発明は、このようなポリヌクレオチドに使用するためのグアノシン類似体に関する。
本発明は、医薬有効成分として使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのポリヌクレオチドに関する。より詳細には、本発明は、このようなポリヌクレオチドに使用するためのグアノシン類似体に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
現在、神経障害を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはｓｉＲＮＡ治療薬などのポリヌクレオチドの開発にかなりの関心が寄せられている。このようなポリヌクレオチドは、例えば、髄腔内投与によって投与することができる。しかしながら、新たなポリヌクレオチド治療薬の発見は、かなりの割合のポリヌクレオチドが動物試験において神経毒性を誘発するという所見によって妨げられてきた（例えば、国際公開第２０１６／１２６９９５号パンフレット参照）。一部のポリヌクレオチドを投与されたマウスは、投与後３０分～１時間以内に急性神経毒性の徴候を示し、毒性がハイブリダイゼーションイベントに起因する可能性が低いことを示している。
現在、神経障害を処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）またはｓｉＲＮＡ治療薬などのポリヌクレオチドの開発にかなりの関心が寄せられている。このようなポリヌクレオチドは、例えば、髄腔内投与によって投与することができる。しかしながら、新たなポリヌクレオチド治療薬の発見は、かなりの割合のポリヌクレオチドが動物試験において神経毒性を誘発するという所見によって妨げられてきた（例えば、国際公開第２０１６／１２６９９５号パンフレット参照）。一部のポリヌクレオチドを投与されたマウスは、投与後３０分～１時間以内に急性神経毒性の徴候を示し、毒性がハイブリダイゼーションイベントに起因する可能性が低いことを示している。
【0003】
国際公開第２０１６／１２７０００号パンフレットは、インビボで急性神経毒性を誘発する可能性が高いアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子を同定するためのカルシウムオシレーションアッセイの使用、ならびにシトシンヌクレオチドまたはその類似体の数からグアノシンヌクレオチドまたはその類似体の数を引いて、ポリヌクレオチドの全長で割った数を計算することによって、認容できるインビボ神経毒性を有するポリヌクレオチドを選択するための方法を報告している。
【0004】
Ｓｅｅｌａら、Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９８８、７１、１１９１～１１９８は、ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジンのグリコシル化のための汎用的な候補として６－クロロ－７－デアザプリンおよび７－デアザ－６－（メチルチオ）プリンを使用することを記載している。
【0005】
Ｓｅｅｌａ，Ｆ．、Ｂｅｃｈｅｒ，Ｇ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）、（１８）、２０１７～２０１８は、オリゴヌクレオチドへの７－ハロゲン化７－デアザプリン（ピロロ－［２，３－ｄ］ピリミジンＡ）の導入を記載している。ＤＮＡへのこの導入の目的は、質量分析または原子間力顕微鏡法による配列決定に有用なレポーター基、切断剤または残基として働くことであると思われる。Ｋｕｔｙａｖｉｎら、ＮＡＲ２００２、第３０巻、４９５２～４９５９頁は、８－アザ－７－デアザグアニン（ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、ＰＰＧ）がグアニンに富むオリゴデオキシリボヌクレオチドのグアニン自己会合を減少させ、ＰＰＧのグアニンによる置換が、グアニンに富むＤＮＡプローブの親和性、特異性、感度および予測性を高めることを開示している。
【0006】
Ｈａｒａら、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍは、天然ＤＮＡよりも結合親和性が低いことが分かった、ＬＮＡ－７－デアザグアニンおよびＬＮＡ－８－アザ－７－デアザグアニン修飾ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、ならびにＬＮＡ－７－デアザグアニンが、グアニンが豊富な配列であっても凝集を有効に抑制することを報告している。
【0007】
この文献の簡単な概説は、ある特定のポリヌクレオチドを中枢神経系に投与した場合に観察される神経毒性の問題を解決することが非常に少ないままであることを示している。
【0008】
発明の目的
本発明者らは、ポリヌクレオチド配列内の天然、すなわち、未修飾グアノシン核酸塩基の割合が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなどのポリヌクレオチドが神経毒性となる可能性と直接相関していることを見出して驚いた。本発明は、治療用オリゴヌクレオチドに使用するためのグアノシン類似体を提供し、それによって、神経毒性の低下を提供する。
本発明者らは、ポリヌクレオチド配列内の天然、すなわち、未修飾グアノシン核酸塩基の割合が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなどのポリヌクレオチドが神経毒性となる可能性と直接相関していることを見出して驚いた。本発明は、治療用オリゴヌクレオチドに使用するためのグアノシン類似体を提供し、それによって、神経毒性の低下を提供する。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、ポリヌクレオチド配列内の天然、すなわち、未修飾グアノシン（Ｇ）核酸塩基の割合が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなどのポリヌクレオチドが神経毒性となる可能性と直接相関しているという所見に基づく。未修飾Ｇ核酸塩基を神経毒性のトリガーとして同定したので、本発明者らは、多数のＧ類似体をスクリーニングし、未修飾Ｇの代わりに使用した場合に、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなどのホスホロチオエートポリヌクレオチドの神経毒性を低下させることによって例示される、ポリヌクレオチドの神経毒性を低下させるか、または緩和するある特定のＧ類似体を同定した。特に、本発明者らは、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ中の８－アザ－７－デアザグアニン（ＰＰＧ）または８－オキソ－デオキシグアノシン（８－オキソ－ｄＧ）塩基による未修飾Ｇ核酸塩基の置換が、インビボならびにインビトロ神経毒性アッセイにおいて神経毒性を緩和することを特定した。
【0010】
さらに、本発明者らは、ポリヌクレオチドへのＰＰＧ塩基の組み込みが、ポリヌクレオチド結合親和性を低下させることができるが、これは、組み込まれたＰＰＧ塩基の配列状況に大いに依存することを特定した。本発明者らは、この観察結果を使用して、維持された有効な結合親和性に関連する短い二本鎖および三本鎖モチーフを同定した。あるいは、結合親和性は、例えば、オリゴヌクレオチドへのＬＮＡなどのさらなる高親和性ヌクレオシドの組み込みによって補償され得る。
【0011】
配列表
本出願と共に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列モチーフは、ＤＮＡ配列として示されている。
本出願と共に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表に列挙されるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列モチーフは、ＤＮＡ配列として示されている。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】実施例３による試験におけるグアニン類似体を使用した急性神経毒性の救済を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0013】
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとも呼ばれる場合がある。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製および単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとも呼ばれる場合がある。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製および単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のものであり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
【0014】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡでもｓｈＲＮＡでもない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部または相互の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二本鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二本鎖）を形成することができることが理解される。
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡでもｓｈＲＮＡでもない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部または相互の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二本鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二本鎖）を形成することができることが理解される。
【0015】
いくつかの実施形態では、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、非修飾ＲＮＡヌクレオシドを含有しなくてもよい。
【0016】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。さらに、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることが有利である。
【0017】
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語および「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域などの連続ヌクレオチド配列を含み、任意に、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基（例えば、コンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が連続ヌクレオチド配列である。
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語および「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域などの連続ヌクレオチド配列を含み、任意に、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基（例えば、コンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が連続ヌクレオチド配列である。
【0018】
ヌクレオチドおよびヌクレオシド
ヌクレオチドおよびヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよびヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチドおよびヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、互換的に「単位」または「モノマー」と呼ばれ得る。
ヌクレオチドおよびヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよびヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチドおよびヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、互換的に「単位」または「モノマー」と呼ばれ得る。
【0019】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、１つ以上の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。「修飾ヌクレオシド」という用語はまた、「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。未修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと呼ばれる。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対形成可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡまたはＲＮＡと呼ばれる。
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、同等のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、１つ以上の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。「修飾ヌクレオシド」という用語はまた、「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。未修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと呼ばれる。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、それらがワトソン・クリック塩基対形成可能な場合には、依然として一般的にＤＮＡまたはＲＮＡと呼ばれる。
【0020】
グアノシン類似体
本明細書で使用される「グアニン類似体」または「Ｇ類似体」という用語は、以下の式の核酸塩基８－オキソ－グアニン（８－オキソ－Ｇ）および／または７－デアザ－８－アザ－グアニン（ＰＰＧ）を含有するヌクレオシドまたはヌクレオチドを指す：
（式中、Ｒは、ＨまたはＯＨである）。
本明細書で使用される「グアニン類似体」または「Ｇ類似体」という用語は、以下の式の核酸塩基８－オキソ－グアニン（８－オキソ－Ｇ）および／または７－デアザ－８－アザ－グアニン（ＰＰＧ）を含有するヌクレオシドまたはヌクレオチドを指す：
【0021】
８－オキソ－デオキシグアノシン（８－オキソ－ｄＧ）および／または７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシン（ＰＰＧ）は、以下のようにより詳細に表すこともできる：
または
【0022】
これは、以下の部分などの糖修飾を含むグアノシン類似体も包含することが理解されるべきである：
【0023】
部分（Ｉａ）および（ＩＩａ）は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）で市販されているホスホロアミダイトを使用して得ることができる。
【0024】
部分（ＩＩｂ）および（ＩＩｃ）は、Ｈａｒａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１７、８２、２５～３６およびＢｌａｄｅら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１５、８０、５３３７～５３４３によって記載されている合成経路に従って得ることができる。
【0025】
部分（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）および（Ｉｅ）は、Ｋａｎｎａｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１、７６、７２０～７２３によって記載されるように対応するグアノシンヌクレオシドから得ることができる。
【0026】
部分（ＩＩｄ）および（ＩＩｅ）は、Ｓｅｅｌａら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９８９）、８（５～６）、７８９～７９２およびＳｅｅｌａら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ（１９８６）、６９（７）、１６０２～１６１３によって記載されるように対応するペントフラノシルクロリド中間体から得ることができる。
【0027】
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として、当業者に一般的に理解されているように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合または１つ以上のホスホロジチオエートヌクレオシド間結合などの、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として、当業者に一般的に理解されているように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合または１つ以上のホスホロジチオエートヌクレオシド間結合などの、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
【0028】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートである。
【0029】
いくつかの有利な実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、またはオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【0030】
欧州特許第２７４２１３５号明細書に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート以外）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号明細書によれば、例えば、別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。
【0031】
核酸塩基
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、天然に存在しないバリアントの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第４５巻２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、天然に存在しないバリアントの両方を指す。このようなバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第４５巻２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
【0032】
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分が、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
【0033】
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基についての文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示されてもよく、各文字は、任意に等価機能の修飾核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５－メチルシトシンから選択される。任意に、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【0034】
修飾オリゴヌクレオチド
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、糖修飾ヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、糖修飾ヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。
【0035】
相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対形成の能力を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾された核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば、５－メチルシトシンは、シトシン、本明細書に記載されるグアノシン類似体の代わりに使用されることが多く、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対形成を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏら、（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第４５巻 ２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン・クリック塩基対形成の能力を表す。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾された核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでいてもよく、例えば、５－メチルシトシンは、シトシン、本明細書に記載されるグアノシン類似体の代わりに使用されることが多く、したがって、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対形成を包含することが理解されよう（例えば、Ｈｉｒａｏら、（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第４５巻 ２０５５頁およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
【0036】
本明細書で使用される「％相補的」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列または配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと呼ばれる。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５’－メチルシトシンおよび本明細書に記載されるグアノシン類似体は、％同一性の計算の目的のために、それぞれシトシンおよびグアノシンと同一であると見なされる）。
【0037】
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
【0038】
同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性のパーセンテージ＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性のパーセンテージ＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【0039】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二本鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって表される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（ＭｅｒｇｎｙおよびＬａｃｒｏｉｘ、２００３、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１３：５１５～５３７）。標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表しており、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）によって反応の解離定数（Ｋｄ）と関連付けられている。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔＧ°は、ゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎら、１９６５、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６～３８およびＨｏｌｄｇａｔｅら、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用することによって、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０～１４６５に記載される最近接モデルを使用して、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：１１２１１～１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：５３８８～５４０５に記載される適切に得られる熱力学的パラメータを使用し、数値的に推定することができる。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度が、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、および例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、または－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。
本明細書で使用される「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対間に水素結合を形成することにより二本鎖を形成することと理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって表される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（ＭｅｒｇｎｙおよびＬａｃｒｏｉｘ、２００３、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１３：５１５～５３７）。標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表しており、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）によって反応の解離定数（Ｋｄ）と関連付けられている。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔＧ°は、ゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎら、１９６５、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６～３８およびＨｏｌｄｇａｔｅら、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用することによって、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ、１９９８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０～１４６５に記載される最近接モデルを使用して、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：１１２１１～１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：５３８８～５４０５に記載される適切に得られる熱力学的パラメータを使用し、数値的に推定することができる。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度が、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、および例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、または－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で、標的核酸にハイブリダイズする。
【0040】
標的核酸
本発明によると、標的核酸は、ヒト遺伝子をコードする核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ配列であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。
本発明によると、標的核酸は、ヒト遺伝子をコードする核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ配列であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。
【0041】
標的配列
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、または標的領域と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、標的配列が、単一アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列、または標的領域と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、標的配列が、単一アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。
【0042】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、標的配列に相補的、例えば完全に相補的である。
【0043】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的であり、ハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
【0044】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的である標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含む。連続ヌクレオチド配列は、１０～３０ヌクレオチド長、例えば１２～３０、例えば１４～２０、例えば１５～１８連続ヌクレオチド長、例えば１５、１６、１７連続ヌクレオチド長である。
【0045】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全長にわたって標的配列に完全に相補的である。
【0046】
標的細胞
本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞が、インビボまたはインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞が、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウス細胞もしくはラット細胞、または霊長類細胞、例えば、サル細胞もしくはヒト細胞である。
本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞が、インビボまたはインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞が、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウス細胞もしくはラット細胞、または霊長類細胞、例えば、サル細胞もしくはヒト細胞である。
【0047】
典型的には、標的細胞が、標的ｍＲＮＡ、例えば標的プレｍＲＮＡまたは標的成熟ｍＲＮＡを発現する。実験的評価のために、標的配列を含む核酸を発現する標的細胞が使用され得る。
【0048】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、例えばインビボまたはインビトロのいずれかで、標的核酸を発現している細胞（標的細胞）における標的核酸の発現を阻害することができる。
【0049】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、任意に、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、または他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’またはＤ’’）を除いて、標的核酸に相補的、例えば完全に相補的である。標的核酸は、例えば、所与のタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡなどのメッセンジャーＲＮＡであり得る。
【0050】
天然に存在するバリアント
「天然に存在するバリアント」という用語は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、またはプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、または多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得る遺伝子または転写産物のバリアント、および対立遺伝子バリアントを指す。したがって、オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸およびその天然に存在するバリアントを標的とし得る。
「天然に存在するバリアント」という用語は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、またはプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、または多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得る遺伝子または転写産物のバリアント、および対立遺伝子バリアントを指す。したがって、オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸およびその天然に存在するバリアントを標的とし得る。
【0051】
いくつかの実施形態では、天然に存在するバリアントが、哺乳動物標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有する。
【0052】
発現の阻害
本明細書で使用される「発現の阻害」という用語は、オリゴヌクレオチドが標的細胞において所与のタンパク質の量または活性を阻害する能力の全体的な用語として理解されるべきである。活性の阻害は、標的プレｍＲＮＡもしくは標的ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、または細胞中の標的遺伝子もしくは標的遺伝子活性のレベルを測定することによって決定され得る。したがって、発現の阻害は、インビトロまたはインビボで決定され得る。標的発現の阻害はまた、活性またはタンパク質レベルを測定することによっても決定され得る。
本明細書で使用される「発現の阻害」という用語は、オリゴヌクレオチドが標的細胞において所与のタンパク質の量または活性を阻害する能力の全体的な用語として理解されるべきである。活性の阻害は、標的プレｍＲＮＡもしくは標的ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、または細胞中の標的遺伝子もしくは標的遺伝子活性のレベルを測定することによって決定され得る。したがって、発現の阻害は、インビトロまたはインビボで決定され得る。標的発現の阻害はまた、活性またはタンパク質レベルを測定することによっても決定され得る。
【0053】
典型的には、発現の阻害は、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に投与することによる活性の阻害を比較する、およびそのレベルをアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与しない標的細胞から得られた参照レベル（対照実験）、または既知の参照レベル（例えば、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前の発現レベル、または所定のもしくは他の既知の発現レベル）と比較することによって決定される。
【0054】
例えば、対照実験は、生理食塩水組成物または参照オリゴヌクレオチド（多くの場合、スクランブル対照）で処理した動物もしくはヒト、または標的細胞であり得る。
【0055】
阻害または阻害するという用語は、所与の遺伝子Ａの発現を下方制御する、減少させる、抑制する、減らす、低下させるとも呼ばれ得る。
【0056】
発現の阻害は、例えばプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの分解（例えば、ＲＮａｓｅＨ動員オリゴヌクレオチド、例えばギャップマーを使用）によって起こり得る。
【0057】
高親和性修飾ヌクレオシド
「高親和性修飾ヌクレオシド」は、修飾ヌクレオチドであり、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれと、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、１修飾ヌクレオシド当たり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９～４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、３（２）、２９３～２１３を参照されたい）。
「高親和性修飾ヌクレオシド」は、修飾ヌクレオチドであり、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれと、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、１修飾ヌクレオシド当たり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において知られており、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９～４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、３（２）、２９３～２１３を参照されたい）。
【0058】
糖修飾
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
【0059】
リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドは、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の特性を改善することを主な目的として作製されてきた。本発明のいくつかの実施形態では、「糖修飾」という用語が、「リボース修飾」または「修飾リボース」または「リボースの修飾」を意味する。
【0060】
このような修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、または典型的にはリボース環上のＣ２炭素とＣ４炭素との間にビラジカル架橋を有する二環式環（ＬＮＡ）、または典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。その他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号パンフレット）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号パンフレット）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合には非糖部分で置き換えられているヌクレオシドが含まれる。
【0061】
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによってなされる修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’、または５’位に導入され得る。
【0062】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾としても知られている、２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環中の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
２’糖修飾としても知られている、２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環中の第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
【0063】
実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多数の２’置換ヌクレオシドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれると有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、高められた結合親和性および／または増大されたヌクレアーゼ耐性をアンチセンスオリゴヌクレオチドにもたらすことができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ／ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ／ＤＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ／ＤＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ／ＤＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ／ＤＮＡ、および２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９～４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、３（２）、２９３～２１３、ならびにＤｅｌｅａｖｅｙおよびＤａｍｈａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２、１９、９３７を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
【0064】
本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
【0065】
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するビラジカル（「２’－４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献において、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二本鎖の安定化）に関連している。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド／相補二本鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するビラジカル（「２’－４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献において、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二本鎖の安定化）に関連している。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド／相補二本鎖の融解温度を測定することによって、日常的に決定され得る。
【0066】
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号パンフレット、国際公開第００／６６６０４号パンフレット、国際公開第９８／０３９３５２号パンフレット、国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレット、国際公開第００／０４７５９９号パンフレット、国際公開第２００７／１３４１８１号パンフレット、国際公開第２０１０／０７７５７８号パンフレット、国際公開第２０１０／０３６６９８号パンフレット、国際公開第２００７／０９００７１号パンフレット、国際公開第２００９／００６４７８号パンフレット、国際公開第２０１１／１５６２０２号パンフレット、国際公開第２００８／１５４４０１号パンフレット、国際公開第２００９／０６７６４７号パンフレット、国際公開第２００８／１５０７２９号パンフレット、Ｍｏｒｉｔａら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２、７３～７６、ＳｅｔｈらＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０、第７５（５）巻１５６９－８１頁、ならびにＭｉｔｓｕｏｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２００９、３７（４）、１２２５～１２３８、ならびにＷａｎおよびＳｅｔｈ、Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１６、５９、９６４５～９６６７に開示されている。
【0067】
さらなる非限定的な、例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム１に開示する。
（式中、Ｂは天然または非天然（修飾）核酸塩基であり、Ｚは隣接ヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり、Ｚ＊は隣接ヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合である）。
【0068】
特に明記されていない限り、ＬＮＡヌクレオシドはβ－Ｄまたはα－Ｌステレオアイソフォ－ムであり得ることが認識されよう。
【0069】
ＨＥＬＭアノテーションを有する例示的なヌクレオシド
ＤＮＡヌクレオシド
β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシド
２’－Ｏ－メチルヌクレオシド
ＤＮＡヌクレオシド
【0070】
ＨＥＬＭアノテーションを有する例示的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合
【0071】
点線は、各ヌクレオシドと５’または３’ホスホロチオエートヌクレオシド間結合との間の共有結合を表す。５’末端ヌクレオシドにおいて、５’点線は水素原子への結合を表す（５’末端－ＯＨ基を形成する）。３’末端ヌクレオシドにおいて、３’点線は水素原子への結合を表す（３’末端－ＯＨ基を形成する）。
【0072】
ＲＮａｓｅＨの活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子との二本鎖にあるときにＲＮａｓｅＨを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号パンフレットは、ＲＮａｓｅＨを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供している。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％または２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このアンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員し得ると見なされる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定での使用について、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ（登録商標）（大腸菌で発現したＨｉｓタグと融合した組換えヒトＲＮＡＳＥＨ１）から入手可能である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子との二本鎖にあるときにＲＮａｓｅＨを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号パンフレットは、ＲＮａｓｅＨを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供している。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％または２０％超のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定された初期速度を有する場合に、このアンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ Ｈを動員し得ると見なされる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定での使用について、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ（登録商標）（大腸菌で発現したＨｉｓタグと融合した組換えヒトＲＮＡＳＥＨ１）から入手可能である。
【0073】
ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはギャップマー設計とも呼ばれ得る。ギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅＨ媒介分解を介した標的核酸の阻害に使用される。ギャップマーは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’－フランク、ギャップ、および３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を、５’－＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、ギャップマーがＲＮａｓｅＨを動員するのを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドの伸長を含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）が隣接する。領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するギャップマーの親和性を向上させる（すなわち、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドが、例えばＬＮＡおよび２’－ＭＯＥから独立して選択される、高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはギャップマー設計とも呼ばれ得る。ギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅＨ媒介分解を介した標的核酸の阻害に使用される。ギャップマーは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’－フランク、ギャップ、および３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を、５’－＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、ギャップマーがＲＮａｓｅＨを動員するのを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドの伸長を含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）が隣接する。領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するギャップマーの親和性を向上させる（すなわち、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドが、例えばＬＮＡおよび２’－ＭＯＥから独立して選択される、高親和性２’糖修飾などの２’糖修飾ヌクレオシドである。
【0074】
ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’側および３’側のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義され得る。
【0075】
領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含み得る。
【0076】
ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１４～１７、例えば１６～１８ヌクレオシドであり得る。
【0077】
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’１～８、例えば
Ｆ１～８－Ｇ７～１６－Ｆ’２～８
但し、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’１～８、例えば
Ｆ１～８－Ｇ７～１６－Ｆ’２～８
但し、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【0078】
本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマー（式中、領域ＦおよびＦ’は独立して１～８個のヌクレオシドを含むかまたはそれらからなり、そのうち１～４個は２’糖修飾され、ＦおよびＦ’領域の５’および３’末端を規定し、ＧはＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる６～１６個のヌクレオシドの領域である）からなるかまたはそれを含む。
【0079】
領域Ｆ、Ｇ、およびＦ’は、さらに以下に定義され、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式に組み込むことができる。
【0080】
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれか一方または両方が、ＬＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれからなるギャップマーである。β－Ｄ－オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれか一方または両方がβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれからなるギャップマーである。
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれか一方または両方が、ＬＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれからなるギャップマーである。β－Ｄ－オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’のいずれか一方または両方がβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むかまたはそれからなるギャップマーである。
【0081】
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーが、式：［ＬＮＡ］１～５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］１～５（式中、領域Ｇは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる連続ＤＮＡヌクレオシドの領域であるかまたはそれを含む）のものである。
【0082】
ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーが、設計［ＭＯＥ］１～８－［領域Ｇ］５～１６－［ＭＯＥ］１～８、例えば［ＭＯＥ］２～７－［領域Ｇ］６～１４－［ＭＯＥ］２～７、例えば［ＭＯＥ］３～６－［領域Ｇ］８～１２－［ＭＯＥ］３～６（式中、領域Ｇはギャップマーの定義において定義される通りである）のものである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーが、設計［ＭＯＥ］１～８－［領域Ｇ］５～１６－［ＭＯＥ］１～８、例えば［ＭＯＥ］２～７－［領域Ｇ］６～１４－［ＭＯＥ］２～７、例えば［ＭＯＥ］３～６－［領域Ｇ］８～１２－［ＭＯＥ］３～６（式中、領域Ｇはギャップマーの定義において定義される通りである）のものである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
【0083】
混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’－フルオロ－ＡＮＡ単位からなる群から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦとＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦとＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。
混合ウイングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’－フルオロ－ＡＮＡ単位からなる群から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦとＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦとＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドが、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。
【0084】
交互フランクギャップマー
フランキング領域は、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含んでよく、それらはＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互のモチーフを含むことから、「交互フランク」と呼ばれる。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と呼ばれる。したがって、「交互フランクギャップマー」は、少なくとも１つのフランク（ＦまたはＦ’）がＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の少なくとも一方、または領域ＦとＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。このような実施形態では、フランキング領域ＦもしくはＦ’、またはＦとＦ’の両方が少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の最も５’側および３’側のヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。
フランキング領域は、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含んでよく、それらはＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互のモチーフを含むことから、「交互フランク」と呼ばれる。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と呼ばれる。したがって、「交互フランクギャップマー」は、少なくとも１つのフランク（ＦまたはＦ’）がＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の少なくとも一方、または領域ＦとＦ’の両方が、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。このような実施形態では、フランキング領域ＦもしくはＦ’、またはＦとＦ’の両方が少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の最も５’側および３’側のヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。
【0085】
アンチセンスオリゴヌクレオチド内の領域Ｄ’またはＤ’’
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’、ならびにさらなる５’および／または３’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。さらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’およびＤ’’と呼ばれ得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’、ならびにさらなる５’および／または３’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。さらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’およびＤ’’と呼ばれ得る。
【0086】
領域Ｄ’またはＤ’’の付加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分または別の官能基に連結する目的のために使用され得る。連結に使用される場合、コンジュゲート部分を有する連続ヌクレオチド配列は、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それは、エキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。
【0087】
領域Ｄ’およびＤ’’は、それぞれ、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、またはＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はアンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ’’は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
【0088】
領域Ｄ’またはＤ’’は、独立して、１、２、３、４または５個の追加のヌクレオチドを含むかまたはそれからなり、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡまたはこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’またはＤ’’領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、さらなる５’および／または３’末端ヌクレオチドが、ホスホジエステル結合で結合されており、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’またはＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号パンフレットに開示されており、これには例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は国際公開第ＷＯ２０１５／１１３９２２号パンフレットに開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一アンチセンスオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
【0089】
一実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ’’を含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下の式によって表され得る：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’１～３－Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８－Ｄ’’１～３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’１～３－Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８－Ｄ’’１～３。
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’１～３－Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８－Ｄ’’１～３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’１～３－Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８－Ｄ’’１～３。
【0091】
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である。
【0092】
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域Ｄ’またはＤ’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。コンジュゲート部分は、任意に領域Ｄ’またはＤ’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
【0093】
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびそれらの合成については、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ編、第１６章、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、２００１およびＭａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００２、１２、１０３の包括的なレビューでも報告されている。
【0094】
いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）が、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0095】
リンカー
結合またはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、ある目的の化学基またはセグメントを別の目的の化学基またはセグメントに結合する、２個の原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
結合またはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、ある目的の化学基またはセグメントを別の目的の化学基またはセグメントに結合する、２個の原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
【0096】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、任意に、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）を含みうる。
【0097】
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常見られる条件下、または見られるものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、哺乳動物細胞で見られる、または見られるものに類似した、ｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件または酸化もしくは還元剤、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどに由来する、哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーが、Ｓ１ヌクレアーゼ切断を受けやすい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーが、少なくとも２つの連続するホスホジエステル結合を含むＤＮＡヌクレオシドなどの１～５個のヌクレオシドを含む。ホスホジエステルを含有する生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号パンフレットにより詳細に記載されている。
【0098】
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をアンチセンスオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の局所要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－ＣまたはＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）が、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）がＣ６アミノアルキル基である。いくつかの実施形態では、リンカーがＮＡである。
【0099】
ｓｉＲＮＡ
「低分子干渉」または「低分子干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子を標的とするヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対形成によって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列が標的化遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、遺伝子を「標的とする」。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さが３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二本鎖が、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さが１９～２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分はヘアピン構造の一部であり得る。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列の間に配置されたループ部分を含有し得る。ループの長さは様々であり得る。いくつかの実施形態では、ループが５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造はまた、３’または５’オーバーハング部分を含有することができる。いくつかの実施形態では、オーバーハングが、０、１、２、３、４または５ヌクレオチド長の３’または５’オーバーハングである。
「低分子干渉」または「低分子干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子を標的とするヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対形成によって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列が標的化遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、遺伝子を「標的とする」。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さが３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二本鎖が、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さが１９～２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分はヘアピン構造の一部であり得る。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列の間に配置されたループ部分を含有し得る。ループの長さは様々であり得る。いくつかの実施形態では、ループが５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造はまた、３’または５’オーバーハング部分を含有することができる。いくつかの実施形態では、オーバーハングが、０、１、２、３、４または５ヌクレオチド長の３’または５’オーバーハングである。
【0100】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ分子」は、前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）を形成する慣用的なステムループｓｈＲＮＡを含む。「ｓｈＲＮＡ」には、マイクロＲＮＡ埋め込みｓｈＲＮＡ（ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ）も含まれ、ｍｉＲＮＡ二本鎖のガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、既存の（または天然）ｍｉＲＮＡまたは修飾もしくは合成（設計）ｍｉＲＮＡに組み込まれる。転写されると、慣用的なｓｈＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ（プリｍｉＲＮＡ）または天然プリｍｉＲＮＡに非常に類似の構造を形成する。プリｍｉＲＮＡはその後、Ｄｒｏｓｈａおよびその補因子によってプレｍｉＲＮＡにプロセシングされる。したがって、「ｓｈＲＮＡ」という用語には、プリｍｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ－ｍｉｒ）分子およびプレｍｉＲＮＡ分子が含まれる。
【0101】
「ステムループ構造」は、主に一本鎖ヌクレオチドの領域（ループ部分）によって片側で連結された二本鎖または二本鎖（ステム部分）を形成することが知られているかまたは予測されるヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸を指す。「ヘアピン」および「折り返し」構造という用語もまた、本明細書では、ステムループ構造を指すために使用される。このような構造は当技術分野で周知であり、この用語は当技術分野におけるその既知の意味と一致して使用される。当技術分野で知られているように、二次構造は、正確な塩基対形成を必要としない。したがって、ステムは、１つ以上の塩基のミスマッチまたはバルジを含むことができる。あるいは、塩基対形成は正確であり得る、すなわちいかなるミスマッチも含まない。
【0102】
「ＲＮＡｉ発現構築物」または「ＲＮＡｉ構築物」は、ＲＮＡ干渉効果を達成するように設計された核酸調製物を含む総称である。ＲＮＡｉ発現構築物は、インビボで切断されてｓｉＲＮＡまたは成熟ｓｈＲＮＡを形成することができるＲＮＡｉ分子を含む。例えば、ＲＮＡｉ構築物は、インビボでｓｉＲＮＡまたは成熟ｓｈＲＮＡを生じさせることができる発現ベクターである。本発明に従って使用され得るベクターの非限定的な例は、本明細書において、例えば第４．６節に記載されている。長いまたは短いＲＮＡｉ構築物を作製および送達する例示的な方法は、例えば、国際公開第０１／６８８３６号パンフレットおよび国際公開第０１／７５１６４号パンフレットに見出すことができる。
【0103】
ｓｉＲＮＡは核酸配列によってコードされ得、核酸配列はプロモーターも含み得る。核酸配列は、ポリアデニル化シグナルも含み得る。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルが、合成最小ポリアデニル化シグナルである。
【0104】
処置
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の処置、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の処置、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
【0105】
発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、
－少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合と、
－以下：
からなる群から選択されるグアニン類似体を含む少なくとも１つのグアノシン類似体と
を含む、ポリヌクレオチドに関する。
第１の態様では、本発明は、
－少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合と、
－以下：
を含む、ポリヌクレオチドに関する。
【0106】
ポリヌクレオチドは、一本鎖、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
【0107】
ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどの二本鎖であり得る。
【0108】
ポリヌクレオチドは、１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含むことができる。このような２’糖修飾ヌクレオシドは、ロックド核酸および２’糖置換ヌクレオシドからなる群から独立して選択され得る。
【0109】
２’糖修飾ヌクレオシドは、
（式中、Ｂは天然または修飾核酸塩基であり、Ｚは隣接ヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり、Ｚ＊は隣接ヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合である）
からなる群から選択されるロックド核酸であり得る。
からなる群から選択されるロックド核酸であり得る。
【0110】
２’糖修飾ヌクレオシドは、
からなる群から選択され得る。
【0111】
グアノシン類似体は、
（式中、Ｒは、ＨまたはＯＨである）
からなる群から選択され得る。
【0112】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（Ｉａ）である。
【0113】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（Ｉｂ）である。
【0114】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（ＩＩａ）である。
【0115】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（ＩＩｂ）である。
【0116】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（Ｉｃ）である。
【0117】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（ＩＩｃ）である。
【0118】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（Ｉｄ）である。
【0119】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（ＩＩｄ）である。
【0120】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（Ｉｅ）である。
【0121】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体が（ＩＩｅ）である。
【0122】
本発明によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーであり得る。
【0123】
本発明によると、ポリヌクレオチドは、修飾リボースを有する少なくとも１つのさらなるヌクレオシドを含むことができ、リボース修飾は、ロックド核酸または他の２’修飾からなる群から選択される。
【0124】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体がギャップマーのギャップ領域にあり、かつ式Ｉａまたは式ＩＩｂのものであり、式中、ＲがＨである。
【0125】
本発明の一実施形態では、グアノシン類似体がギャップマーのフランクに無い。
【0126】
本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドがグアノシン類似体を１つ含む。
【0127】
本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドがグアノシン類似体を２つ含む。
【0128】
本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドがグアノシン類似体を３つ含む。
【0129】
本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドが天然グアノシンを含まない。
【0130】
本発明の一実施形態では、ポリヌクレオチドが、
ＣＴＣＡａｃｔｔｇオキソｃｔｔｔａＡＴ（配列番号４）；
ＣＴＣＡｔａｃｔｔｇＮｃｔｔｔａＡＴ（配列番号５）；
ＣＴＣＡｔａｃｔｔｇＰＰＧｃｔｔｔａＡＴ（配列番号６）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＣ（配列番号９）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＰＰＧＣ（配列番号１０）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇオキソＣ（配列番号１１）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＮＣ（配列番号１３）；
ＡＣＡｇオキソｇオキソａｔｔａｇオキソｔｔＣＴＡ（配列番号１５）；および
ＡＣＡｇＰＰＧｇＰＰＧａｔｔａｇＰＰＧｔｔＣＴＡ（配列番号１６）
（これらの配列中の大文字はＬＮＡ修飾リボースを有するヌクレオシドを示し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、これらの配列中の小文字はＤＮＡを示し、
ｇＰＰＧは７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシンであり、
ｇＮは８－アミノ－ｄＧであり、
ｇオキソは８－オキソ－デオキシグアノシンである）
からなる群から選択されるアンチセンスである。
ＣＴＣＡａｃｔｔｇオキソｃｔｔｔａＡＴ（配列番号４）；
ＣＴＣＡｔａｃｔｔｇＮｃｔｔｔａＡＴ（配列番号５）；
ＣＴＣＡｔａｃｔｔｇＰＰＧｃｔｔｔａＡＴ（配列番号６）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＣ（配列番号９）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＰＰＧＣ（配列番号１０）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇオキソＣ（配列番号１１）；
ＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＮＣ（配列番号１３）；
ＡＣＡｇオキソｇオキソａｔｔａｇオキソｔｔＣＴＡ（配列番号１５）；および
ＡＣＡｇＰＰＧｇＰＰＧａｔｔａｇＰＰＧｔｔＣＴＡ（配列番号１６）
（これらの配列中の大文字はＬＮＡ修飾リボースを有するヌクレオシドを示し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、これらの配列中の小文字はＤＮＡを示し、
ｇＰＰＧは７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシンであり、
ｇＮは８－アミノ－ｄＧであり、
ｇオキソは８－オキソ－デオキシグアノシンである）
からなる群から選択されるアンチセンスである。
【0131】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴＣＡａｃｔｔｇオキソｃｔｔｔａＡＴ（配列番号４）である。
【0132】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴＣＡｔａｃｔｔｇＮｃｔｔｔａＡＴ（配列番号５）である。
【0133】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴＣＡｔａｃｔｔｇＰＰＧｃｔｔｔａＡＴ（配列番号６）である。
【0134】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＣ（配列番号９）である。
【0135】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＰＰＧＣ（配列番号１０）である。
【0136】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇオキソＣ（配列番号１１）である。
【0137】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴＡｃａｔｃｔｃａｔａｃｔＴｇＮＣ（配列番号１３）である。
【0138】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＣＡｇオキソｇオキソａｔｔａｇオキソｔｔＣＴＡ（配列番号１５）である。
【0139】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＣＡｇＰＰＧｇＰＰＧａｔｔａｇＰＰＧｔｔＣＴＡ（配列番号１６）
（上記配列中の大文字はＬＮＡ修飾リボースを有するヌクレオシドを示し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、これらの配列中の小文字はＤＮＡを示し、
ｇＰＰＧは７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシンであり、
ｇＮは８－アミノ－ｄＧであり、
ｇオキソは８－オキソ－デオキシグアノシンである）
である。
（上記配列中の大文字はＬＮＡ修飾リボースを有するヌクレオシドを示し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、これらの配列中の小文字はＤＮＡを示し、
ｇＰＰＧは７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシンであり、
ｇＮは８－アミノ－ｄＧであり、
ｇオキソは８－オキソ－デオキシグアノシンである）
である。
【0140】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明によるポリヌクレオチドに関する。これは、中枢神経系に投与するため、または神経障害、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アンジェルマン、アルツハイマー病、動脈瘤、背痛、ベル麻痺、脳および脊髄の先天性欠損、脳損傷、脳腫瘍、脳性麻痺、慢性疲労症候群、脳震盪、認知症、頸部および腰背部の椎間板疾患、浮動性めまい、てんかん、ギラン・バレー症候群、頭痛および片頭痛、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、ニューロパチー、神経筋および関連疾患、パーキンソン病、精神医学的症状（重度のうつ病、強迫性障害）、脊柱側弯症、発作、脊髄損傷、脊椎変形および障害、脊椎腫瘍、脳卒中および回転性めまいからなる群から選択されるＣＮＳ障害を処置するために使用され得る。
【0141】
本発明によるポリヌクレオチドは、髄腔内注射を介して投与することができる。
【0142】
本発明によるポリヌクレオチドは、Ｕｂｅ３Ａの調節が有益である医学的症状を処置するための医薬として使用するために、例えば、アンジェルマンを処置するために使用することができる。
【0143】
本発明によるポリヌクレオチドは、ＡＴＸＮ２の調節が有益である医学的症状を処置するための医薬として使用することができる。
【0144】
本発明によるポリヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３の調節が有益である医学的症状を処置するための医薬として使用することができる。
【0145】
本発明のポリヌクレオチドは、神経毒性の低下が必要とされる医薬として使用することができる。
【0146】
本発明はまた、毒性が低下した本発明のポリヌクレオチドを合成するための方法であって、さらなるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにホスホロアミダイトなどのヌクレオチドモノマーをカップリングさせることを含み、ヌクレオチドモノマーが、上記に定義されるグアノシン類似体を含む、方法に関する。
【0147】
本発明はまた、参照ポリヌクレオチドよりも毒性が低下したポリヌクレオチドを選択するための方法であって、ポリヌクレオチドが少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、神経毒性の低いポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドと比較して少なくとも１つのグアノシン類似体を含むという違いを伴って、参照ポリヌクレオチドおよび神経毒性の低いアンチセンスオリゴヌクレオチドが、同じヌクレオチド配列を有し、かつ少なくとも１つのグアノシンを含む、方法に関する。
【0148】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドアンチセンスまたはｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの製造における、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）および（ＩＩｅ）からなる群から選択されるグアノシン類似体を含有する化合物の使用に関する。
【0149】
本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートに関する。
【0150】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩、または上記で定義されるコンジュゲートに関する。
【0151】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る塩がナトリウム塩またはカリウム塩である。
【0152】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明によるコンジュゲート、または本発明による薬学的に許容され得る塩と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物。
【0153】
本発明はまた、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳを発現している標的細胞におけるＵｂｅ３ａ発現を上方制御するための方法であって、Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳを標的とする本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明によるコンジュゲート、または本発明による薬学的に許容され得る塩を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法に関する。
【0154】
いくつかの実施形態では、前記方法が、インビボ方法またはインビトロ方法である。
【0155】
本発明はまた、神経障害に罹患しているか、または罹患する可能性があるヒトなどの対象における神経障害を処置または予防するための方法であって、神経障害を予防または緩和するなどのために、治療有効量または予防有効量の本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるコンジュゲート、または本発明による薬学的に許容され得る塩を投与することを含む、方法に関する。
【0156】
少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２つ以上のホスホロチオエートを含むことができることを理解すべきである。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合または１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートである。
【0157】
一実施形態では、ロックド核酸が
（式中、Ｂは天然または修飾核酸塩基であり、Ｚは隣接ヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり、Ｚ＊は隣接ヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合である）
からなる群から選択される。
からなる群から選択される。
【0158】
本発明のアンチセンスの一実施形態では、２’修飾が、
からなる群から選択され得る。
【0159】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、修飾リボースを有する少なくとも１つのさらなるヌクレオシドを含むことができ、リボース修飾が、ロックド核酸または２’修飾からなる群から選択される。
【0160】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、上記で定義されるギャップマーである。
【0161】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下の式によって表され得る：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’１～３－Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８－Ｄ’’１～３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’１～３－Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８－Ｄ’’１～３
（式中、Ｆはフランクであり、Ｇはギャップである）。
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’１～３－Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８－Ｄ’’１～３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’１～３－Ｆ１～８－Ｇ５～１６－Ｆ’２～８－Ｄ’’１～３
（式中、Ｆはフランクであり、Ｇはギャップである）。
【0162】
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合である。
【0163】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、グアノシン類似体がギャップマーのギャップ内にあり得る。本発明によるいくつかの実施形態では、グアノシン類似体がギャップマーのフランクに無い。
【0164】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つのグアノシン類似体を含むことができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２つのグアノシン類似体を含むことができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３つのグアノシン類似体を含むことができる。
【0165】
本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが天然グアノシンを含まない。
【0166】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、慣用的なアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも比較的低い神経毒性を提供するので、医薬として使用することができる。これは、例えば髄腔内注射を介して中枢神経系に投与することができる。
【0167】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｕｂｅ３Ａの調節が有益である医学的症状、例えばアンジェルマン症候群を処置するための医薬として使用することができる。
【0168】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ２の調節が有益である医学的症状、例えば脊髄小脳失調症ＩＩ型（ＳＣＡ２）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するための医薬として使用することができる。
【0169】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３の調節が有益である医学的症状、例えば脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）を処置するための医薬として使用することができる。
【0170】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬の神経毒性の低下が必要とされる、医学的症状を処置するための医薬として使用することができる。
【0171】
本発明はさらに、参照化合物よりも神経毒性の低い本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するための方法であって、参照化合物および神経毒性の低いアンチセンスオリゴヌクレオチドが同じヌクレオチド配列を有し、かつ少なくとも１つのグアノシンを含み、神経毒性の低いアンチセンスオリゴヌクレオチドが参照化合物と比較して少なくとも１つのグアノシン類似体を含むという違いを有する、方法に関する。
【0172】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドの製造における、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）および（ＩＩｅ）からなる群から選択されるグアノシン類似体の使用に関する。
【0173】
本発明はまた、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートに関する。
【0174】
本発明はさらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩またはそのコンジュゲートに関する。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）が、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0175】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ナトリウム塩またはカリウム塩などの薬学的に許容され得る塩の形態であり得る。
【0176】
本発明はまた、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートまたは薬学的に許容され得る塩と、１つ以上の薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物に関する。
【0177】
本発明はまた、Ｕｂｅ３ａを発現している標的細胞におけるＵｂｅ３ａ発現を阻害するための方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはコンジュゲート、またはその薬学的に許容され得る塩を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法に関する。本発明は、インビボ方法またはインビトロ方法であり得る。
【0178】
本発明はさらに、神経障害に罹患しているか、または罹患する可能性があるヒトなどの対象における神経障害を処置または予防するための方法であって、神経障害を予防または緩和するなどのために、治療有効量または予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明によるコンジュゲート、または本発明の薬学的に許容され得る塩を投与することを含む、方法に関する。
【0179】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的の発現を阻害または下方制御することにより調節することができる。好ましくは、このような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％の発現の阻害、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、０．０３１μＭ、０．１μＭ、および０．４μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に施用した後、インビトロで標的ｍＲＮＡの発現レベルを少なくとも６０％または７０％阻害することができ得る。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、０．０３１μＭ、０．１μＭ、および０．４μＭのオリゴヌクレオチドを標的細胞に施用した後、インビトロで標的遺伝子の発現レベルを少なくとも５０％阻害することができ得る。好適には、実施例は、標的ＲＮＡまたはタンパク質阻害を測定するために使用され得るアッセイを提供する。標的調節は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、標的遺伝子発現の所望の調節を示すのに依然として十分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、アンチセンスオリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、および／または標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的の発現を阻害または下方制御することにより調節することができる。好ましくは、このような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％の発現の阻害、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、０．０３１μＭ、０．１μＭ、および０．４μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に施用した後、インビトロで標的ｍＲＮＡの発現レベルを少なくとも６０％または７０％阻害することができ得る。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、０．０３１μＭ、０．１μＭ、および０．４μＭのオリゴヌクレオチドを標的細胞に施用した後、インビトロで標的遺伝子の発現レベルを少なくとも５０％阻害することができ得る。好適には、実施例は、標的ＲＮＡまたはタンパク質阻害を測定するために使用され得るアッセイを提供する。標的調節は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、標的遺伝子発現の所望の調節を示すのに依然として十分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、アンチセンスオリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、および／または標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。
【0180】
本発明の一態様は、標的プレｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡまたはそれに由来する転写産物バリアントに対して少なくとも９０％の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【0181】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１０～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは、標的核酸または標的配列の領域と、少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または１００％相補的である。
【0182】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）である場合、またはいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つもしくは２つのミスマッチを含み得る場合に有利である。
【0183】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的核酸の領域に完全に（または１００％）相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
【0184】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸の領域、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的であるかまたはハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
【0185】
治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的であるかまたはハイブリダイズする標的核酸配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基の伸長を含む。連続ヌクレオチド配列は、１２～７０ヌクレオチド、例えば１２～５０、例えば１３～３０、例えば１４～２５、例えば１４～２０連続ヌクレオチドである。
【0186】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、１０～３０ヌクレオチド長、例えば１２～２５、例えば１１～２２、例えば１２～２０、例えば１４～１８または１４～１６連続ヌクレオチド長を含むか、またはそれからなる。
【0187】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６または１７ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解すべきである。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが１０～３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１０ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
【0188】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０連続ヌクレオチド長を含むか、またはそれからなる。
【0189】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２連続ヌクレオチド長を含むか、またはそれからなる。
【0190】
有利な実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシドの１つ以上がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合が有利である。
【0191】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、ＬＮＡヌクレオシドを含む。
【0192】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドを含む。
【0193】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドを含む。
【0194】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドを含み、連続ヌクレオチド結合の各ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0195】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドを含み、連続ヌクレオチド結合の各ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0196】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。
【0197】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドを含む。
【0198】
有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の最も３’側のヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである。
【0199】
有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートなどの少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。
【0200】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0201】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、ホスホロジチオエートヌクレオシド間結合である。
【0202】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。
【0203】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0204】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列内の少なくとも７５％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0205】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0206】
本発明の有利な実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈ、例えばＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することができる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列がギャップマーである。
【0207】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなるかまたはそれを含む。
【0208】
いくつかの実施形態では、領域Ｇが、６個～１６個のＤＮＡヌクレオシドからなる。
【0209】
いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’がそれぞれ、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。
【0210】
薬学的に許容され得る塩
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩、例えば、薬学的に許容され得るナトリウム塩、アンモニウム塩またはカリウム塩を提供する。
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩、例えば、薬学的に許容され得るナトリウム塩、アンモニウム塩またはカリウム塩を提供する。
【0211】
製造方法
さらなる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するための方法であって、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチド内に含まれる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻、２８７～３１３頁を参照されたい）。さらなる実施形態では、この方法が、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。さらなる態様では、本発明の組成物を製造する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントと混合することを含む、方法が提供される。
さらなる態様では、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するための方法であって、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチド内に含まれる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻、２８７～３１３頁を参照されたい）。さらなる実施形態では、この方法が、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。さらなる態様では、本発明の組成物を製造する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントと混合することを含む、方法が提供される。
【0212】
医薬組成物
さらなる態様では、本発明は、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、それだけに限らないが、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る希釈剤が、無菌リン酸緩衝生理食塩水または無菌炭酸ナトリウム緩衝液である。
さらなる態様では、本発明は、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、それだけに限らないが、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る希釈剤が、無菌リン酸緩衝生理食塩水または無菌炭酸ナトリウム緩衝液である。
【0213】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、薬学的に許容され得る希釈剤中の溶液、例えばＰＢＳまたは炭酸ナトリウム緩衝液に溶解した溶液の形態である。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容され得る塩が、粉末、例えば凍結乾燥粉末などの固体形態である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを溶液中に予め製剤化してもよく、またはいくつかの実施形態では、投与前に薬学的に許容され得る希釈剤に溶解され得る乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
【0214】
適切には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、０．１～１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１～１０ｍｇ／薬学的に許容され得る希釈剤の濃度で溶解され得る。
【0215】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、０．５～１００ｍｇ、例えば、１ｍｇ～５０ｍｇまたは２～２５ｍｇの単位用量で製剤化される。
【0216】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、薬学的に許容され得る希釈剤中５０～３００μＭの濃度で使用される。
【0217】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物または製剤を調製するために、薬学的に許容され得る活性または不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物を製剤化するための組成物および方法は、それだけに限らないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含むいくつかの基準に依存する。
【0218】
溶液などの医薬組成物は、慣用的な滅菌技術によって滅菌されてもよく、または滅菌フィルタにかけてもよい。得られた溶液は、そのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に無菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９または６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージなどのように、各々が固定量の上記の薬剤または薬剤群を含有する複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所施用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。
【0219】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートがプロドラッグである。特にアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分がアンチセンスオリゴヌクレオチドから切断される。
【0220】
用途
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として利用され得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として利用され得る。
【0221】
研究では、このようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）および実験動物におけるタンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析または治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解または阻害し、それによってタンパク質形成を防止することによって、またはタンパク質を生成する遺伝子もしくはｍＲＮＡのモジュレータを分解もしくは阻害することによって達成される。
【0222】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡに由来する合成核酸であり得る。
【0223】
本発明は、標的タンパク質を発現している標的細胞における遺伝子発現を調節するためのインビボまたはインビトロ方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効量で前記細胞に投与することを含む、方法を提供する。
【0224】
いくつかの実施形態では、標的細胞が、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、インビトロ細胞培養物または哺乳動物の組織の一部を形成するインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞が中枢神経系に存在する。
【0225】
治療用途
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、塩もしくは医薬組成物は、神経障害の予防または処置のために動物またはヒトに投与され得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、塩もしくは医薬組成物は、神経障害の予防または処置のために動物またはヒトに投与され得る。
【0226】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、塩もしくは医薬組成物で処置され得る神経障害は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、医薬組成物または塩を使用して予防、処置または改善され得る筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、動脈瘤、背痛、ベル麻痺、脳および脊髄の先天性欠損、脳損傷、脳腫瘍、脳性麻痺、慢性疲労症候群、脳震盪、認知症、頸部および腰背部の椎間板疾患、浮動性めまい、てんかん、ギラン・バレー症候群、頭痛および片頭痛、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、ニューロパチー、神経筋および関連疾患、パーキンソン病、精神医学的症状（重度のうつ病、強迫性障害）、脊柱側弯症、発作、脊髄損傷、脊椎変形および障害、脊椎腫瘍、脳卒中および回転性めまいであり得る。
【0227】
本発明は、上記の神経障害を予防または処置するために使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、組成物または塩を提供する。
【0228】
本発明はさらに、上記の神経障害を処置または予防するための医薬を製造するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物の使用に関する。
【0229】
本発明は、医薬として使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、医薬組成物または塩を提供する。
【0230】
本発明は、医薬を製造するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、医薬組成物または塩の使用を提供する。
【0231】
本発明は、上記の神経障害を予防または処置するために使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、医薬組成物または塩を提供する。
【0232】
本発明はさらに、上記の神経障害を処置または予防するための医薬を製造するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物の使用に関する。
【0233】
処置方法
本発明は、上記の神経障害に罹患しているか、または罹患する可能性があるヒトなどの対象における神経障害を処置または予防するための方法であって、治療有効量または予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物を、上記の神経障害に罹患しているか、または罹患しやすい対象に投与することを含む、方法を提供する。
本発明は、上記の神経障害に罹患しているか、または罹患する可能性があるヒトなどの対象における神経障害を処置または予防するための方法であって、治療有効量または予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物を、上記の神経障害に罹患しているか、または罹患しやすい対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0234】
例として、処置方法は、上記の神経障害からなる群から選択される適応症に罹患している対象におけるものであり得る。
【0235】
本発明の方法は、上記の神経障害を処置するためのものであり得る。
【0236】
本発明の方法は、好ましくは、上記の神経障害を処置または予防するために使用される。
【0237】
投与
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、非経口投与を介して投与され得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、非経口投与を介して投与され得る。
【0238】
いくつかの実施形態では、投与経路が皮下または静脈内である。
【0239】
いくつかの実施形態では、投与経路が、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、硬膜外、脳室内、眼内、髄腔内投与、および経椎間孔投与からなる群から選択される。
【0240】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物が脳を標的とする、すなわち脳に送達される。
【0241】
いくつかの有利な実施形態では、投与が、髄腔内投与、または硬膜外投与または経椎間孔投与を介する。
【0242】
有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物が髄腔内投与される。
【0243】
本発明はまた、神経障害を予防または処置するための医薬を製造するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えば本発明の医薬塩または組成物の使用であって、医薬が髄腔内投与用の剤形である、使用を提供する。
【0244】
本発明はまた、神経障害を予防または処置するための医薬を製造するための医薬を製造するために記載される本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用であって、医薬が髄腔内投与用の剤形である、使用を提供する。
【0245】
本発明はまた、神経障害を予防または処置するための医薬として使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えば本発明の医薬塩または組成物であって、医薬が髄腔内投与用の剤形である、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供する。
【0246】
本発明はまた、神経障害を予防または処置するための医薬として使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートであって、医薬が髄腔内投与用の剤形である、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供する。
【0247】
併用療法
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物が、別の治療剤との併用処置に使用される。治療剤は、例えば、上記の疾患または障害の標準治療であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物が、本発明の化合物または組成物の投与と同時にまたは独立して投与され得る低分子鎮痛薬と組み合わせて使用される。本発明の化合物と低分子鎮痛薬の併用療法の利点は、低分子鎮痛薬が、典型的には短い作用持続時間（数時間～数日間）で神経障害軽減活性の迅速な発現を有するのに対して、本発明の化合物が、遅延した活性発現（典型的には数日またはさらには１週間＋）を有するが、長い作用持続時間（数週間～数ヶ月、例えば２＋、３＋または４ヶ月＋）を有することである。
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物が、別の治療剤との併用処置に使用される。治療剤は、例えば、上記の疾患または障害の標準治療であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物が、本発明の化合物または組成物の投与と同時にまたは独立して投与され得る低分子鎮痛薬と組み合わせて使用される。本発明の化合物と低分子鎮痛薬の併用療法の利点は、低分子鎮痛薬が、典型的には短い作用持続時間（数時間～数日間）で神経障害軽減活性の迅速な発現を有するのに対して、本発明の化合物が、遅延した活性発現（典型的には数日またはさらには１週間＋）を有するが、長い作用持続時間（数週間～数ヶ月、例えば２＋、３＋または４ヶ月＋）を有することである。
【実施例】
【0248】
実施例Ａ：オリゴマー化合物の合成
標準的なホスホロアミダイト化学を使用して一本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。非修飾ＤＮＡホスホロアミダイトおよび全ての標準試薬は、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（ドイツのダルムシュタット）から購入した。ＬＮＡホスホロアミダイトを社内で製造した（ＬＮＡホスホロアミダイトも例えばＭｅｒｃｋ ＫＧａＡで市販されている）。８－アミノ－ｄＧ、８－オキソ－ｄＧ、７－デアザ－８－アザ－ｄＧ（ＰＰＧ）および２’－デオキシイノシンホスホロアミダイトは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から購入した。
標準的なホスホロアミダイト化学を使用して一本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。非修飾ＤＮＡホスホロアミダイトおよび全ての標準試薬は、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（ドイツのダルムシュタット）から購入した。ＬＮＡホスホロアミダイトを社内で製造した（ＬＮＡホスホロアミダイトも例えばＭｅｒｃｋ ＫＧａＡで市販されている）。８－アミノ－ｄＧ、８－オキソ－ｄＧ、７－デアザ－８－アザ－ｄＧ（ＰＰＧ）および２’－デオキシイノシンホスホロアミダイトは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から購入した。
【0249】
オリゴヌクレオチドを、ＭｅｒＭａｄｅ１２（テキサス州アービングのＬＧＣ ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）上のＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ３５０支持体（カリフォルニア州オーシャンサイドのＫｉｎｏｖａｔｅ）上で２０μｍｏｌスケールで合成した。合成後、オリゴヌクレオチドを、アンモニア水を使用して６５℃で一晩、支持体から切断した。オリゴヌクレオチドを、１０ｍＭ ＮａＯＨ緩衝液および２Ｍ ＮａＣｌの勾配を使用してＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷゲル（ドイツグリースハイムのＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上でのイオン交換によって精製し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ膜を使用して脱塩した。凍結乾燥後、化合物を最後に液体クロマトグラフィー－質量分析（逆相およびエレクトロスプレーイオン化－質量分析）によって特徴付けた。
【0250】
実施例１：マウスにおけるグアノシン類似体を含むオリゴヌクレオチドのインビボ試験
この実施例では、天然グアノシンまたはグアノシン類似体を含むギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを、以下の急性神経毒性アッセイにおいてそれらの神経毒性について試験した。
この実施例では、天然グアノシンまたはグアノシン類似体を含むギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを、以下の急性神経毒性アッセイにおいてそれらの神経毒性について試験した。
【0251】
１群当たり６匹のＣ５７ＢＬ／６黒色マウスからなる９つの群に、１００μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドの単回用量を脳室内注射を介して注射した。
【0252】
１群のマウスに生理食塩水を注射した。２群のマウスに配列番号１（対照）を注射した。３～９群のマウスに配列番号２～８をそれぞれ注射した。
【0253】
注射後のマウスの行動を、以下の行動スコアリングカテゴリー（０～４）に従って３０分、１時間、２４時間および１４日で観察、報告した：
Ａ．「多動、常同およびホームケージ行動」
Ｂ．「覚醒状態、探索および応答性の低下」
Ｃ．「運動協調性および強度」
Ｄ．「姿勢、外観および呼吸」
Ｅ．「振戦、多動、痙攣」
Ａ．「多動、常同およびホームケージ行動」
Ｂ．「覚醒状態、探索および応答性の低下」
Ｃ．「運動協調性および強度」
Ｄ．「姿勢、外観および呼吸」
Ｅ．「振戦、多動、痙攣」
【0254】
典型的には、高い神経毒性は、注射後３０分以内に運動失調、痙攣および発作として見られる。
【0255】
（表１）
これらの配列中の大文字は、ＬＮＡ修飾リボースを有するヌクレオシドを示す。全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンである
これらの配列中の小文字はＤＮＡを示す。
Ｎ．ａ．：異常なし
Ｉ：イノシンヌクレオシド
以下の修飾グアノシンヌクレオシドをこれらの配列で使用した：
ｇＰＰＧ：７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシン
ｇＮ：８－アミノ－ｄＧ：
ｇオキソ：８－オキソ－デオキシグアノシン
これらの配列中の大文字は、ＬＮＡ修飾リボースを有するヌクレオシドを示す。全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンである
これらの配列中の小文字はＤＮＡを示す。
Ｎ．ａ．：異常なし
Ｉ：イノシンヌクレオシド
ｇＰＰＧ：７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシン
【0256】
この試験は以下を示す：
－ ｇを含まない配列（配列番号１、対照）は神経毒性を示さない
－ ２個または３個のｇを含む配列（配列番号７および８）は、１個のｇを含む配列（配列番号２）と比較して相対的に高い神経毒性を示す
－ ｇを含む配列（配列番号２）は神経毒性を示す
－ Ｉを含む配列（配列番号３）は神経毒性を示す
－ ｇを含まない配列（配列番号１、対照）は神経毒性を示さない
－ ２個または３個のｇを含む配列（配列番号７および８）は、１個のｇを含む配列（配列番号２）と比較して相対的に高い神経毒性を示す
－ ｇを含む配列（配列番号２）は神経毒性を示す
－ Ｉを含む配列（配列番号３）は神経毒性を示す
【0257】
結論：
－ 配列中の多くのｇ：相対的に高い神経毒性
－ 配列中の修飾ｇは、非修飾ｇを含む配列と比較して相対的に低い神経毒性を示す。
－ 配列中のｇオキソおよびｇＰＰＧは、最も相対的に低い神経毒性を示す
－ 配列中の多くのｇ：相対的に高い神経毒性
－ 配列中の修飾ｇは、非修飾ｇを含む配列と比較して相対的に低い神経毒性を示す。
－ 配列中のｇオキソおよびｇＰＰＧは、最も相対的に低い神経毒性を示す
【0258】
７群および８群の急性神経毒性は安楽死をもたらす
ｇは毒性であり、多くのｇはより毒性が高く、修飾ｇはより毒性が低いことを示唆している。
ｇは毒性であり、多くのｇはより毒性が高く、修飾ｇはより毒性が低いことを示唆している。
【0259】
実施例２
実施例１の手順に従って、表２のギャップマー化合物を６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの８つの群で試験した。結果を表２に示す。
実施例１の手順に従って、表２のギャップマー化合物を６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの８つの群で試験した。結果を表２に示す。
【0260】
（表２）
これらの配列中の大文字は、ＬＮＡ修飾リボースを有するヌクレオシドを示す。全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンである
これらの配列中の小文字はＤＮＡを示す。
Ｎ．ａ．：異常なし
Ｉ：イノシンヌクレオシド
以下の修飾グアノシンヌクレオシドをこれらの配列で使用した：
ｇＰＰＧ：７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシン
ｇＮ：８－アミノ－ｄＧ
ｇオキソ：８－オキソ－デオキシグアノシン
これらの配列中の小文字はＤＮＡを示す。
Ｎ．ａ．：異常なし
Ｉ：イノシンヌクレオシド
以下の修飾グアノシンヌクレオシドをこれらの配列で使用した：
ｇＰＰＧ：７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシン
ｇＮ：８－アミノ－ｄＧ
ｇオキソ：８－オキソ－デオキシグアノシン
【0261】
この試験は、グアノシンを含まない配列が神経毒性を示さないことを示す、配列（配列番号１、対照）を参照されたいｇＰＰＧを含む配列（配列番号１０）は、天然グアノシンを含む同じ配列（配列番号９）と比較して、はるかに少ない神経毒性を示す。ｇオキソを含む配列（配列番号１１）は神経毒性を示さない。これは、天然グアノシン（配列番号９）およびｇＰＰＧ（配列番号１０）を含む同じ配列と比較することができる。Ｉを含む配列（配列番号１２）は、グアノシンを含む同じ配列よりも相対的に高い神経毒性を示す。ｇＮを含む配列（配列番号１３）は、グアノシンを含む同じ配列よりも相対的に高い神経毒性を示す。
【0262】
結論：本発明者らは、ポリヌクレオチド配列内の天然、すなわち、未修飾グアノシン核酸塩基の割合が、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチドが神経毒性となる可能性と直接相関していることを見出して驚いた。このような神経毒性は、急性かつ致死的であることを示す。グアノシン類似体ｇＰＰＧおよびｇオキソによる天然グアノシンの置換は、神経毒性を低下させた。
【0263】
実施例３
実施例１の手順に従って、表２のギャップマー化合物を６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの９つの群で試験した。結果を表３に示す。
実施例１の手順に従って、表２のギャップマー化合物を６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの９つの群で試験した。結果を表３に示す。
【0264】
（表３）
これらの配列中の大文字は、ＬＮＡ修飾リボースを有するヌクレオシドを示す。全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンである
これらの配列中の小文字はＤＮＡを示す。
Ｎ．ａ．：異常なし
Ｉ：イノシンヌクレオシド
以下の修飾グアノシンヌクレオシドをこれらの配列で使用した：
ｇＰＰＧ：７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシン
ｇＮ：８－アミノ－ｄＧ
ｇオキソ：８－オキソ－デオキシグアノシン
これらの配列中の小文字はＤＮＡを示す。
Ｎ．ａ．：異常なし
Ｉ：イノシンヌクレオシド
以下の修飾グアノシンヌクレオシドをこれらの配列で使用した：
ｇＰＰＧ：７－デアザ－８－アザ－デオキシグアノシン
ｇＮ：８－アミノ－ｄＧ
ｇオキソ：８－オキソ－デオキシグアノシン
【0265】
この試験は、５０μｇおよび１００μｇで試験された、ギャップに３つの天然グアノシンを含む同じヌクレオチド配列（配列番号１４）が神経毒性の用量依存的増加を示すことを明らかにしている。
【0266】
配列番号１４のギャップマーと同じヌクレオチド配列であるが、３つのグアノシン類似体（ｇオキソ）を含むもの（配列番号１５）を、５０μｇおよび１００μｇで試験したところ、配列番号１４のギャップマーと比較して相対的にはるかに低い神経毒性を示す。興味深いことに、用量を５０μｇから１００μｇに増加させた場合でも、神経毒性の増加はない。
【0267】
配列番号１４のギャップマーと同じヌクレオチド配列であるが、３つのグアノシン類似体（ｇＰＰＧ）を含むもの（配列番号１６）を、５０μｇおよび１００μｇで試験したところ、配列番号１４のギャップマーと比較して相対的にはるかに低い神経毒性を示す。興味深いことに、用量を５０μｇから１００μｇに増加させた場合でも、神経毒性の増加はない。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】