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特表2023-529567大集団をスクリーニングするための３－Ｄ磁気共鳴イメージング検出を使用した核酸増幅アッセイ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-11
(54)【発明の名称】大集団をスクリーニングするための３－Ｄ磁気共鳴イメージング検出を使用した核酸増幅アッセイ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20230704BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230704BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20230704BHJP
C12Q 1/6834 20180101ALI20230704BHJP
C12Q 1/6816 20180101ALI20230704BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/70
C12Q1/6834 Z
C12Q1/6816 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022569574
(86)(22)【出願日】2021-05-16
(85)【翻訳文提出日】2022-12-03
(86)【国際出願番号】 US2021032650
(87)【国際公開番号】W WO2021231993
(87)【国際公開日】2021-11-18
(31)【優先権主張番号】63/133,431
(32)【優先日】2021-01-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
(71)【出願人】
【識別番号】522444933
【氏名又は名称】ドライサミー ロガナサム
(74)【代理人】
【識別番号】100101281
【弁理士】
【氏名又は名称】辻永 和徳
(72)【発明者】
【氏名】ドライサミー ロガナサム
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ05
4B063QQ06
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QR72
4B063QR74
4B063QR75
4B063QR79
4B063QR83
4B063QS24
4B063QS25
4B063QS31
4B063QX01
4B063QX10
(57)【要約】
本発明は、ナノ粒子結合複合体形成による核酸増幅およびＭＲＩまたはＮＭＲ検出を用いた、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２などの病原体からの核酸のハイスループットスクリーニングおよび検出のための方法を提供する。特定の実施形態では、ＭＲＩは、複数の増幅された核酸－ナノ粒子複合体を同時に検出する三次元ＭＲＩである。特定の実施形態において、核酸は、等温ＬＡＭＰ技術によって増幅される。他の実施形態では、核酸はＰＣＲによって増幅される。本発明の方法は、パンデミック状況における多数のサンプルの迅速なスクリーニングに特に有用である。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程を含む、標的核酸を検出する方法：ａ） 標的核酸を含むサンプルを提供する工程；
ｂ） 少なくとも１つのプライマーを用いて標的核酸を増幅する工程、ここで該少なくとも１つのプライマーはビオチン化され、それによりビオチン化された標的核酸を調製する；
ｃ） ビオチン化された標的核酸をストレプトアビジン－ナノ粒子と反応させ、それにより増幅された標的核酸－ナノ粒子複合体を形成する工程；および
ｄ） ＭＲＩまたはＮＭＲで前記核酸－ナノ粒子複合体を検出する工程。
【請求項2】
標的核酸の増幅がＬＡＭＰまたはＰＣＲを含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
標的核酸の増幅が逆転写を含む、請求項１記載の方法。
【請求項4】
前記方法がＲＴ?ＬＡＭＰまたはＲＴ?ＰＣＲで行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
サンプルがヒト臨床サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
ヒト臨床試料が唾液または鼻スワブである、請求項５記載の方法。
【請求項7】
試料が、キレート剤、プロテイナーゼＫ、塩酸グアニジウム、グアニジウム組成物およびそれらの組み合わせの少なくとも１つで処理され、細胞を溶解もしくは解離するか、または会合タンパク質から核酸を放出する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
核酸の単離または精製を必要としない、請求項７記載の方法。
【請求項9】
標的核酸が病原体の核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項10】
病原体が病原性ウイルスまたはバクテリアである、請求項９記載の方法。
【請求項11】
ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその変種である、請求項１０記載の方法。
【請求項12】
以下の工程を含む、標的核酸の存在について複数のサンプルをスクリーニングする方法：ａ） 標的核酸を含む複数の臨床サンプルを提供する工程；
ｂ） 少なくとも１つのプライマーを用いて複数の臨床サンプルの各々における標的核酸を増幅する工程であって、少なくとも１つのプライマーがビオチン化されていることにより、複数のビオチン化された標的核酸サンプルを調製する工程；
ｃ） 複数のビオチン化標的核酸サンプルのそれぞれをストレプトアビジン結合ナノ粒子と反応させ、それにより複数の増幅された標的核酸－ナノ粒子複合体を形成する工程；および
ｄ） ＭＲＩまたはＮＭＲにより複数の核酸－ナノ粒子複合体を検出する工程。
【請求項13】
標的核酸を増幅することがＬＡＭＰまたはＰＣＲを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
標的核酸の増幅が逆転写を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項15】
標的核酸の増幅がＲＴ－ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＰＣＲである、請求項１２記載の方法。
【請求項16】
複数のサンプルがヒト臨床サンプルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
ヒト臨床試料が唾液または鼻スワブである、請求項１６記載の方法。
【請求項18】
前記複数の臨床サンプルが、キレート剤、プロテイナーゼＫ、グアニジウム塩酸塩、グアニジウム組成物およびそれらの組み合わせの少なくとも１つで処理され、細胞を溶解または解離し、または会合タンパク質から核酸を放出する、請求項１２に記載の方法。
【請求項19】
核酸の単離または精製を必要としない、請求項１８記載の方法。
【請求項20】
標的核酸が病原体の核酸である、請求項１２記載の方法。
【請求項21】
病原体が病原性ウイルスまたはバクテリアである、請求項２０記載の方法。
【請求項22】
ウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその変種である、請求項２１記載の方法。
【請求項23】
前記複数の核酸?ナノ粒子複合体を同時に検出するＭＲＩが、３?Ｄ ＭＲＩである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、米国仮特許出願番号６２／７０４，５４０（２０２０年５月１４日出願）および６３／１３３，４３１（２０２１年１月４日出願） の３５ＵＳＣ§１１９に基づく優先権の利益を主張する。これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本発明は、三次元イメージングを使用して、多数のサンプル中の１つまたは複数の標的核酸配列の存在または非存在を同時に検出するための方法およびシステムに関する。具体的には、本発明は、三次元（３－Ｄ）磁気共鳴検出を使用した、ヒト臨床検体中の核酸配列の大規模で高感度かつ迅速な検出に関する。本発明の方法は、多数のヒトおよび／またはヒト以外の動物において、風土病、伝染病、特にパンデミックの状況で必要に応じて、生物学的標本（例えば、鼻スワブ、唾液、痰、血液など）中の微生物学的病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の存在についての診断的スクリーニングに特に有用である。
本発明は、三次元イメージングを使用して、多数のサンプル中の１つまたは複数の標的核酸配列の存在または非存在を同時に検出するための方法およびシステムに関する。具体的には、本発明は、三次元（３－Ｄ）磁気共鳴検出を使用した、ヒト臨床検体中の核酸配列の大規模で高感度かつ迅速な検出に関する。本発明の方法は、多数のヒトおよび／またはヒト以外の動物において、風土病、伝染病、特にパンデミックの状況で必要に応じて、生物学的標本（例えば、鼻スワブ、唾液、痰、血液など）中の微生物学的病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）の存在についての診断的スクリーニングに特に有用である。
【背景技術】
【0003】
核酸増幅法を用いて特定の核酸配列の存在を検出することは、強力な診断ツールである。ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）、ループ媒介等温増幅（Loop Mediated Isothermal Amplification：ＬＡＭＰ）およびその他の方法により、多数のサンプルに存在する特異性標的ＤＮＡ配列を迅速に増幅することができる。逆転写（reverse transcription:ＲＴ）増幅の発見と臨床利用により、細菌、真菌、人間を含む植物および動物、ならびに生命体における、ＲＮＡウイルス（インフルエンザ、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＣＯＶＩＤ－１９、デングウイルス、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、西ナイル熱、エボラウイルス、狂犬病、ポリオ、おたふくかぜ、および麻疹ウイルスなど）、ならびにＤＮＡウイルス（例えば、パピローマウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノウイルス）からの遺伝物質の検出が可能になった。
【0004】
最近のＳＡＲＳ?ＣｏＶ?２パンデミックは、ウイルス病原体の迅速でハイスループットな大規模監視の緊急の必要性と重要性を実証した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスおよび関連するコロナウイルス（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）および中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こす）の急速な拡散は、非常に危険であることが証明されており、ウイルスの伝染を止めるために長期間にわたり世界の大部分が閉鎖されている。このような致命的なウイルスの拡散を制御するには、感染した個人を特定、追跡、隔離できるように、迅速な検出が必要である。
【0005】
ＣＯＶＩＤ－１９は、２０１９年１２月に中国の湖北省武漢で最初に認識された、新たに出現したコロナウイルスである重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（coronavirus - Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus 2：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる気道感染症である。このウイルスの配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＳＡＲＳコロナウイルス１と密接に関連するベータコロナウイルスであることを示唆している。Wu et al., “A new coronavirus associated with human respiratory disease in China” Nature 579:265 (2020)を参照。
【0006】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した世界中の何億人もの人々をクリーニングおよび診断するには、１日当たり数百万の臨床サンプルを低コストで処理できる方法およびシステムが必要である。従来のシステムではこれらの目標を達成するには遅かったため、感染が急増し、多くの人がＣＯＶＩ－１９で死亡した。
【0007】
ＳＡＲＳ?ＣｏＶ?２などのＲＮＡウイルスに対する標準的な分子診断試験は、ウイルスＲＮＡ抽出および定量的逆転写ＰＣＲ（quantitative reverse transcriptase PCR:ＲＴ?ｑＰＣＲ）を含む多段階プロセスである。多くの企業がウイルスＲＮＡを増幅するＲＴ－ＰＣＲキットを製造しているが、あらゆる規模でのＲＮＡ抽出は困難である。診断ラボでは、特定の試薬と消耗品を必要とする自動化されたプラットフォームを使用して、一度に限られた数のサンプルに対して実行される。この柔軟性のなさは、既存の研究設備を備えた大規模な新しい研究所を建設して試験能力を高め、非特異的な試薬やプラスチックを使用できるようにするよりオープンなプラットフォームでＲＮＡを抽出するという多大な努力につながっている。
【0008】
都市中心部に住む何百万人もの人々から短期間で収集された鼻スワブ（nasal swab）および口腔唾液サンプル（oral saliva samples）などのヒトサンプルの大規模で迅速なスクリーニングは、間違いなくパンデミックの蔓延を防ぐのに役立つだろう。大規模なスクリーニングには、プロセスを自動化するための調整された取り組みとシステムを必要とする複数の工程が必要である。これらの手順は次のとおりである。
【0009】
ａ． サンプル収集、
ｂ． サンプルの梱包と処理場所への輸送、
ｃ． 病原体を殺し、遺伝物質を放出するためのウイルスの不活化とサンプルの溶解（lysis）、
ｄ． 核酸の精製と濃縮、
ｅ． ウイルスＲＮＡの逆転写、
ｆ． ＬＡＭＰまたはＰＣＲを使用した核酸増幅、
ｇ． 増幅されたＤＮＡの検出、
ｈ． データ処理による結果の可視化
ｉ． 収集されたサンプルにおける陽性サンプルと陰性サンプルの同定（identification）、および個人の診断への翻訳、
ｊ． 任意に、ウイルス株とその変異体の同定。
ｂ． サンプルの梱包と処理場所への輸送、
ｃ． 病原体を殺し、遺伝物質を放出するためのウイルスの不活化とサンプルの溶解（lysis）、
ｄ． 核酸の精製と濃縮、
ｅ． ウイルスＲＮＡの逆転写、
ｆ． ＬＡＭＰまたはＰＣＲを使用した核酸増幅、
ｇ． 増幅されたＤＮＡの検出、
ｈ． データ処理による結果の可視化
ｉ． 収集されたサンプルにおける陽性サンプルと陰性サンプルの同定（identification）、および個人の診断への翻訳、
ｊ． 任意に、ウイルス株とその変異体の同定。
【0010】
これらの工程は、迅速で、信頼性が高く、正確で、実行可能な結果を??サンプルからタイムリーかつ費用対効果の高い方法で回答するために適切に編成する必要があり、それにより、隔離、治療、および接触追跡を介して病気の蔓延を阻止するために介入する必要がある。
【0011】
現在のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックにおいて、伝統的なＲＴ－ＰＣＲの先行技術の方法は、１システムにつき１日当たり少数のヒトサンプルのみをスクリーニングできる制限された能力を提供した。従来の病気の監視では、大規模なスクリーニングの必要はなかったが、その制限はＣＯＶＩＤ－１９の多くの犠牲者にとって致命的であることが判明した。利用可能な技術では、パンデミックの初期には、大規模な集団のスクリーニングに１日以上、最大で１週間以上かかった。利用可能なスクリーニング方法では、感染者が特定されるまでに、ウイルスはさらに多くの人々に広がり、このパンデミックは制御不能になり、世界中に広がった．
【0012】
以下を含むいくつかのボトルネックが特定されており、これにより検査能力が需要と必要性を満たすことができなかった；科学的に訓練された技術者が抽出を行う必要があり、人々から鼻のサンプルを採取すヒトの臨床サンプルから核酸を抽出するためには多くの工程が必要であり、抽出のためには複雑なオートメーション装置、大量の消耗品、多数の科学的に訓練された技術者が必要であり、ヒトサンプルを採取するためには多くの医療従事者が必要だった。また自己採取のための適切な手段はなかった。世界中で毎日何億ものヒトサンプルを処理するには、高価で洗練されたリアルタイムＰＣＲおよびリアルタイムＬＡＭＰ機器、大量の試薬、大量の個人用保護具、および大量のラボスペースが必要だった。
【0013】
ＰＣＲ法の使用は、プロセスを著しく遅らせた。なぜなら、特別に設計された機器が、毎分または数十回の増幅サイクル中にサンプルの温度を急速に変化させる必要があり、そのような機器は、特にすべてのサンプルに専用の検出器を備え、それぞれがサンプル量をリアルタイムで追跡し、結果をグラフィカルにプロットする洗練された高価な機器を使用しても、リアルタイムＰＣＲが使用される場合、サンプル容量が限られているからである。ＬＡＭＰなどのより単純な方法は、単一の温度で核酸増幅を実行し、このボトルネックを克服する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
ＣＯＶＩＤ?１９の経験に照らして、新しい病原体が出現したときのために、迅速に適応および展開するのに十分迅速で、ハイスループットで、機敏な病原体検出方法が引き続き必要とされている。
【0015】
発明の概要
本発明は、以下の工程を含む、標的核酸を検出するための方法を提供する。
ａ） 標的核酸を含むサンプルを提供する工程；
ｂ） 標的核酸を少なくとも１つのプライマー（primer）で増幅する工程であって、該少なくとも１つのプライマーがビオチン化（biotinylated）されており、それによりビオチン化された標的核酸を調製する工程；
ｃ） 該ビオチン化された標的核酸をストレプトアビジン－ナノ粒子（streptavidin-nanoparticles）と反応させ、それにより増幅された標的核酸－ナノ粒子複合体（target nucleic acid-nanoparticle complexes）を形成する工程；および、
ｄ） ＭＲＩまたはＮＭＲで該核酸－ナノ粒子複合体を検出する工程。
本発明は、以下の工程を含む、標的核酸を検出するための方法を提供する。
ａ） 標的核酸を含むサンプルを提供する工程；
ｂ） 標的核酸を少なくとも１つのプライマー（primer）で増幅する工程であって、該少なくとも１つのプライマーがビオチン化（biotinylated）されており、それによりビオチン化された標的核酸を調製する工程；
ｃ） 該ビオチン化された標的核酸をストレプトアビジン－ナノ粒子（streptavidin-nanoparticles）と反応させ、それにより増幅された標的核酸－ナノ粒子複合体（target nucleic acid-nanoparticle complexes）を形成する工程；および、
ｄ） ＭＲＩまたはＮＭＲで該核酸－ナノ粒子複合体を検出する工程。
【0016】
特定の実施形態では、標的核酸の増幅工程はＬＡＭＰまたはＰＣＲ、ＲＴ－ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＰＣＲ、および逆転写を含むことができる。
【0017】
特定の実施形態では、サンプルは、唾液または鼻スワブなどのヒト臨床サンプルである。
【0018】
特定の態様では、キレート剤、プロテイナーゼＫ、グアニジウム塩酸塩、グアニジウム組成物およびそれらの組み合わせの少なくとも１つで処理され、細胞を溶解または解離するか、または会合タンパク質から核酸を放出するが、典型的には核酸の単離または精製を必要としない。
【0019】
標的核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその変異体などの病原性ウイルスまたは細菌などの病原体の核酸であり得る。
【0020】
本発明はまた、標的核酸の存在について、上記のように複数のサンプルをスクリーニングするための方法を提供し、以下の工程を含む：
ａ） 標的核酸を含む複数の臨床サンプルを提供する工程；
ｂ） 少なくとも１つのプライマーを用いて複数の臨床サンプルの各々における標的核酸を増幅する工程であって、少なくとも１つのプライマーがビオチン化されており、それにより複数のビオチン化された標的核酸サンプルを調製する工程；
ｃ） 複数のビオチン化標的核酸試料のそれぞれをストレプトアビジン結合ナノ粒子と反応させ、それにより複数の増幅された標的核酸－ナノ粒子複合体を形成する工程；および、
ｄ） ＭＲＩまたはＮＭＲにより複数の核酸－ナノ粒子複合体を検出する工程。
ａ） 標的核酸を含む複数の臨床サンプルを提供する工程；
ｂ） 少なくとも１つのプライマーを用いて複数の臨床サンプルの各々における標的核酸を増幅する工程であって、少なくとも１つのプライマーがビオチン化されており、それにより複数のビオチン化された標的核酸サンプルを調製する工程；
ｃ） 複数のビオチン化標的核酸試料のそれぞれをストレプトアビジン結合ナノ粒子と反応させ、それにより複数の増幅された標的核酸－ナノ粒子複合体を形成する工程；および、
ｄ） ＭＲＩまたはＮＭＲにより複数の核酸－ナノ粒子複合体を検出する工程。
【0021】
標的核酸の増幅には、ＬＡＭＰまたはＰＣＲまたはＲＴ－ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＰＣＲが含まれ得る。特定の態様では、標的核酸の増幅には逆転写が含まれる。
特定の実施形態では、ＭＲＩは、複数の核酸－ナノ粒子複合体を同時に検出する３－Ｄ ＭＲＩである。
特定の実施形態では、ＭＲＩは、複数の核酸－ナノ粒子複合体を同時に検出する３－Ｄ ＭＲＩである。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図5】図５は、本発明の一実施形態によるＤＮＡ分析物を検出するためのプロセスを示す。パネルＡは、使用したテンプレート、プライマー、およびナノ粒子を示している。パネルＢは、プロセスの方法の手順を示している。Ｂ＝ビオチン（biotin）。Ｓ＝ストレプトアビジン。ＮＰ＝ナノ粒子コア。
【発明を実施するための形態】
【0023】
詳細な説明
定義
前述の一般的な説明と以下の詳細な説明の両方が、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される本発明を限定するものではないと理解すべきである。本明細書で使用される単数形の使用は、特に断りのない限り、複数形を含む。本明細書で使用される時、「または」は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。本明細書で使用される場合、「含む」などの用語、またはその任意の他の変形は非限定的に理解されるべきであり、プロセス、方法、組成物、反応混合物、キット、または装置は、それらの要素のみを含むのではなく非排他的な包含をカバーすることを意図しており、そのようなプロセス、方法、組成物、反応混合物、キット、または装置に明示的に列挙されていない固有の他の要素を含む場合がある。本明細書で使用されているセクションの見出しは、構成のみを目的としており、説明されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
定義
前述の一般的な説明と以下の詳細な説明の両方が、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される本発明を限定するものではないと理解すべきである。本明細書で使用される単数形の使用は、特に断りのない限り、複数形を含む。本明細書で使用される時、「または」は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。本明細書で使用される場合、「含む」などの用語、またはその任意の他の変形は非限定的に理解されるべきであり、プロセス、方法、組成物、反応混合物、キット、または装置は、それらの要素のみを含むのではなく非排他的な包含をカバーすることを意図しており、そのようなプロセス、方法、組成物、反応混合物、キット、または装置に明示的に列挙されていない固有の他の要素を含む場合がある。本明細書で使用されているセクションの見出しは、構成のみを目的としており、説明されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0024】
特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載される分子生物学、生化学、および有機化学に関連して使用される命名法、ならびに実験手順および技術は、当技術分野で知られているものである。標準的な化学的および生物学的記号および略語は、そのような記号および略語によって表されるフルネームと同じ意味で使用される。したがって、例えば、「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」という用語は、同一の意味を有すると理解される。化学合成、化学分析、組換えＤＮＡ法、およびオリゴヌクレオチド合成のための標準的な技術を使用することができる。反応および精製技術は、例えば、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従ってキットを使用して行うことができる。前述の技術および手順は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、および本明細書全体で引用および議論される様々な一般的またはより具体的な参考文献に記載されているように実行され得る。例えば以下が参照され、その全体が本明細書に組み込まれる；Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)); Rieger et al, 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5th Ed., Berlin: Springer-Verlag; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al, Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement); Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth. Enzymol. 68; Wu et al, (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; and Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York。
【0025】
化学における一般的な用語の定義は、Compendium of Chemical Terminology (IUPAC recommendations), 2nd Ed., 1997, Blackwell Science Inc, Oxford, U.K. (McNaught, ed.) に見出すことができる。これは、goldbook (dot) iupac (dot) orgで、ワールドワイドウェブ上の検索可能なオンラインフォームで入手でき、これは本明細書に参照として組み込まれる。ＮＭＲに関連する原理、方法、計算、および用語については、以下が参照され、これは本明細書に参照として組み込まれる；Levitt, 2008, Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance John, 2nd Ed., John Wiley & Sons, Inc., West Sussex, England; Palmer, III, et al., 2005, Protein NMR Spectroscopy, Second Edition: Principles and Practice, Elsevier Academic Press, San Diego, CA; Ernst et al. (eds.), 1990, Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions, Oxford University Press, Oxford, UK; Mehring et al., 2001, Object-Oriented Magnetic Resonance: Classes and Objects, Calculations and Computations, Academic Press, San Diego, CA; Abragam, 1961, The Principles of Nuclear Magnetism, (International Series of Monographs on Physics, Book 32), Oxford: Clarendon Press, Clarendon, UK; Slichter, 1990, Principles of Magnetic Resonance, Springer, Berlin; Fukushima et al, 1981, Experimental Pulse NMR: A Nuts and Bolts Approach, Addison-Wesley, London。
【0026】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「ａ」または「ａｎ」は、それが使用される文脈に応じて、１つまたは複数を意味し得ることが理解されるべきである。したがって、例えば、「細胞」への言及は、少なくとも１つの細胞、２つの細胞、または複数（３つ以上）の細胞を意味し得る。
【0027】
本明細書で使用される「約」は、「約」と呼ばれる数が、記載された数プラスマイナス１－１０％を含むことを意味する。例えば、「約」５０ヌクレオチドは、場合によって４５－５５ヌクレオチド、または４９－５１ヌクレオチドを意味する。ここに記載されている場合は常に、「４５－５５」などの数値範囲は、指定された範囲内の各整数を指す。たとえば、「４５－５５ヌクレオチド」は、核酸が４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチドから５５ヌクレオチドまでを含むことを意味する。説明する範囲に「１．２％－１０．５％」などの小数値が含まれる場合、その範囲は最小増分の各小数値を指す所定の範囲で示される。たとえば、「１．２％－１０．５％」は、１０．５％までの１．２％、１．３％、１．４％、１．５％などなどから１０．５％の割合を意味する。「１．２０％－１０．５０％」は、パーセンテージが１．２０％、１．２１％、１．２２％、１．２３％などで、１０．５０％以下であることを示す。
【0028】
本明細書で使用される「転写」は、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）によって触媒されるＤＮＡの１つの鎖（すなわち、テンプレート）のＲＮＡコピーの酵素的合成を指す。「逆転写」とは、逆転写酵素ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって触媒される、ＲＮＡの一方の鎖（すなわち、テンプレート）のＤＮＡコピーの酵素的合成を指す。
【0029】
本明細書で使用される「標的分析物」または「標的」は、限定されないが、アッセイで検出することが望ましく、サンプル中に存在し得る任意の分子、分子複合体、細胞または他の物質を指す。本発明の特定の態様において、核酸標的は、アビジンおよびストレプトアビジンに対して例外的な結合親和性を有するビオチンでタグ付けすることができ、ナノ粒子にカップリングされた標的特異的結合部位がアビジンまたはストレプトアビジンである時に、本発明の方法による標的の見地を容易にする。ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンの間に形成される結合は、約１０－１４から１０－１５ＭのＫｄで既知の非共有結合の中で最も高い親和性を持っている。ビオチンは、末端標識プライマーを使用してＰＣＲ中にＤＮＡに組み込むことができる小分子で、一方または両方の末端にビオチンを有する二本鎖ＤＮＡ産物を生成する。ビオチンは、ビオチン－４－ｄＵＴＰ などのビオチン化デオキシリボヌクレオシド ５’－三リン酸（ｄＮＴＰ）およびエキソヌクレアーゼを含まない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例： VentR
R (exo-), New England Biolabs, Ipswich, MA）を使用してＰＣＲ中にＤＮＡに組み込むこともできる。Tasara et al., Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31:2636-46, 2003を参照。
【0030】
ｄＴＴＰをビオチン－４－ｄＵＴＰで置き換え、適切なテンプレートと組み合わせることにより、標的分析物の高度なビオチン化が促進される。ストレプトアビジンとアビジンは、それぞれビオチンの４分子に結合する多量体タンパク質である。
【0031】
さらに、ビオチンはストレプトアビジンに協調的に結合すると考えられているため、複数のビオチン分子が単一のストレプトアビジンに結合し、より高次のＮＰＣ－Ａ複合体が形成される（後述）。Sano et al., J. Biol. Chem., 265: 3369-3373,1990を参照（参照により本明細書に組み込まれる）。ストレプトアビジンに結合するビオチンの高い比率が望ましくない状況では、ストレプトアビジンの一価、二価、三価、および組み換え型を使用することができる。 Fairhead, et al. J. Mol. Biol. 426: 199-214 (2014)を参照（参照により本明細書に組み込まれる。）
【0032】
したがって、図５に示されている本発明の一実施形態では、標的分析物は核酸であるか、標的は核酸を含む細胞またはウイルスであり、それらはビオチン化プライマーを使用して増幅される。
【0033】
また、「標的分析物」という用語によって企図されるのは、無傷の標的（intact target）の代理（surrogate）として標的分析物に由来する種である。例えば、ウイルスに特異的な核酸を検出することにより、ウイルスを検出することができる。そのような代用物（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、本発明の特定の実施形態に従ってウイルスを検出する目的のための標的分析物と考えることができる。このような場合、ウイルス特異的核酸を検出することを「ウイルスを検出する」と呼ぶ。当業者は、行うことができる推論および行うことができない推論を含む、標的分析物と代理分子との間の区別を理解するであろう。例えば、ウイルス核酸の検出は、伝染性および複製可能なウイルスが存在するかどうかを示さない。
【0034】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、物質のアリコートをいい、多くの場合生物学的物質に由来することができる水溶液または水性懸濁液を指し、標的分析物を含む可能性のあるものであることができる。本発明の方法によって検体の存在についてアッセイされるサンプルとしては、例えば、細胞、組織、ホモジネート、溶解物、抽出物、精製または部分精製されたタンパク質および他の生体分子およびそれらの混合物があげられる。本発明の方法で典型的に使用される試料の非限定的な例には、全血、血清、血漿、脳脊髄液、喀痰、気管支洗浄液、気管支吸引液、尿、リンパ液、および呼吸器の様々な外分泌物、腸および泌尿生殖路、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫などのヒトおよび動物の体液；細胞培養上清などの体液；固定されているか固定されていない組織標本、固定されているか固定されていない細胞標本；空気サンプル、土壌サンプル、エアロゾル、ハイドロゾル、表面（ウェットまたはドライ）から得られたワイプサンプル（ウェットまたはドライ）、水またはその他の液体、食品と臨床検体、たとえば血液、尿、唾液、組織、痰、便などとの複合体などの環境サンプルがあげられる。
【0035】
本発明の方法で使用されるサンプルは、アッセイされる組織、細胞、抽出物または他の材料、特に生物学的材料の性質に基づいて変化する。細胞または他の生物学的材料から例えばホモジネート、懸濁液、溶液、抽出物および画分（核酸を含む）を調製する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載の方法に適合するサンプルを得るために容易に適合させることができる。
【0036】
本明細書で使用される「増幅」は、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントまたは領域などのポリヌクレオチドの同一のコピーを作成するプロセスを指す。増幅は、ＬＡＭＰポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成することができるが、当技術分野で知られている他の方法が、本発明のＤＮＡ断片を増幅するのに適している場合がある。
【0037】
「標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列」または「標的ＤＮＡまたはＲＮＡ」は、検出、キャラクタリゼーション、または定量化が望まれる対象のＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。標的ＤＮＡの実際のヌクレオチド配列は、知られているか知られていない可能性がある。「標的ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメント」または「標的フラグメント」は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントである。標的断片は、試料から単離するか、または例えば剪断、超音波処理、または１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼによる消化を含む任意の方法によって生成することができる。
【0038】
本明細書で使用される場合、「テンプレート」はポリヌクレオチドであり、それから相補的なオリゴまたはポリ－ヌクレオチドのコピーが合成されるポリヌクレオチドである。
【0039】
「合成」は、一般に、化学的手段または酵素的手段を介して核酸を生成するプロセスを指す。化学合成は、典型的には、使用できる核酸の一本鎖、ならびにプライマーおよびプローブを生成するために使用される。酵素を介した「合成」には、テンプレートからの転写と複製の両方が含まれる。合成には、ターゲットの単一コピーまたは複数コピーの作成が含まれる。「複数のコピー」とは、少なくとも２つのコピーを意味する。「コピー」は、テンプレート配列との完全な配列相補性または同一性を必ずしも意味しない。例えば、コピーには、ヌクレオチド類似体、意図的な配列変更（テンプレートにハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列変更など）、および／または合成の間に起きる配列エラーが含まれることができる。
【0040】
「ポリヌクレオチド」および「核酸（分子）」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドは、修飾されていても修飾されていなくてもよく、任意の三次元構造を持ち、既知または未知の任意の機能を奏することができる。「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖、二本鎖、および三重らせん分子を含む。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な実施形態である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。
【0041】
「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖核酸の２から約１００のヌクレオチドのポリヌクレオチドを指し、典型的にはＤＮＡである。オリゴヌクレオチドは、オリゴマーまたはオリゴとしても知られており、遺伝子および他の生物学的物質から単離するか、当技術分野で知られている方法によって化学的に合成することができる。「プライマー」は少なくとも６ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを指し、通常一本鎖であり、酵素媒介核酸合成の開始のための３’－ヒドロキシル末端を提供する。「ポリヌクレオチドプローブ」または「プローブ」は、相補的なポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「特異的に結合する（specifically binds）」または「特異的にハイブリダイズする（specifically hybridizes）」とは、所定の条件下での分子の別の分子への結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズを指す。したがって、プローブまたはプライマーは、所与の結合条件下で意図された標的ポリヌクレオチドのみに「特異的にハイブリダイズ」し、抗体は、所与の結合条件下で意図された標的抗原のみに「特異的に結合」する。所与の条件は、結合またはハイブリダイゼーションについて示された条件であり、当業者の知識の範囲内である緩衝液、イオン強度、温度および他の因子を含む。当業者はまた、特異的結合が破壊または解離され、したがって、例えば抗体－抗原、受容体－リガンドおよびプライマー－標的ポリヌクレオチドの組み合わせを溶出（eluting）またはメルティング（melting）できる条件についても熟知している。
【0042】
「核酸配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド塩基の配列を指す。二本鎖分子の場合、一本鎖を使用して両方の鎖を表すことができ、相補的な鎖はワトソン－クリック塩基対によって推測される。
【0043】
「相補的」または「相補性」という用語は、第２のポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドでもよい）と「逆方向会合（antiparallel association）」している第１のポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドでもよい）に関して使用される。本明細書で使用される場合、「逆方向会合」という用語は、２つの会合したポリヌクレオチドの個々のヌクレオチドまたは塩基が、ワトソン・クリックの塩基対規則に従って実質的に対になるような、２つのポリヌクレオチドの整列を指す。相補性は、ポリヌクレオチドの塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する「部分的」であり得る。しかしながら、ポリヌクレオチド間に「完全な」または「総合的な（total）」相補性が存在し得る。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドであることができる第１のポリヌクレオチドの長さ、第１ののポリヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度および誤って組合せられた塩基対の発生率を含む多くの変数の考慮により、二本鎖の安定を経験的に決定することができる。
【0044】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」という用語は、６個以上のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む、相補的核酸の塩基対形成に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の会合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関連する反応条件のストリンジェンシー（stringency）、形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、および二本鎖核酸内のＧ：Ｃ比などの要因によって影響を受ける。一般に、「ハイブリダイゼーション」法は、相補的ポリヌクレオチドを標的核酸（すなわち、直接的または間接的手段によって検出される配列）にアニーリングすることを含む。
【0045】
相補配列を含む２つのポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドの、互いに配置され、塩基ペアリング相互作用を介して互いにアニールされる能力は、よく認識された現象である。
【0046】
核酸の非特異的ハイブリダイゼーションが観察される場合、反応は、低ストリンジェンシーの代わりに中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーなどのより高いストリンジェンシーで実施することができる。本明細書で使用する「高ストリンジェンシー」とは、６０から６５℃で０．２から０．５ｘＳＳＣでのハイブリダイゼーション、または二本鎖形成が起こるために２つの一本鎖核酸間の１００％の相補性を必要とする条件を指す。「中ストリンジェンシー」は５０から６０℃で１から２ｘＳＳＣを指し、「低ストリンジェンシー」は４０から５０℃で４から６ｘＳＳＣを指す。ここで、１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである。核酸間のある程度のミスマッチは、中および低ストリンジェンシーで許容される。当業者は、さらに核酸ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させるか減少させるために使用することができる他の条件および薬剤(たとえば、上昇した温度、ホルムアミドの追加あるいはより高ＧＣ含量の選択された核酸分析物)に精通しているだろう。
【0047】
「複合体」は、成分の集合である。複合体は安定している場合も安定していない場合もあり、直接的または間接的に検出されることができる。例えば、本明細書に記載されるように、反応の特定の成分および反応の生成物のタイプが与えられると、複合体の存在を推測することができる。例えば、本明細書に記載の不完全転写法（abortive transcription method）において、複合体は一般に、最終不完全転写または複製産物などの最終反復合成産物に関する中間体である。
【0048】
本明細書で使用する用語「接触」（すなわち、標的分析物をナノ粒子と接触させること）は、一般に、１つの成分、試薬、標的分析物またはサンプルを別のものに接近させることを指す。例えば、接触は、磁性ナノ粒子を含む溶液を標的分析物を含むサンプルと混合することを含み得る。「接触」は、標的とナノ粒子をインビトロで一緒にインキュベートすることを含むことを意図している（例えば、標的分析物を含む液体サンプルにナノ粒子を添加する）。
【0049】
本明細書で使用される「実質的に」という用語は、かなりの範囲または程度を指す。例えば、「実質的に均一」は、ナノ粒子が液体全体に大部分または大きな程度分散している懸濁液を表すために使用できるが、ナノ粒子の分布のわずかな変動が懸濁液内の異なる場所に存在する場合がある。他の文脈では、「実質的に」という用語は、他の用語と組み合わせた場合、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を意味する。例えば、「実質的に含まない」（例えば、「汚染物質を実質的に含まない」、「標的分析物を実質的に含まない」、「ナノ粒子を実質的に含まない」または同等の表現）とは、溶液、液体、サンプルなどが、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも約１００％、汚染物質、標的分析物、ナノ粒子またはそれらの等価物などの言及された物質を含まないことを意味する。対照的に、「実質的に類似した」組成物、プロセス、方法、溶液などは、参照と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、組成物、プロセス、方法、溶液、または本明細書で前述した組成物、プロセス、方法、溶液、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる前述のプロセスまたは方法に類似することを意味する。
【0050】
本明細書で使用される「結合部位」は、分子の別の分子への特徴的な結合に関与する、分子内の特定の原子群を指す。結合部位は、例えば別の分子への結合など、それらの機能特性を保持しながら、さまざまなベース分子に結合または統合できる官能基の一種である。特に、「標的分析物特異的結合部位」は、それらの類似の標的分析物に結合し、ナノ粒子などのベース分子に組み込まれるかまたは結合されると、標的特異的結合をナノ粒子に付与する。本発明の方法での使用に適した標的特異的結合部位としては、非限定的に、天然抗体および合成抗体、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、有機小分子、リガンド、受容体、炭水化物(例えば単糖、多糖、砂糖)、アプタマーおよびそれらの組み合わせがあげられる。
【0051】
本明細書で使用される「検出する」、「検出」、および「検出される」という用語は、当業者に知られている通常の意味を有し、検出されるべき分子（例えば、核酸）の存在または非存在の検出、または分子の量の検出をいう。
【0052】
「マイクロアレイ」および「アレイ」は、化合物、サンプル、またはオリゴまたはポリヌクレオチドなどの分子の集合の配置を指すために交換可能に使用される。配列は通常、「アドレス指定可能（addressable）」であり、集合の個々のメンバーが配列内で一意の同定可能な位置を持つ。アレイは、ガラススライドなどの固体基板上、ニトロセルロース膜などの半固体基板上、またはチューブやマイクロタイタープレートウェルなどの容器内で形成できる。アレイの一般的な配置は、９６ウェルマイクロタイタープレートなどの８行×１２列構成、および３８４ウェルＰＣＲプレートなどの１６行×２４列構成である。本発明の方法における使用は、当業者の知識の範囲内である。
【0053】
「固体支持体」という用語は、例えば捕捉プローブまたは他のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または他の所望の分子または複合体を固定化するために使用できる任意の固相を指す。適切な固体支持体は当技術分野で周知であり、非限定的な例として、マイクロタイタープレートなどの反応トレイのウェルの壁、試験管の壁、ポリスチレンビーズ、常磁性または非磁性ビーズ、ガラススライド、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ラテックス粒子などの微粒子があげられる。固体支持体の典型的な材料には、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン、セルロース、アガロース、デキストラン、ガラス、ナイロン、ラテックスおよびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。さらに、固体支持体はコーティングされていてもよく、所望の分子の接着を促進するため、および／または非特異的結合または他の望ましくない相互作用を決定するために、誘導体化または修飾される。特定の「固相」の選択は、通常は重要ではなく、使用する方法およびアッセイに応じて当業者が選択することができる。好都合なことに、固体支持体は、様々な検出方法に適応するように選択することができる。例えば、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートは、例えばロボットワークステーションによって自動化されるアッセイ、および／または例えばプレートリーダーを使用して検出されるアッセイに使用することができる。
【0054】
分子を固相に固定化するための適切な方法には、イオン性、疎水性、共有結合など、およびそれらの組み合わせが含まれる。ただし、固定化の方法は通常重要ではなく、キャラクタリゼーションされていない吸着メカニズムが関与する場合がある。したがって、本明細書で使用する「固体支持体」は、不溶性であるか、またはその後の反応によって不溶性にすることができる任意の物質を指すことができる。固体支持体は、捕捉試薬を引き付けて固定化する固有の能力により選択することができる。あるいは、固体支持体は、例えば「捕捉」試薬を引き付けて固定化する能力を有する追加の分子を保持することができる。「検出限界」、「閾値」、および「検出閾値」は、正確に検出できる標的の最低の量または濃度を指すために互換的に使用される。
【0055】
本明細書で使用される「伝染病」とは、コミュニティ、集団、または地域内の多数の人々に影響を与える伝染性疾患（すなわち、伝染性（ transmissible）、感染性および／または接触感染性（contagious））を指す。「パンデミック」とは、複数の国または大陸に広がった伝染病を指す。「風土病」とは、州や国などの特定の人口または地理的地域に限定された伝染病を指す。
【0056】
本発明は、磁場を使用してナノ粒子を検出することができ、標的特異的結合部位に結合して「標的分析物特異性ナノ粒子」を形成したナノ粒子を含む、ナノ粒子の運動および相互作用に影響を与えるために利用することもできるという観察に基づいている。特に、磁場を使用して、ナノ粒子を動かし、ナノ粒子を濃縮し、ナノ粒子の凝集を促進することができる。これは、標的特異的ナノ粒子上の標的特異的部位とその類似標的との結合に影響を与え、標的の存在下で標的特異的ナノ粒子複合体を形成するために使用することができる。
【0057】
本発明は、標的分析物を非常に高い感度で迅速に検出する方法を提供し、それにより、標的分析物が非常に希釈されている場合でも、数時間以内、多くの場合、３０分から６０分以内に検出可能なシグナルを得る。本発明は、磁場をナノ粒子を検出するために使用することができ、また、標的分析物特異性結合部位に結合して「標的分析物特異的ナノ粒子」を形成したナノ粒子を含む、ナノ粒子の運動および相互作用に影響を与えるために利用することができるという観察に基づいている。特に、磁場を使用して、ナノ粒子を動かし、ナノ粒子を濃縮し、ナノ粒子の凝集を促進することができる。これは、標的特異的ナノ粒子上の標的特異的部位とその類似標的との結合に影響を与え、標的の存在下で標的特異的ナノ粒子複合体を形成するために使用することができる。
【0058】
当技術分野で公知であり、以下で詳細に論じるように、ナノ粒子の凝集は、ＮＭＲ技術を使用して検出することができる。本発明によれば、標的特異的ナノ粒子と標的との複合体を含有するサンプルのＮＭＲシグナルは、サンプルを制御された磁気濃度、破壊および再懸濁プロセスに供することによって増加および最適化することができる。
【0059】
したがって、本発明は、磁気共鳴測定に基づく標的分析物の検出方法を提供する。この方法では、通常は非磁性シェルに包まれている、常磁性または超常磁性成分を有するナノメートルスケールの粒子である「ナノ粒子」を使用する。これは、分析物に直接的または間接的に結合する部位（「標的分析物特異的結合部位」）に結合される。本発明の一態様では、磁気共鳴「ナノスイッチ」の形態の磁性ナノ粒子を使用して、標的分析物が検出される。磁気共鳴ナノスイッチは、標的分析物または様々な形態の標的分析物による、隣接する水分子のスピン－スピン緩和時間（すなわち、スピン－スピン デフェージング時間またはＴ２）の変化を伴う分散状態とクラスター化状態との間で切り替わるように誘導される磁性ナノ粒子である。そのような実施形態では、測定可能なＴ２値は、サンプル中のナノ粒子の凝集度に依存する。
【0060】
核磁気共鳴
「核磁気共鳴」または「ＮＭＲ」は、磁場中の原子核が電磁放射を吸収し、再放射または「共鳴」する物理現象である。奇数の陽子および／または中性子を含む原子核は、「非ゼロスピン」と呼ばれる固有の磁気モーメントと角運動量を持ち、ＮＭＲ活性である。陽子と中性子の数が偶数の原子核は、全スピンがゼロであるため、ＮＭＲに対して不活性である。有利なことに、水分子中の水素は非ゼロスピンの原子核を有するため、水溶性分子のＮＭＲ分析は水溶液中で頻繁に行われる。
「核磁気共鳴」または「ＮＭＲ」は、磁場中の原子核が電磁放射を吸収し、再放射または「共鳴」する物理現象である。奇数の陽子および／または中性子を含む原子核は、「非ゼロスピン」と呼ばれる固有の磁気モーメントと角運動量を持ち、ＮＭＲ活性である。陽子と中性子の数が偶数の原子核は、全スピンがゼロであるため、ＮＭＲに対して不活性である。有利なことに、水分子中の水素は非ゼロスピンの原子核を有するため、水溶性分子のＮＭＲ分析は水溶液中で頻繁に行われる。
【0061】
磁場内に配置されると、ＮＭＲ活性原子核（すなわち、「非ゼロスピン原子核」）は、同位体の周波数特性で電磁放射を吸収する。核スピンによる共鳴吸収は、正しい周波数（つまり、同位体のラーモア周波数）の電磁放射が使用された場合にのみ発生する。核磁気共鳴の現象は、磁化を測定可能にする。共鳴周波数と強度は、磁場の強さに正比例する。
【0062】
ＮＭＲに基づく技術は、典型的には、一連のシーケンシャル工程を含む：
１． 適用された、空間的および時間的に一定な（「均一な」）磁場における磁気原子核スピンの整列（「分極」）；
２． 電磁パルス、通常はラジオ周波数（ＲＦ）パルスの適用による原子核スピンの整列の乱れ（「励起」）；および。
３． 共鳴エネルギー「シグナル」の測定。
１． 適用された、空間的および時間的に一定な（「均一な」）磁場における磁気原子核スピンの整列（「分極」）；
２． 電磁パルス、通常はラジオ周波数（ＲＦ）パルスの適用による原子核スピンの整列の乱れ（「励起」）；および。
３． 共鳴エネルギー「シグナル」の測定。
【0063】
非ゼロスピン原子を含む磁化されていないサンプルでは、??ＮＭＲ活性原子核のスピンはランダムな方向を向いている。図６Ａを参照。
【0064】
均一磁場の存在下での分極により、ＮＭＲ活性原子核が均一磁場の方向に整列する。図６Ｂ参照。
【0065】
本明細書で使用される場合、「均一な磁場」は、サンプル容積などの容積全体にわたって同じ大きさおよび方向を有するものを指す。均一な磁場は原子核のスピンの向きを変えるが、不均一な磁場のように磁化可能な原子を動かさないことに注意すべきである。個々の磁気原子核スピンの分極は容易に検出できないが、整列の磁気モーメントは、サンプル内の検出可能な非ゼロスピン原子核の和のベクトル量である。したがって、サンプル中のこれらのベクトル量の合計(「バルク磁化ベクトル」あるいは「バルク磁化」； 図６Ｂの破線の矢印)は検知器を使用して測定される。
【0066】
適切な電磁エネルギーを適用すると、個々の原子核ベクトルのスピンが摂動され（perturbed）、バルク磁化ベクトルが再配向する。適切な電磁パルスは、典型的には、関連する非ゼロスピン原子核（例えば、Ｈ）に対するラーモア周波数のラジオ周波数（ＲＦ）パルスであり、典型的には均一磁場の方向に垂直な面に印加される。Ｈのラーモア周波数は２４．５８ＭＨｚ／Ｔである。パルスの持続時間が十分である場合、バルク磁化ベクトルは、図６Ｃに示されるように、均一磁場に垂直な面に再配向する。バルク磁化ベクトルは、ＲＦパルスに応答して再配向する時間経過と共に、または再配向が発生した時点で検出および記録できる。
【0067】
リラクゼーション
配列の摂動（非ゼロスピン原子核の励起）に続いて、バルク磁化ベクトルは時間の経過とともに元の定常状態に回復する。このプロセスは、原子核の「磁気緩和」と呼ばれる。この緩和を説明するために、単一指数関数的プロセス（single-exponential process）の２つの基礎的な時定数（Ｔ１およびＴ２）が使用される。
配列の摂動（非ゼロスピン原子核の励起）に続いて、バルク磁化ベクトルは時間の経過とともに元の定常状態に回復する。このプロセスは、原子核の「磁気緩和」と呼ばれる。この緩和を説明するために、単一指数関数的プロセス（single-exponential process）の２つの基礎的な時定数（Ｔ１およびＴ２）が使用される。
【0068】
Ｔ１－縦方向またはスピン－格子緩和
第１の磁場の方向（ｚ軸）に沿ったバルク磁化ベクトルの回復（図７、上のパネルを参照）は、「スピン－格子緩和時間」または「縦緩和時間」（Ｔ１）によって説明される。Ｔ１は、原子核スピン系から隣接する原子や分子（「格子」）を含むその周囲へのエネルギーの移動速度を定量化する。Ｔ１測定により、ＮＭＲを使用した複雑な生体分子の構造特性評価が可能になる。ここで、格子へのエネルギーの移動は、分子内の周囲の原子の性質によって影響を受ける。通常、Ｔ１はミリ秒から秒のオーダーである。Ｔ１は、検出コイルを使用してサンプルのバルク磁化ベクトルの変化を脱分極パルスと分極測定の間の時間の関数として観察することによって検出できる。
第１の磁場の方向（ｚ軸）に沿ったバルク磁化ベクトルの回復（図７、上のパネルを参照）は、「スピン－格子緩和時間」または「縦緩和時間」（Ｔ１）によって説明される。Ｔ１は、原子核スピン系から隣接する原子や分子（「格子」）を含むその周囲へのエネルギーの移動速度を定量化する。Ｔ１測定により、ＮＭＲを使用した複雑な生体分子の構造特性評価が可能になる。ここで、格子へのエネルギーの移動は、分子内の周囲の原子の性質によって影響を受ける。通常、Ｔ１はミリ秒から秒のオーダーである。Ｔ１は、検出コイルを使用してサンプルのバルク磁化ベクトルの変化を脱分極パルスと分極測定の間の時間の関数として観察することによって検出できる。
【0069】
Ｔ２－横方向またはスピン－スピン緩和
第１の磁場の方向に垂直な平面（ｘｙ平面）（図７の下のパネルを参照）におけるバルク磁化ベクトルの回復は、「スピン－スピン緩和時間」または「横緩和時間」（Ｔ２）と呼ばれる。Ｔ２は、格子へのエネルギー伝達なしで部分的に横平面にあるスピン間のエネルギー伝達速度を定量化する。水性信号の場合、Ｔ２は一般に１００ミリ秒以上の範囲である。一方、固体サンプルは、一般に１から１００マイクロ秒の範囲のＴ２値を持っている。
第１の磁場の方向に垂直な平面（ｘｙ平面）（図７の下のパネルを参照）におけるバルク磁化ベクトルの回復は、「スピン－スピン緩和時間」または「横緩和時間」（Ｔ２）と呼ばれる。Ｔ２は、格子へのエネルギー伝達なしで部分的に横平面にあるスピン間のエネルギー伝達速度を定量化する。水性信号の場合、Ｔ２は一般に１００ミリ秒以上の範囲である。一方、固体サンプルは、一般に１から１００マイクロ秒の範囲のＴ２値を持っている。
【0070】
スピン－スピン緩和は、通常、一連のＲＦパルスによって測定され、「スピンエコー信号」を生じさせる。スピンエコーは、９０度のパルスとそれに続く小さな遅延時間（τ）、引き続く１８０度のパルス（９０°－τ－１８０°）によって生成される。最初の時間と同じ時間の２番目のτが使用された後にバルク磁化ベクトルが記録される。この一連のＲＦパルスと時間遅延を使用して、最初のτの間に、最初の磁場に垂直な平面内のバルク磁化を含む核磁気モーメントを最初にディフェイズ（dephase）し、２番目のτの間にこの平面内の残りのバルク磁化を再びフォーカスさせる。この後者の再集束によりエコー信号が生成され、これを検出して記録することができる。
【0071】
スピン-スピン緩和を測定する最も一般的な方法は、Carr and Purcell ("Effects of Diffusion on Free Precession in Nuclear Magnetic Resonance Experiments", Physical Rev.94:630-638 (1954))に述べられている方法であり、この改良方法が、 Meiboom and Gill ("Modified Spin-Echo Method for Measuring Nuclear Relaxation Times", Rev. Scientific Instruments 29: 688-691 (1958))に述べられている。これらは、参照され本明細書に組み込まれる。
【0072】
カー=パーセルの方法の改良Meiboom-ギル(CPMG)方法は、一連の小さな時間遅れを使用し、上に記述された最初の９０°－τ－１８０°シーケンスの後に１８０°のパルスを印加した。次いで得られたバルク磁化ベクトル－［９０ｘ－（τ－１８０ｙ －τ－ｒｅｃｏｒｄ）ｎ］が続く。スピン エコー信号の振幅は、エコー時に残っているバルク磁化に比例し、時間の経過とともに（通常はｎの値が増加するにつれて）連続的に小さくなる。したがって、種々の値のｎの後のバルク磁化ベクトルの強度を測定し、緩和時間Ｔ２の単一指数減衰にデータをフィッティングすることによりＴ２の直接的な尺度を提供することができる。
【0073】
ＮＭＲを実行し、緩和定数（例えば、Ｔ１およびＴ２）を決定するのに適した機器およびソフトウェアは、Bruker Corp. (Tucson, A Z; e.g. Minispec, NanoBay and AVANCE NMR with Dynamics Center software), HTS-110 Limited (Lower Hutt, NZ; e.g. Field Cycling Relaxometer), Magritek (San Diego, CA; e.g. KeaNMR), Oxford Instruments (Austin, TX; e.g., Pulsar with SpinFlow software)を始めとする様々なベンダーから利用することができる。通常、２０ＭＨｚで動作するＮＭＲ分光計を使用できる。サンプル コイルは、１００マイクロリットルのサンプルを５０から１００％の充填率で満たすのに十分小さい必要がある。ＣＰＭＧ（Car-Purcell-Meiboom-Gill）パルス シーケンスを使用して、２０ＭＨｚのＲＦフィールドでＴ２を測定できる。
【0074】
ＭＲＩ対ＮＭＲ
ＭＲＩは、ＮＭＲ分光法と同じ物理的効果を利用し、典型的には、それを構成する原子の共鳴特性によって未知の化合物を同定するために使用される。ＮＭＲとＭＲＩの両方で、サンプルを静磁場に置き、ラジオ波エネルギーで短時間励起し、そのエネルギーを再放出させる。ＮＭＲは、再放出されたエネルギーの特徴的な周波数を検出する。これは、分子の構造に基づいて非常にわずかに異なる。ＭＲＩは、磁気的に整列した陽子（人体の水中で一般的）の破壊と、ラジオ波励起後の再整列に焦点を当てており、これは陽子／水分子が存在する組織の厚さと硬度に基づいて変化する。再放出された光子がＭＲＩの検出器に到達するのを注意深く監視することで、さまざまな組織の位置と形状を特定できる。ＭＲＩ装置は、そのような形状や位置を３Ｄで生成および分析するために開発された。したがって、３次元配列のサンプルの分析に適している。
ＭＲＩは、ＮＭＲ分光法と同じ物理的効果を利用し、典型的には、それを構成する原子の共鳴特性によって未知の化合物を同定するために使用される。ＮＭＲとＭＲＩの両方で、サンプルを静磁場に置き、ラジオ波エネルギーで短時間励起し、そのエネルギーを再放出させる。ＮＭＲは、再放出されたエネルギーの特徴的な周波数を検出する。これは、分子の構造に基づいて非常にわずかに異なる。ＭＲＩは、磁気的に整列した陽子（人体の水中で一般的）の破壊と、ラジオ波励起後の再整列に焦点を当てており、これは陽子／水分子が存在する組織の厚さと硬度に基づいて変化する。再放出された光子がＭＲＩの検出器に到達するのを注意深く監視することで、さまざまな組織の位置と形状を特定できる。ＭＲＩ装置は、そのような形状や位置を３Ｄで生成および分析するために開発された。したがって、３次元配列のサンプルの分析に適している。
【0075】
ＮＭＲ分光法とＭＲＩイメージングの主な違いは、ＮＭＲは放出された放射線の周波数（振動する陽子の速度に関連する）に基づいて情報（化学構造に対応する光のスペクトル）を生成することである。代わりに、ＭＲＩは体のさまざまな部分から到達する放射線の強度（再放出された光子の量）を使用して情報（体の画像）を生成する。高密度または固体構造内の陽子は、破壊的な電波が体の組織に適用されると、多かれ少なかれ位置ずれを起こしやすい傾向があり、その結果、その領域から来る再放出光子の数が少なくなり、結果として得られる画像の領域が暗くなる。
【0076】
ナノ粒子の磁気共鳴効果
一般に長いＴ２（２，０００ミリ秒のオーダー程度）を有する水性媒体において、ナノ粒子を添加すると、ナノ粒子が溶液全体に均一に分散または懸濁している場合、一般に磁気共鳴特性Ｔ２が低下する。この効果は、各ナノ粒子が「脱分極中心」として機能し、隣接する水分子の脱分極に起因すると考えられている。しかし、水性環境中のナノ粒子（本明細書で指定されたタイプおよびサイズの）が凝集、凝縮、濃縮、沈殿などによってクラスタ化されると、脱分極中心の数が減少し、したがってＴ２への影響も減少する。その結果、ナノ粒子が分散されたとき、水溶液のＴ２は媒体のＴ２に対して増加する。通常、本発明の方法では、Ｔ２の増加は、ナノ粒子の凝集に依存する脱分極中心の減少に比例する。
一般に長いＴ２（２，０００ミリ秒のオーダー程度）を有する水性媒体において、ナノ粒子を添加すると、ナノ粒子が溶液全体に均一に分散または懸濁している場合、一般に磁気共鳴特性Ｔ２が低下する。この効果は、各ナノ粒子が「脱分極中心」として機能し、隣接する水分子の脱分極に起因すると考えられている。しかし、水性環境中のナノ粒子（本明細書で指定されたタイプおよびサイズの）が凝集、凝縮、濃縮、沈殿などによってクラスタ化されると、脱分極中心の数が減少し、したがってＴ２への影響も減少する。その結果、ナノ粒子が分散されたとき、水溶液のＴ２は媒体のＴ２に対して増加する。通常、本発明の方法では、Ｔ２の増加は、ナノ粒子の凝集に依存する脱分極中心の減少に比例する。
【0077】
ナノ粒子の凝集が、ナノ粒子、特に標的特異的ナノ粒子と標的との相互作用に依存する場合、この効果を溶液中の標的の検出に利用することができる：標的が存在しない場合、ナノ粒子は分散し、その結果、溶液中の水の全体的な脱分極が起こり、したがって、短いＴ２が観察される；ターゲットの存在下では、標的特異的ナノ粒子がターゲットと複合体を形成し、脱分極中心の数が減少するため、（分散したナノ粒子の懸濁液と比較して）全体的な脱分極が減少し、Ｔ２が増加する。この効果は、図４に示されている。
【0078】
さらに、本発明のナノ粒子は、磁場によって引き付けられるため、不均一な磁場において磁場強度が最も高い領域に集中することができる。本明細書において、「不均一磁場」とは、磁場が場所によって変化するものをいう。通常、不均一な磁場は、磁場の発生源（つまり、磁石）に最も近い場所で最も強く、発生源からの距離が増加するにつれて大きさが減少する（「均一な磁場」では、磁場が領域全体で同じマグニチュードと方向を持つ）。
【0079】
本発明の方法で使用されるナノ粒子などの常磁性材料は、不均一磁場内では移動するが、均一磁場内では移動しない。例えば、外部磁石が液体中のナノ粒子の懸濁液を含む試験管と接触し、それにより不均一な磁場が生じると、ナノ粒子は外部磁石に向かって引き寄せられ、図４に示すように、磁石に隣接する管の内面に集中する（チューブＤ）。効果は外部磁石の存在に依存するため、磁石を取り除くとナノ粒子が解放される。濃縮されたナノ粒子は、拡散によって最終的に再分配され、液体全体に分散され、再分配のプロセスは、後述するように、混合、攪拌、掻き取りなどによる再懸濁によって加速されることができる。
【0080】
ナノ粒子の特性
本発明によるナノ粒子は、単分散（磁性材料の単結晶、例えば、ナノ粒子当たりの超常磁性酸化鉄などの金属酸化物の単結晶）または多分散（複数の結晶、例えば、ナノ粒子あたり２、３、または４つの結晶）。磁性金属酸化物はまた、コバルト、マグネシウム、亜鉛、ケイ素、スズ、チタン、ビスマス、および／またはこれらの金属と鉄との混合物を含むことができる。本発明の方法での使用が意図されるナノ粒子の重要な特徴および特性には、以下が含まれる；（ｉ）高い緩和性、すなわち水の緩和に強い効果を有する；（ｉｉ）ナノ粒子が水溶液中に懸濁したままとなるのに十分小さいサイズ；（ｉｉｉ）本発明のアッセイ方法で使用される条件下で磁石を使用してナノ粒子を濃縮することができる十分に大きなサイズ；および（ｉｖ）溶液中での安定性、すなわちナノ粒子は溶解せず、沈殿しない。
本発明によるナノ粒子は、単分散（磁性材料の単結晶、例えば、ナノ粒子当たりの超常磁性酸化鉄などの金属酸化物の単結晶）または多分散（複数の結晶、例えば、ナノ粒子あたり２、３、または４つの結晶）。磁性金属酸化物はまた、コバルト、マグネシウム、亜鉛、ケイ素、スズ、チタン、ビスマス、および／またはこれらの金属と鉄との混合物を含むことができる。本発明の方法での使用が意図されるナノ粒子の重要な特徴および特性には、以下が含まれる；（ｉ）高い緩和性、すなわち水の緩和に強い効果を有する；（ｉｉ）ナノ粒子が水溶液中に懸濁したままとなるのに十分小さいサイズ；（ｉｉｉ）本発明のアッセイ方法で使用される条件下で磁石を使用してナノ粒子を濃縮することができる十分に大きなサイズ；および（ｉｖ）溶液中での安定性、すなわちナノ粒子は溶解せず、沈殿しない。
【0081】
本発明の特定の実施形態で使用される場合、１００から２００ｎｍのナノ粒子は、隣接する水分子を脱分極するのに非常に効果的であることが判明しており、その結果、Ｔ２が約２，０００ミリ秒から約１００ないし約２００ミリ秒に減少する。サイズは不均一な磁場によって容易に濃縮され、沈殿することなく長期間懸濁液中に留まることができる。有利なことに、より小さなナノ粒子への非特異的結合も最小限に抑えることができる。約７５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、２７５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４５０および５００ｎｍ以上などの、少なくとも約６０ｎｍから約５００ｎｍの範囲のナノ粒子が、本発明の方法で使用するために企図される。特に適切なナノ粒子サイズとしては、少なくとも約８０ｎｍから約１８０ｎｍ、例えば約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍがあげられる。
【0082】
ナノ粒子の調製
生物学的用途のための様々なポリマー被覆金属酸化物「コア」粒子の合成は、先行技術、特に磁気共鳴イメージング用途に開示されている。例には、本発明の方法での使用に適した２００未満の磁化可能なナノ粒子が含まれる。
生物学的用途のための様々なポリマー被覆金属酸化物「コア」粒子の合成は、先行技術、特に磁気共鳴イメージング用途に開示されている。例には、本発明の方法での使用に適した２００未満の磁化可能なナノ粒子が含まれる。
【0083】
ナノ粒子コアは任意のタイプの磁化できる材料(例えば、常磁性または超常磁性）から既知の技術を使用して、調製されることができ、たとえば、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｓｎ、Ａｌ、Ｎｉ、Ｔｉ、Ｂｉ、Ｚｒ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｓｒ、Ｉｒ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｂａおよび／またはＺｎが使用できる。特定の実施形態では、ナノ粒子は、金属酸化物、たとえば酸化鉄、例えばマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）およびマグヘマイト（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、ＦｅやＣｏなどの純金属、ＦｅＰｔなどの合金から、共沈、熱分解および／または還元、ミセル合成、水熱合成、プラズマベースおよびレーザー熱分解技術を含むさまざまな方法を使用して製造することができる。Fu et al., Angewandte Chemie Int’l Ed. 46:1222-44, 2007)を参照。これは参照され、本明細書に組み込まれる。共沈は、Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋塩の水溶液からＦｅ３Ｏ４およびγ－Ｆｅ２Ｏ３などの酸化鉄を合成するために使用できる。たとえば、ＰＣＴ国際公開第２００６／１２５４５２号を参照。これは参照され、本明細書に組み込まれる。これは、水溶液中の塩化第二鉄および塩化第一鉄のアルカリ共沈による酸化鉄粒子の調製を開示している。
【0084】
単分散磁性ナノ結晶は、安定化界面活性剤を含有する高沸点有機溶媒中で有機金属化合物を熱分解することによって合成することができる。米国特許第７，０２９，５１４号を参照。この米国特許は参照により本明細書に組み込まれる。別のアプローチでは、所望の反応物質を含有する油中水型マイクロエマルジョンを混合し、凝集させ（coalesce）、その中に沈殿物を有するミセルを形成する。したがって、そのようなマイクロエマルションは、ナノ粒子を形成するためのナノリアクターとして使用することができる。例えば、米国特許第８，５１２，６６５参照。この米国特許は参照により本明細書に組み込まれる。水熱合成では、合成中に存在する液体、固体、および溶液相の界面で発生する一般的な相移動および分離メカニズムを利用して、さまざまな異なるナノ結晶を合成できる。例えば、米国特許第７，７３２，０１５参照。この米国特許は参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００４／０００９１１８号は、固体の金属の微粒子のエアゾールを生成し、微粒子を金属蒸気へするのに十分に高い温度でプラズマホットゾーンを有するプラズマを生成し、プラズマホットゾーンにエアゾールを向けることにより、金属酸化物ナノ粒子を生産する方法を開示する。
【0085】
本発明の方法で使用するのに適したさらなる磁性粒子は、米国特許第４，５５４，０８８、５，０５５，２８８、５，２６２，１７６、５，５１２，４３９、および７，４５９，１４５、および米国特許公開第２００３／００９２０２９、２００３／０１２４１９４、２００６／０２６９９６５、および２００８／０３０５０４８に開示されている。これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0086】
上記の技術を使用して生成されたナノ粒子の懸濁液は、典型的には、サイズなどの様々な特性を有する粒子を含む。ナノ粒子懸濁液の不均一な性質は、本発明の方法における懸濁液の性能を低下させる可能性がある。
【0087】
粒子の均一性を改善する方法は、注射可能な液体としての使用を意図した分散水性系の製造について記載されている。このような均質化方法には、ローター・ステーター法および高圧法が含まれる。液体ジェットまたは液体スロットノズル高圧均質化機（例えば、Microfluidics, a division of MFIC, Corp., Newton, Mass.から入手可能）の使用は、高い機械的エネルギーの印加を可能にする（例えば、米国特許第５，６３５，２０６；５，５９５，６８７を参照（参照により本明細書に組み込まれる）。
【0088】
非水性成分が酸化物を含有する、制御された凝集とそれに続くエマルション中での乾燥を用いた金属酸化物ナノ粒子組成物の製造のための高圧均質化装置が、触媒材料｛例えば、米国特許第５，３０４，３６４号、参照により本明細書に組み込まれる）、電子写真顔料粒子、セラミック粉末、フェルト材料、スプレー層、活性物質キャリア、およびイオン交換樹脂の工業生産に関連して報告されている（例えば、米国特許第５，５８０，６９２号、参照により本明細書に組み込まれる）。ならびに。エマルションは、２つ以上の不溶性液体の多相系の分散液である。エマルションは、少なくとも１つの連続（外）相（例えば、水）と１つの分離（分散または内）相（例えば、油）から構成される。エマルションは熱力学的に不安定である。
【0089】
医薬品、化粧品、化学工業および食品産業におけるエマルジョンおよび懸濁液の調製または安定化のために、高圧均質化装置がしばしば使用される。ナノスケールの金属酸化物は、流動化装置内で高剪断力を使用して調製できることも知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４１７，９５６号）。たとえば、一部の用途では、最大２００メガＰａ（ＭＰａ）またはそれ以上の圧力が使用される。
【0090】
典型的には、ナノ粒子コアはポリマーまたは他の物質でコーティングされて、コアを安定化し、標的特異的結合部位が結合できる材料を提供する。本明細書で使用される「結合（conjugate）」または「結合された」という用語は、共有結合または別の方法で一緒に連結された２つの分子を指す。適切な表面コーティングへの結合は、当技術分野で周知の方法、例えばWong, et al., Chemistry of Protein and Nucleic Acid Cross-Linking and Conjugation, 2nd Ed. (CRC Press; Boca Raton, FL) and Hermanson, “Bioconjugate Techniques, 3rd Ed.” Academic Press, New York, 2013iに記載の方法で提供することができる。これらは参照により本明細書に組み込まれる。一般に、ナノ粒子に対する結合部位の比率は、結合部位に対するナノ粒子の所望の割合を与えるように制御することができる。
【0091】
最も一般的に使用されるコーティング材料は、様々な形態のデキストランである。アラビノガラクタン、デンプン、グリコサミノグリカン、タンパク質（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５７６，２２１号）、およびシリカなどの他の適合性炭水化物も使用される。そのような方法の１つは、デキストランの存在下でのＦｅ（ＩＩ）塩およびＦｅ（ＩＩＩ）塩の沈殿である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４５２，７７３号）。修正された方法は、同じ装置内での超音波処理とそれに続く熱処理の使用を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２７，９４５号）。この方法の品質は、磁気分類によって強化される（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９０／０７３８０）。さらなるカプセル化/コーティングは、安定化のための両親媒性の物質の使用によりナノ粒子の特性を改善することができる。これは、米国特許第５，５４５，３９５号および欧州特許ＥＰ ０２７２０９１号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【0092】
湿式化学合成は、ポリマー成分でコーティングするか（コアシェル法）、またはポリマーの存在下で行うことができる（ワンポット法）。コアシェル法では、酸化鉄のコアは水溶液中で凝集しやすいため、酸化鉄に安定化物質を添加する必要がある。両親媒性物質（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／５６５４６号）または帯電した表面を有する追加のナノ粒子を安定剤として選択することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，２８０，９１８号）。
【0093】
ただし、安定剤として使用される界面活性物質は、ナノ粒子表面の機能に影響を与え、制限する可能性がある。ワンポット法では、酸化鉄の形成中にポリマーを直接コーティングして、形成プロセスと溶液からの結晶の成長を安定させる。
【0094】
特定の実施形態において、コーティングは、標的特異的結合部位への結合を促進するために官能化される。本発明のナノ粒子コーティングでの使用が考えられる官能基としては、非限定的に、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、アミン、イミン、エポキシ、ヒドロキシル、チオール、アクリレート、および／またはイソシアノ基があげられる。カルボキシ官能化ナノ粒子は、例えば、Ｇｏｒｍａｎの方法に従って作製することができる（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／６１１９１を参照）。より安定にコーティングされ、アミノ官能化されたナノセンサーは、例えば、金属酸化物粒子コアのデキストランコーティングをエピクロロヒドリンで架橋し、次にアンモニアで処理して官能アミノ基を提供することにより調製できる。アミン化された架橋酸化鉄ナノ粒子（アミノ－ＣＬＩＯ）は、１粒子あたり４０個のアミノ基を持ち、平均粒子サイズが約４０から約５０ｎｍで作られる。これらの粒子は、サイズの変化やデキストランコートの損失なしに、１２０℃、３０分間でのインキュベーションなどの過酷な処理に耐えることができる。
【0095】
本発明の方法で使用するに適している、様々なサイズおよび組成物のナノ粒子は、商業的に得ることができ、たとえば、Sigma Aldrich (St. Louis, MO), Nanocs Inc. (NY, NY), NanoComposix (San Diego, CA), MKNano (Missisauga, ON, Canada), Miltenyi Biotec (San Diego, CA), Ademtech (Pessac, France), Chemicell GmbH (Berlin, Germany), Corpuscular Inc. (Cold Spring, New York), Nvigen Inc. (Sunnyvale, CA), NanoTherics Ltd. (Staffordshire UK), Cytodiagnostics Inc. (Burlington, Ontario, Canada), Eprui Nanoparticles & Microspheres Co. (Nanjing, China), Polysciences, IncR, SA. (Warrington, PA)から得ることができる。市販のナノ粒子には、コーティングされたもの、コーティングされていないもの、官能化されたものもあり、並びにビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、二次抗体、プロテインＡ、プロテインＧなどの一般的な結合部位に結合したナノ粒子もある。
【0096】
標的核酸検出アッセイ
特定の態様において、本発明は、標的特異的ナノ粒子とそれらの標的との間の反応が、磁場によって影響を受け、磁場を使用して検出され得るという観察に基づく。標的特異的ナノ粒子が標的に特異的に結合し、それによりナノ粒子－標的複合体を形成する、標的を検出するための方法が提供される。磁場が水溶液中の複合体に適用され、それによりナノ粒子が磁化される。適用された磁場は、均一でない場合、ナノ粒子に力を及ぼす。ナノ粒子－ターゲット複合体は、適用された磁力と隣接するナノ粒子の合成磁力に応答して移動する。さらに、ナノ粒子とその複合体との間の相互作用は、適用された磁場に応答するナノ粒子の動きによって強化され得る。
特定の態様において、本発明は、標的特異的ナノ粒子とそれらの標的との間の反応が、磁場によって影響を受け、磁場を使用して検出され得るという観察に基づく。標的特異的ナノ粒子が標的に特異的に結合し、それによりナノ粒子－標的複合体を形成する、標的を検出するための方法が提供される。磁場が水溶液中の複合体に適用され、それによりナノ粒子が磁化される。適用された磁場は、均一でない場合、ナノ粒子に力を及ぼす。ナノ粒子－ターゲット複合体は、適用された磁力と隣接するナノ粒子の合成磁力に応答して移動する。さらに、ナノ粒子とその複合体との間の相互作用は、適用された磁場に応答するナノ粒子の動きによって強化され得る。
【0097】
磁気共鳴シグナルは、複合体および既知の液体を含むサンプルから、サンプルをラジオ周波（radio frequency：ＲＦ）放射に曝露することによって誘発される。Ｔ２などのサンプルの磁気共鳴特性は、磁気共鳴信号から決定することができる。標的の存在は、試料の磁気共鳴特性を、測定されたまたは既知の対照試料および標準の磁気共鳴特性と比較することによって検出することができる。
【0098】
有利なことに、本発明の方法は、近接干渉、汚れ、クラッター、細胞破片などの生物学的干渉物質、タンパク質性干渉物質、ヘモグロビンおよびフミン酸（キレート鉄を含む）などの常磁性干渉物質にもかかわらず、非常に高い特異性で標的核酸の検出を可能にする。
【0099】
本発明の方法は、エアロゾル、ヒドロゾル、食品などの複合媒体、および血液、尿、唾液、組織、喀痰、便などの臨床検体を含むがこれらに限定されない液体媒体または他の形態で存在する標的核酸の検出に有用である。
【0100】
標的核酸が分析される液体は、非ゼロスピンを有する原子核を含む任意の流体材料であり得る。スピンがゼロでない原子核のみがＮＭＲ現象を引き起こす。水分子中の水素などの液体中の分子が非ゼロスピンの原子核を有する場合、液体はそのような原子核を含む。あるいは、液体は、１９Ｆラーモア周波数で磁気共鳴信号を生成するフッ素添加溶質などの溶質または懸濁液として非ゼロスピン原子核を含むことができる。しかしながら、本発明の目的のために、液体は典型的には水または水溶液であり、特に断らない限り、用語「液体」、「流体」、「既知の液体」、「液体媒体」および「溶液」は水または水溶液を指す。
【0101】
本発明は、病原体特異的核酸（すなわち、標的核酸）の核酸増幅を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出と組み合わせる病原体検出を提供する方法を提供する。本発明の方法は、部分的には、ＭＲＩ／ＮＭＲ検出が、より従来の核酸検出方法とは異なり、測定されるサンプルの光学特性によって影響されないラジオ周波数範囲で測定可能なシグナルを生成するため、迅速なサンプル調製を利用することができる。本発明の方法は、世界中の多くの国の政府によって許可されており、核酸抽出および浄化ステップの必要なしで、臨床（例えば、患者の診断に使用される病院または診療所）および専用のＭＲＩ機器の両方を使用して唾液とスワブサンプル内のＣＯＶＩＤ－１９を検出するために採用されている。
【0102】
本発明の方法は、単一のＭＲＩシステムを使用して単一の場所で１日に１０万個のサンプルを可能にする並行処理工程から生じる。ＭＲＩ（またはＮＭＲ）は、サンプルを調製するおよびアッセイを実施するために使用される他のデバイスおよび機器と統合される必要はない。さらに、ＭＲＩ検出は迅速であるため、機器の利用可用性に応じて迅速に実行できる。数分で数万以上のサンプルアッセイを測定できる。本発明の方法は、ＣＯＶＩＤ－１９ パンデミック時に使用された従来のＰＣＲ法と比較して、行われた同じドルの投資に対して２桁大きい容量を提供し、インフラストラクチャおよび運用コストを８０から９５％節約し、アッセイのコストは同等またはそれ以下である。
【0103】
本明細書に記載のこの方法は、スクリーニングされた多数の個体に対応する増幅された核酸サンプルの迅速、高感度、大規模検出を可能にする。一実施形態では、ＬＡＭＰアッセイが実施され、続いてＭＲＩおよび／またはＮＭＲ検出が行われる。市販のＮＭＲシステムと多種多様なＭＲＩイメージャーを使用して、高い感度と特異性で標的核酸を検出する。
【0104】
本発明の検出方法はまた、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＴ－ＬＡＭＰ、および今日利用可能なプライマー配列を使用する任意の他の方法を含む、ほとんどの既知の核酸増幅方法によって生成された増幅された核酸、これはビオチン（または別の結合部位）で修飾されることができる、を検出するために適用可能であり、採用される。
【0105】
本発明の方法は、相補的結合分子であるストレプトアビジンと組み合わせたビオチンなどの相補的結合分子を必要とする。ビオチン－ストレプトアビジンの代わりに、他の相補的な結合化学物質を使用できるが、これはプライマーに結合できることを条件とする。
【0106】
本発明のＭＲＩおよびＮＭＲ検出技術は、ＭＲＩ造影剤として、およびインビトロでの研究ツールとして臨床的に使用されてきたナノメートルスケールの常磁性粒子（ナノ粒子）を利用する。
【0107】
一実施形態では、核酸増幅は、以下に記載するようにＲＴ－ＬＡＭＰを使用して達成される。別の増幅方法を使用する場合は、方法の変更が必要になる場合がある。しかし、必要な変更は、本開示の教示に基づき、十分に当業者ができるレベル内にある。
【0108】
本発明の方法は、以下の工程を含む：
ａ． 標的核酸、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのウイルスを含むサンプルを提供する。特定の実施形態では、臨床サンプルを収集するためのＬＡＭＰ手段、例えば収集装置（唾液用のチューブおよび漏斗、綿棒、呼吸サンプルを収集するためのタブなど）が提供される。
ｂ． 核酸を保存し、その分解を防ぐ条件下で、サンプルを実験室に輸送すること。当業者は、適切な温度の維持およびヌクレアーゼ阻害剤による処理が、サンプル収集と実験室での処理との間の時間の長さに応じて必要とされる場合があることを理解するであろう。
ｃ． サンプルを処理して標的核酸を放出させること。これには、細胞を溶解する試薬、および／またはキレート剤（Ｃｈｅｌｅｘ）、プロテイナーゼ Ｋ、塩酸グアニジウム、グアニジウム組成物およびバッファーなどの核酸関連タンパク質を解離除去する試薬の存在下でサンプルを加熱することが含まれる。
ｄ． 標的特異的プライマーの存在下で標的核酸の領域を増幅する。
特定の実施形態では、核酸は最初に逆転写酵素を使用して逆転写され、得られたｃＤＮＡは、適切なＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子、および当技術分野で周知の他の成分の存在下で、ＬＡＭＰまたはＰＣＲプロトコルに従って増幅される。ＬＡＭＰを使用する場合、５’→３’ＤＮＡポリメラーゼ活性を持ちながら５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＢｓｔポリメラーゼなどの鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅を行う。ＰＣＲが使用される場合、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。
ｅ． 特定の態様において、プライマーの１つまたは複数がビオチン化される。ビオチン化は、１つまたは複数のビオチン化ヌクレオチドでプライマーを合成すること、または合成後にプライマーを化学的または酵素的に修飾することを含む、当技術分野で知られている任意の方法によって達成することができる。
ｆ． 時間および温度の条件は、標的核酸を増幅するために使用される方法（例えば、ＰＣＲまたはＬＡＭＰ）に応じて異なる。たとえば、温度が約５０℃と約１００℃の間でサイクルする一方、等温ランプは単一の温度で実行される。
ｇ． 増幅された標的核酸をナノ粒子と接触させ、ナノ粒子は増幅された標的核酸に特異的に結合する。標的核酸－ナノ粒子複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子はストレプトアビジンに結合している。
ｈ． 標的核酸－ナノ粒子複合体を磁場装置に曝露し、標的ＤＮＡの存在下でシグナル増幅を可能にする。
ｉ． ＭＲＩシステムでシグナルを検出し、特定の増幅された標的核酸－ナノ粒子複合体の存在または非存在を同定する。
ｊ． ＭＲＩ画像処理ソフトウェアを使用してＭＲＩ検出の結果を収集し、分析する。
ａ． 標的核酸、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのウイルスを含むサンプルを提供する。特定の実施形態では、臨床サンプルを収集するためのＬＡＭＰ手段、例えば収集装置（唾液用のチューブおよび漏斗、綿棒、呼吸サンプルを収集するためのタブなど）が提供される。
ｂ． 核酸を保存し、その分解を防ぐ条件下で、サンプルを実験室に輸送すること。当業者は、適切な温度の維持およびヌクレアーゼ阻害剤による処理が、サンプル収集と実験室での処理との間の時間の長さに応じて必要とされる場合があることを理解するであろう。
ｃ． サンプルを処理して標的核酸を放出させること。これには、細胞を溶解する試薬、および／またはキレート剤（Ｃｈｅｌｅｘ）、プロテイナーゼ Ｋ、塩酸グアニジウム、グアニジウム組成物およびバッファーなどの核酸関連タンパク質を解離除去する試薬の存在下でサンプルを加熱することが含まれる。
ｄ． 標的特異的プライマーの存在下で標的核酸の領域を増幅する。
特定の実施形態では、核酸は最初に逆転写酵素を使用して逆転写され、得られたｃＤＮＡは、適切なＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子、および当技術分野で周知の他の成分の存在下で、ＬＡＭＰまたはＰＣＲプロトコルに従って増幅される。ＬＡＭＰを使用する場合、５’→３’ＤＮＡポリメラーゼ活性を持ちながら５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＢｓｔポリメラーゼなどの鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅を行う。ＰＣＲが使用される場合、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。
ｅ． 特定の態様において、プライマーの１つまたは複数がビオチン化される。ビオチン化は、１つまたは複数のビオチン化ヌクレオチドでプライマーを合成すること、または合成後にプライマーを化学的または酵素的に修飾することを含む、当技術分野で知られている任意の方法によって達成することができる。
ｆ． 時間および温度の条件は、標的核酸を増幅するために使用される方法（例えば、ＰＣＲまたはＬＡＭＰ）に応じて異なる。たとえば、温度が約５０℃と約１００℃の間でサイクルする一方、等温ランプは単一の温度で実行される。
ｇ． 増幅された標的核酸をナノ粒子と接触させ、ナノ粒子は増幅された標的核酸に特異的に結合する。標的核酸－ナノ粒子複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子はストレプトアビジンに結合している。
ｈ． 標的核酸－ナノ粒子複合体を磁場装置に曝露し、標的ＤＮＡの存在下でシグナル増幅を可能にする。
ｉ． ＭＲＩシステムでシグナルを検出し、特定の増幅された標的核酸－ナノ粒子複合体の存在または非存在を同定する。
ｊ． ＭＲＩ画像処理ソフトウェアを使用してＭＲＩ検出の結果を収集し、分析する。
【0109】
一実施形態では、増幅は、核酸の逆転写ループ媒介等温増幅（Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal amplification：ＲＴ－ＬＡＭＰ）に依存して、単一工程でＣＯＶＩＤ－１９ ＲＮＡを増幅し、半自動化または自動化された処理プラットフォームでの、迅速、超高スループット、オープンアクセス、またはランダムアクセスソリューションを可能にし、市販のＭＲＩイメージャーを使用して、これらのアッセイ産物を非常に多数で検出する。
【0110】
本発明の方法のランダムアクセス能力
本発明のシステムおよび方法は、様々なサンプル調製方法、様々な核酸増幅方法、様々なアッセイタイプ（ＬＡＭＰアッセイ、ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイ、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡなど）の統合を、ハードウェア、さらに重要なことには、磁気処理およびＭＲＩまたはＮＭＲ検出と適合性の試薬、たとえばプライマー、ナノ粒子、およびさまざまなプローブなどに変更を加えることによって可能にする。本発明の一態様では、サンプル収集から病原体細胞からのＲＮＡおよびＤＮＡ抽出まで、ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅および磁気処理工程前ならびにＭＲＩ検出前に、ヒト臨床サンプルを処理するために、ランダムアクセスコンパティブルサブシステム（random access compatible subsystems）を組み立てる必要がある。
本発明のシステムおよび方法は、様々なサンプル調製方法、様々な核酸増幅方法、様々なアッセイタイプ（ＬＡＭＰアッセイ、ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイ、ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡなど）の統合を、ハードウェア、さらに重要なことには、磁気処理およびＭＲＩまたはＮＭＲ検出と適合性の試薬、たとえばプライマー、ナノ粒子、およびさまざまなプローブなどに変更を加えることによって可能にする。本発明の一態様では、サンプル収集から病原体細胞からのＲＮＡおよびＤＮＡ抽出まで、ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅および磁気処理工程前ならびにＭＲＩ検出前に、ヒト臨床サンプルを処理するために、ランダムアクセスコンパティブルサブシステム（random access compatible subsystems）を組み立てる必要がある。
【0111】
特定の態様によれば、ＭＲＩ検出ＬＡＭＰまたはＲＴ?ＬＡＭＰアッセイを使用して、唾液、スワブ、血液、尿、糞便、喀痰、便、および人体から採取された任意の液体などの任意のサンプルタイプから、ウイルス、細菌および真菌を含む任意の病原体由来の核酸を検出する。サンプル調製方法は、異なるサンプルタイプでは異なるが、本発明の方法は、ＬＡＭＰ増幅からＭＲＩ検出まで実質的に同じである。この機能は、「ランダムサンプルアクセス」または「ランダムアクセス」という用語でも識別され、残りのシステム要素とコンポーネントの大部分またはすべてを変更せずに、さまざまなサンプルタイプを部分的に異なる方法で処理できる。
【0112】
特に、本発明は、上記のボトルネックのほとんどを回避する。たとえば、低コストの広く利用可能なマシンと単純なヒーターを使用してエンドポイント増幅 （ＲＴ－ＬＡＭＰやエンドポイントＲＴ－ＰＣＲなど）を実行し、それにより高スループット、オープンアクセス、またはランダムアクセス半自動化または自動化されたプラットフォームで実現し、また市販のＭＲＩシステムを検出に使用する。上述の本発明の工程では、他の工程を変更することなく、各工程または任意の工程を変更する柔軟性がある。本発明のシステムおよびＭＲＩ検出方法の異なる要素のこのランダムまたはオープンアクセス能力は、短時間で分析できるサンプルの量を増やすのに役立つ。
【0113】
例えば、サンプル採取方法が唾液からスワブに変更されても、他の工程またはシステム構成要素に影響を及ぼさないため、変更することができる。ランダムアクセス機能により、発現した病原体の検出、さまざまな臨床および環境サンプルとその収集方法、さまざまなサンプル調製方法、さまざまなタイプのＬＡＭＰおよびＰＣＲプライマーとプローブを迅速に変更することもできる。
【0114】
９６および３８４ウェルの加熱ブロック、９６または３８４ウェルの超音波処理ブロックを使用して、数千のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス標本に対して、ＭＲＩシステムによって検出可能な多数のＲＴ－ＬＡＭＰアッセイを実行する間、半自動または自動ピペットまたはロボットはウイルスの溶解と増幅および検出のために、試薬やその他の液体を９プレートに供給できる。これらの工程は、他の工程が完了するのを待たずに同時に実行できる。
【0115】
ＭＲＩ検出プラットフォームのさまざまな要素のランダムサンプルアクセスまたはオープンアクセス機能、つまりサンプル収集、サンプル調製、それに続くＭＲＩ検出前のウイルスＲＮＡに対して使用されるループ媒介等温増幅（ＲＴ－ＬＡＭＰ）法を採用することで、プロセスが合理化され、効率が最大化される。ＬＡＭＰ法では、４から６個の特別に設計された標的特異的プライマーを使用して、等温条件下で特異性の高い特定の核酸を迅速に増幅できる。ＬＡＭＰ反応プロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは異なり、変性工程を必要とせず、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性によってＤＮＡ増幅が起こる。ＬＡＭＰ法は、細菌やウイルスを含むさまざまな微生物や病原体の検出に広く適用されている。ＲＮＡウイルスのような病原体のＲＮＡゲノムを検知する場合、ＬＡＭＰは逆転写（ＲＴ）と組み合わされ、核酸増幅のＲＴ－ＬＡＭＰ分析を提供した。
【0116】
ＭＲＩを用いたＬＡＭＰアッセイのエンドポイント検出のランダムアクセス能力により、臨床サンプルおよび環境サンプル、あらゆる種類のサンプル収集方法、さまざまなサンプル調製方法および市販のキットから、さまざまな種類の病原体、バイオマーカーの検出が可能になる。また非常に柔軟なランダムアクセスモダリティにより、さまざまなタイプのプライマーとプローブを使用できる。
【0117】
数千のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１９ウイルスサンプルに対してＭＲＩで検出可能な多数のＲＴ－ＬＡＭＰアッセイを実行するために、業界標準の９６および３８４ウェルの加熱ブロック、９６および３８４ウェルの超音波処理ブロック、ウイルス溶解とＲＴ－ＬＡＭＰ ＲＮＡ増幅のために、試薬やその他の液体を９６または３８４ウェルプレートに分注できる自動ピペットまたはロボットを使用できる。
【0118】
３－Ｄセンサーによるアッセイの３次元同時検出
対応する反応チューブ／ウェルで ＲＴ－ＬＡＭＰ、ＬＡＭＰ、ＰＣＲ、またはＲＴ－ＰＣＲを使用して生成された核酸アンプリコン（nucleic acid amplicons）を、ＭＲＩ検出を使用して同時に検出すると、ＭＲＩサンプルコイル内に配置されたときにすべてのサンプルを同時に定量的に検出できる。ＭＲＩは、脳や体の小さな部分を視覚化し、損傷した細胞や組織、腫瘍などの異常な構造の有無を定性的に識別するためのイメージングデバイスである。同じ概念が、ＰＣＲおよびＬＡＭＰアッセイの多数のアンプリコンのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出に適用される。ＭＲＩサンプルコイル（ヘッドまたはボディコイルまたはホールボディコイル）内に配置された単一から数百、さらには数千のサンプルプレートからの画像は、画像処理後に、３次元アレイとして配置されたすべてのサンプルの３Ｄ画像を提供する。これは、人間の脳のさまざまなスライスをＭＲＩでピクセルまたはボクセルの形で識別することに似ている。これらの２次元のピクセルと３次元のボクセルは、それらのピクセルまたはボクセルに対応する脳の特性を示している。脳組織のこれらの種の領域で測定された緩和パラメータは、３Ｄ画像とその２Ｄスライスとして再構築される。アッセイの３次元配列の２次元でプロットされたピクセルは、結果を視覚化し、１と０で表される陽性と陰性に変換するために使用される。脳組織のこれらの種の領域で測定された緩和パラメータは、３Ｄ画像とその２Ｄスライスとして再構築される。アッセイの３次元配列の２次元でプロットされたピクセルは、結果を視覚化し、１と０で表される陽性と陰性に変換するために使用される。
対応する反応チューブ／ウェルで ＲＴ－ＬＡＭＰ、ＬＡＭＰ、ＰＣＲ、またはＲＴ－ＰＣＲを使用して生成された核酸アンプリコン（nucleic acid amplicons）を、ＭＲＩ検出を使用して同時に検出すると、ＭＲＩサンプルコイル内に配置されたときにすべてのサンプルを同時に定量的に検出できる。ＭＲＩは、脳や体の小さな部分を視覚化し、損傷した細胞や組織、腫瘍などの異常な構造の有無を定性的に識別するためのイメージングデバイスである。同じ概念が、ＰＣＲおよびＬＡＭＰアッセイの多数のアンプリコンのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出に適用される。ＭＲＩサンプルコイル（ヘッドまたはボディコイルまたはホールボディコイル）内に配置された単一から数百、さらには数千のサンプルプレートからの画像は、画像処理後に、３次元アレイとして配置されたすべてのサンプルの３Ｄ画像を提供する。これは、人間の脳のさまざまなスライスをＭＲＩでピクセルまたはボクセルの形で識別することに似ている。これらの２次元のピクセルと３次元のボクセルは、それらのピクセルまたはボクセルに対応する脳の特性を示している。脳組織のこれらの種の領域で測定された緩和パラメータは、３Ｄ画像とその２Ｄスライスとして再構築される。アッセイの３次元配列の２次元でプロットされたピクセルは、結果を視覚化し、１と０で表される陽性と陰性に変換するために使用される。脳組織のこれらの種の領域で測定された緩和パラメータは、３Ｄ画像とその２Ｄスライスとして再構築される。アッセイの３次元配列の２次元でプロットされたピクセルは、結果を視覚化し、１と０で表される陽性と陰性に変換するために使用される。
【0119】
本発明の方法は、従来の光学検出システムとは異なり、サンプルの三次元アレイを検出することができる。各アッセイは光学検出器を使用して増幅および検出されるが、センサーからの光は、数回の増幅サイクルまたは時間ごとに専用の光源を使用して各アッセイに照射される。従来技術の方法とは異なり、本明細書に開示される方法は、信号の検出およびサンプルの位置または数の同定を可能にするＤＣおよびＡＣ磁場ならびにＤＣおよびＲＦパルスのシーケンスを使用する。先行技術の方法は、サンプルのすぐ隣に存在しなければならない光源および光学検出システムを使用し、このシステムはシステム全体に高度に統合され、検出プロセスの始めから終わりまで処理する目的下に、システムが構成される。
【0120】
ＭＲＩ技術を使用する本発明の方法は、３次元における非常に小さい体積の検出を可能にし、３次元空間におけるそれぞれの小さい体積からの信号の処理を可能にする。ＭＲＩは何十年もの間、生体内医療画像処理に使用されてきたが、パンデミック スクリーニングに同じ方法を使用することはこれまでに報告されていない。本発明は、ゲノム科学、ナノテクノロジー、合成遺伝子セグメント、遺伝子配列の機能化・官能化、迅速なアッセイを行うための結合化学、磁場対応アッセイプロセス、迅速なサンプル収集方法、ヒトまたは動物標本の迅速なサンプル溶解および消化方法、機能化・官能化ナノ粒子、画像処理方法およびソフトウェアツール、またさらに市販のＭＲＩシステムおよびＭＲＩエリアの専門知識などの科学および技術におけるさまざまな最新の開発の統合によって促進される、３Ｄフォーマットでの数万のサンプルの検出を提供する。
【0121】
本発明は、核酸アンプリコンのＭＲＩ検出方法を提供する。これは現在の最先端技術とは根本的に異なる。なぜなら、この３次元検知システムは他の３Ｄアレイパターンの上に配置されたサンプルの３Ｄスタック中のそれぞれのサンプルを識別することができるからである。高周波と磁場は相乗的に作用し、磁場勾配と高周波位相エンコード法を使用して各サンプルを同定する。これらの磁場とその特性は、ＭＲＩのピクセルを使用して、存在するサンプルの特徴を持つ画像で各サンプルの位置を同定する。各サンプルチューブから収集されたＭＲＩ画像のピクセルは、特定の核酸配列の有無を同定する。
【0122】
本発明の方法を使用すると、ヒトまたは動物サンプルにおける病原体検出のためにヘルスケアシステムで利用可能なほぼすべてのＭＲＩシステムを「そのまま」使用できるか、または容易に適合させることができる。広範囲にわたる磁場を持つＭＲＩシステムは、この方法を使用して検証されているため、これらのシステムをグローバルに展開して、世界中のＣＯＶＩＤ－１９疾患の蔓延と戦うことができる。低磁場（６５ミリテスラから３０００ミリテスラの間）のＭＲＩシステムがテストされ、臨床サンプル中の病原体の存在または非存在を特定する際に、実質的に同じ結果が得られた。
【0123】
ＭＲＩで検出された核酸は、以下の多くのＭＲＩシステムで検出されたサンプルの比較によって示されるように、磁場に関係なく同じ結果を与える；低磁場ＭＲＩシステム ６５ミリテスラフィールドのＨｙｐｅｒｆｉｎｅ ＭＲＩ、２００ミリテスラフィールドのＥｓａｏｔｅ Ｃ－Ｓｃａｎ、３００ミリテスラのＥｓａｏｔｅ Ｏ－Ｓｃａｎ、中程度磁場の１０００ ミリテスラフィールドのＯＮＩ ＭＲＩシステム、１５００ミリテスラフィールドのＳｉｅｍｅｎｓ Ｍａｇｎｅｔｏｍシステム、３テスラ Ｖａｒｉａｎ および ＧＥシステム。さらに、本発明の方法は、世界中に設置されたさまざまなベンダーおよびシステムからの広範囲のＭＲＩシステムで検証されている。
【0124】
ＭＲＩを使用して、少量のアッセイ液に対する三次元視覚化能力を使用すると、時間単位または分単位で処理される多数のサンプルのデータ処理を同時に視覚化することができる。提案されたＭＲＩ検出システムには、シーケンシャルに他の工程を遅くすることがあるサブシステムがないため、検出のボトルネックはない。
【0125】
先行技術の方法とは異なり、本ＭＲＩ法は、サンプル調製システムに接続されておらず、ラジオ波信号がサンプルの純度によって大きく影響されないので、純粋なサンプルを必要としない。ＰＣＲおよびＬＡＭＰ増幅を妨害する可能性と同時に光信号検出のために、阻害剤を核酸サンプルから除去する必要があるために準備と処理に非常に長い時間がかかる、光学的に検出されるリアルタイムＰＣＲおよびＲＴ－ＬＡＭＰシステムとは異なる。本発明の方法は、光学的阻害剤の影響を受けないので、急速溶解法、およびサンプルの化学的処理または加熱を使用するサンプル処理方法が必要なすべてである。
【0126】
本発明のＭＲＩ検出方法は、ＭＲＩ造影剤としてインビボで使用されるナノメートルスケールの常磁性粒子（ナノ粒子）を含む磁気共鳴および磁気検出技術の先行技術に部分的に依存する。従来技術では、これらの磁性ナノ粒子は、ＭＲＩイメージングの前に患者または動物に注入される。造影剤が標的細胞に選択的に結合すると、スピン緩和パラメータが局所的に変化し、ＭＲＩ画像のコントラストが変化するため、画像のコントラストが向上し、人体の腫瘍細胞や非腫瘍細胞などの視覚化が向上する。
【0127】
本発明は、同様のナノ粒子原理を使用するが、それらは、臨床試料中に存在する低濃度のために検出が困難な核酸に適用される。ナノ粒子を介したＭＲＩおよびＮＭＲ検出を使用して検査できる臨床サンプルには、非侵襲的に収集された唾液、鼻腔スワブ、喀痰、尿、便サンプル、および血液や組織などのより侵襲的に収集されたサンプルが含まれる。
【0128】
１次元ＮＭＲを使用した単一テストの定量化：
本発明の別の態様では、ＭＲＩの背後にある基本技術である核磁気共鳴（ＮＭＲ）として知られる同じ基本的な方法を使用して、処理されたアッセイを市販のＮＭＲシステムを使用して検出し、さらにウイルスまたは細菌病原体負荷、個々の標本のそれらの株を一次元で特定、検証、または定量化する。対照的に、定量化を伴わない多数のサンプルのハイスループット分析にＭＲＩを使用する実施形態は、３次元での検出として定義される。この一次元検出は、同じ病原体または異なる病原体の各株の既知のプライマー（合成核酸セグメント）などのＲＴ－ＬＡＭＰおよびＲＴ－ＰＣＲアッセイ要素にも依存している。磁場強度の低または中程度の端部が検知プローブとして使用される磁気ナノ粒子にほとんど影響がないので、検出に使用されるＭＲＩシステムは、２．５ＭＨｚから１５０ＭＨｚのＮＭＲ周波数範囲にある。
本発明の別の態様では、ＭＲＩの背後にある基本技術である核磁気共鳴（ＮＭＲ）として知られる同じ基本的な方法を使用して、処理されたアッセイを市販のＮＭＲシステムを使用して検出し、さらにウイルスまたは細菌病原体負荷、個々の標本のそれらの株を一次元で特定、検証、または定量化する。対照的に、定量化を伴わない多数のサンプルのハイスループット分析にＭＲＩを使用する実施形態は、３次元での検出として定義される。この一次元検出は、同じ病原体または異なる病原体の各株の既知のプライマー（合成核酸セグメント）などのＲＴ－ＬＡＭＰおよびＲＴ－ＰＣＲアッセイ要素にも依存している。磁場強度の低または中程度の端部が検知プローブとして使用される磁気ナノ粒子にほとんど影響がないので、検出に使用されるＭＲＩシステムは、２．５ＭＨｚから１５０ＭＨｚのＮＭＲ周波数範囲にある。
【0129】
これらの好ましいＮＭＲシステムには、２．５ＭＨｚから１５０ＭＨｚの範囲の、Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｎｉｓｐｅｃシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｐｉｃｏ Ｓｐｉｎシステム、Ｍａｇｒｉｔｅｋ ｂｅｎｃｈ ｔｏｐ ＮＭＲ システム、Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｆｏｒｍｕｌａ ｈａｎｄｈｅｌｄ ＮＭＲ システム、および広範囲周波数のＢｒｕｋｅｒ ａｎｄ Ｖａｒｉａｎ ＮＭＲ装置を含む自家製および市販のベンチトップＮＭＲシステムが含まれる。
【0130】
ＭＲＩ検出ＬＡＭＰおよびＲＴ－ＬＡＭＰアッセイデザイン：
本発明の特定の方法は、６つの異なるプライマー、すなわちＦ３、Ｂ３、ＦＩＰ、ＢＩＰ、ループＦおよびループを必要とする、ＬＡＭＰまたはＲＴ?ＬＡＭＰアッセイを使用して、増幅されたＤＮＡを検出することにアプローチする。ＬＡＭＰは、標的遺伝子の６つの異なる領域を認識するように特異的に設計された最初の４つのプライマーの使用により特徴付けられる。ＬＡＭＰ アッセイはよく知られており、ワールド ワイド ウェブ上で図式的に説明されている。たとえば、以下を参照：www [dot] neb [dot] com/applications/dna-amplification-pcr-and-qpcr/isothermal-amplification/loop-mediated-isothermal-amplification-lamp。
本発明の特定の方法は、６つの異なるプライマー、すなわちＦ３、Ｂ３、ＦＩＰ、ＢＩＰ、ループＦおよびループを必要とする、ＬＡＭＰまたはＲＴ?ＬＡＭＰアッセイを使用して、増幅されたＤＮＡを検出することにアプローチする。ＬＡＭＰは、標的遺伝子の６つの異なる領域を認識するように特異的に設計された最初の４つのプライマーの使用により特徴付けられる。ＬＡＭＰ アッセイはよく知られており、ワールド ワイド ウェブ上で図式的に説明されている。たとえば、以下を参照：www [dot] neb [dot] com/applications/dna-amplification-pcr-and-qpcr/isothermal-amplification/loop-mediated-isothermal-amplification-lamp。
【0131】
使用した４つのプライマーは以下の通りである：
ａ． フォワード インナー プライマー（Forward Inner Primer：ＦＩＰ）：ＦＩＰは、３’末端のＦ２領域と５’末端のＦｌｃ領域からなる。Ｆ２領域は、テンプレート配列のＦ２ｃ領域に相補的である。Ｆｌｃ領域は、テンプレート配列のＦｌｃ領域と同一である。
ｂ． バックワード インナー プライマー（Backward Inner Primer：ＢＩＰ）：ＢＩＰ は、３’末端のＢ２領域と５’末端のＢｌｃ領域からなる。Ｂ２領域は、テンプレート配列のＢ２ｃ領域に相補的である。Ｂｌｃ領域は、テンプレート配列のＢｌｃ領域と同一である。
ｃ． フォワード アウター プライマー（Forward Outer Primer：Ｆ３）：このプライマーは、テンプレート配列のＦ３ｃ領域に相補的なＦ３領域からなる。このプライマーは、ＦＩＰよりも長さが短く、濃度が低い。
ｄ． バックワード アウター プライマー（Backward Outer Primer：Ｂ３ Ｐｒｉｍｅｒ）：このプライマーは、テンプレート配列のＢ３ｃ領域に相補的なＢ３領域からなる。
ａ． フォワード インナー プライマー（Forward Inner Primer：ＦＩＰ）：ＦＩＰは、３’末端のＦ２領域と５’末端のＦｌｃ領域からなる。Ｆ２領域は、テンプレート配列のＦ２ｃ領域に相補的である。Ｆｌｃ領域は、テンプレート配列のＦｌｃ領域と同一である。
ｂ． バックワード インナー プライマー（Backward Inner Primer：ＢＩＰ）：ＢＩＰ は、３’末端のＢ２領域と５’末端のＢｌｃ領域からなる。Ｂ２領域は、テンプレート配列のＢ２ｃ領域に相補的である。Ｂｌｃ領域は、テンプレート配列のＢｌｃ領域と同一である。
ｃ． フォワード アウター プライマー（Forward Outer Primer：Ｆ３）：このプライマーは、テンプレート配列のＦ３ｃ領域に相補的なＦ３領域からなる。このプライマーは、ＦＩＰよりも長さが短く、濃度が低い。
ｄ． バックワード アウター プライマー（Backward Outer Primer：Ｂ３ Ｐｒｉｍｅｒ）：このプライマーは、テンプレート配列のＢ３ｃ領域に相補的なＢ３領域からなる。
【0132】
重要なＬＡＭＰプライマーセット（ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、および Ｂ３）が決定された後、増幅時間を短縮し、特異性を向上させるループプライマーが設計される。
【0133】
ＬＡＭＰまたはＲＴ?ＬＡＭＰの先行技術で使用される段階的アプローチは、文献および先行技術に記載されており、本発明のＭＲＩ検出方法との関連を示し、新しい発明の方法を実施し、ＭＲＩで検出されたＬＡＭＰ産物の要素を理解するために必要な変更を強調することを目的として以下に簡単に記載されている。
【0134】
ＬＡＭＰ法の先行技術では、サンプル溶液中のＲＮＡおよび前述のＭＲＩ検出可能なビオチン化プライマーを含む反応溶液の成分は、６０から６５℃の一定温度でインキュベートされる。その結果、以下の工程が観察された。プロセスは、loopamp [dot] eiken [dot] co [dot] jp/e/lamp/rt_principle.htmlのワールドワイドＷｅｂで表示されるRT-LAMP in RT-LAMP method - Principle: RT-LAMPを示す図を参照して、以下に詳細に説明する。
【0135】
ＲＴ－ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ－１：ＢＩＰプライマーがテンプレートＲＮＡにアニールし、逆転写酵素の活性によりｃＤＮＡが合成される。独自にビオチン化されたプライマーは、５’末端にビオチンを持つプライマーの１６の可能な組み合わせを使用して増幅に使用される。商用ベンダー（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）が種々のビオチンの位置とデザインでこれらを提供する。これらのプライマーは、ＲＴ－ＬＡＭＰ産物の後処理に重要なナノ粒子に結合するために、選択的にビオチン化された。ビオチン結合プライマーを使用する任意の実施形態では、ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰアッセイに参加することができ、ＭＲＩ法またはＮＭＲ法を使用して下流で検出することができる。
【0136】
ＢＩＰまたはＦＩＰプライマーは、標的配列の相補的なセクションに結合するＢ２およびＦ２部位の結果として鎖置換を開始する。このプロセスは、例えば、反応媒体中のＢｓｔポリメラーゼによる置換によって起こる。
【0137】
ＲＴ?ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ?２：Ｆ３プライマーはＢＩＰプライマーの外側の領域にアニールする。逆転写酵素の活性により、新しいｃＤＮＡが合成され、同時にＢＩＰプライマーによって先に形成されたｃＤＮＡ鎖が解放される。
【0138】
ＲＴ－ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ－３：工程（２）から、ＢＩＰから合成された一本鎖ｃＤＮＡが解放される。次に、ＦＩＰプライマーは、この一本鎖ｃＤＮＡにアニールする。
【0139】
ＲＴ－ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ－４：逆転写工程（３）から、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの活性により、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端が開始点となり、相補的ＤＮＡ鎖が合成される。
【0140】
ＲＴ?ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ?５：Ｆ３プライマーはＦＩＰの外側の領域にアニールし、その３’末端が合成の開始点となり、同時にＦＩＰによって先に形成されたＤＮＡ鎖を解放する。
【0141】
ＲＴ?ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ?６：テンプレートＤＮＡ鎖とともにＦ３プライマーにより合成されたＤＮＡ鎖は二本鎖ＤＮＡを形成する。
【0142】
ＲＴ－ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ－７：工程（５）で解放されたＦＬＰ結合ＤＮＡ鎖は両端に相補配列を含むため、自己アニールしてダンベル様構造を形成する。この構造（７）は、ＬＡＭＰサイクリング増幅の出発構造となる。
【0143】
ＲＴ?ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ?８：ダンベル様ＤＮＡ構造（７）は、５’末端でループを広げてＤＮＡ合成を延長する自己プライミングＤＮＡ合成によりステムループＤＮＡに迅速に変換される。ＢＩＰはステムループＤＮＡの一本鎖領域にアニーリルして、工程（８）でＤＮＡ合成を開始し、先に合成された鎖を解放する。
【0144】
ＲＴ－ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ－９：この解放された一本鎖は、ＦｌｃおよびＦＩ領域が相補的であるため、３’末端でステムループ構造を形成する。次に、ＦＩ領域の３’末端から、自己構造をテンプレートとしてＤＮＡ合成が開始され、ＢＩＰ結合した相補鎖が解放される。構造（９）が形成される。
【0145】
ＲＴ?ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ?１０：次いで、解放されたＢＩＰ結合一本鎖は、両端がそれぞれ相補的なＦＩ?ＦｌｃおよびＢｌｃ?Ｂ１領域を有するダンベル様構造を形成する。この構造は構造（７）の反転構造である。
【0146】
ＲＴ?ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ?１１：工程（７）と同様に、構造（１０）は、ＦＩ領域の３’末端から始まる自己プライミングＤＮＡ合成を進行させる。さらに、ＦＩＰはＦ２ｃ領域にアニールし、ＤＮＡ鎖の合成を開始する。このＦｌＰ結合ＤＮＡ鎖は、自己プライミングＤＮＡ合成の鎖置換によって解放される。したがって、工程（７）、（８）および（１０）と同様に、工程（１０）および（１１）が進行し、構造（７）が再び形成される。
【0147】
ＲＴ?ＬＡＭＰ ＳＴＥＰ?１２：工程（９）（または工程（１２））で生成された構造により、ＦＩＰ（またはＢＩＰ）が一本鎖Ｆ２ｃ領域（またはＢ２ｃ領域）にアニールし、ＤＮＡ合成が二本鎖ＤＮＡを解放することによって継続する。このプロセスの結果として、同じ鎖上の標的配列の交互逆方向反復からなる様々なサイズの構造が形成される。
【0148】
上記のすべての工程において、ビオチンは保存され、生成物および残りの生成物において利用可能であり、これらはＭＲＩイメージングを使用するＭＲＩ検出のためのアッセイの下流の調製に利用される。
【0149】
ＭＲＩ法を使用する場合、Ｔ２と呼ばれるＭＲ緩和時間が長いＭＲＩ画像において「明るいスポット」を与える不成功の反応と比較して、増幅が成功した後の成功したＬＡＭＰアッセイは、Ｔ２と呼ばれるＭＲ緩和時間がより短く、ＭＲＩ画像において「より暗いスポット」をもたらす。磁場の存在下での官能基との相互作用により緩和時間を変化させる能力を持つナノビーズを選択することで、暗いものから明るいものへ、またはその逆への切り替えも可能である。
【0150】
本発明の一実施形態では、ＤＮＡの増幅に関与するＬＡＭＰプライマーは、以下に示すようにビオチン化される。相補的な官能基であるストレプトアビジンは、アッセイに追加されるナノ粒子に結合し、特に３次元でのＭＲＩ検出の場合、磁気共鳴ベースの検出プロセスの必須要素である。
【0151】
ＬＡＭＰを使用する本発明の実施形態において、ビオチンは、プライマーの５’末端でプライマーＢＩＰ、ＦＩＰ、ループＦおよびループＢに結合される。以下に示すのは、ＭＲＩ検出を可能にするプライマーのいくつかの異なる配列と組み合わせである。
【0152】
１． ５’－Ｆ３－３’
２． ５’－Ｂ３－３’
３． ５’－ビオチン－ＦＩＰ－３’
４． ５’－ビオチン－ＢＩＰ－３’
５． ５’－ビオチン－ループ Ｆ－３’
６． ５’－ビオチン－ループ Ｂ－３’
２． ５’－Ｂ３－３’
３． ５’－ビオチン－ＦＩＰ－３’
４． ５’－ビオチン－ＢＩＰ－３’
５． ５’－ビオチン－ループ Ｆ－３’
６． ５’－ビオチン－ループ Ｂ－３’
【0153】
Ｆ３およびＢ３のビオチン化は、成功したシグナルシグナルを与えず、また陽性および陰性のＬＡＭＰアッセイ間の差を与えず、したがってＦ３およびＢ３はビオチン化されない。３から６までの５つの他の可能な結合オプション、およびすべての配列と組み合わせでは、異なる陽性および陰性アッセイ強度を示すＭＲＩ画像が得られる。
【0154】
上に列挙した６つのＬＡＭＰプライマーにおいて、プライマーＦ３およびＢ３は、５’末端にビオチンなどの官能基を有しない。これらの２つのプライマーは、それらに結合した官能基が加えられた場合、標的ＤＮＡの存在および非存在を区別することができず、したがって、本発明のＭＲＩ検出ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰアッセイとは認められない。上記の６つのＬＡＭＰプライマーでは、ＦＩＰ、ＢＩＰ、ループＦ、およびループＢの４つのプライマーのうち少なくとも１つが官能基としてイオチン化されている。ストレプトアビジンは、ＭＲＩ特性を陽性と陰性の区別を示すように変化させるナノビーズに付着またはコーティングする必要がある相補的な官能基である。
【0155】
５’末端にビオチン基が付加された（プライマーの５’末端がビオチン化されているとも呼ばれる）ＬＡＭＰプライマーの好ましい組み合わせを、本発明の方法において好ましい順に以下に列挙する。
【0156】
ＦＩＰプライマーのみの５’末端にビオチン、
ＢＩＰプライマーのみの５’末端にビオチン、
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの５’末端にビオチン、
ループＦプライマーのみの５’末端にビオチン、
ループＢプライマーのみの５’末端にビオチン、
ループＦおよびループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマーおよびループＦプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマーおよびループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＢＩＰプライマーおよびループＦプライマーの５’末端にビオチン、
ＢＩＰプライマーとループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ループＦプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマー、ループＦプライマー、ループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＢＩＰプライマー、ループＦプライマー、ループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＢプライマー、ＢＩＰプライマー、ループＢプライマー、ループＦプライマーの５’末端にビオチン。
ＢＩＰプライマーのみの５’末端にビオチン、
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの５’末端にビオチン、
ループＦプライマーのみの５’末端にビオチン、
ループＢプライマーのみの５’末端にビオチン、
ループＦおよびループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマーおよびループＦプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマーおよびループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＢＩＰプライマーおよびループＦプライマーの５’末端にビオチン、
ＢＩＰプライマーとループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ループＦプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＰプライマー、ループＦプライマー、ループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＢＩＰプライマー、ループＦプライマー、ループＢプライマーの５’末端にビオチン、
ＦＩＢプライマー、ＢＩＰプライマー、ループＢプライマー、ループＦプライマーの５’末端にビオチン。
【0157】
ＭＲＩ検出ＬＡＭＰアッセイの一実施形態では、ビオチンがＦＩＰ ＬＡＭＰプライマーのみの５’末端に結合されており、最低コストのプライマーにしている。最も単純な設計では、他のプライマーはビオチン化されていない。あるいは、ＢＩＰプライマーをビオチン化して、ＦＩＰを官能化しないで残すこともできる。最も単純な設計では、ＦＩＰおよびＢＩＰ ＬＡＭＰプライマーからの２つのうちの１つが、ＬＡＭＰ反応で変更される２つのプライマーのうちの１つにすることができ、したがって、メーカーがビオチン化プライマーごとに多額の費用を請求するため、プライマーコストの点で安価になる。対応する磁性ナノ粒子はストレプトアビジンでコーティングされているため、「未使用」のビオチン化ＦＩＰプライマーは、磁性ナノ粒子に結合したストレプトアビジンに強く結合し、特定のＬＡＭＰ反応がなくてもナノ粒子の容易な捕捉を可能にする。
【0158】
一実施形態では、ビオチンがＢＩＰＬＡＭＰプライマーの５’末端に結合されている。ＦＩＰプライマーはビオチン化されていないため、このデザインは非常にシンプルである。ＢＩＰ ＬＡＭＰプライマーは、ＬＡＭＰ反応で変更する必要がある唯一のプライマーである。対応する磁性ナノ粒子はストレプトアビジンでコーティングされているため、「未使用」のビオチン化ＢＩＰプライマーは磁性ナノ粒子内のストレプトアビジンに強く結合し、特定のＬＡＭＰ反応がなくてもナノ粒子の容易な捕捉を可能にする。
【0159】
一実施形態において、ビオチンは、ＦＩＰおよびＢＩＰ ＬＡＭＰプライマーの両方の５’末端に結合されている。２つのプライマー ＦＩＰおよびＢＩＰ ＬＡＭＰプライマーに変更を加えると、ビオチンなどの結合分子が結合した各プライマーにメーカーが多額の費用を請求するため、プライマーのコストが高くなる。対応する磁性ナノ粒子はストレプトアビジンでコーティングされているため、「未使用」のビオチン化ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーは磁性ナノ粒子内のストレプトアビジンに強く結合し、特定のＬＡＭＰ反応がなくてもＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの両方によるナノ粒子の強い親和性と容易な捕捉を可能にする。
【0160】
一実施形態では、ビオチンがＢＩＰ ＬＡＭＰプライマーの５’末端に付着している。ＦＩＰプライマーはビオチン化されていないため、この設計は非常にシンプルである。ＢＩＰ ＬＡＭＰプライマーは、ＬＡＭＰ反応で変更する必要がある唯一のプライマーである。対応する磁性ナノ粒子はストレプトアビジンでコーティングされているため、ビオチンに結合した「未使用」のＢＩＰプライマーは磁性ナノ粒子内のストレプトアビジンに強く結合し、特定のＬＡＭＰ反応がなくてもナノ粒子の容易な捕捉を可能にする。
【0161】
一実施形態において、ビオチンは、ＦＩＰおよびＢＩＰ ＬＡＭＰプライマーの両方の５’末端に結合されている。２つのプライマー ＦＩＰおよびＢＩＰ ＬＡＭＰプライマーに変更を加えると、ビオチンなどの結合分子が結合した各プライマーにメーカーが多額の費用を請求するため、プライマーのコストが高くなる。対応する磁性ナノ粒子はストレプトアビジンでコーティングされているため、ビオチンに結合した「未使用」のＦＩＰおよびＢＩＰプライマーは磁性ナノ粒子内のストレプトアビジンに強く結合し、特定のＬＡＭＰ反応がなくてもＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの両方によるナノ粒子の強力な親和性と容易な捕捉を可能にする。
【0162】
本発明の一実施形態では、２０から２００ナノメートルのストレプトアビジン結合Ｓｕｐｅｒ Ｍａｇナノ粒子が、最大の柔軟性、速度および感度で使用される。ナノビーズのサイズ、ナノ粒子の結合能力は、アッセイにおけるナノビーズの最適濃度によって決定される。
【0163】
検出に使用されるナノ粒子のサイズは、ＭＲＩ検出において変化する。小さいナノビーズは高磁場ＭＲＩで使用され、大きいナノビーズは低磁場ＭＲＩシステムで使用され、検出プロセスをより簡単かつ高感度にする。
【0164】
本発明の一実施形態では、ナノ粒子の表面に共有結合したストレプトアビジンの単層を有するＳｕｐｅｒ Ｍａｇナノ粒子は、ビオチン結合部位のほとんどを、使用されておらず、ＬＡＭＰ反応に参加していないビオチン化プライマーの結合を立体的に利用可能にする。広い表面積、優れたコロイド安定性、および独自の表面コーティングにより、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｓｕｐｅｒ Ｍａｇは高い結合能力、低い非特異的結合、および捕捉のための高速磁気結合を示す。
【0165】
本明細書に記載のＭＲＩ検出方法は、ＭＲＩ検出システムによる迅速で大規模な無抽出試料処理を可能にする終点検出アプローチである。これは、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ－ｑＰＣＲ）のような広範な物理的および化学的原理を使用するＤＮＡおよびＲＮＡからの核酸アンプリコンの存在を検出する先行技術の検出技術とは対照的である。逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）は、サンプルを監視する専用センサーを使用した蛍光分光法で検出されることがほとんどである。等温増幅法ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰの場合、エンドポイントで濁度、熱量測定、蛍光を使用する頻度は低く、ほぼリアルタイム検出モードでほとんどのアンプリコンが検出される。
【0166】
ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスＲＮＡの異なる遺伝子セグメントに対して、また他のウイルスインフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスＲＮＡセグメント、多くの他のウイルス、ＣＯＶＩＤ－１９のさまざまな株や出現しているその他のウイルス変異体、さらには変異しているさまざまな遺伝子セグメントに対して、上記で説明されたものと類似するアプローチで、試験され、検証され、適用されている。
【0167】
本発明の方法の最も重要な要素は、任意の他の検出方法によって検出された任意のＲＴ－ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰアッセイを、ＭＲＩ検出可能な３－Ｄフォーマットにすることである。本発明の特定の実施形態では、選択的ＬＡＭＰプライマーと特異性ＬＡＭＰプライマー上の結合分子とが組み合わされ、該選択的ＬＡＭＰプライマーは適合する結合分子でコーティングされたを設計し、これらの特異的ＬＡＭＰプライマー上のと一致する結合部位でコーティングされた磁性ナノ粒子に結合するために使用される特異的結合分子に結合するように設計される。
【0168】
ＭＲＩシグナル生成は、様々なプライマーおよび増幅生成物中に存在するビオチン部位に付着したナノ粒子の結合により発生し、これらは、緩和パラメータ、すなわち一緒になってコントラストの変化をもたらすＴ２およびＴ１の変化をもたらす、この方法の必須要素である。ここで、Ｔ２は、Ｔ２強調画像として知られるＭＲＩ画像とＮＭＲの両方で最も重要なパラメーターであり、検出と定量化はＴ２測定値を使用して行われる。３－Ｄ ＭＲＩで検出された画像強度には、ターゲットＲＮＡやＤＮＡなどの特定のターゲット核酸の存在下および非存在下で、これらの磁性ナノ粒子によって生成される変動があり、また、反応管内で使用されていない特異性ＬＡＭＰプライマーの存在によっても変動する。
【0169】
成功したＬＡＭＰ反応の終わりに、特異的標的ＬＡＭＰプライマーは、反応によって増幅される標的核酸の存在下で増幅プロセスによってほとんど消費される。特異性標的核酸が存在しない場合、プライマーは反応チューブに残る。反応のこれらの要素により、これらの反応生成物の一意の同定が可能になり、その結果、ＭＲＩ信号の信号強度が変化する。
【0170】
特異性ＬＡＭＰ増幅の場合、結合分子を含む特異性ＬＡＭＰプライマーは、成功したＬＡＭＰ反応プロセスによって保護される。成功したＬＡＭＰ反応では、後で反応混合物に追加されたナノ粒子は、特異性ＬＡＭＰ増幅工程によって「遮蔽」または「隠蔽」された結合分子を検出しない。ＬＡＭＰ特異的反応が存在しない場合、プライマーは自由に浮遊する。これは、結合分子が機能化ナノ粒子に効果的に結合する「残り」のすべてのプライマーが反応に含まれるためである。結合分子を介した「残り」のプライマーの結合は、相補的な結合化学物質でコーティングされたナノ粒子プローブ分子と結合し、反応中に分離できない強力な結合を形成する。
【0171】
したがって、「プライマーの消費」をもたらす成功したＬＡＭＰ反応は、ナノ粒子とのプライマー結合部位を奪うため、ナノ粒子は分散したままになり、ナノ粒子間の弱い結合は機械的な力で容易に破壊される。したがって、特異性ＬＡＭＰ反応が成功すると、磁性ナノ粒子がＬＡＭＰ反応チューブ内に均一に分散される。さらに、大量の特異性ＬＡＭＰ産物は、アッセイにおける磁性ナノ粒子のさらなる分散につながる。したがって、失敗したＬＡＭＰ反応は、特異性ＬＡＭＰ反応の場合に、所定の核スピン緩和につながる反応媒体中の磁性ナノ粒子の均一な分布につながる。
【0172】
あるいは、磁性ナノ粒子の「未使用」プライマーへの結合は、磁性ナノ粒子の磁気分離および不均一な分布を可能にするこれらのプライマーによるナノ粒子の効果的な捕捉をもたらす。特定の「未使用」プライマーとナノ粒子の間に強い結合がある場合、磁性ナノ粒子は機械的な力によって容易に分散できず、その結果、アッセイ媒体中の磁性ナノ粒子の分布が不均一になる。これにより、緩和時間が有意に異なる信号となり、ＬＡＭＰアッセイの信頼性が高まり、迅速かつ大規模になる。
【0173】
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ＭＲＩを使用する場合、特異的増幅後の成功したＬＡＭＰアッセイは、より長い緩和時間を有する「明るいスポット」をもたらす非特異的またはより産物の不在と比較して、「ブラックホール」または「より暗いスポット」をもたらす。別の実施形態では、逆の結果が、ＲＴ－ＬＡＭＰプライマーおよび生成物中に存在するビオチンと結合するナノ粒子の表面特性を化学的に変化させることによって実証された。つまり、「暗いスポット」はウイルスＲＮＡが存在しないことを表し、「明るいスポット」はウイルスＲＮＡが存在することを表する。この反対の信号は、ＲＴ－ＬＡＭＰ増幅工程の前にアッセイ媒体内における表面特性を変更できる化学物質の添加によって達成された。
ＭＲＩを使用する場合、特異的増幅後の成功したＬＡＭＰアッセイは、より長い緩和時間を有する「明るいスポット」をもたらす非特異的またはより産物の不在と比較して、「ブラックホール」または「より暗いスポット」をもたらす。別の実施形態では、逆の結果が、ＲＴ－ＬＡＭＰプライマーおよび生成物中に存在するビオチンと結合するナノ粒子の表面特性を化学的に変化させることによって実証された。つまり、「暗いスポット」はウイルスＲＮＡが存在しないことを表し、「明るいスポット」はウイルスＲＮＡが存在することを表する。この反対の信号は、ＲＴ－ＬＡＭＰ増幅工程の前にアッセイ媒体内における表面特性を変更できる化学物質の添加によって達成された。
【0174】
ＭＲＩ検出ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲアッセイ
本発明の別の実施形態において、ＲＴ－ＰＣＲアンプリコンは、特異的な設計のプライマーを用いてＭＲＩを使用して検出するために合成される。ＲＴ－ＰＣＲには、ＲＴ－ＬＡＭＰでも検出されるＣＯＶＩＤ－１９の遺伝子セグメントをターゲットにすることができるフォワードプライマーとリバースプライマーの２つのプライマーが必要である。ＲＴ－ＰＣＲとＲＴ－ＬＡＭＰのアンプリコンは質的に大きく異なる。ＲＴ－ＰＣＲプライマーも両方のＰＣＲプライマーの５’末端でビオチン化されている。
本発明の別の実施形態において、ＲＴ－ＰＣＲアンプリコンは、特異的な設計のプライマーを用いてＭＲＩを使用して検出するために合成される。ＲＴ－ＰＣＲには、ＲＴ－ＬＡＭＰでも検出されるＣＯＶＩＤ－１９の遺伝子セグメントをターゲットにすることができるフォワードプライマーとリバースプライマーの２つのプライマーが必要である。ＲＴ－ＰＣＲとＲＴ－ＬＡＭＰのアンプリコンは質的に大きく異なる。ＲＴ－ＰＣＲプライマーも両方のＰＣＲプライマーの５’末端でビオチン化されている。
【0175】
ＭＲＩ検出アッセイ用のさらなるシステムとサブシステム
以下のプロセス、方法およびサブシステムの１つまたは複数は、ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰアッセイを使用して核酸を迅速かつ高感度に検出するための本発明の方法に関連する。
以下のプロセス、方法およびサブシステムの１つまたは複数は、ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰアッセイを使用して核酸を迅速かつ高感度に検出するための本発明の方法に関連する。
【0176】
混合生成物は、多数の磁石の磁気アレイの存在下でユニークなプロセスを行い、このプロセスは反応がより速く起こるように促進し、核種シグナルを磁気的に増強することによってシグナルを劇的に増加させる。より正確には、このプロセスはコントラストを増加させるか、またはシグナルを強くし、または陰性アッセイと陽性アッセイの間のシグナルの差を大きくする。
【0177】
ＭＲＩ画像は、臨床ＭＲＩ装置を使用して収集され、すべての処理されたサンプルのアレイを使用してそれらを視覚的に見るか、および／または後で、ＭＲＩデータを読み取り、転送し、処理して３Ｄから線形データを示し、陽性と陰性を非常に高速に示すソフトウェアプログラムを使用する。
【0178】
Ｆｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）およびこの目的のために開発されたＭａｔｌａｂプログラムなどの利用可能な画像処理ソフトウェアツールを使用して、反応管からの信号測定に利用できる測定に利用可能なすべてのＭＲＩ装置で使用できるソフトウェアを使用して、ＭＲＩ画像を処理し、試験結果を自動的に示す。
【0179】
例
例－１
好ましい実施形態の工程の詳細な説明と、南北アメリカ、アフリカ、アジアなどを含む世界中のさまざまな政府から承認を受け、ＣＯＶＩＤ－１９を検出するために世界中で使用されている唾液の中のＣＯＶＩＤ－１９試料を検出するためのパンデミックスクリーニングのための市販のアッセイ。
例－１
好ましい実施形態の工程の詳細な説明と、南北アメリカ、アフリカ、アジアなどを含む世界中のさまざまな政府から承認を受け、ＣＯＶＩＤ－１９を検出するために世界中で使用されている唾液の中のＣＯＶＩＤ－１９試料を検出するためのパンデミックスクリーニングのための市販のアッセイ。
【0180】
標本収集：
インド、ナイジェリア、および米国の多くの場所で唾液およびスワブ標本を収集し、比較試験をゴールドスタンダードＲＴ－ＰＣＲ試験法で行って、ＲＴ－ＬＡＭＰおよびＲＴ－ＰＣＲのＭＲＩを使用した検出が９５－１００％に近く、結果は標準化されたテストに匹敵することを示した。
インド、ナイジェリア、および米国の多くの場所で唾液およびスワブ標本を収集し、比較試験をゴールドスタンダードＲＴ－ＰＣＲ試験法で行って、ＲＴ－ＬＡＭＰおよびＲＴ－ＰＣＲのＭＲＩを使用した検出が９５－１００％に近く、結果は標準化されたテストに匹敵することを示した。
【0181】
１，０００を超えるヒト唾液および鼻スワブサンプルが、インドの病院および医科大学（ＳＶＳ医科大学、メブブナガル、インド）への来院者から収集され、これらのサンプルを複数の方法で試験して、結果間の相関関係を示した。ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイキットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ から購入したもので、ＴａｑＰａｔｈ（登録商標）ＣＯＶＩＤ－１９ Ｃｏｍｂｏ Ｋｉｔ として知られている。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ を使用して、スワブと唾液サンプルから抽出したＲＮＡに対してリアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲテストが実行された。ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを実施するために従来技術を採用する商用システムは、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ５と呼ばれ、米国のＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入された。
【0182】
インドで試験および比較された唾液サンプルの数は２５０であり、そのうち１１９サンプルがＣＯＶＩＤ－１９ウイルスに対して陰性であり、１３１サンプルが陽性の唾液サンプルであった。Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ（蛍光ベースの光学検出）を使用して検出されたＲＴ－ｑＰＣＲを使用した比較研究と、ＭＲＩ、ＮＭＲ、およびゲル電気泳動を使用してＲＴ－ＬＡＭＰが検出された。同じ患者からの同じ唾液サンプルとスワブサンプルも、これらすべての方法を使用してテストされ、結果は、陽性サンプルで９７％一致、陰性サンプルで９９％一致を示す技術間のほぼ完全な一致を示した。
【0183】
ＣＯＶＩＤ－１９に対して広く使用されている分子試験（ＲＴ－ＰＣＲおよびＲＴ－ＬＡＭＰ）は、鼻スワブ試料に対して最初から実施された。毎日２００万から３００万人の鼻スワブを採取するには、何十万人もの医療従事者と看護師が必要だった。検査数を数千万人に増やす際のボトルネックの１つは、唾液検体の採取によって解消された。この方法では、自己採取した唾液を使用した。唾液の収集は、プラスチック製の漏斗と、漏斗にねじで接続された５ｍＬチューブからなる低コストのデバイスを使用して行われた。唾液を自己収集する人は、唾液を排出した後、漏斗をスクリューキャップに交換する。本発明の方法を実施するために必要な唾液量は、１０マイクロリットル未満である。採取された唾液の量は、１００マイクロＬから１ｍＬの間だった。収集チューブまたはバイアルに唾液を収集した後、唾液は、固定または移動式ラボである試験施設に輸送される。唾液の温度は約４から８℃に保たれている。唾液サンプルは、バイアル内のＣＯＶＩＤ－１９ウイルスの品質と初期量に悪影響を与えることなく、１から２日間２０から３０℃の温度に保たれた。別のオプションとして、鼻スワブ標本を処理した。ウイルス輸送培地（ＶＴＭ）に保存されたスワブサンプルは、唾液に採用されたのと同じプロセスに従って直接処理された。処理された唾液とスワブのＶＴＭの量は、２５マイクロＬのＲＴ－ＬＡＭＰ反応で約４から６マイクロＬである。
【0184】
ｂ．ＣＯＶＩＤ－１９検体の梱包と発送
唾液サンプルは同日中に試験場所に運ばれ、保存溶液は必要なかった。安全な除染パッケージに入ったサンプルの発送は、郵便で送られるか、収集スタッフによって直接配達される。
唾液サンプルは同日中に試験場所に運ばれ、保存溶液は必要なかった。安全な除染パッケージに入ったサンプルの発送は、郵便で送られるか、収集スタッフによって直接配達される。
【0185】
ｃ．唾液中に存在するＣＯＶＩＤ－１９ウイルスは、本発明の方法の簡単なプロセスを使用して不活化および溶解された。安全で簡単に２５０マイクロＬのＲＴ－ＬＡＭＰ反応チューブに追加できるように、８５から９８℃の温度の温水を追加した。加える水の量は、集めた唾液の量とほぼ同じである。この不活性化によってウイルスも殺され、ウイルスからＲＮＡを放出するために、唾液処理バッファーと化学物質を使用して溶解工程が実行される。
【0186】
溶解バッファーの添加に続いて、唾液処理バッファーと化学物質の混合物を９０から９８℃の温度で２から１０分間加熱する。ヒアリング温度が高いほど加熱時間が短くなる。好ましい実施形態では、９５℃で１０分間加熱された。本発明の方法の好ましい実施形態では、カオトロピック剤および最強の変性剤であるグアニジニウム塩が、１０マイクロＭから１００マイクロＭの濃度範囲で、液体の形態で使用され、唾液酵素の活性を低下させ、溶解度を高め、および唾液の粘度を低下させた。
【0187】
ｄ．ＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、Lucigen, USA New England Bio Labs (NEB), USA and Optigene, UK.の３社のベンダーから容易に入手できるＲＴ－ＬＡＭＰマスターミックスを使用して実行された。ＣａｔＬｏｇ 番号１７００および１８０４の市販のすぐに使用できるマスターミックスを使用した。ＭＲＩ法を使用したＣＯＶＩＤ検出のためのＲＴ－ＬＡＭＰのためのプライマー設計は、ＲＴ－ＬＡＭＰプライマーのいくつかのセットを使用して実行された。各プライマーセットは、ＣＯＶＩＤ－１９ゲノムの特定の領域をターゲットにしている。公開された文献で入手可能なプライマーを使用した。特許の前のセクションに記載されているように、ビオチン添加のすべての配列および組み合わせは、以下のリストのプライマーを使用して検証された。
【0188】
文献からのいくつかのＬＡＭＰプライマーが検証され、場合によっては、新しいプライマーが設計および最適化された（異なるＣＯＶＩＤ?１９遺伝子セグメント、バリアントおよび他の標的に対して）。ＭＲＩ検出ＲＴ－ＬＡＭＰの好ましい実施形態について以下に挙げるプライマーセットは、刊行物（参考文献１）から入手し、主にビオチン付加によって可能になるＭＲＩ検出ができるようにプライマーに改変を加えて、商用ベンダー(Integrated DNA technologies (IDT), USA) によって提供される精製プロセスを使用して任意に精製を行った。
【0189】
参考文献－１：Rabe, B. A. & Cepko, C. SARS-CoV-2 detection using isothermal amplification and a rapid, inexpensive protocol for sample inactivation and purification. Proc. Nat. Acad. Sci.(PNAS) 117, 24450-24458 (2020)。
【0190】
プライマー選択と合成ＤＮＡの設計
Ｏｒｆｌａｂ遺伝子セグメント、すなわちＦ３、Ｂ３、ビオチン－ＦＩＰ、およびビオチン－ＢＩＰのビオチン化オリゴは、上記の参考文献で入手可能なプライマーを改変して設計された。またループプライマーのセット（５’端にビオチンを含むかまたは含まないＬＦおよびＬＢ）は、リンカーとギャップを埋めることによって、選択された遺伝子セグメントのギャップを埋めることによって設計された。合成ＤＮＡは、同じソフトウェアを使用して作成され、商用ベンダー（ＩＤＴ、米国）の助けを借りて合成された。
Ｏｒｆｌａｂ遺伝子セグメント、すなわちＦ３、Ｂ３、ビオチン－ＦＩＰ、およびビオチン－ＢＩＰのビオチン化オリゴは、上記の参考文献で入手可能なプライマーを改変して設計された。またループプライマーのセット（５’端にビオチンを含むかまたは含まないＬＦおよびＬＢ）は、リンカーとギャップを埋めることによって、選択された遺伝子セグメントのギャップを埋めることによって設計された。合成ＤＮＡは、同じソフトウェアを使用して作成され、商用ベンダー（ＩＤＴ、米国）の助けを借りて合成された。
【0191】
すべてのオリゴはＩＤＴに注文し、ＩＤＴが提供するＴＥ水に１００マイクロＭの濃度で再懸濁した。オリゴを組み合わせて、次のように１００マイクロＬの１０ｘプライマーミックスを以下のように作成した：４マイクロＬのビオチン－ＦＩＰ、４マイクロＬのビオチン－ＢＩＰ、０．５マイクロＬのＦ３、０．５マイクロＬのＢ３、１マイクロＬのビオチン－ＬＦ、および１マイクロＬのビオチン－ＬＢ、および１００マイクロＬにする量のヌクレアーゼを含まない水。
【0192】
すべてのＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、ＮＥＢプロトコル（Ｅ１７００およびＭ１８０４）によって記載されるように設定され、６２℃で実行された。
【0193】
この研究で使用されたすべてのウイルスＲＮＡ配列は精製されたＲＮＡであり、ヌクレアーゼを含まない水で段階的に希釈されたさまざまなＣＯＶＩＤ－１９株について ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ からさまざまなウイルスコントロールを受け取った。
【0194】
ＭＲＩ検出ＲＴ－ＬＡＭＰプライマーの組み合わせの好ましい実施形態は、以下のプライマー－ビオチンの組み合わせを使用して検証され提示される。プライマーは、上記の１８の組み合わせに従ってビオチンを結合して設計され、ＭＲＩ画像が記録され、画像は増幅されたＣＯＶＩＤ－１９遺伝子セグメントの有無を示した。
【0195】
本発明は、ＬＡＭＰ法を使用して増幅されたｃＤＮＡに変換されたＲＮＡを有するＣＯＶＩＤ－１９ウイルスについて検証され、また、実験室で死滅したＣＩＶＩＤ－１９ウイルスを使用し、後にＣＯＶＩＤ－１９ウイルス感染者から収集された数千のサンプルを用いて臨床検査室で検証された。一致するターゲットＣＯＶＩＤウイルス、一致するターゲットＲＮＡ、および一致するｃＤＮＡは、本発明を検証するＬＡＭＰアンプリコンの後処理後にＭＲＩ画像を記録すると、より暗い画像をもたらした。
【0196】
米国ＩＤＴの助けを借りて商業的に設計および合成された合成ｃＤＮＡを以下に示す。
【0197】
ORFlab 遺伝子標的配列( ヌクレオチド2101-2581 of Genbank Accession No. NC 045512.2):
2101 gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga
2161 agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat
2221 ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa
2281 ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc
2341 tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca
2401 ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc
2461 tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt
2521 aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga
(SEQ ID NO: 10)
2101 gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga
2161 agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat
2221 ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa
2281 ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc
2341 tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca
2401 ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc
2461 tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt
2521 aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga
(SEQ ID NO: 10)
【0198】
この好ましい実施形態のＯＲＦｌａｂ遺伝子を標的とする６つのＣＯＶＩＤ－１９ ＬＡＭＰプライマーを以下に示す。ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーは、その５末端にビオチン分子を使用して設計された。
【0199】
F3 Primer: 5 ’ -CGGT GGAC AAATT GTC AC-3 ’ (SEQ ID NO:l)
B3 Primer: 5 ’ -CTT CTCT GGATTT AAC AC ACTT -3 ’ (SEQ ID NO:2)
FIP Primer: 5 ’ -Biotin-TC AGC AC AC A AAGCC AAAAATTT ATTTTT CT GT G CAAAGGAAATTAAGGAG-3 ’ (SEQ ID NO:3)
BIP Primer: 5 ’ -Biotin-T ATT GGT GGAGCT AAACTT AAAGCCTTTTCT GT AC AA TCCCTTTGAGTG-3’(SEQ ID NO:4
Loop F Primer: 5 ’ -TT AC AAGCTT A AAGAAT GTCT GAAC ACT -3 ’ (SEQ ID NO:5)
Loop B Primer: 5 ’ -TT GAATTTAGGT GAAACATTT GTC ACG-3 ’ (SEQ ID NO:6)
B3 Primer: 5 ’ -CTT CTCT GGATTT AAC AC ACTT -3 ’ (SEQ ID NO:2)
FIP Primer: 5 ’ -Biotin-TC AGC AC AC A AAGCC AAAAATTT ATTTTT CT GT G CAAAGGAAATTAAGGAG-3 ’ (SEQ ID NO:3)
BIP Primer: 5 ’ -Biotin-T ATT GGT GGAGCT AAACTT AAAGCCTTTTCT GT AC AA TCCCTTTGAGTG-3’(SEQ ID NO:4
Loop F Primer: 5 ’ -TT AC AAGCTT A AAGAAT GTCT GAAC ACT -3 ’ (SEQ ID NO:5)
Loop B Primer: 5 ’ -TT GAATTTAGGT GAAACATTT GTC ACG-3 ’ (SEQ ID NO:6)
【0200】
ＣＯＶＩＤ?１９のＲＴ?ＬＡＭＰプライマー配列のこの実施形態では、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの両方が、それらの５末端に結合したビオチン分子を用いて設計された。
【0201】
他の配列および組み合わせで同じＯＲＦｌａｂ遺伝子を標的とする同じ６つのＬＡＭＰプライマーの設計を以下に示す：ＢＩＰ、ＦＩＰ、ループＢおよびループＦは、プライマーの５’末端でビオチン分子と結合している。
【0202】
以下は、すべてのテストされた実施形態を有するプライマーであり、陽性検体と陰性検体との間で測定可能かつ観察可能な差異を示す、４つの選択されたプライマー（ＦＩＰ、ＢＩＰ、ループＢおよびループＦ）のうちの１つまたは複数に少なくとも１つのビオチンを有する。４つすべてのプライマーにビオチンを有することは、あまり好ましくないが、この実施形態はまた、陽性サンプルと陰性サンプルとの間のコントラスト差を与える。４つの同定されたプライマーすべてにビオチンを付着させる必要はない。定性的な検出方法であり定量的な方法ではないので、３－ＤでＭＲＩを使用して陽性と陰性を検出する際には追加の利点はなく、より多くのプライマーにより多くのビオチン部位を付加することはコストの増大を招くので好ましくない。
【0203】
F3 Primer: 5 ’ -CGGT GGAC AAATT GTC AC-3 ’ (SEQ ID NO:l)
B3 Primer: 5 ’ -CTT CTCT GGATTT AAC AC ACTT -3 ’ (SEQ ID NO:2)
FIP Primer: 5’ -Biotin- T C AGC AC AC AAAGCC AAAAATTT ATTTTT CT GT GC AAAGGAA ATT AAGGAG-3 ’ (SEQ ID NO:3)
BIP Primer: 5 ’ -Biotin-T ATT GGT GGAGCT AAACTT AAAGCCTTTTCT GTAC AAT CCCTTT GAGT G-3 ’ (SEQ ID NO:4)
Loop F Primer: Biotin-5’ TT AC AAGCTTAAAGAATGTCTGAAC ACT-3’ (SEQ ID NO:5)
Loop B Primer: 5 ’ -Biotin-TT GAATTT AGGT GAAAC ATTT GT C ACG-3 ’ (SEQ ID NO:6)
B3 Primer: 5 ’ -CTT CTCT GGATTT AAC AC ACTT -3 ’ (SEQ ID NO:2)
FIP Primer: 5’ -Biotin- T C AGC AC AC AAAGCC AAAAATTT ATTTTT CT GT GC AAAGGAA ATT AAGGAG-3 ’ (SEQ ID NO:3)
BIP Primer: 5 ’ -Biotin-T ATT GGT GGAGCT AAACTT AAAGCCTTTTCT GTAC AAT CCCTTT GAGT G-3 ’ (SEQ ID NO:4)
Loop F Primer: Biotin-5’ TT AC AAGCTTAAAGAATGTCTGAAC ACT-3’ (SEQ ID NO:5)
Loop B Primer: 5 ’ -Biotin-TT GAATTT AGGT GAAAC ATTT GT C ACG-3 ’ (SEQ ID NO:6)
【0204】
ビオチン結合の４つのプライマーに由来する１６の実施形態は、アッセイで使用される６つのプライマーを含む全てのＬＡＭＰおよびＲＴ－ＬＡＭＰアッセイに適用可能である。
【0205】
好ましい実施形態では、ビオチンの組み合わせを有する上記のプライマーを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ（カタログ番号ＮＥＢ １７００シリーズおよび／またはＮＥＢ １８０４シリーズ）またはＯｐｔｉＧｅｎｅ ＲＴ－ＬＡＭＰ マスターミックス、または Ｌｕｃｉｇｅｎ ＲＴ－ＬＡＭＰ マスターミックスの市販のシングルチューブＲＴ－ＬＡＭＰマスターミックスに添加する。これはさまざまな濃度の上記の６種類のプライマーの最適化されたプライマーミックスと混合される（４から１６マイクロＭのＦＩＰおよびＢＩＰ、１から４マイクロＭのループＢおよびループＦプライマー、および０．５から２．０マイクロＭのＦ３およびＢ３プライマー）。このマスターミックスは、ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスおよび上記の他のＲＮＡウイルスのＲＴ－ＬＡＭＰ増幅を実行するために、熱処理、バッファー処理、およびホモジナイズされた唾液に追加される。増幅工程には、逆転写（ＲＴ）を実行するために使用される酵素およびその他の成分の添加が含まれる。増幅工程はまた、反応試薬および緩衝液中に存在する別の酵素を使用する核酸増幅を含む。６０から６７℃の温度でＬＡＭＰ反応を行う。ＮＥＢおよびＯｐｔｉＧｅｎｅマスターミックスの場合は６０から６５℃、Ｌｕｃｉｇｅｎ ＲＴ－ＬＡＭＰマスターミックスの場合は６７℃で実行されるＲＴ－ＬＡＭＰ反応が完了した。好ましいアッセイは、ステップＲＴおよびＬＡＭＰを実行するために同じ温度を使用し、それは同じ温度で実行される。一般に１０分から６０分の間続くことができる増幅工程の後、好ましい実施形態では、それは１５分から３０分に制限される。時間は、アプリケーションに定義されたパフォーマンス予測パラメータに応じて調整される。増幅が完了したら、ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイ試薬を８５℃に加熱して、増幅が完了した後に考えられる予定外の反応を防止するか停止するオプションの工程を行う。そして、８、９６、または３８４個のサンプルを含む増幅されたサンプルトレイがヒーターから取り出され、冷蔵温度で保存される。
【0206】
工程ａからｄは両方の実施形態（ＲＴ?ＰＣＲおよびＲＴ?ＬＡＭＰ）について妥当であるが、ＲＴ?ＬＡＭＰについて上述した工程は、ＭＲＩ検出ＲＴ?ＰＣＲアンプリコンを作製する際に同等であるが異なる要素または工程を有する。ＯＲＦｌａｂ遺伝子の遺伝子セグメントをターゲットとするＲＴ－ＰＣＲ プライマーは、両方のプライマーに結合したビオチンの１つの構成のみを以下に示す。
【0207】
ＭＲＩ検出アンプリコンを検出するために使用されるＲＴ－ＰＣＲパラメータは以下の通りである。Ｔ２が長い明るい画像は陽性サンプルを表し、Ｔ２が短い暗いスポットは陰性サンプルを表する。ＲＴ－ＰＣＲテスト用のＰＣＲプライマーは、ＩＤＴによって合成されたもので、以下に示されている。各ＰＣＲ反応混合物には、1XPrimeTime（登録商標） Gene Expression Master Mix（ＩＤＴ、米国から購入）、０．２５マイクロＭ濃度のＰＣＲプライマー、および１０ｆｇの合成ＣＯＶＩＤ－１９ターゲット（ＩＤＴ、米国製）が含まれていた。ＰＣＲは、Applied Biosystems Veriti 9902 4375786 PCR ９６ウェル サーマルサイクラーを使用して、温度プロフィール９５℃で３分間、続いて５０サイクル（９５℃で１５秒間、６０℃で１分間）の増幅を行った。
【0208】
ＰＣＲプライマーの参考文献：
Mohamed El-Tholotha, b, Haim H. Baua, and Jinzhao Songa,, A Single and Two-Stage, Closed-Tube, Molecular Test for the 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) at Home, Clinic, and Points of Entry”, Pre-Print published at doi: 10.26434/chemrxiv.11860137. vl
Mohamed El-Tholotha, b, Haim H. Baua, and Jinzhao Songa,, A Single and Two-Stage, Closed-Tube, Molecular Test for the 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) at Home, Clinic, and Points of Entry”, Pre-Print published at doi: 10.26434/chemrxiv.11860137. vl
【0209】
フォワードプライマー: 5’ -Biotin- CCCTGTGGGTTTTACACTTAA- 3 ’ (SEQ ID NO:7)
リバースプライマー: 5’ -Biotin- ACGATTGTGCATCAGCTGA- 3 ’ (SEQ ID NO:8)
リバースプライマー: 5’ -Biotin- ACGATTGTGCATCAGCTGA- 3 ’ (SEQ ID NO:8)
【0210】
アッセイを検証するために使用した合成遺伝子セグメントを以下に示すが、これは米国ＩＤＴの助けを借りて作成されたものである。
【0211】
5 ’ -CTGCT AAAGCTT AC AAAGATT ATCTAGCT AGTGGGGGAC AACC AATC ACTAATTGTGTTA AGAT GTT GT GT AC AC AC ACT GGT ACT GGT C AGGC AAT A AC AGTT AC ACCGGAAGCC AAT AT GGAT C AAGAATCCTTT GGT GGT GC ATCGT GTT GT CT GT ACT GCCGTT GCC AC AT AGAT C ATCC AAAT CCT AAAGGATTTT GT GACTT AAAAGGT AAGT AT GT AC AA AT ACCT AC AACTT GT GCT AAT GACCCT GT GGGTTTT AC ACTT AAAAAC AC AGTCT GT ACCGTCT GCGGT AT GT GGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGC AC AGGC ACT AGT ACT GAT GTCGT AT AC AGGGCTTTT GAC ATCT AC AAT GATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGAC AATTT AATT GATT CTT ACTTT GT AGTT AAGAGAC AC ACTTT CT CT AACT ACC AAC AT GAAGA AACAATTTATAATTTACTT- 3’ (SEQ ID NO:9)
【0212】
ＭＲＩ感受性プローブと混合された増幅産物は、最大のシグナルを得るように作製され、ＬＡＭＰプロセス中に作製された産物に特異的である。
【0213】
５０から１５０ナノメートルのサイズのＭＲＩ感受性ストレプトアビジン結合Ｓｕｐｅｒ Ｍａｇナノ粒子を、使用するＭＲＩ装置の磁場に応じてこの試験で使用する。５０ｎｍの小さなナノビーズは高磁場ＭＲＩで使用され、１００ｎｍの大きなナノビーズは低磁場ＭＲＩシステム（最大３００ミリテスラ）で使用される。
【0214】
混合生成物は、ＭＲＩシステム内の不均一な磁場または均一な磁場、またはその両方の下で、好ましいプロセスを受ける。これは他の用途でビーズを分離する際に使用される磁気分離装置の好ましい実施形態で実施される。不均一磁気の存在下で９６ウェルおよび３８４ウェル形式で組み立てられた多数の磁石のアレイは、ＭＲＩを使用する本発明の検出方法のために最適化される。このプロセスは、結合反応がより速く起こるように促進し、このプロセスは、磁気的に核酸シグナルを増強することによってシグナルを劇的に増加させる。より正確には、このプロセスは、コントラスト、またはシグナルの強度、または陰性と陽性の間のシグナルの差を増加させる。
【0215】
Ｈｙｐｅｒｆｉｎｅ ＭＲＩシステムおよびＥａｓｏｔｅ Ｏ－ｓｃａｎを使用して、９６ウェルプレートでＭＲＩ画像をイメージングした。Ｈｙｐｅｒｆｉｎｅ ＭＲＩシステムは、処理されたサンプルのＴ２値も測定できる。Ｈｙｐｅｒｆｉｎｅ ＭＲＩシステムを使用してＴ２値を測定し、６０ＭＨｚ Ｎａｎａｌｙｓｉｓ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ を使用して行われたベンチトップＮＭＲ測定値と比較した。ワシントン大学ＮＭＲ施設（ＢｒｕｋｅｒとＶａｒｉａｎ製）で利用可能なさまざまなＮＭＲシステムで測定されたＴ２値で、陽性サンプルと陰性サンプル間のさまざまなＮＭＲでのＴ２値の違いを確認した。ＮＭＲ測定値とＭＲＩ画像および測定値は、Ｔ２値が次の範囲にあることを示した。
【0216】
ＲＴ?ＦＡＭＰおよびＲＴ?ＰＣＲアンプリコンの両方について、Ｔ２値は１００ミリ秒から１８００ミリ秒の間で測定された。３００ミリ秒未満のＴ２値は「暗いスポット」を示し、５００ミリ秒を超えるＴ２値は「明るいスポット」を示す。コントラストは、３００ミリ秒から５００ミリ秒の間の値で変化する。既知のウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ（陽性）とウイルスまたはＲＮＡを含まない（陰性）、陽性および陰性の対照サンプルの明るさは、ＭＲＩで、データ処理の助けをするソフトウエアを使用して未知のサンプルの陽性と陰性を決定するためのリファレンスとして使用される。画像処理ソフトウェアは、ＭＲＩデータについての決定を行うために使用される。これはサンプルから収集されたＭＲＩ画像の自動処理を可能にするＭＡＴＦＡＢおよびＦｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）を使用して開発された
【0217】
この実施例は、同じアンプリコンを同定するためにＮＭＲがどのように使用できるかを示し、使用されるナノ粒子はＮＭＲとＭＲＩの両方で同じである。本発明は、利用可能なサンプルの数が少ない状況でＮＭＲを使用して実施することができる。
【0218】
ＮＭＲは、製造業者（Ｎａｎａｌｙｓｉｓ）によって提供されたカスタムパルスシーケンスを使用して測定が行われる場合、Ｔ２の値を与える。これらのパルスシーケンスは、マシンごとに異なる名前が付けられており、ＮａｎａｌｙｓｉｓではＯｎｅを使用した。Ｔ２を決定するために使用した方法はＣＰＭＧ（Ｃａｒｒ－Ｐｕｒｃｅｌｌ－Ｍｅｉｂｏｏｍ－Ｇｉｌｌ）の実験である。なぜなら、このシーケンスではシステムに不均一性が存在する場合に場の不均一性の効果にフォーカスすることができるからである。
【0219】
Ｔ２値は、ＲＴ－ＬＡＭＰおよびＲＴ－ＰＣＲ増幅時間およびサンプル中のウイルス負荷に応じて、定性的情報を与えるだけでなく、定量的情報もある程度与える。本発明はまた、１０分から９０分の間の短い増幅時間でＲＴ－ＰＣＲおよびＲＴ－ＬＡＭＰ産物を定量して、様々な量のウイルス負荷またはＤＮＡを定量するためにも使用される。
【0220】
ＭＲＩ画像は、すべての処理されたサンプルのアレイを使用する臨床ＭＲＩ装置を使用して収集され、それらを視覚的に見るか、および／または、３ＤからのＭＲＩデータを読み取り、転送し、処理して３Ｄから線形データを示すソフトウェアプログラムを使用し、陽性か陰性かを非常に高速に示す。ＭＲＩ画像は、Ｆｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）およびＭａｔｌａｂプログラムなどのこの目的のために開発された利用可能な画像処理ソフトウェアツールを使用して処理され、反応管からの信号を測定するために利用可能なすべてのＭＲＩマシンで使用できるソフトウェアを使用して、テストの結果を自動的に示す。
【0221】
【0222】
図面の説明：
明細書に組み込まれ、明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の実施形態を示し、説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
明細書に組み込まれ、明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の実施形態を示し、説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【0223】
図１：本発明の一実施形態において、陽性サンプルおよび陰性サンプルについてＬＡＭＰ反応から得られた代表的なＭＲＩ画像が示されている。本発明では、ビオチン官能基がプライマーの５’末端に付加されるが、ＬＡＭＰプライマーのリストおよび上記で特定されたそれらのそれぞれの位置を必要とする。暗い画像が陽性を表し、明るい画像が陰性アッセイを表す。この実施形態はまた、エンドツーエンドアッセイプロセス中に生成物に結合したナノプローブのサイズにも関連する。より暗い陽性および明るい陰性は、１００ｎｍサイズ未満の特定のサイズのプライマーによって達成される（例：１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、１００ｎｍおよびその間の値）。同じことを他のサイズに拡張することもできるが、上記のサイズ間で最高のコントラストが得られ、理想的には５０ｎｍ近傍である
【0224】
より暗いまたは黒い陽性およびより明るいまたはより輝度の高い陰性を示す図１は、視覚的に示されるだけでなく、ソフトウェアを使用して測定および処理される。これらの強度は変化し、異なるＭＲＩパルスシーケンス、パルスパラメーターを使用して陽性と陰性の差を強調することができる。これらのパラメーターは、Ｔ１やＴ２などの測定値または既知の緩和パラメーター、およびそれらに関連する他の緩和パラメーターに基づいて調整される。ＭＲＩパルスシーケンスと磁場パルス勾配は、暗いスポットと明るいスポットの相対的な明るさまたは強度とサイズを調整する上で重要な役割を果たす。したがって、ＭＲＩ画像のコントラストは、ＭＲＩ静磁場、パルス磁場、および磁場勾配の存在下で、これらの磁気共鳴緩和パラメーターによって決定される。
【0225】
図２：陽性サンプルおよび陰性サンプルのＬＡＭＰ反応から得られた代表的なＭＲＩ画像が、本発明の別の第２の実施形態に示されている。この発明にはプライマーの５’末端に付加されたビオチン官能基と、ＬＡＭＰプライマーのリストおよび上記で特定されたそれらのそれぞれの位置が必要である。暗い画像がネガを表し、明るいイメージャーが陽性アッセイを表す画像である。この実施形態はまた、エンドツーエンドアッセイプロセス中に生成物に結合するナノプローブの大きなサイズにも関連している。より明るい陽性とより暗い陰性は、５０から４００の間の特定のサイズのプライマー、理想的には約１００ｎｍのサイズ（例：５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍおよびその間の値）で達成される。同じことを他のサイズに拡張することもできるが、最適なコントラストは上記のサイズ間で、理想的には５０から１５０ｎｍの範囲で達成された。
【0226】
明るい陽性およびより暗い陰性を示す図２はまた、陰性と陽性との間の結合プロセスを変更または切り替えることができる特定の試薬を使用してアッセイを処理されるが、明るい陽性をもたらす結合を増強するために使用されるさらなる試薬を必要とする。これらの特別な試薬は、プライマーに結合したビオチンと磁気ビーズに結合したストレプトアビジン、および磁場の存在下でのそれらの相対的な相互作用と結合に作用する。陽性と陰性の間の「ナノスイッチング」は、３つの要素がシステムとして連携して異なる関係時間を与え、最終的に陽性に異なる明るさ／コントラストを与えるために発生している。図１に記載の実施形態と図２に記載の実施形態との間のこの切り替えの理由は、作用する複数の力およびそれらの相対的強度、ナノビーズのサイズ、プライマー、ＬＡＭＰ産物に起因する。これは、ｐＨ値、粘度、侵入性、および上記のパラメーターと特性の間の相互作用を持つバッファーと試薬の存在によってさらに変更される。第２の実施形態は、多次元の実験アプローチにおける体系的な方法での上記パラメータの最適化により成功した。ＬＡＭＰおよびサンプル処理バッファの使用もこれらのプロセスを妨害し、この実施形態で最適化、検証、およびファイナライズされたすべてのものであり、結果の一貫性がこの複雑なパラメータ空間の下で実証された。
【0227】
本発明の例示的な実施形態によれば、図１１は、図１および図２は、円形ディスクによって表される１つの黒または白のスポットによって同定される個々のサンプルから処理された各アッセイを表す、ＭＲＩ装置を使用して収集された３次元画像を示す。ＭＲＩ検出のこの好ましい実施形態によると、目標は、ウイルスおよび細菌について数百または数千ものアッセイを同時にスクリーニングできるハイスループット検出モダリティを開発することである。このようなモダリティは、大規模な人口スクリーニング、パンデミック発生中の迅速な診断、およびそのような発生中の病気の広がりのリアルタイム追跡などの用途に使用できる。高スループット検出は、一般的に診断時間の短縮にも役立つ。特定の標的病原体の存在を決定するためのアッセイにおいて、磁気共鳴緩和時間Ｔ２の変化を測定する新規な技術に本発明は基づいている。ここでは、病院で利用可能な市販の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）システムを使用して、Ｃｏｖｉｄ－１９ コロナウイルスなどの標的ウイルスを持っているものとそうでないものを区別するＴ２強調画像を使用して複数のアッセイを同時に読み取ることが提案されている。このＭＲＩベースの方法は、病院やＭＲＩセンターの固定システム、モバイルトレーラーに取り付けられたシステム、および患者の幅広いアクセスを可能にする小型で安価なポータブルシステムなど、既存のＭＲＩスキャナーの設置ベースを活用できる。
【0228】
本発明の好ましい実施形態は、平均的なＭＲＩシステムが、装填および取り出し時間を含めて、５から１５分ごとに最大４０００のアッセイを検出することを可能にする。検出可能なアッセイへのサンプル数の前処理では、同時に処理できるサンプル数に制限はない。ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰアッセイは２０から３０分で処理できる（サンプルの溶解や磁気処理などの前処理および後処理工程を除く）。サンプルごとに計算した場合にＭＲＩ検出にかかる時間は比較的短く、ほとんどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイよりも高速である。
【0229】
本発明の好ましい実施形態によれば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、磁場勾配とＲＦパルスとの適切な組み合わせを使用してサンプルから空間的に分解された信号で画像を取得することを含む。２次元イメージングでは、たとえばＺ方向に磁気勾配を適用して、測定用のＸＹ平面内のサンプルのスライスを選択する。
【0230】
本発明の好ましい実施形態によれば、図３は、ＭＲＩ検出ＲＴ－ＬＡＭＰ増幅アッセイの主な工程を示している。
【0231】
本発明の例示的な実施形態によれば、以下に示す説明および図は、ＭＲＩ検出ＲＴ－ＬＡＭＰ増幅アッセイの主要な工程を示す。これらの手順は、光学的に検出されるＲＴ－ＬＡＭＰに似ており、病原体の検出に適用される。ＭＲＩ検出アッセイは光学的に検出されるＲＴ－ＬＡＭＰアッセイと似ているが、ナノ粒子がＭＲＩに敏感なプローブとして使用されているため、大きく異なる。ＭＲＩ感受性ナノ粒子とプライマーとの結合の化学、およびアッセイ産物は大きく異なる。手順は、ターゲット病原体のＭＲＩ検出の前の、合成されたＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列で予想される変更を示す代表的な図で説明されている。
【0232】
ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰ反応の後、表面を有する磁性ナノ粒子またはスーパー磁性ナノ粒子をストレプトアビジンで修飾して、反応媒体中に存在するビオチン分子に結合させる。結合は、特に２つのプライマーＦＩＰ および／またはＢＩＰがビオチン化されている（ビオチンが５’末端に結合している）場合に、ＬＡＭＰプライマーに対して強力である。ビオチンをプライマーに付加できる部位としてのさまざまな配列が上に列挙されており、すべての組み合わせが検証され、結果は図１および図２に示されている本発明のアプローチを示している。
【0233】
図３は、図１のＭＲＩ画像をもたらす実施形態の１つである、ナノビーズ間に強い会合を形成するＬＡＭＰ反応の後に、磁性ナノ粒子が未使用のプライマーにどのように結合するかを示す。ＬＡＭＰ産物の非存在下でのこれらのナノビーズは、勾配磁場または強い磁場の存在下でビオチン－ストレプトアビジン結合誘導凝集により大きなクラスターを形成することによりＭＲＩ検出を可能にし、長いＴ１および／またはＴ２をもたらし、明るいＭＲＩ画像を提供する。
【0234】
図３は、ビオチン分子が付着した隠れた／使用されたプライマーを有するＬＡＭＰアンプリコンのセグメント間で、ナノビーズハイブリダイゼーションがどのように起こるかを示し、アンプリコンによるナノビーズ表面での立体障害によってナノビーズハイブリダイゼーションは少し、それらの間の反発をもたらす。したがって、ナノビーズは反応媒体中に均一に分布および分散したままであり、短いＴ１および／またはＴ２が暗い画像を与える。最終工程では、ＬＡＭＰ産物を磁気ナノビーズ溶液と混合し、ストリング勾配磁場の存在下で約５から１０分間インキュベートして、ナノビーズと「未使用」または残りのＬＡＭＰプライマーとの迅速な結合を可能にする。
【0235】
図３は、図１のＭＲＩ画像をもたらす実施形態の１つである、ナノビーズ間に強い会合を形成するＬＡＭＰ反応の後に、磁性ナノ粒子が未使用のプライマーにどのように結合するかを示す。ＬＡＭＰ産物の非存在下でのこれらのナノビーズは、勾配磁場または強い磁場の存在下でビオチン－ストレプトアビジン結合誘導凝集により大きなクラスターを形成することによりＭＲＩ検出を可能にし、長いＴ１および／またはＴ２をもたらし、明るいＭＲＩ画像を提供する。
【0236】
図３は、ビオチン分子が結合した隠れた／使用されたプライマーを有するＬＡＭＰアンプリコンのセグメント間で、ナノビーズハイブリダイゼーションがどのように起こるかを示し、アンプリコンによるナノビーズ表面での立体障害によって減少し、それらの間の反発をもたらす。したがって、ナノビーズは反応媒体中に均一に分布および分散したままであり、短いＴ１および／またはＴ２が暗い画像を与える。最終工程では、ＬＡＭＰ産物を磁気ナノビーズ溶液と混合し、ストリング勾配磁場の存在下で約５から１０分間インキュベートして、ナノビーズと「未使用」または残りのＬＡＭＰプライマーとの迅速な結合を可能にする。
【0237】
インフルエンザＡ型およびＢ型は、エンドポイントＲＴ?ＬＡＭＰアッセイで検証されている。ＭＲＩに基づくＣＯＶＩＤ?１９、ＣＯＶＩＤ?１９の様々な株のＬＡＭＰおよびＲＴ?ＬＡＭＰ検出は、ＭＲＩコイル内にＲＴ?ＬＡＭＰをスタッキングし、自動化されたソフトウェアを使用してＭＲＩ画像を処理することによって、数分で多数のアッセイを可能にする。ＣＯＶＩＤおよびインフルエンザウイルスについて、反応あたり２０から１００のＲＮＡコピーの分析感度と、それぞれ９８．３％および１００％の診断感度と特異性がこのアプローチによって達成された。
【0238】
ＭＲＩ検出ＰＣＲおよびＲＴ?ＰＣＲ検出もまた、ＣＯＶＩＤ?１９について検証され、図４に示されている
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】