特表 2023-529612 敗血症の治療のためのクロマノール、キノン又はヒドロキノン化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-11

(54)【発明の名称】敗血症の治療のためのクロマノール、キノン又はヒドロキノン化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 311/72 20060101AFI20230704BHJP

   A61K 31/353 20060101ALI20230704BHJP

   C07D 405/12 20060101ALI20230704BHJP

   C07D 295/185 20060101ALI20230704BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230704BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230704BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230704BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230704BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230704BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230704BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230704BHJP

   A61K 31/453 20060101ALI20230704BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20230704BHJP

【ＦＩ】

C07D311/72 101

A61K31/353

C07D405/12 CSP

C07D295/185

A61P31/04

A61P11/00

A61P9/00

A61P1/16

A61P13/12

A61P25/00

A61P1/00

A61K31/453

A61K31/496

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022574167

(86)(22)【出願日】2021-06-02

(85)【翻訳文提出日】2023-01-17

(86)【国際出願番号】 NL2021050351

(87)【国際公開番号】W WO2021246868

(87)【国際公開日】2021-12-09

(31)【優先権主張番号】2025730

(32)【優先日】2020-06-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515169186

【氏名又は名称】スルファテック・ベスローテン・フェンノートシャップ

【氏名又は名称原語表記】Ｓｕｌｆａｔｅｑ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ボウマ，ヤルマル・ローランド

(72)【発明者】

【氏名】クレニング，グイド

(72)【発明者】

【氏名】ヘニング，ロベルト・ヘンク

(72)【発明者】

【氏名】ファン・デル・フラーフ，アドリアヌス・コルネリス

【テーマコード（参考）】

4C063

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C063AA01

4C063BB09

4C063CC79

4C063DD10

4C063EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BA08

4C086BC21

4C086BC50

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA12

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA16

4C086MA34

4C086MA52

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA36

4C086ZA59

4C086ZA66

4C086ZA75

4C086ZA81

4C086ZB35

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、敗血症、及び敗血症によって誘発される臓器機能不全の治療のための特定のクロマノール、キノン、又はヒドロキノン化合物、及びそれらの誘導体に関する。具体的には、本発明は、Ｓ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン、及びＳ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノンから選択されるクロマノール化合物、及びその薬学的に許容される塩に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

敗血症の治療又は予防に使用するための、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）による化合物、式（ＩＩ）によるヒドロキノン類似体、又はその薬学的に許容される塩であって、

【化1】

【化2】

－式中、Ｒ１が、水素、又は生体組織において除去され得るプロドラッグ部分を表し、
－ｉ．Ｒ２及びＲ３が、それらが結合しているＮ原子と一緒に、１～４個のＮ、Ｏ、若しくはＳ原子を有する、飽和若しくは不飽和の非芳香族の、任意に置換された５～８員環を形成し、Ｒ２及びＲ３が、一緒に３～１２個の炭素原子を含むか、
ｉｉ．又はＲ２が、水素原子、若しくは１～６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３が、窒素若しくは酸素で任意に置換されたアルキル基であり、前記アルキル基が、３～１２個の炭素原子を含み、Ｒ３における前記アルキル基が、環中に窒素若しくは酸素原子を含み得、直鎖状及び／若しくは分岐状の置換基、並びに１つ以上のエチレン性不飽和を含み得る１つ以上の非芳香族環状構造を含むか、
ｉｉｉ．又はＲ２が、水素原子、若しくは１～６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３が、窒素若しくは酸素で任意に置換されたアリール基若しくはアリールアルキル基であり、Ｒ３が６～１４個の炭素原子を含み、Ｒ３が、環中に窒素若しくは酸素原子を含み得、直鎖状及び／若しくは分岐状の置換基、並びに１つ以上のエチレン性不飽和を含み得る１つ以上の芳香族及び／若しくは非芳香族環状構造を含み、前記式（Ｉ）若しくは式（ＩＩ）による化合物が遊離塩基として４００Ｄａ未満の分子量を有する、化合物、ヒドロキノン類似体、又はその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

Ｒ１が水素であるか、又は６－酸素と一緒に２～６個の炭素原子を有するエステル基を形成する、請求項１に記載の使用のための化合物。

【請求項3】

前記窒素が、アミン、四級アミン、グアニジン、若しくはイミンであり得、酸素が、ヒドロキシル、カルボニル若しくはカルボン酸であり、かつ／又は酸素及び窒素が一緒になって、アミド、尿素、若しくはカルバメート基を形成する、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。

【請求項4】

式（Ｉ）によるか、又は式（ＩＩ）によるいずれかの化合物において、Ｒ２及びＲ３が、それらが結合している前記Ｎ原子と一緒に、追加のＮ原子を組み入れる飽和環を形成し、この環が、非置換であるか、又はアルコール、若しくは１～４個の炭素原子を有するアルカノール基で置換されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項5】

前記化合物が、式Ｉによる化合物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項6】

Ｒ２及びＲ３が、それらが結合している前記Ｎ原子と一緒に、１つの追加のアミン基を含む５～７員環を形成し、この環が、任意にメチル、エチル、又はアルコール置換メチル若しくはエチルで置換されている、請求項５に記載の使用のための化合物。

【請求項7】

Ｒ２が、水素原子であり、Ｒ３が、４～７個の炭素原子を有し、１個の窒素原子を有する飽和環状構造を含み、この環が、アルキル基、アルコール基、又は酸素、カルボン酸若しくはアミン基を含み得る１～４個の炭素原子を有する基で置換され得る、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項8】

前記化合物が、式ＩＩによる化合物であり、式中、Ｒ２が、水素原子であり、Ｒ３が、４～６個の炭素原子を有し、１個の窒素原子を有する環状構造を含み、この環が、任意にメチル、エチル、又はアルコール置換メチル若しくはエチルで置換されている、請求項７に記載の使用のための化合物。

【請求項9】

前記化合物が、ラセミ混合物として、又はそのエナンチオマーのうちの１つとして、（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１２１）、（（Ｓ）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－Ｎ－（（Ｒ）－ピペリジン－３－イル）クロマン－２－カルボキサミド塩酸塩（ＳＵＬ－１３）、又は（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１０９）、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の使用のための化合物。

【請求項10】

前記化合物が、ＳＵＬ－１０９のＳ－エナンチオマー：Ｓ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１３８）、又はその薬学的に許容される塩である、請求項９に記載の使用のための化合物。

【請求項11】

前記化合物が、ＳＵＬ－１２１のＳ－エナンチオマー：Ｓ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１５１）、又はその薬学的に許容される塩である、請求項９に記載の使用のための化合物。

【請求項12】

選択肢（ｉ）及び（ｉｉ）に定義される、前記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）による化合物が、５００Ｄａ未満、好ましくは４５０Ｄａ未満、最も好ましくは４００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項13】

前記使用が、感染に対する宿主の反応の調節不全によって引き起こされる臓器機能不全の治療又は予防のためである、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【請求項14】

前記臓器が、肺、心臓及び血管、肝臓、腎臓、脳、又は腸のうちの１つ以上であり、好ましくは腎臓である、請求項１３に記載の使用のための化合物。

【請求項15】

前記治療又は予防が、敗血症を治療するための１つ以上の一般的な手段との併用療法で行われる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

Ｉ．
本発明は、敗血症の治療又は予防のためのクロマノール化合物及びその誘導体に関する。本発明は更に、敗血症によって誘発される臓器機能不全の治療又は予防のためのクロマノール化合物及びその誘導体に関する。

【背景技術】

【0002】

ＩＩ．
敗血症は、感染に対する有害な全身性炎症反応である。これは、世界中の罹患率と死亡率の主な原因である（Ｒｕｄｄ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０２０；３９５：２００－２１１）。敗血症は現在、感染に対する宿主の反応の調節不全によって引き起こされる、生命を脅かす臓器機能不全と定義されている。最も重篤な形態の敗血症は、多臓器機能不全を引き起こし、重度の免疫機能障害と異化作用を特徴とする重大な病気の状態を引き起こす可能性がある（Ｇｏｔｔｓ＆Ｍａｔｔｈｅｙ，ＢＭＪ ２０１６；３５３：ｉｌ５８５）。

【0003】

抗生物質に重点を置き、感染源を根絶し、血圧、臓器の血流、及び換気をサポートする敗血症の現在の治療法は、敗血症に関連する死亡率を減らす限られた効果しか示していない。現在の治療戦略を改善するための努力にもかかわらず、先進国における敗血症の院内死亡率は依然として約２０％のままである（Ｓｅｙｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１７；３７６：２２３５－２２４４；Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ－Ｓｔｒｕｚｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１８ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００１３４－０１８－５３７７－４）。

【0004】

敗血症反応は通常、微生物感染で始まる。リポ多糖類（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡなどの微生物成分がトール様受容体（ＴＬＲ）によって認識されると、自然免疫応答が急速に活性化され、グルココルチコイド、カテコールアミン、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、ＩＬ－６などの近位炎症性サイトカインを含む様々な体液性メディエーターが放出される。この炎症誘発性状態は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）であると定義されている。

【0005】

炎症性サイトカインの過剰な産生と、一酸化窒素、血小板活性化因子、プロスタグランジンなどのより遠位のメディエーターの誘発は、内皮の変化と凝固促進状態の誘発に関与しており、低血圧、不十分な臓器灌流、及び多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）に伴う壊死性細胞死を引き起こす。

【0006】

多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）は、敗血症の最も致命的な合併症の１つとして特定されている。全身性炎症反応の様々な段階を標的とする多くの薬剤が長年にわたって開発されてきたが、これらのほとんどは臨床試験でほとんど又はまったく効果を示していない。

【0007】

ＷＯ２０１９／１７２７６６Ａ１は、例えば敗血症によって引き起こされる急性腎障害の症状の予防、治療、治癒、又は改善のためのアルカリホスファターゼの使用を記載している。

【0008】

ＷＯ２０１７／２２０８１０Ａ１は、シラスタチンがβ－ラクタム系抗生物質ではない別の薬物と組み合わせて投与されるという条件付きで、哺乳動物対象における敗血症の治療又は予防におけるシラスタチンの使用を記載している。

【0009】

ＵＳ６２３１８９４は、一酸化窒素合成酵素が組織損傷を引き起こす活性酸素産生に寄与する障害の治療のための多くの異なる化合物の使用を記載している。これらの化合物のほとんどはアルギニン誘導体である。提案された化合物の１つはＢＮ８０９３３であり、これは一酸化窒素合成酵素とＮＯ供給化合物の電子伝達反応をブロックする一酸化窒素合成酵素阻害剤であると説明されている。化合物ＢＮ８０９３３の構造は次のとおりである。

【化1】

【0010】

敗血症はＵＳ６２３１８９４で言及されているが、以下の実験セクション（実施例５）に示されるように、化合物はミトコンドリアレベルではほとんど効果がないように見える。

【0011】

敗血症の治療のための新しい化合物が依然として必要とされている。

【0012】

本発明の目的は、敗血症の治療又は予防のための化合物を提供すること、特に、腎機能障害などの感染に対する宿主の反応の調節不全によって引き起こされる臓器機能不全の治療又は予防のための化合物を提供することである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】国際公開第２０１９／１７２７６６号

【特許文献2】国際公開第２０１７／２２０８１０号

【特許文献3】米国特許第６２３１８９４号明細書

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ｒｕｄｄ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０２０；３９５：２００－２１１

【非特許文献2】Ｇｏｔｔｓ＆Ｍａｔｔｈｅｙ，ＢＭＪ ２０１６；３５３：ｉｌ５８５

【非特許文献3】Ｓｅｙｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１７；３７６：２２３５－２２４４

【非特許文献4】Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ－Ｓｔｒｕｚｅｋ ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１８ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００１３４－０１８－５３７７－４

【発明の概要】

【0015】

ＩＩＩ．
上記の目的は、特定のクロマノール、キノン又はヒドロキノン化合物を提供することによって満たされる。

【0016】

上記の目的は、敗血症の治療又は予防に使用するための、式（Ｉ）、（ＩＩ）による化合物、式（ＩＩ）のヒドロキノン類似体、又はその薬学的に許容される塩を提供することにより、本発明によって達成される。

【化2】

－式中、Ｒ１が、水素、又は生体組織において除去され得るプロドラッグ部分を表し、
－ｉ．Ｒ２及びＲ３が、それらが結合しているＮ原子と一緒に、１～４個のＮ、Ｏ、若しくはＳ原子を有する、飽和若しくは不飽和の非芳香族の、任意に置換された５～８員環を形成し、Ｒ２及びＲ３が、一緒に３～１２個の炭素原子を含むか、
ｉｉ．又はＲ２が、水素原子、若しくは１～６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３が、窒素若しくは酸素で任意に置換されたアルキル基であり、前記アルキル基が、３～１２個の炭素原子を含み、Ｒ３における前記アルキル基が、環中に窒素若しくは酸素原子を含み得、直鎖状及び／若しくは分岐状の置換基、並びに１つ以上のエチレン性不飽和を含み得る１つ以上の非芳香族環状構造を含むか、
ｉｉｉ．又はＲ２は水素原子、若しくは１～６個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３は窒素若しくは酸素で任意に置換されたアリール基若しくはアリールアルキル基であり、Ｒ３は６～１４個の炭素原子を含み、Ｒ３は環中に窒素若しくは酸素原子を含み得、直鎖状及び／若しくは分岐状の置換基、並びに１つ以上のエチレン性不飽和を含み得る１つ以上の芳香族及び／若しくは非芳香族環状構造を含み、式（Ｉ）若しくは式（ＩＩ）による化合物が遊離塩基として４００Ｄａ未満の分子量を有する。

【0017】

本発明の場合、式（ＩＩ）による化合物は、水素化キノン（すなわち、ヒドロキノン）類似体を含むが、安定性の観点からキノン誘導体が好ましい。

【0018】

好ましい実施形態では、窒素は、アミン、四級アミン、グアニジン若しくはイミンであり得、酸素は、ヒドロキシル、カルボニル若しくはカルボン酸であり、かつ／又は酸素及び窒素が一緒になって、アミド、尿素、若しくはカルバメート基を形成し得る。

【0019】

好ましい実施形態では、式（Ｉ）のＲ１は水素であるか、又は６－酸素と一緒に２～６個の炭素原子を有するエステル基を形成する。

【0020】

式（Ｉ）によるか、又は式（ＩＩ）によるいずれかの化合物の好ましい実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合しているＮ原子と一緒に、追加のＮ原子を組み入れる飽和環を形成し、この環は、非置換であるか、又はアルコール、若しくはエチロール（ｅｔｈｙｌｏｌ）などの１～４個の炭素原子を有するアルカノール基で置換されている。

【0021】

別の好ましい実施形態では、Ｒ２が、水素原子であり、Ｒ３が、４～７個の炭素原子を有し、１個の窒素原子を有する飽和環状構造を含み、この環が、アルキル基、アルコール基、又は酸素、カルボン酸、若しくはアミン基を含み得る１～４個の炭素原子を有する基で置換され得る。

【0022】

別の好ましい実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）による化合物であり、Ｒ２は、水素原子であり、Ｒ３は、４～６個の炭素原子を有し、１個の窒素原子を有する環状構造を含み、この環は、非置換であるか、又はアルコール、若しくはエチロールなどの１～４個の炭素原子を有するアルカノール基で置換され、好ましくは任意にメチル、エチル、又はアルコール置換メチル若しくはエチルで置換される。

【0023】

別の好ましい実施形態では、化合物は、式（Ｉ）による化合物であり、Ｒ２は、水素原子であり、Ｒ３は、４～７個の炭素原子を有し、１個の窒素原子を有する飽和環状構造を含み、この環は、非置換であるか、又はアルコール、若しくはエチロールなどの１～４個の炭素原子を有するアルカノール基で置換され、好ましくは任意にメチル、エチル、又はアルコール置換メチル若しくはエチルで置換される。

【0024】

別の好ましい実施形態では、Ｒ３は、窒素又は酸素で任意に置換されたアリール基又はアリールアルキル基であり、Ｒ３は、６～１０個の炭素原子を含み、Ｒ３は、環中に１個以上の窒素原子を含み得、１個又は２個の窒素及び／又は酸素原子で任意に置換された直鎖状及び／又は分岐状の脂肪族基を含み得る１つの芳香環構造を含む。

【0025】

より好ましくは、Ｒ２及びＲ３は芳香環を含まない。

【0026】

更に別の好ましい実施形態によれば、化合物は、ラセミ混合物として、又はそのエナンチオマーのうちの１つとして、（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１２１）、（（Ｓ）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－Ｎ－（（Ｒ）－ピペリジン－３－イル）クロマン－２－カルボキサミド塩酸塩（ＳＵＬ－１３）、又は（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１０９）、又はその薬学的に許容される塩である。

【0027】

最も好ましい実施形態では、化合物は、ＳＵＬ－１０９のＳ－エナンチオマー、すなわち、Ｓ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１３８）、又はＳＵＬ－１２１のＳ－エナンチオマー、すなわちＳ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１５１）、又はその薬学的に許容される塩である。

【0028】

本発明による好ましい実施形態では、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）によるいずれかの化合物は、（遊離塩基として）５００Ｄａ未満、より好ましくは４５０Ｄａ未満、更に最も好ましくは４００Ｄａ未満の分子量を有する。

【0029】

本発明による好ましい実施形態では、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）によるいずれかの化合物は、臓器系における敗血症の治療又は予防に使用するためのものであり、臓器は、肺、心臓及び血管、肝臓、腎臓、脳、又は腸である。

【0030】

本発明によるより好ましい実施形態では、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）によるいずれかの化合物は、感染に対する宿主の反応の調節不全によって引き起こされる臓器機能不全、特に、敗血症によって引き起こされる腎臓の臓器機能不全の治療又は予防に使用するためのものである。

【0031】

急性腎障害は敗血症によって最も頻繁に引き起こされるため、腎臓は敗血症の重要な臓器であると思われる。同様に、急性腎障害の発生は、他の臓器の機能不全、及び３倍高い院内死亡率と強く関連している。更に、急性腎障害は、末期腎疾患を発症するリスクの増加に関連して、敗血症後に慢性腎疾患を発症するリスクを９倍増加させる。したがって、急性肝障害の重症度を予防又は軽減することは、敗血症の治療における主な目標の１つであるが、これを達成するのは非常に困難であることが示される。

【0032】

敗血症の予防又は治療における本発明による使用のための化合物は、一般に、抗生物質及び／又は他のケアの標準治療に加えて、補助療法として使用される（前述のＧｏｔｔｓを参照）。

【0033】

臓器の生存率の向上は、敗血症の短期的な生存だけでなく、長期的にも非常に有益であることが判明する場合がある。長期生存率の重要性が高まっている。過去１０年間で致死率は低下したが、長期罹患率の増加のリスク、特に（致命的な）心血管イベントの大きなリスクにさらされている敗血症生存者の数が増加している。その結果、敗血症後の長期生存率は、敗血症後５年で５０％未満である。

【0034】

現在発明されている治療法は、長期生存率を大幅に改善することが期待される。

【0035】

ＩＶ．

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】ＳＵＬ－１３８の有無にかかわらず、標準的な盲腸結紮及び穿刺（ＣＬＰ）モデルで敗血症を誘発した後のマウスの剣状突起温度を示している。

【図2】ＳＵＬ－１３８で治療した場合としない場合のＣＬＰ誘発後のマウスにおけるサイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦα、及びＩＬ１２）の血漿レベルを示している。

【図3】腎機能のバイオマーカーである血漿中のＮＧＡＬと尿素を測定することにより、ＳＵＬ－１３８による治療に応じて、マウスのＣＬＰ誘発性腎機能障害又はその予防を示している。

【図4】ＳＵＬ－１３８による治療の有無にかかわらず、マウスのＣＬＰ誘発性腎臓炎症を、腎臓における多くのマーカーのＲＮＡの発現によって示している。

【図5】キイロショウジョウバエにおける敗血症誘発後の生存率及び走地性に対するＳＵＬ－１５１の効果を示している。

【図6】インビトロでのＬＰＳ誘発ミトコンドリア機能障害及び細胞死に対するＳＵＬ－１３８の効果を示している。

【図7A】ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０の細胞及びミトコンドリア過酸化物のＮＯ産生とスーパーオキシド産生を比較する。

【図7B】ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０の細胞及びミトコンドリア過酸化物のＮＯ産生とスーパーオキシド産生を比較する。

【図7C】ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０の細胞及びミトコンドリア過酸化物のＮＯ産生とスーパーオキシド産生を比較する。

【図7D】ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０の細胞及びミトコンドリア過酸化物のＮＯ産生とスーパーオキシド産生を比較する。

【図8A】ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０の内皮炎症活性化、及び低体温再加温ストレス後の内皮細胞生存率を比較する。

【図8B】ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０の内皮炎症活性化、及び低体温再加温ストレス後の内皮細胞生存率を比較する。

【図8C】ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０の内皮炎症活性化、及び低体温再加温ストレス後の内皮細胞生存率を比較する。

【図8D】ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０の内皮炎症活性化、及び低体温再加温ストレス後の内皮細胞生存率を比較する。

【発明を実施するための形態】

【0037】

Ｖ．
本発明の目的である、敗血症の治療又は予防のための化合物を提供すること、特に、腎機能障害などの感染に対する宿主の反応の調節不全によって引き起こされる臓器機能不全の治療又は予防のための化合物を提供することは、敗血症の治療又は予防に使用するための、上記式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）による化合物、又はその薬学的に許容される塩を提供することにより達成される。

【0038】

本発明による、より好ましい実施形態では、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）によるいずれかの化合物は、感染に対する宿主の反応の調節不全によって引き起こされる臓器機能不全の治療又は予防に使用するためのものである。

【0039】

損傷及び／又は機能不全の影響を受けやすい器官は、肺、心臓、及び血管、肝臓、腎臓、脳、又は腸のうちの１つ以上であり得る。

【0040】

本発明による化合物は、敗血症によって引き起こされる腎臓の臓器機能不全を治療又は予防するのに特に適している。

【0041】

本発明によるクロマノール、キノン、又はヒドロキノン化合物による治療又は予防は、敗血症を治療するための１つ以上の一般的な他の手段との併用療法の一部であることが好ましい。

【0042】

Ｒ１は、人体で容易に除去される置換基であり得、したがって化合物はプロドラッグである。Ｒ１は、例えば、アミノ酸誘導体又はエステル誘導体であり得、一般に、１００ダルトン未満の分子量を有する。

【0043】

好ましい実施形態では、式（Ｉ）のＲ１は水素であるか、又は６－酸素と一緒に２～６個の炭素原子を有するエステル基を形成する。エステルは、１つ以上のエーテル又はアルコール基を含むことができる。適切なエステルは、酢酸エステル、酪酸エステル、３－ヒドロキシ酪酸エステルなどである。

【0044】

選択肢（ｉ）の好ましい実施形態では、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）によるいずれかの化合物は、Ｒ２及びＲ３が、それらが結合しているＮ原子と一緒に、３～６個の炭素原子を有し、１つの追加のＮ原子を組み入れる飽和環を形成し、これは、酸素、カルボン酸、又はアミン基を含み得る１～４個の炭素原子で置換され得る。

【0045】

より好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合しているＮ原子と一緒に、１つの追加のアミン基を含む５～７員環を形成し、この環は、任意にメチル、エチル、又はアルコール置換メチル若しくはエチルで置換される。

【0046】

上記の選択肢（ｉ）において、Ｒ２及びＲ３は合わせて、３個以上で１２個以下の炭素原子を有する。

【0047】

上記の選択肢（ｉｉ）において、好ましくは、Ｒ３は、３個以上で１２個以下の炭素原子を有する。

【0048】

選択肢（ｉｉ）の別の好ましい実施形態では、Ｒ２は、水素原子であり、Ｒ３は、３～６個の炭素原子を有し、１個の窒素原子を有する環状構造を含む。

【0049】

より好ましくは、選択肢（ｉｉ）において、Ｒ２は、水素原子であり、Ｒ３は、１つの追加のアミン基を含む５～７員環を含み、この環は、アミド窒素に結合し、任意にメチル、エチル、又はアルコール置換メチル若しくはエチルで置換される。

【0050】

いずれの場合も、環（Ｒ２及びＲ３、又はＲ３のみで形成される環状構造）は、非置換であり得、又は１～４個の炭素原子を有するアルキル、アルコール、若しくはエチロールなどの１～４個の炭素原子を有するアルカノール基で置換され得る。

【0051】

選択肢（ｉｉｉ）による別の好ましい実施形態において、Ｒ３は、窒素又は酸素で任意に置換されたアリール基又はアリールアルキル基であり、Ｒ３は１０個以下の炭素原子を含む。好ましい実施形態において、Ｒ３は、環中に１個以上の窒素原子を含み得、１個又は２個、好ましくは１個のカルボン酸、エステル、又はアミド基で任意に置換された直鎖状及び／又は分岐状の脂肪族基を含み得る１つの芳香環構造を含む。

【0052】

本発明による好ましい実施形態では、式（Ｉ）、又は式（ＩＩ）によるいずれかの化合物は、（遊離塩基として）５００Ｄａ未満、より好ましくは４５０Ｄａ未満、更に最も好ましくは４００Ｄａ未満の分子量を有する。

【0053】

好ましい実施形態では、本発明に従って使用するための化合物は、式Ｉによるクロマノール化合物である。

【0054】

特定のクロマノール化合物は、ＷＯ２０１４／０９８５８６に記載されている。詳細に説明されている化合物には、ＳＵＬ－ＸＸＸ（ＸＸＸは２桁又は３桁の数字）を指す略語がある。これらの化合物の多くは、ラセミ混合物であるが、一部のエナンチオマーも試験されている。本発明によるクロマノール化合物を調製するための適切な方法は、ＷＯ２０１４／０９８５８６又はＷＯ２０１４／０１１０４７に記載されている。

【0055】

ＷＯ２０１７／０６０４３２Ａ１は、２－ヒドロキシ－２－メチル－４－（３，５，６－トリメチル－１，４－ベンゾキノン－２－イル）－ブタン酸のアミド誘導体、及びそのような化合物の製造方法を開示している。

【0056】

水素化キノン誘導体は、キノン構造の水素化によって容易に調製することができる。

【0057】

更に別の好ましい実施形態によれば、化合物は、ラセミ混合物として、又はそのエナンチオマーのうちの１つとして、（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１２１）、（（Ｓ）－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－Ｎ－（（Ｒ）－ピペリジン－３－イル）クロマン－２－カルボキサミド塩酸塩（ＳＵＬ－１３）、又は（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１０９）、又はその薬学的に許容される塩である。

【0058】

最も好ましい実施形態では、化合物は、ＳＵＬ－１０９のＳ－エナンチオマー、すなわち、Ｓ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－イル）（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１３８）、又はＳＵＬ－１２１のＳ－エナンチオマー、すなわちＳ－（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２イル）（ピペラジン－１－イル）メタノン（ＳＵＬ－１５１）、又はその薬学的に許容される塩である。

【0059】

薬学的に許容される塩中の対イオンは、当技術分野で知られている対イオンであり得る。好ましくは、化合物は、プロトン化することができる少なくとも１つの塩基性窒素、アミンを有する。対イオンは、好ましくは、塩化物、硫酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩などのハロゲン、最も好ましくは塩化物である。

【0060】

これらの化合物は、ラセミ混合物として、又は実質的に純粋なエナンチオマー形態で有効である。化合物は、１つ以上のキラル中心、一般的に１つ又は２つを有する。

【0061】

実験は、敗血症における有効性について、エナンチオマー形態が強力な決定因子ではないことを示している。しかし、一般的な規制上の理由から、好ましくは、化合物は、実質的に鏡像異性的に純粋な化合物である。実質的に鏡像異性的に純粋なものは、約９５％以上の鏡像体過剰率、より好ましくは約９８％の鏡像体過剰率、最も好ましくは約９９％以上の鏡像体過剰率である。また、化合物に複数のキラル中心が含まれている場合は、これらの量が適用される。

【0062】

化合物は、好ましくは、敗血症の治療又は予防を達成するために有効量で使用される。

【0063】

治療又は予防という用語には、敗血症の症状の改善及び／又は臓器機能の改善を含む敗血症の進行の減少が含まれる。

【0064】

好ましくは、本発明による化合物は、哺乳動物の臓器における敗血症の治療又は予防に使用するためのものであり、哺乳動物は好ましくはヒトである。

【0065】

本発明によるより好ましい実施形態では、式（Ｉ）、又は式（ＩＩ）によるいずれかの化合物は、感染に対する宿主の反応の調節不全によって引き起こされる臓器機能不全の治療又は予防に使用するためのものである。

【0066】

最も好ましい実施形態では、本発明による化合物は、感染によって引き起こされる腎機能障害の治療又は予防に使用するためのものである。

【0067】

感染症は体外からの原因と考えられ、自己免疫疾患などと対比される。感染症の一般的な原因は、細菌、真菌、又はウイルスの蔓延である。細菌及び真菌の感染源が最も一般的である。感染に対する宿主の反応の調節不全を引き起こすウイルスの最近の例は、ＣＯＶＩＤ－１９である。呼吸機能不全による入院の際、敗血症が起こる前に、本発明による化合物を予防的に投与することができる。

【0068】

効果は、一般的に体液中の約１μＭの量で観察されるが、より多くの量が使用されることが好ましい。好ましい量は、約１０μＭ以上、より好ましくは約２０μＭ以上のインビボ又はインビトロの濃度である。一般的に、ヒトにおける濃度は、約２００μＭ以下で十分かつ安全である。

【0069】

ヒトが使用する場合、これは、３０Ｌの分布容積、１００％の有効性、及び約１μＭの濃度を想定すると、約１０ｍｇ以上の投与量を意味する。好ましい量は、約１０μＭの濃度をもたらし、そのためには、約１００ｍｇ以上の投与量が適切であろう。したがって、好ましくは、約２０ｍｇ以上、好ましくは５０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上の剤形が適切である。

【0070】

一般的に、固形、経口剤形は、賦形剤を可能にするために、最大で約５００ｍｇの化合物、好ましくは約４５０ｍｇ以下を含む。

【0071】

例えば静脈内などの非経口投与、又は他の液体投与形態では、より多くの量を投与することができる。

【0072】

使用できる投与量の例は、有効量の本発明の化合物の０．２ｍｇ／ｋｇ以上の投与量であり、例えば、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内、又は約２ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、又は約３ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内、又は約４ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。本発明の化合物は、１日１回の用量で投与することができ、又は総１日投与量は、１日２、３又は４回の分割投与で投与することができる。

【0073】

本明細書に記載の化合物は、薬学的又は生理学的に許容される賦形剤担体、及びビヒクルなどの添加剤を配合することにより、医薬組成物として調製することができる。

【0074】

適切な薬学的又は生理学的に許容される賦形剤、担体及びビヒクルには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、単糖類、二糖類、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、デキストロース、ヒドロキシプロピル－Ｐ－シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスなど、それらの任意の２つ以上の組み合わせなどの処理剤、薬物送達調節剤及び増強剤が挙げられる。他の適切な薬学的に許容される賦形剤は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されている。

【0075】

医薬組成物は、好ましくは、単位用量製剤を含み、単位用量は、治療効果を有するのに十分な用量である。単位用量は、障害の治療又は抑制の過程で定期的に投与される用量であり得る。

【0076】

本発明の化合物は、必要に応じて、従来の無毒の薬学的又は生理学的に許容される担体、アジュバント、及びビヒクルを含む投与単位製剤において、経腸的、経口的、非経口的、舌下的、吸入（例えば、ミスト又はスプレーとして）によって、直腸に、又は局所的に投与され得る。本明細書で使用される非経口的という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、足根内注射、又は注入手法を含む。化合物は、所望の投与経路に適した薬学的に許容される担体、アジュバント、及びビヒクルと混合される。

【0077】

一般的に、経口投与は、好ましい投与経路であり、経口投与に適した製剤が好ましい製剤である。

【0078】

敗血症は急性疾患であることが多いため、患者が敗血症を発症するリスクがある場合には経口剤形が有用であり、そのような経口剤形は当該患者に予防的に投与される。

【0079】

しかし、特に急性型の敗血症では、患者はしばしば錠剤、丸薬などの経口投与には重症であるため、静脈内注射剤及び／又は持続的な静脈内点滴が好ましい。更に、敗血症は、与えられた薬の経口利用可能性に実質的に影響を与えることがある。血漿レベルの確実性は、一般に静脈内又は他の非経口投与によってのみ達成することができる。

【0080】

本明細書で使用するために記載された化合物は、固体形態、液体形態、エアロゾル形態、又は錠剤、丸剤、散剤混合物、カプセル剤、顆粒剤、注射液、クリーム、液剤、坐剤、浣腸、結腸洗浄、乳剤、分散液、食品プレミックスの形態、及びその他の適切な形態で投与することができる。化合物はまた、リポソーム製剤で投与することができる。

【0081】

注射用製剤、例えば、無菌の注射用水性又は油性の懸濁剤は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、既知の技術に従って調製され得る。無菌の注射用製剤はまた、例えば、プロピレングリコール中の液剤として、無毒の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射用液剤又は懸濁剤であり得る。使用できる許容可能なビヒクル及び溶媒の中には、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。更に、無菌の固定油は、従来は、溶媒又は懸濁媒として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の刺激の少ない固定油を使用することができる。更に、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用されている。

【0082】

薬物の直腸投与用の坐剤は、薬物を、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸で溶融して薬物を放出する、ココアバター及びポリエチレングリコールなどの適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。

【0083】

経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、顆粒剤、散剤、顆粒が含まれ得る。そのような固体剤形において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、又はデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。そのような剤形はまた、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含み得る。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含み得る。錠剤及び丸剤は、腸溶性コーティングで更に調製することができる。

【0084】

経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、及び水などの当技術分野で一般的に使用されている不活性希釈剤を含むエリキシル剤が含まれ得る。そのような組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、シクロデキストリン、甘味料、香料、及び芳香剤などのアジュバントを含み得る。

【0085】

単回投与形態を生成するために担体材料と組み合わせ得る有効成分の量は、有効成分が投与される宿主及び特定の投与様式に応じて変化するであろう。選択された単位投与量は、通常、血液、組織、臓器、又は体の他の標的領域における薬物の定義された最終濃度を提供するために製造及び投与される。所与の状況に対する有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができ、通常の臨床医又は当業者の技能及び判断の範囲内である。

【0086】

本発明を以下の実施例を使用して更に説明する。実施例では、図を参照している。

【0087】

ＶＩ．

【実施例】

【0088】

敗血症の治療又は予防に対する本発明による化合物の有効性は、インビボでマウス及びショウジョウバエで、インビトロでＨＵＶＡ、ＨＵＶＥＣ又はＮＲＫ細胞で試験された。（実施例１－４）

【0089】

実施例１；マウス
実験
動物実験は、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎによって承認された（ＩｖＤ ｎｒ．１６５９３）。

【0090】

オスのＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスは、室温で１２時間－１２時間の明暗サイクルで飼育された。動物には、標準的な動物用実験用飼料を使用して自由に餌を与え、いつでも飲料水を自由に摂取できるようにした。

【0091】

敗血症を誘発するために、標準的な盲腸結紮及び穿刺（ＣＬＰ）モデルが使用された。キシラジン／ケタミン（１００／１０ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射により動物を麻酔し、続いて鎮痛剤としてブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を投与した。足のピンチと目の反射に対する反応の欠如によって麻酔が確認された後、１ｃｍの正中切開が行われる前に、ポビドンヨード溶液を使用して腹部を剃り、洗浄し、除菌した。盲腸は、遠位極と盲腸の基部との間の距離の半分で６－０縫合糸で結紮され、２１ゲージ針（腸間膜から反腸間膜方向への「貫通」）で１回穿刺され、これは「中等度」の敗血症のモデルとして認められている。次に、少量の便（２～３ｍｍ）を押し出して、創傷の開存性を確保した。盲腸の位置を変え、それによって糞便が傷の縁にこぼれないように注意した後、腹部の筋肉組織に縫合を行い、皮膚に短い結節縫合をして腹部を閉じた。次に、１ｍｌの生理食塩水（加温、０．９％ＮａＣｌ皮下注射）を投与して、敗血症の発症により予想される相対体積の喪失を補った。

【0092】

マウスは２６～２８℃で回復した。広域抗生物質（イミペネム／シラスタチン、１００ｍｇ／ｋｇ皮下注射）を、鎮痛薬（ブプレノルフィン、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、皮下注射）とともに、手術の２時間後及び１０時間後に投与した。

【0093】

盲腸が位置しているが穿刺されていない操作された動物のグループは、偽として機能した。

【0094】

更に、時間を一致させた麻酔を受けたが、手術を受けずに対照として機能した動物のグループが含まれていた。

【0095】

ＳＵＬ－１３８処置群のマウスには、手術の２時間前と８時間後にＳＵＬ－１３８（生理食塩水に溶解、５ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）を注射し、これらの時点で他のグループのマウスには等量の生理食塩水を注射した。

【0096】

マウスの剣状突起温度は、手順の８時間後及び２４時間後に測定された。結果を図１に示し、以下で説明する。

【0097】

処置の２４時間後にマウスを屠殺した。安楽死時に、ＥＤＴＡ抗凝固処理された血液を１，６００ｇで１０ｍｍ遠心分離することにより血漿に分離し、３０分間凝固させた後、３，０００ｇで１０分間遠心分離することにより血清に分離した。

【0098】

さらなる分析のために、血漿、血清、及び臓器を液体窒素で瞬間凍結した。

【0099】

全身性炎症に対する敗血症の重症度とＳＵＬ－１３８による治療の効果を定量化するために、メーカーの指示に従って、血漿中のＴＮＦα、ＩＬ－６、及びＩＬ－１２のレベルを、Ｍｏｕｓｅ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（それぞれＤＹ４１０、ＤＹ４０６、及びＤ４１９、ＲｎＤ－Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレート（ＤＹ９９０、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μＬ ＰＢＳで希釈した捕捉抗体で一晩コーティングした。プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２－７．４）で３回洗浄し、続いて３００μＬの試薬希釈液で１時間ブロッキングした（ＰＢＳ中の１％プロブミンｗ／ｖ）。洗浄を繰り返し、サンプルをウェルに加えた。血漿サンプルは、試薬希釈液でＴＮＦα及びＩＬ－１２については１０倍、ＩＬ－６については１００倍に希釈した。室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、続いて試薬希釈液で希釈した１００μＬの検出抗体を各ウェルに加えた。再度、プレートを室温で２時間インキュベートした後、洗浄した。最後に、１００μＬの基質溶液（ＤＹ９９９、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、暗所で２０分間インキュベートした後、５０μＬの停止液（２Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を添加した。４５０ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダーを使用して光学密度（ＯＤ）を測定し、５４０ｎｍでの読み取り値を補正として差し引いて精度を高めた。結果を図２に示し、以下で説明する。

【0100】

更に、血清中のＮＧＡＬ及び尿素の量を測定した。ＮＧＡＬと尿素は、マウスの腎障害の一般的なバイオマーカーである。結果を図３に示し、以下で説明する。

【0101】

ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＣＡＭなどの腎臓における炎症誘発性サイトカイン及び接着分子の発現を評価するために、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ（Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて約３０ｍｇの腎臓組織からＲＮＡを分離し、ナノドロップ分光光度計ＮＤ－１０００を使用して定量化し、各サンプルの０．５μｇのＲＮＡを使用してコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。細胞からのＲＮＡ分離には、キットの溶解バッファーの代わりに、溶解バッファーとしてＴＲＩｚｏｌとクロロホルムをわずかに変更して同じキットを使用した。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔ及びＣｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ（付録を参照）を使用して設計され、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用した効率、融解温度及び曲線、並びにナイーブ及び酵素消化産物のゲル電気泳動上のサイズを評価することによって検証された。ｑＲＴ－ＰＣＲ増幅は、次の熱プロファイルを使用して実行された。すなわち、９５°Ｃで２ｍｍ、続いて９５°Ｃで１５秒間、５８°Ｃで３０秒間、及び７２°Ｃで３０秒間の４０サイクルである。全ての反応は三連で行い、各プライマーの標準曲線を使用した。結果を図４に示し、以下で説明する。

【0102】

結果
図１は、チャレンジされていない対照に対するＳＵＬ－１３８を使用した場合と使用しない場合のＣＬＰの誘発後のマウスの剣状突起温度を示している。図１は、ＳＵＬ－１３８で治療すると剣状突起温度が２４時間後に回復する一方で、ＣＬＰ手順が８時間及び２４時間後に剣状突起温度の低下をもたらすことを示している。有意差は、対になっていない片側スチューデントＴ検定を使用して、ＣＬＰ／生理食塩水に対するチャレンジされていない対照と、ＣＬＰ／ＳＵＬ－１３８に対するＣＬＰ／生理食塩水との間で２４時間で計算される。図中の「＊」は、有意差を示している。

【0103】

図２は、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、及びＩＬ１２）の血漿レベルが、ＳＵＬ－１３８による治療によって、未治療の対照に近いレベルまで低下することを示している。有意差は、対になっていない片側スチューデントＴ検定を使用して、ＣＬＰ／生理食塩水に対する対照と、ＣＬＰ／生理食塩水に対する偽と、ＣＬＰ／Ｓｕｌ－１３８に対するＣＬＰ／生理食塩水との間で計算される。ＴＮＦ－αは明らかに低かったが、その差はＴ検定では有意に達しなかった。

【0104】

図３は、ＣＬＰ誘発性腎機能障害がＳＵＬ－１３８による治療によって排除されることを示している。血清尿素（Ａ）及びＮＧＡＬ（Ｂ）レベルは敗血症で大幅に増加するが、これはＳＵＬ－１３８による治療によって排除される。ＣＬＰの前にＳＵＬ－１３８で治療された動物における血清尿素及びＮＧＡＬレベルは、偽手術動物と差がなかった。有意差は、対になっていない片側スチューデントＴ検定を使用して、ＣＬＰ／生理食塩水に対する対照と、ＣＬＰ／生理食塩水に対する偽と、ＣＬＰ／ＳＵＬ－１３８に対するＣＬＰ／生理食塩水との間で計算される。

【0105】

図４は、ＣＬＰ誘発性腎臓炎症がＳＵＬ－１３８による治療によって大幅に減少することを示している。ＣＬＰによって誘発された敗血症は、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＣＡＭなどの腎臓における炎症誘発性サイトカイン及び接着分子の発現をアップレギュレートした。ＳＵＬ－１３８を用いたＣＬＰによる敗血症の誘発前の動物の治療は、ＩＬ－６発現の上昇を完全に防止した（図４Ａを参照）。ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、又はＩＣＡＭ（図４Ｂ－Ｄ）は、未治療のＣＬＰ動物よりも低かったが、対になっていない片側スチューデントＴ検定を使用すると、統計的に有意な差はなかった。

【0106】

考察
敗血症の誘発後のマウスの体温の低下は、代謝恒常性の喪失を示しており、ＳＵＬ－１３８で処理したマウスの２４時間後の回復は、敗血症にもかかわらず代謝恒常性の回復を示唆している。

【0107】

ＩＬ－６及びＩＬ－１２の血漿レベルの増加は、ＣＬＰによって誘発された全身性炎症を示しているが、ＳＵＬで治療した動物では両方のサイトカインがＣＬＰ後に有意に低下しており、炎症レベルが低下していることを示している。

【0108】

ＣＬＰの誘発後のＮＧＡＬと尿素のレベルの増加は、急性腎機能障害を示している。ＮＧＡＬと尿素は、マウスの腎機能のバイオマーカーである。図３は、ＳＵＬ－１３８による治療により、マウスのＣＬＰ誘発性腎機能障害が排除されるか、少なくとも大幅に減少することを示している。

【0109】

腎臓におけるＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、及びＩＣＡＭのＲＮＡ発現は、ＣＬＰの誘発後に増加し、腎臓における局所的な炎症反応を示している。Ｓｕｌ－１３８による治療はＩＬ－６の発現を有意に減少させたが、他のマーカーはＳＵＬ－１３８による治療によって低下した。

【0110】

実施例２；キイロショウジョウバエ
実験
Ｗ１１１８ハエを飼育し、２５°Ｃで１２時間－１２時間の明／暗サイクルで飼育した。ハエは、約５ｍＬの標準的な酵母コーンミール培地を含むバイアルに保管された。ストックとして保持されたハエは、毎週新しいバイアルにひっくり返された。使用したイーストコーンミール培地は、Ｓｔｏｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇａｌｌａｎｔの「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」の指示に従って調製され、水１リットル当たりイースト１００グラム、グルコース７５グラム、寒天８グラム、コーンミール５５グラム、小麦粉１０グラムで構成されている。煮沸後、菌の増殖を防ぐためにリン酸とプロピオン酸を混合物に加えた。

【0111】

黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）を２．５％トリプシンソイブイヨン（ＴＳＢ）中、３７℃で連続回転（毎分２００ラウンド）しながら、－８０℃で維持された黄色ブドウ球菌グリセロールストックから、好気性雰囲気下で一晩、培養した。各実験について、実験の１日前に新鮮な培養物を調製した。細菌感染については、翌日、６００ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した。清浄なＴＳＢをＯＤ＝０．００として使用し、細菌培養物をＰＢＳでＯＤ＝２．２０に希釈した。次に、１．０ｍＬの細菌培養物（ＯＤ＝２．２０）を１４，０００ｇで１分間遠心分離し、上清を捨て、細菌ペレットを１．０ｍＬ ＰＢＳに再懸濁した。適切な実験では、段階希釈（ＰＢＳでそれぞれ約１．０５及び０．２５の光学密度で５倍及び２５倍希釈）を使用した。

【0112】

オスのハエ（生後３～５日）に、注射の直前にＣＯ_２パッド上で麻酔をかけた。タングステン針（直径０．２５ｍｍ、Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ、１０１３０－１０）を細菌懸濁液に浸し、ハエを胸部の側面（胸部の縫合前の盾板）にピンで刺した。偽ハエにはＰＢＳのみを投与し、対照ハエは操作せず、ＣＯ_２パッド上で麻酔したのみである。偽ハエには、針の血リンパコーティングを確保し、偽ハエの偶発的な細菌注入を防ぐために最初に注入された。ハエのサブグループは抗生物質で治療された。したがって、リネゾリドは、ハエ培地１ｍＬ当たり５００μｇの物質を溶解して経口投与された。様々な濃度の黄色ブドウ球菌で介入群をピン刺しした後、リネゾリド培地を含むバイアルにハエを入れた。

【0113】

４８時間後、ハエを非抗生物質含有バイアルに導入した。細菌感染を誘発する効率を検証するために、２５０μＬ ＰＢＳで１０匹のハエをホモジナイズして細菌負荷を決定した。短時間の遠心分離の後、上清を１／１０、１／１００、及び１／１０００希釈でＬｕｎａ－Ｂｅｒｔａｍ（ＬＢ）寒天プレートにプレーティングし、２４時間後にチェックした。

【0114】

リネゾリドは、ハエの培地１ｍＬ当たり５００μｇの物質を溶解することにより、経口投与された。ピン刺し後、対照ハエ、偽手術されたハエ、及び様々な濃度の黄色ブドウ球菌を含む感染介入群、ハエをリネゾリド培地を含むバイアルに入れた。４８時間後、ハエを非抗生物質含有バイアルに導入した。

【0115】

化合物ＳＵＬ－１５１は、細菌注射と同時に胸腔内注射によって投与された。介入群には３ｍＭ ＳＵＬ－１５１を、ビヒクルに感染したハエには１％ＤＭＳＯを、細菌注射の直前に細菌溶液自体に溶解して投与した。

【0116】

ハエの健康状態のマーカーとして、負の走地性が研究された。したがって、１５匹のハエのグループは、空のスチレンバイアル（高さ９．５ｃｍ）に移し替えられた。次に、最大９個のバイアルを、負の走地性用に設計された３Ｄプリント製のバイアルホルダーに入れた。ハエを５分間順応させた。次に、ワークトップに対してバイアルホルダーを３回軽く叩くことにより、ハエをバイアルの底に向かって軽く叩いた。デジタルカメラを使用して、最後に叩いてから５秒後に写真を撮った。この実験は、試行ごとに１分間の休止を挟んで５回繰り返された。ＩｍａｇｅＪを使用して、全てのハエが５秒以内に移動した距離を決定し、グループごとに５回の試行を平均した。

【0117】

更に、ハエの生存は、感染後２４時間で、バイアル内の死んだハエを数える目視検査によってチェックした。

【0118】

結果
図５は、キイロショウジョウバエにおける敗血症誘発後の生存率（Ａ）及び走地性（Ｂ）に対するＳＵＬ－１５１の効果を示している。２４時間後の生存率は、ＳＵＬ－１５１で治療されたハエの８０％であったが、ＳＵＬ治療なしの敗血症のハエではわずか４２％であった（Ａ）。走地性は、ＳＵＬ（Ｂ）で前処置されたハエの敗血症の誘発後２４時間及び４８時間の両方で改善された。有意差は、対になっていない片側スチューデントＴ検定を使用して、敗血症／ＤＭＳＯに対する対照と、敗血症／ＳＵＬ－１５１に対する敗血症／ＤＭＳＯとの間で計算される。

【0119】

考察
敗血症の誘発時の３ｍＭ ＳＵＬ－１５１の注射は、敗血症の誘発後２４時間及び４８時間で走地性の改善をもたらし、死亡率は２４時間で大幅に減少した。両方の測定値は、感染誘発性炎症に対するＳＵＬ１５１の有効性を示している。

【0120】

実施例３；内皮細胞
実験
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＲｕＧ／ＵＭＣＧ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（内皮細胞施設）から入手した。臍帯の一次分離株を混合し、その後、２０％熱不活化ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ａｒｔ．ｎｒ．１００８２１４７）、２ｍＭ １－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｒｔ．ｎｒ．２５０３０）、５Ｕ／ｍｌ ヘパリン（Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ａｒｔ．ｎｒ．Ｐ４３３３）、及び（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ａｒｔ．ｎｒ．Ｅ２７５９）による５０μｇ／ｍｌ ＥＣ成長因子補足剤で補充されるＲＰＭＩ １６４０（Ｌｏｎｚａ，ａｒｔ．ｎｒ．ＢＥ１２－１１５Ｆ）からなるＨＵＶＥＣ培養培地で培養した。

【0121】

一次ＨＵＶＥＣは、７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ａｒｔ．ｎｒ．４３０７２０Ｕ）内で３７°Ｃ、５％ ＣＯ２／９５％空気下で培養された。ＨＵＶＥＣは、継代８までの実験に使用された。実験は６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ ａｒｔ．ｎｒ．３５０６）又は９６ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ａｒｔ．ｎｒ．３５９６）において、８０％の集密度（コンフルエンシー）で行われた。細胞をＬＰＳ大腸菌０１１１：Ｂ４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ａｒｔ．ｎｒ．Ｌ２６３０）により、異なる濃度で刺激した。細胞をトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ａｒｔ．ｎｒ．２５３０００５４）により剥離した。全ての化合物をハンクス平衡塩類溶液（Ｌｏｎｚａ、ａｒｔ．ｎｒ．１０－５２７Ｆ）に溶解した。

【0122】

ＨＵＶＥＣは、ＬＰＳ刺激の１時間前に添加された１０マイクログラム／ｍｌの量のＳＵＬ－１３８によりプレインキュベートされた。このようなプレインキュベーションは、インビトロモデルの標準である。

【0123】

膜電位は、ＪＣ－１（５，５’，６，６’－テトラクロロ－１，１’，３，３’－テトラエチル－イミダカルボシアニンヨウ化物）を用いて測定した。３０分後にミトコンドリア膜電位を測定した。

【0124】

細胞及びミトコンドリアをインキュベートし、５４８／５７４ｎｍの励起／発光率でＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ４マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）で製造元のプロトコルに従って測定した。

【0125】

結果
図６は、ＳＵＬ－１３８がインビトロでのＬＰＳ誘発ミトコンドリア機能障害及び細胞死から保護することを示している。

【0126】

図６Ａは、ＨＵＶＥＣの呼吸を示し、対照と比較して、１０ｕｇ／ｍｌのＬＰＳで脱結合状態（ＣＣＣＰ）の減少を示している。ＳＵＬ－１３８で治療されたＬＰＳチャレンジＨＵＶＥＣは、非共役呼吸をほぼ回復する。

【0127】

図６Ｂは、ＭｉｔｏＳＯＸによって測定された、ミトコンドリアの酸化ストレスのＬＰＳ誘発増加を示している。ＭｉｔｏＳＯＸはミトコンドリアでのＲＯＳ産生を測定するため、ＳＵＬ－１３８はＬＰＳ誘発性ミトコンドリアの酸化ストレスを軽減する。

【0128】

図６Ｃは、ＨＵＶＥＣでＬＰＳを使用した４８時間で細胞生存率が低下したのに対し、ＳＵＬ－１３８では４８時間後に細胞生存率が回復したことを示している。細胞死はＣｙｑｕａｎｔによって測定された。

【0129】

有意差は、対になっていない片側スチューデントＴ検定を使用して、ＬＰＳに対する対照と、ＬＰＳ／ＳＵＬ－１３８に対するＬＰＳとの間で計算される。

【0130】

考察
ＬＰＳ処理内皮細胞に対して実施された実験は、細胞レベルでの敗血症がミトコンドリア機能障害を含み、これが本発明による化合物によって回復される一方で、全細胞生存率はＳＵＬ－１３８の使用によって有意に増加したことを示している。

【0131】

理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、本発明による化合物がＬＰＳ誘発ミトコンドリア機能障害及び細胞死から細胞を保護するため、敗血症の治療又は予防に使用できると考える。

【0132】

実施例４（いくつかのＳＵＬ化合物を用いたインビトロ試験）
次の化合物がテストされた。

【表1-1】

【表1-2】

【0133】

実験計画
ＨＵＶＥＣ細胞培養
ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ ＣＣ－２５１９）は、２０％ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μｇ／ｍｌ ウシ下垂体抽出物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１％ゼラチンをコーティングした培養用フラスコに維持させた。培養物が７０％の集密度（コンフルエンシー）に達したとき、ＨＵＶＥＣをトリプシン処理によって継代した。全ての実験において、ＨＵＶＥＣは０．６・１０^５細胞／ｃｍ^２で播種し、２４時間接着させた。

【0134】

ＮＲＫ５２Ｅ細胞培養
ラット腎臓上皮細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－１５７１）は、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＤＭＥＭ培地で維持された。ＮＲＫ５２Ｅ細胞は、培養物が７０％の集密度（コンフルエンシー）に達したときに、トリプシン処理によって継代した。全ての実験で、ＮＲＫ５２Ｅ細胞を０．６・１０^５細胞／ｃｍ^２で播種し、２４時間接着させた。

【0135】

エンドトキシン曝露後の炎症活性化
ＨＵＶＥＣ及びＮＲＫ５２Ｅ細胞をＳＵＬ化合物（１０μＭ）で３０分間プレインキュベートし、続いて標準的な培養条件下で２４時間ＬＰＳに曝露した。細胞をｔｒｉＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解し、製造者の指示に従って全ＲＮＡを単離した。ＦｉｒｓｔＡｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、サンプル当たり１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において、ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、及び腫瘍壊死因子アルファに特異的なプライマー、インターロイキン１ベータ、インターロイキン－６、及びベータアクチンをローディングコントロールとして使用して、５ｎｇの全ＲＮＡに相当するコピーＤＮＡを増幅した。増幅は、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間を４０サイクル行った。相対的なｍＲＮＡ発現は

【数1】

として計算され、刺激されていない対照細胞（１００％阻害）、及びビヒクル処理及びＬＰＳ曝露細胞（０％阻害）に対して正規化された。以下のプライマーを使用した。

【表2】

【0136】

統計的評価
全ての実験は、条件ごとに最低３連で行われた。個別の実験から得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、Ｃａ）での評価に使用した。ＡＮＯＶＡ及びそれに続くボンフェローニ事後分析を使用して、統計的有意性を計算した。０．０５未満の確率値（ｐ）は有意とみなされた。

【0137】

結果
内皮及び上皮の炎症性活性化。

【0138】

内皮炎症活性化は、敗血症時の炎症過程の調節に重要な役割を果たす。内皮細胞は、エンドトキシン又はその他の炎症誘発性分子によって引き起こされ、炎症性サイトカインの産生を開始し、その後、炎症性細胞を動員して補充し、炎症反応を引き起こす。

【0139】

内皮細胞及び腎臓上皮細胞は、炎症性サイトカインのベースライン遺伝子発現が非常に低く、ＬＰＳなどのエンドトキシンに曝露されると大幅に増加する。内皮細胞又は腎臓上皮細胞をＳＵＬ化合物（３０ｍｍで全て１０μＭ）で前処理すると、ＬＰＳチャレンジの前に、様々な有効性で、次の表に示すように、炎症誘発性サイトカインＴＮＦα、及びインターロイキンＩＬ－１β及びＩＬ－６のｍＲＮＡ発現の誘発が妨げられる。

【表3】

【0140】

この表から、本発明によらない化合物は約３５％以下の阻害率を示すが、本発明による化合物は約４０％以上の阻害を示すことが明らかである。

【0141】

更に、ＳＵＬ－１５０とＳＵＬ－１５１との比較は、効果がエナンチオマー配置に依存しないことを示している。ＳＵＬ－１３８とＳＵＬ－１３８Ｍ２との比較は、式２による化合物はあまり好ましくないが、活性も示すことを示している。

【0142】

実施例５及び比較実験Ａ
この研究では、ＮＯの放出、細胞質及びミトコンドリアの酸化ストレスの阻害、炎症性シグナル伝達、並びに低体温再加温ストレス後の細胞生存に焦点を当てたインビトロ実験の範囲内で、ＳＵＬ化合物ＳＵＬ－１３８及びＳＵＬ－１５０（本発明による）の作用機序を、ＢＮ－８０９３３（比較Ａ、構造は上記の序文を参照）の作用機序と比較した。これらのインビトロアッセイは、指定された化合物の有効性を確立する前に使用されているため、それらの作用機序の適切な指標とみなされる。

【0143】

実験計画
ＨＵＶＥＣ細胞培養
ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ ＣＣ－２５１９）は、２０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μｇ／ｍｌウシ下垂体抽出物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１％ゼラチンをコーティングした培養用フラスコに維持させた。培養物が７０％の集密度（コンフルエンシー）に達したとき、ＨＵＶＥＣをトリプシン処理によって継代した。全ての実験で、ＨＵＶＥＣを０．６・１０^５細胞／ｃｍ^２で播種し、２４時間接着させた。

【0144】

ＲＡＷ２６４．７細胞培養
マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ－７１）を、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＤＭＥＭ培地で維持した。培養物が７０％の集密度（コンフルエンシー）に達したとき、ＲＡＷ２６４．７細胞をトリプシン処理によって継代した。全ての実験で、ＲＡＷ２６４．７細胞を０．５・１０^５細胞／ｃｍ^２で播種し、２４時間接着させた。

【0145】

ＮＯ産生の測定
製造元の指示に従って、Ｍｅａｓｕｒｅ－ＩＴ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｎｉｔｒｉｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（＃Ｍ３６０５１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して培養培地中の硝酸塩濃度を測定することにより、ＮＯの細胞産生を概算した。産生されたＮＯは不安定で、半減期は２～３０秒で、酸素分子と急速に反応して亜硝酸塩を形成する。亜硝酸塩は、細胞培養液中で更に酸化されて硝酸塩になる。したがって、馴化培地中の硝酸塩濃度は、細胞のＮＯ産生を評価するのに適している。単一の９６ウェルプレートウェルに由来する５０μｌの馴化培地をアッセイごとに使用し、タンパク質濃度に対して正規化した。全ての実験は４連で行った。

【0146】

ＬＰＳ誘発性細胞及びミトコンドリアの酸化ストレスの測定。

【0147】

細胞及びミトコンドリアの酸化ストレスの生成は、細胞及びミトコンドリアのスーパーオキシド、すなわちそれぞれジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）及びＭｉｔｏＳｏｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の蛍光プローブを使用して測定された。ＨＵＶＥＣをＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８又はＳＵＬ－１５０（全て１０μＭ）により３０ｍｍインキュベートした。次に、ＨＵＶＥＣをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）に更に２４時間曝露した。インキュベーションの最終時間に、２．５μＭのＤＨＥ又はＭｉｔｏＳｏｘを各サンプルに適用した。ＨＵＶＥＣをＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定した。核染色は、５μＭの２－（４－アミジノフェニル）－ｌＨ－インドール－６－カルボキサミジン（ＤＡＰＩ）によって行い、サンプルの蛍光強度を、適切なフィルターセットを備えたＣＬＡＲＩＯＳｔａｒ Ｐｌｕｓプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で記録した。ＤＨＥ及びＭｉｔｏＳｏｘの蛍光記録は、ＤＡＰＩ蛍光に対して補正された。全ての実験は４連で行った。

【0148】

エンドトキシン曝露後の炎症活性化
ＨＵＶＥＣ細胞をｔｒｉＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解し、製造者の指示に従って全ＲＮＡを単離した。ＦｉｒｓｔＡｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、サンプル当たり１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において、ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、及び腫瘍壊死因子アルファに特異的なプライマー（ＴＮＦα；センス５’－ＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴ－３’、アンチセンス５’－ＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＡＴＴＡＧＡＧＡ－３’）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β；センス５’－ＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＣ－３’、アンチセンス５’－ＡＣＡＣＡＡＡＴＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧ－３’）、インターロイキン－６（ＩＬ－６；センス５’－ＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＧＡＡＧＧＧＧＣＣＴＡ－３’、アンチセンス５’－ＴＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴＡＡＧＴＡＧＡ－３’）、及びベータアクチン（ＡＣＴＢ；センス５’－ＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡ－３’、アンチセンス５’－ＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡＧ－３’）をローディングコントロールとして使用して、５ｎｇの全ＲＮＡに相当するコピーＤＮＡを増幅した。増幅は、９５°Ｃで３０秒間、６０°Ｃで１分間を４０サイクル行った。相対ｍＲＮＡ発現は、δδＣｔ法に従って計算された。

【0149】

低体温再加温ストレス後の細胞生存率の定量化。

【0150】

ＨＵＶＥＣは、ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８又はＳＵＬ－１５０（全て１０μＭ）で３７℃の加湿インキュベーター内で１時間前処置した。前処理に続いて、ＨＵＶＥＣを冷蔵室（２～８℃）に２４時間置き、続いて３７℃に戻して３時間再加温した。１時間再加温した後、細胞培養培地を、培養培地中の予熱して濾過した０．４ｍｇ／ｍＬのニュートラルレッド（＃Ｎ４６３８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に交換した。残りの２時間の再加温期間の後、ＨＵＶＥＣをＰＢＳで洗浄し、ＮＲＵを１００μＬの吸収溶液（ｄＨ_２Ｏ中の５０％エタノール、１％酢酸）に可溶化した。吸光度は、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ８０８プレートリーダーで５５０ｎｍの波長で測定された。記録されたＯＤ_{５５０ｎｍ}値は、常に３７°Ｃに維持された対照サンプルに対して正規化され、１００％生存可能であると想定された。

【0151】

統計的評価
全ての実験は、条件ごとに最低３連で行われた。個別の実験から得られたデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、Ｃａ）での評価に使用した。全てのデータセットは、ビヒクル対照に対して正規化された。ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ事後分析を使用して、統計的有意性を計算した。０．０５未満の確率値（ｐ）は有意とみなされた。

【0152】

結果
１．エンドトキシン（ＬＰＳ）チャレンジ後の内皮ＮＯ産生
ＨＵＶＥＣの馴化培地中の硝酸塩レベルによって測定される基礎内皮ＮＯ産生は、平均２３９ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった（図７Ａ）。ＢＮ－８０９３３は内皮ＮＯ産生を約３８％（ｐ＜０．００１）抑制したが、ＳＵＬ化合物は基礎のＮＯ産生を変化させなかった（図７Ａ）。

【0153】

エンドトキシンは、ｅＮＯＳの活性を制限することにより、内皮のＮＯ産生を抑制する。ＨＵＶＥＣは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０、又は（全て１０μＭ）で前処置した後、エンドトキシン（ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌ）に２４時間曝露した。ＬＰＳに曝露された内皮細胞からの馴化培地中の硝酸塩レベルは、平均１６０ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であり（非ＬＰＳ曝露ＨＵＶＥＣに対して約３３％減少、ｐ＝０．００２）、これは基礎対照レベルより低かった。ＢＮ－８０９３３は更に、馴化培地中の硝酸塩レベルを平均９０ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質（ｐ＝０．００８）に抑制した（図７Ａ）。対照的に、ＳＵＬ－１３８（ｐ＝０．００８）及びＳＵＬ－１５０（ｐ＝０．００４）は、硝酸塩レベルＬＰＳ誘発性低下を緩和し、それらのレベルは基礎硝酸塩レベルから変化しなかった。

【0154】

２ エンドトキシン（ＬＰＳ）チャレンジ後のマクロファージＮＯ産生
生理学的状況下では、非常に限られた量のＮＯが炎症細胞によって生成されるが、エンドトキシンチャレンジなどの免疫学的ストレス下では、誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）によるＮＯ産生が促進される。ＲＡＷ２６４．７マクロファージの馴化培地中の硝酸塩レベルによって測定される基礎のＮＯ産生は最小であり、平均５ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった（図７Ｂ）。ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、ＳＵＬ－１５０のいずれも、細胞外硝酸塩の基礎生産に影響を与えなかった。

【0155】

ＬＰＳは、ｉＮＯＳを活性化することにより、マクロファージＮＯ産生を誘発する。ＲＡＷ２６４．７マクロファージは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、又はＳＵＬ－１５０、又は（全て１０μＭ）で前処置した後、エンドトキシン（ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌ）に２４時間曝露した。ＬＰＳ露出ＲＡＷ２６４．７マクロファージからの馴化培地中の硝酸塩レベルは、平均８３ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった（露出していないＲＡＷ２６４．７細胞に対して約１６倍の増加、ｐ＝０．００１）。ＢＮ－８０９３３は、ＮＯＳ阻害剤としての機能と一致して、細胞外硝酸塩レベルのＬＰＳ誘発増加を鈍化させた（ｐ＜０．００１、図７Ｂ）。ＳＵＬ－１３８もＳＵＬ－１５０も、ＲＡＷ２６４．７マクロファージによる硝酸塩産生のＬＰＳ誘発増加を強く抑制しなかった（図７Ｂ）。

【0156】

３ 細胞及びミトコンドリアのスーパーオキシド産生
ＨＵＶＥＣは、細胞質（すなわち、ＤＨＥ）及びミトコンドリア（すなわち、ＭｉｔｏＳｏｘ）Ｏ_２ ^－蛍光の基底レベルを生成し、これはＬＰＳ曝露によって大幅に増強される（図７Ｃ、７Ｄ）。ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、及びＳＵＬ－１５０による前処理（全て１０μＭで３０分間）は、細胞質酸化ストレスの誘発を同等の効果で緩和する（図７Ｃ）。ＳＵＬ－１３８及びＳＵＬ－１５０はまた、ＢＮ－８０９３３による前処理によって影響を受けなかった（図７Ｄ）ミトコンドリアの酸化ストレスのＬＰＳ誘発増加を排除した（図７Ｃ）。

【0157】

これらのデータは、ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、及びＳＵＬ－１５０の全てが特定の抗酸化能力を持っていることを示しているが、その能力は細胞コンパートメント等によって異なる。

【0158】

４ 内皮炎症活性化
内皮細胞は、炎症性サイトカインのベースライン遺伝子発現が低く、エンドトキシンへの曝露により様々な大きさで劇的に増加する（図８Ａ～Ｃ）。ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、及びＳＵＬ－１５０による前処理（全て１０μＭで３０分間）は、炎症誘発性サイトカインＴＮＦα（図８Ａ）のｍＲＮＡ発現の誘発を同等の効果で排除する。特に、ＢＮ－８０９３３によるＨＵＶＥＣの前処置は、インターロイキンＩＬ－１β及びＩＬ－６のＬＰＳ誘発性ｍＲＮＡ発現を排除しないが（図８Ｂ、８Ｃ）、ＳＵＬ－１３８及びＳＵＬ－１５０もＩＬ－１β及びＩＬ－６のＬＰＳ誘発増加を排除した（図８Ａ～８Ｃ）。

【0159】

５ 低体温再加温ストレス後の内皮細胞生存率
異なる作用機序を確認するために、ミトコンドリア損傷のモデルとして内皮細胞を低体温にさらした。４℃で２４時間、その後３７℃で３時間の冷却－再加温サイクルにさらされた内皮細胞は、正常体温の対照細胞と比較して、細胞生存率が大幅に低下した（約６１％）（図８Ｄ）。ＢＮ－８０９３３による前処理は、低体温に関連する細胞生存率の低下に影響を与えないが（約５５％の低下）、ＳＵＬ－１３８及びＳＵＬ－１５０の両方が正常体温の対照細胞の生存率のすぐ下のレベルで、細胞生存率を維持した（約１５％の低下）。これは、ＳＵＬ－１３８及びＳＵＬ－１５０の作用機序がＢＮ－８０９３３とは異なることを示している。

【0160】

考察
ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、及びＳＵＬ－１５０の作用機序を、エンドトキシン誘発性細胞損傷及び低体温再加温ストレスとの関連で調査すると、以下の結論を導き出すことができる。
１．ＢＮ－８０９３３は、ＳＵＬ－１３８又はＳＵＬ－１５０とは異なり、内皮細胞及びマクロファージにおける一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）酵素の一般的な阻害剤である。
２．ＢＮ－８０９３３、ＳＵＬ－１３８、及びＳＵＬ－１５０には、細胞質抗酸化能がある。
３．ＳＵＬ－１３８及びＳＵＬ－１５０にはミトコンドリアの抗酸化能があるが、ＢＮ－８０９３３にはない。
４．ＳＵＬ－１３８及びＳＵＬ－１５０は、全てのＴＮＦα、ＩＬ－１β及びＩＬ－６に対するエンドトキシン誘発性内皮細胞活性化を妨げる。ＢＮ－８０９３３はＴＮＦαのみを阻害した。
５．ＳＵＬ－１３８及びＳＵＬ－１５０は内皮細胞の低体温による再加温損傷を排除するが、ＢＮ－８０９３３はこれを排除しない。

【0161】

まとめると、これらのデータは、ＢＮ－８０９３３及びＳＵＬ化合物が非常に異なる作用機序を持ち、異なる細胞コンパートメントで活性であることを示している。ＢＮ８０９３３は、ＳＵＬ化合物とは対照的に、ミトコンドリアに対して活性がない。

【0162】

結論
実施例は、ＳＵＬ－１３８がマウスにおけるＣＬＰの徴候後２４時間後に剣状突起温度を回復することを示している。ＳＵＬ－１３８による治療は、敗血症誘発後のサイトカインの血漿レベルを低下させる。特に、ＮＧＡＬ及び尿素機能の回復で示されるように、ＣＬＰ誘発性腎機能障害は、マウスにおけるＳＵＬ－１３８による治療によって妨げられるか、又は有意に減少する。

【0163】

実施例はまた、ＳＵＬ－１５１が敗血症のキイロショウジョウバエの死亡率を低下させ、敗血症の誘発後２４時間及び４８時間で走地性を改善することを示している。

【0164】

敗血症の内皮細胞では、ＳＵＬ－１３８はミトコンドリアの機能障害を回復させる。

【0165】

ＢＮ－８０９３３及びＳＵＬ化合物は作用機序が大きく異なり、異なる細胞コンパートメントで活性がある。ＢＮ８０９３３は、ＳＵＬ化合物とは対照的に、ミトコンドリアに対して活性がない。

【0166】

さらなるインビトロ実験は、多くのＳＵＬ化合物が敗血症のインビトロモデルで活性であることを示しており、現在の発見が化合物のグループに適用可能であることを示している。

【0167】

このインビボ及びインビトロ証拠の全体は、本発明によって画定される化合物が敗血症、及び感染誘発性炎症によって引き起こされる臓器機能障害の治療において有効性があることを示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【国際調査報告】