特表2023-529660エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン標的プローブを用いた診断及びモニタリング
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-11
(54)【発明の名称】エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン標的プローブを用いた診断及びモニタリング
(51)【国際特許分類】
A61K 49/14 20060101AFI20230704BHJP
A61K 49/06 20060101ALI20230704BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230704BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20230704BHJP
A61B 5/055 20060101ALN20230704BHJP
【ＦＩ】
A61K49/14
A61K49/06
A61P35/00
C07K7/06 ZNA
A61B5/055 383
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022574846
(86)(22)【出願日】2021-06-04
(85)【翻訳文提出日】2023-02-06
(86)【国際出願番号】 US2021035852
(87)【国際公開番号】W WO2021247967
(87)【国際公開日】2021-12-09
(31)【優先権主張番号】63/034,520
(32)【優先日】2020-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/170,746
(32)【優先日】2021-04-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500429332
【氏名又は名称】ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＳＥ ＷＥＳＴＥＲＮ ＲＥＳＥＲＶＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100128347
【弁理士】
【氏名又は名称】西内 盛二
(72)【発明者】
【氏名】ルー，ジョンロン
(72)【発明者】
【氏名】アヤット，ナディア
(72)【発明者】
【氏名】ホール，ライアン
(72)【発明者】
【氏名】ヴァイディア，アミタ・エム．
(72)【発明者】
【氏名】チアオ，ピーター
【テーマコード（参考）】
4C085
4C096
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085HH01
4C085HH07
4C085KA07
4C085KA09
4C085KB02
4C085KB07
4C085KB11
4C085KB12
4C085KB15
4C085KB37
4C085KB82
4C085LL18
4C096AA03
4C096AA11
4C096AC01
4C096AC04
4C096AC05
4C096AC07
4C096AD14
4C096AD19
4C096BA41
4C096DC22
4C096DC33
4C096FC14
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA14
4H045BA50
4H045CA40
4H045EA51
(57)【要約】
【課題】本開示は、被験者体内の薬剤耐性癌の検出方法について説明する。
【解決手段】被験者の組織と有効量の分子プローブとを接触させ、組織中に存在する分子プローブの量を検出し、検出された分子プローブの量を対照値と比較し、組織中に存在する前記分子プローブの量が対照値よりも高い場合に、被験者体内の薬剤耐性癌を検出する。前記分子プローブは、式Ｐ－Ｌ－Ｃを含み、ＰがＥＤＢ－ＦＮ標的ペプチドであり、Ｃが造影剤であり、Ｌが前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーである。また、本開示は、薬剤耐性癌の治療のモニタリング方法についても説明する。
【選択図】なし
【解決手段】被験者の組織と有効量の分子プローブとを接触させ、組織中に存在する分子プローブの量を検出し、検出された分子プローブの量を対照値と比較し、組織中に存在する前記分子プローブの量が対照値よりも高い場合に、被験者体内の薬剤耐性癌を検出する。前記分子プローブは、式Ｐ－Ｌ－Ｃを含み、ＰがＥＤＢ－ＦＮ標的ペプチドであり、Ｃが造影剤であり、Ｌが前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーである。また、本開示は、薬剤耐性癌の治療のモニタリング方法についても説明する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者体内の薬剤耐性癌の検出方法であって、被験者の組織を、式：Ｐ－Ｌ－Ｃ
（式中、Ｐは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｃは、造影剤であり、
Ｌは、前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーであり、前記リンカーは、前記ペプチドのアミンと共に反応してカルボキサミドを形成するカルボン酸、前記ペプチドのシステイン残基と共に反応してチオエステル結合を形成するマレイミド、又は前記ペプチドのシステイン残基と共に反応してチオエステルを形成するマレイミドを含む。）を含む分子プローブの有効量に接触させること、
前記組織中に存在する前記分子プローブの量を検出すること、
検出された前記分子プローブの量を対照値と比較すること、及び
前記組織中に存在する前記分子プローブの量が前記対照値よりも大きい場合には、前記被験者体内の薬剤耐性癌を検出すること、を含む方法。
【請求項2】
前記癌は、乳癌、口腔癌、膵癌又は前立腺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記分子プローブは、磁気共鳴イメージング剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
インビボで前記組織を接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記分子プローブは、癌に罹患している又は癌罹患の疑いがある被験者に全身投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記分子プローブの非ペプチドリンカーは、非ペプチド脂肪族又はヘテロ脂肪族リンカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記分子プローブの非ペプチドリンカーは、前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合させる場合に、アルキレンジカルボキサミドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記分子プローブの造影剤は、金属キレート剤又は金属フラーレンのうちの少なくとも１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記分子プローブの前記造影剤は、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）又はその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザドデカンテトラアセテート（ＤＯＴＡ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリアセテート（ＤＯ３Ａ）及びその誘導体、
エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン四酢酸（ＴＲＩＴＡ）及びその誘導体、
１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザドデカンテトラメチルアセテート（ＤＯＴＭＡ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリメチルアセテート（ＤＯ３ＭＡ）及びその誘導体、
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラホスホナトメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＰ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアゼシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンメチルホスホン酸）（ＤＯＴＭＰ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンフェニルホスホン酸）（ＤＯＴＰＰ）及びその誘導体、又は、
Ｎ，Ｎ’－エチレンジ－Ｌ－システイン及びその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する金属キレート剤を含む、請求項１の方法。
【請求項10】
前記分子プローブは、下記の式：【化1】
【化2】
Ｌ１は、存在してもしなくてもよいスペーサーであり、
Ｌ２は、前記ペプチドＰ１又は前記スペーサーのアミノ基であり、
Ｍは、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋３、Ｔｍ＋３、Ｄｙ＋３、Ｙｂ＋３、Ｍｎ＋２、Ｆｅ＋３、５５Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９ｍＴＣ、１１１ｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、及び１８８Ｒｅからなる群より選ばれる金属又はその塩である。）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
Ｌ１は、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、共重合（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリフォスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレートのうちの少なくとも１種を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
薬剤耐性癌の治療をモニタリングする方法であって、薬剤耐性癌治療中の被験者の組織を、式：Ｐ－Ｌ－Ｃ
（式中、Ｐは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、
Ｃは、造影剤であり、
Ｌは、前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーであり、前記リンカーは、前記ペプチドのアミンと反応してカルボキサミドを形成するカルボン酸、前記ペプチドのシステイン残基と反応してチオエステル結合を形成するマレイミド、又は前記ペプチドのシステイン残基と反応してチオエステルを形成するマレイミドを含む。）を含む分子プローブの有効量と1回目接触させること、
前記組織中に存在する前記分子プローブの第１の量を検出すること、
前記被験者の組織を、前記式：Ｐ－Ｌ－Ｃを含む分子プローブの有効量と２回目接触させること、
前記組織中に存在する前記分子プローブの第２の量を検出すること、及び
前記分子プローブの前記第１の量と前記第２の量とを比較することにより、前記被験者体内の薬剤耐性癌の治療をモニタリングすること、を含む方法。
【請求項13】
前記癌は、乳癌、口腔癌、膵癌又は前立腺癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記分子プローブは、磁気共鳴イメージング剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
インビボで前記組織を接触させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記薬剤耐性癌は、化学療法剤で治療されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記分子プローブの非ペプチドリンカーは、非ペプチド脂肪族又はヘテロ脂肪族リンカーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
前記分子プローブの非ペプチドリンカーは、前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合させる場合に、アルキレンジカルボキサミドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項19】
前記分子プローブの造影剤は、金属キレート剤又は金属フラーレンのうちの少なくとも１種を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項20】
分子プローブの造影剤は、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）又はその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザドデカンテトラアセテート（ＤＯＴＡ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリアセテート（ＤＯ３Ａ）及びその誘導体、
エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン四酢酸（ＴＲＩＴＡ）及びその誘導体、
１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザドデカンテトラメチルアセテート（ＤＯＴＭＡ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリメチルアセテート（ＤＯ３ＭＡ）及びその誘導体、
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラホスホナトメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＰ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアゼシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンメチルホスホン酸）（ＤＯＴＭＰ）及びその誘導体、
１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンフェニルホスホン酸）（ＤＯＴＰＰ）及びその誘導体、又は、
Ｎ，Ｎ’－エチレンジ－Ｌ－システイン及びその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する金属キレート剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項21】
前記分子プローブは、下記の式：【化3】
【化4】
Ｌ１は、存在してもしなくてもよいスペーサーであり、
Ｌ２は、前記ペプチドＰ１又は前記スペーサーのアミノ基であり、
Ｍは、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋３、Ｔｍ＋３、Ｄｙ＋３、Ｙｂ＋３、Ｍｎ＋２、Ｆｅ＋３、５５Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９ｍＴＣ、１１１ｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、及び１８８Ｒｅからなる群より選ばれる金属又はその塩である。）を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項22】
Ｌ１は、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、共重合（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリフォスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレートのうちの少なくとも１種を含む、請求項２１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
（政府の資金提供）
本出願は、米国国立衛生研究所から授与されたＣＡ２１１７６２及びＣＡ１９４５１８の政府の支援を得て行われた。政府は、本出願における権利を保有している。
本出願は、米国国立衛生研究所から授与されたＣＡ２１１７６２及びＣＡ１９４５１８の政府の支援を得て行われた。政府は、本出願における権利を保有している。
【0002】
（関連出願の相互参照）
この出願は、２０２０年６月４日に出願された米国仮出願第６３／０３４，５２０号、２０２１年４月５日に出願された米国仮出願第６３，１７０，７４６号の優先権を要求し、これらの２つの出願は、参照によってこの記事に組み込まれた。
この出願は、２０２０年６月４日に出願された米国仮出願第６３／０３４，５２０号、２０２１年４月５日に出願された米国仮出願第６３，１７０，７４６号の優先権を要求し、これらの２つの出願は、参照によってこの記事に組み込まれた。
【0003】
（配列表）
この出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表が含まれており、これにより全体が参照されて組み込まれている。２０２１年３月３１日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＣＷＲ－０２９５９３ ＷＯ ＯＲＤ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと呼ばれ、サイズが７８４１バイトである。
この出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表が含まれており、これにより全体が参照されて組み込まれている。２０２１年３月３１日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＣＷＲ－０２９５９３ ＷＯ ＯＲＤ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと呼ばれ、サイズが７８４１バイトである。
【背景技術】
【0004】
癌とは、ＵＳで合成された男女の生死の第２の最も一般的な原因である。癌の早期診断は、正確にパーソナライズ・治療介入を開始し、疾病で診断された患者の生存や品質を向上させるために重要である。また、化学療法や手術では早期に治療が可能であるが、薬剤耐性の発達により、非硬化性である再燃や遠方のメタスタを導入することができる。治療部位において早期に治療効果を非侵襲的に評価することにより、癌のサバイバビリティを高めることができ、ケアのコストを低減することができる。ＰＥＴ－ＣＴ、ＭＲＩ、超音波のような血液マーカやイメージングモダリティは、疾患の診断や評価に一般的に用いられているが、薬剤耐性腫瘍及び感受性腫瘍を区別することはできない。
【0005】
エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン（Ｅｘｔｒａｄｏｍａｉｎ－Ｂ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ；ＥＤＢ－ＦＮ）は、フィブロネクチンの癌胚イソフォームである。この細胞外マトリックスオンコタンパク質は、大腸癌を含むＮＥＯＰ－ＳＭＳのｐＥＲＡに有意に増殖しており、腫瘍攻撃性を反映した上皮間質転換（ＥＭＴ）、癌細胞の蒸れ、増殖、血管新生、転移に関連している。臨床研究では、肺癌、脳癌、大腸癌、卵巣癌の患者において、ＥＤＢ－ＦＮの存在が示されている。また、ＥＤＢ－ＦＮの過剰発現は、乳腺腫瘍の組織学的勾配にも相関しており、口腔癌患者の生存が悪く、複数のネットのマーカーとしての役割を示唆している。
【0006】
複雑さの別の層は、ＥＤＢ－ＦＮ発現プロファイルは、同じ癌タイプでも異なっており、細胞又は組織の分子及び機能特性に特異性を有する。例えば、ＥＤＢ－ＦＮ特異的なペプチドプローブＺＤ２－Ｃｙ５．５を用いて、本発明者らは、浸潤的な癌細胞株、例えば、ＬＮＣａＰ（前立腺）及びＭＣＦ７（ホルモン受容体陽性乳癌）は、ＥＤＢ－ＦＮレベルが有意に低い。このＥＤＢ－ＦＮの特異的な発現を利用し、ＥＤＢ－ＦＮ－標的ＭＲＩ造影剤、特にＭＴ２１８［ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）］を用いて、非浸潤的な異種移植片と区別させるように、浸潤性前立腺癌及び乳癌腫瘍を診断した。しかし、薬剤耐性の非侵襲的な評価、治療反応のモニタリング、薬剤耐性癌の積極的なモニタリングが依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
発明者らは、浸潤性の高い大腸癌（ＣＲＣ）細胞及び腫瘍において、ＥＤＢ－ＦＮが過剰発現していると判断した。これにより、ＭＴ２１８を用いてＥＤＢ－ＦＮを行ったＭＲＭＩは，薬剤耐性ＣＲＣ異種移植モデルの効果的で非侵襲的な検出と鑑別診断を促進することができる。また、ＭＴ２１８によるＭＲＭＩは、ＭＫ２２０６．ＨＣｌ、パクリタキセル等を含む標的薬物の薬剤耐性ＣＲＣ腫瘍に対する治療効果をモニタリングするためにも使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【0008】
一態様では、本発明は、被験者体内の薬剤耐性癌の検出方法を提供する。該方法は、被験者の組織と、前記一般式Ｐ－Ｌ－Ｃからなる分子プローブの有効量とを接触させる工程を含み、ここで、Ｐは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり；Ｃは、造影剤であり；及びＬは、前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーであり、前記リンカーは、前記ペプチドのアミンとカルボキサミドを形成するカルボン酸と、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステル結合を形成するマレイミドと、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステルを形成するマレイミドを含み、前記組織中に存在する前記分子プローブの量を検出することと、検出された前記分子プローブの量と対照値とを比較することと、及び前記組織中に存在する前記分子プローブの量が前記対照値よりも多い場合には、前記被験者体内の薬剤耐性癌を検出することとの工程を含む。
【0009】
また、別の態様では、本発明は、薬剤耐性癌の治療をモニタリングする方法を提供する。該方法は、薬剤耐性癌治療中の被験者の組織と、式Ｐ－Ｌ－Ｃからなる分子プローブの有効量とを初めて接触させ、ここで、Ｐは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり；Ｃは、造影剤であり；及びＬは、前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーであり、前記リンカーは、前記ペプチドのアミンとカルボキサミドを形成するカルボン酸と、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステル結合を形成するマレイミドと、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステルを形成するマレイミドを含み、前記組織中に存在する前記分子プローブの第１の量を検出することと、薬剤耐性癌治療中の被験者の組織と、式Ｐ－Ｌ－Ｃからなる分子プローブの有効量とを第２回目で接触させることと、前記組織中に存在する前記分子プローブの第２の量を検出することと、及び前記分子プローブの前記第１の量と前記第２の量とを比較することにより、前記被験者体内の薬剤耐性癌の治療をモニタリングすることとの工程を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、前記癌は、乳癌、口腔癌、膵癌、前立腺癌である。他の実施形態では、生体内で前記組織を接触させる。また、追加の本実施形態では、前記薬剤耐性癌は、化学療法剤で治療されている。
【0011】
いくつかの実施形態では、前記分子プローブは、磁気共鳴イメージング剤である。追加の実施形態では、前記分子プローブの非ペプチドリンカーは、非ペプチド脂肪族又はヘテロ脂肪族リンカーである。他の実施形態では、前記分子プローブの非ペプチドリンカーは、前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合させる際に、アルキレンジカルボキサミドを含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、前記分子プローブの造影剤は、金属キレート剤又は金属フラーレンの少なくとも１種を含む。他の実施形態では、前記分子プローブの前記造影剤は、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）又はその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザドデカンテトラアセテート（ＤＯＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリアセテート（ＤＯ３Ａ）及びその誘導体、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン四酢酸（ＴＲＩＴＡ）及びその誘導体、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザドデカンテトラメチルアセテート（ＤＯＴＭＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリメチルアセテート（ＤＯ３ＭＡ）及びその誘導体、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラホスホナトメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＰ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアゼシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンメチルホスホン酸）（ＤＯＴＭＰ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンフェニルホスホン酸）（ＤＯＴＰＰ）及びその誘導体、又は、Ｎ，Ｎ’－エチレンジ－Ｌ－システイン及びその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する金属キレート剤を含む。
【0013】
前記分子プローブは、下記の式
又は、
を有し、ここで、Ｐ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであり；Ｌ１は、任意のスペーサーであり；Ｌ２は、前記ペプチドＰ１又は前記スペーサーのアミノ基であり；Ｍは、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋３、Ｔｍ＋３、Ｄｙ＋３、Ｙｂ＋３、Ｍｎ＋２、Ｆｅ＋３、５５Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９ＭＴＣ、１１１Ｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅからなる群より選ばれる金属又はその塩である。
【化1】
【化2】
【0014】
他の実施形態では、Ｌ１は、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、共重合（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリフォスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレートのうちの少なくとも１種を含む。
【図面の簡単な説明】
【0015】
本明細書の一部を構成する添付図面は、発明のいくつかの実施形態を示すものであり、発明の原理を説明するためのものである。
【0016】
【図1A-1H】獲得性薬剤耐性は、ＣＲＣ細胞の遊走及び浸潤を増強することを示す画像である。Ａ．親ＤＬＤ１細胞による５’－ＦＵの獲得性薬剤耐性を有するＤＬＤ１－ＤＲ細胞における２Ｄ単層及び３Ｄ腫瘍スフェロイド培養物の形態学的変化。Ｂ．親ＲＫＯ細胞による５’－ＦＵ及びＣＢ－８３９の獲得性薬剤耐性を有するＲＫＯ－ＤＲ細胞における２Ｄ単層及び３Ｄ腫瘍スフェロイド培養物の形態学的変化。タンパク質ブロッティングとｑＲＴ－ＰＣＲのタンパク質及びｍＲＮＡレベルでのＣ． Ｄ． ＤＬＤ１－ＤＲ及びＥ． Ｆ． ＲＫＯ－ＤＲ細胞における薬剤耐性マーカータンパク質ＭＤＲ１の発現の増加とＥＭＴマーカーＮ－ｃａｄ及びＥ－ｃａｄのレベルの変化をそれぞれ使用する。タンパク質ブロットバンド強度は、アクチン対照に基づき正規化され、タンパク質レベルの変化は、それぞれのレーンに隣接する感受性と耐性の比率として表されている。親細胞と比較して、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ測定法を用いて薬剤耐性Ｇ． ＤＬＤ１－ＤＲ及びＨ． ＲＫＯ－ＤＲ細胞におけるマトリゲルによる浸潤及び遊走の増加を測定した。細胞は、０．１％結晶性紫で染色した。棒グラフは、平均値±ｓｅｍを示している。ペアなしｔで検定し、＊ｐ＜０．０５である。スケールゲージ＝１００μｍ。
【0017】
【図2A-2F】獲得の薬剤耐性を、ＣＲＣ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ式に対応付けたことを示すグラフ及び画像である。３Ｄマトリゲル中で培養したＣＲＣ細胞を、ＥＤＢ－ＦＮ特定ペプチドプローブＺＰ２－Ｃｙ５．５、核染色剤Ｈｏｅｃｈｓｔで染色した。２Ｄ単層培養物で増殖したＣＲＣ細胞を、ＲＮＡ抽出及びｍＲＮＡ発現のＱＲＴ－ＰＣＲ解析のために採取した。ＤＬＤ－１細胞と比較して、耐性ＤＬＤ１－ＤＲ細胞はＡを示した。ＺＤ２－Ｃｙ５．５結合の増加、Ｂ． ＥＤＢ－ＦＮ及びＣ． ＦＮ１のｍＲＮＡレベルを３倍に高めた。ＲＫＯ細胞と比較して、耐性ＲＫＯ－ＤＲ細胞は、Ｄ． ＺＤ２－Ｃｙ５．５結合の増加、Ｅ． ＥＤＢ－ＦＮ及びＦ．ＦＮ１のｍＲＮＡレベルは、４倍と１．５倍に増加した。棒グラフは、平均値±ｓｅｍを示している。ペアなしｔで検定し、＊ｐ＜０．０５である。スケールゲージ＝１００μｍ（１００ｘ）と５０μｍ（２００ｘ）。
【0018】
【図3A-3J】ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮの造影ＭＲＭＩは、ＣＲＣ腫瘍の薬剤耐性の非侵襲的な評価に役立ったことを示すグラフ及び画像である。ＣＲＣ異種移植マウスにＭＴ２１８の４０μｍｏｌ／ｋｇ用量を注射した前後（２５分）にＴ１強調ＦＳＥ冠状断（ｃｏｒｏｎａｌ）像及び軸位断（ａｘｉａｌ）像を得た。ＭＲＩの代表的な冠状断像及び軸位断像表示は、非耐性ＤＬＤ－１及びＲＫＯ腫瘍と比較して、Ａ－Ｂであった。ＤＬＤ１－ＤＲ及びＣ－Ｄ． ＲＫＯ－ＤＲ腫瘍の固体シグナル増強（白い矢印：腫瘍）。薬剤耐性Ｅ－Ｆ． ＤＬＤ１－ＤＲ及びＧ－Ｈ． ＲＫＯ－ＤＲ腫瘍は、それぞれＤＬＤ－１及びＲＫＯ腫瘍に対して有意に高いＣＮＲを示した。（ｎ＝各群５匹のマウス）。棒形は、平均値±ｓｅｍを表し、点は、個々のマウスＣＮＲを表している。ペアなしｔで検定し、＊ｐ＜０．０５である。解剖後の組織学的に低分化のＨ＆Ｅによる有糸分裂活性細胞、及び薬剤耐性Ｉを示した。ＤＬＤ１－ＤＲ及びＪ．ＲＫＯ－ＤＲ腫瘍切片におけるそれぞれの非薬剤耐性対応物よりも強い抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体Ｇ４の染色（赤色及び黒色の矢印は、それぞれ腫瘍細胞及び線維芽細胞におけるＥＤＢ－ＦＮを示す）。
【0019】
【図4A-4C】薬剤耐性ＤＬＤ１－ＤＲホルママウスにおける治療レジメンのタイムラインと治療効果の非侵襲的なモニタリングを示すグラフである。薬剤耐性ＤＬＤ１－ＤＲ腫瘍皮下を胸腺ｎｕ／ｎｕ雌マウスの側腹に移植した。腫瘍の体積は、毎週マーカーでモニタリングされた。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達すると、ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮベースラインＭＲＭＩが第１週に行われる。マウスは、ＤＭＳＯ処理の「ビークル」群とＭＫ２２０６処理の「処理」群にランダムに分類した。第４週では、ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮに対する終点ＭＲＭＩを行い、実験を終了した。Ｂ．各群の平均腫瘍体積は、第１週から第４週に増加した。Ｃ．第１週から第４週にかけて、ビークル群及び治療群の単一マウス（番号ＴＭ１－ＴＭ１０）の腫瘍体積が徐々に増加した（ｎ＝各群の５匹のマウス）。棒形は、平均値±ｓｅｍを表し、点は、個々のマウスの腫瘍体積を表している。ペアなしｔで検定し、＊ｐ＜０．０５である。
【0020】
【図5A-5E】ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩは、薬剤耐性ＣＲＣ腫瘍を運ぶビークル治療マウスの非侵襲的な治療モニタリングに寄与することを示すグラフ及び画像である。ＤＭＳＯで処理したＤＬＤ１ ＤＲマウスでは、ＭＴ２１８の４０μｍｏｌ／ｋｇ用量でＡ．ベースライン（第１週）とＢ．エンドポイント（第４週）で行ったＭＲＭＩのＴ１強調２Ｄスピンエコー軸位断像（ＴＭ：ビークル群における単一マウスの番号）。ＭＴ２１８の注射前と注射後２５分で撮影。Ｃ．１週目と４週目の個々のマウスのＣＮＲをプロットした。Ｄ．キャリア群の平均ＣＮＲは、第１週から第４週において有意に変化しなかった。Ｅ．４週間後に行われた解剖組織学は、分化が悪いＤＬＤ１－ＤＲ腫瘍切片を示した。 抗ＥＤＢ－ＦＮ抗体Ｇ４の免疫組織化学は、ＴＭ３がＴＭ１０よりも強く染色された（ｎ＝各群の５匹のマウス）ことを示した。棒形は、平均値±ｓｅｍを表し、点は、個々のマウスの腫瘍体積を表している。ペアなしｔで検定し、＊ｐ＜０．０５である。
【0021】
【図6A-6E】図６Ａ～６ Ｅは、ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩは、ＭＫ２２０６ ＨＣｌ処理に耐性ＣＲＣ腫瘍を運ぶマウスの非侵襲的な治療モニタリングに寄与することを示すグラフ及び画像である。１００ｍｇ／ｋｇ ＭＫ２２０６ ＨＣｌで処理したＤＬＤ１ ＤＲマウスにおいて、ＭＴ２１８の４０μｍｏｌ／ｋｇ用量でＡ．ベースライン（第１週）とＢ．エンドポイント（第４週）は、行われたＭＲＭＩのＴ１強調２Ｄスピンエコー軸位断像（ＴＭ：ビークル群の個々のマウスの番号）を示す。ＭＴ２１８の注射前と注射２５分後に画像を撮影した。Ｃ．１週目と４週目の個々のマウスのＣＮＲをプロットした。Ｄ．治療群の平均ＣＮＲは、第１週から第４週まで有意に増加した。Ｅ．４週間後に行われた解剖組織学は、分化が悪いＤＬＤ１－ＤＲ腫瘍切片を示した。抗ＥＤＢ ＦＮ抗体Ｇ４の免疫組織化学は、ＴＭ７がＴＭ９よりも強く染色された（ｎ＝各群の５匹のマウス）ことを示した。棒形は、平均値±ｓｅｍを表し、点は、個々のマウスの腫瘍体積を表している。ペアなしｔで検定し、＊ｐ＜０．０５である。
【0022】
【図7A-7F】ヒト大腸腺癌においてＥＤＢ－ＦＮを過剰発現させ、生存不良に相関した場合のグラフ及び画像を示すである。ＥＤＰ－ＦＮ特異的抗体Ｇ４を用いた免疫組織化学染色は、Ａ．未治療患者とＢ．治療患者からの代表的な原発性大腸腺癌組織ではＥＤＢ－ＦＮ発現が強いが、対応する正常隣接組織（ＮＡＴ）ではＥＤＢ－ＦＮ発現は無視される。代表的な転移性肝臓標本の免疫組織化学染色は、Ｃ． 未治療患者と Ｄ． 治療した患者ではＥＤＢ－ＦＮ発現が異なり、治療した患者ではＥＤＢ－ＦＮ発現が異なり，対応する正常隣接肝組織（ＮＡＴ）には発現はなかったことを示した。黒と赤の矢印は、それぞれ線維芽細胞と腫瘍細胞を示している。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線は、高ＥＤＢ－ＦＮレベルが大腸腺癌患者の不良総生存率（ＯＳ）と望ましくない無進行生存率（ＰＦＳ）と関連していたことを示す。Ｅ．不良総生存率（ＯＳ）とＦ．不良無進行生存率（ＰＦＳ）相関（対数ランク検定、すなわちＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定を用いて、ＯＳの危険比＊ｐ＝０．０１８と＊ｐ＝０．０２、ＰＦＳの危険比＊ｐ＝０．０２５と＊ｐ＝０．０２８）。
【0023】
【図8A-8H】浸潤性乳癌におけるＥＤＢ－ＦＮの過剰発現を示すグラフ及び画像である。Ａ．ＴＣＧＡ及びＧＴＥＸデータベースから患者データに対して行った差動遺伝子発現解析は、通常の乳房組織サンプル（ＮＯＲ、Ｎ＝２９１）と比較して、乳腫瘍サンプル（ＢＲＣＡ、ｎ＝１０８４）におけるＥＤＢ－ＦＮのイソフォーム（ＥＮＳＴ０００００４３２０７．６）の過剰発現を示す。ブロック図は、分散分析、＊ｐ＝６．５７ｅ－６９ を使用して、１００万値あたりのｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）転写物と四分位数範囲の中央値を表した。Ｂ．Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線は、ＥＤＢ－ＦＮ発現乳癌患者の全体的な生存分析を示す（＊ｐ＜０．０５；対数ランク検定、すなわちＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定を用いて、危険比の＊ｐ＝０．０２２）。Ｃ．原発性乳房腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮの免疫組織化学染色パターンは、線維芽細胞（緑）、癌細胞（紫）及び腫瘍マトリックス（赤）における発現を示す。正常隣接組織（ＮＡＴ）、Ｅ．リンパ節転移及びＦ．肺及び脳転移と比べて、患者１と２のＤ． 乳房腫瘍では強いＥＤＢ－ＦＮ染色が認められた。ホルモン受容体陽性ＭＣＦ７細胞と比較して、Ｇ．ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、三陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＢＴ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡレベルの有意な上昇を示した。１８Ｓ表現を標準として採用。棒形は、平均値±ｓｅｍ（ｎ＝３）を表した。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、＊＊ｐ＝０．００１３を使用した。Ｈ．ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイにより乳癌細胞株の異なるサブタイプの浸潤ポテンシャルを比較した。ＥＤＢ－ＦＮ過発現三陰性癌細胞はＥＤＢ－ＦＮの低いＭＣＦ７細胞よりも浸潤性であり、マトリガーコーティングされたｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓによって浸潤する結晶性紫染色の細胞数の増加が示された。
【0024】
【図9A-9E】ＴＧＦ－β治療及び薬剤耐性を有する乳癌細胞における改変された特徴を示す画像及び増強された遊走を示す画像である。ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βで７日間培養し、ＭＣＦ７－ＴＧＦ－β及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦ－β細胞をそれぞれ得た。ＭＣＦ７－ＤＲ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞は、それぞれ５００ｎＭパボキシニ（Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ）及び１００ｎＭパクリタキセルに対する耐性を誘導することによって得られる。Ａ．２Ｄ培養では、ＭＣＦ７－ＴＧＦβ及びＭＣＦ７－ＤＲ細胞は、親株と比較して明らかな形態学的変化を示し、より多くの間充填表現型を有し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞は、目に見える形態学的変化を示さなかった。Ｂ．３Ｄマトリックスゲル培養では、ＭＣＦ７－ＴＧＦβ及びＭＣＦ７－ＤＲ細胞は、それぞれの親細胞と比較してスフェロイドを形成する能力の増強を示し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞は、同様の増殖ネットワークを形成する。ＥＭＴマーカー物のタンパク質ブロット分析は、親ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞と比較して、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＳｌｕｇがそれぞれＣ．ＭＣＦ７－ＴＧＦβ及びＭＣＦ７－ＤＲ及びＤ．ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞におけるタンパク質発現であったことを示した。Ｅ．ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイは、ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有するＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のより高い浸潤ポテンシャルを示し、結晶性紫染色による遊走細胞の数の増加によって実証された。スケールゲージ＝１００μｍ。
【0025】
【図10A-10F】ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有する乳癌細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ増加の発現量を示すグラフ及び画像である。Ａ．乳癌細胞の３Ｄ培養物のＺＤ２－Ｃｙ５．５染色は、親ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞と比較して、Ａ．ＭＣＦ７－ＴＧＦ－βとＭＣＦ７－ＤＲ及びＢ．ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦ－βとＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲを有意に増加させた。ＥＤＢ－ＦＮに結合したＺＤ２ペプチドは、ＦＩＪＩにおいて、Ｈｏｅｃｈｓｔの画素強度に対するＺＤ２－Ｃｙ５．５の画素強度の比として定量化され、親ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞と比較して、Ｃ．ＭＣＦ７－ＴＧＦ－βとＭＣＦ７－ＤＲ及びＤ．ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦ－β及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮレベルの増加を示す。バーは、平均値±ｓｅｍを表し、ポイントは、独立した繰り返しサンプルを表した。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して、＊ｐ＜０．０５である。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析では、親ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞と比較して、ＥＤＢ－ＦＮがそれぞれＥ．ＭＣＦ７－ＴＧＦβ及びＭＣＦ７－ＤＲ及びＦ．ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞におけるｍＲＮＡ発現の有意な増加を示す。ドットは、３つの独立した実験からの３つの技術サンプルを表し、ラインは、平均値±ｓｅｍである。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して、＊ｐ＜０．０５である。スケールゲージ＝１００μｍ。
【0026】
【図11A-11H】ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有する浸潤性乳癌細胞におけるＡｋｔの治療用アブレーション、浸潤及びＥＤＢ－ＦＮの過剰発現が低減されていることを示すグラフ及び画像である。Ａ．ＴＧＦ－β処理及び薬剤耐性は、ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞におけるリン酸化ＡＫＴシグナル伝達及びＳＲｐ５５のリン酸化を増加させた。Ｂ．ＡＫＴ阻害剤ＭＫ２２０６－ＨＣｌ（ＭＣＦ７細胞では２μＭ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞では４μＭ）で２日間細胞を処理し、浸潤性乳癌細胞株におけるＡＫＴリン酸化シグナル伝達を抑制した。ＭＫ２２０６－ＨＣｌを介したリン酸化ＡＫＴシグナル伝達の枯渇は、ＥＤＰ－ＦＮエクトンを含むＳＲｐ５５の潜在的な役割を示唆するＳＲｐ５５の増加を減少させる。ＭＫ２２０６－ＨＣｌによるリン酸化ＡＫＴシグナル伝達の阻害は、浸潤的Ｃ．ＭＣＦ７及びＤ．ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞誘導体の浸潤ポテンシャルの低下、ならびにＥ．及びＦ．ｍＲＮＡレベル及びＧ．及びＨ．３Ｄ培養におけるＥＤＢ－ＦＮの発現の低下を示した。ドットは、３つの独立した実験から２つの技術サンプルを表し、ラインは、平均値±ｓｅｍである。Ｇ～Ｈ．ＥＤＢ－ＦＮに結合したＺＤ２ペプチドは、ＦＩＪＩにおいて、Ｈｏｅｃｈｓｔの画素強度に対するＺＤ２－Ｃｙ５．５の画素強度の比として定量化される。バーは、平均値±ｓｅｍを表し、ポイントは、独立した繰り返しサンプルを表している。
【0027】
【図12A-12G】ＴＧＦ－βで処理された薬剤耐性を有する乳癌細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ及びＳＲｐ５５の枯渇は、浸潤を抑制していることを示す画像である。ＴＧＦ－βで処理した耐性ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、１００ ｎＭ［ｓｉＲＮＡ］和Ｎ／Ｐ＝１０的ＥＣＯ／ｓｉＮＣ（ｓｉＮ）及びＥＣＯ／ｓｉＥＤＢ（ｓｉＥ）和ＥＣＯ／ｓｉＳＲＳＦ６（ｓｉＳ）ナノ粒子治療した。Ａ．ＥＤＢ－ＦＮ及びＳＲＳＦ６のノックダウンは、ＥＤＢ－ＦＮ発現及びＳＲｐ５５レベルの低下をもたらし、ＴＧＦ－βで処理された、薬剤耐性を有する浸潤性Ｂ．ＭＣＦ７及びＣ．ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の浸潤ポテンシャルを低減した。浸潤的なＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞Ｄ．をＭＫ２２０６－ＨＣｌで処理し、ＥＤＢ－ＦＮ発現及びＥ．浸潤を減少させた。これらのＭＫ２２０６で処理された細胞におけるＴＧＦ－βの過剰発現は、ＥＤＢ－ＦＮの発現及びこれらの細胞の浸潤ポテンシャルを救った。浸潤的なＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞Ｄ．をＭＫ２２０６－ＨＣｌで処理し、ＥＤＢ－ＦＮ発現及びＥ．浸潤を減少させた。これらのＭＫ２２０６で処理された細胞におけるＴＧＦ－βの過剰発現は、ＥＤＢ－ＦＮの発現及びこれらの細胞の浸潤ポテンシャルを救った。浸潤的なＭＣＦ７－ＤＲ細胞ＦをＭＫ２２０６－ＨＣｌで処理し、ＥＤＰ－ＦＮ発現とＧ．浸潤を減少させた。ＴＧＦ－βは、これらのＭＫ２２０６で処理された細胞における過剰発現がＥＤＢ－ＦＮの発現又はその浸潤的可能性を救わない。スケールゲージ＝１００μｍ。
【0028】
【図13A-13D】ヒト組織中のＥＤＢ－ＦＮに対するＥＤＢ－ＦＮ特異的Ｇ４抗体による免疫組織化学染色を示す画像である。（ａ）正常舌試料中では弱い（ｎ＝３）、（ｂ）未治療の原発性ＯＳＣＣ試料では強い（ｎ＝７）、（ｃ）ＯＳＣＣ転移試料では強い（ｎ＝２）、（ｄ）新規補助原発性ＯＳＣＣ試料では中程度（ｎ＝４）。全パネルのスケールは、２００μｍである。
【0029】
【図14A-14B】（ａ）２Ｄ及び３Ｄ培養で増殖した細胞（ｎ＝３）がＨＳＣ３及びＳＣＣ４細胞において高リスク特性を示したが、ＣＡＬ２７細胞には示さなかったことを示している。（ｂ）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ移行及び浸潤試験（ｎ＝３）は、ＨＳＣ３及びＳＣＣ４細胞に対する高い浸潤ポテンシャルを確認したが、ＣＡＬ２７細胞は存在しなかったことを示す画像である。
【0030】
【図15A-15E】（ａ）ＱＲＴ－ＰＣＲ ｍＲＮＡの分析（ｎ＝３）及び（ｂ）タンパク質ブロット分析（ｎ＝３）は、浸潤的ＨＳＣ３及びＳＣＣ４細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの違いと発現の増加を明らかにした。（ｃ）ＥＤＢ ＦＮ特異性ＺＤ２－Ｃｙ５．５（ｎ＝３）スフェロイドのペプチド結合に関する研究は、ＨＳＣ３及びＳＣＣ４スフェロイドにおける強い染色を示したが、ＣＡＬ２７スフェロイドには存在しなかった。共焦点画像を定量化したところ、（ｄ）大きなスフェロイド、（ｅ）ＨＳＣ３、ＳＣＣ４スフェロイドでは、そのＥＤｂ－ＦＮ発現量に応じて強いＺＤ２－Ｃｙ５．５染色が認められた。データは、一方向ＡＮＯＶＡ（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びＦｉｓｈｅｒの少なくとも有意差後試験（※、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊、Ｐ＜０．００１、Ｎ．Ｓ．Ｓ、Ｐ＞０．０５）で解析したことを示すグラフ及び画像である。
【0031】
【図16A-16C】（ａ）ＭＴ２１８対ＣＡＬ２７腫瘍（ｎ＝５）の増強は、ガドテルデロール（ｇａｄｏｔｅｒｉｄｏｌ）よりもわずかに低かった。（ｂ）ＭＴ２１８によるＨＳＣ３腫瘍（ｎ＝４）の増強は、ガドテリドールよりもわずかに高かった。（ｃ）ＭＴ２１８によるＳＣＣ４腫瘍（ｎ＝４）の増強は、ガドテリドールよりも有意に高かった。ＭＴ２１８及びガドテリドールの投与量は、それぞれ０．０４ｍｍｏｌ／ｋｇ及び０．１０ｍｍｏｌ／ｋｇであったことを示す画像である。
【0032】
【図17A-17I】造影性腫瘍のＣＮＲ解析において、（ａ）ＥＤＢ－ＦＮ発現によれば、ＭＴ２１８はＣＡＬ２７、ＨＳＣ３及びＳＣＣ４腫瘍の増強に有意差を有し、（ｂ）３つのモデル間のガドテリドールの増強に差はなかった。 ＭＴ２１８の増強（ｃ）は、ＣＡＬ２７腫瘍では一般的にガドテリドールよりも低く、（ｄ）ＨＳＣ３腫瘍では一般的にガドテリドールよりも高く、（ｅ）ＳＣＣ４腫瘍ではガドテリドールよりも有意に高かった。ＭＴ２１８被験者の最大ＣＮＲ増強（ｆ）は、ＣＡＬ２７腫瘍においてガドテリドール（ｐ＝０．０９５７）よりわずかに低く、（ｇ）ＨＳＣ３腫瘍ではガドテリドール（ｐ＝０．０６３９）よりわずかに高く、（ｈ）ＳＣＣ４腫瘍ではガドテリドールよりも有意に高かった。（ｆ－ｈ）一致するマウスごとのデータを実線で結ぶオープン点と、点線で接続された実線点でキューの平均値を表す。（ｉ）ＭＴ２１８によるＥＤＢ－ＦＮ発現により、３つの腫瘍モデル間の平均最大ＣＮＲ増強は有意に異なるが、ガドテリドールは用いなかったことを示すグラフである。双方向分散分析（Ｔｗｏ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とフィッシャー最小有意差事後検定（ａ－ｅ，ｉ）とペアなしｔ（ｆ－ｈ）でデータを検定し、解析した（＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．，ｐ＞０．０５）。
【0033】
【図18】ＯＳＣＣ異種移植片のＨ＆Ｅ染色（左側、ｎ＝３）は、分化の種々の形態特徴と段階を示す画像である。また、ＥＤＢ－ＦＮ特異的Ｇ４抗体（右、Ｎ＝３）によるＥＤＢ－ＦＮの免疫組織化学は、ＣＡＬ２７、ＨＳＣ３、及びＳＣＣ４腫瘍の上皮領域において、それぞれ、弱い、中程度、強染色を示した。スケールバーは、Ｈ＆Ｅ画像用６００μｍ、免疫組織化学画像用２００μｍである。
【0034】
【図19A-19C】標的造影剤ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＭＴ２１８）の構造（Ａ）、結合親和性測定（Ｂ）及び緩和性（Ｃ）が提供される。
【0035】
【図20A-20C】ヒト膵臓癌（Ａ）、癌前膵上皮内腫症（ＰａｎＩＮ）（Ｂ）及び正常膵臓組織（Ｃ）で１０ｘ（スケール：２００ μｍ）の倍率でＺＤ２－Ｃｙ５．５（赤）及びＤＡＰＩ（青）で染色したエクストラドメイン－Ｂフィブロネクチンで発現した蛍光共焦点画像を提供する。
【0036】
【図21A-21C】ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ（ＢｘＰＣ３）、Ｃａｐａｎ－１及びＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－Ｌｕｃ（ＰＡＮＣ－１）ヒトＰａＣａ細胞におけるエクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）のタンパク質ブロットは、密度定量（Ａ）、ＰａＣａ細胞由来の腫瘍異種移植片（Ｂ）と、（ＮＡＣ）Ｇ４抗－ＥＤＢ－ＦＮモノクローナル抗体を有し、有しないＰａＣａ異種移植片におけるＥＤＢ－ＦＮの免疫組織化学染色（Ｃ、スケール２００μｍ、倍率１０倍）。また、腫瘍検体の正常組織及びヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のウェスタンブロットを参考として示した。
【0037】
【図22】ＭＴ２１８（ｎ＝７）又はＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＧＴＤＬ）（ｎ＝５）を注射する前と後の異なる時点でＣａｐａｎ－１側腹異種移植片を有するマウスの代表的なＴ１強調２ＤスピンエコーＭＲ像が提供され、対応する差分画像（造影後マイナス造影前）が造影前画像に覆われている。減影画像における腫瘍シグナルの変化が大きい領域は白／赤で表され、腫瘍シグナルの変化が小さい領域は黒／青で表されている。腫瘍は、白い矢印でマークされ、スケールは、５ｍｍである。
【0038】
【図23A-23B】ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ膵臓内腫瘍を移植したマウスの生物発光像（Ａ）を提供した。ＭＴ２１８又はＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＧＴＤＬ）の０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ注射の前後の異なる時点で、膵内腫瘍の代表的なＴ１強調２ＤスピンエコーＭＲ像と、事前比較画像にオーバーレイされた対応する減影画像（ｎ＝３）。スケールは、５ｍｍである（Ｂ）。矢印は膵臓内のＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ－ＰａＣａ腫瘍へ指す。
【0039】
【図24A-24B】ＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－Ｌｕｃ膵内腫瘍を移植したマウスの生物発光画像（Ａ）と、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ ＭＴ２１８又はＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＧＴＤＬ）を注入する前及び後の１０分間の膵臓内腫瘍の代表的なＴ１強調２ＤスピンエコーＭＲ像（ｎ＝６）と、造影前画像上に覆われた差分画像を提供する。スケールは、５ｍｍである（Ｂ）。腫瘍の位置は、矢印でマークされた。
【0040】
【図25A-25C】ＭＴ２１８又はＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（キトノール）の注射前後の異なる時点におけるＭＲＩ画像から計算されたＣａｐａｎ－１側腹異種移植片（Ａ）、ＢｘＰＣ－ＧＦＰ－Ｌｕｃ膵臓腫瘍（Ｂ）及び肝臓の対照雑音比（ＣＮＲ）が提供される。ＭＴ２１８及びＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ガドテリドール）の注射前後で得られたＭＲＩ画像から算出したＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－Ｌｕｃ膵臓内のＰａＣａ腫瘍のＣＮＲ（Ｃ）＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５であった。
【0041】
【図26A-26C】前立腺癌細胞の性状を示す画像である。ＬＮＣａＰ－ＣＸＣＲ２、Ｃ４－２及びＣ４－２－ＤＲ細胞は、Ａ．低リスクＬＮＣａＰ細胞と比較して、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングによるトランスウェルインサートの浸潤性の増加、Ｂ．ＥＭＴマーカーＮ－カドヘリンの発現の増加、及びＣ．ＥＤＢ－ＦＮ特異的ＺＤ２－Ｃｙ５．５ペプチドプローブで染色した３Ｄ培養におけるＥＤＢ－ＦＮの発現増強を示した。
【0042】
【図27A-27B】ＭＴ２１８のＥＤＢ－ＦＮの造影増強ＭＲＭＩは、０．０４ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ用量を使用して前立腺癌の非侵襲的な評価に寄与することを示すグラフ及び画像である。Ｔ１強調２Ｄスピンエコー軸位断像は、ＭＴ２１８を無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスに注入する２０分前と後に得られた。ＬＮＣａＰ－ＣＸＣＲ２、Ｃ４－２及びＣ４－２－ＤＲ異種移植片は、低リスクＬＮＣａＰ腫瘍と比較して、Ａ．堅牢なシグナル増強及びＢ．高いＣＮＲを示した。
【0043】
【図28A-28D】ＭＴ２１８のＥＤＢ－ＦＮの造影増強ＭＲＭＩは、０．０４ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ用量を使用して、浸潤性薬剤耐性前立腺癌の鑑別診断に役立つことを示すグラフ及び画像である。ＰＣ３－ＤＲ細胞は、Ａ．Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングによるｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓの浸潤減少を示し，Ｂ．ＥＤＢ－ＦＮ特異的ＺＤ２－Ｃｙ５．５ペプチドプローブで染色した３Ｄ培養におけるＥＤＢ－ＦＮの発現が低下した。Ｔ１強調２Ｄスピンエコー軸位断像は、ＭＴ２１８を無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスに注入する２０分前と後に得られた。ＥＤＢ ＦＮが豊富な浸潤性ＰＣ３異種移植片は、浸潤性の小さいＰＣ３－ＤＲ腫瘍と比較して、Ｃ．堅牢なシグナル増強とＤ．高いＣＮＲを示した。
【0044】
【図29A-29D】ＭＴ２１８の０．０４ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ用量を使用したＥＤＢ－ＦＮの造影増強ＭＲＭＩは、前立腺癌の非侵襲的なアクティブモニタリングに役立つことを示すグラフ及び画像である。Ｃ４－２腫瘍を持ち胸腺なしｎｕ／ｎｕマウスでＭＴ２１８を注射する前と後の２０分後に、Ｔ１強調２Ｄ軸位断スピンエコー像を得た。２つの独立したマウスは、２１日目から６０日目までのＣ４－２腫瘍の進行は、Ａ－Ｂ．シグナル増強及びＣ－Ｄ．ＣＮＲの着実な増加を伴った。
【0045】
【図30A-30D】ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の特性を示すグラフ及び画像である。動的光散乱法動的光散乱により、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子のサイズ分布及びζ電位（Ａ）を測定した；遊離ＲＮＡ対照と比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子のアガロースゲル遅延アッセイは、高い封入効率を示した（Ｂ）；蛍光共焦点顕微鏡画像は、ＧＳＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ－Ｃｙ５．５ナノ粒子をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の４時間トランスフェクションで効果的に摂取し（Ｃ）、かつ、未処理細胞と比較してＦＡＣＳ定量ナノ粒子（Ｄ）。バーは、ペアなしｔで検定し、平均値±ｓｅｍを示し、＊＊＊ｐ＜０．００５である。
【0046】
【図31A-31P】ＲＴＢＣ細胞におけるｍｉＲ－２００ ｃナノ粒子の堅牢性及び持続性と、下流ＧＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、トランスフェクションＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるｍｉＲ－２００ｃは、１４日間（Ａ）及びＺＥＢ１を７日間下方修正した（Ｂ）；ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、１００ｎＭ ｍｉＲ－２００ｃでＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃをトランスフェクションしてから４８時間後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｃ）及びＨｓ５７８Ｔ（Ｉ）のｍｉＲ－２００ｃレベル、及び２つの細胞株におけるＺＥＢ１（Ｄ、Ｊ）、ＢＭＩ１（Ｅ、Ｋ）、サバイビン（Ｆ、Ｌ）、ＦＮ１（Ｇ、Ｍ）及びＥＤＢ－ＦＮ（Ｈ、Ｎ）ｍＲＮＡレベルでのダウングレード；側標的遺伝子のダウングレードとをそれぞれ示すグラフ及び画像である。タンパク質ブロットは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｏ）及びＨｓ５７８Ｔ（Ｐ）細胞媒介下流ＺＥＢ１、ＢＭＩ１、サバイビン、及びＥＤＢ－ＦＮタンパク質におけるＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃのダウングレードを、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ及び非特異的なコントロールと比較して示した。バーは、平均値±ｓｅｍを示してる。ペアなしｔで検定し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５である。
【0047】
【図32A-32C】ＴＮＢＣ細胞の遊走、浸潤及びスフェロイド形成を阻害するＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子を示す画像である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ細胞をＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子と比較する、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理すると、傷損傷測定に示されるそれらのマイグレーション（Ａ）、例えば、ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイに示される浸潤（Ｂ）及び３Ｄ培養における腫瘍スフェロイドの形成（Ｃ）を抑制した。
【0048】
【図33A-33G】ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の全身投与は、ＴＮＢＣ腫瘍異種移植の原発性腫瘍の進行を有意に抑制したことを示すグラフ及び画像である。ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子（Ｎ／Ｐ＝８，１．０ｍｇ／ｋｇ ＲＮＡ用量、２．５ｍｏｌ％ ＭＡＬ－ＰＥＧ－ＲＧＤ、５％スクロース）のバッチを調製し、使用まで－８０°Ｃで保存した。Ａ）ナノ粒子治療スケジュールの模式図に従ってマウスを治療した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍異種移植の腫瘍増殖は、ＢＬＩ（Ｂ－Ｅ）及びキャリパー測定（Ｆ、Ｇ）によって毎週モニタリングされる。バーと線は、平均値±ｓｅｍを示している。ペアなしｔで検定し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００５である。キャリパー測定値は、第１週と比較した。
【0049】
【図34A-34D】ＲＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理したＴＮＢＣ腫瘍におけるＥＤＮ－ＦＮ発現ＭＲＭＩ。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ａ、Ｂ）及びＨｓ５７８Ｔ（Ｃ、Ｄ）腫瘍は、ＭＴ２１８の静脈内投与前後の異なる時点におけるＴ１強調軸位断スピンエコー像及びＣＮＲである。なお、ＭＲ画像は、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳを毎週処理する６週目以降に取得された。線は、平均値±ｓｅｍを示している。ペアなしｔで検定し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００５である。
【0050】
【図35A-35G】ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の全身投与は、ｍｉＲ－２００ｃの上昇とＥＤＢ－ＦＮの減少につながったことを示すグラフ及び画像である。ＱＲＴ－ＰＣＲ及び免疫組織化学的アッセイにより、ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳで処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍におけるＺＥＢ１及びＥＤＢ－ＦＮのｍｉＲ－２００ｃ及びｍＲＮＡレベル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）及びＥＤＢ－ＦＮタンパク質レベル（Ｇ）を測定し、腫瘍を７週目に切断した。
【0051】
【図36A-36D】ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の全身投与は、処理されたマウスにおいて顕著な副作用を誘発していないことを示すグラフ及び画像である。Ａ）ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳで処理したマウスは，６週間の処理中に体重に有意差を示さなかった。肝臓（Ｂ）、膵臓（Ｃ）及び腎臓（Ｄ）の組織学的評価は、Ｈ＆Ｅ染色による明らかな組織損傷を示さなかった。（スケール＝１００μｍ）
【発明を実施するための形態】
【0052】
本発明は、被験者体内の薬剤耐性癌の検出方法を提供する。該方法は、被験者の組織と有効量の分子プローブとを接触させ、組織中に存在する分子プローブの量を検出し、検出された分子プローブの量と対照値とを比較し、組織中に存在する分子プローブの量が対照値よりも高い場合に、被験者体内の薬剤耐性癌を検出することを含む。前記分子プローブは、下記式Ｐ－Ｌ－Ｃを含み、ここで、ＰがＥＤＢ－ＦＮ標的ペプチドであり、Ｃが造影剤であり、Ｌがペプチドと造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーである。また、薬剤耐性癌の治療をモニタリングする方法も提供される。
【0053】
また、本明細書に記載された技術用語及び科学技術用語は、何ら規定していない限り、これらの発明が属する技術分野において一般的に知られているものと同様の意味を有するものである。本明細書の記載において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。なお、特許請求の範囲及び特許請求の範囲の記載において、「一」、「一つ／一種」及び「該」は、特にそうでない旨明示した場合を除き、複数の形態も同様に含む。
【0054】
本発明の広い範囲を規定する数値範囲及びパラメータは、ある場合においてては近似値である。ただし、各具体例に記載された数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値であっても、本来の試験測定で求められた標準偏差に起因して、必ず一定の誤差が含まれている。本明細書に示される各数値範囲には、この狭い数値範囲が明示的にここに書かれているかのように、この広い数値範囲に収まるすべての狭い数値範囲が含まれる。
【0055】
本明細書において、「診断」とは、被験者の疾病の性質を判定し、疾病又は疾病の発症の重症度と可能な結果及び／又は回復の見通し（予後）の可能性を判定することを含むことができる。また、「診断」には、合理的な治療の文脈での診断を含むことができ、ここで、診断指導治療は、治療の初期選択、治療の修正（例えば、線量及び／又は線量の調整）等を含む。
【0056】
また、本明細書中で使用されている「治療」、「処理」等は、癌等の病症又は疾患に罹患しているリスクがあり、或は癌等の病症又は疾患に罹患している被験者に特典を与える何らの行為であり、少なくとも１つの症状の緩和や抑制することによって条件を改善、疾患の進行を遅らせ、疾患の発症を予防又は遅れらせること等を含む。被験者は、発癌化剤への暴露による危険性があるため、遺伝子的に不要で急激な細胞増殖等を特徴とする疾患にかかりやすい。
【0057】
本明細書において、「被験者」及び「患者」とは、交換可能に使用される用語であり、一般に哺乳動物であり、類人猿とヒトを含む霊長類動物、ウマ（例えば、ウマ）類、イヌ（例えば、イヌ）類、ネコ類、各種家畜類（例えば、豚、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄類動物等）、飼いならされたペットや動物園で飼われている動物等を含むがこれらに限定されるものではない。人間の診断に対して特に注目されている。
【0058】
本明細書において、「有機基」とは、脂肪族基、環式基、又は脂肪族基と環式基との組み合わせ（例えば、アルカン基、芳香族炭化水素基）に分類される炭化水素基を意味する。本発明において、本発明の化合物の好適な有機基は、化合物の抗癌活性を阻害しないものである。本明細書において、「脂肪族基」とは、飽和又は不飽和の直鎖状又は分岐鎖状の炭化水素基を意味する。この用語は、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基を包含するものとする。
【0059】
本明細書において、「アルキル基」、「アルケニル基」及び「アルキニル部」とは、直鎖状の基及び分岐鎖状の基を包含するものとする。これらの基は、特に断りがない限り、炭素数が１～２０であり、アルケニル基の炭素数が２～２０である。これらの基は、炭素数が１０以下、炭素数が８以下、炭素数が６以下、又は炭素数が４以下であることが好ましい。以下、炭素数４以下のアルキル基を低級アルキル基ともいう。アルキル基は、炭素数（即ち、Ｃ１－Ｃ４アルキル基は炭素数１～４のアルキル基である）で表すこともできる。
【0060】
ここで説明するいずれの式又はスキームにおいて、基が１回以上存在する場合には、明示的に記載されているか否かに関わらず、各基（又は置換基）は、それぞれ独立して選択される。例えば、Ｃ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ２としては、Ｒ基がそれぞれ独立して選択される。
【0061】
本明細書において、「ポリペプチド」とは、単一の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を含み、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を含むものである。したがって、本明細書において、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」の用語又は２つ以上のアミノ酸の１つ以上の鎖を指す何れかの他の用語が含まれるが、これらに限定されるものではなく、「ポリペプチド」の定義には、「ポリペプチド」という用語がこれらの用語に代わるものであってもよいし、これらの用語と交換可能に用いられてもよい。また、該用語は、翻訳後に修飾されたポリペプチドを更に含み、例えば、糖鎖修飾、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護・ブロック基による誘導体化、タンパク質分解開裂、非天然のアミノ酸による修飾等が挙げられる。
【0062】
「アミノ酸」とは、一般式がＮＨ２－ＣＲＨ－ＣＯＯＨの化合物であり、ここで、側鎖ＲがＨ又は有機基である。Ｒが有機である場合に、Ｒは変化し、極性又は非極性（即ち疎水性）である。アプリケーション全体において、Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジンの略語が使用される。なお、本明細書において「アミノ酸」とは、特に断りがない限り、一般式を保持するアミノ酸誘導体を更に含む。
【0063】
薬剤耐性癌の検出方法
一態様では、本発明は、被験者体内の薬剤耐性癌の検出方法を提供する。該方法は、被験者の組織と有効量の分子プローブとを接触させ、組織中に存在する分子プローブの量を検出し、検出された分子プローブの量と対照値とを比較し、組織中に存在する分子プローブの量が対照値よりも高い場合に、被験者体内の薬剤耐性癌を検出するステップを含む。
一態様では、本発明は、被験者体内の薬剤耐性癌の検出方法を提供する。該方法は、被験者の組織と有効量の分子プローブとを接触させ、組織中に存在する分子プローブの量を検出し、検出された分子プローブの量と対照値とを比較し、組織中に存在する分子プローブの量が対照値よりも高い場合に、被験者体内の薬剤耐性癌を検出するステップを含む。
【0064】
前記分子プローブは、被験者の臓器、組織、又は体領域におけるＥＤＢ－ＦＮを発現する薬剤耐性癌細胞の存在、位置及び／又は分布を検出及び／又は判定する方法に用いることができる。動物の組織、例えば、前立腺組織における分子プローブの存在、位置及び／又は分布は、可視化（例えば、本明細書において説明する生体内撮像モダリティ）することができる。本明細書において「分布」とは、ある領域又は体積に分散られる空間特性を指すことである。この場合、「癌細胞の分布」とは、癌細胞が被験者の組織（例えば前立腺組織）中の領域又は体積に分散られる空間特性である。そして、分子プローブの分布は、該組織中の薬剤耐性癌細胞の有無と相関していてもよい。
【0065】
一態様では、分子プローブは、被験者に投与されることによって、被験者体内の薬剤耐性癌細胞の分布を評価し、その分布を特定の位置に関連付けることができる。外科医は、手術切除で、定位テクニックと術中ＭＲＩ（ｉＭＲＩ）が日常的に使用されている。これにより、腫瘍の異なる領域（例えば、腫瘍の縁或いは腫瘍の中心）から組織を特異的に識別し、サンプリングすることができる。また、腫瘍の縁の外側である腫瘍の周辺の組織領域をサンプリングし、これらの領域は、一般的に正常に見えるが、組織学的に検査する際に分散した腫瘍細胞により浸潤させる。
【0066】
「癌」又は「悪性腫瘍」は、同義語として使用され、細胞が非制御及び異常に増殖し、影響を受けた細胞が局所的に拡散するか、血流とリンパ系を経由して身体の他の部分（即ち、転移）に拡散する能力、及び複数の特徴的な構造及び／又は分子特徴のいずれかを特徴とする複数の疾患を指す。「癌細胞」とは、多段階の腫瘍進行の早期、中期、又は後期を経験する細胞である。なお、腫瘍進行の早期、中期と後期の特徴については、顕微鏡法を用いて説明した。腫瘍進行の３つの段階において、各段階の癌細胞は、一般に、経地、反転、欠失、等腕染色体、単性体及び追加染色体を含む異常な核型を有している。癌細胞は、「増殖細胞」、即ち悪性進行の早期の細胞と、「発育不全細胞」、即ち腫瘍進行の中期の細胞と、「腫瘍細胞」、即ち腫瘍進行の後期の細胞とを含む。癌の例としては、肉腫、乳癌、肺癌、脳癌、骨癌、肝臓癌、腎臓癌、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌等が挙げられる。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、口腔癌、膵癌又は前立腺癌である。腫瘍は、被験者の体内の癌の物理的な症状である。
【0067】
本発明は、薬剤耐性癌の検出及びモニタリングの方法を提供する。薬剤耐性癌は、抗癌剤による治療耐性を有する癌の一種である。薬剤耐性の各種ファセットは、当業者に知られている。Ｖａｓａｎなどを参照し，Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ５７５， ２９９－３０９ （２０１９）。薬剤耐性癌は、固有薬剤耐性及び後天性薬剤耐性を含むことができる。薬剤耐性に寄与する因子としては、腫瘍の負担、腫瘍の不均一性、腫瘍による物理的な障壁の発生や使用、免疫抑制、治療不可能なゲノムドライバーが挙げられる。
【0068】
この方法は、被験者の組織を接触させる工程を含む。本明細書において、接触とは、２つの項目を物理的に隣接させて接触させたり、妥当な短時間で接触が発生する環境で接触させたりすることである。例えば、組織と分子プローブとを接触させるとは、分子プローブを被験者から採取した生検試料等の組織に直接適用することを含む。接触には、インビボ、エクスビボ、インビトロでの接触を含むことができる。しかし、接触には、循環で媒介される接触によって分子プローブと組織との間の接触を引き起こす全身投与を更に含む。そこで、本実施形態では、生体内で組織を接触させる。
【0069】
分子プローブは、癌に罹患している又は疑いがある被験者に全身投与されることが好ましい。癌に関連する一般的な標識や症状としては、疲労、垂直変化、又は皮膚下に感じ可能なしこりや肥厚領域が挙げられる。癌が発生した組織には、最も癌の兆候や症状が特異的である。例えば、頭痛や焼き付きは、脳癌の兆候であってもよいし、排尿困難は、膀胱癌の兆候であってもよい。しかしながら、癌の各種の兆候や症状は、当業者にはよく知られており、国立癌研究所のウェブサイトに記載されている。癌の症状は、被験者が癌に罹患している、又は、癌に疑いがあることを示すことができるが、遺伝的易感性や放射線照射などの他のリスク要因によっても、癌の疑いがあることを示すことができる。
【0070】
組織領域とは、治療及び／又は解析中の被験者体内の組織の領域である。一般に、組織領域は、癌が特定された組織内にあるか、又は癌が転移によって広がった疑いがある組織内にある。組織領域は、心臓、肺、血管等の被験者の臓器とすることができる。他の実施形態では、組織領域は、腫瘍、又は転移経路によって腫瘍に連結された組織領域、又は原発性腫瘍組織と同様の特徴を有する組織などの疾患組織又は疑いがある組織であり得る。転移経路としては、例えば、経体腔内経路（腹腔内表面の浸透、胸膜、心膜、くも膜下腔の表面を浸透する）、リンパルート（腫瘍細胞がリンパ節に転移し、リンパ節から身体の他の部分へ移る）、及び、造血経路（肉腫及び癌に使用する）等が挙げられる。組織領域の大きさは、広く変化することができ、例えば、約１ｃｍ３～約５００ｃｍ３の寸法範囲で変化させることができる。
【0071】
分子プローブは、分子プローブに含まれる撮像基に応じて、種々の異なる撮像技術を用いて検出することができる。撮影方法としては、例えば、ガンマイメージング、ポジトロンエミッショントモグラフィ（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ＰＥＴ）イメージング、コンピュータ断層（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ＣＴ）イメージング、磁気共鳴イメージング（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ＭＲＩ）、近赤外線イメージング、蛍光イメージングなどが挙げられる。
【0072】
分子プローブは、磁気共鳴イメージング剤として好適な撮像基を含むことが好ましい。ＭＲＩを用いた疾病検出は、周囲の健常組織に比べてシグナル強度が近いため、疾患の検出が困難な場合が多い。磁気共鳴イメージングの場合には、造影剤とも呼ぶことができる。ランタノイド元素は、造影剤として有用であることが知られている。ランタノイド元素は、原子番号５７～７１の１５種の金属元素を含み、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウムを更に含む。好ましいランタノイド元素としては、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウムが挙げられる。これらの希土類金属をより容易に扱うためには、ランタノイド元素がキレート化されていることが好ましい。また、撮像基として選択されるランタニド元素は、ガドリニウムであることが好ましく、ガドリニウム（ＩＩＩ）であることがより好ましい。
【0073】
分子プローブ
本発明は、分子プローブの投与及び検出を含む。本明細書において、分子プローブは、一般に下記の式を含み、
Ｐ－Ｌ－Ｃ
Ｐは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり；
Ｃは、造影剤であり；及び
Ｌは、前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーであり、前記リンカーは、前記ペプチドのアミンとカルボキサミドを形成するカルボン酸と、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステル結合を形成するマレイミドと、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステルを形成するマレイミドを含む。
本発明は、分子プローブの投与及び検出を含む。本明細書において、分子プローブは、一般に下記の式を含み、
Ｐ－Ｌ－Ｃ
Ｐは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり；
Ｃは、造影剤であり；及び
Ｌは、前記ペプチドと前記造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーであり、前記リンカーは、前記ペプチドのアミンとカルボキサミドを形成するカルボン酸と、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステル結合を形成するマレイミドと、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステルを形成するマレイミドを含む。
【0074】
ここに記載される分子プローブには、特異的にドメイン外のフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）に結合するペプチド配列を有する標的ペプチドが含まれる。癌、特に薬剤耐性癌は、癌細胞の生存、増殖、転移が容易な特異的な腫瘍マイクロ環境を有する。ＥＤＢ－ＦＮの高発現は、薬剤耐性癌の存在と相関している。
【0075】
標的ペプチドを含む分子プローブは、静脈内投与や非経口投与等の被験者に対して全身投与することができ、細胞外マトリックスタンパク質ＥＤＢ－ＦＮを容易に標的とすることにより、被験者体内の腫瘍細胞の位置、分布、及び／又は浸潤性、及び腫瘍細胞の限界を決定する。分子プローブ及びその製造方法の説明については、米国特許第１０９２５９８０号明細書を参照し、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0076】
いくつかの実施形態では、分子プローブは、一般に下記の式を含み、
Ｐ－Ｌ－Ｃ
ここで、Ｐは、標的ペプチドであり、Ｃは、造影剤であり、Ｌは、ペプチドと造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーである。前記リンカーは、前記ペプチドのアミンとカルボキサミドを形成するカルボン酸と、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステル結合を形成するマレイミドとを含む。
Ｐ－Ｌ－Ｃ
ここで、Ｐは、標的ペプチドであり、Ｃは、造影剤であり、Ｌは、ペプチドと造影剤とを共有結合する非ペプチドリンカーである。前記リンカーは、前記ペプチドのアミンとカルボキサミドを形成するカルボン酸と、又は前記ペプチドのシステイン残基とチオエステル結合を形成するマレイミドとを含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、標的ペプチドは、ＥＤＢ－ＦＮに特異的に結合することができる。ＥＤＢ－ＦＮを特異的に結合させる標的ペプチドとしては、例えば、ＴＶＲＴＳＡＤ（配列番号１）、ＮＷＧＤＲＬ（配列番号２）、ＮＷＧＫＰＩＫ（配列番号３）、ＳＧＶＫＳＡＦ（配列番号４）、ＧＶＫＳＹＮＥ（配列番号５）、ＩＧＫＴＮＡＴＬ（配列番号６）、ＩＧＮＳＮＴＬ（配列番号７）、ＩＧＮＴＩＰＶ（配列番号８）、及び、ＬＹＡＮＳＰＦ（配列番号９）のアミノ酸配列を有する線状ペプチド、ＣＴＶＲＴＳＡＤＣ（配列番号１０）、ＣＮＷＧＤＲＩＬＣ（配列番号１１）、ＣＮＷＧＫＰＩＫＣ（配列番号１２）、ＣＳＧＶＫＳＡＣ（配列番号１３）、ＣＧＶＫＳＹＮＥＣ（配列番号１４）、ＣＩＧＫＴＮＴＬＣ（配列番号１５）、ＣＩＧＮＳＮＴＬＣ（配列番号１６）、ＣＩＧＮＴＩＰＶＣ（配列番号１７）、又は、ＣＬＹＡＮＳＰＦＣ（配列番号１８）のアミノ酸配列を有する環状ペプチド、ＣＴＶＲＴＳＡＤ（配列番号３１）、ＣＮＷＧＤＲＩＬ（配列番号３２）、ＣＮＷＧＫＰＩＫ（配列番号３３）、ＣＳＧＶＫＳＡＦ（配列番号３４）、ＣＧＶＫＳＹＮＥ（配列番号３５）、ＣＩＧＫＴＮＡＴＬ（配列番号３６）、ＣＩＧＮＳＮＴＬ（配列番号３７）、ＣＩＧＮＴＩＰＶ（配列番号３８）、及び、ＣＬＹＡＮＳＰＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を有する線状ペプチドを挙げることができる。他の実施形態では、前記標的ペプチドは、ＥＤＡＴＡ－ＦＮに特異的に結合することができる。ＥＤＡ－ＦＮを特異的に結合するペプチドとしては、ＷＮＹＰＦＲＬ（配列番号１９）、ＳＮＴＳＹＶＮ（配列番号２０）、ＳＦＳＹＴＳＧ（配列番号２１）、ＷＳＰＡＰＭＳ（配列番号２２）、ＴＲＥＨＰＡＱ（配列番号２３）、ＡＲＩＩＤＮＡ（配列番号２４）のアミノ酸配列を有する鎖状ペプチド、ＣＷＮＹＰＦＲＬＣ（配列番号２５）、ＣＳＮＴＳＹＶＮＣ（配列番号２６）、ＣＳＦＳＹＴＳＧＣ（配列番号２７）、ＣＷＳＰＭＡＰＭＳＣ（配列番号２８）、ＣＴＲＥＨＰＡＱＣ（配列番号２９）、ＣＡＲＩＤＮＡＣ（配列番号３０）のアミノ酸配列を有する環状ペプチド、ＣＴＶＲＴＳＡＤ（配列番号４０）、ＣＮＷＧＤＲＩＬ（配列番号４１）、ＣＮＷＧＫＰＩＫ（配列番号４２）、ＣＳＧＶＫＳＡＦ（配列番号４３）、ＣＧＶＫＳＹＮＥ（配列番号４４）、ＣＩＧＫＴＮＡＴＬ（配列番号４５）、ＣＩＧＳＮＴＬ（配列番号４６）、ＣＩＧＮＴＩＰＶ（配列番号４７）、及び、ＣＬＹＡＮＳＰＦ（配列番号４８）のシステインリンカーを有する線状ペプチドを挙げることができる。
【0078】
標的ペプチドは、様々な変更、置換、挿入、欠失を行うことができ、これらの変化は、その使用に特定の利点を提供する。ここで、ＥＤＢ－ＦＮと結合及び／又は錯化する標的ペプチドは、同一ではなく、１つ以上の変化が生じ、かつ、ＥＤＢ－ＦＮと特異的に結合及び／又は錯化として機能する能力を保持し、上記のペプチドの配列と実質的に相同とすることができる。
【0079】
前記標的ペプチドは、アミド、タンパク質とのコンジュゲート、環化ポリペプチド、重合ポリペプチド、アナログ、フラグメント、化学修飾ポリペプチド等の種々の形態のポリペプチド誘導体のいずれであってもよい。
【0080】
「アナログ」とは、本明細書に特に示される配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を有し、そのうちの１つ以上の残基が機能的に類似する残基で保存的に置換された任意のペプチドと、本明細書で説明するようなＥＤＢ－ＦＮと特異的に結合及び／又は錯化する任意のペプチドとを含む。保存的置換の例としては、一方の非極性（疎水性）残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）が他方に置換され、一方の極性（親水性）残基が他方（例えば、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンアミドとの間、グリシンとセリンとの間）に置換され、一方のアルカリ残基（例えば、リジン、アルギニン又はヒスチジン）が他方に置換され、一方の酸性残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）が他方に置換されることを含む。
【0081】
また、「保存的置換」は、このようなペプチドが必要な結合活性を示すものであれば、誘導体化されていない残基の代わりに、化学誘導体化された残基を用いることを更に含む。
【0082】
「化学誘導体」とは、機能的側基の反応により化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する被験ペプチドをいう。このような誘導体化された分子としては、例えば、遊離アミノ基を誘導体化してアミン塩酸塩、ｐ－トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ－ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、ホルミル基等を形成した分子が挙げられる。また、遊離カルボキシルを誘導体化して塩、メチル、エチルエステル等のエステル類又はヒドラジド類を形成してもよい。また、遊離水酸基を誘導体化してＯ－アシル基又はＯ－アルキル誘導体を形成してもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化してＮ－ベンジルヒスチジンを形成してもよい。また、化学誘導体として２０種の標準アミノ酸のうちの１種以上の天然由来のアミノ酸誘導体を含有するポリペプチドを更に含む。例えば、プロリンに４－ヒドロキシプロリンが置換されていてもよく、リジンに５－ヒドロキシリジンが置換されていてもよく、ヒスチジンに３－メチルヒスチジンが置換されていてもよく、セリンにホモセリンが置換されていてもよく、リジンにオルニチンが置換されていてもよい。本明細書に記載のペプチドには、必要な結合特異性又は活性が維持されていれば、本明細書に記載されているペプチドの配列に対して、１つ以上の付加及び／又は欠失又は残基を有するペプチドを更に含む。
【0083】
「フラグメント」とは、アミノ酸残基配列がここに示されるポリペプチドよりも短いアミノ酸残基配列を有する任意の被験ペプチドをいう。
【0084】
また、「リンカー」を提供するために、ペプチドのいずれかの末端に追加残基を添加することもでき、このリンカーにより、他のポリペプチド、タンパク質、検出可能部分、標識、固体マトリックス、又は担体に簡便に結合及び／又は固定することができる。
【0085】
アミノ酸残基のリンカーは、通常、少なくとも１個残基であり、４０個以上の残基であることが好ましく、一般的には１～１０個残基であることがより好ましい。連結に用いられる典型的なアミノ酸残基としては、グリシン、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられる。また、被験者標的ペプチド剤は、末端－ＮＨ２アシル化（例えば、アセチル化、チオグリコール酸アミド化）又は末端－カルボキシアミド化（例えばアンモニア、メチルアミン等の末端修飾）により修飾された配列によって異なる。末端修飾は、公知のようにプロテイナーゼ消化の感受性を低下させるために有用で、溶液中のポリペプチド、特にプロテアーゼが存在し得る体液中のポリペプチドの半減期を長くする働きをする。なお、ポリペプチドの環化も有用な末端修飾であり、ここで説明するような環状ペプチドで観測される生物活性を考慮して環化して形成した安定構造であることからも特に好ましい。
【0086】
いくつかの実施形態では、前記非ペプチドリンカーは、非ペプチド脂肪族又はヘテロ脂肪族リンカーである。前記非ペプチドリンカーは、前記ペプチドと造影剤とを共有結合するアルキレングリコールカルボキサミドを含むことができる。
【0087】
いくつかの実施形態では、非ペプチドリンカーは、長さ１～１０程度の第１部分と、スペーサーとして作用する第２部分とを含むことができる。スペーサーとして作用するリンカーの部位としては、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、共重合（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリフォスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリンを含む非ペプチド系ポリマーを挙げることができる。非ペプチドリンカー用のスペーサーのより詳細な説明については、本明細書に組み込まれ、例えばＷＯ／２００６／１０７１２４号公報を参照される。このようなリンカーは、典型的には分子量が１ｋＤａ～５０ｋＤａ程度であり、特定のコネクタによって異なる。例えば、典型的なＰＥＧの分子量は、１ｋＤａ～５ｋＤａ程度であり、ポリエチレングリコールの分子量は、５ｋＤａ～５０ｋＤａ程度であり、より好ましくは１０ｋＤａ～４０ｋＤａ程度である。
【0088】
造影剤は、リンカーを介して標的ペプチドに直接結合している。造影剤の役割は、標的ペプチドを含む分子プローブをＥＤＢ－ＦＮに結合させて形成された錯化体を可視化することにより、検出又は診断方法の検出工程を容易にすることである。造影剤は、解析対象の組織に結合した分子プローブの量に関連し（好ましくは比例する）且つ測定可能な強度を有するシグナルを生成するように選択することができる。
【0089】
ある実施形態では、前記造影剤は、キレート剤及び金属イオンを含む。キレート剤は、一般に前記リンカーと共有結合を形成する基を１つ以上有している。本明細書において、従来公知の様々なキレート剤を用いることができる。一態様では、キレート剤は、イメージング剤と配位可能なローンペア電子を有する少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、酸素、窒素、硫黄、リン等）を含有する非環状又は環状の化合物を含む。非環状キレート剤としては、例えば、エチレンジアミンが挙げられる。環状キレート剤としては、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）又はその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザドデカンテトラアセテート（ＤＯＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリアセテート（ＤＯ３Ａ）及びその誘導体（例えば、ＨＰ－ＤＯ３Ａ）、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザシクロトリデカン四酢酸（ＴＲＩＴＡ）及びその誘導体、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザドデカンテトラメチルアセテート（ＤＯＴＭＡ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザドデカン－１，４，７－トリメチルアセテート（ＤＯ３ＭＡ）及びその誘導体、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラホスホナトメチル－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＰ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアゼシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンメチルホスホン酸）（ＤＯＴＭＰ）及びその誘導体、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ（メチレンフェニルホスホン酸）（ＤＯＴＰＰ）及びその誘導体、又は、Ｎ，Ｎ’－エチレンジ－Ｌ－システイン及びその誘導体等が挙げられる。本明細書において、「誘導体」は、キレート剤の塩及びそのエステルとして定義される。
【0090】
金属イオンの選択は、検出技術（例えば、ＭＲＩ、ＰＥＴ等）によって異なる。磁気共鳴イメージングに有用な金属イオンとしては、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋３、Ｔｍ＋３、Ｄｙ＋３、Ｙｂ＋３、Ｍｎ＋２、Ｆｅ＋３、５５Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９ｍＴＣ、１１１ｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅを挙げることができる。いくつかの実施形態では、前記分子プローブの造影剤は、金属キレート剤又は金属フラーレンの少なくとも１種を含む。いくつかの実施形態では、前記造影剤は、例えば、Ｇｄ３Ｎ＠Ｃ８０等の金属フラーレンを用いることができる。
【0091】
いくつかの実施形態では、前記分子プローブは、下記式を有することができ、
、又は
Ｐ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであり；
Ｌ１は、任意のスペーサーであり；
Ｌ２は、前記ペプチドＰ１又は前記スペーサーのアミノ基であり；及び
Ｍは、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋３、Ｔｍ＋３、Ｄｙ＋３、Ｙｂ＋３、Ｍｎ＋２、Ｆｅ＋３、５５Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９ｍＴＣ、１１１ｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅからなる群から選択される金属又はその塩である。
【化3】
【化4】
Ｌ１は、任意のスペーサーであり；
Ｌ２は、前記ペプチドＰ１又は前記スペーサーのアミノ基であり；及び
Ｍは、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋３、Ｔｍ＋３、Ｄｙ＋３、Ｙｂ＋３、Ｍｎ＋２、Ｆｅ＋３、５５Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９ｍＴＣ、１１１ｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅからなる群から選択される金属又はその塩である。
【0092】
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、共重合（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリフォスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレートの少なくとも１種を挙げることができる。
【0093】
他の実施形態では、前記分子プローブは、下記式を有することができ、
、又は
Ｐ１は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドであり；
Ｌ２は、前記ペプチドＰ１のアミノ基であり；及び
Ｍは、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋３、Ｔｍ＋３、Ｄｙ＋３、Ｙｂ＋３、Ｍｎ＋２、Ｆｅ＋３、５５Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９ｍＴＣ、１１１ｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅからなる群から選択される金属又はその塩である。
【化5】
【化6】
Ｌ２は、前記ペプチドＰ１のアミノ基であり；及び
Ｍは、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋３、Ｔｍ＋３、Ｄｙ＋３、Ｙｂ＋３、Ｍｎ＋２、Ｆｅ＋３、５５Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、４７Ｓｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９ｍＴＣ、１１１ｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅからなる群から選択される金属又はその塩である。
【0094】
いくつかの実施形態では、癌細胞の除去を認識し、促進するために、顕微鏡法におけるイメージング（ＩＯＩ）技術は、全身投与又は局所投与の本明細書で説明する分子プローブと組み合わせることができる。被験者に投与された分子プローブは、患者の臓器又は身体領域内の薬剤耐性癌細胞（即ち、ＥＤＢ－ＦＮ発現に関連する癌細胞）の存在、位置、及び／又は分布を標的と検出及び／又は判定することができる。一例では、分子プローブをＩＯＩと組み合わせることにより、腫瘍の周辺に浸潤及び／又は浸潤し始める悪性細胞を認識させることができる。この方法は、手術中にリアルタイムで行うことができる。該方法は、ＰＥＴ、蛍光、ＭＲＩ等の検出可能な部分などを含む前記分子プローブに局所的又は全身投与されることを含む。そして、撮像モダリティを用いて画像データの検出及び収集を行うことができる。得られた画像データは、外科及び／又は放射線治療の少なくとも一部を判定するために用いられてもよい。あるいは、この画像データを用いて、自動手術装置（例えば、レーザー、メス、マイクロマシン等）を制御してもよいし、手術の手動誘導を補助してもよい。また、画像データは、治療薬の受け渡しを計画及び／又は制御するために用いられてもよい（例えば、マイクロ電子機械又はマイクロマシン）。
【0095】
薬剤耐性癌の治療のモニタリング方法
薬剤耐性癌の治療中の被験者の組織と、有効量の分子プローブとを接触させ、前記組織中に存在する前記分子プローブの第１の量を検出し、前記被験者の組織と有効量の式Ｐ－Ｌ－Ｃを含む分子プローブとを接触させ、前記組織中に存在する前記分子プローブの第２の量を検出し、前記分子プローブの前記第１の量と前記第２の量とを比較することで、前記被験者体内の薬剤耐性癌の治療をモニタリングすることを含む薬剤耐性癌の治療のモニタリング方法。
薬剤耐性癌の治療中の被験者の組織と、有効量の分子プローブとを接触させ、前記組織中に存在する前記分子プローブの第１の量を検出し、前記被験者の組織と有効量の式Ｐ－Ｌ－Ｃを含む分子プローブとを接触させ、前記組織中に存在する前記分子プローブの第２の量を検出し、前記分子プローブの前記第１の量と前記第２の量とを比較することで、前記被験者体内の薬剤耐性癌の治療をモニタリングすることを含む薬剤耐性癌の治療のモニタリング方法。
【0096】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法及び分子プローブは、薬剤耐性癌の治療効果を測定するために用いることができる。該実施形態では、治療の前、中、又は後に、被験者に分子プローブを投与することができ、且つ癌細胞の分布をイメージングして治療の有効性を判定することができる。一例では、前記治療は、転移癌の外科手術の切除を含み、分子プローブは、転移前と転移後の転移癌の分布を定義することで、外科手術の有効性を判定するために使用することができる。また、前記方法及び分子プローブは、外科手術中の癌細胞の質量や体積をより容易に定義及び／又は画像化するために、外科手術の腫瘍切除等の術中の外科手術の過程に用いることができる。
【0097】
治療は、癌治療剤又は他のタイプの癌治療の投与を更に含む。本明細書において、「癌治療」は、癌細胞を死滅させ、癌細胞のアポトーシスを誘発し、癌細胞の増殖速度を低下させ、転移の発生率又は数を減少させ、腫瘍の大きさを減少させ、腫瘍の増殖を抑制し、腫瘍又は癌細胞への血液の供給を減少させ、癌細胞又は腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を予防又は阻害し、癌に罹患した動物の寿命を増加させることにより、動物の癌に悪影響を与えることが可能な任意の薬剤を含むことができる。癌治療としては、例えば、化学療法、放射線治療、ホルモン療法及び／又は生物学治療法／免疫療法等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、被験者体内の癌の体積、成長、マイグレーション、及び／又は拡散の減少は、所定の治療の有効性を示すことができる。これにより、癌の治療の直接的な臨床的な端点測定を提供することができる。したがって、その一方で、癌治療剤の有効性をモニタリングする方法を提供する。より具体的には、本出願の実施形態は、癌治療の有効性をモニタリングする方法を提供する。
【0098】
治療剤は、抗腫瘍性、化学療法、抗ウイルス、抗ミトティック、腫瘍抑制、及び／又は免疫療法効果を発揮する抗増殖剤、例えば、細胞抑制又は細胞殺傷作用によって腫瘍細胞の発達、成熟、又は拡散を直接防止し、生物学的反応修飾などのメカニズムを介して間接的に阻止されるものではない。商業使用、臨床評価及び前臨床開発のための抗増殖剤が多数存在している。また、説明の便宜上、抗増殖剤は、下記のカテゴリ、サブタイプ及びタイプに分類され、ＡＣＥ阻害剤、アルキル化剤、血管新生抑制剤、アンジオテンシン、アンスラサイクリン／ＤＮＡインターカレーター、抗癌性抗生物質又は抗生物質系剤、代謝拮抗剤、代謝拮抗化合物、アスパラギナーゼ、ビスホスフェート、ｃＧＭＰフォスフォジエステラーゼ阻害薬炭酸カルシウム、シクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、ＤＨＡ誘導体、ＤＮＡトポイソメラーゼ、エンドセリン阻害剤、エピポロチン、ゲンステイン、ホルモン系抗癌剤、親水性胆汁酸（ＵＲＳＯ）、免疫調節剤又は免疫製剤、インテグリンアンタゴニスト、インターフェロンアンタゴニスト又は剤、ＭＭＰ阻害剤、その他の抗悪性腫瘍剤、モノクローナル抗体、ニトロソリアン、ＮＳＡＩＤ、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、ｐＢＡＴＴＳ、放射線／化学増感剤や放射線／化学保護剤、レチノイド、内皮細胞の増殖及び遊走の選択阻害剤、セレン、ストロメシン阻害剤、タタキサン、ワクチン、及びニチニチソウアルカロイド。
【0099】
薬剤耐性癌の治療には、特殊な方法を用いることができる。薬剤耐性癌の治療法としては、非重畳作用の機構を有する複数の化学療法剤を併用する併用療法が挙げられる。ＢＯＳｌなど、Ｎ．ＥＮＧ．Ｊ．ＭＥＤ．、４０５－４１０（１９８６）を参照する。薬剤耐性癌は、投与量の強度を変化させたり、化学療法の高ドーズ量で処理したりすることもできる。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇなど、Ｊ．ＣＬｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９，２６３８－２６４６（２００１）を参照する。その他の方法としては、具体的には、標的チロシンキナーゼ、核受容体又はエストロゲン受容体などの薬剤耐性癌の特性を有効とする治療法が挙げられる。Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ Ｒ．Ａ．，Ｃｅｌｌ，１４４，６４６－６７４ （２０１１）を参照する。免疫学的方法は、特に免疫検査を無効にするためのモノクローナル抗体の使用も、薬剤耐性癌の治療に用いることができる。Ｒｉｂａｓ Ａ．，Ｗｏｌｃｈｏｋ Ｊ．Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９，１３５０－１３５５（２０１８）を参照する。
【0100】
本明細書に記載の方法及び分子プローブは、薬剤耐性癌を有する被験者の治療をモニタリングするために用いることができる。本実施形態では、治療レジメンの投与前、投与中、又は投与後に、被験者の組織を分子プローブの有効量に初めて接触させ、癌細胞の量及び／又は分布をイメージングして治療の有効性を判定することができる。次に、後の時刻において、被験者の組織と分子プローブの有効量とを２回目に接触させ、組織中に存在する分子プローブの第２量及び／又は分布を検出する。そして、分子プローブの第１量及び第２量（及び／又はその分布）を比較し、被験者体内の薬剤耐性癌の治療をモニタリングする。
【0101】
投与及び処方
本明細書に記載の分子プローブは、例えば、全身、局所及び／又は非経口投与法等により、被験者に投与することができる。これらの方法としては、例えば、注入法、輸液法、沈着法、インプラント又は局所投与法等が挙げられ、分子プローブによる組織へのアクセスが求められる他の投与方法が挙げられる。一例では、分子プローブの投与は、被験者体内の分子プローブを静脈注射することにより行うことができる。プローブの投与は、単数であってもよいし、複数であってもよい。本明細書において、「投与」は、被験者の癌細胞の量及び期間を効果的に標識することで、分子プローブを提供又は配送することである。
本明細書に記載の分子プローブは、例えば、全身、局所及び／又は非経口投与法等により、被験者に投与することができる。これらの方法としては、例えば、注入法、輸液法、沈着法、インプラント又は局所投与法等が挙げられ、分子プローブによる組織へのアクセスが求められる他の投与方法が挙げられる。一例では、分子プローブの投与は、被験者体内の分子プローブを静脈注射することにより行うことができる。プローブの投与は、単数であってもよいし、複数であってもよい。本明細書において、「投与」は、被験者の癌細胞の量及び期間を効果的に標識することで、分子プローブを提供又は配送することである。
【0102】
本明細書に記載の標的ペプチドを含む分子プローブは、分子プローブ又はその薬学的に許容される水溶性塩を有効量含む医薬組成物で被験者に投与することができる。
【0103】
「有効量」とは、投与される分子プローブの量が、癌細胞又は癌細胞マイクロ環境における癌細胞等の細胞で発現されるＥＤＢ－ＦＮ及び／又はＥＤＡ－ＦＮとのプローブの結合又は錯化を検出可能で十分な量である。「イメージング有効量」は、癌細胞又は癌細胞マイクロ環境における癌細胞等のＥＤＢ－ＦＮ及び／又はＥＤＡ－ＦＮとの分子プローブの結合又は錯化をイメージングすることが可能な量である。
【0104】
投与される分子プローブの処方は、選択された投与経路（例えば、溶液、エマルション、カプセル等）に応じて変化する。適切な薬学的に許容される担体には、化合物の生物活性を過度に阻害しない不活性成分が含まれていてもよい。薬学的に許容される担体は、被験者に投与した際に、非毒性、非炎症性、非免疫原性、且つその他の不要な反応を含まなく、生体適合性を有する担体であればよい。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（同上）で説明されているように、標準的な医薬製剤技術を用いることができる。非経口投与のための好適な医薬担体としては、例えば、无菌水、生理食塩水、殺菌性生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍＬベンジルアルコールを含む食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、Ｈａｎｋ溶液、リン酸乳酸塩等が挙げられる。
【0105】
有効成分が溶解又は分散された薬理学的組成物の調製は、当業者にとって周知である。通常、このような組成物は、典型的には、液体の溶液又は懸濁液の形態で注射剤として調製されるが、溶液、懸濁液に適した固体形態のものを調製することもできる。処方は、選択された投与経路（例えば、溶液、エマルション、カプセル等）に応じて変化する。
【0106】
いずれのポリペプチド又は化合物は、薬学的に許容される塩の形態で使用されてもよい。ポリペプチドと塩を形成することができる酸は、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸等の無機酸が挙げられる。
【0107】
ポリペプチドと塩を形成することができる塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、モノ、ジ、トリ－アルキル、アリールアミン等の有機塩基（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）、及び必要に応じてアミン類（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン等）等が挙げられる。
【0108】
以下の実施例は、例示を目的とするものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。
【実施例】
【0109】
実施例１：エクストラドメイン－ＢフィブロネクチンのＭＲ分子イメージングによる薬剤耐性大腸癌の非侵襲的な評価及び治療モニタリング
大腸癌（ＣＲＣ）は、米国の男性と女性の癌死亡の２番目に、一般的な原因である。２０１３年目のＣＲＣケースの５年生存率は、段階Ｉの８．１％から段階ＩＶの１２．６％に減少した。複数回の研究や臨床試験は、予防スクリーニングがＣＲＣモル度が大幅に低減されていることが判明した。化学療法や手術は初期段階で高度に治療可能であるが、転移性ＣＲＣの８０～９０％は診断時に手術できず、新しい補助化学療法が必要である。また、多薬剤耐性の発達は、再発や遠方転移にもつながり、これらは治癒不可能である。ＣＲＣ処理モニタリングの現在の基準は、ＲＥＣＩＳＴ（ソリッド腫瘍の応答評価基準）ガイドライン（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ， Ｅ．Ａ．等、 Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ２００９． ４５（２）： ｐ． ２２８－４７）に従い、腫瘍の解剖学的サイズへの依存、主観的な意見につながる病変の不規則性、及び治療応答の負の腫瘍の検出の遅れのために制限されている。化学治療法又は標的治療法の結果を向上させるとともに、適応的な介入の意思決定を可能とするために、非侵襲的な且つ反復の撮影の正確なモニタリング、浸潤性、薬剤耐性の腫瘍集団のモニタリングが不可欠である。
大腸癌（ＣＲＣ）は、米国の男性と女性の癌死亡の２番目に、一般的な原因である。２０１３年目のＣＲＣケースの５年生存率は、段階Ｉの８．１％から段階ＩＶの１２．６％に減少した。複数回の研究や臨床試験は、予防スクリーニングがＣＲＣモル度が大幅に低減されていることが判明した。化学療法や手術は初期段階で高度に治療可能であるが、転移性ＣＲＣの８０～９０％は診断時に手術できず、新しい補助化学療法が必要である。また、多薬剤耐性の発達は、再発や遠方転移にもつながり、これらは治癒不可能である。ＣＲＣ処理モニタリングの現在の基準は、ＲＥＣＩＳＴ（ソリッド腫瘍の応答評価基準）ガイドライン（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ， Ｅ．Ａ．等、 Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ２００９． ４５（２）： ｐ． ２２８－４７）に従い、腫瘍の解剖学的サイズへの依存、主観的な意見につながる病変の不規則性、及び治療応答の負の腫瘍の検出の遅れのために制限されている。化学治療法又は標的治療法の結果を向上させるとともに、適応的な介入の意思決定を可能とするために、非侵襲的な且つ反復の撮影の正確なモニタリング、浸潤性、薬剤耐性の腫瘍集団のモニタリングが不可欠である。
【0110】
臨床的なＣＲＣ診断では、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）やグアイＡＣ系ＦｅＡｌ（ＧＯＢＴ）のように、感度や特異性が低い血液型マーカーが利用されている。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の変異負荷を測定する液体バイオプラスチックは、患者間、腫瘍間及び腫瘍内の不均一性を反映し、診断・予後診断において運動量が速いが、腫瘍性病変に関する空間的な情報を提供することができず、診断画像化が不可欠である。一般的なＣＲＣ治療モニタリングのための撮影モダリティは、ＰＥＴ－ＣＴ（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ－コンピュータ断層撮影）であり、通常、機能や代謝データを提供する［１８Ｆ］－フルオロ－２－デオキシグルコース（１８Ｆ－ＦＤＧ）放射性を有しているが、細胞密度、高血糖、分解能のような放射線露光及び交絡因子によって制限される。造影磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）では、組織のＴ１の基を短くするＧｄ（ＩＩＩ）系造影剤（ＧＢＣＡ）が用いられ、ＣＲＣの診断やモニタリングにはＴ１強調撮影も日常的に用いられている。Ｊｈａｖｅｒｉ， Ｋ．Ｓ．和Ｈ． Ｈｏｓｓｅｉｎｉ－Ｎｉｋ， ＡＪＲ Ａｍ Ｊ Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ， ２０１５． ２０５（１）： ｐ． Ｗ４２－５５。この現在の臨床的評価は、臨床的な非標的のＧＢＣＡＳが非特異的であり、かつ、攻撃的な薬剤耐性腫瘍と感受性腫瘍から区別することができないという重大な課題となっており、ＧＢＣＡの繰り返し投与は、Ｇｄ系の毒性や脳沈着の潜在的安全性に関連している。ＣＲＣ腫瘍の広範な分子及び表現型可塑性を有することを考えると、個々の腫瘍や腫瘍の生体関連マイクロ環境特性の変化に基づいて、腫瘍治療中のＣＲＣの軌跡を正確に特定することができる分子イメージング剤及び戦略を開発することが必須である。
【0111】
これまで分子癌イメージングの分野は、限られた数で研究され、信頼性の高いバイオマーカーの発見に起因する可能性がある。大腸癌分泌タンパク質２（ＣＣＳＰ－２）は、原発性腫瘍、患者由来の異種移植片、及び肝転移の近赤外蛍光イメージングの分子マーカーとして使用されているが、、このマーカーは大腸明細胞腫にのみ特異的である。広く報告されている磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）研究では、ヒト腫瘍抗原低グリコシル化ムチン１（ｕＭＵＣ１）を標的とするＭＲＩによる酸化鉄ナノ粒子の検出と、アポトーシス促進システイン（ｃａｓｐａｓｅｓ）特異的プローブステントのナノ凝集とが、大腸異種移植片の化学療法反応をモニターするために用いられている。Ｚｈｏｕ，Ｚ．ら，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ，２０１９．３１（８）：ｐ．ｅ１８０４５６７。また、血管体積分率（ＶＶＦ）、Ｋ－ＲＡＳ変異、及びＥＧＦＲは、ＣＲＣ ＭＲＩの代替マーカーとしても使用されているが、成功率が限定的である。しかし、薬剤耐性ＣＲＣの非侵襲的な評価及び治療モニタリングのためのＭＲ分子イメージング（ＭＲＭＩ）は、従来は全く行われていない。この課題を解決するために、ＭＮＰの免疫及び翻訳のハードルを回避し、より広範囲の薬剤耐性癌を標的とし、腫瘍細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中の多量に発現する癌タンパク質エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）を標的とするＭＲＭＩ戦略が開発されている。Ｈａｎ， Ｚ．及びＺ．Ｒ． Ｌｕ， Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｃｈｅｍ Ｂ， ２０１７． ５（４）： ｐ． ６３９－６５４；Ｌｕ， Ｚ．Ｒ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ， ２０１７． ３： ｐ． ６７－７３。
【0112】
ＥＤＢ－ＦＮは、癌胚型フィブロネクチンサブタイプを多数の癌で過剰発現させている。Ｈａｎ，Ｚ．ら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２０１７．２８（４）：ｐ．１０３１－１０４０；Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１７．８（１）：ｐ．６９。また、ＥＤＢ－ＦＮは、ＣＲＣにおいても上昇し、血管新生、成長、組織の再造形に関連している。Ｓａｎｔｉｍａｒｉａ，Ｍ．ら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００３．９（２）：ｐ．５７１－９。特許文献の研究では、同じ癌タイプであっても、不活性フィブロネクチンに比べて、ＥＤＢ－ＦＮがより浸潤的な細胞及び腫瘍サブタイプでも優先的に上昇することが示されている。Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ，２０１８．７９（６）：ｐ．３１３５－３１４３。悪性腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮの特異的空間的と時間的発現及び健康な組織におけるその欠損は、分子イメージング及び標的治療のための引力的な標的となる。Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２０１９．３０（５）：ｐ．１４２５－１４３３。ＥＤＢ－ＦＮ特異的ペプチドＺＤ２と臨床ＧＢＣＡ Ｇａｄｏｔｅｒｉｏｌとの結合によって、ＥＤＢ－ＦＮ標的ＧＢＣＡ、ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＭＴ２１８）（Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２０１５．２６（５）：ｐ．８３０－８））を設計し開発し、２０μｍｏｌ／ｋｇ（臨床線量の１／５）のような低線量であっても、ＥＤＢ－ＦＮが豊富な前立腺と乳癌のリスク成層化のための効率的なＭＲＭの使用を促進し、その翻訳用途と優れた安全プロファイルを強調することが証明されている。独立したグループは、ＥＤＰ－ＦＮに関連するこれらの研究を行ったが、薬剤耐性のあるＣＲＣにおけるＥＤＢ－ＦＮの発現プロファイルについては検討されていない。また、薬剤耐性のあるＣＲＣの治療応答を評価するための分子マーカーとしてＥＤＢ－ＦＮを用いることの可能性は、未踏である。
【0113】
ここで、第１回目に、ＥＤＢ－ＦＮとＭＴ２１８のＭＲＭＩが、ＥＤＢ－ＦＮレベルが著しく上昇した薬剤耐性ＣＲＣ腫瘍の効果的で非侵襲的な評価及び治療応答モニタリングを促進することを初めて実証した。皮下に移植した薬剤耐性のＣＲＣエノットは、それぞれの薬物感受性と比較して、ＭＴ２１８の４０μｍｏｌ／ｋｇの線量でロバストなシグナル増強を示した。また、ＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩは、標的汎－ＡＫＴ阻害剤ＭＫ２２０６ ＨＣｌに対する薬剤耐性ＣＲＣ腫瘍の陰性反応のモニタリングを正常なモニタリングのためにも使用されることで（Ａｇａｒｗａｌ，Ｅ．ら，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２０１４）．１４：ｐ．１４５）、治療予測マーカーとしてのＥＤＢ－ＦＮの可能性を示す。また、ＥＤＢ－ＦＮの上昇は、大腸癌患者の予後不良に相関した。これまで、ＣＲＣイメージング及び治療モニタリングの分子マーカーとして薬剤耐性媒介ＥＤＢ－ＦＮのアップリッページを使用する説得力の生体内証拠を提供する最初で唯一の報告書のみである。
【0114】
略語
ＣＯＡＤ：大腸腺癌、ＣＮＲ：コントラスト対ノイズ比、ＣＲＣ：大腸癌、ＥＣＭ：細胞外マトリックス、ＥＤＢ－ＦＮ：エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン、ＥＭＴ：上皮間葉転換、ＧＢＣＡ：ガドリニア系造影剤、５’－ＦＵ：５’－フルオロウラシル、ＧＴＥｘ：ＧｅｎｏｔｙＰＥ－組織式、ＭＤＲ１：多重薬剤耐性１、ＭＲＭＩ：磁気共鳴分子イメージング、ＰＥＴ－ＣＴ：ＰｏｓｉｔｒｏｎＥｍｉｓｓｉｏｎＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ－コンピュータ断層撮影；ＴＣＧＡ：癌ゲノムアトラス。
ＣＯＡＤ：大腸腺癌、ＣＮＲ：コントラスト対ノイズ比、ＣＲＣ：大腸癌、ＥＣＭ：細胞外マトリックス、ＥＤＢ－ＦＮ：エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン、ＥＭＴ：上皮間葉転換、ＧＢＣＡ：ガドリニア系造影剤、５’－ＦＵ：５’－フルオロウラシル、ＧＴＥｘ：ＧｅｎｏｔｙＰＥ－組織式、ＭＤＲ１：多重薬剤耐性１、ＭＲＭＩ：磁気共鳴分子イメージング、ＰＥＴ－ＣＴ：ＰｏｓｉｔｒｏｎＥｍｉｓｓｉｏｎＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ－コンピュータ断層撮影；ＴＣＧＡ：癌ゲノムアトラス。
【0115】
方法
細胞培養
ＣＲＣ細胞系ＤＬＤ－１とＲＫＯとは、ＡＴＣＣ（ＭＡＮＡＳＡＳ、ＶＡ）から購入した。これらのそれぞれの薬剤耐性誘導体、ＤＬＤ１－ＤＲ、及びＲＫＯ－ＤＲは、Ｚｅｎｇｈｅ ＷＡＮＧ（ＣＷＲＵ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）の研究所からの寛大な贈り物である。ＤＬＤ１－ＤＲ細胞は、５’－フルオロウラシル（５’－ＦＵ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に対して薬剤耐性を産生し、そのＩＣ５０は、２１０．６μＭであり、ＤＬＤ－１細胞のＩＣ５０は、２．５μＭである。 Ｚｈｕ，Ｈ．ら，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，２００５．４（３）：ｐ．４５１－６。ＲＫＯ－ＤＲ細胞は、１０ μＭ ５’－ＦＵ及び１５ μＭ ＣＢ－８３９（グルタミナーゼ阻害剤、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）の併用療法に対して耐性を生じる。ＤＬＤ－１及びＤＬＤ１－ＤＲ細胞をＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で培養した。ＲＫＯ及びＲＯＤ－ＤＲ細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。両方の培地に１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを添加した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。
細胞培養
ＣＲＣ細胞系ＤＬＤ－１とＲＫＯとは、ＡＴＣＣ（ＭＡＮＡＳＡＳ、ＶＡ）から購入した。これらのそれぞれの薬剤耐性誘導体、ＤＬＤ１－ＤＲ、及びＲＫＯ－ＤＲは、Ｚｅｎｇｈｅ ＷＡＮＧ（ＣＷＲＵ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）の研究所からの寛大な贈り物である。ＤＬＤ１－ＤＲ細胞は、５’－フルオロウラシル（５’－ＦＵ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に対して薬剤耐性を産生し、そのＩＣ５０は、２１０．６μＭであり、ＤＬＤ－１細胞のＩＣ５０は、２．５μＭである。 Ｚｈｕ，Ｈ．ら，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，２００５．４（３）：ｐ．４５１－６。ＲＫＯ－ＤＲ細胞は、１０ μＭ ５’－ＦＵ及び１５ μＭ ＣＢ－８３９（グルタミナーゼ阻害剤、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）の併用療法に対して耐性を生じる。ＤＬＤ－１及びＤＬＤ１－ＤＲ細胞をＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で培養した。ＲＫＯ及びＲＯＤ－ＤＲ細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。両方の培地に１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを添加した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。
【0116】
ウェスタンブロット
全タンパク質抽出は、細胞ペレットを細胞溶解バッファー（ＰＢＳにおけるプロテアーゼ阻害剤とＬａｅｍｍｌｉ緩衝液との１：１混合物）で処理した後、１００℃で１０分間インキュベートした後、１５０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離して行った。抽出液の蛋白質濃度は、製造者の指示（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従って、Ｌｏｗｒｙのアッセイキットを用いて求めた。同量のタンパク質抽出物（４０μｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥに装填し、電気泳動を行い、ニトロセルロース膜上に転写した。一次抗体（１：１０００希釈、４℃で一晩インキュベート）は、抗－ＭＤＲ１、抗－Ｅ－カドヘリン及び抗－β－アクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）及び抗－Ｎ－カドヘリン（１：５００希釈、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いた。二次抗体をインキュベートした後（１：１２０００で２ｈ希釈）、Ｓｉｇｎａｌ Ｆｉｒｅ Ｐｌｕｓ ＥＣＬキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて膜を展開し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭＸＲＳ＋イメージャー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上に撮影した。バンド強度の定量は、ＦＩＪＩ及びＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）ソフトウェアを用いて行った。
全タンパク質抽出は、細胞ペレットを細胞溶解バッファー（ＰＢＳにおけるプロテアーゼ阻害剤とＬａｅｍｍｌｉ緩衝液との１：１混合物）で処理した後、１００℃で１０分間インキュベートした後、１５０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離して行った。抽出液の蛋白質濃度は、製造者の指示（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に従って、Ｌｏｗｒｙのアッセイキットを用いて求めた。同量のタンパク質抽出物（４０μｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥに装填し、電気泳動を行い、ニトロセルロース膜上に転写した。一次抗体（１：１０００希釈、４℃で一晩インキュベート）は、抗－ＭＤＲ１、抗－Ｅ－カドヘリン及び抗－β－アクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）及び抗－Ｎ－カドヘリン（１：５００希釈、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いた。二次抗体をインキュベートした後（１：１２０００で２ｈ希釈）、Ｓｉｇｎａｌ Ｆｉｒｅ Ｐｌｕｓ ＥＣＬキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて膜を展開し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭＸＲＳ＋イメージャー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上に撮影した。バンド強度の定量は、ＦＩＪＩ及びＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）ソフトウェアを用いて行った。
【0117】
ｑＲＴ－ＰＣＲ
ＣＲＣ細胞からの全ＲＮＡ抽出は、メーカーのプロトコルに従い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用いて行った。ｃＤＮＡは、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（ＱＩＡＧＥＮ）と逆転写して生成し、ＱＰＣＲは、ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。相対遺伝子発現は、２－ΔΔＣＴ法により測定した。ハウスキーピング遺伝子としては、β－アクチンを用いた。
ＣＲＣ細胞からの全ＲＮＡ抽出は、メーカーのプロトコルに従い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用いて行った。ｃＤＮＡは、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（ＱＩＡＧＥＮ）と逆転写して生成し、ＱＰＣＲは、ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。相対遺伝子発現は、２－ΔΔＣＴ法により測定した。ハウスキーピング遺伝子としては、β－アクチンを用いた。
【0118】
浸潤・遊走試験
標準的なｔｒａｎｓｗｅｌｌ実験を行い、ＣＲＣ細胞の遊走・浸潤を評価した。遊走をテストする場合には、１０００００個のＣＲＣ細胞（空腹一晩）をｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）に入れた。翌日、小室は、内部で拭き取られ、未遊走の細胞を除去した。小室底部の泳動細胞を１０％ホルマリン（１０分）で固定した後、０．１％クリスタルバイオレットで染色し（２０分）固定した。過剰の汚れを洗浄し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌを乾燥させ、１０倍対物レンズを用いてＭｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラで撮影する。侵入入をテストするために、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓは、１ｍｇ／ｍＬ ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）でコーティングされ、ＣＲＣ細胞がマトリゲル層及び小室多孔質膜に侵入する能力を評価するために使用される。この測定のために約２０００００個のＣＲＣ細胞（空腹一晩）を行い、上記と同様の処理を行った。なお、侵入及び移行細胞の定量は、ＦＩＪＩ（ＦＩＪＩ ｉｓ Ｊｕｓｔ ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェアを用いて行った。
標準的なｔｒａｎｓｗｅｌｌ実験を行い、ＣＲＣ細胞の遊走・浸潤を評価した。遊走をテストする場合には、１０００００個のＣＲＣ細胞（空腹一晩）をｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）に入れた。翌日、小室は、内部で拭き取られ、未遊走の細胞を除去した。小室底部の泳動細胞を１０％ホルマリン（１０分）で固定した後、０．１％クリスタルバイオレットで染色し（２０分）固定した。過剰の汚れを洗浄し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌを乾燥させ、１０倍対物レンズを用いてＭｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラで撮影する。侵入入をテストするために、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓは、１ｍｇ／ｍＬ ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）でコーティングされ、ＣＲＣ細胞がマトリゲル層及び小室多孔質膜に侵入する能力を評価するために使用される。この測定のために約２０００００個のＣＲＣ細胞（空腹一晩）を行い、上記と同様の処理を行った。なお、侵入及び移行細胞の定量は、ＦＩＪＩ（ＦＩＪＩ ｉｓ Ｊｕｓｔ ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェアを用いて行った。
【0119】
３Ｄ培養及びＺＤ２－Ｃｙ５．５染色
３Ｄ培養におけるＣＲＣ細胞の増殖能を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養を用いて試験した。約９０００００個のＣＲＣ細胞を、ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ膜マトリックスの厚い層でコーティングされた４ウェルマイクロスライド（Ｉｂｉｄｉ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ）に入れた。１０Ｘ対物レンズ付きＭｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラを用いて、腫瘍スフェロイド／類器官形成を４日間モニタリングし、撮影した。ＥＤＢ－ＦＮ発現を試験するために、腫瘍スフェロイドを１００ｎＭ ＺＤ２－Ｃｙ５．５と５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ－３３３４２で３０分間インキュベートした。過剰の色素をＰＢＳで３回洗浄し、１０Ｘ及び２０Ｘ対物レンズのＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｊａｐａｎ）で蛍光イメージングを行った。画像処理は、ＦＩＪＩを用いて行った。
３Ｄ培養におけるＣＲＣ細胞の増殖能を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養を用いて試験した。約９０００００個のＣＲＣ細胞を、ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ膜マトリックスの厚い層でコーティングされた４ウェルマイクロスライド（Ｉｂｉｄｉ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ）に入れた。１０Ｘ対物レンズ付きＭｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラを用いて、腫瘍スフェロイド／類器官形成を４日間モニタリングし、撮影した。ＥＤＢ－ＦＮ発現を試験するために、腫瘍スフェロイドを１００ｎＭ ＺＤ２－Ｃｙ５．５と５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ－３３３４２で３０分間インキュベートした。過剰の色素をＰＢＳで３回洗浄し、１０Ｘ及び２０Ｘ対物レンズのＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｊａｐａｎ）で蛍光イメージングを行った。画像処理は、ＦＩＪＩを用いて行った。
【0120】
マウスモデル
ジャクソン研究所（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）から裸の胸なし腺マウス（６週のｎｕ／ｎｕ雌性）を購入し、ＣＷＲＵの動物施設に収納した。全ての動物実験は、ＣＷＲＵ ＩＡＣＣにより承認されたプロトコルに従って実施した。薬剤耐性を評価するために、２個薬剤耐性及び２種類の非薬剤耐性モデルを設定した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ－ＰＢＳ混合物（１：１）に懸濁した約３～４×１０６個ＤＬＤ－１、ＲＫＯ、ＤＬＤ１－ＤＲ、及びＲＫＯ－ＤＲ細胞をヌードマウスの左側面（各マウス１００μＬ、各群５匹×４モデル＝２０匹）腹に皮下注射した。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に到達した９日後に、４０μｍｏｌ／ｋｇ線量のＭＴ２１８を用いて４つの異種移植モデルにＭＲＭＩを投与した。その後、動物を安楽死させ、解剖組織学とＩＨＣのために腫瘍を採取した。
ジャクソン研究所（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）から裸の胸なし腺マウス（６週のｎｕ／ｎｕ雌性）を購入し、ＣＷＲＵの動物施設に収納した。全ての動物実験は、ＣＷＲＵ ＩＡＣＣにより承認されたプロトコルに従って実施した。薬剤耐性を評価するために、２個薬剤耐性及び２種類の非薬剤耐性モデルを設定した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ－ＰＢＳ混合物（１：１）に懸濁した約３～４×１０６個ＤＬＤ－１、ＲＫＯ、ＤＬＤ１－ＤＲ、及びＲＫＯ－ＤＲ細胞をヌードマウスの左側面（各マウス１００μＬ、各群５匹×４モデル＝２０匹）腹に皮下注射した。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に到達した９日後に、４０μｍｏｌ／ｋｇ線量のＭＴ２１８を用いて４つの異種移植モデルにＭＲＭＩを投与した。その後、動物を安楽死させ、解剖組織学とＩＨＣのために腫瘍を採取した。
【0121】
治療モニタリングのために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ－ＰＢＳ混合物（１：１）に懸濁した３～４×１０６個ＤＬＤ１－ＤＲ細胞を１０匹ヌードマウスの左側面（各マウス１００μＬ、Ｔｍ１～Ｔｍ１０に標識したマウス）に皮下注射した。ノギスを用いて、腫瘍体積を週に１回モニタリングし、測定した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達すると、マウスは、各群５匹でビークル群（マウス＃ＴＭ１、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５及びＴＭ１０）及び処理群（マウス＃ＴＭ２、ＴＭ６、ＴＭ７、ＴＭ８及びＴＭ９）の２つのグループに分けられる。週に１回、治療群のマウスは、ＭＫ２２０６－ＨＣｌ（１００ｍｇ／ｋｇ）を受け、ビークル群のマウスは、前述のように同量のＤＭＳＯを注射した。Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ａ．， Ｌ．Ｊ． ＳｔａｌｌｏｎｓとＲ．Ｇ． Ｓｃｈｎｅｌｌｍａｎｎ， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０１４． ３０７（４）： ｐ． Ｆ４３５－４４。３週間の処理後に、腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えて増加し、実験を終了した。その後、動物を安楽死させ、腫瘍を採取し解剖組織学とＩＨＣを行う。腫瘍体積は、［（幅）２×長さ］／２として算出した。
【0122】
ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩ
ＭＴ２１８は、前述と同様にして合成した。Ａｙａｔ，Ｎ．Ｒ．ら，ＡＣＳ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２０１８．９（７）：ｐ．７３０－７３５。簡潔に説明すると、室温でＣｕＳＯ４及びアスコルビン酸ナトリウムの存在下で、アルキニルーＺＤ２とＮ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）とのクリック反応を行い、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（ｍ．ｗ．１４４３）により、ＦＬＡＳＨクロマトグラフィー精製及びＭＴ２１８の検証を行った。薬剤耐性及び治療用モニタリングを評価するために、マウスショートクワッドコイル（ｍｏｕｓｅ ｓｈｏｒｔ ｑｕａｄ ｃｏｉｌ）を備えた３Ｔ ＭＲＳ ３０００スキャナ（ＭＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）でＭＲＭＩを行った。マウスをイソフルオランで麻酔し、尾静脈カテーテルを設定した。Ｔ１－強調ＭＲ画像は、ＭＴ２１８［ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）］の４０μｍｏｌ／ｋｇ用量を注射する前（比較前）と２５分後（比較後）を求めた。次の２つのシーケンスが呼吸同期に使用され、軸位断高速スピンエコー（ＦＳＥ）（ＴＲ＝３０５ｍｓ、ＴＥ＝１１ｍｓ、ＦＡ＝９０°、ＦＯＶ＝４０ｍｍ×４０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、スライス番号＝１５、Ｎａｖ＝２、マトリックス＝２５６×２５６）、及びコロナルＦＳＥ（ＴＲ＝３０５ｍｓ、ＴＥ＝１１ｍｓ、ＦＡ＝９０°、ＦＯＶ＝９０ｍｍ×９０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、スライス番号＝２０、Ｎａｖ＝１、マトリックス＝２４８×５１２）の２つのシーケンスを用いた。治療モニタリングのために、ＤＬＤ１－ＤＲ腫瘍を有する１０匹のマウスにおいて、ベースラインＭＲＭＩ（第１週）及びエンドポイントＭＲＭＩ（４週間）は、上記の配列の４０μｍｏｌ／ｋｇ ＭＴ２１８用量を用いて行った。コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）は、（平均腫瘍強度－平均筋強度）／ノイズ標準偏差として計算される。ＦＩＪＩソフトウェアを用いた画像・ＣＮＲ解析ＲＯＩは、腫瘍全体、２～４筋肉領域及び背景の周りに描かれる。ＣＮＲ分析は、２個体により独立して行い、バイアスを回避した。
ＭＴ２１８は、前述と同様にして合成した。Ａｙａｔ，Ｎ．Ｒ．ら，ＡＣＳ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２０１８．９（７）：ｐ．７３０－７３５。簡潔に説明すると、室温でＣｕＳＯ４及びアスコルビン酸ナトリウムの存在下で、アルキニルーＺＤ２とＮ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）とのクリック反応を行い、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（ｍ．ｗ．１４４３）により、ＦＬＡＳＨクロマトグラフィー精製及びＭＴ２１８の検証を行った。薬剤耐性及び治療用モニタリングを評価するために、マウスショートクワッドコイル（ｍｏｕｓｅ ｓｈｏｒｔ ｑｕａｄ ｃｏｉｌ）を備えた３Ｔ ＭＲＳ ３０００スキャナ（ＭＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）でＭＲＭＩを行った。マウスをイソフルオランで麻酔し、尾静脈カテーテルを設定した。Ｔ１－強調ＭＲ画像は、ＭＴ２１８［ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）］の４０μｍｏｌ／ｋｇ用量を注射する前（比較前）と２５分後（比較後）を求めた。次の２つのシーケンスが呼吸同期に使用され、軸位断高速スピンエコー（ＦＳＥ）（ＴＲ＝３０５ｍｓ、ＴＥ＝１１ｍｓ、ＦＡ＝９０°、ＦＯＶ＝４０ｍｍ×４０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、スライス番号＝１５、Ｎａｖ＝２、マトリックス＝２５６×２５６）、及びコロナルＦＳＥ（ＴＲ＝３０５ｍｓ、ＴＥ＝１１ｍｓ、ＦＡ＝９０°、ＦＯＶ＝９０ｍｍ×９０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、スライス番号＝２０、Ｎａｖ＝１、マトリックス＝２４８×５１２）の２つのシーケンスを用いた。治療モニタリングのために、ＤＬＤ１－ＤＲ腫瘍を有する１０匹のマウスにおいて、ベースラインＭＲＭＩ（第１週）及びエンドポイントＭＲＭＩ（４週間）は、上記の配列の４０μｍｏｌ／ｋｇ ＭＴ２１８用量を用いて行った。コントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）は、（平均腫瘍強度－平均筋強度）／ノイズ標準偏差として計算される。ＦＩＪＩソフトウェアを用いた画像・ＣＮＲ解析ＲＯＩは、腫瘍全体、２～４筋肉領域及び背景の周りに描かれる。ＣＮＲ分析は、２個体により独立して行い、バイアスを回避した。
【0123】
ヒト及びマウス組織における免疫組織化学
ＣＷＲＵにおけるヒト組織調達設備（Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から、識別及び分類された原発性大腸腺癌（ｎ＝６）、肝臓転移（ｎ＝４）、及びそれに対応する正常な隣接組織（ｎ＝６＋４）を含む組織試料を取得した。剥離したマウス腫瘍組織を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、１μｍスライスに切断した。染色及びＩＨＣのサービスは、症例総合癌中心組織資源コア施設（Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｓｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、及びクリーブランド大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）により提供された。スライドをＨ＆Ｅで染色し、形態学を可視化した。免疫組織化学は、前述したように、抗ＥＤＢ－ＦＮ抗体Ｇ４クローン（１：１００希釈、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＵＫ）免疫組織化学を用いて行った。全てのスライドについて、認定医によって検討される。ＩＨＣ画像は、４０Ｘ対物レンズ付けＢｘ６１ＶＳスライド走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて得られ、ＯｌｙＶＩＡソフトウェアで処理される。
ＣＷＲＵにおけるヒト組織調達設備（Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から、識別及び分類された原発性大腸腺癌（ｎ＝６）、肝臓転移（ｎ＝４）、及びそれに対応する正常な隣接組織（ｎ＝６＋４）を含む組織試料を取得した。剥離したマウス腫瘍組織を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、１μｍスライスに切断した。染色及びＩＨＣのサービスは、症例総合癌中心組織資源コア施設（Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｓｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、及びクリーブランド大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）により提供された。スライドをＨ＆Ｅで染色し、形態学を可視化した。免疫組織化学は、前述したように、抗ＥＤＢ－ＦＮ抗体Ｇ４クローン（１：１００希釈、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＵＫ）免疫組織化学を用いて行った。全てのスライドについて、認定医によって検討される。ＩＨＣ画像は、４０Ｘ対物レンズ付けＢｘ６１ＶＳスライド走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて得られ、ＯｌｙＶＩＡソフトウェアで処理される。
【0124】
遺伝子データ及び統計解析
ＧｅＰＩＡ２には、ＥＤＰ－ＦＮ発現に関する総生存率（ＯＳ）と増殖なし生存率（ＰＦＳ）データ（転写物ＩＤ：ＥＮＳＴ０００００４３２０７２．６）のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線がＧＥＰＩＡ２に導出された。Ｔａｎｇ，Ｚ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１７．４５（Ｗ１）：ｐ．Ｗ９８－Ｗ１０２。該Ｗｅｂサーバは、ＴＣＧＡ及びＧＴＥｘデータベースから、腫瘍／正常データ及び正常組織データ（１００万回あたりの転写スクリプト）をそれぞれ評価し、対数ランク（Ｌｏｇ－ｒａｎｋ）又はＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定を用いて統計的生存分析を行い、Ｃｏｘ－ＰＨモデルを用いてハザード比（ＨＲ）計算を行った。
ＧｅＰＩＡ２には、ＥＤＰ－ＦＮ発現に関する総生存率（ＯＳ）と増殖なし生存率（ＰＦＳ）データ（転写物ＩＤ：ＥＮＳＴ０００００４３２０７２．６）のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線がＧＥＰＩＡ２に導出された。Ｔａｎｇ，Ｚ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１７．４５（Ｗ１）：ｐ．Ｗ９８－Ｗ１０２。該Ｗｅｂサーバは、ＴＣＧＡ及びＧＴＥｘデータベースから、腫瘍／正常データ及び正常組織データ（１００万回あたりの転写スクリプト）をそれぞれ評価し、対数ランク（Ｌｏｇ－ｒａｎｋ）又はＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定を用いて統計的生存分析を行い、Ｃｏｘ－ＰＨモデルを用いてハザード比（ＨＲ）計算を行った。
【0125】
なお、何ら規定しない限り、すべての実験は、少なくとも３回（ｎ＝３）独立して繰り返した。 データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３を使用して統計分析を行う。ペアなしｔで検定し、２つのグループ間のデータ（正規分布）を比較する。それ以外の場合は、関連する凡例で説明されているように、非パラメトリック テスト （Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕテスト）を使用する。複数の細胞系の時間プロセスＭＲＭＩデータは、Ｔｕｋｅｙ補正を有する双方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって解析される。ｐ＜０．０５は、統計的に重要であると考えられる。
【0126】
結果
獲得性薬剤耐性は、ＣＲＣ細胞の遊走及び浸潤を増強する。
独立した２種の薬剤耐性のＣＲＣ線が作製され、ＤＬＤ－１細胞における５’－ＦＵ療法の長期使用によって産生されたＤＬＤ１－ＤＲ及びＲＫＯ－ＤＲ細胞における５’－ＦＵ及びＣＢ－８３９併用療法によるＲＫＯ－ＤＲの生成、及び生物学的特性の評価。２Ｄ及び３Ｄ培養で増殖した細胞の形態を、位相差顕微鏡で観察した。ＤＤＬ－１細胞は、２Ｄ培養で規則的な上皮形態を示し、３Ｄ培養では多細胞ブドウ様クラスター（図１Ａ）を示したが、ＤＬＤ１－ＤＲ細胞は、２Ｄ培養で列島状体を形成し、３Ｄ培養では緻密なスフェロイドを形成した。ＲＫＯとＲＯＤ－ＤＲ細胞の単層培養では、明らかな形態学的差異を示さなかった（図１Ｂ）。一方、３Ｄ培養では、ＲＫＯ－ＤＲ細胞は、緻密で凝集した腫瘍スフェロイドを形成しやすく、ＲＫＯ細胞はスフェロイドを形成することができない。これらの結果は、単層培養、３Ｄ培養におけるＣＲＣ細胞株間の異なる形態学的変化を示す。
獲得性薬剤耐性は、ＣＲＣ細胞の遊走及び浸潤を増強する。
独立した２種の薬剤耐性のＣＲＣ線が作製され、ＤＬＤ－１細胞における５’－ＦＵ療法の長期使用によって産生されたＤＬＤ１－ＤＲ及びＲＫＯ－ＤＲ細胞における５’－ＦＵ及びＣＢ－８３９併用療法によるＲＫＯ－ＤＲの生成、及び生物学的特性の評価。２Ｄ及び３Ｄ培養で増殖した細胞の形態を、位相差顕微鏡で観察した。ＤＤＬ－１細胞は、２Ｄ培養で規則的な上皮形態を示し、３Ｄ培養では多細胞ブドウ様クラスター（図１Ａ）を示したが、ＤＬＤ１－ＤＲ細胞は、２Ｄ培養で列島状体を形成し、３Ｄ培養では緻密なスフェロイドを形成した。ＲＫＯとＲＯＤ－ＤＲ細胞の単層培養では、明らかな形態学的差異を示さなかった（図１Ｂ）。一方、３Ｄ培養では、ＲＫＯ－ＤＲ細胞は、緻密で凝集した腫瘍スフェロイドを形成しやすく、ＲＫＯ細胞はスフェロイドを形成することができない。これらの結果は、単層培養、３Ｄ培養におけるＣＲＣ細胞株間の異なる形態学的変化を示す。
【0127】
次に、ウエスタンブロッティング及びｑＲＴ－ＰＣＲにより、ＣＲＣ細胞のシグナル伝達経路における薬剤耐性誘導の分子変化を解析した。薬剤流出ポンプ及び上皮間葉系転移（ＥＭＴ）は、薬剤耐性の発現と関連しているため、複数薬剤耐性タンパク質１（ＭＤＲ１）及びＥＭＴマーカー（Ｅ－カドヘリン及びＮ－カドヘリン）のタンパク質及びｍＲＮＡの発現が決定された。タンパク質レベルでは、ＤＬＤ１－ＤＲ細胞は、ＤＬＤ－１細胞よりも、ＭＤＲ－１の有意な上昇と適度なＥＭＴを示し、Ｅ－ｃａｄレベルは、適度に低下し、Ｎ－ｃａｄレベルは、増加した（図１Ｃ）。ｍＲＮＡレベルにおいて、ＤＬＤ１－ＤＲ細胞は、ＭＤＲ－１において４倍の増加を示し、Ｅ－ｃａｄ及びＮ－ｃａｄのｍＲＮＡレベルの変化がなかった（図１Ｄ）。一方、ＲＫＯ－ＤＲは、ＲＫＯ細胞に比べて、タンパク質（図１Ｅ）及びｍＲＮＡ（図１Ｆ）の両方において、大きく隆起したＭＤＲ１及びＥ－ｃａｄを示した。また、ＲＦＯ－ＤＲ細胞においてもＮ－ｃａｄ蛋白質発現が上昇し、ＲＯＤ－ＤＲ細胞における上皮細胞と間葉系細胞との混合物又は部分／ハイブリッドＥ－Ｍ表現型の存在が示している。
【0128】
ＣＲＣ細胞の遊走ポテンシャルを試験することにより、ＣＲＣ細胞における獲得性薬剤耐性による機能的影響を評価した。図１Ｇ－Ｈ及び図Ｓ１Ｂ－Ｃに示すように、ＤＬＤ１－ＤＲ及びＲＫＯ－ＤＲ細胞は、トランスウェル膜を通過することによっての移行の増加と、トランスウェル膜上に塗布された追加のＭａｔｒｉｇｅｌ層を通過することによっての浸潤の増加とを示す。要約すると、これらの結果は、ＣＲＣ細胞が薬剤耐性の獲得による明らかな形態学的及び分子的変化にかかわらず、親細胞よりも有意な浸潤的優位性を得たことを示している。
【0129】
獲得性薬剤耐性は、ＣＲＣ細胞における向上したＥＤＢ－ＦＮ発現に関連する。
先に述べたように、ＥＤＢ－ＦＮは、薬剤耐性、浸潤性乳癌（Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１７．８（１）：ｐ．６９２）及び積極的な前立腺癌に過剰発現していることが分かった。Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２０１７．２８（４）：ｐ．１０３１－１０４０。ここでは、ｑＲＴ－ＰＣＲとＥＤＢ－ＦＮ－特異的ペプチドプローブＺＤ２－Ｃｙ５．５（Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２０１５．２６（５）：ｐ．８３０－８）を用いて、薬剤耐性の発現は、ＣＲＣ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ発現増加の有無を評価した。
先に述べたように、ＥＤＢ－ＦＮは、薬剤耐性、浸潤性乳癌（Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１７．８（１）：ｐ．６９２）及び積極的な前立腺癌に過剰発現していることが分かった。Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２０１７．２８（４）：ｐ．１０３１－１０４０。ここでは、ｑＲＴ－ＰＣＲとＥＤＢ－ＦＮ－特異的ペプチドプローブＺＤ２－Ｃｙ５．５（Ｈａｎ，Ｚ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２０１５．２６（５）：ｐ．８３０－８）を用いて、薬剤耐性の発現は、ＣＲＣ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ発現増加の有無を評価した。
【0130】
図２Ａに示すように、ＤＬＤ－１とＤＬＤ１－ＤＲ細胞ともにＥＤＢ－ＦＮを表しており、ＺＤ２－Ｃｙ５．５結合で明らかになった。しかしながら、ＤＬＤ１－ＤＲ細胞は、より明るい蛍光シグナルを示し、ＺＤ２－Ｃｙ５．５がより高い結合を示し、これはＤＬＤ－１細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡレベルの３倍の増加によって確認された（図２Ｂ）。また、ＤＬＤ１－ＤＲ細胞（Ｃａ）において、全ＦＮ１発現は、薬剤耐性とともに増加することも確認された（約３倍、図形２Ｃ）。同様に、ＲＫＯとＲＫＯ－ＤＲ細胞の両方がＥＤＢ－ＦＮを分泌するのに対し、後者ではその発現が著しく高く、これは明暗度の強いＺＤ２－Ｃｙ５．５染色（図２Ｄ）及び、ＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡ（図２Ｅ）の約４．５倍の増加（図２Ｅ）に反映されている。全Ｆｎ１は、ＲＦＯ－ＤＲ細胞（図２Ｆ）において１．５倍に増加しただけであった。これらの結果から、ＣＲＣ細胞における得られた薬剤耐性は、ＥＤＢ－ＦＮ過剰発現に関与していることが確認された。
【0131】
ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮの造影増強ＭＲＭＩは、薬剤耐性のあるＣＲＣ腫瘍の効果的な鑑別診断に寄与する。
非耐性と薬剤耐性のＣＲＣ腫瘍を区別するための分子マーカーとしてＥＤＢ－ＦＮ過剰発現を使用することができるか否かを判断するには、ＤＬＤ－１、ＤＬＤ１－ＤＲ、ＲＫＯ、ＲＯＤ－ＤＲの皮下脂肪組織を持つ胸腺欠損マウスｎｕ／ｎｕにおいて、ＥＤＢ－ＦＮターゲティング標的造影剤ＭＴ２１８を用いてＭＲＭを行う。４０μｍｏｌ／ｋｇのＭＴ２１８を射出する前の２５分間と射出した後の２５分間にＴ１－強調クラウン及びアキシャル画像を取得した。ＭＴ２１８のサブ臨床線量は、ＭＴ２１８の標準線量（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ）及び臨床造影剤ガドテリドールと同じ有効であることを示している。Ａｙａｔ，Ｎ．Ｒ．ら，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ，２０１９．９：ｐ．１３５１。
非耐性と薬剤耐性のＣＲＣ腫瘍を区別するための分子マーカーとしてＥＤＢ－ＦＮ過剰発現を使用することができるか否かを判断するには、ＤＬＤ－１、ＤＬＤ１－ＤＲ、ＲＫＯ、ＲＯＤ－ＤＲの皮下脂肪組織を持つ胸腺欠損マウスｎｕ／ｎｕにおいて、ＥＤＢ－ＦＮターゲティング標的造影剤ＭＴ２１８を用いてＭＲＭを行う。４０μｍｏｌ／ｋｇのＭＴ２１８を射出する前の２５分間と射出した後の２５分間にＴ１－強調クラウン及びアキシャル画像を取得した。ＭＴ２１８のサブ臨床線量は、ＭＴ２１８の標準線量（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ）及び臨床造影剤ガドテリドールと同じ有効であることを示している。Ａｙａｔ，Ｎ．Ｒ．ら，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ，２０１９．９：ｐ．１３５１。
【0132】
予備タイムコース分析は、ＤＬＤ－１及びＲＫＯ腫瘍モデルのいずれにおいても、ＭＴ２１８の注射後の３５分後にＣＮＲを大幅に向上させ、増加させたことを示す。また、２０～３５分の間にピークの増強が見られたため、その後の薬剤耐性の評価には２５分間の時点が選択された。ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩ－ＦＮは、非薬剤耐性ＤＬＤ－１及びＲＫＯ腫瘍（図３Ａ～Ｄ）でのシグナルを増強し、ＣＮＲは、それぞれ比較前より１．５３倍、１．４倍増加した（図３Ｅ～Ｆ）。薬剤耐性のＤＬＤ１－ＤＲ及びＲＯＤ－ＤＲ腫瘍は、シグナルの増強が非常に強く、ＣＮＲは、それぞれ比較前より３．３倍と２．６倍高いことに反映されていた（図３Ａ～Ｆ）。重要なことから、このシグナル強調は、このシグナル増強は、非薬剤耐性対応よりも強く、ＣＮＲは、それぞれ非薬剤耐性ＤＬＤ－１及びＲＫＯ腫瘍よりも２．２倍及び１．８倍高い（すなわち、１２０％及び８４％の増加）（図３Ｅ～Ｈ）。イメージング後にマウスを安楽死後、Ｈ＆Ｅ染色及びＥＤＢ－ＦＮ免疫組織化学（ＩＨＣ）ための腫瘍組織をＧ４抗体で処理した。図３（Ｉ－Ｊ）に示すように、Ｈ＆Ｅ染色は、薬剤耐性と非薬剤耐性のＣＲＣ腫瘍との有意差を示しておらず、高レベル、低分化、有糸分裂活性を有する多形癌細胞を示した。ＥＤＢ－ＦＮのＩＨＣは、それぞれＤＬＤ－１、ＲＫＯ腫瘍に比べて、ＤＬＤ１－ＤＲ（図３Ｉ）及びＲＫＯ－ＤＲ（図３Ｊ）腫瘍で強い染色を示した。ＥＤＢ－ＦＮ染色は、腫瘍細胞と長尺紡錘形状で散在する癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）との両方に局在しており、それぞれ赤色及び黒色の矢印で示した。このＩＨＣデータは、この４つのモデルで観測されたシグナルの強調及びＣＮＲと関連して、ＭＴ２１８のＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩの投与量を減少させることは、ＣＲＣモデルにおける薬剤耐性の非侵襲的な評価を促進することを示している。
【0133】
ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩは、薬剤耐性のあるＣＲＣ腫瘍の治療応答モニタリングを容易にする。
薬剤耐性のＣＲＣ腫瘍の鑑別診断に続いて、ＭＫＮ２２０６－ＨＣｌ（汎－ＡＫＴ阻害剤）で治療したＤＬＤ１－ＤＲマウスにおいて、非侵襲的な評価治療反応におけるＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩの可能性を測定した。図４Ａは、有効性モニタリングのための治療レジメンとＭＲＭＩのタイムラインを示す模式図である。腫瘍注入後１週間後、ベースラインＭＲＭＩを行い、マウスを無作為にビークル群（ＤＭＳＯ処理：ＴＭ１、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ１０）と治療群（ＭＫ２２０６処理：ＴＭ２、ＴＭ６、ＴＭ７、ＴＭ８、ＴＭ９）に分けた。マウスは、週に１回治療し、３週間持続し、腫瘍負荷が高いため、第４週目にＭＲＭＩを終了し、その後、死体解剖組織学的検査を行った。腫瘍の体積は、週に１回モニタリングされる。図４（ｂ）は、４週間の期間における腫瘍の増殖の進行を示している。ビークル群及び治療群の平均腫瘍体積は、９７．７±８．１４ｍｍ３以上８１３．４±２５９．７ｍｍ３以下、及び１１０．５±１１．９７ｍｍ３以上１２４９．７±１９９．３ｍｍ３以下に有意に増加した。ビークル群と治療群の最終的な平均腫瘍体積に有意な差（ｐ＝０．２２）は、認められなかったが、後群の単一マウスは、有意に重篤と大きな腫瘍を示し、薬剤耐性腫瘍は、治療に反応しなかったことを示した。また、単一マウスの腫瘍体積（図４Ｃ）もモニタリングされ、終点ＭＲＭＩシグナル及びＥＤＢ－ＦＮ発現に関連していた。各マウス（ＴＭ１－ＴＭ１０から標識）は、腫瘍体積が多かれ少なかれ有意に増加したことを示した。
薬剤耐性のＣＲＣ腫瘍の鑑別診断に続いて、ＭＫＮ２２０６－ＨＣｌ（汎－ＡＫＴ阻害剤）で治療したＤＬＤ１－ＤＲマウスにおいて、非侵襲的な評価治療反応におけるＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩの可能性を測定した。図４Ａは、有効性モニタリングのための治療レジメンとＭＲＭＩのタイムラインを示す模式図である。腫瘍注入後１週間後、ベースラインＭＲＭＩを行い、マウスを無作為にビークル群（ＤＭＳＯ処理：ＴＭ１、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ１０）と治療群（ＭＫ２２０６処理：ＴＭ２、ＴＭ６、ＴＭ７、ＴＭ８、ＴＭ９）に分けた。マウスは、週に１回治療し、３週間持続し、腫瘍負荷が高いため、第４週目にＭＲＭＩを終了し、その後、死体解剖組織学的検査を行った。腫瘍の体積は、週に１回モニタリングされる。図４（ｂ）は、４週間の期間における腫瘍の増殖の進行を示している。ビークル群及び治療群の平均腫瘍体積は、９７．７±８．１４ｍｍ３以上８１３．４±２５９．７ｍｍ３以下、及び１１０．５±１１．９７ｍｍ３以上１２４９．７±１９９．３ｍｍ３以下に有意に増加した。ビークル群と治療群の最終的な平均腫瘍体積に有意な差（ｐ＝０．２２）は、認められなかったが、後群の単一マウスは、有意に重篤と大きな腫瘍を示し、薬剤耐性腫瘍は、治療に反応しなかったことを示した。また、単一マウスの腫瘍体積（図４Ｃ）もモニタリングされ、終点ＭＲＭＩシグナル及びＥＤＢ－ＦＮ発現に関連していた。各マウス（ＴＭ１－ＴＭ１０から標識）は、腫瘍体積が多かれ少なかれ有意に増加したことを示した。
【0134】
腫瘍の成長は、ＭＴ２１８を用いて、ＥＤＢ－ＦＮの終点ＭＲＭＩでモニタリングした。図５Ａに示すように、ベースラインＭＲＭＩを行った場合に、ビークル群の各マウスは、比較前と比較してシグナル増強を示した。ＤＭＳＯの注射の３週間後、すべての５匹のマウスは、エンドポイントＭＲＭＩでシグナル増強を示した。他の３匹のマウス（ＴＭ１、ＴＭ４及びＴＭ１０）と比較して、マウス＃ＴＭ３及びＴＭ５は、シグナル増強及び腫瘍サイズの増加を示し、（図５Ｂ）。このデータの定量化は一貫した傾向を示し、ＴＭ３及びＴＭ５マウスは、第１～第４週でＣＮＲの増加を示し、ＴＭ１、ＴＭ４及びＴＭ１０マウスは、第１～第４週でＣＮＲの減少を示した（図５Ｃ）。ＭＲＭＩシグナルは、腫瘍体積の増加にも相関しており、ＴＭ３及びＴＭ５マウスがＴＭ１、ＴＭ４及びＴＭ１０マウスと比較して腫瘍体積の急速な増加を示す（図４Ｃ）。また、１週目から４週目までのビークル群の平均値ＣＮＲ間に有意な差は、見られなかった（図５Ｄ）。ＥＤＢ－ＦＮの解剖組織学とＩＨＣは、ＴＭ３においてＴＭ１０よりも強いＧ４染色を示し、ＭＴ２１８によるＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩは、内因性腫瘍ＥＤＢ－ＦＮ発現と相関していることを示した（図５Ｅ）。
【0135】
治療群について、ベースラインＭＲＭＩの間、５匹のマウスのそれぞれは、比較前よりも高いシグナル増強を示した（図６Ａ）。３週間の治療にもかかわらず、薬剤耐性ＤＬＤ１－ＤＲ腫瘍は、治療に反応せず、その大きさは、シグナル増強の増加とともに対照前に増加し（図６Ｂ）、第１週から第４週の個体マウスのＣＮＲ上昇に反映された（図６Ｃ）。５匹のマウスのうち、マウス＃ＴＭ７は、最高のシグナル増強、ＣＮＲ、及び最大腫瘍体積を示した（図４Ｃ）。一方、マウス＃ＴＭ２、ＴＭ６、ＴＭ８及びＴＭ９は、第１週から第４週におけるＣＮＲ及び腫瘍体積の増加を示したが、両者間の相関パターンは検出されなかった。治療群の平均腫瘍ＣＮＲは、第１週から第４週（図６Ｄ）に増加し、薬剤耐性腫瘍が治療に反応せず、ビークル群よりも劣っていたことが確認された。ＥＤＢ－ＦＮの解剖組織学及びＩＨＣは、ＴＭ９（図６Ｅ）及びビークル治療ののマウス＃ＴＭ３及びＴＭ１０（図５Ｅ）と比較して、マウス＃ＴＭ７腫瘍の強力なＧ４染色を示し、ＥＤＢ－ＦＮ発現とＭＲＭＩに基づくモニタリングとの直接的な相関を更に確認した。治療群の第４週の平均ＣＮＲは、ビークル群よりも高かったが、統計的に意味はなかった（ｐ＝０．０５５、図Ｓ４）。要約すると、これらの結果は、ＭＴ２１８のＥＤＢ－ＦＮを用いたＭＲＭＩが薬剤耐性ＣＲＣ腫瘍の非侵襲的な治療モニタリングを促進可能であることを示している。
【0136】
ＥＤＢ－ＦＮは、ヒト大腸腺癌において過剰発現しており、患者の生存不良に関連する。
ＣＲＣ患者におけるＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩの使用可能性を評価するために、大腸腺癌（ＣＯＡＤ）の代表的なヒト検体、転移型肝臓、及びそれに対応する正常な隣接する組織において、ＥＤＢ－ＦＮの発現を解析した。原発性ＣＯＡＤ腫瘍は、未治療患者（図７Ａ）及び治療患者（図７Ｂ）の両方において強いＥＤＢ－ＦＮ発現を示し、対応する正常隣接組織における発現は、無視できることがわかった。一方、ＣＯＡＤ肝転移は、ＥＤＢ－ＦＮレベルが異なっており、未治療患者では中等度染色（図７Ｃ）、治療患者では中強染色（図７Ｄ）、正常隣接肝臓では染色されなかった。パターンについては、大部分のＥＤＢ－ＦＮ染色は、マトリックスの線維芽細胞及び癌関連線維芽細胞（黒色の矢印）で観察され、一部は、腫瘍細胞（灰色の矢印）で、原発及び転移部位で観察された。また、ＴＣＧＡ及びＧＴＥｘデータベースのＲＮＡ－Ｓｅｑデータの分析は、ＥＤＢ－ＦＮレベルの増加がＣＯＡＤ患者の全体的な生存率（ＯＳ）差（図７Ｅ）と進行しない生存率差（図７Ｆ）と相関していることを示し、ＥＤＢ－ＦＮの過剰発現がＣＯＡＤの予後指標となり得ることが示された。
ＣＲＣ患者におけるＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩの使用可能性を評価するために、大腸腺癌（ＣＯＡＤ）の代表的なヒト検体、転移型肝臓、及びそれに対応する正常な隣接する組織において、ＥＤＢ－ＦＮの発現を解析した。原発性ＣＯＡＤ腫瘍は、未治療患者（図７Ａ）及び治療患者（図７Ｂ）の両方において強いＥＤＢ－ＦＮ発現を示し、対応する正常隣接組織における発現は、無視できることがわかった。一方、ＣＯＡＤ肝転移は、ＥＤＢ－ＦＮレベルが異なっており、未治療患者では中等度染色（図７Ｃ）、治療患者では中強染色（図７Ｄ）、正常隣接肝臓では染色されなかった。パターンについては、大部分のＥＤＢ－ＦＮ染色は、マトリックスの線維芽細胞及び癌関連線維芽細胞（黒色の矢印）で観察され、一部は、腫瘍細胞（灰色の矢印）で、原発及び転移部位で観察された。また、ＴＣＧＡ及びＧＴＥｘデータベースのＲＮＡ－Ｓｅｑデータの分析は、ＥＤＢ－ＦＮレベルの増加がＣＯＡＤ患者の全体的な生存率（ＯＳ）差（図７Ｅ）と進行しない生存率差（図７Ｆ）と相関していることを示し、ＥＤＢ－ＦＮの過剰発現がＣＯＡＤの予後指標となり得ることが示された。
【0137】
議論
この作業は、非耐性の相手に比べて、ＥＣＭタンパク質ＥＤＢ－ＦＮを過剰発現する薬剤耐性のある浸潤性ＣＲＣ腫瘍が存在することを示している。標的治療に対してネガティブな反応を示す薬剤耐性のＣＲＣ腫瘍ＥＤＢ－ＦＮに上昇した。これらの治療圧力誘発ＥＤＢ－ＦＮレベルの変化により、ＭＴ２１８のサブ臨床用量でもＭＲＭＩによる耐性ＣＲＣの効果的で非侵襲的な評価及び治療応答モニタリングが可能になる。
この作業は、非耐性の相手に比べて、ＥＣＭタンパク質ＥＤＢ－ＦＮを過剰発現する薬剤耐性のある浸潤性ＣＲＣ腫瘍が存在することを示している。標的治療に対してネガティブな反応を示す薬剤耐性のＣＲＣ腫瘍ＥＤＢ－ＦＮに上昇した。これらの治療圧力誘発ＥＤＢ－ＦＮレベルの変化により、ＭＴ２１８のサブ臨床用量でもＭＲＭＩによる耐性ＣＲＣの効果的で非侵襲的な評価及び治療応答モニタリングが可能になる。
【0138】
分子的に多様なＣＲＣの風景は、診断、予後、治療予測値を提供することができる堅牢なオロッカーを必要とする。ここで、初めて、ＥＤＢ－ＦＮの過剰発現は、ＣＲＣ患者の生存率と負の相関があることを示している。以前の研究では、ＦＤＣ－６抗体を使用した高ｏｎｃＦＮ１レベルの術後ＣＲＣ患者は、ＦＮ１の別の癌胚と同型に結合する予後不良であった。Ｉｎｕｆｕｓａ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ，１９９５．７５（１２）：ｐ．２８０２－８。患者試料の免疫組織化学分析は、Ｇ４抗体が原発性及び転移性ＣＲＣ部位において強いＥＤＢ－ＦＮ特異的染色を有することを示した。ＥＤＢ－ＦＮは、ストロマ、ストロマ線維芽細胞、腺癌細胞、及びこれらの腫瘍細胞の周囲に点在している線維芽細胞に局在していることがわかった。これらの結果から、すなわち、腫瘍環境における複数の細胞型発現ＥＤＢ－ＦＮ（Ｍｉｄｕｌｌａ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００．６０（１）：ｐ．１６４－９）は、腫瘍微小環境における細胞と細胞外成分との多面的な相互作用を示す。正常な隣接結腸及び肝臓組織におけるＧ４染色の完全な欠損は、ＥＤＢ－ＦＮの深遠な腫瘍特異的発現を示し、ＥＤＢ－ＦＮがＣＲＣの魅力的な候補マーカーであることを意味する。ＥＤＢ－ＦＮレベルの上昇は、筋肉浸潤性膀胱癌患者の尿試料で３００％以上上昇し、その臨床結果と負の相関を示し、他の癌診断マーカーとしての可能性も証明した。Ａｒｎｏｌｄ， Ｓ．Ａ．ら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２０１６．３３（１）：ｐ．２９－４４。
【0139】
これらの２Ｄ培養及び３Ｄ培養はいずれも、薬剤耐性のＣＲＣ細胞の浸潤性と内因性のＥＤＢ－ＦＮ式との関連性が正であることが示された。２つの非薬剤耐性モデルの間で、ＤＬＤ－１細胞は、ＲＫＯ細胞よりも高いＥＤＢ－ＦＮ発現を示した。これは、Ｄｕｋｅ Ｃ型、ｐ５３変異、ＣＥＡを発現する腺癌由来のＤＬＤ－１細胞が、ｐ５３－、Ｋ－Ｒａｓ－野生型原発癌部位に由来するＲＫＯ細胞よりも浸潤的で遊走性であるモデルの固有生物学的特性と一致している。Ｇｕ， Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ，２０１８．９（６）：ｐ．６５４。ＤＬＤ－１細胞が５’－ＦＵに対する薬剤耐性及びＲＫＯ細胞が５’－ＦＵ＋ＣＢ－８３９に対する薬剤耐性の発展は、ＥＭＴ様ＤＬＤ１－ＤＲ及びハイブリダイゼーションＥ－Ｍ ＲＫＯ－ＤＲ細胞の動的変化をもたらし、治療ストレス誘発のクローン選択後の２つの細胞株の異なる軌道を強調する。両薬剤の難治性細胞株は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターＭＤＲ－１の強い過剰発現を示しており、細胞流出増強が５’－ＦＵ耐性の一般的なメカニズムであることを考えると驚くべきことではない。Ｓｋａｒｋｏｖａ，Ｖ．ら，Ｃｅｌｌｓ，２０１９．８（３）。Ｅ－Ｍ表現型誘導可塑性増強がＲＫＯ－ＤＲ細胞ＣＢ－８３９に耐性を与えるヘテロ接合である可能性が高い。ＣＢ－８３９耐性乳癌では、ＣＲＣにおけるグルタミナーゼ阻害耐性の正確なメカニズムは不明であるが、以前に増強された可塑性及び代謝冗長性が観察された。 Ｒｅｉｓ，Ｌ．Ｍ．Ｄ．ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１９．２９４（２４）：ｐ．９３４２－９３５７。
【0140】
また、異種分子の変化やＥＭＴ状態に関わらず、薬剤耐性細胞株の両方による浸潤的及び遊走性の取得は、ＥＤＢ－ＦＮの有意なアップレギュレーションと関連付けられていた。このアップレギュレーションは、薬剤耐性のＤＬＤ１－ＤＲとＲＫＯ－ＤＲ異種移植片において再現され、それぞれの非薬剤耐性対応物と比較して、ＥＤＢ－ＦＮ標的造影剤ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩにおいて強力なシグナル増強及び有意に高いＣＮＲを示し、ＥＤＢ－ＦＮが有望な診断腫瘍マーカーとしての可能性を示唆した。先に、薬剤耐性乳癌細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの過剰発現を示した。また、他の群は、ＣＲＣ細胞や腫瘍においても、ＥＤＢ－ＦＮが高くなっていることが確認された。Ｅｌ－Ｅｍｉｒ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．、 Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ２００７． ９６（１２）： ｐ． １８６２－７０。本発明者らの知見によれば、このことは、薬物難治性ＣＲＣにおいて、ＥＤＢ－ＦＮを過剰発現させる第１報告である。これらの上昇したＥＤＢ－ＦＮレベルは、腫瘍の進行の非浸潤的なモニタリングを目的としたＺＤ２目標のＭＲＭＩを対象とすることができ、薬剤耐性の発現に先行する危険事象や段階を特定することができた。
【0141】
薬剤耐性は、腫瘍治療及び癌放射治療の悩みの種である。これらの薬剤耐性細胞及び腫瘍が腫瘍治療にどのように反応するかを正確かつ非侵襲的に評価することは（治療の数日の早い段階で）、現代の癌治療パラダイムに革命をもたらす可能性がある。複数の臨床証拠は、治療応答の評価が腫瘍サイズの変化のみに基づくことができないことを示している。このため、疾患の攻撃的な性質に相関し、腫瘍の大きさに依存せずに豊富に過剰発現されたＥＤＢ－ＦＮの分子イメージングを行うことで、治療法に対する正確な腫瘍の応答を得ることができると推測される。本発明の処理槽では、ＭＫ２２０６ ＨＣｌ療法に対する薬剤耐性の高いＤＬＤ１－ＤＲ腫瘍の障害が、その増加されたＥＤＢ－ＦＮレベル、ＭＴ２１８の取り込みが増加することに反映され、これは、ロバストなシグナル強調と、ＭＲＭＩにおけるＣＮＲが増大したことによって証明される。これらの腫瘍もビークル腫瘍と同様に大型化しているが、後者は、被処理腫瘍としてＥＤＢ－ＦＮ及びＭＴ２１８取り込みが同程度に増加することはなく、ＭＲＭＩは、固有のＥＤＢ－ＦＮ発現に基づくものであり、解剖学的な腫瘍サイズではないことが示唆された。なお、ＭＫ２２０６－ＨＣｌに対する陰性応答は、乳癌細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ規制におけるリン－ＡＫＴシグナルの役割についての本発明の知見を考慮していないが、薬剤流出ポンプＭＤＲ－１の可塑性増強及び過剰発現が、ＤＬＤ１－ＤＲ腫瘍がＭＫ２２０６ＨＣｌに反応しない可能性があることが推測される。また、５’－ＦＵで治療されたＤＬＤ－１細胞において、置換ＡＫＴ非依存性発癌シグナル伝達（例えば、ＮＦ－κβ）の補償活性化も示されている［６２］。腫瘍の負担が大きいため、治療は、第４週で終了し、他の適応介入又はイメージング検査が除外された。この研究は、原発性腫瘍のイメージングに限定されているが、有望な結果はさらなる研究に値し、他のパラメータとイメージングパターンを分析し、腫瘍体積をモニタリングすることで、様々な治療における腫瘍反応を検証し、関連させる。
【0142】
１２５Ｉ標識Ｌ１９－ＳＩＰ抗体を用いたＣＲＣ中のＥＤＢ－ＦＮ系放射免疫療法の２つ前の報告のみが存在することから、それは、ＣＲＣ異種移植片（Ｅｌ－Ｅｍｉｒ，Ｅ．ら，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００７ ９６（１２）：ｐ． １８６２－７０）及びＣＲＣ患者（Ｓａｎｔｉｍａｒｉａ，Ｍ．ら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００３．９（２）：ｐ．５７１－９）中の選択的腫瘍摂取と腫瘍増殖抑制を証明した。しかしながら、薬剤耐性のＣＲＣのＥＤＢ－Ｆ系ＭＲＭＩ評価は、従来は全く行われていない。本発明の予備データは、ＥＤＢ－ＦＮＮ標的分子撮像のみを形質転換するための土台となるデータであり、他のスクリーニング用モダリティへの付属品として、臨床的にはＣＲＣ管理のための生技術となっている。ＣＲＣイメージングにおけるＭＲＩの課題の１つは、肝臓のＣＲＣ転移を正確に検出することであり、患者の予後指標が出ようとする。そこで、患者の転移性肝臓試験片において、独立研究者と独立研究者とを観察した結果、これらの回避性ＮＣＨＥＳを正確かつタイムリーに検出することで、治療内容の治療中に致命的な診断効果を得ることができた。ＭＲＩは、直腸癌をステージングするための主要な選択であるが、腫瘍治療後の腫瘍再発におけるその性能が不整合である。そのため、手術中の介入を計画する前に、「待ち及び観察」期間中に、ネジュバント療法に対する患者の応答性を判定する際に、ＭＴ２１８でＭＲＭＩの薬効を評価することが関心となる。
【0143】
造影増強のＭＲＩは、診断上重要であるが、造影剤、特にリニアＧＢＣＡｓへの累積被曝は、患者の脳、骨、及び皮膚へのＧｄの堆積・長期的な蓄積の結果である。ＭＴ２１８は、安定性が高く、安全性が良好な臨床大環状の造影剤ガドテリドールの小さいペプチド結合体である。最近では、乳癌モデルにおいて、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇの標準臨床線量と比較して、ＭＴ２１８は、４０μｍｏｌ／ｋｇの低下用量で、ＭＴＭＩにおける腫瘍特異的増強が強く発現していることが明らかとなった。Ａｙａｔ，Ｎ．Ｒ．ら，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ，２０１９．９：ｐ．１３５１。また、ＭＴ２１８の用量を減少させるＭＲＭＩの割引されていない有効性は、Ｇｄ関連及び用量依存毒性の潜在的なリスクを最小限に抑えることができる。この低線量でも、この検討において、ＣＲＣと薬剤耐性のあるＣＲＣ腫瘍を効果的に評価することが可能であった。ＭＴ２１８の高Ｔ１緩和性能（３Ｔでの６．１３ｍＭ－１Ｓ－１））、亜臨床用量での有効ＭＲＭＩ、及び腫瘍微小環境における豊富なＥＤＢ－ＦＮがＭＴ２１８と容易に結合するため、Ｇｄ曝露減少ＭＲＭＩは、ＣＲＣの能動的な監視及び治療モニタリングに期待できると推測される。腫瘍細胞の可塑性は、腫瘍進行及び治療応答の患者間ばらつきが大きいことから、同じ癌種であっても、ＥＤＢ－ＦＮの腫瘍準位に基づくＭＴ２１８のＭＲＭＩは、化学療法期間中に早期に薬剤耐性の発現を検出することができ、当該患者の治療部位を補助し、治療の成功性を向上させることができた。
【0144】
また、ＥＤＢ－ＦＮ特定のＺＤ２ペプチド特有の利点は、ＰＥＴ／ＭＲＩやＰＥＴ／ＣＴなどの多パラメトリック分子イメージング用の統合撮像システムの開発にも応用できる。実際には、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴプローブは、既に、前立腺癌、膵島癌及び乳癌の検出を向上させるために、ＥＤＢ－ＦＮ特異的なＺＤ２ペプチドを放射性トレーサー（６４ＣｕＤＯＴＡ、６８Ｇａ ＮＯＴＡ、と９９ＭＴｃ－ＨＹＮＩＣ型キレート）に結合させることにより生成されている。Ｈａｎ，Ｚ．ら，ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ，２０１９．４（１）：ｐ．１１８５－１１９０；Ｇａｏ，Ｓ．ら，Ａｍ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，２０１９．９（５）：ｐ．２１６－２２９。これらのシステムにおいても、原発性腫瘍切除後の転移モニタリング、化学療法処理の同遺伝子モデルにおけるＣＲＣのイメージング、免疫療法における腫瘍反応の評価など、ＣＲＣのいくつかの側面に関する洞察を提供することができた。また、ＺＤ２以外にも、ＡＰＴ－ＦＮ－ＥＤＢ、Ｌ１９、ＢＣ１、及びＮＪＢ２を含む他のＥＤＢ－ＦＮ標的配位子、抗体及びナノ体も、腫瘍ＥＣＭ及び血管システムへの治療剤及び撮像剤の受け渡しに使用され、有望な腫瘍マーカーとしてのＥＤＢ－ＦＮの役割が検証された。Ｔｉｊｉｎｋ，Ｂ．Ｍ．ら，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，２００９．３６（８）：ｐ．１２３５－４４；Ｊａｉｌｋｈａｎｉ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９．１１６（２８）：ｐ．１４１８１－１４１９０。
【0145】
以上をまとめると、大腸腺癌（ＣＯＡＤ）検体では腫瘍特異的なＥＤＢ－ＦＮ発現が示され、ＥＤＢ－ＦＮのレベルが高いＣＯＡＤ患者の予後は不良であることが明らかとなった。本来、ＣＲＣ細胞や腫瘍異種移植片は、ＥＤＢ－ＦＮを固有に発現しているが、その発現は、更に薬剤耐性に優れている。ＭＴ２１８の線量が有意に低減されたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩは、薬剤耐性のあるＣＲＣの効果的な非侵襲的な評価及び治療モニタリングを促進し、ＭＴ２１８媒介ＥＤＢ－ＦＮ標的ＭＲＭＩの積極的なモニタリング及び薬剤耐性腫瘍における変換の可能性を強調する。
【0146】
実施例２：エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチンの過剰発現と、乳癌細胞の浸潤性との関連性
乳癌（ＢＣＡ）は、壊滅的な病気であり、米国では毎年４１，０００人が死亡している。局所的なＢＣａ患者の生存率は９９％に近いが、遠隔転移及び薬剤耐性患者では生存率が急激に低下した。この疾患の臨床治療における主要な障害は、腫瘍異質性であり、ＢＣａの進行の動的性質において機能する。全ゲノムシーケンシング及びプロファイリング研究は、同じ組織学的サブタイプの乳房腫瘍が、異なる段階のＢＣａ患者において異なる分子画像及び離散軌道を示すことが実証されている。ランダム変異、ゲノムの不安定性、遺伝的、エピジェネティックな、環境的、治療的刺激からの選択的圧力によるクローニングの進化は、有意な成長と浸潤の利点を有するリスクの高い腫瘍集団の出現をもたらす。原発性及び転移性腫瘍における広範な空間的及び時間的差異は、診断、治療及び予後結果に直接影響する。腫瘍転移及び浸潤特性の特異的マーカーの欠如のために、現在のイメージング方法（ＭＲＩ、ＰＥＴ及びＣＴを含む）は、低リスク及び高リスク腫瘍の検出及び区別において限られた能力を有する。これらの事実は、非侵襲的な検出、リスクの階層化、乳房腫瘍の積極的なモニタリングを促進し、動的であるにもかかわらず、治療応答をタイムリーに評価する適切な分子マーカーを発見し、特徴付ける必要性を強調している。
乳癌（ＢＣＡ）は、壊滅的な病気であり、米国では毎年４１，０００人が死亡している。局所的なＢＣａ患者の生存率は９９％に近いが、遠隔転移及び薬剤耐性患者では生存率が急激に低下した。この疾患の臨床治療における主要な障害は、腫瘍異質性であり、ＢＣａの進行の動的性質において機能する。全ゲノムシーケンシング及びプロファイリング研究は、同じ組織学的サブタイプの乳房腫瘍が、異なる段階のＢＣａ患者において異なる分子画像及び離散軌道を示すことが実証されている。ランダム変異、ゲノムの不安定性、遺伝的、エピジェネティックな、環境的、治療的刺激からの選択的圧力によるクローニングの進化は、有意な成長と浸潤の利点を有するリスクの高い腫瘍集団の出現をもたらす。原発性及び転移性腫瘍における広範な空間的及び時間的差異は、診断、治療及び予後結果に直接影響する。腫瘍転移及び浸潤特性の特異的マーカーの欠如のために、現在のイメージング方法（ＭＲＩ、ＰＥＴ及びＣＴを含む）は、低リスク及び高リスク腫瘍の検出及び区別において限られた能力を有する。これらの事実は、非侵襲的な検出、リスクの階層化、乳房腫瘍の積極的なモニタリングを促進し、動的であるにもかかわらず、治療応答をタイムリーに評価する適切な分子マーカーを発見し、特徴付ける必要性を強調している。
【0147】
腫瘍細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、腫瘍細胞と腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の間で発癌シグナルを伝達し、成長、アポトーシス脱出、遊走、炎症及び免疫回避をサポートすることにより、腫瘍の進行のあらゆる側面において重要な役割を果たしている。フィブロネクチン（ＦＮ１）は、正常なＥＣＭ及び腫瘍ＥＣＭの必須成分であり、接着、運動性、成長及び発達を調節する重要な糖タンパク質である。しかし、その別のせん断変異体は、エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）と呼ばれ、悪性形質転換中に発現することが知られているが、通常、健常成人組織には存在しない。Ｈａｎ， Ｚ．とＬｕ， Ｚ． Ｒ．， Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｃｈｅｍ Ｂ ５， ６３９－６５４ （２０１７）。ＥＤＢ－ＦＮが上皮間プライミング（ＥＭＴ）、癌細胞の乾燥、増殖、血管新生及び転移に関連していることを示唆している。Ｈａｎら，Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ ７９，ｐ．３１３５－３１４３（２０１８）．臨床研究は、ＥＤＢ－ＦＮが肺癌、脳癌、大腸癌及び卵巣癌の患者に存在することを証明している。Ｓａｎｔｉｍａｒｉａら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９，ｐ．５７１－５７９（２００３）。また、ＥＤＢ－ＦＮの過剰発現は、乳腺腫瘍の組織学的勾配（Ｌｏｒｉｄｏｎ－Ｒｏｓａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０，ｐ．１６０８－１６１２ （１９９０））と口腔癌患者の生存率の不良（Ｌｙｏｎｓら，Ｂｒ Ｊ Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ Ｓｕｒｇ ３９，ｐ．４７１－４７７（２００１））にも相関があり、多発性腫瘍のマーカーとしてのその潜在的な役割を示す。
【0148】
さらに複雑なことは、同じ癌種であっても、ＥＤＢ－ＦＮ発現プロファイルが明確であり、細胞や組織の分子や機能特性に特異的である。例えば、ＥＤＢ－ＦＮ特異的ペプチドプローブＺＤ２－Ｃｙ５．５を用いて、ＰＣ３（前立腺）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ホルモン受容体陰性乳癌）などの浸潤性癌細胞株がＥＤＢ－ＦＮを豊富に含み、浸潤性の低い癌細胞株（例えば、ＬＮＣａＰ（前立腺））及びＭＣＦ７（ホルモン受容体陽性乳癌）が有意に低いＥＤＢ－ＦＮレベルを示すことが分かった。Ｈａｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２６，８３０－８３８（２０１５）、Ｈａｎら，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，６９２（２０１７）。このＥＤＢ－ＦＮのこの差異発現は、ＥＤＢ－ＦＮ標的ＭＲＩ造影剤を用いて非浸潤的異種移植片から浸潤性前立腺癌及び乳癌腫瘍を鑑別診断するために用いられた。Ａｙａｔら， ＡＣＳ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ９，７３０－７３５ （２０１８）。また、他の独立した研究グループは、ＥＤＢ－ＦＮを標的イメージング及び治療のための様々な癌の分子標的として利用している。Ｓｕｎら，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ４，８４５－８５７（２０１４）；Ｙｅら，ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２，２４５９－２４６８（２０１７）。
【0149】
腫瘍の可塑度が高いことから、異なる選択圧力、環境、実験的刺激により、ＴＭＥとＥＤＢ－ＦＮの発現が明確に変化し、ＥＤＢ－ＦＮ標的イメージング及び治療介入の臨床結果に影響を与えることが明らかとなった。ここでは、非浸潤的、低ＥＤＢ－ＦＮ発現乳癌細胞に２つの異なる選択圧力を加えた後のＥＤＢ－ＦＮの発現パターンの変化と、それらがその後浸潤性リスクの高い集団に進化することを決定しようとする。このため、２つの乳癌細胞株ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８は、サイトカインＴＧＦ－β及び化学療法薬で処理することにより、ランダム交互及びクローニングの進化を誘導することによって、顕著な生存上の利点を得た。得られた集団も高度に特異的なＡＫＴ阻害剤で処理し、ＥＤＢ－ＦＮレベルの変化と高リスク細胞が標的治療に対する反応との相関を更に評価した。
【0150】
結果
ＥＤＢ－ＦＮの発現は、乳癌中に有意に増加する。
重要なＥＣＭ成分としては、複数の癌種でＦＮ１が過剰発現している。Ｈａｎ， Ｚ．とＬｕ， Ｚ． Ｒ． （２０１７）， Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｃｈｅｍ Ｂ ５， ６３９－６５４。ここで、ＴＣＧＡとＧＴＥｘデータベースにおける１０８４個の乳腺腫瘍と２９１個の正常乳腺試料における癌胚同種型ＥＤＢ－ＦＮ（転写物ＩＤ：ＥＮＳＴ００００４３２０７２．６）の発現を評価した。差分ＥＤＢ－ＦＮ発現解析と生存相関データは、ネットワークサーバＧＥＰＩＡ２２８から取得される。図８Ａに示すように、乳房腫瘍は、正常乳房組織（中央値２．４１０転写物／百万（ＴＰＭ））と比較して、ＥＤＢ－ＦＮの有意な過剰発現［中央値３６．３１９ ＴＰＭ］を示し、乳癌が正常組織よりも３．４５２の非常に有意な対数（ｌｏｇ２）倍成長（調整されたＰ値＝６．５７ｅ－６９）を有することを意味する。また、ＥＤＢ－ＦＮの高発現は、乳癌患者の全体的な生存率差と有意に相関していた（図８Ｂ）、リスク比は、１．９［ｐ（ＨＲ）＝０．０２２］であり、その予後値が証明された。
ＥＤＢ－ＦＮの発現は、乳癌中に有意に増加する。
重要なＥＣＭ成分としては、複数の癌種でＦＮ１が過剰発現している。Ｈａｎ， Ｚ．とＬｕ， Ｚ． Ｒ． （２０１７）， Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｃｈｅｍ Ｂ ５， ６３９－６５４。ここで、ＴＣＧＡとＧＴＥｘデータベースにおける１０８４個の乳腺腫瘍と２９１個の正常乳腺試料における癌胚同種型ＥＤＢ－ＦＮ（転写物ＩＤ：ＥＮＳＴ００００４３２０７２．６）の発現を評価した。差分ＥＤＢ－ＦＮ発現解析と生存相関データは、ネットワークサーバＧＥＰＩＡ２２８から取得される。図８Ａに示すように、乳房腫瘍は、正常乳房組織（中央値２．４１０転写物／百万（ＴＰＭ））と比較して、ＥＤＢ－ＦＮの有意な過剰発現［中央値３６．３１９ ＴＰＭ］を示し、乳癌が正常組織よりも３．４５２の非常に有意な対数（ｌｏｇ２）倍成長（調整されたＰ値＝６．５７ｅ－６９）を有することを意味する。また、ＥＤＢ－ＦＮの高発現は、乳癌患者の全体的な生存率差と有意に相関していた（図８Ｂ）、リスク比は、１．９［ｐ（ＨＲ）＝０．０２２］であり、その予後値が証明された。
【0151】
臨床検体中のＥＤＢ－ＦＮ発現の位置及びパターンを深く理解するために、乳房腫瘍標本及び正常隣接組織をＥＤＢ－ＦＮ特異的Ｇ４抗体で染色した。 図８Ｃに示すように、ＥＤＢ－ＦＮは、癌細胞関連線維芽細胞（緑）、マトリックス及びマトリックス線維芽細胞（赤）、及び乳癌の有糸分裂腫瘍細胞（紫色）に多量に発現する。また、ＥＤＢ－ＦＮの発現は、隣接する組織（図８Ｄ）に比べて、乳腫瘍組織の方が有意に高かった。また、原発組織以外にも、ＥＤＢ－ＦＮは、リンパ節（図８Ｅ）、肺、及び脳のメタステーブル（図８Ｆ）においても高度に発現されており、癌胚ＥＤＢ－ＦＮ同型が悪性乳房表現型において高度に発現していることが示された。
【0152】
次に、乳癌の多分子サブタイプを表す細胞株群におけるＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡの内因性レベルとその浸潤的特性との相関を測定した。図８Ｇ－Ｈに示すように、最小浸潤性ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）ＭＣＦ７細胞は、ＥＤＢ－ＦＮの最低発現を示した。より浸潤的な３倍陰性（ＨＲ－）乳癌ラインは、ＥＤＢ－ＦＮレベルの有意性が顕著であり、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８及びＢＴ５４９が約９～１０倍に増加し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が１４倍に増加し、Ｈｓ５７８Ｔ細胞が７００倍以上に増加した。これらの結果から、乳癌の分子マーカーとして、ＥＤＢ－ＦＮの過剰発現のポテンシャルが示されている。
【0153】
ＴＧＦ－β処理と薬剤耐性により、２Ｄ及び３Ｄ培養された乳癌細胞の成長及び形態を変化させる。
乳癌細胞の細胞増幅率が有意な生存効果を有する場合のＥＤＢ－ＦＮ発現量の変化を評価するために、ＦＤＢ－ＦＮ発現が最も低い２つの細胞株、すなわちＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を選択した。２つの選択的圧力を適用し、１）ＴＧＦ－β（５ ｎｇ／ｍＬ）を用いた長期処理によるＥＭＴ３０誘導は、ＭＣＦ７－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ細胞を生成する。２）細胞周期タンパク質依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤であるパボキシニ（Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ）と、マイクロチューブ剤パクリタキセルに対する化学的耐性を得て、それぞれＭＣＦ７－ＤＲ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞を生成する。ＭＣＦ－ＤＲ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞におけるＰ－糖タンパク質１又は多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ１）の有意な過剰発現は、薬剤耐性の獲得を確認した。母体及び由来細胞株の形態、分子及び機能表現型を特徴としている。
乳癌細胞の細胞増幅率が有意な生存効果を有する場合のＥＤＢ－ＦＮ発現量の変化を評価するために、ＦＤＢ－ＦＮ発現が最も低い２つの細胞株、すなわちＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を選択した。２つの選択的圧力を適用し、１）ＴＧＦ－β（５ ｎｇ／ｍＬ）を用いた長期処理によるＥＭＴ３０誘導は、ＭＣＦ７－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ細胞を生成する。２）細胞周期タンパク質依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤であるパボキシニ（Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ）と、マイクロチューブ剤パクリタキセルに対する化学的耐性を得て、それぞれＭＣＦ７－ＤＲ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞を生成する。ＭＣＦ－ＤＲ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞におけるＰ－糖タンパク質１又は多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ１）の有意な過剰発現は、薬剤耐性の獲得を確認した。母体及び由来細胞株の形態、分子及び機能表現型を特徴としている。
【0154】
図９Ａに示すように、ＭＣＦ７細胞は、２Ｄ培養における典型的な上皮形態を示している。ＴＧＦ－βでの長期的な処理と、掌への耐性の発現は、ＭＣＦ７－ＴＧＦβ細胞よりもＭＣＦ７－ＤＲ細胞で顕著である間葉系表現型に形態的に変化した。一方、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の細胞は、ＴＧＦ－β処理による明らかな形態変化及びパクリタキセルに対する耐性の発達変化を示さなかった。しかし、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβは、母体ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に比べて成長速度が向上した。
【0155】
また、９Ｄ培養に加えて、細胞は基底膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で増殖し、有利なＥＣＭの確立を促進する。図９Ｂに示すように、９Ｄ培養では、低リスクＨＲ＋ＭＣＦ７細胞は無視可能な腫瘍スフェロイド形成を示し、より浸潤的なＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は増殖性ネットワーク形成を示した。ＭＣＦ７－ＴＧＦβ及びＭＣＦ７－ＤＲ細胞は、母体ＭＣＦ７細胞とは異なり、腫瘍のスフェロイドが形成されているのに対し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞は、その母体と同様の増殖性ネットワークを形成している。これらの結果は、各癌細胞の種類と、外部のミトゲン刺激に対する応答性とが異なっていることを示している。
【0156】
ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有する乳癌細胞の遊走の向上
次に、ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有する乳癌細胞の分子量及び官能変化を解析した。ＴＧＦ－βは、ＥＭＴの有力なインデューサであり、転移開始に向かってクリティカルなステップである。同様にＥＭＴのシグナリングプログラムや薬剤耐性は、複雑に関係しており、ＥＭＴ様分子マーカーは、乳癌の化学療法を拮抗させることができる。Ｈｕａｎｇ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｈ．とＲｅｎ，Ｇ．（２０１５），Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ４７，８４０－８４８。これにより、一般的なＥＭＴマーカーＮ－カド、Ｅ－カルシトニン及びスラッグ（侵入マーカー）の発現が誘導細胞株で試験された。図９Ｃに示すように、ＭＣＦ－ＴＧＦβ及びＭＣＦ７－ＤＲ細胞は、いずれもＥ－ｃａｄ及びＮ－ｃａｄ発現の増加を示し、Ｓｌｕｇ発現は中程度のみ増加し、ＭＣＦ７細胞がＴＧＦ－β処理及び薬剤耐性の発達によって部分的なＥＭＴサンプル表現型を得たことを示している。一方、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ細胞は、親細胞と比較してＥ－ｃａｄ及びＮ－ｃａｄの変化を示さず、Ｓｌｕｇレベルは、中等度に増加し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞は、Ｅ－ｃａｄ、Ｎ－ｃａｄ及びＳｌｕｇ発現の増加を示した（図９Ｄ）。これらの結果は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞が遊走タンパク質Ｓｌｕｇを過剰発現しているにもかかわらず、前者は、ＴＧＦ－β処理されていないＥＭＴであり、後者は、薬剤耐性を有するヘテロＥ－Ｍ表現型を得る可能性があることを示している。
次に、ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有する乳癌細胞の分子量及び官能変化を解析した。ＴＧＦ－βは、ＥＭＴの有力なインデューサであり、転移開始に向かってクリティカルなステップである。同様にＥＭＴのシグナリングプログラムや薬剤耐性は、複雑に関係しており、ＥＭＴ様分子マーカーは、乳癌の化学療法を拮抗させることができる。Ｈｕａｎｇ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｈ．とＲｅｎ，Ｇ．（２０１５），Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ４７，８４０－８４８。これにより、一般的なＥＭＴマーカーＮ－カド、Ｅ－カルシトニン及びスラッグ（侵入マーカー）の発現が誘導細胞株で試験された。図９Ｃに示すように、ＭＣＦ－ＴＧＦβ及びＭＣＦ７－ＤＲ細胞は、いずれもＥ－ｃａｄ及びＮ－ｃａｄ発現の増加を示し、Ｓｌｕｇ発現は中程度のみ増加し、ＭＣＦ７細胞がＴＧＦ－β処理及び薬剤耐性の発達によって部分的なＥＭＴサンプル表現型を得たことを示している。一方、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ細胞は、親細胞と比較してＥ－ｃａｄ及びＮ－ｃａｄの変化を示さず、Ｓｌｕｇレベルは、中等度に増加し、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞は、Ｅ－ｃａｄ、Ｎ－ｃａｄ及びＳｌｕｇ発現の増加を示した（図９Ｄ）。これらの結果は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞が遊走タンパク質Ｓｌｕｇを過剰発現しているにもかかわらず、前者は、ＴＧＦ－β処理されていないＥＭＴであり、後者は、薬剤耐性を有するヘテロＥ－Ｍ表現型を得る可能性があることを示している。
【0157】
処理した細胞集団を、トランスウェルインサート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ）に被覆されたマトリゲルの層に侵入させる能力を分析した。図９Ｅに示すように、ＴＧＦ－β処理及び薬剤耐性は、ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に有意な浸潤的利点を与え、結晶性紫染色の遊走細胞数の増加に示されるように、親細胞よりも活力を与える。確かに、近年の研究では、部分的又はハイブリッドＥ－Ｍの表現型が腫瘍細胞の可塑性に起因するものであり、転移性が極めて良好であることが明らかとなった。Ｓａｉｔｏｈ， Ｍ． （２０１８）， Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６４， ２５７－２６４。
【0158】
ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有する乳癌細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ発現の向上
次に、乳癌細胞浸潤性の分子マーカーとしてのＥＤＢ－ＦＮの潜在的な役割は、ＴＧＦ－β処理及び薬剤耐性ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において決定される。蛍光標識ＥＤＢ－ＦＮ特異的ペプチドＺＤ２－Ｃｙ５．５２１を用いて、３Ｄ培養細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現を分析した。図３Ａ－Ｂに示すように、内因性ＥＤＢ－ＦＮ発現は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞においてＭＣＦ７細胞よりも高く、図８ＧのｍＲＮＡレベルと一致しており、その浸潤能は、図８Ｈ及び図９Ｅに示される。ＴＧＦ－β処理及び獲得性薬剤耐性は、図１０Ａ－ＢにおけるＺＤ２－Ｃｙ５．５結合の増加と図１０Ｃ－ＤのＨｏｅｃｈｓｔ正規化したＺＤ２－Ｃｙ５．５％画素強度の増加に反映された３Ｄ培養ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ発現の有意な増加をもたらした。また、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＭＣＦ７－ＴＧＦβ及びＭＣＦ７－ＤＲ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現が１７倍及び８．５倍増加したことを示すペプチド結合結果を確認した（図１０Ｅ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ発現は３倍以上に増加した（図１０Ｆ）。
次に、乳癌細胞浸潤性の分子マーカーとしてのＥＤＢ－ＦＮの潜在的な役割は、ＴＧＦ－β処理及び薬剤耐性ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において決定される。蛍光標識ＥＤＢ－ＦＮ特異的ペプチドＺＤ２－Ｃｙ５．５２１を用いて、３Ｄ培養細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現を分析した。図３Ａ－Ｂに示すように、内因性ＥＤＢ－ＦＮ発現は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞においてＭＣＦ７細胞よりも高く、図８ＧのｍＲＮＡレベルと一致しており、その浸潤能は、図８Ｈ及び図９Ｅに示される。ＴＧＦ－β処理及び獲得性薬剤耐性は、図１０Ａ－ＢにおけるＺＤ２－Ｃｙ５．５結合の増加と図１０Ｃ－ＤのＨｏｅｃｈｓｔ正規化したＺＤ２－Ｃｙ５．５％画素強度の増加に反映された３Ｄ培養ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ発現の有意な増加をもたらした。また、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＭＣＦ７－ＴＧＦβ及びＭＣＦ７－ＤＲ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現が１７倍及び８．５倍増加したことを示すペプチド結合結果を確認した（図１０Ｅ）。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ発現は３倍以上に増加した（図１０Ｆ）。
【0159】
また、ＺＤ２－Ｃｙ５．５プローブのＥＤＢ－ＦＮ特異的結合は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞において、ＥＤＢ－ＦＮのノックアウト実験により確認したところ、ＥＣＯ／ｓｉＥＤＢナノ粒子治療では、ＺＤ２－Ｃｙ５．５結合（Ｓ図９Ａ）を管理し、かつ、消音されたＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡの発現量は、７０％を超えていることが確認された（Ｓ図９Ｂ）。これらの結果は、ヘテロ接合Ｅ－Ｍ様変化が得られるかどうかにかかわらず、乳癌細胞の浸潤性の増加がＥＤＢ－ＦＮの有意な増加につながることを示している。したがって、ＥＤＢ－ＦＮの過剰発現は、浸潤性乳癌細胞及び低リスク乳癌細胞から進化した乳癌細胞と関連している。
【0160】
浸潤性乳癌細胞におけるＡＫＴの治療用アブレーションは、浸潤及びＥＤＢ－ＦＮ発現を低減する。
癌抑制薬に対する腫瘍の非侵襲的な治療モニタリングは、意思決定とタイムリーな介入を促進するために不可欠である。ＥＤＢ－ＦＮが治療予測マーカーであるかどうか、及びその発現が乳癌細胞の浸潤ポテンシャルの変化と関連しているかどうかをテストするために、ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有するＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞をＭＫ２２０６－ＨＣｌ（非常に特異的なパン－ＡＫＴ阻害剤）で処理し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達によって誘導される腫瘍細胞の増殖を阻害することが示された。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達は、複数の癌の進行、転移及び薬剤耐性に関連する主要なシグナル伝達カスケードである。
癌抑制薬に対する腫瘍の非侵襲的な治療モニタリングは、意思決定とタイムリーな介入を促進するために不可欠である。ＥＤＢ－ＦＮが治療予測マーカーであるかどうか、及びその発現が乳癌細胞の浸潤ポテンシャルの変化と関連しているかどうかをテストするために、ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有するＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞をＭＫ２２０６－ＨＣｌ（非常に特異的なパン－ＡＫＴ阻害剤）で処理し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達によって誘導される腫瘍細胞の増殖を阻害することが示された。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達は、複数の癌の進行、転移及び薬剤耐性に関連する主要なシグナル伝達カスケードである。
【0161】
リン酸化ＡＫＴ（Ｔ３０８及びＳ４７３）及び総ＡＫＴレベルの試験により、ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有する浸潤性ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞集団における糸分裂を促進するＡＫＴシグナル伝達軸の上昇が初めて確認された（図１１Ａ）。ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有するＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞におけるリン酸－ＡＫＴ－Ｔ３０８及びリン酸－ＡＫＴ－Ｓ４７３の平均水は、それぞれの親細胞と比較して有意に上昇した。また、総ＡＫＴは、ＴＧＦ－β処理された細胞において、２つの薬剤耐性細胞株で上昇した。更に、以前の研究は、選択的せん断媒介ＥＤＢ－ＦＮ発現調節におけるリン酸化ＡＫＴ－ＳＲｐ４０経路の役割を示した。（Ｂｏｒｄｅｌｅａｕら，（２０１５），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２，８３１４－８３１９。ＴＧＦ－βの上昇ＥＤＢ－ＦＮのメカニズムと薬剤耐性を決定するために、リン酸化ＳＲタンパク質（ＳＲｐ５５及びＳＲｐ４０）の発現を検出した。より浸潤的なＭＣＦ７－ＴＧＦβ、ＭＣＦ７－ＤＲ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβ及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞は、それぞれの親細胞と比較して、ＭＣＦ７－ＴＧＦ－β及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦβのみがＳＲｐ４０を引き上げた。浸潤的な細胞誘導体をＭＫ２２０６－ＨＣｌで処理すると、図４Ｂに示すように、ＡＫＴのリン酸化（Ｔ３０８及びＳ４７３）が強く抑制される。ＭＫ２２０６－ＨＣｌ処理の４つの細胞株において、リン酸化ＳＲｐ５５の上昇も弱まり、これらの浸潤的な細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの上昇は、少なくとも部分的にリン酸化ＡＫＴ－ＳＲｐ５５シグナル伝達経路によって制御できることを示している（図１１Ｂ）。
【0162】
機能的には、ＭＫ２２０６－ＨＣｌ媒介のリン酸化ＡＫＴ枯渇は、ＴＧＦβ処理された、薬剤耐性を有する細胞誘導体の浸潤ポテンシャルを減少させる（図１１Ｃ－Ｄ）。これは、ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有するＥＤＢ－ＦＮ過剰発現のＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現の有意な低下を伴い、対応するＤＭＳＯ処理の対照と比較してｍＲＮＡレベルが有意に低下したという証拠（図１１Ｅ－Ｆ）、３Ｄ培養におけるＺＤ２－Ｃｙ５．５染色強度の低下（図１１Ｇ－Ｈ）。具体的には、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞では、ＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡは適度な減少（約１０～１５％）を示したが、３Ｄスフェロイド発現のインプレースＥＤＢ－ＦＮは有意に減少し、ＭＫ２２０６－ＨＣｌ処理の浸潤の大幅な減少に寄与する可能性がある。これらの結果は、ＥＤＢ－ＦＮが乳癌細胞株の浸潤性と正の相関を示し、ＥＤＢ－ＦＮ発現変化と治療介入反応との潜在的な相関を示す。
【0163】
ＳＲ５５－ＥＤＢ－ＦＮ経路と浸潤性との関連を更に探求するために、ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有するＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞をｓｉＥＤＢ－ＦＮ又はｓｉＳＲＳＦ６を含有するナノ粒子でトランスフェクションすることで、細胞運動に対する機能喪失の影響を評価した。図１２Ａに示すように、ｓｉＥＤＢ－ＦＮ（ｓｉＥ）及びｓｉＳＲＳＦ６（ｓｉＳ）処理は、それぞれＮＣ（ｓｉＮ）と比較して、４つの誘導細胞株におけるＥＤＢ－ＦＮ及びＳＲｐ５５の発現の低下をもたらす。更に、ＳＲｐ５５（ｓｉＳＲＳＦ６）のダウングレードはＥＤＢ－ＦＮレベルのダウングレードにもつながり、ＥＤＢ－ＦＮ発現の調節におけるＳＲｐ５５の役割を確認した。また、ＥＤＢ－ＦＮ及びＳＲｐ５５のレベル低下は、ＴＧＦ－β処理された薬剤耐性を有するＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の浸潤ポテンシャルの低下と相関しており（図１２Ｂ－Ｃ）、ＥＤＢ－ＦＮが乳癌細胞浸潤パターンの調節に直接的又は間接的な役割を果たしていることを示している。ＭＫ２２０６－ＨＣｌ処理されたＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞をＴＧＦ－βで処理すると、これらの細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの過剰発現を救うことができることが分かった（図１２Ｄ）。一方、ＭＫ２２０６－ＨＣｌの処理は、ＭＣＦ７－ＤＲ細胞のＥＤＢ－ＦＮ発現（図１２Ｆ）及び浸潤（図１２Ｇ）を減少させたが、ＴＧＦ－βの添加は、ＥＤＢ－ＦＮの発現又は浸潤ポテンシャルを救わなかった。可能なのは、ＴＧＦ－β及びＡＫＴシグナル伝達経路が癌で密接に絡み合い、ｐＡＫＴがＴＧＦ－β誘導腫瘍促進反応を阻害することが示されているので、ＴＧＦ－βに対するｐＡＫＴ欠失変化ＥＲ＋ ＭＣＦ７－ＤＲ細胞の反応である。それにもかかわらず、この結果は、ＥＤＢ－ＦＮ発現パターンと細胞の浸潤ポテンシャルとの間に強い正の相関関係を示し、乳癌細胞の浸潤分子マーカーとしてのＥＤＢ－ＦＮの可能性を示す。
【0164】
議論
ＣＡ１５．３、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、超音波、マンモグラム、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＣＴなどのイメージングを含む多くの血液バイオマーカーは、通常、原発性乳房腫瘍疾患及び再発を検出し、治療応答を評価するために使用される。Ｂａｙｏら，（２０１８）Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ ２０，４６７－４７５．しかし、疾患の鑑別診断とリスク階層化能力は、限られており、偽陽性の診断率が高く、高浸潤性及び転移性乳房腫瘍を正確に検出し、低リスクの不活性腫瘍と区別するために特異的マーカーの必要性を強調している。また、乳房腫瘍は、多くの場合に、化学療法及び標的薬に対する内天性又は後天性耐性を示す。適切な分子マーカーがない場合に、化学療法介入の有効性を積極的に監視及びモニタリングし、薬剤耐性表現型の出現をタイムリーに検出し、患者の治療に別の障害を形成する。
ＣＡ１５．３、癌胚抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、超音波、マンモグラム、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＣＴなどのイメージングを含む多くの血液バイオマーカーは、通常、原発性乳房腫瘍疾患及び再発を検出し、治療応答を評価するために使用される。Ｂａｙｏら，（２０１８）Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ ２０，４６７－４７５．しかし、疾患の鑑別診断とリスク階層化能力は、限られており、偽陽性の診断率が高く、高浸潤性及び転移性乳房腫瘍を正確に検出し、低リスクの不活性腫瘍と区別するために特異的マーカーの必要性を強調している。また、乳房腫瘍は、多くの場合に、化学療法及び標的薬に対する内天性又は後天性耐性を示す。適切な分子マーカーがない場合に、化学療法介入の有効性を積極的に監視及びモニタリングし、薬剤耐性表現型の出現をタイムリーに検出し、患者の治療に別の障害を形成する。
【0165】
これらの問題を解決するために、本研究では、ＥＣＭ癌タンパク質ＥＤＢ－ＦＮの動的変化と乳癌細胞浸潤ポテンシャルの動的変化について検討した。低リスク癌細胞から進化した浸潤的な細胞が部分的なＥ－Ｍ表現型を示し、ＥＤＢ－ＦＮを過剰発現することができることを発見した。代わりに、標的薬によるこれらの高リスク癌細胞の浸潤能力の阻害は、ＥＤＢ－ＦＮの過剰発現を排除し、ＥＤＢ－ＦＮレベルと乳癌細胞の浸潤力との直接的な関係を証明する。また、乳癌細胞の薬剤耐性の発達に伴いＥＤＢ－ＦＮが上昇したと報告されたのは今回が初めてである。
【0166】
本研究で用いた２つの異なる乳癌細胞株の間では、両細胞株とも上皮表現型を示したが、最も浸潤性の低いＨＲ＋ ＭＣＦ７細胞の内因性ＥＤＢ－ＦＮレベルは、浸潤性の高い三陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞よりも有意に低かった。誘導耐性及び長期ＴＧＦ－β処理は、異なるシグナル伝達機構によって２つの細胞株の分子表現型に顕著な変化をもたらす可能性がある。新たに出現した侵入集団は、その親細胞よりも攻撃的であり、転移前のヘテロＥ－Ｍ表現型及びリン酸化ＡＫＴシグナル伝達の増加を有する。実際に、近年の研究では、Ｅ－Ｍスペクトル上の異なる位置に沿って癌細胞のサブ集団が存在することにより、腫瘍に可塑性が認められ、進行、転移、蒸れが促進されることが示唆されている。これらの細胞株のそれぞれは、他の未研究のメカニズムを介して生存の利点を獲得可能性もある。しかし、シグナル伝達機構にかかわらず、得られた浸潤性を有するすべての細胞はＥＤＢ－ＦＮ発現の増加を示した。逆に、標的治療で浸潤性細胞を処理すると、その浸潤性が低下し、ＥＤＢ－ＦＮ発現が低下する。その後のＴＧＦ－β処理がＭＣＦ７－ＤＲ細胞ではなくＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現を上方修正した場合にのみ、浸潤性が回復し、乳癌の積極的なモニタリング及びモニタリングのための治療予測マーカーとしてのＥＤＢ－ＦＮの役割を示す。
【0167】
浸潤的な細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの上昇の正確なメカニズムは謎のままである。遺伝的レベルでは、ＥＤＢ－ＦＮは、選択的なせん断イベントによって生成され、ＦＮ１転写物にＥＤＢエクセルを含むプロセスをもたらし、このプロセスは、ファミリーのＳＲ（セリン及びアルギニンが豊富な含有される）タンパク質のせん断調節によって制御される。選択的せん断は、ＥＤＢ－ＦＮ同種の形成に不可欠であるため、ＳＲタンパク質がこのプロセスに関与することは避けられない。しかし、腫瘍改質中のＥＤＢエキネトトロジーの優先順位と差異に含まれる潜在的なメカニズムに関する研究は限られている。以前の研究は、組織硬度の増加がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ媒介ＳＲｐ４０リン酸化に直接上昇し、乳癌細胞のエクチックイントイント及びＥＤＢ－ＦＮ分泌を増加させることが示されている。Ｂｏｒｄｅｌｅａｕら，（２０１５），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２，８３１４－８３１９。本研究では，ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞における薬剤耐性の発達とＴＧＦ－β処理がＳＲｐ５５リン酸化，ならびにリン酸化－ＡＫＴの増加を持続的に上昇させた。ＲＮＡｉを直接使用するか、ＭＫ２２０６－ＨＣｌを間接的に使用することでＳＲｐ５５をノックアウトすると、ＥＤＢ－ＦＮ発現及び侵入の可能性が大幅に低下した。ＳＲｐ５５は、通常、乳癌及び大腸癌で変異し、ＫＩＴ、ＣＤ４４及びＦＧＦＲ１４７などの複数の腫瘍関連遺伝子の選択的切断パターンに影響を与えるため、ＳＲｐ５５の欠失が乳癌細胞の浸潤を減少させるのは驚くべきことではない。しかし、ＳＲ５５の枯渇によるＥＤＢ－ＦＮ発現の低下を報告したのは初めてである。ＳＲｐ５５及び他のＳＲタンパク質が切断体におけるアンタゴニストｈｎＲＮＰｓとどのように相乗的に作用するかは、様々な内的及び外的刺激に応答して複雑な選択的せん断プロセスを調節するために、まだ検討されていない。更に、ＭＫ２２０６－ＨＣｌ処理は、リン酸化ＡＫＴの高い特異性ノックダウン及びＳＲｐ４０／ＳＲｐ５５レベルのその後の細胞特異的なダウングレードを示した。ＭＫ２２０６－ＨＣｌ処理は、ＥＤＢ－ＦＮの発現及び浸潤を有意に減少させたが、完全には排除されず、他の有糸分裂タンパク質（ＡＫＴ３など）又は腫瘍発生に関与するＥＤＡ－ＦＮ同型の代償的活性化も示した。Ｈａｎ， Ｚ．とＬｕ， Ｚ． Ｒ． （２０１７）， Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｃｈｅｍ Ｂ ５， ６３９－６５４。乳房悪性腫瘍における複雑な成分と分子シグナル伝達を考えると、異なる薬物処理後のＥＤＢ－ＦＮ発現及び機能の異なる空間的及び時間的変化を評価することは興味深いである。
【0168】
ＥＤＢ－ＦＮは、乳癌、口腔癌、肺癌、前立腺癌など、さまざまな種類の癌で過剰に発現する。Ｋｈａｎら，（２００５），Ｅｘｐ Ｌｕｎｇ Ｒｅｓ ３１，７０１－７１１；Ａｌｂｒｅｃｈｔら，（１９９９），Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１２，５１－６１。Ｅｘｐ肺胞子３１、７０１－７１１；ＡＬＢＣＣＨＴら（１９９９）、組織化細胞ＢＩＯＬ １１２、５１－６１。本来、癌に関連する線維芽細胞（ＣＡＦＳ）や内皮細胞のみで分泌されると考えられるが、腫瘍細胞、特に低浸潤の腫瘍細胞では、ＥＤＢ－ＦＮが豊富に産生されることが知られている。ＥＤＢ－ＦＮは、胚発生時に上昇し、創傷治癒、組織修復、血管新生の間に一時的に活性化されるが、健康な成人組織ではほとんど欠失する。Ｗｈｉｔｅら，（２００８），Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２１６，１－１４。実際に、本研究における免疫組織化学的分析は、ＥＤＢ－ＦＮが有糸分裂乳腺腫瘍細胞において強く発現し、マトリックス、マトリックス線維芽細胞と癌細胞との間の線維芽細胞において、原発性腫瘍標本及び転移部位において拡散性染色され、正常な乳房組織における発現が無視できることを示し、悪性腫瘍の進行におけるＥＤＢ－ＦＮの複雑な構造及び機能的役割を示す。ＴＣＧＡ／ＧＴＥｘ試料では、ＥＤＢ－ＦＮは乳癌で有意に過剰発現し、患者の生存率と負の相関を示した。更に、ＥＤＢ－ＦＮは、細胞外位置とアクセス性のために、新しい診断及び治療レジメンを設計するための魅力的なターゲットとなっている。以前の研究は、抗体媒介ＥＤＢ－ＦＮ標的（Ｌ１９、ＢＣ－１を使用）が血管新生、炎症及び癌幹細胞治療に及ぼす可能性を実証している。Ｍａｒｉａｎｉら，（１９９７），Ｃａｎｃｅｒ ８０，２３７８－２３８４。ＺＤ２、ＡＰＴＴＥＤＢのようなＥＤＢ－ＦＮＮ特異的ペプチドは、小型で免疫原性が低く、組織の浸透性が高いことから、抗原性ＥＣＭを標的とした場合に有利である。Ｚａｈｎｄら，（２０１０），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０，１５９５－１６０５。また、ＥＤＢ－ＦＮ用のＺＤ２プローブの特異性及び優れた結合性は、直翻訳の衝撃性を有する。本発明者らは、ＺＤ２標的型ＭＲＩ造影剤を用いたマウスモデルにおいて、非浸潤かつ低浸潤の乳房及び前立腺癌の差動診断に成功した。Ｈａｎら，（２０１７），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２８，１０３１－１０４０。この検討結果は、分子イメージングに基づく検出、リスク層化、乳癌の積極的な監視とモニタリング、化学療法及び未化学療法の場合の疾患の進行を追跡するためにＥＤＢ－ＦＮが使用される可能性を特定するための新しい道を開いた。
【0169】
以上のことから、この研究では、高浸潤の乳癌と、危険度の高いものに進化する低リスク細胞とに、ＥＤＢ－ＦＮ式が対応付けられていることが示されている。癌細胞は可塑性であるが、この相関は確立され、乳癌細胞の浸潤特性の動的変化はＥＤＢ－ＦＮ発現レベルの対応する変化をもたらす。ＥＤＢ－ＦＮの得能性耐性の初めての証明に加えて、この増強発現部分は、ＡＫＴ－ＳＲｐ５５シグナル伝達経路のリン酸化によって起こることを示した。これらの観察結果は、ＥＤＢ－ＦＮが診断イメージングと治療介入の文脈で乳癌の進行をモニタリングする有望な分子マーカーであることを示している。
【0170】
材料及び方法
細胞株及び培養
ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＴ５４９、及びＨｓ５７８Ｔ細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＭＣＦ７－ＤＲ細胞（５００ ｎＭ ＰＡＬＩＣＩＢ耐性）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ（１００ ｎＭのパタキセル耐性）細胞は、ＤＲ．Ｒｕｔｈ Ｋｅｒｉ（ＣＷＲＵ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）の一種である。ＭＣＦ７－ＴＧＦ－β、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦ－β細胞は、母体を５ ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で少なくとも７～１０日間処理することにより得た。乳癌細胞株は、１０％ウシ血清（ＦＢＳ）と１００単位／ｍＬペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／ｓ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＭＣＦ７、ＭＣＦ７－ＤＲ及びＨｓ５７８Ｔ細胞は、更に０．０１ｍｇ／ｍＬヒトインスリン（シグマＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充した。 すべての細胞は３７°Ｃ及び５％ＣＯ２で増殖する。ＭｙｃＡｌｅｒｔＴＭマイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）を用いて細胞株にマイコプラズマがないか試験した。細胞株は、また、ゲネカＤＮＡ研究所（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）によって同定された。
細胞株及び培養
ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＴ５４９、及びＨｓ５７８Ｔ細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＭＣＦ７－ＤＲ細胞（５００ ｎＭ ＰＡＬＩＣＩＢ耐性）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＤＲ（１００ ｎＭのパタキセル耐性）細胞は、ＤＲ．Ｒｕｔｈ Ｋｅｒｉ（ＣＷＲＵ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）の一種である。ＭＣＦ７－ＴＧＦ－β、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－ＴＧＦ－β細胞は、母体を５ ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で少なくとも７～１０日間処理することにより得た。乳癌細胞株は、１０％ウシ血清（ＦＢＳ）と１００単位／ｍＬペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／ｓ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＭＣＦ７、ＭＣＦ７－ＤＲ及びＨｓ５７８Ｔ細胞は、更に０．０１ｍｇ／ｍＬヒトインスリン（シグマＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充した。 すべての細胞は３７°Ｃ及び５％ＣＯ２で増殖する。ＭｙｃＡｌｅｒｔＴＭマイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）を用いて細胞株にマイコプラズマがないか試験した。細胞株は、また、ゲネカＤＮＡ研究所（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）によって同定された。
【0171】
ＭＫ２２０６－ＨＣｌ処理
ＴＧＦ－β処理された、薬剤耐性を有する浸潤性ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の集団を、ＭＫ２２０６－ＨＣｌ（汎－ＡＫＴ阻害剤、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した）で処理した。この処理のために、８×１０５細胞を６ウェルプレートに置いた。２４時間付着後、細胞をＭＫ２２０６－ＨＣｌで２日間処理した（ＭＣＦ７細胞２μＭ用量、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞４μＭ用量）。等量のＤＭＳＯで処理した細胞を対照として用いた。処理後、関連する章で説明したように、細胞をカウントし、侵入及び３Ｄ成長アッセイのためにＭａｔｒｉｇｅｌ及びｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓに同数の細胞を配置した。処理された細胞と未処理細胞を同様のカウントし、タンパク質ブロットとｑＲＴ－ＰＣＲのそれぞれに使用されるタンパク質及びＲＮＡ抽出を収穫する。
ＴＧＦ－β処理された、薬剤耐性を有する浸潤性ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の集団を、ＭＫ２２０６－ＨＣｌ（汎－ＡＫＴ阻害剤、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した）で処理した。この処理のために、８×１０５細胞を６ウェルプレートに置いた。２４時間付着後、細胞をＭＫ２２０６－ＨＣｌで２日間処理した（ＭＣＦ７細胞２μＭ用量、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞４μＭ用量）。等量のＤＭＳＯで処理した細胞を対照として用いた。処理後、関連する章で説明したように、細胞をカウントし、侵入及び３Ｄ成長アッセイのためにＭａｔｒｉｇｅｌ及びｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓに同数の細胞を配置した。処理された細胞と未処理細胞を同様のカウントし、タンパク質ブロットとｑＲＴ－ＰＣＲのそれぞれに使用されるタンパク質及びＲＮＡ抽出を収穫する。
【0172】
遺伝子データ解析
遺伝子発現解析及び生存曲線データは、ＴＣＧＡ（腫瘍及び正常）及びＧＴＥｘ（正常）データベース（１０８４個ＢＲＣＡ及び２９１正常組織サンプル）から、ＥＤＢ－ＦＮトラスクリプト（ＥＮＳＴ０００００４３２０７．６）の乳房腫瘍－正常比較及び全体生存曲線を提供したＷｅｂサーバＧＥＰＩＡ２２８から導出した。表現データは、差分解析のために変換された第１のｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）であり、ｌｏｇ２ＦＣは、中央値（腫瘍）－中央値（正常）と定義される。ＧＥＰＩＡ２は、ログランク試験、又はＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を用いて、生存解析の仮説検定、Ｃｏｘのハザード比計算のためのＣｏｘ ＰＨモデル、差動遺伝子の発現解析のためのＡＮＯＶＡ又はＬＩＭＭＡを使用する。
遺伝子発現解析及び生存曲線データは、ＴＣＧＡ（腫瘍及び正常）及びＧＴＥｘ（正常）データベース（１０８４個ＢＲＣＡ及び２９１正常組織サンプル）から、ＥＤＢ－ＦＮトラスクリプト（ＥＮＳＴ０００００４３２０７．６）の乳房腫瘍－正常比較及び全体生存曲線を提供したＷｅｂサーバＧＥＰＩＡ２２８から導出した。表現データは、差分解析のために変換された第１のｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）であり、ｌｏｇ２ＦＣは、中央値（腫瘍）－中央値（正常）と定義される。ＧＥＰＩＡ２は、ログランク試験、又はＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を用いて、生存解析の仮説検定、Ｃｏｘのハザード比計算のためのＣｏｘ ＰＨモデル、差動遺伝子の発現解析のためのＡＮＯＶＡ又はＬＩＭＭＡを使用する。
【0173】
ヒト組織標本及びＩＨＣ
ヒト組織調達設備から、ヒト組織標本（乳房原発性腫瘍、正常な隣接組織、肺、リンパ節、脳の転移点）を、ケース西予備大学（ＣＷＲＵ）のヒト組織調達設備（Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から取得した。すべてのサンプルは、識別され、分類される。組織スライスとＩＨＣサービスは、ＣＷＲＵ統合がんセンター組織リソースコア施設（Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）とクリーブランド大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）によって提供される（Ｐ３０ ＣＡ４３７０３助成金）。短時間の抗原修復工程（クエン酸緩衝液中１２５°Ｃで３０秒）の後、１：１００希釈抗ＥＤＢ－ＦＮ抗体Ｇ４クローン（Ａｂｓｏｌｕｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＵＫ）を用いてＥＤＢ－ＦＮのＩＨＣを行った。スライドは、証明された病理学者によって見直される。画像は、Ｂｘ６１ＶＳスライド走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で４０Ｘ対物レンズでキャプチャされ、ＯｌｙＶＩＡソフトウェアで処理される。
ｑＲＴ－ＰＣＲ
メーカーの指示に従い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して、細胞及び組織から総ＲＮＡを抽出する。ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡ濃度を測定し、１ ｕｇ ＲＮＡを用いて逆転写を確立し、ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）を用いてｑＰＣＲを行った。１８Ｓ又はβ－アクチン発現を対照として、２－ΔΔＣｔ法により遺伝子発現を分析した。
ヒト組織調達設備から、ヒト組織標本（乳房原発性腫瘍、正常な隣接組織、肺、リンパ節、脳の転移点）を、ケース西予備大学（ＣＷＲＵ）のヒト組織調達設備（Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から取得した。すべてのサンプルは、識別され、分類される。組織スライスとＩＨＣサービスは、ＣＷＲＵ統合がんセンター組織リソースコア施設（Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）とクリーブランド大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ ｏｆ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）によって提供される（Ｐ３０ ＣＡ４３７０３助成金）。短時間の抗原修復工程（クエン酸緩衝液中１２５°Ｃで３０秒）の後、１：１００希釈抗ＥＤＢ－ＦＮ抗体Ｇ４クローン（Ａｂｓｏｌｕｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＵＫ）を用いてＥＤＢ－ＦＮのＩＨＣを行った。スライドは、証明された病理学者によって見直される。画像は、Ｂｘ６１ＶＳスライド走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で４０Ｘ対物レンズでキャプチャされ、ＯｌｙＶＩＡソフトウェアで処理される。
ｑＲＴ－ＰＣＲ
メーカーの指示に従い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して、細胞及び組織から総ＲＮＡを抽出する。ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡ濃度を測定し、１ ｕｇ ＲＮＡを用いて逆転写を確立し、ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）を用いてｑＰＣＲを行った。１８Ｓ又はβ－アクチン発現を対照として、２－ΔΔＣｔ法により遺伝子発現を分析した。
【0174】
３Ｄ腫瘍スフェロイドの成長及びＺＤ２－Ｃｙ５．５染色
Ｍａｔｒｉｇｅｌ成長法では、５×１０５個の乳癌細胞を５％のＭａｔｒｉｇｅｌ含有培地に懸濁し、ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ膜マトリックスの厚層に広げた。１０Ｘ対物レンズを備えたＭｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラを使用して、最大５日間、３Ｄマトリックスで腫瘍スフェロイドを形成する細胞の能力をモニタリングし、撮影した。２～４日後、Ｈｏｅｃｈｓｔ－３３３４２（５μｇ／ｍＬ）及びＺＤ２－Ｃｙ５．５（１００ｎＭ）で３７℃で３０分間細胞を染色した。ＰＢＳを３回洗浄した後、新しい培地を添加し、Ｏｌｉｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点レーザー走査顕微鏡（１０Ｘ対物レンズ）で細胞をイメージングし、Ｚ－スタック画像を得た。ＦＩＪＩソフトウェアによる画像解析では、ＺＤ２ペプチドとＥＤＢ－ＦＮの結合は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の画素強度に対するＺＤ２－Ｃｙ５．５の画素強度の比として定量化される。
Ｍａｔｒｉｇｅｌ成長法では、５×１０５個の乳癌細胞を５％のＭａｔｒｉｇｅｌ含有培地に懸濁し、ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ膜マトリックスの厚層に広げた。１０Ｘ対物レンズを備えたＭｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラを使用して、最大５日間、３Ｄマトリックスで腫瘍スフェロイドを形成する細胞の能力をモニタリングし、撮影した。２～４日後、Ｈｏｅｃｈｓｔ－３３３４２（５μｇ／ｍＬ）及びＺＤ２－Ｃｙ５．５（１００ｎＭ）で３７℃で３０分間細胞を染色した。ＰＢＳを３回洗浄した後、新しい培地を添加し、Ｏｌｉｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点レーザー走査顕微鏡（１０Ｘ対物レンズ）で細胞をイメージングし、Ｚ－スタック画像を得た。ＦＩＪＩソフトウェアによる画像解析では、ＺＤ２ペプチドとＥＤＢ－ＦＮの結合は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２の画素強度に対するＺＤ２－Ｃｙ５．５の画素強度の比として定量化される。
【0175】
ウェスタンブロット
以上のようにして全細胞蛋白質を抽出した。Ｖａｉｄｙａら，（２０１９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ３０，９０７－９１９。タンパク質濃度をＬｏｗｒｙにより測定し、等濃度のタンパク質抽出液（４０ｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に展開し、ニトロセルロース膜に移し、一次抗体で一晩免疫ブロッティングした。抗ＥＤＢ－ＦＮ抗体（Ｇ４クローン）は、１：１０００希釈で用いた。以下の一次抗体（１：１０００希釈）、抗Ｅ－カドヘリン（Ｃａｔ＃３１９５）、抗－Ｓｌｕｇ（Ｃａｔ＃９５８５）、抗－リン酸化－Ｔ３０８－ＡＡＫＴ（Ｃａｔ＃１３０３８）、抗－リン酸化－Ｓ４７３－ＡＫＴ（Ｃａｔ＃４０６０）、抗－汎－ＡＫＴ（Ｃａｔ＃４６９１）、抗－ＭＤＲ１（Ｃａｔ＃１２６８３Ｓ）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から購入された。抗－ヒストンＨ３（Ｃａｔ＃４４９９）及び抗－β－アクチン（Ｃａｔ＃４９７０）を負荷対照として用いた。抗－リン酸エピトープ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｐｉｔｏｐｅ）ＳＲタンパク質（Ｃａｔ＃ＭＡＢＥ５０、クローン１Ｈ４）及び抗－ＳＲｐ４０（Ｃａｔ＃０６－１３６５）抗体は、Ｍｉｒｉｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入され、１：５００希釈で使用されている。抗Ｎ－カドヘリン抗体（Ｃａｔ＃７６０５７）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入され、１：５００希釈で使用されている。
以上のようにして全細胞蛋白質を抽出した。Ｖａｉｄｙａら，（２０１９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ３０，９０７－９１９。タンパク質濃度をＬｏｗｒｙにより測定し、等濃度のタンパク質抽出液（４０ｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に展開し、ニトロセルロース膜に移し、一次抗体で一晩免疫ブロッティングした。抗ＥＤＢ－ＦＮ抗体（Ｇ４クローン）は、１：１０００希釈で用いた。以下の一次抗体（１：１０００希釈）、抗Ｅ－カドヘリン（Ｃａｔ＃３１９５）、抗－Ｓｌｕｇ（Ｃａｔ＃９５８５）、抗－リン酸化－Ｔ３０８－ＡＡＫＴ（Ｃａｔ＃１３０３８）、抗－リン酸化－Ｓ４７３－ＡＫＴ（Ｃａｔ＃４０６０）、抗－汎－ＡＫＴ（Ｃａｔ＃４６９１）、抗－ＭＤＲ１（Ｃａｔ＃１２６８３Ｓ）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から購入された。抗－ヒストンＨ３（Ｃａｔ＃４４９９）及び抗－β－アクチン（Ｃａｔ＃４９７０）を負荷対照として用いた。抗－リン酸エピトープ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｐｉｔｏｐｅ）ＳＲタンパク質（Ｃａｔ＃ＭＡＢＥ５０、クローン１Ｈ４）及び抗－ＳＲｐ４０（Ｃａｔ＃０６－１３６５）抗体は、Ｍｉｒｉｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入され、１：５００希釈で使用されている。抗Ｎ－カドヘリン抗体（Ｃａｔ＃７６０５７）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入され、１：５００希釈で使用されている。
【0176】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ測定
侵入アッセイでは、乳癌細胞を血清欠失培地で一晩空腹にした。翌日、０．３ｍｇ／ｍＬ ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）でコーティングされたｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）に１－２×１０５細胞を入れた。１～２日後、Ｑ－綿棒で小さい室を拭き取り、舗装された細胞を除去した。小室底部の侵入細胞を４％ポリアセタールで固定し、０．１％結晶性紫で２０分間染色した。余分な染色剤を水道水で洗浄し、１０Ｘ対物レンズを備えたＭｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラを使用して紫色の遊走細胞の画像を撮影した。
侵入アッセイでは、乳癌細胞を血清欠失培地で一晩空腹にした。翌日、０．３ｍｇ／ｍＬ ＣｏｒｎｉｎｇＴＭ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）でコーティングされたｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）に１－２×１０５細胞を入れた。１～２日後、Ｑ－綿棒で小さい室を拭き取り、舗装された細胞を除去した。小室底部の侵入細胞を４％ポリアセタールで固定し、０．１％結晶性紫で２０分間染色した。余分な染色剤を水道水で洗浄し、１０Ｘ対物レンズを備えたＭｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラを使用して紫色の遊走細胞の画像を撮影した。
【0177】
遺伝子ノックアウト測定
ＥＣＯ／ｓｉＲＮＡのナノ粒子は、前述したように配合した。Ｇｕｊｒａｔｉら，（２０１６），Ａｄｖ Ｈｅａｌｔｈｃ Ｍａｔｅｒ ５，２８８２－２８９５。簡潔に説明すると、アミノ脂質ＥＣＯ（エタノール中の５ｍＭ原液）とｓｉＬｕｃ（陰性対照ＮＣとして）又はｓｉＥＤＢ－ＦＮ又はｓｉＳＲＳＦ６を１００ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度とＮ／Ｐ＝１０で３０分間混合し、ＥＣＯ／ｓｉＮＣ、ＥＣＯ／ｓｉＥＤＢ又はＥＣＯ／ｓｉＳＲＳＦ６ナノ粒子の自己組織化をそれぞれ実現した。トランスフェクションの場合は、ナノ粒子製剤を培地と混合し、細胞に添加する。２４～４８時間後、細胞を採取し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ実験を行い、又はＭａｔｒｉｇｅｌに添加し、上記のようにＺＤ２－Ｃｙ５．５で染色した。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入した。
ＥＣＯ／ｓｉＲＮＡのナノ粒子は、前述したように配合した。Ｇｕｊｒａｔｉら，（２０１６），Ａｄｖ Ｈｅａｌｔｈｃ Ｍａｔｅｒ ５，２８８２－２８９５。簡潔に説明すると、アミノ脂質ＥＣＯ（エタノール中の５ｍＭ原液）とｓｉＬｕｃ（陰性対照ＮＣとして）又はｓｉＥＤＢ－ＦＮ又はｓｉＳＲＳＦ６を１００ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度とＮ／Ｐ＝１０で３０分間混合し、ＥＣＯ／ｓｉＮＣ、ＥＣＯ／ｓｉＥＤＢ又はＥＣＯ／ｓｉＳＲＳＦ６ナノ粒子の自己組織化をそれぞれ実現した。トランスフェクションの場合は、ナノ粒子製剤を培地と混合し、細胞に添加する。２４～４８時間後、細胞を採取し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ実験を行い、又はＭａｔｒｉｇｅｌに添加し、上記のようにＺＤ２－Ｃｙ５．５で染色した。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入した。
【0178】
統計解析
特に断りのない限り、すべての実験は、独立して３回行った（ｎ＝３）。棒グラフは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表され、１つのドットは、繰り返しを表した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３を使用して統計分析を行った。ペアなし学生のｔ検定とＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して、２つのグループ間のデータを比較した。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ試験を用いて乳癌細胞株間のＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡデータを分析した。ｐ＜０．０５は、統計的に重要であると考えられている。
特に断りのない限り、すべての実験は、独立して３回行った（ｎ＝３）。棒グラフは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表され、１つのドットは、繰り返しを表した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３を使用して統計分析を行った。ペアなし学生のｔ検定とＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して、２つのグループ間のデータを比較した。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ試験を用いて乳癌細胞株間のＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡデータを分析した。ｐ＜０．０５は、統計的に重要であると考えられている。
【0179】
実施例３：エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチンの磁気共鳴分子イメージングによる口腔癌の検出と同定の有効性の前臨床評価
口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）は、口腔内の最も一般的な悪性腫瘍であり、口腔悪性腫瘍の９０％以上を占める。治療計画の改善にもかかわらず、ＯＳＣＣ患者の５年間の生存率は、５０％程度であり、ほとんど改善していない。この望ましくない予後は、末期診断、局所浸潤及び転移、切除後の再発、及び早期及び正確な検出のための標的バイオマーカーの欠如から生じる。患者の６０％以上が進行腫瘍と診断され、総生存率は、２０％に低下した。従来の組織学的グレーディングスキームは、患者の予後を確実に予測できないため、臨床予後を改善するためのＯＳＣＣ診断方法の開発が必要である。
口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）は、口腔内の最も一般的な悪性腫瘍であり、口腔悪性腫瘍の９０％以上を占める。治療計画の改善にもかかわらず、ＯＳＣＣ患者の５年間の生存率は、５０％程度であり、ほとんど改善していない。この望ましくない予後は、末期診断、局所浸潤及び転移、切除後の再発、及び早期及び正確な検出のための標的バイオマーカーの欠如から生じる。患者の６０％以上が進行腫瘍と診断され、総生存率は、２０％に低下した。従来の組織学的グレーディングスキームは、患者の予後を確実に予測できないため、臨床予後を改善するためのＯＳＣＣ診断方法の開発が必要である。
【0180】
ＯＳＣＣ患者の定期的な検査は、病気の境界をよりよく描写するために、健康診断と診断画像が含まれている。ほとんどの患者は、診断が困難な局所又は地域浸潤性疾患を有し、局所リンパ節の微小転移は望ましくない結果と非常に関連している。口腔の物理的な検査は、可能であるが、ルーチン検査は、一貫してすべての生物学的に関連する前駆体病変を識別しないし、補助スクリーニング技術は、広く使用される正当化するために適切な感受性及び特異性を欠いている。ＯＳＣＣの一般的な診断イメージング方法には、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）と磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が含まれる。いずれも有価診断情報を提供するが、ＭＲＩは優れた軟部組織対比を提供し、原発性腫瘍の境界、局所浸潤、転移検出をより正確に描写した。したがって、ＭＲＩは、通常、外科的切除の範囲、その後の組織再建、及び治療効果及び再発の治療モニタリングを計画するために使用される。Ｐａｌａｓｚら，（２０１７），Ｐｏｌ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ ８２：１９３－２０２。最も一般的に用いられているＭＲＩ造影剤は、ガドリニア系の造影剤（ＧＢＣＡ）である。しかし、現在のＧＢＣＡは非標的であり、疾患の同定を行うことができない非特異的造影増強を提供する。Ｚｈｏｕ Ｚ， Ｌｕ ＺＲ （２０１３）， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｎａｎｏｍｅｄ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５：１－１８。そのため、したがって、診断を増強し、タイムリーで正確な治療を導くために、正確な検出、描画、及び特性評価のためのＯＳＣＣの正確なイメージングを可能にするターゲットＧＢＣＡの開発に対する臨床的ニーズは、満たされていない。
【0181】
腫瘍細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は腫瘍細胞と密接に相互作用し、腫瘍の進行に関連する多くの生物学的プロセスを媒介する。ＥＣＭフィブロネクチンの増加は、腫瘍の浸潤、転移及び治療耐性と関連している。エクストラドメイン－Ｂフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）は、膵臓癌、乳癌及び口腔癌を含む多くの浸潤性癌において、正常な成人組織においてほとんど発現しない新生血管形成に関与するフィブロネクチン切断変異体である。Ｈａｎ Ｚ， Ｌｕ ＺＲ （２０１７）， Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｃｈｅｍ Ｂ ５：６３９－６５４。上皮腫瘍細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの存在は、マトリックス細胞によって産生されるＥＤＢ－ＦＮと結合してタンパク質を産生する固有の能力を示す。最近の研究では、前立腺癌と乳癌におけるＥＤＢ－ＦＮの差発現が腫瘍の浸潤性と正の相関を示した。Ａｙａｔ等人 （２０１８）， ＡＣＳ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ９：７３０－７３５；Ａｙａｔ等人 （２０１９）， Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ９：１３５１。ＯＳＣＣでは、ＥＤＢ－ＦＮは１００％以上の原発性腫瘍及び６３－９６％の子宮頸転移において可変発現を示し、浸潤性ＯＳＣＣの診断画像においてその可能性を示唆した。Ｂｉｒｃｈｌｅｒ等人 （２００３）， Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ １１３：１２３１－１２３７。
【0182】
腫瘍微小環境におけるＥＤＢ－ＦＮを選択的に標的とする小ペプチドＺＤ２を開発したＨａｎら，（２０１５），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２６：８３０－８３８。ＺＤ２と臨床ＧＢＣＡガドテリドールの組み合わせは、腫瘍微小環境を磁気共鳴分子イメージング（ＭＲＭＩ）することができる新しいＥＤＢ－ＦＮ標的造影剤ＺＤ２－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）を生成した。Ｈａｎら，（２０１７），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２８：１０３１－１０４０。ＺＤ２－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）のさらなる最適化により、Ｔ１緩和性を向上させるより効果的な標的造影剤ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＭＴ２１８）が生成された。標的薬を有するＭＲＭＩは、前立腺癌及び三陰性乳癌の浸潤性を有意に増強する。用量研究は、ＭＴ２１８がＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）又はガドテリドール（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ）の推奨臨床用量の２０％で使用される場合でも、三陰性乳癌におけるかなりの造影増強（大きいものではないにしても）を提供することを示した。１５． Ａｙａｔら，（２０１８），ＡＣＳ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ９：７３０－７３５。ここで、ＥＤＢ－ＦＮを発現する浸潤性ＯＳＣＣをＭＲＭＩを用いて診断画像化を行う際のＭＴ２１８の投与量の低下の有効性を実証した。
【0183】
方法
細胞培養
ヒトＯＳＣＩＣセル線ＣＡＬ２７、ＳＣＣ４は、アメリカンタイプのカルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＯＳＣＣ細胞株ＨＳＣ３は、日本生物資源研究センター細胞バンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，Ｉｂａｒａｋｉ Ｃｉｔｙ， Ｊａｐａｎ）ＣＡＬ２７及びＨＳＣ３を介して、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を補充した Ｉｎｃ．， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ， ＵＳＡ）及び１％ペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）のダルベコ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ，ＡＴＣＣ）で培養した。ＳＣＣ４は、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳ、及び４００ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ－Ｌｏｕｔ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭで培養した。安定した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びホタルルシフェリンを発現させた細胞株を、ＣＭＶ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓ－２Ａ－ＧＦＰレンチウイルスを用いた細胞を導入し、ＧＦＰ発現のために蛍光活性化細胞の選別を行って生成した。各親細胞株の完全培地では、ＣＡＬ２７－ＧＦＰ、ＳＣＣ４－ＧＦＰ、ＨＳＣ３－ＧＦＰ細胞株を培養した。全細胞を３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。
細胞培養
ヒトＯＳＣＩＣセル線ＣＡＬ２７、ＳＣＣ４は、アメリカンタイプのカルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＯＳＣＣ細胞株ＨＳＣ３は、日本生物資源研究センター細胞バンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ，Ｉｂａｒａｋｉ Ｃｉｔｙ， Ｊａｐａｎ）ＣＡＬ２７及びＨＳＣ３を介して、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を補充した Ｉｎｃ．， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ， ＵＳＡ）及び１％ペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）のダルベコ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ，ＡＴＣＣ）で培養した。ＳＣＣ４は、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳ、及び４００ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ－Ｌｏｕｔ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭで培養した。安定した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びホタルルシフェリンを発現させた細胞株を、ＣＭＶ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓ－２Ａ－ＧＦＰレンチウイルスを用いた細胞を導入し、ＧＦＰ発現のために蛍光活性化細胞の選別を行って生成した。各親細胞株の完全培地では、ＣＡＬ２７－ＧＦＰ、ＳＣＣ４－ＧＦＰ、ＨＳＣ３－ＧＦＰ細胞株を培養した。全細胞を３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0184】
半定量リアルタイムＰＣＲ
細胞ペレットからＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で抽出した。ＲＮＡ試料を、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。半定量リアルタイムＰＣＲは、製造者の推奨に従ってＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。相対ｍＲＮＡレベルは、標準的な２－ΔΔＣＴ法を用いて計算され、対照遺伝子として１８Ｓで発現される。ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡ合成とｑＲＴ－ＰＣＲを行った。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）から購入された。
細胞ペレットからＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で抽出した。ＲＮＡ試料を、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。半定量リアルタイムＰＣＲは、製造者の推奨に従ってＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。相対ｍＲＮＡレベルは、標準的な２－ΔΔＣＴ法を用いて計算され、対照遺伝子として１８Ｓで発現される。ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡ合成とｑＲＴ－ＰＣＲを行った。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）から購入された。
【0185】
タンパク質ブロット
細胞溶解液は、２ｘ Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、細胞塊からメーカーの推奨に従って調製した。溶解物を沸騰させ、４℃及び１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、Ｌｏｗｒｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を介して蛋白質濃度を測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてタンパク質抽出物（５０μｇ）を解析し、氷下でニトロセルロース膜（セルシグナリングテクノロー、ダンバース、ＭＡ、ＵＳＡ）に移した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＡＮ Ｔｅｔｒａシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び転送を行う。５％牛乳で膜を閉じ、洗浄し、抗－ＥＤＢ－ＦＮ（Ｇ４、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）及び抗－β－アクチン（ＣＳＴ）一次抗体（１：２０００）で５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマアルドリッチ）で一晩インキュベートした。膜を洗浄し、室温でスパイシーな根ペルオキシダーゼと結合させた抗－マウス及び抗－ウサギＩｇＧ二次抗体（１：１０００、ＣＳＴ）を５％ＢＳＡで１時間インキュベートした。洗浄後、ＳｉｇｎａｌＦｉｒｅ Ｐｌｕｓ ＥＣＬ試薬（ＣＳＴ）で膜を活性化し、ＢｉｏＲａｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でイメージングした。
細胞溶解液は、２ｘ Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、細胞塊からメーカーの推奨に従って調製した。溶解物を沸騰させ、４℃及び１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、Ｌｏｗｒｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を介して蛋白質濃度を測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてタンパク質抽出物（５０μｇ）を解析し、氷下でニトロセルロース膜（セルシグナリングテクノロー、ダンバース、ＭＡ、ＵＳＡ）に移した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＡＮ Ｔｅｔｒａシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び転送を行う。５％牛乳で膜を閉じ、洗浄し、抗－ＥＤＢ－ＦＮ（Ｇ４、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）及び抗－β－アクチン（ＣＳＴ）一次抗体（１：２０００）で５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマアルドリッチ）で一晩インキュベートした。膜を洗浄し、室温でスパイシーな根ペルオキシダーゼと結合させた抗－マウス及び抗－ウサギＩｇＧ二次抗体（１：１０００、ＣＳＴ）を５％ＢＳＡで１時間インキュベートした。洗浄後、ＳｉｇｎａｌＦｉｒｅ Ｐｌｕｓ ＥＣＬ試薬（ＣＳＴ）で膜を活性化し、ＢｉｏＲａｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でイメージングした。
【0186】
スフェロイドの形成及びペプチド結合に関する検討
カバープレート（４－ウェル、Ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、Ｃｕｌｔｒｅｘ基底膜マトリックス（３５０μＬ、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ，ＵＳＡ）でコーティングされている。スフェロイドを形成するために、２×１０５個ＯＳＣＣ細胞を準備ウェルに接種し、２日間インキュベートし、モティカムＴ２カメラ（Ｍｏｔｉｃ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ｃｈｉｎａ）で撮影した。ペプチド結合について、１×１０５細胞を調製したウェルに接種し、２日間インキュベートした。スフェロイドを上記のようにして合成したＺＤ２－Ｃｙ５．５（１２５ｎＭ）とＨｏｅｃｈｓｔ（１：２０００で希釈）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）染料で１５分間染色し、ＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３回洗浄し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００システム（ＯｌｙｍｐｕｓＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）は、共焦点レーザー走査顕微鏡で画像化される。
カバープレート（４－ウェル、Ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、Ｃｕｌｔｒｅｘ基底膜マトリックス（３５０μＬ、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ，ＵＳＡ）でコーティングされている。スフェロイドを形成するために、２×１０５個ＯＳＣＣ細胞を準備ウェルに接種し、２日間インキュベートし、モティカムＴ２カメラ（Ｍｏｔｉｃ、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ、Ｃｈｉｎａ）で撮影した。ペプチド結合について、１×１０５細胞を調製したウェルに接種し、２日間インキュベートした。スフェロイドを上記のようにして合成したＺＤ２－Ｃｙ５．５（１２５ｎＭ）とＨｏｅｃｈｓｔ（１：２０００で希釈）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）染料で１５分間染色し、ＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３回洗浄し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００システム（ＯｌｙｍｐｕｓＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）は、共焦点レーザー走査顕微鏡で画像化される。
【0187】
得られた共焦点蛍光画像を、ＦＩＪＩを用いて解析した。定量のために、画像に閾値処理を施し、２種類の染色剤のＲＯＩを生成する。スフェロイドサイズの場合、Ｈｏｅｃｈｓｔ ＲＯＩの平均寸法が計算された。染色強度について、ＺＤ２－Ｃｙ５．５とＨｏｅｃｈｓｔ ＲＯＩの平均信号強度と、平均強度との比率を算出した。
【0188】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの遊走及び浸潤アッセイ
ＯＳＣＣ細胞を一晩空腹にし、無血清培地（１×１０５個細胞）にＴｒａｎｓｗｅｌｌ ＴｈｉｎＣｅｒｔ 小室（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ，Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）の中に接種し、１００ μＬ １．０ ｍｇ／ｍＬ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティング（浸潤）又は塗布（移行）せず、完全な培地の上に置いた。移行と浸潤のための小室は、それぞれ１日と２日間インキュベートされた。小室の下側の細胞を１０％ホルマリンで固定し、０．１％結晶性紫で染色し、Ｍｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラで撮影した。
ＯＳＣＣ細胞を一晩空腹にし、無血清培地（１×１０５個細胞）にＴｒａｎｓｗｅｌｌ ＴｈｉｎＣｅｒｔ 小室（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ，Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）の中に接種し、１００ μＬ １．０ ｍｇ／ｍＬ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティング（浸潤）又は塗布（移行）せず、完全な培地の上に置いた。移行と浸潤のための小室は、それぞれ１日と２日間インキュベートされた。小室の下側の細胞を１０％ホルマリンで固定し、０．１％結晶性紫で染色し、Ｍｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラで撮影した。
【0189】
動物モデル
動物実験は、ケース西予約大学（ＣＷＲＵ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）動物保護・利用委員会（ＩＡＣＵＣ）が承認した動物プログラムに従って行われる。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した雌４週の胸のない裸のマウスは、ＣＷＲＵの動物コア研究所に収容された。麻酔した後のマウスは、右腹皮下に４×１０６ＧＦＰ／ルシフェラーゼ発現ＯＳＣＣ細胞（各細胞株ｎ＝５）を接種し、これらの細胞を１００ μＬ Ｍａｔｒｉｇｅｌ ＨＣ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）とＤＰＢＳの１：１混合物に投与した。腫瘍のサイズをキャリパーで測定し、モニタリングする。成長の４週間後、腫瘍は、ＭＲＩ実験を行うのに十分な大きかった。
動物実験は、ケース西予約大学（ＣＷＲＵ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）動物保護・利用委員会（ＩＡＣＵＣ）が承認した動物プログラムに従って行われる。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した雌４週の胸のない裸のマウスは、ＣＷＲＵの動物コア研究所に収容された。麻酔した後のマウスは、右腹皮下に４×１０６ＧＦＰ／ルシフェラーゼ発現ＯＳＣＣ細胞（各細胞株ｎ＝５）を接種し、これらの細胞を１００ μＬ Ｍａｔｒｉｇｅｌ ＨＣ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）とＤＰＢＳの１：１混合物に投与した。腫瘍のサイズをキャリパーで測定し、モニタリングする。成長の４週間後、腫瘍は、ＭＲＩ実験を行うのに十分な大きかった。
【0190】
ＭＲ分子イメージング
ＭＲＩの実験は、３Ｔ ＭＲＳ－３０００システム（ＭＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）を用いて行った。標的造影剤ＭＴ２１８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｎｏｔｉｃｓ、ＬＬＣ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）を注射する前と後の１０分、２０分及び３０分間、０．０４ｍｍｏｌ／ｋｇの用量で、呼吸ゲート制御を備えたＴ１強調高速スピンエコー軸位断シーケンスを使用した（ＴＲ＝３０５ｍｓ、ＴＥ＝１１ｍｓ、ＦＯＶ＝４０×４０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、スライス数＝１５、Ｎａｖ＝２、行列＝２５６×２４８）。２日後、同じマウスで０．１０ｍｍｏｌ／ｋｇの臨床用量を有する非標的臨床薬ガドテリドールを用いて該プロトコルを繰り返した。
ＭＲＩの実験は、３Ｔ ＭＲＳ－３０００システム（ＭＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）を用いて行った。標的造影剤ＭＴ２１８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｎｏｔｉｃｓ、ＬＬＣ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）を注射する前と後の１０分、２０分及び３０分間、０．０４ｍｍｏｌ／ｋｇの用量で、呼吸ゲート制御を備えたＴ１強調高速スピンエコー軸位断シーケンスを使用した（ＴＲ＝３０５ｍｓ、ＴＥ＝１１ｍｓ、ＦＯＶ＝４０×４０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、スライス数＝１５、Ｎａｖ＝２、行列＝２５６×２４８）。２日後、同じマウスで０．１０ｍｍｏｌ／ｋｇの臨床用量を有する非標的臨床薬ガドテリドールを用いて該プロトコルを繰り返した。
【0191】
画像は、ＤＩＣＯＭ形式でエクスポートし、ＦＩＪＩを用いて解析した。各時点のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）は、平均腫瘍強度と平均筋強度の差をノイズの標準偏差で割った値として計算された。
【0192】
異種移植組織学的分析
マウスは、ＩＡＣＵＣ指針に従って安楽死させた。異種移植腫瘍は、１０％ホルマリンで固定され、パラフィンで包埋され、カバーガラス上に５μｍのスライスに切断された。組織は、１：１００希釈ＥＤＢ－ＦＮ特異的抗体Ｇ４を用いて、組織形態学的従来のＨ＆Ｅ染色及び免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学の前に、クエン酸緩衝液を用いて１２５℃の圧力鍋で３０秒間抗原修復を行った。組織調製及び染色は、ＣＷＲＵ組織資源センターによって行われる。
マウスは、ＩＡＣＵＣ指針に従って安楽死させた。異種移植腫瘍は、１０％ホルマリンで固定され、パラフィンで包埋され、カバーガラス上に５μｍのスライスに切断された。組織は、１：１００希釈ＥＤＢ－ＦＮ特異的抗体Ｇ４を用いて、組織形態学的従来のＨ＆Ｅ染色及び免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学の前に、クエン酸緩衝液を用いて１２５℃の圧力鍋で３０秒間抗原修復を行った。組織調製及び染色は、ＣＷＲＵ組織資源センターによって行われる。
【0193】
ヒト組織の取得と組織学的分析
ＣＷＲＵのヒト組織調達施設（Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から５μｍスライスのヒト正常舌及びＯＳＣＣ試料を得た。組織試料は、ＣＷＲＵの機関審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）が承認した非ヒト被験者研究プログラムに従って完全に同定された。前述のように、ＥＤＢ－ＦＮの免疫組織化学染色は、組織資源センターによって行われる。
ＣＷＲＵのヒト組織調達施設（Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から５μｍスライスのヒト正常舌及びＯＳＣＣ試料を得た。組織試料は、ＣＷＲＵの機関審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）が承認した非ヒト被験者研究プログラムに従って完全に同定された。前述のように、ＥＤＢ－ＦＮの免疫組織化学染色は、組織資源センターによって行われる。
【0194】
統計解析
特に断らない限り、全ての実験を独立して３回複製した。また、２つのグループ間の統計的な意味は、ペアリングを行っていないＴ検定を用いて算出した。そして、単一因子分散分析と双方向分散分析を使用して、２つのグループと１つの独立変数を持つグループ間の統計的有意性を計算し、Ｆｉｓｈｅｒの最小有意差事後テストを実行した。Ｐ値が０．０５未満は、統計的に重要であると考えられる。すべてのデータは、平均±標準誤差で表されている。
特に断らない限り、全ての実験を独立して３回複製した。また、２つのグループ間の統計的な意味は、ペアリングを行っていないＴ検定を用いて算出した。そして、単一因子分散分析と双方向分散分析を使用して、２つのグループと１つの独立変数を持つグループ間の統計的有意性を計算し、Ｆｉｓｈｅｒの最小有意差事後テストを実行した。Ｐ値が０．０５未満は、統計的に重要であると考えられる。すべてのデータは、平均±標準誤差で表されている。
【0195】
結果
ヒト組織におけるＥＤＢ－ＦＮの発現
患者のＯＳＣＣに対する標的ＥＤＢ－ＦＮの臨床的相関を評価するために、ＥＤＰ－ＦＮ特異的Ｇ４モノクローナル抗体を用いて、免疫組織化学的にヒト組織試料中のＥＤＢ－ＦＮの発現を評価した。正常舌組織は、ＥＤＢ－ＦＮの弱点状染色が主に間質であることを示しているが、未処理原発性ＯＳＣＣ及び転移性試料は、悪性上皮細胞及び周囲間質の強い染色を示した（図１３ａ－ｃ）。これらの結果は，先に報告したヒトＯＳＣＣにおけるＥＤＢ－ＦＮ表現の結果と一致した。興味深いことに、新しい補助化学療法後の腫瘍は、未治療の腫瘍と比較して染色の減少を示し、処理後のＥＤＢ－ＦＮの下方調整を示している可能性がある（図１３ｄ）。これらの結果は、原発性及び転移性ＯＳＣＣ分子イメージングにおける癌タンパク質標的としてのＥＤＢ－ＦＮの可能性を探求することを強調する。
ヒト組織におけるＥＤＢ－ＦＮの発現
患者のＯＳＣＣに対する標的ＥＤＢ－ＦＮの臨床的相関を評価するために、ＥＤＰ－ＦＮ特異的Ｇ４モノクローナル抗体を用いて、免疫組織化学的にヒト組織試料中のＥＤＢ－ＦＮの発現を評価した。正常舌組織は、ＥＤＢ－ＦＮの弱点状染色が主に間質であることを示しているが、未処理原発性ＯＳＣＣ及び転移性試料は、悪性上皮細胞及び周囲間質の強い染色を示した（図１３ａ－ｃ）。これらの結果は，先に報告したヒトＯＳＣＣにおけるＥＤＢ－ＦＮ表現の結果と一致した。興味深いことに、新しい補助化学療法後の腫瘍は、未治療の腫瘍と比較して染色の減少を示し、処理後のＥＤＢ－ＦＮの下方調整を示している可能性がある（図１３ｄ）。これらの結果は、原発性及び転移性ＯＳＣＣ分子イメージングにおける癌タンパク質標的としてのＥＤＢ－ＦＮの可能性を探求することを強調する。
【0196】
ＯＳＣＣ細胞株の同定
３種類のヒトＯＳＣＣ細胞株を用いてＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩのＯＳＣＣ診断イメージングに対する有効性を評価した。ＣＡＬ２７とＳＣＣ４は、それぞれ治療前と治療後に舌の主要部位から分離された。ＣＡＬ２７は、上皮、玉石様の細胞レイアウトを維持し、ＳＣＣ４は、多倍体巨細胞で満たされている（図１４ａ）。興味深いことに、多倍体巨細胞は、通常、処理圧力による形態学的変化を示し、腫瘍の再発、薬剤耐性及び不均一性と関連している。一方、ＨＳＣ３は、頸部リンパ節転移から分離され、腫瘍モデルにおいて高い転移ポテンシャルを有する。
３種類のヒトＯＳＣＣ細胞株を用いてＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩのＯＳＣＣ診断イメージングに対する有効性を評価した。ＣＡＬ２７とＳＣＣ４は、それぞれ治療前と治療後に舌の主要部位から分離された。ＣＡＬ２７は、上皮、玉石様の細胞レイアウトを維持し、ＳＣＣ４は、多倍体巨細胞で満たされている（図１４ａ）。興味深いことに、多倍体巨細胞は、通常、処理圧力による形態学的変化を示し、腫瘍の再発、薬剤耐性及び不均一性と関連している。一方、ＨＳＣ３は、頸部リンパ節転移から分離され、腫瘍モデルにおいて高い転移ポテンシャルを有する。
【0197】
ＣＡＬ２７は、基底膜抽出物上に培養してスフェロイドを形成する際に、多数の小さな点状スフェロイドを形成し、ＨＳＣ３及びＳＣＣ４は、ゲル全体にわたって大きな密なネットワークを形成する（図１４ａ）。また、Ｔｒｒａｎｓｗｅｌｌアッセイは、細胞株の浸潤及び遊走能力をそれぞれ特徴付けるために、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを使用及び使用せずに行われた。２つの実験において、ＣＡＬ２７は、限られた移行又は侵入能力を示し、ＨＳＣ３及びＳＣＣ４は重大な侵入の可能性を示した（図１４ｂ）。これらのデータは、転送ＨＳＣ３及び処理後ＳＣＣ４が浸潤性の高リスクＯＳＣＣを表し、ＣＡＬ２７が浸潤性の低リスクＯＳＣＣを表していることを示している。
【0198】
ＥＤＢ－ＦＮは、高リスクＯＳＣＣに関連する標的可能な癌タンパク質である。
ＥＤＢ－ＦＮ発現を分析し、ＯＳＣＣ浸潤性との相関を決定した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡが非浸潤的なＣＡＬ２７と比較して浸潤的ＨＳＣ３（２１倍）及びＳＣＣ４（２３４倍）細胞で有意に上昇したことを示している（図１５ａ）。更に、ＳＣＣ４は、ＨＳＣ３の１１倍高いＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡのアップセンブルを示した。この結果は、タンパク質レベルでタンパク質ブロットによって確認され、ＥＤＢ－ＦＮが浸潤的なＯＳＣＣで発現及び上昇することが示された（図１５ｂ）。
ＥＤＢ－ＦＮ発現を分析し、ＯＳＣＣ浸潤性との相関を決定した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡが非浸潤的なＣＡＬ２７と比較して浸潤的ＨＳＣ３（２１倍）及びＳＣＣ４（２３４倍）細胞で有意に上昇したことを示している（図１５ａ）。更に、ＳＣＣ４は、ＨＳＣ３の１１倍高いＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡのアップセンブルを示した。この結果は、タンパク質レベルでタンパク質ブロットによって確認され、ＥＤＢ－ＦＮが浸潤的なＯＳＣＣで発現及び上昇することが示された（図１５ｂ）。
【0199】
スフェロイドをＥＤＢ－ＦＮ特異的蛍光プローブＺＤ２－Ｃｙ５．５で染色することにより、ＯＳＣＣ分子イメージングの標的ＥＤＢ－ＦＮを評価した。浸潤性ＨＳＣ３及びＳＣＣ４細胞はＣＡＬ２７よりも大きなスフェロイドを形成し、ＺＤ２－Ｃｙ５．５染色は、有意に強かった（図１５ｃ－ｄ）。染色強度の定量も、ＳＣＣ４の染色強度がＨＳＣ３より約２倍強く、ＥＤＢ－ＦＮ発現分析と一致していることを示している（図１５ｅ）。このデータは、ＺＤ２ペプチドがＯＳＣＣの分子イメージングのために異なる発現ＥＤＢ－ＦＮを標的とするのに有効であることを示している。
【0200】
ＭＲＭＩで発見したＭＴ２１８によるＥＤＢ－ＦＮ発現ＯＳＣＣに対する差別的な増強
マウス側腹異種移植モデルにおいて、ＯＳＣＣにおけるＥＤＢ－ＦＮに対するＭＴ２１８のＭＲＭＩの有効性と腫瘍浸潤性との相関をサブ臨床用量で決定し、臨床薬ガドテリドールを非標的対照として用いた。低リスク、低ＥＤＢ－ＦＮ ＣＡＬ２７腫瘍は、０．０４ｍｍｏｌ／ｋｇのＭＴ２１８で中程度の増強を示し、注射後３０分後に消失した。０．１ｍｍｏｌ／ｋｇガドテリドールの増強効果は、ＣＡＬ２７腫瘍でＭＴ２１８よりもわずかに大きいようである（図１６ａ）。高リスク、中等度ＥＤＢ－ＦＮ ＨＳＣ３腫瘍は、ＭＴ２１８注射後１０分後に強い増強を示し、３０分後に有意に減少した。ＭＴ２１８の投与量は、減少したが、ＨＳＣ３腫瘍におけるガドテリドールの増強作用は、ＭＴ２１８よりもやや小さいように見えるが、全体的にはＭＴ２１８に匹敵する（図１６ｂ）。高リスク、高ＥＤＢ－ＦＮ ＳＣＣ４腫瘍は、すべての時点でＭＴ２１８の有意な増強を示した。ＳＣＣ４腫瘍におけるガドテリドールの増強効果は、ＭＴ２１８よりもはるかに弱い（図１６ｃ）。これらの画像は、ＭＴ２１８がＥＤＢ－ＦＮの発現の違いに応じてサブ臨床用量で高リスクＯＳＣＣ腫瘍を増強することを示しており、これは臨床造影剤では達成できない特性である。
マウス側腹異種移植モデルにおいて、ＯＳＣＣにおけるＥＤＢ－ＦＮに対するＭＴ２１８のＭＲＭＩの有効性と腫瘍浸潤性との相関をサブ臨床用量で決定し、臨床薬ガドテリドールを非標的対照として用いた。低リスク、低ＥＤＢ－ＦＮ ＣＡＬ２７腫瘍は、０．０４ｍｍｏｌ／ｋｇのＭＴ２１８で中程度の増強を示し、注射後３０分後に消失した。０．１ｍｍｏｌ／ｋｇガドテリドールの増強効果は、ＣＡＬ２７腫瘍でＭＴ２１８よりもわずかに大きいようである（図１６ａ）。高リスク、中等度ＥＤＢ－ＦＮ ＨＳＣ３腫瘍は、ＭＴ２１８注射後１０分後に強い増強を示し、３０分後に有意に減少した。ＭＴ２１８の投与量は、減少したが、ＨＳＣ３腫瘍におけるガドテリドールの増強作用は、ＭＴ２１８よりもやや小さいように見えるが、全体的にはＭＴ２１８に匹敵する（図１６ｂ）。高リスク、高ＥＤＢ－ＦＮ ＳＣＣ４腫瘍は、すべての時点でＭＴ２１８の有意な増強を示した。ＳＣＣ４腫瘍におけるガドテリドールの増強効果は、ＭＴ２１８よりもはるかに弱い（図１６ｃ）。これらの画像は、ＭＴ２１８がＥＤＢ－ＦＮの発現の違いに応じてサブ臨床用量で高リスクＯＳＣＣ腫瘍を増強することを示しており、これは臨床造影剤では達成できない特性である。
【0201】
造影増強の半定量分析
腫瘍のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）は、ＭＴ２１８及びガドテリドールを用いた腫瘍増強の半定量分析のために算出した。ＭＴ２１８は、そのＥＤＢ－ＦＮ発現に基づいて３種の腫瘍モデルの違いを全時点で増強したが、ガドテリドールはどの時点でも差増強を示さなかった（図１７ａ－ｂ）。注射後の１０分を除いて、低リスク、低ＥＤＢ－ＦＮ ＣＡＬ２７腫瘍のＭＴ２１８増強は、ガドテリドールよりも有意に低かった（図１７ｃ）。高リスク、中等度ＥＤＢ－ＦＮ ＨＳＣ３腫瘍は、注射後の１０分後にＭＴ２１８の増強がガドテリドールよりも有意に高く、残りの時点で上昇傾向を示した（図１７ｄ）。高リスク、高ＥＤＢ－ＦＮ ＳＣＣ４腫瘍は、すべての時点で、ＭＴ２１８のＣＮＲ増強は、ガドテリドールよりも有意に高かった（図１７ｅ）。ＣＡＬ２７のＭＴ２１８とガドテリドールの平均最大増強値は、臨界値（ＣＮＲＭＴ２１８＝１．８０±０．１７、ＣＮＲｇａｄ＝２．２７±０．１８、ｐ＝０．０９５７）よりも有意に低く、ＨＳＣ３のは、臨界値（ＣＮ ＲＭＴ２１８＝２．６１±０．１７、ＣＮＲｇａｄ＝２．１８±０．０７、ｐ＝０．０６３９）よりも有意に高かく、ＳＣＣ４のは、臨界値（ＣＮＲＭＴ２１８＝３．８１±０．２５，ＣＮｇａｄ＝２．５７±０．２８，ｐ＝０．０１７０）を大幅に上回った（図１７ｆ－ｈ）。ＥＤＢ－ＦＮの発現によると、ＭＴ２１８の平均最大増強は、３種の腫瘍モデル間で有意に異なるが、ガドテリドールに有意な差はなかった（図１７ｉ）。これらのデータは、ＭＴ２１８のサブ臨床用量の違いが、ＥＤＢ－ＦＮの高リスクＯＳＣＣ腫瘍をＭＲＭＩで発現するユニークな能力を高めることを確認する。
腫瘍のコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）は、ＭＴ２１８及びガドテリドールを用いた腫瘍増強の半定量分析のために算出した。ＭＴ２１８は、そのＥＤＢ－ＦＮ発現に基づいて３種の腫瘍モデルの違いを全時点で増強したが、ガドテリドールはどの時点でも差増強を示さなかった（図１７ａ－ｂ）。注射後の１０分を除いて、低リスク、低ＥＤＢ－ＦＮ ＣＡＬ２７腫瘍のＭＴ２１８増強は、ガドテリドールよりも有意に低かった（図１７ｃ）。高リスク、中等度ＥＤＢ－ＦＮ ＨＳＣ３腫瘍は、注射後の１０分後にＭＴ２１８の増強がガドテリドールよりも有意に高く、残りの時点で上昇傾向を示した（図１７ｄ）。高リスク、高ＥＤＢ－ＦＮ ＳＣＣ４腫瘍は、すべての時点で、ＭＴ２１８のＣＮＲ増強は、ガドテリドールよりも有意に高かった（図１７ｅ）。ＣＡＬ２７のＭＴ２１８とガドテリドールの平均最大増強値は、臨界値（ＣＮＲＭＴ２１８＝１．８０±０．１７、ＣＮＲｇａｄ＝２．２７±０．１８、ｐ＝０．０９５７）よりも有意に低く、ＨＳＣ３のは、臨界値（ＣＮ ＲＭＴ２１８＝２．６１±０．１７、ＣＮＲｇａｄ＝２．１８±０．０７、ｐ＝０．０６３９）よりも有意に高かく、ＳＣＣ４のは、臨界値（ＣＮＲＭＴ２１８＝３．８１±０．２５，ＣＮｇａｄ＝２．５７±０．２８，ｐ＝０．０１７０）を大幅に上回った（図１７ｆ－ｈ）。ＥＤＢ－ＦＮの発現によると、ＭＴ２１８の平均最大増強は、３種の腫瘍モデル間で有意に異なるが、ガドテリドールに有意な差はなかった（図１７ｉ）。これらのデータは、ＭＴ２１８のサブ臨床用量の違いが、ＥＤＢ－ＦＮの高リスクＯＳＣＣ腫瘍をＭＲＭＩで発現するユニークな能力を高めることを確認する。
【0202】
異種移植腫瘍の組織学的分析
腫瘍は、組織学的・免疫組織学的分析のためにイメージング後に体から切除された。低リスク、中程度に分化したＣＡＬ２７腫瘍は、腫瘍境界付近での天体染色が増加し、上皮領域では弱いＥＤＢ－ＦＮ染色を示した（図１８）。高リスク、低分化ＨＳＣ３腫瘍は、ＣＡＬ２７腫瘍の対応する領域よりも強いＥＤＢ－ＦＮ染色を示し、説明のためのほとんど基質を示していない（図１８）。高リスクで分化の良いＳＣＣ４腫瘍は、上皮領域内及び周囲のＥＤＢ－ＦＮ膜性染色を示し、これは３種の腫瘍モデルの中で最も強く、大きな角化基質領域はほとんど染色されていない（図１８）。上皮腫瘍領域のＥＤＢ－ＦＮ染色強度は、インナトロＥＤＢ－ＦＮ発現分析及びＭＲＭＩデータのＣＮＲ分析と一致しており、ＯＳＣＣのＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩにおける造影増強は、ＥＤＢ－ＦＮ発現の増加とともに増加し、浸潤性と非浸潤性ＯＳＣＣを区別するために使用できることを示した。
腫瘍は、組織学的・免疫組織学的分析のためにイメージング後に体から切除された。低リスク、中程度に分化したＣＡＬ２７腫瘍は、腫瘍境界付近での天体染色が増加し、上皮領域では弱いＥＤＢ－ＦＮ染色を示した（図１８）。高リスク、低分化ＨＳＣ３腫瘍は、ＣＡＬ２７腫瘍の対応する領域よりも強いＥＤＢ－ＦＮ染色を示し、説明のためのほとんど基質を示していない（図１８）。高リスクで分化の良いＳＣＣ４腫瘍は、上皮領域内及び周囲のＥＤＢ－ＦＮ膜性染色を示し、これは３種の腫瘍モデルの中で最も強く、大きな角化基質領域はほとんど染色されていない（図１８）。上皮腫瘍領域のＥＤＢ－ＦＮ染色強度は、インナトロＥＤＢ－ＦＮ発現分析及びＭＲＭＩデータのＣＮＲ分析と一致しており、ＯＳＣＣのＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩにおける造影増強は、ＥＤＢ－ＦＮ発現の増加とともに増加し、浸潤性と非浸潤性ＯＳＣＣを区別するために使用できることを示した。
【0203】
議論
ＭＲＩは、一般に、ＯＳＣＣの診断に使用され、原発性及び転移性疾患を描写し、治療計画に役立つ比類のない軟部組織対照及び高解像度を提供する。更に、ＭＲＩは、患者を有害な放射線にさらさないし、ＧＢＣＡの臨床線量は通常ヨウ素基のＣＴ造影剤より腎毒性が少ない。本研究では、標的造影剤ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは、高リスクＯＳＣＣ腫瘍における臨床用量の４０％で強力な増強を提供した。同様の結果は、臨床用量のわずか２０％の浸潤性三陰性乳癌で観察された。Ａｙａｔら，（２０１９），Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ９：１３５１。増強された増加は、主に腫瘍ＥＣＭにおけるＥＤＢ－ＦＮとのＭＴ２１８の選択的結合に起因し、ＭＴ２１８が腫瘍に蓄積し、保持することを可能にする。浸潤性腫瘍に対するサブ臨床用量ＭＴ２１８の有効ＭＲＭＩはＧＢＣＡの臨床安全性を大幅に改善し、ガドテリドール投与に関連する潜在的な用量依存性副作用を軽減する。
ＭＲＩは、一般に、ＯＳＣＣの診断に使用され、原発性及び転移性疾患を描写し、治療計画に役立つ比類のない軟部組織対照及び高解像度を提供する。更に、ＭＲＩは、患者を有害な放射線にさらさないし、ＧＢＣＡの臨床線量は通常ヨウ素基のＣＴ造影剤より腎毒性が少ない。本研究では、標的造影剤ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは、高リスクＯＳＣＣ腫瘍における臨床用量の４０％で強力な増強を提供した。同様の結果は、臨床用量のわずか２０％の浸潤性三陰性乳癌で観察された。Ａｙａｔら，（２０１９），Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ９：１３５１。増強された増加は、主に腫瘍ＥＣＭにおけるＥＤＢ－ＦＮとのＭＴ２１８の選択的結合に起因し、ＭＴ２１８が腫瘍に蓄積し、保持することを可能にする。浸潤性腫瘍に対するサブ臨床用量ＭＴ２１８の有効ＭＲＭＩはＧＢＣＡの臨床安全性を大幅に改善し、ガドテリドール投与に関連する潜在的な用量依存性副作用を軽減する。
【0204】
リンパ節転移は、ＯＳＣＣの最も重要な予後指標の１つであり、頸部臨床及び放射線陰性患者の２０～４０％が潜伏転移を示した。領域転送を識別するための標準的なプラクティスには、健康診断と診断イメージングが含まれるが、多くの転送は、そのサイズが非常に小さいため、見過ごされたり、認識されない。選択的頸部解剖は、潜在的に影響を受けるリンパ節を除去するが、その後の組織学的検査は、多くの不要な解剖学を示した。以前、非常に特異的な標的ＧＢＣＡが微小転移性乳癌を検出できることを証明した。Ｚｈｏｕら，（２０１５），Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６：７９８４。また、転移性ＯＳＣＣ試料や細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの強い発現も観察され、これまでの研究と一致した。したがって、ＥＤＢ－ＦＮ標的造影剤ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは、ＯＳＣＣ転移をより正確に検出し、診断し、疾患の正確な管理と個別化治療を改善するための有望な新しい戦略を提供する。
【0205】
抗癌治療は、ＥＣＭタンパク質の発現に直接影響し、腫瘍の開始、進行及び治療効果を媒介する動的ＥＣＭを生成することができる。Ｈａｒｉｓｉ Ｒ， Ｊｅｎｅｙ Ａ （２０１５）， Ｏｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ ８：１３８７－１３９８。化学療法耐性は、ＡＫＴシグナル伝達の増加と下流フィブロネクチン及びＥＤＢ－ＦＮ発現の増加に規則的に関連している。治療後の長期暴露により、新しい補助ＯＳＣＣ検体におけるＥＤＢ－ＦＮ発現の減少、ＯＳＣＣ細胞における発現の増加が認められた。更に、頭頸部扁平上皮癌患者の２０％以上が局所腫瘍の再発を発症し、その後５年間で生存率は、３０％までに低下した。ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは、治療反応とＥＤＢ－ＦＮ発現の変化を関連し可視化し、医師に薬剤耐性などの高リスク特性を得るための洞察を提供し、適時かつ個別化された治療を改善し、腫瘍切除後の再発をモニタリングし、疾患を正確に管理することができる。
【0206】
この事前検討には、いくつかの制約がある。癌生物学におけるＥＤＢ－ＦＮの役割は大きく不明であり、分子、前臨床及び臨床レベルでさらなる研究が必要である。浸潤性ＯＳＣＣの実行可能なバイオマーカーであるＥＤＢ－ＦＮを総合的に評価するには、さらなる研究が必要である。本研究で用いたＭＲＩ技術は、半定量であるが，ＭＲ指紋認識などの定量ＭＲＩ技術ではＭＴ２１８を用い，腫瘍浸潤性や治療反応に関するＯＳＣＣにおけるＥＤＢ－ＦＮ発現のより正確な測定を提供することができる。今後の作業は、ＯＳＣＣとしてのＥＤＢ－ＦＮのイメージング可能なバイオマーカーの検証と、ＯＳＣＣの正確なイメージングのためのＭＴ２１８によるＭＲＭＩの臨床トランス翻訳に着目している。
【0207】
結論
ＥＤＰ－ＦＮ発現とヒトＯＳＣＣ細胞の浸潤性，腫瘍モデルと患者標本との予備的な相関を示した。 ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩはＯＳＣＣ腫瘍モデルにおいて実質的かつ差の造影増強を提供し、その固有のＥＤＢ－ＦＮ発現及びサブ臨床用量における浸潤性と関連している。同時に、ガドテリドールは、臨床用量で適度な未分化増強を提供する。これらの結果から、ＥＤＢ－ＦＮ標的造影剤ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは、ＯＳＣＣの臨床管理において正確な診断、リスク評価、描写、治療効果のモニタリングを提供することができる。
ＥＤＰ－ＦＮ発現とヒトＯＳＣＣ細胞の浸潤性，腫瘍モデルと患者標本との予備的な相関を示した。 ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩはＯＳＣＣ腫瘍モデルにおいて実質的かつ差の造影増強を提供し、その固有のＥＤＢ－ＦＮ発現及びサブ臨床用量における浸潤性と関連している。同時に、ガドテリドールは、臨床用量で適度な未分化増強を提供する。これらの結果から、ＥＤＢ－ＦＮ標的造影剤ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは、ＯＳＣＣの臨床管理において正確な診断、リスク評価、描写、治療効果のモニタリングを提供することができる。
【0208】
実施例４：ＭＲ分子イメージングを用いて膵癌の早期発見のためのＥＣＭ癌タンパク質を標的とすることによる間質バリアの克服
膵臓癌（ＰａＣａ）は、癌の大量かつ急速な成長の原因である。ＰａＣａの予後は、不良であり、５年の生存率は、９％に過ぎない。患者は、通常、後期ＰａＣａとして現れ、転移又は外科的切除を受けることができない。術後の結果を解析することにより、早期疾患の検出・除去は、生存や疾患の硬化が飛躍的に向上することを示唆している。しかし、ＰａＣａ診断のための現在の戦略は、前段の疾患に対しては敏感ではない。造影されたコンピュータ断層撮影（ＣＥ－ＣＴ）は、ＰａＣａのイメージングに最も一般的に利用されているが、治癒可能な腫瘍、リンパ節転移や肝臓転移には、困難である。造影増強磁気共鳴イメージングは、優れた軟部組織対照と優れた空間分解能を示し、ＰａＣａ診断にますます使用されている。しかし、既存の臨床造影剤は、腫瘍特異性ではなく、小さな腫瘍を検出する際に感度が低い。腫瘍特異的造影剤の開発は、腫瘍内造影剤の蓄積を改善し、早期ＰａＣａの正確な検出と描写におけるＭＲＩの利点を最大化する。早期ＰａＣａを検出できる安全で効果的な標的ＭＲＩ造影剤の必要性は満たされていない。
膵臓癌（ＰａＣａ）は、癌の大量かつ急速な成長の原因である。ＰａＣａの予後は、不良であり、５年の生存率は、９％に過ぎない。患者は、通常、後期ＰａＣａとして現れ、転移又は外科的切除を受けることができない。術後の結果を解析することにより、早期疾患の検出・除去は、生存や疾患の硬化が飛躍的に向上することを示唆している。しかし、ＰａＣａ診断のための現在の戦略は、前段の疾患に対しては敏感ではない。造影されたコンピュータ断層撮影（ＣＥ－ＣＴ）は、ＰａＣａのイメージングに最も一般的に利用されているが、治癒可能な腫瘍、リンパ節転移や肝臓転移には、困難である。造影増強磁気共鳴イメージングは、優れた軟部組織対照と優れた空間分解能を示し、ＰａＣａ診断にますます使用されている。しかし、既存の臨床造影剤は、腫瘍特異性ではなく、小さな腫瘍を検出する際に感度が低い。腫瘍特異的造影剤の開発は、腫瘍内造影剤の蓄積を改善し、早期ＰａＣａの正確な検出と描写におけるＭＲＩの利点を最大化する。早期ＰａＣａを検出できる安全で効果的な標的ＭＲＩ造影剤の必要性は満たされていない。
【0209】
膵癌は、標的細胞表面分子を標的細胞表面分子とする分子イメージング剤の結合を阻害する緻密な腫瘍ストロマを有し、有効分子イメージングや癌の検出のための大きな障害を提供する。しかし、そのユニークな細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子特性は、正確な分子イメージングと小さな腫瘍検出のための画像コントラストを生成するために使用することができる。ドメイン外Ｂフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）は、悪性腫瘍で再建されたが、ほとんどの正常組織で欠失したフィブロネクチンの癌胚せん断変異体である。Ｈａｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６，８３０－８３８（２０１５）。腫瘍ＥＣＭのＥＤＢ－ＦＮは、ＰａＣａ腫瘍の有効分子イメージング用の撮像剤を特異的に結合させるために容易にアクセス可能である。浸潤性腫瘍におけるその豊富さは、磁気共鳴分子イメージング（ＭＲＭＩ）における強力なシグナル増強を生成するために、適切な標的造影剤の迅速な結合を可能にする。したがって、ＥＤＢ－ＦＮは、有望な標的分子イメージング及びＭＲＭＩを用いたＰａＣａの早期検出方法である。
【0210】
ＥＤＢ－ＦＮ１７に高い特異性で結合するオリゴペプチド、ＴＶＲＴＳＡＤ（ＺＤ２）を先に開発した。ＺＤ２標的ＭＲＩ造影剤は、浸潤性乳癌及び前立腺癌モデルにおけるＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩを開発し、テストした。Ｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８，６９２（２０１７）。標的造影剤ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＭＴ２１８）は、ＺＤ２ペプチドと臨床大環造影剤Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）１７，２１とを配合して開発された。 ＭＴ２１８はＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）よりも高いＴ１緩和性を有し、浸潤性乳癌及び前立腺癌における優れた造影増強を示す。Ａｙａｔら，ＡＣＳ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，９（７）：７３０－７３５（２０１８）。ＭＴ２１８とＰａＣａ腫瘍ＥＣＭの豊富なＥＤＢ－ＦＮの組み合わせは、緻密な腫瘍間質バリアを克服し、強力な造影増強を生成し、ＭＲＭＩによるＰａＣａイメージングを改善することができる。
【0211】
材料及び方法
細胞及び試薬
ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｎｏｔｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から求めた。ＰｒｏＨａｎｃｅ（登録商標）Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍｏｎｒｏｅ Ｔｏｗｎｓｈｉｐ， ＮＪ）から購入した。ＺＤ２－Ｃｙ５．５を先に説明したように合成した。Ｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８，６９２（２０１７）。Ｃａｐａｎ－１、ＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ－１（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）ヒトＰａＣａ細胞を推奨培地及び条件で培養した。ＢｘＰＣ３及びＰＡＮＣ－１細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びルシフェラーゼの発現のためのレンチウィルスビークル（Ａｍｓｂｉｏ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を導入した。
細胞及び試薬
ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｎｏｔｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から求めた。ＰｒｏＨａｎｃｅ（登録商標）Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍｏｎｒｏｅ Ｔｏｗｎｓｈｉｐ， ＮＪ）から購入した。ＺＤ２－Ｃｙ５．５を先に説明したように合成した。Ｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８，６９２（２０１７）。Ｃａｐａｎ－１、ＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ－１（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）ヒトＰａＣａ細胞を推奨培地及び条件で培養した。ＢｘＰＣ３及びＰＡＮＣ－１細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びルシフェラーゼの発現のためのレンチウィルスビークル（Ａｍｓｂｉｏ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を導入した。
【0212】
緩和性測定
ＭＴ２１８及びＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）溶液のＴ１及びＴ２値は、３Ｔ ＭＲＳ ３０００スキャナ（ＭＲ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用して測定される。濃度０、０．２５、０．５、１及び２ｍＭのＭＴ２１８溶液をＤＰＢＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で調製した。Ｔ１値（μ＝１０ｍｓ、ＴＥ＝４ｍｓ、ＦＡ＝８°、エコー／フレーム＝１２８、ＦＯＶ＝４０ｍｍ×４０ｍｍ、スライス厚さ＝２ｍｍ、平均数＝１、時間遅延＝４０００ｍｓ、サンプリング期間＝２００、行列＝２５６×１２８）は、反転回復高速低角度撮影（ＩＲ－ＦＬＡＳＨ）シーケンスを用いて測定した。Ｔ２値は、マルチエコー多層スライス（ＭＥＭＳ）シーケンスを用いて求めた（ＴＥ＝１５ｍｓ、繰り返し時間＝１５ｍｓ、エコー＝１０、ＦＯＶ：４０ｍｍ×４０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、平均＝１、行列＝２５６×１９２）。ｒ１及びｒ２緩和性は、それぞれ１／Ｔ１及び１／Ｔ２及びＧｄ濃度マップの傾きに基づいて算出される。
ＭＴ２１８及びＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）溶液のＴ１及びＴ２値は、３Ｔ ＭＲＳ ３０００スキャナ（ＭＲ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用して測定される。濃度０、０．２５、０．５、１及び２ｍＭのＭＴ２１８溶液をＤＰＢＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で調製した。Ｔ１値（μ＝１０ｍｓ、ＴＥ＝４ｍｓ、ＦＡ＝８°、エコー／フレーム＝１２８、ＦＯＶ＝４０ｍｍ×４０ｍｍ、スライス厚さ＝２ｍｍ、平均数＝１、時間遅延＝４０００ｍｓ、サンプリング期間＝２００、行列＝２５６×１２８）は、反転回復高速低角度撮影（ＩＲ－ＦＬＡＳＨ）シーケンスを用いて測定した。Ｔ２値は、マルチエコー多層スライス（ＭＥＭＳ）シーケンスを用いて求めた（ＴＥ＝１５ｍｓ、繰り返し時間＝１５ｍｓ、エコー＝１０、ＦＯＶ：４０ｍｍ×４０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、平均＝１、行列＝２５６×１９２）。ｒ１及びｒ２緩和性は、それぞれ１／Ｔ１及び１／Ｔ２及びＧｄ濃度マップの傾きに基づいて算出される。
【0213】
結合親和性測定
ＭＴ２１８の結合親和性は、ＮａｎｏｔｅｍｐｅｒＴＭ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５機器（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）により求めた。また、ＦＮのＥＤＢ断片は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で発現し、精製し、アミン活性色素ＮＴ－６４７で標識した。ＭＴ２１８をアッセイバッファー（５０ ｍＭ ＰＢＳ ｗ／０．０５％トウェイン－２０）に溶解した。この溶液を更にアッセイバッファーで希釈し、一連のＭＴ２１８作動溶液を得た。次に、各ＭＴ２１８作動溶液を蛍光標識ＥＤＢフラグメントの固定濃度と混合した。次に、ＭＴ２１８とＥＤＢの混合物を標準キャピラリーにロードし、２５℃で２０％～８０％の発光ダイオードパワーと４０％の赤外レーザーパワーを使用して、異なる濃度のＭＴ２１８でＭＳＴ測定を行った。
ＭＴ２１８の結合親和性は、ＮａｎｏｔｅｍｐｅｒＴＭ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５機器（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）により求めた。また、ＦＮのＥＤＢ断片は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で発現し、精製し、アミン活性色素ＮＴ－６４７で標識した。ＭＴ２１８をアッセイバッファー（５０ ｍＭ ＰＢＳ ｗ／０．０５％トウェイン－２０）に溶解した。この溶液を更にアッセイバッファーで希釈し、一連のＭＴ２１８作動溶液を得た。次に、各ＭＴ２１８作動溶液を蛍光標識ＥＤＢフラグメントの固定濃度と混合した。次に、ＭＴ２１８とＥＤＢの混合物を標準キャピラリーにロードし、２５℃で２０％～８０％の発光ダイオードパワーと４０％の赤外レーザーパワーを使用して、異なる濃度のＭＴ２１８でＭＳＴ測定を行った。
【0214】
動物モデル
側腹異種移植モデルの場合、１００ μＬ ６ ｍｇ／ｍＬ Ｍａｔｒｉｇｅｌ （Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）溶液中の４×１０６個Ｃａｐａｎ－１細胞皮下を８週齢の雌ヌ／ヌマウスの側腹に注入した。腫瘍体積が３００ｍｍ３を超えた後、腫瘍マウスをイメージングした。インプレース膵臓内モデルの場合、手術は４週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスの膵臓を暴露し、１００ μＬ Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液（６ｍｇ／ｍＬ）に懸濁した１×１０６個ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ又はＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－Ｌｕｃ細胞を膵臓組織に注入した。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステム（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の腹腔内注射ｄ－ルシフェリンのバイオ発光イメージングによって画像化される前に検証される。
側腹異種移植モデルの場合、１００ μＬ ６ ｍｇ／ｍＬ Ｍａｔｒｉｇｅｌ （Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）溶液中の４×１０６個Ｃａｐａｎ－１細胞皮下を８週齢の雌ヌ／ヌマウスの側腹に注入した。腫瘍体積が３００ｍｍ３を超えた後、腫瘍マウスをイメージングした。インプレース膵臓内モデルの場合、手術は４週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスの膵臓を暴露し、１００ μＬ Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液（６ｍｇ／ｍＬ）に懸濁した１×１０６個ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ又はＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－Ｌｕｃ細胞を膵臓組織に注入した。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステム（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の腹腔内注射ｄ－ルシフェリンのバイオ発光イメージングによって画像化される前に検証される。
【0215】
ヒト組織のＺＤ２－Ｃｙ５．５染色
ＰａＣａ患者（症例総合がんセンター（Ｃａｓｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）の組織切片をキシレン、エタノールで脱ろうし，水で洗浄した。 １０％ヤギ血清のＰＢＳ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と０．１％トウェイン２０（ＰＢＳ－Ｔ）で３０分間閉鎖し、３７℃で５００ ｎＭ ＺＤ２－Ｃｙ５．５のＰＢＳ－Ｔ溶液で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄインストールメディア（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用してスライスをインストールした。あらかじめプログラムされたＣｙ５．５（励起：６３５ｎｍ、発光：６９３ｎｍ）とＤＡＰＩ（励起：４０５ｎｍ、発光：４６１ｎｍ）の発光及び励起フィルタを用いて、１０Ｘ対物レンズを用いてＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）共焦点顕微鏡上で画像を取得した。すべての組織試料は、同じレーザーパワーとセンサーゲインでイメージングされた。ＦＩＪＩソフトウェアを用いて、シングルチャンネルグレースケール画像から画像を生成した。
ＰａＣａ患者（症例総合がんセンター（Ｃａｓｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）の組織切片をキシレン、エタノールで脱ろうし，水で洗浄した。 １０％ヤギ血清のＰＢＳ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と０．１％トウェイン２０（ＰＢＳ－Ｔ）で３０分間閉鎖し、３７℃で５００ ｎＭ ＺＤ２－Ｃｙ５．５のＰＢＳ－Ｔ溶液で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄインストールメディア（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用してスライスをインストールした。あらかじめプログラムされたＣｙ５．５（励起：６３５ｎｍ、発光：６９３ｎｍ）とＤＡＰＩ（励起：４０５ｎｍ、発光：４６１ｎｍ）の発光及び励起フィルタを用いて、１０Ｘ対物レンズを用いてＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）共焦点顕微鏡上で画像を取得した。すべての組織試料は、同じレーザーパワーとセンサーゲインでイメージングされた。ＦＩＪＩソフトウェアを用いて、シングルチャンネルグレースケール画像から画像を生成した。
【0216】
細胞及び組織のタンパク質ブロット分析
ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤混合液（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充したＲＩＰＡ緩衝液中のＣａｐａｎ－１、ＢｘＰＣ３及びＰＡＮＣ－１細胞及び組織を溶解した。サンプルは、ローターステータホモジナイザー（ＩＫＡ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）で更に均質化された。溶解物を遠心分離し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を用いて上清の総タンパク質濃度を測定した。全タンパク質（３０μｇ）をＬａｅｍｌｉバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で５分間混合し、煮沸した。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（５－２０％）で分離し、ニトロセルロースフィルム（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）に移した。使用される一次抗体は、５％ウシ血清アルブミンで希釈された抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体ＢＣ－１（１：５００、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及び５％牛乳で希釈された抗－β－アクチン抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）の細胞溶解に使用された。５％ウシ血清アルブミン中のＧ４抗体（１：１０００、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｂｓｏｌｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）と５％牛乳中の抗ＧＡＰＤＨ抗体（１：１００００、セルシグナリングＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を組織溶解物に用いた。一晩抗体のインキュベーションを行う。二次抗－マウスＨＲＰ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）及び抗－ウサギＨＲＰ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）抗体を室温で５％牛乳のＴＢＳ－Ｔ溶液で１時間振とうインキュベートした。ＳｉｇｎａｌＦｉｒｅ Ｐｌｕｓ ＥＣＬキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）で染色膜を開発し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてイメージングした。ＦＩＪＩソフトウェアによる密度を測定した。
ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤混合液（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充したＲＩＰＡ緩衝液中のＣａｐａｎ－１、ＢｘＰＣ３及びＰＡＮＣ－１細胞及び組織を溶解した。サンプルは、ローターステータホモジナイザー（ＩＫＡ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）で更に均質化された。溶解物を遠心分離し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を用いて上清の総タンパク質濃度を測定した。全タンパク質（３０μｇ）をＬａｅｍｌｉバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で５分間混合し、煮沸した。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（５－２０％）で分離し、ニトロセルロースフィルム（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）に移した。使用される一次抗体は、５％ウシ血清アルブミンで希釈された抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体ＢＣ－１（１：５００、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及び５％牛乳で希釈された抗－β－アクチン抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）の細胞溶解に使用された。５％ウシ血清アルブミン中のＧ４抗体（１：１０００、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｂｓｏｌｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）と５％牛乳中の抗ＧＡＰＤＨ抗体（１：１００００、セルシグナリングＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を組織溶解物に用いた。一晩抗体のインキュベーションを行う。二次抗－マウスＨＲＰ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）及び抗－ウサギＨＲＰ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）抗体を室温で５％牛乳のＴＢＳ－Ｔ溶液で１時間振とうインキュベートした。ＳｉｇｎａｌＦｉｒｅ Ｐｌｕｓ ＥＣＬキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）で染色膜を開発し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてイメージングした。ＦＩＪＩソフトウェアによる密度を測定した。
【0217】
マウス腫瘍組織の免疫組織化学染色及び組織化学染色
安楽死したマウスからＰａＣａ腫瘍組織及び正常膵臓組織を採取し、１０％緩衝ホルマリンで２４時間固定した。パラフィンブロックにサンプルを埋め込み、ＲＭ２２３５スライサー（Ｌｅｉｃａ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して５μｍスライスに切断した。標準条件でヘマトキシリン/エオシン染色を行った。抗原修復は、ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中で１２５℃で３０秒間行い、次いで３％Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼブロッキング（８分）とげっ歯類のブロックＭ（Ｒｏｄｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ Ｍ、２０分）（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｐａｃｈｅｃｏ，ＣＡ）を行った。抗－ＥＤＢ－ＦＮ Ｇ４モノクローナル抗体（１：１００）を組織切片でＲＴ下で１時間振動インキュベートした。ＨＲＰポリマー検出溶液（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｐａｃｈｅｃｏ、ＣＡ）を用いて検出した。３，３’－ジアミノビフェニルアミンで５分間可視化し、ヘマトキシリンで５秒間精染した。Ｂｘ６１ＶＳ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）スライドスキャナで画像をキャプチャし、ＯｌｙＶＩＡソフトウェアで処理した。組織学的解釈は、委員会によって認定された病理学者によって行われた。
安楽死したマウスからＰａＣａ腫瘍組織及び正常膵臓組織を採取し、１０％緩衝ホルマリンで２４時間固定した。パラフィンブロックにサンプルを埋め込み、ＲＭ２２３５スライサー（Ｌｅｉｃａ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して５μｍスライスに切断した。標準条件でヘマトキシリン/エオシン染色を行った。抗原修復は、ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中で１２５℃で３０秒間行い、次いで３％Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼブロッキング（８分）とげっ歯類のブロックＭ（Ｒｏｄｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ Ｍ、２０分）（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｐａｃｈｅｃｏ，ＣＡ）を行った。抗－ＥＤＢ－ＦＮ Ｇ４モノクローナル抗体（１：１００）を組織切片でＲＴ下で１時間振動インキュベートした。ＨＲＰポリマー検出溶液（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｐａｃｈｅｃｏ、ＣＡ）を用いて検出した。３，３’－ジアミノビフェニルアミンで５分間可視化し、ヘマトキシリンで５秒間精染した。Ｂｘ６１ＶＳ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）スライドスキャナで画像をキャプチャし、ＯｌｙＶＩＡソフトウェアで処理した。組織学的解釈は、委員会によって認定された病理学者によって行われた。
【0218】
ＺＤ２ペプチドの結合特異性を評価するために、腫瘍と正常組織のフラッシュ凍結サンプルを安楽死した腫瘍ベアリングマウスから採取し、最適な切削温度培地に包埋した。その後、包埋したサンプルを、液体窒素中に５分間浸漬し、凍結乾燥前の保管用－８０℃に移送した。組織切片を０．０５％トウェイン－２０及び１０％正常ヤギ血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むＰＢＳで１時間ブロックし、その後、ＢＣ－１一次モノクローナル抗体（１：４００）又はＺＤ２－Ｃｙ５．５（５００ｎＭ）で４°Ｃで２．５時間染色し、ＰＢＳ－Ｔ緩衝液で洗浄した。二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４抗－ウサギをＢＣ－１で処理したスライスを室温（１：１０００）で１時間インキュベートした。ブロッキング実験は、まず、組織切片を過剰のＢＣ１抗体で４°Ｃで一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。その後、ＺＤ２－Ｃｙ５．５でスライスし、室温で２．５時間インキュベートした。染色したスライスをＰＢＳ－Ｔバッファーで洗浄し、Ｃｙ５．５（励起：６３５ｎｍ、放出：６９３ｎｍ）及びＤＡＰＩ（励起：４０５ｎｍ、グロー：４６１ｎｍ）の事前プログラムされた発光及び励起フィルタは、１０Ｘ対物レンズを使用して、Ｏｌａｍｐｕｓ ＦＶ１０００（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）共焦点顕微鏡で画像を取得した。
【0219】
造影増強ＭＲＩ
麻酔側腹腫マウスを尾静脈カテーテルに挿入した。ＭＲ画像取得は、体積ＲＦコイルを備えた７Ｔ Ｂｉｏｓｐｉｎ（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）前臨床小型動物スキャナで行った。マルチスピンマルチエコー（ＭＳＭＥ）ＭＲＩシーケンス（５００ｍｓＴＲ、８．１ｍｓＴＥ、９０°ＦＡ、４．５０ｃｍ×４．５０ｃｍＦＯＶ、１．５０ｍｍスライス厚さ、１６スライス、２つ平均値、２００×２００マトリックス、０．０２２５×０．０２２５ｃｍ／画素解像度）を得た。造影剤を尾静脈カテーテルに０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ（１００μＬ）の用量で注射し、その後、生理食塩水洗浄を行った。腫瘍画像は、造影剤の投与前及び投与後の異なる時点で採取した。Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、対照として使用された。
麻酔側腹腫マウスを尾静脈カテーテルに挿入した。ＭＲ画像取得は、体積ＲＦコイルを備えた７Ｔ Ｂｉｏｓｐｉｎ（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）前臨床小型動物スキャナで行った。マルチスピンマルチエコー（ＭＳＭＥ）ＭＲＩシーケンス（５００ｍｓＴＲ、８．１ｍｓＴＥ、９０°ＦＡ、４．５０ｃｍ×４．５０ｃｍＦＯＶ、１．５０ｍｍスライス厚さ、１６スライス、２つ平均値、２００×２００マトリックス、０．０２２５×０．０２２５ｃｍ／画素解像度）を得た。造影剤を尾静脈カテーテルに０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ（１００μＬ）の用量で注射し、その後、生理食塩水洗浄を行った。腫瘍画像は、造影剤の投与前及び投与後の異なる時点で採取した。Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、対照として使用された。
【0220】
膵臓内腫瘍を運ぶマウスを麻酔し、尾静脈カテーテルに挿入した。マウスＲＦコイルを用いたＭＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ３Ｔ ＭＲＳ ３０００スキャナで画像取得を行った。高速スピンエコー（ＦＳＥ）ＭＲＩシーケンス（３０５ ｍｓ ＴＲ、１１ｍｓ ＴＥ、９０°ＦＡ、４ｃｍ×４ｃｍ ＦＯＶ、１ｍｍスライス厚さ、１０つスライス、エコー列長＝４、エコー間隔＝１１ｍｓ、４つ平均値、２５６×２５６マトリックス、０．０１５６×０．１５６ｃｍ／画素解像度）、及び呼吸ゲートを使用して軸位断像を得た。造影前と造影後の異なる時点で０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ（１００μＬ）の線量で画像を取得した。競合結合実験では、５：１モル比の遊離のＺＤ２ペプチドとＭＴ２１８を、０．１ｍｍｏｌ ＭＴ２１８／ｋｇ（１００μＬ）の線量で、膵臓内のＢｘＰＣ３腫瘍異種移植片を運ぶマウスに注入した（ｎ＝３）。提供されたＳｕｒｓｃａｌｅｒｅａｄｅｒ．ｅｘｅ（ＭＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ）プログラムを用いてＭＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ３Ｔスキャナ上で得られた画像を正規化した。
【0221】
イメージファイルは、Ｈｏｒｕｓソフトウェアでエクスポート及び解析された。ＲＯＩは、腫瘍、肝臓、腎臓、筋肉に描出された。筋肉ＲＯＩは、筋肉から採取し、他の構造（肝臓、腎臓、腫瘍）を公開画像と比較し、解剖学的なランドマークや生体発光イメージングと比較した後に決定される。画像解析のために描画されたＲＯＩのサイズを補助テーブルＳ１にまとめる。腫瘍のコントラスト対ノイズの比（ＣＮＲ）は、以下の式を用いて算出し、ここで、σノイズがマウスのインビトロからプロットされたＲＯＩ強度の標準偏差である。
ＣＮＲ＝平均強度 腫瘍 －平均強度 筋肉
σノイズ
ＣＮＲ＝平均強度 腫瘍 －平均強度 筋肉
σノイズ
【0222】
肝臓のノイズ（ＣＮＲ）に対するコントラストの比は、以下の式を用いて算出した。
ＣＮＲ＝平均強度 肝臓 －平均強度 筋肉
σノイズ
ＣＮＲ＝平均強度 肝臓 －平均強度 筋肉
σノイズ
【0223】
ＦＩＪＩオープンソースソフトウェアでは、同じウィンドウとレベルに調整された画像の画像を影を引いた。ＲＧＢ虹色ルックアップテーブルを使用して、イメージの減算の結果を探しした。
【0224】
統計分析
画像コントラストは、造影前画像に対する造影後画像のコントラスト対ノイズの比の倍数増強値として報告されており、その中、倍数増強値＝ＣＮＲｐｏｓｔ／ＣＮＲｐｒｅを用いて通知された。ＣＮＲの統計分析は、Ｍｉｎｉｔａｂ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ，Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）で行った。単一因子分散分析とフィッシャー個人平均差検定を行い、２つ以上の平均間の統計的有意性を決定した（ｐ＜０．０５）。学生Ｔ検定は、２つの平均間の統計的有意性を決定するために使用された（ｐ＜０．０５）。
画像コントラストは、造影前画像に対する造影後画像のコントラスト対ノイズの比の倍数増強値として報告されており、その中、倍数増強値＝ＣＮＲｐｏｓｔ／ＣＮＲｐｒｅを用いて通知された。ＣＮＲの統計分析は、Ｍｉｎｉｔａｂ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ，Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）で行った。単一因子分散分析とフィッシャー個人平均差検定を行い、２つ以上の平均間の統計的有意性を決定した（ｐ＜０．０５）。学生Ｔ検定は、２つの平均間の統計的有意性を決定するために使用された（ｐ＜０．０５）。
【0225】
結果
ＭＴ２１８の結合親和性と緩和性
標的造影剤ＭＴ２１８の化学構造、結合親和性、及び緩和性を図１９に示す。ＭＴ２１８は、大環状臨床ＭＲＩ造影剤ＧＤ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）に対する、ＺＤ２ペプチドの小さな分子結合物である。また、ＭＴ２１８とＥＤＢ－ＦＮの結合親和性は、３．２±０．２μｍであった。３Ｔの場合に、ＭＴ２１８のＴ１及びＴ２緩和性は、それぞれ６．０７±１．１３ｓ－１ｍＭ－１及び８．２０±０．１８ｓ－１ｍＭ－１であった。
ＭＴ２１８の結合親和性と緩和性
標的造影剤ＭＴ２１８の化学構造、結合親和性、及び緩和性を図１９に示す。ＭＴ２１８は、大環状臨床ＭＲＩ造影剤ＧＤ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）に対する、ＺＤ２ペプチドの小さな分子結合物である。また、ＭＴ２１８とＥＤＢ－ＦＮの結合親和性は、３．２±０．２μｍであった。３Ｔの場合に、ＭＴ２１８のＴ１及びＴ２緩和性は、それぞれ６．０７±１．１３ｓ－１ｍＭ－１及び８．２０±０．１８ｓ－１ｍＭ－１であった。
【0226】
ヒトＰａＣａにおけるＥＤＢ－ＦＮの発現
図２０は、ヒトＰａＣａ、膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）及び正常膵組織標本におけるＺＤ２ペプチドとＥＤＢ－ＦＮとの結合を標的蛍光プローブＺＤ２－Ｃｙ５．５で示す。ＺＤ２－Ｃｙ５．５は、ヒトＰａＣａ組織において高く結合し、癌前のＰａｎＩＮ組織では中程度であり、正常膵臓組織では低い。悪性組織及び癌前組織におけるＺＤ２－Ｃｙ５．５の結合の分布は、不均一である。ＰａＣａ検体では組織不良のカテーテル構造に強い蛍光強度が認められたが、ＰａｎＩＮ組織では中間染色が認められ、染色は、管腔構造を持たない細胞クラスターに集中していた。異なるヒト膵臓組織におけるＺＤ２－Ｃｙ５．５結合の蛍光強度は、ＥＤＢ－ＦＮが悪性ＰａＣａ組織において高発現し、癌前ＰａｎＩＮ中で中程度、正常膵臓で低発現していることを示している。
図２０は、ヒトＰａＣａ、膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）及び正常膵組織標本におけるＺＤ２ペプチドとＥＤＢ－ＦＮとの結合を標的蛍光プローブＺＤ２－Ｃｙ５．５で示す。ＺＤ２－Ｃｙ５．５は、ヒトＰａＣａ組織において高く結合し、癌前のＰａｎＩＮ組織では中程度であり、正常膵臓組織では低い。悪性組織及び癌前組織におけるＺＤ２－Ｃｙ５．５の結合の分布は、不均一である。ＰａＣａ検体では組織不良のカテーテル構造に強い蛍光強度が認められたが、ＰａｎＩＮ組織では中間染色が認められ、染色は、管腔構造を持たない細胞クラスターに集中していた。異なるヒト膵臓組織におけるＺＤ２－Ｃｙ５．５結合の蛍光強度は、ＥＤＢ－ＦＮが悪性ＰａＣａ組織において高発現し、癌前ＰａｎＩＮ中で中程度、正常膵臓で低発現していることを示している。
【0227】
ＰａＣａマウスモデルにおけるＥＤＢ－ＦＮの発現
また、Ｃａｐａｎ－１、ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ及びＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－ＬｕｃヒトＰａＣａ細胞及びこれらの細胞由来の腫瘍異種移植片におけるＥＤＢ－ＦＮの発現も評価した。ＥＤＢ－ＦＮ特異的Ｇ４抗体によるタンパク質ブロットは、３つのＰａＣａ株すべてにおいて、２つの２２０＋ｋＤａバンドの発現がＥＤＢ－ＦＮタンパク質の大きさと一致していることを明らかにした（図２１Ａ）。ＰａＣａ異種移植片を運ぶマウスからの肝臓、膵臓及び腫瘍タンパク質抽出物のタンパク質ブロットは、３つのＰａＣａモデルすべてにおいて２２０＋ｋＤａバンドを示し、正常な肝臓及び膵臓組織では、腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮ発現の増加を示し、正常組織及び器官には発現しなかった（図２１Ｂ）。膵腫瘍異種移植片のヘマトキシリンとエオシン染色切片は、ＰａＣａの外観と一致する低分化癌大結節を明らかにした（図２１Ｃ）。すべての腫瘍は、細胞核に対する細胞質の比率が低い緻密な細胞を示した。Ｇ４抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体の免疫組織化学染色は、抗体がない場合には染色が認められなかった３つのＰａＣａモデルの全ての組織切片において強い染色を示した（図２１Ｃ）。高速凍結組織切片をＥＤＢ－ＦＮ特異的モノクローナル抗体ＢＣ－１又はＺＤ２－Ｃｙ５．５で染色した結果，ＢｘＰＣ３，Ｃａｐａｎ－１及びＰＡＮＣ－１組織におけるＥＤＢ－ＦＮの染色パターンが類似していた。染色は、正常膵臓及び筋肉組織に見出されず、ＥＤＢ－ＦＮが発現していないことを示した。ＺＤ２－Ｃｙ５．５結合は、抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体の存在下でブロックされる。その結果、ＥＤＢ－ＦＮは、ヒト膵臓癌細胞とそのマウス腫瘍異種移植片において過剰に発現し、正常組織では発現しなかった。
また、Ｃａｐａｎ－１、ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ及びＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－ＬｕｃヒトＰａＣａ細胞及びこれらの細胞由来の腫瘍異種移植片におけるＥＤＢ－ＦＮの発現も評価した。ＥＤＢ－ＦＮ特異的Ｇ４抗体によるタンパク質ブロットは、３つのＰａＣａ株すべてにおいて、２つの２２０＋ｋＤａバンドの発現がＥＤＢ－ＦＮタンパク質の大きさと一致していることを明らかにした（図２１Ａ）。ＰａＣａ異種移植片を運ぶマウスからの肝臓、膵臓及び腫瘍タンパク質抽出物のタンパク質ブロットは、３つのＰａＣａモデルすべてにおいて２２０＋ｋＤａバンドを示し、正常な肝臓及び膵臓組織では、腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮ発現の増加を示し、正常組織及び器官には発現しなかった（図２１Ｂ）。膵腫瘍異種移植片のヘマトキシリンとエオシン染色切片は、ＰａＣａの外観と一致する低分化癌大結節を明らかにした（図２１Ｃ）。すべての腫瘍は、細胞核に対する細胞質の比率が低い緻密な細胞を示した。Ｇ４抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体の免疫組織化学染色は、抗体がない場合には染色が認められなかった３つのＰａＣａモデルの全ての組織切片において強い染色を示した（図２１Ｃ）。高速凍結組織切片をＥＤＢ－ＦＮ特異的モノクローナル抗体ＢＣ－１又はＺＤ２－Ｃｙ５．５で染色した結果，ＢｘＰＣ３，Ｃａｐａｎ－１及びＰＡＮＣ－１組織におけるＥＤＢ－ＦＮの染色パターンが類似していた。染色は、正常膵臓及び筋肉組織に見出されず、ＥＤＢ－ＦＮが発現していないことを示した。ＺＤ２－Ｃｙ５．５結合は、抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体の存在下でブロックされる。その結果、ＥＤＢ－ＦＮは、ヒト膵臓癌細胞とそのマウス腫瘍異種移植片において過剰に発現し、正常組織では発現しなかった。
【0228】
膵臓癌側腹異種移植片のＭＲＭＩ
標的造影剤ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩのＰａＣａ検出における有効性は、まず皮下Ｃａｐａｎ－１側腹腫瘍異種移植片を運ぶマウスにおいて評価した。同じ用量（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ）の臨床試薬Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）を対照として用いた。Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）と比較して、ＭＴ２１８の注射後５分後、腫瘍周辺でより強い造影増強が認められた（図２２）。そして、ＭＴ２１８を注射したマウスでは、腫瘍コアのコントラストが徐々に高まった（図２２）。Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）を投与したマウスは、有意な腫瘍コア増強を示さなかった。同じマウスの異なる時点の比較画像から比較前画像を減算すると、ＭＴ２１８投与後の初期時点（比較後５～１５分）において、腫瘍周囲に強い初期増強が現れ、その後、後期時点（対照後２５～３５分）において、腫瘍全体に堅牢な腫瘍造影増強が出現した（図２２）。これに対し、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）を投与したマウスの影軽減像は、注射後の早期時点で適度な末梢造影増強を生じ、全時点で腫瘍内対比がほとんどなかった。結果は、ＭＴ２１８が効果的に腫瘍全体で堅牢なシグナル増強を生成し、効果的な分子イメージングとＭＲＭＩによるＰａＣａの検出に有効であることを示している。
標的造影剤ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩのＰａＣａ検出における有効性は、まず皮下Ｃａｐａｎ－１側腹腫瘍異種移植片を運ぶマウスにおいて評価した。同じ用量（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ）の臨床試薬Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）を対照として用いた。Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）と比較して、ＭＴ２１８の注射後５分後、腫瘍周辺でより強い造影増強が認められた（図２２）。そして、ＭＴ２１８を注射したマウスでは、腫瘍コアのコントラストが徐々に高まった（図２２）。Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）を投与したマウスは、有意な腫瘍コア増強を示さなかった。同じマウスの異なる時点の比較画像から比較前画像を減算すると、ＭＴ２１８投与後の初期時点（比較後５～１５分）において、腫瘍周囲に強い初期増強が現れ、その後、後期時点（対照後２５～３５分）において、腫瘍全体に堅牢な腫瘍造影増強が出現した（図２２）。これに対し、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）を投与したマウスの影軽減像は、注射後の早期時点で適度な末梢造影増強を生じ、全時点で腫瘍内対比がほとんどなかった。結果は、ＭＴ２１８が効果的に腫瘍全体で堅牢なシグナル増強を生成し、効果的な分子イメージングとＭＲＭＩによるＰａＣａの検出に有効であることを示している。
【0229】
膵内腫瘍異種移植片のＭＲＭＩ
膵臓内のヒトＰａＣａ腫瘍異種移植片を投与したマウスにおいて、ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩの有効性について更に検討した。バイオ発光イメージングは、腫瘍細胞を移植した３匹のマウスの左上腹部にルシフェラーゼ標識ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ腫瘍異種移植片の存在を確認した（図２３Ａ）。ＭＴ２１８投与１０分以内に、腫瘍マウスのＭＴ２１８ ＭＲＭＩは、強い造影増強を有する小さな病巣を明瞭に描写した（図２３Ｂ）。腫瘍造影増強はその後２０分で低下し、ＭＴ２１８注射後３０分後にバックグラウンドレベルに戻った。臨床薬Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、注射後１０分後に腫瘍に中等度の造影増強を生じ、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）注射後２０分間のシグナル増強を背景レベルまで低下させた（図２３Ｂ）。また、比較後の画像から比較前の画像を減算すると、Ｔ１強調ＭＲ画像では、注射後１０分間、標的造影剤による膵内腫瘍の強い増強と鮮明な描写が、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）による腫瘍内シグナル増強が少ないことが更に証明された（図２３Ｂ）。ＰａＣａのＭＲＭＩに対するＭＴ２１８の特異性を更に証明するために、膵臓内のＢｘＰＣ３異種移植片を運ぶマウスにおいて競合結合実験が行われ、そのうち５倍の遊離ＺＤ２ペプチド及びＭＴ２１８が過剰に投与された。過剰な遊離ペプチドの共注射は、ＭＴ２１８と腫瘍との結合を遮断することで、遊離ＺＤ２ペプチドを注射したＭＴ２１８の腫瘍マウスと比較して腫瘍画像における造影増強が有意な減少した。
膵臓内のヒトＰａＣａ腫瘍異種移植片を投与したマウスにおいて、ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩの有効性について更に検討した。バイオ発光イメージングは、腫瘍細胞を移植した３匹のマウスの左上腹部にルシフェラーゼ標識ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ腫瘍異種移植片の存在を確認した（図２３Ａ）。ＭＴ２１８投与１０分以内に、腫瘍マウスのＭＴ２１８ ＭＲＭＩは、強い造影増強を有する小さな病巣を明瞭に描写した（図２３Ｂ）。腫瘍造影増強はその後２０分で低下し、ＭＴ２１８注射後３０分後にバックグラウンドレベルに戻った。臨床薬Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、注射後１０分後に腫瘍に中等度の造影増強を生じ、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）注射後２０分間のシグナル増強を背景レベルまで低下させた（図２３Ｂ）。また、比較後の画像から比較前の画像を減算すると、Ｔ１強調ＭＲ画像では、注射後１０分間、標的造影剤による膵内腫瘍の強い増強と鮮明な描写が、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）による腫瘍内シグナル増強が少ないことが更に証明された（図２３Ｂ）。ＰａＣａのＭＲＭＩに対するＭＴ２１８の特異性を更に証明するために、膵臓内のＢｘＰＣ３異種移植片を運ぶマウスにおいて競合結合実験が行われ、そのうち５倍の遊離ＺＤ２ペプチド及びＭＴ２１８が過剰に投与された。過剰な遊離ペプチドの共注射は、ＭＴ２１８と腫瘍との結合を遮断することで、遊離ＺＤ２ペプチドを注射したＭＴ２１８の腫瘍マウスと比較して腫瘍画像における造影増強が有意な減少した。
【0230】
ＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－Ｌｕｃ細胞由来の別の膵臓内ＰａＣａモデルにおいて、ＭＴＭＩにおけるＭＴＦの改善が再生可能であるか否かを判定するために、ＭＴ２１８ ＭＲＭＩを試験した。ＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－Ｌｕｃ膵臓内の異種移植片を備えるマウスの生物発光像は、癌細胞が接種した左上腹部領域に大量のルシフェラーゼシグナルが存在することを示し、腫瘍の存在を示す（図２４Ａ）。腫瘍マウスのＭＴ２１８ ＭＲＭＩは、腫瘍組織に有意な造影増強を生じ、注射後１０分後に腫瘍を明瞭に描写した。対照的に、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、有意な腫瘍造影増強を示さず、腫瘍を明確に同定できなかった（図２４Ｂ）。比較後の画像から比較前の画像を減算した画像は、ＭＴ２１８の腫瘍における有意なシグナル増強を明らかにし、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）投与後にはほとんど変化が認められなかった（図２４Ｂ）。
【0231】
ＺＤ２ ＭＲＭＩの定量分析
ＭＴ２１８のＭＲＭＩ腫瘍シグナル増強と臨床薬の比較を分析した。肝臓のシグナル増強も分析され、正常組織におけるＭＴ２１８の潜在的な非特異的増強が同定された。ＭＴ２１８は、注射後１５分後にＣａｐａｎ－１側腹腫瘍異種移植片に４．８４倍のコントラスト－ノイズ比（ＣＮＲ）を発生し、少なくとも３５分間維持した（図２５Ａ）。臨床医薬Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、実験中に腫瘍内のＣＮＲを１．７７倍増加させ、ＭＴ２１８＞（ｐ＜０．０１）を有意に下回った。２種の造影剤は、すべての被験者の肝臓（図２５Ａ）、腎臓及び膵臓においてＣＮＲに有意差は、認められなかった（ｐ＞０．０５）。
ＭＴ２１８のＭＲＭＩ腫瘍シグナル増強と臨床薬の比較を分析した。肝臓のシグナル増強も分析され、正常組織におけるＭＴ２１８の潜在的な非特異的増強が同定された。ＭＴ２１８は、注射後１５分後にＣａｐａｎ－１側腹腫瘍異種移植片に４．８４倍のコントラスト－ノイズ比（ＣＮＲ）を発生し、少なくとも３５分間維持した（図２５Ａ）。臨床医薬Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、実験中に腫瘍内のＣＮＲを１．７７倍増加させ、ＭＴ２１８＞（ｐ＜０．０１）を有意に下回った。２種の造影剤は、すべての被験者の肝臓（図２５Ａ）、腎臓及び膵臓においてＣＮＲに有意差は、認められなかった（ｐ＞０．０５）。
【0232】
注射後１０分後、ＭＴ２１８は、ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ膵臓内腫瘍のＣＮＲを最大５．３倍に増加させ、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、１０分で約２．５倍の腫瘍ＣＮＲを産生し、ＭＴ２１８（ｐ＜０．０１）を有意に下回った（図２４Ｂ）。２種の薬剤の腫瘍ＣＮＲは、その後減衰し、ＭＴ２１８は、ＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－Ｌｕｃ膵臓内腫瘍異種移植片で約３．８５倍の腫瘍内ＣＮＲを産生し、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）は、２．３５倍の腫瘍内ＣＮＲを産生した。２種の造影剤は、すべての被験者の肝臓（図２５Ｂ、Ｃ）及び腎臓においてＣＮＲの差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。
【0233】
また、過剰の遊離のＺＤ２ペプチドをＭＴ２１８で共注入したことにより、ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ内膵島モデルでは、ＣＮＲが２．５倍で上昇し、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）と同様にＣＮＲが上昇した（図２５Ｂ）。また、５倍遊離ペプチドの存在下でのＭＴ２１８のＣＮＲの増加は、遊離ペプチドを含まないＭＴ２１８のＣＮＲ（約４．５倍、ｐ＜０．０５）よりも有意に低かった。遊離ＺＤ２ペプチドの共注射は、ＭＴ２１８の結合を阻害し、腫瘍ＣＮＲをＧｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）と同様の薬物非特異的蓄積レベルまで低下させた。結果は、ＭＴ２１８がＰａＣａ腫瘍と特異的に結合することを示している。
【0234】
議論
磁気共鳴分子イメージング（ＭＲＭＩ）の臨床応用は、ＭＲＩの高軟部組織コントラストと良好な空間分解能を組み合わせ、腫瘍内の分子変化をイメージングし、特徴付ける能力を備えているため、正確な癌イメージングに最適である。臨床ＭＲＭＩの主な課題は、標的造影剤を十分に組み合わせて検出可能な造影増強を生成する間質バリアを克服することである。膵臓癌（ＰａＣａ）は、高度に線維化しており、腫瘍の内部組織への造影剤の侵入を制限する密集したＥＣＭを有する。多くの分子イメージング剤は、巨大で到達が困難な細胞表面ターゲットと結合した。腫瘍ＥＣＭにおけるドメイン外Ｂフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）の腫瘍特異的発現をＭＲＭＩの標的として利用することにより、ＰａＣａのイメージングを大幅に改善できることを見出した。
磁気共鳴分子イメージング（ＭＲＭＩ）の臨床応用は、ＭＲＩの高軟部組織コントラストと良好な空間分解能を組み合わせ、腫瘍内の分子変化をイメージングし、特徴付ける能力を備えているため、正確な癌イメージングに最適である。臨床ＭＲＭＩの主な課題は、標的造影剤を十分に組み合わせて検出可能な造影増強を生成する間質バリアを克服することである。膵臓癌（ＰａＣａ）は、高度に線維化しており、腫瘍の内部組織への造影剤の侵入を制限する密集したＥＣＭを有する。多くの分子イメージング剤は、巨大で到達が困難な細胞表面ターゲットと結合した。腫瘍ＥＣＭにおけるドメイン外Ｂフィブロネクチン（ＥＤＢ－ＦＮ）の腫瘍特異的発現をＭＲＭＩの標的として利用することにより、ＰａＣａのイメージングを大幅に改善できることを見出した。
【0235】
また、ヒトＰａＣａ及び癌前組織におけるＥＤＢ－ＦＮの発現は、ＥＤＢ－ＦＮ特異的蛍光プローブＺＤ２－Ｃｙ５．５で検出され、ＭＴ２１８ ＭＲＭＩが初癌及び悪性腫瘍の特徴付けにも使用できることを示している。ＰａＣａ及び初癌におけるＥＤＢ－ＦＮの発現は、他の群の観察と一致している。Ｊａｉｌｋｈａｎｉら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１６，１４１８１（２０１９）。分子イメージング剤ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＭＴ２１８）を用いたＰａＣａマウスモデルにおけるＥＤＢ－ＦＮ ＭＲＭＩによるＰａＣａの検出の有効性を実証した。ＭＴ２１８は、ＥＴＢ－ＦＮをマイクロモル親和性で結合し、以前の報告と一致している。Ｈａｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８，１０３１－１０４０，（２０１７）。また、ＭＴ２１８は、Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）よりも緩和性が高い。ＭＴ２１８は、臨床薬Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）と比較して、Ｃａｐａｎ－１側腹（対照群２７３％ＣＮＲ、ｐ＜０．０５）、ＢｘＰＣ３－ＧＦＰ－Ｌｕｃ（対照群２１２％ＣＮＲ、ｐ＜０．０１）及びＰＡＮＣ－１－ＧＦＰ－Ｌｕｃ膵臓内（対照１６４％ＣＮＲ，ｐ＜０．０５）でＰａＣａマウスモデルでは、特異的腫瘍結合と高いＴ１緩和性により、画像コントラスト－ノイズ比（ＣＮＲ）が有意に大きかった。ＥＤＢ－ＦＮが豊富なＰａＣａとのＭＴ２１８の特異的結合は、膵内モデルにおける過剰な遊離ＺＤ２ペプチドによるＭＴ２１８結合の破壊によって低下する腫瘍ＣＮＲによって検証される。時間プロセスＭＲＭＩ画像は、ＭＴ２１８が腫瘍コアの奥深くでＥＤＢ－ＦＮと結合できることを示しており、これは非標的臨床造影剤Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）を用いたイメージング研究では観察されなかった。更に、ＭＴ２１８の小型（１４４２Ｄａ）、中結合親和性及び親水性は、バックグラウンドノイズを低く保ちながら、腫瘍コア内で拡散及び結合する遊走性に寄与する。ＭＴ２１８は、６．１３ｍｍ２の面積を持つ腫瘍結節をよりよく示すことができ、ＭＴ２１８がＰａＣａの正確な早期検出の可能性を有し、早期発見を改善し、タイムリーな治療を開始し、患者の生存率を向上させることができることを示している。これは、ＭＲＭＩ２８を使用して小さな転移を検出することができる他のＺＤ２標的イメージング剤の性能と一致している。これは、治療を開始し、時間内に治療の結果を改善するために不可欠である。１０ｍｍ未満のＰａＣａ腫瘍の検出と外科的除去は、ＰａＣａ患者の長期生存率と生活の質を大幅に改善することが報告されている。Ｔｓｕｎｏｄａら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏ－Ｂｉｌｉａｒｙ－Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ５，１２８－１３２，（１９９８）。
【0236】
癌におけるＥＤＢ－ＦＮの分子イメージングは、ＰＥＴ撮影用の放射性同位体で標識された抗体を用いて予め調べた。抗ＥＥＤＮ－ＦＮ抗体ＢＣ－１を１２５Ｉで標識し、Ｕ８７脳腫瘍及びＳＫＭｅｌ２８メラノーマ異種移植片を運ぶマウスで試験した。 Ｍａｒｉａｎｉら，Ｃａｎｃｅｒ ８０，２３７８－２３８４（１９９７）． 抗体はＥＤＢ－ＦＮに特異的であり、ＥＤＢ－ＦＮが豊富な腫瘍に結合することが見出されているが、その大きさのために循環中の長期滞留は、顕著なバックグラウンドノイズを生成し、特定の腫瘍イメージングの品質に影響を与える。近年、様々なタイプの腫瘍モデルにおけるＥＤＢ－ＦＮの分子イメージング用の小型ナノボディが開発されている。６４Ｃｕ標識ナノボディプローブ（６４Ｃｕ－ＮＪＢ２）は、ＰＥＴ／ＣＴ２６を用いたマウスモデルにおけるＰａＣａ及び癌前病変の特異的摂取及び効果的な検出を示した。また、ＺＤ２ペプチドは、ＥＤＢ－ＦＮ分子イメージングのためのＰＥＴプローブとして６８Ｇａで標識されている。ＺＤ２標的プローブは、ＰａＣａにおけるＥＤＢ－ＦＮの感度と特異的分子イメージングを提供する。Ｇａｏら，Ａｍ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ９，２１６－２２９（２０１９）。ＭＲＭＩは、ＰＥＴと比較して、治療計画に価値がある高解像度及び軟部組織対比で小さなＰａＣａを描くのに有利である。ＰＥＴ／ＭＲＩの臨床実装は、ＰａＣａの分子イメージングのためのＰＥＴプローブとＭＲＩ造影剤でＥＤＢ－ＦＮを標的とするユニークな方法を提供する。
【0237】
ＥＤＢ－ＦＮ ＭＲＭＩの他の方法も検討されている。グルカンの化学交換飽和転移（ＣＥＳＴ）に基づいて、ＭＲＩは、ＺＤ２ペプチドを用いてＰａＣａをイメージングする。Ｈａｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１４２５－１４３３（２０１９）。グルカン－ＺＤ２コンジュゲートは、ＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩが診断値を提供するという仮定をサポートするＰａＣａの側腹モデルで４５分以内に検出可能な腫瘍内シグナルを生成した。しかし、ＣＥＳＴは、臨床現場での信号対雑音の低さ、低感度、高用量など、トランス翻訳に関するいくつかの課題に直面している。現在までに、キセノン系造影剤、特に大環造影剤は、臨床癌ＭＲＩの安全かつ有効な造影剤であると考えられている。
【0238】
なお、ＰａＣａイメージングにおけるＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩの展望を示したが、本研究には限界がある。多数のヒトＰａＣａ集団におけるＥＤＢ－ＦＮ発現の包括的な研究は、ＰａＣａのバイオマーカーとしての使用を検証するために必要である。ヒトＰａＣａにおけるＥＤＢ－ＦＮの発現は、大きく異なる可能性がある。しかし、我々の結果と別のヒトＰａＣａにおけるＥＤＢ－ＦＮ発現の小規模研究との相関が高いことは、そうはいきないことを示唆している。ｎｕ／ｎｕマウスの免疫機能障害により、本研究所で用いたモデルはヒトＰａＣａの腫瘍微小環境を完全に再現できない可能性がある。また、ＭＴ２１８のさらなる研究は、現在ＰａＣａの免疫適応及び自発的モデルにおいて行われている。関連するリスク要因のさらなる疫学的調査とＭＲＭＩとのスクリーニングツールは、早期膵臓癌を検出するために必要とされる。ＭＲＭＩは、特にリスクの高い集団では、早期ＰａＣａの検出を改善することができるが、一般集団のための理想的なスクリーニングツールではない。ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）によるＭＲＭＩの臨床転換は、早期ＰａＣａ ＭＲＭＩ検査の恩恵を受ける可能性のある高リスク患者を特定する一般的な集団スクリーニングツールの迅速な開発に役立つことを確信したものである。
【0239】
要するには、本研究では、ヒトＰａｎＩＮ，ＰａＣａ標本及びＰａＣａマウスモデルにおけるＥＤＢ－ＦＮの過剰発現を検討し、小分子標的ＭＲＩ造影剤ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮのＭＲＭＩの有効性を実証した。ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは良好な造影増強を生み出し，小さなＰａＣａ腫瘍を鮮明に描いた。肝組織において最小の非特異的シグナル増強が観察された。ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは、膵臓癌前病変の監視と、小膵臓癌の正確な検出と描写の可能性を有する。ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩの臨床トランス翻訳は、早期膵臓癌の検出のための高度に特異的なイメージング技術の満たされていない臨床ニーズに対処し、高リスク集団のスクリーニング、診断、治療決定、治療後のモニタリングなど、膵臓癌の臨床管理のあらゆる側面に影響を与えることが期待されている。
【0240】
実施例５：ＭＴ２１８を用いたＥＤＢ－ＦＮの造影増強ＭＲＭＩの、前立腺癌の非侵襲的なモニタリング及びアクティブサーベイランスに対する促進
ＥＤＢ－ＦＮは、ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩの分子マーカーとしての潜在的な作用は、浸潤性の程度が異なる複数の前立腺癌モデルにおいて同定された。
ＥＤＢ－ＦＮは、ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩの分子マーカーとしての潜在的な作用は、浸潤性の程度が異なる複数の前立腺癌モデルにおいて同定された。
【0241】
低リスク、低ＥＤＢ－ＦＮ発現前立腺癌ＬＮＣＡＰ細胞株を改変して、より低浸潤の前立腺癌細胞を生成した。例えば、ＬＮＣＡＰ－ＣＸＣＲ２細胞は、安定して炎症を過剰発現させるように設計されており、初抗腫瘍化されたＩＬ８受容体ＣＸＣＲ２を安定して過剰発現させることができた。Ｃ４－２細胞は、カストマウスのＬＮＣＡＰ細胞皮下組織から分離した。そして、２０μＭエンチルアミン（Ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ，アンドロゲン受容体アンタゴニスト）の獲得耐性によりＣ４－２－ＤＲ細胞を作製した。
【0242】
標準ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイでは、ＬＮＣａＰ－ＣＸＣＲ２、Ｃ４－２及びＣ４－２－ＤＲ細胞は、低リスクの不活性ＬＮＣａＰ細胞と比較して、マトリゲルでコーティングされた小室への浸潤の増加を示した（図２６Ａ）及びＥＭＴマーカーＮ－カドリンの増加（図２６Ｂ）。３Ｄ培養では，ＬＮＣａＰ球体と比較して浸潤性前立腺細胞が増殖性腫瘍スフェロイドを示し、ＥＤＢ－ＦＮ分泌が有意に増加し、ＺＤ２－Ｃｙ５．５染色によってこれを示した（図２６Ｃ）。これらの結果は、ＥＤＢ－ＦＮが浸潤性腫瘍として発症する低リスク腫瘍において強く上昇することを示している。
【0243】
胸腺のないｎｕ／ｎｕマウスに４種類の前立腺癌細胞を皮下注射して異種移植モデルを構築し、０．０４ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇのＭＴ２１８を用いてＭＲＭＩ試験を行った。腫瘍の差分造影増強ＭＲＭＩは、ＭＴ２１８が低レベルのＬＮＣａＰ腫瘍と比較して浸潤的なＬＮＣａＰ－ＣＸＣＲ２、Ｃ４－２及びＣ４－２－ＤＲ腫瘍でより強いシグナル増強を引き起こすことを示している（図２７Ａ）。これは、注射後２０分後に、ＬＮＣａＰ－ＣＸＣＲ２及びＣ４－２腫瘍のＣＮＲがほぼ３倍増加し、Ｃ４－２－ＤＲ腫瘍が６倍増加し、低レベルＬＮＣａＰ腫瘍のＣＮＣ増加は、無視できる（図２７Ｂ）。
【0244】
興味深いところ、別のモデルＰＣ３とその薬剤耐性対応ＰＣ３－ＤＲは、異なる傾向を示している。ＰＣ３細胞と比較して、２００ｎＭパクリタキセルの獲得耐性によりＰＣ３細胞から産生されるＰＣ３－ＤＲ細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌによってコーティングされた小室への浸潤の減少を示し（図２８Ａ）、及びＺＤ２－Ｃｙ５．５染色による低強度で観察された３Ｄ培養におけるＥＤＢ－ＦＮ分泌の減少を示した（図２８Ｂ）。
【0245】
これらの結果もＭＴ２１８のＭＲＭＩで再現した。図２８Ｃ－Ｄに示すように、ＰＣ３腫瘍は強いシグナル増強を示し、ＣＮＲは造影前より５倍高かったが、ＰＣ３－ＤＲ腫瘍は、造影前の１．６倍に比べて中等度増強のシグナル増強とＣＮＲ（ｐ＝０．０７）のみを示した。重要なことに、浸潤性ＰＣ３腫瘍は、浸潤性の小さいＰＣ３－ＤＲ腫瘍よりも有意に高いＣＮＲを示し（図２８Ｄ）、ＥＤＢ－ＦＮの上昇は、浸潤性薬剤耐性前立腺癌にのみ関連していることを示している。
【0246】
また、前立腺癌の能動的な監視についても、２ヶ月間にわたって予備研究を行った。ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは、２１日目及び６０日目に行われ、浸潤的Ｃ４－２腫瘍の進行をモニタリングした。０．０４ｍｍｏｌ Ｇｄ／ｋｇ ＭＴ２１８の注射の２０分前と後に、２匹のマウスをイメージングし、Ｔ１強調軸位断像を得た。図２９に示すように、第２月におけるＣ４－２腫瘍の進行は、シグナル増強の増加を伴い（図２９Ａ－Ｂ）、２１日目から６０日目までのＣＮＲの着実な増加を反映している（図２９Ｃ－Ｄ）。
【0247】
実施例６：ＭＲ分子イメージングで非侵襲的に測定した、標的ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子治療による腫瘍微小環境の調節及び三陰性乳癌の治療への有効性
本実施例では、標的とするｍｉＲ－２００ｃ療法に対する腫瘍反応の非侵襲的な評価のためのＭＲＭＩの有効性と、マウスＴＮＢＣモデルにおけるＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の治療効果の検討について説明する。標的ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子は、ＭＩＲ－２００ｃ二本鎖体と多官能アミノ脂質担体ＥＣＯとＰＥＧスペーサーを有する環状ＲＧＤペプチドとの自己組織化により開発され、ＴＮＢＣ細胞におけるｍｉＲ－２００ｃの特異的送達及びアセンションに用いられる。本発明者らは、ＥＣＯ、すなわち（１－アミノエチル）イミノビス［Ｎ－オレイルシステイン－１－アミノエチル）プロピルアミド］を先に用いて行った研究において、治療ｓｉＲＮＡの生体内系送達が優れた効率を有し、ＴＮＢＣで治療された種々の発癌性ｍＲＮＡ及び長い非コードＲＮＡを効果的に調節することを示した。Ｐａｒｖａｎｉら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３０，９０７（２０１９）。ｍｉＲ－２００ｃは、フィブロネクチン発現を直接調節するため、まずＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ治療後のＴＮＢＣ癌細胞における癌胚サブタイプＥＤＢ－ＦＮ及びＺＥＢ１、ＢＭＩ１及びＦＮ１を含む他の下流遺伝子標的の下方修正を検討した。ＴＮＢＣ癌細胞のスフェロイド形成、浸潤性及び遊走に対するＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃのインビトロ評価の影響。２人の原住民ＴＮＢＣマウスモデルにおいて、ＭＴ２１８のＭＲＭＩのＥＤＢ－ＦＮの非侵襲的なイメージングを用いて、ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子系投与の治療効果と腫瘍反応を研究し、死後の免疫組織化学によって更に検証した。
本実施例では、標的とするｍｉＲ－２００ｃ療法に対する腫瘍反応の非侵襲的な評価のためのＭＲＭＩの有効性と、マウスＴＮＢＣモデルにおけるＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の治療効果の検討について説明する。標的ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子は、ＭＩＲ－２００ｃ二本鎖体と多官能アミノ脂質担体ＥＣＯとＰＥＧスペーサーを有する環状ＲＧＤペプチドとの自己組織化により開発され、ＴＮＢＣ細胞におけるｍｉＲ－２００ｃの特異的送達及びアセンションに用いられる。本発明者らは、ＥＣＯ、すなわち（１－アミノエチル）イミノビス［Ｎ－オレイルシステイン－１－アミノエチル）プロピルアミド］を先に用いて行った研究において、治療ｓｉＲＮＡの生体内系送達が優れた効率を有し、ＴＮＢＣで治療された種々の発癌性ｍＲＮＡ及び長い非コードＲＮＡを効果的に調節することを示した。Ｐａｒｖａｎｉら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３０，９０７（２０１９）。ｍｉＲ－２００ｃは、フィブロネクチン発現を直接調節するため、まずＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ治療後のＴＮＢＣ癌細胞における癌胚サブタイプＥＤＢ－ＦＮ及びＺＥＢ１、ＢＭＩ１及びＦＮ１を含む他の下流遺伝子標的の下方修正を検討した。ＴＮＢＣ癌細胞のスフェロイド形成、浸潤性及び遊走に対するＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃのインビトロ評価の影響。２人の原住民ＴＮＢＣマウスモデルにおいて、ＭＴ２１８のＭＲＭＩのＥＤＢ－ＦＮの非侵襲的なイメージングを用いて、ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子系投与の治療効果と腫瘍反応を研究し、死後の免疫組織化学によって更に検証した。
【0248】
結果
標的ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子
上述したように、環状ＲＧＤペプチド標的ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子は、未修飾のｍｉＲ－２００ｃ二本鎖体（Ｎ／Ｐ＝８）との自己組織化により調製される。Ｐａｒｖａｎｉら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３０，９０７（２０１９）．ｍｉＲ－２００ｃ二本鎖体を用いたのは、天然一本鎖ｍｉＲ－２００ｃ配列の安定性が悪く、ＥＣＯと安定なナノ粒子を形成することができないからである。非特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖のＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子を対照として同様に調製した。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子は、それぞれ１７４．０±２５．４ｎｍ及び１４９．６±５．４ｎｍの流体力学的直径を有し、動的光散乱によって測定される場合、ζ電位は、それぞれ２５．３±４．４ｍＶ及び１７．７±２．４ｍＶであった（図３０Ａ）。標準的なゲル遅延アッセイは、２つのナノ粒子の有効なＲＮＡエンベロープと無視可能な遊離ＲＮＡバンドを示し、高いＲＮＡローディング効率とエンベロープを示した（図３０Ｂ）。
標的ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子
上述したように、環状ＲＧＤペプチド標的ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子は、未修飾のｍｉＲ－２００ｃ二本鎖体（Ｎ／Ｐ＝８）との自己組織化により調製される。Ｐａｒｖａｎｉら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３０，９０７（２０１９）．ｍｉＲ－２００ｃ二本鎖体を用いたのは、天然一本鎖ｍｉＲ－２００ｃ配列の安定性が悪く、ＥＣＯと安定なナノ粒子を形成することができないからである。非特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖のＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子を対照として同様に調製した。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子は、それぞれ１７４．０±２５．４ｎｍ及び１４９．６±５．４ｎｍの流体力学的直径を有し、動的光散乱によって測定される場合、ζ電位は、それぞれ２５．３±４．４ｍＶ及び１７．７±２．４ｍＶであった（図３０Ａ）。標準的なゲル遅延アッセイは、２つのナノ粒子の有効なＲＮＡエンベロープと無視可能な遊離ＲＮＡバンドを示し、高いＲＮＡローディング効率とエンベロープを示した（図３０Ｂ）。
【0249】
ｍｉＲ－２００ｃの細胞内構造は、侵入性間プライミングｍｉＲ－２００ｃ－低ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ細胞にＣｙ５．５で標識されたｍｉＲ－２００ｃ二本鎖を有するＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－Ｃｙ５．５ナノ粒子を用いて評価した。図３０Ｃに示すように、共焦点蛍光顕微鏡は、トランスフェクション後４時間以内の細胞核周りのＣｙ５．５蛍光強度が強いことを示し、ナノ粒子の細胞スラリー送達効率が高いことを示している。フローサイトメトリーは、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－Ｃｙ５．５ｎｍ粒子トランスフェクションの効率を更に確認し、トランスフェクション後４時間の蛍光強度を未トランスフェクション細胞と比較して３６０倍に増加させた（図３０Ｄ）。これらの結果から、標的のＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子は、ＴＮＢＣ細胞におけるｍｉＲ－２００ｃの効率的な細胞内送達を効果的に抑制できることが示唆された。
【0250】
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子は、ＴＮＢＣ細胞における延長されたｍｉＲ－２００ｃアップレギュレーションと下流遺伝子標的の効果的な調節に寄与する。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＳ７８ＴヒトＴＮＢＣ細胞において、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の細胞内過剰発現に対する有効性を調べた。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子媒介ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるｍｉＲ－２００ｃは、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定したようなトランスフェクション後最大１４日間の延長アディションで、図３１Ａに示す。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子は、トランスフェクション後最初の２４時間以内にｍｉＲ－２００ｃ発現を１０００倍近く増加させ、７日目に８０倍に大幅に減少する前に４日間高いレベルを維持した。１４日目まで、ｍｉＲ－２００ｃの３０倍の大幅な増加が観察された。ｍｉＲ－２００ｃは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＺＥＢ１のｍＲＮＡ発現の有意な低下を誘導し、ＺＥＢ１は、ＥＭＴマーカーであり、ｍｉＲ－２００ｃの直接標的である。図３１Ｂに示すように、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子が１週間までトランスフェクションされた後、ＺＢＩ１が２０～４０％下方修正された。同様に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ細胞をＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子で処理し、トランスフェクション後４８時間のそれぞれの対照ＳＩＮＳ対応物と比較して、ｍｉＲ－２００ｃを５０倍及び１００倍に引き上げた。図３１Ｃ、Ｉに示す。ｍｉＲ－２００ｃ発現の違いは、トランスフェクション中の細胞数及び増殖速度に起因することができる。したがって、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔでは、ＺＥＢ１、ＢＭＩ１及びサバイビンを含む直接下流標的は、それぞれｍＲＮＡレベルで発現が有意に低下し、ＺＥＢ１の場合は５７％及び４０％（図３１Ｄ、Ｊ）、ＢＭＩ１の場合は１５％及び３５％（図３１Ｅ、Ｋ）及びサバイビンのために２５％及び６４％（図３１Ｆ、Ｌ）。タンパク質ブロットにより、これらの遺伝子標的の有意な低下もタンパク質レベルで観察された（図３１Ｏ、Ｐ）。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＳ７８ＴヒトＴＮＢＣ細胞において、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の細胞内過剰発現に対する有効性を調べた。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子媒介ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるｍｉＲ－２００ｃは、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定したようなトランスフェクション後最大１４日間の延長アディションで、図３１Ａに示す。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子は、トランスフェクション後最初の２４時間以内にｍｉＲ－２００ｃ発現を１０００倍近く増加させ、７日目に８０倍に大幅に減少する前に４日間高いレベルを維持した。１４日目まで、ｍｉＲ－２００ｃの３０倍の大幅な増加が観察された。ｍｉＲ－２００ｃは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＺＥＢ１のｍＲＮＡ発現の有意な低下を誘導し、ＺＥＢ１は、ＥＭＴマーカーであり、ｍｉＲ－２００ｃの直接標的である。図３１Ｂに示すように、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子が１週間までトランスフェクションされた後、ＺＢＩ１が２０～４０％下方修正された。同様に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ細胞をＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子で処理し、トランスフェクション後４８時間のそれぞれの対照ＳＩＮＳ対応物と比較して、ｍｉＲ－２００ｃを５０倍及び１００倍に引き上げた。図３１Ｃ、Ｉに示す。ｍｉＲ－２００ｃ発現の違いは、トランスフェクション中の細胞数及び増殖速度に起因することができる。したがって、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔでは、ＺＥＢ１、ＢＭＩ１及びサバイビンを含む直接下流標的は、それぞれｍＲＮＡレベルで発現が有意に低下し、ＺＥＢ１の場合は５７％及び４０％（図３１Ｄ、Ｊ）、ＢＭＩ１の場合は１５％及び３５％（図３１Ｅ、Ｋ）及びサバイビンのために２５％及び６４％（図３１Ｆ、Ｌ）。タンパク質ブロットにより、これらの遺伝子標的の有意な低下もタンパク質レベルで観察された（図３１Ｏ、Ｐ）。
【0251】
次に、細胞外マトリックスタンパク質フィブロネクチン（ＦＮ１）発現に対するＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理の影響について検討し、ＥＭＴにも関与するフィブロネクチンは、ｍｉＲ－２００ｃの３’－ＵＴＲ結合による遺伝子発現抑制の直接標的である。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理により、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ細胞におけるＦＮ１ ｍＲＮＡレベルが約２０％低下した（図３１Ｇ、Ｍ）。また、ＭＩＲ－２００ｃの腫瘍反応を治療するための非侵襲的なイメージングマーカーとしてＥＤＢ－ＦＮを使用する可能性を評価するために、ＦＮ１癌胚同種ＥＤＢ－ＦＮ発現に対するｍｉＲ－２００ｃの増加の影響も検討した。２種の細胞株は、強い内因性ＥＤＢ－ＦＮ発現を示したが、Ｈｓ５７８Ｔ細胞ではＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞よりもはるかに高かった（図３１Ｏ、Ｐ）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ細胞においてそれぞれＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡレベルが約８０％及び４０％低下することが観察された（図３１Ｈ、Ｎ）、タンパク質ブロットを介して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃと比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ２００ｃ処理後のタンパク質発現低下が確認された（図３１Ｏ、Ｐ）、ＥＤＢ－ＦＮは、ｍｉＲ－２００ｃの下流標的であることを示している。要約すると、これらの結果は、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃの強力で拡張された細胞内送達ｍｉＲ－２００ｃがＴＮＢＣ細胞におけるｍｉＲ－２００ｃの複数の下流標的遺伝子を効果的に調節できることを示している。
【0252】
ＲＧＢＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子は、ＴＮＢＣ細胞の浸潤及び３Ｄ成長を抑制する。
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃを介したｍｉＲ－２００ｃのアディショナーションによるＴＮＢＣ細胞浸潤性の影響の抑制は、遊走、浸潤及び腫瘍スフェロイド形成の標準機能アッセイを用いて決定される。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ細胞をＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃでトランスフェクションすると、２つの細胞株の遊走が減少した（図３２Ａ）。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで２４時間処理すると、マトリゲルで被覆された多孔質膜を介して侵入する能力が著しく低下し、図３２Ｂは、侵入した細胞が結晶性紫で紫色に染まる。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳコントロールと比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃは、３Ｄマトリゲル培養におけるＴＮＢＣ細胞が腫瘍スフェロイドを形成する傾向を有意に低下させた（図３２Ｃ）。これらの結果は、ＴＮＢＣ細胞の遊走、浸潤及び３Ｄスフェロイド形成を抑制するためにＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理を使用することを示している。
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃを介したｍｉＲ－２００ｃのアディショナーションによるＴＮＢＣ細胞浸潤性の影響の抑制は、遊走、浸潤及び腫瘍スフェロイド形成の標準機能アッセイを用いて決定される。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ細胞をＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃでトランスフェクションすると、２つの細胞株の遊走が減少した（図３２Ａ）。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで２４時間処理すると、マトリゲルで被覆された多孔質膜を介して侵入する能力が著しく低下し、図３２Ｂは、侵入した細胞が結晶性紫で紫色に染まる。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳコントロールと比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃは、３Ｄマトリゲル培養におけるＴＮＢＣ細胞が腫瘍スフェロイドを形成する傾向を有意に低下させた（図３２Ｃ）。これらの結果は、ＴＮＢＣ細胞の遊走、浸潤及び３Ｄスフェロイド形成を抑制するためにＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理を使用することを示している。
【0253】
ＲＧＤ－ＰＥＧ－Ｅｃｏ／ｍｉＲ－２００ｃは、インビボでのＴＮＢＣ増殖を抑制する。
ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の生体内治療におけるＴＮＢＣの効力は、インプレースＧＦＰルシフェラーゼ標識ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ異種移植片を運ぶ胸腺裸マウスで評価した。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ（Ｎ／Ｐ＝８）ナノ粒子を５％ショ糖水溶液に水溶液中で配合し、１．０ｍｇ／ｋｇ ＲＮＡの線量で６週間以内に静脈内投与した（図３３Ａ）。腫瘍の成長は、治療の前後に毎週キャリパー測定と全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）及びＭＲＭＩによってモニタリングされた。両方の腫瘍モデルにおいて、ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃによる治療は腫瘍の進行の有意な阻害をもたらす。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ処理マウスは、第６週目に処理前（第１週）と比較して、生体発光強度の有意な増加を示し、対照群における腫瘍の急速な成長を示した。これに対し、ｍｉＲ－２００ｃで処理した腫瘍は、第６週におけるシグナル強度の有意な増加が対照群より有意に低いことを示した（図３３Ｂ－Ｅ）。ＧＤＡ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍は、腫瘍の進行を抑制し、第１週から第６週にかけて腫瘍体積は有意に増加しなかった（７６．１±１５．２～１１１．４±２２．１ｍｍ３，ｐ＞０．０５）が、対照処理された腫瘍体積は３倍近く増加した（５７．７±３２．０～１７２．２±１７．８ｍｍ３，ｐ＜０．００５）、図３３Ｆ。Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍の場合、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理は、５１．４８±３．３７から１０．５４±５．４５ｍｍ３（ｐ＜０．００５）まで、腫瘍体積の大幅な減少を示した。 ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ処理Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍の腫瘍体積が２．２倍（４９．５±４．７～１１１．１±１１．３ｍｍ３、ｐ＜０．００５）、図３３Ｇと一方、週次で約７９％減少した。しかし、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで治療されたマウスは、治療や腫瘍の負担とは関係のない未知の症例で死亡した。結果は、動物モデル媒介における腫瘍標的ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子系によるｍｉＲ－２００ｃの送達がＴＮＢＣの効果的な治療につながる結果であることを示している。
ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の生体内治療におけるＴＮＢＣの効力は、インプレースＧＦＰルシフェラーゼ標識ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ異種移植片を運ぶ胸腺裸マウスで評価した。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ（Ｎ／Ｐ＝８）ナノ粒子を５％ショ糖水溶液に水溶液中で配合し、１．０ｍｇ／ｋｇ ＲＮＡの線量で６週間以内に静脈内投与した（図３３Ａ）。腫瘍の成長は、治療の前後に毎週キャリパー測定と全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）及びＭＲＭＩによってモニタリングされた。両方の腫瘍モデルにおいて、ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃによる治療は腫瘍の進行の有意な阻害をもたらす。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ処理マウスは、第６週目に処理前（第１週）と比較して、生体発光強度の有意な増加を示し、対照群における腫瘍の急速な成長を示した。これに対し、ｍｉＲ－２００ｃで処理した腫瘍は、第６週におけるシグナル強度の有意な増加が対照群より有意に低いことを示した（図３３Ｂ－Ｅ）。ＧＤＡ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍は、腫瘍の進行を抑制し、第１週から第６週にかけて腫瘍体積は有意に増加しなかった（７６．１±１５．２～１１１．４±２２．１ｍｍ３，ｐ＞０．０５）が、対照処理された腫瘍体積は３倍近く増加した（５７．７±３２．０～１７２．２±１７．８ｍｍ３，ｐ＜０．００５）、図３３Ｆ。Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍の場合、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理は、５１．４８±３．３７から１０．５４±５．４５ｍｍ３（ｐ＜０．００５）まで、腫瘍体積の大幅な減少を示した。 ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ処理Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍の腫瘍体積が２．２倍（４９．５±４．７～１１１．１±１１．３ｍｍ３、ｐ＜０．００５）、図３３Ｇと一方、週次で約７９％減少した。しかし、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで治療されたマウスは、治療や腫瘍の負担とは関係のない未知の症例で死亡した。結果は、動物モデル媒介における腫瘍標的ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子系によるｍｉＲ－２００ｃの送達がＴＮＢＣの効果的な治療につながる結果であることを示している。
【0254】
ＭＲＭＩにより、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで治療した後にＴＭＥにおけるＥＤＢ－ＦＮ発現が変化したことが示される。
ｍｉＲ－２００ｃの上昇は、インビトロＴＮＢＣ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現を著しく低下させ、インビボ腫瘍の増殖を抑制することを考慮すると、ＭＴ２１８の高解像度ＭＲＭＩを用いて、ＥＤＢ－ＦＮ発現に基づくＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理による腫瘍への反応を評価した。図３４は、ＲＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子で処理した前後のＴＮＢＣ腫瘍のＴ１強調軸位断ＭＲ像を示す。比較前腫瘍画像と比較して、ＭＴ２１８の用量が０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＭＴ２１８を注射したの最初の３０分間で、すべての前処理ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍において強いシグナル増強が観察され、ＥＤＢ－ＦＮが２種の腫瘍モデルのＥＣＭにおいて高い発現を示し、ＭＴ２１８は、細胞外造影剤であるため。処理６週間後、ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと対照したＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍の比較後、ＭＲ画像に強いシグナル増強が残った。ＭＴ２１８のＭＲＭＩを用いて対照群の２種の腫瘍異種移植片の顕著な成長を明瞭に示した。これに対し、前処理腫瘍と対照処理腫瘍と比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理した２つの腫瘍モデルの比較後のＭＲ画像では有意なシグナル増強は認められず、ｍｉＲ－２００ｃ処理によるＴＮＢＣ腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮの有意な減少を示した。図３４の観察結果と同様に、ＭＲＭＩは、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理した後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の増殖抑制とＨｓ５７８Ｔ腫瘍の退治を、それぞれの対照で処理した腫瘍と比較して明らかにした。これらの結果から、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理により、腫瘍ＥＣＭでは、ＥＤＢ－ＦＮ発現が低減され、ＭＴＢＣ腫瘍のＴＭＥは、非侵襲的なＭＲＭＩで示されるように、ＭＴ２１８で変更されていることが示された。
ｍｉＲ－２００ｃの上昇は、インビトロＴＮＢＣ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現を著しく低下させ、インビボ腫瘍の増殖を抑制することを考慮すると、ＭＴ２１８の高解像度ＭＲＭＩを用いて、ＥＤＢ－ＦＮ発現に基づくＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理による腫瘍への反応を評価した。図３４は、ＲＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子で処理した前後のＴＮＢＣ腫瘍のＴ１強調軸位断ＭＲ像を示す。比較前腫瘍画像と比較して、ＭＴ２１８の用量が０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＭＴ２１８を注射したの最初の３０分間で、すべての前処理ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍において強いシグナル増強が観察され、ＥＤＢ－ＦＮが２種の腫瘍モデルのＥＣＭにおいて高い発現を示し、ＭＴ２１８は、細胞外造影剤であるため。処理６週間後、ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと対照したＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍の比較後、ＭＲ画像に強いシグナル増強が残った。ＭＴ２１８のＭＲＭＩを用いて対照群の２種の腫瘍異種移植片の顕著な成長を明瞭に示した。これに対し、前処理腫瘍と対照処理腫瘍と比較して、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理した２つの腫瘍モデルの比較後のＭＲ画像では有意なシグナル増強は認められず、ｍｉＲ－２００ｃ処理によるＴＮＢＣ腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮの有意な減少を示した。図３４の観察結果と同様に、ＭＲＭＩは、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理した後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の増殖抑制とＨｓ５７８Ｔ腫瘍の退治を、それぞれの対照で処理した腫瘍と比較して明らかにした。これらの結果から、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理により、腫瘍ＥＣＭでは、ＥＤＢ－ＦＮ発現が低減され、ＭＴＢＣ腫瘍のＴＭＥは、非侵襲的なＭＲＭＩで示されるように、ＭＴ２１８で変更されていることが示された。
【0255】
腫瘍のＭＲ画像におけるコントラスト対ノイズ比（ＣＮＲ）を定量分析したところ、ＭＴ２１８の静脈注射後のナノ粒子（ベースライン）の２種両方のナノ粒子で処理する前（ベースライン）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍におけるＣＮＲは高く、ＥＤＢ－ＦＮ発現が高いことを示している、図３４Ａ。Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍の対比後のＣＮＲはＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍よりも有意に高く、前者のＥＤＢ－ＦＮは細胞内のＥＤＢ－ＦＮのタンパク質ブロットと一致するより高い発現を示した（図３１Ｏ、Ｐ）。ＧＳＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理すると、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍におけるＣＮＲが有意に低下し、ＥＤＢ－ＦＮ発現が低下し、ＧＳＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳで処理された腫瘍は、同じ群のマウスの前処理腫瘍と同じ高ＣＮＲを有することが示された。ｍｉＲ－２００ｃで処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍の対比後ＣＮＲは、対照前背景レベルより有意に増加せず、処理されたＨｓ５７８Ｔ腫瘍のＣＮＲは、背景レベルよりやや高かった（図３４Ｂ）。この観察結果は、ｍｉＲ－２００ｃ処理後、Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍中のＥＤＢ－ＦＮ残基がＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍よりも高く、ｍｉＲ－２００ｃで処理した細胞におけるＥＤＢ－ＦＮのタンパク質ブロット結果と一致することを示している（図３１Ｏ、Ｐ）。要約すると、これらの結果から、ＭＴ２１８のＭＲＭＩによるＥＤＢ－ＦＮ発現は、ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子治療の腫瘍反応を非侵襲的かつ正確に可視化し、ｍｉＲ－２００ｃ治療の有効性を効果的に評価できることが示唆された。
【0256】
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ治療法により、ＴＮＢＣ腫瘍におけるｍｉＲ－２００ｃレベルが向上され、下流ターゲット遺伝子が抑制される。
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の全身投与は、外科的に切除された原発腫瘍のｑＲＴ－ＰＣＲ分析に示されるように、ＴＮＢＣ腫瘍におけるｍｉＲ－２００ｃの強い上昇をもたらす。ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳで処理した腫瘍と比較して、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍のｍｉＲ－２００ｃレベルは、それぞれ約７．６倍及び３．４倍に増加した、図３５Ａ、Ｄである。重要なことに、このｍｉＲ－２００ｃの上方修正は、ＺＢ１及びＥＤＢ－ＦＮをｍＲＮＡレベルで有意に低下させ、図３５Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ。免疫組織化学は、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃによって処理された腫瘍におけるＥＢＦ－ＦＮのダウングレードも確認した。ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍の組織切片には、抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体染色などの強いＥＤＢ－ＦＮ染色が観察されたが、ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理した腫瘍は、ＥＤＢ－ＦＮ染色の有意な減少を示した（図３５Ｇ）。要約すると、これらの結果は、ＴＮＢＣ腫瘍をＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃシステムで処理することで、ｍｉＲ－２００ｃ発現を効果的に増加させ、下流発癌遺伝子ＺＥＢ１及びＥＤＢ－ＦＮを体内でダウングレードできることを示している。動物モデル腫瘍において、ｍｉＲ－２００ｃ及びその関連下流遺伝子レベルの変化は、イントロ実験で得られたデータと一致し、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理における腫瘍反応を強く確認した。
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の全身投与は、外科的に切除された原発腫瘍のｑＲＴ－ＰＣＲ分析に示されるように、ＴＮＢＣ腫瘍におけるｍｉＲ－２００ｃの強い上昇をもたらす。ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳで処理した腫瘍と比較して、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍のｍｉＲ－２００ｃレベルは、それぞれ約７．６倍及び３．４倍に増加した、図３５Ａ、Ｄである。重要なことに、このｍｉＲ－２００ｃの上方修正は、ＺＢ１及びＥＤＢ－ＦＮをｍＲＮＡレベルで有意に低下させ、図３５Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ。免疫組織化学は、ＧＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃによって処理された腫瘍におけるＥＢＦ－ＦＮのダウングレードも確認した。ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳ処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍の組織切片には、抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体染色などの強いＥＤＢ－ＦＮ染色が観察されたが、ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理した腫瘍は、ＥＤＢ－ＦＮ染色の有意な減少を示した（図３５Ｇ）。要約すると、これらの結果は、ＴＮＢＣ腫瘍をＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃシステムで処理することで、ｍｉＲ－２００ｃ発現を効果的に増加させ、下流発癌遺伝子ＺＥＢ１及びＥＤＢ－ＦＮを体内でダウングレードできることを示している。動物モデル腫瘍において、ｍｉＲ－２００ｃ及びその関連下流遺伝子レベルの変化は、イントロ実験で得られたデータと一致し、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理における腫瘍反応を強く確認した。
【0257】
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃは、マウスにおける顕著な毒性のある副作用を引き起こさない。
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ和ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子の繰り返し全身投与の安全性は、治療中のマウスの体重をモニターして評価した。また、ナノ粒子の繰り返し注入の６週間の間、いずれのマウスキューにおいても体重の有意な変化は認められなかった、図３６Ａ。ナノ粒子除去に関与する肝臓、膵臓及び腎臓のＨ＆Ｅ染色組織病理学的分析は、２種のナノ粒子で処理されたマウスにおいて、組織学的に正常であり、顕著な組織損傷がないことを示した。これらの結果は、ＴＮＢＣの標的治療のための全身投与ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の安全性が優れていることを示している。
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ和ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子の繰り返し全身投与の安全性は、治療中のマウスの体重をモニターして評価した。また、ナノ粒子の繰り返し注入の６週間の間、いずれのマウスキューにおいても体重の有意な変化は認められなかった、図３６Ａ。ナノ粒子除去に関与する肝臓、膵臓及び腎臓のＨ＆Ｅ染色組織病理学的分析は、２種のナノ粒子で処理されたマウスにおいて、組織学的に正常であり、顕著な組織損傷がないことを示した。これらの結果は、ＴＮＢＣの標的治療のための全身投与ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子の安全性が優れていることを示している。
【0258】
議論
この作業は、１回目にＴＮＢＣ ＴＭＥにおけるＥＤＢ－ＦＮのＭＲ分子イメージングで標的とするｍｉＲ－２００ｃ治療に対する腫瘍応答を非侵襲的に撮像することを示す。フィブロネクチン（ＦＮ１）は、ＥＭＴマーカーの１つとして考えられ、癌部組織における重要なＥＣＭタンパク質である。しかし、正常組織のＥＣＭにも存在するため、その適切な腫瘍マーカーとしての臨床的価値を妨げる。具体的には、その癌胚同種ＥＤＢ－ＦＮは、浸潤性腫瘍において特異的に過剰発現し、正常組織では発現しないため、癌のイメージング及び治療のための理想的な標的となる。Ｋｕｍｒａ， Ｄ． Ｐ． Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９７， １０１ （２０１６）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ ＴＮＢＣ細胞は、いずれも低ｍｉＲ－２００ｃ発現及び高ＥＤＢ－ＦＮ発現を有する。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子媒介ｍｉＲ－２００ｃのアディションは、両細胞株におけるＥＤＢ－ＦＮの著しい低下をもたらし、インビトロでの浸潤抑制と関連している。同様に、マウスの体内にＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子を毎週系統的に注入すると、非特異的コントロールＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、インビボＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ ＴＮＢＣ腫瘍の増殖が有意に抑制された。ＭＴ２１８を用いた処理前のＭＲＭＩスキャンでは、２種の腫瘍モデルに強いシグナル増強が示され、ｍｉＲ－２００ｃ処理腫瘍のスキャンでは有意に減少したが、対照処理の腫瘍画像では減少しなかった。これらの観察は、ｍｉＲ－２００ｃがＥＤＢ－ＦＮ発現に直接的又は間接的に影響し、ＭＲＭＩの誘導ＥＤＢ－ＦＮレベル変化の治療がＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理腫瘍反応の非侵襲的な評価を効果的に提供できることを示している。
この作業は、１回目にＴＮＢＣ ＴＭＥにおけるＥＤＢ－ＦＮのＭＲ分子イメージングで標的とするｍｉＲ－２００ｃ治療に対する腫瘍応答を非侵襲的に撮像することを示す。フィブロネクチン（ＦＮ１）は、ＥＭＴマーカーの１つとして考えられ、癌部組織における重要なＥＣＭタンパク質である。しかし、正常組織のＥＣＭにも存在するため、その適切な腫瘍マーカーとしての臨床的価値を妨げる。具体的には、その癌胚同種ＥＤＢ－ＦＮは、浸潤性腫瘍において特異的に過剰発現し、正常組織では発現しないため、癌のイメージング及び治療のための理想的な標的となる。Ｋｕｍｒａ， Ｄ． Ｐ． Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９７， １０１ （２０１６）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ ＴＮＢＣ細胞は、いずれも低ｍｉＲ－２００ｃ発現及び高ＥＤＢ－ＦＮ発現を有する。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子媒介ｍｉＲ－２００ｃのアディションは、両細胞株におけるＥＤＢ－ＦＮの著しい低下をもたらし、インビトロでの浸潤抑制と関連している。同様に、マウスの体内にＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子を毎週系統的に注入すると、非特異的コントロールＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳと比較して、インビボＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ ＴＮＢＣ腫瘍の増殖が有意に抑制された。ＭＴ２１８を用いた処理前のＭＲＭＩスキャンでは、２種の腫瘍モデルに強いシグナル増強が示され、ｍｉＲ－２００ｃ処理腫瘍のスキャンでは有意に減少したが、対照処理の腫瘍画像では減少しなかった。これらの観察は、ｍｉＲ－２００ｃがＥＤＢ－ＦＮ発現に直接的又は間接的に影響し、ＭＲＭＩの誘導ＥＤＢ－ＦＮレベル変化の治療がＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ処理腫瘍反応の非侵襲的な評価を効果的に提供できることを示している。
【0259】
また、ＭＴ２１８を用いたＭＲＭＩは、ＧＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ標的送達ｍｉＲ－２００ｃによるＴＮＢＣの腫瘍微小環境の効果的な変化を初めて実証した。ＦＮ１及びＥＤＢ－ＦＮは、癌細胞の遊走及び浸潤を促進し、基質との相互作用を媒介することによって重要な役割を果たすＥＣＭタンパク質である。Ｖａｉｄｙａら，Ｃｅｌｌｓ，９，１８２６（２０２０）。ＭＲＭＩは、ｍｉＲ－２００ｃ処理前後の腫瘍ＥＤＢ－ＦＮ発現レベル全体の３次元、高解像度画像を非侵襲的に提供する。また、ＲＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃで処理した腫瘍画像におけるＭＲＭＩシグナルの低下は、ＥＤＢ－ＦＮのダウングレードを示し、腫瘍切片の死後免疫組織化学的に確認した。これらの結果は、ｍｉＲ－２００ｃの上昇が癌タンパク質ＥＤＢ－ＦＮ及びその後の腫瘍ＥＣＭリモデリングを調節することによって、２つのＴＮＢＣ腫瘍モデルにおけるＴＭＥを変更することができることを示している。ｍｉＲ－２００ｃ発現がＴＭＥの他のいくつかの構成要素（コラーゲン、層接着タンパク質及び免疫回路を含む）間の相互作用及び治療結果の調節に及ぼす影響は、さらなる詳細な研究を必要とする。
【0260】
また、ｍｉＲ－２００ｃ治療に関しては、２種のＴＮＢＣ腫瘍モデルは、ＭＲＭＩによって明らかにされたＥＤＢ－ＦＮ発現に類似した生物学的反応を示したが、ＲＲＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子とのモデル特異的な違いも示した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍は、治療中に静止し、有意な大きさ変化は見られず、治療６週間後にはＨｓ５７８Ｔ腫瘍で有意な退治が認められた。治療後の分析は、ｍｉＲ－２００ｃが２種の治療腫瘍モデルで有意に上昇し、ＺＥＢ１及びＥＤＢ－ＦＮが有意に下方修正されたことを示した。ｍｉＲ－２００ｃは、Ｎｏｔｃｈ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｗｎｔを含む他の多くの癌性経路調節発癌遺伝子を標的としているため、２種の処理された腫瘍モデル間の腫瘍サイズの違いは、ｍｉＲ－２００ｃの上昇によって直接影響を受ける分子経路によって部分的に説明することができる。複数のＴＮＢＣモデルにおける腫瘍サイズに基づく生物学的反応と治療結果の違いを理解するには、さらなる包括的な調査が必要である。それにもかかわらず、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃが複数の発癌性遺伝子を直接調節する能力は、ｍｉＲ－２００ｃが不均一性ＴＮＢＣ腫瘍を効果的に治療するための有望な治療法であることを示している。この研究は、ｍｉＲ－２００ｃがＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子を標的とするシステム配信を介して攻撃性ＴＮＢＣ腫瘍の安全な治療のための有望な治療標的であるかもしれないという強い証拠を提供する。ＭＴ２１８のＭＲＭＩとＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃによる治療の組み合わせにより、がん患者の正確な医療のための非侵襲的で垂直的な評価が可能になる。
【0261】
以上をまとめると、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃナノ粒子療法に対する腫瘍応答の非侵襲的な評価のためのＥＤＢ－ＦＮのＭＲＮＡの有効性が実証された。ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃを比較的低用量で週毎に投与すると、無毒な副作用がなく、マウスモデルにおけるＴＮＢＣ腫瘍の阻害及び回帰が阻害された。ＭＴ２１８のＭＲＭＩを用いて、ｍｉＲ－２００ｃの腫瘍特異的ＥＤＢ－ＦＮレベルの低下と腫瘍微小環境の変化が、癌治療における腫瘍反応の分子イメージングパターンの有望かつ非侵襲的な評価であることを証明した。この研究は、分子イメージングとｍｉＲＮＡレベルのシステム調節を組み合わせて、ＴＮＢＣ患者の個別化のための新しい精密医学的アプローチを開いた。
【0262】
実験セクション
細胞及び細胞培養
三陰性乳癌系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入された。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、１０％のウシ血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）に保持された。Ｈｓ５７８Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトアビジン及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）由来の０．０１ｍｇ／ｍＬ組換えヒトインスリンを補充したＤＭＥＭで培養した。すべての細胞を３７℃及び５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで培養した。細胞株は、アメシオ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）由来のレンチウイルスＣＭＶルシフェラーゼ（ホタル）－２Ａ－ＧＦＰ（Ｎｅｏ）を用いて、ホタルルシフェラーゼ及びＧＦＰを発現するように工法を行い、フローサイトメトリーを用いて選別した。
細胞及び細胞培養
三陰性乳癌系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入された。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、１０％のウシ血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）に保持された。Ｈｓ５７８Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトアビジン及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）由来の０．０１ｍｇ／ｍＬ組換えヒトインスリンを補充したＤＭＥＭで培養した。すべての細胞を３７℃及び５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで培養した。細胞株は、アメシオ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）由来のレンチウイルスＣＭＶルシフェラーゼ（ホタル）－２Ａ－ＧＦＰ（Ｎｅｏ）を用いて、ホタルルシフェラーゼ及びＧＦＰを発現するように工法を行い、フローサイトメトリーを用いて選別した。
【0263】
ナノ粒子製剤
アミノ脂質ＥＣＯ（ＭＷ＝１０２３）と標的リガンドＲＧＤ－ＰＥＧ－ＭＡＬ（ＰＥＧ，３．４ｋ，Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧｗｏｒｋｓ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を合成した。ｍｉＲ－２００ｃ二本鎖及び陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＳ）をヌクレアーゼフリーの水に溶解し、濃度２５μｍｏｌ／Ｌとした。新鮮なＲＧＤ－ＰＥＧ－ＭＡＬをＮＦ水に溶解し、材料濃度０．６２５ｍｍｏｌ／Ｌにした。ＥＣＯを１００％エタノールに溶解し、材料濃度５ｍＭと５０ｍＭに溶解し、インビトロ及びインビボ実験に使用した。標的ナノ粒子製剤は、まずＲＧＤ－ＰＥＧ－ＭＡＬ（２．５ｍｏｌ％）とＥＣＯをヌクレアーゼフリーの水に３０分間混合し、竜胆攪拌することにより調製した。続いてｍｉＲ－２００ｃ又はＳＩＮＳ二本鎖体と錯化し、対応する標的ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ又はＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子を形成し、Ｎ／Ｐ＝８。生体内実験では、ナノ粒子製剤を５％スクロースと混合し、急速凍結し、－８０°Ｃで保存した。
アミノ脂質ＥＣＯ（ＭＷ＝１０２３）と標的リガンドＲＧＤ－ＰＥＧ－ＭＡＬ（ＰＥＧ，３．４ｋ，Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧｗｏｒｋｓ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を合成した。ｍｉＲ－２００ｃ二本鎖及び陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＳ）をヌクレアーゼフリーの水に溶解し、濃度２５μｍｏｌ／Ｌとした。新鮮なＲＧＤ－ＰＥＧ－ＭＡＬをＮＦ水に溶解し、材料濃度０．６２５ｍｍｏｌ／Ｌにした。ＥＣＯを１００％エタノールに溶解し、材料濃度５ｍＭと５０ｍＭに溶解し、インビトロ及びインビボ実験に使用した。標的ナノ粒子製剤は、まずＲＧＤ－ＰＥＧ－ＭＡＬ（２．５ｍｏｌ％）とＥＣＯをヌクレアーゼフリーの水に３０分間混合し、竜胆攪拌することにより調製した。続いてｍｉＲ－２００ｃ又はＳＩＮＳ二本鎖体と錯化し、対応する標的ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ又はＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子を形成し、Ｎ／Ｐ＝８。生体内実験では、ナノ粒子製剤を５％スクロースと混合し、急速凍結し、－８０°Ｃで保存した。
【0264】
ナノ粒子同定
ナノ粒子径及びζ電位の測定は、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＧｍｂＨ（Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）のＬｉｔｅｓｉｚｅｒ ５００を用いて２５℃でＮＦ水（１：２０）中で希釈した。ナノ粒子（２０μＬ）を薄い炭素膜（２０ｎｍ）で被覆した銅格子に装填し、３μＬの２％酢酸ウリル溶液で染色することで電子顕微鏡（ＴＥＭ）を透過させた。乾燥後、ＴＥＭを用いてサンプルを撮影した。ＲＮＡのカプセルのカプセル化は、アガロースゲル電気泳動を用いて評価し、２０μＬのナノ粒子にロシュＲｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）由来の４μＬの泳動色素を混合し、エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにロードした。電気泳動は、１００Ｖで３０分間行った後、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋イメージャー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて可視化した。
ナノ粒子径及びζ電位の測定は、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＧｍｂＨ（Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）のＬｉｔｅｓｉｚｅｒ ５００を用いて２５℃でＮＦ水（１：２０）中で希釈した。ナノ粒子（２０μＬ）を薄い炭素膜（２０ｎｍ）で被覆した銅格子に装填し、３μＬの２％酢酸ウリル溶液で染色することで電子顕微鏡（ＴＥＭ）を透過させた。乾燥後、ＴＥＭを用いてサンプルを撮影した。ＲＮＡのカプセルのカプセル化は、アガロースゲル電気泳動を用いて評価し、２０μＬのナノ粒子にロシュＲｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）由来の４μＬの泳動色素を混合し、エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにロードした。電気泳動は、１００Ｖで３０分間行った後、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋イメージャー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて可視化した。
【0265】
ＥＣＯ／ｍｉＲＮＡナノ粒子の細胞取り込み
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲＮＡのナノ粒子の細胞取り込みの定性評価を、生細胞蛍光顕微鏡を用いて評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１０００００個細胞）をガラス下のマイクロウェルプレートに接種し、一晩静置した後、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲＮＡ－Ｃｙ５．５（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を用いて、Ｎ／Ｐ＝８、［ｍｉＲＮＡ］＝４０ｎｍで処理した。４時間後、トランスフェクション培地を５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で３０分間置換した。その後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、Ｏｌｅｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を用いてイメージングした。同様に、細胞摂取はフローサイトメトリーを用いて定量的に評価される。トランスフェクション細胞を０．２６ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で採取し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５％ポリアセタールＤＰＢＳ（５００μＬ）に固定した。３５μｍ細胞フィルター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で濾過した後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーを用いてＣｙ５．５の蛍光強度を測定し、細胞取り込みを定量した。
半定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析
半定量リアルタイムＰＣＲを行った。簡潔に説明すると、メーカーの指示に従い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して、細胞及び組織からｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出した。ヒトＲＮＵ６Ｂ（ＲＮＵ６－２）ｍｉＳｃｒｉｐｔプライマーアッセイ及びｍｉＳｃｒｉｐｔ汎用プライマーを含むｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて逆転写を行い、その後、ヒトＲＮＵ６Ｂ（ＲＮＵ６－２）ｍｉＳｃｒｉｐｔプライマーアッセイ及びｍｉＳｃｒｉｐｔ汎用プライマーを含むｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑａｇｅｎ）を用いてｑＰＣＲを行った。ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡの発現レベルは、それぞれＵ６（Ｑｉａｇｅｎ）及び１８Ｓ対照に基づき正規化された。
ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲＮＡのナノ粒子の細胞取り込みの定性評価を、生細胞蛍光顕微鏡を用いて評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１０００００個細胞）をガラス下のマイクロウェルプレートに接種し、一晩静置した後、ＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲＮＡ－Ｃｙ５．５（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を用いて、Ｎ／Ｐ＝８、［ｍｉＲＮＡ］＝４０ｎｍで処理した。４時間後、トランスフェクション培地を５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で３０分間置換した。その後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、Ｏｌｅｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を用いてイメージングした。同様に、細胞摂取はフローサイトメトリーを用いて定量的に評価される。トランスフェクション細胞を０．２６ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で採取し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５％ポリアセタールＤＰＢＳ（５００μＬ）に固定した。３５μｍ細胞フィルター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で濾過した後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーを用いてＣｙ５．５の蛍光強度を測定し、細胞取り込みを定量した。
半定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析
半定量リアルタイムＰＣＲを行った。簡潔に説明すると、メーカーの指示に従い、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して、細胞及び組織からｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出した。ヒトＲＮＵ６Ｂ（ＲＮＵ６－２）ｍｉＳｃｒｉｐｔプライマーアッセイ及びｍｉＳｃｒｉｐｔ汎用プライマーを含むｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて逆転写を行い、その後、ヒトＲＮＵ６Ｂ（ＲＮＵ６－２）ｍｉＳｃｒｉｐｔプライマーアッセイ及びｍｉＳｃｒｉｐｔ汎用プライマーを含むｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑａｇｅｎ）を用いてｑＰＣＲを行った。ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡの発現レベルは、それぞれＵ６（Ｑｉａｇｅｎ）及び１８Ｓ対照に基づき正規化された。
【0266】
免疫ブロット解析
全タンパク質は、細胞塊（ＰＢＳにおけるプロテアーゼ阻害剤及びＬａｅｍｍｌｉ緩衝液の１：１）を溶解することによって抽出される。溶解物を１００°Ｃで１０分間インキュベートし、４°Ｃで１３２００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。タンパク質濃度は、測定者のプロトコール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に従って、Ｌｏｗｒｙのアッセイキットを用いて求めた。等量のタンパク質抽出物（４０・μｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。ＴＢＳＴで５％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。抗－ＺＥＢ１、抗－ＢＭＩ１、抗－サバイビン、抗－波形タンパク質及び抗β－アクチンモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）及び抗－ＥＤＢ－ＦＮ Ｇ４クローニング（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＵＫ）の抗体（１：１０００希釈、４°Ｃで一晩インキュベート）を使用した。二次抗体インキュベーション（１：２０００希釈１時間）の後、Ｓｉｇｎａｌ Ｆｉｒｅ Ｐｌｕｓ ＥＣＬキット（セルシグナリングテクノローヤ）で膜を現像し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋イメージャー（バイオラッド）にイメージングした。
全タンパク質は、細胞塊（ＰＢＳにおけるプロテアーゼ阻害剤及びＬａｅｍｍｌｉ緩衝液の１：１）を溶解することによって抽出される。溶解物を１００°Ｃで１０分間インキュベートし、４°Ｃで１３２００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。タンパク質濃度は、測定者のプロトコール（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に従って、Ｌｏｗｒｙのアッセイキットを用いて求めた。等量のタンパク質抽出物（４０・μｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。ＴＢＳＴで５％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。抗－ＺＥＢ１、抗－ＢＭＩ１、抗－サバイビン、抗－波形タンパク質及び抗β－アクチンモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）及び抗－ＥＤＢ－ＦＮ Ｇ４クローニング（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＵＫ）の抗体（１：１０００希釈、４°Ｃで一晩インキュベート）を使用した。二次抗体インキュベーション（１：２０００希釈１時間）の後、Ｓｉｇｎａｌ Ｆｉｒｅ Ｐｌｕｓ ＥＣＬキット（セルシグナリングテクノローヤ）で膜を現像し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋イメージャー（バイオラッド）にイメージングした。
【0267】
スクラッチ試験
スクラッチを行った。簡単に言えば、１×１０６の乳癌細胞を６ウェルプレートに２４時間置いた。１０μＬピペットの先端を使用して、プレートの中央に傷を作成した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、［ＲＮＡ］＝１００ｎＭのＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ又はＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子で細胞をトランスフェクションし、傷が閉じるまで２４時間モニタリングした。Ｍｏｔｉｒａｍ Ｔ２カメラ（Ｍｏｔｉｃ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｃｈｉｎａ）で画像を撮影した。
スクラッチを行った。簡単に言えば、１×１０６の乳癌細胞を６ウェルプレートに２４時間置いた。１０μＬピペットの先端を使用して、プレートの中央に傷を作成した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、［ＲＮＡ］＝１００ｎＭのＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ又はＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子で細胞をトランスフェクションし、傷が閉じるまで２４時間モニタリングした。Ｍｏｔｉｒａｍ Ｔ２カメラ（Ｍｏｔｉｃ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｃｈｉｎａ）で画像を撮影した。
【0268】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ遊走アッセイ
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ遊走試験を行った。ＴＮＢＣ細胞を標的とするＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子を［ＲＮＡ］＝１００ｎｍで４８時間トランスフェクトした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ（５００００個細胞／小室）（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）に血清空腹細胞を接種し、０．２８ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｒｎｉｎｇ基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）でコーティングした。２４時間後、細胞を遊走しない限り、小室を拭き取た。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓの底の遊走細胞を１０％ホルマリン（１０分）に固定し、０．１％結晶性紫で染色した（２０分）。Ｍｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラで画像を取得した。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ遊走試験を行った。ＴＮＢＣ細胞を標的とするＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ及びＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子を［ＲＮＡ］＝１００ｎｍで４８時間トランスフェクトした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ（５００００個細胞／小室）（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）に血清空腹細胞を接種し、０．２８ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｒｎｉｎｇ基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）でコーティングした。２４時間後、細胞を遊走しない限り、小室を拭き取た。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓの底の遊走細胞を１０％ホルマリン（１０分）に固定し、０．１％結晶性紫で染色した（２０分）。Ｍｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラで画像を取得した。
【0269】
３Ｄ腫瘍スフェロイド形成成長の測定
マトリゲル成長試験を行った。ＴＮＢＣ細胞を１００ ｎＭ ＲＮＡのＲＥＧ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ又はＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子で４８時間処理した。次いで、細胞を１０００００個の細胞／ウェルの密度でコルニング基底膜マトリックスコーティングされたμスライド（８ウェル、Ｉｂｉｄｉ，Ｇｒａｆｅｌｆｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接種した。腫瘍スフェロイドの評価は、最大４８時間行い、Ｍｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラを用いて撮像した。
マトリゲル成長試験を行った。ＴＮＢＣ細胞を１００ ｎＭ ＲＮＡのＲＥＧ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ又はＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子で４８時間処理した。次いで、細胞を１０００００個の細胞／ウェルの密度でコルニング基底膜マトリックスコーティングされたμスライド（８ウェル、Ｉｂｉｄｉ，Ｇｒａｆｅｌｆｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接種した。腫瘍スフェロイドの評価は、最大４８時間行い、Ｍｏｔｉｃａｍ Ｔ２カメラを用いて撮像した。
【0270】
動物モデル
Ｊａｃｋｓｏｎ研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から４～６週の雌裸マウス（胸腺ｎｕ／ｎｕ背景なし）を購入し，Ｃａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）の動物コア施設（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でケアを行った。すべての動物実験は、ＣＷＲＵ ＩＡＣＵＣによって承認されたスキームに従って実施した。マウスの乳房脂肪パッドは、マトリゲルＰＢＳ混合物に懸濁された２×１０６個ＧＦＰ－Ｌｕｃで標識されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１又は４×１０６個Ｈｓ５７８Ｔ細胞で注入された。腫瘍の体積は、定規とバイオルミネッセンスイメージング（ＢＬＩ）を使用して毎週モニタリングされた。平均腫瘍体積が５０ｍｍ３に達したマウスを無作為に対照群と処理群（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のｎ＝５／キュー，Ｈｓ５７８Ｔのｎ＝４／キュー，２匹のマウスに腫瘍を認めなかった）に分けた。
Ｊａｃｋｓｏｎ研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から４～６週の雌裸マウス（胸腺ｎｕ／ｎｕ背景なし）を購入し，Ｃａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）の動物コア施設（Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でケアを行った。すべての動物実験は、ＣＷＲＵ ＩＡＣＵＣによって承認されたスキームに従って実施した。マウスの乳房脂肪パッドは、マトリゲルＰＢＳ混合物に懸濁された２×１０６個ＧＦＰ－Ｌｕｃで標識されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１又は４×１０６個Ｈｓ５７８Ｔ細胞で注入された。腫瘍の体積は、定規とバイオルミネッセンスイメージング（ＢＬＩ）を使用して毎週モニタリングされた。平均腫瘍体積が５０ｍｍ３に達したマウスを無作為に対照群と処理群（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のｎ＝５／キュー，Ｈｓ５７８Ｔのｎ＝４／キュー，２匹のマウスに腫瘍を認めなかった）に分けた。
【0271】
インビボでのナノ粒子治療法
ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ又はＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子（１ｍｇ／ｋｇ、５％ｗ／ｖスクロース）を含む生体内製剤を、インプレースＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍を有するマウスに静脈内投与し、週１回、６週間（１ｍｇ／ｋｇ、５％ｗ／ｖスクロース）で注射した。原発性腫瘍の増殖は、キャリパ測定及びＢＬＩを介して１週間に亘ってモニタリングした。６週間後、原発性腫瘍を外科的切除し、組織学、ＲＮＡ発現及びｉＨｃの解析を行った。また、組織学的に脾臓、肝臓、腎臓を抽出した。腫瘍の一部を１０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に固定し、パラフィン包埋、区分、Ｈ＆Ｅ染色を行った。ＩＨＣは、抗ＥＤＢ－ＦＮ Ｇ４抗体を用いて行った。ＣＷＲＵの組織資源コア施設により染色サービスを提供した。１つのＲＧＤ－ＰＥＧ－Ｅｃｏ／ｍｉＲ－２００ｃ処理したＨ５７８Ｔ腫瘍ベアリングマウスを屠殺しなければならなかったが、腫瘍転移前の死因と治療毒性を組織学的に分析しても検出されなかった。
ＲＴＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｍｉＲ－２００ｃ又はＲＧＤ－ＰＥＧ－ＥＣＯ／ｓｉＮＳナノ粒子（１ｍｇ／ｋｇ、５％ｗ／ｖスクロース）を含む生体内製剤を、インプレースＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨｓ５７８Ｔ腫瘍を有するマウスに静脈内投与し、週１回、６週間（１ｍｇ／ｋｇ、５％ｗ／ｖスクロース）で注射した。原発性腫瘍の増殖は、キャリパ測定及びＢＬＩを介して１週間に亘ってモニタリングした。６週間後、原発性腫瘍を外科的切除し、組織学、ＲＮＡ発現及びｉＨｃの解析を行った。また、組織学的に脾臓、肝臓、腎臓を抽出した。腫瘍の一部を１０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に固定し、パラフィン包埋、区分、Ｈ＆Ｅ染色を行った。ＩＨＣは、抗ＥＤＢ－ＦＮ Ｇ４抗体を用いて行った。ＣＷＲＵの組織資源コア施設により染色サービスを提供した。１つのＲＧＤ－ＰＥＧ－Ｅｃｏ／ｍｉＲ－２００ｃ処理したＨ５７８Ｔ腫瘍ベアリングマウスを屠殺しなければならなかったが、腫瘍転移前の死因と治療毒性を組織学的に分析しても検出されなかった。
【0272】
治療応答のｍＲＮＡを介したモニタリング
標的ＭＲＩ造影剤ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＭＴ２１８）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｎｏｔｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）によって供給され、合成される。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＨｓ５７８Ｔ腫瘍を運ぶマウスのＭＲ画像は、３Ｔ ＭＲＳ ３０００スキャナ（ＭＲＳ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）上のマウス短い４コイルで採取した。ＭＴ２１８の０．１ｍｍｏｌ／ｋｇの静脈内投与後、高速スピンエコー（ＦＳＥ）軸位断シーケンスと呼吸ゲーティング（ＴＲ＝３０５ｍｓ、ＴＥ＝１１ｍｓ、ＦＡ＝９０°、ＦＯＶ＝４０×４０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、スライス数＝１５、Ｎａｖ＝２、行列＝２５６×２５６）を用いてＴ１強調画像を取得した。ＭＴ２１８の射出後、１０、２０、３０分前後で画像を取得した。ＭＤＭＩは、治療前に行った後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＳ７８Ｔ腫瘍の６週間後ナノ粒子治療を行った。ＭＲＩデータ及び画像処理は、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェアを用いて行った。腫瘍のコントラスト対ノイズ比（ＣｎｔＲ）は、平均腫瘍強度とノイズの標準偏差で割った平均筋強度との差として算出した。
標的ＭＲＩ造影剤ＺＤ２－Ｎ３－Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ）（ＭＴ２１８）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｎｏｔｉｃｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）によって供給され、合成される。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＨｓ５７８Ｔ腫瘍を運ぶマウスのＭＲ画像は、３Ｔ ＭＲＳ ３０００スキャナ（ＭＲＳ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）上のマウス短い４コイルで採取した。ＭＴ２１８の０．１ｍｍｏｌ／ｋｇの静脈内投与後、高速スピンエコー（ＦＳＥ）軸位断シーケンスと呼吸ゲーティング（ＴＲ＝３０５ｍｓ、ＴＥ＝１１ｍｓ、ＦＡ＝９０°、ＦＯＶ＝４０×４０ｍｍ、スライス厚さ＝１ｍｍ、スライス数＝１５、Ｎａｖ＝２、行列＝２５６×２５６）を用いてＴ１強調画像を取得した。ＭＴ２１８の射出後、１０、２０、３０分前後で画像を取得した。ＭＤＭＩは、治療前に行った後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＳ７８Ｔ腫瘍の６週間後ナノ粒子治療を行った。ＭＲＩデータ及び画像処理は、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェアを用いて行った。腫瘍のコントラスト対ノイズ比（ＣｎｔＲ）は、平均腫瘍強度とノイズの標準偏差で割った平均筋強度との差として算出した。
【0273】
統計解析
全ての実験を独立して３回（ｎ＝３）行った。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ｖ８．４．３）を用いて行い、Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると考えた。２つのグループ間のデータをペアＴ検定を用いて比較した。２組以上のグループを超えるデータは、単一因子分散分析と比較した。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍで表される。ドットは、個々のマウスや図形凡例に記載されている技術的複製を表す。
全ての実験を独立して３回（ｎ＝３）行った。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ｖ８．４．３）を用いて行い、Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると考えた。２つのグループ間のデータをペアＴ検定を用いて比較した。２組以上のグループを超えるデータは、単一因子分散分析と比較した。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍで表される。ドットは、個々のマウスや図形凡例に記載されている技術的複製を表す。
【0274】
また、本明細書で引用されている特許請求の範囲、特許出願、及び出版物、並びに、電子的に入手可能な材料の開示は、参考として援用されている。以上の詳細な説明及び実施例は、理解を容易にするために説明したものである。もちろん、これに限定されるものではない。本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図1A-1H】
【図2A-2F】
【図3A-3J】
【図4A-4C】
【図5A-5E】
【図6A-6E】
【図7A-7F】
【図8A-8H】
【図9A-9E】
【図10A-10F】
【図11A-11H】
【図12A-12G】
【図13A-13D】
【図14A-14B】
【図15A-15E】
【図16A-16C】
【図17A-17I】
【図18】
【図19A-19C】
【図20A-20C】
【図21A-21C】
【図22】
【図23A-23B】
【図24A-24B】
【図25A-25C】
【図26A-26C】
【図27A-27B】
【図28A-28D】
【図29A-29D】
【図30A-30D】
【図31A-31P】
【図32A-32C】
【図33A-33G】
【図34A-34D】
【図35A-35G】
【図36A-36D】
【配列表】
【国際調査報告】