特表 2023-529825 コンフォメーション化された拘束型α－ＲＧＩＡアナログ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-12

(54)【発明の名称】コンフォメーション化された拘束型α－ＲＧＩＡアナログ

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20230705BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20230705BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20230705BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230705BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230705BHJP

   A61P 23/00 20060101ALI20230705BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230705BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20230705BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20230705BHJP

   A61K 9/70 20060101ALI20230705BHJP

【ＦＩ】

C07K7/08 ZNA

A61K38/12

A61P25/04

A61P29/00

A61K45/00

A61P23/00

A61K9/08

A61K9/10

A61K9/06

A61K9/70 401

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022574088

(86)(22)【出願日】2021-06-03

(85)【翻訳文提出日】2022-12-23

(86)【国際出願番号】 US2021035799

(87)【国際公開番号】W WO2021247936

(87)【国際公開日】2021-12-09

(31)【優先権主張番号】63/034,395

(32)【優先日】2020-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513256479

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100104411

【弁理士】

【氏名又は名称】矢口 太郎

(72)【発明者】

【氏名】マッキントッシュ、ジョセフ マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ツェン、ナン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ、ハン－チエー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA06

4C076AA09

4C076AA11

4C076AA16

4C076AA22

4C076AA72

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB31

4C076CC01

4C076CC04

4C076FF70

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA18

4C084BA26

4C084MA17

4C084MA22

4C084MA23

4C084MA28

4C084MA32

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA08

4C084ZB11

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA32

4H045CA40

4H045DA83

4H045EA20

4H045FA10

(57)【要約】

【要約】
【解決手段】 α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ、それを有する組成物、ならびにそれらの治療および使用のための方法が開示および記載される。例えば、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に結合するように構成された認識フィンガー領域、およびシステイン間硫黄結合を保護する側鎖結合構成を含み得る。
【選択図】 図１ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログであって、
α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に結合するように構成された認識フィンガー領域と、および
システイン間硫黄結合を保護する側鎖結合構成と、を含み、
前記アナログは、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％である前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体の結合親和性を有する、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項2】

保護されたシステイン間硫黄結合によって維持される構造を有するα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログであって、前記構造が、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％である前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を提供する、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項3】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体の前記結合親和性は、
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも５％であるか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも７．５％であるか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも１５％であるか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも２５％であるか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも２５％であるか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも４０％であるか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも５０％であるか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも８０％であるか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性と実質的に等しい、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性より大きい、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項4】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記保護されたシステイン間硫黄結合が、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの効能と比較して、効能の増加を提供する、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項5】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、
前記アナログが、
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値と実質的に等しいか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の２倍を超えない、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の３倍を超えない、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の５倍を超えない、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の１５倍を超えない、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の２５倍を超えない、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値を提供する、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項6】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、α－ＲｇＩＡ４ペプチド、または保護されたシステイン間硫黄結合を有さないα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログと比較して、前記保護されたシステイン間硫黄結合が、ジスルフィドブリッジスクランブル、ジスルフィドブリッジ分解、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれ以上を低減させる、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項7】

請求項１記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記側鎖結合構成が、メチレンチオアセタール、ラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化されているＮ末端アミノ酸側鎖、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれ以上を含む、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項8】

請求項７に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記側鎖結合構成が、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶの間のシステイン間結合を含むメチレンチオアセタールである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項9】

請求項７に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記側鎖結合構成が、ラクタムブリッジを有するＣ末端アミノ酸側鎖に環化されているＮ末端アミノ酸側鎖である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項10】

請求項９に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記Ｎ末端アミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項11】

請求項９に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記Ｃ末端アミノ酸がリジンおよびＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸からなる群から選択される、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項12】

請求項９に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記Ｎ末端アミノ酸がグルタミン酸であり、Ｃ末端アミノ酸がリジンである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項13】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記保護されたシステイン間硫黄結合が、ヒト血清中におけるα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性よりも大きい前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中における前記安定性を提供し、前記ヒト血清中の前記安定性は、前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログまたは前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドを９０％ヒト血清ＡＢ型に入れ、３７℃で１、２、４、８、２４、４８、または７２時間のうち少なくとも１つの時間インキュベートした後の残存量によって測定される、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項14】

請求項１３に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中における前記安定性が、前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドのヒト血清中における安定性よりも１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００％の少なくとも１つまたはそれ以上大きい、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項15】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記保護されたシステイン間硫黄結合が、還元型グルタチオン中でのα－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記安定性よりも大きい還元型グルタチオン中の前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの前記安定性を提供し、前記還元型グルタチオンにおける前記安定性は、前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログまたは前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドを１０等量の還元型グルタチオンとともにｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、３７℃で１、２、４、８、２４、４８または７２時間のうちの少なくとも１つインキュベートした後の残存量で測定される、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項16】

請求項１５に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの前記還元型グルタチオンにおける前記安定性が、前記還元型グルタチオンにおける前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記安定性より１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００％の少なくとも１つまたはそれ以上でより大きい、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項17】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記保護されたシステイン間硫黄結合が、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体選択性と実質的に等しい、α９αニコチン性アセチルコリン受容体選択性を提供する、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項18】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記保護されたシステイン間硫黄結合が、異なるニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブタイプの選択性と比較して、前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する選択性の５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または２００倍のうちの少なくとも１つより大きいα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する選択性を提供する、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項19】

請求項１８に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記異なるｎＡＣｈＲサブタイプが、α１β１δε、α２β２、α２β４、α３β２、α３β４ α４β２、α４β４、α６／α３β２β３、およびα６／α３β４からなる群から選択される、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項20】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記保護されたシステイン間硫黄結合が、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの安全性プロファイルと実質的に等しいかまたはそれよりも大きい安全性プロファイルを提供し、前記安全性プロファイルは、
１００μＭの濃度で存在する前記アナログは、自動化ホールセルパッチクランプアッセイから測定されたヒトエーテル－ア－ゴー－ゴー－関連遺伝子（ｈＥＲＧ）Ｋ^＋チャネルの２５％未満を阻害し、
１００μＭの濃度で存在する前記アナログは、モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ）アッセイによって測定される約２０％未満の阻害活性を有し、または
１０μＭの濃度で存在する前記アナログは、ＣＹＰアッセイで測定した場合、２０％以下の阻害活性を有する
の１つまたはそれ以上によって測定される、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項21】

請求項１または２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記保護されたシステイン間連結が、Ｃ^ＩとＣ^ＩＩＩ、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶ、またはそれらの組み合わせの間のシステイン間連結の１つまたはそれ以上である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項22】

請求項２に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記構造体が球状である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項23】

α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログであって、
Ｄ Ｐ Ｒを含む と、および
Ｃ^Ｉ、Ｃ^ＩＩ、Ｃ^ＩＩＩ、およびＣ^ＩＶを含むシスチン残基と、を含み、
前記Ｃ^ＩおよびＣ^ＩＩＩは、第１のシステイン間硫黄結合によって連結されており
Ｃ^ＩＩおよびＣ^ＩＶは、第２のシステイン間硫黄結合によって連結され、および
少なくとも第２のシステイン間硫黄結合は、側鎖結合構成によって保護される、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項24】

請求項２３記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、
第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含み、
Ｎ末端アミノ酸側鎖が、ラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化される、または
それらの組み合わせである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項25】

請求項２３に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項26】

請求項２５に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６（配列ＩＤ番号： １３）を含み、前記Ｘａａ_１－６はＣ以外の任意のアミノ酸である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項27】

請求項２６記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６（配列ＩＤ番号：１４）を含み、
Ｘａａ_１が、Ｃ以外の任意のタンパク質原性アミノ酸または非タンパク質原性アミノ酸であり、
Ｘａａ_２が、Ｃ以外の任意のタンパク質原性アミノ酸または非タンパク質原性アミノ酸であり、
Ｘａａ_３が、（Ｃｉｔ）または任意のタンパク質原性または非タンパク質原性の正アミノ酸からなる群から選択されるメンバーであり、
Ｘａａ_４が、任意のタンパク質原性または非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり、
Ｘａａ_５が、任意のタンパク質原性または非タンパク質原性の正アミノ酸であり、
Ｘａａ_６が、任意のタンパク質生成性または非タンパク質原性の芳香族アミノ酸である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項28】

請求項２５に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、前記アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７（配列ＩＤ番号：２０）を含み、前記Ｘａａ_１－７はＣ以外の任意のアミノ酸である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項29】

請求項２８記載に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７（配列ＩＤ番号：２１）を含み、
Ｘａａ_１が、Ｃ以外のタンパク質原性アミノ酸または非タンパク質原性アミノ酸であり、
Ｘａａ_２が、Ｃ以外のタンパク質原性アミノ酸または非タンパク質原性アミノ酸であり、
Ｘａａ_３が、（Ｃｉｔ）または任意のタンパク質原性または非タンパク質原性の正アミノ酸からなる群から選択されるメンバーであり、
Ｘａａ_４が、任意のタンパク質原性または非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり、
Ｘａａ_５が、任意のタンパク質原性または非タンパク質原性の正アミノ酸であり、
Ｘａａ_６が、任意のタンパク質原性または非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり、
Ｘａａ_７が、Ｃ以外のタンパク原性または非タンパク源原性のアミノ酸である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項30】

請求項２６記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６（配列ＩＤ番号：１５）を含み、Ｘａａ_１がＧ、Ｘａａ_２がＴ、Ｘａａ_５がＱ、Ｘａａ_{３，４，または６}がＣ以外の任意のアミノ酸である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項31】

請求項２６記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６（配列ＩＤ番号：１６）を含み、
Ｘａａ_３が、（Ｃｉｔ）およびＲからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｘａａ_４が、（ｉＹ）およびＹからなる群から選択されるメンバーであり、および
Ｘａａ_６が、（ｂｈＹ）、Ｙ、およびｂＡからなる群から選択されるメンバーである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項32】

請求項２６に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）（ｉＹ）Ｑ Ｃ Ｙ（配列ＩＤ番号：１８）を含み、
Ｘａａ_３が、（Ｃｉｔ）であり、
Ｘａａ_４が、（ｉＹ）であり、および
Ｘａａ_６が、Ｙである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項33】

請求項２８記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７（配列ＩＤ番号：２２）を含み、Ｘａａ_１がＧ、Ｘａａ_２がＴ、Ｘａａ_５がＱ、およびＸａａ_{３、４、６、または７}がＣ以外の任意のアミノ酸である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項34】

請求項２８記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７（配列ＩＤ番号：２３）を含み、
Ｘａａ_３が、（Ｃｉｔ）およびＲからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｘａａ_４が、（ｉＹ）およびＹからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｘａａ_６が、（ｂｈＹ）、Ｙ、およびｂＡからなる群から選択されるメンバーであり、および
Ｘａａ_７が、Ｒである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項35】

請求項２８に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｒ（ｉＹ）Ｑ Ｃ（ｂｈＹＲ（配列ＩＤ番号：２４）を含み、
Ｘａａ_３が、Ｒであり、
Ｘａａ_４が、（ｉＹ）であり、
Ｘａａ_６が（ｂｈＹ）である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項36】

請求項２８に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｒ（ｉＹ）Ｑ Ｃ（ｂＡ）Ｒ（配列ＩＤ番号：２５）を含み、
Ｘａａ_３が、Ｒであり、
Ｘａａ_４が、（ｉＹ）であり、
Ｘａａ_６が、（ｂＡ）である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項37】

請求項２３に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログであって、前記ラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化されているＮ末端アミノ酸側鎖をさらに含む、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項38】

請求項３７に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記Ｎ末端アミノ酸がグルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項39】

請求項３７に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記Ｃ末端アミノ酸がリジンおよびＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸からなる群から選択される、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項40】

請求項３７に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記Ｎ末端アミノ酸がグルタミン酸であり、Ｃ末端アミノ酸がリジンである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項41】

請求項３７に記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログが、前記アナログが、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｘａａ_１０ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３ Ｃ Ｘａａ_１４ Ｘａａ_１５（配列ＩＤ番号：３）を含み、前記Ｘａａ_８－１５はＣ以外の任意のアミノ酸である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項42】

請求項４１記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｘａａ_１０ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３ Ｃ Ｘａａ_１４ Ｘａａ_１５（配列ＩＤ番号：４）を含み、
Ｘａａ_８が、ＥおよびＤからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｘａａ_１５が、Ｋおよび（Ｄａｐ）からなる群から選択されるメンバーであり、および
Ｘａａ_９－１４が、Ｃ以外のアミノ酸である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項43】

請求項４１記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｑ Ｃ Ｙ Ｘａａ_１５（配列ＩＤ番号：５）を含み、
Ｘａａ_８が、ＥおよびＤからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｘａａ_１０が、Ｔであり、
Ｘａａ_１３が、Ｑであり、
Ｘａａ_１４が、Ｙであり、
Ｘａａ_１５が、Ｋおよび（Ｄａｐ）からなる群から選択されるメンバーであり、
Ｘａａ_{９，１１，または１２}が、Ｃ以外のアミノ酸である、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項44】

請求項４１記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｑ Ｃ Ｙ Ｘａａ_１５（配列ＩＤ番号：６）を含み、
Ｘａａ_８が、ＥおよびＤからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｘａａ_９が、Ｇまたは（^ｂＡ）であり、
Ｘａａ_１１が、Ｒまたは（Ｃｉｔ）であり、
Ｘａａ_１２が、Ｙまたは（ｉＹ）であり、および
Ｘａａ_１５が、Ｋおよび（Ｄａｐ）からなる群から選択されるメンバーである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項45】

請求項４１記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｅ Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）Ｙ Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：９）を含み、
Ｘａａ_８が、Ｅであり、
Ｘａａ_９が、Ｇであり、
Ｘａａ_１１が、（Ｃｉｔ）であり、
Ｘａａ_１２が、Ｙであり、および
Ｘａａ_１５が、Ｋである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項46】

請求項４１記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｅ（^ｂＡ）Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）Ｙ Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、
Ｘａａ_８が、Ｅであり、
Ｘａａ_９が、（^ｂＡ）であり、
Ｘａａ_１１が、（Ｃｉｔ）であり、
Ｘａａ_１２が、Ｙであり、および
Ｘａａ_１５が、Ｋである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項47】

請求項４１記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｅ Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）（ｉＹ）Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：１１）を含み、
Ｘａａ_８が、Ｅであり、
Ｘａａ_９が、Ｇであり、
Ｘａａ_１１が、（Ｃｉｔ）であり、
Ｘａａ_１２が、（ｉＹ）であり、および
Ｘａａ_１５が、Ｋである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項48】

請求項４１記載のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて、前記アナログが、アミノ酸配列Ｅ Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｒ（ｉＹ）Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：１２）を含み、
Ｘａａ_８が、Ｅであり、
Ｘａａ_９が、Ｇであり、
Ｘａａ_１１が、Ｒであり、
Ｘａａ_１２が、（ｉＹ）であり、および
Ｘａａ_１５が、Ｋである、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ。

【請求項49】

組成物であって、
請求項１、２、または２３のいずれかに記載の治療上有効な量のアナログと、薬学的に許容される担体との組合せである、組成物。

【請求項50】

請求項４９記載の組成物において、前記組成物が、局所投与、経皮投与、静脈内投与、または皮下投与に適している、組成物。

【請求項51】

請求項５０記載の組成物において、前記組成物が、さらに追加の活性剤を含む、組成物。

【請求項52】

請求項５１記載の組成物において、前記追加の活性剤が、抗炎症剤、麻酔剤、二次鎮痛ペプチド、非ペプチド鎮痛剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーである、組成物。

【請求項53】

請求項４９記載の組成物において、前記追加の活性剤が、約０．０００１ｗｔ％～約１０ｗｔ％の濃度で存在する、組成物。

【請求項54】

請求項４９記載の組成物において、前記組成物が、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、ヒドロゲル、熱応答性ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、接着剤、液溜め、パッチ、またはこれらの組み合わせのうちの１つとして処方される、組成物。

【請求項55】

請求項５０記載の組成物において、前記組成物が皮下注射に適する、組成物。

【請求項56】

請求項５５記載の組成物において、前記薬学的に許容される担体が、水、強壮剤、緩衝剤、防腐剤、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上を含む、組成物。

【請求項57】

α－ＲｇＩＡ４アナログにおけるα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対するα－ＲｇＩＡ４効能を維持する方法であって、前記アナログの認識フィンガー領域をα－ＲｇＩＡ４構成で維持するシステイン間硫黄結合を側鎖結合の構成で保護する工程を含む、α－ＲｇＩＡ４アナログ。

【請求項58】

請求項５７記載の方法において、前記アナログが、
α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも５％、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも７．５％、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも１５％、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも２５％、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも４０％、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも５０％、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性の少なくとも８０％、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性と実質的に等しい、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドの前記結合親和性よりも大きい
親和性でα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に結合する、方法。

【請求項59】

請求項５７記載の方法において、
前記アナログが、
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値と実質的に等しいか、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の２倍を超えない、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の３倍を超えない、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の５倍を超えない、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の１５倍を超えない、または
前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の２５倍を超えない、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値を阻害する、方法。

【請求項60】

請求項５７に記載の方法において、前記システイン間硫黄結合を保護する工程が、異なるｎＡＣｈＲサブタイプの選択性と比較して、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対して５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または２００倍のうちの少なくとも１つまたはそれ以上であるα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）選択性を提供する、方法。

【請求項61】

請求項５７に記載の方法において、前記システイン間硫黄結合を保護する工程が、前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドのヒト血清中における安定性よりも１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００％の少なくとも１つまたはそれ以上大きい前記α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中における前記安定性を提供する、方法。

【請求項62】

請求項５７に記載の方法において、前記システイン間硫黄結合を保護する工程が、Ｃ^ＩとＣ^ＩＩＩ、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶ、またはそれらの組み合わせの間のシステイン間結合の１つまたはそれ以上を保護する工程を含む、方法。

【請求項63】

請求項６２に記載の方法において、前記システイン間硫黄結合を保護する工程が、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶの間にメチレンチオアセタールを挿入する工程を含む、方法。

【請求項64】

請求項５７に記載の方法において、前記システイン間硫黄結合を保護する工程が、Ｎ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸との間にラクタムブリッジを作る工程を含む、方法。

【請求項65】

対象において、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に応答する状態を治療するための方法であって、請求項４８に記載の前記組成物の治療上有効な量を前記対象に投与する工程を含む、方法。

【請求項66】

前記状態が痛みである、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

請求項６６に記載の方法において、前記痛みが、化学物質誘発性神経障害（ＣＩＰＮ）、糖尿病性神経障害、関節炎性神経障害、骨関節炎性神経障害、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれ以上を含む神経障害性疼痛である、方法。

【請求項68】

前記痛みがＨＩＶの痛みである、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

前記痛みがハンセン病に関連する痛みである、請求項６６に記載の方法。

【請求項70】

前記痛みが、術後痛、または外傷後痛のうちの１つまたはそれ以上である、請求項６６に記載の方法。

【請求項71】

前記状態が脊髄性多発性硬化症である、請求項６５に記載の方法。

【請求項72】

前記状態が帯状疱疹後神経痛である、請求項６５に記載の方法。

【請求項73】

前記状態が三叉神経痛である、請求項６５に記載の方法。

【請求項74】

前記状態が複合性局所疼痛症候群である、請求項６５に記載の方法。

【請求項75】

前記状態が癌である、請求項６５に記載の方法。

【請求項76】

前記癌が、上皮癌、肺癌、乳癌、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上を含む、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記状態が多発性硬化症である、請求項６５に記載の方法。

【請求項78】

前記状態が炎症である、請求項６５に記載の方法。

【請求項79】

請求項７８に記載の方法において、前記炎症が、免疫細胞によって媒介される、リウマチに関連する、またはそれらの組み合わせである、方法。

【請求項80】

請求項６５に記載の方法において、前記治療が、投与後の選択された時間内に少なくとも１０％の症状の軽減を提供する、方法。

【請求項81】

請求項６５に記載の方法において、前記治療上有効な量の組成物を１日１～５回、前記対象に投与する工程をさらに含む、方法。

【請求項82】

請求項６５に記載の方法において、前記治療上有効な量の組成物を、約１日～約３ヶ月の期間、少なくとも１日１回の投与レジメンに従って前記対象に投与する工程をさらに含む、方法。

【請求項83】

請求項６５に記載の方法において、前記治療上有効な量の組成物を、皮下投与形態、経皮投与形態、局所投与形態、静脈内投与形態、またはそれらの組み合わせとして投与する工程をさらに含む、方法。

【請求項84】

α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に応答する対象の状態の治療に使用するための組成物であって、請求項４９に記載の前記組成物の治療上有効な量を前記対象に投与する工程を含む、組成物。

【請求項85】

α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に応答する対象の状態を治療するための医薬の製造における組成物の使用であって、請求項４９に記載の前記組成物の治療上有効な量を前記対象に投与する工程を含む、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２０年６月３日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６３／０３４，３９５の利益を主張し、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、助成金Ｄｅｆｅｎｓｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ａｆｆａｉｒｓ（賞番号Ｗ８１ＸＷＨ－１７－１－０４１３）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ＧＭ０４８６７７、ＧＭ１３６４３０、ＧＭ１０３８０１、ＧＭ１２５００１による政府の支援を受けて行われた。この発明は、政府が一定の権利を有する。

【0003】

本開示は、ペプチドおよびそのアナログ、ならびにそれらの治療的用途に関する。したがって、本開示は、一般に、生物学、細胞生理学、化学、薬学、医学、および他の健康科学の分野に関する。

【背景技術】

【0004】

神経障害性疼痛は、身体的にも心理的にも衰弱させるもので、癌、糖尿病、脳卒中、ＡＩＤＳ、神経損傷など、多種多様な疾患の合併症として非常に多くみられる。このような痛みの治療には、これまでオピオイドが第一選択薬として用いられてきた。しかし、神経障害性疼痛の治療にオピオイド系薬剤を使用することは、重篤な副作用だけでなく、長期使用における薬物耐性や中毒の傾向が強いため、困難である。そのため、神経障害性疼痛の治療には、オピオイド以外の治療薬が求められる。

【0005】

コーンカタツムリ毒のペプチドは、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を含む疼痛関連受容体の標的など、さまざまな治療用途に有用な分子として役立ってきた。しかし、残念なことに、コーンカタツムリの自然型あるいは野生型のペプチド、例えばα－ＲｇＩＡは、好ましくない物理化学的特性を有しているため、治療上の可能性が制限され、哺乳類において治療効果を発揮するためには改変が必要である。さらに、自然型ペプチドをアナログに変化させるプロセス、例えばα－ＲｇＩＡ４アナログのようなアナログへの変更プロセスには多くの不確定要素があり、そのようなアナログはしばしば穏やかな効力しか達成できない。従って、哺乳動物における様々な症状の治療に高い効力を有する、コーンカタツムリ毒からのペプチドアナログが引き続き求められる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

一実施形態においてα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に結合するように構成された認識フィンガー領域と、システイン間硫黄結合を保護する側鎖結合構成とを含み得る。このアナログは、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有し得、ニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性は、少なくともα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％である。

【0007】

別の実施形態において、あるα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、保護されたシステイン間硫黄結合によって維持される構造（例えば、球状構造）を有することができる。球状構造は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％である、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体の結合親和性を提供し得る。

【0008】

さらに別の実施形態ではα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、ＤＰＲを含む認識フィンガー領域と、およびＣ^Ｉ、Ｃ^ＩＩ、Ｃ^ＩＩＩ、およびＣ^ＩＶを含むシスチン残基とを含み得る。システイン残基Ｃ^ＩおよびＣ^ＩＩＩは、第１のシステイン間硫黄結合により連結することができ、システイン残基Ｃ^ＩＩおよびＣ^ＩＶは、第２のシステイン間硫黄結合により連結することができる。第２のシステイン間硫黄結合は、側鎖結合構成によって保護され得る。

【0009】

別の実施態様では、α－ＲｇＩＡ４アナログにおいて、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対するα－ＲｇＩＡ４効能を維持する方法であってα－ＲｇＩＡ４アナログの認識指領域をα－ＲｇＩＡ４構成に維持する側鎖結合構成でシステイン間硫黄結合を保護することを含み得る（例えば、球状α－ＲｇＩＡ４構成）。

【0010】

より多くの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のアナログと薬学的に許容される担体との組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、対象において、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に応答する状態を治療するための方法は、治療有効量の組成物を対象に投与する工程を含み得る。

【0011】

このように、以下に続くその詳細な説明がより良く理解されるように、また、技術に対する本寄与がより良く理解されるように、本開示のより重要な特徴について、むしろ大まかに概説してきた。本開示の他の特徴は、添付の図面および特許請求の範囲と共にとらえた以下の詳細な説明から明らかになるか、または本開示の実施により知ることができる。

【0012】

本発明の他の態様および実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0013】

本開示の特徴および利点は、本開示の特徴を例として共に示す添付図面と共に取られる、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。

【図1a】図１ａ－Ａは、実施例に従って、Ａ１（活性）とＡ２（不活性）の間の急速なコンフォメーション平衡を示し、図１ａ－Ｂは、実施例に従って、Ｂ１（活性）からＢ２（不活性）へのコンフォメーション変化を嫌う拘束型のコンフォメーションを示す。

【図1b】図１ｂは、一実施例によるラクタムブリッジを含む活性コンフォメーションを示す。

【図1c】図１ｃは、実施例によるメチレンチオアセタールを含む活性コンフォメーションを示す図である。

【図2】図２は、実施例によると、大環状α－ＲｇＩＡアナログの合成経路を示す。ａ）ＦｍＣｏ－ＳＰＰＳ．ｂ）ＢＣｏ_２Ｏ，ＤＩＥＡ，ＤＣＭ．ｃ）通常のチロシン（ＰＧ_１＝ａｌｌｙｌ，ＰＧ_２＝ａｌＣｏ）に対する方法１。Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４，ＤＭＢＡ，ＤＣＭ；３－ヨードチロシン（ＰＧ_１＝Ｄｍａｂ，ＰＧ_２＝ｉｖＤｄｅ）の方法２：ｄ）ＰｙＢＯＰ，ＤＩＥＡ，ＨＯＢｔ，ＤＭＦ．ｅ）ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：ＴＩＰＳ：ＥＤＴ＝９５：２：２：１（ｖ／ｖ）次にＲＰ－ＨＰＬＣ．ｆ）０．０２Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ８．０），ａｉｒ．ｇ）Ｉ_２，ＡＣｏＨ，Ｈ_２Ｏ。

【図3a】図３ａは、Ａ）ヒトα９α１０ｎＡＣｈＲに対する合成されたアナログの濃度応答を示す。データは、別々の卵母細胞（ｎ＝３～６）の測定を表し、エラーバーはＳＤを表す。Ｂ）アナログ６は、コールドプレート試験において化学療法誘発神経障害性疼痛を防止する。投与量＝８０μｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）。値は、各実験決定についての平均±ＳＥＭ（ｎ＝８～９）として表される。＊＊ｐ<０．０１．Ｓａｌ＝生理食塩水；Ｏｘ＝オキサリプラチン；ＳＤ＝実施例に準じた標準偏差。

【図3b】図３ｂは、実施例によるヒトα９α１０対α７受容体に対するアナログ６の用量反応曲線を示す。

【図3c】図３ｃは、実施例によるα－ＲｇＩＡ４のＬＣ－クロマトグラムおよびＭＳ－スペクトルを示す。

【図3d】図３ｄは、実施例によるアナログ１のＬＣ－クロマトグラムとＭＳ－スペクトルを示す。

【図3e】図３ｅは、実施例によるアナログ２のＬＣ－クロマトグラムおよびＭＳ－スペクトルを示す。

【図3f】図３ｆは、実施例によるアナログ３のＬＣ－クロマトグラムおよびＭＳ－スペクトルを示す。

【図3g】図３ｇは、実施例によるアナログ４のＬＣ－クロマトグラムおよびＭＳ－スペクトルを示す。

【図3h】図３ｈは、実施例によるアナログ５のＬＣ－クロマトグラムおよびＭＳ－スペクトルを示す。

【図3i】図３ｉは、実施例によるアナログ６のＬＣ－クロマトグラムおよびＭＳ－スペクトルを示す。

【図3j】図３ｊは、実施例によるアナログ６［１，４］のＬＣ－クロマトグラムとＭＳ－スペクトルを示す。

【図3k】図３ｋは、実施例によるＲｇＩＡ４［１，４］のＬＣ－クロマトグラムとＭＳ－スペクトルを示す。

【図4a】図４ａは、ヒト血清中におけるα－ＲｇＩＡ４およびアナログ６の安定性を示す。Ａ）ヒト血清安定性の比較。値は、３つの別個の複製の平均±ＳＤである。Ｂ）ヒト血清中の異なる時点におけるジスルフィドスクランブルの代表的なＲＰ－ＨＰＬＣトレース、３７℃（Ｃｏｎｃ．０．１ｍｇ／ｍＬ）．実施例による^＊＊ｐ<０．０１。

【図4a】図４ｂは、ＲＰ－ＨＰＬＣコインジェクションによる異性体の決定を示す。図ｂ－Ａは、合成されたＲｇＩＡ４およびその［１，４］異性体を示し、図４ｂ－Ｂは、合成されたアナログ６およびその［１，４］異性体を示し、図４ｂ－Ｃは、実施例にしたがって試験した化合物の配列表示を示す。

【図5a】図５ａは、α－ＲｇＩＡ４、アナログ３および６のＮＭＲ研究を示す。Ａ二次Ｈα化学シフトのオーバーレイ。残基番号０はＧｌｕを、１４はＬｙｓを表す。Ｂ）Ｂ）α－ＲｇＩＡ４（黒）と３（赤）Ｃ）α－ＲｇＩＡ４（黒）と６（青）の代表的なＮＭＲ溶液構造を実施例に従って重ね合わせたものである。

【図5b-5d】図５ｂ～５ｄは、α－ＲｇＩＡ４について、ＴＣｏＳＹ（青）とＮＯＥＳＹ（赤）のアミド領域、ＨＳＱＣの脂肪族領域、芳香族領域を重ね合わせたものである。割り当てはＳＰＡＲＫＹで行った。（ＣＩＲ＝シトルリン、ＴＩＹ＝３－ヨードチロシン）の例に従っている。

【図5e-5g】図５ｅ～図５ｇは、アナログ３について、ＴＣｏＳＹ（青）およびＮＯＥＳＹ（赤）のアミド領域、ＨＳＱＣ脂肪族領域および芳香族領域のオーバーレイを示す図である。（ＣＩＲ＝シトルリン）の実施例によるものである。

【図5h-5j】図５ｈ～図５ｊは、アナログ６について、ＴＣｏＳＹ（青）およびＮＯＥＳＹ（赤）のアミド領域、ＨＳＱＣ脂肪族領域および芳香族領域のオーバーレイを示す図である。（ＣＩＲ＝シトルリン、ＴＩＹ＝３－ヨード－チロシン）の実施例によるものである。

【図5k-A】図５ｋ－Ａは、ＲｇＩＡ４バックボーンの重ね合わせについて示し、図５ｋ－Ｂは、実施例による、構造拘束、原子ＲＭＳＤ（２－１２）、およびラマチャンドランプロットを伴う側鎖の重ね合わせについて示す。

【図5l-A】図５ｌ－Ａは、アナログ３について、バックボーンの重ね合わせ、図５ｋ－Ｂは、コンフォメーション拘束を伴う側鎖の重ね合わせ、図５ｋ～Ｃは、一実施例に従って、原子ＲＭＳＤ（２－１２）によるリンカーの重ね合わせ（緑）とラマチャンドランプロットを示す。

【図5m】図５ｍは、アナログ６について、バックボーンの重ね合わせ、図５ｍ－Ｂは、コンフォメーション拘束を伴う側鎖の重ね合わせ、図５ｍ－Ｃは、原子ＲＭＳＤ（２－１２）によるリンカーの重ね合わせ（緑）、および一実施例によるラマチャンドランプロットを示す。

【図6a】図６ａは、アナログ６のＮＭＲ構造アンサンブルを、ＲｏｓｓｅｔａＤＣｏｋを用いて、ヒト（Ａ、Ｂ）α９（＋）／α９（－）および（Ｃ、Ｄ）α１０（＋）／α９（－）ｎＡＣｈＲ界面のホモロジーモデルにドッキングして得られた結合モデルの選択例を示す。α９－ＥＣＤは緑、α１０－ＥＣＤは水色、アナログ６はオレンジで示す。結合残基は棒グラフで示し、酸素、窒素、硫黄原子をそれぞれ赤、青、黄色で示す。破線はアナログ６と受容体の間に形成される水素結合を示す。ｈα９－ＥＣＤの構造はＲｇＩＡ結合Ｘ線結晶構造（ＰＤＢ ６ＨＹ７）から、ｈα１０－ＥＣＤは同構造に基づく既報のホモロジーモデルから、実施例に従って作成したものである。

【図6b】図６ｂは、一実施例によるドッキングクラスタリングファイルを示す。

【図6c】図６ｃは、一実施例によるドッキングクラスタリングファイルを示す。

【図7a】図７ａは、（Ａ）α－Ｃｔｘ ＲｇＩＡ，ＩｍＩ，Ｖｃ１．１，ＰｅＩＡ，ＭＩＩ，ＰｎＩＡのアミノ酸配列アラインメントを示す。ジスルフィド結合はＣｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ（ｌｏｏｐ Ｉ）とＣｙｓ^ＩＩ－Ｃｙｓ^ＩＶ（ｌｏｏｐ ＩＩ）である。＃Ｃ末端アミド；＾＝Ｃ末端カルボン酸。（Ｂ）α９ｎＡＣｈＲサブユニット結晶構造（ＰＤＢ ６ＨＹ７）に結合したＲｇＩＡの結合面。結合残基（Ｓｅｒ４，Ａｓｐ５，Ａｒｇ７，Ａｒｇ９）は黒字で表示し、酸素、窒素、硫黄原子をそれぞれ赤、青、黄色で棒状に表示した。（Ｃ）ネイティブ・ジスルフィドと開発されたジスルフィド模倣物質の化学構造。ペン＝Ｌ－ペニシラミン。（Ｄ）本研究で得られたメチレンチオアセタールＲｇＩＡアナログの化学合成。すべての直鎖ペプチドは、自動合成装置でＦｍＣｏ－ＳＰＰＳにより合成した。完全に折りたたまれたペプチドは、２回の操作で得られた。反応条件ａ）ＴＣＥＰ－ＨＣｌ，Ｋ_２Ｃｏ_３，Ｈ_２Ｏ、次にＥｔ３Ｎ、ＣＨ_２Ｉ_２、ＴＨＦ．ｂ）Ｉ_２、ＡＣｏＨ、Ｈ_２Ｏ実施例に準ずる。

【図7b】図７ｂは、ＲｇＩＡ－５５２４の折り畳みのＲＰ－ＨＰＬＣ分析を示し、図７ｂ－Ａは、線形ペプチドから部分折り畳みおよび完全折り畳みアナログへの変換を示し、図７ｂ－Ｂは、実施例による対応ペプチドのＨＰＬＣトレースを示している。

【図7c】図７ｃは、実施例によるＲｇＩＡ－５６１７のＬＣ－クロマトグラムとＭＳ－スペクトルを示す。

【図7d】図７ｄは、実施例によるＲｇＩＡ－５５３３のＬＣ－クロマトグラムとＭＳ－スペクトルを示す。

【図7e】図７ｅは、実施例によるＲｇＩＡ－５６１８のＬＣ－クロマトグラムとＭＳ－スペクトルを示す。

【図7f】図７ｆは、実施例によるＲｇＩＡ－５５２４のＬＣ－クロマトグラムとＭＳ－スペクトルを示す。

【図7g】図７ｇは、実施例によるＲｇＩＡ－５５７３のＬＣ－クロマトグラムとＭＳ－スペクトルを示す。

【図8a】図８ａは、（Ａ）合成されたメチレンチオアセタールＲｇＩＡアナログのｈα９α１０ｎＡＣｈＲ上のアミノ酸配列および効力を示す。^ａすべてのネイティブなジスルフィドまたはメチレンチオアセタールは、Ｃｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ，Ｃｙｓ^ＩＩ－Ｃｙｓ^ＩＶ構成で接続される。メチレンチオアセタールの置換は太字で表示し、ループ－Ｉは赤、ループ－ＩＩは緑で表示した。＾はＣ末端カルボン酸、Ｃｉｔ＝Ｌ－シトルリン、ｉＹ＝Ｌ－３－ヨード－チロシン、ｂＡ＝β－アラニン、ｂｈＹ＝Ｌ－β－ホモチロシンを表す。^ｂ濃度－反応曲線から算出。括弧内の数値は９５％信頼区間。（Ｂ）ヒトα９α１０ｎＡＣｈＲの阻害のための、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞で発現されたヒトｎＡＣｈＲ電流のＡＣｈ誘導電流を遮断する合成されたペプチドによる濃度反応解析。（Ｃ）Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ｏｏｃｙｔｅｓで発現させたヒトｎＡＣｈＲ電流に対するＲｇＩＡ－５５２４およびＲｇＩＡ－５５３３のｎＡＣｈＲ サブタイプ阻害のＩＣ_５０．（Ｄ）ＲｇＩＡ－５５２４およびＲｇＩＡ－５５３３によるｈα９α１０対ｈαｎＡＣｈＲの阻害に関する濃度応答解析。データポイントは、実施例に従って、３～４の独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。

【図8b】図８ｂは、Ｘ．ｌａｅｖｉｓ ｏｏｃｙｔｅｓで発現したヒトｎＡＣｈＲサブタイプ電流のＡＣｈ誘導電流の遮断に対する効果（１００ｎＭペプチド）を示し、データポイントは、実施例に従って３～４の独立実験からの平均±ＳＥＭを表す。

【図9】図９は、慢性化学療法誘発性神経障害性疼痛におけるＲｇＩＡ－５５２４のインビボ鎮痛効果を示す図である。ＲｇＩＡ－５５２４は、オキサリプラチンの反復投与により誘発される疼痛を緩和する。マウスに化学療法剤オキサリプラチン（３．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を１日１回、週５日、３週間にわたって注射した。オキサリプラチンを注射した日に、マウスは生理食塩水またはＲｇＩＡ－５５２４（４０μｇ／ｋｇ）のいずれかを投与された。週に一度、最後のＲｇＩＡ－５５２４注射の２４時間後に、マウスを、実験セクションに記載したように、コールドプレートを用いて冷感アロディニアについて評価した。アロディニアは２１日目までに統計的有意差に達し、ＲｇＩＡ－５５２４によって効果的に逆転された。データの統計的評価は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって行った。データは、平均値±ＳＥＭｎ＝８マウス／グループとして表した。Ｏｘ／Ｓａｌ対Ｓａｌ／Ｓａｌ処理マウスとの有意差について^ｘｘｘＰ<０．００１；Ｏｘ／Ｓａｌ対Ｏｘ／ＲｇＩＡ－５５２４処理マウスとの有意差については^＊＊＊Ｐ<０．００１である。Ｏｘ、オキサリプラチン；Ｓａｌ、０．９％食塩水；ｓ、実施例による秒数。

【図10】図１０は、α９ｎＡＣｈＲサブユニットが、ＲｇＩＡ－５５２４の鎮痛効果に使用されることを示す。（Ａ、Ｂ）１日目に、オキサリプラチン５ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．の単回投与が、ＲｇＩＡ５５２４（４０ｕｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）または０．９％食塩水のいずれかとともに与えられた。マウスは５日目に冷感アロディニアについて評価された。ＲｇＩＡ－５５２４は、（Ａ）野生型マウスにおけるアロディニアの発症を防止したが、（Ｂ）α９－サブユニット欠損マウスにおいては防止しなかった（ｎ＝１２マウス／群）。（Ｃ，Ｄ）１日目に、マウスに高用量のオキサリプラチン（１０ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．）とＲｇＩＡ－５５２４（４０ｕｇ／ｋｇｓ．ｃ．）または生理食塩水のいずれかを投与した。オキサリプラチン誘発の冷感アロディニアは、（Ｃ）野生型マウスでは１日目に投与したＲｇＩＡ－５５２４の単回投与により予防されたが、（Ｄ）α９サブユニット欠損マウスでは予防されなかった（ｎ＝８マウス／群）。データの統計的評価は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって行った。すべての結果は、平均値±ＳＥＭとして表される^＊Ｐ<０．０５、^＊＊Ｐ<０．０１、および^＊＊＊Ｐ<０．００１は、Ｓａｌ／Ｓａｌ処理マウスとの有意差である。^０Ｐ<０．０５、^００Ｐ<０．０１、およびＯｘ／Ｓａｌ処理マウスからの大きな有意差については^０００Ｐ<０．００１．Ｏｘ，ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、Ｓａｌ，０．９％ｓａｌｉｎｅ；ｓ，ｓｅｃｏｎｄｓ．，α９^－／－，α９ノックアウトマウスは実施例によるものである。

【図11a】図１１ａは、（Ａ）１０μＭでの他の疼痛関連イオンチャネルおよび受容体に対するＲｇＩＡ－５５２４の結合活性を示す。^ａ各実験は、二重のウェルで実施された。結合は、各ターゲットに特異的な放射能標識リガンドの結合の％阻害として計算され、酵素阻害効果は、対照酵素活性の％阻害として計算された。スクリーニングアッセイで５０％以上の阻害が認められた場合、二次的な濃度反応解析を行った。^ｂニコチン性神経細胞タイプ。^ｃストリキニーネ感受性．^ｄストリキニーネ不感受性、ＡＲ、アデノシン受容体、ＡＴ、アンジオテンシン、ＢＫ_２、ブラジキニン受容体、ＣＢ、カンナビノイド受容体、ＣＣＫ、コレシストキニン受容体；ＣＲＦ、コルチコトロピン放出因子、Ｄ、ドーパミン、ＥＴ、エンドセリン受容体、ＧＡＢＡ、γ－アミノ酪酸、ＧＡＬ、ガラニン受容体、ｍＧｌｕＲ、代謝性グルタミン酸受容体、ＧｌｙＲ、グリシン受容体（ストリキニン感受性）、Ｈ、ヒスタミン受容体、ＣｙｓＬＴ、システイニルロイコトリアン、Ｍ、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ＮＫ、ニューロキニン受容体、ＤＯＰ、δ－オピオイド受容体、ＫＯＰ、κ－オピオイド受容体、ＭＯＰ、μ－オピオイド受容体、ＮＯＰ、ノシセプチン・オルファニンＦＱ受容体、ＧＲ、グルココルチコイド受容体、ＥＲ、エストロゲン受容体、ＡＲ、アンドロゲン受容体、ＰＡＦＲ、血小板活性化因子受容体、ＴＲＨ１、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ＶＰＡＣ、血管作動性腸管ペプチド受容体、Ｖ、バソプレシン受容体、ＬＴＣＣ、Ｌ型Ｃａ^２＋チャネル、ＮＴＣＣ、Ｎ型Ｃａ^２＋チャネル、ＢＺＤ、ベンゾジアゼピン、ＰＣＰ、フェンシクリジンの各チャネルの機能活性を示す。（Ｂ）ＧＡＢＡ_Ｂ受容体およびｈＥＲＧＫ^＋チャンネルに対するＲｇＩＡ－５５２４の機能的活性。^ｅＩＣ_５０およびＥＣ_５０研究のために、２つの別々の実験が重複したウェルで実施された。細胞アゴニストおよびアンタゴニスト効果は、それぞれ既知の基準アゴニストまたはアンタゴニストに対する対照応答および％阻害の％として計算した。^ｆＲｇＩＡ－５５２４の１００μＭで測定した。（Ｃ）ＲｇＩＡ－５５２４の酵素アッセイと取り込みアッセイ。^ｇ各実験は二重のウェルで行った。アンタゴニスト効果は、測定された成分に対する阻害率として計算された。ＴＸＡ２合成酵素、トロンボキサンＡ２合成酵素、構成的ＮＯＳ、構成的ＮＯシンターゼ、ＭＡＯ、モノアミンオキシダーゼ、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体に対するＲｇＩＡ－５５２４の（Ｄ）アゴニスト効果および（Ｅ）アンタゴニスト効果の濃度反応解析。（Ｆ）尾部電流阻害により測定したｈＥＲＧ Ｋ^＋チャネルに対するＲｇＩＡ－５５２４の濃度反応解析。（Ｇ）１００ｎＭおよび１０μＭでのＲｇＩＡ－５５２４によるＣＹＰ酵素アイソフォームの阻害。各濃度について実験を重複して行い、データは実施例に従って平均値±ＳＥＭで表した。

【図11b-11d】図１１ｂ～１１ｄは、ＲｇＩＡ－５５３３について、ＴＣｏＳＹ（青）とＮＯＥＳＹ（赤）のアミド領域、ＨＳＱＣの脂肪族領域、芳香族領域の重ね合わせである。割り当てはＳＰＡＲＫＹで行った。（ＳＣＳ＝Ｌ－Ｓ－メチレン－Ｃｙｓ、ＣＩＲ＝シトルリン、ＴＩＹ＝３－ヨード－チロシン）を例に挙げて説明する。

【図11e-11g】図１１ｅ～１１ｇは、ＲｇＩＡ－５６１７について、ＴＣｏＳＹ（青）とＮＯＥＳＹ（赤）のアミド領域、ＨＳＱＣの脂肪族領域、芳香族領域の重ね合わせである。割り当てはＳＰＡＲＫＹで行った。（ＳＣＳ＝Ｌ－Ｓ－メチレン－Ｃｙｓ、ＣＩＲ＝シトルリン、ＴＩＹ＝３－ヨード－チロシン）を例にとって説明した。

【図11h-11j】図１１ｈ～図１１ｊは、ＲｇＩＡ－５５２４について、ＴＣｏＳＹ（青）およびＮＯＥＳＹ（赤）のアミド領域、ＨＳＱＣ脂肪族領域および芳香族領域のオーバーレイを示す図である。（ＳＣＳ＝Ｌ－Ｓ－メチレン－Ｃｙｓ、ＣＩＲ＝シトルリン、ＴＩＹ＝３－ヨード－チロシン、ＢＨＹ＝Ｌ－ベータホモチロシン）を実施例に従って示す。

【図11k】図１１ｋは、ＲｇＩＡ－５５３３のＡ）バックボーン重ね合わせ、Ｂ）側鎖重ね合わせと、構造拘束、原子ＲＭＳＤ（２－１２）、ラマチャンドランプロットを例に従って示す。

【図11l】図１１ｌは、ＲｇＩＡ－５６１７のＡ）バックボーン重ね合わせ、Ｂ）側鎖重ね合わせと、実施例によるコンフォメーション拘束、原子ＲＭＳＤ（２－１２）、ラマチャンドランプロットを示す。

【図11m】図１１ｍは、ＲｇＩＡ－５５２４について、Ａ）バックボーン重ね合わせ、Ｂ）側鎖重ね合わせ、コンフォメーション拘束、原子ＲＭＳＤ（２－１２）、ラマチャンドランプロットを実施例に従って示す。

【図12】図１２は、（Ａ）ＲｇＩＡ（黒）、ＲｇＩＡ４（灰）、ＲｇＩＡ－５６１７（ピンク）、ＲｇＩＡ－５５３３（緑）およびＲｇＩＡ－５５２４（青）の二次化学シフトを重ねたものである。Ｘ軸は、対応する標準化学シフトに基づいて計算された残基４、９、１０、１３、１４で変異体の残基を置換したペプチド配列を示す。代表的なＮＭＲ構造と、２つの分子内ブリッジにおけるＣα間の距離測定値（Å）を示す。（Ｂ）ｈα９ｎＡＣｈＲサブユニットと結合したＲｇＩＡの結晶構造（ＰＤＢ ６ＨＹ７）および（Ｃ）ＲｇＩＡ（ＰＤＢ ２ＪＵＱ）、（Ｄ）ＲｇＩＡ４、（Ｅ）ＲｇＩＡ－５５３３、（Ｆ）ＲｇＩＡ－５６１７、および（Ｇ）ＲｇＩＡ－５５２４の代表的ＮＭＲ解像構造。構造は、原子の酸素、窒素、硫黄、ヨウ素をそれぞれ赤、青、黄、紫で着色した棒グラフで示した。Ｃα距離は例によってＰｙＭＯＬプログラムによって測定した。

【図13】図１３は、ＲｇＩＡ－５５２４がＲｇＩＡ４と比較して大幅に向上した安定性を示すことを示す。（Ａ）完全なジスルフィドスクランブル防止は、３７℃における９０％ヒト血清中のペプチドインキュベーション後のある時点におけるＨＰＬＣトレースによって示され、観察された。（Ｂ）ヒト血清中におけるＲｇＩＡ－５５２４とＲｇＩＡ－５５３３の対ＲｇＩＡ４安定性アッセイ。ペプチドを９０％ヒト血清ＡＢ型（０．１ｍｇ／ｍＬ）中、３７℃）ＲｇＩＡ－５５２４とＲｇＩＡ４の還元的安定性アッセイ。ペプチドサンプルは、ｐＨ７．４ＰＢＳ中の還元ＧＳＨ（１０等量）の存在下で０．１ｍｇ／ｍＬに溶解し、３７℃でインキュベートした。データの統計評価は、スチューデントｔ（ｕｎｐａｉｒｅｄ）テストにより実施した。すべての結果は、一実施例に従って、平均±ＳＤ（ｎ＝３）、^＊＊Ｐ<０．０１、^＊＊＊Ｐ<０．００１で表す。ここで、図示された例示的な実施形態を参照し、本明細書では、特定の言語を用いて、同じものを説明する。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定は、それによって意図されないことが理解されるだろう。

【発明を実施するための形態】

【0014】

これらの例示的な実施形態は、当業者が本開示を実施できるように十分詳細に説明されているが、他の実施形態が実現されてもよく、本開示の精神および範囲から逸脱することなく本開示に対する種々の変更がなされてもよいことは理解されるべきである。したがって、本開示の実施形態に関する以下のより詳細な説明は、請求されたように本開示の範囲を限定することを意図したものではなく、本開示の特徴および特性を説明し、本開示の最良の動作モードを示し、当業者が本開示を実施することを十分に可能にするために、例示のみを目的として示され限定されるものではない。したがって、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ定義されるものである。

【0015】

定義
本開示の説明および請求において、以下の用語が使用される。

【0016】

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の参照元を含む。したがって、例えば、「ペプチド」への言及は、そのような構造の１つまたは複数への言及を含み、「アナログ」への言及は、そのようなアナログの１つまたは複数への言及を指す。

【0017】

本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、作用、特性、性質、状態、構造、項目、または結果の完全なまたはほぼ完全な範囲または程度を意味する。例えば、「実質的に」囲まれているオブジェクトは、そのオブジェクトが完全に囲まれているか、またはほぼ完全に囲まれていることを意味することになる。絶対的な完全性からの正確な逸脱がどの程度許容されるかは、場合によっては特定の文脈に依存することがある。しかし、一般的には、絶対的な完全性が得られる場合と同じ全体的な結果が得られるように、ほぼ完全であることを意味する。実質的に」の使用は、ある作用、特性、性質、状態、構造、項目、または結果を完全にまたはほぼ完全に欠いていることを意味する否定的な意味合いで使用する場合にも同様に適用されます。例えば、粒子を「実質的に含まない」組成物は、粒子を完全に欠くか、または粒子を完全に欠くのと同じ効果が得られるほど粒子をほぼ完全に欠くかのいずれかである。言い換えれば、成分または要素を「実質的に含まない」組成物は、測定可能な影響がない限り、実際にそのような項目を含んでいても良い。

【0018】

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、所定の用語、指標または値に関連する柔軟性および不正確性を提供するために使用される。特に断らない限り、特定の数値または数値範囲に従った「約」という用語の使用は、「約」という用語なしにそのような数値用語または範囲のサポートを提供するとも理解されるべきである。例えば、便宜上および簡潔さのために、「約５０オングストローム～約８０オングストローム」の数値範囲も、「５０オングストローム～８０オングストローム」の範囲に対する支持を提供するものと理解されたい。さらに、この書面の説明では、「約」という用語がそれとともに使用される場合であっても、実際の数値に対するサポートが提供されることが理解されよう。例えば、「約」３０の記載は、３０の少し上と少し下の値に対するサポートを提供するだけでなく、同様に３０の実際の数値に対するサポートも提供すると解釈されるべきである。特定の変数に対する柔軟性の程度は、当業者であれば容易に判断することができる。しかし、特に明言しない限り、「約」という用語は、一般に、２％未満、最も頻繁には１％未満、場合によっては０．０１％未満の柔軟性を意味する。

【0019】

本明細書で使用する場合、「治療する」、「処置する」、または「治療する」等の用語は、無症状または症状がある対象への治療剤または治療行為の投与を意味する。すなわち、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療の（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、状態（すなわち、症状が発現している）を軽減または除去する行為を指すこともあれば、予防的治療（すなわち、症状が発現していない対象に対して、その発生を防止するために投与すること）を指すこともある。このような予防的治療は、症状の予防、予防的作用、予防的措置等とも称することができる。

【0020】

本明細書で使用する場合、「治療剤」、「活性剤」などの用語は互換的に使用でき、適切なまたは有効な量で対象に投与された場合に対象に有益またはプラスの効果を与えることができる薬剤を指す。１つの態様において、治療剤または活性剤は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログであり得る。「追加活性剤」、「補足活性剤」、「二次活性剤」等の用語は互換的に使用することができ、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ以外の化合物、分子、または物質を指す。

【0021】

本明細書で使用される場合、「製剤」および「組成物」という用語は互換的に使用され、２つ以上の化合物、要素、または分子の混合物を意味する。いくつかの態様において、用語「製剤」および「組成物」は、担体または他の賦形剤と１つ以上の活性剤の混合物を指すために使用され得る。さらに、用語「剤形」は、対象への投与のために形式（例えば、特定の形態、形状、ビヒクルなど）で提供される１つまたは複数の製剤（複数可）または組成物（複数可）を含むことができる。例えば、「経口剤形」は、対象の口への投与に適することができる。「局所投与形態」は、擦るなどして対象の皮膚に投与するのに好適であり得る。

【0022】

本明細書において、「治療部位」とは、治療が望まれる被検体上または被検体内の部位を指す。例えば、痛みを治療する場合、治療部位は、痛みの領域であり得る。さらに、本明細書で使用される場合、「適用部位」は、治療が行われる対象上または対象内の場所を指す。さらに、輸液投与製剤の適用部位は、輸液装置が対象の循環系に入る部位であり得る。さらに、局所投与製剤のための適用部位は、局所投与製剤が適用される皮膚または粘膜の領域であっても良い。いくつかの実施形態では、適用部位は、治療部位と実質的に同じであってよい（例えば、組成物または製剤は、治療部位に直接投与される）。他の実施形態では、適用部位は、治療部位とは異なる（例えば、遠位）場合がある。このような場合、投与が治療部位から遠位であっても、組成物または製剤は依然として治療部位において治療効果を発揮する。

【0023】

本明細書で使用される場合、「局所用組成物」または「局所投与」などは、皮膚または粘膜表面への直接投与に適した組成物を指し、そこから有効量の薬剤が放出される。いくつかの実施形態では、局所用組成物は、局所的または局部的な治療効果（例えば、適用部位またはその近傍）を提供することができる。例えば、創傷、病変、火傷、カンジダ等（例えば、治療部位）に適用される場合の局所用組成物は、主に適用部位またはその周辺で治療効果を発揮し得るが、それを実質的に超えないようにすることができる。他の実施形態では、局所用組成物は、局所的な効果を提供することができる。例えば、指、腕、足首、関節などの身体のある部位の皮膚表面に投与された局所用組成物は、その部位内で治療効果を発揮し得るが、実質的にそれを超えることはない。例えば、足首の領域に投与された局所用組成物は、例えば、浮腫、関節の炎症、痛みなどを軽減することによって、足首およびその周辺に治療効果を発揮することができる。他の実施形態では、局所用組成物は、全身的な効果を提供することができる。いくつかの態様では、局所用組成物は、薬物または活性剤自体が治療部位に到達する作用機序を介して、治療効果を提供することができる。他の局面では、局所用組成物は、酵素カスケードまたは他のシグナル伝達（例えば、細胞シグナル伝達、または細胞間／細胞内シグナル伝達）イベントのような生化学カスケードイベントなど、最終的に治療部位で所望の治療効果を発揮する中間作用機序を介して治療効果を提供することが可能である。いくつかの例では、そのような中間機構は、適用部位から遠位である治療部位の治療を可能にし得る。さらに他の例では、遠方の治療部位の治療が行われる場合、活性剤は、塗布部位から治療部位まで真皮および他の組織を通って移動し、直接効果を発揮し得る。

【0024】

本明細書で使用する「経皮」とは、治療薬を皮膚表面に投与する際に、切れ目なく皮膚表面を通して投与される経路を指す。経皮投与された場合、薬物または活性剤は、適用部位から治療部位に移行し、治療効果を発揮する。経皮組成物および剤形は、例えば、バッキングフィルム、接着剤、リザーバーなど、皮膚表面への組成物の保持を補助する構造および／またはデバイスを含むことができる。さらに、経皮組成物は、浸透または透過エンハンサーなどの、活性薬剤の適用部位から治療部位への（例えば、皮膚を通って対象の循環系への）移動を助けるか、さもなければ促進する薬剤を含むことができる。このような浸透性または透過性増強剤は、いくつかの実施形態において局所製剤と共に使用することも可能である。

【0025】

「皮膚」または「皮膚表面」という用語は、１つまたはそれ以上の表皮層を含む対象の外皮だけでなく、呼吸器（鼻腔および肺を含む）、口腔（口および頬）、膣および直腸腔の粘膜などの粘膜表面も含まれる。したがって、用語「経皮」は、「経粘膜」をも包含する場合がある。

【0026】

本明細書で使用されるように、第１の治療薬と第２の治療薬とを「共投与する」ことは、適切な時間枠内での同時投与を含み得る。一実施例では、好適な時間窓は、以下：１時間、４５分、３０分、１５分、５分、２分、１分、またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数未満であり得る。併用投与は、同じ組成物からであっても、異なる組成物からであっても良い。

【0027】

本明細書で使用される場合、「対象」は、本明細書に開示される方法または装置から利益を得る可能性のある哺乳動物を指す。対象の例には、ヒトが含まれ、また、馬、豚、牛、犬、猫、ウサギ、および水生哺乳類などの他の動物が含まれても良い。一つの具体的な態様において、対象はヒトである。

【0028】

本明細書で使用される場合、「初期投与レジメン」もしくは「開始用量」または「維持投与レジメン」などの「投与レジメン」または「レジメン」は、本開示の組成物の用量を対象にどのように、いつ、どの程度、およびどのくらいの期間投与することができるかを意味する。例えば、対象に対する初期または開始用量レジメンは、少なくとも１２時間間隔で２回に分けて投与される約１５ｍｃｇ／１ｍＬ～約１５００ｍｃｇ／１ｍＬの１日総用量（例えば、朝食と一緒に１回、夕食と一緒に１回）を提供し、食事を３０日間毎日繰り返しても良い。

【0029】

本明細書で使用される場合、「１日用量」は、２４時間の間に対象に投与される活性剤（例えば、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ）の量を指す。α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログ）を２４時間の期間にわたって対象に投与する。１日用量は、２４時間の間に２回以上投与することができる。一実施形態では、１日用量は、２４時間期間中に２回の投与を提供する。このことを念頭に置いて、「初期投与量」または「初期日用量」は、投与レジメンの初期レジメンまたは期間中に投与される用量を指す。

【0030】

本明細書で使用する場合、薬物の「有効量」または「治療有効量」とは、その薬物が有効であることが知られている状態を治療する際に、治療効果を得るための、無毒であるが十分な量の薬物を指す。様々な生物学的要因が、物質が意図された役割を果たす能力に影響を与えることが理解される。したがって、「有効量」または「治療上有効な量」は、場合によっては、そのような生物学的要因に依存することがある。さらに、治療効果の達成度は、医師または他の資格を有する医療関係者が、当該技術分野で知られる評価を用いて測定することができるが、個人差や治療に対する反応によって、治療効果の達成度はやや主観的な判断になる可能性があることが認識されている。有効量の決定は、薬学および医学の技術分野における通常の技能の範囲内に十分にある。例えば、Ｍｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｔｏｎａｓｃｉａ，"Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃｏｎｄｕｃｔ，ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，"Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ｉｎ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．８（１９８６）、参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0031】

本明細書において、「急性」状態とは、急速に進行し、緊急または準緊急の治療を必要とする明確な症状を有する状態を指す。対照的に、「慢性」状態は、典型的には、発症が遅く、長引くか、さもなければ時間とともに進行する状態を指す。急性状態のいくつかの例は、限定されないが、喘息発作、気管支炎、心臓発作、肺炎などを含むことができる。慢性状態のいくつかの例は、限定されないが、関節炎、糖尿病、高血圧、高コレステロールなどを含むことができる。

【0032】

本明細書で使用する場合、「選択性」とは、グループ内（例えば、細胞群）またはグループ間（例えば、非生細胞群と生細胞群）の差を提供する作用の改変を意味する。例えば、作用は受容体結合であり得、グループは第１の受容体および第２の受容体であり得る。例えば、第２の受容体と比較した第１の受容体の「選択的受容体結合」は、第１の受容体と第２の受容体の間の選択性比の差を提供することができる。一実施例では、選択性比は、１：１比とは異なる。一実施例では、選択性比は、以下、１：１、２：１、３：１：４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、１００：１、およびこれらの組合せのうちの少なくとも１つよりも大きい比であることが可能である。

【0033】

本明細書で使用される「Ｄ－置換アナログ」は、Ｄ－アミノ酸で置換された１つまたはそれ以上のＬ－アミノ酸を有する本明細書に開示されるＲｇＩＡおよびＲｇＩＡ４アナログを含む。Ｄ－アミノ酸は、アナログ配列に見出されるものと同じアミノ酸タイプであり得、または異なるアミノ酸であり得る。したがって、Ｄ－アナログもまた変異体である。

【0034】

本明細書で使用される「変異体」は、１つまたはそれ以上のアミノ酸が非アミノ酸成分で置換された、またはアミノ酸が官能基に結合された、または官能基がアミノ酸に他の方法で結合された、本明細書に開示されるＲｇＩＡアナログを含む。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの共有および非共有結合またはアマルガム）、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、脂肪酸などの脂質部位と結合したアミノ酸、または有機誘導体化剤と結合したアミノ酸などでも良い。修飾アミノ酸の存在は、例えば、（ａ）ポリペプチドの血清半減期および／または機能的インビボ半減期の増加、（ｂ）ポリペプチドの抗原性の低減、（ｃ）ポリペプチドの貯蔵安定性の増加、（ｄ）ペプチドの溶解性の増加、（ｅ）循環時間の延長、および／または（ｆ）バイオアベイラビリティの増加、例えば曲線下の面積（ＡＵＣｓｃ）の増加などに有利となることがある。アミノ酸（複数可）は、例えば、組換え生産中に共翻訳的または翻訳後的に（例えば、哺乳類細胞での発現中にＮ－Ｘ－Ｓ／ＴモチーフでＮ－結合型グリコシル化）、または合成手段によって修飾され得る。修飾されたアミノ酸は、配列内または配列の末端に存在し得る。変異体は、本明細書の他の場所に記載されるような誘導体を含むことができる。

【0035】

本明細書で使用する場合、「Ｉ－３－Ｙ」は３－ヨードチロシンであり、「３－Ｒ－チロシン」および「Ｒ－３－Ｙ」は３－クロロチロシン、３－フルオロチロシン、３－ヨードチロシンおよびチロシンからなる群より選ばれるペプチド残基を示す。

【0036】

本明細書で使用される場合、「Ｃｉｔ」はシトルリンである。

【0037】

本明細書で使用される場合、「ｉＹ」はＬ－３－ヨード－チロシンである。

【0038】

本明細書で使用される場合、「Ｄａｐ」はＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸である。

【0039】

本明細書で使用される場合、「^ｂＡ」および「ｂＡ」は、β－アラニンである。

【0040】

本明細書で使用される場合、「ｂｈＹ」はβ－ホモチロシンである。

【0041】

本明細書で使用される場合、「Ｘａａ」は任意のアミノ酸である。さらに、本書で使用されるように、Ｘａａは、任意のアミノ酸の発現支持を提供する。例えば、Ｘａａは、任意のアミノ酸またはその誘導体に対する発現支持を提供する。例えば、Ｘａａは、以下：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｙまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｙｒまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、セレノシステイン（ＳｅｃまたはＵ）、ピロリシン（ＰｙｌまたはＯ）などまたはその組み合わせの支持を提供する。

【0042】

本明細書で使用される場合、本明細書に開示される「ＲｇＩＡアナログの変異体」または「ＲｇＩＡ－４アナログの変異体」は、本明細書に開示されるＲｇＩＡペプチドまたは本明細書に開示されるＲｇＩＡ－４ペプチドと比較して、１または複数のアミノ酸付加、欠失、または置換を有するペプチドを含む。

【0043】

本明細書に開示される実施形態は、本明細書に記載されるＲｇＩＡアナログ、ならびに本明細書に記載されるＲｇＩＡアナログの変異体、Ｄ－置換アナログ、修飾体、および誘導体を含む。いくつかの実施形態では、変異体、Ｄ－置換アナログ、改変体、および誘導体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の配列付加、欠失、置換、交換、共役、会合、または並べ替えを有する。本明細書に開示される各アナログペプチドは、本明細書に開示されるアナログペプチド配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の位置を含む任意の位置に付加、欠失、置換、交換、共役、会合、または並べ換えを含むこともできる。

【0044】

いくつかの実施形態では、Ｘａａ位は、アナログペプチドの任意の位置に含まれ得、ここで、Ｘａａは、付加、欠失、置換、交換、共役、会合、または並べ替えを表す。特定の実施形態では、各アナログペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のＸａａ位を１つまたは複数の位置で有する。

【0045】

アナログは、１つ以上の変化（付加、欠失、置換、交換、共役、会合、または並べ替え）を有し、変異体、Ｄ－置換アナログ、改変体、および／または誘導体の１つまたはそれ以上として修飾され得る。すなわち、アナログ、変異体、Ｄ－置換アナログ、修飾体および／または誘導体の１つの分類を含むことは、他の分類を含むことを排除するものではなく、本明細書では、すべてを総称して「アナログペプチド」と称する。

【0046】

アミノ酸置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。本明細書に開示されるＲｇＩＡアナログの変異体は、１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換を有するものを含み得る。本明細書で使用されるように、「保存的置換」は、以下の保存的置換群：グループ１：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；グループ２：アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グループ３：アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グループ４：アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；グループ５：イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）；およびグループ６：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）の１つに見出される置換を含む。

【0047】

さらに、アミノ酸は、類似の機能、化学構造、または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）によって保存的置換基群にグループ化することが可能である。例えば、脂肪族グループには、置換の目的で、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅが含まれ得る。互いの保存的置換とみなされるアミノ酸を含む他のグループには、以下、含硫：ＭｅｔおよびＣｙｓ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性のある残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；極性で負に帯電した残基とそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；極性のある正電荷の残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、および大型の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐが含まれる。その他の情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに記載される。

【0048】

本明細書で使用する「正アミノ酸」は、タンパク質生成陽性アミノ酸であるＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、および非タンパク質原性の正アミノ酸を含む。

【0049】

本明細書で使用する「芳香族アミノ酸」は、タンパク質原性の芳香族アミノ酸であるＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ、ならびに非タンパク質原性の芳香族アミノ酸を含む。

【0050】

本明細書に開示または参照されるＲｇＩＡアナログまたはＲｇＩＡ－４アナログの変異体は、本明細書に開示または参照されるペプチド配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列も含まれる。より詳細には、本明細書に開示されるＲｇＩＡアナログまたはＲｇＩＡ－４アナログの変異体は、以下のものを共有するペプチドを含む：配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと７０％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと８０％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと８１％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと８２％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと８３％の配列同一性；配列ＩＤ番号のいずれかと８４％の配列同一性；配列ＩＤ番号のいずれかと８０％の配列同一性；配列ＩＤ番号のいずれかと８４％の配列同一性；１～１３のいずれかと８５％配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと８６％配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと８７％配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと８８％配列同一性；配列ＩＤ番号のいずれかと８９％配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと９０％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと９１％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと９２％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと９３％の配列同一性；配列ＩＤ番号のいずれかと９４％の配列同一性；配列ＩＤ番号：配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと９５％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと９６％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１－１３のいずれかと９７％の配列同一性；配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと９８％の配列同一性；または配列ＩＤ番号：１～１３のいずれかと９９％の配列同一性を示す。

【0051】

合成鎮痛ペプチドのＣ－末端は、カルボン酸またはアミド基であっても良い。本開示はまた、（ｉ）チロシン、３－ヨードチロシン、蛍光タグ、脂質、炭水化物、またはβ－ホモアミノ酸、Ｄ／Ｌ－スルホノ－γ－ＡＡペプチド、Ｌ－γ－ＡＡペプチドなどのＣ末端になされる付加、および／または（ｉｉ）チロシン、３－ヨードチロシン、ピログルタミン酸、蛍光タグ、脂質、炭水化物、またはβ－ホモアミノ酸などのＮ－末端になされる付加によってさらに修飾されたＲｇＩＡアナログにも関連する。

【0052】

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、ペプチドをコードする核酸配列を指す。この定義には、様々な配列の多型、変異、および／または配列の変異体が含まれるが、そのような変化がコードされたペプチドの機能に影響を与えないことが条件である。「遺伝子」という用語は、コード化配列のみならず、プロモーター、エンハンサー、終止領域などの制御領域も含むことができる。「遺伝子」はさらに、すべてのイントロンおよびｍＲＮＡ転写物からスプライシングされる他のＤＮＡ配列、ならびに代替スプライス部位から生じる変異体を含むことができる。ペプチドをコードする核酸配列は、ペプチドの発現を指示するＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。これらの核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖の配列であってもよいし、タンパク質に翻訳されるＲＮＡの配列であっても良い。核酸配列には、全長核酸配列の他、全長タンパク質に由来する非全長配列も含まれる。配列はまた、ネイティブ配列の縮退コドン、または特定の細胞型におけるコドン優先性を提供するために導入され得る配列を含み得る。本明細書に開示されるペプチドをコードするための遺伝子配列は、公開されたデータベースおよび出版物で入手可能である。

【0053】

本明細書で使用されるように、特定のアミノ酸の言及はまた、特定のアミノ酸、およびその任意のアナログ、バリアント、Ｄ－置換アナログ、修飾体および／または誘導体に対する支持を含む。一実施例において、チロシンの暗唱は、３－クロロ－チロシン、３－フルオロ－チロシン、３－ヨード－チロシン、チロシン、オルト－チロシン、３－ニトロ－チロシン、３－アミノ－チロシン、Ｏ－メチル－チロシン、２，６－ジメチル－チロシン、ベータホモ－チロシン、ＢＣｏ－Ｔｙｒ（３，５－Ｉ_２）－ＯＳｕ、［ＣｐＲｕ（ＦｍＣｏ－チロシン）］ＣＦ_３Ｃｏ_２、Ｏ－（２－ニトロベンジル）－Ｌ－チロシン塩酸塩、３－ニトロ－Ｌ－チロシンエチルエステル塩酸塩、Ｎ－（２，２，２－トリフルオロメチル）－Ｌ－チロシンエチルエステル、ＤＬ－オチロシン等またはその組み合わせに関する支持も明示的に含む。一実施例において、システインの復唱は、システイン、Ｌ－システイン酸一水和物、Ｌ－システインスルフィン酸一水和物、セレノ－Ｌ－シスチン、等、またはこれらの組み合わせの支持も明示的に含む。一実施例において、リジンの記載は、ＦｍＣｏ－Ｌｙｓ（Ｍｅ，ＢＣｏ）－ＯＨ、ＦｍＣｏ－Ｌｙｓ（Ｍｅ）_３－ＯＨ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＦｍＣｏ－Ｌｙｓ（ＮｖＣｏ）－ＯＨ、ＦｍＣｏ－Ｌｙｓ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）－ＯＨ、ＦｍＣｏ－Ｌ－光リジン、ＤＬ－５－ヒドロキシリシン塩酸塩、Ｈ－Ｌ－光－リジンＨＣｌ、またはそれらの組み合わせに対する支持も明示的に含む。

【0054】

本開示において、「含む（Ｃｏｐｍｒｉｓｅ）」、「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに付与される意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し、一般にオープンエンド用語であると解釈される。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語は、閉じた用語であり、かかる用語と関連して具体的に列挙された構成要素、構造、工程等のみを含むとともに、米国特許法に従ったものである。「実質的にからなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「実質的にからなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、米国特許法によって一般的に付与される意味を有する。特に、このような用語は一般に閉じた用語であり、それに関連して使用される項目の基本的かつ新規な特性または機能に重大な影響を与えない追加の項目、材料、構成要素、工程、または要素を含めることを許可するという例外がある。例えば、組成物中に存在するが、組成物の性質または特性に影響を与えない微量元素は、そのような用語に続く項目のリストに明示的に記載されていなくても、「実質的にからなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語の下で存在すれば許容されるだろう。記述において「を含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のようなオープンエンド用語を使用する場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と同じように「実質的にからなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」言語にも、明示的に記載されているかのように直接的な支持が与えられるべきであることが理解され、その逆もまた然りである。

【0055】

本明細書および特許請求の範囲における「第１」、「第２」、「第３」、「第４」などの用語は、類似の要素間を区別するために使用され、必ずしも特定の連続的または時系列的順序を説明するために使用されるものではない。そのように使用される任意の用語は、本明細書に記載される実施形態が、例えば、本明細書に図示またはその他の方法で記載されるもの以外の順序で動作可能であるような適切な状況下で交換可能であることが理解されるものとする。同様に、方法が一連の工程を含むものとして本明細書に記載される場合、本明細書に提示されるそのような工程の順序は、そのような工程が実行され得る唯一の順序であるとは限らず、記載された工程のうちのあるものはおそらく省略され得る、および／または本明細書に記載されていない他のある工程はおそらくその方法に追加され得る。

【0056】

本明細書で使用される場合、「増加」、「減少」、「より良い」、「より悪い」、「より高い」、「より低い」、「強化」、「改善」、「最大化」、「最小化」などの比較用語は、他の装置と測定可能に異なる装置、コンポーネント、組成、生物学的反応、生物学的状態、または活動の性質を意味し、周辺または隣接領域にある、類似する、単一の装置または組成物にある、または複数の比較可能な装置または組成物にある、グループまたはクラスにある、複数のグループまたはクラスにある、または元の（例えば未処理）またはベースラインと比較される、他の装置、コンポーネント、組成物、生物学的反応、生物学的状態、または活動から測定可能に異なる、装置、コンポーネント、組成物、生物学的反応、生物学的状態、または活動の特性を指す。例えば、神経痛の軽減において「改善された」性能を有するα－ＲｇＩＡ４アナログは、他のものと比較して、安定性、結合効力、効力、または他の性能関連特性の少なくとも１つの側面に関して改善を提示するだろうα－ＲｇＩＡ４アナログ。

【0057】

本明細書で使用されるように、複数のアイテム、構造要素、構成要素、および／または材料は、便宜上、共通のリストで示されることがある。しかしながら、これらのリストは、リストの各メンバーが個別にユニークなメンバーとして識別されるかのように解釈されるべきである。したがって、そのようなリストの個々のメンバーは、反対の指示なしに、共通のグループにおけるそれらの提示にのみ基づいて、同じリストの他のメンバーの事実上の同等物と解釈されるべきではない。

【0058】

本明細書で使用される場合、用語「少なくとも１つの」は、「１つ以上の」と同義であることが意図される。例えば、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、またはそれぞれの組合せを明示的に含む。

【0059】

濃度、量、レベルおよび他の数値データは、本明細書において範囲形式で表現または提示されることがある。このような範囲形式は、単に便宜上および簡潔さのために使用され、したがって、範囲の限界として明示的に唱えられた数値のみならず、各数値および小範囲が明示的に唱えられたかのようにその範囲内に包含される全ての個々の数値または小範囲または小数単位も含むように柔軟に解釈されるべきであることが理解されよう。例として、「約１～約５」の数値範囲は、約１～約５の明示的な値だけでなく、示された範囲内の個々の値およびサブレンジも含むと解釈されるべきである。したがって、この数値範囲に含まれるのは、１、２、３、４、および５と同様に、２、３、および４などの個々の値および１～３、２～４、および３～５などの下位範囲である。また、最小値、最大値として１つの数値のみを記載した範囲についても同様とする。さらに、このような解釈は、範囲の広さや記述される特性に関係なく適用されるべきである。

【0060】

方法またはプロセスの請求項に記載された工程は、任意の順序で実行することができ、請求項に示された順序に限定されるものではない。手段プラス機能または工程プラス機能の限定は、特定の請求項の限定について、以下の条件：ａ）「のための手段」または「のための工程」が明示的に記載されている、およびｂ）対応する機能が明示的に記載されていることのすべてがその限定に存在する場合にのみ採用される。手段プラス機能をサポートする構造、材料または行為は、本明細書において明示的に記載される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載された説明および実施例によってではなく、添付の請求項およびその法的同等物によってのみ決定されるべきである。

【0061】

本明細書で使用される「結合」という用語は、化学的、機械的、電気的または非電気的な方法で直接または間接的に接続されることと定義される。本明細書において互いに「隣接」していると説明される物体は、フレーズが使用される文脈に適切なように、互いに物理的に接触しているか、互いに近接しているか、または互いに同じ一般領域若しくは区域に存在することができる。

【0062】

本明細書における「一実施形態において」または「一態様において」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態または態様を指すわけではない。本明細書を通じての「一実施例」への言及は、例に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の様々な場所での「実施例において」という表現の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではない。

【0063】

具体的な実施形態例
開示の実施形態の最初の概要を以下に提供し、その後、特定の実施形態をさらに詳細に説明する。この初期の概要は、読者が技術的概念をより迅速に理解するのを助けることを意図しているが、その重要なまたは必須の特徴を特定することを意図しておらず、また請求された主題の範囲を制限することを意図していない。

【0064】

コノトキシン（ＣＴｘｓ）は、海産捕食性巻き貝の毒に由来し、その高い効力と神経障害性疼痛に関与するイオンチャネルに対する選択性から、非オピオイド鎮痛剤の有望な候補である。ω－コノトキシンＭＶＩＩＡ（別名：ジコノトイド（Ｐｒｉａｌｔ（登録商標））は電圧依存性カルシウムチャネル亜型（Ｃａ_ｖ２．２）を選択的に標的とし、２００４年に米国ＦＤＡにより承認されて、難治性の慢性疼痛の治療に臨床で使用される。

【0065】

ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲｓ）は、末梢神経系と中枢神経系に分布する膜貫通型のリガンド依存性陽イオンチャネルで、シナプス伝達を高速に行い、神経障害性疼痛、パーキンソン病、統合失調症、アルコール、薬物中毒などの神経系疾患に広く関与している。ｎＡＣｈＲは、α、β、γ、δ、εなどの異なるサブユニットが、ホモあるいはヘテロ５量体の受容体内で様々な組み合わせで結合しており、薬理学的および生物物理学的に異なる機能を持つ複雑なｎＡＣｈＲサブタイプを形成している。ｎＡＣｈＲは、これまでにも鎮痛薬の創薬ターゲットとして用いられてきたが、治療域の狭さや無差別なサブタイプ標的に起因する副作用が、創薬活動の妨げとなっていた。

【0066】

最近の研究では、化学療法誘発性神経障害性疼痛に対する非オピオイドベースのメカニズムとして、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブタイプの阻害が同定される。α９α １０ｎＡＣｈＲ拮抗薬のうち、親配列α－ＲｇＩＡから改変された第二世代アナログα－ＲｇＩＡ４は、「種による親和性のギャップ」を乗り越え、他のサブタイプや他の疼痛関連受容体を阻害することなく（例えば、選択性>１０００倍）ネズミ（ＩＣ_５００．９ｎＭ）とヒトα９α１０ ｎＡＣｈＲ（ＩＣ_５０１．５ｎＭ）の両方に高活性を発揮することが分かっている。したがって、α－ＲｇＩＡ４は、非オピオイド鎮痛薬開発のリード化合物としての可能性を持つ。

【0067】

しかしながら、他のジスルフィドに富むペプチド医薬品分子と同様に、α－ＲｇＩＡ４はプロテアーゼ耐性が低く、血漿中半減期が短いため、候補としては不向きである。これは、チオール／ジスルフィド交換反応によって誘発されるジスルフィドスクランブルによって引き起こされ、図１ｂ－Ａに示すように、活性コンフォメーションと不活性コンフォメーションの間の熱力学的安定性の限界の差によって、コンフォメーション変化と効力の大幅な喪失を引き起こす。構造的には、ＣＴｘｓは高度に保存されたシステインフレームワークに依存し、受容体認識、効力、および選択性に重要な剛構造を維持している。残念ながら、他のジスルフィドに富んだペプチドと同様に、ＲｇＩＡ４は還元的な生理的環境においてジスルフィドスクランブルの影響を受けやすく、三次元構造の変化、凝集、治療効果の低下、免疫原性の副作用の増大を招くことがある。

【0068】

ジスルフィド擬態化合物は、この問題に対処し、さらなる臨床開発のために生物学的利用能のある化合物を作り出すことを試みている。しかし、ジスルフィド擬態化合物は、構造的な障害を引き起こす可能性があり、その結果、効能が損なわれる。例えば、ネイティブなジスルフィドの代わりに非還元性のジカルバブリッジを有するα－ＲｇＩＡアナログは、ジスルフィドスクランブリングを受けないが、ネイティブペプチドと比較して著しく（すなわち、２桁の大きさで）効力が減少している。「ヘッド・トゥ・テール」骨格の環化は、柔軟な末端プロテアーゼ認識領域を隠すことによってＣＴｘｓを安定化するための別の方法として試みられてきた。例えば、ｃＲｇＩＡ－６は、他の骨格環化アナログとともに、血清安定性の増加を示したが、この安定性の増加は、ヒトα９α１０ ｎＡＣｈＲに対する効力の減少をもたらした。

【0069】

ジカルバ、飽和ジカルバ、アルキン、チオエーテル、エーテル、ジセレニド（Ｓｅｃ）、およびトリアゾールブリッジ置換を含む戦略は、図７ａ～Ｃに示すように、ＣＴｘｓ改変において試みられている。しかしながら、そのような戦略は、模倣部分の非適合性、生物活性の低下、および毒性のために、広い適用性を欠く。ヘッド－テール骨格環化は、分解の防止を通じてペプチドの安定性を高めるための別の戦略であるが、ＲｇＩＡを適用した場合、α９α１０ｎ ＡＣｈＲ結合親和性の効力低下をもたらす。

【0070】

一実施形態では、α－ＲｇＩＡに導入されたラクタム結合は、活性球状コンフォメーションの劣化を防ぎ、ジスルフィドスクランブルを抑制することができる。大環状ペプチドのＮＭＲ構造はα－ＲｇＩＡ４の構造とよく重なり、環状化によって骨格や側鎖残基の全体的なコンフォメーションが乱されないことが実証された。最後に、分子ドッキングモデルによって、大環状アナログとα９α １０ニコチン性アセチルコリン受容体の間の選択的な結合を合理化することができる。インビボ試験は、進行中で議論されるアナログ６が、化学療法によって誘発された神経障害性疼痛モデルにおいて疼痛を防止できることを示す。構造的に、導入されたラクタム結合は、生物活性コンフォメーションを硬直化させ、ジスルフィドスクランブルを抑制し、ヒト血清安定性の増加を提供するための追加のコンフォメーション拘束を提供することができる。このような構造的制約のあるアンタゴニストは、抗侵害受容治療への介入を可能にする有望な候補である。

【0071】

別の実施形態では、ＲｇＩＡアナログは、非オピオイド鎮痛剤としてヒトα９α１０ ｎＡＣｈＲを標的とするために、ジスルフィド代用体であるメチレンチオアセタールで安定化することが可能である。ＲｇＩＡ骨格のジスルフィドループＩ［Ｃｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ］をメチレンチオアセタールに置き換えることは、大幅な効力損失をもたらすが、ループＩＩ［Ｃｙｓ^ＩＩ－Ｃｙｓ^ＩＶ］をメチレンチオアセタールで橋渡しすることは、アナログの生物活性を維持するために必要な対応と考えられる。分子であるＲｇＩＡ－５５２４は、ヒトα９α１０ ｎＡＣｈＲｓに対して０．９ｎＭのＩＣ_５０と高い選択的阻害を示す。さらに、ＲｇＩＡ－５５２４はＲｇＩＡ４よりもヒト血清中での分解抵抗性が大幅に向上していた。マウスを用いたインビボ試験では、ＲｇＩＡ－５５２４は化学療法誘発の神経障害性疼痛を緩和することが示された。α９ノックアウトマウスでは、ＲｇＩＡ－５５２４は神経因性疼痛を緩和することができず、α９含有ｎＡＣｈＲがＲｇＩＡ－５５２４の治療効果に利用されていることが明らかとなった。このように、メチレンチオアセタールは、コノトキシンやその他のジスルフィドを多く含むペプチド創薬におけるジスルフィド代替物として応用することが可能である。

【0072】

α－ＣＴｘｓの治療的作用機序に関して進行中の論争があり、多くの研究がＧＡＢＡ_Ｂ受容体の刺激が用いられると主張する一方で、他の研究はα９ ｎＡＣｈＲのブロックアデが用いられると指摘している。本明細書に開示される研究は、野生型およびノックアウト（ＫＯ）マウスが、選択的α９α １０ｎＡＣｈＲアンタゴニストが鎮痛性であることのみならず、α９－ｎＡＣｈＲサブユニットの存在が鎮痛活性に用いられることを実証していることを示す。

【0073】

一実施形態においてα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、ニコチン性アセチルコリン受容体に結合するように構成された認識フィンガー領域と、システイン間硫黄結合を保護する側鎖結合構成とを含むことができる。α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体と、システイン間硫黄結合を保護する側鎖結合構成とを含むことができる。このアナログは、少なくともα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％であるα９αニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有し得る。

【0074】

別の実施形態ではα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、保護されたシステイン間硫黄結合によって維持される構造（例えば、球状）を有することができる。この構造（例えば、球状）は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％であるα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体の結合親和性を提供し得る。

【0075】

さらに別の実施形態ではα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、Ｄ Ｐ Ｒ、およびＣ^Ｉ、Ｃ^ＩＩ、Ｃ^ＩＩＩ、およびＣ^ＩＶを含むシスチン残基を含むことができる。システイン残基Ｃ^ＩおよびＣ^ＩＩＩは、第１のシステイン間硫黄結合により連結することができ、システイン残基Ｃ^ＩＩおよびＣ^ＩＶは、第２のシステイン間硫黄結合により連結することができる。第２のシステイン間硫黄結合は、側鎖結合構成によって保護され得る。

【0076】

別の実施態様では、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対するα－ＲｇＩＡ４効能を維持する方法であって、α－ＲｇＩＡ４アナログの認識指領域をα－ＲｇＩＡ４構成に維持する側鎖結合構成でシステイン間硫黄結合を保護することを含むことができる。α－ＲｇＩＡ４配置（例えば、球状α－ＲｇＩＡ４構成）。

【0077】

より多くの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のアナログと薬学的に許容される担体との組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、対象において、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に応答する状態を治療するための方法は、治療有効量の組成物を対象に投与する工程を含み得る。

【0078】

α－ＲｇＩＡ４のアナログ
側鎖の環化は、適用され得るペプチド安定化方法の１つである。例えば、図１ｂ－Ｂに示すように、結合活性を保持しながらα－ＲｇＩＡアナログの活性コンフォメーションを硬直させるために、側鎖環化によって末端に第３の環化ブリッジを挿入することができる。高い効力、受容体選択性、および強化された血清安定性を有するコンフォメーション的に拘束されたα－ＲｇＩＡアナログは、ヒトα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体を標的にすることができる。本明細書に開示されるアナログ６は、α－ＲｇＩＡに導入されたラクタム結合が、活性球状コンフォメーションの分解を防ぎ、ジスルフィドスクランブルを抑制できることを実証する。

【0079】

別の安定化方法として、ジスルフィドに最小限の機能的炭素単位（ＣＨ_２）を挿入することで、還元できないメチレンチオアセタールは効率的なジスルフィド代替物となり得る。ジスルフィドをメチレンチオアセタールに置き換えることで、ＲｇＩＡアナログの球状活性コンフォメーションを安定化させることができる。一実施例において、ＲｇＩＡ－５５２４は、他の疼痛関連イオンチャネルおよび受容体と比較して、高い選択性を有するヒトα９α１０ｎＡＣｈＲ上で高い効力（例えば、ＩＣ_５０＝０．９ｎＭ）を示した。

【0080】

一実施形態においてα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、ニコチン性アセチルコリン受容体に結合するように構成された認識フィンガー領域と、システイン間硫黄結合を保護する側鎖結合構成とを含むことができる。このアナログは、少なくともα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％であるα９αニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有し得る。別の実施形態ではα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、保護されたシステイン間硫黄結合によって維持される構造（例えば、球状）を有し得る。この構造（例えば、球状）は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％であるα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体の結合親和性を提供し得る。

【0081】

認識フィンガー領域は、図６ａでモデル化されているように、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体、および図７ａ－Ｂでモデル化されるようなα９サブユニットに結合するよう構成し得る。

結合が起こるようにするために、認識フィンガー領域の構造は維持される必要がある。認識フィンガー領域の構造を維持する（したがって、認識フィンガー領域の結合親和性を維持する）１つの方法には、配列順に、Ｃ^Ｉ、Ｃ^ＩＩ、Ｃ^ＩＩＩ、およびＣ^ＩＶと番号付けされ得る、αＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおいて見出される４つのシステイン残基の間のシステイン間結合を保護することを含み得る。これらは配列順に、Ｃ^Ｉ、Ｃ^ＩＩ、Ｃ^ＩＩＩ、およびＣ^ＩＶと番号付けされ得る。

【0082】

システイン間硫黄結合には、各システイン上の硫黄間の直接側鎖結合（例えば、Ｃ^ＩＩ上の硫黄は、Ｃ^ＩＶ上の硫黄に結合できる）または各システイン上の硫黄間の間接結合（例えば、Ｃ^ＩＩ上の硫黄は、炭素などの中間体を介してＣ^ＩＶ上の硫黄に結合できる）などを含めることができる。

【0083】

一実施形態において、システイン間硫黄結合は、側鎖結合構成によって保護され得る。一態様において、側鎖結合構成は、メチレンチオアセタール、ラクタムブリッジを有するＣ末端アミノ酸側鎖に環化されているＮ末端アミノ酸側鎖、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上を含むことが可能である。

【0084】

側鎖結合構成がメチレンチオアセタールである場合、側鎖結合構成は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログにおけるＣ^ＩＩとＣ^ＩＶの間のシステイン間結合を構成することができる。側鎖結合構成（例えば、メチレンチオアセタール）をこの位置に配置すると、α－ＲｇＩＡ４ペプチドと比較してα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に関してアナログの効力を低下させることなく、アナログを球状の活性コンフォメーションで安定化させることができる。一方、側鎖結合構成（例えば、メチレンチオアセタール）をＣ^ＩとＣ^ＩＩＩの間のシステイン間結合として位置づけることは、α－ＲｇＩＡ４ペプチドと比較してα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する増強効果をもたらさない。

【0085】

多くのアナログ（例えば、アナログ１～６）は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの球状コンフォメーションを維持したままであった。しかしながら、あまり強力でないＲｇＩＡ－５６１７と、より強力なアナログ（ＲｇＩＡ４、ＲｇＩＡ－５５３３、および５５２４）の間の１つの違いは、システイン対のＣα距離であった。ＲｇＩＡ－５６１７の２つのシステイン対のＣα距離は共に、ＲｇＩＡ４、ＲｇＩＡ－５５３３、およびＲｇＩＡ－５５２４を含む他の活性分子（例えば、平均５．４～６．１Å）に比べて短くなった（例えば、システインループＩおよびループＩＩにおいてそれぞれ平均４．８および４．７Åであった）。一実施例において、ループ－Ｉ（例えば、ｃｙｓ^Ｉ－ｃｙｓ^ＩＩＩ）におけるメチレンチオアセタール置換から生じる効力損失は、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体への結合親和性を低下させ得るニコチン結合親和性を低下させ得る構造的縮小を引き起こし得る。別の実施例において、α－ＣＴｘのループ－Ｉジスルフィドは、α９（＋）表面のＣループジスルフィドに直接接触することによって、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対してスタッキング相互作用を与えることができる。したがって、このループのメチレンチオアセタール置換は、この結合部位を阻害することによって、より強力なアナログと比較して効力の低下を引き起こす可能性がある。

【0086】

側鎖結合構成が、ラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化されるＮ末端アミノ酸側鎖である場合、Ｎ末端アミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択することができ、Ｃ末端アミノ酸は、リジン、ホモリジン、オルニチン、Ｌ－２，４－ジアミノ酪酸、およびＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸からなる群から選択することができる。別の実施例において、Ｃ末端アミノ酸は、リジンおよびＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸からなる群から選択され得る。一実施例において、Ｎ－末端アミノ酸はグルタミン酸であり、Ｃ－末端アミノ酸はリジンであり得る。

【0087】

このような側鎖の結合配置により、α－ＲｇＩＡ４ペプチドと比較した場合、それぞれのｔｈｅα－ＲｇＩＡ４アナログは、ニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を高めることができる。例えば、アナログは、１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有することができる。
２．５％、５％、７．５％、１５％、２５％、４０％、５０％、８０％の少なくとも１つまたはそれ以上であるα９αニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有し得、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのニコチン性アセチルアルコールに対する結合親和性α９αニコチン性アセチルコリン受容体に対するα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性と実質的に等しくても良い。さらに、アナログは、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対するα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性よりも大きいα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有しても良い。

【0088】

この側鎖の結合配置は、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する高い結合親和性を有するα－ＲｇＩＡ４アナログを供給するだけでなく、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの効力と比較して、効力の増加を提供し得る。一実施例において、アナログは、以下のものを提供することができる。α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値と実質的に等しい。α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣの値と実質的に等しい値を提供することができる。５０α－ＲｇＩＡ４ペプチドの１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ値と実質的に等しい値を提供することができる。別の例では、アナログは、以下の値：２．０ｘ、３．０ｘ、５．０ｘ、１５．０ｘ、２５．０ｘ少なくとも１つまたはそれ以上より大きくないα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値のα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値を提供し得る。ＩＣ_５０値は、値が低いほど低濃度で５０％阻害の閾値を達成できることを示すため、値が低いほど高活性を有する。

【0089】

一態様において、保護されたシステイン間結合は、Ｃ^ＩとＣ^ＩＩＩ、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶ、またはそれらの組み合わせの間のシステイン間結合（例えば、側鎖結合）の１つまたはそれ以上であることができる。保護されたシステイン間結合（側鎖結合構成によって保護され得る）は、α－ＲｇＩＡ４ペプチド、または保護されたシステイン間硫黄結合を有しないα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログと比較して、ジスルフィド橋のスクランブル、ジスルフィド橋の分解、またはそれらの組み合わせを低減することができる。ジスルフィドブリッジスクランブリングは、ペプチド中のジスルフィドブリッジが分解され、その後異なる配置で再形成される場合に起こり得る。例えば、第一の構成ではα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、Ｃ^ＩとＣ^ＩＩＩの間に第１のジスルフィド橋、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶの間に第２のジスルフィド橋を有することができる。スクランブル後、Ｃ^ＩとＣ^ＩＶの間に第１のジスルフィド橋、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＩＩの間に第２のジスルフィド橋が存在しうる。ディスルフィド橋スクランブルによりペプチドが構造変化し、目的のペプチド機能（例えば、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体の阻害）が妨げられうる可能性がある。ジスルフィド橋の分解は、ジスルフィド橋が再形成されずに分解される場合に起こり得る。この分解はまた、所望のペプチド機能を阻害し得るペプチドの構造変化をもたらすことがある。

【0090】

側鎖結合構成はまた、システイン間硫黄結合を保護し、ヒト血清中のα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性より大きいα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中における安定性を提供する。１つの態様において、ヒト血清中の安定性は、０．１ｍｇ／ｍＬのインキュベーション後に残存するペプチドまたはペプチドアナログの量によって測定され、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログまたはα－ＲｇＩＡ４ペプチドを９０％ヒト血清ＡＢ型に入れ、３７℃で１、２、４、８、または２４時間のうちの少なくとも１つでインキュベートした後に残存するペプチドまたはペプチドアナログの量によって測定される。

【0091】

いくつかの実施例において、ヒト血清中におけるα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性の１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００％のうちの少なくとも１つまたはそれ以上より大きくても良い。別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中における安定性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのヒト血清中における安定性より少なくとも５０倍大きくし得る。別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中における安定性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性の少なくとも１０倍大きくし得る。別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中における安定性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのヒト血清中における安定性の少なくとも２倍であることが可能である。

【0092】

α－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性と比較してα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの安定性は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）において測定することができる。一実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、還元型グルタチオン中のα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性よりも大きい還元型グルタチオン中のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの安定性を提供し得る。いくつかの実施例において、還元型グルタチオン中の安定性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログまたはα－ＲｇＩＡ４ペプチドを０．１ｍｇ／ｍＬインキュベートした後に残存する量、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドを１０等量の還元型グルタチオンとともにｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３７℃で１、２、４、８または２４時間のうち少なくとも１時間インキュベートした後に残存する量によって測定される。

【0093】

いくつかの実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのＧＳＨでの安定性は、ＧＳＨにおけるα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性と比較して、１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％の少なくとも１つまたはそれ以上よりも大きくすることができる。別の実施例において、ＧＳＨ中でのα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのＧＳＨにおける安定性は、ＧＳＨにおけるα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性の少なくとも５０倍大きくすることができる。別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのＧＳＨにおける安定性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのＧＳＨにおける安定性の少なくとも１０倍大きくすることができる。

【0094】

α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対するα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの選択性は、ニコチン性アセチルコリン受容体のα－ＲｇＩＡ４ペプチドの選択性と比較することができる。一実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、α９αと実質的に等しい１０ニコチン性アセチルコリン受容体選択性と実質的に等しいα９αニコチン性アセチルコリン受容体の選択性を提供することができる。別の実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、異なるニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブタイプの選択性と比較して、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する少なくとも１００倍以上の選択性を提供することができる。異なるｎＡＣｈＲサブタイプは、α１β１δε、α２β２、α２β４、α３β２、α３β４α４β２、α４β４、α６／α３β２β３、α６／α３β４、またはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。

【0095】

α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの安全性プロファイルもまた、安全性プロファイルを有することができる。一態様において、保護されたシステイン間硫黄結合は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの安全性プロファイルと実質的に等しいか、またはそれよりも大きい安全性プロファイルを提供することができる。安全性プロファイルは、以下の１つ以上によって測定することができる：１００μＭの濃度で存在するアナログは自動化ホールセルパッチクランプアッセイから測定したヒトエーテル－ア－ゴー－ゴー－関連遺伝子（ｈＥＲＧ）Ｋ^＋チャネルの２５％未満を阻害するか、または１００μＭの濃度で存在するアナログは、モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ）アッセイによって測定される約２０％未満の阻害活性を有するか、または１０μＭの濃度で存在するアナログは、ＣＹＰアッセイで測定して２０％未満の阻害活性を有する。

【0096】

本明細書に開示される側鎖結合構成（例えば、メチレンアセタールの包含、またはラクタムブリッジを介した側鎖の連結）は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの様々な側面を強化することができる。例えば、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの血清半減期は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの血清半減期と比較した場合より長い。別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの循環時間は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの循環時間と比較した場合よりも長い。α－ＲｇＩＡ４ペプチドの循環時間と比較して、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの循環時間は増強され得る。別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの経口および／または頬への吸収はα－ＲｇＩＡ４ペプチドの経口および／または頬への吸収と比較した場合より増強される。別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのＡＵＣによって測定されるバイオアベイラビリティは、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのＡＵＣによって測定されるバイオアベイラビリティと比較した場合より増強され得る。別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの免疫原性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの免疫原性と比較した場合より向上し得る。

【0097】

別の例では、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの貯蔵安定性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの保存安定性と比較した場合と比べて向上し得る。一実施例において、貯蔵安定性は、周囲湿度および温度において選択された貯蔵時間だけ貯蔵した場合に測定することができる。いくつかの実施態様において、１日、１週間、２週間、４週間、３ヶ月、６ヶ月、１年、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれ以上を超える保存時間を測定して、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログとα－ＲｇＩＡ４ペプチドとの間の安定性の向上を比較するために測定することができる。

【0098】

さらに別の実施形態ではα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、Ｄ Ｐ Ｒ；およびＣ^Ｉ、Ｃ^ＩＩ、Ｃ^ＩＩＩ、およびＣ^ＩＶを含むシスチン残基を含むことができる。システイン残基Ｃ^ＩおよびＣ^ＩＩＩは、第１のシステイン間硫黄結合により連結することができ、システイン残基Ｃ^ＩＩおよびＣ^ＩＶは、第２のシステイン間硫黄結合により連結することができる。第２のシステイン間硫黄結合は、側鎖結合構成によって保護され得る。一態様において、第２のシステイン間硫黄結合は、メチレンチオアセタール、Ｎ末端アミノ酸側鎖がラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化されるか、またはその組み合わせを含み得る。

【0099】

一態様において、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む場合、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６を含み、Ｘａａ_１－６はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0100】

一実施例において、アナログがアミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６を含み、次に、Ｘａａ_１は、Ｃ以外の任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸であり得、Ｘａａ_２は、Ｃ以外の任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸であり得、Ｘａａ_３は、（Ｃｉｔ）または任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の正アミノ酸からなる群から選択されるメンバーであり得、Ｘａａ_４は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり得、Ｘａａ_５は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の正アミノ酸であり得、およびＸａａ_６は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり得る。

【0101】

別の態様において、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む場合、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７を含み、Ｘａａ_１－７はＣ以外の任意のアミノ酸であり得る。

【0102】

別の実施例において、アナログがアミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７を含み、次に、Ｘａａ_１はＣ以外の任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸であり得、Ｘａａ_２はＣ以外の任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸であり得、Ｘａａ_３は（Ｃｉｔ）または任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の正アミノ酸からなる群から選択されるメンバーであり得、Ｘａａ_４は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり得、Ｘａａ_５は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の正アミノ酸であり得、Ｘａａ_６は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり得、およびＸａａ_７はＣ以外の任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸であり得る。

【0103】

別の態様において、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む場合、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６を含み、ここでＸａａ_１はＧ、Ｘａａ_２はＴ、Ｘａａ_５はＱ、Ｘａａ_{３、４、または６}はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0104】

別の態様において、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む場合、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６を含み得るが、ここで、Ｘａａ_３は、（Ｃｉｔ）およびＲからなる群より選択されるメンバーであり、Ｘａａ_４は、（ｉＹ）およびＹからなる群より選択されるメンバーであり、Ｘａａ_６は、（ｂｈＹ）、Ｙ、およびｂＡからなる群より選択されるメンバーである。

【0105】

別の態様において、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む場合、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）（ｉＹ）Ｑ Ｃ Ｙ（配列ＩＤ番号：１０）を含み得、ここで、Ｘａａ_３は（Ｃｉｔ）であり、Ｘａａ_４は（ｉＹ）であり、Ｘａａ_６はＹである。

【0106】

別の態様において、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む場合、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７を含み得、ここでＸａａ_１はＧ、Ｘａａ_２はＴ、Ｘａａ_５はＱ、Ｘａａ_{３、４、６、または７}はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0107】

別の態様において、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む場合、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７を含み得る、ここでＸａａ_３は（Ｃｉｔ）およびＲからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_４は（ｉＹ）およびＹからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_６は（ｂｈＹ）、Ｙ、およびｂＡからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_７は、Ｒである。

【0108】

別の態様において、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む場合、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｒ（ｉＹ）Ｑ Ｃ（ｂｈＹ）Ｒ（配列ＩＤ番号：１２）を含み得、ここで、Ｘａａ_３はＲであり、Ｘａａ_４は（ｉＹ）であり、Ｘａａ_６は（ｂｈＹ）である。

【0109】

別の態様において、第２のシステイン間硫黄結合がメチレンチオアセタールを含む場合、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｒ（ｉＹ）ＱＣ（ｂＡ）Ｒ（配列ＩＤ番号：１３）を含み得、ここで、Ｘａａ_３はＲであり、Ｘａａ_４は（ｉＹ）であり、Ｘａａ_６は（ｂＡ）である。

【0110】

別の態様では、Ｎ末端アミノ酸側鎖は、ラクタムブリッジを有するＣ末端アミノ酸側鎖に環化することができる。Ｎ末端アミノ酸側鎖が、ラクタムブリッジを有するＣ末端アミノ酸側鎖に環化され得る場合、Ｎ－末端アミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択され得る。別の態様において、Ｃ末端アミノ酸は、リジンおよびＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸からなる群から選択することができる。別の実施例において、Ｃ末端アミノ酸は、リジン、ホモリジン、オルニチン、Ｌ－２，４－ジアミノ酪酸、およびＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸からなる群より選択することができる。別の態様では、Ｎ末端アミノ酸はグルタミン酸であり得、Ｃ末端アミノ酸はリジンである。

【0111】

別の態様では、Ｎ末端アミノ酸側鎖がラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化されている場合、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｘａａ_１０ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３ ＣＸａａ_１４ Ｘａａ_１５を含み得、ここでＸａａ_８－１５はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0112】

別の態様では、Ｎ末端アミノ酸側鎖がラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化される場合、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｘａａ_１０ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３ Ｃ Ｘａａ_１４ Ｘａａ_１５を含み得、ここで、Ｘａａ_８はＥおよびＤからなる群より選ばれたメンバー、Ｘａａ_１５はＫおよび（Ｄａｐ）からなる群より選ばれたメンバー、Ｘａａ_９－１４はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0113】

別の態様において、Ｎ末端アミノ酸側鎖がラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化される場合、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｑ Ｃ Ｙ Ｘａａ_１５を含み得、ここでＸａａ_８はＥおよびＤからなる群から選択されるメンバー、Ｘａａ_１０はＴ、Ｘａａ_１３はＱ、Ｘａａ_１４はＹ、Ｘａａ_１５はＫおよび（Ｄａｐ）からなる群から選択されるメンバー、Ｘａａ_９、１１、または１２はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0114】

別の態様において、Ｎ末端アミノ酸側鎖がラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化される場合、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｑ Ｃ Ｙ Ｘａａ_１５を含み得、ここでＸａａ_８はＥおよびＤからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_９はＧまたは（^ｂＡ）であり、Ｘａａ_１１はＲまたは（Ｃｉｔ）であり、Ｘａａ_１２はＹまたは（ｉＹ）であり、Ｘａａ_１５はＫおよび（Ｄａｐ）からなる群から選択されるメンバーである。

【0115】

別の態様において、Ｎ末端アミノ酸側鎖がラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化される場合、アナログは、アミノ酸配列Ｅ Ｇ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）Ｙ Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：５）を含み得、ここで、Ｘａａ_８はＥ、Ｘａａ_９はＧ、Ｘａａ_１１は（Ｃｉｔ）、Ｘａａ_１２はＹ、およびＸａａ_１５はＫである。

【0116】

別の態様では、Ｎ末端アミノ酸側鎖がラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化される場合、アナログは、アミノ酸配列Ｅ（^ｂＡ）Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）Ｙ Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：６）を含み得、ここで、Ｘａａ_８はＥ、Ｘａａ_９は（^ｂＡ）、Ｘａａ_１１は（Ｃｉｔ）、Ｘａａ_１２はＹ、およびＸａａ_１５はＫである。

【0117】

別の態様では、Ｎ末端アミノ酸側鎖がラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化される場合、アナログは、アミノ酸配列Ｅ Ｇ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）（ｉＹ）Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：７、以下同様）を含み得、ここでＸａａ_８はＥ、Ｘａａ_９はＧ、Ｘａａ_１１は（Ｃｉｔ）、Ｘａａ_１２は（ｉＹ）、Ｘａａ_１５はＫである。

【0118】

別の態様では、Ｎ末端アミノ酸側鎖がラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化される場合、アナログは、アミノ酸配列Ｅ Ｇ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｒ（ｉＹ）Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：８）から成り得、ここで、Ｘａａ_８はＥ、Ｘａａ_９はＧ、Ｘａａ_１１はＲ、Ｘａａ_１２は（ｉＹ）、およびＸａａ_１５はＫである。

【0119】

別の実施態様では、α－ＲｇＩＡ４アナログにおけるα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対するα－ＲｇＩＡ４効能を維持する方法であってα－ＲｇＩＡ４アナログの認識フィンガー領域をα－ＲｇＩＡ４構成（例えば、球状α－ＲｇＩＡ４構成）に維持する側鎖結合構成でシステイン間硫黄結合を保護することを含むことができる。

【0120】

１つの態様において、アナログは、以下：２．５％、５％、７．５％、１５％、２５％、４０％、５０％、８０％のうちの少なくとも１つまたはそれ以上の親和性、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性に実質的に等しい親和性、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性より大きい親和性でα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に結合することができる。

【0121】

別の態様では、アナログは、
α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体のＩＣ_５０値と実質的に等しい、または２．０倍、３．０倍、５．０倍、１５．０倍、２５．０倍のうちの少なくとも１つまたはそれ以上より大きくないα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値である、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体を阻害することができる。

【0122】

別の態様では、システイン間硫黄結合を保護することで、異なるｎＡＣｈＲサブタイプの選択性と比較して、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対して、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、または２００倍のうちの少なくとも１つまたはそれ以上であるα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）提供し得る。別の態様では、システイン間硫黄結合を保護することにより、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのヒト血清中安定性より少なくとも１００倍大きいα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中における安定性を提供することができる。

【0123】

別の態様では、システイン間結合を保護する工程は、Ｃ^ＩとＣ^ＩＩＩ、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶ、またはそれらの組み合わせの間のシステイン間結合の１つまたは複数を保護する工程を含む。一実施例において、システイン間硫黄結合を保護することは、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶの間にメチレンチオアセタールを挿入する工程を含み得る。別の実施例において、システイン間硫黄結合を保護する工程は、Ｎ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸の間にラクタムブリッジを作成する工程を含む。

【0124】

α－ＲｇＩＡ４アナログの調製方法
一実施形態において、活性環状α－ＲｇＩＡ４アナログは、図２に示されるように調製され得る。新たに導入されたラクタム橋は、樹脂上で合成され、続いて、位置選択的なジスルフィド結合配置が球状異性体を維持するために適用され得る２操作液相酸化プロセスによって合成することができる。詳細には、側鎖保護Ｐ１は、塩化２－クロロトリチル（２－ＣＴＣ）樹脂上での自動９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦｍＣｏ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、Ｎ末端のＦｍＣｏ除去、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ＢＣｏ）での再保護を行うことにより合成することが可能である。末端側鎖アミンと酸を直交脱保護し（例えば、保護基１（ＰＧ_１）と保護基２（ＰＧ_２））、さらに環化してラクタム架橋分子複合体Ｐ２を形成させることができる。ラクタム環化ペプチドは、切断、精製によって生成することができ、空気酸化を経て二環式生成物Ｐ３を生成することができる。最後に、完全に折り畳まれたＰ４は、ｉｎ ｓｉｔｕのヨウ素酸化的脱保護－ジスルフィド形成により生成することができる。

【0125】

別の実施形態では、活性メチレンチオアセタールα－ＲｇＩＡ４アナログは、図７ａ～Ｄに示されるように調製され得る。ＲｇＩＡアナログの化学合成は、塩化２－クロロトリチル（２－ＣＴＣ）樹脂上の９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦｍＣｏ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に続いて、２操作および位置選択的分子内結合形成反応を用いることにより達成され得る。正しい足場形成は、Ｃｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ、Ｃｙｓ^ＩＩ－Ｃｙｓ^ＩＶまたはそれに対応するメチレンチオアセタール置換で、同じ接続性を持つものである。結合は、１）開裂によるトリチル（Ｔｒｔ）除去後のフリーＣｙｓ上でのメチレンチオアセタール形成、２）ｉｎ ｓｉｔｕ 酸化的アセトアミドメチル（Ａｃｍ）脱保護－カップリングプロセスによるジスルフィド結合形成、３）繰り返しメチレンチオアセタール形成によるビスメチレンチオアセタール置換アナログの順に明示的に形成された。

【0126】

詳細には、２－ＣＴＣ樹脂から組み立てられたペプチド鎖を切断した後、Ｔｒｔ保護を除去し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ^．ＨＣｌ）、炭酸カリウムおよびトリメチルアミン（Ｅｔ_３Ｎ）の存在下でジヨードメタンで処理し、標的メチレンチオアセタル結合を形成することが可能である。この変換は、１バッチで３００ｍｇスケールと大規模に行うことができ、ターゲットペプチドの大量調製を可能にすることができる。Ａｃｍ脱保護後、２５％水性酢酸（ＡＣｏＨ）中の過剰なヨウ素処理により、２番目のジスルフィドブリッジを形成し、完全に折り畳まれたペプチドを得ることができる。

【0127】

組成と剤形
このことを念頭に置いて、より多くの実施形態において、組成物は、本明細書に開示される治療上有効な量のアナログと薬学的に許容される担体の組み合わせを含み得る。

【0128】

一態様では、アナログは、約０．０００１ｗｔ％～約１０ｗｔ％の濃度で存在することができる。一実施例において、アナログは、約０．０００１ｗｔ％～約１ｗｔ％の濃度で組成物中に存在することができる。別の実施例において、アナログは、組成物中に約０．００１ｗｔ％～約１ｗｔ％の濃度で存在することができる。もう１つの実施例において、アナログは、約０．０１ｗｔ％～約０．１ｗｔ％の濃度で組成物中に存在することができる。いくつかの実施例において、アナログは、約０．００５ｗｔ％～約０．０５ｗｔ％の濃度で組成物中に存在することができる。

【0129】

一態様において、薬学的に許容される担体は、水、強壮剤、緩衝剤、防腐剤などの１つ以上、またはそれらの組み合わせを含むことができる。

【0130】

いくつかの実施例において、担体は、強壮剤を含むことができる。強壮剤の非限定的な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、グリセリン、プロピレングリコール、エタノール、トレハロース、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコＰＢＳ、アルセバー液、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、水、平衡塩溶液（ＢＳＳ）、例えばハンクＢＳＳ、アールＢＳＳ、グレイＢＳＳ、パックＢＳＳ、シムＢＳＳ、チロデＢＳＳ、ＢＳＳプラス等、またはそれらの組合せを挙げることができる。強壮剤は、組成物の適切な強壮性を提供するために使用することができる。一態様において、組成物の強壮度は、約２５０～約３５０ミリオスモル／リットル（ｍＯｓｍ／Ｌ）とすることができる。別の態様では、組成物の強壮度は、約２７７～約３１０ｍＯｓｍ／Ｌとすることができる。

【0131】

いくつかの実施例において、担体は、ｐＨ調整剤または緩衝剤を含むことができる。ｐＨ調整剤または緩衝剤の非限定的な例としては、塩酸、リン酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン（ＴＲＩＳ）緩衝液等の多数の酸、塩基およびそれらの組み合わせ、またはその組み合わせが挙げられ得る。典型的には、治療用組成物のｐＨは、約５～約９、または約６～約８であり得る。別の例では、治療用組成物のｐＨは、約５～約６であり得る。

【0132】

いくつかの実施例において、担体は防腐剤を含み得る。防腐剤の非限定的な実施例としては、アスコルビン酸、アセチルシステイン、重亜硫酸塩、メタ重亜硫酸塩、モノチオグリセロール、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ブチルヒドロキシトルエン、塩化ミリスチルγ－ピコリミウム、２－フェノキシエタノール、硝酸フェニル水銀、クロロブタノール、チメロサール、トコフェロール等、またはそれらの組み合わせを含み得る。

【0133】

一態様では、組成物は、追加の活性剤をさらに含むことができる。一態様において、追加の活性剤は、抗炎症剤、麻酔剤、二次鎮痛ペプチド、非ペプチド性鎮痛剤など、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである。

【0134】

一実施例において、追加の活性剤は、抗炎症剤であり得る。抗炎症剤の非限定的な実施例としては、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリン、ジクロフェナク、セレコキシブ、スリンダック、オキサプロジン、ピロキシカム、インドメタシン、メロキシカム、フェノプロフェン、ジフニサル、エトドラク、ケトロラク、メクロフェナメート、ナブメトン、サルサレート、ケトプロフェン、トルメチン、フルルビプロフェン、メフェナム酸、ファモチジン、ブロムフェナック、ネパフェナック、プレドニゾン、コーチゾン、ハイドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デフラザコルト、プレドニゾロン、フルドロコルチゾン、アムシノニド、ベタメタゾンジプロプリオネート、クロベタゾール、クロコルトロン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、デュラステリド、フルメタゾンピバレート、フルニソライド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロメソロン、プロピオン酸フルチカゾン、フルランドルノライド、ヒドロフルメチアジド等、その水和物、その酸、その塩基、またはその塩、またはその組み合わせが挙げられる。

【0135】

一実施例において、追加の活性剤は麻酔薬であり得る。麻酔薬の非限定的な実施例としては、アルチカイン、ブピバカイン、シンチカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、ロピバカイン、トリメカインなど、またはそれらの組み合わせがあり得る。

【0136】

一実施例において、追加の活性剤は、第二の鎮痛ペプチドであり得る。一実施例において、追加の活性剤は、非ペプチド性鎮痛剤とすることができる。非ペプチド鎮痛剤の非限定的な例としては、アセトアミノフェン、コデイン、ジヒドロコデイン、トラマドール、メペリジン、ヒドロコドン、オキシコドン、モルヒネ、フェンタニル、ヒドロモルフォン、ブプレノルフィン、メタドン、ジモルフィン、ペチジン等、それらの水和物、それらの酸、それらの塩基、またはそれらの組合せが挙げられ得る。

【0137】

一態様において、追加の活性剤は、約０．０００１ｗｔ％～約１０ｗｔ％の濃度で存在することができる。一例では、追加の活性剤は、約０．０００１ｗｔ％～約１ｗｔ％の濃度で組成物中に存在することができる。別の実施例において、追加の活性剤は、組成物中に約０．００１ｗｔ％～約１ｗｔ％の濃度で存在することができる。もう１つの実施例において、追加の活性剤は、約０．０１ｗｔ％～約０．１ｗｔ％の濃度で組成物中に存在することができる。いくつかの実施例において、追加の活性剤は、約０．００５ｗｔ％～約０．０５ｗｔ％の濃度で組成物中に存在することができる。

【0138】

別の態様では、組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、ヒドロゲル、熱応答性ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、接着剤、液溜め、パッチ、またはこれらの組み合わせのうちの１つとして製剤化することができる。ある態様において、組成物は、局所投与、経皮投与、静脈内投与、皮下投与など、またはそれらの組み合わせに適し得る。ある態様において、組成物は、皮下注射に適し得る。

【0139】

治療方法
さらに別の実施形態では、対象において、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に応答する状態を治療する方法は、治療有効量の組成物を対象に投与する工程を含み得る。１つの態様において、状態は、痛みであり得る。別の態様では、状態は、脊髄性多発性硬化症であり得る。別の態様では、状態は、帯状疱疹後神経痛であり得る。別の態様では、状態は、三叉神経痛であり得る。別の態様では、状態は、複合性局所疼痛症候群であり得る。別の態様では、状態は、多発性硬化症であり得る。

【0140】

症状が痛みである場合、痛みは、化学物質誘発性神経障害（ＣＩＰＮ）、糖尿病性神経障害、関節炎性神経障害、骨関節炎性神経障害などの１つまたはそれ以上を含む神経障害性疼痛、またはこれらの組み合わせであり得る。別の態様では、痛みは、ＨＩＶ痛であり得る。別の態様では、痛みは、ハンセン病に関連する痛みであり得る。別の態様では、痛みは、術後疼痛、外傷後疼痛などの１つまたはそれ以上、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0141】

別の態様では、状態は、癌であり得る。癌は、上皮癌、肺癌、乳癌、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上を含み得る。

【0142】

別の態様では、状態は、炎症であり得る。一態様において、炎症は、免疫細胞によって媒介され、リウマチに関連し、またはそのような組み合わせであり得る。治療することができる例示的な炎症状態には、炎症、慢性炎症、リウマチ性疾患（関節炎、ループス、強直性脊椎炎、線維筋痛症、腱炎、滑液包炎、強皮症、痛風を含む）、敗血症、線維筋痛症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、サルコイドーシス、内膜症、子宮筋腫、炎症性皮膚疾患（乾癬および創傷治癒障害を含む）、肺の炎症性疾患（喘息および慢性閉塞性肺疾患を含む）、神経系の炎症に伴う疾患（多発性硬化症、パーキンソン病、およびアルツハイマー病を含む）、歯周病、心血管疾患であり得る。

【0143】

一態様では、組成物は、約２５μｌ～約１ｍｌのα－ＲｇＩＡ４アナログを有する剤形であり得る。別の態様では、組成物は、約１ｍｌ～約５ｍｌのα－ＲｇＩＡ４アナログを有する剤形であり得る。一態様において、組成物は、約５ｍｌ～約１０ｍｌのα－ＲｇＩＡ４アナログを有する剤形であり得る。

【0144】

別の実施形態では、治療は、投与後の選択された時間内に症状の軽減を提供することができる。治療上有効な量の局所用組成物を投与することで、症状に関連する症状を軽減することができる。別の態様では、治療は、投与後の選択された時間の量内で少なくとも１０％の症状の軽減を提供することができる。一実施例において、治療法は、投与後の選択された量の時間内に少なくとも２０％の症状の低減を提供することができる。さらに１つ以上の実施例において、治療は、投与後の選択された時間内に少なくとも３０％の症状の低減を提供することができる。さらに別の実施例において、治療法は、投与後の選択された時間内に少なくとも５０％の症状の低減を提供することができる。

【0145】

症状の軽減を達成する投与後の選択された時間は、様々であり得る。一実施例において、選択された時間の量は、投与後１５秒未満とすることができる。別の実施例において、選択された時間の量は、投与後３０秒未満とすることができる。別の実施例において、選択された時間の量は、投与後６０秒未満とすることができる。別の実施例において、選択された時間の量は、投与後５分未満とすることができる。別の実施例において、選択された時間の量は、投与後１５分未満とすることができる。別の実施例において、選択された時間の量は、投与後３０分未満とすることができる。

【0146】

さらに別の態様において、治療上有効な量の組成物は、１日当たり１～１０回、対象に投与することができる。一実施例において、組成物は、１日あたり１～１０回、対象に投与することができる。別の実施例において、組成物は、１日当たり１～５回、対象に投与することができる。さらに別の実施例において、組成物は、１日当たり３～５回、対象に投与することができる。

【0147】

１つのより詳細な態様において、治療上有効な量の組成物は、投与レジメンに従って対象に投与することができる。一実施例において、組成物は、約１日～約１２ヶ月の期間、１日当たり少なくとも１回投与することができる。別の実施例において、組成物は、約１日～約６ヶ月の期間、１日当たり少なくとも１回投与することができる。さらに別の実施例において、組成物は、約１日～約３ヶ月の期間、１日当たり少なくとも１回投与することができる。さらに別の実施例において、組成物は、約１日～約１ヶ月の期間、１日当たり少なくとも１回投与することができる。

【0148】

別の態様において、治療上有効な量の組成物を投与することは、皮下投与形態、経皮投与形態、局所投与形態、静脈内投与形態など、またはそれらの組み合わせとすることができる。

【0149】

別の態様において、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に反応する対象における状態の治療に使用するための組成物は、治療的有効量の組成物を含むことができる。別の態様では、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に反応する対象における状態の処置のための医薬の製造における組成物の使用は、治療上有効な量の組成物を含み得る。

【表1】

注１：［］は、１位のアミノ酸の側鎖（例えば、ＤまたはＥ）と最終位のアミノ酸の側鎖（例えば、ＤａｐまたはＫ）の間にラクタム橋が架かって環化されたペプチドを意味する。
注２：Ｃ^Ｉ、Ｃ^ＩＩ、Ｃ^ＩＩＩ、Ｃ^ＩＶは、Ｎ末端に対するペプチド中のシステインの順序を意味する。例えば、Ｃ^ＩはＣ^ＩＩよりもＮ末端に近く、Ｃ^ＩＩはＣ^ＩＩＩよりもＮ末端に近く、Ｃ^ＩＩＩはＣ^ＩＶよりもＮ末端に近い。
注３：Ｘ１～Ｘ１５は、本明細書に記載されるＸａａを意味する。
^１３は、Ｃ^ＩとＣ^ＩＩＩのシステイン間硫黄結合のメチレンチオアセタールを指す。
^２４は、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶのシステイン間硫黄結合のメチレンチオアセタールを指す。

【0150】

事例紹介
一実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に結合するように構成された認識フィンガー領域と、およびシステイン間硫黄結合を保護する側鎖結合構成とを含み得、ここで、前記アナログは、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％である前記α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有する。

【0151】

別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、保護されたシステイン間硫黄結合によって維持される構造を有し得、前記構造は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２．５％であるα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性を提供する。

【0152】

別の例では、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対する結合親和性は、以下のようになり得る：α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも５％か、または－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも７．５％か、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも１５％か、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２５％か、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも４０％か、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも５０％か、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも８０％か、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性と実質的に同等であるか、または－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性よりも大きい。

【0153】

別の実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの効力と比較して、効力の増加を提供することができる。

【0154】

別の実施例において、アナログは、以下のα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値を提供する：α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値と実質的に等しい、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の２．０倍を超えない、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の３．０倍を超えない、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の５．０倍を超えない、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の１５．０倍を超えない、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体ＩＣ_５０値の２５倍を超えない。

【0155】

別の実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドまたはα－保護されたシステイン間硫黄結合を有しないα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログと比較して、ジスルフィドブリッジスクランブル、ジスルフィドブリッジ分解、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれ以上を減少させることができる。

【0156】

別の実施例において、側鎖結合構成は、メチレンチオアセタール、ラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化されているＮ末端アミノ酸側鎖、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれ以上を含み得る。

【0157】

別の実施例において、側鎖の結合構成は、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶの間のシステイン間結合を含むメチレンチオアセタールであり得る。

【0158】

別の実施例において、側鎖結合構成は、ラクタムブリッジを有するＣ末端アミノ酸側鎖に環化されるＮ末端アミノ酸側鎖であり得る。

【0159】

別の実施例において、Ｎ－末端アミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択することができる。

【0160】

別の実施例において、Ｃ末端アミノ酸は、リジンおよびＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸からなる群から選択することができる。

【0161】

別の例では、Ｎ末端アミノ酸はグルタミン酸であり得、Ｃ末端アミノ酸はリジンであり得る。

【0162】

別の実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、ヒト血清中におけるα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性よりも大きい、ヒト血清中のα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの安定性を提供し得、ここで、ヒト血清中の安定性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの０．１ｍｇ／ｍＬのインキュベーション後に残存する量によって測定されるか、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドを９０％ヒト血清ＡＢ型に入れ、３７℃で１、２、４、８、２４、４８、または７２時間のうち少なくとも１つの時間インキュベートした後の残存量によって測定される。

【0163】

別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中の安定性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのヒト血清中における安定性より、１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００％のうちの少なくとも１つまたはそれ以上大きいとすることができる。

【0164】

別の実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、還元型グルタチオンにおけるα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性より大きい、還元型グルタチオンにおけるα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの安定性を提供し得、前記還元型グルタチオンにおけるα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの０．１ｍｇ／ｍＬのインキュベーション後の残存量によって測定されるか、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドを１０等量の還元型グルタチオンとともにｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、３７℃で１、２、４、８、２４、４８または７２時間のうちの少なくとも１つでインキュベーションした後の残存量によって測定される。

【0165】

別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログの還元型グルタチオンにおける安定性は、還元型グルタチオンにおけるα－ＲｇＩＡ４ペプチドの安定性よりも１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００％のうち少なくとも１つ以上大きいとすることができる。

【0166】

別の実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体選択性と実質的に同等のα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体選択性を提供することができる。

【0167】

別の実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、異なるニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣＣ）サブタイプの選択性と比較して、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または２００倍のうちの少なくとも１つ以上大きいα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体の選択性である、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体を提供し得る。

【0168】

別の実施例において、異なるｎＡＣｈＲサブタイプは、以下からなる群から選択することができる：α１β１δε、α２β２、α２β４、α３β２、α３β４α４β２、α４β４、α６／α３β２β３およびα６／α３β４。

【0169】

別の実施例において、保護されたシステイン間硫黄結合は、α－ＲｇＩＡ４ペプチドの安全性プロファイルと実質的に等しいか、またはそれよりも大きい安全性プロファイルを提供し得、ここで、安全性プロファイルは、１００μＭの濃度で存在するアナログは自動化ホールセルパッチクランプアッセイから測定されるヒトエーテル－ア－ゴー－ゴー－関連遺伝子（ｈＥＲＧ）Ｋ^＋チャネルの２５％未満を阻害し、１００μＭの濃度で存在するアナログは、モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ）アッセイによって測定される約２０％未満の阻害活性を有するか、または１０μＭの濃度で存在するアナログは、ＣＹＰアッセイで測定される２０％未満の阻害活性を有する。

【0170】

別の実施例において、保護されたシステイン間結合は、Ｃ^ＩとＣ^ＩＩＩ、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶ、またはそれらの組み合わせの間のシステイン間結合の１つまたはそれ以上であることが可能である。

【0171】

別の実施例において、構造は球状であることができる。

【0172】

別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログは、ＤＰＲを含む認識フィンガー領域と、およびＣ^Ｉ、Ｃ^ＩＩ、Ｃ^ＩＩＩ、およびＣ^ＩＶを含むシスチン残基と、を含み、ここで、Ｃ^ＩとＣ^ＩＩＩは第１のシステイン間硫黄結合で結合し、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶは第２のシステイン間硫黄結合で結合し、および少なくとも第２のシステイン間硫黄結合は側鎖結合構成によって保護される。

【0173】

別の実施例において、第２のシステイン間硫黄結合は、メチレンチオアセタールを含み得、Ｎ末端アミノ酸側鎖は、ラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化することができ、またはそれらの組合せであることができる。

【0174】

別の実施例において、第２のシステイン間硫黄結合は、メチレンチオアセタールを含み得る。

【0175】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６（配列ＩＤ番号：１３）を含み得、ここで、Ｘａａ_１－６はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0176】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ ＣＸａａ_６（配列ＩＤ番号：１４）を含み得るが、ここで、Ｘａａ_１はＣ以外の任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸であり、Ｘａａ_２はＣ以外の任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸であり、Ｘａａ_３は（Ｃｉｔ）または任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の正アミノ酸以下からなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_４は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり、Ｘａａ_５は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の正アミノ酸であり、およびＸａａ_６は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の芳香族アミノ酸、である。

【0177】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７（配列ＩＤ番号：２０）を含み得、ここでＸａａ_１－７はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0178】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_１ Ｃ Ｃ Ｘａａ_２ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｘａａ_５ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７（配列ＩＤ番号：２１）を含み得る、ここで、Ｘａａ_１はＣ以外の任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸、Ｘａａ_２はＣ以外の任意のタンパク質原性または非タンパク質原性アミノ酸であり、Ｘａａ_３は（Ｃｉｔ）または任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の正アミノ酸からなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_４は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり、Ｘａａ_５は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の正アミノ酸であり、Ｘａａ_６は任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性の芳香族アミノ酸であり、Ｘａａ７はＣ以外の任意のタンパク質原性もしくは非タンパク質原性アミノ酸である。

【0179】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６（配列ＩＤ番号：１５）を含み得、ここでＸａａ_１はＧ、Ｘａａ_２はＴ、Ｘａａ_５はＱ、およびＸａａ_{３、４、または６}はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0180】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６（配列ＩＤ番号：１６）を含み得、ここで、Ｘａａ_３は、（Ｃｉｔ）およびＲからなる群より選択されるメンバーであり、Ｘａａ_４は、（ｉＹ）およびＹからなる群より選択されるメンバーであり、Ｘａａ_６は、（ｂｈＹ）、Ｙ、およびｂＡからなる群より選択されるメンバーである。

【0181】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）（ｉＹ）ＱＣＹ（配列ＩＤ番号：１８）を含み得、ここで、Ｘａａ_３は（Ｃｉｔ）であり、Ｘａａ_４は（ｉＹ）であり、Ｘａａ_６はＹである。

【0182】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７（配列ＩＤ番号：２２）を含み得、ここでＸａａ_１はＧ、Ｘａａ_２はＴ、Ｘａａ_５はＱ、およびＸａａ３、４、６、または７はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0183】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_３ Ｘａａ_４ Ｑ Ｃ Ｘａａ_６ Ｘａａ_７（配列ＩＤ番号：２３）を含み得、ここで、Ｘａａ_３は（Ｃｉｔ）およびＲからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_４は（ｉＹ）およびＹからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_６は（ｂｈＹ）、Ｙ、およびｂＡからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_７は、Ｒである。

【0184】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｒ（ｉＹ）ＱＣ（ｂｈＹ）Ｒ（配列ＩＤ番号：２４）を含み得、ここで、Ｘａａ_３はＲであり、Ｘａａ_４は（ｉＹ）であり、Ｘａａ_６は（ｂｈＹ）である。

【0185】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｒ（ｉＹ）ＱＣ（ｂＡ）Ｒ（配列ＩＤ番号：２５）を含み得、ここで、Ｘａａ_３はＲであり、Ｘａａ_４は（ｉＹ）であり、Ｘａａ_６は（ｂＡ）である。

【0186】

別の実施例において、Ｎ末端アミノ酸側鎖は、ラクタムブリッジでＣ末端アミノ酸側鎖に環化することができる。

【0187】

別の実施例において、Ｎ－末端アミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択することができる。

【0188】

別の実施例において、Ｃ末端アミノ酸は、リジンおよびＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸からなる群から選択することができる。

【0189】

別の実施例において、Ｎ末端アミノ酸はグルタミン酸であり得、Ｃ末端アミノ酸はリジンであり得る。

【0190】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｘａａ_１０ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３ Ｃ Ｘａａ_１４ Ｘａａ_１５（配列ＩＤ番号：３）からなり得、ここでＸａａ_８－１５はＣ以外の任意のアミノ酸でもある。

【0191】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｘａａ_１０ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｘａａ_１３ Ｃ Ｘａａ_１４ Ｘａａ_１５（配列ＩＤ番号：４）を含み得、ここで、Ｘａａ_８はＥおよびＤからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_１５はＫおよび（Ｄａｐ）からなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_９－１４はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0192】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｑ Ｃ Ｙ Ｘａａ_１５（配列ＩＤ番号：５）を含み得、ここで、Ｘａａ_８はＥおよびＤからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_１０はＴ、Ｘａａ_１３はＱ、Ｘａａ_１４はＹ、Ｘａａ_１５はＫおよび（Ｄａｐ）からなる群から選択されるメンバー、Ｘａａ_{９、１１、または１２}はＣ以外の任意のアミノ酸である。

【0193】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｘａａ_８ Ｘａａ_９ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｘａａ_１１ Ｘａａ_１２ Ｑ Ｃ Ｙ Ｘａａ_１５（配列ＩＤ番号：６）を含み得、ここでＸａａ_８はＥおよびＤからなる群から選択されるメンバーであり、Ｘａａ_９はＧまたは（^ｂＡ）であり、Ｘａａ_１１はＲまたは（Ｃｉｔ）であり、Ｘａａ_１２はＹまたは（ｉＹ）であり、Ｘａａ_１５はＫおよび（Ｄａｐ）からなる群から選択されるメンバーである。

【0194】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｅ Ｇ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）Ｙ Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：９）を含み得、ここで。Ｘａａ_８はＥ、Ｘａａ_９はＧ、Ｘａａ_１１は（Ｃｉｔ）、Ｘａａ_１２はＹ、およびＸａａ_１５はＫである。

【0195】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｅ（^ｂＡ）Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）Ｙ Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：１０）を含み得、ここで、Ｘａａ_８はＥ、Ｘａａ_９は（^ｂＡ）、Ｘａａ_１１は（Ｃｉｔ）、Ｘａａ_１２はＹ、およびＸａａ_１５はＫである。

【0196】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｅ Ｇ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ（Ｃｉｔ）（ｉＹ）Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：１１）を含み得、ここで、Ｘａａ_８はＥ、Ｘａａ_９はＧ、Ｘａａ_１１は（Ｃｉｔ）、Ｘａａ_１２は（ｉＹ）、Ｘａａ_１５はＫである。

【0197】

別の実施例において、アナログは、アミノ酸配列Ｅ Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｄ Ｐ Ｒ Ｃ Ｒ（ｉＹ）Ｑ Ｃ Ｙ Ｋ（配列ＩＤ番号：１２）を含み得、ここで、Ｘａａ_８は、Ｅ、Ｘａａ_９はＧ、Ｘａａ_１１はＲ、Ｘａａ_１２は（ｉＹ）、Ｘａａ_１５はＫである。

【0198】

別の実施例において、組成物は、治療上有効な量の前述のようなアナログと薬学的に許容される担体との組合せを含み得る。

【0199】

別の実施例において、組成物は、局所投与、経皮投与、静脈内投与、または皮下投与に適していることができる。

【0200】

別の実施例において、組成物は、追加の活性剤をさらに含み得る。

【0201】

別の実施例において、追加の活性剤は、抗炎症剤、麻酔剤、二次鎮痛ペプチド、非ペプチド鎮痛剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーであり得る。

【0202】

別の実施例において、追加の活性剤は、約０．０００１ｗｔ％～約１０ｗｔ％の濃度で存在することができる。

【0203】

別の実施例において、組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、ヒドロゲル、熱応答性ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、接着剤、液溜め、パッチ、またはそれらの組み合わせのうちの１つとして配合することができる。

【0204】

別の実施例において、組成物は、皮下注射に適することができる。

【0205】

別の実施例において、薬学的に許容される担体は、水、強壮剤、緩衝剤、防腐剤、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上を含むことができる。

【0206】

別の実施例において、α－ＲｇＩＡ４アナログにおけるα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に対するα－ＲｇＩＡ４効力を維持する方法は、認識フィンガー領域を維持する側鎖結合構成でシステイン間硫黄結合を保護する工程を含み得る。

【0207】

別の実施例において、アナログは、以下のα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体に結合することができる：α－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも５％、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも７．５％、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも１５％、またはＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも２５％、またはＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも４０％、またはＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも５０％、またはＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性の少なくとも８０％、またはＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性と実質的に等々であるか、またはＲｇＩＡ４ペプチドの結合親和性より大きい。

【0208】

別の実施例において、アナログは、以下のＩＣ_５０値を有するα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体を阻害し得る：α－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体のＩＣ_５０値と実質的に等しい、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体のＩＣ_５０値２．０倍を超えない、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体のＩＣ_５０値の３．０倍を超えない、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体のＩＣ_５０値の１５．０倍を超えない、またはα－ＲｇＩＡ４ペプチドのα９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体のＩＣ_５０値の２５．０倍を超えない、

【0209】

別の実施例において、システイン間硫黄結合を保護することで、異なるｎＡＣｈＲサブタイプの選択性と比較して、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または２００倍のうちの少なくとも１つ以上より大きいα９αニコチン性アセチルコリン受容体に対する選択性である、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の選択性を提供し得る。

【0210】

別の実施例において、システイン間硫黄結合を保護することにより、α－ＲｇＩＡ４ペプチドのヒト血清中の安定性よりも１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００％の少なくとも１つまたはそれ以上より大きいα－ＲｇＩＡ４ペプチドアナログのヒト血清中における安定性を提供し得る。

【0211】

別の実施例において、システイン間結合を保護することにより、Ｃ^ＩとＣ^ＩＩＩ、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶ、またはそれらの組み合わせの間のシステイン間結合の１つまたはそれ以上を保護することを含み得る。

【0212】

別の実施例において、システイン間硫黄結合を保護することにより、Ｃ^ＩＩとＣ^ＩＶの間にメチレンチオアセタールを挿入することを含み得る。

【0213】

別の実施例において、システイン間硫黄結合を保護することにより、Ｎ－末端アミノ酸とＣ－末端アミノ酸との間にラクタム橋を作ることを含み得る。

【0214】

別の実施例において、対象において、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に応答する状態を治療するための方法は、治療上有効な量の前述のような組成物を対象に投与することを含み得る。

【0215】

別の実施例において、状態は痛みであり得る。

【0216】

別の実施例において、痛みは、化学物質誘発性神経障害（ＣＩＰＮ）、糖尿病性神経障害、関節炎性神経障害、骨関節炎性神経障害、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれ以上を含む神経障害性疼痛であり得る。

【0217】

別の実施例において、痛みはＨＩＶの痛みである可能性がある。

【0218】

別の実施例において、痛みはハンセン病に関連する痛みであり得る。

【0219】

別の実施例において、痛みは、術後の痛み、または外傷後の痛みのうちの１つ以上とすることができる。

【0220】

別の実施例において、状態は、脊髄性多発性硬化症であり得る。

【0221】

別の実施例において、症状は帯状疱疹後神経痛であり得る。

【0222】

別の実施例において、症状は三叉神経痛とすることができます。

【0223】

別の実施例において、複雑性局所疼痛症候群とすることができる。

【0224】

別の実施例において、状態は癌であり得る。

【0225】

別の実施例において、癌は、上皮癌、肺癌、乳癌、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれ以上を含み得る。

【0226】

別の実施例において、状態は多発性硬化症であり得る。

【0227】

別の実施例において、状態は炎症であり得る。

【0228】

別の実施例において、炎症は、免疫細胞によって媒介され、リウマチに関連し、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0229】

別の実施例において、治療は、投与後の選択された時間内に少なくとも１０％の症状の低減を提供し得る。

【0230】

別の実施例において、治療上有効な量の組成物は、１日当たり１～５回、対象に投与し得る。

【0231】

別の実施例において、治療上有効な量の組成物は、約１日～約３ヶ月の期間、少なくとも１日１回の投与レジメンに従って対象に投与され得る。

【0232】

別の実施例において、治療上有効な量の組成物は、皮下投与形態、経皮投与形態、局所投与形態、静脈内投与形態、またはそれらの組み合わせとして投与し得る。

【0233】

別の実施例において、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に反応する対象における状態の治療に使用するための組成物は、治療上有効な量の標記組成物を対象に投与し得る。

【0234】

別の実施例において、α９α１０ニコチン性アセチルコリン受容体結合に反応する対象における状態の治療のための医薬の製造における組成物の使用は、治療上有効な量の標記組成物を対象に投与し得る。

【0235】

実験例
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態のより明確な理解を促進するために提供されるものであり、決してそれを制限するものではない。

【実施例1】

【0236】

実施例１－Ａ：コンフォメーションに制約のあるα－ＲｇＩＡアナログの設計と合成
方法
ペプチドの合成ペプチドは、シンセサイザー（ＳｙｒｏＩ）の自動ＦｍＣｏＳＰＰＳ化学を使用して合成した。最初のアミノ酸を２－ＣＴＣ樹脂（置換度＝０．７７ｍｍｏｌ／ｇ）上に手動でカップリングし、樹脂をＭｅＯＨでキャップして最終置換度を０．４ｍｍｏｌ／ｇとした。簡単に言うと、２５０ｍｇの２－ＣＴＣ樹脂（置換度＝０．７７ｍｍｏｌ／ｇ）を膨潤させ、ＤＣＭで３０分間洗浄した。樹脂を排出し、続いて特定のＦｍＣｏ保護アミノ酸（ＤＣＭ＝４ｍＬ中のＦｍＣｏ－ＡＡ－ＯＨ＝０．１ｍｍｏｌ，ＤＩＥＡ＝０．２ｍｍｏｌ）の溶液中に添加し、室温で１．５時間インキュベートした。次に樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで複数回洗浄して、１６％ｖ／ｖＭｅＯＨおよび８％ｖ／ｖＤＩＥＡを含むＤＣＭ５ｍＬと５分間一緒にインキュベートした。この動作を５回繰り返した後，ＤＣＭとＤＭＦで十分に洗浄した。その後、樹脂をシンセサイザーにセットして自動合成を行った。カップリング反応は、ＤＭＦ（０．１ｍｍｏｌアミノ酸結合樹脂あたり５ｍＬ）中に、ＨＡＴＵ（５．０ｅｑ．）、ＤＩＥＡ（１０．０ｅｑ．）およびＦｍＣｏ－ＡＡ－ＯＨ（５．０ｅｑ．）を用いて、７０^ｏＣ（ＣｙｓおよびＡｌｌｙｌとＡｌＣｏ保護アミノ酸については５０^ｏＣ）に１５分間加熱して実施した。脱保護反応は、ＤＭＦ（４ｍＬ）中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて、室温で５分間、２ラウンド行った。

【0237】

切断。ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／ＴＩＰＳ／ＥＤＴ＝９５：２：２：１からなるカクテルバッファーで室温で２．５時間処理することにより、樹脂からペプチドを切断した（０．１ｍｍｏｌ配列結合樹脂あたり３．０ｍＬ）。次に、得られたペプチド－ＴＦＡ溶液を濾過し、冷エチルエーテル中に沈殿させ、遠心分離し、エチルエーテルで少なくとも２回洗浄してから真空中で乾燥させた。その後、粗生成物をＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。

【0238】

ＬＣ／ＭＳ分析。ペプチドの特性評価は、アジレント６１２０四重極ＬＣ／ＭＳシステム上で、ＸｂｒｉｄｇｅＣ１８５μｍ（５０ｘ２．１ｍｍ）カラムを０．４ｍＬ／ｍｉｎで、Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮグラジエントを０．１％ＦＡで行って、ＬＣ／ＭＳにより実施した。ＨＰＬＣランから集めたフラクションもＬＣ／ＭＳで分析した。

【0239】

ＨＰＬＣによる精製方法と純度確認。全てのサンプルは、特に指定がない限り、以下の条件で分析した。粗ペプチドのセミ分取逆相ＨＰＬＣは、ジュピター５μ Ｃ １８３００Å（２５０ｘ１０ｍｍ）カラムで、アジレント１２６０ＨＰＬＣシステムで４５分かけてＡＣＮの５％から３５％まで０．１％ＴＦＡを含むＨ_２Ｏ／ＡＣＮグラジエントを用いて３．０ｍＬ／分で行った。目的物を含む精製画分を回収し、ＬａｂＣｏｎＣｏ社の凍結乾燥機を用いて凍結乾燥した。すべての純度評価、異性体共注入、および安定性アッセイ分析は、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＧｅｍｉｎｉＣ１８３μｍ（１１０Å１５０ｘ３ｍｍ）カラムを用いたＨＰＬＣによって行われた。

【0240】

樹脂上での直交脱保護とラクタム化。方法１：樹脂上でＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．１ｅｑ．）とＤＭＢＡ（４．０ｅｑ．）ｉｎＤＣＭを用いてアリルエステル（ＯＡｌｌ）とアリルカルバミン酸（ＮＨＡｌＣｏ）を２時間かけて除去し、この反応を２ラウンド繰り返した。方法２：Ｐｄを介した脱保護は３－ヨード－Ｔｙｒ含有配列に適合しない（Ｐｄの挿入と還元により、脱ヨード生成物が主要な可能性があった）。そこで、Ｏ（Ｄｍａｂ）とＮＨ（ｉｖＤｄｅ）を直交保護ペアとして使用した。この樹脂をＤＭＦ中の５％ヒドラジン中で４時間インキュベートし、この操作を１回繰り返した。ラクタム環化反応は、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ（２：２：２．４ｅｑ．）の環化条件下で樹脂上で行い、>完了に使用したローター上で６時間の攪拌を行った。反応転化率はマイクロクリーバージュでモニターし、ＬＣ／ＭＳで確認した。

【0241】

空気酸化によるジスルフィド結合の形成。２つの遊離システインを持つペプチドを、５％ＤＭＳＯを含む０．０１ＭＮａ_２ＨＰＯ_４ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝８．０）中、室温で４８時間以上通気して酸化させ、反応の進行をＬＣ／ＭＳでモニターした。反応終了後、反応混合物を上記の方法でＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。

【0242】

Ｉ_２－によるジスルフィド結合の形成。ＡＣｏＨ：Ｈ_２Ｏ（８０％：２０％ｖ／ｖ，１．００ｍＭ）中の撹拌したＢｉｓ－Ａｃｍ保護ペプチド溶液に、ＡＣｏＨに溶解したＩ_２（１０．０ｅｑ．）を滴下して添加した。反応物を室温で１０分間撹拌し、ＬＣ／ＭＳでモニターした。過剰のＩ_２は、混合物が無色になるまでアスコルビン酸溶液（１．０Ｍ）の添加によりクエンチした。その後、Ｈ_２Ｏ（反応混合物と等量）で希釈し、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。

【0243】

結果と考察
完全活性型環状α－ＲｇＩＡ４アナログを設計するという目標のもと、α－ＲｇＩＡのＮＭＲ構造（ＰＤＢ２ＪＵＱ）および最近の受容体共結晶構造（ＰＤＢ６ＨＹ７）を調べた。α－ＲｇＩＡのＮ末端とＣ末端は約１１．６Åの距離を持ち、ファーマコフォアから離れた位置にある。既存のバックボーン形状に適合させるためには、この距離を埋めるために両末端に追加のアミノ酸を使用し、理想的なリンカーがバックボーンを最小限の力で刺激して効力を維持できるようにする必要がある。そこで、スキーム１に示すような合成経路を設計し、一連の側鎖環化ペプチドを合成した。新たに導入したラクタム橋は、樹脂上で合成した後、位置選択的にジスルフィド結合を配置する２操作の液相酸化プロセスを経て、球状異性体を得ることができた。詳細には、図２に示すように、側鎖保護Ｐ１は、Ｎ－末端Ｆｍｏｃを除去し、Ｂｏｃで再保護した塩化２－クロロトリチル（２－ＣＴＣ）樹脂上の自動Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成された。その後、末端側鎖アミンと酸を直交脱保護し（ＰＧ_１とＰＧ_２）、さらに環化させてラクタム架橋分子複合体Ｐ２を形成させた。このラクタム環化ペプチドは、切断、精製を経て生成し、空気酸化を経て二環式生成物Ｐ３を得た。最後に、ｉｎ ｓｉｔｕヨウ素酸化的脱保護－ジスルフィド形成により、完全に折り畳まれたＰ４が生成された。

【0244】

実施例１－Ｂ：合成したペプチドのインビトロおよびインビボでの生物学的評価
方法
化合物の特性評価本研究で合成・検討したすべてのアナログは、ＨＰＬＣにより純度９５％以上で決定した。分子量はＥＳＩ－ＭＳ．［Ｍ＋Ｈ］^＋Ｍ／Ｚ（Ｄａ）：ＲｇＩＡ４，Ｃａｌｃ １６９１．６，Ｆｏｕｎｄ １６９１．４；Ａｎａｌｏｇｕｅ １：Ｃａｌｃ １７４９．１，Ｆｏｕｎｄ １７４９．６；Ａｎａｌｏｇｕｅ ２，Ｃａｌｃ １７９１．０，Ｆｏｕｎｄ １７９１．５；Ａｎａｌｏｇｕｅ ３，Ｃａｌｃ １８０４．１，Ｆｏｕｎｄ １８０４．６；Ａｎａｌｏｇｕｅ ４，Ｃａｌｃ １８１９．１，Ｆｏｕｎｄ １８１９．６；Ａｎａｌｏｇｕｅ ５，Ｃａｌｃ １９３１．０，Ｆｏｕｎｄ １９３１．５；Ａｎａｌｏｇｕｅ ６，Ｃａｌｃ １９２９．０，Ｆｏｕｎｄ １９２９．８；ＲｇＩＡ４［１，４］，Ｃａｌｃ １６９１．６，Ｆｏｕｎｄ １６９１．４；Ａｎａｌｏｇｕｅ ６［１，４］，Ｃａｌｃ １９２９．０，Ｆｏｕｎｄ １９２９．６によって測定された。精製した各ペプチドのＬＣ－クロマトグラムおよびＭＳ－スペクトラムを表１Ｂ－１にまとめて図３Ｃ～３Ｋに示す。

【表2】

【0245】

卵母細胞受容体の発現。Ｘ．ｌａｅｖｉｓ卵母細胞に、選択したｎＡＣｈＲサブユニットをコードするｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。すべてのヒト異種ｎＡＣｈＲについて、卵母細胞は各サブユニットの１５～２５ｎｇ等量を注入され、相同ヒトα７について、卵母細胞はα７をコードする５０ｎｇのｃＲＮＡを注入された。卵子は、使用前にＮＤ９６中で１７℃で１～３日間インキュベートした。

【0246】

電気生理学的記録。注入された卵子は３０μＬの記録チャンバーに入れられ、－７０ｍＶの膜電位に電圧クランプされた。ＮＤ９６（９６．０ｍＭＮａＣｌ，２．０ｍＭＫＣｌ，１．８ｍＭＣａＣｌ_２，１．０ｍＭＭｇＣｌ_２，５ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）と０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを、２ｍＬ／ｍｉｎで記録室を通して重力灌流させた。受容体の反応を測定するために、ＡＣｈの１秒パルスを１分間隔で印加した。ＡＣｈは、α７では２００μＭ、筋サブタイプでは１０μＭを除いて、すべてのサブタイプで１００μＭの濃度で適用された。ベースラインのＡＣｈ反応を確立した後、ＮＤ９６コントロール溶液を、様々な濃度の試験ペプチドを含むＮＤ９６溶液に切り替えた。ペプチドを含む溶液の灌流中、ＡＣｈパルスは１分間に１回続けられ、ＡＣｈによる反応がブロックされているかどうかを評価した。ＡＣｈの反応は、ペプチド濃度の存在下で、反応が定常状態になるまで測定された。ベースライン反応と比較したこれらの反応の３つの平均が、反応パーセントを決定するために使用された。材料が限られているため、１０μＭ濃度試験では、ＮＤ９６の流れを止めた状態で、３μｌの１００μＭペプチドを３０μｌの記録チャンバーに導入した。５分間のインキュベーションの後、ＮＤ９６のフローとＡＣｈパルスを再開し、ペプチドによるブロックを測定した。すべての濃度反応解析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。得られたＩＣ_５０を含む値は、非線形回帰（カーブフィット）シグモイド用量反応（可変スロープ）を用いて計算された。

【0247】

オキサリプラチン誘発性冷感アロディニア。オキサリプラチンは０．９％滅菌生理食塩水に０．８７５μｇ／μｌで溶解した。アナログ６は０．９％滅菌生理食塩水に０．０２μｇ／μｌで溶解した。ＣＢＡ／ＣａＪマウスに、毎日（週末を除く）、オキサリプラチン（３．５ｍｇ／ｋｇ）または０．９％生理食塩水（ビヒクル）をｉ．ｐ．投与した。マウスはまた、コントロールとしてアナログ６（８０μｇ／ｋｇ）または０．９％生理食塩水を毎日ｓ．ｃ．投与された。この研究では、すべての化合物が実験者にとって盲検化されていた。この研究は、水曜日に最初のベースライン寒冷感受性試験で始まり、最初の１週間は水曜日、木曜日、金曜日に注射を行った。さらに２週間、月曜日から金曜日まで注射を続け、前日の注射の２４時間後に水曜日にテストを行った。最終週は、月曜日と火曜日に注射を行い、その２４時間後に最終検査日を迎えた。

【0248】

コールドプレートテスト。ＩＩＴＣ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社から購入したホット／コールドプレート機を用いて試験を実施した。試験マウスを室温（２３^ｏＣ）に保ったまま、調査行動が落ち着くまで試験室に慣れさせた。その後、１分間に１０^ｏＣの速度で直線的に温度を下げた。マウスが両前足を持ち上げて激しく揺さぶるか、足底を繰り返し舐めた時点で試験を停止した。一度に片方の前足を持ち上げたり、前足を交互に往復させたりしても採点されず、試験は続行された。最終的な時間と温度を記録し、得られたデータはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてプロットした。データは、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた一元配置分散分析で解析した。Ｐ値は、オキサリプラチン／食塩水対照との有意差について、^＊Ｐ<０．０５，^＊＊Ｐ<０．０１，および^＊＊＊Ｐ<０．００１であった。

【0249】

結果と考察
これまで、いくつかのα－ＣＴｘ系薬剤の臨床試験が失敗したことから、ヒトとネズミのｎＡＣｈＲの感受性の違いを克服することが、ＣＴｘ系鎮痛剤の開発における大きなハードルであり交絡因子であることが示された。この問題に対処するため、合成された類似化合物は、ヒトα９α１０ｎＡＣｈＲ発現Ｘ．ｌａｅｖｉｓ卵母細胞の２電極電圧クランプ電気生理学によってテストされた。図３ａ－Ａおよび図３ａ－Ｂに示すように、各濃度－応答曲線から生成したＩＣ_５０値を表１Ｂ－２に示す（［］は環化、＾はＣ末を示す）。

【表3】

【0250】

最適なリンカー配置を特定するために、アナログ１～４を合成した。最も強力なアナログ３は末端の［Ｇｌｕ－Ｌｙｓ］側鎖で環状化されており、α－ＲｇＩＡ４と比較して１０倍の活性が低下している。アナログ１［Ａｓｐ－Ｄａｐ］とアナログ２［Ａｓｐ－Ｌｙｓ］では、短いリンカーを生成すると生物活性が著しく低下するが、これはバックボーンの歪みや摂動が原因であると思われる。分子のＮ－末端残基のＧｌｙ１を^βＡｌａ１に置き換えて１ＣＨ_２ユニット長くしたアナログ４も、リンカーを短くしたアナログほど劇的ではないものの、効力の低下をもたらした。［Ｇｌｕ－Ｌｙｓ］と同定された良好なリンカーを用いて、ヒトα９α１０ｎＡＣｈＲの効能を高めることができる残基である３－ヨード－チロシン変異を持つアナログ５が合成された。アナログ５の効力は５．９ｎＭに達し、さらにＣｉｔ９をＡｒｇ９に変異して戻した場合（α－ＲｇＩＡ５に準拠）、３．４ｎＭに減少した（アナログ６）。その選択性を測定するために他のヒトｎＡＣｈＲサブタイプでアナログ６を試験すると、図３ｂに示すように、疼痛関連ｎＡＣｈＲサブタイプでもあるα７（ＩＣ_５０＝５０４．０ｎＭ、１５０倍減少）を除くすべてのサブタイプに対して>１０μＭの効能が示された。この結果は、表１Ｂ－３に示すように、現在の環化戦略によって、保持された効力と良好な受容体選択性の両方を有するアナログ６が生成されることを示す。

【表4】

【0251】

アナログ６のインビボ疼痛緩和効果を、オキサリプラチン誘発末梢神経障害性疼痛げっ歯類モデルで評価した。図３ａ－Ｂに示すように、マウスにオキサリプラチンを投与すると、冷感アロディニアが生じ、冷感プレート試験での潜時が徐々に減少したが、アナログ６の毎日の同時投与は、冷感アロディニアを有意に防止した。

【0252】

実施例１－Ｃ：ＲｇＩＡ４およびアナログ６のヒト血清安定性
方法
インビトロにおけるヒト血清の安定性試験。ペプチド（ＲｇＩＡ４およびアナログ６）をＨ_２Ｏに溶解し（１．０ｍｇ／ｍＬ）、この溶液１００μＬを、初回解凍、滅菌ろ過、１３０００ｒｐｍで１５分間予備遠心して脂質を除去したヒト男性ＡＢ血漿からのヒト血清９００μＬに添加した。最終的なペプチド濃度は０．１ｍｇ／ｍＬであった。次に、溶液を３７℃ウォーターバスでインキュベートし、あらかじめ決められた時点で個別に１００μＬを取り、３００μＬＡＣＮで処理し、３０分間氷上で冷却した。この懸濁液を室温で１３，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。その後、上清１０μＬを取り、１０μＬのＢｕｆｆｅｒＡ（０．１％ＴＦＡｉｎＨ_２Ｏ）に溶解し、ＨＰＬＣサンプルとした。このサンプルをＨＰＬＣ（注入量＝１５μＬ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，１５０ｍｍｘ４．６ｍｍ，１００Å，５μｍ）で分析し、８分間かけて５－５０％Ｂの線形グラジエント（Ａ＝Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＦＡおよびＢ＝ＡＣＮ＋０．１％ＦＡ；流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ）を行った。ペプチドのピーク面積を２２０ｎｍで積分し、時間に対する残存率をグラフ化した。血清安定性実験は、各ペプチドについて独立に３回繰り返した。データ解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで行った。

【0253】

結果と考察
チオールによるジスルフィドのスクランブルとヒト血漿中のタンパク質分解は、ジスルフィドに富むペプチド医薬品の２大脅威である。新しく導入されたコンフォメーション制約が代謝安定性にどのように影響するかを決定するために、α－ＲｇＩＡ４と比較して最も強力なアナログ６についてインビトロヒト血清安定性アッセイを実施した。図４ａ－Ａに示すように、アナログ６は、α－ＲｇＩＡ４よりも劇的に増加した安定性を示した。さらに、図４ａ－Ｂに示すように、ＨＰＬＣ分析により、顕著なジスルフィドスクランブルの抑制が観察された。前方のピークは、図４ｂ－Ａ、図４ｂ－Ｂ、および図４ｂ－Ｃに示すように、異性体共注入で同定されたスクランブル生成物［１，４］である。α－ＲｇＩＡ４の半分以上がそのリボン異性体α－ＲｇＩＡ４［１，４］にスクランブルしたのに対し、図４ａ－Ａに示すように、アナログ６の１０％未満がスクランブルされた。まとめると、このデータは、アナログ６における側鎖環化が、タンパク質分解およびジスルフィドスクランブルの両方を大きく阻害したことを示す。

【0254】

実施例１－Ｄ：ＮＭＲ解析と構造決定
方法
ＮＭＲ ＳｐｅｃｔｒｏｓＣｏｐｙ．ペプチドサンプルは、２．０ｍＭの１０％Ｄ_２Ｏを含む（２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４，５０ｍＭＮａＣｌ，５０μＭＮａＮ_３および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）ｐＨ３．５ ｂｕｆｆｅｒ中で調製した（アイソトープ効果について未補正）。スペクトルはＩｎｏｖａ５００および６００ＭＨｚスペクトロメーターで２９８Ｋで記録した。スペクトロメーターはＶｎｍｒＪ４．０で設定した。ＴＣｏＳＹ（８０ｍｓ），ｇＣｏＳＹ，ＮＯＥＳＹ（２００ｍｓ），ｇ１１－ＮＯＥＳＹ，１３Ｃ－ＨＳＱＣを含む２次元実験が生成された。重水管に試料をセットし、勾配をつけた励起スカルプティングにより水分子の抑制を行った。スペクトルはソフトウェアＮＭＲＰｉｐｅで処理し、化学シフトはＳＰＡＲＫＹで割り当てた。表１Ｄ－１にα－ＲｇＩＡ４、表１Ｄ－２にアナログ３、表１Ｄ－３にアナログ６を示す。ＴＣｏＳＹ（青）およびＮＯＥＳＹ（赤）のアミド領域とＨＳＱＣの脂肪族領域および芳香族領域の重ね合わせ。割り当てはＳＰＡＲＫＹを用いて行った。例えば、図５ｂから図５ｊを参照。

【表5】

【表6】

【表7】

【0255】

構造計算。本研究における立体構造は、ＣＹＡＮＡ３．０を用い、ＮＯＥＳＹ（２００ｍｓ）およびｇ１１－ＮＯＥＳＹスペクトルのクロスピークの強度からプロトン間距離拘束を導出することにより計算されたものである。特殊なアミノ酸ライブラリー（３－ｉｏｄｏＴｙｒ，Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｕ，Ｌｙｓ）は、天然アミノ酸をベースに側鎖を修飾したものである。非ステレオ特異的に割り当てられたプロトンには擬似原子補正が適用された。Ｈα、Ｃα、Ｃβ、ＨＮ化学シフトに基づき、φ、ψ、χ１バックボーン二面角の制約をＴＡＬＯＳから作成した。構造はＰｙＭＯＬを使用して示され、Ｒｏｓｓｅｔａで精製された。２０個の最低エネルギー構造のアンサンブルは、図５ｋから５ｍに示すように、水素が省略された棒として示されたバックボーン原子（Ｎ、Ｏ、ＣαおよびＨα）に重ね合わせ、計算統計を提示する。

【0256】

結果と考察
構造全体に対する側鎖環化の効果をよりよく理解するために、α－ＲｇＩＡ４とアナログ３および６とのＮＭＲ研究が行われた。図５ａ－Ａに示すように、特にＰｒｏ６からＧｌｎ１１までのらせん領域で密接に相関した２次Ｈα化学シフトは、これら３分子の間に高い構造的類似性があることを示唆した。α－ＲｇＩＡ４と３ではＣ－末端領域にわずかな差異が見られたが、α－ＲｇＩＡ４と６ではより類似性が高いことが示された。次に、ＣＹＡＮＡ３．０を用いて、α－ＲｇＩＡ４、３、６の完全な３次元溶液ＮＭＲ構造を計算した。２００の計算構造から、バックボーンＲＭＳＤの低い２０の低エネルギー構造が生成された。環化拘束末端や側鎖リンカーの摂動に違いはあるものの、アナログ３とアナログ６は共にα－ＲｇＩＡ４と高い構造的類似性を有しており（図５ａ－Ｂと５ａ－Ｃ）、特にＡｓｐ５－Ｐｒｏ６－Ａｒｇ７の「認識指」領域が受容体結合に使用されていることが判明した。全体として、［Ｇｌｕ－Ｌｙｓ］側鎖の付加的な環化はペプチドのコアに構造的な障害をもたらすことはない。

【0257】

実施例１－Ｅ：ドッキングモデル
方法
ドッキングスタディ。ＮＭＲデータから得られた２０の低エネルギーアンサンブルには、アナログ６のコンフォマーに２つの一般的なクラスが存在しました。これらのクラスは両方ともＲｏｓｅｔｔａで解析されたが、１つのクラス（２０のアンサンブル構造のうち１７を含む）は、ＲｇＩＡとα９サブユニット（ＰＤＢ ６ＨＹ７）の結晶構造で解決された既知の相互作用をうまく再現するドッキング座標を生成する。その中から最もエネルギーの低いコンフォーマーを選び、Ｒｏｓｅｔｔａを用いてα９／α１０ ｎＡＣｈＲサブユニット界面におけるアナログ６の仮想的な結合モデルを作成した。α９の構造はＰＤＢエントリー６ＨＹ７と４Ｄ０１から、α１０のホモロジーモデル座標は以前の報告から取得した。α－ＲｇＩＡはα９（＋）／α９（－）およびα１０（＋）／α９（－）界面に優先的に結合することがインビトロの変異実験から示唆されており、α９（＋）／α９（－）とα１０（＋）／α９（－）がＲｏｓｅｔｔａでモデル化するために選択された。受容体サブユニット界面に対するアナログ６の最初のドッキングは、Ｒｏｓｅｔｔａ ＤＣｏｋｉｎｇ ＰｒｏｔＣｏｏｌを使用して行われ、アセチルコリン結合部位におけるアナログ６の開始位置のランダムな並進および回転摂動を３Åおよび８°だけ許容した。得られた１０００個の座標ファイルに対するＲｏｓｅｔｔａドッキングメトリクスＩ＿ｓｃとｒｍｓを２次元散布図にプロットしたところ、アセチルコリン結合部位（ＰＤＢファイル６ＨＹ７のＲｇＩＡに整列）にアナログ６を配置すると、最も好ましいＩ＿ｓｃスコアを得られることが判明した。Ｉ＿ｓｃとｒｍｓの間には有意な相関があり、最初のドッキング操作で収束したことが示された。界面相互作用のさらなる精密化は、［－ｄＣｏｋｉｎｇ＿ｌＣｏａｌ＿ｒｅｆｉｎｅフラグ］を使用して行われた。局所精密化の結果は、Ｉ＿ｒｍｓとＩ＿ｓｃを用いてクラスタリングされ、高得点の結果が外れ値でないことを確認し、図６ｂと６ｃに示すように、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｒｅｌａｘを用いて最終最小化演算が行われた。

【0258】

結果と考察
最後に、Ｒｏｓｅｔｔａのタンパク質－タンパク質ドッキング計算に基づいて、アナログ６の受容体へのドッキングモデルを作成し、ＳＡＲの取り組みに役立てた。我々は、α－ＲｇＩＡ／α９（＋）結晶構造（ＰＤＢ ６ＨＹ７）によって明らかになった結合相互作用が、アナログ６がα９／α１０ｎＡＣｈＲと結合する場合にも存在するとＲｏｓｅｔｔａによって予測されることを見いだした。具体的には、アナログ６残基Ａｓｐ５およびＡｒｇ７は、分子内塩橋を形成し、Ａｒｇ７上の残りのアミンは、α９（＋）およびα１０（＋）表面の両方で受容体残基Ｐｒｏ２００の骨格カルボニルに水素結合し、図６ａ－Ａおよび６ａ－Ｃに示すように、この相互関係は、報告された結晶構造とほぼ同一であった。さらに、アナログ６のＰｒｏ６は、ループＢ上のＴｒｐ１５１とＣＨ_２－π相互作用を形成する。しかし、このモデルは、リガンド結合時に受容体骨格の位置が変化することを考慮していないため、この明らかな違いは、水素結合のカットオフ距離を超えたところにある潜在的な相互作用パートナーの存在を誇張している可能性がある。その結果、α９（＋）／α９（－）界面の場合、Ａｒｇ９とＴｈｒ１５２の骨格酸素の間にさらなる相互作用があることが示された。受容体残基Ａｒｇ５９は、α１０（＋）／α９（－）とα９（＋）／α９（－）ではアナログ６残基Ｃｙｓ３、α１０（＋）／α９（－）ではＣｙｓ８のバックボーン酸素と水素結合を形成していることがわかった。最後に、残基Ｔｈｒ４は、図６ａ－Ｂおよび図６ａ－Ｄに示すように、Ａｓｐ１７１と水素結合を形成することが予測される。これらの仮説的モデルは、報告されたα－ＲｇＩＡとヒトα９（＋）表面の共複合体と一致し、これらの予測の基礎を支持するものである。しかしながら、α－ＲｇＩＡとα９α１０ｎＡＣｈＲの（－）面に関する直接的で経験的な構造データがないことから、α－ＲｇＩＡと関連アナログの完全な受容体ＥＣＤとの複合体の構造決定は今後の研究の目標である。

【0259】

実施例１－Ｆ：材料および方法
材料市販の化学物質はすべて購入し、さらに精製することなくそのまま使用した。標準的なＦｍｏｃ保護アミノ酸は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から入手した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｃｙｓ（ＳＡｃｍ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｃｉｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－３－Ｉｏｄｏ－Ｔｙｒ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（ＮＡｌｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ＯＡｌｌｙｌ）＝ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｇｌｕ（ＯＤｍａｂ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ（ＮＡｌＣｏ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨを含む特別なＦｍＣｏ保護アミノ酸は、およびＨＡＴＵ，ＨＯＢｔ，ＰｙＢＯＰを含む化学物はＣｈｅｍｉｍｐｅｘ Ｉｎｃから購入した。２－ＣＴＣレジンはＣｈｅｍＰｅｐ社から購入した。ＥＤＴ、ＤＩＥＡ、ＤＣＭ、ＴＩＰＳ、ＤＭＢＡ、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、ヨウ素、ピペリジン、ＡＣｈ、塩化カリウム、ヒト血清およびＢＳＡはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。ＤＭＦ、ＴＦＡ、酢酸、ＡＣＮ、エチルエーテルはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。オキサリプラチンはＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓから購入した。動物動物に対するすべての実験手順は、実験動物の世話と使用に関するＮＩＨガイドラインに従い、ユタ大学によるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）承認のプロトコルの下で実施された。２電極電圧クランプ実験に用いたＸｅｎｏｐｕｓ ｌｅａｖｉｓカエル卵子は、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｏｎｅから入手した。オキサリプラチン実験用のマウスはＣＢＡ／ＣａＪ近交系で、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。使用する動物の数を減らし、処置中の苦痛を最小限にするためにあらゆる努力が払われた。

【実施例2】

【0260】

実施例２－Ａ：ＲｇＩＡメチレンチオアセタールアナログの化学合成と特性評価
方法
コノトキシンアナログの合成。固相ペプチドの合成。線状ペプチドは、２－ＣＴＣ樹脂を使用して、以前に記載したようにシンセサイザー（ＳｙｚｏＩ）の自動ＦｍＣｏ－ＳＰＰＳ化学を使用して合成された。

【0261】

切断と精製ペプチドをカクテルバッファー（ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：ＴＩＰＳ：ＥＤＴ＝９５：２：２：１，３．０ｍＬ／０．１ｍｍｏｌ）で２．５時間処理して樹脂から切断した。得られたペプチド－ＴＦＡ溶液はプラスチックフィルターでろ過して冷エーテル（４０ｍＬ）中に沈殿させて－２０^ｏＣで３０分間冷却してから遠心分離によりペレット化された。粗ペプチドを冷エーテル（３０ｍＬ）で洗浄して残留ＴＦＡを除去し、真空中で乾燥させた。次に、粗生成物を、ジュピター５μＣ１８３００Å（２５０ｘ１０ｍｍ）カラムで３．０ｍＬ／ｍｉｎで、アジレント１２６０ＨＰＬＣシステムで４０分かけて５％から４５％ＡＣＮまで０．１％ＴＦＡを含むＨ_２Ｏ／ＡＣＮグラジェントで行ったＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。目的物を含む精製画分を回収し、Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ（ＬａｂＣｏｎＣｏ）で凍結乾燥した。

【0262】

ＬＣ／ＭＳ分析。ペプチドの特性評価は、アジレント１２６０四重極ＬＣ／ＭＳシステムを用い、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８３．０μｍ（１１０Å１５０ｘ３ｍｍ）カラム、流速０．４ｍＬ／分で０．１％ギ酸含有Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮグラジエントにより行った。ＨＰＬＣ精製分画、最終生成物の純度確認、安定性試験もＬＣ／ＭＳで分析した。

【0263】

メチレンチオアセタールの生成。この反応は、Ｃｒａｍｅｒによって報告されたプロトコルを用いて行った。精製した直鎖ペプチドをＨ_２Ｏに溶解し、予め混合したＴＣＥＰ^．ＨＣｌ（２．０ｅｑ．）およびＫ_２Ｃｏ_３（４．０ｅｑ．）ｉｎＨ_２Ｏ（１９．０ｍＭ）で処理した。この混合物を室温で２時間穏やかに撹拌した。次に、Ｅｔ_３Ｎ（１０．０ｅｑ．３８０ｍＭｉｎＴＨＦ）をこの混合物に加え、続いてＣＨ_２Ｉ_２（６．０ｅｑ．ＴＨＦで溶解した２３０ｍＭ）を加えた。この混合物を室温で反応させ、約６時間で線状ペプチドが完全に変換された（注：反応時間が長いと、ＲＰ－ＨＰＬＣでアミノ酸のラセミ化に起因すると思われるブロードピークが生じることがある；大規模調製では５％ＤＭＳＯを添加することができる）。Ｉ_２仲介されたジスルフィド形成。ＡＣｏＨ（ａｑ．２５％，１．０ｍＭ）中の撹拌されたビスＡｃｍ保護ペプチド溶液に、ＡＣｏＨ中のＩ_２（１０．０ｅｑ．）（５．０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。反応物を室温で１０分間撹拌し、ＬＣ－ＭＳでモニターした。過剰のＩ_２は、無色になるまで１．０Ｍのアスコルビン酸溶液を加えてクエンチし、混合物をＲＰ－ＨＰＬＣで精製してペプチドを得た。ＮＭＲ分析と生物学的アッセイを行う前に、ＲＰ－ＨＰＬＣにより純度９５％以上のペプチドを同定した。

【0264】

ペプチドの特性評価分子量は、ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋および［Ｍ＋２Ｈ］^２＋，ＲｇＩＡ－５６１７：Ｃａｌｃ １７０５．６ ８５３．３，Ｆｏｕｎｄ １７０５．４ ８５３．２；ＲｇＩＡ－５５３３：Ｃａｌｃ Ｃａｌｃ １７０５．６ ８５３．３，Ｆｏｕｎｄ １７０５．４ ８５３．４；ＲｇＩＡ－５６１８，Ｃａｌｃ １７１９．７ ８６０．４，Ｆｏｕｎｄ １７１９．６ ８６０．４；ＲｇＩＡ－５５２４，Ｃａｌｃ １８７４．９ ９３７．９，Ｆｏｕｎｄ １８７４．４，９３７．５；ＲｇＩＡ－５５７３，Ｃａｌｃ １７６８．８ ８８４．９，Ｆｏｕｎｄ １７６８．５ ８８４．９によって測定された。

【0265】

結果と考察
ＲｇＩＡアナログの化学合成は、図７ａ－Ａ、７ａ－Ｂ、７ａ－Ｃ、７ａ－Ｄに示すように、塩化２－クロロトリチル（２－ＣＴＣ）樹脂上での９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦｍＣｏ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に続いて、２操作、位置選択的分子内結合形成反応を用いて達成された。正しい足場折りたたみは、Ｃｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ，Ｃｙｓ^ＩＩ－Ｃｙｓ^ＩＶまたはそれに対応するメチレンチオアセタール置換で同じ接続性である。結合は、１）開裂によるトリチル（Ｔｒｔ）除去後の遊離Ｃｙｓ上でのメチレンチオアセタール形成、２）ｉｎ ｓｉｔｕ酸化的アセトアミドメチル（Ａｃｍ）脱保護－結合プロセスによるジスルフィド結合形成、３）繰り返しのメチレンチオアセタール形成によりビスメチレンチオアセタール置換アナログを生成、の順序で明確にを形成していた。詳細には、２－ＣＴＣ樹脂から組み立てられたペプチド鎖を切断した後、Ｔｒｔ保護剤を除去し、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ^．ＨＣｌ）、炭酸カリウムおよびトリメチルアミン（Ｅｔ_３Ｎ）の存在下でジヨードメタンで処理し目的のメチレンチオアセタル結合を形成させる。この操作変換は、１バッチで３００ｍｇという大きなスケールで行うことができ、さらなる研究のために標的ペプチドを大量に調製することが可能である。Ａｃｍ脱保護後、２５％水性酢酸（ＡＣｏＨ）中の過剰なヨウ素処理により２つ目のジスルフィド橋が形成され、完全に折り畳まれたペプチドが得られた。ＲｇＩＡおよびＲｇＩＡ４は、本明細書に記載したように合成した。すべてのペプチドを、ＲＰ－ＨＰＬＣによって示される≧９５％純度として精製し、最終生成物を、図７Ｂ－ａおよび７Ｂ－ｂ、表２Ａ－１、ならびに図７ｃから７ｇに示されるように、ＮＭＲ研究および生体アッセイの前にＥＳＩ－ＭＳによって分析した。

【表8】

【0266】

実施例２－Ｂ：ＲｇＩＡメチレンチオアセタールアナログのインビトロ生物学的評価
方法
２電極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）記録。以下のような方法に従った。簡単に言えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ｏＣｏｙｔｅｓを使用して、クローン化したラットまたはヒトｎＡＣｈＲ亜型をヘテロログで発現させた。記録は、注入後１－３日目に行った。０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含むＮＤ－９６バッファーを２－４ｍＬ／分の流速で重力灌流した３０μＬの卵母細胞チャンバー内で、卵母細胞を膜電位－７０ｍＶでボルテージクランプさせた。ベースラインを確立するために、毎分１秒のＡＣｈ（α７については２００μＭ、筋サブタイプについては１０μＭを除く、すべてのサブタイプについて１００μＭ）パルスを印加した。その後、様々な濃度の試験ペプチドを含むＮＤ９６溶液を切り替え、定常状態に達するまでＡＣｈ反応を測定した。すべての記録は室温で作成し、３－６回の独立した実験として繰り返した。データ解析はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアで行い，得られたＩＣ_５０を含む値を非線形回帰シグモイド用量反応を用いて算出した．

【0267】

結果と考察
すべての合成されたアナログの生物活性は、ｔｗｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ－ｖｏｌｔａｇｅ－ｃｌａｍｐ（ＴＥＶＣ）ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ｏＣｏｙｔｅｓ ヒトα９α１０ｎＡＣｈＲｓによってテストされた。ＲｇＩＡシリーズにおけるジスルフィド代替物としてのメチレンチオアセタールの適合性を決定するために、異なるメチレンチオアセタール置換を有する図８ａ－Ａに描かれるような一連のアナログを合成し、試験した。図８ａ－Ｂに示すように、濃度反応分析によって決定されたＩＣ_５０値。比較として、ネイティブＲｇＩＡは、ヒト受容体に対する親和性が低いため、ヒトα９α１０ｎＡＣｈＲによって媒介されるＡＣｈ誘発電流を５１０ｎＭのＩＣ_５０値で阻害する。

【0268】

ＲｇＩＡの改変体であるＲｇＩＡ４の配列にメチレンチオアセタールを導入した場合、異なる効果が生じた。具体的には、ループＩＩ［Ｃｙｓ^ＩＩ－Ｃｙｓ^ＩＶ］のジスルフィドをメチレンチオアセタールに交換したＲｇＩＡ－５５３３は、低いナノモル力価（ＩＣ_５０＝６．１ｎＭ）であった。一方、のアナログＲｇＩＡ－５６１７は、メチレンチオアセタール機能をループＩ［Ｃｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ］に移動させると、力価が驚異的に低下した（ＩＣ_５０＝８８０ｎＭ）。ＲｇＩＡ－５６１８で両方のジスルフィドを置換した場合、活性はさらに消失した（ＩＣ_５０>１０μＭ）。これらのデータは、ＲｇＩＡのループＩＩジスルフィド［Ｃｙｓ^ＩＩ－Ｃｙｓ^ＩＶ］はメチレンチオアセタールで修飾可能であるが、他の位置の置換［Ｃｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ］はヒトα９α１０ｎＡＣｈＲの活性を消失させることを示している。この結果は、ＲｇＩＡのジカルバ修飾アナログの先駆的研究（）と一致する。この研究では、［Ｃｙｓ^ＩＩ－Ｃｙｓ^ＩＶ］－ジカルバＲｇＩＡのトランス／シス異性体ともにα９α１０ｎＡＣｈＲに対する活性が大幅に低下していたが、［Ｃｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ］－ジカルバアナログは完全に不活性化された。同様に、［Ｃｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ］のジスルフィドが構造と活性に及ぼす影響も、ジスルフィド欠損のアナログを分析することによって、別のα－４／３－ＣＴｘｓＩｍＩで実証された。ＲｇＩＡ－５５３３をＲｇＩＡ５に基づく変異体および非正規アミノ酸であるβ－ホモチロシン（ｂｈＴｙｒ）で修飾し、ＩＣ_５０値が０．９ｎＭである強力なアナログＲｇＩＡ－５５２４を得ることができた。ｂｈＴｙｒの１残基をβ－アラニン（ｂＡｌａ）に変異させると、アナログＲｇＩＡ－５５７３が得られたが、このアナログはあまり強力ではなく（ＩＣ_５０＝２．９ｎＭ）、残基１３位のフェノールｍｏｉｅｔｙの影響があることが示された。

【0269】

ＲｇＩＡ－５５３３およびＲｇＩＡ－５５２４のサブタイプ選択性を検討した。２ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ－ｖｏｌｔａｇｅ－ｃｌａｍｐ（ＴＥＶＣ）電気生理では，両アナログは１０μＭで広範囲のｎＡＣｈＲサブタイプを阻害しなかった（ＩＣ_５０>１０μＭ）。１０μＭ）、図に示すように、α１β１δε、α２β２、α２β４、α３β２、α３β４α４β２、α４β４、α６／α３β２β３およびα６／α３β４が含まれることが分かった。８ａ－Ｃおよび図８ｂに示すように、α６／α３β２β３およびα６／α３β４であった。濃度反応解析は、図８ａ－Ｄに示されるように、ＲｇＩＡ－５５３３およびＲｇＩＡ－５５２４の両方が、α７ｎＡＣｈＲ上でナノモルのＩＣ_５０ｓを示し、それでもｈα９α１０ｎＡＣｈＲに対して２００倍以上の選択性を有していたことを示した。放射性リガンドとして［^１２５Ｉ］α－バンガロトキシン（α－Ｂｔｘ）を用いる競合結合アッセイを介してＲｇＩＡ－５５２４を試験すると、ＲｇＩＡ－５５２４は１０μＭレベルで４１％の阻害を生じ、図８ａ－Ｃおよび８ａ－Ｄに示すように、ｈα７ｎＡＣｈＲサブタイプに対するその低い効力と一貫することが実証された。

【0270】

実施例２－Ｃ：ＲｇＩＡ－５５２４のインビボ鎮痛効果
方法
インビボでの抗侵害活性評価。神経障害性疼痛モデル。動物に対するすべての実験手順は、実験動物の世話と使用に関するＮＩＨガイドラインに従って行われ、ユタ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）が承認したプロトコルの下で実施された。苦痛を最小化するためにあらゆる努力が払われた。雄のＣＢＡ／ＣａＪマウス（２～３ヶ月齢、）にオキサリプラチンを注射した。慢性投与群では、２１日間にわたり週５日、３．５ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチンをｉ．ｐ．投与した。急性期投与群には、５．０ｍｇ／ｋｇまたは１０．０ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチンを単回で投与した。ビヒクル対照として０．９％生理食塩水を使用した。

【0271】

コールドプレートテストホット／コールドプレート（ＩＩＴＣライフサイエンス社製）を用いてコールドプレート試験を実施した。マウスは、調査行動が収まるまで試験室に馴化させた。その後、プレート温度を室温からリニアランプ（１０^ｏＣ／分）を用いて下げた。最初の痛み関連行動（後肢の持ち上げと舐め）の時間と温度を記録した。評価者は、薬物およびマウスの遺伝子型について盲検化された。データの統計的評価は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によって行った。すべての結果は、平均値±ＳＥＭで表した（ｎ＝８－１２）。Ｐ値は、有意差について、^＊Ｐ<０．０５，^＊＊Ｐ<０．０１，および^＊＊＊Ｐ<０．００１とした。

【0272】

結果と考察
化学療法による神経障害性疼痛は、プラチン系薬剤の主要な用量制限性副作用である。現在、オキサリプラチン誘発性神経障害性疼痛の病態生理は十分に解明されておらず、この用量制限性副作用の予防薬として承認されている薬剤はない。図９に示すように、ＲｇＩＡ－５５２４のインビボ鎮痛活性を、マウスのオキサリプラチン誘発性末梢神経障害性疼痛モデルを用いて評価した。冷感アロディニアは、オキサリプラチンの無効な副作用である。この副作用の大きさおよび時間経過は、用量依存的である。ＲｇＩＡ－５５２４の毎日の反復注射は、化学療法によって引き起こされる神経障害性疼痛の発生を防止した。オキサリプラチン（ｉ．ｐ．３．５ｍｇ／ｋｇ、毎週５日）は、治療２１日目までに、コールドプレート上の足引き抜き潜時の有意な減少によって示されるように、かなりの冷感アロディニアを生じさせた。一方、ＲｇＩＡ－５５２４を４０μｇ／ｋｇ投与したオキサリプラチン投与マウスは、アロディニアを発症しなかった。

【0273】

次に、野生型およびα９ＫＯマウスを対象に、オキサリプラチン単回注射投与試験を実施した。その結果、図１０Ａおよび図１０Ｃに示すように、Ｓａｌ／ＳａｌｖｓＯｘ／ＳａｌおよびＯｘ／ＲｇＩＡ－５５２４ｖｓＯｘ／ＳａｌのＷＴ群間の有意差で示されるように、ＲｇＩＡ－５５２４はオキサリプラチン投与（ｓ．ｃ．５．０ｍｇ／ｋｇおよび１０．０ｍｇ／ｋｇ）５日後の急性冷アロディニアの回復に有効であることが示された。しかしながら、この効果は、α９ＫＯマウス群では起こらず、図１０Ｂおよび１０Ｄに示すように、Ｏｘ／ＲｇＩＡ－５５２４対Ｏｘ／Ｓａｌのα９ＫＯ群間の有意差は観察されなかった。このＫＯ実験により、ＲｇＩＡ－５５２４によるα９α１０ｎＡＣｈＲの遮断が、化学療法誘発性神経障害性疼痛の予防または減弱を可能にすることが実証された。

【0274】

実施例２－Ｄ：ＲｇＩＡ－５５２４のインビトロ薬理、毒性および代謝アセスメント
方法
インビトロ薬理学アッセイ。一般に、ＲｇＩＡ－５５２４は、最初にアッセイにおいて１０μＭの既定濃度で四重反復で試験された。二次アッセイは、ＲｇＩＡ－５５２４が放射性リガンド結合の５０％以上をブロックしたときの濃度反応曲線を決定するために実施された。

【0275】

競合結合と酵素アッセイ。細胞膜ホモジネートは、ＲｇＩＡ－５５２４の非存在下または存在下で放射性リガンドとインキュベートされた。非特異的結合は、標的の特異的アゴニストまたはアンタゴニストの存在下で決定された。インキュベーションの後、サンプルをバッファに浸したグラスファイバーフィルターを通して真空下で急速にろ過し、４８サンプルまたは９６サンプルのセルハーベスターを使用して氷冷したバッファで数回すすいだ。その後、シンチレーションカウンターでシンチレーションカクテルを用いて放射能を計数した。

【0276】

ｈＥＲＧ Ｋ^＋チャネル阻害アッセイ。ヒトｈＥＲＧトランスフェクトＣＨＯ－Ｋ１細胞の自動ホールセルパッチクランプ（Ｑｐａｔｃｈ１６）を使用して、外向きカリウム電流を記録した。２２℃で全細胞構成が達成された後、細胞を－８０ｍＶに保持した。漏洩電流を測定するために、－４０ｍＶへの５０ｍｓパルスを供給した。次に、細胞を＋２０ｍＶに２秒間脱分極し、その後－４０ｍＶに１秒間パルスを送り、ｈＥＲＧＫ^＋の尾部電流を明らかにした。このパラダイムは、電流振幅をモニターするために、５秒ごとに供給される。細胞外液が最初に適用され、続いてＲｇＩＡ－５５２４液が同じ細胞上に順次適用される。Ｅ－４０３１はリファレンスリガンドとしてテストされた。

【0277】

ＲｇＩＡ－５５２４のＧＡＢＡ_Ｂ１ｂレセプターにおける機能研究。細胞はＤＭＥＭバッファに懸濁させた後、マイクロプレートに分配した。２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）で補ったＨＢＳＳバッファー中でプロベニシドと混合したＦｌｕｏ４ＮＷを各ウェルに加え、３７℃で６０分、２２℃で１５分、細胞と平衡化させた。その後、アッセイプレートをマイクロプレートリーダーにセットし、１濃度（刺激対照）または様々な濃度（ＥＣ_５０またはＩＣ_５０決定）の参照アゴニストまたはアンタゴニスト（３－ＡＰＭＰＡ）を加え、自由細胞質Ｃａ^２＋イオン濃度に比例して変動する蛍光強度の変化を測定する。

【0278】

CYP酵素阻害アッセイ。ＲｇＩＡ－５５２４をＰＢＳ７．４中のＮＡＤＰＨ生成系と３７℃ドライインキュベータで５分間プレインキュベーションする。ＣＹＰ酵素アイソフォーム、基質、ＢＳＡの混合物を添加し、反応を開始する。インキュベーション期間の前後で、各ウェルの蛍光を読み取る。阻害率は、コントロールのパーセントを差し引くことによって算出される。

【0279】

結果と考察
さらに、最も強力なアナログであるＲｇＩＡ－５５２４は、幅広いインビトロ薬理試験により、有望な非オピオイド鎮痛剤候補であることを証明した。最初に、我々はＲｇＩＡ－５５２４を様々な疼痛関連受容体とイオンチャンネルでテストした。図１１ａ－Ａにまとめたように、ＲｇＩＡ－５５２４は１０μＭレベルで、オピオイド受容体、ＮＭＤＡＲ、ＢＺＤ、ＣｏＴ受容体、および様々な電位依存性イオンチャネル（Ｎａ^＋，Ｋ^＋&Ｃａ^２＋）を含むこれらの潜在的標的に対して低いか全く活性を示さなかった（<５０％抑制）。ＲｇＩＡ－５５２４をＮ型Ｃａ^２＋チャネルに作用させたところ、１０μＭで５８．４％の阻害と低い効力しか示さなかったが、さらなる濃度応答分析により、鎮痛作用を説明するには低すぎるマイクロモル親和性が示された。また、細胞誘電分析法を用いて、図１１ａ－Ｂ、図１１ａ－Ｄおよび図１１ａ－Ｅに示すように、ＲｇＩＡ－５５２４は、ＲｇＩＡ鎮痛作用のメカニズムとされているＧＡＢＡ_Ｂ１ｂ受容体のいかなる濃度依存性のアゴニストまたはアンタゴニスト効果も示さないことが証明された。上記のインビボα９ＫＯマウスの研究と合わせて考えると、この結果は、α９含有ｎＡＣｈＲの拮抗が、観察されたＲｇＩＡ－５５２４鎮痛作用の主要なメカニズムであることをしっかりと実証している。

【0280】

薬物誘発性心毒性は、過去数十年間、薬物離脱につながる主要な理由の１つとなっており、これは、ヒトエーテル－ア－ゴー－ゴー－関連遺伝子（ｈＥＲＧ）Ｋ^＋チャネルの遮断に密接に関連している。図１１ａ－Ｂおよび図１１ａ－Ｆに示すように、ＲｇＩＡ－５５２４が１００μＭの高濃度で<２５％の阻害を引き起こした自動ホールセルパッチクランプアッセイから、心血管系の責任に関する証拠は示されなかった。一方、ＲｇＩＡ－５５２４は、図１１Ａ－Ｃに示されるように、いくつかの神経変性障害において使用され得るアセチルコリンエステラーゼおよびＭＡＯを含む一連の酵素および取り込みアッセイにおいて不活性である。最後に、薬物－薬物相互作用に影響を及ぼすＲｇＩＡ－５５２４の可能性を評価した；図１１ａ～Ｇに示すように、１０μＭでＣＹＰ酵素アイソフォームの広いパネルに対して阻害が観察されなかった。

【0281】

実施例２－Ｅ：ＮＭＲスペクトロスコピーと構造解析
方法
構造解析。ＮＭＲ ＳｐｅｃｔｒｏｓＣｏｐｙ．ペプチドサンプル（２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０μＭ ＮａＮ_３、および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、同位体効果について未補正）を、Ｉｎｏｖａ６００ＭＨｚスペクトロメーターで２９８Ｋで記録した、１０％Ｄ_２Ｏ含有緩衝液ｐＨ３．５中に溶解した濃度２．０ｍＭで調製した。二次構造の決定は、ＴＣｏＳＹ（８０ｍｓ）、ＮＯＥＳＹ（２００ｍｓ）、ｇ１１－ＮＯＥＳＹ、ｇＣｏＳＹ、ＨＳＱＣを用いて行われた。水分の抑制には励起スカルプティングスキームを使用した。スペクトルはＮＭＲＰｉｐｅとＳＰＡＲＫＹで解析した。分子表現はＰｙＭＯＬプログラムで作成した。ＴＣｏＳＹ（青）とＮＯＥＳＹ（赤）のアミド領域とＨＳＱＣの脂肪族領域および芳香族領域を重ね合わせたもの。割り当てはＳＰＡＲＫＹを用いて行った。例えば、図１１ｂ～図１１ｊ、および表２Ｅ－１、２Ｅ－２、および２Ｅ－３（Ｓｃｓ＝Ｌ－Ｓ－メチレン－システイン；Ｃｉｔ＝Ｌ－シトルリン、Ｔｉｙ＝Ｌ－３－ヨード－チロシンとする）参照。

【表9】

【表10】

【表11】

【0282】

構造計算。二次元スペクトルからＣＹＡＮＡ３．０を用いて三次元構造を計算し、ＴＡＬＯＳプログラムで予測されたバックボーンの二面角の制約を加えた。非正規アミノ酸（Ｌ－シトルリン、Ｌ－３－ヨードチロシン、Ｌ－Ｓ－メチレン－システイン、Ｌ－β－ホモチロシン）は、前述のようにＣＹＡＮＡ３．０を用いて対応する天然アミノ酸をベースに構築された。合計２００の計算された構造のうち、最もエネルギーの低い２０のアンサンブルが、Ｃα距離測定のさらなる解析のために選ばれた。２０個の最低エネルギー構造のアンサンブルは、図１１ｊから図１１ｍに示すように、水素が省略され、計算統計が示された棒として示されたバックボーン原子（Ｎ、Ｏ、ＣαおよびＨα）に重ねられる。

【0283】

結果と考察
構造的特徴を比較対照するために，修飾されたアナログのＮＭＲ研究を行った。ＲｇＩＡ－５５３３、ＲｇＩＡ－５６１７およびＲｇＩＡ－５５２４を含む類似化合物は、ＴＣｏＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＣｏＳＹおよびＨＳＱＣを含むホモ核２Ｄ^１Ｈ－ＮＭＲ分光法で解析された。Ｎ末端Ｇｌｙ^１の一級アミンを除くすべての残基の同定が達成された。Ａｓｐ^５ＨαからＰｒｏ^６Ｈδに強いＮＯＥが観測されたことから、研究したすべての分子でＰｒｏ^４はトランスコンフォメーションであることが確認された。二次構造要素の変化を評価するために、Ｈα二次シフト分析が使用された。一般に、ＲｇＩＡ－５５３３、５５２４、および５６１７はすべて球状コンフォーメーションを維持していることがＨα二次シフトによって確認された。Ａｓｐ^５－Ｐｒｏ^６－Ａｒｇ^７とＡｒｇ／Ｃｉｔ^９－Ｔｙｒ／ｉＴｙｒ^１０－Ｇｌｎ／Ａｒｇ^１１セグメントを含む残基で微妙な変化が観察された。ＲｇＩＡ－５５３３、ＲｇＩＡ－５５２４、ＲｇＩＡ－５６１７は、二次化学シフトから、ＲｇＩＡとＲｇＩＡ４が結合したジスルフィドのアナログと明らかな違いは認められなかった。図１２Ａに示すように、主に末端の柔軟性に起因して、個々のペプチドのＣ－末端にわずかな偏差が存在した。

【0284】

これらのアナログの３次元ＮＭＲ溶液構造は，ｇ１１－ＮＯＥＳＹおよびＮＯＥＳＹ（２００ｍｓ）スペクトルから生成した原子距離および二面角拘束を用いてＣＹＡＮＡ３．０を用いて計算した。Ｈα、Ｃα、Ｃβおよびアミド水素（ＨＮ）の化学シフトに基づいて、φ、ψおよびχ１を含むバックボーン二面角拘束をＴＡＬＯＳプログラムによって予測した。２０個の最低エネルギー状態のアンサンブルを低いＲＭＳＤで得ることができた。ＲｇＩＡ（ＮＭＲ溶液構造ＰＤＢ２ＪＵＱおよび共結晶抽出物ＰＤＢ６ＨＹ７）およびＲｇＩＡ４の既報の構造とともに、「平均に最も近い」エネルギー状態を各ペプチドを表すために選択し、図１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｅ、１２Ｆおよび１２Ｇとして示し、システイン対の平均Ｃα距離はＰｙＭＯＬプログラムによって測定されたものである。すべてのメチレンチオアセタール修飾ペプチドは、ＲｇＩＡおよびＲｇＩＡ４のものに酷似した球状コンフォメーションを維持した。ＲｇＩＡ－５６１７と強力なアナログ（ＲｇＩＡ４、ＲｇＩＡ－５５３３、および５５２４）の間の最も顕著な違いは、システイン対のＣα距離であった。ＲｇＩＡ－５６１７の２つのシステインペアのＣα距離は、他の分子（平均５．４－６．１Å）に比べて明らかに短くなっている（システインループＩとループＩＩで、受容的に平均４．８Åと４．７Å）。アナログＲｇＩＡ－５６１７とＲｇＩＡ－５６１８の効力低下の理由の一つは、ループＩのジスルフィド［Ｃｙｓ^Ｉ－Ｃｙｓ^ＩＩＩ］にＣＨ_２基を挿入したことにより、これらのループＩ修飾アナログでは二面体とねじれ角の変化に対応するためにコンフォメーション「ｓｈｒｉｎｋ」を強制され、結合親和性が低下したと考えられる。また、ＭＤ刺激により、ＲｇＩＡアナログのループＩジスルフィドは、α９（＋）表面のＣループジスルフィドと直接接触することにより、受容体に対してスタッキング相互作用を与える可能性も提案されている。したがって、このループのメチレンチオアセタール置換は、この結合部位と干渉することによって効力を失う可能性があり、二次構造の変化は小さいものの、別の要因である可能性がある。

【0285】

実施例２－Ｆ：インビトロ安定性アッセイ
方法
安定性アッセイ。試験ペプチドを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ７．４に溶解し、ｓｔＣｏｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎとし、ヒト血清（ＡＢｔｙｐｅ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）または還元グルタチオン（１０等量）を含むＰＢＳ７．４でさらに希釈して最終試験ペプチド濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに設定した。その後、希釈した溶液を３７℃でインキュベートし、混合物の一部を所定の時点で取り出してＲＰ－ＨＰＬＣ分析に用いた。血清タンパクは、等容量のＡＣＮを加えた変性、氷上で１０分間冷却し、その後１３，０００ｇで１０分間遠心分離することにより除去した。上清を回収し、ＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。各時点での安定性は、ＲＰ－ＨＰＬＣ上の処理ペプチドピーク（２２０ｎｍ）の面積を、０時間処理ペプチドの面積に対するパーセンテージとして算出した。各実験は３重で行った。データは、ｓｔｕｄｅｎｔｔ（ｕｎｐａｉｒｅｄ）テストによって分析した。Ｐ値は、各時点での有意差について、^＊＊Ｐ<０．０１，^＊＊＊Ｐ<０．００１とした。

【0286】

結果と考察
一般に、ジスルフィド結合したペプチドやタンパク質は剛直な構造を持ち、その結果、プロテアーゼに対する安定性が相対的に向上する。しかし、ヒト血清中の遊離還元性チオールは、システインに富むペプチドのジスルフィド結合をスクランブルにより阻害し、酵素分解や力価の低下につながる可能性がある。メチレンチオアセタールがＲｇＩＡ４の代謝安定性にどのように影響するかを調べるために、ＲｇＩＡ－５５４４とＲｇＩＡ－５５３３のインビトロヒト血清安定性アッセイを実施した。ペプチド（０．１ｍｇ／ｍＬｉｎ９０％ヒト血清ＡＢ型）をヒト血清中で３７℃で２４時間連続インキュベートし、インキュベート後の時点０、１、２、４、８、２４時間で残存ペプチド量をＲＰ－ＨＰＬＣにより測定した。図１３Ａに示すように、ＲｇＩＡ４はその異性体ＲｇＩＡ４［１，４］に急速にスクランブルし、球状ＲｇＩＡ４の２５％未満で終了し、これは以前の観察結果と一致する。ＲｇＩＡ－５５３３はＲｇＩＡ４よりも安定であり、２４時間培養しても７０％以上のペプチドが損なわれていなかった。ＲｇＩＡ－５５２４は、図１３Ｂに示されるように、おそらくトリプシンによって切断され得るその高いアルギニンリッチ配列のために、ＲｇＩＡ－５５３３と比較してわずかに低い安定性であった。また、メチレンチオアセタールを導入すると、完全なジスルフィドスクランブル阻害が達成された。また、ＲｇＩＡ－５５２４のＲｇＩＡ４に対する安定性を、生理的ｐＨにおける還元型グルタチオン（ＧＳＨ）存在下で評価した。ヒト血清の分解結果と同様に、ＲｇＩＡ－５５２４の単一のメチレンチオアセタール置換は、図１３Ｃに示すように、ジスルフィドスクランブルを大きく抑制することが可能であった。全体として、ＲｇＩＡ－５５２４は著しく強化された安定性を示し、さらなる開発のためのより魅力的で有望な候補となる。

【0287】

実施例２－Ｇ：材料および方法
化学物質すべての化学物質は購入し、さらに精製することなく直接使用した。Ｆｍｏｃで保護されたアミノ酸および試薬はＣｈｅｍｉｍｐｅｘ，Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。卵子。２電極電圧クランプ実験に使用したＸｅｎｏｐｕｓ ｌｅａｖｉｓカエル卵子はＸｅｎｏｐｕｓ Ｏｎｅから購入した。マウス。インビボ実験に用いたＣＢＡ／ＣａＪ近交系マウス（２～３週、雄）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。

【0288】

この技術について提示されたフローチャートは、特定の実行順序を暗示する場合があるが、実行順序は図示されたものと異なる場合がある。例えば、示された順序に対して、さらに２つのブロックの順序が並べ換えられても良い。さらに、連続して示されている２つ以上のブロックは、並行して、または部分的に並列化されて実行されても良い。いくつかの構成では、フローチャートに示される１つまたはそれ以上のブロックが省略されるか、スキップされても良い。ユーティリティ、アカウンティング、パフォーマンス、測定、トラブルシューティング、または同様の理由で、任意の数のカウンタ、状態変数、警告セマフォ、またはメッセージを論理フローに追加することができる。

【0289】

本明細書を通じて「実施例」に言及することは、実施例に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の様々な場所での「実施例において」というフレーズの出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。

【0290】

図面に例示された実施例を参照し、本明細書では特定の言語を用いて同じものを説明した。それにもかかわらず、技術の範囲の限定はそれによって意図されないことが理解されるであろう。本明細書に例示された特徴の変更およびさらなる修正、ならびに本明細書に例示された実施例のさらなる適用は、本明細書の範囲内で考慮されるものとする。

【0291】

さらに、記載された特徴、構造、または特性は、１つまたはそれ以上の実施例において任意の適切な方法で組み合わされても良い。先の説明では、説明された技術の実施例の完全な理解を提供するために、様々な構成の例など、多数の具体的な詳細が提供された。しかしながら、本技術は、具体的な詳細の１つ以上なしに、または他の方法、構成要素、装置などを用いて実施され得ることが認識されるだろう。他の実施例では、技術の側面を不明瞭にすることを避けるために、周知の構造または動作は詳細に示されず、説明されない。

【0292】

主題は、構造的特徴および／または動作に特有の言語で説明されてきたが、添付の特許請求の範囲に定義される主題は、必ずしも上述した特定の特徴および動作に限定されないことが理解されよう。むしろ、上述した特定の特徴および行為は、特許請求の範囲を実施する例示的な形態として開示されている。記載された技術の精神および範囲から逸脱することなく、多数の修正および代替的な配置が考案され得る。

【0293】

前述の詳細な説明は、特定の例示的な実施形態を参照して本開示を説明するものである。しかしながら、添付の特許請求の範囲に規定される本開示の範囲から逸脱することなく、様々な修正および変更を行うことができることが理解されよう。詳細な説明および添付の図面は、制限的というよりは単に例示的とみなされ、そのような修正または変更があったとしても、全て本明細書に記載および規定された本開示の範囲内に入ることが意図されている。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図3f】

【図3g】

【図3h】

【図3i】

【図3j】

【図3k】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図5f】

【図5g】

【図5h】

【図5i】

【図5j】

【図5k】

【図5l】

【図5m】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図7d】

【図7e】

【図7f】

【図7g】

【図8a】

【図8b】

【図9】

【図10】

【図11a】

【図11b】

【図11c】

【図11d】

【図11e】

【図11f】

【図11g】

【図11h】

【図11i】

【図11j】

【図11k】

【図11l】

【図11m】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】