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2023-529895がん治療のための無機ナノ粒子をベースとしたワクチン組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-12
(54)【発明の名称】がん治療のための無機ナノ粒子をベースとしたワクチン組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20230705BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230705BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230705BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230705BHJP
A61K 47/52 20170101ALI20230705BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H
A61K39/39
A61P35/00
A61P37/04
A61K47/52
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022575761
(86)(22)【出願日】2021-05-31
(85)【翻訳文提出日】2022-12-08
(86)【国際出願番号】 CU2021050005
(87)【国際公開番号】W WO2021259397
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】CU-2020-0032
(32)【優先日】2020-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500185689
【氏名又は名称】セントロ ド インムノロジア モレキュラー
(71)【出願人】
【識別番号】518390697
【氏名又は名称】ウニベルシダ デ ラ ハバナ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス ルイス、グスタヴォ
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス マルティネス、ダヴィッド アレハンドロ
(72)【発明者】
【氏名】ボルダーリョ レオン、フェルナンド
(72)【発明者】
【氏名】サンチェス ラミレス、ベリンダ
(72)【発明者】
【氏名】レオン モンソン、カレット
(72)【発明者】
【氏名】エチェヴェリア ルナ、イエランディー
(72)【発明者】
【氏名】ルザルド ロレンツォ、マリア デル カルメン
(72)【発明者】
【氏名】クルス ロドリゲス、マベル
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス パロモ、アディス
(72)【発明者】
【氏名】サント トマス ポムパ、フリオ フェリペ
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア アルタレホ、フデイ アイメッド
(72)【発明者】
【氏名】ルイス カストロ、エレーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ロペス マティージャ、リエン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA99
4C076BB11
4C076CC06
4C076DD26
4C076EE59
4C085AA03
4C085BA99
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF01
(57)【要約】
本発明は、バイオテクノロジー、特にヒトの健康分野に関する。本発明は、ナノメートル又はサブマイクロメートルのスケール次元を有する無機ナノ粒子によって構成される核に結合した、組換えヒトＥＧＦ又はそのペプチド、及びキャリアタンパク質又はペプチドを含む系を活性原理として含む、新しいワクチン組成物を提供する。これらのワクチン組成物は、がんの慢性治療での使用に適しており、注射部位での副作用を引き起こさず、体内に蓄積されないという利点を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
上皮成長因子（ＥＧＦ）に対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物であって、無機ナノ粒子によって形成された核に結合した、組換えヒトＥＧＦ（ｒｈＥＧＦ）又はそのペプチド、及びキャリアタンパク質を含む系を活性原理として含む、上記ワクチン組成物。
【請求項2】
無機核が、カルシウム、鉄、亜鉛、マグネシウム、ジルコニウム、セリウム、ベリリウム、ケイ素、又はこれらの２種以上の混合物を含む群から選択される塩、酸化物又は水酸化物により形成されていることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項3】
無機核がリン酸カルシウムであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項4】
リン酸カルシウムがヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項5】
ＨＡｐが非晶質型であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項6】
ＨＡｐが低結晶性を有することを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項7】
ヒドロキシアパタイトは、有機リガンドによって部分的にコーティングされていることを特徴とする、請求項１～６のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項8】
有機リガンドがクエン酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項9】
キャリアタンパク質が、‐コレラ毒素Ｂサブユニット、
‐破傷風トキソイド、
‐ＫＬＨ及び
‐髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰ６４ｋ
を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項10】
活性原理がＨＡｐナノ粒子の表面にあることを特徴とする、請求項１～９のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項11】
活性原理が以下の方法：‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドとの化学コンジュゲートと、ＨＡｐナノ粒子との共有結合、
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドと、ＨＡｐナノ粒子との独立した方法での共有結合、
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドと、ＨＡｐナノ粒子との連続的な共有結合、
‐ＨＡｐの表面でのｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドの多重コンジュゲーション、
‐ＨＡｐの表面でのｒｈＥＧＦとキャリアタンパク質又はペプチドとのカプセル化又は物理的結合、
の１つによってＨＡｐナノ粒子に結合されていることを特徴とする、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項12】
‐不完全なフロイントアジュバント、‐スクアレンベースのアジュバント、
‐合成起源アジュバント、
‐鉱物起源アジュバント、
‐植物起源アジュバント、
‐動物起源アジュバント、
‐微粒子タンパク質アジュバント、及び
‐リポソーム
を含む群から選択される他のアジュバントと組み合わせた、請求項１～９のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項13】
請求項１～１０のいずれかに記載のワクチン組成物の、がんの慢性的治療への使用。
【請求項14】
請求項１～９のいずれかに記載のワクチン組成物の治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象の治療方法。
【請求項15】
前の免疫応答誘導段階が、ＥＧＦに対する別のワクチン組成物で達成される、請求項１２に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー、特に人間の健康分野に関するものである。特に、上皮成長因子に対する免疫応答を誘導するナノ粒子化系を含み、したがってがん治療薬として有用な新しいワクチン製剤を記載するものである。
【背景技術】
【0002】
上皮起源組織の腫瘍は、一般にその表面に上皮成長因子（ＥＧＦ）の受容体を過剰に発現している。自己ＥＧＦがその受容体（ＥＧＦＲ）に結合することで、腫瘍を増殖させ、免疫系による防御から逃れる腫瘍のメカニズムが活性化される。この知見に基づき、１９９０年代以降、ＥＧＦは肺がんやその他の上皮起源がんの治療標的として同定され、ＥＧＦとその受容体の結合が関連することが分かってきた。
【0003】
ＥＧＦＲ‐標的抗体を用いた受動的免疫療法の評価を目的とした多くの研究が行われている。以前は、マウス起源の抗体による受容体の特異的認識が、悪性細胞の分裂促進を阻害することが示された（Ｓａｔｏ Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１４６：６３‐８１）。ＵＳ５，８９１，９９６特許に公開された別の研究では、ＥＧＦＲの過剰発現を有する腫瘍において診断又は治療の役割を果たすことができるキメラ及びヒト化モノクローナル抗体が記載されている。
【0004】
能動免疫療法は、がんと闘い、慢性的に管理可能な疾患に変える可能性があることから、ここ数年、その使用が急速に拡大している。受動的療法とは異なり、能動的療法は、腫瘍やその発生を促す他の要素に対して作用するように免疫系を刺激することに基づくものである。特に、必要な投与量が少量の活性物質を含むだけなので、毒性が軽減されるという利点がある。
【0005】
ＵＳ５，８９４，０１８特許に言及されている製剤は、自己ＥＧＦに対する免疫応答を引き起こすワクチン組成物を特許請求している。これは、水酸化アルミニウムでアジュバントされたキャリアタンパク質（コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風トキソイド、モノクローナル抗体又は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜からのタンパク質）に結合した自己ＥＧＦを含む。一方、ＵＳ８，７７８，８７９特許は、がん患者における治療的使用のためのワクチン組成物を記載しており、活性原理として、組み換えヒトＥＧＦ（ｒｈＥＧＦ）と組み換えタンパク質Ｐ６４ｋの化学コンジュゲートを有している。これには、化学コンジュゲートの純度と免疫原性活性を向上させる化学コンジュゲートの精製手順が記載されている。この組成物は、水酸化アルミニウム又はモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）であり得るアジュバントを含む。
【0006】
その後の臨床試験により、前述の発明に由来する治療用ワクチンは、進行期の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の治療に対して安全かつ有効であることが実証された（Ｒｏｄｒiｇｕｅｚ Ｐ．Ｃ．ａｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６），２２（１５）：３７８２‐３７９０）。しかし、高い生存率（５年以上）を達成した患者は、アジュバントが含む鉱油の蓄積の結果、注射部位の筋肉（三角筋と臀部）の損傷に苦しむことが証明された。そのため、最終的には治療を中断せざるを得なくなったり、リンパ器官からより離れた筋肉への接種が必要になったりする患者がいる。
【0007】
免疫学的アジュバントは、組換えタンパク質から開発されたワクチンの免疫原性を高める必要性から発生した。最初に使用されたアジュバントは、１９２６年のアルミニウムの二重硫酸塩であった。その後、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、ジルコニウム、セリウム、ベリリウム、シリコンなど、さまざまな無機アジュバントが評価された。しかし、ヒトではアルミニウム塩とカルシウム塩の使用のみが承認されている（Ｐａｎｅｑｕｅ‐Ｑｕｅｖｅｄｏ Ａ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）３０：２４３‐２４９）。これまでに行われたすべての研究において、無機アジュバントは異種抗原と組み合わせて使用された。
【0008】
水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムのアジュバントは、アルミニウムが有毒で人体での代謝が悪いため、慢性的な治療にはあまり適していない。アルミニウムの蓄積によるヒトの健康への影響は十分に立証されており、具体的には中枢神経系、筋骨格系、呼吸器系、循環器系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系などへの影響である（Ｎａｙａｋ Ｐ．，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｃｔｉｏｎ ＴＯ（２００２），８９：１０１‐１１５；Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅｎ Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ（２００８）８２：７８９‐８０２；Ｆｌａｔｅｎ Ｔ．Ｐ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（２００１）２：１８７‐１９６）。
【0009】
一方、リン酸カルシウム（以下ＣａＰ）は、免疫学的アジュバントとして有用であることが実証されている無機物質である。米国特許２，９６７，８０２号では、丹毒抗原と水和ＣａＰゲルの混合物が特許請求されている。研究及びその後の特許において、ＣａＰに吸着されたいくつかの病原性及びアレルギー性微生物によって引き起こされる感染に対する予防ワクチンが開発された（ＵＳ３，６０８，０７１，ＵＳ４０１６２５２；ＵＳ４３５０６８６；ＵＳ２０１２０１２１７１４；Ｃｏｕｒｓａｇｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ（１９８６）５１（３）：７８４‐７８７）。
【0010】
水酸化物やリン酸アルミニウムの場合と同様に、ＣａＰアジュバントの免疫学的効果は、ゆっくりと放出される抗原のデポの形成に基づいており、これにより、接種した抗原に対する応答を生成するのに十分な免疫系への提示時間を延長することができる。ＵＳ８，３３３，９９６特許は、以下のような抗原の吸着によって形成される免疫原性系の開発を特許請求している：百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｉｓ）、アレルゲン、ヒト免疫不全症（ＨＩＶ‐２）不活性化ウイルス、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジフテリア、破傷風トキソイド、連鎖球菌、弱毒性細菌又はウイルス、ポリオ及びＡ型及びＢ型肝炎に対するワクチン。それらは、さらにＤＮＡ及びサイトカイン吸着、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）なども含まれている。
【0011】
ＵＳ６，３５５，２７１特許では、３００～４０００ｎｍの直径を持つＣａＰ粒子の調製方法が特許請求されており、これは塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、及びクエン酸ナトリウムの水性混合物をベースとしており、ＨＳＶ‐１、ＨＳＶ‐２、ＥＢＶウイルス、ＤＮＡ、並びにオボバルブミン、結核菌抗原を吸着させるためのものである。
【0012】
最近の研究では、ＣａＰをワクチンアジュバントとして、あるいは様々な医薬品の放出に使用することが評価されている。その中でも、粒子状のヒドロキシアパタイト系（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、以下ＨＡｐ）の開発、好ましくはナノ粒子の形態での開発を評価する研究が関連している。この物質は、骨組織の主な無機成分であるため、その生体適合性が保証される。さらに、非晶質又は低結晶性のＨＡｐは、生体媒体と接触することで生分解される。粒子径の縮小と選択された材料により、水酸化アルミニウムと比較して、アジュバントとして優れた特性を発揮する。それらは、よりバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を生じさせ、ＩｇＥ型抗体の生成を少なくする（Ｑｉｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）７（６）：８９９‐９０３；Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１４）３２：４２３４‐４２４２；Ｌｉｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１７），１６（９）：８９５‐９０６。また、この物質は生体適合性があり、非晶質形態では生分解性であるため、注射部位の副作用を軽減する。
【0013】
ＷＯ２００５０８４６３７特許は、ＣａＰナノ粒子の核と、核の粒子に封入された生物学的に活性な高分子と、表面修飾剤とを含む系を特許請求している。生物学的に活性な高分子は、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、核酸、ポリヌクレオチド、脂質、又は炭水化物であり得る。
【0014】
一方、ＷＯ２００３０５１３９４発明は、アジュバントとして使用するために、１つの製剤に異なるタイプのコーティングを施したナノ粒子化されたＨＡｐを示している。その中で、ナノ粒子は、粘膜の表面に適用されるネイティブ又は組換え抗原又は他の薬理学的薬剤のキャリアとして採用されている。
他の研究、一般的にＣａＰの、特にＨＡｐナノ粒子の免疫学的アジュバント又は活性物質キャリアとしての開発及び応用は、がんを含む感染性又は免疫系疾患の治療のために採用されると主張している（ＵＳ５，４４３，８３２；ＵＳ６，３５５，２７１；ＵＳ６，７６７，５５０；ＵＳ２００２００６８０９０；ＵＳ７，７７６，６００；ＷＯ２０１７０２５３５９）。
他の研究、一般的にＣａＰの、特にＨＡｐナノ粒子の免疫学的アジュバント又は活性物質キャリアとしての開発及び応用は、がんを含む感染性又は免疫系疾患の治療のために採用されると主張している（ＵＳ５，４４３，８３２；ＵＳ６，３５５，２７１；ＵＳ６，７６７，５５０；ＵＳ２００２００６８０９０；ＵＳ７，７７６，６００；ＷＯ２０１７０２５３５９）。
【0015】
これまでの報告には、ＣａＰ粒子の表面に構築された、ｒｈＥＧＦ分子とキャリアタンパク質との化学的結合から独立して、又は両者のコンジュゲーション（結合）によって、ＥＧＦ又は他の自己タンパク質に対する特異的免疫応答を誘導するワクチン組成物は、記載されていない。
【発明の概要】
【0016】
本発明の新規性は、自己抗原と化学的に連結した生分解性無機ナノ粒子を核とする、がんの慢性的治療のための新しいワクチン組成物を提供することである。ナノメートル又はサブマイクロメートルの大きさのＣａＰ粒子、特にＨＡｐと、ｒｈＥＧＦ又はそのペプチド、及びＥＧＦに対する免疫応答を引き起こすことができる別のタンパク質又はキャリアペプチドとの結合により。これらの新規組成物は、ＥＧＦに対する応答を起こす既存の組成物に比べ、注射部位での副作用がなく、体内に蓄積されないという点で優れている。また、１本のバイアルに分注されるため、使用時に混合液や乳化液の調製などの追加的な手順を必要としない。
【0017】
発明の簡単な説明
一実施形態において、本発明は、ＥＧＦに対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物に関するものである。ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドと、塩、カルシウム酸化物又は水酸化物、鉄、亜鉛、マグネシウム、ジルコニウム、セリウム、ベリリウム、ケイ素、又はそれらの２つ以上の混合物であり得る生分解性無機ナノ粒子によって形成された核に連結したキャリアタンパク質又はペプチドとを含む系を活性原理として含むことを特徴とする。好ましくは、無機核は、ＣａＰ、より詳細にはＨＡｐ型を含む。このＨＡｐは、好ましくは非晶質又は低結晶性であり、部分的又は全体的に有機リガンド、特にクエン酸ナトリウムでコーティングされている。
一実施形態において、本発明は、ＥＧＦに対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物に関するものである。ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドと、塩、カルシウム酸化物又は水酸化物、鉄、亜鉛、マグネシウム、ジルコニウム、セリウム、ベリリウム、ケイ素、又はそれらの２つ以上の混合物であり得る生分解性無機ナノ粒子によって形成された核に連結したキャリアタンパク質又はペプチドとを含む系を活性原理として含むことを特徴とする。好ましくは、無機核は、ＣａＰ、より詳細にはＨＡｐ型を含む。このＨＡｐは、好ましくは非晶質又は低結晶性であり、部分的又は全体的に有機リガンド、特にクエン酸ナトリウムでコーティングされている。
【0018】
さらに、タンパク質又はペプチドキャリアは、コレラ毒素Ｂサブユニット、破傷風トキソイド、ＫＬＨ、及び髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰ６４ｋを含む群から選択される。
【0019】
また、本発明のワクチン組成物の活性原理は、以下のいずれかの方法によって結合したＨＡｐナノ粒子の表面にある：
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドとの化学コンジュゲートと、ＨＡｐナノ粒子との共有結合（ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ）。
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドと、ＨＡｐナノ粒子との独立した方法での共有結合（ＨＡｐ‐ＰＩ）。
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドと、ＨＡｐナノ粒子との連続的な共有結合。
‐ＨＡｐの表面でのｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドとの間の多重コンジュゲーション（ＨＡｐ‐ＣＭ）。
‐ＨＡｐの表面でのｒｈＥＧＦとキャリアタンパク質又はペプチドとのカプセル化又は物理的吸着。
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドとの化学コンジュゲートと、ＨＡｐナノ粒子との共有結合（ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ）。
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドと、ＨＡｐナノ粒子との独立した方法での共有結合（ＨＡｐ‐ＰＩ）。
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドと、ＨＡｐナノ粒子との連続的な共有結合。
‐ＨＡｐの表面でのｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドとの間の多重コンジュゲーション（ＨＡｐ‐ＣＭ）。
‐ＨＡｐの表面でのｒｈＥＧＦとキャリアタンパク質又はペプチドとのカプセル化又は物理的吸着。
【0020】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のワクチン組成物と、不完全フロイントアジュバント、スクアレンベースアジュバント、合成起源アジュバント、鉱物起源アジュバント、植物起源アジュバント、動物起源アジュバント、微粒子タンパク質アジュバント及びリポソームを含む群から選択されるアジュバントとの組み合わせを企図するものである。
【0021】
追加の実施形態では、本発明の目的は、がんの慢性的な治療のための本明細書に記載されたワクチン組成物の使用である。
【0022】
本発明のさらなる目的は、本明細書に記載されたワクチン組成物の治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象の治療方法を提供することである。この方法は、ＥＧＦに対する別のワクチン組成物で達成された免疫応答の誘導を維持するという点で特に特徴的である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
発明の詳細な説明
本発明は、有機リガンドでコーティングされた生分解性無機ナノ粒子の合成、その化学的活性化、及び共有結合又は静電相互作用による、ＥＧＦに対する特異的免疫応答を誘導する抗原との結合と、この粒子表面への構築を含む。
本発明は、有機リガンドでコーティングされた生分解性無機ナノ粒子の合成、その化学的活性化、及び共有結合又は静電相互作用による、ＥＧＦに対する特異的免疫応答を誘導する抗原との結合と、この粒子表面への構築を含む。
【0024】
生分解性無機ナノ粒子の取得と活性化
本発明は、ナノメートル、サブマイクロメートル又はマイクロメートルのスケールサイズの生分解性無機粒子を形成することを含む。これらの粒子は、有機リガンド、好ましくはクエン酸ナトリウムでコーティングされ、沈殿によって得られるが、この方法は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
本発明は、ナノメートル、サブマイクロメートル又はマイクロメートルのスケールサイズの生分解性無機粒子を形成することを含む。これらの粒子は、有機リガンド、好ましくはクエン酸ナトリウムでコーティングされ、沈殿によって得られるが、この方法は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0025】
生分解性粒子は、塩、酸化物又は水酸化カルシウム、鉄、亜鉛、マグネシウム、ジルコニウム、セリウム、ベリリウム、ケイ素、又はそれらの２つ以上の混合物によって形成される無機核を有する。好ましくはＣａＰ、より好ましくは非晶質ＨＡｐ、又は１種以上の金属が同型置換された非晶質ＨＡｐにより形成される。
【0026】
無機粒子の形成には、カルシウムイオンとリン酸イオンの供給源と、表面電荷と生体分子との化学結合を可能にする官能基をそれらに付与する有機リガンドが使用される。
【0027】
本発明に記載の免疫治療系に用いられる粒子は、以下の特性のうち少なくとも１つを有することを特徴とする：
‐それらは、金属又は他のイオンの同型置換を有することができる生分解性無機粒子によって形成される。
‐それらは、好ましくは湿式合成によって、より好ましくは沈殿によって得られるが、この方法は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
‐それらは、マイクロメートル、サブマイクロメートル、ナノメートルサイズ、又はそれらの組み合わせを有する。
‐それらは、球状、円筒状、又は板状の形態又はそれらの組み合わせを有するが、これらの形態は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
‐それらは、好ましくは、抗原とのコンジュゲーションを可能にする表面電荷及び官能基をそれらに付与する有機リガンドでコーティングされる。
‐それらは、金属又は他のイオンの同型置換を有することができる生分解性無機粒子によって形成される。
‐それらは、好ましくは湿式合成によって、より好ましくは沈殿によって得られるが、この方法は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
‐それらは、マイクロメートル、サブマイクロメートル、ナノメートルサイズ、又はそれらの組み合わせを有する。
‐それらは、球状、円筒状、又は板状の形態又はそれらの組み合わせを有するが、これらの形態は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
‐それらは、好ましくは、抗原とのコンジュゲーションを可能にする表面電荷及び官能基をそれらに付与する有機リガンドでコーティングされる。
【0028】
本発明に記載の無機微粒子を得るために、好ましくは、以下のことが必要である：
‐カチオンとアニオンのモル比を１：４の間に維持すること。
‐クエン酸ナトリウム又は反応物に同様の効果を有する他の有機リガンドを、カルシウムイオン含有量に対して３：５の間のモル比を提供するのに十分な量で添加すること。
‐アルカリ、好ましくは水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウムの添加によって、ｐＨを７～１３に調整すること。
‐１～４時間、好ましくは室温（２０±５℃）で反応を行うこと。
‐真空乾燥プロセスを室温で行うこと。
‐カチオンとアニオンのモル比を１：４の間に維持すること。
‐クエン酸ナトリウム又は反応物に同様の効果を有する他の有機リガンドを、カルシウムイオン含有量に対して３：５の間のモル比を提供するのに十分な量で添加すること。
‐アルカリ、好ましくは水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウムの添加によって、ｐＨを７～１３に調整すること。
‐１～４時間、好ましくは室温（２０±５℃）で反応を行うこと。
‐真空乾燥プロセスを室温で行うこと。
【0029】
先に述べた条件で得られた、カルボキシレート基を含む有機リガンド、好ましくはクエン酸ナトリウムで部分的又は完全にコーティングされた無機粒子は、カルボジイミド系の架橋試薬又は同様の機能を有する別のものを添加することにより活性化される。このプロセスでは、試薬／粒子の質量比は１～６、好ましくは２～５ｍｇ／ｍｇのものが使用される。懸濁液は室温（２０±５℃）で１～４時間、好ましくは０．５～３時間攪拌下に保たれる。その後、活性化された粒子は、好ましくは遠心分離又は濾過のプロセスによって精製される。
【0030】
先に述べた手順により、表面が活性化され、官能基が露出したタンパク質に結合する能力を有する、主なサイズが≦２００ｎｍの粒子が得られる。上記の特性により、活性原理のカプセル化又は物理的吸着のために無機粒子から開発された以前のものより優れたものとなる。
【0031】
抗ＥＧＦ応答の誘導のためのナノ粒子系の達成
先に活性化した粒子を、組換えタンパク質ｒｈＥＧＦ及びｒＰ６４ｋからの化学コンジュゲートと、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ／ＨＡｐ質量比１～１０、好ましくは２～７ｍｇ／ｍｇで、混合する。先に述べた反応により、コンジュゲートのアミン基（ＮＨ２）と粒子表面のカルボキシレート基（ＣＯＯ－）の間にアミド型の共有結合が生じる。また、ＨＡｐの表面に残っているカルシウム基とｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの間には静電的な相互作用が生じ、それは負に帯電し、カルボキシル基が露出させる。次に、コロイド懸濁液は、好ましくはＥＤＴＡで分散され、最後にそのｐＨが６．７から７．３の間の値に調整される。
先に活性化した粒子を、組換えタンパク質ｒｈＥＧＦ及びｒＰ６４ｋからの化学コンジュゲートと、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ／ＨＡｐ質量比１～１０、好ましくは２～７ｍｇ／ｍｇで、混合する。先に述べた反応により、コンジュゲートのアミン基（ＮＨ２）と粒子表面のカルボキシレート基（ＣＯＯ－）の間にアミド型の共有結合が生じる。また、ＨＡｐの表面に残っているカルシウム基とｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの間には静電的な相互作用が生じ、それは負に帯電し、カルボキシル基が露出させる。次に、コロイド懸濁液は、好ましくはＥＤＴＡで分散され、最後にそのｐＨが６．７から７．３の間の値に調整される。
【0032】
別の実現形態では、組換えタンパク質ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋの化学的コンジュゲートは、ｒＰ６４ｋ又は別のキャリアタンパク質とｒｈＥＧＦの１つ又はいくつかのペプチドのコンジュゲートによって置換される。
【0033】
本発明に記載のコンジュゲートの無機粒子の表面への結合、これは先に規定した手順によって起こる。その結果、ＵＳ５，８９４，０１８特許及びＵＳ８，７７８，８７９特許に記載のワクチン製剤とは実質的に異なる組成を有する、がんの治療のための、このタイプの最初の新規な系が得られる。この系を接種すると、循環するＥＧＦを捕捉し、腫瘍表面の受容体への結合を阻止することができる抗ＥＧＦ抗体の生成を含む免疫応答が生じる。
【0034】
無機粒子への抗原の共有結合によって得られた系は安定で、非経口製剤に要求されるような長期間の保存が可能である。この特徴により、この系は、無機粒子から出発して活性原理のカプセル化又は吸着法により先に開発された免疫療法又は薬物送達系より優れている。
【0035】
抗ＥＧＦ応答の誘導のための、共有結合と静電相互作用による無機粒子上のコンジュゲートのコンフォメーション
本発明は、共有結合と静電相互作用によって、抗ＥＧＦ免疫応答を誘導する系の構築のための他の方法を含んでおり、次に詳述される。
本発明は、共有結合と静電相互作用によって、抗ＥＧＦ免疫応答を誘導する系の構築のための他の方法を含んでおり、次に詳述される。
【0036】
‐無機ナノ粒子へのｒｈＥＧＦ又はそのペプチド及びキャリアタンパク質又はそのペプチドの結合。
先に述べた方法論で得られた、予めカルボジイミド、好ましくは１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で活性化した粒子を、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋをｒｈＥＧＦ／ｒＰ６４ｋモル比３～９、好ましくは４～８で含む、ｐＨ７±０のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）滅菌液と混合する。また、使用するＨＡｐ／ｒＰ６４ｋ及びＨＡｐ／ｒｈＥＧＦの質量比は、１～６、好ましくは２～５ｍｇ／ｍｇである。その後、懸濁液を室温で１～４時間、より好ましくは２～３時間攪拌を続ける。
先に述べた方法論で得られた、予めカルボジイミド、好ましくは１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で活性化した粒子を、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋをｒｈＥＧＦ／ｒＰ６４ｋモル比３～９、好ましくは４～８で含む、ｐＨ７±０のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）滅菌液と混合する。また、使用するＨＡｐ／ｒＰ６４ｋ及びＨＡｐ／ｒｈＥＧＦの質量比は、１～６、好ましくは２～５ｍｇ／ｍｇである。その後、懸濁液を室温で１～４時間、より好ましくは２～３時間攪拌を続ける。
【0037】
さらなる実現形態では、組換えタンパク質ｒＰ６４ｋは、破傷風トキソイド、ＫＬＨ等のキャリアタンパク質に置換される。本発明はまた、天然又は合成起源の１つ又はいくつかの免疫原性ペプチドによるｒＰ６４ｋタンパク質の置換を含む。
【0038】
さらなる実現形態では、ｒｈＥＧＦは、その１つ又はいくつかのペプチドによって置換される。
【0039】
上記の方法により、ｒｈＥＧＦ及びｒＰ６４ｋタンパク質が、互いに結合することなく、化学的及び静電的相互作用によりナノ粒子に結合した系が得られる。無機粒子は、系の免疫原性を確保する連結のための構造要素を構成している。さらに、系の形成に必要なｒｈＥＧＦの量を４０％まで減らし、ＵＳ５，８９４，０１８発明及びＵＳ８，７７８，８７９発明に使用されているグルタルアルデヒドの毒性に関連するリスクを軽減する。
【0040】
‐２つの反応ステップによる、ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はそのペプチドのコンジュゲーション。
先に記載した方法論で得られた、カルボジイミド、好ましくはＥＤＣで予め活性化されたナノ粒子を、１～６、好ましくは２～５の質量比でｒＰ６４ｋを含むＰＢＳ、ｐＨ７±０．３の溶液と混合する。この懸濁液を室温で１～４時間、好ましくは２～３時間撹拌し続ける。その後、過剰のタンパク質ｒＰ６４ｋを除去し、好ましくはＥＤＣで活性化し、次に過剰のＥＤＣを除去し、ｒＰ６４ｋ当たりｒｈＥＧＦの１～１０、好ましくは２～６のモル比でｒｈＥＧＦと混ぜ合わせる。
先に記載した方法論で得られた、カルボジイミド、好ましくはＥＤＣで予め活性化されたナノ粒子を、１～６、好ましくは２～５の質量比でｒＰ６４ｋを含むＰＢＳ、ｐＨ７±０．３の溶液と混合する。この懸濁液を室温で１～４時間、好ましくは２～３時間撹拌し続ける。その後、過剰のタンパク質ｒＰ６４ｋを除去し、好ましくはＥＤＣで活性化し、次に過剰のＥＤＣを除去し、ｒＰ６４ｋ当たりｒｈＥＧＦの１～１０、好ましくは２～６のモル比でｒｈＥＧＦと混ぜ合わせる。
【0041】
さらなる実現形態では、破傷風トキソイド、ＫＬＨ又は別のキャリアタンパク質が、組換えタンパク質ｒＰ６４ｋを置換する。本発明はまた、天然又は合成起源の１つ又はいくつかの免疫原性ペプチドによるｒＰ６４ｋタンパク質の置換を含む。
【0042】
さらなる実現形態では、ｒｈＥＧＦは、その１つ又はいくつかのペプチドによって置換される。
【0043】
この手法では、キャリアタンパク質が生分解性無機ナノ粒子と化学的又は静電的相互作用によって結合し、さらにｒｈＥＧＦと結合した系が生成される。この方法では、遊離のｒｈＥＧＦやｒＰ６４ｋを含まない、２層の高純度タンパク質から形成されるｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートが生成される。このコンジュゲートは、ＵＳ５，８９４，０１８及びＵＳ８，７７８，８７９発明のｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートに比べて優れており、得られたｒｈＥＧＦの４０％超は生物学的な関連性のない遊離型である。また、前述の２つの発明で使用されているグルタルアルデヒドの毒性に関連するリスクを低減する。
【0044】
‐無機粒子の表面へのｒｈＥＧＦ又はそのペプチドと、キャリアタンパク質又はそのペプチドの多重コンジュゲーション。
先に述べた方法論で得られた、カルボジイミド、好ましくはＥＤＣであらかじめ活性化された粒子を、ｒｈＥＧＦ及びｒＰ６４ｋを含むＰＢＳ、ｐＨ７±０．３の溶液と混合する。両タンパク質は、活性化された粒子及び活性化後に溶解して残る過剰なＥＤＣと反応し、タンパク質同士及び粒子表面と結合する。この結果を得るためには、ｒｈＥＧＦ／ｒＰ６４ｋのモル比が３～９、好ましくは４～８を採用する必要がある。また、使用する粒子／ｒＰ６４ｋ及び粒子／ｒｈＥＧＦの質量比は１～６、好ましくは２～５の間である。これらは、室温で１～４時間、より好ましくは２～３時間攪拌を継続する。
先に述べた方法論で得られた、カルボジイミド、好ましくはＥＤＣであらかじめ活性化された粒子を、ｒｈＥＧＦ及びｒＰ６４ｋを含むＰＢＳ、ｐＨ７±０．３の溶液と混合する。両タンパク質は、活性化された粒子及び活性化後に溶解して残る過剰なＥＤＣと反応し、タンパク質同士及び粒子表面と結合する。この結果を得るためには、ｒｈＥＧＦ／ｒＰ６４ｋのモル比が３～９、好ましくは４～８を採用する必要がある。また、使用する粒子／ｒＰ６４ｋ及び粒子／ｒｈＥＧＦの質量比は１～６、好ましくは２～５の間である。これらは、室温で１～４時間、より好ましくは２～３時間攪拌を継続する。
【0045】
さらなる実現形態では、破傷風トキソイド、ＫＬＨ又は別のキャリアタンパク質がｒＰ６４ｋ組換えタンパク質を置換する。本発明はまた、天然又は合成起源の１つ又はいくつかの免疫原性ペプチドによるｒＰ６４ｋタンパク質の置換を含む。
【0046】
さらなる実現形態では、ｒｈＥＧＦは、その１つ又はいくつかのペプチドによって置換される。
【0047】
ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの複合マトリックスが生成され、これらのタンパク質は無機ナノ粒子をコーティングするリガンドと連結している。これまでの実現例と同様に、この系でも抗ＥＧＦ抗体による免疫応答が生じる。また、系の形成に必要なｒｈＥＧＦの量を最大４０％低減し、ＵＳ５，８９４，０１８及びＵＳ８，７７８，８７９の発明で使用されたグルタルアルデヒドの毒性に関連するリスクを低減する。
【0048】
無機粒子へのカプセル化又は吸着による抗ＥＧＦ応答を誘導するための系の構築
先に述べた手順で得られた化学結合系は、より安定でワクチン製剤に適しているが、抗原のカプセル化や吸着もまた有用な手順である。そのため、本発明は、無機核とｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲート又はｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋ又はそのペプチドを、粒子内部又は表面に吸着させた免疫原を合成する方法を提供するものである。
先に述べた手順で得られた化学結合系は、より安定でワクチン製剤に適しているが、抗原のカプセル化や吸着もまた有用な手順である。そのため、本発明は、無機核とｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲート又はｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋ又はそのペプチドを、粒子内部又は表面に吸着させた免疫原を合成する方法を提供するものである。
【0049】
‐ｒｈＥＧＦコンジュゲートとキャリアタンパク質又はそのペプチドの無機粒子へのカプセル化。
カルシウムイオンとリン酸イオンを有するソースを水溶液中で混合し、陽イオンと陰イオンの適切なモル比１．４～３．５が維持されることを確認する。ｒｈＥＧＦ‐Ｐ６４ｋコンジュゲートを、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ／無機ナノ粒子の質量比が１～１０、より好ましくは２～７となるように添加する。その後、水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウムをｐＨ８～１０になるまで添加し、室温で１～４時間撹拌下に反応を継続する。反応が終了したら、好ましくは精製水で洗浄し、濾過により分離する。この手順により、粒子の正電荷基とコンジュゲートのカルボキシレート基の間、及び粒子の負電荷基とコンジュゲートのアミン基の間の相互作用により結合したｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートを内部及び表面に含むナノ粒子及びマイクロ粒子が生成される。
カルシウムイオンとリン酸イオンを有するソースを水溶液中で混合し、陽イオンと陰イオンの適切なモル比１．４～３．５が維持されることを確認する。ｒｈＥＧＦ‐Ｐ６４ｋコンジュゲートを、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ／無機ナノ粒子の質量比が１～１０、より好ましくは２～７となるように添加する。その後、水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウムをｐＨ８～１０になるまで添加し、室温で１～４時間撹拌下に反応を継続する。反応が終了したら、好ましくは精製水で洗浄し、濾過により分離する。この手順により、粒子の正電荷基とコンジュゲートのカルボキシレート基の間、及び粒子の負電荷基とコンジュゲートのアミン基の間の相互作用により結合したｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートを内部及び表面に含むナノ粒子及びマイクロ粒子が生成される。
【0050】
さらなる実現形態では、破傷風トキソイド、ＫＬＨ又は別のキャリアタンパク質が、組換えｒＰ６４ｋタンパク質を置換する。本発明はまた、ｒＰ６４ｋタンパク質を、天然又は合成起源の１つ又はいくつかの免疫原性ペプチドで置換することを含む。
【0051】
さらなる実現形態では、ｒｈＥＧＦは、その１つ又はいくつかのペプチドによって置換される。
【0052】
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はそのペプチドの無機粒子へのカプセル化。
この手順は、先に述べたものと同様であるが、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋが、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの代わりに、１～１０の質量比、さらに好ましくは２～７で溶解物に添加される点のみが異なる。このプロセスの間、ｒＰ６４ｋあたり１～１０のｒｈＥＧＦのモル比が維持され、より好ましくはｒＰ６４ｋあたり２～５のｒｈＥＧＦが維持される。反応が終了したら、好ましくは精製水で洗浄し、濾過により分離する。この手順により、粒子の正電荷基とコンジュゲートのカルボキシレート基との間の静電相互作用、及び粒子の負電荷基とコンジュゲートのアミン基との間の静電相互作用により結合したｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートを、内部及び表面に含むナノ粒子及びマイクロ粒子を生成させる。
この手順は、先に述べたものと同様であるが、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋが、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの代わりに、１～１０の質量比、さらに好ましくは２～７で溶解物に添加される点のみが異なる。このプロセスの間、ｒＰ６４ｋあたり１～１０のｒｈＥＧＦのモル比が維持され、より好ましくはｒＰ６４ｋあたり２～５のｒｈＥＧＦが維持される。反応が終了したら、好ましくは精製水で洗浄し、濾過により分離する。この手順により、粒子の正電荷基とコンジュゲートのカルボキシレート基との間の静電相互作用、及び粒子の負電荷基とコンジュゲートのアミン基との間の静電相互作用により結合したｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートを、内部及び表面に含むナノ粒子及びマイクロ粒子を生成させる。
【0053】
別の実現形態では、破傷風トキソイド、ＫＬＨ又は別のキャリアタンパク質が、組換えタンパク質ｒＰ６４ｋを置換する。本発明はまた、天然又は合成起源の１つ又はいくつかの免疫原性ペプチドによるｒＰ６４ｋタンパク質の置換を含む。
【0054】
さらなる実現形態では、ｒｈＥＧＦは、その１つ又はいくつかのペプチドによって置換される。
【0055】
‐無機粒子へのｒｈＥＧＦコンジュゲート及びキャリアタンパク質又はそのペプチドの吸着。
クエン酸ナトリウムでコーティングされた前述の粒子を、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートを１～１０の質量比で、さらに好ましくは２～７の質量比で含むＰＢＳ溶解液、ｐＨ７±０．３と混合する。それらを室温で１～４時間、より好ましくは２～３時間攪拌を保つ。この手順から得られる系は、２００ｎｍより小さい寸法のナノ粒子が主体である。ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートは、ナノ粒子表面の正電荷基とコンジュゲートのカルボキシレート基との間の静電相互作用、及びクエン酸塩のカルボキシレート基とコンジュゲートのアミン基との間の静電相互作用によって結合されている。
クエン酸ナトリウムでコーティングされた前述の粒子を、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートを１～１０の質量比で、さらに好ましくは２～７の質量比で含むＰＢＳ溶解液、ｐＨ７±０．３と混合する。それらを室温で１～４時間、より好ましくは２～３時間攪拌を保つ。この手順から得られる系は、２００ｎｍより小さい寸法のナノ粒子が主体である。ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートは、ナノ粒子表面の正電荷基とコンジュゲートのカルボキシレート基との間の静電相互作用、及びクエン酸塩のカルボキシレート基とコンジュゲートのアミン基との間の静電相互作用によって結合されている。
【0056】
他の実現形態では、破傷風トキソイド、ＫＬＨ又は他のキャリアタンパク質が、組換えタンパク質ｒＰ６４ｋを置換する。本発明はまた、天然又は合成起源の１つ又はいくつかの免疫原性ペプチドによるｒＰ６４ｋタンパク質の置換を含む。
【0057】
さらなる実現形態では、ｒｈＥＧＦは、その１つ又はいくつかのペプチドによって置換される。
【0058】
‐無機粒子へのｒｈＥＧＦ又はそのペプチド及び担体タンパク質又はそのペプチドの吸着。
ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの代わりに、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋを１～１０質量比、より好ましくは２～７質量比で溶液に添加することのみが異なる、先の実現形態に記載したものと同様の手順を実施する。このプロセスでは、ｒＰ６４ｋあたりｒｈＥＧＦの１～１０のモル比、より好ましくはｒＰ６４ｋあたりｒｈＥＧＦの２～５を維持することが必要である。この手順により、粒子の正電荷基とタンパク質のカルボキシレート基との間の相互作用、及び粒子の負電荷基とタンパク質のアミン基との間の相互作用によって結合したｒｈＥＧＦ及びｒＰ６４ｋ分子を表面に含むナノ粒子及び微粒子が生成される。
ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの代わりに、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋを１～１０質量比、より好ましくは２～７質量比で溶液に添加することのみが異なる、先の実現形態に記載したものと同様の手順を実施する。このプロセスでは、ｒＰ６４ｋあたりｒｈＥＧＦの１～１０のモル比、より好ましくはｒＰ６４ｋあたりｒｈＥＧＦの２～５を維持することが必要である。この手順により、粒子の正電荷基とタンパク質のカルボキシレート基との間の相互作用、及び粒子の負電荷基とタンパク質のアミン基との間の相互作用によって結合したｒｈＥＧＦ及びｒＰ６４ｋ分子を表面に含むナノ粒子及び微粒子が生成される。
【0059】
さらなる実現形態では、破傷風トキソイド、ＫＬＨ又は別のキャリアタンパク質が、組換えタンパク質ｒＰ６４ｋを置換する。本発明はまた、天然又は合成起源の１つ又はいくつかの免疫原性ペプチドによるｒＰ６４ｋタンパク質の置換を含む。
【0060】
さらなる実現形態では、ｒｈＥＧＦは、その１つ又はいくつかのペプチドによって置換される。
【0061】
先に述べた新規な微粒子系は、生分解性無機コア上に形成される。このコアは、自己抗原、好ましくは組換えタンパク質ｒｈＥＧＦ及びｒＰ６４ｋの化学コンジュゲート、又は前記タンパク質若しくはそのペプチドに個別に結合している。これらの系は、アミド型共有結合、カプセル化、又はナノ粒子表面への吸着によって維持される。それらはＥＤＴＡで分散し、ｐＨを７±０．３に調整した後、非経口的に投与されるがん治療用ワクチン製剤の基剤となるものである。
【0062】
医薬組成物及び治療方法
本発明から得られる医薬製剤は、上皮組織起源がんの治療に有用である。例えば：扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、肝細胞がん、胃がん、胃腸がん、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、大腸がん、頭頸部及び子宮がん、グリア芽腫、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肛門がん及び陰茎がんなどである。
本発明から得られる医薬製剤は、上皮組織起源がんの治療に有用である。例えば：扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がん、肝細胞がん、胃がん、胃腸がん、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、大腸がん、頭頸部及び子宮がん、グリア芽腫、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肛門がん及び陰茎がんなどである。
【0063】
これらは単独で、あるいはアジュバントと組み合わせて使用することができ、これらによって生成される抗ＥＧＦ抗体応答を増強あるいは補完することができる。
【0064】
特に、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋタンパク質に結合した生分解性無機ナノ粒子系と、不完全フロイントアジュバント、スクアレンベースアジュバント、合成、鉱物、植物又は動物起源アジュバントなどの油脂性アジュバントとの組み合わせは本発明の目的である。また、同様に、粒子状タンパク質アジュバント及びリポソーム、又は液性免疫応答若しくは細胞媒介性免疫応答を生成若しくは増強することができる他のアジュバント若しくは系、又はこれらの組合せも挙げられる。上記の系は、ＵＳ８，７７８，８７９特許に記載の製剤で、又は同様の結果を提供する別の系で生成された、抗ＥＧＦ抗体免疫応答の以前の誘導を効果的に維持するものである。
【0065】
先に述べた組み合わせは、それで処置すると注射部位での体内異物の蓄積を避け、それゆえ投与に伴う毒性をもたらさないため、上皮組織起源がんの慢性治療に有利である。
【0066】
本発明に含まれる抗ＥＧＦ系は、薬学的に適切な賦形剤を使用する。これらの賦形剤には、注射用水、塩化ナトリウム、リン及びカリウム塩、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム及びＥＤＴＡが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらは、タンパク質濃度０．５～５ｍｇ／ｍＬ、投与量２０～７０μＬ／ｋｇ又は総タンパク質２０～７０μｇ／ｋｇ又は総タンパク質５ｍｇまで、より好ましくは３０～６０μｇ／ｋｇの範囲で、非経口製剤として上皮組織起源がんの患者に接種することができる。投与する本発明で定義される無機成分の用量は、ヒトにおける筋肉内又は皮下経路による投与のための承認された用量範囲内であれば、２～４．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは３～４ｍｇ／ｋｇの間であろう。
【0067】
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに詳しく説明される。ただし、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0068】
【図1】Ｘ線回折パターン：Ａ）本発明で得られた非晶質ＨＡｐ粒子。Ｂ）標準的なＨＡｐパターン‐ＪＣＰＤＳ：ＰＤＦ Ｒｅｆ．０９‐０４３２。
【図2】ＦＴＩＲスペクトル：Ａ）本発明で得られた非晶質ＨＡｐ粒子。Ｂ）クエン酸ナトリウム。
【図3】電子透過顕微鏡で測定した、本発明で得られた非晶質ＨＡｐ粒子のサイズ。Ａ）２５０００倍の倍率で記録された粒子の画像。Ｂ）５０００００倍の倍率で記録された粒子の画像。Ｃ）粒子のサイズ分布。
【図4】本発明で得られた非晶質ＨＡｐナノ粒子のサーモグラム。
【図5】動的光散乱（ＤＬＳ）の方法で決定した、共有結合したＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系のサイズ分布。
【0069】
【図6】以下によるＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系の特性評価。Ａ）ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ：１‐分子量パターン。２‐ＵＳ８，７７８，８７９発明に従って生成したｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの陽性対照。３‐ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系。Ｂ）ウェスタンブロットプロファイル：１‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの陽性対照、２‐ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系。
【図7】ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系を共有結合して免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスと対照グループ（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ）の抗ＥＧＦ抗体応答。
【図8】ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系で免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスと対照グループ（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ）の血清に含まれる抗体サブクラス（ＩｇＧ２ｂ＋ＩｇＧ２ｃ）／ＩｇＧ１の比率。
【図9】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系とＭｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系の注射部位の効果の写真。Ａ）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系の効果。Ｂ）ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系の効果。
【図10】ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系とＶＳＳＰを組み合わせたもので、及びリポソームにカプセル化したｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋで、免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ＥＧＦ抗体応答。
【0070】
【図11】ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系とＶＳＳＰを組み合わせたもので、及びリポソームにカプセル化したｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋで、免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清に含まれる抗体サブクラス（ＩｇＧ２ｂ＋ＩｇＧ２ｃ）／ＩｇＧ１の比率。
【図12】以前に１回又は２回のＭｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系の投与により免疫応答を誘導した、ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系の抗ＥＧＦ抗体応答の維持。
【図13】ＤＬＳにより測定した、粒子上に構築されたＨＡｐ‐ＰＩ系のサイズ分布。
【図14】Ａ）ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ：１‐分子量パターン、２‐ｒＰ６４ｋの陽性対照、３‐ｒｈＥＧＦの陽性対照、４‐ＨＡｐ‐ＰＩ系、及びＢ）ウェスタンブロットプロファイル：１‐ｒＰ６４ｋの陽性対照、２‐ＨＡｐ‐ＰＩ系、によるＨＡｐ‐ＰＩ系の特性評価。
【図15】ＤＬＳで測定したＨＡｐ‐ＣＭ系のサイズ分布。
【0071】
【図16】Ａ）ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ：１‐分子量パターン、２‐ＵＳ８，７７８，８７９発明に従って生成したｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの陽性対照、３‐ＨＡｐ‐ＣＭ系、及びＢ）ウェスタンブロットプロファイル １‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの陽性対照、２‐ＨＡｐ‐ＣＭ系、によるＨＡｐ‐ＣＭ系の特性評価。
【図17】ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ、ＨＡｐ‐ＰＩ及びＨＡｐ‐ＣＭ系で免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ＥＧＦ抗体応答。
【図18】ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ、ＨＡｐ‐ＰＩ及びＨＡｐ‐ＣＭ系及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ対照で免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清に含まれる抗体サブクラス（ＩｇＧ２ｂ＋ＩｇＧ２ｃ）／ＩｇＧ１の比率。
【図19】Ｃ５７ＢＬ／６マウスの接種部位で抽出した筋組織と隣接する筋組織の組織切片の写真画像、１０倍拡大。★は線維芽細胞性修復組織を表す。マウスには、以下のものを投与した。Ａ‐Ｃ：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ、Ｄ：ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ、Ｅ：ＨＡｐ‐ＣＭ、Ｆ：ＨＡｐ‐ＰＩ。
【図20】ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ、ＨＡｐ‐ＰＩ及びＨＡｐ‐ＣＭ系、及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ対照で免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの注射部位の組織で見られた病変の数。
【実施例】
【0072】
例１ ＨＡｐナノ粒子の合成、特性評価、及び活性化
Ｋｏｒｏｌｅｖａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１６），６１（６）６７４‐６８０）によって記載された手順の修正された変形版に従って、クエン酸ナトリウムでコーティングされた非晶質ＨＡｐのナノ粒子を得た。環境条件を制御して、ＣａＣｌ２ ０．０５ｍｏｌ／Ｌとクエン酸ナトリウムをクエン酸ナトリウム／カルシウムのモル比４：１で形成した溶液を調製した（Ａ液）。次に、ＮａＨ２ＰＯ４ ０．０６ｍｏｌ／Ｌで形成された無菌Ｂ液を、Ｃａ／Ｐモル比１．６７を維持しながら１ｍＬ／ｍｉｎの流速で添加した。その後、反応液を水酸化ナトリウムの溶解液でｐＨ１０に調整し、室温で３時間攪拌を継続した。反応が終了したら、精製水で洗浄し、１０ｋＤａのアミコンポリエーテルスルホン膜を用いて濾過分離した。得られた固体を室温で真空乾燥した。次に、純水蒸気で１２０℃で３０分間滅菌した後、真空乾燥した。
Ｋｏｒｏｌｅｖａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１６），６１（６）６７４‐６８０）によって記載された手順の修正された変形版に従って、クエン酸ナトリウムでコーティングされた非晶質ＨＡｐのナノ粒子を得た。環境条件を制御して、ＣａＣｌ２ ０．０５ｍｏｌ／Ｌとクエン酸ナトリウムをクエン酸ナトリウム／カルシウムのモル比４：１で形成した溶液を調製した（Ａ液）。次に、ＮａＨ２ＰＯ４ ０．０６ｍｏｌ／Ｌで形成された無菌Ｂ液を、Ｃａ／Ｐモル比１．６７を維持しながら１ｍＬ／ｍｉｎの流速で添加した。その後、反応液を水酸化ナトリウムの溶解液でｐＨ１０に調整し、室温で３時間攪拌を継続した。反応が終了したら、精製水で洗浄し、１０ｋＤａのアミコンポリエーテルスルホン膜を用いて濾過分離した。得られた固体を室温で真空乾燥した。次に、純水蒸気で１２０℃で３０分間滅菌した後、真空乾燥した。
【0073】
Ｘ線回折法により、結晶化度９．３％、結晶子サイズ１６．５ｎｍのＨＡｐ非晶質ナノ粒子が生成していることが実証された（図１）。この方法では、４５ｋＶ、４０ｍＡで作動する管内の銅放射線（ＣｕＫα）が使用された。範囲は１０°から９０°で、９秒間隔で０．０１３°のステップで照射した。
【0074】
図２に、ナノ粒子（Ａ）と対照として用いたクエン酸ナトリウム（Ｂ）のフーリエ変換赤外分光スペクトル（ＦＴＩＲ）を示す。ナノ粒子のスペクトルにおいて、１０９０，１０３０，９６２，６０４，５６１，４７２ｃｍ－１に観測されるバンドから、ＨＡｐに対応するリン酸基の存在が確認された。また、３４００ｃｍ－１には、残留水とＯＨ－基に起因する広いバンドが観測された。また、両スペクトルにおいて１６１０ｃｍ－１と１４１３ｃｍ－１にクエン酸のカルボキシル基のバンドが観測され、表面上にこのリガンドが存在することが確認された。
【0075】
電子透過顕微鏡で測定したナノ粒子は、球状の形態を示し（図３Ａ及び３Ｂ）、平均サイズは６２±１３ｎｍであった（図３Ｃ）。
サーモグラフィーでは、ナノ粒子表面のクエン酸ナトリウムの存在に関連し、２００℃超の温度で６．２％の質量減少が確認された（図４）。分析温度範囲は２５℃～１０００℃、加熱速度は２０Ｋ／分、アルゴン流量は６０ｍＬ／分で行った。
サーモグラフィーでは、ナノ粒子表面のクエン酸ナトリウムの存在に関連し、２００℃超の温度で６．２％の質量減少が確認された（図４）。分析温度範囲は２５℃～１０００℃、加熱速度は２０Ｋ／分、アルゴン流量は６０ｍＬ／分で行った。
【0076】
非晶質ＨＡｐのナノ粒子は、制御された環境条件下で、質量比ＥＤＣ／ＨＡｐを２：１に維持したＥＤＣの無菌溶解液で１時間処理された。その後、懸濁液を６７０８ｇで遠心分離し、過剰なＥＤＣを除去した。
【0077】
例２ 非晶質ＨＡｐナノ粒子とｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの間の共有結合によるＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系の獲得
例１に記載の手順で得られ活性化された非晶質ＨＡｐのナノ粒子を、制御された環境条件下で、ＵＳ８，７７８，８７９発明に記載の方法論で得られたｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ化学コンジュゲートを含むＰＢＳ、ｐＨ７±０．３の無菌溶液と、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ／ＨＡｐ質量比１：２．５で混合した。形成された懸濁液を、室温で２時間、毎分１４０サイクルの振盪下に保った。
例１に記載の手順で得られ活性化された非晶質ＨＡｐのナノ粒子を、制御された環境条件下で、ＵＳ８，７７８，８７９発明に記載の方法論で得られたｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ化学コンジュゲートを含むＰＢＳ、ｐＨ７±０．３の無菌溶液と、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ／ＨＡｐ質量比１：２．５で混合した。形成された懸濁液を、室温で２時間、毎分１４０サイクルの振盪下に保った。
【0078】
得られたＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系をＥＤＴＡで分散し、ＰＢＳと水酸化ナトリウムの滅菌溶液でｐＨ７±０．３、タンパク質濃度１±０．２ｍｇ／ｍＬに調整した。
【0079】
ＤＬＳアッセイにより、平均流体力学的直径９７．５ｎｍ、多分散性指数０．３６のナノ粒子の存在が確認された。得られた系は、強度で測定した粒子径が９～３６６ｎｍの範囲にある多分散性であった（図５）。
【0080】
先に説明した手順によって得られたナノ粒子系を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって特性評価した（図６）。電気泳動では、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートは、陽性対照のものと類似したバンドのパターン（すなわち、６６ｋＤａ以上の分子量を有する優勢なバンド）を有し、これは系内のコンジュゲートの存在を示していた。ウェスタンブロットアッセイでは、遊離のｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの対照と同様のバンドが観察され、分子量２００ｋＤａ超のコンジュゲートにｒｈＥＧＦが存在することが示された。この分析により、ナノ粒子に結合したｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートは、抗ＥＧＦ抗体によって依然として認識されるという事実によって確認されるように、その構造的及び機能的完全性を維持することができることが証明された。
【0081】
例３ ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系は、注射部位に目に見える副作用なしに、ＥＧＦに対する液性応答を生成する。
Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝５）マウスを、例２に記載の系に含まれる、６３μｇのタンパク質で免疫化した。ＵＳ８，７７８，８７９発明に記載の方法論で得られた生成物のバッチ（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ）を、アッセイの陽性対照として使用した。４回の投与からなる免疫化プロトコルを適用した（日数：０、１４、２８、４２）。
Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝５）マウスを、例２に記載の系に含まれる、６３μｇのタンパク質で免疫化した。ＵＳ８，７７８，８７９発明に記載の方法論で得られた生成物のバッチ（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ）を、アッセイの陽性対照として使用した。４回の投与からなる免疫化プロトコルを適用した（日数：０、１４、２８、４２）。
【0082】
免疫プロトコルを開始する２日前、及び３５日目と５６日目に、ＥＧＦに対する総ＩｇＧ抗体価を、両グループのマウスでＥＬＩＳＡ法により測定した。また、５６日目の免疫血清において、ＥＧＦに特異的な比率（ＩｇＧ２ｂ＋ＩｇＧ２ｃ）／ＩｇＧ１が測定された。統計解析は、Ｋｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓの平均値の比較検定を用いて行い、異なる文字は統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を示した。
【0083】
ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系は抗ＥＧＦ抗体を生成し、それは５６日目に１／１００００の希釈で免疫血清中に検出することができた（図７）。この結果は、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートの粒子への結合がコンジュゲートの完全性に影響を与えないこと、そしてＨＡｐがグループ間対照のものよりも著しく低いにもかかわらず抗ＥＧＦ液性応答を増強させることを示している。一方、比率（ＩｇＧ２ｂ＋ＩｇＧ２ｃ）／ＩｇＧ１では、ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系と対照（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ）で得られた応答に統計的に有意差はなかった（図８）。どちらの系でも、優勢な応答は液性タイプ（Ｔｈ２）であり、これにより上皮組織起源がんの治療の一環として、ＥＧＦの枯渇に非常に適した系となっている。
【0084】
注入部位におけるＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系の効果を決定した。この目的のために、５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを例２に記載の抗ＥＧＦ系（ＨａＰ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ）で処理し、５匹をＭｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ対照で処理した。ワクチン接種プロトコルは、以前に記載したものと同様であった。実験を終了した後、２つの処理グループからのマウスの注射部位の写真画像を撮影した。図９Ａに見られるように、対照グループのマウスでは、注入部位にモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）投与に起因する鉱油の蓄積が見られた。一方、例２に記載の手順に従って製造したＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系で処理したマウスでは（図９Ｂ）、注射部位に損傷は見られなかった。これらの結果から、本発明で開発した新規な系は、注射部位の損傷を大幅に軽減することができ、慢性投与、特に数年にわたる定期的な接種を必要とするがんの治療に大きな可能性を示すことがわかった。
【0085】
例４ ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系と粒子状アジュバントとの組み合わせにより、抗ＥＧＦＩｇＧ抗体応答を生じさせ、Ｔｈ１型応答パターンを誘導する。
５匹ずつ３グループに分けたＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。動物は以下の方法で免疫された。
５匹ずつ３グループに分けたＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。動物は以下の方法で免疫された。
【0086】
グループ１：ＵＳ８，７７８，８７９に記載のワクチン組成物のタンパク質６３μｇ（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒｈＰ６４ｋ）（陽性対照）。
グループ２：ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系のタンパク質６３μｇとナノ粒子アジュバントＶＳＳＰのタンパク質１００μｇ。
グループ３：脱水‐再水和の方法論によって得られたリポソーム小胞（ＤＲＶ）中にカプセル化された、ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系のタンパク質３１．５μｇ及びｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲート３１．５μｇ（Ｋｉｒｂｙ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８４）２：９７９～９８４）。
グループ２：ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系のタンパク質６３μｇとナノ粒子アジュバントＶＳＳＰのタンパク質１００μｇ。
グループ３：脱水‐再水和の方法論によって得られたリポソーム小胞（ＤＲＶ）中にカプセル化された、ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系のタンパク質３１．５μｇ及びｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲート３１．５μｇ（Ｋｉｒｂｙ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８４）２：９７９～９８４）。
【0087】
免疫は０日目、１４日目、２８日目、４２日目に行った。プロトコル開始の２日前、及び３５日目、５６日目に採血を行い、得られた血清中のＥＧＦに対する総ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。血清中のＥＧＦに特異的な比率（ＩｇＧ２ｂ＋ＩｇＧ２ｃ）／ＩｇＧ１も５６日目に決定した。統計解析は、Ｋｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓの平均値の比較検定によって行い、異なる文字は統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を示す。
【0088】
抗ＥＧＦ抗体の生成は、調査した３つのグループで証明された。ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系とＶＳＳＰ及びＤＲＶリポソームの組み合わせは、１／１００００の希釈まで免疫血清中で検出可能で、２回の抽出の間に同じだった抗体を生み出した（図１０）。対照に対する組み合わせの統計的な有意差の存在が示された。
【0089】
５６日目にＥＧＦに特異的な比率（ＩｇＧ２ｂ＋ＩｇＧ２ｃ）／ＩｇＧ１を解析したところ、どちらのアジュバントの組み合わせも同様の応答を示し、対照と比較して両方とも統計的に優れていた（図１１）。これらの結果は、ＨＡｐベースの製剤と他の粒子状アジュバントとの組み合わせが、標的がん治療に最も好ましい優れたＴｈ１応答パターンを誘導するＥＧＦに対する特異的免疫応答を増強することを実証した。
【0090】
例５ ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋで以前に誘導された抗ＥＧＦＩｇＧ抗体応答を維持する。
３グループのＣ５７ＢＬ／６マウスを用い（ｎ＝５）、これを０、１４、２８、４２、７０日目に以下の免疫スケジュールで免疫した。
３グループのＣ５７ＢＬ／６マウスを用い（ｎ＝５）、これを０、１４、２８、４２、７０日目に以下の免疫スケジュールで免疫した。
【0091】
グループ１。（対照）マウスを、ＵＳ８，７７８，８７９特許に記載の系（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒｈＰ６４ｋ）に含まれるタンパク質６３μｇで免疫した。
グループ２。マウスを、０日目にＭｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒｈＰ６４ｋ系に含まれる６３μｇのタンパク質で免疫し、残りの免疫時には同量のＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒｈＰ６４ｋ系に含まれるタンパク質で免疫した。
グループ３。マウスを、０日目と１４日目にＭｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒｈＰ６４ｋ系に含まれるタンパク質６３μｇで免疫し、残りの免疫時にはＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系に含まれるタンパク質を同じ量で免疫した。
グループ２。マウスを、０日目にＭｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒｈＰ６４ｋ系に含まれる６３μｇのタンパク質で免疫し、残りの免疫時には同量のＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒｈＰ６４ｋ系に含まれるタンパク質で免疫した。
グループ３。マウスを、０日目と１４日目にＭｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒｈＰ６４ｋ系に含まれるタンパク質６３μｇで免疫し、残りの免疫時にはＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系に含まれるタンパク質を同じ量で免疫した。
【0092】
初回免疫の２日前に免疫前血清を抽出し、３５、５６、８４日目に免疫血清の抽出を行い、ＥＬＩＳＡ法によりＥＧＦに対する総ＩｇＧ抗体価を定量化した。
【0093】
抗ＥＧＦ抗体価は、調査した３つの時期において、３５日目の１／５００００希釈、５６日目と８４日目の１／１０００００希釈で、３グループ間で統計的有意差なく検出可能であった（図１２）。ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系の接種により、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系によって誘導された抗ＥＧＦ ＩｇＧ抗体応答を、調査した期間中、維持することが可能であった。この結果は、抗ＥＧＦ免疫応答の維持段階におけるｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートのアジュバントとして、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）の代わりにＨＡｐを用いることが可能であり、上皮起源がんの慢性治療における適性を支持するものである。
【0094】
例６ 非晶質ＨＡｐナノ粒子表面へのｒｈＥＧＦ及びｒＰ６４ｋタンパク質の共有結合によるＨＡｐ‐ＰＩ系の構築
例１に記載の方法論に従って得られた、クエン酸ナトリウムであらかじめコーティングされ、ＥＤＣで活性化されたＨＡｐナノ粒子を、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋをｒＰ６４ｋあたり６ｒｈＥＧＦのモル比及びタンパク質／ＨＡｐの質量比１：２．５で含む無菌ＰＢＳ溶液、ｐＨ７±０．３と制御環境条件の下で混合した。形成された懸濁液を、室温で２時間、毎分１４０サイクルの振盪下に保った。この手順により、タンパク質がＨＡｐナノ粒子に結合しているが、互いに結合していないという特徴を持つｒｈＥＧＦ‐ＨＡｐ‐ｒＰ６４ｋ系が得られた。この系をＥＤＴＡで分散させ、ｐＨを７±０．３に、タンパク質濃度を１±０．２ｍｇ／ｍＬに調整した。
例１に記載の方法論に従って得られた、クエン酸ナトリウムであらかじめコーティングされ、ＥＤＣで活性化されたＨＡｐナノ粒子を、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋをｒＰ６４ｋあたり６ｒｈＥＧＦのモル比及びタンパク質／ＨＡｐの質量比１：２．５で含む無菌ＰＢＳ溶液、ｐＨ７±０．３と制御環境条件の下で混合した。形成された懸濁液を、室温で２時間、毎分１４０サイクルの振盪下に保った。この手順により、タンパク質がＨＡｐナノ粒子に結合しているが、互いに結合していないという特徴を持つｒｈＥＧＦ‐ＨＡｐ‐ｒＰ６４ｋ系が得られた。この系をＥＤＴＡで分散させ、ｐＨを７±０．３に、タンパク質濃度を１±０．２ｍｇ／ｍＬに調整した。
【0095】
図１３にＤＬＳで測定した粒子径プロファイルを示す。平均直径は１１１．２ｎｍであり、多分散性指数は０．３４７であった。得られた系は、サイズ、多分散性及びＤＬＳプロファイルの点で、例２で生成されたものと同様であった。以上のことから、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋが互いに結合せず、ＨＡｐナノ粒子に結合している場合、ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋコンジュゲートのものと同様の分散性を有していたことが示される。
【0096】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥアッセイの結果を示す図１４Ａに見られるように、ＨＡｐ‐ＰＩ系に対応するレーンでは、ｒＰ６４ｋタンパク質に特徴的な６６ｋＤａの高さにメインバンドが現れ、さらにｒｈＥＧＦ対照（６ｋＤａ）と同様の高さに別のバンドが現れている。これらの結果から、両組換えタンパク質はＨＡｐナノ粒子に結合しており、還元しても互いに結合していないため、特徴的な分子量を維持していることが示された。
【0097】
図１４Ｂに示すように、レーン１と２に約６６ｋＤａの高さのバンドがあり、ＨＡｐ‐ＰＩ系内にｒＰ６４ｋタンパク質が存在すること、さらにタンパク質がＨＡｐナノ粒子に結合したときにその完全性を維持することが確認された。
【0098】
例７ ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋタンパク質の多重コンジュゲーションによる非晶質ＨＡｐナノ粒子表面へのＨＡｐ‐ＣＭ系の構築
例１で得られた非晶質ＨＡｐナノ粒子を、ＨＡｐあたりのＥＤＣの質量比を２．７に保ちながら、滅菌ＥＤＣ溶液で環境条件を制御して１時間処理した。次に、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋをｒＰ６４ｋあたり６ｒｈＥＧＦのモル比、タンパク質／ＨＡｐの質量比１：２．５で含む滅菌ＰＢＳ溶液（ｐＨ７±０．３）を添加した。形成された懸濁液は、室温で２時間、毎分１４０回の振盪下に保たれた。
例１で得られた非晶質ＨＡｐナノ粒子を、ＨＡｐあたりのＥＤＣの質量比を２．７に保ちながら、滅菌ＥＤＣ溶液で環境条件を制御して１時間処理した。次に、ｒｈＥＧＦとｒＰ６４ｋをｒＰ６４ｋあたり６ｒｈＥＧＦのモル比、タンパク質／ＨＡｐの質量比１：２．５で含む滅菌ＰＢＳ溶液（ｐＨ７±０．３）を添加した。形成された懸濁液は、室温で２時間、毎分１４０回の振盪下に保たれた。
【0099】
この手順の結果、互いに結合した組み換えタンパク質とナノ粒子に結合した組み換えタンパク質の両方でコーティングされたＨＡｐナノ粒子によって形成される系が得られた。この系をＥＤＴＡで分散させ、ｐＨを７±０．３に調整した。その後、タンパク質濃度が１±０．２ｍｇ／ｍＬになるまでＰＢＳ溶液で希釈した。
【0100】
先に述べた多重コンジュゲーションにより、ＤＬＳで測定した平均サイズが９０．２ｎｍ、多分散性指数が０．３３７の複合体ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系が得られた（図１５）。
【0101】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動及びウェスタンブロットによる特性評価により、タンパク質のコンジュゲーションが確認された。抗ＥＧＦ抗体を認識するｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ陽性対照と同様の生成物が得られた（図１６）。
【0102】
例８ ＨＡｐナノ粒子上に構築された新しい系は、抗ＥＧＦ ＩｇＧ抗体応答を生成し、注射部位でより少ない数の表皮病変を生成する
Ｃ５７ＢＬ／６マウス５匹ずつの３つのグループを、以下の系に含まれる、６３μｇのタンパク質で免疫した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス５匹ずつの３つのグループを、以下の系に含まれる、６３μｇのタンパク質で免疫した。
【0103】
グループ１：例２に記載の方法論に従って得られたＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒｈＰ６４ｋ系。
グループ２：例６に記載の方法論に従って得られたＨＡｐ‐ＰＩ系。
グループ３：例７に記載の方法論に従って得られたＨＡｐ‐ＣＭ系。
グループ２：例６に記載の方法論に従って得られたＨＡｐ‐ＰＩ系。
グループ３：例７に記載の方法論に従って得られたＨＡｐ‐ＣＭ系。
【0104】
免疫は０日目、１４日目、２８日目、４２日目に行った。採血は、プロトコル開始の２日前、及び３５日目、５６日目に行った。得られた血清中のＥＧＦに対する総ＩｇＧ抗体価を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。血清中のＥＧＦに特異的な比率（ＩｇＧ２ｂ＋ＩｇＧ２ｃ）／ＩｇＧ１も５６日目に決定した。統計解析は、Ｋｒｕｓｋａｌ‐Ｗａｌｌｉｓの平均値の比較検定によって行い、異なる文字は統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を示す。
【0105】
ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋとＨＡｐ‐ＣＭ系は、３５日目と５６日目に免疫血清中に１／１００００希釈まで、ＨＡｐ‐ＰＩ系では１／８０００希釈まで検出可能な抗ＥＧＦ抗体を生成した（図１７）。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥとウェスタンブロットで得られた結果を確認すると（例６と７）、ＨＡｐ‐ＰＩ系ではｒｈＥＧＦがｒＰ６４ｋと共有結合していないが、ＨＡｐナノ粒子上に構築した系はすべて免疫原性であることが実証された。この系は、ｒｈＥＧＦをキャリアタンパク質に化学的に結合させることなく、抗ＥＧＦ応答免疫を引き起こす系を作り出すことが可能であることを示す証拠となる。
【0106】
（ＩｇＧ２ｂ ＩｇＧ２ｃ）／ＩｇＧ１の比率を解析した結果、両者の応答に統計的な有意差は見られなかった。優勢な応答は液性タイプ（Ｔｈ２）であり、上皮組織起源がんの治療の一部として、ＥＧＦの枯渇に適していた（図１８）。
【0107】
実験開始後１２０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスを犠牲にし、あらかじめヘマトキシリン・エオジンで染色して、解剖病理学的解析のために注射部位の組織標本を抽出した。組織切片は中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋法により処理した。対照グループ（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ）の結果を示す図１９Ａ～Ｃから分かるように、接種部位の筋肉組織の正常な構造の喪失が見られる。Ａゾーンは、炎症性浸潤と血管の拡張が見られ、隣接する筋組織との間に不連続性が見られることが特徴である。図１９Ｂ及びＣでは、線維芽細胞性修復組織の応答の侵入を伴う接種部位の隣接筋肉組織の縦方向（Ｂ）及び横方向（Ｃ）の繊維が観察され得る。しかし、本発明の新規系対象物を投与したマウスの結果を示す図１９Ｄ～Ｆでは、接種部位及び隣接する筋肉組織に正常な構造が観察され得る。Ｄ：ＨＡｐ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ。Ｅ：ＨＡｐ‐ＣＭ。Ｆ：ＨＡｐ‐ＰＩ。
【0108】
先の３つのグループの各マウスにおいて、以下の病変の有無を評価した。
‐表皮の不連続性と真皮のリンパ球浸潤。
‐炎症性浸潤。
‐筋組織の浸潤。
‐上皮細胞の空胞変性。
‐血管の拡張。
‐表皮の不連続性と真皮のリンパ球浸潤。
‐炎症性浸潤。
‐筋組織の浸潤。
‐上皮細胞の空胞変性。
‐血管の拡張。
【0109】
病変が見つかるたびに１点ずつ加算し、各グループのマウスに対応する値を合計してグラフにした。
【0110】
この試験により、本発明で開発した系で処理したグループは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系を接種した対照グループで観察されたのとは逆に、非常に少ない数の病変を示したことが証明された（図２０）。この結果は、例３の視覚的観察を確認するものである。
【0111】
これらの結果は、ＨＡｐナノ粒子に基づく抗ＥＧＦ系の低毒性と、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ‐ｒｈＥＧＦ‐ｒＰ６４ｋ系に含まれる鉱油による注入部位の副作用を裏付けるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図19E】
【図19F】
【図20】
【手続補正書】
【提出日】2022-12-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
上皮成長因子（ＥＧＦ）に対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物であって、無機ナノ粒子によって形成された核に結合した、組換えヒトＥＧＦ（ｒｈＥＧＦ）又はそのペプチド、及びキャリアタンパク質を含む系を活性原理として含む、上記ワクチン組成物。
【請求項2】
無機核が、カルシウム、鉄、亜鉛、マグネシウム、ジルコニウム、セリウム、ベリリウム、ケイ素、又はこれらの２種以上の混合物を含む群から選択される塩、酸化物又は水酸化物により形成されていることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項3】
無機核がリン酸カルシウムであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項4】
リン酸カルシウムがヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項5】
ＨＡｐが非晶質型であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項6】
ＨＡｐが低結晶性を有することを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項7】
ヒドロキシアパタイトは、有機リガンドによって部分的にコーティングされていることを特徴とする、請求項１～６のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項8】
有機リガンドがクエン酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項9】
キャリアタンパク質が、‐コレラ毒素Ｂサブユニット、
‐破傷風トキソイド、
‐ＫＬＨ及び
‐髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＰ６４ｋ
を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項10】
活性原理がＨＡｐナノ粒子の表面にあることを特徴とする、請求項１～９のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項11】
活性原理が以下の方法：‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドとの化学コンジュゲートと、ＨＡｐナノ粒子との共有結合、
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドと、ＨＡｐナノ粒子との独立した方法での共有結合、
‐ｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドと、ＨＡｐナノ粒子との連続的な共有結合、
‐ＨＡｐの表面でのｒｈＥＧＦ又はそのペプチドとキャリアタンパク質又はペプチドの多重コンジュゲーション、
‐ＨＡｐの表面でのｒｈＥＧＦとキャリアタンパク質又はペプチドとのカプセル化又は物理的結合、
の１つによってＨＡｐナノ粒子に結合されていることを特徴とする、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項12】
‐不完全なフロイントアジュバント、‐スクアレンベースのアジュバント、
‐合成起源アジュバント、
‐鉱物起源アジュバント、
‐植物起源アジュバント、
‐動物起源アジュバント、
‐微粒子タンパク質アジュバント、及び
‐リポソーム
を含む群から選択される他のアジュバントと組み合わせた、請求項１～９のいずれかに記載のワクチン組成物。
【国際調査報告】