(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-13
(54)【発明の名称】ウイルス様粒子を作製する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20230706BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20230706BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230706BHJP
C12N 15/33 20060101ALI20230706BHJP
C07K 1/16 20060101ALI20230706BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z ZNA
C12N15/70 Z
C12P21/02 C
C12N15/33
C07K1/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022576074
(86)(22)【出願日】2021-06-09
(85)【翻訳文提出日】2023-01-10
(86)【国際出願番号】 US2021036688
(87)【国際公開番号】W WO2021252687
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】63/036,535
(32)【優先日】2020-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522478466
【氏名又は名称】アイコサバックス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】リアン， ハンス アール．
(72)【発明者】
【氏名】リチャードソン， チャールズ
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG32
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045CA11
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA01
4H045GA21
(57)【要約】
封入体からの組換え成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質を可溶化溶液で可溶化し、それによって産物ｃｏｍｐＢタンパク質を含む産物試料を生成することによって、ナノ構造を作製する方法が開示される。広範な実験の後、本発明者らは、２成分のタンパク質ベースの自己組織化ウイルス様粒子（ｐｂＶＬＰ）のための成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質が、組換え発現系の可溶性画分から得ることができるのと同じ、又はそれ以上の収率、純度、及び／又は生物学的活性において、封入体から発現及び精製することができることを驚くべきことに気付いた。更に、本明細書に開示される精製手順は、驚くべきことに、封入体からのｃｏｍｐＢタンパク質の可溶化後の変性又はリフォールディングステップを必要としない。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナノ構造を作製する方法であって、組換え成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質を封入体から可溶化溶液で可溶化することを含み、それによって産物ｃｏｍｐＢタンパク質を含む産物試料を生成する、方法。
【請求項2】
前記可溶化溶液は、任意選択で０．１５Ｍ～２Ｍ、任意選択で０．５Ｍの尿素濃度の尿素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記可溶化溶液は、７～８のｐＨ、任意選択で７．４のｐＨを有する緩衝溶液である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記可溶化溶液は、両性イオン界面活性剤を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記可溶化溶液は、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記方法は、前記可溶化ステップの前に、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で５０～１５０ｍＭの尿素濃度の尿素を含む洗浄液で前記封入体を洗浄することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記方法は、前記ｃｏｍｐＢタンパク質を、陰イオン交換樹脂、任意選択で弱陰イオン交換樹脂、任意選択でジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）コンジュゲート樹脂と接触させることと、溶出溶液を使用して、前記樹脂から前記ｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記方法は、前記溶出ステップの前に、カラム洗浄液で前記陰イオン交換樹脂を洗浄することを含み、前記カラム洗浄液は、両性イオン界面活性剤、任意選択で３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）若しくはその等価物、及び／又は
非イオン性界面活性剤、任意選択でＴｒｉｔｏｎＸ－１００又はその等価物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記溶出溶液は、４００ｍＭ～６００ｍＭのＮａＣｌ濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記方法は、混合モード樹脂、任意選択でセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）樹脂で前記ｃｏｍｐＢタンパク質を精製することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記封入体は、前記ｃｏｍｐＢタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細菌細胞において生成されており、前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記細菌細胞は、約３３℃未満、任意選択で約１５℃～約３３℃、又は約１７℃～約３０℃、好ましくは約３０℃で培養される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記細菌細胞は、Ｂ株Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記細菌細胞は、Ｋ１２株Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記プロモーターは、ＰｈｏＡプロモーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
前記プロモーターは、Ｔ７プロモーター以外のプロモーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項18】
前記方法は、前記細菌細胞を溶解液中で溶解することであって、前記溶解液が、封入体の溶解度を促進する薬剤を実質的に含まない、溶解することと、前記封入体を回収することと、を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項19】
前記溶解液は、洗剤を実質的に含まない、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも５０％の溶解度、任意選択で７０～９５％の溶解度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
溶解度は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、任意選択でＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムを使用して測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、総タンパク質の重量比（ｗ／ｗ）として計算される少なくとも８０％の純度、任意選択で少なくとも９５％ｗ／ｗの純度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、任意選択で変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、測定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも７０％ｗ／ｗの組織化能、任意選択で９０～９８％ｗ／ｗの組織化能がある、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
組織化能があるｃｏｍｐＢタンパク質のパーセンテージは、前記ｃｏｍｐＢタンパク質が過剰に成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）タンパク質を含む溶液と混合されるときに、タンパク質ベースのウイルス様粒子（ｖｐＶＬＰ）に組織化する、産物溶液中のｃｏｍｐＢタンパク質のパーセンテージ、重量比（ｗ／ｗ）として定義される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記産物溶液は、１ミリグラムの総タンパク質当たり５０エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）未満、任意選択で５～１５単位のＥＵ／ｍｇを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
前記方法は、前記ｃｏｍｐＢタンパク質を変性させることを含まず、かつ／又は前記ｃｏｍｐＢタンパク質をリフォールディングすることを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
前記ｃｏｍｐＢタンパク質の収率は、採取時の約１７０～１９０ｇ／Ｌ湿潤細胞重量（ＷＣＷ）及び／又は前記封入体中の約１ｇ／Ｌ ＷＣＷ ｃｏｍｐＢタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
前記ｃｏｍｐＢタンパク質は、Ｉ５３－５０Ｂタンパク質である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記Ｉ５３－５０Ｂタンパク質は、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、又はＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記Ｉ５３－５０Ｂは、配列番号４０（Ｉ５３－５０Ｂ属）で表されるタンパク質のいずれか１つである、請求項２９に記載の方法。
【請求項32】
前記Ｉ５３－５０Ｂタンパク質は、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、又はＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）と少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項33】
前記Ｉ５３－５０Ｂタンパク質は、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、又はＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）と１００％の同一性を共有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項34】
前記ｃｏｍｐＢタンパク質は、Ｉ５３＿ｄｎ５Ａタンパク質である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記Ｉ５３＿ｄｎ５Ａタンパク質は、配列番号１６９と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記Ｉ５３＿ｄｎ５Ａタンパク質は、配列番号１６９と少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項37】
前記Ｉ５３＿ｄｎ５Ａタンパク質は、配列番号１６９と少なくとも１００％の同一性を共有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項38】
請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法によって産生されるｃｏｍｐＢタンパク質を含む組成物。
【請求項39】
ｃｏｍｐＢタンパク質を含む組成物であって、前記ｃｏｍｐＢタンパク質は、ａ．少なくとも５０％可溶性、任意選択で７０～９５％可溶性であり、
ｂ．少なくとも８０％純粋であり、純度が、総タンパク質の重量比（ｗ／ｗ）、任意選択で少なくとも９５％ｗ／ｗ純粋として計算され、及び／又は
ｃ．少なくとも７０％ｗ／ｗの組織化能、任意選択で９０～１００％ｗ／ｗの組織化能がある、組成物。
【請求項40】
前記組成物が、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、任意選択で２０ｍＭ、及び／又は２５０ｍＭ ＮａＣｌ、任意選択で２５０ｍＭのうちの１つ以上を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項41】
前記組成物は、７～８のｐＨ、任意選択で７．４のｐＨで緩衝される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項42】
前記組成物は、貯蔵及び／又は凍結融解に対して安定である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項43】
ナノ構造を作製する方法であって、前記ナノ構造は、成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）タンパク質及び成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質を含み、前記ｃｏｍｐＢタンパク質は、可溶化溶液で封入体から可溶化され、それによって、単離されたｃｏｍｐＢタンパク質を生成し、ｃｏｍｐＡ及び前記単離されたｃｏｍｐＢは、ナノ構造を形成する、方法。
【請求項44】
請求項４３に記載の方法によって作製されるナノ構造。
【請求項45】
ｃｏｍｐＢは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２７、２８、３２～３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列によってコードされる、請求項４４に記載のナノ構造。
【請求項46】
前記ｃｏｍｐＡ及び前記ｃｏｍｐＢは各々、（ｉ）それぞれ、配列番号１及び配列番号２、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号４、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号２４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号４、
（ｖ）それぞれ、配列番号３５及び配列番号３６、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号６、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２７、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２８、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号６、
（ｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２７、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２８、
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号６、
（ｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２７、
（ｘｉｖ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２８、
（ｘｖ）それぞれ、配列番号３７及び配列番号３８、
（ｘｖｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号８、
（ｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３２、
（ｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３３、
（ｘｉｘ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３４、
（ｘｘ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号８、
（ｘｘｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３２、
（ｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３３、
（ｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３４、
（ｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号８、
（ｘｘｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３２、
（ｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３３、
（ｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３４、
（ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号８、
（ｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３２、
（ｘｘｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３３、
（ｘｘｘｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３４、
（ｘｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号３９及び配列番号４０、
（ｘｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号９及び配列番号１０、
（ｘｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号１１及び配列番号１２、
（ｘｘｘｖ）それぞれ、配列番号１３及び配列番号１４、
（ｘｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６、
（ｘｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号２０、
（ｘｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号２２、
（ｘｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号２４、
（ｘｌ）それぞれ、配列番号４１及び配列番号４２、
（ｘｌｉ）それぞれ、配列番号４３及び配列番号４４、
（ｘｌｉｉ）それぞれ、配列番号４５及び配列番号４６、
（ｘｌｉｉｉ）それぞれ、配列番号４７及び配列番号４８、
（ｘｌｉｖ）それぞれ、配列番号４９及び配列番号５０、
（ｘｌｖ）それぞれ、配列番号５１及び配列番号４４、
（ｘｌｖｉ）それぞれ、配列番号５３及び配列番号５２、
（ｘｌｖｉｉ）それぞれ、配列番号５５及び配列番号５４、
（ｘｌｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５７及び配列番号５６、並びに
（ｘｌｉｘ）それぞれ、配列番号５９及び配列番号５８のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項４４に記載のナノ構造。
【請求項47】
請求項４４に記載のナノ構造、及び薬学的に許容される希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項48】
請求項４４～４７のいずれか一項に記載のナノ構造からなるワクチン。
【請求項49】
疾患又は障害の治療又は予防を必要とする対象において疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、有効量の請求項４４に記載のナノ構造を、請求項４７に記載の薬学的組成物又は請求項４８に記載のワクチンを使用して、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項50】
前記疾患又は障害は、ウイルス感染症である、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
免疫応答を必要とする対象において免疫応答を生成する方法であって、有効量の、請求項４４に記載のナノ構造、請求項４７に記載の薬学的組成物、又は請求項４８に記載のワクチンを、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項52】
請求項４４に記載のナノ構造、請求項４７に記載の薬学的組成物、又は請求項４８に記載のワクチンを含む、キット。
【請求項53】
請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法のための、又は薬剤としての、請求項４４に記載のナノ構造、請求項４６に記載の薬学的組成物、又は請求項４８に記載のワクチンの、使用。
【請求項54】
請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法で使用されるための、又は薬剤としての使用のための、請求項４４に記載のナノ構造、請求項４６に記載の薬学的組成物、又は請求項４８に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２０年６月９日に出願された米国特許仮出願第６３／０３６，５３５号に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年６月９日に出願された米国特許仮出願第６３／０３６，５３５号に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＩＣＶＸ＿００８＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、９４ＫＢであり、２０２１年６月９日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
［技術分野］
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＩＣＶＸ＿００８＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、９４ＫＢであり、２０２１年６月９日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
［技術分野］
【0003】
本開示は、概して、自己組織化タンパク質ナノ構造、特に、ナノ構造ベースのワクチンを含むナノ構造を作製する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
タンパク質ベースのウイルス様粒子（ｐｂＶＬＰ）は、タンパク質又は他の巨大分子を対称的に提示するための有用なプラットフォームを提供する。これらは、ウイルスカプシドタンパク質（例えば、非エンベロープウイルスから）又は脂質包埋タンパク質（例えば、エンベロープウイルスから抽出されるか、又は脂質と混合された組換え膜タンパク質を使用して作製される）から作製される従来のＶＬＰと区別することができる。後者は、一般に、定義された対称性を有しない。前者は、一般に、タンパク質をウイルスカプシドに付着させる際の課題により、タンパク質を表示する能力が制限されている。
【0005】
一般的にＶＬＰ及び特にｐｂＶＬＰに対する１つの用途は、ワクチンとしてである。研究は、ｐｂＶＬＰ上に表示される抗原が、従来のサブユニットワクチン及び非対称ＶＬＰよりも強力な抗体応答を誘発することを実験的に実証した。
【0006】
Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３：３８９－３９４（２０１６）は、成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）及び成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）と呼ばれるタンパク質成分から作製されるｐｂＶＬＰのセットを含む、様々な２成分の二十面体ｐｂＶＬＰを開示している。
タンパク質ベースのウイルス様粒子を発現、精製、及び組織化する方法の必要性が当該技術分野に残っている。本開示は、この必要性を満たす。
タンパク質ベースのウイルス様粒子を発現、精製、及び組織化する方法の必要性が当該技術分野に残っている。本開示は、この必要性を満たす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３：３８９－３９４（２０１６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
広範な実験の後、本発明者らは、２成分のタンパク質ベースの自己組織化ウイルス様粒子（ｐｂＶＬＰ）のための成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質が、組換え発現系の可溶性画分から得ることができるのと同じ、又はそれ以上の収率、純度、及び／又は生物学的活性において、封入体から発現及び精製することができることを驚くべきことに気付いた。更に、本明細書に開示される精製手順は、驚くべきことに、封入体からのｃｏｍｐＢタンパク質の可溶化後の変性又はリフォールディングステップを必要としない。
【0009】
本明細書において、ナノ構造を作製する方法であって、組換え成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質を封入体から可溶化溶液で可溶化することを含み、それによって産物ｃｏｍｐＢタンパク質を含む産物試料を生成する、方法が提供される。
【0010】
いくつかの実施形態では、可溶化溶液は、尿素を含む。尿素は、０．５Ｍなど、０．１５Ｍ～２Ｍの尿素濃度であり得る。
【0011】
いくつかの実施形態では、可溶化溶液は、７～８のｐＨ、任意選択で７．４のｐＨを有する緩衝溶液である。
【0012】
いくつかの実施形態では、可溶化溶液は、両性イオン界面活性剤を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、両性イオン界面活性剤は、ＣＨＡＰＳＯ（３－（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート）、ＬＤＡＯ、ＤＤＭＡＢ、及び任意のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）界面活性剤から選択される。
【0014】
いくつかの実施形態では、可溶化溶液は、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、方法は、可溶化ステップの前に、任意選択で１５０ｍＭ未満、任意選択で５０～１５０ｍＭの尿素濃度の尿素を含む洗浄液で封入体を洗浄することを含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、方法は、ｃｏｍｐＢタンパク質を、陰イオン交換樹脂、任意選択で弱陰イオン交換樹脂、任意選択でジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）コンジュゲート樹脂と接触させることと、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、方法は、溶出ステップの前に、カラム洗浄液で陰イオン交換樹脂を洗浄することを含み、カラム洗浄液は、
両性イオン界面活性剤、任意選択で３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）又はその等価物、及び／又は
非イオン性界面活性剤、任意選択でＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００又はその等価物を含む。
両性イオン界面活性剤、任意選択で３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）又はその等価物、及び／又は
非イオン性界面活性剤、任意選択でＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００又はその等価物を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、溶出溶液は、４００ｍＭ～６００ｍＭのＮａＣｌ濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、方法は、混合モード樹脂、任意選択でセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）樹脂でｃｏｍｐＢタンパク質を精製することを含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、封入体は、ｃｏｍｐＢタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細菌細胞において生成され、ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。
【0021】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、約３３℃未満、任意選択で約１５℃～約３３℃、又は約１７℃～約３０℃、好ましくは約３０℃で培養される。
【0022】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。
【0023】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、Ｂ株Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。
【0024】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、Ｋ１２株Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。
【0025】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＰｈｏＡプロモーターである。
【0026】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーター以外のプロモーターである。
【0027】
いくつかの実施形態では、方法は、細菌細胞を溶解液中で溶解することであって、溶解液は、封入体の溶解度を促進する薬剤を実質的に含まない、溶解することと、封入体を回収することと、を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、溶解液は、洗剤を実質的に含まない。
【0029】
いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも５０％の溶解度、任意選択で７０～９５％の溶解度を有する。
【0030】
いくつかの実施形態では、溶解度は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、任意選択でＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムを使用して測定される。
【0031】
いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、総タンパク質の重量比（ｗ／ｗ）として計算される少なくとも８０％の純度、任意選択で少なくとも９５％ｗ／ｗの純度を有する。
【0032】
いくつかの実施形態では、純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、任意選択で変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、測定される。
【0033】
いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも７０％ｗ／ｗの組織化能、任意選択で９０～９８％ｗ／ｗの組織化能がある。
【0034】
いくつかの実施形態では、組織化能があるｃｏｍｐＢタンパク質のパーセンテージは、ｃｏｍｐＢタンパク質が過剰に成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）タンパク質を含む溶液と混合されるときに、タンパク質ベースのウイルス様粒子（ｖｐＶＬＰ）に組織化される、産物溶液中のｃｏｍｐＢタンパク質のパーセンテージ、重量比（ｗ／ｗ）として定義される。
【0035】
いくつかの実施形態では、産物溶液は、１ミリグラムの総タンパク質当たり５０エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）未満、任意選択で５～１５単位のＥＵ／ｍｇを含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、方法は、ｃｏｍｐＢタンパク質を変性させることを含まず、かつ／又はｃｏｍｐＢタンパク質をリフォールディングすることを含まない。いくつかの実施形態では、方法は、ｃｏｍｐＢタンパク質を変性させることを含まない。いくつかの実施形態では、方法は、ｃｏｍｐＢタンパク質をリフォールディングすることを含まない。いくつかの実施形態では、方法は、単量体タンパク質から多量体を組織化することなく、多量体組織化体を生成することを伴う。いくつかの実施形態では、方法は、単量体タンパク質から五量体を組織化することなく、五量体組織化体を生成することを伴う。
【0037】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢタンパク質の収率は、採取時に約１７０～１９０ｇ／Ｌ湿潤細胞重量（ＷＣＷ）及び／又は封入体中の約１ｇ／Ｌ ＷＣＷ ｃｏｍｐＢタンパク質である。
【0038】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢタンパク質は、Ｉ５３－５０Ｂタンパク質である。
【0039】
いくつかの実施形態では、Ｉ５３－５０Ｂタンパク質は、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、又はＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）と少なくとも９５％の同一性を共有する。
【0040】
いくつかの実施形態では、Ｉ５３－５０Ｂは、配列番号４０（Ｉ５３－５０Ｂ属）で表されるタンパク質のいずれか１つである。
【0041】
いくつかの実施形態では、Ｉ５３－５０Ｂタンパク質は、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、又はＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）と少なくとも９９％の同一性を共有する。
【0042】
いくつかの実施形態では、Ｉ５３－５０Ｂタンパク質は、Ｉ５３－５０Ｂ．１（配列番号３２）、Ｉ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２（配列番号３３）、又はＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１（配列番号３４）と１００％同一性を共有する。
【0043】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢタンパク質は、Ｉ５３＿ｄｎ５Ａタンパク質である。
【0044】
いくつかの実施形態では、Ｉ５３＿ｄｎ５Ａタンパク質は、配列番号１６９と少なくとも９５％の同一性を共有する。
【0045】
いくつかの実施形態では、Ｉ５３＿ｄｎ５Ａタンパク質は、配列番号１６９と少なくとも９９％の同一性を共有する。
【0046】
いくつかの実施形態では、Ｉ５３＿ｄｎ５Ａタンパク質は、配列番号１６９と少なくとも１００％の同一性を共有する。
【0047】
本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されるｃｏｍｐＢタンパク質を含む組成物が、本明細書に更に提供される。
【0048】
本明細書では更に、ｃｏｍｐＢタンパク質を含む組成物を提供し、ｃｏｍｐＢタンパク質は、
ａ．少なくとも５０％可溶性、任意選択で７０～９５％可溶性であり、
ｂ．少なくとも８０％純粋であり、純度は、総タンパク質の重量比（ｗ／ｗ）、任意選択で少なくとも９５％ｗ／ｗ純粋として計算され、及び／又は
ｃ．少なくとも７０％ｗ／ｗの組織化能、任意選択で９０～１００％ｗ／ｗの組織化能がある。
ａ．少なくとも５０％可溶性、任意選択で７０～９５％可溶性であり、
ｂ．少なくとも８０％純粋であり、純度は、総タンパク質の重量比（ｗ／ｗ）、任意選択で少なくとも９５％ｗ／ｗ純粋として計算され、及び／又は
ｃ．少なくとも７０％ｗ／ｗの組織化能、任意選択で９０～１００％ｗ／ｗの組織化能がある。
【0049】
いくつかの実施形態では、組成物は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、任意選択で２０ｍＭ、及び／又は２５０ｍＭ ＮａＣｌ、任意選択で２５０ｍＭのうちの１つ以上を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、組成物は、７～８のｐＨ、任意選択で７．４のｐＨで緩衝される。
【0051】
いくつかの実施形態では、組成物は、貯蔵及び／又は凍結融解に対して安定である。
【0052】
いくつかの実施形態では、組成物は、貯蔵及び／又は凍結融解に対して安定である。
【0053】
いくつかの実施形態では、本開示は、ナノ構造を作製する方法を提供し、ナノ構造は、成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）タンパク質及び成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質を含み、Ｃｏｍｐｂタンパク質は、可溶化溶液を用いて封入体から可溶化され、それによって単離されたｃｏｍｐＢタンパク質を生成し、ｃｏｍｐＡ及び単離されたｃｏｍｐＢは、ナノ構造を形成する。
【0054】
いくつかの実施形態では、ナノ構造は、本明細書に記載される方法によって作製される。
【0055】
いくつかの実施形態では、ナノ構造のｃｏｍｐＢは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２７、２８、３２～３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、及び５８のうちのいずれか１つにと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列によってコードされる。
【0056】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢは各々、
（ｉ）それぞれ、配列番号１及び配列番号２、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号４、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号２４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号４、
（ｖ）それぞれ、配列番号３５及び配列番号３６、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号６、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２７、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２８、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号６、
（ｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２７、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２８、
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号６、
（ｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２７、
（ｘｉｖ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２８、
（ｘｖ）それぞれ、配列番号３７及び配列番号３８、
（ｘｖｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号８、
（ｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３２、
（ｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３３、
（ｘｉｘ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３４、
（ｘｘ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号８、
（ｘｘｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３２、
（ｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３３、
（ｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３４、
（ｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号８、
（ｘｘｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３２、
（ｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３３、
（ｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３４、
（ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号８、
（ｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３２、
（ｘｘｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３３、
（ｘｘｘｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３４、
（ｘｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号３９及び配列番号４０、
（ｘｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号９及び配列番号１０、
（ｘｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号１１及び配列番号１２、
（ｘｘｘｖ）それぞれ、配列番号１３及び配列番号１４、
（ｘｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６、
（ｘｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号２０、
（ｘｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号２２、
（ｘｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号２４、
（ｘｌ）それぞれ、配列番号４１及び配列番号４２、
（ｘｌｉ）それぞれ、配列番号４３及び配列番号４４、
（ｘｌｉｉ）それぞれ、配列番号４５及び配列番号４６、
（ｘｌｉｉｉ）それぞれ、配列番号４７及び配列番号４８、
（ｘｌｉｖ）それぞれ、配列番号４９及び配列番号５０、
（ｘｌｖ）それぞれ、配列番号５１及び配列番号４４、
（ｘｌｖｉ）それぞれ、配列番号５３及び配列番号５２、
（ｘｌｖｉｉ）それぞれ、配列番号５５及び配列番号５４、
（ｘｌｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５７及び配列番号５６、並びに
（ｘｌｉｘ）それぞれ、配列番号５９及び配列番号５８のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
（ｉ）それぞれ、配列番号１及び配列番号２、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号４、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号２４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号４、
（ｖ）それぞれ、配列番号３５及び配列番号３６、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号６、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２７、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２８、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号６、
（ｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２７、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２８、
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号６、
（ｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２７、
（ｘｉｖ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２８、
（ｘｖ）それぞれ、配列番号３７及び配列番号３８、
（ｘｖｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号８、
（ｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３２、
（ｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３３、
（ｘｉｘ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３４、
（ｘｘ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号８、
（ｘｘｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３２、
（ｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３３、
（ｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３４、
（ｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号８、
（ｘｘｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３２、
（ｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３３、
（ｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３４、
（ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号８、
（ｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３２、
（ｘｘｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３３、
（ｘｘｘｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３４、
（ｘｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号３９及び配列番号４０、
（ｘｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号９及び配列番号１０、
（ｘｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号１１及び配列番号１２、
（ｘｘｘｖ）それぞれ、配列番号１３及び配列番号１４、
（ｘｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６、
（ｘｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号２０、
（ｘｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号２２、
（ｘｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号２４、
（ｘｌ）それぞれ、配列番号４１及び配列番号４２、
（ｘｌｉ）それぞれ、配列番号４３及び配列番号４４、
（ｘｌｉｉ）それぞれ、配列番号４５及び配列番号４６、
（ｘｌｉｉｉ）それぞれ、配列番号４７及び配列番号４８、
（ｘｌｉｖ）それぞれ、配列番号４９及び配列番号５０、
（ｘｌｖ）それぞれ、配列番号５１及び配列番号４４、
（ｘｌｖｉ）それぞれ、配列番号５３及び配列番号５２、
（ｘｌｖｉｉ）それぞれ、配列番号５５及び配列番号５４、
（ｘｌｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５７及び配列番号５６、並びに
（ｘｌｉｘ）それぞれ、配列番号５９及び配列番号５８のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
【0057】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の任意のナノ構造と、薬学的に許容される希釈剤と、を含む薬学的組成物を提供する。
【0058】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の任意のナノ構造からなるワクチンを提供する。
【0059】
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患又は障害の治療又は予防を必要とする対象において疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、有効量の、本明細書に記載のナノ構造、本明細書に記載の薬学的組成物、又は本明細書に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0060】
いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ウイルス感染症である。
【0061】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫応答を必要とする対象において免疫応答を生成する方法であって、有効量本明細書に記載のナノ構造、本明細書に記載の薬学的組成物、又は本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、方法を提供する。
【0062】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のナノ構造、本明細書に記載の薬学的組成物、又は本明細書に記載のワクチンを含むキットを提供する。
【0063】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の任意の方法のための、又は薬剤としての、本明細書に記載のナノ構造、本明細書に記載の薬学的組成物、又は本明細書に記載のワクチンの使用を記載する。
【0064】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法において使用するための、又は薬剤として使用するための、本明細書に記載のナノ構造、本明細書に記載の薬学的組成物、又は本明細書に記載のワクチンを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1A】本開示によるタンパク質ベースのウイルス様粒子（ｐｂＶＬＰ）の例示的な実施形態を示す。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生成されたナノ粒子五量体は、抗原と三量体との融合物と組み合わされ、ｐｂＶＬＰに組織化される。
【0066】
【図1B】ｐｂＶＬＰ及びｐｂＶＬＰ成分（Ｇタンパク質は図示せず）の更なる例示的な実施形態を示す。
【0067】
【図2-1】Ｅ．ｃｏｌｉ株スクリーニングのための可溶性及び不溶性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。株ＩＣＸＢ０１－ＩＣＢＸ０２５、ＩＣＸＢ－０２７、及びＩＣＸＢ－０２８を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上に実行した。ＣＢＭ１７９、ＣＢＭ１６３、及びＣＢＭ１８１は、形質転換されていない対照Ｅ．ｃｏｌｉ株を表す。
【図2-2】同上。
【図2-3】同上。
【図2-4】同上。
【図2-5】同上。
【図2-6】同上。
【図2-7】同上。
【図2-8】同上。
【0068】
【図3】実施例１で生成した封入体から収集した上清の代表的なＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製実行のクロマトグラムを示す。
【0069】
【図4】代表的なＣＨＴ培地精製実行のクロマトグラムを示す。
【0070】
【図5】尿素濃度が増加したＩ５３－５０Ｂ抽出物の非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。Ｉ５３－５０Ｂは、５０ｍＭの尿素で抽出を開始し、８Ｍの尿素で終わる。
【0071】
【図6】封入体洗浄ステップの非還元性ＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。被験試料を、指示された洗浄緩衝液のうちの１つで、全てＰＢＳ背景で洗浄した。対照には洗浄ステップは含まれなかったが、直接抽出に進んだ。ＩＰＡ＝イソプロパノール
【0072】
【図7】ゲルクロマトグラフィーによる二十面体ナノ構造の組織化（１１．４分、保持時間）を示す。過剰なｃｏｍｐＡは、１７．３分で実行される。組織化されていないｃｏｍｐＢ（存在する場合）は、２２分で実行される。
【0073】
【図8】組織化されたナノ構造の非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。５０Ａ－ＯＧ＝ｃｏｍｐＡストック（抗原に融合していない）、２０１８１１１２＝ｃｏｍｐＢストック（抗原に融合していない）、試験組織化体＝ＳＥＣ精製画分、２０１８１０３０＝ｃｏｍｐＢ、１０３０試験組織化体＝ｃｏｍｐＢ、１００８プール＝ｃｏｍｐＢ。
【0074】
【図9】タンパク質を発現すること、宿主細胞を採取する、細胞を溶解する、封入体を単離及び洗浄する、並びにタンパク質を精製するための本明細書に開示される方法の実施形態のフローチャートを示す。
【0075】
【図10】ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢタンパク質の近隣結合系統樹を示す。
【0076】
【図11】ｃｏｍｐＢを製造するための一実施形態のフロー図を示す。ＭＣＢ＝マスターセルバンク（ロット番号２０－０１５８、品番７１２８０１
【0077】
【図12】Ｅ．ｃｏｌｉ発現株ＩＶＸＢ３０におけるＩ５３－ｄｎ５Ａ発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す。Ｉ５３－ｄｎ５Ａリーディングフレームを含有するｐＣＹＴ１３でＥ．ｃｏｌｉ株ＣＢＭ１７９を形質転換した後、ｐｈｏＡプロモーターの制御下でＩ５３－ｄｎ５Ａの産生を評価した。ＣＢＭ１７９：Ｉ５３－ｄｎ５Ａリーディングフレームを欠く対照Ｅ．ｃｏｌｉ株、ＩＶＸＢ３０：Ｉ５３－ｄｎ５Ａリーディングフレームを含有するＥ．ｃｏｌｉ産生株、Ｓｏｌ：Ｅ．ｃｏｌｉ産生培養物の採取後に生成された可溶性画分、Ｉｎｓｏｌ：Ｅ．ｃｏｌｉ産生培養物の採取後に生成された不溶性画分。
【発明を実施するための形態】
【0078】
本発明は、タンパク質ベースのウイルス様粒子（ｐｂＶＬＰ）を組織化するのに使用されることを意図される、成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質の組換え産生のためのプロセスに関する。
【0079】
ｃｏｍｐＢタンパク質の発現及び精製のための既知の方法とは異なり、本開示の方法は、組換えタンパク質発現系の不溶性画分（封入体）から高収率及び純度でのｃｏｍｐＢタンパク質の産生を達成する。従来の方法は、薬剤を可溶化する濃度を必要とし、これにより、封入体内のタンパク質の部分的な変性及びリフォールディングをもたらした。本明細書に示すように、ｃｏｍｐＢタンパク質は、細菌細胞において発現され、封入体から精製されることができる。方法は、精製が可溶化後のｃｏｍｐＢタンパク質の変性又はリフォールディングステップを必要としないことを実証する。
【0080】
定義
いずれかの図面及び付録を含む全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許若しくは特許出願、図面、又は付録が、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれることが具体的及び個別に示された場合と同じ程度に、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
いずれかの図面及び付録を含む全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許若しくは特許出願、図面、又は付録が、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれることが具体的及び個別に示された場合と同じ程度に、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
【0081】
「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」という用語は、ウイルスに似ているが、ウイルスタンパク質又は糖タンパク質の抗原タンパク質又はその抗原断片を表示する非感染性である分子組織化体を指す。「タンパク質ベースのＶＬＰ」とは、タンパク質又は糖タンパク質から形成され、他の成分（例えば脂質）を実質的に含まないＶＬＰを指す。タンパク質ベースのＶＬＰは、翻訳後修飾及び化学修飾を含み得るが、生体又は生体不活性化ウイルス調製物からのウイルスタンパク質の抽出によって形成されるミセルＶＬＰ及びＶＬＰから区別される。「設計されたＶＬＰ」という用語は、計算タンパク質設計によって生成された１つ以上のポリペプチドを含むＶＬＰを指す。例示的な設計されたＶＬＰは、図１Ｂに図示されるナノ構造を含むＶＬＰである。「対称ＶＬＰ」という用語は、図１Ｂに示すような対称コアを有するタンパク質ベースのＶＬＰを指す。これらには、設計されたＶＬＰが含まれるが、これらに限定されない。例えば、タンパク質フェリチンは、天然に存在するフェリチン配列を使用して、対称的なタンパク質ベースのＶＬＰを生成するために使用されている。フェリチンベースのＶＬＰは、ウイルスタンパク質をフェリチン分子に融合する以外に、フェリチンから対称的なＶＬＰを形成するためのタンパク質工学は必要でないという点で、設計されたＶＬＰとは区別される。タンパク質設計方法を使用して、鋳型構造（例えば、タンパク質データバンクに堆積された構造）又は新規（すなわち、所望の構造を有するが、天然に存在するタンパク質との相同性がほとんど又はまったくない新しいタンパク質の計算設計によって）に基づいて、同様の１つ及び２つの成分ナノ構造を生成することができる。次いで、そのような１つ及び２つの成分ナノ構造を、設計されたＶＬＰのコアとして使用することができる。
【0082】
「二十面体粒子」という用語は、二十面体対称性を有するコアを有する設計されたｐｂＶＬＰを指す（例えば、表１におけるＩ５３及びＩ５２とラベル付けされた粒子）。Ｉ５３は、五量体及び三量体から構築される二十面体粒子を指す。Ｉ５２は、五量体及び二量体から構築された二十面体粒子を指す。Ｔ３３は、２セットの三量体から構築された四面体粒子を指す。Ｔ３２は、三量体及び二量体から構築された四面体粒子を指す。
【0083】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合、及び任意選択で１つ以上の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）及び／又は他の修飾（蛍光タグなどのマーカー又はアジュバントとして使用されるポリペプチド部分のコンジュゲーションを含むが、これらに限定されない）によって結合される一連のアミノ酸残基を指す。
【0084】
「変異体」という用語は、参照ポリペプチドに対して１つ以上の挿入、欠失、又はアミノ酸置換を有するが、参照タンパク質の１つ以上の特性を保持するポリペプチドを指す。
【0085】
「機能的変異体」という用語は、参照ポリペプチドと同じ又は類似の機能的効果を示す変異体を指す。例えば、多量体化ドメインの機能的変異体は、参照多量体化ドメインと同じ程度又は同様の程度に多量体化を促進することができ、かつ／又は参照多量体化ドメインと同じ同族多量体化ドメインと多量体化することができる。
【0086】
「断片」という用語は、参照ポリペプチドと比較して１つ以上のＮ末端又はＣ末端切断を有するポリペプチドを指す。
【0087】
「機能的断片」という用語は、断片の機能的変異体を指す。
【0088】
「アミノ酸置換」という用語は、配列中の単一のアミノ酸を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸置換の標準的な形態の略語が使用される。例えば、Ｖ９４Ｒは、参照配列におけるバリン（Ｖ）のアルギニン（Ｒ）での置換を指す。略語Ａｒｇ９４は、参照配列に対して９４番目の残基がアルギニン（Ａｒｇ）である任意の配列を指す。
【0089】
「螺旋」又は「螺旋状」という用語は、発生することが知られている、又は発生することが予測されるポリペプチド内のα螺旋状二次構造を指す。例えば、配列は、計算モデリングが、配列が螺旋状コンフォメーションを採用する可能性が高いことを示唆する場合、螺旋状として記載され得る。
【0090】
「成分」という用語は、適切な条件下でウイルス様粒子に組織化することができるタンパク質又はタンパク質複合体（例えば、多量体化ドメインを含む抗原又はポリペプチド）を指す。「成分Ａ」又は「ｃｏｍｐＡ」及び「成分Ｂ」又は「ｃｏｍｐＢ」は、本明細書に記載のｐｂＶＬＰを形成するために組織化することができる２つのタンパク質を指す。ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢは、ｐｂＶＬＰの組織化に使用するために、本明細書に記載の二量体、三量体、又は五量体構造を独立して形成することができる。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、抗原に連結されて、融合タンパク質を形成する。
【0091】
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、動物又はヒトにおけるインビボでの使用に生物学的又は薬理学的に適合する賦形剤を意味し、動物、より具体的にはヒトにおける使用のために、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認されたか、又は米国薬局方又は他の一般的に認識されている薬局方に列挙されている賦形剤を意味し得る。
【0092】
「製造」という用語は、少なくとも２５ｍＬ、５０ｍＬ、１Ｌ、１，０００Ｌ、５０，０００Ｌ、又はそれ以上のスケールを含む、任意のスケールでの組換えポリペプチド又はウイルス様粒子の産生を指す。
【0093】
「培養」及び「培養培地」という用語は、標準的な細胞培養及び組換えタンパク質発現技術を指す。
【0094】
「宿主細胞」という用語は、組換えポリペプチドの発現に使用することができる任意の細胞を指す。
【0095】
「混合」という用語は、２つの溶液を接触させて溶液を混合させることを指す。
【0096】
「精製する」という用語は、組成物中に存在する他の物質から分子を分離することを指す。ポリペプチドは、親和性によって（例えば、抗体又はタグに対して、例えば、Ｈｉｓタグ捕捉樹脂を使用して）、電荷によって（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）、サイズによって（例えば、分取超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー）、又はそれ以外の方法で精製され得る。
【0097】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、約１００個を超えるヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、単鎖、二本鎖、又は多鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基、又は他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、約５～約１００ヌクレオチドの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的では、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」又は「オリゴ」としても知られ、遺伝子から単離され得るか、又は当該技術分野で既知の方法によって化学的に合成され得る。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載される実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解すべきである。
【0098】
「同一性」、「同一の」、及び「配列同一性」という用語は、同じであり、同じ相対位置にある２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の塩基又はアミノ酸のパーセンテージを指す。したがって、１つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、別のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と比較して、ある特定のパーセンテージの配列同一性を有する。配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。「参照配列」という用語は、試験配列が比較される分子を指す。
【0099】
パーセント配列同一性の比較及び決定のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性探索方法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のコンピュータ化された実装、手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されている、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含む当該技術分野で既知のアルゴリズムを使用することによって、実施され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて一般に入手可能である。
【0100】
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味し、それは、その値がどのように測定又は決定されるか、例えば、測定システムの限界に一部依存する。例えば、「約」は、１以内の、又は１を超える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、２０％まで、１０％まで、又は５％までの範囲のプラス又はマイナスを意味し得る。
【0101】
本明細書で参照される全ての重量パーセンテージ（すなわち、「重量％（％ ｂｙ ｗｅｉｇｈｔ）」及び「重量％（ｗｔ．％）」及びｗ／ｗ）は、別段の指示がない限り、薬学的組成物の総重量に対して測定される。
【0102】
本明細書で使用される場合、「実質的に」又は「実質的な」は、作用、特徴、特性、状態、構造、項目、又は結果の完全又はほぼ完全な程度又は度合を指す。例えば、「実質的に」囲まれているオブジェクトは、オブジェクトが完全に囲まれているか、又はほぼ完全に囲まれているかのいずれかであることを意味する。絶対完全性からの正確に許容される逸脱の程度は、場合によっては、特定の文脈に依存し得る。しかしながら、一般的に言えば、絶対的な完成度と完全な完成度が得られた場合と同様の全体的な結果が得られるように、完成度の近さが求められる。「実質的に」の使用は、否定的な意味で使用される場合、完全又はほぼ完全な作用、特徴、特性、状態、構造、項目、又は結果の欠如を指す場合にも同様に適用される。例えば、他の活性剤を「実質的に含まない」組成物は、他の活性剤を完全に欠くか、又は他の活性剤をほぼ完全に欠くため、効果は、他の活性剤を完全に欠く場合と同じである。言い換えれば、成分若しくは要素、又は別の活性剤を「実質的に含まない」組成物は、その測定可能な効果がない限り、そのような項目を依然として含有し得る。
【0103】
本明細書で使用される場合、「変性する」という用語は、ポリペプチドが全て又は実質的に全ての三次構造を失う、又はミスフォールドタンパク質の場合、凝集形態から可溶性非折り畳み形態に変換させる、折り畳まれたポリペプチド分子の構造の変化を指す。「変性した」という用語はまた、タンパク質の天然の三次元構造が破壊される条件下で封入体を可溶化した後に、組換え産生プロセスの産物として得られる、発現されたタンパク質の生物学的に不活性な形態を指す。
【0104】
「リフォールディング」（又は「再成長」）という用語は、変性したタンパク質に、その天然のコンフォメーション及び生物学的活性を取り戻させるプロセスを指す。
【0105】
本明細書で使用される場合、「回収すること」という用語は、調製物中で物質を他の物質から分離することによって、例えば、遠心分離及び／又は１つ以上の洗浄ステップによって物質（例えば、封入体及び／又は目的のタンパク質）を得ることを指す。
【0106】
本明細書で使用される場合、「封入体」という用語は、形質転換された宿主細胞の細胞質に存在する組換えタンパク質を含有する不溶性凝集体を指す。これらは、顕微鏡下で明るい斑点として現れ、細胞の細胞質から封入体を分離することによって回収することができる。従来技術では、封入体は、典型的には、高濃度のカオトロピック剤（例えば、＞８Ｍ尿素及び／又は＞３Ｍグアニジニウム）、強イオン洗剤（例えば、Ｎ－ラウロイルサルコシン）、及び／又はアルカリ性ｐＨを使用して可溶化される。本開示によれば、低濃度のこれらの薬剤を使用して、穏やかに可溶化し得る。
【0107】
本明細書で使用される場合、「ナノ構造」という用語は、第１の成分分子（例えば、ｃｏｍｐＡ）及び第２の成分分子（例えば、ｃｏｍｐＢ）を、組織化された構造内に配向させる、対称的に繰り返される非天然の非共有タンパク質－タンパク質界面を含む。ナノ構造は、目的の分子を封入することができ、かつ／又は第１及び／若しくは第２のタンパク質は、目的の分子（診断、治療、撮像及び他の用途のための検出可能な分子など）に結合するように修飾することができるため、ナノ構造には、限定されないが、送達ビヒクルが含まれる。本開示のナノ構造は、ワクチン設計、治療薬の標的送達、及びバイオエネルギーを含む、いくつかの用途に大変適している。
【0108】
本明細書で使用される場合、「可溶化」という用語は、生体試料の細胞を破壊することによって、生体試料内に含まれるタンパク質を水性溶媒などの溶媒に移すことを指す。本明細書で使用される場合、「可溶化」又は「可溶化する」は、「溶解する」又は「抽出する」と互換的に使用され得る。「可溶化」という用語はまた、例えば、封入体を溶解することによって、封入体からのタンパク質の放出を指す。
【0109】
以下の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれも、先行技術であるか、又は現在特許請求されている発明に関連しているか、又は具体的又は暗黙的に参照される任意の出版物が先行技術であることは認められない。
【0110】
実施形態
本開示は、封入体からのタンパク質ベースのＶＬＰのための成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質の発現を実証する。驚くべきことに、本開示の方法に従って産生されるｃｏｍｐＢタンパク質は、宿主細胞の可溶性画分に発現され、かつそれから精製されるｃｏｍｐＢタンパク質と少なくとも同等に可溶性かつ組織化能があるか、又はそれ以上である。
本開示は、封入体からのタンパク質ベースのＶＬＰのための成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質の発現を実証する。驚くべきことに、本開示の方法に従って産生されるｃｏｍｐＢタンパク質は、宿主細胞の可溶性画分に発現され、かつそれから精製されるｃｏｍｐＢタンパク質と少なくとも同等に可溶性かつ組織化能があるか、又はそれ以上である。
【0111】
ワクチン接種は、細菌、ウイルス、及び寄生虫を含む様々な感染因子による感染の重症度を予防又は低減するために使用される治療モダリティである。新しいワクチンの開発は、商業的及び公衆衛生上重要な影響を及ぼす。特に、ライム病、百日咳、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、肺炎ウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、及びマラリアは、ワクチンが既に存在するか、開発されているか、又は望ましい感染性薬剤である。
【0112】
サブユニットワクチンは、単離された抗原、通常は細菌、昆虫、又は哺乳動物細胞宿主において組換え発現されるタンパク質から作製されるワクチンである。典型的には、サブユニットワクチンの抗原成分は、感染時に天然免疫応答を誘発することが観察される感染性因子のタンパク質の中から選択されるが、場合によっては、感染性因子の他の成分を使用することができる。サブユニットワクチンで使用するための典型的な抗原としては、ウイルスの表面発現エンベロープ糖タンパク質などの標的感染性因子の表面上で発現されるタンパク質が挙げられる。好ましくは、抗原は、抗体を中和するための標的である。より好ましくは、抗原は、抗原に対する免疫応答が感染剤の複数の株に対する免疫をカバーするように、広範囲に中和する抗体の標的である。ある場合には、抗原のエピトープに寄与することによって、又は抗原上の特定のエピトープに対する免疫応答を立体障害によって誘導することによって、サブユニットワクチンにＮ結合又はＯ結合されたグリカンもまた、ワクチン接種において重要であり得る。ワクチン接種に応答して生じる免疫応答は、タンパク質自体、グリカン、又はタンパク質及び連結グリカンの両方に直接的であり得る。サブユニットワクチンは、ワクチンによる患者の感染に関する懸念を排除する生体病原体を含有しないこと、標準的な遺伝子工学技術を使用して設計され得ること、他のワクチンの形態よりも均質であること、及び十分に特徴付けられた発現システムを使用して標準化された組換えタンパク質発現産生システムで製造され得ることを含む、様々な利点を有する。ある場合には、抗原は、中和抗体又は広く中和する抗体などの所望の抗体の生成に有利になるように遺伝子操作され得る。特に、Ｘ線結晶学、電子顕微鏡学、又は核磁気共鳴実験によって得られた目的の抗原に関する構造情報を使用して、サブユニットワクチンの合理的な設計を導くことができる。
【0113】
サブユニットワクチンの既知の制限は、誘発される免疫応答が、全ウイルス、生ワクチン、又は生減衰ワクチンなどの他のタイプのワクチンに対する免疫応答よりも弱い場合があることである。設計された及び／又はタンパク質ベースのＶＬＰワクチンは、対称的に順序付けられたアレイにおける抗原の多価表示を通じて、ワクチン誘発性免疫応答の効力及び幅を増大させながら、サブユニットワクチンの利点を利用する可能性を有する。本開示において、タンパク質ベースのＶＬＰは、タンパク質ベース又は糖タンパク質ベースのワクチン（例えば、米国特許第９，４４１，０１９号を参照されたい）、重合リポソーム（例えば、米国特許第７，２８５，２８９号を参照されたい）、界面活性剤ミセル（例えば、米国特許公開第２００４／００３８４０６Ａ１号を参照されたい）、及び合成生分解性粒子（例えば、米国特許第８，３２３，６９６号を参照されたい）を指すために、ナノ粒子ワクチンという用語が当該技術分野で使用されているため、ナノ粒子ワクチンと区別される。
【0114】
実施形態の非限定的な例は、図１Ａに示されており、これは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）において組換えて発現される成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質組織化体とともに、宿主細胞（例えば、２９３Ｆ細胞）において任意選択で組換えて発現される、ｐｂＶＬＰの成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）タンパク質に遺伝的に融合されたタンパク質抗原を示し、これらの２つの成分は、二十面体コアの周りにタンパク質抗原の２０コピーを表示するｐｂＶＬＰに自己組織化する。
【0115】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、二量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、三量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、五量体である。
【0116】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、二量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、三量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、五量体である。
【0117】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、配列番号１３、１７、又は４１から選択される二量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、配列番号５、７、９、１９、２１、２５、２６、２９、３０、３１、３７、３９、４３、４５、４７、４９、又は５１から選択される三量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、配列番号３、１１、１５、２３、又は３５から選択される五量体である。
【0118】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、配列番号１２、１６、２０、又は２２から選択される二量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、配列番号４、１８、２４、３４、３６、４２、４４、４６、４８、又は５０から選択される三量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、配列番号２、６、８、１０、１４、２７、２８、３２、３３、３８、又は４０から選択される五量体である。
【0119】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２６、２９～３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、及び５９のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも少なくとも９９％、又は１００％同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２７、２８、３２～３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、及び５８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【0121】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びＣｏｍｐＢは、「Ｉ５３」アーキテクチャを形成する。Ｉ５３アーキテクチャは、Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３：３８９－３９４（２０１６）に記載されているように、５回及び３回二十面体対称軸に沿って整列された、１２個の五量体ビルディングブロックと２０個の三量体ビルディングブロックとの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、Ｉ５３五量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、Ｉ５３三量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、Ｉ５３五量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、Ｉ５３三量体である。
【0122】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢは、「Ｉ５２」アーキテクチャを形成する。Ｉ５２アーキテクチャは、１２個の五量体及び３０個の二量体から、それらの対応する二十面体対称軸に沿って形成される。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、Ｉ５２五量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、Ｉ５２二量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、Ｉ５２五量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、Ｉ５２二量体である。
【0123】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢは、「Ｉ３２」アーキテクチャを形成する。Ｉ３２アーキテクチャは、２０個の三量体と３０個の二量体との組み合わせであり、各々、それらの対応する二十面体対称軸に沿って整列する。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、Ｉ３２三量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、Ｉ３２二量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、Ｉ３２三量体である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、Ｉ３２二量体である。
【0124】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡとｃｏｍｐＢとの混合物は、二十面体ナノ構造を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡとｃｏｍｐＢとの混合物は、四面体ナノ構造を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡとｃｏｍｐＢとの混合物は、八面体ナノ構造を形成する。
【0125】
いくつかの実施形態では、小分子薬物（すなわち、７００未満のＭＷを有する）、生物学的薬物（すなわち、特に組換えポリペプチドを含む、細菌、酵母、細胞、又は器官から単離された薬物）、又は生合成薬物（例えば、アプタマー、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、組換え核酸、ヌクレオシド類似体、組換えポリペプチド、ポリペプチド薬物、抗原など）が、ｃｏｍｐＡに融合される。
【0126】
いくつかの実施形態では、抗原は、ｃｏｍｐＡに融合される
【0127】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢは、ナノ構造を形成する。
【0128】
いくつかの実施形態では、ナノ構造は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２６、２９～３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９のうちの１つから選択されるｃｏｍｐＡと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２７、２８、３２～３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８のうちの１つから選択されるｃｏｍｐＢとを組み合わせることによって形成される。
【0129】
いくつかの実施形態では、ナノ構造は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１及び配列番号２、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号４、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号２４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号４、
（ｖ）それぞれ、配列番号３５及び配列番号３６、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号６、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２７、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２８、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号６、
（ｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２７、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２８、
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号６、
（ｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２７、
（ｘｉｖ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２８、
（ｘｖ）それぞれ、配列番号３７及び配列番号３８、
（ｘｖｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号８、
（ｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３２、
（ｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３３、
（ｘｉｘ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３４、
（ｘｘ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号８、
（ｘｘｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３２、
（ｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３３、
（ｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３４、
（ｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号８、
（ｘｘｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３２、
（ｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３３、
（ｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３４、
（ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号８、
（ｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３２、
（ｘｘｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３３、
（ｘｘｘｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３４、
（ｘｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号３９及び配列番号４０、
（ｘｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号９及び配列番号１０、
（ｘｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号１１及び配列番号１２、
（ｘｘｘｖ）それぞれ、配列番号１３及び配列番号１４、
（ｘｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６、
（ｘｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号２０、
（ｘｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号２２、
（ｘｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号２４、
（ｘｌ）それぞれ、配列番号４１及び配列番号４２、
（ｘｌｉ）それぞれ、配列番号４３及び配列番号４４、
（ｘｌｉｉ）それぞれ、配列番号４５及び配列番号４６、
（ｘｌｉｉｉ）それぞれ、配列番号４７及び配列番号４８、
（ｘｌｉｖ）それぞれ、配列番号４９及び配列番号５０、
（ｘｌｖ）それぞれ、配列番号５１及び配列番号４４、
（ｘｌｖｉ）それぞれ、配列番号５３及び配列番号５２、
（ｘｌｖｉｉ）それぞれ、配列番号５５及び配列番号５４、
（ｘｌｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５７及び配列番号５６、並びに
（ｘｌｉｘ）それぞれ、配列番号５９及び配列番号５８のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢポリペプチド配列から形成される。
（ｉ）それぞれ、配列番号１及び配列番号２、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号４、
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３及び配列番号２４、
（ｉｖ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号４、
（ｖ）それぞれ、配列番号３５及び配列番号３６、
（ｖｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号６、
（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２７、
（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５及び配列番号２８、
（ｉｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号６、
（ｘ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２７、
（ｘｉ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号２８、
（ｘｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号６、
（ｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２７、
（ｘｉｖ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号２８、
（ｘｖ）それぞれ、配列番号３７及び配列番号３８、
（ｘｖｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号８、
（ｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３２、
（ｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３３、
（ｘｉｘ）それぞれ、配列番号７及び配列番号３４、
（ｘｘ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号８、
（ｘｘｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３２、
（ｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３３、
（ｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号３４、
（ｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号８、
（ｘｘｖ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３２、
（ｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３３、
（ｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号３０及び配列番号３４、
（ｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号８、
（ｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３２、
（ｘｘｘ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３３、
（ｘｘｘｉ）それぞれ、配列番号３１及び配列番号３４、
（ｘｘｘｉｉ）それぞれ、配列番号３９及び配列番号４０、
（ｘｘｘｉｉｉ）それぞれ、配列番号９及び配列番号１０、
（ｘｘｘｉｖ）それぞれ、配列番号１１及び配列番号１２、
（ｘｘｘｖ）それぞれ、配列番号１３及び配列番号１４、
（ｘｘｘｖｉ）それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６、
（ｘｘｘｖｉｉ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号２０、
（ｘｘｘｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号２２、
（ｘｘｘｉｘ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号２４、
（ｘｌ）それぞれ、配列番号４１及び配列番号４２、
（ｘｌｉ）それぞれ、配列番号４３及び配列番号４４、
（ｘｌｉｉ）それぞれ、配列番号４５及び配列番号４６、
（ｘｌｉｉｉ）それぞれ、配列番号４７及び配列番号４８、
（ｘｌｉｖ）それぞれ、配列番号４９及び配列番号５０、
（ｘｌｖ）それぞれ、配列番号５１及び配列番号４４、
（ｘｌｖｉ）それぞれ、配列番号５３及び配列番号５２、
（ｘｌｖｉｉ）それぞれ、配列番号５５及び配列番号５４、
（ｘｌｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号５７及び配列番号５６、並びに
（ｘｌｉｘ）それぞれ、配列番号５９及び配列番号５８のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢポリペプチド配列から形成される。
【0130】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡは、螺旋伸長を含む。いくつかの実施形態では、螺旋伸長は、ｃｏｍｐＡのＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、螺旋伸長は、ＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫ（配列番号６２）である。
【0131】
いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＢは、螺旋伸長を含む。いくつかの実施形態では、螺旋伸長は、ｃｏｍｐＢのＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、螺旋伸長は、ＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫ（配列番号６２）である。
【0132】
いくつかの実施形態では、ナノ構造は、ｐｂＶＬＰである。いくつかの実施形態では、ｐｂＶＬＰは、ワクチンである。
【0133】
本開示の他のｃｏｍｐＡ／ｃｏｍｐＢ組織化体を図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、ｐｂＶＬＰは、最大８個の三量体、８個の三量体及び１２個の二量体、６個の四量体及び１２個の二量体、６個の四量体及び８個の三量体、２０個の三量体及び３０個の二量体、４個の三量体及び６個の二量体、４個の第１の三量体及び４個の第２の三量体、又は８個の三量体、１２個の五量体及び２０個の三量体、又は１２個の五量体及び３０個の二量体、又は４個の三量体の表示に適合される。ある場合には、対称軸のうちの１つは抗原表示に使用されないため、いくつかの実施形態では、ｐｂＶＬＰは、最大８個の三量体、１２個の二量体、６個の四量体、２０個の三量体、３０個の二量体、４個の三量体、６個の二量体、８個の三量体、又は１２個の五量体の表示に適合される。ある場合には、単量体抗原が表示され、したがって、ｐｂＶＬＰは、最大１２、２４、６０、又は７０個の単量体抗原の表示に適合される。ある場合には、ｐｂＶＬＰは、別様には、ｐｂＶＬＰのコアの同一のポリペプチドが、異なる抗原を表示するか、又は抗原を表示しないように、混合された複数のポリペプチドを含む。したがって、ポリペプチドの比率に応じて、ｐｂＶＬＰは、場合によっては、１～１３０個の抗原を（例えば、Ｉ５２粒子上に）表示するように適合され、表示される抗原の各々は、選択される任意の比率に比例して、混合集団の同じメンバーであっても、異なるメンバーであってもよい。抗原は、組換え発現系において共発現され、精製前に自己組織化され得る。非限定的な例示的ｐｂＶＬＰは、Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３：３８９－９４（２０１６）、Ｈｅｉｎｚｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ Ｂ．１２０：５９４５－５９５２（２０１６）、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５１０：１０３－１０８（２０１４）、及びＫｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３６：１１７１－７１（２０１２）に提供される。
【0134】
本開示のｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢタンパク質は、様々なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。米国特許公開第２０１５／０３５６２４０Ａ１号は、タンパク質組織化体を設計するための様々な方法を記載している。米国特許公開第２０１６／０１２２３９２Ａ１号及び国際特許公開第２０１４／１２４３０１Ａ１号に記載されているように、配列番号１～５１の単離されたポリペプチドは、二十面体粒子などのｐｂＶＬＰを形成するために対で自己組織化する能力のために設計された。設計には、組織化してｐｂＶＬＰを形成することができるポリペプチド対の各メンバーの好適な界面残基の設計が含まれる。このように形成されるｐｂＶＬＰには、第１の組織化体及び第２の組織化体を、二十面体対称性を有するものなどのｐｂＶＬＰに配向させる、対称的に繰り返される非天然の非共有結合ポリペプチド－ポリペプチド界面が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢ（すなわち、ｐｂＶＬＰのコアの２つのポリペプチド）は、配列番号１～５１からなる群から選択される。各場合において、全長タンパク質に存在するが、典型的には融合を作製するために除去されるＮ末端メチオニン残基は、配列に含まれない。様々な実施形態では、１つ以上の追加の残基がＮ末端から欠失され、及び／又は追加の残基がＮ末端に添加される（例えば、螺旋伸長を形成する）。図１０に示すように、以下に開示する配列は、関連するタンパク質配列のいくつかのファミリーに分類される。
表１
表２
表１
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0135】
表１及び２は、本開示の実施形態のｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢのアミノ酸配列を提供する。各場合において、配列の対はともに、二十面体対称性を有するＩ５３多量体を形成する。表１の右側の列は、得られた組織化されたウイルス様粒子（すなわち、「識別された界面残基」）の界面に存在すると識別された各例示的なポリペプチドにおける残基番号を識別する。見ることができるように、配列番号１～３４の例示的なポリペプチドの界面残基の数は、４～１３の範囲である。いくつかの実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個の界面残基を有する。様々な実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢは、配列番号１～３４からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり、かつ少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個の識別された界面位置と同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号３５～５１は、本開示の実施形態に由来するｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢの他のアミノ酸配列を表す。他の実施形態では、ｃｏｍｐＡ及び／又はｃｏｍｐＢは、配列番号１～５１からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり、かつ少なくとも２０％、２５％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0136】
表２に示すように、ｃｏｍｐＢタンパク質は、類似の分子量（ＭＷ）、等電点（ｐＩ）、及びパーセント疎水性残基を有し、類似の方法を使用してそれらを発現及び精製することができることを示唆する。
【0137】
一般的なタンパク質の場合と同様に、ポリペプチドは、ウイルス様粒子へのその後の組織化を妨げることなく、設計された配列のいくつかの変動を許容すると、特に、そのような変動が保存的アミノ酸置換を含む場合に、予想される。本明細書で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」とは、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）は、他の疎水性アミノ酸でのみ置換することができ、かさばる側鎖を有する疎水性アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）は、かさばる側鎖を有する他の疎水性アミノ酸でのみ置換することができ、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）は、正に荷電した側鎖を有する他のアミノ酸でのみ置換することができ、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）は、負に荷電した側鎖を有する他のアミノ酸でのみ置換することができ、及び極性非荷電側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）は、極性非荷電側鎖を有する他のアミノ酸でのみ置換することができることを意味する。
【0138】
本発明のｐｂＶＬＰの様々な実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢ、又はその逆は、以下の対から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその修飾バージョンを含み（すなわち、本発明のポリペプチドについて開示されるような許容される修飾、その長さにわたって少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％であり、及び／又は配列番号で示されるアミノ酸配列と少なくとも１つの識別された界面位置と同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド）、すなわち、
配列番号１及び配列番号２（Ｉ５３－３４Ａ及びＩ５３－３４Ｂ）、
配列番号３及び配列番号４（Ｉ５３－４０Ａ及びＩ５３－４０Ｂ）、
配列番号３及び配列番号２４（Ｉ５３－４０Ａ及びＩ５３－４０Ｂ．１）、
配列番号２３及び配列番号４（Ｉ５３－４０Ａ．１及びＩ５３－４０Ｂ）、
配列番号３５及び配列番号３６（Ｉ５３－４０Ａ属及びＩ５３－４０Ｂ属）、
配列番号５及び配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ及びＩ５３－４７Ｂ）、
配列番号５及び配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ及びＩ５３－４７Ｂ．１）、
配列番号５及び配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ及びＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号２５及び配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１及びＩ５３－４７Ｂ）、
配列番号２５及び配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１及びＩ５３－４７Ｂ．１）、
配列番号２５及び配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１及びＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号２６及び配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－４７Ｂ）、
配列番号２６及び配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－４７Ｂ．１）、
配列番号２６及び配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号３７及び配列番号３８（Ｉ５３－４７Ａ属及びＩ５３－４７Ｂ属）、
配列番号７及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ）、
配列番号７及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．１）、
配列番号７及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号７及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）、
配列番号２９及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ）、
配列番号２９及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ．１）、
配列番号２９及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号２９及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）、
配列番号３０及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ）、
配列番号３０及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ．１）、
配列番号３０及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号３０及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）、
配列番号３１及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ）、
配列番号３１及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ．１）、
配列番号３１及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号３１及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）、
配列番号３９及び配列番号４０（Ｉ５３－５０Ａ属及びＩ５３－５０Ｂ属）、
配列番号９及び配列番号１０（Ｉ５３－５１Ａ及びＩ５３－５１Ｂ）、
配列番号１１及び配列番号１２（Ｉ５２－０３Ａ及びＩ５２－０３Ｂ）、
配列番号１３及び配列番号１４（Ｉ５２－３２Ａ及びＩ５２－３２Ｂ）、
配列番号１５及び配列番号１６（Ｉ５２－３３Ａ及びＩ５２－３３Ｂ）、
配列番号１７及び配列番号１８（Ｉ３２－０６Ａ及びＩ３２－０６Ｂ）、
配列番号１９及び配列番号２０（Ｉ３２－１９Ａ及びＩ３２－１９Ｂ）、
配列番号２１及び配列番号２２（Ｉ３２－２８Ａ及びＩ３２－２８Ｂ）、
配列番号２３及び配列番号２４（Ｉ５３－４０Ａ．１及びＩ５３－４０Ｂ．１）、
配列番号４１及び配列番号４２（Ｔ３２－２８Ａ及びＴ３２－２８Ｂ）、
配列番号４３及び配列番号４４（Ｔ３３－０９Ａ及びＴ３３－０９Ｂ）、
配列番号４５及び配列番号４６（Ｔ３３－１５Ａ及びＴ３３－１５Ｂ）、
配列番号４７及び配列番号４８（Ｔ３３－２１Ａ及びＴ３３－２１Ｂ）、
配列番号４９及び配列番号５０（Ｔ３３－２８Ａ及びＴ３２－２８Ｂ）、並びに
配列番号５１及び配列番号４４（Ｔ３３－３１Ａ及びＴ３３－０９Ｂ（Ｔ３３－３１Ｂとも称される））であって、「Ａ」で終わるものがｃｏｍｐＡであり、「Ｂ」で終わるものがｃｏｍｐＢである（例えば、Ｉ５３－３４ＡはｃｏｍｐＡであり、Ｉ５３－３４ＢはｃｏｍｐＢである）。
配列番号１及び配列番号２（Ｉ５３－３４Ａ及びＩ５３－３４Ｂ）、
配列番号３及び配列番号４（Ｉ５３－４０Ａ及びＩ５３－４０Ｂ）、
配列番号３及び配列番号２４（Ｉ５３－４０Ａ及びＩ５３－４０Ｂ．１）、
配列番号２３及び配列番号４（Ｉ５３－４０Ａ．１及びＩ５３－４０Ｂ）、
配列番号３５及び配列番号３６（Ｉ５３－４０Ａ属及びＩ５３－４０Ｂ属）、
配列番号５及び配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ及びＩ５３－４７Ｂ）、
配列番号５及び配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ及びＩ５３－４７Ｂ．１）、
配列番号５及び配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ及びＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号２５及び配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１及びＩ５３－４７Ｂ）、
配列番号２５及び配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１及びＩ５３－４７Ｂ．１）、
配列番号２５及び配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１及びＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号２６及び配列番号６（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－４７Ｂ）、
配列番号２６及び配列番号２７（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－４７Ｂ．１）、
配列番号２６及び配列番号２８（Ｉ５３－４７Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－４７Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号３７及び配列番号３８（Ｉ５３－４７Ａ属及びＩ５３－４７Ｂ属）、
配列番号７及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ）、
配列番号７及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．１）、
配列番号７及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号７及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）、
配列番号２９及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ）、
配列番号２９及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ．１）、
配列番号２９及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号２９及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）、
配列番号３０及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ）、
配列番号３０及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ．１）、
配列番号３０及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号３０及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＮｅｇＴ２及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）、
配列番号３１及び配列番号８（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ）、
配列番号３１及び配列番号３２（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ．１）、
配列番号３１及び配列番号３３（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ．１ＮｅｇＴ２）、
配列番号３１及び配列番号３４（Ｉ５３－５０Ａ．１ＰｏｓＴ１及びＩ５３－５０Ｂ．４ＰｏｓＴ１）、
配列番号３９及び配列番号４０（Ｉ５３－５０Ａ属及びＩ５３－５０Ｂ属）、
配列番号９及び配列番号１０（Ｉ５３－５１Ａ及びＩ５３－５１Ｂ）、
配列番号１１及び配列番号１２（Ｉ５２－０３Ａ及びＩ５２－０３Ｂ）、
配列番号１３及び配列番号１４（Ｉ５２－３２Ａ及びＩ５２－３２Ｂ）、
配列番号１５及び配列番号１６（Ｉ５２－３３Ａ及びＩ５２－３３Ｂ）、
配列番号１７及び配列番号１８（Ｉ３２－０６Ａ及びＩ３２－０６Ｂ）、
配列番号１９及び配列番号２０（Ｉ３２－１９Ａ及びＩ３２－１９Ｂ）、
配列番号２１及び配列番号２２（Ｉ３２－２８Ａ及びＩ３２－２８Ｂ）、
配列番号２３及び配列番号２４（Ｉ５３－４０Ａ．１及びＩ５３－４０Ｂ．１）、
配列番号４１及び配列番号４２（Ｔ３２－２８Ａ及びＴ３２－２８Ｂ）、
配列番号４３及び配列番号４４（Ｔ３３－０９Ａ及びＴ３３－０９Ｂ）、
配列番号４５及び配列番号４６（Ｔ３３－１５Ａ及びＴ３３－１５Ｂ）、
配列番号４７及び配列番号４８（Ｔ３３－２１Ａ及びＴ３３－２１Ｂ）、
配列番号４９及び配列番号５０（Ｔ３３－２８Ａ及びＴ３２－２８Ｂ）、並びに
配列番号５１及び配列番号４４（Ｔ３３－３１Ａ及びＴ３３－０９Ｂ（Ｔ３３－３１Ｂとも称される））であって、「Ａ」で終わるものがｃｏｍｐＡであり、「Ｂ」で終わるものがｃｏｍｐＢである（例えば、Ｉ５３－３４ＡはｃｏｍｐＡであり、Ｉ５３－３４ＢはｃｏｍｐＢである）。
【0139】
本開示のタンパク質ベースのＶＬＰにおいて有用な設計されたタンパク質複合体の非限定的な例としては、米国特許第９，６３０，９９４号、国際特許公開第２０１８／１８７３２５Ａ１号、米国特許公開第２０１８／０１３７２３４Ａ１号、米国特許公開第２０１９／０１５５９８８Ａ２号に開示されるものが挙げられ、これらの各々はその全体が本明細書に組み込まれる。
【0140】
本開示のｐｂＶＬＰの様々な実施形態では、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢは、以下の対又はその修飾バージョンから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み（すなわち、本発明のポリペプチドについて開示される許容される修飾、配列番号で示されるアミノ酸配列に対して、その長さにわたって少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％であり、及び／又は少なくとも１つの識別された界面位置と同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド）、すなわち、
配列番号５２及び配列番号５３（Ｔ３３＿ｄｎ２Ａ及びＴ３３＿ｄｎ２Ｂ）、
配列番号５４及び配列番号５５（Ｔ３３＿ｄｎ５Ａ及びＴ３３＿ｄｎ５Ｂ）、
配列番号５６及び配列番号５７（Ｔ３３＿ｄｎ１０Ａ及びＴ３３＿ｄｎ１０Ｂ）、又は
配列番号５８及び配列番号５９（Ｉ５３＿ｄｎ５Ａ及びＩ５３＿ｄｎ５Ｂ）であって、
「ｄｎ５Ｂ」で終わるものはｃｏｍｐＡであり、「ｄｎ５Ａ」で終わるものはｃｏｍｐＢである（例えば、Ｉ５３＿ｄｎ５ＢはｃｏｍｐＡであり、ｄｎ５ＡはｃｏｍｐＢである）。
Ｔ３３＿ｄｎ２Ａ（配列番号５２）
ＮＬＡＥＫＭＹＫＡＧＮＡＭＹＲＫＧＱＹＴＩＡＩＩＡＹＴＬＡＬＬＫＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＡＹＫＫＧＥＹＤＥＡＩＥＡＹＱＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＫＫＡＬＲＬＤＰＲＮＶＤＡＩＥＮＬＩＥＡＥＥＫＱＧ
Ｔ３３＿ｄｎ２Ｂ（配列番号５３）
ＥＥＡＥＬＡＹＬＬＧＥＬＡＹＫＬＧＥＹＲＩＡＩＲＡＹＲＩＡＬＫＲＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＲＥＡＩＲＹＹＬＲＡＬＫＬＤＰＥＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＬＹＫＱＧＫＹＤＬＡＩＩＡＹＱＡＡＬＥＥＤＰＮＮＡＥＡＫＱＮＬＧＮＡＫＱＫＱＧ
Ｔ３３＿ｄｎ５Ａ（配列番号５４）
ＮＳＡＥＡＭＹＫＭＧＮＡＡＹＫＱＧＤＹＩＬＡＩＩＡＹＬＬＡＬＥＫＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＡＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＥＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＬＫＮＬＬＥＡＩＡＥＱＤ
Ｔ３３＿ｄｎ５Ｂ（配列番号５５）
ＴＤＰＬＡＶＩＬＹＩＡＩＬＫＡＥＫＳＩＡＲＡＫＡＡＥＡＬＧＫＩＧＤＥＲＡＶＥＰＬＩＫＡＬＫＤＥＤＡＬＶＲＡＡＡＡＤＡＬＧＱＩＧＤＥＲＡＶＥＰＬＩＫＡＬＫＤＥＥＧＬＶＲＡＳＡＡＩＡＬＧＱＩＧＤＥＲＡＶＱＰＬＩＫＡＬＴＤＥＲＤＬＶＲＶＡＡＡＶＡＬＧＲＩＧＤＥＫＡＶＲＰＬＩＩＶＬＫＤＥＥＧＥＶＲＥＡＡＡＩＡＬＧＳＩＧＧＥＲＶＲＡＡＭＥＫＬＡＥＲＧＴＧＦＡＲＫＶＡＶＮＹＬＥＴＨＫ
Ｔ３３＿ｄｎ１０Ａ（配列番号５６）
ＥＥＡＥＬＡＹＬＬＧＥＬＡＹＫＬＧＥＹＲＩＡＩＲＡＹＲＩＡＬＫＲＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＥＫＡＬＥＬＤＰＥＮＬＥＡＬＱＮＬＬＮＡＭＤＫＱＧ
Ｔ３３＿ｄｎ１０Ｂ（配列番号５７）
ＩＥＥＶＶＡＥＭＩＤＩＬＡＥＳＳＫＫＳＩＥＥＬＡＲＡＡＤＮＫＴＴＥＫＡＶＡＥＡＩＥＥＩＡＲＬＡＴＡＡＩＱＬＩＥＡＬＡＫＮＬＡＳＥＥＦＭＡＲＡＩＳＡＩＡＥＬＡＫＫＡＩＥＡＩＹＲＬＡＤＮＨＴＴＤＴＦＭＡＲＡＩＡＡＩＡＮＬＡＶＴＡＩＬＡＩＡＡＬＡＳＮＨＴＴＥＥＦＭＡＲＡＩＳＡＩＡＥＬＡＫＫＡＩＥＡＩＹＲＬＡＤＮＨＴＴＤＫＦＭＡＡＡＩＥＡＩＡＬＬＡＴＬＡＩＬＡＩＡＬＬＡＳＮＨＴＴＥＫＦＭＡＲＡＩＭＡＩＡＩＬＡＡＫＡＩＥＡＩＹＲＬＡＤＮＨＴＳＰＴＹＩＥＫＡＩＥＡＩＥＫＩＡＲＫＡＩＫＡＩＥＭＬＡＫＮＩＴＴＥＥＹＫＥＫＡＫＫＩＩＤＩＩＲＫＬＡＫＭＡＩＫＫＬＥＤＮＲＴ
Ｉ５３＿ｄｎ５Ａ（配列番号５８）
ＫＹＤＧＳＫＬＲＩＧＩＬＨＡＲＷＮＡＥＩＩＬＡＬＶＬＧＡＬＫＲＬＱＥＦＧＶＫＲＥＮＩＩＩＥＴＶＰＧＳＦＥＬＰＹＧＳＫＬＦＶＥＫＱＫＲＬＧＫＰＬＤＡＩＩＰＩＧＶＬＩＫＧＳＴＭＨＦＥＹＩＣＤＳＴＴＨＱＬＭＫＬＮＦＥＬＧＩＰＶＩＦＧＶＬＴＣＬＴＤＥＱＡＥＡＲＡＧＬＩＥＧＫＭＨＮＨＧＥＤＷＧＡＡＡＶＥＭＡＴＫＦＮ
Ｉ５３＿ｄｎ５Ｂ（配列番号５９）
ＥＥＡＥＬＡＹＬＬＧＥＬＡＹＫＬＧＥＹＲＩＡＩＲＡＹＲＩＡＬＫＲＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＲＹＲＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＥＲＧＥＹＥＥＡＩＥＹＹＲＫＡＬＲＬＤＰＮＮＡＤＡＭＱＮＬＬＮＡＫＭＲＥＥ
配列番号５２及び配列番号５３（Ｔ３３＿ｄｎ２Ａ及びＴ３３＿ｄｎ２Ｂ）、
配列番号５４及び配列番号５５（Ｔ３３＿ｄｎ５Ａ及びＴ３３＿ｄｎ５Ｂ）、
配列番号５６及び配列番号５７（Ｔ３３＿ｄｎ１０Ａ及びＴ３３＿ｄｎ１０Ｂ）、又は
配列番号５８及び配列番号５９（Ｉ５３＿ｄｎ５Ａ及びＩ５３＿ｄｎ５Ｂ）であって、
「ｄｎ５Ｂ」で終わるものはｃｏｍｐＡであり、「ｄｎ５Ａ」で終わるものはｃｏｍｐＢである（例えば、Ｉ５３＿ｄｎ５ＢはｃｏｍｐＡであり、ｄｎ５ＡはｃｏｍｐＢである）。
Ｔ３３＿ｄｎ２Ａ（配列番号５２）
ＮＬＡＥＫＭＹＫＡＧＮＡＭＹＲＫＧＱＹＴＩＡＩＩＡＹＴＬＡＬＬＫＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＡＹＫＫＧＥＹＤＥＡＩＥＡＹＱＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＫＫＡＬＲＬＤＰＲＮＶＤＡＩＥＮＬＩＥＡＥＥＫＱＧ
Ｔ３３＿ｄｎ２Ｂ（配列番号５３）
ＥＥＡＥＬＡＹＬＬＧＥＬＡＹＫＬＧＥＹＲＩＡＩＲＡＹＲＩＡＬＫＲＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＲＥＡＩＲＹＹＬＲＡＬＫＬＤＰＥＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＬＹＫＱＧＫＹＤＬＡＩＩＡＹＱＡＡＬＥＥＤＰＮＮＡＥＡＫＱＮＬＧＮＡＫＱＫＱＧ
Ｔ３３＿ｄｎ５Ａ（配列番号５４）
ＮＳＡＥＡＭＹＫＭＧＮＡＡＹＫＱＧＤＹＩＬＡＩＩＡＹＬＬＡＬＥＫＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＡＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＥＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＬＫＮＬＬＥＡＩＡＥＱＤ
Ｔ３３＿ｄｎ５Ｂ（配列番号５５）
ＴＤＰＬＡＶＩＬＹＩＡＩＬＫＡＥＫＳＩＡＲＡＫＡＡＥＡＬＧＫＩＧＤＥＲＡＶＥＰＬＩＫＡＬＫＤＥＤＡＬＶＲＡＡＡＡＤＡＬＧＱＩＧＤＥＲＡＶＥＰＬＩＫＡＬＫＤＥＥＧＬＶＲＡＳＡＡＩＡＬＧＱＩＧＤＥＲＡＶＱＰＬＩＫＡＬＴＤＥＲＤＬＶＲＶＡＡＡＶＡＬＧＲＩＧＤＥＫＡＶＲＰＬＩＩＶＬＫＤＥＥＧＥＶＲＥＡＡＡＩＡＬＧＳＩＧＧＥＲＶＲＡＡＭＥＫＬＡＥＲＧＴＧＦＡＲＫＶＡＶＮＹＬＥＴＨＫ
Ｔ３３＿ｄｎ１０Ａ（配列番号５６）
ＥＥＡＥＬＡＹＬＬＧＥＬＡＹＫＬＧＥＹＲＩＡＩＲＡＹＲＩＡＬＫＲＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＤＹＤＥＡＩＥＹＹＥＫＡＬＥＬＤＰＥＮＬＥＡＬＱＮＬＬＮＡＭＤＫＱＧ
Ｔ３３＿ｄｎ１０Ｂ（配列番号５７）
ＩＥＥＶＶＡＥＭＩＤＩＬＡＥＳＳＫＫＳＩＥＥＬＡＲＡＡＤＮＫＴＴＥＫＡＶＡＥＡＩＥＥＩＡＲＬＡＴＡＡＩＱＬＩＥＡＬＡＫＮＬＡＳＥＥＦＭＡＲＡＩＳＡＩＡＥＬＡＫＫＡＩＥＡＩＹＲＬＡＤＮＨＴＴＤＴＦＭＡＲＡＩＡＡＩＡＮＬＡＶＴＡＩＬＡＩＡＡＬＡＳＮＨＴＴＥＥＦＭＡＲＡＩＳＡＩＡＥＬＡＫＫＡＩＥＡＩＹＲＬＡＤＮＨＴＴＤＫＦＭＡＡＡＩＥＡＩＡＬＬＡＴＬＡＩＬＡＩＡＬＬＡＳＮＨＴＴＥＫＦＭＡＲＡＩＭＡＩＡＩＬＡＡＫＡＩＥＡＩＹＲＬＡＤＮＨＴＳＰＴＹＩＥＫＡＩＥＡＩＥＫＩＡＲＫＡＩＫＡＩＥＭＬＡＫＮＩＴＴＥＥＹＫＥＫＡＫＫＩＩＤＩＩＲＫＬＡＫＭＡＩＫＫＬＥＤＮＲＴ
Ｉ５３＿ｄｎ５Ａ（配列番号５８）
ＫＹＤＧＳＫＬＲＩＧＩＬＨＡＲＷＮＡＥＩＩＬＡＬＶＬＧＡＬＫＲＬＱＥＦＧＶＫＲＥＮＩＩＩＥＴＶＰＧＳＦＥＬＰＹＧＳＫＬＦＶＥＫＱＫＲＬＧＫＰＬＤＡＩＩＰＩＧＶＬＩＫＧＳＴＭＨＦＥＹＩＣＤＳＴＴＨＱＬＭＫＬＮＦＥＬＧＩＰＶＩＦＧＶＬＴＣＬＴＤＥＱＡＥＡＲＡＧＬＩＥＧＫＭＨＮＨＧＥＤＷＧＡＡＡＶＥＭＡＴＫＦＮ
Ｉ５３＿ｄｎ５Ｂ（配列番号５９）
ＥＥＡＥＬＡＹＬＬＧＥＬＡＹＫＬＧＥＹＲＩＡＩＲＡＹＲＩＡＬＫＲＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＫＱＧＲＹＲＥＡＩＥＹＹＱＫＡＬＥＬＤＰＮＮＡＥＡＷＹＮＬＧＮＡＹＹＥＲＧＥＹＥＥＡＩＥＹＹＲＫＡＬＲＬＤＰＮＮＡＤＡＭＱＮＬＬＮＡＫＭＲＥＥ
【0141】
発現及び精製方法
Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質の過剰発現は、封入体としても知られる密集した不溶性粒子の凝集及び堆積に頻繁につながる。封入体における発現は、得られる組換えタンパク質の純度を増加させ得るが、タンパク質の所望の三次構造を保存するためには、通常、細胞の可溶性画分からタンパク質を精製することが好ましいことが広く知られている。タンパク質が包摂体内で発現する場合、タンパク質の変性及びリフォールディングが重要であると考えられる。このため、通常、溶解は、完全なアンフォールディングに到達するために、尿素又は塩酸グアニジニウムなどの高濃度のカオトロピック剤中で行われる。２－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又は１－モノチオグリセロール（ＭＴＧ）などの還元剤を添加して、非天然のジスルフィド結合及び分子内ジスルフィド結合を還元し、システインを還元状態に保つ。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質の過剰発現は、封入体としても知られる密集した不溶性粒子の凝集及び堆積に頻繁につながる。封入体における発現は、得られる組換えタンパク質の純度を増加させ得るが、タンパク質の所望の三次構造を保存するためには、通常、細胞の可溶性画分からタンパク質を精製することが好ましいことが広く知られている。タンパク質が包摂体内で発現する場合、タンパク質の変性及びリフォールディングが重要であると考えられる。このため、通常、溶解は、完全なアンフォールディングに到達するために、尿素又は塩酸グアニジニウムなどの高濃度のカオトロピック剤中で行われる。２－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又は１－モノチオグリセロール（ＭＴＧ）などの還元剤を添加して、非天然のジスルフィド結合及び分子内ジスルフィド結合を還元し、システインを還元状態に保つ。
【0142】
対照的に、本開示の方法は、低濃度のカオトロピック剤を使用して、それらを変性させることなく封入体からｃｏｍｐＢタンパク質を放出する。したがって、本明細書において、ナノ構造を作製する方法であって、組換え成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質を封入体から可溶化溶液で可溶化することを含み、それによって産物ｃｏｍｐＢタンパク質を含む産物試料を生成する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ｃｏｍｐＢタンパク質を変性させることを含まず、かつ／又はｃｏｍｐＢタンパク質をリフォールディングすることを含まない。
【0143】
封入体は、様々な組換え発現系を使用して生成され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ又は他の細菌発現系を使用し得る。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、株Ｋ－１２である。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｂ株である。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｗ３１１０ ｏｍｐＴ株である。
【0144】
本発明者らは、Ｔ７及びｐｈｏＡベースの発現系の両方が、ｃｏｍｐＢタンパク質の好適な収率を生成することができると判断した。しかしながら、ｐｈｏＡベースの発現系は、ある場合には、より高い収率でｃｏｍｐＢタンパク質を生成した。好適な発現技術は、本明細書に引用される参照文献に提供され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明者らは、約３０℃での発現が封入体においてｃｏｍｐＢタンパク質を生成したことを見出したように、発現は低温で実行される。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、約３３℃未満、任意選択で約１５℃～約３３℃、又は約１７℃～約３０℃、好ましくは約３０℃で培養される。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、又は約３３℃で培養される。
【0145】
宿主（例えば細菌細胞）は、ｃｏｍｐＢタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動的に連結されている。プロモーターは、組換えタンパク質発現に好適なｐｈｏＡプロモーター又は任意の他のプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｐｈｏＡプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーター以外のプロモーターである。
【0146】
封入体は、宿主細胞の化学的及び／又は物理的溶解を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して採取され得る。いくつかの実施形態では、方法は、細菌細胞を溶解液中で溶解することであって、溶解液が、封入体の溶解度を促進する薬剤を実質的に含まない、溶解することと、封入体を回収することと、を含む。いくつかの実施形態では、溶解液は、洗剤を実質的に含まない。封入体は、遠心分離及び／又は濾過によって宿主細胞の細胞質から精製され得る。
【0147】
封入体を採取した後、可溶化溶液を使用して、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化する。溶解は、溶液を攪拌するか、又は他の方法で混合することによって、例えば、溶液をボルテックスするか、又は溶液を超音波処理することによって促進され得る。尿素、又は塩酸グアニジニウムを含む溶液を含む、様々な可溶化溶液が使用され得る。いくつかの実施形態では、可溶化溶液は、任意選択で０．０５Ｍ～３Ｍの尿素濃度の尿素を含む。尿素濃度は、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、２．０Ｍ、２．１Ｍ、２．２Ｍ、２．３Ｍ、２．４Ｍ、２．５Ｍ、２．６Ｍ、２．７Ｍ、２．８Ｍ、２．９Ｍ、又は３．０Ｍであり得る。ある場合には、可溶化溶液は、緩衝液及び／又は中性洗剤を含み得、これは任意選択で同じ又は異なる賦形剤であり得る。好適な緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）緩衝液、又はこれらの組み合わせ、例えばリン酸－クエン酸緩衝液が挙げられる。ＣＨＡＰＳは、界面活性剤としても機能するという利点を有する。
【0148】
可溶化溶液は、中性ｐＨなどの所定のｐＨの緩衝溶液であり得る。可溶化溶液の最適ｐＨは、最適値、例えば、５～６、６～７、７～８、又は８～９のｐＨを決定するために、様々なｐＨで手順を試験することによって決定され得る。多くのｃｏｍｐＢタンパク質に好適なｐＨは、ｐＨ７．４である。可溶化ステップの前に、封入体を任意選択で洗浄し得る。いくつかの実施形態では、可溶化ステップの前に、封入体を洗浄する。様々な洗浄液を使用し得る。ある場合には、洗浄液は、可溶化溶液よりも低い濃度、例えば、１５０ｍＭ未満、任意選択で５０～１５０ｍＭの尿素濃度のカオトロピック剤を含む。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、尿素、塩酸グアニジニウム、及びｎ－プロパノールから選択される。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、尿素である。いくつかの実施形態では、尿素濃度は、１５０ｍＭ未満、１４０ｍＭ未満、１３０ｍＭ未満、１２０ｍＭ未満、１１０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、又は５０ｍＭ未満である。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、塩酸グアニジニウムである。いくつかの実施形態では、塩酸グアニジニウム濃度は、３Ｍ未満である。いくつかの実施形態では、塩酸グアニジニウムは、３Ｍ未満、２．５Ｍ未満、２Ｍ未満、１．５Ｍ未満、１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、又は０．１Ｍ未満である。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、ｎ－プロパノールである。いくつかの実施形態では、ｎ－プロパノールの濃度は、５％以下である。いくつかの実施形態では、ｎ－プロパノールの濃度は、５％未満である。いくつかの実施形態では、ｎ－プロパノールの濃度は、５％以下である。いくつかの実施形態では、ｎ－プロパノールの濃度は、５％未満である。可溶化されると、ｃｏｍｐＢタンパク質は、様々な生化学技術を使用して更に精製され得る。有利には、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、エンドトキシン、及び／又は他の不純物を除去する精製手順が用いられる。ｃｏｍｐＢタンパク質の精製に特に好適なのは、いわゆる直交精製戦略である。非限定的な例として、イオン交換クロマトグラフィーは、混合モードのクロマトグラフィーステップと組み合わせ得る。
【0149】
いくつかの実施形態では、方法は、ｃｏｍｐＢタンパク質を、陰イオン交換樹脂、任意選択で弱陰イオン交換樹脂、任意選択でジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）コンジュゲート樹脂と接触させることと、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、陰イオン交換樹脂は、弱陰イオン交換樹脂である。いくつかの実施形態では、陰イオン交換樹脂は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）コンジュゲート樹脂である。いくつかの実施形態では、陰イオン交換樹脂は、四級アミン（Ｑ）強陰イオン交換樹脂である。いくつかの実施形態では、方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してｃｏｍｐＢタンパク質を精製することを含む（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）を参照されたい）。
【0150】
いくつかの実施形態では、方法は、溶出ステップの前に、カラム洗浄液で陰イオン交換樹脂を洗浄することを含む。様々なカラム洗浄液を使用し得る。両性イオン界面活性剤及び／又は非イオン界面活性剤を含むカラム洗浄液を本明細書に開示する。非イオン性界面活性剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００又はその等価物であり得る。両性イオン界面活性剤は、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）又はその等価物であり得る。いくつかの実施形態では、両性イオン界面活性剤は、ＣＨＡＰＳＯ（３－（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート）、ＬＤＡＯ、ＤＤＭＡＢ、及び任意のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）界面活性剤から選択される。
【0151】
陰イオン交換樹脂からの溶出は、塩勾配を使用して達成され得る。段階的又は連続的な勾配のいずれかを使用し得る。いくつかの実施形態では、溶出溶液は、５０ｍＭ～８００ｍＭ、例えば、１００ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、又は８００ｍＭのＮａＣｌ濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む。
【0152】
いくつかの実施形態では、方法は、混合モード樹脂でｃｏｍｐＢタンパク質を精製することを含む。好適な混合モード培地は、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）樹脂を含む。ヒドロキシアパタイトは、タンパク質及びＤＮＡのクロマトグラフィー分離に古くから使用されているリン酸カルシウムの形態である。（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１３（２００３）１７６－１７８．）タンパク質のヒドロキシアパタイトへの吸着は、陰イオン性及びカチオン性の両方の交換を伴う。タンパク質は、最も一般的に、低濃度（１０～２５ｍＭ）のリン酸緩衝液中で吸着されるが、いくつかの酸性タンパク質は、水、食塩水、又は非リン酸緩衝液中に装填された場合にのみ吸着される。タンパク質は、通常、増加したリン酸勾配によって溶出されるが、Ｃａ２＋＋、Ｍｇ２＋＋、又はＣｌ－イオンの勾配も、特に塩基性タンパク質の選択的溶出に有用である。リン酸塩を使用する場合、酸性タンパク質は塩基性タンパク質よりも容易に溶出されるが、任意のタンパク質を溶出するのに必要なリン酸塩濃度は、ｐＨを上げることによって低下させることができる。ヒドロキシアパタイトに結合したタンパク質の混合物は、ｐＨを増加させる一連のリン酸塩洗浄ステップによって分画され得る。
【0153】
いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも５０％の溶解度、任意選択で７０～９５％の溶解度を有する。いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の溶解度を有する。いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも７０～９５％の溶解度を有する。いくつかの実施形態では、溶解度は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、任意選択でＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムを使用して測定される。
【0154】
いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、総タンパク質の重量比（ｗ／ｗ）として計算される少なくとも８０％の純度、任意選択で少なくとも９５％ｗ／ｗの純度を有する。いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％ｗ／ｗの純度を有する。いくつかの実施形態では、純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、任意選択で変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、測定される。
【0155】
いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも７０％ｗ／ｗの組織化能、任意選択で９０～９８％ｗ／ｗの組織化能がある。いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％ｗ／ｗの組織化能がある。いくつかの実施形態では、産物ｃｏｍｐＢタンパク質は、少なくとも７０％ｗ／ｗの組織化能、任意選択で９０～１００％ｗ／ｗの組織化能がある。いくつかの実施形態では、組織化能があるｃｏｍｐＢタンパク質のパーセンテージは、ｃｏｍｐＢタンパク質が過剰に成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）タンパク質を含む溶液と混合されるときに、タンパク質ベースのウイルス様粒子（ｖｐＶＬＰ）に組織化する、産物溶液中のｃｏｍｐＢタンパク質のパーセンテージ、重量比（ｗ／ｗ）として定義される。いくつかの実施形態では、組織化能があるｃｏｍｐＢタンパク質のパーセンテージは、ｃｏｍｐＢタンパク質が過剰に成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）タンパク質を１０％含む溶液と混合されるときに、タンパク質ベースのウイルス様粒子（ｖｐＶＬＰ）に組織化する、産物溶液中のｃｏｍｐＢタンパク質のパーセンテージ、重量比（ｗ／ｗ）として定義される。
【0156】
いくつかの実施形態では、産物溶液は、１ミリグラムの総タンパク質当たり５０エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍｇ）未満、任意選択で５～１５単位のＥＵ／ｍｇを含む。いくつかの実施形態では、産物溶液は、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、又は５単位のＥＵ／ｍｇを含む。いくつかの実施形態では、産物溶液は、４、５、６、１０、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６単位のＥＵ／ｍｇを含む。
【0157】
本明細書では、本開示の方法のいずれかによって産生されるｃｏｍｐＢタンパク質を含む組成物を更に提供する。組成物は、例えば、少なくとも５０％可溶性、任意選択で７０～９５％可溶性であり得、少なくとも８０％純粋であり得、純度は、総タンパク質の重量比（ｗ／ｗ）として計算され、任意選択で、少なくとも９５％ｗ／ｗ純粋であり得、及び／又は少なくとも７０％ｗ／ｗの組織化能、任意選択で、９０～１００％ｗ／ｗの組織化能があり得る。
【0158】
ｃｏｍｐＢタンパク質は、濃縮されたｃｏｍｐＢ溶液の最終溶液への希釈、及び／又は例えば連続モードでの透析濾過／限外濾過（ＤＦ／ＵＦ）を含む、当該技術分野で既知の様々な緩衝液交換技法のいずれかを使用して、最終溶液に配置され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、任意選択で２０ｍＭ、及び／又は２５０ｍＭ ＮａＣｌ、任意選択で２５０ｍＭのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、７～８のｐＨ、任意選択で７．４のｐＨで緩衝される。いくつかの実施形態では、組成物は、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０のｐＨに緩衝される。いくつかの実施形態では、組成物は、７．４のｐＨに緩衝される。いくつかの実施形態では、組成物は、貯蔵及び／又は凍結融解に対して安定である。いくつかの実施形態では、組成物は、貯蔵に対して安定である。いくつかの実施形態では、組成物は、凍結融解に対して安定である。
【0159】
例示的方法
ナノ構造を作製する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢタンパク質を含む。
ナノ構造を作製する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、成分Ｂ（ｃｏｍｐＢ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、成分Ａ（ｃｏｍｐＡ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、ｃｏｍｐＡ及びｃｏｍｐＢタンパク質を含む。
【0160】
いくつかの実施形態では、方法は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｃｏｍｐＢタンパク質を発現することを含む。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｂ株である。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｋ１２株である。いくつかの実施形態では、方法は、封入体から成分タンパク質（すなわち、ｃｏｍｐＡ又はｃｏｍｐＢ）を単離することを含む。
【0161】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するためのカオトロピック剤を含む可溶化溶液と封入体を接触させることであって、カオトロピック剤が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分な濃度で提供される、接触させることと、
（ｉｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を精製することと、を含む。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するためのカオトロピック剤を含む可溶化溶液と封入体を接触させることであって、カオトロピック剤が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分な濃度で提供される、接触させることと、
（ｉｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を精製することと、を含む。
【0162】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、第１の濃度のカオトロピック剤を含む洗浄液と接触させることであって、第１の濃度が、ｃｏｍｐＢの可溶化なしで封入体を精製するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、第２の濃度のカオトロピック剤を含む可溶化溶液と接触させて、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化することであって、濃度は、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を精製することと、を含む。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、第１の濃度のカオトロピック剤を含む洗浄液と接触させることであって、第１の濃度が、ｃｏｍｐＢの可溶化なしで封入体を精製するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、第２の濃度のカオトロピック剤を含む可溶化溶液と接触させて、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化することであって、濃度は、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を精製することと、を含む。
【0163】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するためのカオトロピック剤を含む可溶化溶液と封入体を接触させることであって、カオトロピック剤が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分な濃度で提供される、接触させることと、
（ｉｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を混合モード樹脂で精製することと、を含む。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するためのカオトロピック剤を含む可溶化溶液と封入体を接触させることであって、カオトロピック剤が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分な濃度で提供される、接触させることと、
（ｉｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を混合モード樹脂で精製することと、を含む。
【0164】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、第１の濃度のカオトロピック剤を含む洗浄液と接触させることであって、第１の濃度が、ｃｏｍｐＢの可溶化なしで封入体を精製するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、第２の濃度のカオトロピック剤を含む可溶化溶液と接触させて、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化することであって、濃度は、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を混合モード樹脂で精製することと、を含む。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、第１の濃度のカオトロピック剤を含む洗浄液と接触させることであって、第１の濃度が、ｃｏｍｐＢの可溶化なしで封入体を精製するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、第２の濃度のカオトロピック剤を含む可溶化溶液と接触させて、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化することであって、濃度は、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を混合モード樹脂で精製することと、を含む。
【0165】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するための尿素を含む可溶化溶液と封入体を接触させることであって、尿素が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分な濃度で提供される、接触させることと、
（ｉｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を精製することと、を含む。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するための尿素を含む可溶化溶液と封入体を接触させることであって、尿素が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分な濃度で提供される、接触させることと、
（ｉｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を精製することと、を含む。
【0166】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、第１の濃度の尿素を含む洗浄液と接触させることであって、第１の濃度が、ｃｏｍｐＢの可溶化なしで封入体を精製するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、第２の濃度の尿素を含む可溶化溶液と接触させて、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化することであって、濃度は、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を精製することと、を含む。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、第１の濃度の尿素を含む洗浄液と接触させることであって、第１の濃度が、ｃｏｍｐＢの可溶化なしで封入体を精製するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、第２の濃度の尿素を含む可溶化溶液と接触させて、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化することであって、濃度は、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を精製することと、を含む。
【0167】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するための尿素を含む可溶化溶液と封入体を接触させることであって、尿素が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分な濃度で提供される、接触させることと、
（ｉｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を混合モード樹脂で精製することと、を含む。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するための尿素を含む可溶化溶液と封入体を接触させることであって、尿素が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分な濃度で提供される、接触させることと、
（ｉｉｉ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を混合モード樹脂で精製することと、を含む。
【0168】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、第１の濃度の尿素を含む洗浄液と接触させることであって、第１の濃度が、ｃｏｍｐＢの可溶化なしで封入体を精製するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、第２の濃度の尿素を含む可溶化溶液と接触させて、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化することであって、濃度は、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を混合モード樹脂で精製することと、を含む。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、第１の濃度の尿素を含む洗浄液と接触させることであって、第１の濃度が、ｃｏｍｐＢの可溶化なしで封入体を精製するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、第２の濃度の尿素を含む可溶化溶液と接触させて、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化することであって、濃度は、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を陰イオン交換樹脂と接触させ、溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出させることと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質を混合モード樹脂で精製することと、を含む。
【0169】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、１５０ｍＭ未満の濃度の尿素を含む洗浄液と、持続時間、接触させることであって、濃度が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体として、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、０．１５Ｍ～２Ｍの濃度の尿素を含む可溶化溶液と、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するための持続時間、接触させることであって、濃度が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質をジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）コンジュゲート樹脂と接触させ、
溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出することと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質をセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）樹脂で精製することと、を含む。
（ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を単離することと、
（ｉｉ）封入体を、１５０ｍＭ未満の濃度の尿素を含む洗浄液と、持続時間、接触させることであって、濃度が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体として、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、０．１５Ｍ～２Ｍの濃度の尿素を含む可溶化溶液と、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するための持続時間、接触させることであって、濃度が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質をジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）コンジュゲート樹脂と接触させ、
溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出することと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質をセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）樹脂で精製することと、を含む。
【0170】
いくつかの実施形態では、方法は、
（ｉ）配列番号５８に記載の配列を有するｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を、Ｅ．ｃｏｌｉから単離することと、
（ｉｉ）封入体を、１５０ｍＭ未満の濃度の尿素を含む洗浄液と、持続時間、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、０．１５Ｍ～２Ｍの濃度の尿素を含む可溶化溶液と、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するための持続時間、接触させることであって、濃度が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質をジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）コンジュゲート樹脂と接触させ、
溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出することと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質をセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）樹脂で精製することと、を含む。
（ｉ）配列番号５８に記載の配列を有するｃｏｍｐＢタンパク質を含む封入体を、Ｅ．ｃｏｌｉから単離することと、
（ｉｉ）封入体を、１５０ｍＭ未満の濃度の尿素を含む洗浄液と、持続時間、接触させることと、
（ｉｉｉ）封入体を、０．１５Ｍ～２Ｍの濃度の尿素を含む可溶化溶液と、ｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するための持続時間、接触させることであって、濃度が、多量体（例えば、五量体）に組織化することができる単量体としてｃｏｍｐＢタンパク質を可溶化するのに十分である、接触させることと、
（ｉｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質をジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）コンジュゲート樹脂と接触させ、
溶出溶液を使用して樹脂からｃｏｍｐＢタンパク質を溶出することと、
（ｖ）ｃｏｍｐＢタンパク質をセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）樹脂で精製することと、を含む。
【0171】
ｐｂＶＬＰの組織化
いくつかの実施形態では、単一の成分は、ｐｂＶＬＰに自己組織化する。いくつかの実施形態では、ｐｂＶＬＰを形成する際に使用するための第１及び第２の成分の１つ以上の精製試料を、水性条件（例えば、Ｉ５３～５０Ａ／Ｂ二十面体ｐｂＶＬＰ）においてほぼ等モル比で混合する。第１及び第２の成分（多量体化ドメインを介して、及び任意選択でエクトドメインを介して）は、標的ｐｂＶＬＰの組織化を駆動するために互いに相互作用する。標的ｐｂＶＬＰの組織化の成功は、サイズ排除クロマトグラフィー、天然（非変性）ゲル電気泳動、動的光散乱、多角度光散乱、分析的超遠心分離、負染色電子顕微鏡法、冷凍電子顕微鏡法、又はＸ線結晶学を含むがこれらに限定されない、タンパク質又はタンパク質組織化体の物理的サイズを評価するために使用される一般的な生化学的又は生物物理的方法によってインビトロ組織化反応を分析することによって確認することができる。必要に応じて、組織化されたｐｂＶＬＰは、サイズ排除クロマトグラフィー、調製超遠心分離、接線流濾過、又は調製ゲル電気泳動を含むがこれらに限定されない、タンパク質をその物理サイズによって単離するために一般的に使用される調製技術を使用して、インビトロ組織化反応に存在する他の種又は分子から精製することができる。ｐｂＶＬＰ中の抗原タンパク質の存在は、限定されないが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析、タンパク質配列決定、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又はアミノ酸分析を含む水溶液中のタンパク質分子の同一性を決定するために一般的に使用される技法によって評価することができる。粒子の外側におけるタンパク質のアクセス可能性、並びにそのコンフォメーション又は抗原性は、モノクローナル抗体、コンフォメーション特異的モノクローナル抗体、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は抗原に特異的な抗血清による結合を含むがこれらに限定されない、抗原の存在及びコンフォメーションを検出するために一般的に使用される技術によって評価することができる。
いくつかの実施形態では、単一の成分は、ｐｂＶＬＰに自己組織化する。いくつかの実施形態では、ｐｂＶＬＰを形成する際に使用するための第１及び第２の成分の１つ以上の精製試料を、水性条件（例えば、Ｉ５３～５０Ａ／Ｂ二十面体ｐｂＶＬＰ）においてほぼ等モル比で混合する。第１及び第２の成分（多量体化ドメインを介して、及び任意選択でエクトドメインを介して）は、標的ｐｂＶＬＰの組織化を駆動するために互いに相互作用する。標的ｐｂＶＬＰの組織化の成功は、サイズ排除クロマトグラフィー、天然（非変性）ゲル電気泳動、動的光散乱、多角度光散乱、分析的超遠心分離、負染色電子顕微鏡法、冷凍電子顕微鏡法、又はＸ線結晶学を含むがこれらに限定されない、タンパク質又はタンパク質組織化体の物理的サイズを評価するために使用される一般的な生化学的又は生物物理的方法によってインビトロ組織化反応を分析することによって確認することができる。必要に応じて、組織化されたｐｂＶＬＰは、サイズ排除クロマトグラフィー、調製超遠心分離、接線流濾過、又は調製ゲル電気泳動を含むがこれらに限定されない、タンパク質をその物理サイズによって単離するために一般的に使用される調製技術を使用して、インビトロ組織化反応に存在する他の種又は分子から精製することができる。ｐｂＶＬＰ中の抗原タンパク質の存在は、限定されないが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析、タンパク質配列決定、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又はアミノ酸分析を含む水溶液中のタンパク質分子の同一性を決定するために一般的に使用される技法によって評価することができる。粒子の外側におけるタンパク質のアクセス可能性、並びにそのコンフォメーション又は抗原性は、モノクローナル抗体、コンフォメーション特異的モノクローナル抗体、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は抗原に特異的な抗血清による結合を含むがこれらに限定されない、抗原の存在及びコンフォメーションを検出するために一般的に使用される技術によって評価することができる。
【0172】
様々な実施形態では、本開示のｐｂＶＬＰは、遺伝子融合として異なる抗原タンパク質を有する２つ以上の異なるｃｏｍｐＡを含み、これらのｐｂＶＬＰは、同じｐｂＶＬＰ上で複数の異なるタンパク質を共発現する。これらの多抗原ｐｂＶＬＰは、多量体化ドメインを各々含む２つ以上の抗原の混合物を用いてインビトロ組織化を行うことによって産生される。混合物中の各抗原の画分は、得られるｐｂＶＬＰにおける各抗原タンパク質の平均価を決定する。所与の試料中の各抗原の存在及び平均価は、全価ｐｂＶＬＰ中の抗原性タンパク質の存在を評価するための上述の技術を使用した定量分析によって評価することができる。
【0173】
様々な実施形態では、ｐｂＶＬＰは、直径が約２０ナノメートル（ｎｍ）～約４０ｎｍであり、タンパク質シェルの内部管腔は、直径が約１５ｎｍ～約３２ｎｍであり、タンパク質シェルの孔径は、最長寸法が約１ｎｍ～約１４ｎｍである。
【0174】
いくつかの実施形態では、ｐｂＶＬＰは、二十面体対称性を有する。そのような実施形態では、ｐｂＶＬＰは、第１の成分の６０コピー及び第２の成分の６０コピーを含み得る。１つのそのような実施形態では、各第１の組織化体における同一のｃｏｍｐＡの数は、各第２の組織化体における同一のｃｏｍｐＡの数とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、ｐｂＶＬＰは、１２個の第１の組織化体及び２０個の第２の組織化体を含み、そのような実施形態では、各第１の組織化体は、例えば、同一の第１の成分の５つのコピーを含み得、各第２の組織化体は、例えば、同一の第２の成分の３つのコピーを含み得る。他の実施形態では、ｐｂＶＬＰは、１２個の第１の組織化体及び３０個の第２の組織化体を含み、そのような実施形態では、各第１の組織化体は、例えば、同一の第１の成分の５つのコピーを含み得、各第２の組織化体は、例えば、同一の第２の成分の２つのコピーを含み得る。更なる実施形態では、ｐｂＶＬＰは、２０個の第１の組織化体及び３０個の第２の組織化体を含み、この実施形態では、各第１の組織化体は、例えば、同一の第１の成分の３つのコピーを含み得、各第２の組織化体は、例えば、同一の第２の成分の２つのコピーを含み得る。これらの実施形態の全ては、規則的な二十面体対称性を有するタンパク質ベースのｐｂＶＬＰを形成することができる。
【0175】
様々な更なる実施形態では、第１及び第２の多量体化ドメインのオリゴマー状態は以下のとおりである。
Ｉ５３－３４Ａ：三量体＋Ｉ５３－３４Ｂ：五量体、
Ｉ５３－４０Ａ：五量体＋Ｉ５３－４０Ｂ：三量体、
Ｉ５３－４７Ａ：三量体＋Ｉ５３－４７Ｂ：五量体、
Ｉ５３－５０Ａ：三量体＋Ｉ５３－５０Ｂ：五量体、
Ｉ５３－５１Ａ：三量体＋Ｉ５３－５１Ｂ：五量体、
Ｉ３２－０６Ａ：二量体＋Ｉ３２－０６Ｂ：三量体、
Ｉ３２－１９Ａ：三量体＋Ｉ３２－１９Ｂ：二量体、
Ｉ３２－２８Ａ：三量体＋Ｉ３２－２８Ｂ：二量体、
Ｉ５２－０３Ａ：五量体＋Ｉ５２－０３Ｂ：二量体、
Ｉ５２－３２Ａ：二量体＋Ｉ５２－３２Ｂ：五量体、及び
Ｉ５２－３３Ａ：五量体＋Ｉ５２－３３Ｂ：二量体
Ｉ５３－３４Ａ：三量体＋Ｉ５３－３４Ｂ：五量体、
Ｉ５３－４０Ａ：五量体＋Ｉ５３－４０Ｂ：三量体、
Ｉ５３－４７Ａ：三量体＋Ｉ５３－４７Ｂ：五量体、
Ｉ５３－５０Ａ：三量体＋Ｉ５３－５０Ｂ：五量体、
Ｉ５３－５１Ａ：三量体＋Ｉ５３－５１Ｂ：五量体、
Ｉ３２－０６Ａ：二量体＋Ｉ３２－０６Ｂ：三量体、
Ｉ３２－１９Ａ：三量体＋Ｉ３２－１９Ｂ：二量体、
Ｉ３２－２８Ａ：三量体＋Ｉ３２－２８Ｂ：二量体、
Ｉ５２－０３Ａ：五量体＋Ｉ５２－０３Ｂ：二量体、
Ｉ５２－３２Ａ：二量体＋Ｉ５２－３２Ｂ：五量体、及び
Ｉ５２－３３Ａ：五量体＋Ｉ５２－３３Ｂ：二量体
【0176】
核酸
別の態様において、本開示は、本開示の抗原、第１の成分、及び／又は第２の成分をコードする単離された核酸を提供する。単離された核酸配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る。本明細書で使用される場合、「単離された核酸」は、ゲノム中又はｃＤＮＡ配列中のそれらの通常の周囲核酸配列から除去されたものである。かかる単離された核酸配列は、ポリＡ配列、修飾Ｋｏｚａｋ配列、及びエピトープタグをコードする配列、輸出シグナル、及び分泌シグナル、核局在化シグナル、及び形質膜局在化シグナルを含むがこれらに限定されない、コードされたタンパク質の発現及び／又は精製を促進するのに有用な追加の配列を含み得る。どの核酸配列が本開示のタンパク質をコードするかは、本明細書の教示に基づいて、当業者には明らかであろう。
別の態様において、本開示は、本開示の抗原、第１の成分、及び／又は第２の成分をコードする単離された核酸を提供する。単離された核酸配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る。本明細書で使用される場合、「単離された核酸」は、ゲノム中又はｃＤＮＡ配列中のそれらの通常の周囲核酸配列から除去されたものである。かかる単離された核酸配列は、ポリＡ配列、修飾Ｋｏｚａｋ配列、及びエピトープタグをコードする配列、輸出シグナル、及び分泌シグナル、核局在化シグナル、及び形質膜局在化シグナルを含むがこれらに限定されない、コードされたタンパク質の発現及び／又は精製を促進するのに有用な追加の配列を含み得る。どの核酸配列が本開示のタンパク質をコードするかは、本明細書の教示に基づいて、当業者には明らかであろう。
【0177】
更なる態様において、本開示は、任意の実施形態の単離された核酸又は好適な制御配列に作用可能に連結された本開示の実施形態の組み合わせを含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」は、核酸コード領域又は遺伝子を、遺伝子産物の発現をもたらすことができる任意の制御配列に作動的に連結するベクターを含む。本開示の核酸配列に作動可能に連結される「制御配列」は、核酸分子の発現をもたらすことができる核酸配列である。制御配列は、核酸配列の発現を指示するように機能する限り、核酸配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在する非翻訳でありながら転写された配列は、プロモーター配列と核酸配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」とみなすことができる。他のそのような制御配列には、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、及びリボソーム結合部位が含まれるが、これらに限定されない。そのような発現ベクターは、限定されないが、プラスミド及びウイルスベースの発現ベクターを含む、当該技術分野で既知の任意のタイプのものであり得る。哺乳動物系における開示される核酸配列の発現を駆動するために使用される制御配列は、構成的（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含むがこれらに限定されない様々なプロモーターのいずれかによって駆動される）又は誘導性（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含むがこれらに限定されないいくつかの誘導性プロモーターのいずれかによって駆動される）であり得る。原核細胞のトランスフェクションに使用するための発現ベクターの構築も当該技術分野で周知であり、したがって、標準的な技術を介して達成することができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９－１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、及びＡｍｂｉｏｎ １９９８ Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を参照されたい。発現ベクターは、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡへの組み込みのいずれかによって、宿主生物において複製可能でなければならない。好ましい実施形態では、発現ベクターは、プラスミドを含む。しかしながら、本開示は、ウイルスベクターなどの等価機能を果たす他の発現ベクターを含むことが意図される。
【0178】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される組換え発現ベクターでトランスフェクト又は形質導入された宿主細胞を提供し、宿主細胞は、原核又は真核のいずれかであり得る。細胞は、一時的又は安定的にトランスフェクト又は形質導入され得る。そのような発現ベクターの原核細胞及び真核細胞へのトランスフェクション又は形質導入は、限定されないが、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、又はリポソーム媒介性、ＤＥＡＥデキストラン媒介性、ポリカチオン媒介性、又はウイルス媒介性トランスフェクションを含む当該分野技術で既知のいずれかの技術によって達成することができる。（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
【0179】
別の態様において、本開示は、本開示に従って抗原、成分、又はｐｂＶＬＰを産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ポリペプチドの発現に有利な条件下で、本開示のこの態様による宿主を培養するステップと、（ｂ）任意選択で、発現したポリペプチドを回収するステップと、を含む。
【0180】
いくつかの実施形態では、本開示は、ワクチンを製造する方法であって、宿主細胞が抗原を培地中に分泌するように、本開示の抗原をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培地中で培養することと、任意選択で、抗原を培地から精製することと、抗原を第２の成分と混合することであって、第２の成分が抗原と多量体化して、ｐｂＶＬＰを形成することと、任意選択で、ｐｂＶＬＰを精製することと、を含む、方法を提供する。
【0181】
いくつかの実施形態では、本開示は、ワクチンを製造する方法であって、宿主細胞が第１の成分及び第２の成分を培地に分泌するように、本開示のいずれか１つのｐｂＶＬＰの両方の成分をコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、任意選択で、ｐｂＶＬＰを培地から精製することと、を含む方法を提供する。
【0182】
例示的な宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、２９３及び２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｓｆ９細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びに組換えタンパク質の産生に使用される任意の他の細胞株が挙げられる。
【0183】
製剤
いくつかの実施形態では、組成物中の緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、又は酢酸緩衝液である。組成物はまた、リオ保護剤、例えば、スクロース、ソルビトール、又はトレハロースを含み得る。特定の実施形態では、組成物は、保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、及びこれらの様々な混合物を含む。他の実施形態では、組成物は、グリシンのような増量剤を含む。更に他の実施形態では、組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエスト、又はそれらの組み合わせを含む。組成物はまた、等張化調整剤、例えば、製剤をヒト血液と実質的に等張性又は等浸透性にする化合物を含み得る。例示的な等張化調整剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、及びアルギニン塩酸塩が挙げられる。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥又は液体形態で、安定剤、例えば、ｐｂＶＬＰの化学的及び／又は物理的不安定性を実質的に防止又は低減する分子を更に含む。例示的な安定剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、及びアルギニン塩酸塩が挙げられる。
いくつかの実施形態では、組成物中の緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、又は酢酸緩衝液である。組成物はまた、リオ保護剤、例えば、スクロース、ソルビトール、又はトレハロースを含み得る。特定の実施形態では、組成物は、保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、及びこれらの様々な混合物を含む。他の実施形態では、組成物は、グリシンのような増量剤を含む。更に他の実施形態では、組成物は、界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエスト、又はそれらの組み合わせを含む。組成物はまた、等張化調整剤、例えば、製剤をヒト血液と実質的に等張性又は等浸透性にする化合物を含み得る。例示的な等張化調整剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、及びアルギニン塩酸塩が挙げられる。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥又は液体形態で、安定剤、例えば、ｐｂＶＬＰの化学的及び／又は物理的不安定性を実質的に防止又は低減する分子を更に含む。例示的な安定剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、及びアルギニン塩酸塩が挙げられる。
【0184】
使用の方法
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患又は障害の治療又は予防を必要とする対象において疾患又は障害を治療又は予防するための方法であって、本明細書に記載の方法に従って調製されたナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、免疫応答を必要とする対象において免疫応答を誘導、促進、又は増加させるための方法であって、記載の方法に従って調製されたナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、１つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原は、ナノ構造の表面上に表示される。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、外側に結合される及び／又はケージ内に封入される１つ以上の免疫刺激分子を含む。本明細書で使用される場合、免疫刺激分子は、単独で又は別の薬剤（例えば、抗原）と組み合わせて投与される対象における免疫応答を刺激する（既存の免疫応答を増強することを含む）化合物である。例示的な免疫刺激分子には、ＴＬＲリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患又は障害の治療又は予防を必要とする対象において疾患又は障害を治療又は予防するための方法であって、本明細書に記載の方法に従って調製されたナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、免疫応答を必要とする対象において免疫応答を誘導、促進、又は増加させるための方法であって、記載の方法に従って調製されたナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、１つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原は、ナノ構造の表面上に表示される。いくつかの実施形態では、ナノ構造は、外側に結合される及び／又はケージ内に封入される１つ以上の免疫刺激分子を含む。本明細書で使用される場合、免疫刺激分子は、単独で又は別の薬剤（例えば、抗原）と組み合わせて投与される対象における免疫応答を刺激する（既存の免疫応答を増強することを含む）化合物である。例示的な免疫刺激分子には、ＴＬＲリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
【0185】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫原性組成物又はワクチンとして、本明細書に記載の方法に従って調製されたナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を投与することを含む、免疫応答を必要とする対象において免疫応答を誘導する、促進する、又は増加させるための方法を提供する。宿主への導入時に、免疫原性組成物又はワクチンは、免疫応答を誘発する。「免疫応答」は、先天性又は適応型免疫の活性化又は効率を誘導する、増加させる、又は持続させる応答を指す。いくつかの実施形態では、免疫応答は、抗体及び／又はサイトカインの産生を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、及び／又は他の細胞応答の活性化を含む。
【0186】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫原性組成物又はワクチンとして、本明細書に記載の方法に従って調製されるナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を投与することを含む、抗体応答を必要とする対象において抗体応答を誘導する、促進する、又は増加させるための方法を提供し、ナノ構造は１つ以上の抗原を表示し、抗体応答は１つ以上の抗原上に存在するエピトープを対象とする。対象における抗体応答を分析するための方法は、当業者に既知である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫応答の増加をＥＬＩＳＡによって測定して、抗原特異的抗体力価を決定する。
【0187】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫原性組成物又はワクチンとして、本明細書に記載の方法に従って調製されたナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を免疫化対象において投与することを含む、改善されたＢ記憶細胞応答を含む免疫応答を必要とする対象において、免疫応答を誘導する、促進する、又は増加させるための方法を提供する。改善されたＢ記憶細胞応答は、インビトロ分化の刺激によって測定されるように、抗原遭遇時に抗体分泌形質細胞への分化が可能な末梢血Ｂ細胞の増加した頻度を意味することが意図される。いくつかの実施形態では、本開示は、抗体分泌Ｂ細胞の数を増加させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体分泌Ｂ細胞は、骨髄形質細胞又は出芽Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞を分泌する抗体を測定するための方法は、限定されないが、免疫後の様々な時点で収集された形質細胞又は出芽中心Ｂ細胞の抗原特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びフローサイトメトリーを含む。
【0188】
いくつかの実施形態では、ナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）は、予防免疫原性組成物又はワクチンの一部として投与され、免疫原性組成物又はワクチンは、その後の感染性薬剤への曝露に対する対象において耐性を付与する。いくつかの実施形態では、ナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）は、治療用免疫原性組成物又はワクチンの一部として投与され、免疫原性組成物又はワクチンは、既存の抗原に対する対象の免疫応答を開始又は増強する。いくつかの実施形態では、既存の抗原は、感染性薬剤又は新生物に感染した対象におけるウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、既存の抗原は、腫瘍又は悪性腫瘍を有する対象におけるがん抗原である。予防的又は治療的免疫応答の所望の転帰は、当該技術分野で周知の原理に従って、治療される疾患又は状態に依存する。例えば、いくつかの実施形態では、感染性因子に対する免疫応答は、感染性因子のコロニー形成及び複製を完全に防止し得る。いくつかの実施形態では、感染性因子に対するワクチンは、それが症状の数、重症度、又は期間を減少させる場合、それが症状を有する集団における個体の数を減少させる場合、又は感染性因子の伝播を減少させる場合、有効であるとみなされる。いくつかの実施形態では、がん、アレルゲン、又は感染性因子に対する免疫応答は、疾患を完全に治療する、症状を緩和する、又は疾患に対する全体的な治療的介入に寄与するために有効である。
【0189】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫原性組成物又はワクチンとして、本明細書に記載の方法に従って調製されたナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を投与することを含む、急性又は慢性感染症の治療又は予防を必要とする対象において急性又は慢性の感染症を治療又は予防するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）は１つ以上の感染性抗原を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の感染症抗原は、微生物抗原である。微生物抗原は、微生物種、例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、又はマイコバクテリウムに由来する抗原である。いくつかの実施形態では、本開示は、免疫原性組成物又はワクチンとして、本明細書に記載の方法に従って調製されるナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を投与することを含む、ウイルス感染を必要とする対象においてウイルス感染を治療又は予防するための方法を提供し、ナノ構造は、ウイルスに由来する１つ以上の感染性抗原を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、免疫不全（例えば、ＨＩＶ、乳頭腫（例えば、ＨＰＶ）、ヘルペス（例えば、ＨＳＶ）、脳炎、インフルエンザ（例えば、ヒトインフルエンザウイルスＡ）、ＣＯＶＩＤ－１９（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、及び一般的な風邪（例えば、ヒトライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）である。いくつかの実施形態では、本開示は、ウイルス感染を必要とする対象においてウイルス感染を低減するための方法であって、本明細書に記載の方法に従って調製されたナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0190】
いくつかの実施形態では、本開示は、異常なアポトーシス、分化プロセス（例えば、細胞増殖性障害、例えば、過剰増殖性障害）、又は細胞分化障害（例えば、がん）に関連する障害を治療又は予防するための方法を提供する。細胞増殖性及び／又は分化性障害の例としては、がん（例えば、がん腫、がん腫、転移性障害、又は造血腫瘍性障害）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って調製されるナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を含む免疫原性組成物又はワクチンは、がんを有する対象に投与される。「がん」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ組織、胃腸臓器、及び泌尿生殖管に影響を及ぼすものを含む、様々な臓器系の悪性腫瘍、並びに一般に、ほとんどの結腸がん、腎細胞がん、前立腺がん、及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞がん、小腸がん、及び食道がんなどの悪性腫瘍を含むと考えられる腺がんを指す。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物又はワクチンは、任意の種類のがんを発症している、発症している疑いがある、又は発症するリスクが高い可能性がある対象を治療するために使用される。
【0191】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って調製されたナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を含む、免疫原性組成物又はワクチンを投与することを含む、がんを有する対象において抗腫瘍免疫応答を誘導するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ構造は１つ以上の抗原を含み、抗原はがん抗原である。がん抗原は、好ましくは、がん細胞上に発現され（すなわち、がん細胞において、非がん細胞上よりも高いレベルで発現される）、いくつかの場合において、がん細胞によって単独で発現される抗原である。がん抗原は、がん細胞内又はがん細胞の表面上で発現され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のがん抗原を含むナノ構造（例えば、ｐｂＶＬＰ）を含む免疫原性組成物又はワクチンを投与することは、抗腫瘍免疫応答を誘導し、それによって対象におけるがんを予防又は治療する。
【実施例】
【0192】
実施例１：ＣｏｍｐＢ－０１の産生のためのＥ．ｃｏｌｉ株の開発
この実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉの不溶性画分からのｃｏｍｐＢ－０１の発現を実証する。Ｂ及びＫ－１２Ｅ．ｃｏｌｉ宿主背景の両方において、一組の組み合わせ株を評価した。２つの異なるプロモーター、Ｔ７及びｐｈｏＡを使用して、異なる発現動態を評価した。最適化されたＤＮＡコード配列を使用して、合計１０個のプラスミドを適切な宿主に形質転換して、２７種の独自の株を作製した（表３）。発現評価を、２４ウェルディッシュを使用して、３ｍＬの総体積で行った。可溶性及び不溶性の画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによりアッセイした。９つの株は、主に細胞の不溶性画分において、いくつかの検出可能な産物を得た。４つの株が、参照基準よりも高い分子量で移動する産物を得た。８つの株をシェイクフラスコ中で再評価し、発現をヌル宿主と比較した。エドマン分解は、正しく処理されたＮ末端が、細胞質内の封入体としてｃｏｍｐＢ－０１を発現するＩＣＸＢ０１、ＩＣＸＢ１０、及びＩＸＣＢ１１に存在することを確認した。これらの３つを、４×５Ｌ発酵におけるプラットフォーム、飼料バッチ発酵プロセスにおける評価のために選択した。非最適化プロセスにおけるＩＣＸＢ１０及びＩＣＸＢ１１のバイオマス収率は、１７０～１９０ｇ／Ｌ湿潤細胞重量（ＷＣＷ）及び約１ｇ／Ｌ不溶性ｃｏｍｐＢ－０１であった。ＩＣＸＢ１０由来の材料を精製し、ＱＣを試験し、ナノ粒子組織化体について評価した。
この実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉの不溶性画分からのｃｏｍｐＢ－０１の発現を実証する。Ｂ及びＫ－１２Ｅ．ｃｏｌｉ宿主背景の両方において、一組の組み合わせ株を評価した。２つの異なるプロモーター、Ｔ７及びｐｈｏＡを使用して、異なる発現動態を評価した。最適化されたＤＮＡコード配列を使用して、合計１０個のプラスミドを適切な宿主に形質転換して、２７種の独自の株を作製した（表３）。発現評価を、２４ウェルディッシュを使用して、３ｍＬの総体積で行った。可溶性及び不溶性の画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによりアッセイした。９つの株は、主に細胞の不溶性画分において、いくつかの検出可能な産物を得た。４つの株が、参照基準よりも高い分子量で移動する産物を得た。８つの株をシェイクフラスコ中で再評価し、発現をヌル宿主と比較した。エドマン分解は、正しく処理されたＮ末端が、細胞質内の封入体としてｃｏｍｐＢ－０１を発現するＩＣＸＢ０１、ＩＣＸＢ１０、及びＩＸＣＢ１１に存在することを確認した。これらの３つを、４×５Ｌ発酵におけるプラットフォーム、飼料バッチ発酵プロセスにおける評価のために選択した。非最適化プロセスにおけるＩＣＸＢ１０及びＩＣＸＢ１１のバイオマス収率は、１７０～１９０ｇ／Ｌ湿潤細胞重量（ＷＣＷ）及び約１ｇ／Ｌ不溶性ｃｏｍｐＢ－０１であった。ＩＣＸＢ１０由来の材料を精製し、ＱＣを試験し、ナノ粒子組織化体について評価した。
【0193】
ｃｏｍｐＢ－０１の全配列は、配列番号６０である。
ＭＮＱＨＳＨＫＤＨＥＴＶＲＩＡＶＶＲＡＲＷＨＡＥＩＶＤＡＣＶＳＡＦＥＡＡＭＲＤＩＧＧＤＲＦＡＶＤＶＦＤＶＰＧＡＹＥＩＰＬＨＡＲＴＬＡＥＴＧＲＹＧＡＶＬＧＴＡＦＶＶＮＧＧＩＹＲＨＥＦＶＡＳＡＶＩＮＧＭＭＮＶＱＬＮＴＧＶＰＶＬＳＡＶＬＴＰＨＮＹＤＫＳＫＡＨＴＬＬＦＬＡＬＦＡＶＫＧＭＥＡＡＲＡＣＶＥＩＬＡＡＲＥＫＩＡＡ
ＭＮＱＨＳＨＫＤＨＥＴＶＲＩＡＶＶＲＡＲＷＨＡＥＩＶＤＡＣＶＳＡＦＥＡＡＭＲＤＩＧＧＤＲＦＡＶＤＶＦＤＶＰＧＡＹＥＩＰＬＨＡＲＴＬＡＥＴＧＲＹＧＡＶＬＧＴＡＦＶＶＮＧＧＩＹＲＨＥＦＶＡＳＡＶＩＮＧＭＭＮＶＱＬＮＴＧＶＰＶＬＳＡＶＬＴＰＨＮＹＤＫＳＫＡＨＴＬＬＦＬＡＬＦＡＶＫＧＭＥＡＡＲＡＣＶＥＩＬＡＡＲＥＫＩＡＡ
【0194】
試験された構築物の完全なリストは、表３に提供される。
表３
表３
【表3-1】
【表3-2】
【0195】
特に明記しない限り、全てのインキュベーションを３０℃で行った。全てのブロス培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍ、１インチの軌道で振盪しながらインキュベートした。２±０．５時間インキュベーションした後、Ｔ７培養物を、３μＬの１Ｍ ＩＰＴＧを各ウェルに添加することによって誘導した。培養物は時間に基づいて誘導したが、誘導時の予想ＯＤ６００は０．６～０．９であった。ＩＰＴＧを添加した後、培養物を更に４±０．５時間インキュベートした。採取時に、各ウェルの最終的なＯＤ６００を記録した。発現培地が、完全に抑制されたアルカリホスファターゼ（Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ）であったことを除いて、ＰｈｏＡ株をＴ７株と同様に調製した。ＰｈｏＡ株を２４±１時間インキュベートした。
【0196】
その後の飼料バッチ発酵スクリーニングを、表４に提供される発酵構成を使用して、１％（ｖ／ｖ）で発酵槽に播種し、バッチ培地中のグリセロールが枯渇するまで８～１２時間操作せずに培養物を増殖させることによって行い、次いで溶解酸素（ＤＯ）が急激に増加した（「スパイク」）。ＤＯスパイクの観察後、飼料の添加を開始した。飼料計画は、指数関数的に増加するように設計された。
表４．発酵構成
表４．発酵構成
【表4】
【0197】
ピークの供給速度の時間前後に、リン酸塩は、ｐｈｏＡプロモーターを自動的に誘導するｐｈｏＡプロセスにおいて制限されるようになる。したがって、ｐｈｏＡプロセス誘導時間は、バッチ培地中に補充された全リン酸塩によって制御された。供給速度は、あらかじめプログラムされたスケジュールに従って３０％低下し、発酵の残りの期間にわたって一定の速度を維持するように予定された。
【0198】
各サンプリング時間に、２つの１．０ｍＬの全ブロス試料を収集し、１０分間遠心分離した。上清を別のチューブセットに移し、必要に応じて代謝産物濃度を決定した。ペレットを秤量して、湿潤細胞重量（ＷＣＷ）を得、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために凍結保管した。全てのＷＣＷデータは、少なくとも２つの１．０ｍＬの試料の平均として報告される。採取物からの材料も、エドマン分解及びｃｏｍｐＡ－０１による粒子組織化によってＮ末端配列について評価した。
【0199】
ｃｏｍｐＡ－０１の全配列は、配列番号６１である。
ＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥＬＥ
ＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥＬＥ
【0200】
発酵槽は、ＩＰＴＧ添加（Ｔ７）後１２時間、又は接種（ｐｈｏＡ）後４８時間採取されるように設定した。各発酵槽をバケツ遠心分離によって採取した。
【0201】
結果
全てのプラスミドを、指定された宿主に正常に形質転換した。産物バンドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、主に不溶性画分中で観察されたが、ＩＣＸＢ１０の可溶性画分中にも存在した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上の参照基準物質のおおよそのサイズで、単一のバンドとして移行した推定産物を産生した株を、更なる処理のために選択した。不溶性画分からのＩＣＸＢ０１、ＩＣＸＢ１０、ＩＣＸＢ１１、及びＩＣＸＢ１５の主要なバンドを、ポンソーＳで染色したＰＶＤＦ電気転写物から切断した。各々のＮ末端をエドマン分解によって解析し、ＩＣＸＢ０１、１ＣＸＢ１０、及びＩＣＸＢ１１について正しいことが分かった。ＰｈｏＡリーダーペプチドは、ＩＣＸＢ１５にまだ存在していたため、将来の作業に使用されなかった。一次スクリーニングからの全てのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを図２に提示する。いずれの株においても、成長不良又は遺伝的不安定性の目に見える兆候はなかった。成長及び発現結果を表５に要約する。
表５
ｂ発現に与えられた数値は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上の産物バンドの輝度及びゲル荷重に基づく任意の値である。
全てのプラスミドを、指定された宿主に正常に形質転換した。産物バンドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、主に不溶性画分中で観察されたが、ＩＣＸＢ１０の可溶性画分中にも存在した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上の参照基準物質のおおよそのサイズで、単一のバンドとして移行した推定産物を産生した株を、更なる処理のために選択した。不溶性画分からのＩＣＸＢ０１、ＩＣＸＢ１０、ＩＣＸＢ１１、及びＩＣＸＢ１５の主要なバンドを、ポンソーＳで染色したＰＶＤＦ電気転写物から切断した。各々のＮ末端をエドマン分解によって解析し、ＩＣＸＢ０１、１ＣＸＢ１０、及びＩＣＸＢ１１について正しいことが分かった。ＰｈｏＡリーダーペプチドは、ＩＣＸＢ１５にまだ存在していたため、将来の作業に使用されなかった。一次スクリーニングからの全てのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを図２に提示する。いずれの株においても、成長不良又は遺伝的不安定性の目に見える兆候はなかった。成長及び発現結果を表５に要約する。
表５
【表5】
【0202】
成長曲線、発現、及びＮ末端配列データ（表６）に基づいて、株ＩＣＸＢ０１、ＩＣＸＢ１０、及びＩＣＸＢ１１を発酵スクリーニングのために選択した。
表６．Ｎ末端配列データ概要：二次スクリーニング培養物
表６．Ｎ末端配列データ概要：二次スクリーニング培養物
【表6】
【0203】
４つの５Ｌ発酵槽を使用して、３つの株（ＩＣＸＢ０１、ＩＣＸＢ１０、及びＩＣＸＢ１１）の発現を評価した。実験的設計については、表７を参照されたい。オンラインプロファイルによると、ｐＨ、温度、又はガス流において有意な逸脱が発生しなかったことが示されている。各発酵槽のＤＯスパイクで供給送達を成功裏に開始し、実行全体を通して合理的に安定したＤＯプロファイルを維持した。ＤＯにおける周期的なスパイクは、消泡添加に対応する。発酵槽Ａ及びＢの両方で代謝にダウンシフトがあり、これは誘導期間が少し長かったことを示す。採取基準及び誘導動態は、プロセス開発中に最適化されるパラメータである。発酵槽結果の概要を表８に示す。
表７．発酵スクリーニング設計
表８．発酵データ要約
表７．発酵スクリーニング設計
【表7】
【表8】
【0204】
結論として、３つのＥ．ｃｏｌｉ株、ＩＣＸＢ０１、ＩＣＸＢ１０、及びＩＣＸＢ１１は、小規模培養物において細胞質内でかなり高いレベルの不溶性ｃｏｍｐＢ－０１を産生した。ＩＣＸＢ１０及びＩＣＸＢ１１は、初期の最適化されていない５Ｌの飼料バッチ発酵において、かなりの量の材料を産生した。ＩＣＸＢ１０及びＩＣＸＢ１１株における細胞質中のｃｏｍｐＢ－０１の発現は、培地中の無機リン酸塩レベルが枯渇すると発現を誘導するｐｈｏＡプロモーターによって制御される。ＩＣＸＢ１０及びＩＣＸＢ１１は、組織化能のある産物に加工することができる正しいＮ末端を有するｃｏｍｐＢ－０１の封入体を産生した。
【0205】
参考文献
以下の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
以下の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【0206】
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【0209】
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【0210】
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【0212】
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【0220】
実施例２：封入体抽出
本実施例は、実施例１に開示される方法によって産生された封入体からのｃｏｍｐＢ－０１の回収を実証する。具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ産生培養物の採取後、細胞ペーストを均質化溶液（８．４ｍＭリン酸ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に再懸濁させる。均質化後、封入体を表９に示すように４つの溶液で洗浄する。
表９．封入体洗浄液
本実施例は、実施例１に開示される方法によって産生された封入体からのｃｏｍｐＢ－０１の回収を実証する。具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ産生培養物の採取後、細胞ペーストを均質化溶液（８．４ｍＭリン酸ナトリウム、１．５ｍＭリン酸カリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に再懸濁させる。均質化後、封入体を表９に示すように４つの溶液で洗浄する。
表９．封入体洗浄液
【表9】
【0221】
１００ｇの洗浄した封入体（ＷＩＢ）を、２５ｍＬ／ｇ ＷＩＢのＴｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ中０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ｐＨ７．４）中のポリトロンで再懸濁し、室温で２時間攪拌した。試料を４℃で３０分間１１，０００ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、ペレット化ＷＩＢを、５０ｍＬ／ｇ ＷＩＢの抽出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５Ｍ尿素、０．７５％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．４）中のポリトロンで再懸濁した。抽出物を周囲温度で２時間混合しながらインキュベートした。試料を１１，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離し、上清を０．２２μｍフィルターを使用して濾過した。
【0222】
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
濾過した上清をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに充填した。以下のプロセスパラメータに従って、ステップ勾配を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。代表的なクロマトグラムを図３に示す。
濾過した上清をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに充填した。以下のプロセスパラメータに従って、ステップ勾配を使用して陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。代表的なクロマトグラムを図３に示す。
【表10-1】
【表10-2】
【0223】
２カラム体積（ＣＶ）のピーク上昇から２５％での溶出（Ｆ１）を、精製の次のステップのために収集した。
【0224】
ＣＨＴクロマトグラフィー
収集した試料をＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトＩ型培地カラムに充填した。以下のプロセスパラメータに従って、混合モードクロマトグラフィーを行った。代表的なクロマトグラムを図４に示す。
収集した試料をＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトＩ型培地カラムに充填した。以下のプロセスパラメータに従って、混合モードクロマトグラフィーを行った。代表的なクロマトグラムを図４に示す。
【表11-1】
【表11-2】
【0225】
溶出液回収を、ピークの下降側のピーク最大値の３０％まで上昇した溶出ピークから開始した。
【0226】
限外濾過／透析濾過
限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）製剤をＣＨＴ溶出液（２９５８．４ｍｇ）上で実行した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｍｉｎｉ Ｃａｓｓｅｔｔｅ，Ｂｉｏｍａｘ １０ｋＤａ（カタログ番号：Ｐ２Ｂ０１０Ａ０１、０．１ｍ２）を使用した。ＣＨＴ溶出液を約４ｍｇ／ｍＬ（試料体積約７００ｍＬ）に濃縮し、５００ｍＬ／分の供給ポンプ流量を使用して８ＤＶ（５６００ｍＬ）にわたって製剤緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して透析濾過した。ＵＦＤＦ産物を０．２２μｍ濾過し、濃度を２．５５ｍｇ／ｍＬに調整し、総体積を１０５１ｍＬ、最終タンパク質収率＝２６８０ｍｇとした。アリコートを－８０℃で保管した。
限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）製剤をＣＨＴ溶出液（２９５８．４ｍｇ）上で実行した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｍｉｎｉ Ｃａｓｓｅｔｔｅ，Ｂｉｏｍａｘ １０ｋＤａ（カタログ番号：Ｐ２Ｂ０１０Ａ０１、０．１ｍ２）を使用した。ＣＨＴ溶出液を約４ｍｇ／ｍＬ（試料体積約７００ｍＬ）に濃縮し、５００ｍＬ／分の供給ポンプ流量を使用して８ＤＶ（５６００ｍＬ）にわたって製剤緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して透析濾過した。ＵＦＤＦ産物を０．２２μｍ濾過し、濃度を２．５５ｍｇ／ｍＬに調整し、総体積を１０５１ｍＬ、最終タンパク質収率＝２６８０ｍｇとした。アリコートを－８０℃で保管した。
【0227】
エンドトキシン試験は、次の表に示すように、産物が所望の基準を満たしていることを実証した。
【表12】
【0228】
結論として、約１．３５ｇの最終Ｃｏｍｐ－Ｂ産物は、１Ｌの細胞液から得ることができる。最終製剤を、製剤結果に基づいて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に変更した。ＣＨＴカラム溶出収集カットオフは、溶出ピークの下降側でピーク最大値の３０％であることが決定された。ステップ収率は７７％であった。エンドトキシンレベルは４倍低下した。最終的なＵＦＤＦは、エンドトキシンレベルを低下させる。全体的なプロセス収率を次の表に要約する。
収率概要
収率概要
【表13】
【0229】
実施例３：封入体抽出
本実施例は、実施例２に記載される封入体抽出方法の更なる精製を実証する。代替洗剤を含む、不溶性ペレット洗浄のためのいくつかの選択肢を検討した。Ｉ５３－５０Ｂ細胞ペレットを１０ｍＬ／ｇ湿潤細胞重量でＰＢＳ中に再懸濁し、ＩＫＡ Ｕｌｔｒａ－ＴｕｒｒａｘＴ２５ホモジナイザーを４０００ｒｐｍで使用して１分間均質化した。再懸濁細胞を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ１１０Ｐマイクロフルイダイザーを使用して、２～８℃、１８０００ｐｓｉで３回の別々の経路で溶解した。溶解物を清浄な容器に収集し、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに分け、４℃で３０分間、２４０００ｇで遠心分離することによって明らかにした。可溶性画分を新しい容器に除去した。最初の実験は、溶解物のアリコート及び尿素モル濃度を増加させた等量のＰＢＳを２時間使用して、５０ｍＭから開始し、８Ｍまで増加させて、どの尿素の濃度でｃｏｍｐＢタンパク質が可溶化したかを決定した。その結果を図５に示す。ｃｏｍｐＢタンパク質は５０ｍＭ尿素で抽出を開始したため、低濃度のカオトロープを洗浄ステップとして追求しなかった。
本実施例は、実施例２に記載される封入体抽出方法の更なる精製を実証する。代替洗剤を含む、不溶性ペレット洗浄のためのいくつかの選択肢を検討した。Ｉ５３－５０Ｂ細胞ペレットを１０ｍＬ／ｇ湿潤細胞重量でＰＢＳ中に再懸濁し、ＩＫＡ Ｕｌｔｒａ－ＴｕｒｒａｘＴ２５ホモジナイザーを４０００ｒｐｍで使用して１分間均質化した。再懸濁細胞を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ１１０Ｐマイクロフルイダイザーを使用して、２～８℃、１８０００ｐｓｉで３回の別々の経路で溶解した。溶解物を清浄な容器に収集し、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに分け、４℃で３０分間、２４０００ｇで遠心分離することによって明らかにした。可溶性画分を新しい容器に除去した。最初の実験は、溶解物のアリコート及び尿素モル濃度を増加させた等量のＰＢＳを２時間使用して、５０ｍＭから開始し、８Ｍまで増加させて、どの尿素の濃度でｃｏｍｐＢタンパク質が可溶化したかを決定した。その結果を図５に示す。ｃｏｍｐＢタンパク質は５０ｍＭ尿素で抽出を開始したため、低濃度のカオトロープを洗浄ステップとして追求しなかった。
【0230】
その後の実験は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度及びエンドトキシンクリアランスを主な読み出しとして、代替の洗剤であるＴｒｉｔｏｎＸ－１００、高塩、及び３０％イソプロパノールを調べた。その結果を図６に示す。対照試料は、洗浄ステップを有さなかったが、ＰＢＳ ２Ｍ尿素０．７５％（ｗ／ｖ）Ｃｈａｐｓ ｐＨ７．４を使用して直接抽出に進んだ。被験試料を、以下の洗浄緩衝液のうちの１つで、全てＰＢＳ背景で洗浄した。
ａ．３０％イソプロパノール、
ｂ．０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、
ｃ．０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、
ｄ．１Ｍ ＮａＣｌ、及び
ｅ．１Ｍ ＮａＣｌ ３０％イソプロパノール。
ａ．３０％イソプロパノール、
ｂ．０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、
ｃ．０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、
ｄ．１Ｍ ＮａＣｌ、及び
ｅ．１Ｍ ＮａＣｌ ３０％イソプロパノール。
【0231】
イソプロパノールは溶解度に悪影響を及ぼすようであり、抽出画分中のｃｏｍｐＢは少なかった。１Ｍ ＮａＣｌは、宿主細胞タンパク質を除去するように見えるが、エンドトキシンクリアランスには影響しない。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００は、最良のクリアランスファクターを示した。続いて、２つの洗浄ステップを実施し、洗浄１はＰＢＳ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００であり、洗浄２は２０ｍＭ ＮａＰＯ４ １Ｍ ＮａＣｌである。結果を以下の表に要約する。
【表14】
【0232】
その後、発酵を３０℃で４つの５リットル発酵槽にスケールアップした。発酵槽Ｂ（６９６．１ｇ）及び発酵槽Ｃ（５５３．９ｇ）から１．２５ｋｇの細胞ペーストを再懸濁し、溶解し、洗浄して、初期重量の２９％に相当する３６６．５ｇの洗浄されたＩＢを回収した。封入体を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中の２５ｍＬ／ｇの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中に再懸濁し、室温で２時間攪拌した。１１，０００ｇでの遠心分離によって封入体を回収した。次いで、洗浄した封入体を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ、０．５Ｍ 尿素、０．７５％のＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．４で抽出した。上清を１１，０００ｇでの遠心分離によって澄ませ、更に精製した。
【0233】
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦクロマトグラフィー
ＴｒｉｔｏｎＸ－１００とＣＨＡＰＳとの組み合わせを試験した。１０ｃｍのベッド高ＤＥＡＥカラムを２０ｍＭ ＮａＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で平衡化し、異なるカラム洗浄緩衝液で洗浄した。
ａ．２０ｍＭ ＮａＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ ｐＨ７．４、
ｂ．２０ｍＭ ＮａＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．７５％ Ｃｈａｐｓ ｐＨ７．４、又は
ｃ．順番に両方。
ＴｒｉｔｏｎＸ－１００とＣＨＡＰＳとの組み合わせを試験した。１０ｃｍのベッド高ＤＥＡＥカラムを２０ｍＭ ＮａＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で平衡化し、異なるカラム洗浄緩衝液で洗浄した。
ａ．２０ｍＭ ＮａＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ ｐＨ７．４、
ｂ．２０ｍＭ ＮａＰＯ４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．７５％ Ｃｈａｐｓ ｐＨ７．４、又は
ｃ．順番に両方。
【0234】
溶出を２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ５００ｍＭ ＮａＣｌの５ＣＶで達成し、次いでカラムを２０ｍＭ ＮａＰＯ４ １Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４の５ＣＶ各々で剥離し、０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒した。
【0235】
非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定される溶出の純度は、３つの選択肢の間で同等であったが、２つの洗剤の組み合わせでは、エンドトキシン除去が明らかに最も効率的であった。
【表15】
【0236】
組織化能
インビトロで混合したときに、精製されたＩ５３－５０Ｂが、Ｉ５３－５０Ａとともに、設計された二十面体アーキテクチャに組織化される能力を、精製された成分を１：１のモル比で穏やかに混合することによって分析した。次いで、混合物を、移動相として２０ｍＭ ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４を使用して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬゲル濾過カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。代表的なクロマトグラムを図７に示す。組織化混合物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図８に示す。単分散ナノ粒子は、約１１．３分、Ｉ５３～５０Ａ単独では１７．２分の保持時間を有する。
インビトロで混合したときに、精製されたＩ５３－５０Ｂが、Ｉ５３－５０Ａとともに、設計された二十面体アーキテクチャに組織化される能力を、精製された成分を１：１のモル比で穏やかに混合することによって分析した。次いで、混合物を、移動相として２０ｍＭ ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４を使用して、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬゲル濾過カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。代表的なクロマトグラムを図７に示す。組織化混合物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図８に示す。単分散ナノ粒子は、約１１．３分、Ｉ５３～５０Ａ単独では１７．２分の保持時間を有する。
【0237】
結論として、精製されたＩ５３－５０Ｂは、組織化能があり、かつ凝集されない。図９に示す精製プロセスフローは、純粋な組織化能を有するＩ５３－５０Ｂを産生した。
【0238】
実施例４：成分Ｂの製造及び精製のスケールアップ
ｃｏｍｐＢ－０１（Ｉ５３－５０Ｂ配列）の製造のために、バイオリアクター製造及び採取、不溶性画分からの可溶性五量体の抽出、並びに最終製剤のための２段階のクロマトグラフィー法、続いてＵＦ／ＤＦを使用した下流処理を含む単位操作のためのスケーラブルなプロセスを開発した。ｃｏｍｐＢ－０１原薬中間体製造プロセスの概要フロー図を図１１に提供する。
ｃｏｍｐＢ－０１（Ｉ５３－５０Ｂ配列）の製造のために、バイオリアクター製造及び採取、不溶性画分からの可溶性五量体の抽出、並びに最終製剤のための２段階のクロマトグラフィー法、続いてＵＦ／ＤＦを使用した下流処理を含む単位操作のためのスケーラブルなプロセスを開発した。ｃｏｍｐＢ－０１原薬中間体製造プロセスの概要フロー図を図１１に提供する。
【0239】
小規模での初期の概念実証のために、ｃｏｍｐＢ－０１製造プロセスを２×２．５Ｌバイオリアクタースケールで実行し、２．６ｇの最終的な原薬中間体（ｃｏｍｐＢ ＤｅｍｏロットＡ；０６１８－６０）を得た。ｃｏｍｐＢ－０１のスケールアップされた現在の良好な製造プロトコル（ｃＧＭＰ）製造を、２００Ｌのバイオリアクタースケールで実行し、得られたバイオリアクター採取細胞ペーストの約１０％を後続の下流処理に使用し、１９．０ｇの最終的な原薬中間体（ｃｏｍｐＢ－０１ ＧＭＰロットＢ；２０－４０７６）を得た。
【0240】
ｃｏｍｐＢ－０１ ＤｅｍｏロットＡ及びｃｏｍｐＢ－０１ ＧＭＰロットＢの製造スケールの比較を表１０に提供する。ｃｏｍｐＢ－０１製造プロセスの成功したスケールアップは、バイオリアクター採取後に回収された細胞ペーストのレベルと、ＧＭＰプロセスのための１０倍高いレベルの封入体を使用した下流処理を通じて最終的な原薬中間体の７倍の増加の両方によって強調される。ｃｏｍｐＢ－０１製造プロセスの成功したスケールアップは、両方のロットの材料が同等の産物品質属性を有することが示された表１１に提供される分析的特徴付けデータによっても実証される。
表１０．ＣｏｍｐＢ－０１原薬中間体のスケーラブルな製造
１プロセススケールは、下流の単位操作に対応するように意図的に調整。
表１１．ＣｏｍｐＢ－０１原薬中間体の分析的特性評価。
ＣＥ－ＳＤＳ＝キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム、ＣＦＵ＝コロニー形成単位、ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸、ＥＵ＝エンドトキシン単位、ＳＥ－ＨＰＬＣ＝サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー
表１０．ＣｏｍｐＢ－０１原薬中間体のスケーラブルな製造
【表10-3】
【表10-4】
表１１．ＣｏｍｐＢ－０１原薬中間体の分析的特性評価。
【表11-3】
【0241】
代替ＣｏｍｐＢ産生：
現在のＧＭＰ製造のために、ｂｏｍｐＢ－０１（Ｉ５３－５０Ｂ配列）をＥ．ｃｏｌｉで製造し、下流処理のための可溶性五量体として抽出する。
現在のＧＭＰ製造のために、ｂｏｍｐＢ－０１（Ｉ５３－５０Ｂ配列）をＥ．ｃｏｌｉで製造し、下流処理のための可溶性五量体として抽出する。
【0242】
Ｉ５３－５０Ｂ ｂｏｍｐＢ－０１の現在のＧＭＰ製造のために、産生株ＩＸＣＢ１０ ＤＣＢ（ロット１９１１００３０８）を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＢＭ１７９の形質転換のために、Ｉ５３－５０Ｂ配列をｐＣＴＹ１３ベクター骨格にクローニングすることによって生成した。培地中のリン酸枯渇後にｃｏｍｐＢ－０１発現を駆動し、比較的穏やかな条件下で不溶性画分から抽出することができる可溶性ｃｏｍｐＢ－０１五量体をもたらすｐｈｏＡプロモーターを使用したｐＣＹＴ１３ベクター。
【0243】
試料製造プラットフォームを使用した代替分子の評価のために、Ｉ５３－ｄｎ５Ａ ＤＮＡ配列も、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＢＭ１７９の形質転換のためにｐＣＴＹ１３ベクター骨格にクローニングし、発現株ＩＶＸＢ３０をもたらした。Ｉ５３－ｄｎ５ＡｃｏｍｐＢ産生の評価のために、Ｉ５３－ｄｎ５Ａ発現の評価のための標準的な手順を使用して、１０００ｍＬシェイクフラスコ産生培養物を増殖させた。産生後、可溶性及び不溶性の画分を細胞ペレットから単離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。
【0244】
図１２に示すように、Ｅ．ｃｏｌｉ産生培養物からの不溶性画分において、有意なレベルのＩ５３－ｄｎ５Ａが観察された。これらの結果は、Ｉ５３－５０Ｂ ｃｏｍｐＢ－０１で観察される発現パターンと一致し、別個の可溶性五量体のための共通の製造プラットフォームの使用を支持する。
【0245】
本発明は、提案されるその特定の実施形態に関連して説明されてきたが、それは更なる修正が可能であり、本出願は、概して、本発明の原理に従う本発明の任意の変形、使用、又は適応を網羅し、本発明が関連する技術分野内の既知又は慣習的な慣行の範囲内にあり、前述の本質的特徴に適用され得、添付の特許請求の範囲において以下に記載される、本開示からの逸脱を含むことが意図されることが理解される。
【図1A】
【図1B】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図2-7】
【図2-8】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】