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▶ ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-14
(54)【発明の名称】マクロファージの産生方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0786 20100101AFI20230707BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20230707BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230707BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230707BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230707BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230707BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230707BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0786
A61K35/15
A61P1/16
A61P11/00
A61P13/12
A61P21/00
A61P29/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022573206
(86)(22)【出願日】2021-05-27
(85)【翻訳文提出日】2023-01-26
(86)【国際出願番号】 GB2021051294
(87)【国際公開番号】W WO2021240162
(87)【国際公開日】2021-12-02
(31)【優先権主張番号】2007903.4
(32)【優先日】2020-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505066349
【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100187540
【弁理士】
【氏名又は名称】國枝 由紀子
(72)【発明者】
【氏名】フォーブス，スチュアート
(72)【発明者】
【氏名】カンパーナ，ララ
(72)【発明者】
【氏名】ドワイヤー，ベンジャミン
(72)【発明者】
【氏名】キャンベル，ジョン
(72)【発明者】
【氏名】フレイザー，アラスデア
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BB19
4B065BD50
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB34
4C087DA32
4C087NA05
4C087ZA59
4C087ZA75
4C087ZA81
4C087ZA94
4C087ZB11
(57)【要約】
改善された４～５日、任意に３～５日のＧＭＰに準拠したｉｎ ｖｉｖｏ方法によって、ヒトマクロファージの所望の特性を維持しながら、より短い細胞培養時間、より少ない介入から利益を得る、単球からのマクロファージの産生が可能になる。本発明は、再生促進表現型を有するマクロファージを刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む培地中で単球が培養される方法を記載している。本明細書に記載される方法は、ゼノフリー、血清非含有であり、ＧＭＰに準拠している。また、本発明によって産生されたマクロファージおよび肝臓疾患、例えば肝硬変の処置における前記マクロファージの使用がさらに開示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏのＧＭＰに準拠した方法であって、（ａ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含み、工程（ａ）が完全に同じ培地中で行われる、方法。
【請求項2】
単球が５日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
培地を再供給または交換する工程を含まない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
単球が１×１０６細胞／ｃｍ２～最大１×１０７細胞／ｃｍ２の間の密度で播種される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
培地が、Ｘ－Ｖｉｖｏ １０、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、ＴｅｘＭＡＣＳ、ＡＩＭｖ、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭおよびＤＭＥＭ／Ｆ１２、好ましくはＴｅｘＭＡＣＳから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
培地がＣＳＦファミリー、好ましくはＭ－ＣＳＦから選択される１つまたは複数の因子を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
培地が２５～２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＭ－ＣＳＦを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
単球がヒトであり、マクロファージがヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
単球がヒト血液、好ましくはヒト血液のバフィーコート、好ましくはヒト血液のＰＢＭＣ画分に由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
工程（ａ）で産生されたマクロファージを、好ましくはＭ１様またはＭ２様マクロファージに分極させる工程をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
マクロファージを分極させるさらなる工程が、分極因子、好ましくはＭ１またはＭ２分極因子を培地に添加する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
Ｍ１分極因子が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、およびＬＰＳなどのＴＬＲアゴニストから選択され；Ｍ２分極因子が、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびポリ（Ｉ：Ｃ）から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％の収率で成熟マクロファージを産生する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法によって産生されたマクロファージ。
【請求項15】
再生促進表現型を有する、任意に請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法によって産生されたｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージ。
【請求項16】
１つまたは複数の再生促進サイトカインの発現が増加している、請求項１４または１５に記載のマクロファージ。
【請求項17】
１つもしくは複数の抗炎症性サイトカインの発現の増加、および／または１つもしくは複数の炎症性サイトカインの発現の低下、および／または１つもしくは複数の抗線維化サイトカインの発現の増加、および／または１つもしくは複数の線維化サイトカインの発現の低下を有する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のマクロファージ。
【請求項18】
以下のサイトカイン：ＩＬ１、ＩＬ１２、ＩＬ１７（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＩＬ１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、好ましくはＩＬ１７Ｆの１つまたは複数の発現が低下している、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のマクロファージ。
【請求項19】
以下のサイトカイン：ＩＬ４、ＩＬ１３、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ（１、２、３）、好ましくはＴＧＦβ１の１つまたは複数の発現が低下している、請求項１４～１８のいずれか一項に記載のマクロファージ。
【請求項20】
成熟細胞表面マーカー、好ましくはＣＣＲ２－、ＣＤ１４＋、ＣＤ２０６＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ１６９＋、２５Ｆ９＋、およびＣＤ８６＋を発現する、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のマクロファージ。
【請求項21】
請求項１４～２０のいずれか一項に記載のマクロファージの集団。
【請求項22】
請求項２１に記載のマクロファージの集団を含む組成物。
【請求項23】
医薬として使用するための、請求項１４～２２のいずれか一項に記載のマクロファージ、集団または組成物。
【請求項24】
疾患または傷害の処置における使用のための、請求項１４～２２のいずれか一項に記載のマクロファージ、集団、または組成物であって、疾患が肝臓疾患、腎臓疾患、肺疾患または筋疾患を含むリストから選択される、マクロファージ、集団、または組成物。
【請求項25】
肝臓疾患、腎臓疾患、肺疾患または筋疾患が線維化疾患または炎症性疾患であり、任意に疾患が急性または慢性であり、任意に薬剤過剰摂取、好ましくはＡＰＡＰ過剰摂取および肝硬変を含むリストから選択される、請求項２４に記載の使用のためのマクロファージ、集団、または組成物。
【請求項26】
ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびＬＰＳの１つまたは複数などの炎症性刺激に応答する、請求項１６～２４のいずれかに記載のマクロファージ、集団または組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、成熟マクロファージ、特に単球由来マクロファージを産生する、４～５日、任意に３～５日のＧＭＰに準拠した方法、および前記方法により産生されるマクロファージに関する。本発明はさらに、前記マクロファージの医学的用途、特に肝臓疾患または傷害の処置に関する。
【背景技術】
【0002】
線維化は、毒性損傷、ウイルス感染、代謝および遺伝疾患、ならびに自己免疫性肝炎を含む、様々な病因の慢性肝臓疾患の最終的な共通経路である。急性であるが自己限定的な線維化が肝臓傷害に対する可逆的および保護的な応答として進化してきたと考えられる。自己限定的な線維化と過剰な線維化のバランスは、複数の経路およびシステムによって細かく制御されており、本質的に傷害の期間および反復に依存している。末期の慢性肝臓線維化は、肝硬変としても知られ、生命を脅かす状態である（１～３）。肝臓疾患による死亡率は、英国では１９７０年代から年々増加している唯一の主要な死因であり、世界的にも大きな健康上の負担のままである。唯一の治療アプローチは、傷害的な刺激の除去（例えば、有効な抗ウイルス療法の投与）および肝臓移植を伴う。したがって、有効な抗線維化療法を送達することは、慢性および急性両方の肝臓損傷に対する主要なアンメット臨床ニーズである（４～６）。
【0003】
マクロファージ（Ｍφ）は、傷害を受けた肝臓の炎症応答において重要な役割を果たす。肝臓には、２つの主要なＭφ集団：（ｉ）常在性のマクロファージ（ＫＣ）および（ｉｉ）浸潤マクロファージが存在する。ＫＣは、恒常的な状態では、洞様毛細血管を経由して肝臓に到達する微生物の残骸を貪食するために、肝類洞でパトロール機能を発揮する。肝臓損傷の初期において、ＫＣはＣＣＬ２およびＣＣＬ５などのケモカインを発現し、それによって循環から単球をリクルートすることに貢献する（２、７）。線維化の過程でＫＣの数は減少するが、自己限定的な線維化の回復期には肝臓で再増殖する（８）。浸潤性の単球由来Ｍφは、肝臓損傷に対する応答において主要な役割を果たす。浸潤性ＭφはＣＣＲ２／ＣＣＬ２軸を介してリクルートされ、一度肝臓実質部内に入ると、肝臓線維化の初期には線維隔壁に沿って位置し、肝臓星細胞を活性化して炎症を悪化させるＴＧＦ－β、ＩＬ１、ＰＤＧＦおよびＣＣＬ２などの因子を放出することによって線維化を促進し得る。このことは、進行性の線維化におけるＭφの有害な役割を示唆している可能性がある。しかし、線維化のリモデリングの開始時にＭφが枯渇すると、リモデリングプロセスが失敗し、肝臓線維化が持続する。現在では、マクロファージが線維化の確立および解消に二重の役割を果たしていることが広く受け入れられている（２、８～１０）。
【0004】
線維化の治癒における役割から、マクロファージ細胞療法は慢性肝臓線維化の軽減に有益であり得ると考えられてきた。マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）は、慢性肝臓線維化のマウスモデルに注入すると、肝臓線維化が改善することが示されている（１１）。同様の結果は、慢性肝臓線維化の免疫不全マウスモデルにヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）を用いて再現されている（１２）。さらに、現在、進行中の第ＩＩ相試験（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＳＲＣＴＮ１０３６８０５０）では、肝硬変患者への自家移植のためにＧＭＰ（優良製造基準）グレードの細胞培養プロトコル（１３）を用いてｈＭＤＭを生成する。欧州医薬品庁（ＥＭＡ）および米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の両方によって定義される優良製造基準（ＧＭＰ）品質は、臨床グレードの細胞の要件であり、細胞療法の最適に定義された品質および安全性を示す。動物成分非含有培養培地および準拠した凍結保存手法を使用して、動物タンパク質に対する免疫反応および動物微生物によって引き起こされる感染リスクを避けることができる。細胞療法の開発において、それを必要とする患者に対する投与に先立って、細胞の安全な調製および保存を確実にするために準拠した手法を開発しなければならない。
【0005】
しかし、このｈＭＤＭを生成するために使用されるプロトコルは、時間および手間がかかる。現在、ｈＭＤＭは、高用量のＭＣＳＦ（単球コロニー刺激因子、別名ＣＳＦ１、コロニー刺激因子１）中で、様々な時点で新鮮な培地およびＭＣＳＦを供給して７日間培養することによって、循環単球から分化する（１３、１４）。ｈＭＤＭの培養にかかる時間および労力を軽減することが望まれる。しかし、これまでのところ、それは実現不可能であると考えられてきた。ＧＭＰガイドライン（Ｇｉａｎｃｏｌａ，Ｒ．、Ｂｏｎｆｉｎｉ，Ｔ．、＆Ｉａｃｏｎｅ，Ａ．（２０１２）．Ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ：ｃＧＭＰ ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．Ｍｕｓｃｌｅｓ，ｌｉｇａｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｅｎｄｏｎｓ ｊｏｕｒｎａｌ、２（３）、２４３～２４７．）に従って細胞を培養および産生する製造プロセスにおいて克服するべき障害が多数存在する。臨床応用に適したＧＭＰに準拠した方法に実験室試験で通常使用される細胞培養プロトコルを変更することは、細胞のスケーラビリティ、収率、形態および機能に影響を与える課題を経験することがしばしばである。このような産生方法を短縮および単純化する試みは、ＧＭＰに準拠した治療に適し、治療用のｈＭＤＭの所望の特性を保持する成熟ｈＭＤＭを再現することができなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、治療用のｈＭＤＭの必要な特性を維持しながら、細胞培養時間の短縮および中間供給工程の排除の両方から利益を得る第２世代の方法を提供することにより、上記問題を解決しようとした。この改善された方法は、ゼノフリー、血清非含有およびＧＭＰに準拠しており、細胞を臨床用に適したものにするのが好都合である。
【0007】
本発明の１つまたは複数の態様は、上記の問題の１つまたは複数を解決することに関する。
本発明の第１の態様によれば、マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含む方法が提供される。
本発明の第１の態様によれば、マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含む方法が提供される。
【0008】
本発明の代替的な第１の態様によれば、マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含み、工程（ａ）が、完全に同じ培地中で行われる、
方法が提供される。
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含み、工程（ａ）が、完全に同じ培地中で行われる、
方法が提供される。
【0009】
本発明の他の態様によれば、マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｂ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含む方法が提供される。
（ｂ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含む方法が提供される。
【0010】
本発明の他の第１の態様によれば、マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｂ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含み、工程（ａ）が、完全に同じ培地中で行われる、
方法が提供される。
（ｂ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含み、工程（ａ）が、完全に同じ培地中で行われる、
方法が提供される。
【0011】
本発明の第２の態様によれば、第１の態様の方法によって産生されたマクロファージが提供される。
本発明の第３の態様によれば、再生促進表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージが提供される。
本発明の第３の態様によれば、再生促進表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージが提供される。
【0012】
一実施形態において、ｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージは、未分極である。一実施形態において、ｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージは、未分極の成熟マクロファージである。一実施形態において、ｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージは、抗炎症性表現型を有する。一実施形態において、ｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージは、抗線維化表現型を有する。一実施形態において、ｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージは、抗炎症性および抗線維化表現型を有する。
【0013】
本発明の第４の態様によれば、第２または第３の態様によるマクロファージの集団が提供される。
本発明の第５の態様によれば、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第４の態様による集団を含む組成物が提供される。
本発明の第５の態様によれば、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第４の態様による集団を含む組成物が提供される。
【0014】
一実施形態において、組成物は、医薬組成物である。
本発明の第６の態様によれば、第２もしくは第３の態様のマクロファージ、第５の態様の組成物、または第４の態様のマクロファージの集団を含む細胞培養バッグが提供される。
本発明の第６の態様によれば、第２もしくは第３の態様のマクロファージ、第５の態様の組成物、または第４の態様のマクロファージの集団を含む細胞培養バッグが提供される。
【0015】
本発明の第７の態様によれば、医薬として使用するための、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物が提供される。
本発明の代替的な第７の態様によれば、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物の有効量を、対象に投与することによる、疾患を有する対象の処置方法が提供される。
本発明の代替的な第７の態様によれば、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物の有効量を、対象に投与することによる、疾患を有する対象の処置方法が提供される。
【0016】
本発明の第８の態様によれば、肝臓疾患または傷害の処置に使用するための、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物が提供される。
本発明の代替的な第８の態様によれば、肝臓疾患または傷害を有する対象の処置方法であって、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、方法が提供される。
本発明の代替的な第８の態様によれば、肝臓疾患または傷害を有する対象の処置方法であって、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、方法が提供される。
【0017】
第９の態様によれば、対象の疾患を処置するための医薬の製造における、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物の使用であって、
製造が以下の工程：
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；
および
（ｂ）前記マクロファージの一部または全部を、対象に投与するための医薬に製剤化する工程を含む、使用が提供される。
製造が以下の工程：
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；
および
（ｂ）前記マクロファージの一部または全部を、対象に投与するための医薬に製剤化する工程を含む、使用が提供される。
【0018】
代替的な第９の態様によれば、対象の疾患を処置するための医薬の製造における、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物の使用であって、製造が以下の工程：
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；
および
（ｂ）前記マクロファージの一部または全部を、対象に投与するための医薬に製剤化する工程を含み、
工程（ａ）が完全に同じ培地中で行われる、使用が提供される。
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；
および
（ｂ）前記マクロファージの一部または全部を、対象に投与するための医薬に製剤化する工程を含み、
工程（ａ）が完全に同じ培地中で行われる、使用が提供される。
【0019】
異なる第９の態様によれば、対象の疾患を処置するための医薬の製造における、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物の使用であって、製造が以下の工程：
（ｃ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；
および
（ｄ）前記マクロファージの一部または全部を、対象に投与するための医薬に製剤化する工程を含む、使用が提供される。
（ｃ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；
および
（ｄ）前記マクロファージの一部または全部を、対象に投与するための医薬に製剤化する工程を含む、使用が提供される。
【0020】
他の第９の態様によれば、対象の疾患を処置するための医薬の製造における、第２もしくは第３の態様によるマクロファージ、または第５の態様による組成物の使用であって、製造が以下の工程：
（ｃ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；
および
（ｄ）一部または全部の前記マクロファージを、対象に投与するための医薬に製剤化する工程を含み、
工程（ａ）が完全に同じ培地中で行われる、使用が提供される。
（ｃ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；
および
（ｄ）一部または全部の前記マクロファージを、対象に投与するための医薬に製剤化する工程を含み、
工程（ａ）が完全に同じ培地中で行われる、使用が提供される。
【0021】
好ましい実施形態において、疾患は、肝臓疾患または傷害である。
本発明者らは、好都合なことに、先行技術の方法よりも数日短く、かつ、培地の再供給を必要としない、単球からマクロファージを産生する新規なＧＭＰに準拠した方法を発見した。文献で一般的に報告されていることとは反対に、本明細書の方法に従って産生されたマクロファージは、培養開始後３日という早さで成熟マクロファージの特徴を示し、培地の再供給を必要としない。好都合なことに、望ましいマクロファージの特徴である重要なマーカー、例えば２５Ｆ９およびＣＤ２０６は、培養３日という早さで上方制御される（図４Ｂおよび４Ｃ）。単球上で通常発現されるマーカー、例えばＣＣＲ２は、培養３日という早さで下方制御される（図４Ｆ）。これは、単球の培養の３日目におけるマクロファージの産生を示している。
本発明者らは、好都合なことに、先行技術の方法よりも数日短く、かつ、培地の再供給を必要としない、単球からマクロファージを産生する新規なＧＭＰに準拠した方法を発見した。文献で一般的に報告されていることとは反対に、本明細書の方法に従って産生されたマクロファージは、培養開始後３日という早さで成熟マクロファージの特徴を示し、培地の再供給を必要としない。好都合なことに、望ましいマクロファージの特徴である重要なマーカー、例えば２５Ｆ９およびＣＤ２０６は、培養３日という早さで上方制御される（図４Ｂおよび４Ｃ）。単球上で通常発現されるマーカー、例えばＣＣＲ２は、培養３日という早さで下方制御される（図４Ｆ）。これは、単球の培養の３日目におけるマクロファージの産生を示している。
【0022】
したがって、本発明の方法は、従来の方法よりも迅速であり、ＧＭＰ（優良製造基準）に準拠している。さらに、本発明の方法は、先行技術の方法よりもマクロファージの収率が高いことが見出されている。
【0023】
また、本発明者らは、驚くべきことに、新規の方法により産生されたマクロファージは、他の方法により産生されたマクロファージとは異なるサイトカインプロファイルおよび発現マーカープロファイルを有することを見出した。前記マクロファージは、現在の技術水準のプロトコルで産生されたマクロファージと比較して、再生促進プロファイルを有する。さらに、これらのマクロファージは、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ４－ＩＬ１３の組合せ、およびＩＬ１０などの分極刺激に応答する優れた能力を有する。また、プラスチック表面への接着レベルが低いため、輸送および送達がより容易である。
【0024】
最後に、本発明者らは、本明細書に記載のマクロファージが、マウスにおけるパラセタモール（アセトアミノフェン、ＡＰＡＰ）過剰摂取およびＣＣｌ４誘導性肝硬変のモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験により示されるように、急性および慢性状態を処置できることを示した。
【0025】
本発明のさらなる態様は、以下のように定義される：
さらなる態様において、以下の炎症性サイトカイン：ＩＬ１、ＩＬ１２、ＩＬ１７（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＩＬ１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγの１つまたは複数の発現が低下したマクロファージの組成物または集団が提供される。
さらなる態様において、以下の炎症性サイトカイン：ＩＬ１、ＩＬ１２、ＩＬ１７（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＩＬ１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγの１つまたは複数の発現が低下したマクロファージの組成物または集団が提供される。
【0026】
さらなる態様において、２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好適には１９０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、１８０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好適には１７０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、１６０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好適には１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＩＬ１７Ｆを発現するマクロファージの組成物または集団が提供される。
【0027】
さらなる態様において、４５０００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＧＦβ、好適には４４０００ｐｇ／ｍＬ未満、好適には４３０００ｐｇ／ｍＬ未満、好適には４２０００ｐｇ／ｍＬ未満、好適には４１０００ｐｇ／ｍＬ未満、好適には４００００ｐｇ／ｍＬ以下のＴＧＦβを発現するマクロファージの組成物または集団が提供される。
【0028】
さらなる態様において、５０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１００ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１２０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１４０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１６０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１７０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１を発現するマクロファージの組成物または集団が提供される。
【0029】
さらなる態様において、５００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、３００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、１８０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、１６０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、１４０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、１３０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９を発現するマクロファージの組成物または集団が提供される。
【0030】
さらなる態様において、抗炎症性および抗線維化表現型を有するマクロファージの組成物または集団であって、マクロファージが２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆおよび４５０００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＧＦβを発現する、組成物または集団が提供される。
【0031】
さらなる態様において、マクロファージが抗炎症性および抗線維化表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージの組成物または集団であって、マクロファージが約１５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ１７Ｆおよび約４００００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦβを発現する、組成物または集団が提供される。
【0032】
さらなる態様において、成熟マクロファージであるマクロファージの組成物または集団であって、成熟マクロファージが、ＣＤ１４＋、ＣＤ２０６＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ１６９＋、２５Ｆ９＋、およびＣＤ８６＋であり、成熟マクロファージがＣＣＲ２－である、組成物または集団が提供される。
【0033】
さらなる態様において、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびＬＰＳの１つまたは複数などの炎症性刺激に応答するマクロファージの組成物または集団が提供される。
【0034】
さらなる態様において、第１の態様の方法によって産生された培養成熟マクロファージの収率が、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、最大４０％、最大４５％、最大５０％である組成物または集団が提供される。
【0035】
上記態様のいずれかの実施形態において、マクロファージからのサイトカイン発現レベルは、実施例で説明するように、Ｖ－ｐｌｅｘ技術を使用して細胞培養上清を試験することによって測定される。
【0036】
ここで本発明のさらなる特徴および実施形態について説明する。特徴は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されるものではなく、任意の適合する方法で組み合わせることができる。
【発明を実施するための形態】
【0037】
以下の定義が提供される。
本発明で使用される「ｈＭＤＭ」は、ヒト単球由来マクロファージを指す。単球由来とは、単球から分化したマクロファージを意味する。単球は、マクロファージおよび樹状細胞の天然の前駆体であり、血液および骨髄に含まれる。
本発明で使用される「ｈＭＤＭ」は、ヒト単球由来マクロファージを指す。単球由来とは、単球から分化したマクロファージを意味する。単球は、マクロファージおよび樹状細胞の天然の前駆体であり、血液および骨髄に含まれる。
【0038】
本発明で使用される「未分極マクロファージ」は、特定の機能的能力を誘導するためのさらなる刺激を受けていない成熟マクロファージを指し、未分極マクロファージは、ナイーブまたは非活性化マクロファージを指すこともある。
【0039】
本発明で使用される「分極マクロファージ」は、Ｍ１様またはＭ２様表現型などの特定の表現型に活性化されるように環境刺激を受けたマクロファージを指す。Ｍ１様表現型およびＭ２様表現型については、後述する。
【0040】
「マクロファージ」は、病原体、損傷細胞およびアポトーシス細胞を検出し、貪食し、破壊する役割を担う、単球の分化によって産生される貪食細胞を指す。本明細書で使用される「マクロファージ」という用語は、一般的に、本明細書に記載のプロセスによって産生されるマクロファージを指す。それは、未分極であっても分極されていてもよい。
【0041】
「成熟マクロファージ」は、成熟細胞表面マーカー、好ましくはＣＣＲ２－、ＣＤ１４＋、ＣＤ２０６＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ１６９＋、２５Ｆ９＋、およびＣＤ８６＋を発現するマクロファージを指す。
【0042】
本発明で使用される「Ｍ１分極因子」は、未分極マクロファージをＭ１様表現型に刺激する因子を指し、例えばＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、およびＬＰＳなどのＴＬＲアゴニストの１つまたは複数を指していてもよい。
【0043】
本発明で使用される「Ｍ２分極因子」は、未分極マクロファージをＭ２様表現型に刺激する因子を指し、例えばＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびポリ（Ｉ：Ｃ）の１つまたは複数を指していてもよい。
【0044】
本発明で使用される「ＧＭＰに準拠した」は、方法が優良製造基準に準拠することを意味する。例として、ＧＭＰに準拠した培地は、血清非含有、抗生物質非含有、およびゼノプロテインフリー（動物物質非含有）である必要がある。ＷＨＯは、優良製造基準に必要とされる事項に関するガイダンスを提供している：「Ｃｈａｐｔｅｒ １：ＷＨＯ ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：Ｍａｉｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ」．Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ － Ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ａｎｄ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ． ２（２ｎｄ ｕｐｄａｔｅｄ ｅｄ．）．ＷＨＯ Ｐｒｅｓｓ． ｐｐ．１７～１８．ＩＳＢＮ ９７８９２４１５４７０８６。
【0045】
本発明で使用される「処置」は、対象の所定の生理学的状態に関連する臨床症状を防止、軽減または除去する生理学的状態への介入を意味する。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」とは、対象が「健常な対象」として定義される場合を除き、診断、予後、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト；家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）；家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）；例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ウシ（ｃｏｗ）などが挙げられる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」とは、対象が「健常な対象」として定義される場合を除き、診断、予後、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト；家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）；家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）；例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ウシ（ｃｏｗ）などが挙げられる。
【0046】
方法／プロトコルに関して本発明で使用される「５日供給なし」または「５日」は、マクロファージを産生するための本発明の方法／プロトコルを指す。第１の態様で定義されるように、本発明の方法は、３～５日間、場合によって４～５日間持続する。３～５日とは、典型的には、約７２～１２０時間の期間を指す。４～５日とは、典型的には、約９６～１２０時間の期間を指す。この期間は、±１０時間、好ましくは±５時間、好ましくは±２時間変動してもよい。したがって好適には、本発明の方法は、６２～１３０時間、好適には８６～１３０時間、好適には９０～１２５時間、好適には９６～１２０時間持続してもよい。
【0047】
方法／プロトコルに関連して本発明で使用される「７日＋再供給」または「７日」は、マクロファージを産生するために当技術分野で現在使用される標準的なより長い方法／プロトコルを指す。これらの先行方法は、典型的には約１６８時間の期間を指す約７日間の期間持続する。この期間は、±１０時間、好ましくは±５時間、好ましくは±２時間変動し得る。
【0048】
用語「ａ」または「ａｎ」を有する実体は、その実体の１つまたは複数を指すことに留意されたい。
「約」は、特に断らない限り、所与の値の±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％を意味する。
「約」は、特に断らない限り、所与の値の±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％を意味する。
【0049】
「発現の増加」は、少なくとも２倍の発現の増加を指す。倍増は、マクロファージにおける所定のマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、マクロファージが分化した単球における同じマーカーのＭＦＩで割ることにより算出される。本明細書では、この２つの値の比率を「ＭＦＩ比率」または「相対蛍光強度（ＲＦＩ）」と定義する。これらの値は、フローサイトメトリーにより測定される。「発現の増加」はまた、１つの試料の培地中の所定のサイトカインの濃度が、他の試料と比較して増加することを指していてもよい。この増加は、２つの試料群を比較する統計検定が値＜０．０５を返した場合に、有意であると考える。
【0050】
「発現の低下」は、少なくともＲＦＩ＜０．５であることを指す。低下は、マクロファージにおける所定のマーカーのＭＦＩを、マクロファージが分化した単球における同じマーカーのＭＦＩで割ることにより算出される。本明細書では、この２つの値の比率を「ＭＦＩ比率」または「相対蛍光強度（ＲＦＩ）」と定義する。これらの値は、フローサイトメトリーにより測定される。「発現の低下」はまた、１つの試料の培地中の所定のサイトカインの濃度が、他の試料と比較して増加することを指していてもよい。この低下は、２つの試料群を比較する統計検定が値＜０．０５を返した場合に、有意であると考える。
【0051】
細胞培養培地
本発明は、単球からマクロファージを産生する新規の方法に関し、単球は培地中で３～５日間培養され、この工程を通して同じ培地が使用される。
本発明は、単球からマクロファージを産生する新規の方法に関し、単球は培地中で３～５日間培養され、この工程を通して同じ培地が使用される。
【0052】
好適には、培地は単球からマクロファージを生成するのに適している。好適には、培地は、Ｔ細胞培地である。好適には、培地は、Ｘ－Ｖｉｖｏ １０、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、ＴｅｘＭＡＣＳ、ＡＩＭｖ、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、およびＤＭＥＭ／Ｆ１２から選択し得る。好適には、培地はＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）である。
【0053】
好適には、培地は血清非含有である。好適には、培地は、ゼノプロテインフリーである。好適には、培地はＧＭＰに準拠している。
好適には、培地は、１つまたは複数の因子を含んでもよい。好適な因子としては、増殖因子、多糖、サイトカインおよびケモカインが挙げられる。好適な因子としては、ＭＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦを挙げることができる。したがって好適には、因子は増殖因子である。好適には、１つまたは複数の因子はＧＭＰに準拠している。一実施形態において、培地は、ＭＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦを含んでいてもよい１つまたは複数の増殖因子を含んでいてもよい。単球はＭＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦのいずれかと共に培養されるのが最も一般的である。ＧＭ－ＣＳＦと共に単球を培養することによって「Ｍ１様表現型」へと偏向され、ＭＣＳＦと共に単球を培養することによって「Ｍ２様表現型」へと偏向される。しかし、ＭＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦの両方と共に単球を培養するのは一般的なアプローチではない。他の実施形態において、１つまたは複数の増殖因子はＭＣＳＦとＧＭ－ＣＳＦの組合せを含まない。したがって、Ｍ－ＣＳＦが本発明の任意の方法においてマクロファージを生成するための増殖因子として使用される場合、単球からのマクロファージの生成にＧＭ－ＣＳＦも使用することはない方が好ましい場合がある。これは、マクロファージが生成されるまで単球を培養する工程に当てはまる。
好適には、培地は、１つまたは複数の因子を含んでもよい。好適な因子としては、増殖因子、多糖、サイトカインおよびケモカインが挙げられる。好適な因子としては、ＭＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦを挙げることができる。したがって好適には、因子は増殖因子である。好適には、１つまたは複数の因子はＧＭＰに準拠している。一実施形態において、培地は、ＭＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦを含んでいてもよい１つまたは複数の増殖因子を含んでいてもよい。単球はＭＣＳＦまたはＧＭ－ＣＳＦのいずれかと共に培養されるのが最も一般的である。ＧＭ－ＣＳＦと共に単球を培養することによって「Ｍ１様表現型」へと偏向され、ＭＣＳＦと共に単球を培養することによって「Ｍ２様表現型」へと偏向される。しかし、ＭＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦの両方と共に単球を培養するのは一般的なアプローチではない。他の実施形態において、１つまたは複数の増殖因子はＭＣＳＦとＧＭ－ＣＳＦの組合せを含まない。したがって、Ｍ－ＣＳＦが本発明の任意の方法においてマクロファージを生成するための増殖因子として使用される場合、単球からのマクロファージの生成にＧＭ－ＣＳＦも使用することはない方が好ましい場合がある。これは、マクロファージが生成されるまで単球を培養する工程に当てはまる。
【0054】
好適には、培地は、別名ＣＳＦ－１としても知られるＭＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）を含む。好適には、ＭＣＳＦは、組換えＭＣＳＦ、好適には、組換えヒトＭＣＳＦであってもよい。
【0055】
好適には、培地は、２５～２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度、好適には５０～１２５ｎｇ／ｍＬの間の濃度、好適には７５～１１０ｎｇ／ｍＬの間の濃度、好適には１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＭＣＳＦを含む（国際単位（ＩＵ）で同等：組換えヒトＭＣＳＦ ＧＭＰグレードの１００ｎｇ＝１．６×１０４ＩＵ）。
【0056】
好適には、１つまたは複数の因子が培地に添加される。好適には、方法は、１つまたは複数の因子を培地に添加する工程を含んでいてもよい。好適には、１つまたは複数の因子を添加する工程は、工程（ａ）の前および／または工程（ａ）の間に行われてもよい。
【0057】
好適には、ＭＣＳＦが培地に添加される。好適には、本発明の方法は、ＭＣＳＦを培地に添加する工程を含む。好適には、ＭＣＳＦは、培養工程（ａ）の前に培地に添加される。
【0058】
好適には、培地は、１つまたは複数のさらなる添加剤を含んでいてもよい。好適なさらなる添加剤としては、アルブミン、グルタミン、およびストレプトマイシンまたはペニシリンなどの抗生物質を挙げることができる。
【0059】
好適には、培地は、例えばｐＨ指示薬などの１つまたは複数の指示薬を含んでいてもよい。
好適には、１つまたは複数のさらなる添加剤は培地に添加され、あるいは、培地は既に前記さらなる添加剤を含んでいてもよい。好適には、方法は、１つまたは複数のさらなる添加剤を培地に添加する工程を含んでいてもよい。好適には、１つまたは複数のさらなる添加剤を添加する工程は、工程（ａ）の前および／または工程（ａ）の間に行われてもよい。
好適には、１つまたは複数のさらなる添加剤は培地に添加され、あるいは、培地は既に前記さらなる添加剤を含んでいてもよい。好適には、方法は、１つまたは複数のさらなる添加剤を培地に添加する工程を含んでいてもよい。好適には、１つまたは複数のさらなる添加剤を添加する工程は、工程（ａ）の前および／または工程（ａ）の間に行われてもよい。
【0060】
一実施形態において、培地は、添加剤を含まない。
好適には、少なくとも工程（ａ）は、全く同じ培地中で行われる。好適には、単球のマクロファージへの分化は、同じ培地中で行われる。好適には、方法全体が同じ培地中で行われる。好適には、「同じ培地」は、培地の添加、再供給または交換が行われないことを意味し、すなわち、これは単回供給方法である。文献で一般的に報告されている方法は、「複数回供給方法」であることがしばしばであり、すなわち、培地の添加、再供給または置換を伴う。「複数回供給方法」の欠点は、培養プレートの表面に付着していない細胞が培地交換のプロセスにおいて除かれることがしばしばであることである。他の場合において、成分の添加または再供給は、培養プレートで成長する細胞をしばしば損ない得る。プロセスが伴う介入が多くなる程、そのプロセス中の細胞の損失が多くなる。好都合なことに、本方法は、単回供給を伴い、そのため介入が少なくなっていることにより、細胞損失が低下している。好適には、工程（ａ）は、培地の再供給を含まない。好適には、工程（ａ）は、培地を交換することを含まない。好適には、方法は、培地を再供給する工程を含まない。好適には、方法は、培地を交換する工程を含まない。
好適には、少なくとも工程（ａ）は、全く同じ培地中で行われる。好適には、単球のマクロファージへの分化は、同じ培地中で行われる。好適には、方法全体が同じ培地中で行われる。好適には、「同じ培地」は、培地の添加、再供給または交換が行われないことを意味し、すなわち、これは単回供給方法である。文献で一般的に報告されている方法は、「複数回供給方法」であることがしばしばであり、すなわち、培地の添加、再供給または置換を伴う。「複数回供給方法」の欠点は、培養プレートの表面に付着していない細胞が培地交換のプロセスにおいて除かれることがしばしばであることである。他の場合において、成分の添加または再供給は、培養プレートで成長する細胞をしばしば損ない得る。プロセスが伴う介入が多くなる程、そのプロセス中の細胞の損失が多くなる。好都合なことに、本方法は、単回供給を伴い、そのため介入が少なくなっていることにより、細胞損失が低下している。好適には、工程（ａ）は、培地の再供給を含まない。好適には、工程（ａ）は、培地を交換することを含まない。好適には、方法は、培地を再供給する工程を含まない。好適には、方法は、培地を交換する工程を含まない。
【0061】
培養方法
本発明は、単球を培養してマクロファージを産生する新規の方法に関する。
好適には、方法は、単球を得る工程をさらに含んでいてもよい。好適には、単球は、末梢血または白血球アフェレーシス収集または動態化アフェレーシス収集から得てもよい（例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦ動態化血液前駆体）。好適には、ヒト血液から、好適にはヒト血液試料からである。好適には、単球は、ヒト血液の単核白血球画分から得られ、好適には、ヒト血液試料の単核白血球画分から得られる。
本発明は、単球を培養してマクロファージを産生する新規の方法に関する。
好適には、方法は、単球を得る工程をさらに含んでいてもよい。好適には、単球は、末梢血または白血球アフェレーシス収集または動態化アフェレーシス収集から得てもよい（例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦ動態化血液前駆体）。好適には、ヒト血液から、好適にはヒト血液試料からである。好適には、単球は、ヒト血液の単核白血球画分から得られ、好適には、ヒト血液試料の単核白血球画分から得られる。
【0062】
好適には、方法は、血液から、好適には血液の単核白血球画分から、好適にはヒト血液試料の単核白血球画分から単球を精製する工程をさらに含んでいてもよい。かかる精製は、単核白血球画分の単離、および特異的（単球系列のマーカー）または非特異的（接着）方法を用いた画分からの精製単球の単離を含んでいてもよい。好適には、単核白血球画分の単離は、原料に応じた様々な方法により実施することができる。好適には、選択された精製単球の単離は、小規模（磁気ビーズカラムデバイスまたはプラスチック接着）またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）などの関連デバイスを用いた製造のためにより大規模で実施してもよい。他の実施形態において、方法は、アフェレーシス収集に先立って患者に動態化薬剤を投与する工程をさらに含んでいてもよい。好適には、動態化薬剤は、前駆細胞の骨髄からの動態化を促す。
【0063】
好適には、方法は、マクロファージを産生するために単離単球を培地中で３～５日間培養する工程を含む。好適には、単球は、以下にさらに説明するように、プレート内または細胞培養バッグ内で培地中で培養され得る。
【0064】
好適には、単球は、１×１０６細胞／ｃｍ２～最大１×１０８細胞／ｃｍ２の密度で、好適には５×１０６細胞／ｃｍ２～最大５×１０７細胞／ｃｍ２の密度で、好適には７×１０６細胞／ｃｍ２の密度で播種される。
【0065】
好適には、単球は、加湿された雰囲気中で培養される。
好適には、単球は、３５℃～３９℃の温度、好適には３６℃～３８℃の温度、好適には約３７℃で培養される。
好適には、単球は、３５℃～３９℃の温度、好適には３６℃～３８℃の温度、好適には約３７℃で培養される。
【0066】
好適には、単球は、二酸化炭素を含む雰囲気中で培養される。好適には、二酸化炭素は、１～２０％、好適には２～１５％、好適には３～１０％、好適には４～８％、好適には約５％の濃度である。
【0067】
好適には、単球は、４～５日間、任意に３～５日間培養される。一実施形態において、単球は、５日間培養される。好適には、単球は、４～５日間、任意に３～５日間連続的に培養される。一実施形態において、単球は、５日間連続的に培養される。
【0068】
好適には、方法は、培地から成熟マクロファージを単離する工程、好適には、工程（ａ）の培地から成熟マクロファージを単離する工程をさらに含んでいてもよい。好適には、成熟マクロファージは、典型的な細胞解離技術、例えば細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびパステットを用いて、または細胞培養バッグの自動もしくは手動操作を用いて単離される。
【0069】
好適には、方法は、成熟マクロファージを医薬として製剤化する工程をさらに含んでいてもよい。好適には、この工程は、賦形剤中に成熟マクロファージを再懸濁することを含んでいてもよい。好適には、賦形剤は、任意の薬学的に許容される賦形剤、例えば、本明細書の他の場所で議論されるような生理食塩水であってもよい。
【0070】
好適には、方法中の細胞生存率は、少なくとも７０％の生存率、少なくとも７５％の生存率、少なくとも８０％の生存率、少なくとも８５％の生存率、少なくとも９０％の生存率、少なくとも９５％の生存率である。
【0071】
好適には、本発明の方法は、マクロファージを高収率で産生する。好適には、本発明の方法は、先行技術の方法よりも高い収率のマクロファージを産生する。好適には、本発明の方法は、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％のマクロファージの収率を産生する。好適には、本発明の方法は、２０％～７０％のマクロファージの収率を産生する。好適には、本発明の方法は、最大４０％、最大４５％、最大５０％、最大５５％、最大６０％、最大６５％、最大７０％の収率をもたらす。好適には、マクロファージの収率は、（回収時のマクロファージの数／培養したマクロファージの数）＊１００として算出される。
好適には、方法はＧＭＰに準拠している。
好適には、方法はＧＭＰに準拠している。
【0072】
分極
本発明のマクロファージの産生方法は、マクロファージを分極するさらなる工程を含んでいてもよい。好適には、マクロファージを分極する工程は、工程（ａ）の後であるが、マクロファージの単離または製剤化の前に行われる。好適には、本発明の方法または使用のいずれかが、かかる追加の工程を含んでいてもよい。
本発明のマクロファージの産生方法は、マクロファージを分極するさらなる工程を含んでいてもよい。好適には、マクロファージを分極する工程は、工程（ａ）の後であるが、マクロファージの単離または製剤化の前に行われる。好適には、本発明の方法または使用のいずれかが、かかる追加の工程を含んでいてもよい。
【0073】
好適には、マクロファージを分極する工程は、工程（ａ）のマクロファージをＭ１様またはＭ２様マクロファージに変換することを含んでいてもよい。
一実施形態において、
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；および
（ｂ）工程（ａ）で産生されたマクロファージを分極する工程
を含む、マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が提供される。
一実施形態において、
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；および
（ｂ）工程（ａ）で産生されたマクロファージを分極する工程
を含む、マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が提供される。
【0074】
一実施形態において、マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；および
（ｂ）工程（ａ）で産生されたマクロファージを分極する工程を含み、
工程（ａ）が、完全に同じ培地中で行われる、
方法が提供される。
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；および
（ｂ）工程（ａ）で産生されたマクロファージを分極する工程を含み、
工程（ａ）が、完全に同じ培地中で行われる、
方法が提供される。
【0075】
他の実施形態において、
（ｃ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；および
（ｄ）工程（ａ）で産生されたマクロファージを分極する工程を含む、
マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が提供される。
（ｃ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；および
（ｄ）工程（ａ）で産生されたマクロファージを分極する工程を含む、
マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が提供される。
【0076】
さらなる実施形態において、マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｃ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；および
（ｄ）工程（ａ）で産生されたマクロファージを分極する工程を含み、
工程（ａ）が、完全に同じ培地中で行われる、
方法が提供される。
（ｃ）単球を培地中で３～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程；および
（ｄ）工程（ａ）で産生されたマクロファージを分極する工程を含み、
工程（ａ）が、完全に同じ培地中で行われる、
方法が提供される。
【0077】
さらなる実施形態において、１つまたは複数の増殖因子はＧＭＰグレードの増殖因子、例えばＧＭＰ ＧＭ－ＣＳＦおよびＧＭＰ ＭＣＳＦである。
好適には、マクロファージを分極する工程は、培地に１つまたは複数の分極因子を添加することを含み得る。好適には、１つまたは複数の分極因子は、Ｍ１様またはＭ２様マクロファージを産生することができる。好適には、Ｍ１様表現型およびＭ２様表現型は、以下に説明するように、様々な因子による分極によって生成される。
好適には、マクロファージを分極する工程は、培地に１つまたは複数の分極因子を添加することを含み得る。好適には、１つまたは複数の分極因子は、Ｍ１様またはＭ２様マクロファージを産生することができる。好適には、Ｍ１様表現型およびＭ２様表現型は、以下に説明するように、様々な因子による分極によって生成される。
【0078】
好適には、Ｍ１様表現型は、炎症促進性である。
好適には、Ｍ２様表現型は、回復促進性である。
好適には、Ｍ１様マクロファージを産生するために、１つまたは複数の分極因子としては、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、およびＬＰＳなどのＴＬＲアゴニストが挙げられる。一実施形態において、Ｍ１分極増殖因子は、ＩＦＮγまたはＩＦＮγ＋ＬＰＳである。
好適には、Ｍ２様表現型は、回復促進性である。
好適には、Ｍ１様マクロファージを産生するために、１つまたは複数の分極因子としては、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、およびＬＰＳなどのＴＬＲアゴニストが挙げられる。一実施形態において、Ｍ１分極増殖因子は、ＩＦＮγまたはＩＦＮγ＋ＬＰＳである。
【0079】
好適には、Ｍ２様マクロファージを産生するために、１つまたは複数の分極因子としては、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびポリ（Ｉ：Ｃ）が挙げられる。一実施形態において、Ｍ２分極因子は、ＩＬ４＋ＩＬ１３である。あるいは、Ｍ２分極因子は、ＩＬ１０である。あるいは、Ｍ２分極因子は、ポリ（Ｉ：Ｃ）である。
【0080】
好適には、培地に添加される各分極因子の濃度は、１０～１５０ｎｇ／ｍＬの間、好適には２５～１２５ｎｇ／ｍＬの間、好適には５０～１００ｎｇ／ｍＬの間である。
好適には、各Ｍ１分極因子の濃度は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの間、好適には２０～８０ｎｇ／ｍＬの間、好適には３０ｎｇ／ｍＬ～６０ｎｇ／ｍＬの間、好適には約５０ｎｇ／ｍＬである。一実施形態において、Ｍ１分極因子は、５０ｎｇ／ｍＬ（０．１×１０４ＩＵ／ｍＬと同等）の濃度で使用されるＩＦＮγである。
好適には、各Ｍ１分極因子の濃度は、１０～１００ｎｇ／ｍＬの間、好適には２０～８０ｎｇ／ｍＬの間、好適には３０ｎｇ／ｍＬ～６０ｎｇ／ｍＬの間、好適には約５０ｎｇ／ｍＬである。一実施形態において、Ｍ１分極因子は、５０ｎｇ／ｍＬ（０．１×１０４ＩＵ／ｍＬと同等）の濃度で使用されるＩＦＮγである。
【0081】
好適には、各Ｍ２分極因子の濃度は、１～２０ｎｇ／ｍＬの間、好適には５～１５ｎｇ／ｍＬの間、好適には８ｎｇ／ｍＬ～１２ｎｇ／ｍＬの間、好適には約１０ｎｇ／ｍＬである。一実施形態において、Ｍ２分極因子は、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ（０．２９×１０３ＩＵ／ｍＬと同等）の濃度で使用されるＩＬ４およびＩＬ１３である。代替的な実施形態において、Ｍ２分極因子は、１０ｎｇ／ｍＬ（０．２９×１０３ＩＵ／ｍＬと同等）の濃度で使用されるＩＬ１０である。
【0082】
好適には、各Ｍ１分極因子の濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬである。
好適には、各Ｍ２分極因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬである。
好適には、分極工程の間、さらなるＭＣＳＦが培地に添加される。
好適には、各Ｍ２分極因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬである。
好適には、分極工程の間、さらなるＭＣＳＦが培地に添加される。
【0083】
好適には、さらなるＭＣＳＦは、１０～１５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度で、好適には２５～１２５ｎｇ／ｍＬの間、好適には５０～１００ｎｇ／ｍＬの間で培地に添加される。好適には、さらなるＭＣＳＦは、約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で培地に添加される。好適には、１００ｎｇの組換えヒトＭＣＳＦ ＧＭＰグレード＝１．６×１０４ＩＵである。
【0084】
好適には、マクロファージを分極する工程を含む方法は、分極マクロファージを産生する。好適には、マクロファージを分極する工程を含む方法は、分極したＭ１様またはＭ２様マクロファージを産生する。
【0085】
一実施形態において、そのような方法によって産生された分極マクロファージが提供される。
一実施形態において、抗炎症性および抗線維化表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成分極マクロファージが提供される。
一実施形態において、抗炎症性および抗線維化表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成分極マクロファージが提供される。
【0086】
一実施形態において、前記分極マクロファージの集団が提供される。
一実施形態において、前記分極マクロファージまたはその集団を含む細胞培養バッグが提供される。
一実施形態において、前記分極マクロファージまたはその集団を含む細胞培養バッグが提供される。
【0087】
好適には、分極マクロファージは、Ｍ１様マクロファージまたはＭ２様マクロファージであってもよい。
【0088】
単球
本発明は、マクロファージを産生するために単球を培養する新規の方法に関する。
本発明は、マクロファージを産生するために単球を培養する新規の方法に関する。
【0089】
したがって、好適には、本発明の方法は、単球を得る工程をさらに含んでいてもよい。
好適には、ヒト単球は、全血、単核細胞、白血球アフェレーシス、動態化アフェレーシスなどの任意の供給源から提供され、またはそれらはｉＰＳＣ由来であってもよい。
好適には、ヒト単球は、全血、単核細胞、白血球アフェレーシス、動態化アフェレーシスなどの任意の供給源から提供され、またはそれらはｉＰＳＣ由来であってもよい。
【0090】
好適には、単球は、ヒト血液、好適にはヒト血液の単核白血球画分に由来する。好適には、単球は、ヒト末梢血または白血球アフェレーシス提供に由来し、好適には、ヒト末梢血もしくは白血球アフェレーシス提供または動態化アフェレーシス血液収集の単核白血球画分に由来する。好適には、血液もしくは白血球アフェレーシス提供または動態化アフェレーシス血液提供は、健常な対象または疾患対象由来であってもよい。
【0091】
好適には、方法は、血液から、好適には血液の単核白血球画分から、好適にはヒト血液試料の単核白血球画分から単球を精製する工程をさらに含んでいてもよい。かかる精製は、単核白血球画分の単離、および特異的（単球系列のマーカー）または非特異的（接着）方法を用いた画分からの精製単球の単離を含んでいてもよい。好適には、単核白血球画分の単離は、原料に応じた様々な方法によって実施することができる。好適には、選択された精製単球の単離は、小規模（磁気ビーズカラムデバイスまたはプラスチック付着）またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）などの関連デバイスを用いた製造のためにより大規模で実施され得る。
【0092】
好適には、単球は、上記のように全血または他の細胞源から、好適には濃縮により単離される。好適には、単核細胞画分の単離は、原料の密度遠心分離またはマイクロ流体分離によって実施され得る。好適には精製単球の単離は、単核細胞画分の濾過、例えばカラム濾過による単球に特異的な表面マーカーへの磁気ビーズなどによって実施されてもよく、好適な濾過システムは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含む。好適には、精製単球の単離は、ＣＤ１４マイクロビーズ選択によって実施されてもよい。
【0093】
好適には、単球は、健常な対象または疾患対象からの末梢血または白血球アフェレーシス提供から得られてもよい。したがって好適には、単球は、対象に対して同種異系であっても自己由来であってもよい。好適には、同種異系単球は、健常な対象の末梢血または白血球アフェレーシス提供から得られる。好適には、健常な対象は、処置される対象と血液型が一致している。好適には、健常な対象は、処置する対象と部分的にＨＬＡが適合している。好適には、健常な対象は、処置される対象とＨＬＡが適合している。
【0094】
好適には、処置中の免疫反応を最小化するために、単球は、得られたマクロファージ処置される疾患対象からの末梢血または白血球アフェレーシス提供に由来している。したがって、一実施形態において、単球は、処置される対象に対して自己由来である。好適には、単球は、肝臓疾患または傷害を有する疾患対象からの末梢血もしくは白血球アフェレーシス提供または動態化アフェレーシス提供から得られてもよい。好適な肝臓疾患は本明細書で以下に特定する。
【0095】
好適には、本発明の方法のための単球の供給を確保するために、単球は、健常な対象からの末梢血もしくは白血球アフェレーシス提供または動態化アフェレーシス提供に由来する。したがって、一実施形態において、単球は、処置される対象に対して同種異系である。
【0096】
好適には、単球は、以下の表面マーカー－ＣＤ１４、ＣＤ４５およびＣＤ１９２（ＣＣＲ２）の発現について陽性である。好適には、単離単球は、表面マーカー２５Ｆ９（またはこの抗体によって認識される特定の分子）およびＣＤ２０６の発現が低い。好適には、単球はＣＣＲ２の発現が高い。
【0097】
マクロファージ
本発明は、３～５日間の培養方法によって産生される新規のマクロファージ、および任意に本明細書の方法によって産生される、特定の再生促進特性を有するマクロファージに関する。
本発明は、３～５日間の培養方法によって産生される新規のマクロファージ、および任意に本明細書の方法によって産生される、特定の再生促進特性を有するマクロファージに関する。
【0098】
上述のように、好適には、マクロファージは単球由来マクロファージであり、好適にはヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）である。
好適には、上述のように、本発明のマクロファージを産生するために使用される単球は、処置される対象に対して自己由来であってもよく、したがって、好適には、マクロファージは自己由来であってもよい。したがって、好適には、本発明の方法は、自己由来のマクロファージを産生する方法であってもよく、本発明の医学的方法において使用するためのマクロファージは、自己由来のマクロファージであってもよい。
好適には、上述のように、本発明のマクロファージを産生するために使用される単球は、処置される対象に対して自己由来であってもよく、したがって、好適には、マクロファージは自己由来であってもよい。したがって、好適には、本発明の方法は、自己由来のマクロファージを産生する方法であってもよく、本発明の医学的方法において使用するためのマクロファージは、自己由来のマクロファージであってもよい。
【0099】
好適には、上述のように、本発明のマクロファージを産生するために使用される単球は、処置される対象に対して同種異系であってもよく、したがって好適には、マクロファージは同種異系であってもよい。したがって、好適には、本発明の方法は、同種異系マクロファージを産生する方法であってもよく、本発明の医学的方法において使用するためのマクロファージは、同種異系マクロファージであってもよい。
【0100】
好適には、ほとんどの実施形態において、マクロファージは未分極である。好適には、マクロファージは成熟している。しかしながら、分極工程が産生方法に含まれるいくつかの実施形態において、マクロファージは分極されていてもよく、好適には、Ｍ１様またはＭ２様に分極されていてもよい。
【0101】
一実施形態において、本発明の方法によって産生された自己由来の未分極ｈＭＤＭが提供される。一実施形態において、抗炎症性および抗線維化表現型を有する、本発明の方法によって産生された自己由来の未分極ｈＭＤＭが提供される。
【0102】
一実施形態において、本発明の方法によって産生された同種異系の未分極ｈＭＤＭが提供される。一実施形態において、抗炎症性および抗線維化表現型を有する、本発明の方法によって産生された同種異系の未分極ｈＭＤＭが提供される。
【0103】
好適には、マクロファージおよびマクロファージを含む任意の組成物は、ＧＭＰに準拠している。
好適には、本発明の方法によって産生されたマクロファージは、その方法によって新規である。好適には、さらに、本方法により産生されたマクロファージは、そのサイトカインプロファイルによりそれ自体が新規である。好適には、本発明のマクロファージは、再生促進表現型を有する。好適には、本発明のマクロファージは、抗炎症性表現型を有し得る。好適には、本発明のマクロファージは、抗線維化表現型を有し得る。好適には、マクロファージは、抗炎症性および抗線維化表現型を有し得る。
好適には、本発明の方法によって産生されたマクロファージは、その方法によって新規である。好適には、さらに、本方法により産生されたマクロファージは、そのサイトカインプロファイルによりそれ自体が新規である。好適には、本発明のマクロファージは、再生促進表現型を有する。好適には、本発明のマクロファージは、抗炎症性表現型を有し得る。好適には、本発明のマクロファージは、抗線維化表現型を有し得る。好適には、マクロファージは、抗炎症性および抗線維化表現型を有し得る。
【0104】
好適には、マクロファージは、関連する表現型を提供する、または関連する表現型を示すサイトカインプロファイルを有していてもよい。好適には、本発明のマクロファージは、再生促進サイトカインプロファイルを有する。好適には、本発明のマクロファージは、成熟マクロファージであり、再生促進サイトカインプロファイルを有する。好適には、本発明のマクロファージは、成熟した未分極マクロファージであり、再生促進サイトカインプロファイルを有する。
【0105】
好適には、「サイトカインプロファイル」とは、マクロファージによって発現されるサイトカインの範囲を意味する。典型的には、マクロファージは、以下のサイトカイン：ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１ＲＡ、ＩＬ９、ＴＮＦａ、ＩＬ１３、ＩＬ１０、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７ｃ、およびＩＬ１７Ｆのいずれかを発現することができる。これらのサイトカインのそれぞれの発現レベルは、変動してもよい。好適には、マクロファージは、ｉｎ ｖｉｖｏでの再生および修復を促進するサイトカインプロファイルを有する。好適には、マクロファージは、ｉｎ ｖｉｖｏで炎症を誘発しないおよび／または線維化を誘導しないサイトカインプロファイルを有していてもよい。好適には、マクロファージは、ｉｎ ｖｉｖｏで炎症を低減するおよび／または線維化を低減するサイトカインプロファイルを有していてもよい。
【0106】
好適には、マクロファージは、１つまたは複数の再生促進サイトカインの発現が増加していてもよい。好適には、マクロファージは、１つまたは複数の抗再生サイトカインの発現が低下していてもよい。
【0107】
好適には、マクロファージは、１つもしくは複数の抗炎症性サイトカインの発現が増加していてもよく、および／または、１つもしくは複数の炎症促進性サイトカインの発現が低下していてもよい。好適には、マクロファージは、１つもしくは複数の抗線維化サイトカインの発現が増加していてもよく、および／または、１つもしくは複数の線維化促進サイトカインの発現が低下していてもよい。
【0108】
好適には、マクロファージは、以下のサイトカイン：ＩＬ１、ＩＬ１２、ＩＬ１７（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＩＬ１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＰＤＧＦ、およびＴＧＦβ（１、２、３）の１つまたは複数の発現が低下している。好適には、これらのサイトカインは、抗再生サイトカインと考えることができる。
【0109】
好適には、マクロファージは、以下の炎症性サイトカイン：ＩＬ１、ＩＬ１２、ＩＬ１７（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＩＬ１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγの１つまたは複数の発現が低下している。一実施形態において、マクロファージは、ＩＬ１７Ｆの発現が低下している。
【0110】
好適には、マクロファージは、以下の線維化サイトカイン：ＩＬ４、ＩＬ１３、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ（１、２、３）の１つまたは複数の発現が低下している。一実施形態において、マクロファージは、ＴＧＦβ１の発現が低下している。
【0111】
好適には、抗再生サイトカインの発現は、先行技術の方法によって産生されたマクロファージにおける同じサイトカインの発現レベルと比較して低下している。好適には、炎症性サイトカインおよび線維化サイトカインの発現は、先行技術の方法によって産生されたマクロファージにおける同じサイトカインの発現レベルと比較して低下している。
【0112】
好適には、マクロファージは、７日法などの先行技術の方法によって産生されたマクロファージによるＩＬ１７Ｆの発現と比較して、ＩＬ１７Ｆの発現が少なくとも２５％低い。好適には、マクロファージは、７日法などの先行技術の方法によって産生されたマクロファージによるＩＬ１７Ｆの発現と比較して、ＩＬ１７Ｆの発現が、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％低くてもよい。
【0113】
好適には、マクロファージは、２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好適には１９０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好適には１８０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好適には１７０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好適には１６０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好適には１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＩＬ１７Ｆを発現する。
【0114】
好適には、マクロファージは、７日法などの先行技術の方法によって産生されたマクロファージによるＴＧＦβの発現と比較して、ＴＧＦβの発現が少なくとも２％低い。好適には、マクロファージは、７日法などの先行技術の方法によって産生されたマクロファージによるＴＧＦβの発現と比較して、ＴＧＦβの発現が、少なくとも４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％低くてもよい。
【0115】
好適には、マクロファージは、４５０００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＧＦβ、好適には４４０００ｐｇ／ｍＬ未満、好適には４３０００ｐｇ／ｍＬ未満、好適には４２０００ｐｇ／ｍＬ未満、好適には４１０００ｐｇ／ｍＬ未満、好適には４００００ｐｇ／ｍＬ以下のＴＧＦβを発現する。
【0116】
好適には、マクロファージは、７日法などの先行技術の方法によって産生されたマクロファージによるＶＥＧＦＲ１の発現と比較して、ＶＥＧＦＲ１の発現が少なくとも２０％低い。好適には、マクロファージは、７日法などの先行技術の方法によって産生されたマクロファージによるＶＥＧＦＲ１の発現と比較して、ＶＥＧＦＲ１の発現が少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％低い。
【0117】
好適には、マクロファージは、５０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１００ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１２０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１４０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１６０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、１７０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１を発現している。
【0118】
好適には、マクロファージは、７日法などの先行技術の方法によって産生されたマクロファージによるＩＬ９の発現と比較して、ＩＬ９の発現が少なくとも２０％低い。好適には、マクロファージは、７日法などの先行技術の方法によって産生されたマクロファージによるＩＬ９の発現と比較して、ＩＬ９の発現が少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％低い。
【0119】
好適には、マクロファージは、５００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、３００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、１８０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、１６０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、１４０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、１３０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９を発現する。
【0120】
好適には、マクロファージからのサイトカイン発現レベルは、実施例で説明するように、Ｖ－ｐｌｅｘ技術を使用して所定の分化方法の終了時に細胞培養上清を試験することにより測定される。
【0121】
一実施形態において、抗炎症性および抗繊維化表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージが提供され、マクロファージは、２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆおよび４５０００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＧＦβを発現する。
【0122】
一実施形態において、抗炎症性および抗繊維化表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージが提供され、マクロファージは、約１５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ１７Ｆおよび約４００００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦβを発現する。
【0123】
好適には、これらのサイトカイン発現レベルは、マクロファージの集団の平均である。
好適には、本発明のマクロファージは、成熟マクロファージである。好適には、マクロファージは、予測される成熟マクロファージ細胞表面マーカーを発現する。好適には、本発明のマクロファージは、ＣＤ１４＋、ＣＤ２０６＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ１６９＋、２５Ｆ９＋、およびＣＤ８６＋である。好適には、マクロファージは、ＣＣＲ２－である。
好適には、本発明のマクロファージは、成熟マクロファージである。好適には、マクロファージは、予測される成熟マクロファージ細胞表面マーカーを発現する。好適には、本発明のマクロファージは、ＣＤ１４＋、ＣＤ２０６＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ１６９＋、２５Ｆ９＋、およびＣＤ８６＋である。好適には、マクロファージは、ＣＣＲ２－である。
【0124】
好適には、本発明のマクロファージは、貪食能を有する。好適には、本発明のマクロファージは、成熟マクロファージについて予測される貪食能を有する。好適には、本発明のマクロファージは、１４０分の貪食後に２０～６５の間、１４０分の貪食後に３０～５５の間、１４０分の貪食後に３５～５０の間、１４０分の貪食後に約４０の細胞質ＭＦＩを有する。好適には、細胞質ＭＦＩは、実施例で説明されるように、マクロファージをｐＨ感受性蛍光ビーズと１４０分間インキュベートし、放出された蛍光を測定することによって測定される。
【0125】
好適には、本発明のマクロファージは、炎症性刺激に応答する。好適には、本発明のマクロファージは、炎症性刺激に対して予測される応答を示す。好適には、本発明のマクロファージは、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびＬＰＳなどの炎症刺激に応答する。
【0126】
好適には、本発明のマクロファージは、表面への接着性が低い。好適には、本発明のマクロファージは、先行技術の方法によって産生されたマクロファージよりも、表面への接着性が低い。好適には、本方法によって産生された集団における接着マクロファージの割合は、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満である。好適には、接着細胞の割合は、（インキュベーションおよび洗浄前の播種細胞数／インキュベーションおよび洗浄後の回収細胞数）＊１００によって算出される。好適には、これらの値は、３７℃および５％ＣＯ２において、２時間にわたってプラスチック表面に接着することができるマクロファージの数として算出される。例えば、接着７０％は、プレートに播種したマクロファージの７０％が２時間後に接着していることを意味する。
【0127】
細胞培養バッグ
本発明のマクロファージ、その集団、またはその組成物は、細胞培養バッグ内で産生、すなわち培養し得る。
本発明のマクロファージ、その集団、またはその組成物は、細胞培養バッグ内で産生、すなわち培養し得る。
【0128】
したがって、好適には、本発明の方法の工程（ａ）は、細胞培養バッグ内で行われてもよい。したがって、好適には、単球は、細胞培養バッグ内でマクロファージに分化し得る。したがって、好適には、マクロファージは、細胞培養バッグ内で単球を培養することによって、単球から産生されてもよい。
【0129】
好適には、細胞培養バッグは、ＧＭＰグレードである。
好適には、細胞培養バッグ内の単球の密度は、１×１０６／ｃｍ２～最大４×１０６／ｃｍ２の間、好適には１．５×１０６／ｃｍ２～最大３．５×１０６／ｃｍ２の間、好適には１．７×１０６／ｃｍ２～最大３．２×１０６／ｃｍ２の間、好適には２×１０６／ｃｍ２～最大３×１０６／ｃｍ２の間である。一実施形態において、細胞培養バッグ内の単球の密度は、３×１０６／ｃｍ２である。
好適には、細胞培養バッグ内の単球の密度は、１×１０６／ｃｍ２～最大４×１０６／ｃｍ２の間、好適には１．５×１０６／ｃｍ２～最大３．５×１０６／ｃｍ２の間、好適には１．７×１０６／ｃｍ２～最大３．２×１０６／ｃｍ２の間、好適には２×１０６／ｃｍ２～最大３×１０６／ｃｍ２の間である。一実施形態において、細胞培養バッグ内の単球の密度は、３×１０６／ｃｍ２である。
【0130】
好適には、単球は、上記の密度で細胞培養バッグ内で培養される。
製剤
本発明のマクロファージは、対象の任意の疾患、特に対象の肝臓疾患または傷害の処置に好適に使用される。
製剤
本発明のマクロファージは、対象の任意の疾患、特に対象の肝臓疾患または傷害の処置に好適に使用される。
【0131】
好適には、マクロファージは、対象に投与するための医薬に製剤化される。好適には、医薬への製剤化は、組成物、好適には医薬組成物への製剤化を含んでいてもよい。
好適には、そのような製剤または組成物は液体である。
好適には、そのような製剤または組成物は液体である。
【0132】
好適には、そのような製剤または組成物は、賦形剤または希釈剤などの１つまたは複数の許容される担体を含んでいてもよい。好適には、マクロファージは、１つまたは複数の許容される担体と共に製剤化される。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および特性が、それが組み合わされる活性成分の量、投与経路および他の周知の変数によって規定されることは当業者には認識されるであろう。
【0133】
好適には、製剤または組成物は、例えば、水、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ロウ、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂などの薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。
【0134】
好適には、製剤または組成物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含んでいてもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、例えば、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば生理食塩水および緩衝化媒体が挙げられる。
【0135】
好適には、薬学的に許容される担体としては、０．０１～０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の一般的な非経口担体としては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内担体としては、流体および栄養補給剤、電解質補給剤、例えばリンゲルデキストロースベースのものなどが挙げられる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在し得る。
【0136】
好適には、注射用の製剤または組成物は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌注射用溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含んでいてもよい。このような場合、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流体的であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されるであろう。好適には、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持し得る。
【0137】
本明細書に開示された治療方法における使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）１６ｔｈ ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【0138】
好適には、微生物の作用の防止は、無菌製造技術、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、医薬組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好適であるだろう。注射用組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを製剤または組成物に含むことによってもたらされ得る。
【0139】
適切な賦形剤としては、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）緩衝液（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液）または０．５％ＨＡＳ（ヒトアルブミン血清）を含むＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液；生理食塩水、例えば０．９％生理食塩水または０．５％ＨＡＳを含む０．９％生理食塩水を挙げることができる。
【0140】
好適には、賦形剤は０．５％ＨＡＳを含む０．９％生理食塩水である。
好適には、製剤または組成物は、例えば、抗酸化剤、または防腐剤などの添加剤をさらに含んでいてもよい。好適には、製剤または組成物が凍結されることを意図している場合、製剤または組成物は、ＤＭＳＯなどの凍結保存剤、好適には５～１０％ＤＭＳＯをさらに含んでいてもよい。
好適には、製剤または組成物は、例えば、抗酸化剤、または防腐剤などの添加剤をさらに含んでいてもよい。好適には、製剤または組成物が凍結されることを意図している場合、製剤または組成物は、ＤＭＳＯなどの凍結保存剤、好適には５～１０％ＤＭＳＯをさらに含んでいてもよい。
【0141】
好適には、本発明のマクロファージは、第２の治療剤と組み合わせてもよい。したがって、好適には、本発明のマクロファージは、第２の治療剤と共に医薬に製剤化されてもよい。
【0142】
好適には、第２の治療剤は、肝臓疾患または傷害の処置に有効な他の剤であってもよい。あるいは、第２の治療剤は、線維化の処置に有効な他の剤であってもよい。好適には、肝臓疾患を処置するための第２の治療剤は、例えば、副腎皮質ホルモン、インターフェロン、抗ウイルス剤、胆汁酸、利尿剤、アルブミン、ビタミンＫ、血液製剤、および抗生物質から選択されてもよい。好適には、線維化を処置するための第２の治療剤は、（１５、１６）または（１７）に記載のものなどの抗線維化薬剤から選択し得る。
【0143】
好適には、本発明のマクロファージは、第２および第３の治療剤と組み合わせてもよい。好適には、本発明のマクロファージは、肝臓疾患または傷害の処置に有効な第２の剤、および線維化の治療に有効な第３の治療剤と組み合わせてもよい。
【0144】
好適には、第２の治療剤は、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＣＲ２アンタゴニスト、ＣＣＲ５アンタゴニスト、または二重アンタゴニストであってもよい（１８、１９）。
医学的使用
好適には、本発明のマクロファージは、疾患を処置するための医薬として使用するためのものである。肝臓疾患または傷害の好ましい処置は、本明細書の他の箇所に記載されている。
医学的使用
好適には、本発明のマクロファージは、疾患を処置するための医薬として使用するためのものである。肝臓疾患または傷害の好ましい処置は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0145】
好適には、上記で説明するように、医学的使用のためのマクロファージは、自己由来または同種異系である。
一実施形態において、医薬として使用するための、本発明の方法によって産生された自己由来マクロファージが提供される。一実施形態において、医薬として使用するための、抗炎症性および抗線維化表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成自己由来マクロファージが提供される。好適には、肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
一実施形態において、医薬として使用するための、本発明の方法によって産生された自己由来マクロファージが提供される。一実施形態において、医薬として使用するための、抗炎症性および抗線維化表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成自己由来マクロファージが提供される。好適には、肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
【0146】
一実施形態において、医薬として使用するための、本発明の方法によって産生された同種異系マクロファージが提供される。一実施形態において、医薬として使用するための、抗炎症性および抗線維化表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成同種異系マクロファージが提供される。好適には、肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
【0147】
一実施形態において、医学的使用のためのマクロファージは、分極マクロファージであってもよい。一実施形態において、医薬として使用するための、本発明の方法によって産生された分極マクロファージが提供される。一実施形態において、医薬として使用するための、抗炎症性および抗線維化表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成分極マクロファージが提供される。好適には、肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
【0148】
好適には、マクロファージは、未分極および自己由来であっても、または分極および自己由来であってもよい。好適には、マクロファージは、未分極および同種異系であっても、または分極および同種異系であってもよい。
【0149】
好適には、本発明のマクロファージの医学的使用に関連して本明細書に記載される任意の特徴は、本発明のマクロファージを含む製剤または医薬組成物にも同様に適用され得る。
【0150】
好適には、本発明のマクロファージは、対象における疾患の処置のための医薬として提供し得る。好適には、本発明のマクロファージは、対象における疾患の処置のための医薬として好適であるように製剤化されてもよい。
【0151】
好適な製剤は、本明細書の他の箇所に記載されている。
好適には、マクロファージは、対象に対して非経口的に、好適には静脈内投与するためのものである。好適には、マクロファージは、注射または注入による対象への投与のためのものである。好適には、マクロファージは、末梢静脈を介した対象への静脈内投与のためのものである。
好適には、マクロファージは、対象に対して非経口的に、好適には静脈内投与するためのものである。好適には、マクロファージは、注射または注入による対象への投与のためのものである。好適には、マクロファージは、末梢静脈を介した対象への静脈内投与のためのものである。
【0152】
好適には、マクロファージは、約１０５～１０９細胞、好適には約１０６～１０８細胞、好適には約１０７細胞の用量で対象に投与するためのものである。好適には、適切な用量は、例えば、対象の体重、性別および年齢に基づいて、医学的専門家によって決定し得る。
【0153】
好適には、マクロファージは、単回用量または複数回用量で対象に投与するためのものである。好適には、用量は、間隔を空けて投与し得る。好適には、用量は、例えば、１日３回、１日１回、２日に１回、４日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、数ヶ月に１回、１年に１回投与し得る。
【0154】
一実施形態において、マクロファージは、１ヶ月に１回の間隔で対象に投与するためのものである。一実施形態において、マクロファージは、１ヶ月に１回の間隔で３回用量で対象に投与するためのものである。一実施形態において、マクロファージは、１ヶ月に１回の間隔で１０９個の細胞を３回用量で対象に投与するためのものである。
【0155】
好適には、本発明のマクロファージは、医薬として使用するためのものである。
好適には、本発明のマクロファージは、疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
好適には、本発明のマクロファージは、疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
【0156】
好適には、本発明のマクロファージは、急性または慢性の疾患または傷害の処置における使用のためのものである。好適には、本発明のマクロファージは、急性傷害の処置における使用のためのものである。好適には、本発明のマクロファージは、慢性疾患の処置における使用のためのものである。
【0157】
好適には、本発明のマクロファージは、再生を改善することによる、好適には抗再生サイトカインの発現を低下させることによる、急性または慢性の疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
【0158】
好適には、本発明のマクロファージは、線維化を低減することおよび／または炎症を低減することによる、好適には、線維化促進および／または炎症促進サイトカインの発現を低下させることによる、急性または慢性の疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
【0159】
したがって、好適には、マクロファージは、線維化または炎症性疾患の処置における使用のため、好適には線維化および／または炎症を伴う疾患の処置における使用のためのものであり得る。好適には、トランスフェクトされたマクロファージは、線維化を低減することおよび／または炎症を低減することによる疾患の処置における使用のためのものであり得る。
【0160】
好適には、マクロファージは、任意の炎症性疾患、または任意の線維化疾患の処置における使用のためのものであってもよい。
好適には、マクロファージは、任意の肝臓疾患、腎臓疾患、肺疾患、または筋疾患の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、マクロファージは、肝臓、腎臓、肺、または筋肉における任意の線維化疾患または炎症性疾患の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、トランスフェクトされたマクロファージは、肝臓の任意の線維化疾患または炎症性疾患の処置における使用のためのものであってもよい。
好適には、マクロファージは、任意の肝臓疾患、腎臓疾患、肺疾患、または筋疾患の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、マクロファージは、肝臓、腎臓、肺、または筋肉における任意の線維化疾患または炎症性疾患の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、トランスフェクトされたマクロファージは、肝臓の任意の線維化疾患または炎症性疾患の処置における使用のためのものであってもよい。
【0161】
好適には、マクロファージは、線維化肝臓疾患、線維化腎臓疾患、線維化肺疾患、または線維化筋疾患の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、マクロファージは、炎症性肝臓疾患、炎症性腎臓疾患、炎症性肺疾患、または炎症性筋疾患の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、マクロファージは、線維化および／または炎症を低減することによる、肝臓疾患、腎臓疾患、肺疾患、または筋疾患の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、マクロファージは、線維化肝臓疾患または炎症性肝臓疾患の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、マクロファージは、線維化を低減することおよび／または炎症を低減することによる肝臓疾患の処置における使用のためのものであってもよい。
【0162】
好適な肝臓疾患としては、慢性肝臓疾患、急性肝臓疾患、急性増悪した慢性肝臓疾患、アラジール症候群、アルコール関連肝臓疾患、妊娠の急性脂肪肝、α１アンチトリプシン欠損、自己免疫性肝炎、良性肝臓腫瘍、胆道閉鎖症、バッドキアリ症候群、肝硬変、クリグラーナジャー症候群、嚢胞性線維化関連肝臓疾患、胆石症、ガラクトース血症、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、肝性脳症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、肝腎症候群、妊娠性肝内胆汁うっ滞症（ＩＣＰ）、リソソーム酸性リパーゼ欠損（ＬＡＬ－Ｄ）、肝嚢、肝膿瘍、肝臓癌、新生児黄疸、非アルコール性脂肪性肝臓疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、ポルフィリン症、門脈圧亢進症、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）、レイ症候群、Ｉ型グリコーゲン貯蔵病、ウィルソン病が挙げられる。
【0163】
好適には、肺疾患としては、慢性肺疾患、急性肺疾患、急性増悪した慢性肺疾患、喘息、ＣＯＰＤ、肺炎、肺気腫、肺線維症、肺癌、中皮腫、嚢胞性線維症、結核、呼吸器感染症、肺浮腫、気管支炎、肺塞栓症、肺高血圧、サルコイドーシス、間質性肺疾患、ランゲルハンス細胞組織球症、閉塞性気管支炎、炎症後肺線維症、肺胞タンパク症、特発性肺ヘモシデローシス、肺胞微石症、特発性間質性肺炎、特発性肺線維症、急性間質性肺炎、隠蔽性組織化肺炎、落屑性間質性肺炎、リンパ脈管筋腫症、神経内分泌細胞過形成、肺間質性糖原病、肺胞形成不全、リウマチ性肺疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）誘発性急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、および二次性血球貪食性リンパ組織球症（ｓＨＬＨ）が挙げられる。
【0164】
好適な腎臓疾患としては、慢性腎臓疾患、急性腎臓疾患、急性増悪した慢性腎臓疾患、アブデルハルデン－カウフマン－リグナック症候群（腎性シスチン症）、急性腎不全／急性腎臓傷害、急性葉状腎症、急性リン酸腎症、急性尿細管ネクローシス、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損、見かけのミネラロコルチコイド過剰症候群、泌尿器科管の動静脈奇形および瘻孔、常染色体優性低カルシウム血症、バルデー－ビードル症候群、バーター症候群、ビール心因性多飲症、ビート尿、β－サラセミア腎臓疾患、胆汁円柱腎症、バート－ホッグ－デュベ症候群、Ｃ１ｑ腎症、Ｃ３糸球体症、モノクローン高ガンマグロブリン血症を伴うＣ３糸球体症、Ｃ４糸球体症、ＣＡＫＵＴ（先天性腎尿路異常症）、毛細血管漏出症候群（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｌｅａｋ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心腎症候群、ＣＦＨＲ５腎症、糸球体症を伴うシャルコー－マリー－トゥース病、チャーグ－ストラウス症候群、チロ尿、繊毛症、寒冷利尿、コラーゲン線維性糸球体症、崩壊性糸球体症、先天性腎尿路異常症（ＣＡＫＵＴ）、先天性ネフローゼ症候群、うっ血性腎不全、コノレナル症候群（メインザー－サルディノ症候群またはサルディノ－メインザー病）、造影剤腎症、皮質ネクローシス、クリオクリスタルグロブリン血症、クリオグロブリン血症、結晶貯蔵組織球症、シスチン尿症、緻密沈着症（ＭＰＧＮ２型）、象牙病（Ｘ連鎖劣性腎結石症）、透析平衡症候群、糖尿病および糖尿性腎臓疾患、利尿、薬剤および物質誘導性腎臓疾患、ＥＡＳＴ症候群、異所性腎臓、エルドハイム－チェスター病、ファブリー病、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、ファンコニ症候群、フレーザー症候群、線維性糸球体腎炎および免疫タクト糸球体症、フレーリー症候群、高ボリューム血症、巣状分節性糸球体硬化症、巣状糸球体硬化症、ギャロウェイモワット症候群、高血圧症、ギテルマン症候群、糸球体疾患、糸球体管逆流症、糖尿、グッドパスチャー症候群、ＨＡＮＡＣ症候群、熱ストレス腎症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、血球貪食症候群、出血性膀胱炎、ネフロパティスエピデミカ（Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｉｓ Ｅｐｉｄｅｍｉｃａ）、ヘモジデリン尿症、発作性夜間血色素尿症および溶血性貧血に関連するヘモシデローシス、肝性糸球体症、肝性静脈閉塞疾患、類洞閉塞症候群、Ｃ型肝炎関連腎臓疾患、肝細胞核因子１β関連腎臓疾患、肝腎症候群、ＨＮＦ１Ｂ関連常染色体優性遺伝性尿細管間質性腎臓疾患、馬蹄腎（腎融合症）、ハンナー潰瘍、親水性高分子塞栓症、高アルドステロン症、高カルシウム血症、高カリウム血症、高マグネシウム血症、高ナトリウム血症、高シュウ酸尿症、高リン酸血症、低カルシウム血症、低補体性じんま疹血管炎症候群、低カリウム血症誘導性腎機能障害、低マグネシウム血症、低ナトリウム血症、低リン酸血症、間質性腎炎、感染症誘導性腎臓疾患、イベマルク症候群、ジュベール症候群、腎結石、腎結石症、腎臓癌、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損（ＬＣＡＴ欠損）、リドル症候群、ライトウッド－アルブライト症候群、リポ蛋白糸球体症、狼瘡、全身性エリテマトーデス、リジン尿蛋白不耐症、リゾチーム腎症、悪性腫瘍関連腎臓疾患、マラコプラキア、マッキトリック－ウィーロック症候群、大動脈弁狭窄症、髄様嚢胞腎臓疾患、ウロロデュリン関連腎症、若年性高尿酸血症１型、髄様海綿状腎、ＭＥＬＡＳ症候群、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、メソアメリカン腎症、代謝性アシドーシス、代謝性アルカローシス、顕微鏡的多発血管炎、ミルクアルカライ症候群、ディスプロテイン血症、ＭＵＣ１腎症、多嚢胞性異形成腎、多発性骨髄腫、骨髄増殖性新生物および糸球体症、ネイルパテラ症候群、ＮＡＲＰ症候群、ネフロカルシノーシス、ネフロシスチン－１遺伝子欠失およびＥＳＲＤ、腎性全身性線維症、ネフロシスチン－１遺伝子欠失によるネフロン癆、ネフロプトーシス（浮遊腎、腎臓下垂）、ネフローゼ症候群、結節性糸球体硬化症、くるみ割り人形症候群、オリゴメガネフロニア、オロチン酸尿症、シュウ酸腎症、ページ腎、乳頭ネクローシス、乳頭腎症候群（腎コロボマ症候群、孤立性腎低形成）、腹膜－腎臓症候群、ＰＯＥＭＳ症候群、ポドサイト陥入糸球体症、感染後糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、多嚢胞性腎疾患、後尿道弁、閉塞後利尿症、モノクローンＩｇＧ沈着を伴う増殖性糸球体腎炎（ナスル病）、蛋白尿（尿中蛋白）、偽性高アルドステロン症、偽性低炭酸血症、偽性副甲状腺症、肺－腎症候群、腎盂腎炎（肝臓感染）、腎盂腎症、逆流性腎症、急速進行性糸球体腎炎、腎膿瘍、腎周囲膿瘍、腎欠損、腎弧状静脈微小血栓症関連急性腎臓傷害、腎動脈瘤、腎動脈狭窄症、腎細胞癌、腎嚢胞、腎梗塞、腎骨異栄養症、腎尿細管酸性化症、後腹膜線維症、横紋筋融解症、関節リウマチ関連腎臓疾患、サルコイドーシス腎臓疾患、塩分消耗症、強皮症腎臓危機、蛇行性腓骨－多嚢胞性腎臓症候群、エクスナー症候群、鎌状赤血球腎症、ＴＡＦＲＯ症候群、紅茶トースト低ナトリウム血症、薄層基底膜疾患、家族性良性血尿、モノクローン高ガンマグロブリン血症を伴う血栓性微小血管障害、トレンチ腎炎、トリゴン炎、結核、泌尿器、結節性硬化症、尿細管異形成、近位尿細管ブラシボーダーに対する自己抗体による免疫複合体尿細管間質性腎炎、腫瘍溶解症候群、尿毒症、尿毒症性視神経症、膀胱尿管炎、尿管結節、尿道カルンクル、尿道狭窄、尿路感染症、尿路性器フィステル、ウロモジュリン関連腎臓疾患、血管運動性腎症、膀胱腸瘻、膀胱尿管逆流、ＶＧＥＦ阻害および腎血栓性微小血管症、ウイルス誘導性腎臓疾患、フォンヒッペル－リンドウ病、ワルデンシュトロームマクログロブリン血性糸球体腎炎、ウェゲナー肉芽腫症、多発血管炎性を伴う肉芽腫症、ヴンダーリッヒ症候群、ゼルヴェガー症候群、脳肝腎症候群が挙げられる。
【0165】
好適な筋疾患としては、慢性筋疾患、急性筋疾患、急性増悪した慢性筋疾患、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィー、四肢帯状筋ジストロフィー）、特発性炎症性筋疾患（例えば、皮膚筋炎、多発性筋炎）、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、ミトコンドリアミオパチー、横紋筋融解症、線維筋痛症、捻挫および挫傷、ならびに筋腫瘍、例えば平滑筋腫、横紋筋腫、および横紋筋肉腫が挙げられる。
【0166】
肝臓疾患または傷害
本発明のマクロファージは、好ましくは、肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
本発明のマクロファージは、好ましくは、肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。
【0167】
好適には、本発明のマクロファージは、肝臓疾患または傷害における肝硬変の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、本発明のマクロファージは、肝臓疾患または傷害における炎症および／または線維化の処置における使用のためのものであってもよい。
【0168】
好適には、本発明のマクロファージは、線維化を低減すること、ネクローシスを低減すること、肝細胞増殖を増加すること、ビリルビン血症を低減すること、ＧＬＤＨを低減すること、肝臓：重量比率を増加すること、ＡＳＴレベルを低減すること；および／または炎症を低減することによる（肝機能試験解釈の全詳細は材料および方法に示す）肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものであってもよい。
【0169】
好適には、肝臓疾患または傷害は、慢性、または急性、または急性増悪した慢性であり得る。好適には、急性肝臓疾患または傷害は、原因から２４週間未満で発症した肝臓疾患または傷害として分類し得る。好適には、慢性肝臓疾患は、６ヶ月超持続している肝臓疾患または傷害として分類し得る。好適には、急性増悪した慢性肝臓疾患は、６ヶ月超持続している慢性肝臓疾患を既に有する患者において、原因から２４週間未満で発症した肝臓疾患または傷害として分類し得る。
【0170】
好適には、慢性肝臓疾患／傷害は、以下：Ｃ型肝炎；Ｂ型肝炎；アルコール関連肝臓疾患；非アルコール性脂肪性肝臓疾患；特発性肝硬変；ウィルソン病；自己免疫肝炎；胆管炎；血色素症；およびα１－アンチトリプシン欠損から選択し得る。
【0171】
好適には、マクロファージは、慢性肝臓疾患における線維化および／または炎症を低減することによる肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。好適には、マクロファージは、線維化および／または炎症を低減することによる慢性肝臓疾患の処置における使用のためのものである。
【0172】
好適には、急性肝臓疾患／傷害は、以下：過度のアルコール消費；薬物に対する有害反応；例えば食物、化学物質、毒素による中毒；サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、黄熱などの微生物による感染；妊娠の急性脂肪肝；および薬剤の過剰摂取、例えばアセトアミノフェンの過剰摂取（ＡＰＡＰ）によって引き起こされ得る。
【0173】
好適には、マクロファージは、急性肝臓疾患におけるネクローシスを低減することによる肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。好適には、マクロファージは、ネクローシスを低減することによる急性肝臓疾患の処置における使用のためのものである。
【0174】
好適には、急性肝臓疾患／傷害の処置のためのマクロファージは、分極している。
したがって、好適には、本発明の分極マクロファージは、急性肝臓疾患におけるネクローシスを低減することによる肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、本発明の分極マクロファージは、ネクローシスを低減することによる急性肝臓疾患の処置における使用のためのものである。
したがって、好適には、本発明の分極マクロファージは、急性肝臓疾患におけるネクローシスを低減することによる肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものであってもよい。好適には、本発明の分極マクロファージは、ネクローシスを低減することによる急性肝臓疾患の処置における使用のためのものである。
【0175】
好適には、慢性肝臓疾患／傷害の処置のためのマクロファージは、未分極である。
したがって、好適には、本発明の未分極マクロファージは、慢性肝臓疾患における線維化を低減することによる肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。好適には、本発明の未分極マクロファージは、線維化を低減することによる慢性肝臓疾患の処置における使用のためのものである。
したがって、好適には、本発明の未分極マクロファージは、慢性肝臓疾患における線維化を低減することによる肝臓疾患または傷害の処置における使用のためのものである。好適には、本発明の未分極マクロファージは、線維化を低減することによる慢性肝臓疾患の処置における使用のためのものである。
【0176】
一実施形態において、本発明のマクロファージは、肝硬変の処置における使用のためのものである。
一実施形態において、本発明のマクロファージは、ＡＰＡＰ過剰摂取の処置における使用のためのものである。
一実施形態において、本発明のマクロファージは、ＡＰＡＰ過剰摂取の処置における使用のためのものである。
【0177】
好適には、肝硬変の処置における使用のためのマクロファージは、未分極マクロファージである。
好適には、薬剤過剰摂取の処置における使用のためのマクロファージは、分極マクロファージである。好適には、薬剤過剰摂取の処置における使用のためのマクロファージは、Ｍ２マクロファージである。
好適には、薬剤過剰摂取の処置における使用のためのマクロファージは、分極マクロファージである。好適には、薬剤過剰摂取の処置における使用のためのマクロファージは、Ｍ２マクロファージである。
【0178】
一実施形態において、ＡＰＡＰ過剰摂取の処置における使用のための、本発明の方法によって産生されたＭ２分極マクロファージが提供される。
【0179】
対象
本発明のマクロファージは、それを必要とする対象における疾患を処置するための医薬として使用するためのものである。
本発明のマクロファージは、それを必要とする対象における疾患を処置するための医薬として使用するためのものである。
【0180】
好適には、対象はヒトまたは動物であってよく、好適には、対象はヒトである。好適には、対象は、子供または成人であってよく、好適には、対象は、成人である。
好適には、対象は、処置を必要としている場合がある。したがって、好適には、対象は、疾患を有していても、または疾患を発症するリスクがあってもよい。好適には、対象は、本明細書の上記で定義される肝臓疾患または傷害を有していても、または発症するリスクがあってもよい。
好適には、対象は、処置を必要としている場合がある。したがって、好適には、対象は、疾患を有していても、または疾患を発症するリスクがあってもよい。好適には、対象は、本明細書の上記で定義される肝臓疾患または傷害を有していても、または発症するリスクがあってもよい。
【0181】
好適には、対象は、肝臓疾患または傷害に関連する特定の危険因子、例えば、アルコール中毒、薬物乱用、肥満、自己免疫障害、メタボリック症候群、特定の薬物の服用、有毒化学物質／微生物への曝露を満たす場合がある。
【0182】
好適には、対象は、疾患の症状を有していてもよい。好適には、対象は、肝臓疾患または傷害に関連する症状を有していてもよい。
好適には、対象は、以下の症状：例えば、爪甲剥離、手掌紅斑、血管腫、女性化乳房、精巣萎縮、貧血、頭蓋中膜、眠気、過呼吸、アステリキシス、黄疸、腹水、白骨症、末梢水腫、打撲、呼吸アルカリ症、肝臓肥大、デュピュイトレン拘縮、耳下腺肥大、末梢神経障害およびカイザー－フライシャーリングの１つまたは複数を有していてもよい。
好適には、対象は、以下の症状：例えば、爪甲剥離、手掌紅斑、血管腫、女性化乳房、精巣萎縮、貧血、頭蓋中膜、眠気、過呼吸、アステリキシス、黄疸、腹水、白骨症、末梢水腫、打撲、呼吸アルカリ症、肝臓肥大、デュピュイトレン拘縮、耳下腺肥大、末梢神経障害およびカイザー－フライシャーリングの１つまたは複数を有していてもよい。
【0183】
好適には、対象は、対象の肝臓疾患または傷害の重症度をランク付けするＭＥＬＤスコアを有していてもよい。好適には、対象は、１０～１６の間であるＭＥＬＤスコアを有していてもよい。
【0184】
好適には、対象は、対象の肝臓疾患または傷害の重症度をランク付けするＭＥＬＤスコアを有していてもよい。好適には、対象は、２０未満であるＭＥＬＤスコアを有していてもよく、任意に対象は、１０～１９の間のＭＥＬＤスコアを有していてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0185】
【図1】本発明のプロトコル（５日供給なし）ｖｓ．標準プロトコル（７日＋再供給）の特徴付けを示す。Ａ ２人の異なるドナーからの５日供給なしマクロファージ（５日）および７日＋供給マクロファージ（７日）の代表的写真（明視野、２０×、スケールバー＝２００ｍｍ）；Ｂ ５日供給なしｖｓ．７日＋供給プロトコルの収率。収率の割合（％）は、（回収時のマクロファージ数／播種したマクロファージ数）＊１００として算出される。ダゴスティーノおよびピアソンオムニバス正規性検定を実施した後、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を適用した。ｐ＝０．０６４１；Ｃ ５日供給なしｖｓ．７日＋供給プロトコルの終了時の生存率。割合（％）は、単一細胞ゲートにおけるＤＲＡＱ－ＣＤ４５＋マクロファージの％として算出される。ダゴスティーノおよびピアソンオムニバス正規性検定を実施した後、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を適用した。ｐ＝０．９９；Ｄ～Ｅ ５つの５日供給なしおよび５つの７日＋供給の細胞培養上清の上清のガスクロマトグラフィー結果。グルコース（Ｄ）および乳酸（Ｅ）を測定する。試料が少なすぎるため、ダゴスティーノおよびピアソンオムニバス正規性検定を実施できず：ノンパラメトリックマンホイットニー検定を適用した。ｐ＝０．９９；Ｆ ５日供給なしマクロファージおよび７日＋供給マクロファージの接着特性。接着性細胞の割合（％）は、（インキュベーションおよび洗浄前の播種細胞数／インキュベーションおよび洗浄後の回収細胞数）＊１００として算出される。試料が少なすぎるため、ダゴスティーノおよびピアソンオムニバス正規性検定を実施できず；ノンパラメトリックなウィルコクソン符号付順位和検定を適用した。ｐ＝０．１８７５。
【図2】本発明のプロトコル（５日供給なし）ｖｓ．標準プロトコル（７日＋再供給）のさらなる特徴付けを示す。Ａ Ｖ－Ｐｌｅｘ技術を用いた機能的関連サイトカインの投与量。データはｐｇ／ｍＬで示されている。５日および７日の濃度は、材料および方法で報告されているように算出される。同じドナーを５日および７日のサイトカイン分泌について試験する。データは対応のあるデータに対してｔ－検定を用いて解析される。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；Ｂ 細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析。各ドットはドナーを表す。ＭＦＩ比率は、５日または７日のＭＦＩを培養開始時のＣＤ１４＋単球のＭＦＩで割ることによって算出する。点線は、ＣＤ２０６および２５Ｆ９の７日のマクロファージを処置のために放出するための最小標的比率と考えられている５の比率を表す。データは、対応のないデータに対してｔ－検定を用いて解析される；Ｃ ライブイメージングを用いた貪食アッセイ。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８チャンネルにおけるマクロファージの細胞質ＭＦＩ（すなわち、摂取されたビーズの）の平均±ＳＤを報告する。解析したいずれのデータポイントにおいても有意差はない。データは、二元配置分散分析を用いて解析される。
【図3】本発明のプロトコル（５日供給なし）ｖｓ．標準プロトコル（７日＋再供給）のさらなる特徴付けを示す。Ａ 供給をした、および供給をしない５日および７日のプロトコルの収率。各記号は独立したドナーである；Ｂ ヒト血清ＡＢ型（ｈ血清ＡＢ）を添加した、および添加しない、供給をした、および供給をしない５日および７日のプロトコルの収率；Ｃ ＡｉｍＶ（ＡＶ）またはＴｅｘＭａｃｓ（ＴＭ）中で培養した、供給をした、または供給をしない、血清を添加した、または添加しないｈＭＤＭの細胞培養上清中のグルコースのガスクロマトグラフィー分析。各記号は独立したドナーである；Ｄ ＡｉｍＶ（ＡＶ）またはＴｅｘＭａｃｓ（ＴＭ）中で培養した、供給をした、または供給をしない、血清を添加した、または添加しないｈＭＤＭの細胞培養上清中の乳酸のガスクロマトグラフィー分析。各記号は独立したドナーである；Ｅ 供給をした、および供給をしない、ヒト血清ＡＢ型（ｈ血清ＡＢ）を添加した、および添加しない、５日プロトコルを使用した細胞の生存率；Ｆ 供給なしプロトコルおよび供給プロトコルを使用した２人のドナーにおけるフローサイトメトリーによる生存率の日ごとの解析。
【図4】供給あり、または供給なしの単球のマクロファージへの分化の日ごとの特徴付けを示す。Ａ～Ｈ 細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析。各時点において、各記号は、経時的な単一のドナーからの単球－マクロファージを表す。供給をした、および供給をしない単球－マクロファージは異なる記号（）で表す。ＭＦＩ比率は、Ｘ日目のＭＦＩを培養開始時のＣＤ１４＋単球のＭＦＩで割ることにより算出する。解析する特定のマーカーは、Ｙ軸のラベルに報告されている。
【図5-1】本発明のプロトコル（５日供給なし）ｖｓ．標準プロトコル（７日＋再供給）の特徴付けを示す。Ａ Ｖ－Ｐｌｅｘ技術を用いた機能的関連サイトカインの投与量。データはｐｇ／ｍＬで表されている。５日および７日の分極マクロファージからのデータは、オンラインプラットフォームＭｏｒｐｈｅｕｓを使用してクラスタリングされる。同じドナーを５日および７日のサイトカイン分泌について試験する。擬似カラースケールは淡い灰色から濃い灰色までの範囲であり、任意の所定のタンパク質の最小から最大までの発現を表す。灰色のボックスは、アッセイの検出限界を下回った試料を表す；Ｂ～Ｄ 代表的なサイトカインとケモカインを報告する（それぞれＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＭＣＰ－１、およびＩＬ１０）。各記号は異なるドナーである。データは平均値±ＳＤで示されている。同じ形のドットは、同じキューで分極させた試料を表す；Ｅ～Ｈ 細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析。各記号はドナーを表す。ＭＦＩ比率は、５日または７日の分極ｈＭＤＭのＭＦＩを５日または７日の未分極ｈＭＤＭのＭＦＩで割ることによって算出される。点線は、１の比率を表す：１を超える比率は、分極ｈＭＤＭ ｖｓ未分極ｈＭＤＭの間で上方制御されていることを意味する。１を下回る比率は、下方制御を意味する。
【図5-2】本発明のプロトコル（５日供給なし）ｖｓ．標準プロトコル（７日＋再供給）の特徴付けを示す。Ａ Ｖ－Ｐｌｅｘ技術を用いた機能的関連サイトカインの投与量。データはｐｇ／ｍＬで表されている。５日および７日の分極マクロファージからのデータは、オンラインプラットフォームＭｏｒｐｈｅｕｓを使用してクラスタリングされる。同じドナーを５日および７日のサイトカイン分泌について試験する。擬似カラースケールは淡い灰色から濃い灰色までの範囲であり、任意の所定のタンパク質の最小から最大までの発現を表す。灰色のボックスは、アッセイの検出限界を下回った試料を表す；Ｂ～Ｄ 代表的なサイトカインとケモカインを報告する（それぞれＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＭＣＰ－１、およびＩＬ１０）。各記号は異なるドナーである。データは平均値±ＳＤで示されている。同じ形のドットは、同じキューで分極させた試料を表す；Ｅ～Ｈ 細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析。各記号はドナーを表す。ＭＦＩ比率は、５日または７日の分極ｈＭＤＭのＭＦＩを５日または７日の未分極ｈＭＤＭのＭＦＩで割ることによって算出される。点線は、１の比率を表す：１を超える比率は、分極ｈＭＤＭ ｖｓ未分極ｈＭＤＭの間で上方制御されていることを意味する。１を下回る比率は、下方制御を意味する。
【図6】様々な分化および分極プロトコルの特徴付けを示す。Ａ ｒＩＬ４およびｒＩＬ１３（２０ｎｇ／ｍＬ）の組合せを使用して分極させたｈＭＤＭ Ｄ５およびＤ７の細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析。各記号は独立したドナーである。データはＲＦＩとして報告され、分極ＭＦＩ／未分極ＭＦＩとして算出される。したがって、グラフ上で１に設定された点線は、未分極細胞と比較して特定のマーカーのモジュレーションがないことを表す；Ｂ ＧＭＰ細胞培養バッグ中で異なる密度で培養した５日のｈＭＤＭにおけるＣＤ２０６のフローサイトメトリー解析。ＲＦＩは、５日のｈＭＤＭのＭＦＩをＣＤ１４＋単球のＭＦＩで割ることによって算出される。線は、単一のドナーからのｈＭＤＭにおいて測定されたＲＦＩ値を結合する；Ｃ ＧＭＰ細胞培養バッグ中で異なる密度で培養した５日のｈＭＤＭにおける２５Ｆ９のフローサイトメトリー解析。ＲＦＩは、５日のｈＭＤＭのＭＦＩをＣＤ１４＋単球のＭＦＩで割ることによって算出される。線は、単一のドナーからのｈＭＤＭにおいて測定されたＲＦＩ値を結合する。
【図7】ＧＭＰバッグ中ｖｓ．標準プラスチック中の５日供給なしプロトコルの特徴付けを示す。Ａ ３つの異なる細胞密度：１０６／ｃｍ２、２×１０６／ｃｍ２、および３×１０６／ｃｍ２を使用したＧＭＰバッグ中の５日供給なしプロトコルの収率。各線は、凡例に示すように、単一のドナーからのデータを結合する；Ｂ ３つの異なる細胞密度：１０６／ｃｍ２、２×１０６／ｃｍ２、および３×１０６／ｃｍ２を使用したＧＭＰバッグ中の５日供給なしプロトコルで産生されたｈＭＤＭの生存率。各線は、凡例に示すように、単一のドナーからのデータを結合する；Ｃ ＧＭＰバッグ中ｖｓ．標準プラスチック中の５日供給なしプロトコルの収率。収率の割合（％）は、（回収時のマクロファージ数／播種されたマクロファージ数）＊１００として算出される。ダゴスティーノおよびピアソンオムニバス正規性検定を実施した後、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を適用した；Ｄ ＧＭＰバッグ中ｖｓ．標準プラスチック中の５日供給なしプロトコルの終了時の生存率。割合（％）は、単一細胞ゲートにおけるＤＲＡＱ－ＣＤ４５＋マクロファージの％として算出される。ダゴスティーノおよびピアソンオムニバス正規性検定を実施した後、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を適用した；Ｅ 細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析。各記号はドナーを表す。ＭＦＩ比率は、５日のＭＦＩを培養開始時のＣＤ１４＋単球のＭＦＩで割ることによって算出する。点線は、ＣＤ２０６および２５Ｆ９の７日のマクロファージを処置のために放出するための最小標的比率と考えられている４の比率を表す。データは、対応のないデータに対してｔ－検定を使用して解析される。
【図8】慢性および急性肝臓傷害のマウスモデルにおける５日のｈＭＤＭの注射を示す。Ａ 実験デザイン：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＣＣｌ４を週２回、１２週間注射し、重度の肝臓線維化を誘導する。９週目、１０週目、および１１週目の開始時に５日のｈＭＤＭを注射する。マウスは、マクロファージ療法の最終用量の１週間後に選別する；Ｂ ＰＳＲ染色を、５日のｈＭＤＭまたは生理食塩水で処理した肝臓で行い、染色面積を定量化する。各記号はマウスを表す。６～１０の１０×視野／マウスが定量化されている。ダゴスティーノおよびピアソンオムニバス正規性検定を実施した後、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を適用した。ｐ＝０．１２；Ｃ～Ｄ 選別時の循環血清ＡＬＴ（Ｃ）およびビリルビン（Ｄ）の投与量。各ドットはマウスを表す。ダゴスティーノおよびピアソンオムニバス正規性検定を実施し、その後、不等分散を有する試料に対してウェルチの補正を行い、対応のないデータに対して片側ｔ－検定を行った。ｐは血清ＡＬＴについては有意ではなかったが、５日のｈＭＤＭで処理したマウスで減少する傾向が報告されており（ｐ＝０．０７）；血清ビリルビンは選別時において、５日のｈＭＤＭで処理したマウスで有意に減少した：ビリルビンについては＊ｐ＜０．０５（ｐ＝０．０２）；Ｅ ５日のｈＭＤＭおよび生理食塩水で処理した肝臓の代表的な写真。（１０×、明視野）；Ｆ 実験デザイン：Ｃ５７Ｂｌ／６ ＷＴマウスは、パラセタモール（アセトアミノフェン、ＡＰＡＰ）注射の前に１４時間絶食させた。ＡＡＭに分極した５日のｈＭＤＭをＡＰＡＰ注射後１６時間で注射し、２０時間後（ＡＡＰ注射後３６時間）にマウスを選別する；Ｇ Ｈ＆Ｅ染色を５日のＡＡＭまたは生理食塩水で処理した肝臓において行い、染色面積を定量化する。各ドットはマウスを表す。６～１０の１０×視野／マウスが定量化されている。シャピロ－ウィルク正規性検定を適用し、その後、対応のないデータについてｔ－検定を適用した。ｐ＝０．１３；Ｈ～Ｉ 循環血清ＧＬＤＨおよびＡＳＴの投与量。各ドットはマウスを表す。シャピロ－ウィルク正規性検定を実施し、その後、不等分散を有する試料に対してウェルチの補正を行って対応のないデータに対する片側ｔ－検定を行った。ＧＬＤＨについては＊ｐ＜０．０５（ｐ＝０．０４６）、ＡＳＴについてはｐは有意ではない（ｐ＝０．２６３）。Ｊ ビヒクルまたは５日のＡＡＭで処理した肝臓の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色。
【図9-1】図８で実施したｉｎ ｖｉｖｏ実験の支持データを示す。Ａ ＣＣｌ４処理中、週２回、１２週間、重量をモニターした。マウスごとのデータをプロットしている。ビヒクル処理マウスおよびｈＭＤＭ ５日処理マウスを報告する。Ｂ 肝臓：重量比率は、選別時点で、ビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスでは有意に異なっていない。Ｃ～Ｅ 選別時点の、ビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおけるＡＬＰ（Ｃ）、ビリルビン（Ｄ）およびアルブミン（Ｅ）の血清レベル。Ｆ～Ｈ 選別時点の、ビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける白血球（ＷＢＣ、Ｆ）、赤血球（ＲＢＣ、Ｇ）、およびヘマトクリット（ＨＣＴ、Ｈ）。５日のｈＭＤＭにおいて、ビヒクル処理マウスと比較して、ＲＢＣおよびＨＣＴが減少する傾向があることが報告した。Ｉ～Ｊ 選別時点の、ビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける血清ＩＬ６（Ｉ）およびＩＬ１０（Ｊ）。差は報告されていない。Ａ～Ｊ シャピロ－ウィルク正規性検定が実施され、その後、不等分散を有する試料に対してウェルチの補正を行い、対応のないデータに対して片側ｔ－検定を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。Ｋ 選別時のビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおけるパラセタモール（ＡＰＡＰ）過剰摂取の３６時間後の選別時の肝臓：体重比率。Ｌ 選別時のビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける、選別時の重量減少。Ｍ～Ｏ 選別時のビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける、ＡＬＰ（Ｍ）、ビリルビン（Ｎ）、およびアルブミン（Ｏ）の血清レベル。ビリルビンは、５日のｈＭＤＭ処理した場合、ビヒクル処理マウスと比較して有意に低かった。Ｐ～Ｒ 選別時のビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける白血球（ＷＢＣ、Ｐ）、赤血球（ＲＢＣ、Ｑ）およびヘマトクリット（ＨＣＴ、Ｒ）。Ｋ～Ｒ 不等分散を有する試料についてウェルチの補正を行い、対応のないデータに対して片側ｔ－検定を実施した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。Ｂ～Ｒ 全てのドットは異なるマウスを表す。
【図9-2】図８で実施したｉｎ ｖｉｖｏ実験の支持データを示す。Ａ ＣＣｌ４処理中、週２回、１２週間、重量をモニターした。マウスごとのデータをプロットしている。ビヒクル処理マウスおよびｈＭＤＭ ５日処理マウスを報告する。Ｂ 肝臓：重量比率は、選別時点で、ビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスでは有意に異なっていない。Ｃ～Ｅ 選別時点の、ビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおけるＡＬＰ（Ｃ）、ビリルビン（Ｄ）およびアルブミン（Ｅ）の血清レベル。Ｆ～Ｈ 選別時点の、ビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける白血球（ＷＢＣ、Ｆ）、赤血球（ＲＢＣ、Ｇ）、およびヘマトクリット（ＨＣＴ、Ｈ）。５日のｈＭＤＭにおいて、ビヒクル処理マウスと比較して、ＲＢＣおよびＨＣＴが減少する傾向があることが報告した。Ｉ～Ｊ 選別時点の、ビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける血清ＩＬ６（Ｉ）およびＩＬ１０（Ｊ）。差は報告されていない。Ａ～Ｊ シャピロ－ウィルク正規性検定が実施され、その後、不等分散を有する試料に対してウェルチの補正を行い、対応のないデータに対して片側ｔ－検定を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。Ｋ 選別時のビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおけるパラセタモール（ＡＰＡＰ）過剰摂取の３６時間後の選別時の肝臓：体重比率。Ｌ 選別時のビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける、選別時の重量減少。Ｍ～Ｏ 選別時のビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける、ＡＬＰ（Ｍ）、ビリルビン（Ｎ）、およびアルブミン（Ｏ）の血清レベル。ビリルビンは、５日のｈＭＤＭ処理した場合、ビヒクル処理マウスと比較して有意に低かった。Ｐ～Ｒ 選別時のビヒクルｖｓ．５日のｈＭＤＭ処理マウスにおける白血球（ＷＢＣ、Ｐ）、赤血球（ＲＢＣ、Ｑ）およびヘマトクリット（ＨＣＴ、Ｒ）。Ｋ～Ｒ 不等分散を有する試料についてウェルチの補正を行い、対応のないデータに対して片側ｔ－検定を実施した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。Ｂ～Ｒ 全てのドットは異なるマウスを表す。
【実施例】
【0186】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。実施例は、例示のみを目的とするものであり、いかなる方法においても本発明を限定するものとして意図されるものではなく、またそのように解釈されるべきものでもない。
【0187】
本発明の特定の実施形態は、ここで、以下の非限定的な実施例によって、および上記の図を参照することによって示される。
【0188】
材料および方法
ＧＭＰヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）の細胞培養
スコットランド国立輸血サービス（ＳＮＢＴＳ）から供給された健常なボランティアからのバフィーコート産物から、Ｆｉｃｏｌｌ勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して単球を単離した後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ１４試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた磁気カラム選択を行った。次に、フェノールレッド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含まないＴｅｘＭＡＣＳで、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭＰグレードの組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＭ－ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）の存在下で１～７日間培養して単球を成熟させた。ｈＭＤＭ ５日および７日を、６ウェルマルチウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中で２×１０６／ｃｍ２の密度で培養する。また、ｈＭＤＭ ｄ５をＧＭＰ細胞培養バッグ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で濃度を１×１０６／ｃｍ２、２×１０６／ｃｍ２、および３×１０６／ｃｍ２に上げながら培養する。ｈＭＤＭは、７日間成熟させる場合、３日目に供給した：簡潔に言うと、培養培地体積の半分を各ウェル／バッグに添加し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＭ－ＣＳＦを補充する。５日および７日のｈＭＤＭを、自動カウンター（ＴＣ２０、ＢｉｏＲａｄ）を用いて計数した。
ＧＭＰヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）の細胞培養
スコットランド国立輸血サービス（ＳＮＢＴＳ）から供給された健常なボランティアからのバフィーコート産物から、Ｆｉｃｏｌｌ勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して単球を単離した後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ１４試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた磁気カラム選択を行った。次に、フェノールレッド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含まないＴｅｘＭＡＣＳで、１００ｎｇ／ｍＬのＧＭＰグレードの組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＭ－ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）の存在下で１～７日間培養して単球を成熟させた。ｈＭＤＭ ５日および７日を、６ウェルマルチウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中で２×１０６／ｃｍ２の密度で培養する。また、ｈＭＤＭ ｄ５をＧＭＰ細胞培養バッグ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で濃度を１×１０６／ｃｍ２、２×１０６／ｃｍ２、および３×１０６／ｃｍ２に上げながら培養する。ｈＭＤＭは、７日間成熟させる場合、３日目に供給した：簡潔に言うと、培養培地体積の半分を各ウェル／バッグに添加し、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＭ－ＣＳＦを補充する。５日および７日のｈＭＤＭを、自動カウンター（ＴＣ２０、ＢｉｏＲａｄ）を用いて計数した。
【0189】
フローサイトメトリー
ｈＭＤＭを回収し、３００×ｇ、５分間、室温でスピンした。ｈＭＤＭを１０６／ｍＬの濃度でＰＢＳ＋２．５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％アルブミン（ＰＥＡ）中に再懸濁した。ブロッキングは、ＰＥＡ中のｈＭＤＭをＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に１：１００で、４℃で２０分間インキュベートすることにより実施した。抗体を１：１００の希釈度で細胞懸濁液に添加し、４℃で２０分間インキュベートした（使用した抗体の詳細は、以下の表に報告する）。
ｈＭＤＭを回収し、３００×ｇ、５分間、室温でスピンした。ｈＭＤＭを１０６／ｍＬの濃度でＰＢＳ＋２．５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％アルブミン（ＰＥＡ）中に再懸濁した。ブロッキングは、ＰＥＡ中のｈＭＤＭをＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に１：１００で、４℃で２０分間インキュベートすることにより実施した。抗体を１：１００の希釈度で細胞懸濁液に添加し、４℃で２０分間インキュベートした（使用した抗体の詳細は、以下の表に報告する）。
【0190】
【表1】
【0191】
データは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｖｙｂフローサイトメーターを用いて取得し、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔソフトウェア（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて解析した。
【0192】
Ｖ－ｐｌｅｘサイトカイン投与量
細胞培養上清中のサイトカイン：サイトカインは、ＭＥＳＯ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ １２０上でＶ－ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ５４－Ｐｌｅｘキットを用いて、製造者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の指示に従って解析した。ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３は、製造者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の指示に従ってＭＥＳＯ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ １２０上でＴＧＦ－ｂ Ｖ－ｐｌｅｘキットを用いて解析した。ＩＬ１７ファミリーに属するサイトカイン（ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｆ）を、製造者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の指示に従って、ＭＥＳＯ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ １２０上でＶ－ｐｌｅｘキットを用いて解析した。１０μＬの上清を試験した。結果はｐｇ／ｍＬで示す。培養時間の違い（ｈＭＤＭ ７日は２日間多く、サイトカインを分泌する）、ｈＭＤＭ ７日におけるサイトカインの高い希釈率（３日目の供給の結果、１／３多く培地を受け取る）、および平均収率（ｈＭＤＭ ｄ５の収率はｈＭＤＭ ｄ７より高い）を考慮して数値を調整する。
細胞培養上清中のサイトカイン：サイトカインは、ＭＥＳＯ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ １２０上でＶ－ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ５４－Ｐｌｅｘキットを用いて、製造者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の指示に従って解析した。ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３は、製造者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の指示に従ってＭＥＳＯ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ １２０上でＴＧＦ－ｂ Ｖ－ｐｌｅｘキットを用いて解析した。ＩＬ１７ファミリーに属するサイトカイン（ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｆ）を、製造者（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の指示に従って、ＭＥＳＯ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ １２０上でＶ－ｐｌｅｘキットを用いて解析した。１０μＬの上清を試験した。結果はｐｇ／ｍＬで示す。培養時間の違い（ｈＭＤＭ ７日は２日間多く、サイトカインを分泌する）、ｈＭＤＭ ７日におけるサイトカインの高い希釈率（３日目の供給の結果、１／３多く培地を受け取る）、および平均収率（ｈＭＤＭ ｄ５の収率はｈＭＤＭ ｄ７より高い）を考慮して数値を調整する。
【0193】
マウス実験
ＮＯＤ ＣＢ１７ Ｐｒｋｄｃ／ＳＣＩＤマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから供給され、無菌動物施設内の個別換気ケージに収容し、１０～１４時間の暗／明周期で、食物および水に自由にアクセスできるようにした。全ての手法は、英国内務省ガイドライン（Ａｎｉｍａｌｓ［Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ］Ａｃｔ １９８６）に従って実施した。成体雄マウスに１２週間の期間にわたって、滅菌オリーブ油に溶解した四塩化炭素（ＣＣｌ４）を、最初の１週間は０．２ｍＬ／ｋｇ、残りの１１週間は０．４ｍＬ／ｋｇまで濃度を上昇させながら週２回腹腔内注射して慢性肝臓線維化を誘導した。１８回目のＣＣｌ４注射の１日後（９週間）に、尾静脈を介して５日のｈＭＤＭ（ｎ＝１０）または生理食塩水（ビヒクル、ｎ＝９）のいずれかの注射を受けるようにマウスを無作為に割り当てた。脾臓内経路は、最大限の細胞送達を保証したが、第Ｉ相ＭＡＴＣＨ試験（慢性肝臓線維化患者における７日のｈＭＤＭ）で用いられた投与経路のモデルとはなっていない（１４）。５日のｈＭＤＭを５×１０７細胞／ｍＬの密度で滅菌生理食塩水に懸濁し、３０ゲージ針（Ｍｙｊｅｃｔｏｒ ０．３ｍＬシリンジ、Ｔｅｒｕｍｏ）で０．１ｍＬを注射した。５日のｈＭＤＭの静脈内注射は、１０週目および１１週目で繰り返した。ＣＣｌ４投与はさらに１週間継続した。
ＮＯＤ ＣＢ１７ Ｐｒｋｄｃ／ＳＣＩＤマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから供給され、無菌動物施設内の個別換気ケージに収容し、１０～１４時間の暗／明周期で、食物および水に自由にアクセスできるようにした。全ての手法は、英国内務省ガイドライン（Ａｎｉｍａｌｓ［Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ］Ａｃｔ １９８６）に従って実施した。成体雄マウスに１２週間の期間にわたって、滅菌オリーブ油に溶解した四塩化炭素（ＣＣｌ４）を、最初の１週間は０．２ｍＬ／ｋｇ、残りの１１週間は０．４ｍＬ／ｋｇまで濃度を上昇させながら週２回腹腔内注射して慢性肝臓線維化を誘導した。１８回目のＣＣｌ４注射の１日後（９週間）に、尾静脈を介して５日のｈＭＤＭ（ｎ＝１０）または生理食塩水（ビヒクル、ｎ＝９）のいずれかの注射を受けるようにマウスを無作為に割り当てた。脾臓内経路は、最大限の細胞送達を保証したが、第Ｉ相ＭＡＴＣＨ試験（慢性肝臓線維化患者における７日のｈＭＤＭ）で用いられた投与経路のモデルとはなっていない（１４）。５日のｈＭＤＭを５×１０７細胞／ｍＬの密度で滅菌生理食塩水に懸濁し、３０ゲージ針（Ｍｙｊｅｃｔｏｒ ０．３ｍＬシリンジ、Ｔｅｒｕｍｏ）で０．１ｍＬを注射した。５日のｈＭＤＭの静脈内注射は、１０週目および１１週目で繰り返した。ＣＣｌ４投与はさらに１週間継続した。
【0194】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（８～１０週齢）は、清潔な動物施設内で最低１週間馴化させた。パラセタモール（ＡＰＡＰ）投与前に、マウスを少なくとも１２時間絶食させた。２０：００～２２：００の間に、温めた生理食塩水に溶解したＡＰＡＰ（３５０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに単回注射（ｉ．ｐ．）した。マウスは、加熱キャビネット（２７℃）で朝まで回復させ；ＡＰＡＰ過剰投与から１６時間後に、ｒｈＩＬ４＋ｒｈＩＬ１３（２０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を用いて代替活性化表現型（ＡＡＭ）へ２４時間分極したｈＭＤＭ ５日を投与した。
【0195】
全てのマウスは、確認方法として麻酔の過量摂取およびその後の頸椎脱臼を用いて、指示する時点で選別した。臓器および血液は、さらなる解析のために回収、処理および保存した：肝臓左葉は急速冷凍して－８０℃で保存し；他の肝葉は１０％ホルマリンで８時間固定した後、パラフィンブロックに入れ；腎臓、脾臓、心臓、および肺は１０％ホルマリンで８時間固定した後、パラフィンブロックに入れ；血液はＥｐｐｅｎｄｏｒｆに回収し、８時間沈降させた後、１００００×ｇで１０分間室温でスピンして血清を得、－８０℃で保存し；ＥＤＴＡコーティングチューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に回収した血液を使用して全血３０μＬを回収し、ＣｅｌｌＴａｃ機器（日本光電）を使用した血液学的パラメータの解析に使用した。
【0196】
血清の肝臓機能試験
血清化学検査は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビン、および血清アルブミンを測定することにより実施した。ＡＬＴは市販のキット（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ）を用いて測定した。ＡＳＴおよびＡＬＰは市販のキット（Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。総ビリルビンは、市販のキット（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ）を用いて、Ｐｅａｒｌｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｅ（２０）記載の酸ジアゾ法により測定した。マウス血清アルブミン測定は、市販の血清アルブミンキット（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ）を用いて測定した。全てのキットは、Ｃｏｂａｓ Ｆａｒａ遠心分離解析機（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ）で使用するために適合させた。全てのアッセイについて、測定時間内精度はＣＶ＜４％であった。ＡＬＰ活性を除き、一部の実験では、血漿試料上でアッセイを行った。
血清化学検査は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビン、および血清アルブミンを測定することにより実施した。ＡＬＴは市販のキット（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ）を用いて測定した。ＡＳＴおよびＡＬＰは市販のキット（Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。総ビリルビンは、市販のキット（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ）を用いて、Ｐｅａｒｌｍａｎ ａｎｄ Ｌｅｅ（２０）記載の酸ジアゾ法により測定した。マウス血清アルブミン測定は、市販の血清アルブミンキット（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ）を用いて測定した。全てのキットは、Ｃｏｂａｓ Ｆａｒａ遠心分離解析機（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ）で使用するために適合させた。全てのアッセイについて、測定時間内精度はＣＶ＜４％であった。ＡＬＰ活性を除き、一部の実験では、血漿試料上でアッセイを行った。
【0197】
以下に、急性および慢性モデルにおける肝臓損傷の評価に、どのパラメータがより有用であるかを強調する表を報告する（＋＋＋＝極めて有用；＋＋＝非常に有用；＋＝有用；±＝中程度に有用；－＝有用ではない）。
【0198】
【表2】
【0199】
組織学的解析
ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色およびピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色は、標準プロトコルに従って実施した。組織染色を定量化するための形態画素解析を実施した。ネクローシスおよび線維化をそれぞれ定量化するために、Ｈ＆ＥおよびＰＳＲで染色した切片をＰｏｌａｒｉｓスライドスキャナー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でスキャンして単一の画像を作成した。同じ機械で２回目のスキャンを行って、１０×拡大で１スライドあたり１０～１５視野のマルチスペクトル画像を取得した。マルチスペクトル画像は、ＩｎＦｏｒｍソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、Ｔｒａｉｎａｂｌｅ ＷＥＫＡ Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎモードで解析した。
ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色およびピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色は、標準プロトコルに従って実施した。組織染色を定量化するための形態画素解析を実施した。ネクローシスおよび線維化をそれぞれ定量化するために、Ｈ＆ＥおよびＰＳＲで染色した切片をＰｏｌａｒｉｓスライドスキャナー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でスキャンして単一の画像を作成した。同じ機械で２回目のスキャンを行って、１０×拡大で１スライドあたり１０～１５視野のマルチスペクトル画像を取得した。マルチスペクトル画像は、ＩｎＦｏｒｍソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、Ｔｒａｉｎａｂｌｅ ＷＥＫＡ Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎモードで解析した。
【0200】
統計学的解析
全てのデータは、平均±標準偏差（ＳＤ）で表される。複製数は各図に示されており、各複製は実験的複製ではなく、生物学的複製を表す。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて解析し、グラフを作成する。統計学的検定は、実験の背景にある生物学的疑問に応じて選択した。簡潔には、スチューデントｔ－検定、一元または二元配置分散分析、それに続く適切な事後検定を使用した。使用した検定は、各図面の凡例に記載されている。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意とする。
全てのデータは、平均±標準偏差（ＳＤ）で表される。複製数は各図に示されており、各複製は実験的複製ではなく、生物学的複製を表す。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて解析し、グラフを作成する。統計学的検定は、実験の背景にある生物学的疑問に応じて選択した。簡潔には、スチューデントｔ－検定、一元または二元配置分散分析、それに続く適切な事後検定を使用した。使用した検定は、各図面の凡例に記載されている。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意とする。
【0201】
全てのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、両側検定が考慮される。全てのデータは、Ｐｒｉｓｍ ｖ８を使用して統計学的解析を行う前に、正規分布および等分散性について検定を行った。
【0202】
ＣＣｌ４処理１２週目のＡＬＴ（肝臓損傷を示す）のレベルに関する過去の研究から利用可能なデータに基づいて、慢性ＣＣｌ４モデルの研究で使用するマウス数に関する検出力の算出を行った。ｈＭＤＭで処理した１２週ＣＣｌ４マウスについてｍｕ１を１００、ビヒクル（生理食塩水）で処理した１２週ＣＣｌ４マウスについてｍｕ２を２００とし、シグマは５０と仮定した。閾値０．０５で統計的に有意であると仮定し、所望する検出力を０．８０とした。検出力の算出では、ｎ＝６が返された。これは、各実験で使用したマウスの最小限の数である。ＡＡＭに分極したｈＭＤＭ ５日で２４時間処理したＡＰＡＰ過剰摂取マウスについては、実験時点で利用可能なデータがなかった。本実験はパイロットとして扱ったが、将来は処理したコホートを拡大することを計画している。
【0203】
ヒトマクロファージがＡＰＡＰ過剰摂取およびＣＣｌ４モデルでそれぞれネクローシスおよび線維化を低減するという仮説を検証しているため、全てのｉｎ ｖｉｖｏ実験について片側検定が考慮される。全てのデータは、Ｐｒｉｓｍ ｖ８を使用して統計学的解析を行う前に、正規分布および等分散性について検定を行った。使用した特定の検定は、各図面の凡例に示されている。検出力の算出は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｔ．ｕｂｃ．ｃａで利用可能な無料のオンラインツールを使用して実施した。
【0204】
結果
本発明の分化プロトコルは、現在のゴールドスタンダードの７日プロトコルと比較して、マクロファージの収率および生存率を増加させる
１００ｎｇ／ｍＬのＴｅｘＭａｃｓ培地中で５日間培養した単球（本明細書中では５日と称する）は、明視野顕微鏡検査を用いて観察すると、３日目に再供給を行って７日間培養したもの（現在のゴールドスタンダードプロトコル、本明細書中では７日と称する）と同様の特性を示す（図１Ａ）。５日プロトコルは、７日プロトコルと比較して、収率が高く（図１Ｂ、ｐ＝０．０６）、生存率および代謝が同程度である（図１Ｃ～Ｅ）という強い傾向を示す。細胞療法をｉ．ｖ．輸注で行う際の主な懸念事項の１つは、血流に乗ると細胞が凝集する可能性があることである。本発明者らは、５日プロトコルによって、ｈＭＤＭのプラスチック表面への接着能が向上したかどうかを検討した。５日のｈＭＤＭは、７日のｈＭＤＭと比較して、接着が低下する傾向を示すことが観察された（図１Ｆ、ｐ＝０．１８７５）。
本発明の分化プロトコルは、現在のゴールドスタンダードの７日プロトコルと比較して、マクロファージの収率および生存率を増加させる
１００ｎｇ／ｍＬのＴｅｘＭａｃｓ培地中で５日間培養した単球（本明細書中では５日と称する）は、明視野顕微鏡検査を用いて観察すると、３日目に再供給を行って７日間培養したもの（現在のゴールドスタンダードプロトコル、本明細書中では７日と称する）と同様の特性を示す（図１Ａ）。５日プロトコルは、７日プロトコルと比較して、収率が高く（図１Ｂ、ｐ＝０．０６）、生存率および代謝が同程度である（図１Ｃ～Ｅ）という強い傾向を示す。細胞療法をｉ．ｖ．輸注で行う際の主な懸念事項の１つは、血流に乗ると細胞が凝集する可能性があることである。本発明者らは、５日プロトコルによって、ｈＭＤＭのプラスチック表面への接着能が向上したかどうかを検討した。５日のｈＭＤＭは、７日のｈＭＤＭと比較して、接着が低下する傾向を示すことが観察された（図１Ｆ、ｐ＝０．１８７５）。
【0205】
本発明の分化プロトコルは、成熟した完全に機能的なＧＭＰに準拠したマクロファージの産生をもたらす
プロトコルを短縮し、供給を排除する際の主な懸念事項は、部分的に成熟した、完全な機能を持たないマクロファージが生成されることである。本発明者らは、分化プロトコルの終了時に細胞培養上清を検査するために、高感度５４－ｐｌｅｘプラットフォームを使用して、５日ｖｓ．７日のｈＭＤＭの分泌プロファイルを比較した。本明細書では、急性および慢性肝臓疾患に関与するいくつかのサイトカイン、ケモカイン、および増殖因子の投与量結果を報告する（図２Ａ）（培養時間および収率の差を考慮した補正係数が適用されている）。５日のｈＭＤＭは、以前から共に肝硬変時の有害な作用と関連付けられていた（２１～２４）ＩＬ１７ＦおよびＴＧＦβ１（トランスフォーミング増殖因子β１）のレベルが低下したことを示す。５日のｈＭＤＭは、ＩＬ６、ＩＬ８、およびＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）などのサイトカインを上方制御しないため、これらの細胞は、注射時にサイトカインストームを引き起こす可能性が低く、細胞療法として安全に使用できることが確認された（表５も参照のこと）。
プロトコルを短縮し、供給を排除する際の主な懸念事項は、部分的に成熟した、完全な機能を持たないマクロファージが生成されることである。本発明者らは、分化プロトコルの終了時に細胞培養上清を検査するために、高感度５４－ｐｌｅｘプラットフォームを使用して、５日ｖｓ．７日のｈＭＤＭの分泌プロファイルを比較した。本明細書では、急性および慢性肝臓疾患に関与するいくつかのサイトカイン、ケモカイン、および増殖因子の投与量結果を報告する（図２Ａ）（培養時間および収率の差を考慮した補正係数が適用されている）。５日のｈＭＤＭは、以前から共に肝硬変時の有害な作用と関連付けられていた（２１～２４）ＩＬ１７ＦおよびＴＧＦβ１（トランスフォーミング増殖因子β１）のレベルが低下したことを示す。５日のｈＭＤＭは、ＩＬ６、ＩＬ８、およびＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）などのサイトカインを上方制御しないため、これらの細胞は、注射時にサイトカインストームを引き起こす可能性が低く、細胞療法として安全に使用できることが確認された（表５も参照のこと）。
【0206】
再供給を行わない、より短いプロトコルを使用する主な問題は、ＣＤ２０６（マンノース受容体）、ＣＤ１６３（ヘモグロビン－アプトグロビンスカベンジャー受容体）、およびＣＤ１６９（シアロアドヘシン）などの成熟マクロファージの典型的な細胞表面受容体をいくつか欠くｈＭＤＭが生成されることであろう。より短いプロトコルで生成されたマクロファージは、抗原提示分子（例えば、ＣＤ８６およびＭＨＣクラスＩＩ）の発現が異常である可能性もあり、ＣＣＲ２（Ｃ－Ｃ ケモカイン受容体２型、またはＣＤ１９２）の下方制御に失敗する可能性もある。本発明者らは、５日のｈＭＤＭが７日のｈＭＤＭと同様の細胞表面マーカー発現を有することを本明細書に示す（図２Ｂおよび表１）。現在のところ、臨床用に生成された「成熟」マクロファージ（ＭＨＲＡに準拠した臨床プロトコルによる）を定義する最小限の基準は、ＣＤ２０６および２５Ｆ９（マクロファージの成熟に関連するマーカー）の発現が５倍上昇することである。本発明者らのプロトコルは共にこの条件を満たしている（図２Ｂの点線）。２５Ｆ９は、現在使用されている臨床用の生成物と比較して本発明者らの調製物では強く上方制御されていないが、これは、本発明者らの出発材料が、健常なドナー血液提供から採取された末梢血単核細胞調製物の単球からなり、これが白血球アフェレーシス由来の単球（すなわち、臨床用の７日生成物の生成に用いられるもの）よりも高い２５Ｆ９発現を有するためである。
【0207】
患者に一度移植されたマクロファージの所望の機能の１つは貪食である：貪食は、死細胞または瀕死細胞の除去、腸起源の細菌に対する肝臓のバリア機能の回復、およびマクロファージの表現型の炎症促進型から回復促進型への転換に寄与する。実際、細胞培養時間を短縮し、かつ供給を除去する際の主な懸念事項の１つは、得られたｈＭＤＭの貪食を行う効率が低下することであり得る。５日ｖｓ７日のｈＭＤＭによるザイモサンＡコーティングビーズの貪食をライブイメージング手法を用いて測定したところ、２つのプロトコルで生成したｈＭＤＭは貪食能の点で同等であることが示された（図２Ｃおよび表４）。
【0208】
【表3】
【0209】
【表4】
【0210】
【表5】
【0211】
本発明者らは、低い割合のヒト血清ＡＢ型（０．５％）の存在および／または他の細胞培養培地（ＡｉｍＶ）の使用により、５日のｈＭＤＭの収率および生存率がさらに向上するかどうかを検証した。図３に示すように、収率および生存率に差を特定することはできなかった（図３Ａ～ＢおよびＥ）。また、ＡｉｍＶ培養細胞は、一般的に細胞培養中に凝集を形成しやすいことが観察され、そのため、その使用には大きな安全性の懸念があった。ヒト血清の使用は、５日のｈＭＤＭの収率、生存率、または代謝（図３Ｃ～Ｄ）を向上させないと結論付けた。また、細胞の凝集が懸念されるため、さらなる実験ではＡｉｍＶを使用しないことを決定した。
【0212】
本発明のプロトコルを用いたヒト単球のマクロファージへの日ごとの分化の特徴付け
マクロファージは約１週間培養する必要があるというのが文献上最も一般的な知見であるにもかかわらず、５日のｈＭＤＭが完全に成熟しており、かつ機能的であることが示された。本発明者らは培養５日目以前であっても、成熟マクロファージとのいくつかの特性が存在する可能性があるのではないかと推論した。そのため、２つの異なるドナーからの単球について、細胞表面マーカーの１日ごとのフローサイトメトリーを行った（図４）。本発明者らは、単球を５日間または７日間のいずれか、供給ありまたはなしで培養した。供給をしていない細胞は、５日目で解析を中止した。培養開始後１日目には早くもＣＣＲ２が下方制御され、２日目以降は成熟マクロファージと同等のレベルになることを示すことができた（図４Ｆ）。ＣＤ２０６、２５Ｆ９およびＣＤ１６９などのマーカーは時間と共に増加し、６日目にピークに達した後、７日目には減少する（図４Ｂ、Ｃ、Ｅ）。これらマーカーの上方制御は培養３日目には早くも見られる（図４Ｂ、Ｃ、Ｅ）。このことにより、７日のｈＭＤＭは、ｉｎ ｖｉｖｏに移植された後、最適な治療機能を発揮するには「消費」され過ぎである可能性があるという本発明者らの仮説を補強される。本発明者らの解析により、１００ｎｇ／ｍＬのＭＣＳＦを補充したＴｅｘＭａｃｓで培養したｈＭＤＭは、供給の有無にかかわらず、４日目から成熟細胞と同等の細胞表面マーカー発現を示すことも明らかになった。しかし、ＣＤ１６３（図４Ｄ）の可変的なレベル、およびＣＤ８６（図４Ｇ）の変動レベルから示されるように、４日目において細胞表面マーカーの一部の発現はまだ安定化していない。本発明者らは、４日目の細胞は若年性の細胞であるため、冷凍保存およびトランスフェクションなどの処理の影響をより受けやすいことを特定した。細胞培養中の生存率の解析から、２日目および６日目に低下していることが明らかになる（図４Ｅ）。２日目の低下は、本発明者らの実験で日常的に観察される１００％を下回る収率を説明するものである。６日目の低下は、図１Ｂで報告したように、７日ｖｓ．５日プロトコルで収率がより低下する傾向を正当化し得る。
マクロファージは約１週間培養する必要があるというのが文献上最も一般的な知見であるにもかかわらず、５日のｈＭＤＭが完全に成熟しており、かつ機能的であることが示された。本発明者らは培養５日目以前であっても、成熟マクロファージとのいくつかの特性が存在する可能性があるのではないかと推論した。そのため、２つの異なるドナーからの単球について、細胞表面マーカーの１日ごとのフローサイトメトリーを行った（図４）。本発明者らは、単球を５日間または７日間のいずれか、供給ありまたはなしで培養した。供給をしていない細胞は、５日目で解析を中止した。培養開始後１日目には早くもＣＣＲ２が下方制御され、２日目以降は成熟マクロファージと同等のレベルになることを示すことができた（図４Ｆ）。ＣＤ２０６、２５Ｆ９およびＣＤ１６９などのマーカーは時間と共に増加し、６日目にピークに達した後、７日目には減少する（図４Ｂ、Ｃ、Ｅ）。これらマーカーの上方制御は培養３日目には早くも見られる（図４Ｂ、Ｃ、Ｅ）。このことにより、７日のｈＭＤＭは、ｉｎ ｖｉｖｏに移植された後、最適な治療機能を発揮するには「消費」され過ぎである可能性があるという本発明者らの仮説を補強される。本発明者らの解析により、１００ｎｇ／ｍＬのＭＣＳＦを補充したＴｅｘＭａｃｓで培養したｈＭＤＭは、供給の有無にかかわらず、４日目から成熟細胞と同等の細胞表面マーカー発現を示すことも明らかになった。しかし、ＣＤ１６３（図４Ｄ）の可変的なレベル、およびＣＤ８６（図４Ｇ）の変動レベルから示されるように、４日目において細胞表面マーカーの一部の発現はまだ安定化していない。本発明者らは、４日目の細胞は若年性の細胞であるため、冷凍保存およびトランスフェクションなどの処理の影響をより受けやすいことを特定した。細胞培養中の生存率の解析から、２日目および６日目に低下していることが明らかになる（図４Ｅ）。２日目の低下は、本発明者らの実験で日常的に観察される１００％を下回る収率を説明するものである。６日目の低下は、図１Ｂで報告したように、７日ｖｓ．５日プロトコルで収率がより低下する傾向を正当化し得る。
【0213】
本発明のマクロファージは成熟しており、炎症性のキューに応答することができる
マクロファージの重要な特徴の１つは、炎症性のキューに応答する能力である。ｉｎ ｖｉｖｏのマクロファージは非常に不均質な集団であり、微小環境に応じて異なる極性を獲得することが長い間報告されてきた。５日ｖｓ．７日のｈＭＤＭ分化プロトコルを使用する場合、炎症性のキューへの過敏な応答は懸念事項の１つである。そのため、５日のｈＭＤＭが安全であり、急性または慢性肝炎が進行中の患者に注射した際にサイトカインストームを引き起こす可能性のある細胞を生成しないことを証明することに取り組んだ。
マクロファージの重要な特徴の１つは、炎症性のキューに応答する能力である。ｉｎ ｖｉｖｏのマクロファージは非常に不均質な集団であり、微小環境に応じて異なる極性を獲得することが長い間報告されてきた。５日ｖｓ．７日のｈＭＤＭ分化プロトコルを使用する場合、炎症性のキューへの過敏な応答は懸念事項の１つである。そのため、５日のｈＭＤＭが安全であり、急性または慢性肝炎が進行中の患者に注射した際にサイトカインストームを引き起こす可能性のある細胞を生成しないことを証明することに取り組んだ。
【0214】
この目的のために、５日のｈＭＤＭおよび７日のｈＭＤＭをＩＦＮγ、ＩＦＮγ＋ＬＰＳ、ＩＬ４＋ＩＬ１３、およびＩＬ１０で２４時間刺激した後の上清を回収した。図２で報告したのと同じ５４－ｐｌｅｘ解析を行い、その後、オンラインツールであるＭｏｒｐｈｅｕｓを用いたクラスタリング解析を実施した。データから、ＩＦＮγおよびＩＦＮγ＋ＬＰＳ刺激マクロファージは、未分極マクロファージが５日または７日のどちらのプロトコルで分化したかにかかわらず、共にクラスター化したことが示される。興味深いことに、ＩＬ４＋ＩＬ１３およびＩＬ１０マクロファージは、より抗炎症性、回復促進性の特性を共有するはずだが、未分極マクロファージを得るための細胞培養プロトコルよりも、由来するドナーに基づいて共にクラスター化した（図５Ａ）。急性および慢性肝臓疾患において重要なサイトカインおよびケモカイン（ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＭＣＰ１およびＩＬ１０）をより詳しく検討することにより、５日の未分極マクロファージが炎症性刺激に対して反応する方法では有意差が検出されないことがさらに確認される（図５Ｂ～Ｄ）。これらの結果は、５日のｈＭＤＭ分化プロトコルが、炎症性のキューに過剰反応せず、そのために急性または慢性肝臓疾患の患者に注射した際にサイトカインストームを引き起こす可能性が低い細胞の生成をもたらすことを示す。
【0215】
分極マクロファージは、多くの病態において有益であり、また他の細胞療法の成功も支持し得る。したがって、５日または７日の未分極のｈＭＤＭから分極マクロファージを産生することに関心があり得る。フローサイトメトリーにより、５日および７日のｈＭＤＭが、分極後に同様の細胞表面マーカーを発現しているかどうかを検証した。ＲＦＩは、分極ｈＭＤＭのＭＦＩを未分極ｈＭＤＭのＭＦＩで割ることにより算出した：ＲＦＩ＞１は上方制御を意味し；ＲＦＩ＜１は下方制御を意味する（図５Ｅ～Ｈ）。ＬＰＳで刺激されたマクロファージの主要な特徴は、ＭＨＣ ＩＩ分子（主要組織適合抗原クラスＩＩ）などの抗原提示分子の上方制御である。７日および５日の分極ｈＭＤＭは、共にＭＨＣ ＩＩ分子の増加を示した（図５Ｆ）。ＩＦＮγによる刺激後、７日の分極ｈＭＤＭは、ＩＬ４／ＩＬ１３刺激により誘導されるはずのスカベンジャー受容体であるＣＤ２０６の異常な上方制御を示した。逆に、ＩＦＮγによる５日の分極ｈＭＤＭはこの上方制御を示さなかった（図５Ｅ）。ＩＬ１０刺激では、予測通り５日および７日のｈＭＤＭの両方でＣＤ１６３の上方制御ならびにＣＤ８６およびＭＨＣＩＩの下方制御をもたらした（図５Ｇ）。しかし、ＩＬ４／ＩＬ１３の組合せを使用した場合、５日の分極ｈＭＤＭではＣＤ２０６の有意な上方制御を見ることができなかった（図７Ａ）。本発明者らは、新鮮なＭＣＳＦを加えることで、分極をよりよく支持できるのではないかと推論した。そのため、５日および７日の分極ｈＭＤＭを、ＭＣＳＦの存在下または非存在下で比較した。ＭＣＳＦの添加により、ＩＬ４／ＩＬ１３の５日の分極ｈＭＤＭでＣＤ２０６の上方制御がもたらされた（図５Ｈ）。これらのデータは、５日のｈＭＤＭが炎症性刺激に正常に応答でき、細胞療法に使用する分極ヒトマクロファージを産生するための出発材料として使用できる成熟マクロファージであるという概念を補強する。
【0216】
本発明の分化プロトコルは、ＧＭＰグレードの細胞培養バッグを用いて成熟した完全に機能的なマクロファージの産生をもたらす
臨床用のｈＭＤＭは、細胞培養処理プラスチックでは増殖することができない。通常、臨床用のｈＭＤＭは、ＧＭＰに準拠した細胞培養バッグを用いて培養される。そのため、本発明者らは上記の細胞培養バッグを支持体として用いて、５日供給なしの分化プロトコルの検証を試みた。
臨床用のｈＭＤＭは、細胞培養処理プラスチックでは増殖することができない。通常、臨床用のｈＭＤＭは、ＧＭＰに準拠した細胞培養バッグを用いて培養される。そのため、本発明者らは上記の細胞培養バッグを支持体として用いて、５日供給なしの分化プロトコルの検証を試みた。
【0217】
本発明者らは、ＧＭＰグレードの細胞培養バッグ中の増殖についての重要な要因は、おそらく細胞密度であると推論した：プラスチック中で使用する密度（２×１０６／ｃｍ２）、それより低い密度（１×１０６／ｃｍ２）、およびより高い密度（３×１０６／ｃｍ２）で５日のｈＭＤＭ分化プロトコルを検討した。本発明者らはまた、マクロファージが、分化プロセスの開始時にはより密集した環境で利益を得ることができ、その後は、より低密度の培養条件で利益を得ることができる可能性があると考えた。そのため、単球／マクロファージを３日目まで２×１０６／ｃｍ２で培養した後、培養の最後の２日間は１×１０６／ｃｍ２に希釈した。３×１０６／ｃｍ２を用いた場合、収率の点で最良の結果が得られた（図７Ａ）。１×１０６／ｃｍ２では、生存率が非常に変動性であった。２×１０６／ｃｍ２および３×１０６／ｃｍ２の細胞密度では、解析した全てのドナーで、９０％以上の一貫した生存率が示された（図７Ｂ）。次に、異なる密度において細胞培養バッグ中で培養した５日のｈＭＤＭの成熟マクロファージマーカーの細胞表面発現を比較した。全てのドナー由来の５日のｈＭＤＭはＣＤ２０６の高い発現を示し；１人のドナー（ドナーＳＰ１０５）のみが、現在の放出基準（ＲＦＩ≧４）に適合しない２５Ｆ９のレベルを示した。プロトコル間のばらつきは最小限であった（図６Ｂ、Ｃ）。培養の最後の２日間にマクロファージを希釈しても、２×１０６／ｃｍ２の細胞密度と比較して著しい利点はなかった（図示せず）。１×１０６／ｃｍ２で得られた生存率に関するわずかに最悪の結果は、マクロファージがその分化および増殖にパラクリンシグナルを必要とすることを示している。本発明者らは、２×１０６／ｃｍ２または３×１０６／ｃｍ２の密度が、将来、臨床用の５日のｈＭＤＭの産生に使用することができると結論付けた。
【0218】
次に、プラスチック上で培養したｈＭＤＭを使用して得られた機能的な結果が、細胞培養バッグで培養したｈＭＤＭにも適用できることを確認する必要があった。この目的のために、２×１０６／ｃｍ２の密度の、プラスチックまたはＧＭＰグレードの細胞培養バッグ中の５日のｈＭＤＭ培養物を、収率、生存率、および細胞表面マーカーについて比較を実施した。バッグ中で培養した細胞は、組織培養処理したプラスチックプレートを用いて培養した細胞と同様の収率および生存率を示す（図７Ｃ、Ｄ）。細胞表面マーカーの発現は、バッグ中およびプラスチック中で培養したｄ５ ｈＭＤＭで同様である（図７Ｅおよび表６）。
【0219】
【表6】
【0220】
本発明のマクロファージは急性および慢性肝臓傷害のマウスモデルに注射しても安全である
本発明者らの５日のｈＭＤＭが急性および慢性肝臓傷害の細胞療法に好適な生成物であることを確実に証明するために、マウスモデルでその安全性を試験する必要があった。本発明者らはまた、この療法の有効性の兆候を示すことを目的とした。この目的のため、免疫不全マウスに四塩化炭素（ＣＣｌ４）を週２回、１２週間注射することによって肝硬変を誘導した。９週目、１０週目、および１１週目の初めに、１０６個の５日のｈＭＤＭまたはビヒクル（生理食塩水）を注射した。１週間後にマウスを選別した（図８Ａ）。細胞療法の注射時においても選別前の１週間時点においても、マウスは何の有害事象も示さなかった。処理群のマウスは重量が減少せず、経時的な重量推移および選別時の肝臓：体重比率は対照と同等であった（図９Ａ、Ｂ）。白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、およびヘマトクリット（ＨＣＴ）などの血液学的パラメータも２つのマウス群で同等であり（図９Ｆ、Ｇ、Ｈ）、それによって処理マウスの骨髄への重度の有害作用が排除される。処理マウスではＨＣＴが有意に低下する傾向があり、この傾向は、本療法により成体雄ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（図９Ｈのピンク色の点線）を正常なＨＣＴレベルに回復させることと関連する可能性がある。ＩＬ６およびＩＬ１０などのサイトカインは、２つのマウス群の血漿中で同等のレベルであり（図９Ｉ、Ｊ）、このことから、５日のｈＭＤＭは注射しても安全であり、慢性炎症を起こしているマウスに注射した場合もサイトカインストームを引き起こさないことが確認される。
本発明者らの５日のｈＭＤＭが急性および慢性肝臓傷害の細胞療法に好適な生成物であることを確実に証明するために、マウスモデルでその安全性を試験する必要があった。本発明者らはまた、この療法の有効性の兆候を示すことを目的とした。この目的のため、免疫不全マウスに四塩化炭素（ＣＣｌ４）を週２回、１２週間注射することによって肝硬変を誘導した。９週目、１０週目、および１１週目の初めに、１０６個の５日のｈＭＤＭまたはビヒクル（生理食塩水）を注射した。１週間後にマウスを選別した（図８Ａ）。細胞療法の注射時においても選別前の１週間時点においても、マウスは何の有害事象も示さなかった。処理群のマウスは重量が減少せず、経時的な重量推移および選別時の肝臓：体重比率は対照と同等であった（図９Ａ、Ｂ）。白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、およびヘマトクリット（ＨＣＴ）などの血液学的パラメータも２つのマウス群で同等であり（図９Ｆ、Ｇ、Ｈ）、それによって処理マウスの骨髄への重度の有害作用が排除される。処理マウスではＨＣＴが有意に低下する傾向があり、この傾向は、本療法により成体雄ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（図９Ｈのピンク色の点線）を正常なＨＣＴレベルに回復させることと関連する可能性がある。ＩＬ６およびＩＬ１０などのサイトカインは、２つのマウス群の血漿中で同等のレベルであり（図９Ｉ、Ｊ）、このことから、５日のｈＭＤＭは注射しても安全であり、慢性炎症を起こしているマウスに注射した場合もサイトカインストームを引き起こさないことが確認される。
【0221】
さらに、本発明者らは、有効性の兆候を検出できるかどうかを評価した。この目的のために、処理マウスと対照マウスの血清について、肝機能検査（ＬＦＴ）を実施した。ＡＳＴが低下する傾向を報告したが、ＡＬＴのレベルには差が検出されなかった（図８Ｃ、図９Ｄ）。ＡＬＰとアルブミンのいずれのレベルにも差は検出されなかった（図９Ｃ、Ｅ）。注目すべきことに、ｈＭＤＭ ５日で処理したマウスの血清では、ビリルビンが有意に減少していた（図８Ｄ）。ＡＬＴおよびＡＳＴの循環レベルは、マクロファージの貪食を含む様々な要因によって影響を受ける可能性がある：実際、このプロセスを通じてマクロファージに取り込まれることがある。したがって、有効性を評価するためには、肝組織の線維化の解析が必要である。本発明者らは、処理群および対照群の肝臓切片においてピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色を行い、線維化を定量化した：処理マウスは、線維化が低減する強い傾向を示した（図８Ｂ、Ｅ）。免疫不全マウスは、肝臓再生の重要な要因となる免疫の適応アームを欠いている。そのため、マクロファージ細胞療法によるパラクリン効果の利用において部分的に欠損がある。さらに、損傷に対する免疫応答は野生型マウスと同じ規模ではないため、マクロファージの治療効果を媒介するのに重要なプロセスである微小環境とマクロファージのクロストークが部分的に損なわれている。したがって、循環ＡＳＴおよび肝臓線維化の両方が低減する傾向があり、循環ビリルビンが有意に低下することは、注目すべき結果である。結論として、データから慢性肝臓疾患のモデルにおいて５日のｈＭＤＭを注射することは安全であり、肝臓線維化の低減に部分的に有効であることが示される。
【0222】
研究室での以前の研究では、代替活性化マクロファージ（ＩＬ４／ＩＬ１３分極、本明細書ではＡＡＭと称する）が、パラセタモール（アセトアミノフェン、ＡＰＡＰ）過剰摂取による急性肝臓傷害を包含し、マウスにおける肝臓再生を促進するのに有用であることが示唆された（Ｓｔａｒｋｅｙ Ｌｅｗｉｓ ＰＪ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｈｅｐ、２０２０）。本発明者らは、ＡＰＡＰ過量摂取の細胞療法のための生成物として、図７に記載するように、ＩＬ４／ＩＬ１３＋ＭＣＳＦを用いて分極させた本発明者らの５日のｈＭＤＭを用いて同じデータを反復することを試みた。Ｃ５７Ｂｌ／６免疫適格マウスにおいてＡＰＡＰ過剰摂取を誘導した（図８Ｆ）。本発明者らは以前、７日のｈＭＤＭを投与された健常な免疫適格マウスが、細胞注射後最長１週間まで拒絶反応または毒性の兆候を示さないことを実証した（図示せず）。このことによって、上記の免疫不全マウスの制限を克服するため、安全性および有効性試験には免疫適格マウスを用いることにした。処理マウスは、肝臓：体重比率の上昇および重量減少の増加の傾向を示し（図９Ｋ、Ｌ）、これは安全性の懸念事項となる可能性がある。しかし、ＷＢＣ、ＲＢＣ、およびＨＣＴなどの血液学的パラメータは、２つのマウス群（ＡＡＭ ５日処理ｖｓ．ビヒクル処理）で同等であり（図９Ｐ、Ｑ、Ｒ）、それによって骨髄レベルでの毒性の進行の可能性が排除された。さらに、ＡＬＰおよびアルブミンは２つのマウス群で同程度であり（図９Ｍ、Ｏ）、ＡＡＭ ５日療法による肝臓損傷の悪化が排除された。逆に、マウスは、壊死した組織の損傷の高感度マーカーである循環ＧＬＤＨのレベルが有意に低下していたことを示した（図８Ｈ）。また、Ｈ＆Ｅ切片の画像定量化により評価すると、ＡＡＭ ５日で処理した場合、マウスは、未処理マウスの肝臓と比較して、壊死面積がより小さくなることが示された（図８Ｇ、Ｊ）。有効性のさらなる指標が処理マウスで観察される循環ビリルビンの減少によって示されている（図９Ｎ）。
【0223】
結論として、本発明者らのデータは、ＧＭＰグレードのｈＭＤＭを、現在の標準よりも安価かつ迅速に生成するプロトコルを確立したことを示している。この結果は、細胞培養時間の短縮および供給工程の排除という２つのアプローチを組み合わせることによって達成された。最適な細胞密度、血清非含有Ｔ細胞培地を、ｒＭＣＳＦの支持と共に使用することによって、本分野の現在のゴールドスタンダードである７日のｈＭＤＭより優れた品質の生成物が保証される。特に、５日のｈＭＤＭは、炎症促進性および線維化促進分泌プロファイルが低い（細胞培養上清中のＩＬ１７ＦおよびＴＧＦβのレベルがそれぞれ低い）ことが示される。本分野の文献では、成熟ｈＭＤＭを産生するためには７日が最適な培養期間であることが示されているにもかかわらず、本発明者らの５日のｈＭＤＭ生成物は、７日のｈＭＤＭ生成物と、細胞表面マーカー発現および貪食の点で同等であることが示された。さらに、５日のｈＭＤＭ分化プロトコルは７日のｈＭＤＭプロトコルと比較して、より良い収率を示す。さらに、５日のｈＭＤＭは、ＡＰＡＰ過剰摂取のマウスモデル（急性肝臓傷害）において安全性および有効性が証明され；肝硬変のマウスモデル（慢性肝臓傷害）においても安全性および部分的な有効性が証明された。
【0224】
上記を参照して、本開示は以下の項目にも関することは理解されるであろう：
項目１：マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含み、工程（ａ）が完全に同じ培地中で行われる、方法。
項目２：単球が５日間培養される、項目１に記載の方法。
項目３：培地を再供給または交換する工程を含まない、項目１～２のいずれか一項に記載の方法。
項目４：単球が１×１０６細胞／ｃｍ２～最大１×１０７細胞／ｃｍ２の間の密度で播種される、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
項目５：培地が、Ｘ－Ｖｉｖｏ １０、ＴｅｘＭＡＣＳ、ＡＩＭｖ、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭおよびＤＭＥＭ／Ｆ１２から選択される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
項目６：培地がＴ細胞培地、好ましくはＴｅｘＭＡＣＳである、項目５に記載の方法。
項目７：培地がＣＳＦファミリー、好ましくはＭ－ＣＳＦから選択される１つまたは複数の因子を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
項目８：培地が２５～１５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＭ－ＣＳＦを含む、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
項目９：単球がヒトであり、マクロファージがヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）である、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
項目１０：単球がヒト血液、好ましくはヒト血液のバフィーコート、好ましくはヒト血液のＰＢＭＣ画分に由来する、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
項目１１：工程（ａ）で産生されたマクロファージを、好ましくはＭ１様またはＭ２様マクロファージに分極させる工程をさらに含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２：分極因子、好ましくはＭ１またはＭ２分極因子が培地に添加される、項目１１に記載の方法。
項目１３：Ｍ１分極因子が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、およびＬＰＳなどのＴＬＲアゴニストから選択され；Ｍ２分極因子が、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびポリ（Ｉ：Ｃ）から選択される、項目１２に記載の方法。
項目１４：ＧＭＰに準拠している、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
項目１５：成熟マクロファージの収率が、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％である、項目１～１４の一項に記載の方法。
項目１６：項目１～１５のいずれか一項に記載の方法によって産生されたマクロファージ。
項目１７：再生促進表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージ。
項目１８：１つまたは複数の再生促進サイトカインの発現が増加している、項目１６または１７のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目１９：１つもしくは複数の抗炎症性サイトカインの発現の増加、および／または１つもしくは複数の炎症性サイトカインの発現の低下、および／または１つもしくは複数の抗線維化サイトカインの発現の増加、および／または１つもしくは複数の線維化サイトカインの発現の低下を有する、項目１６～１８のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目２０：以下のサイトカイン：ＩＬ１、ＩＬ１２、ＩＬ１７（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＩＬ１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、好ましくはＩＬ１７Ｆの１つまたは複数の発現が低下している、項目１６～１９のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目２１：以下のサイトカイン：ＩＬ４、ＩＬ１３、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ（１、２、３）、好ましくはＴＧＦβ１の１つまたは複数の発現が低下している、項目１６～２０のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目２２：成熟細胞表面マーカー、好ましくはＣＣＲ２－、ＣＤ１４＋、ＣＤ２０６＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ１６９＋、２５Ｆ９＋、およびＣＤ８６＋を発現する、項目１６～２１のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目２３：項目１６～２２のいずれか一項に記載のマクロファージの集団。
項目２４：項目２３に記載のマクロファージの集団を含む組成物。
項目２５：医薬として使用するための、項目１６～２４のいずれか一項に記載のマクロファージ、集団または組成物。
項目２６：肝臓疾患または傷害の処置における使用のための、項目１６～２４のいずれか一項に記載のマクロファージ、集団、または組成物。
項目２７：肝臓疾患が急性または慢性である、項目２６に記載の使用のためのマクロファージ、集団、または組成物。
項目２８：急性肝臓疾患が薬剤過剰摂取、好ましくはＡＰＡＰ過剰摂取であり、慢性肝臓疾患が肝硬変である、項目２７に記載の使用のためのマクロファージ、集団、または組成物。
項目２９：マクロファージが、平均２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１９０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１８０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１７０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１６０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＩＬ１７Ｆを発現する、項目２３または２４に記載の集団または組成物。
項目３０：マクロファージが、平均４５０００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＧＦβ、好ましくは４４０００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４３０００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４２０００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４１０００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４００００ｐｇ／ｍＬ以下のＴＧＦβを発現する、項目２３、２４または２９に記載の集団または組成物。
項目３１：マクロファージが、平均５０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１２０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１４０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１６０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１７０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１を発現する、項目２３、２４、２９または３０に記載の集団または組成物。
項目３２：マクロファージが、平均５００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは１８０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは１６０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは１４０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは１３０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９を発現する、項目２３、２４および２９～３１のいずれかに記載の集団または組成物。
項目３３：マクロファージが抗炎症性および抗線維化表現型を有し、平均２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆおよび４５０００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＧＦβを発現する、項目２３、２４および２９～３２のいずれかに記載の集団または組成物。
項目３４：マクロファージが抗炎症性および抗線維化表現型を有し、平均約１５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ１７Ｆおよび約４００００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦβを発現する、項目２３、２４および２９～３３のいずれか一項に記載の集団または組成物。
項目３５：ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびＬＰＳの１つまたは複数などの炎症性刺激に応答する、項目１６～２４のいずれかに記載のマクロファージ、集団または組成物。
項目３６：項目１～２２のいずれかに記載のマクロファージ、項目２３に記載の集団、または項目２４に記載の組成物を含む細胞培養バッグ。
項目１：マクロファージを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）単球を培地中で４～５日間培養してマクロファージを産生する工程であって、培地がマクロファージ産生を刺激する１つまたは複数の増殖因子を含む、工程
を含み、工程（ａ）が完全に同じ培地中で行われる、方法。
項目２：単球が５日間培養される、項目１に記載の方法。
項目３：培地を再供給または交換する工程を含まない、項目１～２のいずれか一項に記載の方法。
項目４：単球が１×１０６細胞／ｃｍ２～最大１×１０７細胞／ｃｍ２の間の密度で播種される、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
項目５：培地が、Ｘ－Ｖｉｖｏ １０、ＴｅｘＭＡＣＳ、ＡＩＭｖ、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭおよびＤＭＥＭ／Ｆ１２から選択される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
項目６：培地がＴ細胞培地、好ましくはＴｅｘＭＡＣＳである、項目５に記載の方法。
項目７：培地がＣＳＦファミリー、好ましくはＭ－ＣＳＦから選択される１つまたは複数の因子を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
項目８：培地が２５～１５０ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＭ－ＣＳＦを含む、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
項目９：単球がヒトであり、マクロファージがヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）である、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
項目１０：単球がヒト血液、好ましくはヒト血液のバフィーコート、好ましくはヒト血液のＰＢＭＣ画分に由来する、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
項目１１：工程（ａ）で産生されたマクロファージを、好ましくはＭ１様またはＭ２様マクロファージに分極させる工程をさらに含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２：分極因子、好ましくはＭ１またはＭ２分極因子が培地に添加される、項目１１に記載の方法。
項目１３：Ｍ１分極因子が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、およびＬＰＳなどのＴＬＲアゴニストから選択され；Ｍ２分極因子が、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびポリ（Ｉ：Ｃ）から選択される、項目１２に記載の方法。
項目１４：ＧＭＰに準拠している、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
項目１５：成熟マクロファージの収率が、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％である、項目１～１４の一項に記載の方法。
項目１６：項目１～１５のいずれか一項に記載の方法によって産生されたマクロファージ。
項目１７：再生促進表現型を有するｅｘ ｖｉｖｏ生成マクロファージ。
項目１８：１つまたは複数の再生促進サイトカインの発現が増加している、項目１６または１７のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目１９：１つもしくは複数の抗炎症性サイトカインの発現の増加、および／または１つもしくは複数の炎症性サイトカインの発現の低下、および／または１つもしくは複数の抗線維化サイトカインの発現の増加、および／または１つもしくは複数の線維化サイトカインの発現の低下を有する、項目１６～１８のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目２０：以下のサイトカイン：ＩＬ１、ＩＬ１２、ＩＬ１７（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＩＬ１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、好ましくはＩＬ１７Ｆの１つまたは複数の発現が低下している、項目１６～１９のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目２１：以下のサイトカイン：ＩＬ４、ＩＬ１３、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ（１、２、３）、好ましくはＴＧＦβ１の１つまたは複数の発現が低下している、項目１６～２０のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目２２：成熟細胞表面マーカー、好ましくはＣＣＲ２－、ＣＤ１４＋、ＣＤ２０６＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ１６９＋、２５Ｆ９＋、およびＣＤ８６＋を発現する、項目１６～２１のいずれか一項に記載のマクロファージ。
項目２３：項目１６～２２のいずれか一項に記載のマクロファージの集団。
項目２４：項目２３に記載のマクロファージの集団を含む組成物。
項目２５：医薬として使用するための、項目１６～２４のいずれか一項に記載のマクロファージ、集団または組成物。
項目２６：肝臓疾患または傷害の処置における使用のための、項目１６～２４のいずれか一項に記載のマクロファージ、集団、または組成物。
項目２７：肝臓疾患が急性または慢性である、項目２６に記載の使用のためのマクロファージ、集団、または組成物。
項目２８：急性肝臓疾患が薬剤過剰摂取、好ましくはＡＰＡＰ過剰摂取であり、慢性肝臓疾患が肝硬変である、項目２７に記載の使用のためのマクロファージ、集団、または組成物。
項目２９：マクロファージが、平均２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１９０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１８０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１７０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１６０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆ、好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以下のＩＬ１７Ｆを発現する、項目２３または２４に記載の集団または組成物。
項目３０：マクロファージが、平均４５０００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＧＦβ、好ましくは４４０００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４３０００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４２０００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４１０００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４００００ｐｇ／ｍＬ以下のＴＧＦβを発現する、項目２３、２４または２９に記載の集団または組成物。
項目３１：マクロファージが、平均５０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１２０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１４０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１６０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１、好ましくは１７０ｐｇ／ｍＬ超のＶＥＧＦＲ１を発現する、項目２３、２４、２９または３０に記載の集団または組成物。
項目３２：マクロファージが、平均５００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは１８０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは１６０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは１４０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９、好ましくは１３０ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ９を発現する、項目２３、２４および２９～３１のいずれかに記載の集団または組成物。
項目３３：マクロファージが抗炎症性および抗線維化表現型を有し、平均２００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ１７Ｆおよび４５０００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＧＦβを発現する、項目２３、２４および２９～３２のいずれかに記載の集団または組成物。
項目３４：マクロファージが抗炎症性および抗線維化表現型を有し、平均約１５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ１７Ｆおよび約４００００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦβを発現する、項目２３、２４および２９～３３のいずれか一項に記載の集団または組成物。
項目３５：ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、およびＬＰＳの１つまたは複数などの炎症性刺激に応答する、項目１６～２４のいずれかに記載のマクロファージ、集団または組成物。
項目３６：項目１～２２のいずれかに記載のマクロファージ、項目２３に記載の集団、または項目２４に記載の組成物を含む細胞培養バッグ。
【0225】
参考文献
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【0226】
等価物
当技術分野の当業者は、日常的な実験手法に過ぎないものを使用して、本明細書に記載の特定の実施形態の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。任意の複数の従属請求項または実施例に開示される実施形態の組合せはいずれも本開示の範囲内にあることが意図される。
当技術分野の当業者は、日常的な実験手法に過ぎないものを使用して、本明細書に記載の特定の実施形態の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。任意の複数の従属請求項または実施例に開示される実施形態の組合せはいずれも本開示の範囲内にあることが意図される。
【0227】
参照による組込み
本明細書で参照する特許、特許出願公開および科学的出版物のそれぞれおよび全ての開示は参照によって、その全体が、その図面の内容と同様に本明細書に具体的に組み込まれる。
本明細書で参照する特許、特許出願公開および科学的出版物のそれぞれおよび全ての開示は参照によって、その全体が、その図面の内容と同様に本明細書に具体的に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図】
【図9-2】
【図】
【国際調査報告】