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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-18
(54)【発明の名称】コロナウイルスを治療するための化合物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/05 20060101AFI20230710BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230710BHJP
【ＦＩ】
A61K31/05
A61P31/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022576421
(86)(22)【出願日】2021-06-08
(85)【翻訳文提出日】2023-02-09
(86)【国際出願番号】 EP2021065356
(87)【国際公開番号】W WO2021250038
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】20305633.8
(32)【優先日】2020-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20306279.9
(32)【優先日】2020-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21305623.7
(32)【優先日】2021-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522480274
【氏名又は名称】アプテウス
(71)【出願人】
【識別番号】518057608
【氏名又は名称】ユニベルシテ・ドゥ・リール
(71)【出願人】
【識別番号】305023584
【氏名又は名称】サントル・ナシオナル・ド・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィック
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【住所又は居所原語表記】３ ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ａｎｇｅ， ７５７９４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １６， Ｆｒａｎｃｅ
(71)【出願人】
【識別番号】500248467
【氏名又は名称】アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム）
(71)【出願人】
【識別番号】517347447
【氏名又は名称】サントレ ホスピタリエール ユニベルシテール デ リール
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】ベギャン， テランス
(72)【発明者】
【氏名】デプレ， ブノア
(72)【発明者】
【氏名】ベルザール， サンドリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ブロダン， プリシル
【テーマコード（参考）】
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA17
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZB33
(57)【要約】
本発明は、コロナウイルスによって生じる疾患、特にＣｏｖｉｄ－１９の予防または治療におけるクロフォクトールの使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コロナウイルスによって生じる疾患の予防または治療における使用のためのクロフォクトール。
【請求項2】
上記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、請求項１に記載の使用のためのクロフォクトール。
【請求項3】
上記疾患はＣｏｖｉｄ－１９である、請求項１に記載の使用のためのクロフォクトール。
【請求項4】
少なくとも１種の他の有効成分と組み合わせて投与される、請求項１～３の何れかに記載の使用のためのクロフォクトール。
【請求項5】
上記少なくとも１種の他の有効成分は同時、順次、または所定の期間に亘って投与される、請求項４に記載の使用のためのクロフォクトール。
【請求項6】
少なくとも１種の医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物の形態で投与される、請求項１～５の何れかに記載の使用のためのクロフォクトール。
【請求項7】
必要とする対象にクロフォクトールを投与することを含む、コロナウイルスによって生じる疾患を予防または治療する方法。
【請求項8】
上記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
上記疾患はＣｏｖｉｄ－１９である、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
上記対象に少なくとも１種の他の有効成分を投与することをさらに含む、請求項７～９の何れかに記載の方法。
【請求項11】
上記少なくとも１種の他の有効成分は同時、順次、または所定の期間に亘って投与される、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コロナウイルスによって生じる疾患、特にＣｏｖｉｄ－１９を治療するためのクロフォクトールの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルスはコロナウイルスファミリー（ニドウイルス目）に属し、一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムの大きさが約２６～３２ｋｂであるウイルスを含む。コロナウイルスファミリーは、アルファコロナウイルス（αＣｏＶ）、ベータコロナウイルス（βＣｏＶ）、デルタコロナウイルス（δＣｏＶ）、およびガンマコロナウイルス（γＣｏＶ）を含む。コウモリおよびげっ歯類がαＣｏＶおよびβＣｏＶのリザーバーだと考えられている。現在、δＣｏＶおよびγＣｏＶのリザーバーとなっている動物についてはあまり明らかになっていない。コロナウイルスは、電子顕微鏡下での外観に応じて命名されており、これらのウイルスは、エンベロープ上にスパイク糖タンパク質が存在するため、コロナまたは王冠のように取り囲む尖った構造で覆われているように見える。
【0003】
２１世紀初頭から、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶとしても知られている）という３種のコロナウイルスが種の境界を越えてヒトで致死性の肺炎を発症させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、エンベロープを持つプラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスであって、βＣｏＶ属に属する。この属はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コウモリＳＡＲＳ様ＣｏＶと８９％のヌクレオチド同一性を有し、ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶと８２％の同一性を有する。ヒトに感染し得る他のコロナウイルスは、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨｃｏＶ－ＮＬ６３）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨｃｏＶ－ＯＣ４３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨｃｏＶ－ＨＫＵ１）、およびヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨｃｏＶ－２２９Ｅ）を含む。
【0004】
コロナウイルスの宿主細胞への侵入は、ウイルス表面から突出しているホモ三量体を形成する膜貫通スパイク（Ｓ）糖タンパク質により媒介される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶは、直接の膜融合に加えて、エンドサイトーシス経路から細胞に侵入することができ、このエンドサイトーシス感染がウイルス遺伝子の発現に繋がることが示されている（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００８；１８：２９０－３０１）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２については、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）が細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ介在性侵入を媒介し、この新たに出現したコロナウイルスの機能的受容体として確立されているが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓと同程度の親和性でヒトＡＣＥ２に結合することが示唆されている（Ｃｅｌｌ ２０２０；１８０：２８１－２９２）。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、Ｓタンパク質プライミングに膜貫通プロテアーゼであるセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）を用いることが示されている（Ｃｅｌｌ ２０２０；１８１：２７１－２８０）。
【0005】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の出現および関連疾患Ｃｏｖｉｄ－１９の大流行以来、研究段階にあるかまたは既に市場に出回っている多くの薬剤が、Ｃｏｖｉｄ－１９の作用を治療／軽減する有効性の可能性について試験されてきた。本発明者らの知る限りでは、これらの薬剤はいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両侵入経路、すなわち、エンドサイトーシス侵入および融合侵入が細胞において利用できる場合、許容できる用法用量で感染組織において到達され得る濃度でウイルスサイクルを阻止することが示されなかった。
【0006】
クロフォクトール（２－（２，４－ジクロロベンジル）－４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェノール、ＣＡＳ番号３７６９３－０１－９、ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ ２７９９）は、グラム陽性バクテリアによって生じる感染の治療に適応される静菌性抗生物質であり、最初に、仏国特許出願第２１０１０７６号に記載された。この化合物は、次いで、小胞体ストレス応答経路を活性化することが示され、前立腺癌治療用の有望な薬剤候補となった（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０１４；１７１：４４７８－４４８９）。より最近では、クロフォクトールは、ＥＢＶ溶解性遺伝子発現を活性化すること（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１９；９３（２０）：ｅ００９９８－１９）、およびＫＬＦ１３を活性化して神経膠腫幹細胞の増殖を抑制すること（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９；１２９（８）：３０７２－３０８５）が示された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
このたび、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両侵入経路、すなわち、エンドサイトーシス侵入及び融合侵入が細胞で利用できる場合、クロフォクトールはウイルスサイクルを阻止することが分かった。結果として、クロフォクトールは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって誘発される細胞変性効果を抑制し、かつウイルスに感染した細胞におけるウイルス量を低減させるのに有効であることが分かった。
【0008】
従って、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、またはＨＣｏＶ－２２９Ｅなどのコロナウイルスによって生じる疾患の予防または治療における使用のためのクロフォクトールに関する。本発明はまた、必要とする対象にクロフォクトールを投与することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、またはＨＣｏＶ－２２９Ｅなどのコロナウイルスによって生じる疾患を治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図5】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた、Ｖｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ８１細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム複製に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図6】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた、Ｖｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ８１細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム複製に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図7】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた、Ｖｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２遺伝子により形質導入されたＶｅｒｏ８１細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２量に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図8】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたＣａｌｕ－３細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム複製に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図9】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるクロフォクトールの薬物動態を示す。
【図10】Ｋ１８－ｈＡＣＥ２遺伝子組み換えＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図11】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる２種の変異体に感染させたＶｅｒｏ８１細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム複製に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図12】Ｈｕｈ－７細胞でのＨＣｏＶ－２２９Ｅ－Ｒｌｕｃウイルス増殖阻害に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図13】感染Ｖｅｒｏ８１細胞（下の曲線）およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入された感染Ｖｅｒｏ８１細胞（上の曲線）におけるウイルス分泌に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図14】感染Ｖｅｒｏ８１細胞（上の曲線）およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入された感染Ｖｅｒｏ８１細胞（下の曲線）におけるウイルス複製に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図15】感染させたヒト気管支上皮におけるウイルス分泌に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【図16】感染させたヒト気管支上皮におけるウイルス分泌に及ぼすクロフォクトールの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本開示の文脈において、以後記載する様々な実施形態は組み合わせることができる。
【0011】
第一の態様では、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、またはＨＣｏＶ－２２９Ｅなどのコロナウイルスによって生じる疾患の予防または治療における使用のためのクロフォクトールに関する。特に、クロフォクトールは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスによって生じる疾患の予防または治療に特に好適である。
【0012】
一実施形態では、上記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対応する疾患はＣｏｖｉｄ－１９である。当業者であれば自明であるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体は総称「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」によって包含される。そのような変異体の例としては、Ｄ６１４Ｇ変異を有するＢ．１変異体、それに由来するＢ．１．１．７変異体（「英国」変異体としても知られている）、ニューヨーク市で最初に同定されたＢ．１．５２６変異体、「南アフリカ」変異体としても知られているＢ．１．３５１変異体、「ブラジル」変異体としても知られているＢ．１．１．２４８変異体、特にカリフォルニアで同定されたＢ．１．４２７およびＢ．１．４２９変異体、「インド」変異体としても知られているＢ．１．６１７変異体が挙げられる。
【0013】
一実施形態では、クロフォクトールは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療のためのまたは該治療について研究段階にある少なくとも１種の他の有効成分（小分子または生物学的成分）と組み合わせて投与される。上記少なくとも１種の他の有効成分の投与は、クロフォクトールの投与に対して同時、順次、または所定の期間に亘って行うことができる。
【0014】
一実施形態では、上記少なくとも１種の他の有効成分は、以下から選択される：
アベマシクリブ、アルミトリンビスメシラート、アモジアキン、アナキンラ、アンジオテンシン１－７、アニデュラファンギン、アピキサバン、アスピリン、アバトロンボパグ、アジスロマイシン、バムラニビマブ、バリシチニブ、バゼドキシフェン、ベルバミン、ブレクスピプラゾール、ブロムヘキシン、カモスタット、カナキヌマブ、カシリビマブ、セファランチン、セリチニブ、セチルピリジニウム、クロロキン、クロルプロマジン、シクレソニド、クロミフェンクエン酸塩、コビシスタット、クロコナゾール、シクロスポリン、ダノプレビル、ダルナビル、デキサメタゾン、ジギトキシン、ジゴキシン、ジヒドロアルテミシニン、ジヒドロガンボギン酸、ジルチアゼム、ドロネダロン、ドロタベリン、エバスチン、エルトロンボパグ、エマパルマブ、エテセビマブ、エタベリン、ファビピラビル、フィンゴリモド、フルナリジン、ギルテリチニブ、ハリングトニン、ヘマトポルフィリン、ヘキサクロロフェン、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸塩、イムデビマブ、ＩＭＵ－８３８、インターフェロンβ－１Ａ、インターフェロンβ－１Ｂ、イソオサジン、イソポミフェリン、イソトレチノイン、イバカフトル、イベルメクチン、ＪＳ０１６、ケトコナゾール、リドフラジン、ロペラミド、ロピナビル、ロラタジン、エタボン酸ロテプレドノール、ルストロンボパグ、ＬＹ－ＣｏＶ５５５、メフロキン、メチルプレドニゾロン、モルヌピラビル、ナファモスタット、ニクロサミド、ニタゾキサニド、オマセタキシンメペスクシナート、オサジン、オセルタミビル、オシメルチニブ、オチリマブ、ウアバイン、オキシコナゾール、オキシクロザニド、オザニモド、パパベリン、ペグインターフェロンλ、マレイン酸ペルヘキシリン、ペキシダルチニブ、ＰＦ－０７３２１３３２、フェナゾピリジン、ポリドカノール、ポサコナゾール、プレドニゾン、組み換えヒトインターフェロンα１β、組み換えインターフェロンα－２ｂ、レゴラフェニブ、レムデシビル、リバビリン、リトナビル、ルキソリチニブ、シタグリプチン、ソフォスブビル、ソニデギブ、ソラフェニブ、タモキシフェン、タリドミド、チメロサール、チオリダジン、サイモシンα１、チロロン、チオグアニン、トシリズマブ、トレミフェン、トリパラノール、チルホスチン、ウミフェノビル。
アベマシクリブ、アルミトリンビスメシラート、アモジアキン、アナキンラ、アンジオテンシン１－７、アニデュラファンギン、アピキサバン、アスピリン、アバトロンボパグ、アジスロマイシン、バムラニビマブ、バリシチニブ、バゼドキシフェン、ベルバミン、ブレクスピプラゾール、ブロムヘキシン、カモスタット、カナキヌマブ、カシリビマブ、セファランチン、セリチニブ、セチルピリジニウム、クロロキン、クロルプロマジン、シクレソニド、クロミフェンクエン酸塩、コビシスタット、クロコナゾール、シクロスポリン、ダノプレビル、ダルナビル、デキサメタゾン、ジギトキシン、ジゴキシン、ジヒドロアルテミシニン、ジヒドロガンボギン酸、ジルチアゼム、ドロネダロン、ドロタベリン、エバスチン、エルトロンボパグ、エマパルマブ、エテセビマブ、エタベリン、ファビピラビル、フィンゴリモド、フルナリジン、ギルテリチニブ、ハリングトニン、ヘマトポルフィリン、ヘキサクロロフェン、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシプロゲステロンカプロン酸塩、イムデビマブ、ＩＭＵ－８３８、インターフェロンβ－１Ａ、インターフェロンβ－１Ｂ、イソオサジン、イソポミフェリン、イソトレチノイン、イバカフトル、イベルメクチン、ＪＳ０１６、ケトコナゾール、リドフラジン、ロペラミド、ロピナビル、ロラタジン、エタボン酸ロテプレドノール、ルストロンボパグ、ＬＹ－ＣｏＶ５５５、メフロキン、メチルプレドニゾロン、モルヌピラビル、ナファモスタット、ニクロサミド、ニタゾキサニド、オマセタキシンメペスクシナート、オサジン、オセルタミビル、オシメルチニブ、オチリマブ、ウアバイン、オキシコナゾール、オキシクロザニド、オザニモド、パパベリン、ペグインターフェロンλ、マレイン酸ペルヘキシリン、ペキシダルチニブ、ＰＦ－０７３２１３３２、フェナゾピリジン、ポリドカノール、ポサコナゾール、プレドニゾン、組み換えヒトインターフェロンα１β、組み換えインターフェロンα－２ｂ、レゴラフェニブ、レムデシビル、リバビリン、リトナビル、ルキソリチニブ、シタグリプチン、ソフォスブビル、ソニデギブ、ソラフェニブ、タモキシフェン、タリドミド、チメロサール、チオリダジン、サイモシンα１、チロロン、チオグアニン、トシリズマブ、トレミフェン、トリパラノール、チルホスチン、ウミフェノビル。
【0015】
一実施形態では、クロフォクトールは、（クロフォクトールに加えて）少なくとも１種の医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物の形態で投与される。賦形剤、医薬組成物、およびそれらの調製方法は当該分野でよく知られている（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ，ｓｅｖｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｕｎｅ ２０１２；Ｒｕｌｅｓ ａｎｄ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒｓ ２０５，Ｍｅｄｅｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｇｅｎｃｙ，Ｌｏｎｄｏｎ ＵＫを参照のこと）。
【0016】
他の態様では、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、またはＨＣｏＶ－２２９Ｅなどのコロナウイルスによって生じる疾患を予防または治療する方法に関する。この方法は、必要とする対象にクロフォクトールを投与することを含む。実施形態によっては、上記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。実施形態によっては、上記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対応する疾患はＣｏｖｉｄ－１９である。
【0017】
現在のクロフォクトールの投与経路は直腸経路である。１００ｍｇ、２００ｍｇ、または７５０ｍｇのクロフォクトールを含む座薬は、好適な医薬的に許容可能な賦形剤を用いて調製することができる。
【0018】
一実施形態では、上記対象は、過体重、肥満、糖尿病、脂質異常症、動脈高血圧症、心臓血管疾患、慢性腎臓病、免疫抑制のうち１つ以上の症状または疾患を有する。
【0019】
一実施形態では、上記方法は、少なくとも１種の他の有効成分を上記対象に投与することをさらに含む。上記少なくとも１種の他の有効成分の投与は、クロフォクトールの投与に対して同時、順次、または所定の期間に亘って行うことができる。
【0020】
一実施形態では、上記少なくとも１種の他の有効成分は上で定義した通りである。
【0021】
クロフォクトールは、Ｖｅｒｏ８１細胞の他、ＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ８１細胞およびヒトＣａｌｕ－３細胞においてｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の細胞変性効果を抑制することが示されている。Ｖｅｒｏ８１細胞は、エンドサイトーシスに基づく侵入路によりウイルスに対して許容状態である。ＴＭＰＲＳＳ２により形質導入された場合、Ｖｅｒｏ８１細胞はエンドサイトーシスおよび融合という２つの侵入路によりウイルスに対して許容状態になる。クロフォクトールはまた、同細胞、および同様にウイルスに対して両侵入を提供するヒトＣａｌｕ－３細胞におけるウイルスゲノム複製を阻害することが示されている。クロフォクトールはさらに、ウイルスに感染させた細胞培養物（Ｖｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ８１細胞）のウイルス量を低減させることが示されている。クロフォクトールはさらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたマウス（Ｋ１８－ｈＡＣＥ２）の肺におけるウイルス量を低減させることが示されている。クロフォクトールはさらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる２つの変異体のウイルスゲノム複製を阻害することが示されている。クロフォクトールはさらに、α－コロナウイルスであるＨＣｏＶ－２２９Ｅの複製を阻害することが示されている。
【0022】
以下の実施例は例示の目的で含められたもので、いかなる形であっても限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【0023】
ウイルスの単離および増幅
ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）を患者の試料から単離して、βＣｏＶ／Ｆｒａｎｃｅ／ＩＤＦ０３７２／２０２０と注記を付けた。これをインビトロで用いて、ＴＭＰＲＳＳ２を発現するＶＥＲＯ－８１細胞において増殖させ、プレートで培養し、細胞単層が完全に崩壊するまでインキュベートした。Ｂ１．１．７系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＧＩＳＡＩＤ登録番号ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１６５３９３１）は、インビトロで用いられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の第二の変異体である。回収後、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を補充したＤＭＥＭでインキュベートしたＶＥＲＯ－８１細胞に分配した上清の１０倍の連続希釈液（１０－１～１０－８）によって、ウイルス力価測定を行った。プレートを５％ＣＯ２、３７℃で５日間インキュベートした。その後、倒立顕微鏡（ＺＥＩＳＳ Ｐｒｉｍｏｖｅｒｔ）を用いてプレートを調べて、細胞培養物におけるウイルス誘発細胞変性効果の程度を評価した。推定ウイルス濃度の計算は、スピアマン－カーバー法によって行い、ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（５０％組織培養物感染用量、すなわち、感染細胞の５０％で細胞変性効果が得られるウイルス量）として表した。この方法の検出限界は１．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
ヒトコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）を患者の試料から単離して、βＣｏＶ／Ｆｒａｎｃｅ／ＩＤＦ０３７２／２０２０と注記を付けた。これをインビトロで用いて、ＴＭＰＲＳＳ２を発現するＶＥＲＯ－８１細胞において増殖させ、プレートで培養し、細胞単層が完全に崩壊するまでインキュベートした。Ｂ１．１．７系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＧＩＳＡＩＤ登録番号ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１６５３９３１）は、インビトロで用いられたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の第二の変異体である。回収後、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を補充したＤＭＥＭでインキュベートしたＶＥＲＯ－８１細胞に分配した上清の１０倍の連続希釈液（１０－１～１０－８）によって、ウイルス力価測定を行った。プレートを５％ＣＯ２、３７℃で５日間インキュベートした。その後、倒立顕微鏡（ＺＥＩＳＳ Ｐｒｉｍｏｖｅｒｔ）を用いてプレートを調べて、細胞培養物におけるウイルス誘発細胞変性効果の程度を評価した。推定ウイルス濃度の計算は、スピアマン－カーバー法によって行い、ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（５０％組織培養物感染用量、すなわち、感染細胞の５０％で細胞変性効果が得られるウイルス量）として表した。この方法の検出限界は１．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【0024】
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｈＣｏＶ－１９＿ＩＰＬ＿Ｆｒａｎｃｅ株（ＮＣＢＩ ＭＷ５７５１４０）をインビトロおよびインビボの実験で用いた。ＴＭＰＲＳＳ２を発現するＶｅｒｏ－Ｅ６細胞においてＭＯＩ０．０１で接種してウイルスを伝播させた。細胞上清培地を感染後７２時間目に回収して、少量ずつに分けて－８０℃で冷凍貯蔵した。
【0025】
ＴＭＰＲＳＳ２形質導入
Ｖｅｒｏ－８１細胞を、ＴＭＰＲＳＳ２を発現するレンチウイルスにより形質導入した。ＴＭＰＲＳＳ２をｐＴＲＩＰベクターにクローニングして、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を用い、製造者の指示に従って、ｐＴＲＩＰ－ＴＭＰＲＳＳ２、ｐｈＣＭＶ－ＶＳＶＧ、およびＨＩＶ ｇａｇ－ｐｏｌによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞の遺伝子導入を行ってレンチウイルスベクターを作製した。レンチウイルスベクターを含む上清を用いて細胞に形質導入した。そして、形質導入の７２時間後に細胞を実験で用いた。
Ｖｅｒｏ－８１細胞を、ＴＭＰＲＳＳ２を発現するレンチウイルスにより形質導入した。ＴＭＰＲＳＳ２をｐＴＲＩＰベクターにクローニングして、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を用い、製造者の指示に従って、ｐＴＲＩＰ－ＴＭＰＲＳＳ２、ｐｈＣＭＶ－ＶＳＶＧ、およびＨＩＶ ｇａｇ－ｐｏｌによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞の遺伝子導入を行ってレンチウイルスベクターを作製した。レンチウイルスベクターを含む上清を用いて細胞に形質導入した。そして、形質導入の７２時間後に細胞を実験で用いた。
【0026】
細胞変性効果の測定
細胞培養
５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でベロ細胞［ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８１（商標）、ＥＣＡＣＣ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、仏国、以後、「Ｖｅｒｏ８１」細胞］を培養した。
細胞培養
５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でベロ細胞［ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８１（商標）、ＥＣＡＣＣ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、仏国、以後、「Ｖｅｒｏ８１」細胞］を培養した。
【0027】
熱で非活性化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｅｕｒｏｂｉｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）でＨｕｈ－７細胞を３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。
【0028】
ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）および熱で非活性化された１０％ＦＢＳを補充した最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ、ＭＥＭ）でＣａｌｕ－３細胞（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＥＰ－ＣＬ－００５４）を増殖させた。
【0029】
熱で非活性化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｅｕｒｏｂｉｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）でＶｅｒｏ－Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５８６）を３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。
【0030】
試験化合物：実験で所望の濃度になるのに必要な濃度でクロフォクトールのＤＭＳＯ溶液を調製した。溶液を生細胞に分注した。ＤＭＳＯの最大濃度は０．１５％であった。
【0031】
細胞感染：様々な濃度のクロフォクトールまたは対照溶媒を加えた後、細胞を感染させた。感染倍数は０．０１であった。
【0032】
試薬：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２トリヒドロクロリド三水和物（Ｒｅｆ Ｈ３５７０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）およびヨウ化プロピジウム（Ｒｅｆ Ｐ１３０４ＭＰ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をそれぞれ１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌで用いて、クロフォクトールのウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）を監視した。これらはいずれも、７２時間インキュベートした後に加えた。
【0033】
細胞に作用するウイルスの毒性を代替するＰＩ陽性核の割合（％）、およびウイルスによって及ぼされる細胞増殖阻害に対応する核の数を分析することで結果を得た。
【0034】
ウイルスゲノム複製の測定
細胞培養：５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でＶｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ－８１細胞を培養した。
細胞培養：５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でＶｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ－８１細胞を培養した。
【0035】
試験化合物：実験で所望の濃度になるのに必要な濃度でクロフォクトールのＤＭＳＯ溶液を調製した。溶液を生細胞に分注した。ＤＭＳＯの最大濃度は０．１５％であった。
【0036】
細胞感染：様々な濃度のクロフォクトールまたは対照溶媒を加えた後、細胞を感染させた。感染倍数は０．２５であった。
【0037】
ウイルス量を代替する、全細胞ＲＮＡに関連するウイルスＲＮＡを投与することにより結果を得た。
【0038】
ＲＮＡ投与：６時間インキュベーションした後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を製造者によって推奨されているように使用して全細胞ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ－ＰＣＲによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムを測定した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＲＮＡを逆転写した。次いで、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３にてＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。Ｅ遺伝子のオープンリーディングフレームを標的とするプライマーおよびプローブ（ＷＨＯプロトコル）を用いた。単位複製配列に対応するインビトロ転写ＲＮＡを用いて標準曲線を作成した。
【0039】
インビトロのウイルス量の決定
Ｖｅｒｏ－８１およびＶｅｒｏ－８１－ＴＭＰＲＳＳ２細胞をＭＯＩ０．２５で１時間感染させ、次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、さらに、クロフォクトールの濃度を増加させながらその存在下で１６時間インキュベートした。それぞれの条件を２連で行った。細胞上清を回収して、ウイルス力価をＴＣＩＤ５０法で測定した。
Ｖｅｒｏ－８１およびＶｅｒｏ－８１－ＴＭＰＲＳＳ２細胞をＭＯＩ０．２５で１時間感染させ、次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、さらに、クロフォクトールの濃度を増加させながらその存在下で１６時間インキュベートした。それぞれの条件を２連で行った。細胞上清を回収して、ウイルス力価をＴＣＩＤ５０法で測定した。
【0040】
マウスの肺におけるウイルス量の決定
肺におけるウイルス量を決定するために、ミキサーミルＭＭ４００（Ｒｅｔｓｃｈ）（１５分－１５Ｈｚ）を用いて、１ｍＬのＰＢＳを含むＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄ管（ｍｐｂｉｏ）中で右葉の半分をホモジナイズした。１１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ウイルス力価測定のために清澄上清を回収した。１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭにて上清の各希釈を行い、ＴＣＩＤ５０アッセイのために各希釈液を９６ウェルプレート内のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に移した。
肺におけるウイルス量を決定するために、ミキサーミルＭＭ４００（Ｒｅｔｓｃｈ）（１５分－１５Ｈｚ）を用いて、１ｍＬのＰＢＳを含むＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄ管（ｍｐｂｉｏ）中で右葉の半分をホモジナイズした。１１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ウイルス力価測定のために清澄上清を回収した。１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭにて上清の各希釈を行い、ＴＣＩＤ５０アッセイのために各希釈液を９６ウェルプレート内のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に移した。
【0041】
ＲＴｑＰＣＲによる遺伝子発現の評価
２０ｍＭのＴＣＥＰを含むＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡキットのＲＡ１緩衝液１ｍＬ中で右葉の半分をホモジナイズした。組織ホモジネート中の全ＲＮＡをＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ製ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡで抽出した。ＲＮＡを６０μＬの水で溶出した。
２０ｍＭのＴＣＥＰを含むＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡキットのＲＡ１緩衝液１ｍＬ中で右葉の半分をホモジナイズした。組織ホモジネート中の全ＲＮＡをＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ製ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡで抽出した。ＲＮＡを６０μＬの水で溶出した。
【0042】
ＲＮＡを高容量ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）で逆転写した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎに基づくリアルタイムＰＣＲおよびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、米国）を用い、製造者のプロトコルに従って、得られたｃＤＮＡを増幅した。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）をコードする遺伝子を用いて相対的定量化を行った。Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、仏国ヴィルボン＝シュル＝イヴェット）を用いて特異的プライマーを設計し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ（独国エーバースベルク）に注文した。（ａ）対象遺伝子とハウスキーピング遺伝子のＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）を比較（ΔＣｔ）し、（ｂ）治療群と対照群のΔＣｔ値を比較（ΔΔＣｔ）することにより、相対的ｍＲＮＡ量（２ΔΔＣｔ）を求めた。データは、ｇａｐｄｈ遺伝子の発現に対して正規化し、モック処置マウスでの平均遺伝子発現量に対する増加倍数として表す。ウイルス量は、Ｇａｐｄｈ発現量（ΔＣｔ）に対して正規化されたウイルスＲＮＡとして表す。
【0043】
実施例１
１：３で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．０１（感染倍数（ＭＯＩ）０．０１は、ウイルス使用量が１細胞あたり０．０１であることを意味する）で７２時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＶｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。２回の技術的反復で２回の生物学的反復を行った。
１：３で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．０１（感染倍数（ＭＯＩ）０．０１は、ウイルス使用量が１細胞あたり０．０１であることを意味する）で７２時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＶｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。２回の技術的反復で２回の生物学的反復を行った。
【0044】
結果は、陽性（０％感染細胞）対照および陰性（１００％感染細胞）対照で規定されたスケールに対するＣＰＥ率（％）として表されるＰＩ陽性核の割合（％）を分析して得た。図１から分かるように、クロフォクトールのＣＰＥを９５％低減させる濃度（ＩＣ９５）は９．２μＭである。
【0045】
実施例２
１：３で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．０１で７２時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＶｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。３回の技術的反復で２回または３回の生物学的反復を行った。
１：３で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．０１で７２時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＶｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。３回の技術的反復で２回または３回の生物学的反復を行った。
【0046】
結果は、正常細胞増殖（非感染対照）および非細胞増殖（感染対照）で規定されたスケールに対する細胞増殖向上率（％）として表される生細胞数を分析して得た。図２から分かるように、クロフォクトールの最大応答の９５％が観察される濃度（ＥＣ９５）は２１μＭと推定される。
【0047】
実施例３
１：３で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．０１で７２時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＴＭＰＲＳＳ２形質導入Ｖｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。３回の生物学的反復を行った。
１：３で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．０１で７２時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＴＭＰＲＳＳ２形質導入Ｖｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。３回の生物学的反復を行った。
【0048】
結果は、陽性（０％感染細胞）対照および陰性（１００％感染細胞）対照により規定されたスケールに対するＣＰＥ率（％）として表されるＰＩ陽性核の割合（％）を分析して得た。図３から分かるように、クロフォクトールのＩＣ９５は８．７μＭである。
【0049】
実施例４
１：３で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．０１で７２時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＴＭＰＲＳＳ２形質導入Ｖｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。３回の生物学的反復を行った。
１：３で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．０１で７２時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＴＭＰＲＳＳ２形質導入Ｖｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。３回の生物学的反復を行った。
【0050】
結果は、正常細胞増殖（非感染対照）および非細胞増殖（感染対照）で規定されたスケールに対する細胞増殖向上率（％）として表される生細胞数を分析して得た。図４から分かるように、クロフォクトールの推定ＥＣ９５は２５μＭである。
【0051】
実施例５
１：２．５で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．２５で６時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＶｅｒｏ８１およびＴＭＰＲＳＳ２形質導入Ｖｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。２回の生物学的反復を行った。
１：２．５で希釈後の様々な濃度のクロフォクトールを加えて、ＭＯＩ０．２５で６時間ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させることにより、ｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染させたＶｅｒｏ８１およびＴＭＰＲＳＳ２形質導入Ｖｅｒｏ８１細胞に及ぼすクロフォクトールの効果を評価した。２回の生物学的反復を行った。
【0052】
ウイルスＲＮＡを投与することにより結果を得て、ウイルス量を試料の全ＲＮＡ（ＲＮＡｔ）に対するウイルスＲＮＡの比として表した。図５から分かるように、クロフォクトールのＩＣ９５は１１μＭである。
【0053】
実施例１～５の結果によって示されるように、クロフォクトールのＩＣ９５は約９μＭ～約１１μＭ、すなわち、手術前または手術中にクロフォクトールが投与されて、肺切除または肺全摘を受けた患者のヒト肺組織において報告されたクロフォクトールのＣｍａｘ（約２５０μＭ）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １９８７；１９：６７９－６８３）に対して約２５分の１の値で変動している。同様に、クロフォクトールのＥＣ９５は約２１μＭ～約２５μＭ、すなわち、ヒト肺組織において報告されたＣｍａｘ（上記を参照のこと）に対して約１０の１の値で変動している。
【0054】
実施例６
クロフォクトールの濃度を増加させながらその存在下でＭＯＩ０．２５で６時間Ｖｅｒｏ－８１細胞およびＶｅｒｏ－８１－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を感染させた。次いで、全ＲＮＡを抽出して、ウイルスＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。結果は、全ＲＮＡ量で正規化し、２連で行った３回の独立した実験の平均値を表している。結果を図６に示すが、クロフォクトールはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム複製を阻害することが分かる。
クロフォクトールの濃度を増加させながらその存在下でＭＯＩ０．２５で６時間Ｖｅｒｏ－８１細胞およびＶｅｒｏ－８１－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を感染させた。次いで、全ＲＮＡを抽出して、ウイルスＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。結果は、全ＲＮＡ量で正規化し、２連で行った３回の独立した実験の平均値を表している。結果を図６に示すが、クロフォクトールはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム複製を阻害することが分かる。
【0055】
実施例７
Ｖｅｒｏ－８１細胞およびＶｅｒｏ－８１－ＴＭＰＲＳＳ２細胞をＭＯＩ０．２５でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。１時間後、接種材料を除去して、細胞をＰＢＳで洗浄した後、クロフォクトールで処置した。次いで、細胞をさらに１６時間インキュベートした。その後、上清を回収して、感染性ウイルスの分泌量を定量した。点線は検出限界（１．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を示している。これらのデータは、３回の独立した実験（Ｎ＝３）の平均値を表している。実験は、それぞれの条件について２連で行った。結果を図７に示すが、クロフォクトールの濃度が増加するにつれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２量は減少することが分かる。
Ｖｅｒｏ－８１細胞およびＶｅｒｏ－８１－ＴＭＰＲＳＳ２細胞をＭＯＩ０．２５でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。１時間後、接種材料を除去して、細胞をＰＢＳで洗浄した後、クロフォクトールで処置した。次いで、細胞をさらに１６時間インキュベートした。その後、上清を回収して、感染性ウイルスの分泌量を定量した。点線は検出限界（１．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を示している。これらのデータは、３回の独立した実験（Ｎ＝３）の平均値を表している。実験は、それぞれの条件について２連で行った。結果を図７に示すが、クロフォクトールの濃度が増加するにつれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２量は減少することが分かる。
【0056】
実施例８
クロフォクトールの濃度を増加させながらその存在下でＣａｌｕ－３細胞をＭＯＩ０．２５で２４時間感染させた。次いで、全細胞ＲＮＡを抽出して、ウイルスＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。結果を図８に示すが、クロフォクトールはＣａｌｕ－３細胞でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を阻害することが分かる。
クロフォクトールの濃度を増加させながらその存在下でＣａｌｕ－３細胞をＭＯＩ０．２５で２４時間感染させた。次いで、全細胞ＲＮＡを抽出して、ウイルスＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。結果を図８に示すが、クロフォクトールはＣａｌｕ－３細胞でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を阻害することが分かる。
【0057】
実施例６～８の結果から、クロフォクトールはＳａｒｓ－ＣｏＶ２に対する抗ウイルス活性を示すことが分かった。
【0058】
実施例９
１．７５％の最終Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ４０（０７０７６、Ｓｉｇｍａ）および１．４％の最終エタノールの塩化ナトリウム溶液で希釈したクロフォクトールを腹腔内注射に用いた。メスの８～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対してクロフォクトールの単回投与量（６２．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内投与して処置し、その後、異なる各時点で犠牲死させた（図９、左パネル）。別の実験では、マウスに対してクロフォクトールの１回の投与量（６２．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて１日２回２日間腹腔内投与して処置し、最後の注射の１時間後にマウスを犠牲死させた（図９、右パネル）。処置マウスの血漿中および肺中のクロフォクトール濃度は、以下のようにして測定した。血漿試料および肺組織を回収し、それぞれ１～１０および１～５０の比率で無水エタノールで処理した。肺組織を機械的溶解システム（Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｚｅｒ ＩＩ）でホモジナイズした。遠心分離により上清を得た後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに注入した。ＵＰＬＣシステムＡｃｑｕｉｔｙ Ｉ Ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ）をトリプル四重極質量分析計Ｘｅｖｏ ＴＱＤ（Ｗａｔｅｒｓ）と組み合わせて用いて、試料を分析した。４０℃に置いたカラムは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ８ ５０＊２．１ｍｍ，１．７μｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）であり、用いた移動相は、溶媒（Ａ）として５ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．７５）の水溶液、溶媒（Ｂ）として５ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．７５）のアセトニトリル溶液であった。図９に示された結果は、３連（肺）または２連（血漿）で行った３回の独立した実験の平均値を表している。クロフォクトールは肺において非常に顕著な量で分配されることが分かる。
１．７５％の最終Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ４０（０７０７６、Ｓｉｇｍａ）および１．４％の最終エタノールの塩化ナトリウム溶液で希釈したクロフォクトールを腹腔内注射に用いた。メスの８～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対してクロフォクトールの単回投与量（６２．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内投与して処置し、その後、異なる各時点で犠牲死させた（図９、左パネル）。別の実験では、マウスに対してクロフォクトールの１回の投与量（６２．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて１日２回２日間腹腔内投与して処置し、最後の注射の１時間後にマウスを犠牲死させた（図９、右パネル）。処置マウスの血漿中および肺中のクロフォクトール濃度は、以下のようにして測定した。血漿試料および肺組織を回収し、それぞれ１～１０および１～５０の比率で無水エタノールで処理した。肺組織を機械的溶解システム（Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｚｅｒ ＩＩ）でホモジナイズした。遠心分離により上清を得た後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに注入した。ＵＰＬＣシステムＡｃｑｕｉｔｙ Ｉ Ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ）をトリプル四重極質量分析計Ｘｅｖｏ ＴＱＤ（Ｗａｔｅｒｓ）と組み合わせて用いて、試料を分析した。４０℃に置いたカラムは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ８ ５０＊２．１ｍｍ，１．７μｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）であり、用いた移動相は、溶媒（Ａ）として５ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．７５）の水溶液、溶媒（Ｂ）として５ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．７５）のアセトニトリル溶液であった。図９に示された結果は、３連（肺）または２連（血漿）で行った３回の独立した実験の平均値を表している。クロフォクトールは肺において非常に顕著な量で分配されることが分かる。
【0059】
実施例１０
Ｋ１８－ヒトＡＣＥ２を発現する８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｋ１８－ｈＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。感染させるために、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射してマウスを麻酔し、次いで、５×１０２ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｈＣｏＶ－１９＿ＩＰＬ＿Ｆｒａｎｃｅ株（ＮＣＢＩ ＭＷ５７５１４０）を含む（またはモック試料では含まない）５０μｌのＤＭＥＭを鼻腔内投与して感染させた。すべての実験は、現在の国および機関の規則と倫理ガイドラインとに従って行われた。プロトコルは、機関の倫理委員会“Ｃｏｍｉｔｅ ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ ｅｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ”（ＣＥＥＡ）７５，Ｎｏｒｄ Ｐａｓ－ｄｅ－Ｃａｌａｉｓ（仏国）によって承認された。
Ｋ１８－ヒトＡＣＥ２を発現する８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｋ１８－ｈＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。感染させるために、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射してマウスを麻酔し、次いで、５×１０２ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｈＣｏＶ－１９＿ＩＰＬ＿Ｆｒａｎｃｅ株（ＮＣＢＩ ＭＷ５７５１４０）を含む（またはモック試料では含まない）５０μｌのＤＭＥＭを鼻腔内投与して感染させた。すべての実験は、現在の国および機関の規則と倫理ガイドラインとに従って行われた。プロトコルは、機関の倫理委員会“Ｃｏｍｉｔｅ ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ ｅｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ”（ＣＥＥＡ）７５，Ｎｏｒｄ Ｐａｓ－ｄｅ－Ｃａｌａｉｓ（仏国）によって承認された。
【0060】
マウスにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（マウス当たり５×１０２ＴＣＩＤ５０）を鼻腔内接種してから１時間後および８時間後、並びに感染後１日目に１日２回、クロフォクトール（６２．５ｍｇ／ｋｇ）または媒体を腹腔内投与して処置した（図１０、左パネル）。感染後２日目および４日目に動物を犠牲死させた。Ｖｅｒｏ－８１細胞に力価測定（図１０、中央パネル）およびＲＴ－ｑＰＣＲ（図１０、右パネル）（感染後２日目）を行ってウイルス量を求めた。
【0061】
クロフォクトール処置はマウスにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を顕著に低減させることが分かる。
【0062】
実施例１１
Ｄ６１４Ｇ変異を含むＢ１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＦＲＡ／Ｌｉｌｌｅ＿Ｖｅｒｏ－ＴＭＰＲＳＳ２／２０２０）またはＢ１．１．７系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＧＩＳＡＩＤ登録番号ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１６５３９３１）にＶｅｒｏ－８１細胞を感染させた。ウイルスゲノムをＲＴ－ｑＰＣＲにより定量した。結果は、全ＲＮＡ量で正規化し、２連で行った３回の独立した実験の平均値を表している。図１１から分かるように、クロフォクトールはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体のゲノム複製を阻害する。
Ｄ６１４Ｇ変異を含むＢ１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ヒト／ＦＲＡ／Ｌｉｌｌｅ＿Ｖｅｒｏ－ＴＭＰＲＳＳ２／２０２０）またはＢ１．１．７系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＧＩＳＡＩＤ登録番号ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿１６５３９３１）にＶｅｒｏ－８１細胞を感染させた。ウイルスゲノムをＲＴ－ｑＰＣＲにより定量した。結果は、全ＲＮＡ量で正規化し、２連で行った３回の独立した実験の平均値を表している。図１１から分かるように、クロフォクトールはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体のゲノム複製を阻害する。
【0063】
実施例１２
異なる濃度のクロフォクトールの存在下、Ｈｕｈ－７細胞をＨＣｏＶ－２２９Ｅ－Ｒｌｕｃに感染させた。感染の７時間後、細胞を溶解して、ルシフェラーゼ活性を定量した。結果を図１２に示すが、対照に対する％として示されており、３連で行った３回の独立した実験の平均値を表している。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。図１２から分かるように、クロフォクトールは、Ｓａｒｓ－ＣｏＶ２とは異なるコロナウイルスであるＨＣｏＶ－２２９Ｅに対して活性がある。
異なる濃度のクロフォクトールの存在下、Ｈｕｈ－７細胞をＨＣｏＶ－２２９Ｅ－Ｒｌｕｃに感染させた。感染の７時間後、細胞を溶解して、ルシフェラーゼ活性を定量した。結果を図１２に示すが、対照に対する％として示されており、３連で行った３回の独立した実験の平均値を表している。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。図１２から分かるように、クロフォクトールは、Ｓａｒｓ－ＣｏＶ２とは異なるコロナウイルスであるＨＣｏＶ－２２９Ｅに対して活性がある。
【0064】
実施例１～１２における上記データは、Ｃｏｖｉｄ－１９など、コロナウイルスによって生じる疾患の予防または治療のためのクロフォクトールの有用性を裏付けるものである。
【0065】
実施例１３
１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地において、Ｖｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ－８１細胞をＭＯＩ０．２５でｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。１時間後、接種材料を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、異なる各濃度のクロフォクトールで処置した。次いで、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気で細胞を１６時間インキュベートした。その後、上清を回収して、上清中に分泌されたウイルスの量をＴＣＩＤ５０で評価し、Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬとして表した。図１３に報告されたデータは、２つの異なる経験（ｎ＝２）の平均値を表している。それぞれの条件を２連で行った。図中の点線は、本方法の検出限界である１．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌを表している。
１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地において、Ｖｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ－８１細胞をＭＯＩ０．２５でｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。１時間後、接種材料を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、異なる各濃度のクロフォクトールで処置した。次いで、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気で細胞を１６時間インキュベートした。その後、上清を回収して、上清中に分泌されたウイルスの量をＴＣＩＤ５０で評価し、Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬとして表した。図１３に報告されたデータは、２つの異なる経験（ｎ＝２）の平均値を表している。それぞれの条件を２連で行った。図中の点線は、本方法の検出限界である１．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌを表している。
【0066】
図１３から分かるように、クロフォクトールは感染細胞によるｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の分泌を阻害する。
【0067】
実施例１４
１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地において異なる各濃度のクロフォクトールの存在下、Ｖｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ－８１をＭＯＩ０．２５でｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。６時間後、接種材料を除去し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用い、製造者の指示に従って細胞を溶解して、全ＲＮＡを抽出した。Ｅ遺伝子のオープンリーディングフレームを標的とするプライマーおよびプローブ（ＷＨＯプロトコル）を用いて定量ＲＴ－ＰＣＲによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムを測定した。結果は、各試料の全ＲＮＡ量によって正規化し、図１４に示すように未処置対照に対する％として表した。実験は２回行った（ｎ＝２）。各実験中、それぞれの条件を２連で行った。
１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地において異なる各濃度のクロフォクトールの存在下、Ｖｅｒｏ８１細胞およびＴＭＰＲＳＳ２により形質導入されたＶｅｒｏ－８１をＭＯＩ０．２５でｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。６時間後、接種材料を除去し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用い、製造者の指示に従って細胞を溶解して、全ＲＮＡを抽出した。Ｅ遺伝子のオープンリーディングフレームを標的とするプライマーおよびプローブ（ＷＨＯプロトコル）を用いて定量ＲＴ－ＰＣＲによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムを測定した。結果は、各試料の全ＲＮＡ量によって正規化し、図１４に示すように未処置対照に対する％として表した。実験は２回行った（ｎ＝２）。各実験中、それぞれの条件を２連で行った。
【0068】
図１４から分かるように、クロフォクトールは感染細胞においてｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の複製を阻害する。
【0069】
実施例１５
ヒト気管支上皮（ＭｕｃｉｌＡｉｒ（商標）、Ｅｐｉｔｈｅｌｉｘ社製）にクロフォクトールを頂端投与して処置した。まず、異なる各濃度のクロフォクトールを含むＭｕｃｉｌａｉｒ（登録商標）培養培地で上皮を洗浄した後、依然としてクロフォクトールの存在下で１時間、ＭＯＩ０．２でｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。次いで、接種材料を除去し、上皮をＰＢＳで洗浄した後、異なる各濃度のクロフォクトールを含むＭｕｃｉｌａｉｒ（登録商標）培養培地２５μｌを頂端極に加えた。３７℃で７２時間インキュベートした後、２００μｌのＭｕｃｉｌＡｉｒ（登録商標）培養培地を上皮の頂端極に加えて、５分間インキュベートした後に回収した。これらの上清を用いて、分泌されたウイルスの量をＴＣＩＤ５０で評価して定量した。結果を図１５に示すが、図中、点線はレムデシビルの検出限界を表している。また、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ｑＰＣＲでゲノムを定量した。結果は、利用できる全ＲＮＡ量が少なかったため正規化できなかったが、図１６に示す。図１５および図１６のデータはいずれも、３回の技術的反復（ｎ＝３）の平均値および標準偏差を表している。
ヒト気管支上皮（ＭｕｃｉｌＡｉｒ（商標）、Ｅｐｉｔｈｅｌｉｘ社製）にクロフォクトールを頂端投与して処置した。まず、異なる各濃度のクロフォクトールを含むＭｕｃｉｌａｉｒ（登録商標）培養培地で上皮を洗浄した後、依然としてクロフォクトールの存在下で１時間、ＭＯＩ０．２でｈＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。次いで、接種材料を除去し、上皮をＰＢＳで洗浄した後、異なる各濃度のクロフォクトールを含むＭｕｃｉｌａｉｒ（登録商標）培養培地２５μｌを頂端極に加えた。３７℃で７２時間インキュベートした後、２００μｌのＭｕｃｉｌＡｉｒ（登録商標）培養培地を上皮の頂端極に加えて、５分間インキュベートした後に回収した。これらの上清を用いて、分泌されたウイルスの量をＴＣＩＤ５０で評価して定量した。結果を図１５に示すが、図中、点線はレムデシビルの検出限界を表している。また、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ｑＰＣＲでゲノムを定量した。結果は、利用できる全ＲＮＡ量が少なかったため正規化できなかったが、図１６に示す。図１５および図１６のデータはいずれも、３回の技術的反復（ｎ＝３）の平均値および標準偏差を表している。
【0070】
図１５および図１６から分かるように、クロフォクトールは、インビトロでヒト気管支上皮の粘液において測定されたウイルス力価を、３０μＭで１００倍超低減させる。これはウイルスＲＮＡの定量の減少によって確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】