特表 2023-530445 キメラＲＳＶおよびコロナウイルスタンパク質、免疫原性組成物、ならびに使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-18

(54)【発明の名称】キメラＲＳＶおよびコロナウイルスタンパク質、免疫原性組成物、ならびに使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/50 20060101AFI20230710BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20230710BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230710BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230710BHJP

   C07K 14/165 20060101ALI20230710BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230710BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230710BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230710BHJP

【ＦＩ】

C12N15/50

A61K39/215 ZNA

A61P31/14

A61P37/04

C07K14/165

C12N15/63 Z

C12N15/62 Z

C07K19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022577349

(86)(22)【出願日】2021-06-17

(85)【翻訳文提出日】2023-02-10

(86)【国際出願番号】 US2021037846

(87)【国際公開番号】W WO2021257841

(87)【国際公開日】2021-12-23

(31)【優先権主張番号】63/040,193

(32)【優先日】2020-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/160,445

(32)【優先日】2021-03-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/194,092

(32)【優先日】2021-05-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】522485981

【氏名又は名称】メイッサ ヴァクシーン，インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭＥＩＳＳＡ ＶＡＣＣＩＮＥＳ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】ムーア，マーティン

(72)【発明者】

【氏名】ジョーダン，ロバート

(72)【発明者】

【氏名】ティオニ，マリアナ

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA03

4C085BA71

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF01

4C085FF02

4C085FF11

4C085FF14

4C085GG10

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、概しては、第１のウイルス融合タンパク質のエクトドメインおよび任意選択的に膜貫通ドメイン（例えば、コロナウイルスのスパイクタンパク質）および第２のウイルス融合タンパク質（例えばＲＳＶ）の細胞質ドメインを含むキメラウイルス融合タンパク質、そのようなキメラタンパク質を含む免疫原性組成物、ならびにその使用方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のエクトドメインおよびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質の細胞質テイル部分を含むキメラタンパク質。

【請求項2】

Ｎ末端からＣ末端への方向において、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の前記エクトドメインおよび前記ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質の前記細胞質テイル部分を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。

【請求項3】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の膜貫通部分をさらに含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。

【請求項4】

配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択される配列または配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードする核酸を含む生キメラウイルスを含む免疫原性組成物。

【請求項6】

前記核酸が、配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される配列または配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアント、または上述のいずれかのＲＮＡ対応物、または上述のいずれかの相補的配列を含む、請求項５に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

ＲＳＶのＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質をさらに含む、請求項５または請求項６に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

前記生キメラウイルスが、ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を含まない、請求項５～７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

アジュバントおよび／または他の医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

前記アジュバントが、アルミニウムゲル、アルミニウム塩、またはモノホスホリルリピドＡである、請求項９に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

前記アジュバントが、α－トコフェロール、スクアレン、および／または界面活性剤を任意選択的に含む水中油エマルションである、請求項９に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、前記対象に有効量の請求項４～１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項13】

前記投与が鼻腔内投与である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記免疫原性組成物が約１０^３～約１０^６の用量で投与される、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

前記免疫原性組成物の投与が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的粘膜ＩｇＡ応答を誘導するかまたは血清中和抗体を生成する、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

請求項１または請求項２に記載のキメラタンパク質をコードする核酸。

【請求項17】

配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される配列または配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアント、または上述のいずれかのＲＮＡ対応物、または上述のいずれかの相補的配列を含む、請求項１６に記載の核酸。

【請求項18】

請求項１６または請求項１７に記載の核酸を含むベクター。

【請求項19】

プラスミドまたは細菌人工染色体から選択される、請求項１８に記載のベクター。

【請求項20】

配列番号５４～５９、６６、６７、７２、７３、７８、７９、８４、８５、９０、９１、９６、９７、１０２、１０３、１１４、１１５、および１３１～１３６からなる群から選択される配列または配列番号５４～５９、６６、６７、７２、７３、７８、７９、８４、８５、９０、９１、９６、９７、１０２、１０３、１１４、１１５、および１３１～１３６からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアントを含む細菌人工染色体である、請求項１９に記載のベクター。

【請求項21】

ＲＳＶのＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質ならびに請求項１または請求項２に記載のキメラＦタンパク質を含む、単離された組換え粒子。

【請求項22】

弱毒生キメラＲＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムまたはアンチゲノムを含む、請求項２１に記載の単離された組換え粒子。

【請求項23】

配列番号１３～１８、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０４～１０９、および１１３からなる群から選択される配列または配列番号１３～１８、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０４～１０９、および１１３からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアント、または上述のいずれかのＲＮＡ対応物、または上述のいずれかの相補的配列を含む、弱毒生キメラＲＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アンチゲノム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０４０，１９３号；２０２１年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／１６０，４４５号；および２０２１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／１９４，０９２号の利益および優先権を主張し、これらの各々の開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、該配列表は参照により全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年６月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＭＳＡ－００７ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１，８２２，４５９バイトのサイズである。

【0003】

発明の分野
本発明は、概しては、キメラＲＳＶおよび非ＲＳＶタンパク質（例えば、非ニューモウイルス科、例えばコロナウイルス）、そのようなキメラタンパク質を含む免疫原性組成物、ならびにその使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

コロナウイルス科は、鳥、魚、および哺乳動物において呼吸器および胃腸疾患の原因となる大きいエンベロープ型一本鎖ＲＮＡウイルスのファミリー（科）である。該科は、最初のコロナウイルス（ＣｏＶ）系統が発見された１９６０年代に報告された、ビリオン表面上の冠に似たスパイクタンパク質の電子顕微鏡法下での特徴的外見からその名称が派生されている（Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ，２４（１１），Ｓ２２３－Ｓ２２７）。ＣｏＶの間で共有されるコアとなる特色は、１００～１６０ｎｍの範囲に及ぶビリオン直径、宿主細胞に結合する上述のスパイク（Ｓ）タンパク質、膜（Ｍ）糖タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、および２７～３２ｋｂの長さの範囲に及ぶポジティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを含む（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７（３），１８１－１９２）。遺伝子系統発生に基づいて、すべての既知のヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）は、オルトコロナウイルス亜科、特にアルファおよびベータコロナウイルス属におけるものである。

【0005】

ある特定のＨＣｏＶは世界的に風土性のものであり、免疫適格宿主において無症候性から中等度の重症度である季節性上または下気道感染症を引き起こす。これらの４つの系統（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、－ＮＬ６３、－ＯＣ４３、および－ＨＫＵ１）は、合わせて成人上気道感染症の１０～３０％を引き起こし（Ｐａｕｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＪＡＭＡ，３２３（８），７０７－７０８）、急性呼吸器病を有する小児の８．２～１０．８％において検出されている（Ｖａｒｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，７（２），１５１－１５８）。２００２年および２０１２年に２つの高度に病原性のベータ－コロナウイルスが保菌動物から出現してヒトに感染し、重症の、生命を脅かす呼吸器疾患の多国家での蔓延のトリガーとなった。重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）－ＣｏＶにより引き起こされたパンデミックは、８か月後に封じ込められる前に、１１％の累積致命率（ＣＦＲ）に直面した２９か国において８０００を上回る感染個体を結果としてもたらした（世界保健機関（ＷＨＯ）２０２０）。対照的に、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）－ＣｏＶは、アラビア半島において依然として蔓延しており、そこで２５００近い症例、および３４％のＣＦＲと共に２７か国において８５０を上回る死を引き起こしている（ＷＨＯ ２０１９）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶのために利用可能な認可された治療用または予防用ワクチンはない。

【0006】

２０１９年１２月に中国の武漢において始まったＣＯＶＩＤ－１９の世界的なパンデミックは、高度伝染性の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）により引き起こされる（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（２０２０）Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（４）：５３６－５４４）。ＣＯＶＩＤ－１９は、高齢者および深刻な基礎となる医学的状態、例えば心臓または肺疾患および糖尿病を有する患者において約２％の全体死亡率を有する。２０２１年５月１８日時点で、世界中で合計３，３８６，８２５人の死亡と共に１６３，３１２，４２９人のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の症例が確認された（ＷＨＯダッシュボード、ウェブサイトｃｏｖｉｄ１９．ｗｈｏ．ｉｎｔ／）。

【0007】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、エンベロープ型ＲＮＡウイルスであり、宿主細胞への侵入のためにその表面糖タンパク質、スパイクに依拠する（Ｌｅｔｋｏ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（４）：５６２－５６９、Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１７（２１）：１１７２７－１１７３４）。スパイクタンパク質は、Ｉ型融合タンパク質であり、電子顕微鏡法下で冠の特徴的な外見をウイルスに与えるウイルス膜上で突出する三量体を形成する（Ｔｕｒｏｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７０（６５１３）：２０３－２０８；Ｌｉ（２００５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ．３（１）：２３７－２６１）。アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクのための細胞受容体として同定されている（Ｌｅｔｋｏ ｅｔ ａｌ．、上掲；Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃｅｌｌ １８１（２）：２７１－２８０）。ＡＣＥ２とスパイクの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）との相互作用の妨害は、ワクチン設計および治療学のコアとなる。現在、３つのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが米国において救急使用のために承認されている（ＣＤＣ、「Ａｕｔｈｏｒｉｚｅｄ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、ウェブサイトｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ－ｖａｃｃｉｎｅｓ．ｈｔｍｌ）。３つのワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に基づき、それらの高いレベルの有効性は、感染防御抗原としてスパイクを検証した。しかしながら、既存のワクチンにもかかわらず、２０２１年５月２０日時点で、１５．６億回のワクチン用量のみが投与されており、これは１００人当たり２０用量に等しい。一部の国は、何らのワクチン用量の投与も報告していない。

【0008】

現行で使用されているすべてのＥＵＡワクチンは筋肉内に送達され、それらのいずれも弱毒生ではない。弱毒生ワクチン（ＬＡＶ）は、多くの場合に、それらが標的化する病原体と同じ侵入の経路を使用し、宿主中で複製されて疾患を引き起こすことなく天然の感染症を模倣する。結果として、ＬＡＶは、感染の部位において粘膜免疫を生成させて、感染の最初期相において病原体を遮断するため、全身性の拡散を制御することを助ける（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｍｅｄ．１１（４ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ４５－５３）。インフルエンザ感染症の場合、ＬＡＶは、他のワクチンタイプと比べてより良好な粘膜ＩｇＡおよび細胞媒介性免疫を誘導して、天然の免疫により緊密に似ているより長い持続性のより広い免疫応答を誘発することが示されている（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９（１）：１－１５）。さらには、マウスにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶに対して筋肉内におよび鼻腔内に投与されたワクチンの比較は、血清ＩｇＡは鼻腔内ワクチン接種後にのみ誘導され（Ｓｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８７（Ｐｔ ３）：６４１－６５０を参照）、鼻腔内ワクチン接種のみが上気道および下気道の両方において保護を提供する（Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃｅｌｌ １８３（１）：１６９－１８４．ｅ１３）ことを示した。特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について、早期抗体応答はＩｇＡにより支配されることおよび粘膜ＩｇＡは高度に中和性であることが報告されており（Ｓｔｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．１３（５７７）：ｅａｂｄ２２２３）、粘膜免疫を誘発する能力を有する鼻腔内ワクチンを開発する重要性を強調している。ＷＨＯワクチン追跡によれば、現行で１０１のワクチンが臨床試験されており、それらの３つのみが鼻腔内弱毒生ワクチンである（「Ｔｈｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、ウェブサイトｗｈｏ．ｉｎｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍ／ｉｔｅｍ／ｄｒａｆｔ－ｌａｎｄｓｃａｐｅ－ｏｆ－ｃｏｖｉｄ－１９－ｃａｎｄｉｄａｔｅ－ｖａｃｃｉｎｅｓ、２０２１年５月１４日の時点で、ＷＨＯによる作成）。これらの候補弱毒生ワクチンは、しかしながら、野生型コロナウイルスとの同時感染の間に弱毒化の喪失を結果としてもたらし得るコロナウイルスにおいて観察される高い率のＲＮＡ組換えを受けやすいことがある。

【0009】

よって、ＣＯＶＩＤ－１９疾患を予防するかまたはその重症度を減少させるための、ワクチンを包含する、免疫原性組成物に対する必要性が当技術分野において存在する。組換えを受けにくい、ならびに粘膜免疫応答および液性免疫応答の両方を生成する、ならびに高い収率で製造され得る、ニードルフリーの鼻腔内ワクチンの開発が必要とされている。

【発明の概要】

【0010】

本開示は、ウイルス感染症の予防用の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）において使用され得る２つのウイルス融合タンパク質の部分を含むキメラタンパク質の発見に部分的に基づく。本明細書に記載されるキメラタンパク質は、ＲＳＶウイルスの構成要素（例えばコドン脱最適化されたＲＳＶ遺伝子によりコードされるタンパク質）を含むが、ウイルスの表面上の融合タンパク質を発現するワクチン構築物において使用され得る。第１の融合タンパク質の部分（例えば、融合タンパク質のエクトドメイン）および第２の融合タンパク質の部分（例えば、第２の融合タンパク質の細胞質テイル）を有するキメラタンパク質は、ＲＳＶ粒子へのキメラタンパク質の適正なアセンブリーを促進する。

【0011】

ある特定の実施形態において、本開示は、コロナウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症）の予防用の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）において使用され得る非ＲＳＶウイルス（ＲＳＶではない任意のウイルス）からの融合タンパク質、例えばコロナウイルススパイクタンパク質または「Ｓタンパク質」；例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、およびＲＳＶ Ｆタンパク質を含むキメラタンパク質に関する。本明細書に記載されるキメラタンパク質は、ＲＳＶウイルスの構成要素（例えばコドン脱最適化されたＲＳＶタンパク質）を含むがウイルスの表面上の非ＲＳＶ融合タンパク質（例えば、キメラコロナウイルスＳタンパク質／ＲＳＶ Ｆタンパク質）を発現するワクチン構築物において使用され得る。非ＲＳＶ融合タンパク質の部分（例えば、エクトドメインおよび任意選択的に膜貫通部分）ならびにＲＳＶ Ｆタンパク質の部分（例えば、細胞質テイル部分）を有するキメラタンパク質は、ＲＳＶ粒子へのキメラタンパク質の適正なアセンブリーを促進する。

【0012】

他の実施形態において、細胞質テイル部分は非ＲＳＶ融合タンパク質、例えばオルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）のＨＡタンパク質；レトロウイルス科のＥｎｖタンパク質；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ、麻疹、およびおたふく風邪ウイルス）のＦおよび／またはＨＮタンパク質；コロナウイルス科のＳタンパク質；フィロウイルス科のＧＰタンパク質；アレナウイルス科のＧＰおよび／またはＳＳＰタンパク質；トガウイルス科のＥ１／Ｅ２タンパク質；フラビウイルス科のＥ（例えば、ＴＢＥＶにおけるもの）またはＥ１／Ｅ２（例えば、ＨＣＶにおけるもの）タンパク質；ブニヤウイルス科のＧＮ／ＧＣタンパク質；ラブドウイルス科（ＶＳＶおよび狂犬病）のＧタンパク質；ヘルペスウイルス科のｇＢ、ｇＤ、および／またはｇＨ／Ｌタンパク質；ポックスウイルス科における８つのタンパク質の複合体の１つ以上；ならびにヘパドナウイルス科のＳおよび／またはＬタンパク質である。

【0013】

ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されているキメラタンパク質を、１つ以上のＲＳＶタンパク質（例えば、ＮＳ１およびＮＳ２タンパク質であって、ＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質は、任意選択的に、コドン脱最適化された遺伝子によりコードされる）と共に含む免疫原性組成物に関する。本明細書に記載される免疫原性組成物は、ある特定の実施形態において、Ｇ遺伝子を含むことができるが、他の実施形態において、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）はＲＳＶ Ｇ遺伝子を含まない。理論により縛られることを望まないが、ある特定の融合タンパク質、例えばコロナウイルスＳタンパク質は、受容体付着およびウイルス－細胞融合の両方を媒介するため、ＲＳＶ Ｇ遺伝子は必要とされないと考えられる。実際に、コロナウイルススパイクタンパク質は、ウイルス侵入のために十分に機能的、必要および十分である。本明細書において実施例２に記載されるように、ＧおよびＦタンパク質を欠いた組換えＲＳＶ－スパイクウイルスは、宿主細胞に侵入することができ、組換えウイルスは、侵入のためにキメラコロナウイルススパイク／ＲＳＶ Ｆタンパク質に完全に依拠することを指し示す。さらに、既知のＲＳＶ中和抗体は主にＦまたはＧに対するものであるため、ＲＳＶ ＧおよびＦを除去することにより、結果としてもたらされる免疫原性組成物は、既存のＲＳＶ免疫により阻害されないはずである。

【0014】

ある特定の実施形態において、本開示は、世界的な免疫化のために有利な鼻腔内にニードルフリー経路で投与される本明細書に記載されているキメラ融合タンパク質を含むワクチンに関する。鼻腔内経路は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の天然の経路に類似しており、いかなるアジュバント製剤もなしにＡＧＭにおいて粘膜免疫応答および液性免疫応答の両方を生成する。本明細書に開示されるワクチンの製造からの収率に基づくモデリングは、高強度バイオリアクターシステムを使用する中サイズの設備において年間数億もの用量の潜在的な用量出力を見積もる。粘膜に送達された弱毒生ワクチン、例えば本明細書に記載されるものは、最小の下流の加工を必要とし、既存のワクチンよりも製造のためにより安価であり得る。さらに、ニードルフリー送達は供給リスクを低減させる。本明細書に記載されるワクチンは、一次ワクチンまたは異種ブースターとして好適である。

【0015】

よって、１つの態様において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のエクトドメインおよびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質の細胞質テイル部分を含むキメラタンパク質に関する。ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への方向において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のエクトドメイン、およびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質の細胞質テイル部分を含む。ある特定の実施形態において、キメラタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態において、キメラタンパク質はＲＳＶ融合タンパク質の膜貫通ドメインをさらに含む。

【0016】

ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択される配列または配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。

【0017】

別の態様において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のエクトドメインおよびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質の細胞質テイル部分を含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む生（例えば、弱毒生）キメラウイルスを含む免疫原性組成物に関する。ある特定の実施形態において、核酸は、Ｎ末端からＣ末端への方向において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のエクトドメインおよびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質の細胞質テイル部分を含むキメラタンパク質をコードする。ある特定の実施形態において、核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含むキメラタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、核酸は、ＲＳＶ融合タンパク質の膜貫通ドメインをさらに含むキメラタンパク質を含む。

【0018】

ある特定の実施形態において、核酸は、配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択される配列または配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアントを含むキメラタンパク質をコードする。ある特定の実施形態において、核酸は、配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される配列、または配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するその断片もしくはバリアント、または上述のいずれかのＲＮＡ対応物、または上述のいずれかの相補的配列を含む。

【0019】

ＤＮＡ配列として表現される（すなわち、「Ｔ」ヌクレオチドを使用する）ウイルス核酸配列について、「Ｕ」ヌクレオチドが「Ｔ」ヌクレオチドのために代用される対応するＲＮＡ配列もまた想定されることが理解される。さらに、アンチゲノム配列（例えば、発現ベクターにおいて見出されるようなもの）が提供される場合、免疫原性組成物において見出されるような相補的配列（例えば、ウイルスのゲノムおよび／またはワクチン配列）もまた想定されることが理解される。

【0020】

ある特定の実施形態において、生キメラウイルスはＲＳＶのＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質をさらに含む。ある特定の実施形態において、生キメラウイルスは、ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を含まない。

【0021】

ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントおよび／または他の医薬的に許容される担体をさらに含む。ある特定の実施形態において、アジュバントは、アルミニウムゲル、アルミニウム塩、またはモノホスホリルリピドＡである。ある特定の実施形態において、アジュバントは、α－トコフェロール、スクアレン、および／または界面活性剤を任意選択的に含む水中油エマルションである。

【0022】

別の態様において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されている免疫原性組成物を投与することを含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、投与は鼻腔内投与である。ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、約１０^３～約１０^６の用量で投与される。ある特定の実施形態において、免疫原性組成物の投与は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的粘膜ＩｇＡ応答を誘導するかまたは血清中和抗体を生成する。

【0023】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されているキメラタンパク質をコードする核酸に関する。ある特定の実施形態において、核酸は、配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される配列または配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアントの断片、または上述のいずれかのＲＮＡ対応物、または上述のいずれかの相補的配列を含む。

【0024】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されている核酸を含むベクターに関する。ある特定の実施形態において、ベクターは、プラスミドまたは細菌人工染色体から選択される。ある特定の実施形態において、ベクターは、配列番号５４～５９、６６、６７、７２、７３、７８、７９、８４、８５、９０、９１、９６、９７、１０２、１０３、１１４、１１５、および１３１～１３６からなる群から選択される配列または配列番号５４～５９、６６、６７、７２、７３、７８、７９、８４、８５、９０、９１、９６、９７、１０２、１０３、１１４、１１５、および１３１～１３６からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアントを含むＢＡＣである。

【0025】

別の態様において、本開示は、ＲＳＶのＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質ならびに本明細書に記載されているキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質－ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質を含む単離された組換え粒子に関する。ある特定の実施形態において、単離された組換え粒子は、弱毒生キメラＲＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムまたはアンチゲノムを含む。

【0026】

別の態様において、本開示は、配列番号１３～１８、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０４～１０９、および１１３からなる群から選択される配列または配列番号１３～１８、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０４～１０９、および１１３からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアント、または上述のいずれかのＲＮＡ対応物、または上述のいずれかの相補的配列を含む弱毒生キメラＲＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アンチゲノムに関する。

【0027】

本発明のこれらおよび他の態様および特色は以下の詳細な説明および請求項において記載される。

【図面の簡単な説明】

【0028】

本発明を理解するためおよびそれが実施においてどのように実行され得るのかを実証するために、実施形態がこれより、非限定的な例としてのみ、添付の図面を参照して、記載される。

【図1】図１は、ＭＶ－０１４－２１２の設計を示す概略図である。ＭＶ－０１４－２１２において、ＮＳ１およびＮＳ２遺伝子は脱最適化されており、ＲＳＶ ＳＨ、ＧおよびＦ遺伝子は欠失され、キメラタンパク質スパイク－Ｆをコードする遺伝子により置き換えられている。ジャンクションにおけるアミノ酸配列は、ブロック図の下に示されている。スパイクの膜貫通ドメインはライトグレーで左に表されており、Ｆの細胞質テイルはダークグレーで右に描写されている。第１の遺伝子位置において蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２をコードするレポーターウイルスＭＶＫ－０１４－２１２は、下部またはパネルにおいて図式的に示されている。ＮＴＤ：Ｎ末端ドメイン。ＲＢＤ：受容体結合ドメイン。Ｓ１：サブユニットＳ１。Ｓ２：サブユニットＳ２。Ｓ１／Ｓ２およびＳ２’：プロテアーゼ切断部位。ＦＰ：融合ペプチド。ＩＦＰ：内部融合ペプチド。ＨＲ１および２：７回反復１および２。ＴＭ：膜貫通ドメイン。ＣＴ：細胞質テイル。図１は配列番号１３９を開示する。

【図2】図２は、候補のＣ末端の配列を描写する概略図であり、ＲＳＶ Ｆタンパク質細胞質テイルとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質膜貫通ドメインとの間のジャンクションの異なる位置を示す。レスキューおよび培養における増殖を追跡するために蛍光マーカーとしてｍＫａｔｅ２遺伝子を含有するように候補を設計した。この図（および表３）に列記される７つの候補を、レスキューする（赤色蛍光フォーカスの生成として定義される）および１０^５ＰＦＵ／ｍＬまたはより高い力価まで増殖するそれらの能力により評価した。ＭＶ－０１４－２１２をさらなる調査を行うために選択した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの配列は配列番号２３のアミノ酸１１９８～１２７３を示す。ＭＶ０１４－２１０の配列は配列番号１のアミノ酸１１９８～１２７８を示す。ＭＶ０１４－２１１の配列は配列番号２のアミノ酸１１９８～１２７８を示す。ＭＶ０１４－２１２の配列は配列番号３のアミノ酸１１９８～１２９０を示す。ＭＶ０１４－２１３の配列は配列番号９８のアミノ酸１１９８～１２８４を示す。ＭＶ０１４－２２０の配列は配列番号４のアミノ酸１１９８～１２７５を示す。ＭＶ０１４－２３０の配列は配列番号５のアミノ酸１１９８～１２６８を示す。ＭＶ０１４－２４０の配列は配列番号６のアミノ酸１１９８～１２７１を示す。ＭＶ０１４－２１５の配列は配列番号１１０のアミノ酸１１９８～１２６０を示す。ＲＳＶ Ｆ（ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分）の配列を示し、配列番号１３０において提供している。

【図3】図３は、キメラＲＳＶ／コロナウイルスワクチンを作出するために使用されたＢＡＣ＿ＤＢ１＿ｍＫａｔｅベクターの設計を示す概略図である。

【図4A】図４Ａ～４Ｃは、融合スパイク－Ｆタンパク質により媒介されるＭＶ－０１４－２１０の増殖を示す細胞単層の明視野および蛍光画像を提供する。

【図4B】図４Ａ～４Ｃは、融合スパイク－Ｆタンパク質により媒介されるＭＶ－０１４－２１０の増殖を示す細胞単層の明視野および蛍光画像を提供する。

【図4C】図４Ａ～４Ｃは、融合スパイク－Ｆタンパク質により媒介されるＭＶ－０１４－２１０の増殖を示す細胞単層の明視野および蛍光画像を提供する。

【図5】図５は、組換えＭＶ－０１４－２１２ウイルスおよびそれに由来するウイルスのレスキューを示す概略図である。

【図6】図６は、ＭＶ－０１４－２１２および派生した組換えウイルスにより形成された合胞体を示す顕微鏡写真を提供する。顕微鏡写真は、位相差下でまたはＴＲＩＴＣフィルターを使用して１００Ｘの総拡大（ｔｏｔａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）で撮影した。

【図7】図７は、コロナウイルススパイクタンパク質、そのグリコシル化部位（短い黒バー）、およびそのフューリン切断部位の概略図を示す。

【図8】図８Ａは、フューリン切断部位を欠いた全長精製ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（レーン１）、ＭＶＫ－０１４－２１２（レーン２）、ＭＶ－０１４－２１２（レーン３）、モック感染Ｖｅｒｏ細胞溶解液（レーン４）、ブランク、（水、レーン５）を示すウエスタンブロットである。分子量マークは、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｃａｔ＃１６１０３７４）の泳動に対応する。図８Ｂは、無血清Ｖｅｒｏ細胞中でのＲＳＶ Ａ２と比較したＭＶ－０１４－２１２の複数サイクル複製動態を示すグラフである。細胞を０．０１のＭＯＩで感染させ、３２℃でインキュベートした。細胞および上清を感染後０、１２、２４、４８、７２、９６、および１２０時間において収集した。試料の力価をＶｅｒｏ細胞におけるプラークアッセイにより決定した。データ点は２つの複製ウェルの平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。図８Ｃは、無血清Ｖｅｒｏ細胞中でのＭＶＫ－０１４－２１２と比較したＭＶ－０１４－２１２の複数サイクル複製動態を示すグラフである。細胞を０．０１のＭＯＩで感染させ、３２℃でインキュベートした。細胞および上清を感染後０、３、２４、および７２時間において収集した。試料の力価をＶｅｒｏ細胞におけるプラークアッセイにより決定した。データ点は３つの複製ウェルの平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。図８Ｄは、短期熱安定性アッセイの結果を示すグラフである。Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ＋ＳＰＧ中で調製されたかまたは単独でのＳＰＧ中で調製されたＭＶ－０１４－２１２のウイルスストックを－８０℃、４℃、－２０℃および室温において６ｈインキュベートし、インキュベーション後の力価をプラークアッセイにより決定した。

【図9】図９は、実施例３に記載される遺伝子安定性実験の概略図を示す。簡潔に述べれば、ＭＶ－０１４－２１２の遺伝子安定性を連続継代によりインビトロで調べた。サブコンフルエントのＶｅｒｏ細胞の３つのフラスコにＭＶ－０１４－２１２のアリコートを感染させ、３つの系列を並行して１０継代にわたり継代した。ＲＴ－ＰＣＲ、続いてサンガーシークエンシングを使用して、すべての系列について出発ストック（継代０）および継代１０のゲノム全体の配列を決定した。バリアントの蓄積は検出されず、ＭＶ－０１４－２１２ワクチン候補は安定であることを示唆した。

【図10】図１０は、ＭＶ－０１４－２１２、ｗｔ ＲＳＶ、またはＰＢＳを接種されたアフリカミドリザル（ＡＧＭ）において行ったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ試験の図式的概観である。鼻スワブ（ＮＳ）を１～１２日目に得た。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を２、４、６、８、１０および１２日目に収集した。ＮＳおよびＢＡＬ試料におけるウイルスシェディングを、新鮮な試料を使用してプラークアッセイにより決定した。接種後２８日目にＡＧＭをｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジした。鼻スワブを２９～３８日目に毎日得た。気管支肺胞洗浄液を３０日目に開始して３８日目まで隔日で得た。ＲＴ－ｑＰＣＲをＮＳおよびＢＡＬ試料におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シェディングの検出のために使用した。

【図11】図１１Ａ～Ｂは、アフリカミドリザル（ＡＧＭ）の上および下気道におけるＭＶ－０１４－２１２の減弱を示すグラフを提供する。ＭＶ－０１４－２１２またはｗｔ ＲＳＶ Ａ２を接種後のＡＧＭからの鼻スワブ（図１１Ａ）または気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）（図１１Ｂ）におけるウイルス力価をＶｅｒｏ細胞におけるプラークアッセイにより測定した。接種後１～１２日目に鼻スワブを、ＳＰＧを補充したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ中に収集した。ＢＡＬにおけるウイルス力価を接種後２、４、６、８、１０、および１２日目に測定した。グラフ中のボックスは２５および７５パーセンタイルを定義し、エラーバーは最大値および最小値を示す。ボックス中の水平線は各々の時点についてのデータ点の平均値である。点線はＬＯＤ（５０ＰＦＵ／ｍＬ）を表す。

【図12】図１２Ａ～Ｄは、コットンラットにおいて行った２つの独立した実験の結果のグラフを示す。実験１において、コットンラット（ｎ＝５／群）に１×１０^５ＰＦＵの生物学的派生ＴＮ－１２、Ｍｅｍｐｈｉｓ ３７（Ｍ３７）または組換えＡ２（ｒＡ２）ＲＳＶ系統を接種した。３、５および７日目にコットンラットの鼻および肺組織をプラークアッセイによる力価決定のためにＨＢＳＳ＋１０％ＳＰＧ中でホモジナイズした。この実験において５日目のみに鼻および肺組織をｒＡ２群について収集した。実験２において、コットンラット（ｎ＝６）に５×１０^５ＰＦＵのｒＡ２を接種した。２、５および７日目にコットンラットの鼻および肺組織をプラークアッセイによる力価決定のためにＨＢＳＳ ＋ １０％ ＳＰＧ中でホモジナイズした。ＥＭＥＭ中に希釈された清澄化された鼻および肺ホモジネートを使用してＨＥｐ－２細胞においてプラークアッセイを行った。プラークを実験１においてＲＳＶポリクローナル抗体での免疫染色および実験２においてクリスタルバイオレット染色により可視化した。図１２Ａは、鼻におけるＴＮ－１２、Ｍ３７およびｒＡ２の複製動態を示す。図１２Ｂは、５日目におけるＴＮ－１２、Ｍ３７およびｒＡ２の鼻力価を比較する。図１２Ｃは、肺における生物学的ＴＮ－１２およびＭｅｍｐｈｉｓ ３７およびｒＡ２の複製動態を示す。図１２Ｄは、ＴＮ－１２、Ｍ３７およびｒＡ２の５日目における肺力価を比較する。結果は、ｒＡ２鼻力価は生物学的派生ＴＮ１２およびＭ３７と同等であるが、ｒＡ２肺力価は生物学的派生ＲＳＶ系統と比較して約２ｌｏｇ低いことを示した。

【図13】図１３は、ｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対するＭＶ－０１４－２１２ワクチン接種ＡＧＭの保護を実証するグラフを提供する。チャレンジ後のＭＶ－０１４－２１２、ｗｔ ＲＳＶ Ａ２またはＰＢＳ（モック）を接種されたＡＧＭからの鼻スワブ試料におけるｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡ。２８日目に、動物を１．０×１０^６ ＴＣＩＤ_５０のｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内および気管内接種によりチャレンジした。ｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でのチャレンジ後１、２、４、および６日目に収集された鼻スワブを示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡのレベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより決定した。破線は５０ゲノム当量（ＧＥ）／ｍＬのＬＯＤを表す。（ｓｇＲＮＡ＝サブゲノムＲＮＡ）

【図14】図１４Ａは、スパイク特異的鼻ＩｇＡを測定するために使用されたサンドイッチアッセイを示す概略図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、試料（例えば、鼻スワブ試料）からのＩｇＡに結合する抗原（２）として使用される。ＩｇＡ標準曲線を、スパイクタンパク質をＩｇＡ捕捉Ａｂで置き換えることにより生成し（図１４Ｂ）、「４５０ｎｍでのＯＤ」をＹ軸、「［ＩｇＡ］（ｐｇ／ｍＬ）」をｘ軸とした。

【図15】図１５Ａは、ＭＶ－０１４－２１２接種ＡＧＭにおけるスパイク特異的血清ＩｇＧを示すグラフを提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的な抗体を、ＭＶ－０１４－２１２、ｗｔ ＲＳＶ Ａ２、またはＰＢＳ（モック）を接種されたＡＧＭから２５日目に収集された血清を使用してＥＬＩＳＡにより測定した。力価は、プールされたヒト回復期血清から生成された標準曲線との比較により算出されたＥＬＩＳＡ単位（ＥＬＵ）／ｍＬとして表される。図１５Ｂは、接種後２５日目に収集された鼻スワブを使用したＥＬＩＳＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的なＩｇＡ抗体の測定を示すグラフを提供する。１日目に対する２５日目に得られた値の比のＬｏｇ２を示す。算出されたＥＬＵ／ｍＬ濃度を、捕捉ＥＬＩＳＡを使用して全精製ヒトＩｇＡから生成された標準曲線から得た。図１５Ｃは、ＭＶ－０１４－２１２での免疫化前（「前」）および２５日後（「免疫化」）の、ＭＶ－０１４－２１２で免疫化された２頭のＡＧＭからの血清での中和力価（ＮＴ５０）を示すグラフを提供する。ＷＨＯ標準は、１００ＩＵ／ｍＬでのヒト回復期血清カクテル対照である。ＮＴ５０を、阻害曲線をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおけるオプション「［Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ］ｖｓ．ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ－－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ」にフィッティングすることから得た。ＷＨＯ標準は、１００ＩＵ／ｍＬでの回復期血清のプールである。阻害％は、実施例３に記載されるように算出し、阻害曲線を図１６に示している。試料ＡＧＭ＃１ Ｐｒｅ（すべてのウイルス）およびＡＧＭ＃２（ＲＳＶ）に対応する曲線は有意な阻害を示さず、フィッティングできなかった。ＬＯＤは５であり、水平破線で指し示される。データは２つの複製の平均を表し、エラーバーはＳ．Ｄ．に対応する。右の表は各々のレポーターウイルスについての平均ＮＴ５０を示す。

【図16】図１６は、中和曲線を示すグラフを提供する。阻害のパーセンテージを方法に記載されるように算出した。下に示された阻害曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおけるオプション「［Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ］ｖｓ．ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ－－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ」と共に非線形回帰を使用してフィッティングした。度合は２つの複製の平均に対応し、エラーバーはＳＤである。各々のアッセイに対応するレポーターウイルスを上に示している。ＷＨＯ標準は１００ＩＵ／ｍＬでの回復期血清のプールである。

【図17】図１７は、ＭＶ－０１４－２１２での免疫化前（「前」）および２５日後（「免疫化」）後の、ＡＧＭ ＃１および＃２からの血清での中和アッセイを示すグラフを提供する。ＷＨＯ標準は１００ＩＵ／ｍＬでのヒト回復期血清カクテル対照である。グラフは、最も高い濃度の血清または対照（１：５）で達成された阻害を示す。阻害のパーセンテージを方法に記載されるように算出した。データは２つの複製の平均を表し、エラーバーはＳ．Ｄ．に対応する。

【図18】図１８は、実施例３に記載されている中和アッセイの概略図である。

【図19】図１９Ａ～Ｄは、ＭＶ－０１４－２１２はＡＣＥ－２マウスにおいてＴｈ１にバイアスされた免疫応答を誘発したことを示すグラフを提供する。図１９Ａは、ＡＣＥ－２マウスにおけるＩＦＮｇ（左）またはＩＬ－５（右）産生細胞についてのＥＬＩＳｐｏｔの結果を示す。ｈＡＣＥ－２発現マウス（ｎ＝５）から単離された脾臓細胞を接種後２８日目に収集し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（プール）、培地、またはマイトジェンコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）にわたるペプチドプールで刺激した。ＩＬ－５またはＩＦＮγ発現Ｔ細胞をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより定量化した。ｈＡＣＥ－２発現マウスに０日目に鼻腔内経路を介してＭＶ－０１４－２１２またはＰＢＳを接種した。対照マウスを、ミョウバンでアジュバント付加された精製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質で筋肉内注射により－２０日目～０日目にワクチン接種した。図１９Ｂは、ＩＬ－５発現細胞（図１９Ａに示される）に対するＩＦＮγ発現細胞の比のｌｏｇを示すグラフを提供する。図１９Ｃは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフを提供する。ＥＬＩＳＡにより決定された場合の、ＰＢＳもしくはＭＶ－０１４－２１２で鼻腔内にまたはスパイク－ミョウバンで筋肉内にワクチン接種されたｈＡＣＥ－２マウスからの２８日目の血清に対応するＩｇＧ２ａ（左パネル）およびＩｇＧ１（右パネル）のレベル。各々の免疫グロブリンアイソタイプの濃度を、精製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的モノクローナルＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ１抗体を用いて生成された標準曲線から決定した。図１９Ｄは、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１（図１９Ｃに示される）の比のｌｏｇを示すグラフを提供する。統計分析は、対応のあるｔ検定である。＊＊＊Ｐ＜０．０００５。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本開示は、ウイルス感染症の予防用の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）において使用され得る２つのウイルス融合タンパク質の部分を含むキメラタンパク質の発見に部分的に基づく。本明細書に記載されるキメラタンパク質は、ＲＳＶウイルスの構成要素（例えばコドン脱最適化されたＲＳＶタンパク質）を含むが、ウイルスの表面上のキメラ融合タンパク質を発現するワクチン構築物において使用され得る。第１の融合タンパク質の部分（例えば、融合タンパク質のエクトドメイン）および第２の融合タンパク質の部分（例えば、第２の融合タンパク質の細胞質テイル）を有するキメラタンパク質は、ＲＳＶ粒子へのキメラタンパク質の適正なアセンブリーを促進する。

【0030】

ある特定の実施形態において、本開示は、ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症）の予防用の免疫原性組成物（例えば、ワクチン）において使用され得る非ＲＳＶ融合タンパク質（例えば、コロナウイルススパイクタンパク質または「Ｓタンパク質」；例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）およびＲＳＶ Ｆタンパク質を含むキメラタンパク質に関する。本明細書に記載されるキメラタンパク質は、ＲＳＶウイルスの構成要素（例えばコドン脱最適化されたＲＳＶタンパク質）を含むがウイルスの表面上の融合タンパク質（例えば、Ｓタンパク質）を発現するワクチン構築物において使用され得る。非ＲＳＶ融合タンパク質の部分（例えば、コロナウイルスＳタンパク質）およびＲＳＶ Ｆタンパク質の部分を有するキメラタンパク質は、ＲＳＶ粒子へのキメラタンパク質の適正なアセンブリーを促進する。

【0031】

本開示は、第１の融合タンパク質の部分（例えば、エクトドメイン）および第２の融合タンパク質の部分（例えば、細胞質テイル）を含むキメラタンパク質をコードする核酸ならびにそれを含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン）にさらに関する。ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、Ｆ遺伝子に加えてまたはそれ以外にＲＳＶ遺伝子を含み、これはコドン脱最適化されていてもよい。本明細書に記載される免疫原性組成物は、ある特定の実施形態において、Ｇ遺伝子を含むことができるが、他の実施形態において、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）はＲＳＶ Ｇ遺伝子を含まない。理論により縛られることを望まないが、ある特定の融合タンパク質、例えばコロナウイルスＳタンパク質は、受容体付着およびウイルス－細胞融合の両方を媒介するため、ＲＳＶ Ｇ遺伝子は必要とされないと考えられる。実際に、コロナウイルススパイクタンパク質は、ウイルス侵入のために十分に機能的、必要および十分である。本明細書において実施例２に記載されるように、ＧおよびＦタンパク質を欠いた組換えＲＳＶ－スパイクウイルスは、宿主細胞に侵入することができ、組換えウイルスは、侵入のためにキメラコロナウイルススパイク／ＲＳＶ Ｆタンパク質に完全に依拠することを指し示す。さらに、既知のＲＳＶ中和抗体は主にＦまたはＧに対するものであるため、ＲＳＶ ＧおよびＦを除去することにより、結果としてもたらされる免疫原性組成物は、既存のＲＳＶ免疫により阻害されないはずである。

【0032】

本明細書の全体を通じて、特有の構成要素を有するか、包含するか、もしくは含むとして組成物が記載される場合、または特有のステップを有するか、包含するか、もしくは含むとしてプロセスおよび方法が記載される場合、記載される構成要素から本質的になるか、もしくはからなる本発明の組成物が追加的にあること、ならびに記載される処理ステップから本質的になるか、もしくはからなる本発明によるプロセスおよび方法があることが想定される。

【0033】

本出願において、要素または構成要素が、記載される要素または構成要素のリストに包含されるおよび／または該リストから選択されるといわれる場合、要素もしくは構成要素は記載される要素もしくは構成要素のいずれか１つであり得るか、または要素もしくは構成要素は記載される要素もしくは構成要素の２つ以上からなる群から選択され得ることが理解されるべきである。

【0034】

さらに、本明細書に記載される組成物または方法の要素および／または特色は、本明細書において明示的または暗示的のいずれであれ、本発明の精神および範囲から離れることなく様々なように組み合わせられ得ることが理解されるべきである。例えば、参照が特定の化合物に対して為される場合、文脈から他に理解されなければ、その化合物は、本発明の組成物の様々な実施形態および／または本発明の方法において使用され得る。換言すれば、本出願において、実施形態は、明確および簡潔な出願が記載および図示されることを可能にするように記載および描写されているが、実施形態は、本教示および本発明から離れることなく様々に組合せまたは分離されてもよいことが意図され、そのように理解される。例えば、本出願において記載および描写されるすべての特色は、本出願において記載および描写される本発明のすべての態様に適用可能であり得ることが理解される。

【0035】

文脈および使用から他に理解されなければ、「～の少なくとも１つ」という表現は、該表現の後の記載される対象の各々を個々におよび記載される対象の２つ以上の様々な組合せを包含することが理解されるべきである。文脈から他に理解されなければ、３つ以上の記載される対象との繋がりでの「および／または」という表現は、同じ意味を有することが理解されるべきである。

【0036】

「包含する（含む）」（ｉｎｃｌｕｄｅ）、「包含する（含む）」（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、「包含する（含む）」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、「有する」（ｈａｖｅ）、「有する」（ｈａｓ）、「有する」（ｈａｖｉｎｇ）、「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎ）、「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎｓ）、または「含有する」（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）という用語の使用は、その文法的等価物を含めて、一般にオープンエンドおよび非限定的であるとして理解されるべきであり、例えば、文脈から特に記載または理解されなければ、追加の記載されない要素またはステップを除外しない。

【0037】

「約」という用語の使用が定量的な値の前にある場合、特に他に記載されなければ、本発明はまた、特有の定量的な値それ自体を包含する。本明細書において使用される場合、他に指し示されないかまたは推測されなければ、「約」という用語は、名目上の値からの±１０％のバリエーションを指す。

【0038】

ステップの順序またはある特定の行為を行うための順序は、本発明が依然として機能可能である限り、重要でないことが理解されるべきである。さらに、２つ以上のステップまたは行為は同時に実行されてもよい。

【0039】

本明細書における任意のおよびすべての例、または例示的な表現、例えば、「例えば（など）」（ｓｕｃｈ ａｓ）もしくは「包含する（含む）」の使用は、本発明をより良好に説明することを単に意図するものであり、クレームされない限り本発明の範囲に対する限定を課さない。本明細書中のいかなる表現も、任意のクレームされない要素を本発明の実施に必須であるとして指し示すと解釈されるべきではない。

【0040】

様々な実施形態を記載する前に、以下の定義が提供され、他に指し示されなければこれらが使用されるべきである。

【0041】

「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して接合されたアミノ酸を含む化合物を指し、交換可能に使用される。

【0042】

「部分」という用語は、（「所与のタンパク質の部分」におけるように）タンパク質に関して使用される場合、そのタンパク質の断片を指す。断片は、４つのアミノ酸残基から、１つのアミノ酸を欠いたアミノ配列全体までのサイズの範囲に及んでもよい。

【0043】

「キメラ呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）」または「キメラコロナウイルス／ＲＳＶ」という用語は、ゲノムまたはアンチゲノムが宿主細胞（例えばＶｅｒｏ細胞）中で複製されることを可能とするために十分なＲＳＶ遺伝子を含有する核酸であって、配列核酸が、非ＲＳＶ（例えば、コロナウイルス）遺伝子配列または断片を含有する少なくとも１つの核酸セグメントを含むように変更されているものを指す。キメラＲＳＶは、コドンが、天然に存在するものとは異なるように変更されているが、遺伝子が、天然に発現されるものと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成する非ＲＳＶ（例えば、コロナウイルス）および／またはＲＳＶ遺伝子を含むことができる。キメラＲＳＶの異なる系統は、異なるヌクレオチド配列を有し、類似した機能を有する異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する。そのため、キメラＲＳＶは、１つの系統からの１つ以上の遺伝子が代替的なまたは第２の系統における遺伝子で置き換えられており、その結果、非ＲＳＶまたはＲＳＶゲノム全体の核酸配列が天然に見出される非ＲＳＶ（例えば、コロナウイルス）またはＲＳＶと同一でない非ＲＳＶ（例えば、コロナウイルス）遺伝子および／またはＲＳＶ遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、キメラＲＳＶは、核酸が、タンパク質発現を切断するために翻訳を開始させるためのコドンの後で欠失されており、但しゲノムのためのそのような切断パターンが天然に存在するウイルス中には見出されない系統を含む。ある特定の実施形態において、キメラＲＳＶは、ヒト対象において感染性であり、複製可能なものを含む。本明細書において使用される場合、「非ＲＳＶ」という用語は、ＲＳＶではない任意のウイルスを指す。ある特定の実施形態において、非ＲＳＶウイルスは、ニューモウイルス科ではないウイルスである（すなわち、非ニューモウイルスである）。本明細書中に存在する「非ＲＳＶ」という用語の任意の場合は、ある特定の実施形態において、「ニューモウイルス科外のウイルス」または「ニューモウイルス科ではない」ウイルスという用語で置換され得る。

【0044】

「キメラ」または「キメラの」という用語は、ポリペプチドに関して使用される場合、異なる供給源から得られるため天然の環境中では一緒に存在せず、一緒にクローニングされており、および翻訳後に単一のポリペプチド配列として作用する、２つ以上のコーディング配列の発現産物を指す。コーディング配列は、同じまたは異なる種の生物から得られるものを包含する。本開示は、キメラＲＳＶタンパク質、例えば、非ＲＳＶ（例えば、コロナウイルス）／ＲＳＶタンパク質に関する。ある特定の実施形態において、キメラＲＳＶタンパク質は、非ＲＳＶ融合タンパク質またはその部分もしくはバリアントおよびＲＳＶ Ｆタンパク質またはその部分（例えば細胞質テイル部分）もしくはバリアントを含む。

【0045】

「融合タンパク質」という用語は、ウイルス膜および細胞膜の融合を媒介して、ウイルスが細胞に侵入して感染することを可能とするウイルスタンパク質を指す。本明細書におけるキメラタンパク質における使用のために想定される融合タンパク質は、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）のＨＡタンパク質；レトロウイルス科のＥｎｖタンパク質；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ、麻疹、およびおたふく風邪ウイルス）のＦおよび／またはＨＮタンパク質；コロナウイルス科のＳタンパク質；フィロウイルス科のＧＰタンパク質；アレナウイルス科のＧＰおよび／またはＳＳＰタンパク質；トガウイルス科のＥ１／Ｅ２タンパク質；フラビウイルス科のＥ（例えば、ＴＢＥＶにおけるもの）またはＥ１／Ｅ２（例えば、ＨＣＶにおけるもの）タンパク質；ブニヤウイルス科のＧＮ／ＧＣタンパク質；ラブドウイルス科（ＶＳＶおよび狂犬病）のＧタンパク質；ヘルペスウイルス科のｇＢ、ｇＤ、および／またはｇＨ／Ｌタンパク質；ポックスウイルス科における８つのタンパク質の複合体の１つ以上；ならびにヘパドナウイルス科のＳおよび／またはＬタンパク質の少なくとも部分を包含する。

【0046】

「コロナウイルス」という用語は、（例えば、哺乳動物および鳥において疾患を引き起こすＲＮＡウイルスの群を指す。コロナウイルスは、免疫適格宿主において無症候性から中等度の重症度である季節性上または下気道感染症を引き起こす。ヒトコロナウイルスは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、－ＮＬ６３、－ＯＣ４３、－ＨＫＵ１、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）－ＣｏＶ、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）－ＣｏＶ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を包含する。用語コロナウイルスが本明細書において使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が特有の実施形態として想定される。

【0047】

「ホモログ」または「相同的」（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）という用語は、ポリペプチドに関して使用される場合、２つのポリペプチドの間の高い程度の配列同一性、または３次元構造の間の高い程度の類似性、または活性部位および作用の機序の間の高い程度の類似性を指す。好ましい実施形態において、ホモログは、参照配列と、６０％より高い配列同一性、より好ましくは７５％より高い配列同一性、さらにより好ましくは９０％より高い配列同一性を有する。

【0048】

ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに適用される場合、「実質的な同一性」という用語は、２つのペプチドまたはヌクレオチド配列が、例えばプログラム「ＧＡＰ」（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、「ＡＬＩＧＮ」（ＤＮＡＳｔａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｊｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ（Ｈｅｉｎ（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．１７９－１９０）により、デフォルトのギャップ重みを使用して、最適にアライメントされた場合に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、例えば、少なくとも９６パーセントの同一性、少なくとも９７パーセントの同一性、少なくとも９８パーセントの同一性、少なくとも９９パーセントの同一性、少なくとも９９．５パーセントの同一性、少なくとも９９．９パーセントの同一性を共有することを意味する。好ましくは、ポリペプチドについて、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。

【0049】

「バリアント」および「突然変異体」という用語は、ポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）に関して使用される場合、別の、通常は関連するポリペプチドから、１つ以上のアミノ酸により異なるアミノ酸配列（またはコードされるアミノ酸配列）を指す。バリアントは、置換されたアミノ酸が類似した構造的または化学的特性を有する「保存的な」変化を有してもよい。保存的アミノ酸置換の１つの種類は、類似した側鎖を有する残基の相互交換可能性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。より稀に、バリアントは、「非保存的な」変化（例えば、トリプトファンでのグリシンの置換）を有してもよい。類似した軽微なバリエーションはまた、アミノ酸欠失もしくは挿入（換言すれば、付加）、または両方を含んでもよい。いずれのおよびどれほど多くのアミノ酸残基が、生物学的活性を消失させることなく置換、挿入または欠失され得るのかの決定におけるガイダンスは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを使用して見出すことができる。バリアントは、機能アッセイにおいて試験され得る。好ましいバリアントは、１０％未満、好ましくは５％未満、さらにより好ましくは２％未満の変化（置換、欠失などのいずれであれ）を有する。

【0050】

「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ、またはポリペプチドもしくはその前駆体（例えば、プロインスリン）の製造のために必要なコーディング配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。機能的なポリペプチドは、全長コーディング配列により、またはポリペプチドの所望される活性もしくは機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持される限りコーディング配列の任意の部分によりコードされ得る。「部分」という用語は、遺伝子に関して使用される場合、その遺伝子の断片を指す。断片は、数ヌクレオチドから遺伝子配列全体マイナス１ヌクレオチドまでのサイズの範囲に及んでもよい。そのため、「遺伝子の少なくとも部分を含むヌクレオチド」は、遺伝子の断片または遺伝子全体を含んでもよい。

【0051】

「遺伝子」という用語はまた、構造遺伝子のコーディング領域を包含し、ならびに遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するように５’末端および３’末端の両方においていずれの末端における約１ｋｂの距離にわたりコーディング領域に隣接して位置する配列を包含する。コーディング領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は５’非翻訳配列として参照される。コーディング領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は３’非翻訳配列として参照される。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コーディング配列を差し挟まれたコーディング領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり；イントロンは、調節エレメント、例えばエンハンサーを含有してもよい。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライシング除去」され；イントロンはしたがってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物中に存在しない。ｍＲＮＡは、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を指定するために翻訳の間に機能する。

【0052】

イントロンを含有することに加えて、遺伝子のゲノム形態はまた、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’末端および３’末端の両方に位置する配列を含んでもよい。これらの配列は、「隣接」配列または領域として参照される（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列の５’または３’に位置する）。５’隣接領域は、遺伝子の転写を制御するかまたは影響を及ぼす調節配列、例えばプロモーターおよびエンハンサーを含有してもよい。３’隣接領域は、転写の終結、転写後切断およびポリアデニル化を指令する配列を含有してもよい。

【0053】

「異種遺伝子」という用語は、その天然の環境中にはない（すなわち、人間の手により変更されている）因子をコードする遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子は、別の種に導入された１つの種からの遺伝子を包含する。異種遺伝子はまた、何らかのやり方で変更（例えば、突然変異、複数のコピーでの付加、ネイティブでないプロモーターまたはエンハンサー配列への連結など）されている、生物にとってネイティブな遺伝子を包含する。異種遺伝子配列は、典型的には、異種遺伝子によりコードされるタンパク質のための遺伝子ともしくは染色体中の遺伝子配列と関連付けられて天然に見出されないか、または天然において見出されない染色体の部分（例えば、遺伝子が通常は発現されない座位において発現される遺伝子）と関連付けられる調節エレメント、例えばプロモーターを含むヌクレオチド配列に接合されているという点において異種遺伝子は内因性遺伝子から区別される。

【0054】

「ポリヌクレオチド」という用語は、２個以上、好ましくは３個より多い、通常は１０個より多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子を指す。正確なサイズは多くの要因に依存し、そして該要因は究極的な機能またはオリゴヌクレオチドの用途に依存する。ポリヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはこれらの組合せを包含する、任意の方式で生成されてもよい。「オリゴヌクレオチド」という用語は短い長さの一本鎖ポリヌクレオチド鎖を一般に指すが、それはまた「ポリヌクレオチド」という用語と交換可能に使用され得る。

【0055】

「核酸」という用語は、上記されている、ヌクレオチドのポリマー、またはポリヌクレオチドを指す。該用語は、単一の分子、または分子の集合を指定するために使用される。核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、コーディング領域、および、以下に記載されるように、様々な制御エレメントの領域を含んでもよい。

【0056】

「遺伝子をコードする核酸」または指定されるポリペプチド「をコードする核酸」という用語は、遺伝子のコーディング領域を含む核酸配列または換言すれば遺伝子産物をコードする核酸配列を指す。コーディング領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのいずれの形態で存在してもよい。ＤＮＡの形態で存在する場合、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸は一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であってもよい。好適な制御エレメント、例えばエンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナルなどが、転写の適正な開始および／または一次ＲＮＡ転写物の正確なプロセシングを可能にするために必要な場合に遺伝子のコーディング領域に近接して置かれてもよい。代替的に、本開示の発現ベクターにおいて利用されるコーディング領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性および外因性の両方の制御エレメントの組合せを含有してもよい。

【0057】

「組換え」という用語は、核酸分子に関する場合、分子生物学技術の手段によって接合されて一緒になった核酸のセグメントから構成される核酸分子を指す。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関する場合、組換え核酸分子を使用して発現されたタンパク質分子を指す。

【0058】

「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則により関係付けされるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則にしたがってマッチしている。または、核酸の間に「完全な」または「トータルな」相補性があってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強さに対する有意な効果を有する。これは増幅反応の他に、核酸の間の結合に依存する検出方法において特に重要である。

【0059】

「相同性」という用語は、核酸に関して使用される場合、相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）があってもよい。「配列同一性」は、２つ以上の核酸またはタンパク質の間の関連性の度合を指し、全比較長さに対するパーセンテージとして与えられる。同一性の算出は、同一であり、およびそれぞれのより大きい配列中で同じ相対的な位置にあるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を考慮に入れる。同一性の算出は、コンピュータプログラム、例えば「ＧＡＰ」（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）および「ＡＬＩＧＮ」（ＤＮＡＳｔａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）内に含有されるアルゴリズムにより行われてもよい。部分的な相補的配列は、完全な相補的配列が標的核酸にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する（または完全な相補的配列と競合する）配列であり、「実質的に相同的」という機能的な用語を使用して参照される。標的配列への完全な相補的配列のハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、および溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して低いストリンジェンシーの条件下で調べられてもよい。実質的に相同的な配列またはプローブは、低いストリンジェンシーの条件下での標的への完全に相同的な配列の結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）について競合するおよびそれを阻害する。これは、低いストリンジェンシーの条件は、非特異的結合が許容されるようなものであるというわけではなく；低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いに対する結合が特異的（すなわち、選択的）な相互作用であることを要求する。非特異的結合の非存在は、部分的な程度の相補性さえも欠いた（例えば、約３０％未満の同一性）第２の標的の使用により試験されてもよく；非特異的結合の非存在下でプローブは第２の非相補的標的にハイブリダイズしない。

【0060】

以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチドの間の配列関係性を記載するために使用される：「参照配列」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」。「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される定義された配列であり；参照配列は、例えば、配列表中に与えられる全長ｃＤＮＡ配列のセグメントとして、より大きい配列のサブセットであってもよく、または完全な遺伝子配列を含んでもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、頻繁には少なくとも２５ヌクレオチドの長さ、多くの場合に少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。２つのポリヌクレオチドは各々、（１）２つのポリヌクレオチドの間で類似した配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の部分）を含んでもよく、および（２）２つのポリヌクレオチドの間で異なる配列をさらに含んでもよいため、２つ（またはより多く）のポリヌクレオチドの間の配列比較は、典型的には、「比較ウインドウ」にかけて２つのポリヌクレオチドの配列を比較して配列類似性の局所領域を同定および比較することにより行われる。「比較ウインドウ」は、本明細書において使用される場合、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド位置の概念上のセグメントであって、ポリヌクレオチド配列が、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの参照配列と比較されてもよく、および比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分が、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよいものを指す。比較ウインドウをアライメントするための配列の最適なアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））により、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））により、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．）８５：２４４４（１９８８））により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または検査により実行されてもよく、様々な方法により生成された最良のアライメント（すなわち、比較ウインドウにかけて最も高い相同性のパーセンテージを結果としてもたらす）が選択される。「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較のウインドウにかけて同一（すなわち、ヌクレオチド毎を基準にして同一）であることを意味する。

【0061】

ある特定の実施形態において、「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、２つの最適にアライメントされた配列を比較のウインドウにかけて比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列中で起こっている位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウインドウ中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。

【0062】

ある特定の実施形態において、配列「同一性」は、同一の位置の数を使用して算出されたアライメントの２つの配列の間の配列アライメント中の正確にマッチしているアミノ酸の数を、最短の配列またはオーバーハングを除外した同等の位置の数のうちのより大きい方により割ったもの（パーセンテージとして表される）を指し、内部ギャップは同等の位置としてカウントされる。例えば、ポリペプチドＧＧＧＧＧＧ（配列番号１９）およびＧＧＧＧＴ（配列番号２０）は、５個のうちの４個または８０％の配列同一性を有する。例えば、ポリペプチドＧＧＧＰＰＰ（配列番号２１）およびＧＧＧＡＰＰＰ（配列番号２２）は、７個のうちの６個または８５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態において、本明細書において表現される配列同一性の任意の記載は、配列類似性に置換されてもよい。「類似性」パーセントは、アライメントの２つの配列の間の類似性を定量化するために使用される。この方法は、ある特定のアミノ酸はマッチを有するために同一である必要はないことを除いて、同一性の決定と同一である。アミノ酸は、以下のアミノ酸群：芳香族－ＦＹＷ；疎水性－Ａ ＶＩＬ；正荷電性：ＲＫＨ；負荷電性－ＤＥ；極性－ＳＴＮＱにしたがって類似した特性を有する群にある場合にマッチとして分類される。

【0063】

「実質的な同一性」という用語は、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドが、少なくとも２０ヌクレオチド位置の比較ウインドウにかけて、頻繁には少なくとも２５～５０ヌクレオチドのウインドウにかけて参照配列と比較して少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０～９５パーセントの配列同一性、より通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特徴を表し、配列同一性のパーセンテージは、比較のウインドウにかけて参照配列の合計で２０パーセントまたはそれ未満である欠失または付加を含んでもよいポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することにより算出される。参照配列は、例えば、本開示においてクレームされる組成物の全長配列のセグメントとして、より大きい配列のサブセットであってもよい。

【0064】

二本鎖核酸配列、例えばｃＤＮＡまたはゲノムクローンに関して使用される場合、「実質的に相同的」という用語は、上記されている低～高ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列のいずれかまたは両方の鎖にハイブリダイズできる任意のプローブを指す。

【0065】

一本鎖核酸配列に関して使用される場合、「実質的に相同的」という用語は、上記されている低～高ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸配列にハイブリダイズできる（すなわち一本鎖核酸配列の相補体である）任意のプローブを指す。

【0066】

「作動可能な組合せで」、「作動可能な順序で」および「作動可能に連結した」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望されるタンパク質分子の合成を指令する能力を有する核酸分子が産生されるような方式での核酸配列の連結を指す。該用語はまた、機能的タンパク質が産生されるような方式でのアミノ酸配列の連結を指す。

【0067】

「調節エレメント」という用語は、核酸配列の発現の一部の態様を制御する遺伝子エレメントを指す。例えば、プロモーターは、作動可能に連結したコーディング領域の転写の開始を促す調節エレメントである。他の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどである。

【0068】

真核生物中の転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７，１９８７）。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫、哺乳動物および植物細胞中の遺伝子を包含する様々な真核性供給源から単離されている。プロモーターおよびエンハンサーエレメントはまた、ウイルスから単離されており、および原核生物中に見出される。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるために使用される細胞種に依存する。一部の真核性プロモーターおよびエンハンサーは広い宿主範囲を有するが、他のものは、細胞種の限定されたサブセットにおいて機能的である（総説のために、Ｖｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１１：２８７，１９８６；およびＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．、上掲 １９８７を参照）。

【0069】

「プロモーターエレメント」、「プロモーター」、または「プロモーター配列」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、スイッチとして機能して、遺伝子の発現を活性化させるＤＮＡ配列を指す。遺伝子が活性化される場合、それは転写される、または転写に参加しているといわれる。転写は、遺伝子からのｍＲＮＡの合成を伴う。プロモーターは、したがって、転写調節エレメントとして役立ち、そしてまたｍＲＮＡへの遺伝子の転写の開始のための部位を提供する。

【0070】

プロモーターは組織特異的または細胞特異的であってもよい。「組織特異的」という用語は、プロモーターに適用される場合、関心対象のヌクレオチド配列の選択的な発現を、特異的な種類の組織（例えば、種子）に対して、異なる種類の組織（例えば、葉）における関心対象の同じヌクレオチド配列の発現の相対的な非存在において指令する能力を有するプロモーターを指す。プロモーターの組織特異性は、例えば、レポーター遺伝子をプロモーター配列に作動可能に連結してレポーター構築物を生成すること、レポーター構築物を生物のゲノムに導入し、その結果、レポーター構築物が、結果としてもたらされるトランスジェニック生物のあらゆる組織に組み込まれるようにすること、およびトランスジェニック生物の異なる組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出すること（例えば、レポーター遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ、タンパク質、またはタンパク質の活性を検出すること）により評価されてもよい。他の組織におけるレポーター遺伝子の発現のレベルと比べた１つ以上の組織におけるレポーター遺伝子の発現のより高いレベルの検出は、プロモーターが、より高いレベルの発現が検出される組織に特異的であることを示す。「細胞種特異的」という用語は、プロモーターに適用される場合、特異的な種類の細胞における関心対象のヌクレオチド配列の選択的な発現を、同じ組織内の異なる種類の細胞における関心対象の同じヌクレオチド配列の発現の相対的な非存在において指令する能力を有するプロモーターを指す。「細胞種特異的」という用語はまた、プロモーターに適用される場合、単一の組織内の領域における関心対象のヌクレオチド配列の選択的な発現を促進する能力を有するプロモーターを意味する。プロモーターの細胞種特異性は、当技術分野において周知の方法、例えば、免疫組織化学染色を使用して評価されてもよい。簡潔に述べれば、組織切片がパラフィン中に包埋され、パラフィン切片が、その発現がプロモーターにより制御される関心対象のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド生成物に特異的な一次抗体と反応させられる。一次抗体に特異的な標識された（例えば、ペルオキシダーゼをコンジュゲートされた）二次抗体が、切片化された組織に結合させられ、特異的結合が顕微鏡法により（例えば、アビジン／ビオチンを用いて）検出される。

【0071】

プロモーターは構成的または調節可能であってもよい。「構成的」という用語は、プロモーターに関する場合、プロモーターは、刺激（例えば、熱ショック、化学物質、光など）の非存在下で作動可能に連結した核酸配列の転写を指令する能力を有することを意味する。典型的には、構成的プロモーターは、実質的に任意の細胞および任意の組織において導入遺伝子の発現を指令する能力を有する。

【0072】

対照的に、「調節可能な」または「誘導性の」プロモーターは、刺激（例えば、熱ショック、化学物質、光など）の非存在下での作動可能に連結した核酸配列の転写のレベルとは異なる、刺激の存在下での作動可能に連結した核酸配列の転写のレベルを指令する能力を有するものである。

【0073】

エンハンサーおよび／またはプロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサーまたはプロモーターは、ゲノム中で所与の遺伝子と天然に連結しているものである。「外因性」または「異種」エンハンサーまたはプロモーターは、遺伝子マニピュレーション（すなわち、分子生物学技術）の手段により遺伝子に並置して置かれており、その結果、遺伝子の転写が、連結したエンハンサーまたはプロモーターにより指令されるようになっているものである。例えば、第１の遺伝子と作動可能な組合せにある内因性プロモーターは、単離し、除去し、および第２の遺伝子と作動可能な組合せで配置し、それにより、第２の遺伝子と作動可能な組合せにある「異種プロモーター」とさせることができる。様々なそのような組合せが想定される（例えば、第１および第２の遺伝子は、同じ種、または異なる種からのものであることができる）。

【0074】

真核細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的な発現は、結果としてもたらされる転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指令するシグナルの発現を要求し得る。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出され、数百ヌクレオチドの長さである。「ポリ（Ａ）部位」または「ポリ（Ａ）配列」という用語は、本明細書において使用される場合、新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指令するＤＮＡ配列を表す。組換え転写物の効率的なポリアデニル化は望ましく、その理由は、ポリ（Ａ）テイルを欠いた転写物は不安定であり、急速に分解されるからである。発現ベクターにおいて利用されるポリ（Ａ）シグナルは「異種」または「内因性」であってもよい。内因性ポリ（Ａ）シグナルは、ゲノム中の所与の遺伝子のコーディング領域の３’末端において天然に見出される。異種ポリ（Ａ）シグナルは、１つの遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’に配置されたものである。一般的に使用される異種ポリ（Ａ）シグナルはＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルである。ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルは、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ制限断片上に含有され、終結およびポリアデニル化の両方を指令する。

【0075】

「ベクター」という用語は、ＤＮＡセグメントを１つの細胞から別の細胞へ移動させる核酸分子を指す。「運搬体」（ｖｅｈｉｃｌｅ）という用語が「ベクター」と交換可能に使用される場合がある。

【0076】

「発現ベクター」または「発現カセット」という用語は、所望されるコーディング配列および特定の宿主生物における作動可能に連結したコーディング配列の発現のために使用される適切な核酸配列を含有する組換え核酸を指す。原核生物における発現のために使用される核酸配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター（任意選択的）、およびリボソーム結合部位を、多くの場合に他の配列と共に、含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが公知である。

【0077】

「宿主細胞」という用語は、異種遺伝子を複製および／または転写および／または翻訳する能力を有する任意の細胞を指す。そのため、「宿主細胞」は、インビトロまたはインビボのいずれで位置するものであれ、任意の真核または原核細胞（例えば、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥細胞、両生類細胞、植物細胞、魚細胞、および昆虫細胞）を指す。例えば、宿主細胞はトランスジェニック動物中に位置してもよい。

【0078】

「選択マーカー」は、人工的な選択または同定のために好適な形質を付与するポリペプチドをコードする組換えベクターに導入される核酸であり（下記の「レポーター遺伝子」も参照）、例えば、ベータ－ラクタマーゼは抗生物質耐性を付与し、ベータ－ラクタマーゼを発現する生物が増殖培地中の抗生物質の存在下で生存することを可能とする。別の例はチミジンキナーゼであり、これは宿主をガンシクロビル選択に対して感受性とする。それは、予想される色の存在または非存在に基づいて望まれる細胞と望まれない細胞とを区別することを可能とするスクリーニング可能なマーカーであり得る。例えば、ｌａｃ－ｚ遺伝子は、Ｘ－ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトシド）の存在下で青色を付与するベータ－ガラクトシダーゼ酵素を生成する。組換え挿入がｌａｃ－ｚ遺伝子を不活性化する場合、結果としてもたらされるコロニーは無色である。１つ以上の選択マーカーがあってもよく、これは例えば、発現生物がその増殖のために要求される特定の化合物を合成することができないこと（栄養要求性）を補完できる酵素、および化合物を、増殖にとって毒性の別の化合物に変換できる酵素である。ＵＲＡ３、オロチジン－５’リン酸デカルボキシラーゼは、ウラシル生合成のために必要であり、ウラシルについて栄養要求性であるｕｒａ３突然変異体を補完することができる。ＵＲＡ３はまた、５－フルオロオロチン酸を毒性化合物５－フルオロウラシルに変換する。追加の想定される選択マーカーは、抗菌剤耐性を付与するかまたは蛍光タンパク質を発現する任意の遺伝子を包含する。例は、以下の遺伝子：ａｍｐｒ、ｃａｍｒ、ｔｅｔｒ、ブラストサイジン、ｎｅｏｒ、ｈｙｇｒ、ａｂｘｒ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ型遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ｐ－グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）、ｅｇｆｐ、ｙｆｐ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ｌａｃＺａ、ｌａｃＺＡＭ１５、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）、細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）、ビアラホス耐性遺伝子（ｂａｒ）、ホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）、アラビトールデヒドロゲナーゼ（ａｔｌＤ）、ＵＤＰ－グルコース：ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼＩ（ｇａｌＴ）、アントラニル酸シンターゼのフィードバック非感受性αサブユニット（ＯＡＳＡ１Ｄ）、２－デオキシグルコース（２－ＤＯＧＲ）、ベンジルアデニン－Ｎ－３－グルクロニド、大腸菌スレオニンデアミナーゼ、グルタミン酸１－セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ（ＧＳＡ－ＡＴ）、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、塩耐性遺伝子（ｒｓｔＢ）、フェレドキシン様タンパク質（ｐｆｌｐ）、トレハロース－６－Ｐシンターゼ遺伝子（ＡｔＴＰＳ１）、リジンラセマーゼ（ｌｙｒ）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、トリプトファンシンターゼベータ１（ＡｔＴＳＢ１）、デハロゲナーゼ（ｄｈｌＡ）、マンノース－６－リン酸レダクターゼ遺伝子（Ｍ６ＰＲ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）、およびＤ－セリンアンモニアリアーゼ（ｄｓｄＡ）を包含するが、これらに限定されない。

【0079】

「標識」は、別の分子、例えば抗体またはタンパク質に直接的または間接的にコンジュゲートされて、その分子の検出を促す、検出可能な化合物または組成物を指す。標識の特有の非限定的な例は、蛍光タグ、酵素連結、および放射活性同位体を包含する。１つの例において、「標識受容体」は、受容体中の異種ポリペプチドの組込みを指す。標識は、放射性標識されたアミノ酸の組込みまたはマークされたアビジン（例えば、蛍光マーカーを含有するストレプトアビジンもしくは光学的もしくは比色的方法により検出され得る酵素活性）により検出され得るポリペプチドへのビオチニル部分の共有結合性取付けを包含する。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において公知であり、使用され得る。ポリペプチドの標識の例は、以下：放射性同位体もしくは放射性ヌクレオチド（例えば３５Ｓもしくは１３１Ｉ）蛍光標識（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、または磁気的剤、例えばガドリニウムキレートを包含するが、これらに限定されない。一部の実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を低減させるために様々な長さのスペーサーアームにより取り付けられる。

【0080】

「免疫原性組成物」は、対象において免疫応答を生じさせる能力を有する１つ以上の核酸またはタンパク質を指す。免疫原性組成物は、例えば、ある特定の実施形態において、ワクチンとして投与され得る、ウイルスまたはその部分（例えば、生もしくは死ウイルス、ウイルス粒子、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ））を含むことができる。

【0081】

ある特定の実施形態において、本開示は、アミノ酸配列のアミノ末端または炭素末端が異種アミノ酸配列、標識、またはレポーター分子に任意選択的に取り付けられている、本明細書に開示される配列またはそのバリアントもしくは融合物を含む組換えポリペプチドに関する。

【0082】

ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるポリペプチドまたはその融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターに関する。

【0083】

ある特定の実施形態において、組換えベクターは、哺乳動物、ヒト、昆虫、ウイルス、細菌、細菌プラスミド、酵母関連の複製起点もしくは遺伝子、例えば遺伝子もしくはレトロウイルス遺伝子またはレンチウイルスＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳヌクレオチドセグメントまたはｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｖｐｘから選択される遺伝子またはｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖから選択される構造遺伝子を任意選択的に含む。

【0084】

ある特定の実施形態において、組換えベクターは、遺伝子ベクターエレメント（核酸）、例えば選択マーカー領域、ｌａｃオペロン、ＣＭＶプロモーター、ハイブリッドニワトリＢ－アクチン／ＣＭＶエンハンサー（ＣＡＧ）プロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列、シス作用性ウッドチャックポスト調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ；ＷＰＲＥ）、スキャフォールド取付け領域（ＳＡＲ）、逆末端反復（ＩＴＲ）、ＦＬＡＧタグコーディング領域、ｃ－ｍｙｃタグコーディング領域、金属アフィニティータグコーディング領域、ストレプトアビジン結合ペプチドタグコーディング領域、ポリＨｉｓタグコーディング領域、ＨＡタグコーディング領域、ＭＢＰタグコーディング領域、ＧＳＴタグコーディング領域、ポリアデニル化コーディング領域、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０複製起点、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点、ｆ１オリジン、ｐＢＲ３２２オリジン、もしくはｐＵＣオリジン、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位、ｌｏｘＰ部位、Ｃｒｅリコンビナーゼコーディング領域、またはマルチプルクローニングサイト、例えば５０もしくは６０ヌクレオチド未満の連続的なセグメント内の５、６、もしくは７もしくはそれより多くの制限部位を有するものもしくは２０もしくは３０ヌクレオチド未満の連続的なセグメント内の３もしくは４もしくはそれより多くの制限部位を有するものを任意選択的に含む。

【0085】

「レポーター遺伝子」という用語は、アッセイされ得るタンパク質をコードする遺伝子を指す。レポーター遺伝子の例は、改変型ｋａｔｕｓｈｋａ、ｍｋａｔｅおよびｍｋａｔｅ２（例えば、Ｍｅｒｚｌｙａｋ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，５５５－５５７及びＳｈｃｈｅｒｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４１８，５６７－５７４を参照）、ルシフェラーゼ（例えば、ｄｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５および米国特許第６，０７４，８５９号明細書；同第５，９７６，７９６号明細書；同第５，６７４，７１３号明細書；および同第５，６１８，６８２号明細書を参照；これらのすべては参照により本明細書に組み込まれる）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４３２８４；多数のＧＦＰバリアントがＣｌｏｎＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．から商業的に入手可能である）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ならびにホースラディッシュペルオキシダーゼを包含するが、これらに限定されない。

【0086】

「野生型」という用語は、遺伝子に関する場合、天然に存在する供給源から単離された遺伝子の特徴を有する遺伝子を指す。「野生型」という用語は、遺伝子産物に関する場合、天然に存在する供給源から単離された遺伝子産物の特徴を有する遺伝子産物を指す。「天然に存在する」という用語は、物に適用されて本明細書において使用される場合、物が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離可能であり、および実験室において人間により意図的に改変されていない生物（ウイルスを包含する）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。野生型遺伝子は、集団中に最も頻繁に観察される遺伝子であり、そのため「正常」または「野生型」遺伝子と任意に呼称される。対照的に、「改変型」または「突然変異体」という用語は、遺伝子または遺伝子産物に関する場合、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列および／または機能的特性における改変（すなわち、変更された特徴）を示すそれぞれ遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体は単離可能であり；これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に変更された特徴を有するという事実により同定されることが留意される。

【0087】

「アンチセンス」または「アンチゲノム」という用語は、そのヌクレオチド残基の配列が、センス鎖中のヌクレオチド残基の配列と比べて逆転した５’から３’への方向性にあるヌクレオチド配列を指す。ＤＮＡデュプレックスの「センス鎖」は、その天然の状態において細胞により「センスｍＲＮＡ」に転写されるＤＮＡデュプレックス中の鎖を指す。そのため、「アンチセンス」配列は、ＤＮＡデュプレックス中の非コーディング鎖と同じ配列を有する配列である。

【0088】

「単離された」という用語は、その天然に存在する環境において通常それと付随するかまたはそれと相互作用する成分を実質的に含まない生物学的材料、例えばウイルス、核酸またはタンパク質を指す。単離された材料は、その天然の環境中の材料、例えば、細胞と共に見出されない材料を任意選択的に含む。例えば、材料がその天然の環境、例えば細胞中にある場合、材料は、その環境において見出される材料にとってネイティブでない細胞中の位置（例えば、ゲノムまたは遺伝子エレメント）に置かれている。例えば、天然に存在する核酸（例えば、コーディング配列、プロモーター、エンハンサーなど）は、その核酸にとってネイティブでないゲノム（例えば、ベクター、例えばプラスミドもしくはウイルスベクター、またはアンプリコン）の座位に天然に存在しない手段により導入される場合に単離される。そのような核酸はまた「異種」核酸として参照される。例えば、単離されたウイルスは、野生型ウイルスのネイティブな環境（例えば、感染した個体の鼻咽頭）以外の環境（例えば、細胞培養系、または細胞培養から精製されている）にある。

【0089】

ウイルスまたは弱毒化ウイルスの「免疫学的有効量」は、作用因子へのその後の曝露に対する個体（例えば、ヒト）自身の免疫応答を増強するために十分な量である。誘導された免疫のレベルは、例えば、中和分泌および／または血清抗体の量を、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素連結免疫吸着、またはマイクロ中和アッセイにより測定することによりモニターされ得る。

【0090】

ウイルスに対する「保護免疫応答」は、個体がその後に野生型ウイルスに曝露および／または感染された場合に深刻な下気道疾患（例えば、肺炎および／または細気管支炎）に対して保護的な、個体（例えば、ヒト）により呈される免疫応答を指す。

【0091】

ＲＳＶ
天然に存在するＲＳＶ粒子は、マトリックスタンパク質、および糖タンパク質を含有するエンベロープにより取り囲まれたらせん状ヌクレオカプシド内のウイルスゲノムを典型的には含有する。ヒト野生型ＲＳＶのゲノムは、タンパク質、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２－１、Ｍ２－２、およびＬをコードする。Ｇ、Ｆ、およびＳＨは糖タンパク質である。ＲＳＶポリメラーゼ活性は、大タンパク質（Ｌ）およびホスホタンパク質（Ｐ）からなる。ウイルスＭ２－１タンパク質は転写の間に使用され、トランスクリプターゼ複合体の構成要素であると思われる。ウイルスＮタンパク質は、複製の間に新生ＲＮＡをカプシド被包するために使用される。

【0092】

ゲノムは、宿主細胞の細胞質中で転写および複製される。宿主細胞での転写は、典型的には、１０個のメチル化およびポリアデニル化されたｍＲＮＡの合成を結果としてもたらす。アンチゲノムは、複製の間に生成されるゲノムのポジティブセンスＲＮＡ相補体であり、次いでこれはゲノム合成のための鋳型として作用する。ウイルス遺伝子は、保存された遺伝子開始（ＧＳ）および遺伝子終了（ＧＥ）配列により隣接されている。ゲノムの３’および５’末端にはリーダーおよびトレイラーヌクレオチドがある。野生型リーダー配列は３’末端においてプロモーターを含有する。ウイルスポリメラーゼがＧＥシグナルに達したときに、ポリメラーゼはポリアデニル化を行い、ｍＲＮＡを放出させ、次のＧＳシグナルにおいてＲＮＡ合成を再開させる。Ｌ－Ｐ複合体は、プロモーターの認識、ＲＮＡ合成、ｍＲＮＡの５’末端のキャップ付加およびメチル化ならびにそれらの３’末端のポリアデニル化の原因となると考えられる。ポリメラーゼはジャンクションにおいて遺伝子から解離する場合があると考えられる。ポリメラーゼはゲノムの３’末端において転写を開始させるため、これは発現の勾配を結果としてもたらし、ゲノムの３’末端における遺伝子は５’末端におけるものよりも頻繁に転写される。

【0093】

ゲノムを複製するために、ポリメラーゼは、シス作用性ＧＥおよびＧＳシグナルに応答せず、ゲノムのポジティブセンスＲＮＡ相補体、アンチゲノムを生成する。アンチゲノムの３’末端においてトレイラーの相補体があり、これはプロモーターを含有する。ポリメラーゼは、このプロモーターを使用してゲノム－センスＲＮＡを生成する。ネイキッドのＲＮＡとして放出されるｍＲＮＡとは異なり、アンチゲノムおよびゲノムＲＮＡは、それらが合成される際にウイルス核タンパク質（Ｎ）でカプシド被包される。

【0094】

ウイルスｍＲＮＡの翻訳後に、全長（＋）アンチゲノムＲＮＡが（－）ＲＮＡゲノムの複製用の鋳型として生成される。感染性組換えＲＳＶ（ｒＲＳＶ）粒子は、トランスフェクトされたプラスミドから回収されてもよい。ＲＳＶ Ｎ、Ｐ、Ｌ、およびＭ２－１タンパク質の共発現の他に、全長アンチゲノムＲＮＡは、ＲＳＶ複製のために十分である。Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９２（２５）：１１５６３－１１５６７および米国特許第６，７９０，４４９号明細書を参照。

【0095】

キメラタンパク質
ある特定の実施形態において、本開示は、１つのウイルスからのエクトドメインの少なくとも部分、および第２のウイルスの細胞質テイルを含むキメラタンパク質に関する。ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、第１または第２のウイルスからの膜貫通ドメインをさらに含む。例えば、ある特定の実施形態において、エクトドメインの少なくとも部分および任意選択的に膜貫通ドメインは、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）のＨＡタンパク質；レトロウイルス科のＥｎｖタンパク質；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ、麻疹およびおたふく風邪ウイルス）のＦおよび／またはＨＮタンパク質；コロナウイルス科のＳタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）；フィロウイルス科のＧＰタンパク質；アレナウイルス科のＧＰおよび／またはＳＳＰタンパク質；トガウイルス科のＥ１／Ｅ２タンパク質；フラビウイルス科のＥ（例えば、ＴＢＥＶにおけるもの）またはＥ１／Ｅ２（例えば、ＨＣＶにおけるもの）タンパク質；ブニヤウイルス科のＧＮ／ＧＣタンパク質；ラブドウイルス科（例えば、ＶＳＶおよび狂犬病ウイルス）のＧタンパク質；ヘルペスウイルス科のｇＢ、ｇＤ、および／またはｇＨ／Ｌタンパク質；ポックスウイルス科における８つのタンパク質の複合体の１つ以上；ならびにヘパドナウイルス科のＳおよび／またはＬタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、細胞質テイルは、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）のＨＡタンパク質；レトロウイルス科のＥｎｖタンパク質；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ、麻疹およびおたふく風邪ウイルス）のＦおよび／またはＨＮタンパク質；コロナウイルス科のＳタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）；フィロウイルス科のＧＰタンパク質；アレナウイルス科のＧＰおよび／またはＳＳＰタンパク質；トガウイルス科のＥ１／Ｅ２タンパク質；フラビウイルス科のＥ（例えば、ＴＢＥＶにおけるもの）またはＥ１／Ｅ２（例えば、ＨＣＶにおけるもの）タンパク質；ブニヤウイルス科のＧＮ／ＧＣタンパク質；ラブドウイルス科（例えば、ＶＳＶおよび狂犬病ウイルス）のＧタンパク質；ヘルペスウイルス科のｇＢ、ｇＤ、および／またはｇＨ／Ｌタンパク質；ポックスウイルス科における８つのタンパク質の複合体の１つ以上；ならびにヘパドナウイルス科のＳおよび／またはＬタンパク質に由来する。

【0096】

例えば、ある特定の実施形態において、本開示は、非ＲＳＶ融合タンパク質およびＲＳＶ Ｆタンパク質の少なくとも部分を含むキメラタンパク質の他に、キメラタンパク質をコードする核酸を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、これらのタンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターおよび前記ベクターを含む細胞を想定する。ある特定の実施形態において、ベクターは選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む。

【0097】

ある特定の実施形態において、本開示は、非ＲＳＶ融合タンパク質のエクトドメインおよびＲＳＶ Ｆタンパク質細胞質テイルを含むキメラタンパク質に関する。ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、非ＲＳＶ融合タンパク質またはＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態において、非ＲＳＶ融合タンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。

【0098】

ある特定の実施形態において、本開示は、第１の非ＲＳＶ融合タンパク質（例えば、コロナウイルススパイクタンパク質）のエクトドメインならびに第２の非ＲＳＶ融合タンパク質、例えば、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザ）のＨＡタンパク質；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ、麻疹、およびおたふく風邪）のＦおよび／またはＨＮタンパク質；コロナウイルス科のＳタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）；フィロウイルス科のＧＰタンパク質；アレナウイルス科のＧＰおよび／またはＳＳＰタンパク質；トガウイルス科のＥ１／Ｅ２タンパク質；フラビウイルス科のＥ（例えば、ＴＢＥＶにおけるもの）またはＥ１／Ｅ２（例えば、ＨＣＶにおけるもの）タンパク質；ブニヤウイルス科のＧＮ／ＧＣタンパク質；ラブドウイルス科のＧタンパク質；ヘルペスウイルス科のｇＢ、ｇＤ、および／またはｇＨ／Ｌタンパク質；ポックスウイルス科における８つのタンパク質の複合体の１つ以上；ならびにヘパドナウイルス科のＳおよび／またはＬタンパク質の細胞質テイルを含むキメラタンパク質に関する。ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、第１または第２の非ＲＳＶ融合タンパク質からの膜貫通ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態において、第１の非ＲＳＶ融合タンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。

【0099】

ある特定の実施形態において、本開示は、（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のエクトドメインおよび任意選択的に膜貫通ドメインならびに（２）インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、パラインフルエンザウイルスＦもしくはＨＮタンパク質、麻疹ウイルスＦもしくはＨＮタンパク質、おたふく風邪ウイルスＦもしくはＨＮタンパク質、水胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、または狂犬病ウイルスＧタンパク質の細胞質テイルを含むキメラタンパク質に関する。ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、水胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、または狂犬病ウイルスの膜貫通ドメインをさらに含む。インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、水胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、および狂犬病ウイルスの膜貫通および細胞質ドメインの配列は当技術分野において公知である。以上のための例示的な細胞質テイル配列は表１において提供される。他の想定される細胞質テイル配列は、表１における細胞質テイル配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するものを包含する。

【0100】

キメラタンパク質における使用のためのコロナウイルススパイクタンパク質およびその部分
ある特定の実施形態において、本開示は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクタンパク質の少なくとも部分およびＲＳＶ Ｆタンパク質の少なくとも部分を含むキメラタンパク質ならびにそれをコードする組換え核酸のある特定の望ましい配列に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、これらのポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターおよび前記ベクターを含む細胞を想定する。ある特定の実施形態において、ベクターは選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含む。

【0101】

ある特定の実施形態において、本開示は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク（Ｓ）タンパク質エクトドメインおよび膜貫通ドメインならびにＲＳＶ Ｆタンパク質細胞質テイルを含むキメラタンパク質に関する。

【0102】

図１における概略図に示されるように（スパイク遺伝子部分を参照）、コロナウイルススパイクタンパク質は、フューリン切断部位（Ｓ１／Ｓ２）により分離されたＳ１ドメインおよびＳ２ドメインを含む。Ｓ１ドメインは、２つのサブドメイン：Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）および受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有する。Ｓ２ドメインは、２つの７回リピート（ＨＲ１およびＨＲ２）、Ｓ２’切断部位、ならびにＣＤ２６相互作用ドメイン（「ＣＤ」）、融合ペプチド（ＦＰ）、ならびに膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含有する。

【0103】

ある特定の実施形態において、コロナウイルススパイクタンパク質は、
ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（配列番号２３）、またはその部分もしくはバリアントを含む。

【0104】

ある特定の実施形態において、コロナウイルススパイクタンパク質の部分は、配列番号２３のアミノ酸１～１２１０、配列番号２３のアミノ酸１～１２５４、配列番号２３の１～１２４１、配列番号２３の１～１２４０、または配列番号２３の１～１２６０を含む。

【0105】

ある特定の実施形態において、コロナウイルススパイクタンパク質の部分は、フューリン切断部位（ＰＲＲＡ（配列番号１３７））（配列番号２３のアミノ酸６８１～６８４および図９における概略図を参照）の欠失、またはフューリン切断部位における突然変異（例えば、フューリン切断部位をＰＲＲＡ（配列番号１３７）からＰＱＲＡ（配列番号１３８）に変化させるＲ６８２Ｑ）を含む。ある特定の実施形態において、コロナウイルススパイクタンパク質の部分は、フューリン切断部位のアミノ酸Ｐの欠失、２つのＲアミノ酸の１つの欠失、アミノ酸Ａの欠失、アミノ酸ＰＲ、ＲＲ、ＲＡ、ＰＲＲ、またはＲＲＡの欠失を含む。ある特定の実施形態において、コロナウイルススパイクタンパク質の部分は、アミノ酸Ｐの置換、２つのＲアミノ酸の１つもしくは両方の置換、アミノ酸Ａの置換、またはこれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態において、フューリン切断部位のアミノ酸はアミノ酸Ｑで置換される。

【0106】

ある特定の実施形態において、コロナウイルススパイクタンパク質の部分は、Ｌ５、Ｓ１３、Ｌ１８、Ｔ１９、Ｔ２０、Ｐ２６、Ａ６７、Ｄ８０、Ｔ９５、Ｄ１３８、Ｇ１４２、Ｗ１５２、Ｅ１５４、Ｆ１５７、Ｒ１５８、Ｒ１９０、Ｄ２１５、Ｄ２５３、Ｒ２４６、Ｋ４１７、Ｌ４５２、Ｌ４５３、Ｓ４７７、Ｔ４７８、Ｅ４８４、Ｎ５０１、Ｆ５６５、Ａ５７０、Ｄ６１４、Ｈ６５５、Ｑ６７７、Ｐ６８１、Ａ７０１、Ｔ７１６、Ｔ７９１、Ｔ８５９、Ｆ８８８、Ｄ９５０、Ｓ９８２、Ｔ１０２７Ｉ、Ｑ１０７１、Ｄ１１１８、Ｖ１１７６に対応する位置における１つ以上のアミノ酸置換、ならびに／またはアミノ酸６９および７０、１４４、１５６、および１５７の１つ以上の欠失を含み、アミノ酸番号付けは配列番号２３に対応する。ある特定の実施形態において、コロナウイルススパイクタンパク質の部分は、以下のアミノ酸置換：Ｌ５Ｆ、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ１９Ｒ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ａ６７Ｖ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｇ、Ｔ９５Ｉ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Ｗ１５２Ｃ、Ｅ１５４Ｋ、Ｆ１５７Ｓ、Ｒ１５８Ｇ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ｄ２５３Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ｆ５６５Ｌ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｑ６７７Ｈ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｔ７９１Ｉ、Ｔ８５９Ｎ、Ｆ８８８Ｌ、Ｄ９５０Ｈ、Ｄ９５０Ｎ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｑ１０７１Ｈ、およびＤ１１１８Ｈ、Ｖ１１７６Ｆの１つ以上を含み、アミノ酸番号付けは配列番号２３に対応する。

【0107】

ある特定の実施形態において、コロナウイルススパイクタンパク質の部分は、表２に列記されるバリアントのいずれかに示されるアミノ酸置換および／または欠失の組合せを含む。

【0108】

ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、本明細書に記載されているコロナウイルススパイクタンパク質、またはその部分（例えば、少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約３００個のアミノ酸、少なくとも約４００個のアミノ酸、少なくとも約５００個のアミノ酸、少なくとも約６００個のアミノ酸、少なくとも約７００個のアミノ酸、少なくとも約８００個のアミノ酸、少なくとも約９００個のアミノ酸、少なくとも約１０００個のアミノ酸、少なくとも約１１００個のアミノ酸、少なくとも約１２００個のアミノ酸、少なくとも約１２１０個のアミノ酸、少なくとも約１２２０個のアミノ酸、少なくとも約１２３０個のアミノ酸、少なくとも約１２４０個のアミノ酸、少なくとも約１２５０個のアミノ酸、少なくとも約１２６０個のアミノ酸、もしくは少なくとも約１２７０個のアミノ酸を含むその断片）、もしくはそのバリアント（例えば、それに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を含むコロナウイルススパイクタンパク質）を含む。ある特定の実施形態において、スパイクタンパク質は、約１～１００個のアミノ酸、約１～９０個のアミノ酸、約１～８０個のアミノ酸、約１～７０個のアミノ酸、約１～６０個のアミノ酸、または約１～５０個のアミノ酸、例えば、約１、約２、約３、約４、約５ 約６、約７、約８、約９、または約１０個のアミノ酸により切断されている。

【0109】

ある特定の実施形態において、コロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号２４またはそれに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するその部分もしくはバリアントによりコードされる。
ＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＣＣＣＣＣＴＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＣＡＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＡＧＴＴＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＴＴＡＣＴＴＧＧＴＴＣＣＡＴＧＣＴＡＴＡＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＴＧＧＴＡＣＴＡＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＴＡＡＣＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＣＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＣＴＡＣＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＴＧＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＣＴＡＧＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＴＧＡＡＴＡＴＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＡＴＧＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＧＧＧＡＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＴＣＴＡＡＧＣＡＣＡＣＧＣＣＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡＧＴＧＣＧＴＧＡＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＧＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＴＴＡＧＡＡＣＣＡＴＴＧＧＴＡＧＡＴＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＧＴＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＴＴＴＣＡＡＡＣＴＴＴＡＣＴＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＴＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＡＣＴＧＴＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＣＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＣＴＴＣＴＡＡＣＴＴＴＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＣＴＧＴＴＴＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＣＴＧＴＣＣＴＡＴＡＴＡＡＴＴＣＣＧＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＡＣＴＡＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＧＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＧＣＴＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＡＡＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＣＡＧＧＣＴＧＣＧＴＴＡＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＣＴＡＡＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＡＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＧＧＣＣＧＧＴＡＧＣＡＣＡＣＣＴＴＧＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴＡＣＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴＡＣＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＡＡＧＴＣＴＡＣＴＡＡＴＴＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＡＧＴＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＧＧＣＡＧＡＧＡＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＴＧＡＧＡＴＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＡＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＡＡＣＣＡＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＡＣＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＴＴＡＡＴＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＴＡＣＣＣＡＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＴＧＣＧＣＴＡＧＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＣＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＧＣＡＣＧＴＡＧＴＧＴＡＧＣＴＡＧＴＣＡＡＴＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＣＡＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＣＴＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＡＣＴＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＡＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＡＴＴＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＴＡＴＧＧＣＡＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＧＧＣＣＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＧＡＴＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＡＣＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＴＡＧＣＧＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＴＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡＴＴＴＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡＴＡＧＧＴＴＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＧＧＡＧＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＣＧＣＴＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＣＴＴＡＧＣＴＣＣＡＡＴＴＴＴＧＧＴＧＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＴＧＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＧＴＣＴＴＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＡＡＡＴＴＧＡＴＡＧＧＴＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＣＡＴＡＴＧＴＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＡＡＡＡＴＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＡＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＡＴＣＡＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧＧＴＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＡＴＧＴＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＴＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＴＣＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＴＴＡＧＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＡＧＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＧＴＡＡＡＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣＣＴＣＡＡＴＧＡＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＴＣＴＣＴＣＡＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＡＣＡＴＴＴＧＧＣＴＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＧＧＣＴＴＧＡＴＴＧＣＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡＴＴＡＣＡＣＡＴＡＡ（配列番号２４）

【0110】

キメラタンパク質における使用のためのＲＳＶ Ｆタンパク質およびその部分
ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、ＲＳＶ細胞質テイル（ＣＴ）ドメインまたはその部分を含む。Ｆタンパク質のＲＳＶ細胞質テイル（ＣＴ）ドメインの位置および構造は当技術分野において公知である（例えば、Ｂａｖｉｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８７（１９）：１０７３０－１０７４１を参照）。ある特定の実施形態において、および当技術分野において一般的に使用されるように、Ｆタンパク質のＲＳＶ細胞質テイル（ＣＴ）ドメインという用語は、配列ＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２５）またはＫＡＲＳＴＰＩＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号２６）を指す（例えば、図２を参照）。

【0111】

ある特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｆタンパク質細胞質テイル（ＣＴ）の部分は、配列番号２５もしくは２６または配列番号２５もしくは２６に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を含む配列の少なくとも約１５個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約２１個のアミノ酸、少なくとも約２２個のアミノ酸、または少なくとも約２３個のアミノ酸を含むＲＳＶ Ｆタンパク質ＣＴの断片を指す。ある特定の実施形態において、ＲＳＶ ＣＴドメインは、Ｎおよび／またはＣ末端において約１～１５個のアミノ酸、約１～１０個のアミノ酸、約１～５個のアミノ酸、約１～３個のアミノ酸、約５～１５個のアミノ酸、または約５～１０個のアミノ酸、例えば、約１、約２、約３、約４、約５ 約６、約７、約８、約９、または約１０個のアミノ酸により切断されている。

【0112】

ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、ＲＳＶ Ｆタンパク質細胞質テイル（ＣＴ）ドメインおよびＲＳＶ膜貫通（ＴＭ）ドメインまたはそれらの部分を含む。ＲＳＶ膜貫通ドメイン（ＴＭ）の位置および構造は当技術分野において公知であり（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＰＮＡＳ ８１：７６８３－７６８７、Ｆｉｇ．３を参照）、配列ＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＳＬＩＡＶＧＬＬＬＹＣ（配列番号２７）またはＩＭＩＴＡＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣ（配列番号２８）を含むことができる。ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、ＲＳＶ膜貫通（ＴＭ）ドメインの部分（例えば、配列番号２７もしくは２８、または配列番号２７もしくは２８に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を含む配列の少なくとも約１５個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約２１個のアミノ酸、少なくとも約２２個のアミノ酸、少なくとも約２３個のアミノ酸、少なくとも約２４個のアミノ酸または少なくとも約２５個のアミノ酸を含むＲＳＶ膜貫通（ＴＭ）ドメインの断片）を含む。ある特定の実施形態において、ＲＳＶ ＴＭドメインは、配列番号２７または２８のＮおよび／またはＣ末端において約１～１５個のアミノ酸、約１～１０個のアミノ酸、約１～５個のアミノ酸、約１～３個のアミノ酸、約５～１５個のアミノ酸、または約５～１０個のアミノ酸、例えば、約１、約２、約３、約４、約５ 約６、約７、約８、約９、または約１０個のアミノ酸により切断されている。

【0113】

ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の膜貫通（ＴＭ）ドメインに対してＮ末端にあるＲＳＶ Ｆタンパク質配列の少なくとも部分、例えば、ＧＫＳＴＴＮ（配列番号２９）を含む。よって、ある特定の実施形態において、キメラタンパク質は、ＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＴＩＩＩＶＩＩＶＩＬＬＳＬＩＡＶＧＬＬＬＹＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３０）およびＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＡＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣＫＡＲＳＴＰＩＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３１）または以上のいずれかの部分から選択されるＲＳＶ Ｆタンパク質配列の少なくとも部分を含む。例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質配列の部分は、配列ＧＬＬＬＹＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３２）、ＹＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３３）、ＣＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３４）、ＫＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３５）、ＡＲＳＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３６）、ＧＬＬＬＹＣＫＡＲＳＴＰＩＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３７）、ＹＣＫＡＲＳＴＰＩＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３８）、ＣＫＡＲＳＴＰＩＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号３９）、ＫＡＲＳＴＰＩＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号４０）、ＡＲＳＴＰＩＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ（配列番号４１）、または以上のいずれかの部分（例えば、少なくとも約１５個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約２１個のアミノ酸、少なくとも約２２個のアミノ酸、少なくとも約２３個のアミノ酸、少なくとも約２４個のアミノ酸、少なくとも約２５個のアミノ酸、少なくとも約２６個のアミノ酸、少なくとも約２７個のアミノ酸、少なくとも約２８個のアミノ酸、もしくは少なくとも約２９個のアミノ酸を含む以上のいずれかの断片もしくはそれに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を含む配列）を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＲＳＶ ＣＴドメインは、ＮまたはＣ末端において約１～１５個のアミノ酸、約１～１０個のアミノ酸、約１～５個のアミノ酸、約１～３個のアミノ酸、約５～１５個のアミノ酸、または約５～１０個のアミノ酸、例えば、約１、約２、約３、約４、約５ 約６、約７、約８、約９、または約１０個のアミノ酸により切断されている。

【0114】

ある特定の実施形態において、キメラコロナウイルスＳタンパク質－ＲＳＶ Ｆタンパク質において使用されるＦタンパク質の部分はＡ２ ＲＳＶ系統からのものである。ある特定の実施形態において、ＲＳＶ株１９系統からのより熱的に安定なＦタンパク質が使用される。理論により縛られることを望まないが、ＲＳＶ １９株からのＦタンパク質の使用は有利なことがあり、その理由は、高度に強力なＲＳＶ中和抗体がＦタンパク質のプレＦコンホメーションに対して誘導されており、１９株Ｆタンパク質はビリオンの表面上にプレＦの相対的に高いレベルを維持するからである。

【0115】

キメラコロナウイルスＳ－ＲＳＶ Ｆタンパク質
ある特定の実施形態において、本開示は、コロナウイルスＳタンパク質のＮ末端部分およびＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分を含むキメラコロナウイルス－ＲＳＶタンパク質を提供する。ある特定の実施形態において、キメラコロナウイルス－ＲＳＶタンパク質のＮ末端部分は、本明細書に記載されているコロナウイルススパイクタンパク質、またはそのバリアント（例えば、本明細書に記載されるコロナウイルススパイクタンパク質に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を含むコロナウイルススパイクタンパク質）の少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約３００個のアミノ酸、少なくとも約４００個のアミノ酸、少なくとも約５００個のアミノ酸、少なくとも約６００個のアミノ酸、少なくとも約７００個のアミノ酸、少なくとも約８００個のアミノ酸、少なくとも約９００個のアミノ酸、少なくとも約１０００個のアミノ酸、少なくとも約１１００個のアミノ酸、少なくとも約１２００個のアミノ酸、少なくとも約１２１０個のアミノ酸、少なくとも約１２２０個のアミノ酸、少なくとも約１２３０個のアミノ酸、少なくとも約１２４０個のアミノ酸、少なくとも約１２５０個のアミノ酸、少なくとも約１２６０個のアミノ酸、または少なくとも約１２７０個のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、スパイクタンパク質のＮ末端部分は、約１～１００個のアミノ酸、約１～９０個のアミノ酸、約１～８０個のアミノ酸、約１～７０個のアミノ酸、約１～６０個のアミノ酸、または約１～５０個のアミノ酸、例えば、約１、約２、約３、約４、約５ 約６、約７、約８、約９、または約１０個のアミノ酸により切断されている。ある特定の実施形態において、キメラコロナウイルス－ＲＳＶタンパク質のＣ末端部分は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分の約１０～約１００個のアミノ酸、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分の約２０～約５０個のアミノ酸、Ｃ末端部分の約２５～約５０個のアミノ酸、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分の約２０～約４０個のアミノ酸、Ｃ末端部分の約２５～約４０個のアミノ酸、ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分の約２０～約３０個のアミノ酸、Ｃ末端部分の約２５～約３０個のアミノ酸、またはＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ末端部分の約２４個のアミノ酸を含む。

【0116】

ある特定の実施形態において、キメラコロナウイルス－ＲＳＶタンパク質において使用されるコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）およびＲＳＶ配列の部分は、野生型タンパク質の対応する部分に対して約７０％もしくはより高い、約７５％もしくはより高い、約８０％もしくはより高い、約８５％もしくはより高い、約９０％もしくはより高い、約９５％もしくはより高い、約９６％もしくはより高い、約９７％もしくはより高い、約９８％もしくはより高い、または約９９％もしくはより高い配列同一性を含む。

【0117】

ある特定の実施形態において、キメラコロナウイルス－ＲＳＶタンパク質は、配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択される配列、または配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択されるタンパク質に対して約８０％もしくはより高い、約８５％もしくはより高い、約９０％もしくはより高い、約９５％もしくはより高い、約９６％もしくはより高い、約９７％もしくはより高い、約９８％もしくはより高い、もしくは約９９％もしくはより高い配列同一性を含むタンパク質を含む。

【0118】

ある特定の実施形態において、キメラコロナウイルス－ＲＳＶタンパク質は、配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される配列を含む核酸配列、または配列番号７～１２、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、および１１１からなる群から選択される核酸に対して約８０％もしくはより高い、約８５％もしくはより高い、約９０％もしくはより高い、約９５％もしくはより高い、約９６％もしくはより高い、約９７％もしくはより高い、約９８％もしくはより高い、もしくは約９９％もしくはより高い配列同一性を含む核酸配列、または上述のいずれかのＲＮＡ対応物、または上述のいずれかの相補的配列によりコードされる。

【0119】

キメラＲＳＶ
ＲＳＶを貯蔵するための一般的なベクターはプラスミドおよび細菌人工染色体（ＢＡＣ）を包含する。典型的には、細菌人工染色体は、選択マーカー、例えば、抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子と作動可能な組合せのＦ因子のｏｒｉＳ、ｒｅｐＥ、ｐａｒＡ、およびｐａｒＢ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子を含む。核酸配列は、任意選択的に突然変異したウイルス、例えば、任意選択的に突然変異したＲＳＶ系統のゲノムまたはアンチゲノム配列であってもよい。

【0120】

大腸菌細菌中でのＲＳＶの培養は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を利用することにより達成されてもよい。ＲＳＶを貯蔵および遺伝子操作するためのＢＡＣベクターは、Ｓｔｏｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１６，１４４２：１４１－５３および米国特許出願公開第２０１２／０２６４２１７号明細書において報告されている。開示されるＢＡＣは、ＲＳＶ系統１９株のアンチゲノム配列である、Ｆ遺伝子を除く呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）系統Ａ２の完全なアンチゲノム配列を含有する。

【0121】

よって、本明細書に開示されるキメラタンパク質（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶタンパク質）は、ＢＡＣ、例えば、Ｆ遺伝子および任意選択的にＧ遺伝子がキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置き換えられている、上掲のＳｔｏｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１６）において報告されるＢＡＣを使用して貯蔵および培養され得る。

【0122】

ヘルパープラスミドと共に、キメラＲＳＶを含むプラスミドまたはＢＡＣは、感染性ウイルスの回収のためのリバースジェネティクスシステムにおいて使用され得る。プラスミド上のアンチゲノム配列は、ウイルス回収の前に突然変異させて、所望される突然変異を有するウイルスを生成することができる。

【0123】

ある特定の実施形態において、本開示は、キメラＲＳＶ粒子（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ粒子）を生成する方法であって、ＢＡＣ遺伝子およびキメラＲＳＶアンチゲノム（例えば、コロナウイルス－ＲＳＶアンチゲノム）を有するベクターを、単離された真核細胞に挿入することならびにＲＳＶのＮタンパク質（例えば、ＮＳ１またはＮＳ２）をコードするベクター、ＲＳＶのＰタンパク質をコードするベクター、ＲＳＶのＬタンパク質をコードするベクター、およびＲＳＶのＭ２－１タンパク質をコードするベクターからなる群から選択される１つ以上のベクター（例えば、ヘルパープラスミド）を細胞に、ＲＳＶビリオンが形成されるような条件下で挿入することを含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｌタンパク質、またはＭＳ－１タンパク質をコードするベクターはコドン脱最適化されている。細胞へのベクターの挿入は、物理的に注入すること、エレクトロポレートすること、またはベクターが細胞に侵入するような条件下で細胞およびベクターを混合することにより行われてもよい。

【0124】

キメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ）は、ある特定の突然変異、欠失、またはバリアントの組合せを含むことが想定され、これは例えばＲＳＶの低温継代（ｃｐ）非温度感受性（ｔｓ）誘導体、ｃｐＲＳＶ、例えばｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨである。ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４ΔＳＨは、４つの独立した弱毒化遺伝子エレメント：一緒になってｃｐＲＳＶの非ｔｓ弱毒化表現型を付与するＮおよびＬタンパク質中のミスセンス突然変異に基づくｃｐ；Ｌタンパク質中のミスセンス突然変異であるｔｓ２４８；Ｍ２遺伝子の遺伝子開始転写シグナル中のヌクレオチド置換であるｔｓ４０４；ならびにＳＨ遺伝子の完全な欠失であるΔＳＨを含有する。ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨは、独立した弱毒化遺伝子エレメント：ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４ΔＳＨ中に存在するものおよびＬタンパク質中の別のミスセンス突然変異であるｔｓ１０３０を含有する。Ｋａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１９１（７）：１０９３－１１０４（参照により本明細書に組み込まれる）を参照。

【0125】

ある特定の実施形態において、キメラＲＳＶアンチゲノム（例えば、コロナウイルス－ＲＳＶアンチゲノム）は、非必須遺伝子（例えば、Ｇ、ＳＨ、ＮＳ１、ＮＳ２、およびＭ２－２遺伝子）中の欠失もしくは突然変異またはこれらの組合せを含有してもよいことが想定される。例えば、ある特定の実施形態において、遺伝子ＳＨは存在しない。ある特定の実施形態において、ＳＨ遺伝子とＧ遺伝子との間の遺伝子間領域は存在しない。ある特定の実施形態において、遺伝子Ｇは存在しない。理論により縛られることを望まないが、ＳＨ遺伝子およびＳＨ遺伝子とＧ遺伝子との間の遺伝子間領域の除外は、キメラＲＳＶ Ｆタンパク質（例えば、キメラコロナウイルスＳタンパク質／ＲＳＶ Ｆタンパク質の転写を増加させ、インビボでウイルスを弱毒化し得ると考えられる。

【0126】

ある特定の実施形態において、ＲＳＶ Ｇ遺伝子は、分泌型のＧタンパク質を除去するためのアミノ酸４８におけるＭｅｔからＩｌｅへの突然変異を含む。理論により縛られることを望まないが、分泌型のＧタンパク質は、抗原デコイとして作用し、インビトロ複製のために必須ではないため、分泌型のＧタンパク質の除去は有利なことがあると考えられる。

【0127】

遺伝コードの縮重に起因して、個々のアミノ酸は、場合により同義コドンとして参照される複数のコドンの配列によりコードされる。異なる種において、同義コドンは、より高いまたはより低い頻度で使用され、これは場合によりコドンバイアスとして参照される。遺伝子のコーディング配列中への少数で存在する同義コドンの遺伝子操作は、タンパク質のアミノ酸配列における変化なしにタンパク質翻訳の速度の減少を結果としてもたらすことが示されている。Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．は、コドンバイアスにおける変化によるウイルス弱毒化を報告している。Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２０：１７８４を参照。国際公開第２００８１２１９９２号パンフレット、国際公開第２００６０４２１５６号パンフレット、Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０（７）：３２５９およびＭｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０（１９）：９６８７も参照。

【0128】

ＲＳＶにおけるコドン脱最適化の使用は、Ｍｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ＭＢｉｏ ５，ｅ０１７０４－０１７１４（２０１４）および米国特許出願公開第２０１６／００３０５４９号明細書において報告されている。ある特定の実施形態において、本開示は、単離された核酸、コドン脱最適化を有する組換えコロナウイルス－ＲＳＶ、それから製造されるワクチン、およびそれに関するワクチン接種方法に関する。ある特定の実施形態において、コドン脱最適化は、ヒトにおいてより低い頻度で使用されるコドンを使用することを含む。ある特定の実施形態において、コドン脱最適化は、非構造遺伝子ＮＳ１およびＮＳ２ならびに任意選択的に遺伝子Ｌにおいて為される。

【0129】

ある特定の実施形態において、コドン脱最適化は、配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０またはこれらのバリアントからなる群から選択されるキメラコロナウイルス－ＲＳＶタンパク質配列をコードする核酸において為される。

【0130】

ある特定の実施形態において、本開示は、野生型ヒトＲＳＶの脱最適化されたＲＳＶ遺伝子（例えば、ＮＳ１および／もしくはＮＳ２、および任意選択的に遺伝子Ｌ）またはＧｌｙを生成するためのコドンがＧＧＴであり、Ａｓｐを生成するためのコドンがＧＡＴであり、Ｇｌｕを生成するためのコドンがＧＡＡであり、Ｈｉｓを生成するためのコドンがＣＡＴであり、Ｉｌｅを生成するためのコドンがＡＴＡであり、Ｌｙｓを生成するためのコドンがＡＡＡであり、Ｌｅｕを生成するためのコドンがＣＴＡであり、Ａｓｎを生成するためのコドンがＡＡＴであり、Ｇｌｎを生成するためのコドンがＣＡＡであり、Ｖａｌを生成するためのコドンがＧＴＡであり、もしくはＴｙｒを生成するためのコドンがＴＡＴであり、もしくはこれらの組合せであるようにヌクレオチドが置換されたそのバリアントを含む単離された核酸に関する。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子は、個々のコドンの少なくとも２、３、４、５、６、７、８ ９、１０個、またはすべての組合せをさらに含む。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子は、少なくとも２０、３０、４０、または５０以上のコドンを含む。

【0131】

ある特定の実施形態において、本開示は、野生型ヒトＲＳＶの脱最適化されたＲＳＶ遺伝子（例えば、ＮＳ１および／もしくはＮＳ２、任意選択的に遺伝子Ｌ）またはＡｌａを生成するためのコドンがＧＣＧであり、Ｃｙｓを生成するためのコドンがＴＧＴであり、Ｐｈｅを生成するためのコドンがＴＴＴであり、Ｐｒｏを生成するためのコドンがＣＣＧであり、Ａｒｇを生成するためのコドンがＣＧＴであり、Ｓｅｒを生成するためのコドンがＴＣＧであり、もしくはＴｈｒを生成するためのコドンがＡＣＧであり、もしくはこれらの組合せであるようにヌクレオチドが置換されたそのバリアントを含む単離された核酸に関する。ある特定の実施形態において、核酸を含有する遺伝子は、個々のコドンの少なくとも２、３、４、５、６、７、８ ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個、またはすべての組合せを含む。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子は、少なくとも２０、３０、４０、または５０以上のコドンをさらに含む。

【0132】

ある特定の実施形態において、コドン脱最適化されたＮＳ１遺伝子は、配列：
ＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＣＧＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＣＧＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＧＴＧＴＴＡＴＡＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴＡＣＡＴＣＴＡＡＣＧＡＡＴＧＣＧＣＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＡＴＡＣＧＡＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡＴＧＧＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡＴＡＴＡＴＧＴＣＣＧＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＡＡＡＡＴＣＧＡＡＴＴＴＴＡＣＧＡＣＧＡＴＧＣＣＧＧＴＡＣＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＡＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＧＴＴＣＧＣＡＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＴＡＣＴＡＧＡＴＧＡＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＧＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣＧＧＡＴＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＧＧＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＡＡＡＴＣＣＧＴＡＡ（配列番号４４）
を含む。

【0133】

ある特定の実施形態において、コドン脱最適化されたＮＳ２遺伝子は、配列：
ＡＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＣＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＴＡＡＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＧＴＣＣＧＣＴＡＴＣＧＣＴＡＧＡＡＡＣＧＡＴＡＡＴＡＡＣＧＴＣＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＧＡＴＡＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＴＡＣＧＴＡＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＡＣＧＴＣＡＡＧＣＧＡＣＧＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＴＴＣＧＡＣＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＡＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＴＡＣＧＴＴＴＣＣＧＡＴＧＣＣＧＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＡＣＧＣＣＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＣＴＡＡＡＴＣＣＧＴＡＡ（配列番号４５）
を含む。

【0134】

理論により縛られることを望まないが、ＮＳ１およびＮＳ２のコドン脱最適化は有利なことがあり、その理由は、ＮＳ１およびＮＳ２タンパク質は、感染に対する宿主インターフェロン応答に干渉することが公知であり、インビトロ複製のために必須ではないからである。

【0135】

ある特定の実施形態において、本開示は、キメラ非ＲＳＶ／ＲＳＶ Ｆタンパク質、例えば、キメラコロナウイルスＳタンパク質およびＲＳＶ Ｆタンパク質のための脱最適化された遺伝子をコードする単離された核酸に関する。キメラコロナウイルスＳタンパク質およびＲＳＶ Ｆタンパク質は、配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択される配列またはＧｌｙを生成するためのコドンがＧＧＴであり、Ａｓｐを生成するためのコドンがＧＡＴであり、Ｇｌｕを生成するためのコドンがＧＡＡであり、Ｈｉｓを生成するためのコドンがＣＡＴであり、Ｉｌｅを生成するためのコドンがＡＴＡであり、Ｌｙｓを生成するためのコドンがＡＡＡであり、Ｌｅｕを生成するためのコドンがＣＴＡであり、Ａｓｎを生成するためのコドンがＡＡＴであり、Ｇｌｎを生成するためのコドンがＣＡＡであり、Ｖａｌを生成するためのコドンがＧＴＡであり、もしくはＴｙｒを生成するためのコドンがＴＡＴであり、もしくはこれらの組合せであるようにヌクレオチドが置換されたそのバリアントまたはそのバリアントを有することができる。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子は、個々のコドンの少なくとも２、３、４、５、６、７、８ ９、１０個、またはすべての組合せをさらに含む。ある特定の実施形態において、単離された核酸中の遺伝子は、少なくとも２０、３０、４０、または５０以上のコドンを含む。

【0136】

Ｇｌｅｎｎ ｅｔ ａｌ．は、妊娠可能年齢の健康な女性における呼吸器合胞体ウイルス組換え融合（Ｆ）ナノ粒子ワクチンの無作為化盲検比較用量範囲研究を報告している（（２０１６）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２１３（３）：４１１－２２）。ある特定の実施形態において、本開示は、非ＲＳＶ融合タンパク質（例えば、コロナウイルスＳタンパク質）の部分およびＲＳＶ Ｆタンパク質の部分を含むキメラタンパク質、例えば、配列番号１～６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、および１１０からなる群から選択される配列またはそのバリアントを含むキメラコロナウイルスＳタンパク質およびＲＳＶ Ｆタンパク質、ならびにＶＬＰを形成するために十分な本明細書に記載されている１つ以上のＲＳＶコア構造タンパク質を含有するウイルス粒子およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。ウイルス粒子は、不活性化されたワクチン（または殺傷されたワクチン）として一般的に使用される。ＲＳＶは、培養において増殖させ、次に熱またはホルムアルデヒドなどの方法を使用して殺傷され得る。弱毒生ワクチンは、典型的には、複製および／または感染の速度がより遅くなるように弱体化されている。

【0137】

ある特定の実施形態において、本開示は、全体ウイルスワクチンとしてのキメラＲＳＶ粒子（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ粒子）、例えば、キメラＲＳＶのゲノムが非複製性または非感染性となるように熱、化学物質、または放射線に曝露された全体ウイルス粒子を想定する。ある特定の実施形態において、本開示は、洗浄剤を使用してウイルスを破壊することによりおよびウイルスに対する応答を開始させるために免疫系を刺激するための抗原として本明細書に開示されるキメラタンパク質を精製することにより製造されるスプリットウイルスワクチン中のキメラＲＳＶ粒子（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ粒子）を想定する。
ある特定の実施形態において、本開示は、配列番号１３～１８、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０４～１０９、および１１３からなる群から選択される配列または配列番号１３～１８、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０４～１０９、および１１３からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％）の配列同一性を有するそのバリアント、または上述のいずれかのＲＮＡ対応物、または上述のいずれかの相補的配列を含む弱毒生キメラＲＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アンチゲノムに関する。

【0138】

ＶＬＰは、成熟したビリオンに密接に似ているが、ウイルスゲノム材料（すなわち、ウイルスゲノムＲＮＡ）を含有しない。したがって、ＶＬＰは非複製性の性質である。さらに、ＶＬＰは、ＶＬＰの表面上にタンパク質を発現することができる。さらに、ＶＬＰはインタクトなビリオンに似ており、多価粒子状構造であるので、ＶＬＰは、表面タンパク質に対する中和抗体の誘導において有効であり得る。ＶＬＰは繰り返し投与され得る。

【0139】

ある特定の実施形態において、本開示は、表面上の本明細書に開示されるキメラＲＳＶ Ｆタンパク質（例えば、キメラコロナウイルスＳタンパク質－ＲＳＶ Ｆタンパク質）およびインフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ１）タンパク質コアを含むＶＬＰを想定する。Ｑｕａｎ ｅｔ ａｌ．は、インフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ１）タンパク質コアおよび表面上のＲＳＶ－Ｆから構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を製造する方法を報告している。（２０１１）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０４（７）：９８７－９９５。ＲＳＶ ＦおよびインフルエンザＭ１を発現する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成することができ、製造のためにそれらを昆虫細胞にトランスフェクトすることができる。

【0140】

使用方法
ある特定の実施形態において、本開示は、免疫学的有効量の本明細書に開示されるキメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ）、ＲＳＶおよび／もしくは非ＲＳＶ（例えば、コロナウイルス）ポリペプチド、キメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ）粒子、キメラＲＳＶウイルス様粒子（例えば、キメラコロナウイルス／ＲＳＶ ＶＬＰ、ならびに／または核酸を含む免疫原性組成物に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、非ＲＳＶウイルス（例えば、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する保護免疫応答を生成させるために個体の免疫系を刺激する方法に関する。ある特定の実施形態において、免疫学的有効量の本明細書に開示されるキメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ）、ポリペプチド、および／または核酸は、生理学的に許容される担体中で個体に投与される。

【0141】

ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される使用のための本明細書に開示される核酸を含む医薬およびワクチン製造物に関する。

【0142】

ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される使用のための医薬およびワクチン製造物の生産のための本明細書に開示される核酸またはベクターの使用に関する。

【0143】

本開示はまた、他の種類の弱毒化突然変異を分析するためおよびそれらをキメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ）にワクチンまたは他の使用のために組み込む能力を提供する。例えば、マウスの肺炎ウイルス（ＲＳＶのマウス対応物）の組織培養適合非病原系統はＧタンパク質の細胞質テイルを欠いている（Ｒａｎｄｈａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０７：２４０－２４５）。類似的に、糖タンパク質、ＨＮ、ＧおよびＳＨの各々の細胞質および膜貫通ドメインは、弱毒化を達成するために欠失または改変され得る。

【0144】

本開示の感染性キメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス／ＲＳＶ）における使用のための他の突然変異は、キメラＲＳＶミニゲノム（例えば、コロナウイルス－ＲＳＶミニゲノム）の突然変異分析の間に同定されるシス作用性シグナル中の突然変異を含む。例えば、リーダーおよびトレイラーならびに隣接配列の挿入および欠失分析は、ウイルスプロモーターおよび転写シグナルを同定し、ＲＮＡ複製または転写の様々な程度の低減と関連付けられる一連の突然変異を提供した。これらのシス作用性シグナルの飽和突然変異誘発（それにより次いで各々の位置はヌクレオチド代替物の各々に改変される）はまた、ＲＮＡ複製または転写を低減させる（または１つの場合において増加させる）多くの突然変異を同定した。これらの突然変異のいずれも、本明細書に記載されている完全なアンチゲノムまたはゲノムに挿入され得る。他の突然変異は、ＲＮＡ複製および転写における変化と関連付けられる、アンチゲノムからのその対応物でのゲノムの３’末端の置換を伴う。さらに、遺伝子間領域（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４５９４－４５９８；参照により本明細書に組み込まれる）は、短縮もしくは延長または配列内容における変化が可能であり、天然に存在する遺伝子オーバーラップ（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５１３４－５１３８；参照により本明細書に組み込まれる）は、本明細書に記載される方法により除去され得るかまたは異なる遺伝子間領域に変化され得る。

【0145】

ワクチン用途のために、本開示にしたがって製造されるウイルスは、ワクチン製剤において直接的に使用され得るか、または所望される場合、当業者に周知の凍結乾燥プロトコールを使用して凍結乾燥され得る。凍結乾燥されたウイルスは典型的には約４℃で維持される。使用のために準備済みとなったときに、凍結乾燥されたウイルスは、安定化溶液、例えば、アジュバントありもしくはなしの、食塩水、または、ＳＰＧ、Ｍｇ、およびＨＥＰＥＳを含む安定化溶液中に再構成される。

【0146】

典型的には、本開示のキメラＲＳＶワクチン（例えば、コロナウイルス－ＲＳＶワクチン）は、本明細書に記載されるように製造された免疫遺伝学的有効量のキメラウイルスを活性成分として含有する。改変されたウイルスは、生理学的に許容される担体および／またはアジュバントと共に対象に導入されてもよい。有用な担体は当技術分野において周知であり、例えば、水、緩衝化水、０．４％の食塩水、０．３％のグリシン、およびヒアルロン酸などを包含する。結果としてもたらされる水性溶液は、そのままの使用のために包装されるか、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は、上記のように、投与の前に無菌溶液と合わせられる。組成物は、生理学的条件を近似するために要求される場合に医薬的に許容される助剤物質、例えばｐＨ調整および緩衝化剤、張度調整剤、ならびに湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、およびオレイン酸トリエタノールアミンなどを含有してもよい。許容されるアジュバントは、当技術分野において周知の材料である、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンを包含する。

【0147】

ある特定の実施形態において、キメラＲＳＶワクチン（例えば、コロナウイルス－ＲＳＶワクチン）は、ポリプロピレンクライオバイアルに充填された無菌非アジュバント添加緩衝化水性溶液中で製剤化され得る。製剤は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ無血清培地、スクロース、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、Ｌ－グルタミン酸およびｐＨ ７．９へのｐＨ調整のための水酸化ナトリウムを含んでもよい。

【0148】

エアロゾル、小滴、経口、外用または他の経路を介した、本明細書に記載されているキメラＲＳＶ組成物（例えば、コロナウイルス－ＲＳＶ組成物）での免疫化で、対象の免疫系は、ウイルスタンパク質、例えば、Ｓ糖タンパク質に特異的な抗体を産生することによりワクチンに応答する。ワクチン接種の結果として、対象は、コロナウイルス感染に対して少なくとも部分的にもしくは完全に免疫性となるか、または特には下気道の、中等症もしくは重症コロナウイルス感染症の発症に対して抵抗性となる。

【0149】

ワクチンが投与される対象は、非ＲＳＶ（例えば、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）または密接に関連したウイルスによる感染を受けやすく、およびワクチン接種系統の抗原に対する保護免疫応答を生成する能力を有する任意の哺乳動物であることができる。そのため、好適な対象は、ヒト、非ヒト霊長動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ目動物、齧歯動物などを包含する。よって、本開示は、様々なヒトおよび獣医学的使用のためのワクチンを作出する方法を提供する。

【0150】

本開示のキメラＲＳＶ（例えば、コロナウイルス－ＲＳＶ）を含有するワクチン組成物は、コロナウイルス感染症を受けやすいかまたは他にそのリスクがある対象に対象自身の免疫応答能力を増強するために投与される。そのような量は「免疫原性有効用量」であると定義される。この使用において、精密な量は再び、対象の健康状態および体重、投与のモード、製剤の性質に依存する。ワクチン製剤は、深刻なまたは生命を脅かす感染症から対象患者を有効に保護するために十分な本開示のキメラコロナウイルス－ＲＳＶの量を提供するべきである。

【0151】

本開示にしたがって製造されるキメラＲＳＶ（例えば、コロナウイルス－ＲＳＶ）は、複数の非ＲＳＶ（例えば、コロナウイルス）亜群もしくは系統に対する保護を達成するために他の亜群もしくは系統のウイルスと組合せ可能であり、またはこれらの系統の保護的なエピトープは、本明細書に記載されている１つのウイルス中に操作され得る。典型的には、異なるウイルスは混合され、同時に投与されるが、別々に投与されてもよい。例えば、コロナウイルス亜群のＳ糖タンパク質はアミノ酸配列において異なるので、この類似性は、キメラコロナウイルス－ＲＳＶまたはＳ抗原で免疫化され、および異種系統でチャレンジされた動物において観察されるような交差保護免疫応答のための基礎である。そのため、１つの系統での免疫化は、同じまたは異なる亜群の異なる系統から保護することがある。

【0152】

一部の事例において、本開示のキメラＲＳＶワクチン（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶワクチン）を、他の作用因子に対する保護的な応答を誘導するワクチンと組み合わせることが望ましいことがある。例えば、本開示のキメラＲＳＶワクチン（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶワクチン）はインフルエンザワクチンと同時に投与され得る。

【0153】

本開示のワクチン組成物の単回または複数回投与が実行され得る。ある特定の実施形態において、ワクチン組成物の単回用量は、免疫を生成するために十分である。ある特定の実施形態において、アジュバントは要求されない。十分なレベルの免疫を誘発するために複数回の逐次的な投与が要求されることがある。投与は、人生の最初の月内、または約２か月齢の前、典型的には６か月齢以前に、小児期の全体を通じて間隔をおいて、例えば２か月、６か月、１年および２年時に、ネイティブな（野生型）感染症からの保護の十分なレベルを維持するための必要に応じて、開始されてもよい。同様に、繰返しのまたは深刻なコロナウイルス感染症を特に受けやすい成人、例えば、医療従事者、デイケア提供者、高齢者介護提供者、高齢者（５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、もしくは９０歳を上回る）、または心肺機能の低下を有する個体などは、保護免疫応答を確立および／または維持するために複数回の免疫化を要求することがある。誘導された免疫のレベルは、中和分泌および血清抗体の量を測定することによりモニター可能であり、所望されるレベルの保護を維持するために必要に応じて投薬量は調整されるかまたはワクチン接種は繰り返され得る。さらに、異なるワクチンウイルスが異なるレシピエント群のために有利なことがある。例えば、Ｔ細胞エピトープに富んだ追加のタンパク質を発現する操作された系統は、乳児ではなく成人のために特に有利なことがある。

【0154】

投与は、典型的には、エアロゾル、ネブライザー、または他の外用適用により、処置されている患者の気道に為される。組換えキメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ）は、所望される遺伝子産物の治療的または予防的レベルの発現を結果としてもたらすために十分な量で投与される。この方法において投与される代表的な遺伝子産物の例は、例えば、一過性発現のために特に好適もの、例えば、インターロイキン－２、インターロイキン－４、ガンマ－インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、エリスロポエチン、および他のサイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、細胞毒、腫瘍抑制因子遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、ならびにワクチン抗原をコードするものを包含する。

【0155】

ある特定の実施形態において、本開示は、免疫学的有効量の本開示の組換えキメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ）（例えば、弱毒化された生組換えキメラＲＳＶもしくは不活性化された非複製性キメラＲＳＶ）、免疫学的有効量の本明細書に開示されるポリペプチド、および／または免疫学的有効量の本明細書に開示される核酸を含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン）に関する。

【0156】

ある特定の実施形態において、本開示は、コロナウイルスに対する保護免疫応答を生成させるために個体の免疫系を刺激する方法に関する。方法において、免疫学的有効量の本明細書に開示される組換えキメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ）、免疫学的有効量の本明細書に開示されるポリペプチド、および／または免疫学的有効量の本明細書に開示される核酸は、生理学的に許容される担体中で個体に投与される。

【0157】

典型的には、担体または賦形剤は、医薬的に許容される担体または賦形剤、例えば無菌水、水性食塩水溶液、水性緩衝化食塩水溶液、水性デキストロース溶液、水性グリセロール溶液、エタノール、またはこれらの組合せである。無菌状態を確実にするそのような溶液の調製、ｐＨ、等張性、および安定性は、当技術分野において確立されたプロトコールにしたがって影響される。一般に、担体または賦形剤は、アレルギー性のおよび他の望ましくない効果を最小化するように、ならびに特定の投与の経路、例えば、皮下、筋肉内、鼻腔内、経口、外用などに適するように選択される。結果としてもたらされる水性溶液は、例えば、そのままの使用のためにまたは凍結乾燥されて包装されることができ、凍結乾燥された調製物は投与の前に無菌溶液と合わせられる。

【0158】

ある特定の実施形態において、キメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス／ＲＳＶ）またはその構成要素（例えば、キメラ非ＲＳＶ／ＲＳＶ融合タンパク質、例えばキメラコロナウイルスＳタンパク質－ＲＳＶ Ｆタンパク質）は、非ＲＳＶ、例えばコロナウイルスの１つ以上の系統に特異的な免疫応答を刺激するために十分な量で投与される。換言すれば、ある特定の実施形態において、免疫学的有効量のキメラＲＳＶ（例えば、コロナウイルス－ＲＳＶ）またはその構成要素、例えば、キメラ非ＲＳＶ／ＲＳＶ融合タンパク質（例えば、キメラコロナウイルスＳタンパク質－ＲＳＶ Ｆタンパク質）が投与される。好ましくは、キメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス／ＲＳＶ）の投与は保護免疫応答を誘発する。非ＲＳＶ（例えば、コロナウイルス）および／またはＲＳＶに対する保護免疫応答を生成させるために適合可能な、保護的な抗ウイルス免疫応答を誘発するための投薬量および方法は当業者に公知である。例えば、米国特許第５，９２２，３２６号明細書；Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：３９７－４００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ５２：５６－６３；およびＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．８８：９３１－９３６を参照。例えば、ウイルスは、投与される用量当たり約１０^３～１０^７ｐｆｕ（プラーク形成単位）の範囲内（例えば、投与される用量当たり１０^３～１０^７ｐｆｕ、１０^３～１０^６ｐｆｕ、１０^３～１０^５ｐｆｕ、１０^４～１０^７ｐｆｕ、１０^４～１０^６ｐｆｕ、または１０^４～１０^６ｐｆｕ）で提供され得る。ある特定の実施形態において、ウイルスは、投与される用量当たり約１０^３ｐｆｕの量で提供される。ある特定の実施形態において、ウイルスは、投与される用量当たり約１０^４ｐｆｕの量で提供される。ある特定の実施形態において、ウイルスは、投与される用量当たり約１０^５ｐｆｕの量で提供される。ある特定の実施形態において、ウイルスは、投与される用量当たり約１０^６ｐｆｕの量で提供される。ある特定の実施形態において、ウイルスは、投与される用量当たり約１０^７ｐｆｕの量で提供される。典型的には、用量は、例えば、年齢、身体条件、体重、性別、食事、投与のモードおよび時間、ならびに他の臨床的な要因に基づいて調整される。

【0159】

ワクチン製剤は、例えば、針およびシリンジまたは無針注射デバイスを使用して皮下または筋肉内注射により全身投与され得る。ワクチン製剤は気管内に投与され得る。好ましくは、ワクチン製剤は、鼻腔内に、例えば、液滴、エアロゾル（例えば、大粒子エアロゾル（約１０ミクロンより大きい））、または上気道への噴霧により投与される。上記の送達の経路のいずれも保護的な全身性免疫応答を結果としてもたらすが、鼻腔内投与は、ウイルスの侵入の部位において粘膜免疫を誘発する付加的な利益を付与する（すなわち、粘膜免疫応答および液性免疫応答の両方を生成し得る）。液性免疫（循環抗体）は深刻な肺疾患を予防するために重要であるが、粘膜抗体は、呼吸器ウイルスの感染および伝染を遮断するために重要である。鼻腔内投与のために、弱毒化生ウイルスワクチンが多くの場合に好ましく、これは例えば、弱毒化された、低温適合性および／または温度感受性組換えウイルスである。さらに、前臨床および臨床開発中の多くの候補ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンとは異なり、ある特定の実施形態において、本明細書に記載されている、生で弱毒化された、複製性キメラコロナウイルス／ＲＳＶワクチンの単回鼻腔内接種は、免疫を生成させるために十分であり得る。さらに、追加的にある特定の実施形態において、アジュバントは存在せず、追加の製剤成分の必要性および臨床研究においてアジュバント活性を評価する必要性が回避される。

【0160】

弱毒化生ウイルスワクチンの代替または追加として、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５５：１１９８－１２０４およびＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８：４９７－５０２により示唆されるように、例えば、殺傷されたウイルスワクチン、核酸ワクチン、および／またはポリペプチドサブユニットワクチンが使用され得る。

【0161】

ある特定の実施形態において、弱毒化組換えキメラコロナウイルス－ＲＳＶは、ワクチンにおいて使用され、ウイルス成分（例えば、本明細書における核酸またはポリペプチド）がワクチンまたは免疫原性成分として使用される実施形態において、感染の症状、または少なくとも深刻な感染症の症状が、弱毒化ウイルスで免疫化された（または他に感染した）ほとんどの個体において起こらないように十分に弱毒化される。しかしながら、軽症または重症下気道感染症がワクチン接種または偶発的対象において典型的には起こらないように、病原性は典型的には十分に妨げられる。

【0162】

単回用量での保護免疫応答の刺激が好ましいが、所望される予防効果を達成するために追加の投薬量が、同じまたは異なる経路により、投与され得る。例えば、新生児および乳児において、十分なレベルの免疫を誘発するために複数回投与が要求されることがある。投与は、野生型コロナウイルス感染症に対する十分なレベルの保護を維持するために必要に応じて小児期の全体を通じて間隔をおいて継続され得る。同様に、繰返しのまたは深刻なコロナウイルス感染症を特に受けやすい成人、例えば、医療従事者、デイケア提供者、高齢者介護提供者、高齢者（５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、もしくは９０歳を上回る）、および心肺機能の低下を有する個体などは、保護免疫応答を確立および／または維持するために複数回の免疫化を要求することがある。誘導された免疫のレベルは、例えば、ウイルス中和分泌および血清抗体の量を測定することによりモニター可能であり、所望されるレベルの保護を誘発および維持するために必要に応じて投薬量は調整されるかまたはワクチン接種は繰り返され得る。

【0163】

代替的に、免疫応答は、ウイルスでの樹状細胞のエクスビボまたはインビボ標的化により刺激され得る。例えば、増殖性樹状細胞は、樹状細胞によるコロナウイルス抗原の捕捉を許容するために十分な量および十分な時間的期間でウイルスに曝露される。細胞は次に、標準的な静脈内移植方法によりワクチン接種されるべき対象に移される。

【0164】

任意選択的に、ワクチンの投与のための製剤はまた、コロナウイルス抗原に対する免疫応答を増強するための１つ以上のアジュバントを含有する。想定されるアジュバントは、アルミニウム塩、例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）およびＡｄｊｕｐｈｏｓ（登録商標）を包含する。想定されるアジュバントは水中油エマルションを包含し、これにおいて、油は水相中の溶質として作用し、乳化剤により安定化された、単離された小滴を形成する。ある特定の実施形態において、エマルションは、スクアレンまたはα－トコフェロール（ビタミンＥ）を追加の乳化剤、例えば界面活性剤としてのトリオレイン酸ソルビタンおよびポリソルベート－８０（ＰＳ８０）と共に含有する。ある特定の実施形態において、エマルションはグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）を含有する。ＧＬＡは、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ、粒子またはキメラコロナウイルスＳタンパク質－ＲＳＶ Ｆタンパク質を単独でまたはスクアレンベース水中油安定エマルション（ＳＥ）中で用いて製剤化され得る。Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．は、ＲＳＶ Ｆタンパク質を使用する異なる粒子サイズの水中油アジュバントを報告している（（２０１５）Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １１（７）：１８５３－１８６４）。

【0165】

好適なアジュバントは、例えば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルション、カルメット－ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、および合成アジュバントＱＳ－２１を包含する。

【0166】

所望される場合、キメラコロナウイルス－ＲＳＶの予防的ワクチン投与は、１つ以上の免疫賦活性分子の投与と組み合わせて行われ得る。免疫賦活性分子は、免疫賦活、免疫強化、および炎症促進活性を有する様々なサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３）；増殖因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）－コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；ならびに他の免疫賦活性分子、例えばマクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２などを包含する。免疫賦活性分子は、キメラコロナウイルス－ＲＳＶと同じ製剤中で投与され得るか、または別々に投与され得る。免疫賦活効果を生成させるためにタンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかが投与され得る。

【0167】

特定の亜群の特定の系統のキメラコロナウイルス－ＲＳＶでの個体のワクチン接種は、異なる系統および／または亜群のウイルスに対する交差保護を誘導し得るが、交差保護は、所望される場合、例えば、各々が異なる亜群を表す、少なくとも２つの系統からの弱毒化コロナウイルスで個体をワクチン接種することにより増強され得る。同様に、キメラコロナウイルス－ＲＳＶワクチンは、他の感染性因子に対する保護免疫応答を誘導するワクチンと任意選択的に組み合わせられ得る。

【0168】

コロナウイルス弱毒生ワクチンについての潜在的な課題は組換え（遺伝子不安定性）である。天然のゲノム組換えは、コロナウイルスおよびニドウイルス目における他のポジティブセンスウイルスの共通の特色である。対照的に、天然の組換えは、ネガティブセンスモノネガウイルス目のＲＳＶおよび麻疹ウイルスのようなウイルス（野生型またはワクチン系統）について希少である。さらには、弱毒生ＲＳＶワクチンは、弱毒化突然変異はウイルス遺伝子の大規模なコドン脱最適化または欠失のいずれかを介するという事実に恐らくは起因して、遺伝学的に安定であることが示されている（Ｓｔｏｂａｒｔ（２０１６）、上掲）。よって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているキメラコロナウイルス－ＲＳＶは遺伝子不安定性をほとんどまたは全く呈しない。

【0169】

さらに、ＳＡＲＳコロナウイルスおよびＲＳＶは、ある特定の種類のワクチン、例えば、非複製性（例えばサブユニット）ワクチンタイプと関連付けられるワクチン関連増強呼吸器疾患（ＶＡＥＲＤ）の潜在的なリスクを共通して有する。しかしながら、弱毒生コロナウイルスワクチンは、他のワクチン技術、例えば固定化された全体ウイルス、サブユニット、および一部のベクターワクチンとは対照的にＶＡＥＲＤを実証していない。よって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているキメラコロナウイルス－ＲＳＶはＶＡＥＲＤのリスクを増加させない。ＶＡＥＲＤは、過度の肺免疫細胞浸潤物、Ｔｈ２炎症性サイトカインレベルの上昇、および病理組織診断による肺損傷を包含する炎症のマーカーを評価することにより前臨床動物モデルにおいて測定され得る。

【0170】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているキメラＲＳＶ（例えば、キメラコロナウイルス－ＲＳＶ）は、（１）結合性の非中和抗体と比べた高いレベルのウイルス中和抗体、および（２）カノニカルなＴｈ１抗ウイルス性サイトカインを有するＴ細胞応答を呈し、ならびに／または高いレベルのＴｈ２サイトカインに向かう不均衡を呈しない。

【実施例】

【0171】

以下の実施例は単に実例的なものであり、いかなる意味でも本発明の範囲または内容を限定することは意図されない。

【0172】

実施例１－キメラコロナウイルススパイクタンパク質－ＲＳＶ融合タンパク質の構築
ＭＶ－０１２－９６８に由来する弱毒化ＲＳＶベクター中のＲＳＶ ＧおよびＦタンパク質の代わりにＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質（系統ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）をクローニングすることにより弱毒生ワクチン候補のシリーズ（ａｔｔＲＳＶ－ＣｏＶ－２、ＭＶ－０１４シリーズ）を構築した（図１）。ＲＳＶ骨格はｍＫａｔｅ２蛍光タンパク質のための遺伝子を含有し、ＤＢ１ Ｑｕａｄ ｍＫａｔｅと呼ばれる。（（Ｒｏｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９２（６）ｅ０１５６８－１７）を参照）。

【0173】

ＲＳＶ Ｆの細胞質テイルがＲＳＶ感染性子孫アセンブリーのために要求される（Ｂａｖｉｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８７（１９），１０７３０－１０７４１）。したがって、Ｆを全長Ｓ遺伝子で置き換えることは、生存不可能なウイルスを結果としてもたらすという仮説を立てた。よって、図１において描写されるように、スパイクの細胞質テイルがＲＳＶ Ｆの細胞質テイルで置き換えられたキメラスパイク遺伝子を作出した（緑色Ｓ遺伝子の青色ＣＴ部分）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の細胞質テイルはスパイク－シュードタイプウイルスの感染力のために要求されなかった（Ｂｒｏｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０（３），１３０２－１３１０）。しかしながら、ＳＡＲＳ－１スパイクの膜貫通および膜近傍領域は、機序は十分に定義されていないが、アセンブリーおよび侵入のために必須である（Ｃｏｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ６（１），２３０；Ｇｏｄｅｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（３），１５６６－１５７１）。ＲＳＶ Ｆの細胞質テイルに融合したスパイクの膜貫通ドメインのアミノ酸配列（下線を引いたテキスト）が図１の下部において描写される。

【0174】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質エクトドメインと融合したＲＳＶ Ｆの異なるＣ末端配列を含有する６つの構築物を設計し、１つの野生型スパイク構築物を設計した（図２および全長配列のための添付物を参照）。

【0175】

ＢＡＣ ＤＢ１ Ｑｕａｄ ｍＫａｔｅ骨格（図３中の概略図を参照；ＢＡＣ ＤＢ１ Ｑｕａｄ ｍＫａｔｅの配列は配列番号４６である）にクローニングするための隣接ＡａｔＩＩおよびＳａｌＩ部位を含有するようにキメラスパイク－Ｆ遺伝子を設計し、ＲＳＶ ＧおよびＦタンパク質のための遺伝子を包含するＤＮＡ断片を置き換えた（ｎｔ ５，１１１～ｎｔ ８０１５）。

【0176】

挿入物２１０（配列番号４７）、２２０（配列番号５０）、２３０（配列番号５１）、２４０（配列番号５２）、および３００（配列番号５３）はＧｅｎｓｃｒｉｐｔにより合成され、挿入物２１１（配列番号４８）および２１２（配列番号４９）はＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより合成され、凍結乾燥ペレットとして受領した。

【0177】

スパイク－Ｆ挿入物およびＤＢ１ Ｑｕａｄ ｍＫａｔｅベクターを酵素ＡａｔＩＩおよびＳａｌ Ｉで消化した。消化されたスパイク－Ｆ挿入物（約４ｋｂ）ならびにＧおよびＦを有しないＤＢ１Ｑｕａｄ ｍＫａｔｅ（約２０ｋｂ）に対応するＤＮＡをゲルから精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートした。ライゲーションの生成物を使用してＯｎｅ－ｓｈｏｔ Ｓｔａｂｌ３化学コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃ７３７３０３）を形質転換した。形質転換体をＢＡＣ ＤＮＡのシークエンシングにより分析した。ＢＡＣ中にクローニングされたアンチゲノムを、構築物全体について約２（平均）のカバレージを提供する７４個のプライマーを使用してＧｅｎｅｗｉｚによりシークエンシングした。

【0178】

ＲＳＶ－コロナウイルスゲノムワクチン候補（ｍＫａｔｅ２マーカーあり）をコードするＢＡＣの配列を配列番号５４～５９（それぞれ挿入物２１０、２１１、２１２、２２０、２３０、および２４０）に提供する。野生型コロナウイルススパイクタンパク質を有するＲＳＶ－コロナウイルスゲノムをコードするＢＡＣの配列（挿入物３００）は配列番号６０にある。ＢＡＣ構築物内に含有されるｍＫａｔｅ含有ウイルスのためのアンチゲノム配列を配列番号１０４～１０９（それぞれ挿入物２１０、２１１、２１２、２２０、２３０、および２４０）に提供する。

【0179】

標識タンパク質ｍＫａｔｅ２を有しないこれらの構築物のバージョンを、制限クローニングを使用して構築した。特に、ｍＫａｔｅ２のための遺伝子を含有するＢＡＣの断片を、酵素ＫｐｎＩ（ＢＡＣ中で切断する）およびＡａｔＩＩ（アンチゲノムの内側で切断する）での消化を介して放出させた。ｍＫａｔｅ２なしのＤＢ１ Ｑｕａｄを同じ酵素で消化し、ｍＫａｔｅ２なしの断片を使用してＭＶ－０１４構築物中のｍＫａｔｅ２ありの断片を置き換える。ＲＳＶ－コロナウイルスゲノムワクチン候補（ｍＫａｔｅ２マーカーなし）を含むＢＡＣの配列を配列番号１３１～１３６（それぞれ挿入物２１０、２１１、２１２、２２０、２３０、および２４０）に提供する。

【0180】

ｍＫａｔｅ２なしならびに挿入物２１０、２１１、２１２、２２０、２３０、および２４０ありのＭＶ－０１４構築物をそれぞれ配列番号１３～１８に提供し、これらはワクチン候補のためのアンチゲノム配列である。

【0181】

すべてのクローンのためのＢＡＣを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ ＢＡＣまたはＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＺｙｍｏＰｕｒｅＩＩ ＭａｘｉＰｒｅｐキットを使用して５００ｍｌの終夜培養物から調製した。得られたＢＡＣ ＤＮＡ（ｍＫａｔｅマーカーありまたはなし）を実施例２に記載されるように組織培養でのウイルスレスキューのためにさらに使用した。

【0182】

実施例２－ウイルスのレスキュー
Ｖｅｒｏ ＲＣＢ２細胞を、４ｍＭのグルタミンを補充した無血清ＭＥＭ中で培養した。２ｍＬの培地を含有する６ウェルディッシュ中に７．５×１０ｅ５／ウェルで細胞を播種し、３７℃、５％のＣＯ_２において加湿インキュベーター中で終夜インキュベートした。翌日、培地を除去し、細胞単層をＯｐｔｉ－ＭＥＭで２回洗浄し、２ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと共に３７℃、５％のＣＯ_２において加湿インキュベーター中でインキュベートした。

【0183】

ウイルスをレスキューするために、Ｖｅｒｏ ＲＣＢ２細胞に、ＤＢ１－Ｑｕａｄ－ｍＫａｔｅ２ ＲＳＶまたはＭＶ－０１４－２１０（実施例１に記載されている２１０挿入物を有するＤＢ１－Ｑｕａｄ－ｍＫａｔｅ２ ＲＳＶ）のためのアンチゲノムを発現するプラスミドを、ｐＸＴ７ベクター中にクローニングされたコドン脱最適化されたＲＳＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ２．１およびＬを発現するヘルパープラスミドならびにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するプラスミドと共にトランスフェクトした。

【0184】

トランスフェクション混合物を、１５ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに混合し、混合物を室温で５分間インキュベートすることにより各々の条件についてアセンブルさせた。別々のチューブ中で、ＤＢ１－Ｑｕａｄ－ｍＫａｔｅ２（ＲＳＶベクター）またはＭＶ－０１４－２１０のアンチゲノムを含有するプラスミドＤＮＡ（１．５ｕｇ）を、ＲＳＶ－Ｎ（１ｕｇ）、ＲＳＶ Ｐ（１ｕｇ）、ＲＳＶ Ｍ２－１（０．７５ｕｇ）、ＲＳＶ Ｌ（０．５ｕｇ）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（１．２５ｕｇ）を発現するプラスミドと混合した。プラスミドＤＮＡ混合物を１．５ｍＬの微量遠心分離チューブ中の２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに加え、室温で５分間インキュベートした。ＤＮＡ － Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ混合物をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ混合物と合わせ、５秒間ボルテックスし、次に室温で３０分間インキュベートした。６ウェルプレート中の培地を除去し、ＤＮＡ－ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を細胞単層に緩徐に加えた。細胞を穏やかな振盪と共に室温で１ｈインキュベートした。このインキュベーションの終わりに、２ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを各々のウェルに加え、細胞を３７℃、５％のＣＯ_２において加湿インキュベーター中で終夜インキュベートした。

【0185】

翌日、培地を除去し、１０％のウシ胎仔血清および１ｘ抗生物質を補充した２ｍＬの１Ｘ ＭＥＭで置き換えた。

【0186】

図４ＡおよびＢは、ＭＶ－０１４－２１０およびＲＳＶヘルパープラスミドでのトランスフェクション後に複数回継代したＶｅｒｏ細胞単層上のウイルスフォーカスの蛍光および明視野画像（ＴＲＩＴＣ）ならびに細胞障害性効果（明視野）を提供する。示されるのは、１０Ｘ拡大での大きいフォーカス（図４Ａ）ならびに２．５Ｘ拡大での大規模な複製および拡散の証拠（図４Ｂ）である。ｍＫａｔｅ２発現を可視化するためにＴＲＩＴＣフィルターセットを使用して蛍光画像を生成した。ウイルスストックを感染Ｖｅｒｏ細胞から無細胞溶解液として調製し、それを使用して、異なる希釈で２４ウェルプレート中の新鮮なＶｅｒｏ細胞単層に感染させた（図４Ｃ）。無細胞溶解液での感染後のフォーカスの形成は、キメラスパイク－Ｆタンパク質を介して感染したインタクトな感染性粒子の単離と合致する。ｍＫａｔｅ２発現を検出するためにＣｅｌｉｇｏイメージング機器セットを使用して蛍光画像を生成した。

【0187】

この実験は、キメラコロナウイルススパイクタンパク質／ＲＳＶ Ｆタンパク質を有する組換えＲＳＶをコードするプラスミドはワクチンの調製における使用のために好適であることを実証した。

【0188】

実施例３－ＭＶ－０１４－２１２でのワクチン接種はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジから霊長動物を保護し、ＭＶＫ－０１４－２１２およびＢ．１．３５１バリアントの両方の特異的な中和を結果としてもたらす
ＭＶ－０１４－２１２およびＭＶＫ－０１４－２１２－Ｂ．１．３５１の設計および生成
ＭＶ－０１４－２１２は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の骨格に基づく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する新規の弱毒生組換えワクチンである（図１）。ＲＳＶの付着および融合タンパク質ＧおよびＦを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（系統ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）のエクトドメインおよび膜貫通（ＴＭ）ドメインならびにＲＳＶ Ｆ（１９株系統）の細胞質テイルからなるキメラタンパク質により置き換えた。スパイクとＦタンパク質との間のジャンクションにおけるアミノ酸の配列を図１に示す。顕著なことに、ＭＶ－０１４－２１２増殖は宿主細胞との付着および融合に依拠するので、キメラスパイク／ＲＳＶ Ｆタンパク質は機能性を保持する。ジャンクション位置において異なる様々なキメラスパイク構築物をＶｅｒｏ細胞における増殖について評価した（図２）。特に、ネイティブなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク全体を有する構築物を評価した（ＭＶ－０１４－３００、図２）。この構築物はレスキュー可能であったが、細胞培養において効率的に増殖しなかった。レスキュー実験の結果を表３に示す。

【0189】

異なるキメラスパイク／ＲＳＶ Ｆ融合タンパク質を発現する構築物のうち、レスキューの容易さならびに前臨床および臨床研究のために許容される力価まで増殖する能力に基づいてＭＶ－０１４－２１２をさらなる評価のために選択した。

【0190】

ＭＶ－０１４－２１２を生成するために使用されたＲＳＶ骨格を、宿主先天免疫を抑制するタンパク質ＮＳ１およびＮＳ２をコードする遺伝子のコドン脱最適化により初代細胞中での複製のために弱毒化した（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ｍＢｉｏ ５（５）：ｅ０１７０４－１４）。さらに、短い疎水性糖タンパク質ＳＨを欠失させて下流の遺伝子の転写を増加させた（Ｂｕｋｒｅｙｅｖ １９９７）。

【0191】

マイクロ中和アッセイの開発を促すために、ＭＶ－０１４－２１２に由来するレポーターウイルスもまた、ＮＳ１遺伝子の上流に蛍光ｍＫａｔｅ２タンパク質（Ｈｏｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３４（１）：１２９－３６、Ｓｈｃｈｅｒｖｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．４１８（３）：５６７－７４）をコードする遺伝子を挿入することにより構築した（ＭＶＫ－０１４－２１２、ｍＫａｔｅのためにＫ、図１、下）。

【0192】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は突然変異の高い率を有し、新たなバリアントは急速に進化する。最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアント系統は、中和エピトープの喪失およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－１またはＵＳＡ／ＷＡ２０２０の祖先系統（スパイクコーディング領域において同一）でのワクチン接種または天然感染により生じる免疫の結果的な逃避に繋がることが疑われるスパイクＲＢＤ中の突然変異を示すため、懸念を生じさせている。留意されるのはバリアントＢ．１．３５１であり、これはスパイクタンパク質中に８つの突然変異を有し、それらのうちの３つはＲＢＤ中に存在する：Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ（Ｔｅｇａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ ５９２（７８５４）：４３８－４４３）。特に、Ｅ４８４Ｋはまた、中和逃避突然変異体を単離するために中和血清の存在下での繰返しの継代を通じて同定された（Ａｎｄｒｅａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ［Ｐｒｅｐｒｉｎｔ］．Ｄｅｃ ２８：２０２０．１２．２８．４２４４５１）。いくつかの研究は、現行で市販されているワクチンにより誘発されるかまたは回復期血清中に存在する中和抗体は、Ｗｕｈａｎ－１系統と比較してＢ．１．３５１バリアントの中和においてより低い効率であることを示している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔｕｒｅ ５９２（７８５５）：６１６－６２２； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０２１ Ａｐｒ １５；３８４（１５）：１４６６－１４６８； Ｍａｄｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３８４（２０）：１８８５－１８９８；Ｗｉｂｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔ Ｍｅｄ．２７（４）：６２２－６２５）。

【0193】

よって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントＢ．１．３５１において観察されたスパイク中の突然変異を組み込んだＭＶＫ－０１４－２１２のバリアント、ＭＶＫ－０１４－２１２－Ｂ．１．３５１を生成させた。ＭＶＫ－０１４－２１２と比べたＭＶＫ－０１４－２１２－Ｂ．１．３５１中のバリエーションを表４に列記する。

【0194】

すべての組換えウイルス構築物をＶｅｒｏ細胞にエレクトロポレートし、感染性ウイルスをレスキューし、さらなる特徴付けのために増殖させた（Ｈｏｔａｒｄ（２０１２）、上掲）。簡潔に述べれば、Ｖｅｒｏ細胞に、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ＭＶ－０１４－２１２をコードする細菌人工染色体（ＢＡＣ）（またはレポーターウイルス）を、Ｔ７ポリメラーゼならびにＲＳＶタンパク質Ｎ、Ｐ、Ｍ２－１およびＬをコードするヘルパープラスミドと共にエレクトロポレートした（図５）。エレクトロポレーションからの回復の間に、細胞を細胞障害性効果（ＣＰＥ）の証拠についてモニターした。ＭＶ－０１４－２１２において、ＣＰＥは、多核化ボディまたは合胞体の形成および最終的な細胞剥離として観察される（図６）。エレクトロポレートされた細胞を、ＣＰＥが大規模となるまで拡大増殖させ、ウイルスストックを全細胞溶解液として採取した。ＭＶ－０１４－２１２および誘導化ウイルスについて得られた力価は同等であり、１～５ １０^５ＰＦＵ／ｍＬの範囲内であった。図６は、ＭＶ－０１４－２１２およびＭＶＫ－０１４－２１２のレスキューの間に撮影された顕微鏡写真を示す。

【0195】

ＭＶＫ－０１４－２１２－Ｂ．１．３５１中のキメラコロナウイルススパイク／ＲＳＶ Ｆタンパク質のタンパク質配列を配列番号６２に提供し、該タンパク質をコードする核酸配列を配列番号６３に提供する。ＭＶＫ－０１４－２１２－Ｂ．１．３５１（ｍＫａｔｅマーカーを含有する）の全長ウイルス配列を配列番号６４に提供し、ＭＶ－０１４－２１２－Ｂ．１．３５１（ｍＫａｔｅマーカーを含有しない）の全長ウイルス配列を配列番号６５に提供する。ＭＶＫ－０１４－２１２－Ｂ．１．３５１（ｍＫａｔｅマーカーを含有する）を含むＢＡＣの配列を配列番号６６に提供し、ＭＶ－０１４－２１２－Ｂ．１．３５１（ｍＫａｔｅマーカーを含有しない）を含むＢＡＣの配列を配列番号６７に提供する。

【0196】

ＭＶ－０１４－２１２のインビトロ特徴付け
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、フューリン様プロテアーゼによりプロセシングされるＳ１ドメインとＳ２ドメインとの間の切断部位を含有する（図７およびＨｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （２０２０） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７８（４）：７７９－７８４．ｅ５）。他のコロナウイルスと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクのＳ１およびＳ２サブユニットは、切断後に融合前コンホメーションにおいて非共有結合的に結合したままとなると考えられている（Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃｅｌｌ １８１（２）：２８１－２９２．ｅ６、Ｂｕｒｋａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１０（１１）：ｅ１００４５０２）。ＭＶ－０１４－２１２によりコードされるキメラスパイクタンパク質が発現され、タンパク質分解によりプロセシングされるかどうかを決定するために、感染したＶｅｒｏ細胞の溶解液から調製されたウイルスストックをウエスタンブロットで分析し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対するポリクローナル抗血清でプロービングした。ＭＶ－０１４－２１２およびＭＶＫ－０１４－２１２の両方のウイルスは、全長および切断型のキメラスパイクタンパク質を発現し（図８Ａ）、これはＳ１－Ｓ２ジャンクションにおける部分的な切断と合致し、予想されるものと合致した見かけのサイズを有する（図８Ａ、Ｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．１１（１）：１６２０、エラータ：Ｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２（１）：２１４４；Ｐｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｄｏｉ：１０．１０３８）。

【0197】

ＭＶ－０１４－２１２の増殖動態をＶｅｒｏ細胞において野生型組換えＲＳＶ Ａ２と比較した（図８Ｂ）。Ｖｅｒｏ細胞に０．０１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させ、全細胞溶解液からの感染性ウイルスを感染後０、１２、２４、４８、７２、９６および１２０時間（ｈｐｉ）においてプラークアッセイにより定量化した。ＭＶ－０１４－２１２は、ＲＳＶ Ａ２と比べて増殖動態の遅延を呈し、約１２時間の初期遅延期を示した。両方のウイルスは７２ｈｐｉにおいてそれらのピーク力価に達し、力価は１２０ｈｐｉまで一定のままであった。ＭＶ－０１４－２１２のピーク力価は、ＲＳＶ Ａ２のそれよりも約１桁低かった。ｍＫａｔｅ２遺伝子の挿入がＭＶＫ－０１４－２１２の複製動態に影響するかどうかを決定するために、Ｖｅｒｏ細胞にＭＶ－０１４－２１２またはＭＶＫ－０１４－２１２を０．０１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させ、感染性ウイルスを３、２４および７２ｈｐｉにおいてプラークアッセイにより測定した。ＭＶＫ－０１４－２１２の増殖動態はＭＶ－０１４－２１２のそれに類似しており、７２ｈｐｉまでに同等のピーク力価に達した（図８Ｃ）。これらのデータは、第１の遺伝子位置中のｍＫａｔｅ２の挿入はインビトロでＲＳＶ Ａ２－１９Ｆ株を有意に弱毒化しなかったという報告と合致する（Ｈｏｔａｒｄ ｅｔ ａｌ（２０１２）、上掲）。

【0198】

ＭＶ－０１４－２１２の短期熱安定性を評価するために、ウイルスストックのアリコートを異なる温度で６時間の期間にわたりインキュベートし、インキュベーション後の感染性ウイルスの量をプラークアッセイにより決定した。異なる賦形剤中で調製されたＭＶ－０１４－２１２の２つのストックをこの研究において比較した（図８Ｄ）。結果は、ＭＶ－０１４－２１２はいずれかの賦形剤中で－８０℃および室温において少なくとも６時間安定であることを実証する。

【0199】

ＭＶ－０１４－２１２の遺伝子安定性をＶｅｒｏ細胞中での連続継代により調べた。サブコンフルエントのＶｅｒｏ細胞に３連でＭＶ－０１４－２１２のアリコートを感染させ、１０回の連続する継代にわたり継代した（図９）。ウイルスＲＮＡを継代０および１０から単離し、ＲＴ－ＰＣＲにより増幅した。ウイルスゲノムのコーディング領域全体の配列をサンガーシークエンシングにより決定した。結果は、３つすべての系列について出発ストック（継代０）と比べて継代１０において検出された変動はないことを示した。ワクチン候補はインビトロで遺伝学的に安定であった。

【0200】

ＭＶ－０１４－２１２複製はアフリカミドリザルにおいて減弱され、ｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジからの保護を付与する
アフリカミドリザル（ＡＧＭ）はｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｏｏｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１）：８６－９８、Ｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｖｉｒｏｌ Ｊ．７（１）：１２５、Ｂｌａｉｒ（２０２１）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１９１（２）：２７４－２８２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｖｉｒｏｌ．４８：７３－８１）およびＲＳＶ（Ｔａｙｌｏｒ（２０１７）Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（３）：４６９－４８０）の複製をサポートし、したがってＭＶ－０１４－２１２の弱毒化および保護免疫を研究するための適切な非ヒト霊長動物モデルを構成する。

【0201】

ＡＧＭ研究設計が図１０において描写される。０日目に、ＡＧＭに鼻腔内（ＩＮ）および気管内（ＩＴ）経路を介して各々の部位において１．０ｍＬの３×１０^５ＰＦＵ／ｍＬのＭＶ－０１４－２１２またはｗｔ ＲＳＶ Ａ２を６×１０^５ＰＦＵ／動物の総用量で接種した。ＡＧＭはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＲＳＶの両方について準許容的に過ぎないため、気管内接種は、肺中でのワクチンまたはチャレンジＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を可能とする必要があった。モック群の動物に同様にＰＢＳをモック接種させた。鼻スワブ（ＮＳ）および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）試料を免疫化後１２日を通じて収集した。ＮＳおよびＢＡＬ試料中のウイルスシェディングを、凍結されなかった新鮮な試料を使用して研究施設においてプラークアッセイにより決定した。図１１Ａ～Ｂに示される結果は、ＭＶ－０１４－２１２を接種された動物における感染性ウイルスのレベルおよび鼻分泌物中のシェディングの持続期間は、ＲＳＶを接種された動物よりも低いことを示した（図１１Ａ）。ＲＳＶについての平均ピーク力価は、ＭＶ－０１４－２１２接種動物について観察されたものよりも約２０倍高かった。これらの結果は、ＭＶ－０１４－２１２はＲＳＶと比較してＡＧＭの上気道中で弱毒化されることを示す。

【0202】

低いウイルス力価から検出不可能なウイルス力価はまた、ＭＶ－０１４－２１２またはＲＳＶ系統Ａ２を接種された動物の下気道において１２日の経過にかけて観察された。両方のウイルスは低いレベルで複製されたが、ピークレベルはＭＶ－０１４－２１２についてより早く起こった。この研究においてＲＳＶ Ａ２は、肺におけるＭＶ－０１４－２１２の弱毒化を実証する能力を混乱させる文献（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８３（１）：５９－６８；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ ２１（２５－２６）：３６４７－５２；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７８（２０）：１１１９８－２０７；Ｌｅ Ｎｏｕｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（３６）：１３１６９－７４）において報告された野生型ＲＳＶ Ａ２力価と比較して２～３ｌｏｇ低いＡＧＭの下気道におけるピーク力価を示した。その後に、より低いｒＡ２力価はまた、生物学的派生ＲＳＶ系統と比べてコットンラットの肺において観察され（実施例４および図１２Ａ～Ｄを参照）、この研究において使用されたｒＡ２は肺において弱毒化されることを示唆した。

【0203】

ワクチン接種後６日目の鼻およびＢＡＬ試料を使用して、ＭＶ－０１４－２１２のスパイク遺伝子の配列解析用のＲＮＡを抽出した。サンガーシークエンシングを使用して、スパイク遺伝子における変動はＭＶ－０１４－２１２についての参照配列と比較して検出されなかった。

【0204】

２８日目にＡＧＭを１×１０^６ ＴＣＩＤ_５０のｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でチャレンジした。ＮＳおよびＢＡＬ試料をチャレンジ後１０日間収集した。ｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のシェディングをＥ遺伝子サブゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のＲＴ－ｑＰＣＲにより測定した（図１３Ａ～Ｂ）。

【0205】

ＭＶ－０１４－２１２をワクチン接種されたサルは、より高いレベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡを有したｗｔ ＲＳＶ Ａ２またはＰＢＳ（モック）を接種された動物とは対照的にＮＳ試料中で低いまたは検出不可能なレベルのｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡを有した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡのレベルは、ＭＶ－０１４－２１２をワクチン接種された動物においてほとんどの時点において検出不可能であったが、１匹の動物は２日目に検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡを有し、異なる動物はチャレンジ後４日目に類似した力価を有した。対照ＲＳＶおよびＰＢＳ群における動物のＮＳにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の平均ピーク力価は、ＭＶ－０１４－２１２をワクチン接種された動物についてよりもそれぞれ２０および２５０倍高かった。ＲＳＶ感染動物およびモック感染動物の両方においてｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡのシェディングは、４～１０日目の鼻分泌物において安定的に減少し、１０日目までに両方の群のすべての動物は検出不可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡを有した。

【0206】

ＭＶ－０１４－２１２でのワクチン接種は、ＲＳＶ Ａ２を接種されたかまたはＰＢＳをモック接種された動物と比較して肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のクリアランスを増加させた。ＢＡＬ試料におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のピーク力価は２日目において起こり、３つすべての処置群において類似していた。肺力価は、ＭＶ－０１４－２１２ワクチン接種動物において４日目～１０日目に検出不可能であったが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＲＳＶ Ａ２を接種されたかまたはＰＢＳをモック接種された動物において容易に測定された。以前に、微量のｓｇＲＮＡが接種物において検出されたため（ＢＩＯＱＵＡＬ、未公開の結果）、シェディングの１日目に検出されたシグナルの一部は接種物に帰せられ得る。

【0207】

以上を合わせると、これらのデータは、ＭＶ－０１４－２１２の単回粘膜投与はＡＧＭをｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジから保護したことを示す。

【0208】

ＭＶ－０１４－２１２は、広く中和性のＡＧＭにおけるスパイク特異的抗体応答を誘発し、懸念とするバリアントに対する中等度の保護を与える。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的血清ＩｇＧおよび鼻ＩｇＡを、ＭＶ－０１４－２１２、ＲＳＶ Ａ２、またはＰＢＳで免疫化されたＡＧＭからのそれぞれ血清および鼻スワブにおいて免疫化後２５日目にＥＬＩＳＡにより測定した（図１４Ａにおける概略図および図１４ＢにおけるＩｇＡ標準曲線を参照）。すべての動物は研究の開始時にＲＳＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について血清反応陰性であった。ＭＶ－０１４－２１２を接種されたＡＧＭは、検出限界に近いスパイク特異的ＩｇＧのレベルを有したＲＳＶ Ａ２またはＰＢＳを接種されたＡＧＭと比較してより高いレベルの血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的ＩｇＧを産生した（図１５Ａ）。

【0209】

スパイク特異的ＩｇＡはまた、ＭＶ－０１４－２１２を接種されたサルの鼻スワブにおいて検出された。ワクチン接種の２５日後にＭＶ－０１４－２１２ワクチン接種動物において鼻スパイク特異的ＩｇＡにおける８倍より大きい増加があった（図１５Ｂ）。対照的に、ＲＳＶまたはモックワクチン接種動物はＩｇＡにおける有意な変化を示さなかった。

【0210】

これらの結果は、ＭＶ－０１４－２１２の粘膜接種は機能的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに対する鼻および全身の両方の抗体応答を誘導することを示した。

【0211】

野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはＢ．１．３５１バリアントに対する中和抗体が、ＭＶ－０１４－２１２をワクチン接種されたサルにおいて誘発されたかどうかを決定するために、レポーターウイルスＭＶＫ－０１４－２１２およびＭＶＫ－０１４－２１２－Ｂ．１．３５を使用してマイクロ中和アッセイを実行した。追加のレポーターウイルス、ｍＫａｔｅ２で標識された野生型組換えＲＳＶ Ａ２（ｒＡ２－ｍＫａｔｅ）を陰性対照として含めた。ワクチン接種の前（「前」）および後（「免疫化」）の２頭のＡＧＭについての中和力価を図１５Ｃに示す。中和における有意な増加が、ワクチン接種後の相同レポーター（ＭＶＫ－０１４－２１２）について観察された（図１７も参照）。Ｂ．１．３５１バリアントに対する中等度の交差中和もまた観察され、バリアントの平均ＮＴ５０は相同ウイルスについてよりも約７倍低かった。Ｂ．１．３５１バリアントについての中和力価におけるこの低減は、他のワクチンについて報告されたものと同じオーダーである（Ｐｌａｎａｓ ｅｔ ａｌ（２０２１）Ｎａｔ Ｍｅｄ．２７（５）：９１７－９２４、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０２１）、上掲、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｎａｔｕｒｅ ５９２（７８５５）：６１６－６２２）。

【0212】

よって、実施例は、ＭＶ－０１４－２１２への感染は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的粘膜ＩｇＡ応答を誘導し、バリアントＢ．１．３５１を包含する、スパイク発現シュードウイルスに対する血清中和抗体を生成させ、上および下気道においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対して高度に保護的であったことを実証する。

【0213】

考察
ＭＶ－０１４－２１２は、鼻腔内に投与されてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する粘膜免疫の他に全身性免疫を刺激するように設計された組換え弱毒生ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンである。ＭＶ－０１４－２１２は、コドン脱最適化されたＮＳ１およびＮＳ２遺伝子を発現する弱毒化ＲＳＶ系統においてＲＳＶ膜表面タンパク質Ｆ、ＧおよびＳＨの代わりに機能的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するように操作された。実際に、ＭＶ－０１４－２１２の複製は、鼻および気管における粘膜投与後のアフリカミドリザルの気道において減弱され、Ｓ ＡＲＳ－ＣＶ－２スパイク特異的粘膜ＩｇＡおよび血清ＩｇＧを誘発した。さらには、ＭＶ－０１４－２１２でのワクチン接種は、血清中和抗体を誘導し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジから保護した。これらのデータは、弱毒生ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンでの単回粘膜免疫化は非ヒト霊長動物においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する保護免疫を誘導できることを示唆する。

【0214】

ＭＶ－０１４－２１２は遺伝学的に安定であり、ウイルスがＶｅｒｏ細胞中で１０回連続継代された場合にバリアントの蓄積は検出されなかった。これは、突然変異がＶｅｒｏ Ｅ６細胞中での継代９において生じたＶＳＶ骨格に基づく別の組換え弱毒生ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン（Ｙａｈａｌｏｍ－Ｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０） Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．１１（１）：６４０２）と対比される。これらの突然変異の１つは多塩基性Ｓ１／Ｓ２フューリン切断部位において起こり、別のものは、スパイク細胞質テイルの２４アミノ酸切断を結果としてもたらす停止コドンを生成させた。スパイク細胞質テイルの切断はまた、ｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｏｕ、上掲）またはシュードタイプＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２８（３）：４７５－４８５．ｅ５、Ｄｉｅｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２８（３）：４８６－４９６．ｅ６）を組織培養において増殖させた場合に報告された。アフリカミドリザルの鼻スワブおよびＢＡＬからのＭＶ－０１４－２１２のスパイク遺伝子もまたサンガーシークエンシングにより分析したところ、変動は参照配列と比較して観察されなかった。したがって、ＭＶ－０１４－２１２におけるキメラスパイク遺伝子はインビトロおよびインビボで安定な遺伝子型を有するようである。

【0215】

アフリカミドリザルは、ＲＳＶ（Ｔａｙｌｏｒ、上掲）およびｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製（Ｗｏｏｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．上掲、Ｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．上掲、Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．上掲、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．上掲）について準許容的であり、ＭＶ－０１４－２１２を評価するためにアカゲザルの代わりに選択された。ＭＶ－０１４－２１２ワクチン接種サルは、ＲＳＶおよびＰＢＳ免疫化群とは対照的にチャレンジ後のＮＳ試料において低いまたは検出不可能なレベルのｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡを有した。ＭＶ－０１４－２１２でのワクチン接種はまた、肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のクリアランスを増加させた。サブゲノムＥ遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲにより検出されたｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シェディングは、ＲＳＶおよびＰＢＳ免疫化群の上および下気道において１または２日目の早期にピークとなった。これは、ウイルスゲノムのＲＴ－ｑＰＣＲにより、ならびにＡＧＭにおいてｗｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＩＮＭＩ１－Ｉｓｏｌａｔｅ／２０２０／ＩｔａｌｙについてＣｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．上掲およびＷｏｏｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．上掲により報告されたプラークアッセイにより検出されたシェディング動態と類似していた。ＲＳＶおよびモックワクチン接種群において観察されたピークＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブゲノムＲＮＡのレベルは、非ワクチン接種アカゲザルにおいて観察されたものと同等であった（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ ５８６（７８３０）：５６７－５７１、Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０（０９．０８．２８０８１８；ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０９．０８．２８０８１８）、Ｍｅｒｃａｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ ５８６（７８３０）：５８３－５８８、ｖａｎ Ｄｏｒｅｍａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ ５８６（７８３０）：５７８－５８２）。

【0216】

ＭＶ－０１４－２１２でのＡＧＭの免疫化は、粘膜および全身の両方の抗体応答を結果としてもたらした。ｗｔ ＲＳＶ Ａ２またはＰＢＳ接種を受けたＡＧＭと比較してＭＶ－０１４－２１２ワクチン接種ＡＧＭにおいて約１００倍多くのスパイク特異的総血清ＩｇＧがあった。スパイク特異的ＩｇＡもまた、ＭＶ－０１４－２１２免疫化動物の鼻スワブにおいて検出された。ＭＶ－０１４－２１２でのワクチン接種の２５日後にＩｇＡ濃度における約８倍の増加があった。対照的に、ＲＳＶまたはモック免疫化サルはＩｇＡ濃度における上昇を示さなかった。実験的ヒトチャレンジ研究において、低いＲＳＶ Ｆ特異的粘膜ＩｇＡは、血清陽性成人におけるＲＳＶチャレンジに対する感受性の、血清抗体レベルよりも良好な予測因子であった（Ｈａｂｉｂｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９１（９）：１０４０－９）。実際に、スパイクＲＢＤ特異的二量体血清ＩｇＡは、単量体ＩｇＧよりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和において強力であることが示された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、上掲）。推測によれば、二量体ＩｇＡとして粘膜表面に存在する分泌性ＩｇＡは、感染の部位においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力な阻害剤として作用する可能性がある。興味深いことに、Ｓｔｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（（２０２１）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．１３（５７７）：ｅａｂｄ２２２３）は最近、ＩｇＡ抗体はヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症において早期液性応答を支配し、粘膜ホーミング潜在能力を有するＩｇＡ形質芽球は疾患開始の第３週の間にピークとなることを報告した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体応答における上昇が、ＭＶＫ－０１４－２１２、ｍＫａｔｅ２発現ＭＶ－０１４－２１２ウイルスに対して検出された。中和抗体応答はまた、Ｂ．１．３５１、南アフリカからの懸念となるバリアントのスパイクを有するレポーターウイルスに対して検出された。Ｂ．１．３５１に対するＮＴ５０は、相同的ＵＳＡ－ＷＡ２０２０スパイクと比較して約７倍低かった。ＡＧＭは、ＲＳＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して準許容的であり、ＣＯＶＩＤ－１９からの保護と関連付けられるヒト回復期およびワクチン接種後血清において観察される力価との直接的な比較を不可能にした。保護の相関は、救急使用のために承認されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンについてヒトにおいて確立されていない。しかしながら、ＭＶ－０１４－２１２ワクチン接種ＡＧＭは、アカゲザルにおいてＥＵＡワクチンを用いて観察されたものと同等のレベルの保護を達成した（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）上掲、Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０２１）上掲、Ｍｅｒｃａｄｏ ｅｔ ａｌ（２０２０）上掲、ｖａｎ Ｄｏｒｅｍａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）上掲）。

【0217】

ＷＨＯにより作成された２０２０年５月１４日の「Ｔｈｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（ウェブサイトｗｈｏ．ｉｎｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍ／ｉｔｅｍ／ｄｒａｆｔ－ｌａｎｄｓｃａｐｅ－ｏｆ－ｃｏｖｉｄ－１９－ｃａｎｄｉｄａｔｅ－ｖａｃｃｉｎｅｓを参照）によれば、世界中で臨床開発中のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが現在、１０１ある。これらの候補の中で７つのみが鼻腔内ワクチンである（表５）。２つの他の鼻腔内ワクチン候補は弱毒生ウイルスである。これらのワクチン候補とは異なり、ＭＶ－０１４－２１２は、天然に組換えを起こす傾向がない非セグメント化ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＮＡ組換えは、実験室の状況において実験的共感染外で非セグメント化ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスについて極めて希少であり、再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）のための機序はない（Ｓｐａａｎ ２００３、Ｈａｎ ２０１１、Ｔａｎ ２０１２）。

【0218】

【0219】

ＭＶ－０１４－２１２のワクチンプロファイルは、救急使用のために承認されているかまたは臨床開発中の現行のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの中で独特である。ＭＶ－０１４－２１２は、鼻腔内に、世界的な免疫化のために潜在的な利点を与えるニードルフリー経路で投与される。鼻腔内経路は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の天然の経路に類似しており、いかなるアジュバント製剤もなしにＡＧＭにおいて粘膜免疫応答および液性免疫応答の両方を生成する。フェーズ１臨床研究材料の製造からの収率に基づくモデリングは、高強度バイオリアクターシステムを使用する中サイズの設備において年間数億もの用量の潜在的な用量出力を見積もった。粘膜に送達された弱毒生ワクチン、例えばＭＶ－０１４－２１２は、最小の下流のプロセシングを必要とし、低コストの商品が予期される。さらに、ニードルフリー送達は供給リスクを低減させる。全体として、ＭＶ－０１４－２１２は、一次ワクチンまたは異種ブースターとして国内および世界的配備のためによく適する。ＭＶ－０１４－２１２は現行で、フェーズ１臨床試験（ＮＣＴ０４７９８００１）において単回用量鼻腔内ワクチンとして評価されている。

【0220】

材料および方法
細胞および動物
Ｖｅｒｏ ＲＣＢ１（ＷＨＯ Ｖｅｒｏ ＲＣＢ １０－８７）細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）および１００Ｉ．Ｕ．／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシン、０．０８５ｇ／ＬのＮａＣＩからなる１Ｘ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｍｉｘを含有する最小必須培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。ＲＣＢ２細胞はＲＣＢ１に由来し、無血清培地中で増殖するように適合されている。この研究において使用されたＲＣＢ２細胞を、４ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した無血清培地ＯｐｔｉＰｒｏ（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。両方のＶｅｒｏ細胞株を３７℃、５％のＣＯ_２において９５％の湿度と共に培養した。

【0221】

アフリカミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）はＳｔ Ｋｉｔｔｓにおいて得られ、不定の年齢、約３～６ｋｇの体重であった。サルをＲＳＶマイクロ中和アッセイおよびスパイクＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ（ＢＩＯＱＵＡＬ）によりＲＳＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について血清反応陰性であることをスクリーニングおよび検証した。動物はまた、獣医スタッフによる身体検査を行って、研究前の適切な健康状態を確認した。各々のＡＧＭは、タトゥーにより独特に同定された。１頭の雄および３頭の雌をＭＶ－０１４－２１２およびＲＳＶ群に割り当てた。２頭の雌および１頭の雄をモック群に割り当てた。ケージサイド観察は、死亡、瀕死、全般的健康状態および毒性の徴候を含んだ。臨床的な観察は、皮膚および毛皮の特徴、目および粘膜、呼吸、循環、自律神経および中枢神経系、体運動性、ならびに行動パターンを含んだ。各々のサルの体重を投薬期間の開始前および鎮静状態の各々の時点において記録した。ＡＧＭの気道におけるＭＶ－０１４－２１２複製の全体的な低いレベルと合致して、処置関連と考えられる有害事象はワクチンの接種後に観察されなかった。ワクチン接種後１６日目にＭＶ－０１４－２１２を接種された１頭のサルは予想外なことに死亡した。死は最後のＮＳおよびＢＡＬ試料収集の４日後に起こった。死の原因の確定的な決定は、肉眼的または顕微鏡的な死後評価に基づいて確認できなかったが；死がワクチン関連であることを示唆する証拠はなかった。さらに、死亡した動物は、この処置群中の他の動物と比較してＮＳ試料中の最低の力価を有し、１つのスワブのみがプラークアッセイの検出限界（５０ＰＦＵ／ｍＬ）より高いウイルスを含有し、評価されたいずれの時点においてもＢＡＬ中の検出可能な感染性ウイルスはなかった。

【0222】

雄および雌Ｋ１８－ｈＡＣＥ２ Ｔｇ（系統＃０３４８６０、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ［Ｋ１８－ＡＣＥ２］２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ）マウスはＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手し、ワクチン接種の時点において約８～１０週齢であった。

【0223】

動物研究は、すべての関連する地方、州、および連邦政府の規制に準拠して実行し、ＢＩＯＱＵＡＬの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認された。

【0224】

プラスミドの構築
組換えＭＶ－０１４－２１２および派生ウイルスをアンチゲノムの方向性で細菌人工染色体（ＢＡＣ）中にＴ７ポリメラーゼプロモーターの制御下でクローニングした（Ｈｏｔａｒｄ ｅｔ ａｌ（２０１２）、上掲）。組換えＭＶ－０１４－２１２およびＭＶＫ－０１４－２１２配列を含有するＢＡＣをＤＢ１－ＱＵＡＤおよびｋＲＳＶ－ＤＢ１－ＱＵＡＤプラスミド（それぞれｍＫａｔｅ遺伝子ありまたはなしの弱毒化バージョンのＲＳＶのアンチゲノムをコードする；Ｒｏｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．（２０１８）、上掲）からの制限消化およびライゲーションにより構築した。キメラスパイクタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、適合性のクローニング部位を含有するように設計し、それはＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより合成された。ｋＲＳＶ－ＤＢ１－ＱＵＡＤプラスミドおよびスパイク挿入物を酵素ＡａｔＩＩおよびＳａｌＩ（ＮＥＢ）で消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて１６℃で終夜ライゲートした。Ｓｔａｂｌ３化学コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をライゲーションミックスを用いて形質転換し、クロラムフェニコール耐性について３２℃で２０～２４時間選択した。ＭＶ－０１４－２１２ ＢＡＣはＭＶＫ－０１４－２１２ベクターから、ＫｐｎＩおよびＡａｔＩＩ制限部位の間の断片（ｍＫａｔｅ遺伝子を含有する約７ｋｂ）を除去し、それを制限消化およびライゲーションによりＤＢ１－ＱＵＡＤから抽出された対応する断片で置き換えることにより誘導した。すべての構築物について、コードされるウイルス全体の配列をサンガーシークエンシングを介して確認した。

【0225】

プラスミドｒＡ２－ｍｋａｔｅ（別名ｋＲＳＶ－Ａ２）の構築はＲｏｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．９０（１６）：７５０８－７５１８に記載されたものである。

【0226】

ウイルスのレスキューおよび採取
組換えウイルスをＲＣＢ２細胞へのＢＡＣプラスミドおよび以下：Ｔ７ポリメラーゼ、ＲＳＶ Ａ２ Ｎ、ＲＳＶ Ａ２ Ｐ、ＲＳＶ Ａ２ Ｍ２－１またはＲＳＶ Ａ２Ｌタンパク質のうちの１つを各々がコードするｐＣＤＮＡ３．１発現プラスミドに基づく５つのヘルパープラスミドのエレクトロポレーションによりレスキューした。細胞を４ｍＭのグルタミンおよび１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＳＦＭ－ＯｐｔｉＰｒｏ培地中で２継代にわたり回収し、次にＣＰＥが大規模となるまでグルタミンを含む無血清培地中で拡大増殖した。

【0227】

組換えウイルスを、ＳＰＧを補充したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）または単独でのＳＰＧ中に、感染細胞を直接的に培地中に剥がし取ることにより採取した。溶解液を激しくボルテックスしてウイルス粒子を放出させ、フラッシュ凍結させた。１サイクルの解凍およびボルテックスを行ってウイルスの放出を増加させた後にストックをアリコート化し、フラッシュ凍結させ、使用まで－７０℃で貯蔵した。

【0228】

ＳＰＧ培地の組成を表６に示す。

【0229】

使用されたすべてのウイルスについてのプラークアッセイは、２４ウェルプレート中でＶｅｒｏ細胞を用いて行った。７０％コンフルエンスの細胞に１００μｌの１０倍段階希釈のウイルス試料（１０－１～１０－６）を接種した。接種を室温で穏やかな振盪と共に１ｈ実行した後に、１０％のＦＢＳおよび１Ｘ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｍｉｘを補充したＭＥＭ中に溶解させた０．７５％のメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）を加えた。細胞を３２℃で４～５日間インキュベートした後にメタノール中に固定し、免疫染色を行った。ＭＶ－０１４－２１２およびＭＶＫ－０１４－２１２のためにウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクポリクローナル抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）およびヤギ抗ウサギＨＲＰ共役二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。ｒＡ２－ｍＫａｔｅのために使用された試薬はヤギ抗ＲＳＶ一次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびロバ抗ヤギＨＲＰ共役二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）であった。すべての場合において、ウイルスプラークはＡＥＣ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。検出限界は１ＰＦＵ／ウェルであり、これは１００ＰＦＵ／ｍｌの最小検出可能力価に対応する。

【0230】

ＲＮＡシークエンシング
ＭＶ－０１４－２１２試料からのＲＮＡを、生産者により示唆されるプロトコールにしたがってＱＩＡａｍｐ（登録商標） Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して抽出した。抽出されたＲＮＡの品質および濃度をゲル電気泳動およびＵＶ分光光度法により評価した。抽出されたＲＮＡを、特異的プライマーまたはランダム六量体を使用するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを使用する逆転写（ＲＴ）のための鋳型として使用した。ｃＤＮＡ第２鎖をＰｌａｔｉｎｕｍＴＭ ＳｕｐｅｒＦｉＴＭ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて合成した。精製されたＰＣＲ生成物を、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して直接的にシークエンシングした。シークエンシング反応物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０精製を使用して精製し、ＡＢＩ ３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。配列トレースをＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアを使用してアセンブルし、アセンブリーを手動で確認した。この研究のためのＲＮＡシークエンシングはＡｖａｎｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ ＴＸにより行われた。

【0231】

ウエスタンブロット
ウイルスおよび対照組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ、ＭＡ）を用いて９５℃で１０分間加熱することにより変性させた。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより４～１５％の勾配のゲル中で分離させ、生産者のプロトコール（ＢＩＯ－ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）にしたがって転写装置を使用してＰＶＤＦ膜に転写させた。転写後に、ブロットを脱イオン水中で洗浄し、生産者のプロトコールにしたがってｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘシステムを使用してプロービングした。ウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）をｉＢｉｎｄ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に１：１０００で希釈した。ＨＲＰ共役抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）をｉＢｉｎｄ溶液中に１：５０００で希釈した。ブロットを脱イオン水中で洗浄し、生産者のプロトコールにしたがってＥＣＬシステム（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ）を用いて顕色させた。ブロットをＲｅｓｔｏｒｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で剥がし、ヤギ抗ＲＳＶポリクローナル抗血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＧＡＰＤＨ（６Ｃ５）タンパク質に特異的なモノクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で再プロービングした。

【0232】

ＡＧＭにおけるウイルスシェディングを検出するためのプラークアッセイ
鼻スワブ（ＮＳ）および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）試料を収集し、プラークアッセイによりワクチンシェディングについてアッセイされるまで氷上で貯蔵した。Ｖｅｒｏ細胞を０．５ｍＬ／ウェルにおいて１×１０^５細胞／ｍＬで２４ウェルプレート中の培養培地に播種した。プレートを３７℃で５％のＣＯ_２を含有する加湿インキュベーター中で終夜インキュベートした。試料を、３０μＬの鼻スワブまたはＢＡＬを２７０μＬのＤＭＥＭに加えることにより血清を含まないＤＭＥＭ中に希釈した。計６個の１０倍段階希釈液を１０－１～１０－６でＤＭＥＭ中に調製した。培地を２４ウェルプレートから除去し、１００μＬの各々の希釈液をＶｅｒｏ細胞の２４ウェルプレートの複製ウェルに加えた。プレートを室温で一定の振盪と共にＲｏｃｋｅｒ ３５ＥＺ、Ｍｏｄｅｌ Ｒｏｃｋｅｒ ３５Ｄ（Ｌａｂｎｅｔ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）上で１ｈインキュベートした。このインキュベーションの終わりに、１ｍＬのメチルセルロース培地（１０％のウシ胎仔血清、１ｘ抗生物質／抗真菌剤、および０．７５％のメチルセルロースを補充したＭＥＭ）を各々のウェルに加えた。プレートを３４℃で６日間、５％のＣＯ_２を含有する加湿インキュベーター中でインキュベートした。

【0233】

ＲＳＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を使用する免疫染色によりプラークを可視化した。免疫染色のために、メチルセルロース培地を吸引し、細胞単層を１ｍＬのＰＢＳを用いて室温で洗浄した。ＰＢＳを除去し、細胞を各々のウェルへの１ｍＬのメタノールの添加により固定し、プレートを室温で１５分間インキュベートした。メタノールを除去し、細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、続いて１ｍＬのＢｌｏｔｔｏ溶液（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水中の５％の無脂肪乾燥ミルク、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を加えた。プレートを室温で１ｈインキュベートした。Ｂｌｏｔｔｏ溶液を除去し、Ｂｌｏｔｔｏ中に１：５００で希釈された０．２５ｍＬの一次ヤギ抗ＲＳＶポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）をＲＳＶ感染細胞に加えた。ＭＶ－０１４－２１２を感染させた細胞を一次ウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ポリクローナル抗血清（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、ＣＮ）で染色した。プレートを室温で一定の振盪と共に１ｈインキュベートした。一次抗体を除去し、ウェルを１ｍＬのＢｌｏｔｔｏ溶液で洗浄した。

【0234】

ＲＳＶ感染細胞について、Ｂｌｏｔｔｏ中に１：２５０で希釈された０．２５ｍＬのロバ抗ヤギＨＲＰ共役ポリクローナル抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を各々のウェルに加えた。ＭＶ－０１４－２１２感染細胞について、Ｂｌｏｔｔｏ中に１：２５０で希釈されたヤギ抗ウサギＨＲＰ共役ポリクローナル抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を各々のウェルに加えた。プレートを室温で一定の振盪と共に１ｈインキュベートした。インキュベーション後に、二次抗体を除去し、ウェルを１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。ＡＥＣ基質を１ｘＡＥＣ緩衝溶液中に１：５０で希釈することにより顕色溶液を調製した。計０．２５ｍＬの顕色溶液を各々のウェルに加え、赤色の免疫染色されたプラークが目により可視的となるまでプレートを室温で１５～３０分間、一定の振盪と共にインキュベートした。顕色反応を、プレートを水道水でリンスすることにより終了させた。プラークを計数し、力価を算出した。

【0235】

チャレンジウイルスのシェディングを検出するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブゲノムＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ
３μＬ当たり１０６～１０７コピーを含有するように希釈された凍結されたＲＮＡストックから標準曲線を作成した。ＲＮＡｓｅ非含有水を使用して１～１０７コピー／反応の範囲に及ぶＲＮＡ濃度を生成することで対照ＲＮＡの８つの１０倍段階希釈液を調製した。

【0236】

プレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ中に置き、以下のプログラム：４８℃で３０分間、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間、および５５℃で１分の４０サイクルを使用して増幅させた。試料１ｍＬ当たりのＲＮＡのコピー数を標準曲線に基づいて算出した。

【0237】

組織からのトータルＲＮＡを、ＲＮＡ－ＳＴＡＴ ６０（Ｔｅｌ－ｔｅｓｔ 「Ｂ」）／クロロホルムを使用して抽出し、続いてＲＮＡの沈殿およびＲＮＡｓｅ非含有水への再懸濁を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡを検出するために、リーダー配列の領域およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＥ遺伝子ＲＮＡを検出するためのプライマーセットおよびプローブを設計した。Ｅ遺伝子ｍＲＮＡは複製の間に、ｓｇＲＮＡに独特の５’リーダー配列（ビリオン中にパッケージングされない）を含有するようにプロセシングされ、したがってｓｇＲＮＡを定量化するために使用され得る。独特のリーダー配列を含むＥ遺伝子配列を含有する既知の量のプラスミドＤＮＡを使用して１～１０^６コピー／反応の濃度範囲を生成することで標準曲線を作成した。２Ｘ緩衝液、Ｔａｑ－ポリメラーゼ、逆転写酵素およびＲＮＡｓｅ阻害剤を含有する４５μＬのマスターミックス（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ）を使用してＰＣＲ反応物をアセンブルした。プライマーペアを２μＭで加えた。５μＬの試料ＲＮＡを９６ウェルプレート中の各々の反応物に加えた。以下の条件：４８℃で３０分間、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間、および５５℃で１分の４０サイクルを使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒにおいてＰＣＲ反応物を増幅させた。

【0238】

プライマー／プローブ配列を下記に示す：
ＳＧ－Ｆ：ＣＧＡＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣ（配列番号１２７）
ＳＧ－Ｒ：ＡＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡＣＡ（配列番号１２８）
ＦＡＭ－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－ＢＨＱ（配列番号１２９）

【0239】

ＡＧＭ血清のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＭａｘｉＳｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、ＰＢＳ中に調製された１００μＬの０．６５μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｐｒｅ－Ｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ、Ｎｅｘｅｌｉｓ）と４℃で終夜インキュベートした。タンパク質溶液を除去し、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を補充した２５０μＬのＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。ブロッキング溶液（５％の無脂肪乾燥ミルクを含有するＰＢＳＴ）を２００μＬ／ウェルで加え、プレートを室温で１ｈインキュベートした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的ＩｇＧ（Ｎｅｘｅｌｉｓ）をブロッキング溶液中に希釈し、標準品として使用した。陰性対照血清をブロッキング溶液中に１：２５で希釈した。血清試料を１：２５で希釈し、続いてブロッキング溶液中に８回、２倍段階希釈した。ブロッキング溶液をプレートから除去し、ウェルを２５０μＬのＰＢＳＴで１回洗浄し、続いて１００μＬの希釈された血清試料および対照を加え、プレートを室温で１ｈインキュベートした。プレートを２５０μＬのＰＢＳＴで４回洗浄し、ブロッキング溶液中に希釈された１００μＬのＨＲＰ共役ヤギ抗サルＩｇＧ抗体（ＰＡ１－８４６３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を最後の洗浄ステップ後に各々のウェルに加えた。プレートを室温で１ｈインキュベートし、次に２５０μＬのＰＢＳＴ中で４回洗浄した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を含有する顕色溶液（１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を各々のウェルに加え、プレートを室温で３０分間インキュベートして顕色させた。比色反応を１００μＬのＥＬＩＳＡ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加により終了させた。４５０ｎｍおよび６５０ｎｍでの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分光光度法により読み取った。

【0240】

ＡＧＭ鼻スワブのためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＡ ＥＬＩＳＡ
精製された融合前ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ）を９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐイムノマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）に吸着させた。陽性対照は、３人のＣＯＶＩＤ－１９回復期個体からの血清プール（Ｎｅｘｅｌｉｓ）であった。ヒト血清から精製されたＩｇＡを標準品として使用した（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。ＩｇＡ標準曲線を生成するために抗ヒトＩｇＡ捕捉抗体Ｍａｂ ＭＴ５７（ＭａｂＴｅｃｈ）をスパイク抗原の代わりにプレートに吸収させた。インキュベーション後に、マイクロプレートを２５０μＬのＰＢＳＴで４回洗浄し、ＰＢＳＴ中の１％のＢＳＡでブロッキングした。精製されたヒトＩｇＡ標準品、対照または試料希釈液を次に加え、被覆されたマイクロプレート中でインキュベートして結合させた。プレートを洗浄し、サル抗体に対する交差反応性を有するビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）をすべてのウェルに加えた。過剰なビオチン化抗ＩｇＡ抗体を洗浄により除去し、ストレプトアビジン共役ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加えた。ＴＭＢを加え、顕色をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの停止溶液の添加により停止させた。各々のウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。各々の試験プレート上でアッセイされた標準的な全ＩｇＡ抗体を使用して、任意単位ＥＬＵ／ｍＬで表されるＡＧＭ試料中のスパイクタンパク質に対するＩｇＡ抗体の濃度を算出した。測定は２連で行い、平均値を標準偏差と共に報告する。

【0241】

マイクロ中和アッセイ
図１８の概略図に示されるように、ＡＧＭからの熱不活化された血清を、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）および抗生物質／抗真菌剤を含むＭＥＭ中に段階希釈した。すべての実験は２連で行った。２００ＰＦＵの所望されるレポーターウイルスを各々の希釈液に加え、室温で１時間インキュベートした。透明底黒色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｎｉｅｒ）中で増殖させたコンフルエントなＲＣＢ１細胞に血清－ウイルスミックスを感染させ、１，８００×ｇで３０分間、２０℃で遠心分離（スピノキュレーション）した。プレートを３７℃および５％のＣＯ_２で２０ｈインキュベートした。各々のウェル中の蛍光フォーカスを、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）を使用してカウントし、下記の式：

（式中、ＭＩＮは、細胞のみ（ウイルスなし）を含む対照ウェルにおいて得られたフォーカスの平均数であり、ＭＡＸは、ウイルスのみ（血清なし）を含む対照ウェルにおけるウェルからのフォーカスの平均数である。Ｌは試料ウェル中のフォーカスの数である。）を使用して阻害％に変換した。血清の希釈に対する阻害の得られた曲線を非線形回帰、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン９．０．０）のオプション「［ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ］ｖｓ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ」を使用してフィッティングした。フィッティングから、ＩＣ５０を得、ＮＴ５０をＩＣ５０の逆数として算出した。

【0242】

実施例４－ＭＶ－０１４－２１２はｈＡＣＥ２マウスにおいてＴｈ１偏性細胞性免疫応答を誘発する
ワクチン関連増強呼吸器疾患（ＶＡＥＲＤ）のマウスモデルは、Ｔｈ２応答への偏性を伴う１型（Ｔｈ１）および２型（Ｔｈ２）ヘルパーＴ細胞免疫における不均衡は、チャレンジ後の肺病理の増強に寄与することを示唆する（Ｂｏｅｌｅｎ ２０００）。ＭＶ－０１４－２１２でのワクチン接種後に生成されたＴｈ１およびＴｈ２免疫の均衡を評価するために、ヒトＡＣＥ－２受容体を発現するトランスジェニックマウスにＭＶ－０１４－２１２またはＰＢＳの単回用量を鼻腔内経路により接種した。対照群に、免疫をＴｈ２応答に向けて偏らせることが示されているミョウバン（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．上掲）中に製剤化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の筋肉内プライムおよびブーストワクチン接種を与えた。２８日目に、血清を収集し、全スパイク特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１をＥＬＩＳＡにより測定した。さらに、脾臓を収集し、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）およびＩＬ－５を発現する脾臓細胞の数をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより測定した。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比およびＩＦＮγ／ＩＬ－５を産生する細胞の比は、Ｔｈ１にバイアスされた細胞性免疫応答の指標である（Ｃｏｒｂｅｔ ｅｔ ａｌ．、上掲、ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＮＰＪ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ５（１）：４９）。

【0243】

結果は、ＭＶ－０１４－２１２は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより測定された場合にスパイク反応性脾臓細胞を誘導したことを示した（図１９Ａ）。重要なことに、細胞懸濁液がスパイクペプチドプールで刺激された場合にＭＶ－０１４－２１２はＩＬ－５と比べてＩＦＮγを発現するより多くの数の脾臓細胞を誘導し、ＭＶ－０１４－２１２でのワクチン接種はＴｈ１にバイアスされた免疫応答を生成させることを示唆した。ＭＶ－０１４－２１２群におけるＩＬ－５産生細胞に対するＩＦＮγ産生細胞の比は、ミョウバンアジュバント添加スパイクタンパク質でワクチン接種された群におけるよりも１桁よりも大きく高かった（図１９Ｂ）。ＥＬＩＳｐｏｔデータと合致して、血清中で検出されたＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比は、ミョウバンアジュバント添加スパイクでワクチン接種された対照群よりもＭＶ－０１４－２１２でワクチン接種された動物においてより高かった（図１９ＣおよびＤ）。これらのデータは、弱毒生組換えＭＶ－０１４－２１２での鼻腔内ワクチン接種は、Ｔｈ１にバイアスされた抗ウイルス免疫応答を誘導したことを示唆する。

【0244】

考察
マウスモデルにおいて、ＭＶ－０１４－２１２免疫化は、Ｔｈ１にバイアスされた細胞性免疫応答を誘発した。より多くのＩＦＮγ産生Ｔ細胞が、ＩＬ－５分泌Ｔ細胞よりもＭＶ－０１４－２１２で免疫化されたｈＡＣＥマウスの脾臓細胞において検出された。さらには、ＭＶ－０１４－２１２ ｈＡＣＥ２マウスにおけるＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１アイソタイプの比は、ミョウバンアジュバント添加スパイクタンパク質免疫化を受けたｈＡＣＥ２マウスと比較して約１０００倍高かった。保護の相関は、救急使用のために承認されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンについて確立されていない。しかしながら、ＭＶ－０１４－２１２ワクチン接種ＡＧＭは、ＥＵＡワクチンで観察されたものと同等の保護のレベルを達成した（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．上掲、Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．上掲、Ｍｅｒｃａｄｏ ｅｔ ａｌ．上掲、ｖａｎ Ｄｏｒｅｍａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．上掲）。

【0245】

材料および方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ ｈＡＣＥ２マウス
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をＮ末端においてスパイクタンパク質シグナル配列に連結し、ヒスチジンタグをタンパク質のＣ末端に付加した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、Ｎｉ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｅｘｃｅｌ（ＧＥ）樹脂（Ｇｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を使用してＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムにおいて均質まで精製した。ＭａｘｉＳｏｒｐイムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、ＰＢＳ中に調製された１００μＬの０．５ｍｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクと４℃で終夜インキュベートした。タンパク質溶液を除去し、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を補充した３００μＬのＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。ブロッキング溶液（５％の無脂肪乾燥ミルクを含有するＰＢＳＴ）を２００μＬ／ウェルで加え、プレートを３７℃で１ｈインキュベートした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的ＩｇＧをブロッキング溶液中に希釈し、標準品として使用した。陽性および陰性対照血清をブロッキング溶液中に１：２５で希釈した。陽性対照血清は、マウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質で免疫化することによりＮｅｘｅｌｉｓにおいて生成された。陰性対照血清はナイーブマウスから得られた。血清試料をブロッキング溶液中に１：２５で希釈し、続いて８回の２倍段階希釈を行った。ブロッキング溶液をプレートから除去し、ウェルを３００μＬのＰＢＳＴで１回洗浄し、続いて１００μＬの希釈された血清試料および対照を加えた。プレートを３７℃で２ｈインキュベートした。インキュベーション後にプレートを３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング溶液中に希釈された１００μＬのＨＲＰ共役ヤギ抗マウス抗体（Ａ１４０－２０１Ｐ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）を最後の洗浄ステップの後に各々のウェルに加えた。プレートを３７℃で１ｈインキュベートし、次に３００μＬのＰＢＳＴ中で３回洗浄した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を含有する顕色溶液（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を各々のウェルに加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートして顕色させた。比色反応を１００μＬの０．３６Ｎ硫酸停止溶液の添加により終了させた。４５０ｎｍおよび６５０ｎｍにおける吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分光光度法により読み取った。

【0246】

スパイク特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ ＥＬＩＳＡ
マウスからの血清試料を－２１日目およびワクチン接種後２８日目に収集してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体のレベルをＥＬＩＳＡにより定量化した。精製された灌流安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ｈｕｍａｎ／ＵＳＡ／ＷＡ１／２０２０、ＬａｋｅＰｈａｒｍａ）をＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬをＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）の各々のウェルに加え、４℃で終夜インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で４回洗浄し、１００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳＴ＋２％ ＢＳＡ）を各々のウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。血清希釈液をブロッキング溶液中で調製し、第１の希釈はＩｇＧ１アッセイのために１：２５またはＩｇＧ２ａアッセイのために１：１０～１：１００とした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＩｇＧ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）または抗スパイク－ＲＢＤ－ｍＩｇＧ２ａ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）をブロッキング溶液中に希釈し、アッセイのための標準品として使用した。

【0247】

ブロッキング溶液を除去し、１００μＬの希釈された抗体を各々のウェルに加えた。プレートを室温で１ｈインキュベートし、次にプレートウォッシャーを使用してＰＢＳＴ中で４回洗浄した。次に、それぞれ１：３２，０００および１：１０００に希釈された１００μＬのＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）またはＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）二次抗体を各々のウェルに加え、プレートを室温で１ｈインキュベートした。プレートをＰＢＳＴ中で４回洗浄した。１００μＬの１－ｓｔｅｐ ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を各々のウェルに加え、プレートをオービタルシェーカー上で一定の振盪と共に３０分間インキュベートした。インキュベーション期間後に、１００μＬの停止溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各々のウェルに加え、プレートを４５０ｎｍおよび６２０ｎｍにおいてＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉｄ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。

【0248】

ＭＶ－０１４－２１２ワクチン接種ｈＡＣＥ２マウスからの脾臓細胞のＥＬＩＳＰＯＴ
ワクチン接種されたＡＣＥ－２マウスからの脾臓を接種後２８日目に収集し、処理まで氷上で１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で貯蔵した。脾臓を、培地を含有する無菌ペトリ皿上でホモジナイズした。ホモジネートを１００μｍの細胞ストレーナーを通じて濾過し、細胞懸濁液を氷上の無菌チューブに移した。細胞を２００×ｇで８分間、４℃での遠心分離により収集した。上清を除去し、チューブの縁の残留液体を清潔なペーパータオルを用いて吸い取った。細胞ペレットを２ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液（１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ｍＭの重炭酸カリウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁することにより赤血球細胞を溶解させ、試料を室温で約５分間インキュベートした。ＰＢＳを細胞懸濁液の体積の２～３倍で加え、細胞を２００×ｇで８分間、４℃での遠心分離により収集した。細胞ペレットをＰＢＳ中で２回洗浄し、細胞を２００×ｇで８分間、４℃での遠心分離により収集した。上清を除去し、ペレットを２ｍＭのＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ＣＴＬ－Ｔｅｓｔ Ｍｅｄｉａ（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）中に再懸濁した。懸濁液を１００μｍ細胞ストレーナーを通じて新たな１５ｍＬのコニカルチューブ中に濾過し、細胞を血球計を使用してカウントし、適切な細胞濃度で再懸濁した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて使用されるまで細胞を５％のＣＯ_２を有する加湿されたインキュベーター中３７℃で維持した。

【0249】

マウスＩＦＮγ／ＩＬ－５ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｃｏｌｏｒ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）を使用してＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。Ｍｕｒｉｎｅ ＩＦＮγ／ＩＬ－５ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび７０％エタノールを生産者のプロトコール（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）にしたがって調製した。プレート上の膜を各々のウェルへの１５μＬの７０％エタノールの添加により活性化させた。プレートを室温で１分未満インキュベートし、続いて１５０μＬのＰＢＳを加えた。アンダードレーン（ｕｎｄｅｒｄｒａｉｎ）を除去してウェル中の溶液を排出し、各々のウェルをＰＢＳで２回洗浄した。Ｍｕｒｉｎｅ ＩＦＮγ／ＩＬ－５ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８０μＬ）を各々のウェルに加え、プレートをパラフィルムで密閉し、４℃で終夜インキュベートした。Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを除去し、プレートを１５０μＬのＰＢＳで１回洗浄した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＰｅｐＭｉｘ（商標） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ ＤＥ）にわたる１５アミノ酸の長さのペプチドを含有するペプチドプールを１０ｍｇ／ｍＬで調製し、１００μＬを各々のウェルに加えた。コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）マイトジェン（１０μｇ／ｍＬ）を含有する陽性対照を別々の反応混合物に加えた。脾臓細胞をＣＴＬ－Ｔｅｓｔ（商標） Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）と混合して３，０００，０００細胞／ｍＬの最終細胞密度を得、１００μＬ／ウェルを大きいオリフィスチップを使用してプレートに加えた。プレートを９％のＣＯ２を含有する加湿されたインキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。プレートを各々の洗浄について２００μＬ／ウェルの体積においてＰＢＳで２回、次に０．０５％のＴｗｅｅｎ－ＰＢＳで２回洗浄し、続いて８０μＬ／ウェルのａｎｔｉ－ｍｕｒｉｎｅ ＩＦＮγ／ＩＬ－５ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）を加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを各々の洗浄について２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、続いて８０μＬ／ウェルのＴｅｒｔｉａｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）を加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで２回、次に２００μＬ／ウェルの蒸留水で２回洗浄した。Ｂｌｕｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）を８０μＬ／ウェルで加え、プレートを室温で１５分間インキュベートした。プレートを水道水中で３回リンスして、顕色反応を停止させた。最終の洗浄後に、Ｒｅｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＯＨ、ＵＳＡ）を８０μＬ／ウェルで加え、プレートを室温で５～１０分間インキュベートした。プレートを３回リンスして顕色反応を停止させた。プレートをベンチトップ上でペーパータオルに伏せて２４時間空気乾燥させた。ＩＦＮγ（赤）またはＩＬ－５（青）を発現する脾臓細胞を表すプレート上のスポットをＣＴＬ－Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ７．０．２３．２ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ＤＣ＼ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ７、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）およびソフトウェア（ＣＴＬ Ｓｗｉｔｃｈｂｏａｒｄ ２．７．２）を使用して定量化した。

【0250】

実施例５－フェーズＩ臨床試験
この実施例において、ＣＯＶＩＤ－１９疾患を引き起こす新規のコロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンが評価される。ワクチンは液滴またはスプレーとして鼻に投与される。特に、研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して血清反応陰性の１８～６９歳の健康な成人に投与された場合のワクチンの安全性、およびそれに対する免疫応答を分析する。

【0251】

コホートＡ（１８～５５歳）は最初に登録される。最初の１０人の参加者（群１）はワクチンの投薬１を与えられる。３日を通じた群１安全性データの検討後に、次の２０人の参加者（群２）はワクチンの投薬２を与えられる。３日を通じた群２安全性データの検討後に、コホートＡ中の５０人の参加者の最後の群（群３）はワクチンの投薬３を与えられる。群３中の亜群は経鼻スプレーを介してワクチンの投薬３を与えられる一方、残りの参加者は点鼻剤による投与を与えられる。コホートＡ中の第２の亜群は３６日目に第２の同一のワクチン用量を与えられる一方、残りの参加者は（１日目に）ワクチンの単回用量を与えられる。

【0252】

１５日を通じたコホートＡ安全性データの検討後に、コホートＢ（５６～６９歳）は登録される。最初の１０人の参加者（群４）はワクチンの投薬１を与えられる。３日を通じた群４安全性データの検討後に、次の２０人の参加者（群５）はワクチンの投薬２を与えられる。３日を通じた群５安全性データの検討後に、コホートＡ中の２０人の参加者の最後の群（群６）はワクチンの投薬３を与えられる。コホートＢ中のすべての参加者はワクチンの単回用量を与えられ、点鼻剤による用量を投与される。コホートＡおよびＢの各々の群内で、前哨投薬アプローチが追加の安全性指標として実行される。

【0253】

転帰指標
決定される一次転帰指標は、自発的有害事象（ＡＥ）、非自発的ＡＥ、重篤な有害事象（ＳＡＥ）、診療を要した有害事象（ＭＡＥ）、およびワクチンにコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する血清中和抗体力価における変化を含む。自発的および非自発的ＡＥは、ワクチン接種直後の期間において決定される。ＳＡＥおよびＭＡＥは、研究持続期間全体（約１年）を通じて決定される。ワクチンにコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する中和抗体の血清力価における変化は、ベースラインから２９日目を通じて、平均で５週間で決定される。

【0254】

自発的ＡＥの頻度が測定され、重症度によりカテゴライズされる。自発的ＡＥは、ワクチン投与後に起こり得る予め定義されたＡＥである。

【0255】

非自発的ＡＥの頻度が測定され、重症度によりカテゴライズされる。非自発的ＡＥは、ワクチンに対する原因的関係性にかかわらず、ワクチンを投与された参加者における任意の有害な医学的出来事である。非自発的ＡＥは、ワクチンの使用と時間的に関連付けられる不都合なおよび意図されない徴候（異常な実験室所見を含む）、症状、または疾患を含むことができる。

【0256】

ＳＡＥの頻度が測定され、ワクチン関連性によりカテゴライズされる。ＳＡＥは、原因的にワクチンに関すると考えられるか否かにかかわらず、生命を脅かすか、または以下：死、入院もしくは既存の入院の延長、正常な生活機能を実行する能力の持続的なもしくは重大な不能性もしくは実質的な妨害、もしくは先天性異常／先天性欠損のいずれかを結果としてもたらすＡＥである。

【0257】

ＭＡＥの頻度が測定され、ワクチン関連性によりカテゴライズされる。ＭＡＥは、原因的にワクチンに関すると考えられるか否かにかかわらず、予定外の診療訪問、例えば救急医療（ｕｒｇｅｎｔ ｃａｒｅ）訪問、救急一次医療（ａｃｕｔｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃａｒｅ）訪問、救急部門（ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）訪問、または医療提供者への他の以前に計画されていない訪問を伴うＡＥである。予定された医療訪問、例えば通常検診、健康チェック、「健康診断」（ｃｈｅｃｋ－ｕｐｓ）、およびワクチン接種はＭＡＥと考えられない。

【0258】

ワクチンにコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する血清中和抗体（ｎＡｂ）力価における変化は、参加者毎にベースラインから２９日目を通じて、平均で５週間測定される。

【0259】

決定される二次転帰指標は、（１）ワクチンにコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する血清結合抗体濃度における変化、（２）潜在的なワクチンウイルスシェディングの頻度、規模、および持続期間を含む。

【0260】

血清結合抗体濃度における変化は、参加者毎にベースラインから２９日目を通じて、平均で５週間測定される。

【0261】

ワクチンウイルスの任意のワクチン接種後シェディング（ウイルス培養により検出される）の頻度は、投薬群毎におよび全体的にベースラインから２９日目を通じて、平均で４週間測定される。ワクチンウイルスのワクチン接種後シェディングが培養により検出される場合、ピークウイルス力価（プラーク形成単位、ＰＦＵにおいて測定される）は、投薬群毎におよび全体的にベースラインから２９日目を通じて、平均で４週間測定される。ワクチンウイルスのワクチン接種後シェディングが培養により検出される場合、シェディングの持続期間（日数）は、投薬群毎におよび全体的にベースラインから２９日目を通じて、平均で４週間で測定される。
この研究のための適格性基準
・研究のために適格な年齢：１８歳～６９歳
・研究のために適格な性別：すべて
・ジェンダーに基づくか否か：なし
・健常ボランティアの受け入れ：あり
包含基準：
・インフォームドコンセントへの署名日において決定される１８歳以上５６歳未満（コホートＡ）および５６歳以上７０歳未満（コホートＢ）の健常な成人
・１日目の投薬前においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＰＣＲ（鼻スワブ）陰性
・妊娠の可能性がある女性（ＷＯＣＢＰ）またはＷＯＣＢＰのパートナーがいる男性対象は、インフォームドコンセントへの署名から最終ＭＶ－０１４－２１２投与後少なくとも３か月間まで、研究参加の間の避妊の実行に同意しなければならない。
・書面によるインフォームドコンセント
除外基準：
・慢性肺疾患（例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺線維症、嚢胞性線維症）の診断。解消された小児期喘息は除外的ではない。
・研究プロトコールに詳述されている併存症または他の状態に起因する免疫不全状態
・鼻閉塞（解剖学的／構造的原因、急性もしくは慢性鼻副鼻腔炎、または他の原因に起因するものを含む）
・医療従事者、長期看護またはナーシングホーム施設の居住者または職員、救急応答チーム、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への曝露の高いリスクを有する他の職業のメンバー、および自宅外で客と対面する職業に従事する者（例えばウェイター、キャッシャーまたは店員、公共輸送またはタクシードライバー）
・スクリーニングの間の血清妊娠検査陽性および／または１日目の尿妊娠検査陽性
・研究参加の任意の期間の間の授乳
・５歳未満の子供または免疫不全者への職業的または家庭内曝露
・ＰＩの見解で、研究参加を不可能にする任意の医学的疾患または状態。これは、対象を傷害の許容できないリスクに置くか、対象をプロトコールの要求を満たせなくさせるか、または応答の評価もしくはこの試験の対象の成功裏の完了に干渉し得る急性、亜急性、間欠性または慢性の医学的疾患または状態を含む。

【0262】

ＭＶ－０１４－２１２を接種された対象は、ワクチンにコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する中和抗体の血清力価における増加の他に、ワクチンにコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する血清結合抗体濃度における増加を呈することが予想される。

【0263】

本出願の配列表において提供される配列を表８に示す：

【0264】

参照による組込み
本明細書において参照される特許および科学文献の各々の全開示はすべての目的のために参照により組み込まれる。

【0265】

均等
本発明は、その精神または本質的な特徴から離れることなく他の特有の形態において具現化され得る。以上の実施形態は、したがって、すべての点において、本明細書に記載される発明に対して限定的ではなく実例的であると考えられるべきである。本発明の範囲はそのため、以上の記載によってではなく添付の請求項により指し示され、請求項の均等の意味および範囲内に入るすべての変更は、請求項に包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

2023530445000001.app

【国際調査報告】