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特表2023-530454アルファ－シヌクレインターゲティング抗体、プログラニュリン及びプロサポシン並びにそれらの複合体、並びにＧＤＮＦを分泌する細胞株
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-18
(54)【発明の名称】アルファ－シヌクレインターゲティング抗体、プログラニュリン及びプロサポシン並びにそれらの複合体、並びにＧＤＮＦを分泌する細胞株
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20230710BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230710BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230710BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230710BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230710BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230710BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20230710BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230710BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230710BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230710BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20230710BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230710BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230710BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47
C07K19/00 ZNA
C12N15/62 Z
C12N5/10
C07K16/00
C12P21/02 C
A61K38/18
A61P25/28
A61P25/16
A61K38/17
G01N33/531 A
G01N33/53 D
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022577574
(86)(22)【出願日】2021-06-21
(85)【翻訳文提出日】2023-02-15
(86)【国際出願番号】 US2021038312
(87)【国際公開番号】W WO2021258074
(87)【国際公開日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】63/040,925
(32)【優先日】2020-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/212,721
(32)【優先日】2021-06-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522488063
【氏名又は名称】ルンドクヴィスト，ヨーアン
【氏名又は名称原語表記】ＬＵＮＤＫＶＩＳＴ，Ｊｏｈａｎ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｌｓｏｖａｇｅｎ ７，１４１５７ Ｈｕｄｄｉｎｇｅ （ＳＥ）
(71)【出願人】
【識別番号】522488085
【氏名又は名称】ウォールバーグ，ラース ユー．
【氏名又は名称原語表記】ＷＡＨＬＢＥＲＧ，Ｌａｒｓ Ｕ．
【住所又は居所原語表記】４０ Ｖｉｋｉｎｇ Ｄｒｉｖｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ， Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ ０２８０９ （ＵＳ）
(71)【出願人】
【識別番号】522488096
【氏名又は名称】バイヴァーステル，ヘンリク
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＶＥＲＳＴＡＬ，Ｈｅｎｒｉｋ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏｒｒ Ｍａｅｌａｒｓｔｒａｎｄ １００，１１２ ３５ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ（ＳＥ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001461
【氏名又は名称】弁理士法人きさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】ルンドクヴィスト，ヨーアン
(72)【発明者】
【氏名】ウォールバーグ，ラース ユー．
(72)【発明者】
【氏名】バイヴァーステル，ヘンリク
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC03
4B064CC10
4B064CC24
4B064CD21
4B064CE07
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB25
4B065BB37
4B065BC11
4B065BD18
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4C084AA02
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4C084BA01
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4C084BA22
4C084BA23
4C084BA41
4C084BA42
4C084CA53
4C084DB52
4C084DC50
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4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA151
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4C084ZA162
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045FA74
4H045GA22
(57)【要約】
プログラニュリンポリペプチド及びプロサポシンポリペプチドからなるヘテロダイマーを発現するように改変された哺乳動物細胞株を含む細胞培養物。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プログラニュリン及びプロサポシンの複合体。
【請求項2】
前記複合体がプログラニュリン及びプロサポシンのヘテロダイマーである、請求項１に記載の複合体。
【請求項3】
前記複合体が融合タンパク質である、請求項１に記載の複合体。
【請求項4】
前記融合タンパク質が組み換えによって形成される、請求項３に記載の複合体。
【請求項5】
前記融合タンパク質が配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、又はそのフラグメントを含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
プログラニュリンポリペプチド及びプロサポシンポリペプチドを発現するか、又は発現するように改変された哺乳動物細胞株を含む細胞培養物。
【請求項7】
前記哺乳動物細胞株が遺伝子改変されている、請求項６に記載の細胞培養物。
【請求項8】
プログラニュリン及びプロサポシン前駆体ポリペプチドのサブペプチドを発現するように改変された哺乳動物細胞株を含む、請求項６に記載の細胞培養物。
【請求項9】
前記プログラニュリンが、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＣアーゼ）相互作用のためのプログラニュリンＣ末端である、請求項６に記載の細胞培養物。
【請求項10】
プログラニュリンを発現する遺伝子及びプロサポシンを発現する遺伝子を含有するか、又はプログラニュリンを発現する遺伝子及びプロサポシンを発現する遺伝子を含有するように改変された哺乳動物細胞株を含む細胞培養物。
【請求項11】
前記プログラニュリン遺伝子がｃＤＮＡである、請求項１０に記載の細胞培養物。
【請求項12】
前記プロサポシン遺伝子がｃＤＮＡである、請求項１０に記載の細胞培養物。
【請求項13】
プログラニュリンに対する遺伝子及びプロサポシンに対する遺伝子を発現する哺乳動物細胞株を含む細胞培養物。
【請求項14】
前記プログラニュリン遺伝子がｃＤＮＡである、請求項１３に記載の細胞培養物。
【請求項15】
前記プロサポシン遺伝子がｃＤＮＡである、請求項１３に記載の細胞培養物。
【請求項16】
前記哺乳動物細胞株が、マウス骨髄腫細胞（ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）－Ｋ１；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウス線維芽細胞－３Ｔ３細胞；アフリカミドリザル細胞株；間葉性軟骨肉腫－１（ＭＣＳ）；ラット副腎褐色細胞腫（ＰＣ）－１２；ラット副腎褐色細胞腫（ＰＣ）－１２Ａ；ＡＴ３、ラットグリア腫瘍（Ｃ６）細胞；ラット神経細胞株ＲＮ３３ｂ；ラット海馬細胞株ＨｉＢ５；増殖因子拡張幹細胞；上皮増殖因子（ＥＧＦ）応答性ニューロスフェア；哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）由来の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）応答性神経前駆幹細胞；胎児細胞；初代線維芽細胞；シュワン細胞；アストロサイト；β－ＴＣ細胞；Ｈｅｐ－Ｇ２線条体細胞；オリゴデンドロサイト及びその前駆体；マウス筋芽細胞－Ｃ２Ｃ１２；ヒトグリア由来細胞－Ｈｓ６８３；ヒトグリア由来細胞－Ａ１７２；ＨＥＩ１９３Ｔ細胞株；ブタ神経膠芽細胞；神経細胞；ニューロン；アストロサイト；介在ニューロン；ヒト長骨から単離された軟骨芽細胞；ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３；ヒト細胞株ＨｅＬａ；ウサギ角膜由来細胞（スターツス・セルムインスティトゥート・ウサギ角膜細胞（ＳＩＲＣ））；ヒト角膜由来細胞、ヒト脈絡叢細胞、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来細胞株、ヒトニューロトロフィン３（ＮＴ３）細胞、成人網膜色素上皮細胞株－１０（ＡＲＰＥ－１９）、循環血管新生細胞（ＣＡＣ）、不死化ヒト線維芽細胞（ＭＤＸ細胞）、テロメラーゼ不死化ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞株、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からなる群より選択される、請求項６又は１０に記載の細胞培養物。
【請求項17】
前記アフリカミドリザル細胞株がＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＳＣＣ－１、ＢＳＣ－４０、ＢＭＴ－１０、及びベロ細胞株からなる群より選択される、請求項１６に記載の細胞培養物。
【請求項18】
前記ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞株がヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）網膜色素上皮－１（ＲＰＥ－１）である、請求項１６に記載の細胞培養物。
【請求項19】
哺乳動物組み換え体産生に対する好ましい細胞株がＡＲＰＥ－１９、ＣＨＯ、ＣＨＯ－１、ＨＥＩ１９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、及びＢＨＫ細胞を含む、請求項１６に記載の細胞培養物。
【請求項20】
前記プログラニュリンポリペプチドが配列番号２又はそのフラグメントを含む、請求項６又は１０に記載の細胞培養物。
【請求項21】
前記プログラニュリン遺伝子が配列番号１又はそのフラグメントを含む、請求項６又は１０に記載の細胞培養物。
【請求項22】
前記プロサポシンポリペプチドが配列番号４又はそのフラグメントを含む、請求項６又は１０に記載の細胞培養物。
【請求項23】
前記プロサポシン遺伝子が配列番号３若しくは配列番号５又はそのフラグメントを含む、請求項６又は１０に記載の細胞培養物。
【請求項24】
前記細胞株がプログラニュリンを発現する第１の発現コンストラクト、又はプロサポシンを発現する第２の発現コンストラクトを含む、請求項６又は１０に記載の細胞培養物。
【請求項25】
前記第１の発現コンストラクトがプラスミドを含む、請求項２４に記載の細胞培養物。
【請求項26】
前記第２の発現コンストラクトがプラスミドを含む、請求項２４に記載の細胞培養物。
【請求項27】
前記第１の発現コンストラクトがトランスポゾンシステムを更に含む、請求項２５に記載の細胞培養物。
【請求項28】
前記トランスポゾンシステムがスリーピングビューティートランスポザーゼシステムである、請求項２７に記載の細胞培養物。
【請求項29】
前記トランスポゾンシステムがピギーバックトランスポザーゼシステムである、請求項２７に記載の細胞培養物。
【請求項30】
前記第２の発現コンストラクトがトランスポゾンシステムを更に含む、請求項２４に記載の細胞培養物。
【請求項31】
前記トランスポゾンシステムがスリーピングビューティートランスポザーゼシステムである、請求項３０に記載の細胞培養物。
【請求項32】
前記トランスポゾンシステムがピギーバックトランスポザーゼシステムである、請求項３０に記載の細胞培養物。
【請求項33】
前記プログラニュリンポリペプチドが、プログラニュリン－抗体フラグメント融合タンパク質、又はプログラニュリン－抗体フラグメント融合タンパク質を発現する遺伝子を含む、請求項１０に記載の細胞培養物。
【請求項34】
前記プロサポシンが、プロサポシン－抗体フラグメント融合タンパク質、又はプロサポシン－抗体フラグメント融合タンパク質を発現する遺伝子を含む、請求項１０に記載の細胞培養物。
【請求項35】
前記プログラニュリン－抗体フラグメント又は前記プロサポシン－抗体フラグメントのいずれかの前記抗体フラグメントが、プログラニュリン、プロサポシン、又はその複合体の脳分配及び細胞取り込みを増加させる、請求項３３又は３４に記載の細胞培養物。
【請求項36】
前記プログラニュリン遺伝子がプログラニュリン－抗体フラグメント融合遺伝子を発現する、請求項１０に記載の細胞培養物。
【請求項37】
前記プロサポシン遺伝子がプロサポシン－抗体フラグメント融合を発現する、請求項１０に記載の細胞培養物。
【請求項38】
前記融合遺伝子が配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、又はそのフラグメントを含む、請求項３６又は３７に記載の融合遺伝子。
【請求項39】
前記プログラニュリン－抗体フラグメント融合遺伝子が、プログラニュリン、プロサポシン、又はその複合体の脳分配及び細胞取り込みを増加させるペプチド配列をコードし；更に、前記プロサポシン－抗体フラグメント融合遺伝子が、プログラニュリン、プロサポシン、又はその複合体の脳分配及び細胞取り込みを増加させるペプチド配列をコードする、請求項３６、３７、又は３８のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項40】
前記発現されたプログラニュリン及びプロサポシンが、前記細胞から分泌される前に複合体を形成する、請求項６又は１０に記載の細胞培養物。
【請求項41】
前記発現されたプログラニュリン及びプロサポシンが、前記細胞から分泌された後に複合体を形成する、請求項６又は１０に記載の細胞培養物。
【請求項42】
前記複合体がプログラニュリン及びプロサポシンのヘテロダイマーを含む、請求項４０又は４１に記載の細胞培養物。
【請求項43】
前記細胞株からのプログラニュリン、プロサポシン、又はプログラニュリン及びプロサポシンのヘテロダイマーの分泌を刺激する因子を更に含む、請求項６又は１０に記載の細胞培養物。
【請求項44】
神経障害を有する患者を処置するためのデバイスであって、埋め込み型細胞デバイスと、
請求項６又は１０に記載の細胞培養物によって産生される細胞株と
を含み、前記細胞株が治療薬を分泌するように設計された、デバイス。
【請求項45】
前記埋め込み型細胞デバイスが前記細胞株を含有するカプセルを含む、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項46】
前記埋め込み型細胞デバイスが半透膜を更に含み、前記半透膜が、前記埋め込み型細胞デバイス内に置かれた前記細胞株から分泌される前記治療薬の前記膜を通じた拡散を可能にする、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項47】
前記半透膜が免疫隔離的である、請求項４６に記載のデバイス。
【請求項48】
前記デバイスが、前記半透膜内に配されたマトリックスを更に含む、請求項４６に記載のデバイス。
【請求項49】
処置を必要とする患者の体内に前記細胞デバイスを埋め込む手段を更に含む、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項50】
前記埋め込む手段がカテーテルを含む、請求項４９に記載のデバイス。
【請求項51】
前記カテーテルが、前記患者の線条体、脊柱管の髄腔内に埋め込みされるか、あるいはくも膜下腔に埋め込まれるように設計される、請求項５０に記載のデバイス。
【請求項52】
前記細胞デバイスからの治療薬の送達のための１つ以上の媒介物を更に含む、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項53】
前記媒介物がポンプ又はシリンジを含む、請求項５２に記載のデバイス。
【請求項54】
前記デバイスが経口的、髄腔内、脳室内、又は脳内に埋め込まれる、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項55】
前記神経障害が神経変性疾患である、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項56】
前記神経障害がリソソーム蓄積疾患である、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項57】
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、辺縁系優位型加齢性ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質－４３（ＴＤＰ－４３）脳症（ＬＡＴＥ）、レビー小体認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、及びリソソーム蓄積障害からなる群より選択される、請求項５５に記載のデバイス。
【請求項58】
前記リソソーム蓄積疾患が、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ゲノムと遺伝子の百科事典（ＫＥＧＧ）の疾患、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ムコ多糖症ＩＩＩ及びＩＶ、テイ・サックス病、ファーバー病、並びにその組み合わせからなる群より選択される、請求項５６に記載のデバイス。
【請求項59】
プログラニュリン及びプロサポシンの複合体を製造するための方法であって、当該方法が、プログラニュリンを発現する第１の発現コンストラクトを細胞株に挿入するステップと、
プロサポシンを発現する第２の発現コンストラクトを同一の細胞株に挿入するステップと
を挿入することを含む、方法。
【請求項60】
前記細胞株が、マウス骨髄腫細胞（ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）－Ｋ１；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウス線維芽細胞－３Ｔ３細胞；アフリカミドリザル細胞株；間葉性軟骨肉腫－１（ＭＣＳ）；ラット副腎褐色細胞腫（ＰＣ）－１２；ラット副腎褐色細胞腫（ＰＣ）－１２Ａ；ＡＴ３、ラットグリア腫瘍（Ｃ６）細胞；ラット神経細胞株ＲＮ３３ｂ；ラット海馬細胞株ＨｉＢ５；増殖因子拡張幹細胞；上皮増殖因子（ＥＧＦ）応答性ニューロスフェア；哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）由来の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）応答性神経前駆幹細胞；胎児細胞；初代線維芽細胞；シュワン細胞；アストロサイト；β－ＴＣ細胞；Ｈｅｐ－Ｇ２線条体細胞；オリゴデンドロサイト及びその前駆体；マウス筋芽細胞－Ｃ２Ｃ１２；ヒトグリア由来細胞－Ｈｓ６８３；ヒトグリア由来細胞－Ａ１７２；ＨＥＩ１９３Ｔ細胞株；ブタ神経膠芽細胞；神経細胞；ニューロン；アストロサイト；介在ニューロン；ヒト長骨から単離された軟骨芽細胞；ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）；ヒト細胞株ＨｅＬａ細胞；ウサギ角膜由来細胞（スターツス・セルムインスティトゥート・ウサギ角膜細胞（ＳＩＲＣ））；ヒト角膜由来細胞、ヒト脈絡叢細胞、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来細胞株、ヒトニューロトロフィン３（ＮＴ３）細胞、成人網膜色素上皮細胞株－１０（ＡＲＰＥ－１９）、循環血管新生細胞（ＣＡＣ）、不死化ヒト線維芽細胞（ＭＤＸ細胞）、テロメラーゼ不死化ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞株、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記アフリカミドリザル細胞株がＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＳＣＣ－１、ＢＳＣ－４０、ＢＭＴ－１０、及びベロ細胞株からなる群より選択される、請求項６０に記載の細胞培養物。
【請求項62】
前記ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞株がヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）網膜色素上皮－１（ＲＰＥ－１）である、請求項６０に記載の細胞培養物。
【請求項63】
哺乳動物組み換え体産生に対する好ましい細胞株がＡＲＰＥ－１９、ＣＨＯ、ＣＨＯ－１、ＨＥＩ１９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、及びＢＨＫ細胞を含む、請求項６０に記載の細胞培養物。
【請求項64】
前記第１の発現コンストラクトがプラスミドを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項65】
前記第１の発現コンストラクトがスリーピングビューティートランスポザーゼシステムを更に含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記第２の発現コンストラクトがプラスミドを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項67】
前記第２の発現コンストラクトがスリーピングビューティートランスポザーゼシステムを更に含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記細胞株がバイオリアクター内に含まれる、請求項５９に記載の方法。
【請求項69】
前記プログラニュリン及びプロサポシンの複合体を精製するステップを更に含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項70】
前記プログラニュリン及びプロサポシンの複合体がイオン交換クロマトグラフィーによって精製される、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記イオン交換クロマトグラフィーがポリプロピレンプラスチックを用いない、請求項７０に記載の方法。
【請求項72】
前記プログラニュリン及びプロサポシンの複合体がゲル濾過によって精製される、請求項６９に記載の方法。
【請求項73】
請求項４０又は４１に記載の方法によるプログラニュリン及びプロサポシンの複合体を含む、神経障害の処置のための治療薬。
【請求項74】
前記治療薬が神経障害に対する処置を必要とする患者に投与される、請求項７３に記載の治療薬。
【請求項75】
前記神経障害が神経変性疾患である、請求項７４に記載の治療薬。
【請求項76】
前記神経障害がリソソーム蓄積疾患である、請求項７４に記載の治療薬。
【請求項77】
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、辺縁系優位型加齢性ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質－４３（ＴＤＰ－４３）脳症（ＬＡＴＥ）、レビー小体認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）からなる群より選択される、請求項５７に記載の治療薬。
【請求項78】
前記リソソーム蓄積疾患が、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ゲノムと遺伝子の百科事典（ＫＥＧＧ）の疾患、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ムコ多糖症ＩＩＩ及びＩＶ、テイ・サックス病、並びにファーバー病からなる群より選択される、請求項７６に記載の治療薬。
【請求項79】
前記治療薬が注射によって前記患者に投与される、請求項７３に記載の治療薬。
【請求項80】
前記治療薬がカテーテルによって前記患者に投与される、請求項７３に記載の治療薬。
【請求項81】
患者からの流体サンプル中のプログラニュリン及びプロサポシンの相対濃度を検査するための方法であって、前記方法は、プログラニュリンの濃度を検査するステップと、
プロサポシンの濃度を検査するステップと、
プログラニュリン及びプロサポシンの複合体の濃度を検査するステップと、
プログラニュリン及びプロサポシンの複合体の濃度に対するプログラニュリンの濃度の比率を比較するステップと、
プログラニュリン及びプロサポシンの複合体の濃度に対するプロサポシンの濃度の比率を比較するステップと
を含む、方法。
【請求項82】
前記検査が酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は近接ライゲーションアッセイを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
前記患者からの前記流体サンプルが、ヒト脳脊髄液、血漿、血清、唾液、涙液、母乳、尿、及びその組み合わせからなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項84】
前記患者の神経障害を診断するステップを更に含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項85】
前記患者の神経障害の進行を評価するステップを更に含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項86】
前記神経障害が神経変性疾患である、請求項８４に記載の方法。
【請求項87】
前記神経障害がリソソーム蓄積疾患である、請求項８４に記載の方法。
【請求項88】
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー小体認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、ゴーシェ病、神経セロイドリポフスチン症、及びその組み合わせからなる群より選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項89】
前記リソソーム蓄積疾患が、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ゲノムと遺伝子の百科事典（ＫＥＧＧ）の疾患、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ムコ多糖症ＩＩＩ及びＩＶ、テイ・サックス病、並びにファーバー病からなる群より選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項90】
患者におけるＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及び／又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の絶対レベル及び相対レベルを決定するために用いられるアッセイ。
【請求項91】
前記アッセイが神経障害を診断するために用いられる、請求項９０に記載のアッセイ。
【請求項92】
前記アッセイが患者の神経障害の進行を評価するために用いられる、請求項９０に記載のアッセイ。
【請求項93】
前記神経障害が神経変性疾患である、請求項９０に記載のアッセイ。
【請求項94】
前記神経障害がリソソーム蓄積疾患である、請求項９０に記載のアッセイ。
【請求項95】
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、辺縁系優位型加齢性ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質－４３（ＴＤＰ－４３）脳症（ＬＡＴＥ）、レビー小体認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）からなる群より選択される、請求項９３に記載のアッセイ。
【請求項96】
前記リソソーム蓄積疾患が、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ゲノムと遺伝子の百科事典（ＫＥＧＧ）の疾患、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ムコ多糖症ＩＩＩ及びＩＶ、テイ・サックス病、並びにファーバー病からなる群より選択される、請求項９４に記載のアッセイ。
【請求項97】
プログラニュリン及びプロサポシンの複合体を含むバイオマーカー。
【請求項98】
前記バイオマーカーが、神経障害の検出並びに／又は神経障害の予後及び進行の評価のために用いられる、請求項９７に記載のバイオマーカー。
【請求項99】
前記神経障害が神経変性疾患である、請求項９８に記載のバイオマーカー。
【請求項100】
前記神経障害がリソソーム蓄積疾患である、請求項９８に記載のバイオマーカー。
【請求項101】
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、辺縁系優位型加齢性ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質－４３（ＴＤＰ－４３）脳症（ＬＡＴＥ）、レビー小体認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）からなる群より選択される、請求項９９に記載のバイオマーカー。
【請求項102】
前記リソソーム蓄積疾患が、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ゲノムと遺伝子の百科事典（ＫＥＧＧ）の疾患、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ムコ多糖症ＩＩＩ及びＩＶ、テイ・サックス病、並びにファーバー病からなる群より選択される、請求項１００に記載のバイオマーカー。
【請求項103】
前記バイオマーカーが、患者における炎症性疾患、癌、及び肥満関連の病態の検出、診断、及び／又はモニタリングのために用いられる、請求項９７に記載のバイオマーカー。
【請求項104】
前記炎症性疾患が、胆石症、脂肪肝疾患、子宮内膜症、炎症性腸疾患、喘息、関節リウマチ、慢性消化性潰瘍、歯周炎、クローン病、副鼻腔炎、肝炎、循環器疾患、関節炎、慢性閉塞性肺疾患、脳炎、髄膜炎、神経炎、及び膵炎からなる群より選択される、請求項１０３に記載のバイオマーカー。
【請求項105】
前記肥満関連の病態が、２型糖尿病、１型糖尿病、高脂血症、インスリン非感受性、高血糖症、高インスリン血症、低インスリン血症、脂質異常症、高血圧症、及び粥状動脈硬化からなる群より選択される、請求項１０３に記載のバイオマーカー。
【請求項106】
クローン細胞培養物であって、前記クローン細胞培養物が因子の組み合わせを発現及び放出する、クローン細胞培養物。
【請求項107】
前記因子が神経再生因子である、請求項１０６に記載のクローン細胞培養物。
【請求項108】
前記因子がリソソームターゲティング因子である、請求項１０６に記載のクローン細胞培養物。
【請求項109】
前記因子がミスフォールドタンパク質ターゲティング因子である、請求項１０６に記載のクローン細胞培養物。
【請求項110】
前記神経再生因子が、ニューロトロフィンタンパク質、グリア細胞由来神経栄養因子タンパク質、脳ドーパミン神経栄養因子タンパク質、及び中脳アストロサイト由来神経栄養因子タンパク質からなる群より選択される、請求項１０７に記載のクローン細胞培養物。
【請求項111】
前記リソソームターゲティング因子が、プログラニュリン、プログラニュリンの誘導体、プロサポシン、プロサポシンの誘導体、プログラニュリン／プロサポシン複合体、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム膜タンパク質１、及びカテプシンからなる群より選択される、請求項１０８に記載のクローン細胞培養物。
【請求項112】
前記ミスフォールドタンパク質ターゲティング因子が、アルファ－シヌクレイン、アミロイドベータ（Αβ：ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ）タウ、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３、肉腫内融合（Ｆｕｓｅｄ ｉｎ Ｓａｒｃｏｍａ）、ハンチンチン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）タンパク質、及びＣ９ｏｒｆ由来ジペプチドからなる群より選択されるペプチド、抗体、又は抗体フラグメントである、請求項１０９に記載のクローン細胞培養物。
【請求項113】
前記ミスフォールドタンパク質ターゲティング因子が機能性ペプチドにコンジュゲートされる、請求項１０９に記載のクローン細胞培養物。
【請求項114】
前記機能性ペプチドが細胞取り込みを促進する、請求項１１３に記載のクローン細胞培養物。
【請求項115】
前記機能性ペプチドが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の転写のトランスアクチベーター（ＴＡＴ）である、請求項１１４に記載のクローン細胞培養物。
【請求項116】
前記機能性ペプチドが分解経路のトリガーを促進する、請求項１１３に記載のクローン細胞培養物。
【請求項117】
前記機能性ペプチドが標的タンパク質分解キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）である、請求項１１６に記載のクローン細胞培養物。
【請求項118】
必要な患者に投与される組み合わせ療法であって、前記療法がプログラニュリン、プロサポシン、プログラニュリン及びプロサポシンの複合体、アルファ－シヌクレインターゲティング抗体、並びにアルファ－シヌクレインターゲティング神経再生因子の送達を含む、組み合わせ療法。
【請求項119】
前記プログラニュリン、プロサポシン、プログラニュリン及びプロサポシンの複合体、アルファ－シヌクレインターゲティング抗体、並びにアルファ－シヌクレインターゲティング神経再生因子が、異なる組み合わせで前記患者に投与される、請求項１１８に記載の組み合わせ療法。
【請求項120】
前記アルファ－シヌクレインターゲティング神経再生因子がグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＣＮＦ）である、請求項１１８に記載の組み合わせ療法。
【請求項121】
前記組み合わせ療法が神経障害を処置する、請求項１１８に記載の組み合わせ療法。
【請求項122】
前記神経障害が神経変性疾患である、請求項１２１に記載の組み合わせ療法。
【請求項123】
前記神経障害がリソソーム蓄積疾患である、請求項１２１に記載の組み合わせ療法。
【請求項124】
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、辺縁系優位型加齢性ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質－４３（ＴＤＰ－４３）脳症（ＬＡＴＥ）、レビー小体認知症、パーキンソン病（ＰＤ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）からなる群より選択される、請求項１２２に記載の組み合わせ療法。
【請求項125】
前記リソソーム蓄積疾患が、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ゲノムと遺伝子の百科事典（ＫＥＧＧ）の疾患、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ムコ多糖症ＩＩＩ及びＩＶ、テイ・サックス病、並びにファーバー病からなる群より選択される、請求項１２３に記載の組み合わせ療法。
【請求項126】
細胞株であって、前記細胞株がプログラニュリンペプチド、プロサポシンペプチド、又はプログラニュリンペプチド及びプロサポシンペプチドの複合体を発現するか、又は発現するように改変された、細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［連邦政府が後援する研究及び開発の下でなされた発明の権利に関する声明］
本発明は、米国政府の支援によって行われたものではない。
本発明は、米国政府の支援によって行われたものではない。
【0002】
［本出願の一部を形成する配列表に関する声明］
本出願はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用により援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２０年５月１５日に作成され、Ｐ９５９０ＵＳ００＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、１４４，４８４バイトのサイズである。
本出願はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用により援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２０年５月１５日に作成され、Ｐ９５９０ＵＳ００＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、１４４，４８４バイトのサイズである。
【0003】
本発明は、新規のバイオマーカーに対する方法及び組成物と、処置とに関し、この処置は、組み換えタンパク質並びに遺伝子ベース及び細胞ベースの治療法、特に、神経変性疾患及びリソソーム蓄積障害の処置のための、プログラニュリン、プロサポシン、プログラニュリン及びプロサポシンの複合体（本明細書において「プログラニュリン／プロサポシン複合体（単数又は複数）」とも呼ばれる）、アルファ－シヌクレインターゲティング抗体、並びに神経再生因子ＧＤＮＦを含むがそれに限定されないそれらの神経再生因子の異なる組み合わせの送達のための組み合わせ療法を含むが、それに限定されない。別の態様において、本発明は、アルファ－シヌクレインターゲティング抗体、ＧＤＮＦ、プログラニュリン、プロサポシン、プログラニュリン及びプロサポシンの複合体を発現する細胞株、これらを製造する方法、例えばヒト血清及びＣＳＦなどにおいてこれらをモニタリングする方法、並びに両方の組み換え因子を治療薬か、又は患者にアルファ－シヌクレインターゲティング抗体、ＧＤＮＦ、プログラニュリン、プロサポシン、及びプログラニュリン／プロサポシン複合体を送達するための埋め込み型細胞デバイス内部の細胞株として用いることに関する。
【背景技術】
【0004】
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ：Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）は、構造的磁気共鳴画像法又はポジトロン断層撮影によって可視化される前頭葉及び／又は前部側頭葉の萎縮を特徴とする神経障害である。ＦＴＤは、全ての認知症の症例の１０％～２０％と推定される。ＦＴＤは最も一般的な初老期認知症の１つと認識されており、１００，０００人当り１５～２２人が罹患する。徴候及び症状は、典型的に後期成人期、一般的には４５～６５歳で顕在化する。徴候及び症状は典型的に、社会的行動及び行為の１つ以上の変化、社会的認識の喪失及び衝動制御不良、言語理解障害、進行性の非流暢性失語、並びに顕著な行動の変化を含む。疾患が進行すると、患者は例えば実行機能及び作業記憶の喪失などの、アルツハイマー病と同等の症状を呈することがある。現在、行動症状を管理するための処置、典型的な選択的セロトニン再取り込み阻害剤を除いて、ＦＴＤに対する治療法はない。
【0005】
ＦＴＤの機構の１つは、グラニュリン（ＧＲＮ：ｇｒａｎｕｌｉｎ）遺伝子の変異である。ＧＲＮにおけるハプロ不全は、グラニュリンの前駆体の形であるプログラニュリン（ＰＧＲＮ：ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）の細胞外レベルの減少として容易にモニタリングされ、それは典型的に遺伝性の形態のＦＴＤをもたらし、かつＰＧＲＮの完全な欠失は、リソソーム蓄積障害である神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ：ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）ももたらす。細胞外ＰＧＲＮはニューロンによって取り入れられ、異なる機構を介してリソソームに輸送される。加えてＰＧＲＮは、リソソームのスフィンゴ糖脂質分解に必須であるサポシンペプチドの前駆体のプロサポシン（ＰＳＡＰ：ｐｒｏｓａｐｏｓｉｎ）のニューロン取り込み及びリソソーム送達を促進する。加えて、ＰＧＲＮ変異ニューロンは、リソソームＧＣアーゼ活性の低下、脂肪蓄積、及び不溶性アルファ－シヌクレインの増加を有する。ＦＴＤの患者の脳組織サンプルは、ニューロン中のＰＳＡＰレベルの低下を示す。したがって、細胞外ＰＧＲＮの細胞取り込みの減少と、ＰＧＲＮが介在するＰＳＡＰリソソーム輸送の低下とは、ＧＲＮ変異によるＮＣＬ及びＦＴＤに対する基礎的な疾患の機構であるかもしれない。このことに対して、血漿又はＣＳＦ中のＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体、及び疾患においてその発現レベルがどの程度変化し得るかのモニタリング又は特徴付けはまだ誰も行っていない。診断、予後、治療法の開発、及び処置応答のモニタリングのために、それぞれ個々の流体バイオマーカー及び経路バイオマーカープロファイルとして、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及び／又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰの絶対レベル及び相対レベルを決定するための特定のアッセイが当該技術分野において必要とされている。
【0006】
ＰＧＲＮ及びＰＳＡＰは、互いの発現レベルを調節することに加えて、互いのリソソーム輸送を促進するために物理的に相互作用し、ＰＧＲＮ－ＰＳＡＰ相互作用は、脳内の適切なリソソーム機能を維持するために重要である。しかしこれまでに、細胞外ＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ－ＰＳＡＰ複合体のいずれかの補充によってＮＣＬ及びＦＴＤを予防又は処置できることは誰にも示されていない。ＰＧＲＮ－ＰＳＡＰ複合体を、これらの分子実体が神経変性からの保護を行い得る脳までの輸送も可能にするやり方で生成する、効果的な方法が当該技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
第１の態様において、本発明は、１つ若しくは複数のアルファ－シヌクレインターゲティング抗体若しくは抗体フラグメント、及び／又はプログラニュリン、及び／又はプロサポシン、及び／又はＧＤＮＦ並びにそれらのサブペプチド及び誘導体を発現する細胞株に関する。好ましい実施形態において、この細胞株は、例えば細胞株にプラスミドを挿入することなどによって、これらの因子を同時に産生するように遺伝子改変される。様々な実施形態において、アルファ－シヌクレインターゲティング抗体／フラグメント、ＧＤＮＦ及びプログラニュリン及びプロサポシンは、ポリペプチド、サブペプチド、ＲＮＡ、又はエキソソームＲＮＡとして発現される。
【0008】
本発明によるデバイスには、多くの異なる細胞型が封入されてもよい。これらの細胞型は、周知の公的に入手可能な不死化細胞株、自然発生的に不死化された細胞株、及び分裂する初代細胞培養物を含む。細胞株はいくつかの実施形態においてトランスフェクト又は形質導入されるため、クローンを選択し、増殖させて、細胞を貯蔵する必要があり、細胞又は細胞株はかなりの数の分裂を行い得ることが好ましい。
【0009】
前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）及び／又は前駆（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞を含む多様な細胞から、長期増殖が可能な細胞株が生成されてもよい。多能性及び複能性幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞、並びに造血幹細胞を含む幹細胞も好適である。
【0010】
本発明の細胞株は、マウス骨髄腫細胞（ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ）；ＣＨＯ－Ｋ１；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）；マウス線維芽細胞－３Ｔ３細胞；アフリカミドリザル細胞株（ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＢＳＣ－１、ＢＳＣ－４０、ＢＭＴ－１０、及びベロを含む）；間葉性軟骨肉腫－１（ＭＣＳ：ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｈｏｎｄｒｏＳａｒｃｏｍａ－１）；ラット副腎褐色細胞腫（ＰＣ１２及びＰＣ１２Ａ）；ＡＴ３、ラットグリア腫瘍（Ｃ６）；ラットニューロン細胞株ＲＮ３３ｂ；ラット海馬細胞株ＨｉＢ５；増殖因子拡張幹細胞；上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）応答性ニューロスフェア；哺乳動物のＣＮＳ由来の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）応答性（ｂＦＧＦ応答性）神経前駆幹細胞；胎児細胞；初代線維芽細胞；シュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞；アストロサイト；β－ＴＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１５０６）細胞；ヒト肝臓癌細胞株Ｈｅｐ－Ｇ２線条体細胞；オリゴデンドロサイト及びその前駆体；マウス筋芽細胞－Ｃ２Ｃ１２；ヒトグリア由来細胞－Ｈｓ６８３；ヒトグリア由来細胞－Ａ１７２；ＨＥＩ１９３Ｔ細胞株；ブタ神経膠芽細胞；神経細胞；ニューロン；アストロサイト；介在ニューロン；ヒト長骨から単離された軟骨芽細胞；ヒト胎児腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３：ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ ２９３）；ヒト細胞株ＨｅＬａ；ウサギ角膜由来細胞（スタテンス・セルムインスティトゥート・ウサギ角膜（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｒｎｅａ）（ＳＩＲＣ））；ヒト角膜由来細胞、ヒト脈絡叢細胞、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）細胞由来細胞株、ヒトニューロトロフィン３（ＮＴ３：ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ３）細胞、ＡＲＰＥ－１９、ＣＡＣ細胞、不死化ヒト線維芽細胞（ＭＤＸ細胞）、例えばｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１などのテロメラーゼ不死化ヒトＲＰＥ細胞株、間葉系幹細胞（ＭＳＣ：ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）を含む。
【0011】
哺乳動物組み換え体産生のための好ましい細胞株は、ＡＲＰＥ－１９、ＣＨＯ、ＣＨＯ－１、ＨＥＩ１９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、Ｃ２Ｃ１２、及びＢＨＫ細胞を含む。
【0012】
好ましい実施形態において、細胞株は最大４つの発現コンストラクトを含む。すなわち、プログラニュリンポリペプチド、プログラニュリン遺伝子、プログラニュリンＲＮＡ、又はプログラニュリンをコードするエキソソームＲＮＡを発現する第１の発現コンストラクトと、プロサポシンポリペプチド、プロサポシン遺伝子、プロサポシンＲＮＡ、又はプロサポシンをコードするエキソソームＲＮＡを発現する第２の発現コンストラクトと、アルファ－シヌクレイン抗体又は抗体フラグメントをコードする遺伝子、ＲＮＡ、又はエキソソームＲＮＡを発現する第３の発現コンストラクトと、ＧＤＮＦ ＲＮＡ又はＧＤＮＦをコードするエキソソームＲＮＡを発現する第４の発現コンストラクトとである。本発明の実施形態において、発現コンストラクトはプラスミドを含む。更なる実施形態において、プラスミドは、例えばスリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）トランスポザーゼなどのトランスポゾンシステムを含んでもよい。
【0013】
本発明の細胞株によって産生されるプログラニュリン又はプロサポシンは、中枢神経系におけるプログラニュリン、プロサポシン、及びプログラニュリン／プロサポシン複合体の分配及び取り込みを促進する目的のために、抗体のフラグメント結晶化可能（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域（Ｆｃ領域）を更に含んでもよい。様々な実施形態において、プロサポシン－Ｆｃ又はプログラニュリン－Ｆｃ領域の組み合わせは、融合タンパク質、融合遺伝子、又は融合ＲＮＡを含む。
【0014】
本発明の細胞株によって発現されるプログラニュリン及びプロサポシンは、細胞株からの分泌の前又は後に典型的に複合体を形成する。この複合体は、プログラニュリンとプロサポシンとのヘテロダイマーであってもよい。
【0015】
本発明の実施形態において、本発明の細胞株は、プログラニュリン又はプロサポシンの細胞株からの分泌を刺激する因子を更に発現する。
【0016】
好ましい実施形態において、本発明の細胞株は埋め込み型細胞デバイス内に含まれ、その埋め込み型細胞デバイスは、次いで処置を必要とする患者に挿入される。こうした細胞デバイスの例は、一般的に米国特許第８，７４１，３４０号；第９，１２１，０３７号；第９，３６４，４２７号；第９，６６９，１５４号；第９，８８４，０２３号；第１０，８３５，６６４号、及び第１０，８８８，５２６号に見出すことができ、これらは全て引用により援用される。こうしたデバイスは、患者の体内に埋め込まれたときに、細胞株から分泌されたアルファ－シヌクレイン抗体又は抗体フラグメント、プログラニュリン及びプロサポシン及びＧＤＮＦを、外傷を繰り返す必要なく患者に効率的に送達することを可能にする。これらの因子は継続的に産生されるため、製剤緩衝剤及びタンパク質の安定性の懸念は必要ない。この安定な細胞株は、２つ以上のエフェクター分子を分泌する単一の薬物物質とも考えられ、これは処置が困難な疾患における新たな治療介入を可能にする。
【0017】
好ましい実施形態において、埋め込み型細胞デバイスは半透膜を含み、この半透膜は、前記埋め込み型細胞デバイス内に置かれた細胞株から分泌された分子が前記膜を通って拡散することを可能にする。更なる実施形態において、この半透膜は、内部の細胞株を患者の免疫系から保護するための免疫分離を行う。別の好ましい実施形態において、埋め込み型細胞デバイスは、中に入れられた細胞株の効率的な生育及び生存を促進するために半透膜内に配されるマトリックスを含む。
【0018】
ある実施形態において、埋め込み型細胞デバイスは、処置を必要とする患者の体内にデバイスを埋め込むための手段を更に含んでもよい。この埋め込み手段はカテーテルであってもよい。デバイスは患者の様々な組織区画に埋め込まれてもよく、好ましくは髄腔内、脳室内、又は脳内に埋め込まれてもよい。埋め込みのための好ましい標的は、患者の線条体、脊柱管、及びくも膜下腔を含む。
【0019】
ある実施形態において、埋め込み型細胞デバイスは、アルファ－シヌクレイン抗体又は抗体フラグメント、プログラニュリン、及びプロサポシンを細胞株から患者の体内の所望の場所に送達することを促進するための媒介物を更に含んでもよい。様々な実施形態において、媒介物はポンプ又はシリンジ又は関連するカテーテルシステムである。
【0020】
本発明の細胞株は、神経疾患又は障害、特に複数の病態を特徴とする障害であるリソソーム蓄積障害又は神経変性疾患の処置に有用であってもよい。本発明の細胞株によって処置可能な神経障害は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、アルツハイマー病（ＡＤ：Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、辺縁系優位型加齢性ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質－４３（ＴＤＰ－４３）脳症（ＬＡＴＥ：ｌｉｍｂｉｃ－ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ＴＡＲ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－４３（ＴＤＰ－４３）ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、レビー小体認知症（ＬＢＤ：Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、パーキンソン病（ＰＤ：Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ）、及びリソソーム蓄積障害を含むが、それに限定されない。本発明の細胞株を用いて処置され得るリソソーム蓄積障害は、ゴーシェ病、異型ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ゲノムと遺伝子の百科事典（ＫＥＧＧ：Ｋｙｏｔｏ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅｓ）の疾患、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ：ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）、ムコ多糖症ＩＩＩ型及びＩＶ型、テイ・サックス病、ファーバー病、並びにその組み合わせを含むが、それに限定されない。
【0021】
加えて、本発明の細胞株によって産生されるアルファ－シヌクレイン抗体又は抗体フラグメント、並びにプログラニュリン、プロサポシン、並びにプログラニュリン及びプロサポシンの複合体は、神経障害の処置における治療薬として用いるために精製されてもよい。この実施形態において、本発明の細胞株は、大量のアルファ－シヌクレイン抗体又は抗体フラグメント、プログラニュリン、プロサポシン、及びプログラニュリン／プロサポシン複合体を生成するためのバイオリアクター内に含まれていてもよい。更なる実施形態において、プログラニュリン及びプログラニュリン／プロサポシン複合体は、塩析、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、及びイオン交換クロマトグラフィーを含むがそれに制限されないいくつかの生化学的なクロマトグラフィーの方法で精製される。なお更なる実施形態において、本発明の細胞株から単離された組み換えタンパク質は、上記で定義された神経障害の処置を必要とする患者に対する治療薬として投与され得る。様々な更なる実施形態において、その治療薬はポンプ、シリンジ、又はカテーテルシステムを用いて投与される。
【0022】
プログラニュリン及びプロサポシンの複合体は体液中に存在するため、例えばこの複合体を認識するＥＬＩＳＡなどの逆免疫に基づく方法によってモニタリングできることを本発明者らは更に発見した。細胞外プログラニュリン／プロサポシン複合体レベルの絶対レベルは、診断並びに薬物曝露及び処置応答のモニタリングのための有用なバイオマーカーであってもよい。加えて、患者からの流体サンプルに存在するプログラニュリン／プロサポシン複合体と比較した非複合型プログラニュリン又は非複合型プロサポシンの比率は、重要な情報を提供してもよく、神経障害に制限されない障害の診断のための有用なバイオマーカーか、又は特に処置開始後の神経障害の予後及び進行を評価するための手段となってもよい。本出願のバイオマーカーは、炎症性疾患、癌、及び肥満関連の病態の診断及びモニタリングに更に用いてもよい。炎症性疾患は、胆石症、脂肪肝疾患、子宮内膜症、炎症性腸疾患、喘息、関節リウマチ、慢性消化性潰瘍、歯周炎、クローン病、副鼻腔炎、肝炎、循環器疾患、関節炎、慢性閉塞性肺疾患、脳炎、髄膜炎、神経炎、及び膵炎を含むが、それに限定されない。肥満関連の病態は、２型糖尿病、１型糖尿病、高脂血症、インスリン非感受性、高血糖症、高インスリン血症、低インスリン血症、脂質異常症、高血圧症、及び粥状動脈硬化を含むが、それに限定されない。
【0023】
様々な実施形態において、非複合型プログラニュリン、非複合型プロサポシン、及びプログラニュリン／プロサポシン複合体の濃度は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、又は任意のその他の免疫に基づくアッセイ原理、例えば電気化学発光、例えばＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）技術（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、ＭＤ）、Ｓｉｍｏａ（登録商標）技術（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ（商標）社、ビレリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）、ＭＡ）、ＨＴＲＦ（登録商標）（ホモジニアス時間分解蛍光法（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ））（シスバイオ・バイオアッセイ株式会社（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｐａｒ Ａｃｔｉｏｎｓ）シンプリフィー・ア・アソシエ・ユニーク・フランス・パルク・マルセル・ボアトー（Ｓｉｍｐｌｉｆｅｅ ａ Ａｓｓｏｃｉｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｆｒａｎｃｅ Ｐａｒｃ Ｍａｒｃｅｌ Ｂｏｉｔｅｕｘ）Ｂ．Ｐ．、コドレ（Ｃｏｄｏｌｅｔ）、ＦＲ）、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、ＭＡ）、及び／又は近接ライゲーションアッセイなどによって決定されるが、代替的な分析方法を更に用いてもよい。様々な実施形態において、流体サンプルは血漿、脳脊髄液、唾液、涙、又は尿であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】図１は、異なるＥＣＢ細胞株からの条件培地におけるＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ及びＰＳＡＰ／ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。このアッセイは、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰコトランスフェクト細胞株と、ＦＬＡＧ（商標）－ＰＧＲＮトランスフェクト細胞（黒色矢印）とから、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の存在を検出することができる。
【図2】図２は、以下のＥＣＢ細胞株からの架橋された条件培地におけるＰＧＲＮ及びＰＳＡＰのウエスタンブロットを示す図である：ＡＲＰＥ－１９親細胞株（Ａ）、ＰＧＲＮ（５６）、ＰＳＡＰ（＃７）、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１同時発現株（Ｄ５）。矢印は、図１に示されるＥＬＩＳＡの結果と一致するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の存在を示す。
【図3】図３は、ヒトプログラニュリン、ヒトプロサポシン、又はヒトプロサポシン＋プログラニュリンを過剰発現する培養封入細胞（ＡＲＰＥ－１９細胞／スリーピングビューティーシステム）からの条件培地におけるＥＬＩＳＡのサンプルを説明する図である。プログラニュリン過剰発現デバイスは、ほとんど単量体プログラニュリンを分泌するが、プログラニュリン／プロサポシン複合体も分泌する。プロサポシン過剰発現デバイスは、プロサポシンのみ分泌する。プロサポシン＋プログラニュリン過剰発現ＥＣＢデバイスは、ほとんどプログラニュリン／プロサポシン複合体を分泌する。ｃｌ５６はプログラニュリン分泌デバイスであり、Ｄ５はプロサポシン＋プログラニュリン＋ｓｃＦｖ８１デバイスである。
【図4A】図４Ａは、プログラニュリン又はプログラニュリン＋プロサポシン＋ｓｃＦｖ８１を過剰発現するＡＲＰＥ－１９細胞からの条件培地の分子ふるいクロマトグラフィーを図示する図である。図４Ａの生データを、プログラニュリン＋プロサポシン＋ｓｃＦｖ８１を過剰発現する細胞（図４Ｂ）及びプログラニュリンを過剰発現する細胞（図４Ｃ）に対してマージすることによって、遊離プログラニュリンはプログラニュリン過剰発現細胞からの画分のみに検出されるのに対し、プログラニュリン＋プロサポシンを過剰発現する細胞からの条件培地における全ての分泌プログラニュリンがプロサポシンとの複合体であることが示される。
【図4B】図４Ｂは、プログラニュリン又はプログラニュリン＋プロサポシン＋ｓｃＦｖ８１を過剰発現するＡＲＰＥ－１９細胞からの条件培地の分子ふるいクロマトグラフィーを図示する図である。図４Ａの生データを、プログラニュリン＋プロサポシン＋ｓｃＦｖ８１を過剰発現する細胞（図４Ｂ）及びプログラニュリンを過剰発現する細胞（図４Ｃ）に対してマージすることによって、遊離プログラニュリンはプログラニュリン過剰発現細胞からの画分のみに検出されるのに対し、プログラニュリン＋プロサポシンを過剰発現する細胞からの条件培地における全ての分泌プログラニュリンがプロサポシンとの複合体であることが示される。
【図4C】図４Ｃは、プログラニュリン又はプログラニュリン＋プロサポシン＋ｓｃＦｖ８１を過剰発現するＡＲＰＥ－１９細胞からの条件培地の分子ふるいクロマトグラフィーを図示する図である。図４Ａの生データを、プログラニュリン＋プロサポシン＋ｓｃＦｖ８１を過剰発現する細胞（図４Ｂ）及びプログラニュリンを過剰発現する細胞（図４Ｃ）に対してマージすることによって、遊離プログラニュリンはプログラニュリン過剰発現細胞からの画分のみに検出されるのに対し、プログラニュリン＋プロサポシンを過剰発現する細胞からの条件培地における全ての分泌プログラニュリンがプロサポシンとの複合体であることが示される。
【図5】それぞれＦＬＡＧ（商標）タグｓｃＦＶ及びＦｃ－ｓｃＦｖ抗アルファ－シヌクレインターゲティング抗体フラグメントを分泌する培養デバイス及び細胞株からの条件培地における直接ＥＬＩＳＡ、並びにＰＧＲＮ及びＰＳＡＰ及びアルファ－シヌクレインターゲティングＦＬＡＧ（商標）タグｓｃＦｖ８１の過剰発現のために選択された細胞株（上右）と、アルファ－シヌクレインターゲティングペプチドｓｃＦｖ８１、ｓｃＦｖ１１３、及びｓｃＦｖ４９を過剰発現する細胞株とにおけるアルファ－シヌクレインターゲティングＦＬＡＧ（商標）タグｓｃＦｖの免疫細胞化学の結果を示す図である。照射は、Ｆｃ－ｓｃＦｖ－を過剰発現及び分泌する細胞に対するＦＩＴＣ抗ＦＬＡＧ（商標）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ｈＩｇＧ（モレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、ＯＲ）である。
【図6A】図６Ａは、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰアッセイ（Ａ）を示し、インビトロで集合した商業的に入手可能な組み換えＰＧＲＮ（リサーチ・アンド・ディアグノスティック・システムズ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＭＮ）及びＰＳＡＰ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北（Ｔａｉｐｅｉ）、ＴＷ）に由来するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰの複合体を検出するサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって生成されたデータを図示し（図６Ｂ及び図６Ｃ）、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体がヒト血漿（図６Ｄ）及びヒトＣＳＦ（図６Ｅ）中に存在して、これらのアッセイによってモニタリング可能であることを示す図である。これらのアッセイは、最初にＰＧＲＮを捕捉する（図６Ｂ）か、又は最初にＰＳＡＰを捕捉し（図６Ｃ）、その後にそれぞれＰＳＡＰ及びＰＧＲＮに対して特異的な検出抗体を用いることの両方によって、複合体を検出する。
【図6B】図６Ｂは、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰアッセイ（Ａ）を示し、インビトロで集合した商業的に入手可能な組み換えＰＧＲＮ（リサーチ・アンド・ディアグノスティック・システムズ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＭＮ）及びＰＳＡＰ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北（Ｔａｉｐｅｉ）、ＴＷ）に由来するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰの複合体を検出するサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって生成されたデータを図示し（図６Ｂ及び図６Ｃ）、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体がヒト血漿（図６Ｄ）及びヒトＣＳＦ（図６Ｅ）中に存在して、これらのアッセイによってモニタリング可能であることを示す図である。これらのアッセイは、最初にＰＧＲＮを捕捉する（図６Ｂ）か、又は最初にＰＳＡＰを捕捉し（図６Ｃ）、その後にそれぞれＰＳＡＰ及びＰＧＲＮに対して特異的な検出抗体を用いることの両方によって、複合体を検出する。
【図6C】図６Ｃは、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰアッセイ（Ａ）を示し、インビトロで集合した商業的に入手可能な組み換えＰＧＲＮ（リサーチ・アンド・ディアグノスティック・システムズ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＭＮ）及びＰＳＡＰ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北（Ｔａｉｐｅｉ）、ＴＷ）に由来するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰの複合体を検出するサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって生成されたデータを図示し（図６Ｂ及び図６Ｃ）、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体がヒト血漿（図６Ｄ）及びヒトＣＳＦ（図６Ｅ）中に存在して、これらのアッセイによってモニタリング可能であることを示す図である。これらのアッセイは、最初にＰＧＲＮを捕捉する（図６Ｂ）か、又は最初にＰＳＡＰを捕捉し（図６Ｃ）、その後にそれぞれＰＳＡＰ及びＰＧＲＮに対して特異的な検出抗体を用いることの両方によって、複合体を検出する。
【図6D】図６Ｄは、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰアッセイ（Ａ）を示し、インビトロで集合した商業的に入手可能な組み換えＰＧＲＮ（リサーチ・アンド・ディアグノスティック・システムズ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＭＮ）及びＰＳＡＰ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北（Ｔａｉｐｅｉ）、ＴＷ）に由来するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰの複合体を検出するサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって生成されたデータを図示し（図６Ｂ及び図６Ｃ）、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体がヒト血漿（図６Ｄ）及びヒトＣＳＦ（図６Ｅ）中に存在して、これらのアッセイによってモニタリング可能であることを示す図である。これらのアッセイは、最初にＰＧＲＮを捕捉する（図６Ｂ）か、又は最初にＰＳＡＰを捕捉し（図６Ｃ）、その後にそれぞれＰＳＡＰ及びＰＧＲＮに対して特異的な検出抗体を用いることの両方によって、複合体を検出する。
【図6E】図６Ｅは、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰアッセイ（Ａ）を示し、インビトロで集合した商業的に入手可能な組み換えＰＧＲＮ（リサーチ・アンド・ディアグノスティック・システムズ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＭＮ）及びＰＳＡＰ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北（Ｔａｉｐｅｉ）、ＴＷ）に由来するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰの複合体を検出するサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって生成されたデータを図示し（図６Ｂ及び図６Ｃ）、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体がヒト血漿（図６Ｄ）及びヒトＣＳＦ（図６Ｅ）中に存在して、これらのアッセイによってモニタリング可能であることを示す図である。これらのアッセイは、最初にＰＧＲＮを捕捉する（図６Ｂ）か、又は最初にＰＳＡＰを捕捉し（図６Ｃ）、その後にそれぞれＰＳＡＰ及びＰＧＲＮに対して特異的な検出抗体を用いることの両方によって、複合体を検出する。
【図7】ＰＧＲＮ（左）、リソソームタンパク質ＧＢＡ１（上中央）、及びＰＳＡＰ（下中央）を探索する免疫細胞化学分析によって作成された画像を示す図である。ヒト患者の初代ＧＢＡ１変異線維芽細胞（上の行）及びマウス一次皮質ニューロン（下の行）を、培養ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ同時発現細胞の条件培地に由来する精製ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体に曝露した。マージ（右の列）は、リソソームタンパク質ＧＢＡ１に対するＰＧＲＮ、及び皮質ニューロンに対する精製ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ複合体の十分な細胞内ターゲティングを示す。
【図8A】図８Ａは、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ、及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞株からの条件培地及び精製分泌因子の活性を図示する図である。一次マウス皮質ニューロン（図８Ａ及び図８Ｃ）並びにヒト初代線維芽細胞（図８Ｂ）を、ＡＲＰＥ－１９細胞株からの条件培地（図８Ａ）並びにＡＲＰＥ－１９細胞株からの条件培地からの精製ＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体（図８Ｂ及び図８Ｃ）に曝露し、分光法を用いてＧＢＡ１活性をアッセイした。
【図8B】図８Ｂは、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ、及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞株からの条件培地及び精製分泌因子の活性を図示する図である。一次マウス皮質ニューロン（図８Ａ及び図８Ｃ）並びにヒト初代線維芽細胞（図８Ｂ）を、ＡＲＰＥ－１９細胞株からの条件培地（図８Ａ）並びにＡＲＰＥ－１９細胞株からの条件培地からの精製ＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体（図８Ｂ及び図８Ｃ）に曝露し、分光法を用いてＧＢＡ１活性をアッセイした。
【図8C】図８Ｃは、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ、及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞株からの条件培地及び精製分泌因子の活性を図示する図である。一次マウス皮質ニューロン（図８Ａ及び図８Ｃ）並びにヒト初代線維芽細胞（図８Ｂ）を、ＡＲＰＥ－１９細胞株からの条件培地（図８Ａ）並びにＡＲＰＥ－１９細胞株からの条件培地からの精製ＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体（図８Ｂ及び図８Ｃ）に曝露し、分光法を用いてＧＢＡ１活性をアッセイした。
【図9B】図９Ｂは、埋め込みの２４週間後の病理組織診断によるＰＧＲＮデバイスの埋め込みの安全性の画像を示す図である。図９Ｂは、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１、及びＣＤ３を探索することによって、対照と比較して細胞増殖、炎症反応、又は浸潤性Ｔ細胞がないことを示す。
【図10A】図１０Ａは、線条体におけるチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンのアルファ－シヌクレインによってもたらされる損失のレスキューと、行動改善とによって測定される、細胞デバイスの埋め込みのインビボ活性を示す図である。図１０Ａは、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ－ＰＳＡＰ複合体を充填したデバイスが、デバイス処置していないラットと比較してニューロンの損失を防止したことを示す画像を選択したものである。
【図10B】図１０Ｂは、線条体におけるチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンのアルファ－シヌクレインによってもたらされる損失のレスキューと、行動改善とによって測定される、細胞デバイスの埋め込みのインビボ活性を示す図である。図１０Ｂは、同側と対側との差として提示されるＴＨ免疫反応性の濃度測定分析を図示する図である。図１０Ｂは、ＴＨ及びアルファ－シヌクレインのＩＨＣ染色の例を示す（アルファ－シヌクレイン過剰発現は、ヒトアルファ－シヌクレイン遺伝子を保有するＡＡＶ９ウイルスを黒質に片側注射することによって誘導した）。
【図10C】図１０Ｃは、線条体におけるチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンのアルファ－シヌクレインによってもたらされる損失のレスキューと、行動改善とによって測定される、細胞デバイスの埋め込みのインビボ活性を示す図である。図１０Ｃは、黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｎｉｇｒａ）に片側ＡＡＶ９－アルファ－シヌクレイン遺伝子注射を受けたラットにおいて、ＥＣＢ－ＰＧＲＮがどのように運動機能を改善するかを示す。
【図10D】図１０Ｄは、線条体におけるチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンのアルファ－シヌクレインによってもたらされる損失のレスキューと、行動改善とによって測定される、細胞デバイスの埋め込みのインビボ活性を示す図である。図１０Ｄは、黒質に片側ＡＡＶ９－アルファ－シヌクレイン遺伝子注射を受けたラットにおいて、ＥＣＢ－ＰＳＡＰ及びＥＣＢ－ＰＧＲＮ－ＰＳＡＰ複合体がどのように運動機能を改善するかを示す。
【図11】図１１は、ＧＤＮＦ＋ＰＧＲＮ又はＧＤＮＦ＋ＰＳＡＰ又はいずれかの因子のみを同時発現及び分泌するＡＲＰＥ細胞の細胞株及びインビボ活性を示す図である。図１１Ａは、それぞれＧＤＮＦ、ＰＳＡＰ、及びＧＤＮＦ＋ＰＳＡＰを発現する異なる細胞株のＧＤＮＦ及びＰＳＡＰ ＥＬＩＳＡ分析を示す。図１１Ｂは、６－ＯＨＤＡモデルのラットに対する自発的前肢配置使用行動検査の結果を図示する図である。親細胞（プラセボ）か、又はＰＳＡＰ、ＰＧＲＮ、ＧＤＮＦ及びＰＧＲＮ、若しくはＧＤＮＦ及びＰＳＡＰのいずれかを分泌する細胞を含むＥＣＢデバイスを線条体内に配置した。ラットの肢が支えられずにぶら下がり、その体長がテーブルの端縁と平行になるようにしてラットを保持した。次いでラットをテーブルの側部まで持ち上げて、前記ラットのヒゲをテーブルに接触させた。ナイーブラットは通常、テーブルの上に前肢を置くことによって応答する。アスタリスクはプラセボデバイスで処置したラットを示す。
【図12A】図１２Ａは、チューブリンを探索する免疫細胞化学によって可視化された神経突起伸長の増加と、対照及びＧＲＮ変異キャリアに由来するヒト初代線維芽細胞におけるグラニュリン、プロサポシン、サポシンＣ、及びＧＣアーゼ活性の増加とを示す図である。細胞培地にＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰのいずれかを補充することによって、ニューロン当りの平均分岐点カウントが増加する。
【図12B】図１２Ｂは、チューブリンを探索する免疫細胞化学によって可視化された神経突起伸長の増加と、対照及びＧＲＮ変異キャリアに由来するヒト初代線維芽細胞におけるグラニュリン、プロサポシン、サポシンＣ、及びＧＣアーゼ活性の増加とを示す図である。細胞培地にＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰのいずれかを補充することによって、平均神経突起長さが増加する。
【図13】ＰＧＲＮ－Ｈｉｓを混合したＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞からの濃縮条件培地を注射したラットからの脳へのＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの重複する拡散の画像を選択した図である。より高い拡大率では、これらの脳におけるＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの細胞内共局在が検出され、Ｈｉｓ様及びＰＳＡＰ様免疫反応性の細胞内共局在も検出され、脳室内（ＩＣＶ：ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は脳内に拡散されて脳細胞によって内部移行されることが示唆された。
【図14A】図１４Ａは、マウス及びラット（ＦＩＧ．１４Ａ）におけるＰＧＲＮ－Ｈｉｓを混合したＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞からの条件培地のＩＣＶ投与後の脳への分配、内部移行、及びリソソームターゲティングを示す図である。ラットにおける精製ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体、及びＰＧＲＮ－ＦｃのＩＣＶ投与（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。ブタにおけるＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を分泌するデバイスのＩＣＶ埋め込み後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｅ）、及びブタにおける精製ＰＧＲＮの髄腔内投与後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｆ）。投与されたＰＧＲＮ及びＰＳＡＰは、マウス及びラットにおいては免疫組織化学的に可視化され（図１４Ａ～図Ｄ）、ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡによって可視化された（図１４Ｅ及び図１４Ｆ）。
【図14B】図１４Ｂは、マウス及びラット（ＦＩＧ．１４Ａ）におけるＰＧＲＮ－Ｈｉｓを混合したＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞からの条件培地のＩＣＶ投与後の脳への分配、内部移行、及びリソソームターゲティングを示す図である。ラットにおける精製ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体、及びＰＧＲＮ－ＦｃのＩＣＶ投与（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。ブタにおけるＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を分泌するデバイスのＩＣＶ埋め込み後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｅ）、及びブタにおける精製ＰＧＲＮの髄腔内投与後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｆ）。投与されたＰＧＲＮ及びＰＳＡＰは、マウス及びラットにおいては免疫組織化学的に可視化され（図１４Ａ～図Ｄ）、ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡによって可視化された（図１４Ｅ及び図１４Ｆ）。
【図14C】図１４Ｃは、マウス及びラット（ＦＩＧ．１４Ａ）におけるＰＧＲＮ－Ｈｉｓを混合したＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞からの条件培地のＩＣＶ投与後の脳への分配、内部移行、及びリソソームターゲティングを示す図である。ラットにおける精製ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体、及びＰＧＲＮ－ＦｃのＩＣＶ投与（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。ブタにおけるＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を分泌するデバイスのＩＣＶ埋め込み後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｅ）、及びブタにおける精製ＰＧＲＮの髄腔内投与後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｆ）。投与されたＰＧＲＮ及びＰＳＡＰは、マウス及びラットにおいては免疫組織化学的に可視化され（図１４Ａ～図Ｄ）、ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡによって可視化された（図１４Ｅ及び図１４Ｆ）。
【図14D】図１４Ｄは、マウス及びラット（ＦＩＧ．１４Ａ）におけるＰＧＲＮ－Ｈｉｓを混合したＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞からの条件培地のＩＣＶ投与後の脳への分配、内部移行、及びリソソームターゲティングを示す図である。ラットにおける精製ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体、及びＰＧＲＮ－ＦｃのＩＣＶ投与（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。ブタにおけるＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を分泌するデバイスのＩＣＶ埋め込み後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｅ）、及びブタにおける精製ＰＧＲＮの髄腔内投与後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｆ）。投与されたＰＧＲＮ及びＰＳＡＰは、マウス及びラットにおいては免疫組織化学的に可視化され（図１４Ａ～図Ｄ）、ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡによって可視化された（図１４Ｅ及び図１４Ｆ）。
【図14E】図１４Ｅは、マウス及びラット（ＦＩＧ．１４Ａ）におけるＰＧＲＮ－Ｈｉｓを混合したＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞からの条件培地のＩＣＶ投与後の脳への分配、内部移行、及びリソソームターゲティングを示す図である。ラットにおける精製ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体、及びＰＧＲＮ－ＦｃのＩＣＶ投与（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。ブタにおけるＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を分泌するデバイスのＩＣＶ埋め込み後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｅ）、及びブタにおける精製ＰＧＲＮの髄腔内投与後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｆ）。投与されたＰＧＲＮ及びＰＳＡＰは、マウス及びラットにおいては免疫組織化学的に可視化され（図１４Ａ～図Ｄ）、ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡによって可視化された（図１４Ｅ及び図１４Ｆ）。
【図14F】図１４Ｆは、マウス及びラット（ＦＩＧ．１４Ａ）におけるＰＧＲＮ－Ｈｉｓを混合したＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞からの条件培地のＩＣＶ投与後の脳への分配、内部移行、及びリソソームターゲティングを示す図である。ラットにおける精製ＰＧＲＮ、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体、及びＰＧＲＮ－ＦｃのＩＣＶ投与（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。ブタにおけるＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を分泌するデバイスのＩＣＶ埋め込み後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｅ）、及びブタにおける精製ＰＧＲＮの髄腔内投与後に脳ライセートのＥＬＩＳＡ分析を行ったもの（図Ｆ）。投与されたＰＧＲＮ及びＰＳＡＰは、マウス及びラットにおいては免疫組織化学的に可視化され（図１４Ａ～図Ｄ）、ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡによって可視化された（図１４Ｅ及び図１４Ｆ）。
【図15】図１５は、ＡＡＶ－アルファ－シヌクレインラットパーキンソン病モデルにおける、それぞれの治療薬を分泌する封入細胞デバイスの埋め込みから１２週間後のＰＧＲＮ（図１５Ａ）、ＰＳＡＰ（図１５Ｂ）、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ（図１５Ｃ）の産生を図示した図である。
【図16】本出願で用いた細胞株の構築に用いたｐＴ２．ＣＡｎ．ＰＧＲＮプラスミドのマップを図示した図である。遺伝子配列は、左及び右の逆方向反復／直列反復配列（ＩＲ／ＤＲ：ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ／ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）の間に挿入され、スリーピングビューティートランスポザーゼシステムによって宿主ゲノムに組み込まれる。この例において、スリーピングビューティーシステムによって挿入される遺伝子はＰＧＲＮ、Ｎｅｏ、及びプロモーター配列（ＣＡ）である。このプラスミド配列は配列番号１として記載される。
【発明を実施するための形態】
【0025】
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）及びＧＲＮ関連の前頭側頭型認知症、ＧＢＡ１変異に関連するレビー小体認知症（ＬＢＤ／ＧＢＡ１）、パーキンソン病（ＰＤ）、及びゴーシェ病の患者の脳内では、遺伝子ＧＢＡ１にコードされるリソソーム酵素のグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ：ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）の活性が減少する。ＧＣアーゼ活性の回復は、これらの適応症に対する主要な治療目標である。加えて、プロサポシンの変異は、常染色体優性遺伝性ＰＤに関連付けられている。同様に、プログラニュリンをコードする遺伝子に損傷を与えるいくつかの変異がＰＤに関連付けられている。細胞外投与された組み換えプログラニュリン（ＰＧＲＮ）、プロサポシン（ＰＳＡＰ）、及び組み換えＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ複合体は、ヒト線維芽細胞のリソソームに内部移行されてＧＣアーゼと共局在し、一次皮質ニューロン（ＦＴＤ、ＬＢＤ、進行ＰＤ、及びＡＬＳに対する標的細胞型）におけるＧＣアーゼ活性を増加させる。加えて、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ、及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞、すなわちＥＣＢ－ＰＧＲＮ、ＥＣＢ－ＰＳＡＰ、及びＥＣＢ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ療法の治療製剤に由来する条件培地は、一次皮質ニューロンにおけるＧＣアーゼ活性を増加させる。このデータは、異なるヒト疾患においてＧＣアーゼ活性を刺激及びレスキューするために、組み換えＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、若しくはＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ、又はそれらに対応するＥＣＢ療法を用いることを支持するものである。
【0026】
シヌクレイン病ＬＢＤ及びＰＤに対して、ＧＣアーゼ活性の減少と、アルファ－シヌクレイン病態／レビー小体病態の発達の増加との間には強い関連がある。ＧＣアーゼの刺激と、アルファ－シヌクレインミスフォールディングを標的とする免疫療法とを単一の治療法に組み合わせることには強力な論拠がある。重要なことに、ＧＣアーゼ活性障害の有害な結果は、レビー小体（ＬＢ）形成に制限されず、他のやり方でニューロンの健康にも影響を与えて致死的結果をもたらすことが示されている。このことは、レビー小体形成の加速に加えて、疾患の進行、認知症の発達、及び致死率さえもが、ＧＢＡ１変異を有さないＰＤと比較してＰＤ／ＧＢＡ１の方が積極的かつ頻繁であるという事実によって示唆される。よって、ＧＣアーゼ活性の増強とアルファ－シヌクレインターゲティング免疫療法との組み合わせの結果として、複数の治療効果が期待される。本出願の新規のアルファ－シヌクレインターゲティング抗体フラグメントは、次のいくつかのレベルでアルファ－シヌクレイン病態の発達を妨げるように設計されたものである。凝集の阻害、複数のアルファ－シヌクレイン種（単量体、オリゴマー、原線維）への結合、及び広いエピトープカバレッジを示すことによって、できる限り効率的にアルファ－シヌクレイン病態の発達を妨げ、かつシンク効果を誘導する。（ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及び抗アルファ－シヌクレインターゲティング抗体フラグメントを分泌するクローンＡＲＰＥ－１９細胞株の生成の実現可能性、証明を示す方法ポイント７を参照。）この細胞株は、ＰＤの２つのラット動物モデル（パーキンソンアルファ－シヌクレイン及び６－ＯＨＤＡモデル）における８～１２週間の研究における治療効果を証明する。このために、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋抗アルファ－シヌクレイン療法は、両方のモデルにおいて行動に対する正の影響を有する。考察されるとおり、ＧＣアーゼ刺激性因子のプログラニュリン及びプロサポシンと、抗アルファ－シヌクレイン免疫療法とは、ＰＤ及びＬＢＤ病理学的カスケードの異なるレベルにおいて神経保護を媒介する。これらの活性に加えて、すでに損傷したニューロンの機能を回復させることが求められる。神経再生活性を治療的に媒介することは、前述の神経保護治療薬を補完することによって、できる限り臨床的に有意義な治療法を達成するだろう。ＧＤＮＦは、動物モデル及び一部の患者において神経再生活性を媒介することが示されている分泌因子である。請求される本発明の一実施形態は、複数の神経保護活性と神経再生活性とを全て単一の治療法において組み合わせたものからなる独自の治療法に向けられたものである。図１～１６に示されるデータによって示されるとおり、処置の２～１２週間後のパーキンソン病の６－ＯＨＤＡラットモデルの行動改善を、次のＥＣＢ療法によって観察した：ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋抗アルファ－シヌクレイン、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＧＤＮＦ、及びＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ＋ＧＤＮＦ。よってこのデータは、リソソームシグナル伝達及び神経修復の両方を標的とするいくつかの治療因子を同時発現するＡＲＰＥ細胞株に基づく有効なＥＣＢ療法を生成可能であることを証明する。加えて、パーキンソン病／シヌクレイン病のラットモデルであるヒトアルファ－シヌクレイン過剰発現モデルにおけるＥＣＢ－ＰＧＲＮ、ＥＣＢ－ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋抗アルファ－シヌクレインの組み合わせの治療活性（行動改善）も示され、パーキンソン病及びその他のシヌクレイン病に対するこれら５つの異なる治療法に対する概念の前臨床的証明が提供され、これは図１～１６に示されるデータによって支持される。
【0027】
ＧＲＮ関連の前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、分泌因子プログラニュリンのハプロ不全によって引き起こされ、プログラニュリンはシグナル伝達を、細胞外で異なる細胞表面受容体を介して媒介することと、細胞内のリソソームのレベルで媒介することとの両方を行い、それはリソソームで例えばカテプシンＤ、ＰＳＡＰ、及びＧＣアーゼなどの複数の因子を調節する。ＰＧＲＮシグナル伝達を回復させることは、ＧＲＮ関連ＦＴＤの主要な治療目標である。ＦＴＤ／ＧＲＮにおけるＰＧＲＮの欠損には、ニューロンＰＳＡＰレベルの減少及びＧＣアーゼ活性の低下が付随する。ＦＴＤ／ＧＲＮにおいて細胞内ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体のレベルがどの程度まで影響されるか、又はこの疾患が遊離ＰＳＡＰ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の細胞外レベルにどの程度（ｅｘｔｅｎｄ）まで影響するかは未知である。図１～１６は、ＰＧＲＮがヒト血漿及びＣＳＦにおいてＰＳＡＰとの複合体であり、したがってＦＴＤ／ＧＲＮ並びにＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＧＣアーゼのシグナル伝達に関係するその他の障害の診断に強く関連するバイオマーカーであることを示す。循環ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰの絶対レベルと、循環ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ対遊離循環ＰＧＲＮ及び遊離循環ＰＳＡＰの相対比との両方が、診断、予後、並びに薬物曝露及び処置応答のモニタリングのために重要であると考えられる。ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰがＣＳＦに存在してヒト皮質と直接接触するという発見は重要であり、ＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の両方が、ＦＴＤ／ＧＲＮ病態形成におけるＰＧＲＮハプロ不全による神経変性を受けた、最初に発症した脳領域における内在性の細胞外発現された分子であることを示すものである。組み換えタンパク質のＩＴ若しくはＩＣＶ投与又はＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体のＥＣＢに基づく送達の後に、ＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は両方とも脳内に拡散する。更に図１～１６は、脳室内投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ混合物が脳内で神経突起と共局在することを示す。まとめると、図１～１６に示されるデータは、ＩＴ及びＩＣＶ投与されたＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体がＣＳＦ区画から脳及び標的ニューロンに効率的に拡散し、細胞内グラニュリン、プロサポシン、及びサポシンＣレベル、並びにＧＣアーゼ活性をレスキューすることを最終的に示す。このデータは、疾患におけるＰＧＲＮ及びＰＳＡＰレベル並びにシグナル伝達の刺激及び／又は回復を目的とする治療法に対する付随バイオマーカーとしてのＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体に特異的な特異的アッセイが必要であることを支持する。
【0028】
ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は神経栄養活性を媒介する。図１～１６は、げっ歯類の一次皮質ニューロンの神経突起伸長の刺激を証明する。ＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの両方が神経栄養因子であることが示されている。図１～１６に示されるデータは、ＦＴＤ／ＧＲＮ、ＦＴＤ／ＴＤＰすなわち一般的なＴＤＰ病態を有するＦＴＤ（ＧＲＮハプロ不全である必要はない）、ＬＢＤ／ＧＢＡ１、ＰＤ及びＰＤ／ＧＢＡ１、並びにＡＬＳにおける神経保護治療薬としてＰＧＲＮ／ＰＳＡＰを用いることを示唆及び支持する。
【0029】
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ：Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）は、ＰＧＲＮの欠損（１００％欠損）によって引き起こされるリソソーム蓄積障害である。細胞外投与されたＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は、内部移行されてリソソームに局在する。加えて、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰからの条件培地は同じ活性をもたらすため、ＮＣＬにおけるリソソームＰＧＲＮシグナル伝達をレスキューするために、ＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰのＥＣＢに基づく投与が用いられる。
【0030】
ＡＬＳ、ＦＴＤ、及びＡＤにおいて、ＴＤＰ病態は最も一般的なタンパク質症である。ＦＴＤ／ＧＲＮにおけるＰＧＲＮ欠損は、ＴＤＰ病態に関連する神経変性をもたらす。ＡＬＳ／ＴＤＰのマウスモデルとＰＧＲＮを過剰発現するマウスとを交配すると、結果として重症度の低いＡＬＳ様の表現型が得られたため、ＰＧＲＮはＴＤＰ関連ＡＬＳに対する治療薬となると考えられる。この先行技術に基づき、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰは、ＡＬＳ／ＴＤＰ並びにＦＴＤ／ＴＤＰ及びＡＤに対する治療薬として用いてもよい。特に、ＡＬＳ病態形成（並びにＦＴＤ、ＬＢＤ、及びＡＤ）における主要な領域である脊柱管及び皮質を標的とするＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰのＩＴ投与は、有効な処置として非常に期待できる。図１～１６に示されるデータは、ＩＴ投与されたＰＧＲＮと、ＩＣＶ投与されたＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体とが脳内に拡散して、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＬＢＤ、及びＡＤに対する主要な関連区域を標的とすることを示す。ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰのいずれかのＣＳＦから脳への拡散は、これまで誰にも実証されていない。
［実施例］
［実施例］
【実施例1】
【0031】
《ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、ＶＡ）をＦ１２／ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）：栄養混合物（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ）Ｆ－１２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ｃａｔ ｎｏ．３１３３１－０２８、１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ：ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を補充）（以後「完全培地」と呼ぶ）中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を無血清培地で置換し、ニワトリベータアクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサーの下で共通のヒトプログラニュリン遺伝子を構成的に発現するプラスミドで、細胞をトランスフェクトした。この組み換え発現コンストラクトはネオマイシン選択遺伝子も含んでおり、かつスリーピングビューティー転位因子に隣接していた。スリーピングビューティートランスポザーゼの一過性発現を用いて、ＰＧＲＮ ｃＤＮＡトランスジーンコンストラクトのコピーを安定に組み込んだ（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従ってプラスミドを導入した。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に播種して、ネオマイシン選択マーカーを発現するクローンを選択した。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた。異なるクローンの細胞株について、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）抗ヒトＰＧＲＮ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＭＮ）を用いて分泌ＰＧＲＮを分析した。更に、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞のＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の分泌も分析した（ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体モニタリングの方法についてはセクション１２及び１３を参照）。前述のＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体アッセイ（図１）と、条件培地の架橋に続くＰＧＲＮ及びＰＳＡＰに向けられた抗体を用いたウエスタンブロット分析（図２）とによって決定されたとおり、封入されたＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞は、ＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の両方を分泌する。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮクローン＃５６を選択して、インビトロで更なる特徴付けを行い、かつインビトロ及びインビボでの治療法の評価のために封入した。
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、ＶＡ）をＦ１２／ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）：栄養混合物（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ）Ｆ－１２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ｃａｔ ｎｏ．３１３３１－０２８、１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ：ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を補充）（以後「完全培地」と呼ぶ）中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を無血清培地で置換し、ニワトリベータアクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサーの下で共通のヒトプログラニュリン遺伝子を構成的に発現するプラスミドで、細胞をトランスフェクトした。この組み換え発現コンストラクトはネオマイシン選択遺伝子も含んでおり、かつスリーピングビューティー転位因子に隣接していた。スリーピングビューティートランスポザーゼの一過性発現を用いて、ＰＧＲＮ ｃＤＮＡトランスジーンコンストラクトのコピーを安定に組み込んだ（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従ってプラスミドを導入した。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に播種して、ネオマイシン選択マーカーを発現するクローンを選択した。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた。異なるクローンの細胞株について、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）抗ヒトＰＧＲＮ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、ＭＮ）を用いて分泌ＰＧＲＮを分析した。更に、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞のＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の分泌も分析した（ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体モニタリングの方法についてはセクション１２及び１３を参照）。前述のＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体アッセイ（図１）と、条件培地の架橋に続くＰＧＲＮ及びＰＳＡＰに向けられた抗体を用いたウエスタンブロット分析（図２）とによって決定されたとおり、封入されたＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞は、ＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の両方を分泌する。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮクローン＃５６を選択して、インビトロで更なる特徴付けを行い、かつインビトロ及びインビボでの治療法の評価のために封入した。
【実施例2】
【0032】
《ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、ヒトＰＳＡＰ ｃＤＮＡをコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた。異なるクローンのＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞株について、セクション１１に記載されるＥＬＩＳＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いて分泌ＰＳＡＰを分析した。封入されたＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞はＰＳＡＰを分泌するのに対し、ＰＧＲＮもＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体も検出できなかった（図３）。
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、ヒトＰＳＡＰ ｃＤＮＡをコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた。異なるクローンのＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞株について、セクション１１に記載されるＥＬＩＳＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いて分泌ＰＳＡＰを分析した。封入されたＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞はＰＳＡＰを分泌するのに対し、ＰＧＲＮもＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体も検出できなかった（図３）。
【実施例3】
【0033】
《ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９－ＰＧＲＮ＃５６細胞を完全培地中で７０％の集密度まで生育させ、次いで、ＰＳＡＰをコードするプラスミドのＧ４１８選択遺伝子をハイグロマイシン選択遺伝子で置換したこと以外はセクション２に記載されるとおりに、ＰＳＡＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした。培地にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）（８００μｇ／ｍｌ）及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ）（５００μｇ／ｍｌ）の両方が含まれることを除いては上記のとおりに、クローン細胞株の生成を達成した。ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）によって、ＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの両方を発現するクローン細胞株を識別した。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞からの条件培地の分子ふるいクロマトグラフィーに由来する異なる画分の分析によって評価されるとおり、封入されたＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞は、ほとんどＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を分泌する（図４）。
ＡＲＰＥ－１９－ＰＧＲＮ＃５６細胞を完全培地中で７０％の集密度まで生育させ、次いで、ＰＳＡＰをコードするプラスミドのＧ４１８選択遺伝子をハイグロマイシン選択遺伝子で置換したこと以外はセクション２に記載されるとおりに、ＰＳＡＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした。培地にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）（８００μｇ／ｍｌ）及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ）（５００μｇ／ｍｌ）の両方が含まれることを除いては上記のとおりに、クローン細胞株の生成を達成した。ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）によって、ＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの両方を発現するクローン細胞株を識別した。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞からの条件培地の分子ふるいクロマトグラフィーに由来する異なる画分の分析によって評価されるとおり、封入されたＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞は、ほとんどＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を分泌する（図４）。
【実施例4】
【0034】
《アルファ－シヌクレインターゲティングＡＲＰＥ－ｓｃＦｖ８１細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のコンストラクト（シグナルペプチド－ｓｃＦｖ８１－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ）３）：
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＬＰＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＹＧＧＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＴＹＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）
をコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた（図５）。
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のコンストラクト（シグナルペプチド－ｓｃＦｖ８１－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ）３）：
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＬＰＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＹＧＧＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＴＹＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）
をコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた（図５）。
【実施例5】
【0035】
《アルファ－シヌクレインターゲティングＡＲＰＥ－ｓｃＦｖ４９細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のコンストラクト（シグナルペプチド－ｓｃＦｖ４９－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ）４）：
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＬＰＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＳＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＩＴＧＹＬＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３）
をコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた。ｓｃＦｖ４９の発現及び分泌を観察した（図５）。
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のコンストラクト（シグナルペプチド－ｓｃＦｖ４９－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ）４）：
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＬＰＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＳＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＩＴＧＹＬＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３）
をコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた。ｓｃＦｖ４９の発現及び分泌を観察した（図５）。
【実施例6】
【0036】
《アルファ－シヌクレインターゲティングＡＲＰＥ－ｓｃＦｖ１１３細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のコンストラクト（シグナルペプチド－ｓｃＦｖ１１３－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ）５）：
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＬＰＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＧＳＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＳＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＹＷＨＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＡＧＬＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７）
をコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた（図５）。
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のコンストラクト（シグナルペプチド－ｓｃＦｖ１１３－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ）５）：
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＬＰＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＧＳＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＳＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＹＷＨＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＡＧＬＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７）
をコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、８００μｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を補充した完全培地に広げた（図５）。
【実施例7】
【0037】
《ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１細胞株の生成》
クローンＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞を完全培地中で７０％の集密度まで生育させ、次いで、セクション３に記載されるＰＳＡＰをコードするプラスミドと、セクション５に記載されるコンストラクト（シグナルペプチド－ｓｃＦｖ８１－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ）をコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）とでトランスフェクトした。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）（８００μｇ／ｍｌ）及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（５００μｇ／ｍｌ）の存在下でトランスフェクタントを培養することによって、クローン細胞株の生成を達成した。免疫細胞化学分析（ＩＣＣ：ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びｓｃＦｖ８１を発現するクローン細胞株を識別した。ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びｓｃＦｖ８１を発現するクローンＤ５（＃Ｄ５）を更なる分析のために選択した（図５）。
クローンＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞を完全培地中で７０％の集密度まで生育させ、次いで、セクション３に記載されるＰＳＡＰをコードするプラスミドと、セクション５に記載されるコンストラクト（シグナルペプチド－ｓｃＦｖ８１－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ）をコードするプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム）とでトランスフェクトした。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）（８００μｇ／ｍｌ）及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（５００μｇ／ｍｌ）の存在下でトランスフェクタントを培養することによって、クローン細胞株の生成を達成した。免疫細胞化学分析（ＩＣＣ：ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びｓｃＦｖ８１を発現するクローン細胞株を識別した。ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びｓｃＦｖ８１を発現するクローンＤ５（＃Ｄ５）を更なる分析のために選択した（図５）。
【実施例8】
【0038】
《アルファ－シヌクレインターゲティングＡＲＰＥ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ８１細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のペプチド（シグナルペプチド－Ｆｃ－ｓｃＦｖ８１）６）：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＹＧＧＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＴＹＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＫＰＣＩＣＴＧＳＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＱＤＤＰＥＶＨＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＲＰＰＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＬＨＱＤＷＬＮＧＲＴＦＲＣＫＶＴＳＡＡＦＰＳＰＩＥＫＴＩＳＫＰＥＧＲＴＱＶＰＨＶＹＴＭＳＰＴＫＥＥＭＴＱＮＥＶＳＩＴＣＭＶＫＧＦＹＰＰＤＩＹＶＥＷＱＭＮＧＱＰＱＥＮＹＫＮＴＰＰＴＭＤＴＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＮＶＫＫＥＫＷＱＱＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号７）
をコードするｃＤＮＡを有する、セクション３に記載されるプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）選択遺伝子）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地に広げた。
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のペプチド（シグナルペプチド－Ｆｃ－ｓｃＦｖ８１）６）：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＧＳＧＧＹＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＹＧＧＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＴＹＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＫＰＣＩＣＴＧＳＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＱＤＤＰＥＶＨＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＲＰＰＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＬＨＱＤＷＬＮＧＲＴＦＲＣＫＶＴＳＡＡＦＰＳＰＩＥＫＴＩＳＫＰＥＧＲＴＱＶＰＨＶＹＴＭＳＰＴＫＥＥＭＴＱＮＥＶＳＩＴＣＭＶＫＧＦＹＰＰＤＩＹＶＥＷＱＭＮＧＱＰＱＥＮＹＫＮＴＰＰＴＭＤＴＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＮＶＫＫＥＫＷＱＱＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号７）
をコードするｃＤＮＡを有する、セクション３に記載されるプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）選択遺伝子）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地に広げた。
【実施例9】
【0039】
《アルファ－シヌクレインターゲティングＡＲＰＥ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ４９細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のペプチド（シグナルペプチド－Ｆｃ－ｓｃＦｖ４９）７）：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＳＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＩＴＧＹＬＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＫＰＣＩＣＴＧＳＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＱＤＤＰＥＶＨＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＲＰＰＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＬＨＱＤＷＬＮＧＲＴＦＲＣＫＶＴＳＡＡＦＰＳＰＩＥＫＴＩＳＫＰＥＧＲＴＱＶＰＨＶＹＴＭＳＰＴＫＥＥＭＴＱＮＥＶＳＩＴＣＭＶＫＧＦＹＰＰＤＩＹＶＥＷＱＭＮＧＱＰＱＥＮＹＫＮＴＰＰＴＭＤＴＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＮＶＫＫＥＫＷＱＱＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号１１）
をコードするｃＤＮＡを有する、セクション３に記載されるプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）選択遺伝子）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地に広げた。Ｆｃ－ｓｃＦｖ４９の発現及び分泌を観察した（図５）。
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のペプチド（シグナルペプチド－Ｆｃ－ｓｃＦｖ４９）７）：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＳＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＩＴＧＹＬＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＫＰＣＩＣＴＧＳＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＱＤＤＰＥＶＨＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＲＰＰＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＬＨＱＤＷＬＮＧＲＴＦＲＣＫＶＴＳＡＡＦＰＳＰＩＥＫＴＩＳＫＰＥＧＲＴＱＶＰＨＶＹＴＭＳＰＴＫＥＥＭＴＱＮＥＶＳＩＴＣＭＶＫＧＦＹＰＰＤＩＹＶＥＷＱＭＮＧＱＰＱＥＮＹＫＮＴＰＰＴＭＤＴＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＮＶＫＫＥＫＷＱＱＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号１１）
をコードするｃＤＮＡを有する、セクション３に記載されるプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）選択遺伝子）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地に広げた。Ｆｃ－ｓｃＦｖ４９の発現及び分泌を観察した（図５）。
【実施例10】
【0040】
《アルファ－シヌクレインターゲティングＡＲＰＥ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ１１３細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のペプチド（シグナルペプチド－Ｆｃ－ｓｃＦｖ１１３）８）：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＧＳＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＳＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＹＷＨＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＡＧＬＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＫＰＣＩＣＴＧＳＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＱＤＤＰＥＶＨＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＲＰＰＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＬＨＱＤＷＬＮＧＲＴＦＲＣＫＶＴＳＡＡＦＰＳＰＩＥＫＴＩＳＫＰＥＧＲＴＱＶＰＨＶＹＴＭＳＰＴＫＥＥＭＴＱＮＥＶＳＩＴＣＭＶＫＧＦＹＰＰＤＩＹＶＥＷＱＭＮＧＱＰＱＥＮＹＫＮＴＰＰＴＭＤＴＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＮＶＫＫＥＫＷＱＱＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号９）
をコードするｃＤＮＡを有する、セクション３に記載されるプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）選択遺伝子）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地に広げた。
ＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、マナッサス、ＶＡ）を完全培地中で７０％の集密度まで生育させた。トランスフェクションの当日に、細胞培地を捨てて無血清培地で置換した。Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｆｕｇｅｎｅ ６（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用い、製造者の指示に従って、次のペプチド（シグナルペプチド－Ｆｃ－ｓｃＦｖ１１３）８）：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＹＧＳＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＳＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＹＷＨＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＡＧＬＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＫＰＣＩＣＴＧＳＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＱＤＤＰＥＶＨＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＲＰＰＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＬＨＱＤＷＬＮＧＲＴＦＲＣＫＶＴＳＡＡＦＰＳＰＩＥＫＴＩＳＫＰＥＧＲＴＱＶＰＨＶＹＴＭＳＰＴＫＥＥＭＴＱＮＥＶＳＩＴＣＭＶＫＧＦＹＰＰＤＩＹＶＥＷＱＭＮＧＱＰＱＥＮＹＫＮＴＰＰＴＭＤＴＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＮＶＫＫＥＫＷＱＱＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号９）
をコードするｃＤＮＡを有する、セクション３に記載されるプラスミド（スリーピングビューティートランスポゾンシステム、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）選択遺伝子）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を１：１０に分割し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地の存在下で１０ｃｍ２の組織培養皿に蒔いた。１４日後、個々のコロニーを収集し、５００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充した完全培地に広げた。
【実施例11】
【0041】
《ＡＲＰＥ－ＧＤＮＦ＋ＰＳＡＰ細胞株の生成》
ＡＲＰＥ－１９－ＧＤＮＦ細胞を完全培地中で７０％の集密度まで生育させ、次いで、ＰＳＡＰをコードするプラスミドのＧ４１８選択遺伝子をハイグロマイシン選択遺伝子で置換したこと以外はセクション２に記載されるとおりに、ＰＳＡＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした。培地にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）（８００μｇ／ｍｌ）及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ）（５００μｇ／ｍｌ）の両方が含まれることを除いては前に考察したとおりに、クローン細胞株の生成を達成した。図１１に示されるとおり、ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）によって、ＧＤＮＦ及びＰＳＡＰの両方を発現するクローン細胞株を識別した。
ＡＲＰＥ－１９－ＧＤＮＦ細胞を完全培地中で７０％の集密度まで生育させ、次いで、ＰＳＡＰをコードするプラスミドのＧ４１８選択遺伝子をハイグロマイシン選択遺伝子で置換したこと以外はセクション２に記載されるとおりに、ＰＳＡＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした。培地にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）（８００μｇ／ｍｌ）及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ）（５００μｇ／ｍｌ）の両方が含まれることを除いては前に考察したとおりに、クローン細胞株の生成を達成した。図１１に示されるとおり、ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）によって、ＧＤＮＦ及びＰＳＡＰの両方を発現するクローン細胞株を識別した。
【実施例12】
【0042】
《ヒトＰＳＡＰのＥＬＩＳＡアッセイ》
捕捉抗体（マウスｍＡｂ Ａｂｎｏｖａ（登録商標）ｃａｔ ｎｏ．Ｈ００００５６６０－Ｍ０１、０．４３ｍｇ／ｍｌ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北、ＴＷ））をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、サウスローガン（Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ）、ＵＴ）で１：５００に希釈し、５０μＩ／ウェルをＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（ｃａｔ ｎｏ．４４２４０４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））に加えた。プレートを室温（ＲＴ：ｒｏｏｍ ｔｅｍｐ）にて一晩（ＯＮ：ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）インキュベートした。次いで反応混合物を捨てた後にウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄してから、各ウェルに１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡ（２％））（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー（Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ）、ＭＡ）を加えた。ＲＴにて２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で２回洗浄してから、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／１％ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ：Ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）（Ｍｅ３ＳｉＮＣ（ＯＳｉＭｅ３）Ｍｅ）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈したサンプルを加えた。結合反応物をＲＴにて２時間置き、次いで除去した後にＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄した。次いで、５０μｌ／ウェルの検出抗体（Ｒｂ抗ＰＳＡＰ、ＨＰＡ００４４２６、０．１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で１：３００に希釈）を加え、反応物をＲＴにて２時間置いた。更に３回洗浄後、５０μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）コンジュゲート抗Ｒｂ ＩｇＧ抗体を加え、プレートをＲＴにて１時間インキュベートした。最後にプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄し、１ Ｓｔｅｐ（商標）ＴＭＢウルトラ（Ｕｌｔｒａ）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いた後に１体積の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させて、ＨＲＰ活性をモニタリングした。その後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）マイクロプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用いて４５０ｎｍの吸光度をモニタリングした。標準物質としてヒト組み換えＰＳＡＰを用いた（ＡＢＣＡＭ（登録商標）、ｃａｔ ｎｒ：２０３５３４（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＵＫ））。
捕捉抗体（マウスｍＡｂ Ａｂｎｏｖａ（登録商標）ｃａｔ ｎｏ．Ｈ００００５６６０－Ｍ０１、０．４３ｍｇ／ｍｌ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北、ＴＷ））をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、サウスローガン（Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ）、ＵＴ）で１：５００に希釈し、５０μＩ／ウェルをＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（ｃａｔ ｎｏ．４４２４０４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））に加えた。プレートを室温（ＲＴ：ｒｏｏｍ ｔｅｍｐ）にて一晩（ＯＮ：ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）インキュベートした。次いで反応混合物を捨てた後にウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄してから、各ウェルに１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡ（２％））（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー（Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ）、ＭＡ）を加えた。ＲＴにて２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で２回洗浄してから、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／１％ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ：Ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）（Ｍｅ３ＳｉＮＣ（ＯＳｉＭｅ３）Ｍｅ）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈したサンプルを加えた。結合反応物をＲＴにて２時間置き、次いで除去した後にＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄した。次いで、５０μｌ／ウェルの検出抗体（Ｒｂ抗ＰＳＡＰ、ＨＰＡ００４４２６、０．１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で１：３００に希釈）を加え、反応物をＲＴにて２時間置いた。更に３回洗浄後、５０μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）コンジュゲート抗Ｒｂ ＩｇＧ抗体を加え、プレートをＲＴにて１時間インキュベートした。最後にプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄し、１ Ｓｔｅｐ（商標）ＴＭＢウルトラ（Ｕｌｔｒａ）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いた後に１体積の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させて、ＨＲＰ活性をモニタリングした。その後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）マイクロプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）社、マディソン、ＷＩ）を用いて４５０ｎｍの吸光度をモニタリングした。標準物質としてヒト組み換えＰＳＡＰを用いた（ＡＢＣＡＭ（登録商標）、ｃａｔ ｎｒ：２０３５３４（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＵＫ））。
【実施例13】
【0043】
《ヒトＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体アッセイ（図６Ａに示される）》
捕捉抗体の抗ＰＧＲＮ抗体（ｈＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ））を製造者の指示に従って希釈し、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（ｃａｔ ｎｏ．４４２４０４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））に５０μｌ／ウェルを加えた。反応物を室温（ＲＴ）にてインキュベートした。次いで反応物を捨てて、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄した。その後、約１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡ（２％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ））を加え、プレートをＲＴにて２時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で２回洗浄してから、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈したサンプルを加えた。ＲＴにて２時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄してから、ＰＳＡＰを認識する抗体（抗ＰＳＡＰ、ＨＰＡ００４４２６、０．１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で１：３００に希釈）を加えた。反応物をＲＴにて２時間インキュベートした。３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗Ｒｂ ＩｇＧ抗体を加えて、反応物をＲＴにて１時間インキュベートした。最後にプレートを３回洗浄し、１ Ｓｔｅｐ（商標）ＴＭＢウルトラ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いた後に１体積の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させて、ＨＲＰ活性をモニタリングした。最後に４５０ｎｍにて吸光度を読取った。標準物質として、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ細胞からの条件培地に由来する精製ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を用いた。ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈した。図６によって証明されるとおり、組み換えＰＧＲＮ及びＰＳＡＰに由来するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体のモニタリングはインビトロで集合した。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞並びにデバイスから分泌され、条件細胞培養培地から精製されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は、このＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体ＥＬＩＳＡ（全てのＣＳＦサンプルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で１：１に希釈した）によってヒト血漿及びＣＳＦにおいて検出可能である（図６）。
捕捉抗体の抗ＰＧＲＮ抗体（ｈＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ））を製造者の指示に従って希釈し、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（ｃａｔ ｎｏ．４４２４０４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））に５０μｌ／ウェルを加えた。反応物を室温（ＲＴ）にてインキュベートした。次いで反応物を捨てて、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄した。その後、約１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡ（２％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ））を加え、プレートをＲＴにて２時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で２回洗浄してから、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈したサンプルを加えた。ＲＴにて２時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄してから、ＰＳＡＰを認識する抗体（抗ＰＳＡＰ、ＨＰＡ００４４２６、０．１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で１：３００に希釈）を加えた。反応物をＲＴにて２時間インキュベートした。３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗Ｒｂ ＩｇＧ抗体を加えて、反応物をＲＴにて１時間インキュベートした。最後にプレートを３回洗浄し、１ Ｓｔｅｐ（商標）ＴＭＢウルトラ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いた後に１体積の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させて、ＨＲＰ活性をモニタリングした。最後に４５０ｎｍにて吸光度を読取った。標準物質として、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ細胞からの条件培地に由来する精製ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を用いた。ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈した。図６によって証明されるとおり、組み換えＰＧＲＮ及びＰＳＡＰに由来するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体のモニタリングはインビトロで集合した。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞並びにデバイスから分泌され、条件細胞培養培地から精製されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は、このＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体ＥＬＩＳＡ（全てのＣＳＦサンプルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で１：１に希釈した）によってヒト血漿及びＣＳＦにおいて検出可能である（図６）。
【実施例14】
【0044】
《ヒトＰＳＡＰ／ＰＧＲＮ複合体アッセイ（図６Ａに示される）》
捕捉抗体のマウスｍＡｂ抗ＰＳＡＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）ｃａｔ ｎｏ．Ｈ００００５６６０－Ｍ０１、０．４３ｍｇ／ｍｌ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北、ＴＷ））、をＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）で１：５００に希釈し、５０μｌ／ウェルのＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（ｃａｔ ｎｏ．４４２４０４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））を加えた。プレートを室温（ＲＴ）にてインキュベートした後、反応混合物を捨てて、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄した。次いで、１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡ（２％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ））を加え、プレートを室温にて２時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で２回洗浄してから、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈したサンプルを加えた。反応物をＲＴにて２時間置いて除去し、その後ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄した。次いで、５０μｌ／ウェルの検出抗体（ビオチン化抗ＰＧＲＮ抗体、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ｈＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ）、製造者の指示に従ってＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈）を加え、反応物をＲＴにて２時間置いた。更に３回洗浄後、５０μｌ／ウェルのＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を加え、プレートをＲＴにて３０分間インキュベートした。最後にプレートを３回洗浄し、１ Ｓｔｅｐ（商標）ＴＭＢウルトラ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いた後に１体積の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させて、ＨＲＰ活性をモニタリングした。最後に４５０ｎｍにて吸光度を読取った。図６は、インビトロで集合した組み換えＰＧＲＮ及びＰＳＡＰに由来するＰＳＡＰ／ＰＧＲＮ複合体のモニタリングを示す。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞から分泌されたＰＳＡＰ／ＰＧＲＮ複合体も、このＰＳＡＰ／ＰＧＲＮ複合体ＥＬＩＳＡによって検出可能である（図１）。分析物として前述の細胞株からの条件培地を用いて、架橋／ウエスタンブロット実験の組み合わせによって、ＡＲＰＥ、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ、及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１細胞からのプログラニュリン／プロサポシン複合体の放出を更に分析した（図２）。コンフルエントな細胞培養物をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ＣＡ）中で９６時間条件付けした。次いでＢＳ３架橋剤（２５ｍＭストック、Ｈ２Ｏ中）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を最終濃度１ｍＭとなるように加え、反応物を室温（ＲＴ）にて１時間保った。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（ｐＨ８．０）部分を添加（５％ｖ／ｖ）して架橋反応を停止させた。反応物及び対照（架橋剤を添加していない条件培地）のアリコートを４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）に流した後、ｉＢｌｏｔ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）、ＭＡ）に転写した。５％のミルク（ｗ／ｖ）を補充したＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％、ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）に膜を浸し、ＲＴにて１時間置いた。その後、膜をヤギ抗ＰＧＲＮ抗体（ＡＦ２４２０ １：５００）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ））及びウサギ抗ＰＳＡＰ抗体（ＨＰＡ００４４２６ １：２００、ＨＰＡ）に順に曝露した。それぞれＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ及び抗Ｒｂ抗体によっていずれかの抗体の標識を検出し、発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＥＣＬウエスタンサイエンティフィックブロッティング基質（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）又はＬｕｍｉｎａｔａ（商標）フォルテ（Ｆｏｒｔｅ）ＥＬＩＳＡ ＨＲＰ基質（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ））によってＨＲＰ活性を検出した。このデータは、全ての細胞株がＰＳＡＰを発現するのに対し、ＰＧＲＮはＰＧＲＮを安定に発現する細胞においてのみ検出できたことを支持する。更に、抗ＰＧＲＮ及び抗ＰＳＡＰ抗体の両方によって標識された、ゲルの同じレベルに移動する高分子量のバンドは、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１細胞のみにおいて検出される。したがって、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は、ＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの両方を安定に発現するＡＲＰＥ細胞によって形成及び分泌される。
捕捉抗体のマウスｍＡｂ抗ＰＳＡＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）ｃａｔ ｎｏ．Ｈ００００５６６０－Ｍ０１、０．４３ｍｇ／ｍｌ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北、ＴＷ））、をＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）で１：５００に希釈し、５０μｌ／ウェルのＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（ｃａｔ ｎｏ．４４２４０４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））を加えた。プレートを室温（ＲＴ）にてインキュベートした後、反応混合物を捨てて、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄した。次いで、１５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡ（２％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ））を加え、プレートを室温にて２時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で２回洗浄してから、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈したサンプルを加えた。反応物をＲＴにて２時間置いて除去し、その後ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）で３回洗浄した。次いで、５０μｌ／ウェルの検出抗体（ビオチン化抗ＰＧＲＮ抗体、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ｈＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ）、製造者の指示に従ってＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）／ＢＳＡ（１％）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）で希釈）を加え、反応物をＲＴにて２時間置いた。更に３回洗浄後、５０μｌ／ウェルのＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を加え、プレートをＲＴにて３０分間インキュベートした。最後にプレートを３回洗浄し、１ Ｓｔｅｐ（商標）ＴＭＢウルトラ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いた後に１体積の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させて、ＨＲＰ活性をモニタリングした。最後に４５０ｎｍにて吸光度を読取った。図６は、インビトロで集合した組み換えＰＧＲＮ及びＰＳＡＰに由来するＰＳＡＰ／ＰＧＲＮ複合体のモニタリングを示す。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞から分泌されたＰＳＡＰ／ＰＧＲＮ複合体も、このＰＳＡＰ／ＰＧＲＮ複合体ＥＬＩＳＡによって検出可能である（図１）。分析物として前述の細胞株からの条件培地を用いて、架橋／ウエスタンブロット実験の組み合わせによって、ＡＲＰＥ、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ、及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１細胞からのプログラニュリン／プロサポシン複合体の放出を更に分析した（図２）。コンフルエントな細胞培養物をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ＣＡ）中で９６時間条件付けした。次いでＢＳ３架橋剤（２５ｍＭストック、Ｈ２Ｏ中）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を最終濃度１ｍＭとなるように加え、反応物を室温（ＲＴ）にて１時間保った。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（ｐＨ８．０）部分を添加（５％ｖ／ｖ）して架橋反応を停止させた。反応物及び対照（架橋剤を添加していない条件培地）のアリコートを４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）に流した後、ｉＢｌｏｔ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）、ＭＡ）に転写した。５％のミルク（ｗ／ｖ）を補充したＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％、ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）に膜を浸し、ＲＴにて１時間置いた。その後、膜をヤギ抗ＰＧＲＮ抗体（ＡＦ２４２０ １：５００）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ））及びウサギ抗ＰＳＡＰ抗体（ＨＰＡ００４４２６ １：２００、ＨＰＡ）に順に曝露した。それぞれＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ及び抗Ｒｂ抗体によっていずれかの抗体の標識を検出し、発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＥＣＬウエスタンサイエンティフィックブロッティング基質（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）又はＬｕｍｉｎａｔａ（商標）フォルテ（Ｆｏｒｔｅ）ＥＬＩＳＡ ＨＲＰ基質（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ））によってＨＲＰ活性を検出した。このデータは、全ての細胞株がＰＳＡＰを発現するのに対し、ＰＧＲＮはＰＧＲＮを安定に発現する細胞においてのみ検出できたことを支持する。更に、抗ＰＧＲＮ及び抗ＰＳＡＰ抗体の両方によって標識された、ゲルの同じレベルに移動する高分子量のバンドは、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１細胞のみにおいて検出される。したがって、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は、ＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの両方を安定に発現するＡＲＰＥ細胞によって形成及び分泌される。
【実施例15】
【0045】
《封入されたＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ、及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１過剰発現細胞の分泌治療因子》
前述の細胞株を前に記載した方法に従って封入した。ここからは、封入された細胞株をそれぞれＰＧＲＮ－、ＰＳＡＰ－、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰデバイスと表す。全てのデバイスをＧｉｂｃｏ ＨＥ－ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２にて２週間から５ヵ月の範囲の長期間にわたり培養した。条件培地のアリコートのＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ分泌を分析した。ＰＧＲＮ－デバイスはＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の両方を分泌し、ＰＳＡＰ－デバイスはＰＳＡＰのみを分泌し、ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰデバイスはＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体のみを分泌する（図３）。
前述の細胞株を前に記載した方法に従って封入した。ここからは、封入された細胞株をそれぞれＰＧＲＮ－、ＰＳＡＰ－、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰデバイスと表す。全てのデバイスをＧｉｂｃｏ ＨＥ－ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２にて２週間から５ヵ月の範囲の長期間にわたり培養した。条件培地のアリコートのＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ分泌を分析した。ＰＧＲＮ－デバイスはＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の両方を分泌し、ＰＳＡＰ－デバイスはＰＳＡＰのみを分泌し、ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰデバイスはＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体のみを分泌する（図３）。
【実施例16】
【0046】
《ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ、及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞株からの分泌因子の活性；皮質ニューロンのターゲティング》
２２５ｃｍ２の組織培養皿内の完全培地中で細胞を集密度まで生育させた。次いで細胞培地をＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ）で置換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間培養した。その後培地を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）－４遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）カットオフ３０ｋＤａを用いて濃縮した。マウス一次皮質ニューロンを胎生期１７日から調製し、３７℃、５％ＣＯ２にて１２～１４日間培養し（Ｄｉｖ１２～１４）、最終［ＰＧＲＮ］、［ＰＳＡＰ］、又は［ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ］が１μｇ／ｍｌとなるように濃縮条件培地に曝露した。反応物を一晩置き、その後細胞を固定して、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＬＡＭＰ１を含む異なるリソソームマーカーに対する特異的な抗体を用いた免疫細胞化学分析に供した。図７はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体による皮質ニューロンのターゲティングを示し、これは皮質ニューロンに対する非常に強力な相互作用を示す。
２２５ｃｍ２の組織培養皿内の完全培地中で細胞を集密度まで生育させた。次いで細胞培地をＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ）で置換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間培養した。その後培地を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）－４遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）カットオフ３０ｋＤａを用いて濃縮した。マウス一次皮質ニューロンを胎生期１７日から調製し、３７℃、５％ＣＯ２にて１２～１４日間培養し（Ｄｉｖ１２～１４）、最終［ＰＧＲＮ］、［ＰＳＡＰ］、又は［ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ］が１μｇ／ｍｌとなるように濃縮条件培地に曝露した。反応物を一晩置き、その後細胞を固定して、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＬＡＭＰ１を含む異なるリソソームマーカーに対する特異的な抗体を用いた免疫細胞化学分析に供した。図７はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体による皮質ニューロンのターゲティングを示し、これは皮質ニューロンに対する非常に強力な相互作用を示す。
【実施例17】
【0047】
《ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ、ＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ、及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ細胞株からの分泌因子の活性；ＧＢＡ１活性の刺激》
２２５ｃｍ２の組織培養皿内の完全培地中で異なるＡＲＰＥ－細胞株を集密度まで生育させた。次いで細胞培地をＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ）で置換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて更に７２時間培養した。次いで条件培地を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ－４遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）カットオフ３０ｋＤａを用いて濃縮した。その後、一次マウス皮質ニューロンのＤｉｖ１２～１４を、１μｇ／ｍｌの最終［ＰＧＲＮ］及び［ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ］にて濃縮条件培地に曝露した。反応物を３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間置き、次いでＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（ｃａｔ ｎｏ．４４２４０４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））から培地を捨てることによって反応を終了させた後に、活性緩衝剤ＮａＣｉｔｒａｔｅ（商標）（（クエン酸三ナトリウム二水和物）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（ｐＨ５．４））、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（０．２５％（ｖ／ｖ））、タウロコール酸（２－｛［（３α，５β，７α，１２α）－３，７，１２－トリヒドロキシ－２４－オキソコラン－２４－イル］アミノ｝エタンスルホン酸）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（０．２５％（ｗ／ｖ））、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（２，２′，２″，２″′－（エタン－１，２－ジイルジニトリロ）四酢酸（２，２′，２″，２″′－（Ｅｔｈａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌｄｉｎｉｔｒｉｌｏ）ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ））（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を加え、その後細胞を効率的に溶解させるためにプレートを直ちに－８５℃中に置いた。ＧＢＡ１活性をモニタリングするために、最初にライセートを融解し、氷上で２０分間インキュベートしてから、４℃で２００００ＲＣＦにて２０分間遠心分離して細胞片を除去した。上清を収集して２つのアリコートに分割し、それぞれＧＢＡ１活性の検査と、タンパク質濃度の決定とを行った。ＧＢＡ１活性を検査するために、ライセートを１％ＢＳＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）、１ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルｂ－グルコピラノシド（（４－ＭＵ：４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｂ－ｇｌｕｃｏｐｈｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（＃Ｍ３６３３）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））と混合して５０μｌの体積にし、次いで３７℃にて４０分間インキュベートした。１体積の１Ｍグリシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）、ｐＨ１２．５によって反応を停止し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｄ５シリーズマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）、サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）、ＣＡ）を用いて蛍光をモニタリングした（ｅｘ＝３５５ｎｍ、ｅｍ＝４６０ｎｍ）。図８は、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ細胞並びに組み換えＰＳＡＰからの条件培地による処理の結果、分化したマウス一次皮質ニューロンにおけるＧＢＡ１活性が増加することを示す。
２２５ｃｍ２の組織培養皿内の完全培地中で異なるＡＲＰＥ－細胞株を集密度まで生育させた。次いで細胞培地をＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ）で置換し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて更に７２時間培養した。次いで条件培地を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ－４遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）カットオフ３０ｋＤａを用いて濃縮した。その後、一次マウス皮質ニューロンのＤｉｖ１２～１４を、１μｇ／ｍｌの最終［ＰＧＲＮ］及び［ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ］にて濃縮条件培地に曝露した。反応物を３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間置き、次いでＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレート（ｃａｔ ｎｏ．４４２４０４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））から培地を捨てることによって反応を終了させた後に、活性緩衝剤ＮａＣｉｔｒａｔｅ（商標）（（クエン酸三ナトリウム二水和物）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（ｐＨ５．４））、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（０．２５％（ｖ／ｖ））、タウロコール酸（２－｛［（３α，５β，７α，１２α）－３，７，１２－トリヒドロキシ－２４－オキソコラン－２４－イル］アミノ｝エタンスルホン酸）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）（０．２５％（ｗ／ｖ））、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（２，２′，２″，２″′－（エタン－１，２－ジイルジニトリロ）四酢酸（２，２′，２″，２″′－（Ｅｔｈａｎｅ－１，２－ｄｉｙｌｄｉｎｉｔｒｉｌｏ）ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ））（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を加え、その後細胞を効率的に溶解させるためにプレートを直ちに－８５℃中に置いた。ＧＢＡ１活性をモニタリングするために、最初にライセートを融解し、氷上で２０分間インキュベートしてから、４℃で２００００ＲＣＦにて２０分間遠心分離して細胞片を除去した。上清を収集して２つのアリコートに分割し、それぞれＧＢＡ１活性の検査と、タンパク質濃度の決定とを行った。ＧＢＡ１活性を検査するために、ライセートを１％ＢＳＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）、１ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルｂ－グルコピラノシド（（４－ＭＵ：４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｂ－ｇｌｕｃｏｐｈｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（＃Ｍ３６３３）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））と混合して５０μｌの体積にし、次いで３７℃にて４０分間インキュベートした。１体積の１Ｍグリシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）、ｐＨ１２．５によって反応を停止し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｄ５シリーズマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）、サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）、ＣＡ）を用いて蛍光をモニタリングした（ｅｘ＝３５５ｎｍ、ｅｍ＝４６０ｎｍ）。図８は、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ細胞並びに組み換えＰＳＡＰからの条件培地による処理の結果、分化したマウス一次皮質ニューロンにおけるＧＢＡ１活性が増加することを示す。
【実施例18】
【0048】
《ＰＧＲＮ－、ＰＳＡＰ－、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１デバイスのインビボの機能》
以前に記載された研究概要（トルノエ（Ｔｏｒｎｏｅ）Ｊら、（２０１２）、リストラティブ・ニューロロジー・アンド・ニューロサイエンス（Ｒｅｓｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）、３０（３）：２２５－３６）と同様の方式でのラットの線条体埋め込みによって、デバイスのインビボの機能を検査した。ラットを４～２４週間処置し、次いでデバイスを取り出して、そのＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の放出をモニタリングすることによって機能を検査した。図１５は、ラットにおける１２週間の処置後の３タイプのデバイス全ての機能を示す。次の実験シリーズにおいては、ブタにおける臨床デバイスの線条体内及び脳室内（ＩＣＶ）留置の後に、ＰＧＲＮ－、ＰＳＡＰ－、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１デバイスのインビボの機能を探索した。いずれかの治療法の２～３週間の処置を検査した後にデバイスを回収し、それらの分泌因子の産生を評価した。
以前に記載された研究概要（トルノエ（Ｔｏｒｎｏｅ）Ｊら、（２０１２）、リストラティブ・ニューロロジー・アンド・ニューロサイエンス（Ｒｅｓｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）、３０（３）：２２５－３６）と同様の方式でのラットの線条体埋め込みによって、デバイスのインビボの機能を検査した。ラットを４～２４週間処置し、次いでデバイスを取り出して、そのＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の放出をモニタリングすることによって機能を検査した。図１５は、ラットにおける１２週間の処置後の３タイプのデバイス全ての機能を示す。次の実験シリーズにおいては、ブタにおける臨床デバイスの線条体内及び脳室内（ＩＣＶ）留置の後に、ＰＧＲＮ－、ＰＳＡＰ－、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ＋ｓｃＦｖ８１デバイスのインビボの機能を探索した。いずれかの治療法の２～３週間の処置を検査した後にデバイスを回収し、それらの分泌因子の産生を評価した。
【実施例19】
【0049】
《ＰＧＲＮ－デバイスのインビボの安全性》
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（登録商標）天然ラット（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、ＭＡ）をＰＧＲＮ－デバイスで２４週間処置したものを屠殺し、脳を回収して、病理組織学的評価のために固定化及びパラフィン包埋（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ）を行った。曝露、増殖細胞、炎症反応、及び浸潤性Ｔ細胞をそれぞれモニタリングするためにヒトＰＧＲＮ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１、及びＣＤ３に対して産生させた抗体とともに、冠状切片（５ｕｍ）をインキュベートした。図９に示されるとおり、ＰＧＲＮ－デバイスによる２４週間の処置の結果、脳内に広いＰＧＲＮの分布がもたらされたが、脳神経外科手術自体によって予期されるシグナル（デバイスが置かれた場所の近傍におけるＧＦＡＰ及びＩｂａ様の免疫反応性の増加によって定められる、限定されたアストログリオーシス）以外のシグナルは観察されなかった。
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（登録商標）天然ラット（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、ＭＡ）をＰＧＲＮ－デバイスで２４週間処置したものを屠殺し、脳を回収して、病理組織学的評価のために固定化及びパラフィン包埋（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ）を行った。曝露、増殖細胞、炎症反応、及び浸潤性Ｔ細胞をそれぞれモニタリングするためにヒトＰＧＲＮ、Ｋｉ６７、ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１、及びＣＤ３に対して産生させた抗体とともに、冠状切片（５ｕｍ）をインキュベートした。図９に示されるとおり、ＰＧＲＮ－デバイスによる２４週間の処置の結果、脳内に広いＰＧＲＮの分布がもたらされたが、脳神経外科手術自体によって予期されるシグナル（デバイスが置かれた場所の近傍におけるＧＦＡＰ及びＩｂａ様の免疫反応性の増加によって定められる、限定されたアストログリオーシス）以外のシグナルは観察されなかった。
【実施例20】
【0050】
《ＰＧＲＮ－、ＰＳＡＰ－、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ－デバイスの処置は、神経変性の２つの異なるラットモデルにおける治療活性を示す》
ヒトアルファ－シヌクレイン遺伝子を保有するＡＡＶ９ウイルスの黒質への注射も受けたラットの線条体に、ＰＧＲＮ－、ＰＳＡＰ－、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ－ｓｃＦｖ８１デバイスを埋め込んだ（デクレサック（Ｄｅｃｒｅｓｓａｃ）Ｍら、（２０１２）、ニューロバイオロジー・オブ・ディジーズ（Ｎｅｕｒｏｂｉｏ Ｄｉｓ）、４５（３）：９３９－９５３）。デバイス埋め込み／ウイルス注射の４、８、及び１２週間後に、ラットに行動検査を受けさせた。次いでラットを屠殺し、脳を回収して、病理組織学的評価を行った（図１０）。
ヒトアルファ－シヌクレイン遺伝子を保有するＡＡＶ９ウイルスの黒質への注射も受けたラットの線条体に、ＰＧＲＮ－、ＰＳＡＰ－、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ－ｓｃＦｖ８１デバイスを埋め込んだ（デクレサック（Ｄｅｃｒｅｓｓａｃ）Ｍら、（２０１２）、ニューロバイオロジー・オブ・ディジーズ（Ｎｅｕｒｏｂｉｏ Ｄｉｓ）、４５（３）：９３９－９５３）。デバイス埋め込み／ウイルス注射の４、８、及び１２週間後に、ラットに行動検査を受けさせた。次いでラットを屠殺し、脳を回収して、病理組織学的評価を行った（図１０）。
【0051】
ＰＧＲＮ－、ＰＳＡＰ－、及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ－デバイスを前述のとおりにラットの線条体に埋め込んだ（トルノエ Ｊら、（２０１２）、リストラティブ・ニューロロジー・アンド・ニューロサイエンス（Ｒｅｓｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）、３０（３）：２２５－３６）。手術の１週間後にラットに行動検査を受けさせた（図１１）。行動検査の翌日、ＰＤ様の神経変性カスケードを引き起こすために、ラットの黒質緻密部に６－ＯＨＤＡを片側注射した。６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）（サンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）、ダラス（Ｄａｌｌａｓ）、ＴＸ）注射の約２週間後及び５週間後に、ラットに上述と同じ行動パラダイムを受けさせた。次いでラットを屠殺し、脳を回収して、病理組織学的評価を行った。ＰＧＲＮ－及びＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ－デバイスの処置は、評価した行動状況の改善を示す（図１１）。
【実施例21】
【0052】
《ＧＤＮＦ＋ＰＧＲＮ分泌デバイス、ＧＤＮＦ＋ＰＳＡＰ分泌デバイス、及びＧＤＮＦ＋ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ分泌デバイス》
ＧＤＮＦ＋ＰＧＲＮ分泌デバイス、ＧＤＮＦ＋ＰＳＡＰ分泌デバイス、及びＧＤＮＦ＋ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ分泌デバイスは、神経変性のラット６－ＯＨＤＡモデルにおける治療活性を示す。ＡＲＰＥ－ＧＤＮＦと、上記の実施例１２に記載したＡＲＰＥ因子細胞株のいずれかとを充填したデバイスの治療活性を、実施例１２に記載したとおりに検査した。全ての処置が治療活性を示した（図１１）。
ＧＤＮＦ＋ＰＧＲＮ分泌デバイス、ＧＤＮＦ＋ＰＳＡＰ分泌デバイス、及びＧＤＮＦ＋ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰ分泌デバイスは、神経変性のラット６－ＯＨＤＡモデルにおける治療活性を示す。ＡＲＰＥ－ＧＤＮＦと、上記の実施例１２に記載したＡＲＰＥ因子細胞株のいずれかとを充填したデバイスの治療活性を、実施例１２に記載したとおりに検査した。全ての処置が治療活性を示した（図１１）。
【実施例22】
【0053】
《組み換えＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の産生のための細胞培養法》
ＡＲＰＥ－１９－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰクローン＃Ｄ５細胞を完全培地中で培養した。３つのフラスコ（２２５ｃｍ２）をトリプシン処理し（ＴｒｙｐＬＥ（商標）エクスプレス（Ｅｘｐｒｅｓｓ）酵素、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、１２６０５－０１０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））、細胞を５５０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）Ｍ細胞培養容器（１７２０ｃｍ２の面積）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）に播種した。播種の３日後に培地を除去し、細胞を２×１００ｍｌのＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）で洗浄した。次いで、５５０ｍｌのＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）に１ｘ Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｇ４１８）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）社、カールスバッド、ＣＡ）、及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充したものを加えた。細胞を３７℃、５％Ｃ０２にて９６時間培養した。条件培地を収集し、５５０ｍｌの新鮮なＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）に１ｘ Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｇ４１８）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）社、カールスバッド、ＣＡ）、及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充したもので置換した。収集した条件培地は、後で更にタンパク質精製を行うために直ちに－８５℃にて凍結した。
ＡＲＰＥ－１９－ＰＧＲＮ＋ＰＳＡＰクローン＃Ｄ５細胞を完全培地中で培養した。３つのフラスコ（２２５ｃｍ２）をトリプシン処理し（ＴｒｙｐＬＥ（商標）エクスプレス（Ｅｘｐｒｅｓｓ）酵素、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、１２６０５－０１０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ））、細胞を５５０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）Ｍ細胞培養容器（１７２０ｃｍ２の面積）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）に播種した。播種の３日後に培地を除去し、細胞を２×１００ｍｌのＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）で洗浄した。次いで、５５０ｍｌのＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）に１ｘ Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｇ４１８）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）社、カールスバッド、ＣＡ）、及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充したものを加えた。細胞を３７℃、５％Ｃ０２にて９６時間培養した。条件培地を収集し、５５０ｍｌの新鮮なＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）に１ｘ Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｇ４１８）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）社、カールスバッド、ＣＡ）、及びＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ）を補充したもので置換した。収集した条件培地は、後で更にタンパク質精製を行うために直ちに－８５℃にて凍結した。
【実施例23】
【0054】
《ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を含有する条件培地の収集及び濃度》
細胞培養培地の凍結バッチを４℃にて一晩でゆっくり融解した。次いで培地を７２００ｒｃｆにて２０分間遠心分離して、死んだ細胞及び細胞片を沈殿させた。更なる処理の前に、粒子の完全な除去を確実にするために、Ｓａｒｓｔｅｄｔ（登録商標）濾過ユニット（０．２２ｕｍフィルター、ｒｅｆ８３．３９４１．１０１）（Ｓａｒｓｔｅｄｔ（登録商標）社、ニュームブレヒト（Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ）、ＤＥ）を用いて上清を無菌濾過／脱気した。その後、３０ｋＤａカットオフフィルターを装填したＡｍｉｃｏｎ（登録商標）細胞フィルター撹拌技術（ｃａｔ ｎｏ．ＵＦＳＣ４０００１）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）を用いて、濾過した条件培地を１０倍濃縮した。結果として得られた濃縮物に対して、次いで異なるクロマトグラフィー法を行った。
細胞培養培地の凍結バッチを４℃にて一晩でゆっくり融解した。次いで培地を７２００ｒｃｆにて２０分間遠心分離して、死んだ細胞及び細胞片を沈殿させた。更なる処理の前に、粒子の完全な除去を確実にするために、Ｓａｒｓｔｅｄｔ（登録商標）濾過ユニット（０．２２ｕｍフィルター、ｒｅｆ８３．３９４１．１０１）（Ｓａｒｓｔｅｄｔ（登録商標）社、ニュームブレヒト（Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ）、ＤＥ）を用いて上清を無菌濾過／脱気した。その後、３０ｋＤａカットオフフィルターを装填したＡｍｉｃｏｎ（登録商標）細胞フィルター撹拌技術（ｃａｔ ｎｏ．ＵＦＳＣ４０００１）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）を用いて、濾過した条件培地を１０倍濃縮した。結果として得られた濃縮物に対して、次いで異なるクロマトグラフィー法を行った。
【実施例24】
【0055】
《ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の精製》
ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を精製するために、２つの異なるクロマトグラフィー法を適用した。それぞれイオン交換クロマトグラフィー及び分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）である。最初に、濃縮無菌濾過培地を６ｍｌのジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ：Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ（商標）テクノロジー（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ）、ＭＡ）に流し、０～５０％勾配の２Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体アッセイによって画分を分析した。３つの画分においてＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体が識別され、それらはプールされて更にＳＥＣを受けた。
ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を精製するために、２つの異なるクロマトグラフィー法を適用した。それぞれイオン交換クロマトグラフィー及び分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）である。最初に、濃縮無菌濾過培地を６ｍｌのジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ：Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ（商標）テクノロジー（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ）、ＭＡ）に流し、０～５０％勾配の２Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体アッセイによって画分を分析した。３つの画分においてＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体が識別され、それらはプールされて更にＳＥＣを受けた。
【0056】
効率的な分離を確実にするために、ＨｉＬｏａｄ（登録商標）２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ＰＧカラム（ＧＥヘルスケアプロセス（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ）Ｒ＆Ｄ ＡＢ、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、ＳＥ）を用いた。次の３つの異なるアッセイを用いて、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を含有する画分を識別した。ＰＳＡＰ ＥＬＩＳＡ（実施例５を参照）、ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡ（ｈＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット（＃ＤＹ２４２０）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ））、及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰアッセイ（実施例５を参照）。これらのアッセイ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）によって、各画分からのアリコートを分析した。ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は、遊離ＰＧＲＮとは異なる画分に溶出する（図４）。加えて、ウエスタンブロット分析は、ＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの化学量論がＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の１：１であることを示唆する。ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体のみを含有する画分をプールして回収した。
【実施例25】
【0057】
《ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰの貯蔵》
ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を有するプール画分を無菌ＰＢＳ溶液（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）中で一晩透析し、無菌ポリプロピレンＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）ＡＧ、ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｇ）、ＤＥ）中にアリコートし、瞬間凍結して－８５℃にて貯蔵した。
ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を有するプール画分を無菌ＰＢＳ溶液（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）中で一晩透析し、無菌ポリプロピレンＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）ＡＧ、ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｇ）、ＤＥ）中にアリコートし、瞬間凍結して－８５℃にて貯蔵した。
【実施例26】
【0058】
《精製ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の活性、皮質ニューロンのターゲティング》
細胞外投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰは、マウス皮質一次ニューロンと効率的に相互作用し、内部移行されてリソソームを標的とする。胎生期１７日から調製したマウス一次皮質ニューロンを、処理の前にＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェル細胞培養皿（ＢＤバイオサイエンシズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、ＭＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２にて１４日間培養した。次いで１～５μｇ／ｍｌに濃縮したＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰのサンプル（Ｓａｍｐｌｅｄ）を加え、培養物を３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。その後培地を除去し、細胞を固定して、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＧＢＡ１を含む異なるリソソームマーカーに特異的な抗体を用いた免疫細胞化学分析に供した。図７によって証明されるとおり、ＧＢＡ１と共局在するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体による皮質ニューロンの効率的なターゲティングは、この複合体が内部移行されてリソソームを標的とすることを示唆する。
細胞外投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰは、マウス皮質一次ニューロンと効率的に相互作用し、内部移行されてリソソームを標的とする。胎生期１７日から調製したマウス一次皮質ニューロンを、処理の前にＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェル細胞培養皿（ＢＤバイオサイエンシズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、ＭＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２にて１４日間培養した。次いで１～５μｇ／ｍｌに濃縮したＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰのサンプル（Ｓａｍｐｌｅｄ）を加え、培養物を３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。その後培地を除去し、細胞を固定して、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＧＢＡ１を含む異なるリソソームマーカーに特異的な抗体を用いた免疫細胞化学分析に供した。図７によって証明されるとおり、ＧＢＡ１と共局在するＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体による皮質ニューロンの効率的なターゲティングは、この複合体が内部移行されてリソソームを標的とすることを示唆する。
【実施例27】
【0059】
《精製ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の活性、ＧＢＡ１活性の刺激》
細胞外投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体、ＰＧＲＮ、又はＰＳＡＰは、ヘテロ接合ＧＢＡ１ Ｌ４４４Ｐ変異キャリアに由来するマウス一次皮質ニューロン及びヒト初代線維芽細胞におけるＧＢＡ１と共局在し、各処理はＧＢＡ１を活性化する。胎生期１７日から調製したマウス一次皮質ニューロンを、処理の前にＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェル細胞培養皿（ＢＤバイオサイエンシズ、ベッドフォード、ＭＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２にて１４日間培養した。次いでＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、培養物を２４時間インキュベートしてから分析した。ヒト線維芽細胞を集密度まで生育させ、次いでマウス一次ニューロン培養物について前述したとおりにＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ ＧＢＡ１で処理した。３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間処理した後、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレートから培地を除去することによって反応を終了させて、ＮａＣｉｔｒａｔｅ（商標）（（クエン酸三ナトリウム二水和物）（ｐＨ５．４）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（（０．２５％（ｖ／ｖ））（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））、タウロコール酸（（２－｛［（３α，５β，７α，１２α）－３，７，１２－トリヒドロキシ－２４－オキソコラン－２４－イル］アミノ｝エタンスルホン酸）（０．２５％（ｗ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（（２，２′，２″，２″′－（エタン－１，２－ジイルジニトリロ）四酢酸）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））からなる活性緩衝剤を加え、プレートを－８５℃中に入れて細胞の効率的な溶解及び破壊を可能にした。ＧＢＡ１活性をモニタリングするために、最初にライセートを融解し、氷上で２０分間インキュベートした後に４℃で２００００ｒｃｆにて２０分間遠心分離して細胞片を除去した。上清を収集して、それぞれＧＢＡ１活性及びタンパク質濃度の決定のために２つのアリコートに分割した。ＧＢＡ１活性のために、ライセートを１％ＢＳＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）、１ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルｂ－グルコピラノシド（４－ＭＵ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、＃Ｍ３６３３）と混合して５０μｌの体積にし、次いで３７℃にて４０分間インキュベートした。１体積の１Ｍグリシン、ｐＨ１２．５によって反応を停止し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｄ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）、サンノゼ、ＣＡ）を用いて蛍光をモニタリングした（ｅｘ＝３５５ｎｍ、ｅｍ＝４６０ｎｍ）。図８は、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体による処理が、機能ＧＢＡ１変異の損失に対するヘテロ接合の分化マウス一次皮質ニューロンヒト初代線維芽細胞におけるＧＢＡ１活性を増加させることを示す。
細胞外投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体、ＰＧＲＮ、又はＰＳＡＰは、ヘテロ接合ＧＢＡ１ Ｌ４４４Ｐ変異キャリアに由来するマウス一次皮質ニューロン及びヒト初代線維芽細胞におけるＧＢＡ１と共局在し、各処理はＧＢＡ１を活性化する。胎生期１７日から調製したマウス一次皮質ニューロンを、処理の前にＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェル細胞培養皿（ＢＤバイオサイエンシズ、ベッドフォード、ＭＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２にて１４日間培養した。次いでＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、培養物を２４時間インキュベートしてから分析した。ヒト線維芽細胞を集密度まで生育させ、次いでマウス一次ニューロン培養物について前述したとおりにＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ ＧＢＡ１で処理した。３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間処理した後、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレートから培地を除去することによって反応を終了させて、ＮａＣｉｔｒａｔｅ（商標）（（クエン酸三ナトリウム二水和物）（ｐＨ５．４）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（（０．２５％（ｖ／ｖ））（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））、タウロコール酸（（２－｛［（３α，５β，７α，１２α）－３，７，１２－トリヒドロキシ－２４－オキソコラン－２４－イル］アミノ｝エタンスルホン酸）（０．２５％（ｗ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（（２，２′，２″，２″′－（エタン－１，２－ジイルジニトリロ）四酢酸）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、セントルイス、ＭＯ））からなる活性緩衝剤を加え、プレートを－８５℃中に入れて細胞の効率的な溶解及び破壊を可能にした。ＧＢＡ１活性をモニタリングするために、最初にライセートを融解し、氷上で２０分間インキュベートした後に４℃で２００００ｒｃｆにて２０分間遠心分離して細胞片を除去した。上清を収集して、それぞれＧＢＡ１活性及びタンパク質濃度の決定のために２つのアリコートに分割した。ＧＢＡ１活性のために、ライセートを１％ＢＳＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）、１ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルｂ－グルコピラノシド（４－ＭＵ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、＃Ｍ３６３３）と混合して５０μｌの体積にし、次いで３７℃にて４０分間インキュベートした。１体積の１Ｍグリシン、ｐＨ１２．５によって反応を停止し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｄ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）、サンノゼ、ＣＡ）を用いて蛍光をモニタリングした（ｅｘ＝３５５ｎｍ、ｅｍ＝４６０ｎｍ）。図８は、ＰＧＲＮ、ＰＳＡＰ、及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体による処理が、機能ＧＢＡ１変異の損失に対するヘテロ接合の分化マウス一次皮質ニューロンヒト初代線維芽細胞におけるＧＢＡ１活性を増加させることを示す。
【実施例28】
【0060】
《精製ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の活性、神経突起伸長の刺激》
細胞外投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰは、マウス一次皮質ニューロン培養物における神経突起伸長を刺激する。胎生期１７日からマウス一次皮質ニューロンを調製した。脳を収集し、公知の方法に従って皮質培養物を調製した。（メリノ－セレス（Ｍｅｒｉｎｏ－Ｓｅｒｒａｉｓ）Ｐら、（２０１９）、セレブラル・コルテックス（Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ）、２９（１）：４２９－４６。）ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェルポリ－Ｌ－コート細胞培養皿（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェル細胞培養皿（ＢＤバイオサイエンシズ、ベッドフォード、ＭＡ））中のニューロベーサル培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）プラス培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ）にＬ－グルタミン、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）、及び２％Ｂ２７（抗ヒト白血球抗原Ｂ２７抗体（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ）を補充したものに細胞を播種した。播種の６時間後に培地を除去し、９０μｌ／ウェルのニューロベーサル培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）プラス培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ））にＬ－グルタミン、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）、及び０％、０．５又は１％のいずれかのＢ２７（抗ヒト白血球抗原Ｂ２７抗体（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ）を補充したもので直接置換した。完全培地による培養物、すなわち２％Ｂ２７（抗ヒト白血球抗原Ｂ２７抗体（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ）が対照の役割をした。次いで、１０μｌのニューロベーサル培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）プラス培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ））にＬ－グルタミンと、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）と、１０ｎｇ／ｍｌのＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰのいずれかとを補充したものを加え、培養物を３７℃にて４日間又は約９６時間更にインキュベートした。次いで培地を捨てて、細胞を４％ホルムアルデヒド（Ｏ＝ＣＨ２）（フィッシャーケミカル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ウォルサム、ＭＡ）中で室温にて３０分間固定した。その後、固定溶液を捨てて、ウェルをＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）で３回洗浄してから次の免疫細胞化学（ＩＣＣ）分析を行った。固定細胞を最初に室温にてＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（ｔ－Ｏｃｔ－Ｃ６Ｈ４－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝９－１０（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ））（０．２５％）及びＢＳＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）（３％）で１時間処理して、細胞を透過性にし、かつ非特異的タンパク質結合を妨げた。ブロッキング溶液を除去した後、新鮮なブロッキング溶液に１：２００に希釈したマウスモノクローナル抗チューブリン抗体（（アンタクルーズ（ａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｇ８）（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ））を補充したものに培養物を暴露し、次いで＋４℃にてインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）（０．２５％）及びＢＳＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）（３％）で３回洗浄し、次いでＡｌｅｘａ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００）（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）及び１０ｕｇ／ｕｌのビスベンズイミド青色蛍光色素、すなわちヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、フランクフルト（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）、ＤＥ）を補充したブロッキング溶液とともに室温にて１時間インキュベートした。反応混合物の除去後、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェルプレートをＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ｘ－１００、すなわちＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）で３回洗浄し、次いで暗い環境で＋４℃にて貯蔵した後に分析した。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（商標）技術（ＡｒｒａｙＳｃａｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）のハイコンテントスクリーニングプラットフォーム（ＨＣＳ：Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ）部分と、神経突起形態ソフトウェア（Ｄａｔａ６１（登録商標）、ＣＳＩＲＯ、キャンベラ（Ｃａｎｂｅｒｒａ）、ＡＵ）とを用いてニューロンの形態をモニタリングした。図１２に示されるとおり、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰは、ＰＧＲＮと同様に神経突起伸長を刺激する。
細胞外投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰは、マウス一次皮質ニューロン培養物における神経突起伸長を刺激する。胎生期１７日からマウス一次皮質ニューロンを調製した。脳を収集し、公知の方法に従って皮質培養物を調製した。（メリノ－セレス（Ｍｅｒｉｎｏ－Ｓｅｒｒａｉｓ）Ｐら、（２０１９）、セレブラル・コルテックス（Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ）、２９（１）：４２９－４６。）ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェルポリ－Ｌ－コート細胞培養皿（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェル細胞培養皿（ＢＤバイオサイエンシズ、ベッドフォード、ＭＡ））中のニューロベーサル培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）プラス培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ）にＬ－グルタミン、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）、及び２％Ｂ２７（抗ヒト白血球抗原Ｂ２７抗体（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ）を補充したものに細胞を播種した。播種の６時間後に培地を除去し、９０μｌ／ウェルのニューロベーサル培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）プラス培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ））にＬ－グルタミン、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）、及び０％、０．５又は１％のいずれかのＢ２７（抗ヒト白血球抗原Ｂ２７抗体（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ）を補充したもので直接置換した。完全培地による培養物、すなわち２％Ｂ２７（抗ヒト白血球抗原Ｂ２７抗体（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ）が対照の役割をした。次いで、１０μｌのニューロベーサル培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）プラス培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、カールスバッド、ＣＡ））にＬ－グルタミンと、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）と、１０ｎｇ／ｍｌのＰＧＲＮ又はＰＧＲＮ／ＰＳＡＰのいずれかとを補充したものを加え、培養物を３７℃にて４日間又は約９６時間更にインキュベートした。次いで培地を捨てて、細胞を４％ホルムアルデヒド（Ｏ＝ＣＨ２）（フィッシャーケミカル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ウォルサム、ＭＡ）中で室温にて３０分間固定した。その後、固定溶液を捨てて、ウェルをＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）で３回洗浄してから次の免疫細胞化学（ＩＣＣ）分析を行った。固定細胞を最初に室温にてＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（ｔ－Ｏｃｔ－Ｃ６Ｈ４－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝９－１０（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ））（０．２５％）及びＢＳＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）（３％）で１時間処理して、細胞を透過性にし、かつ非特異的タンパク質結合を妨げた。ブロッキング溶液を除去した後、新鮮なブロッキング溶液に１：２００に希釈したマウスモノクローナル抗チューブリン抗体（（アンタクルーズ（ａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｇ８）（ＡＢＣＡＭ（登録商標）ＰＬＣ社、ケンブリッジ、ＵＫ））を補充したものに培養物を暴露し、次いで＋４℃にてインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）（０．２５％）及びＢＳＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（登録商標）、トゥックズベリー、ＭＡ）（３％）で３回洗浄し、次いでＡｌｅｘａ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００）（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）及び１０ｕｇ／ｕｌのビスベンズイミド青色蛍光色素、すなわちヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、フランクフルト（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）、ＤＥ）を補充したブロッキング溶液とともに室温にて１時間インキュベートした。反応混合物の除去後、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）９６ウェルプレートをＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ｘ－１００、すなわちＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）ラボラトリーズ社、サウスローガン、ＵＴ）／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（登録商標）、バーリントン、ＭＡ）で３回洗浄し、次いで暗い環境で＋４℃にて貯蔵した後に分析した。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（商標）技術（ＡｒｒａｙＳｃａｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）のハイコンテントスクリーニングプラットフォーム（ＨＣＳ：Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ）部分と、神経突起形態ソフトウェア（Ｄａｔａ６１（登録商標）、ＣＳＩＲＯ、キャンベラ（Ｃａｎｂｅｒｒａ）、ＡＵ）とを用いてニューロンの形態をモニタリングした。図１２に示されるとおり、ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰは、ＰＧＲＮと同様に神経突起伸長を刺激する。
【実施例29】
【0061】
《精製ＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体の活性。脳室内（ＩＣＶ）投与後の脳への分配、内部移行、及びリソソームターゲティング》
ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞から条件培地を調製し、濃縮し、緩衝剤をＰＢＳに交換した。組み換えＰＧＲＮ－Ｈｉｓ（ｃａｔ ｎｏ．２４２０－ＰＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ））をＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞からの濃縮条件培地と混合し、ウエスタンブロット分析（図２）によって示されるとおりＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を形成した。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞からのＡＲＰＥ由来ＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体をウエスタンブロット分析によって識別した（図２）。ＰＢＳ中で調製した反応混合物を、蠕動ポンプ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射（Ｈａｍｉｌｔｏｎ（登録商標）社、リノ（Ｒｅｎｏ）、ＮＶ）によって、１分当り０．５μｌの速度で約２分間検査対象に投与した。ＩＣＶ注射の３時間後にマウスを屠殺して脳を回収し、固定液（４％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液）に４８時間漬け、次いで必要となるまで＋４℃の温度でＰＢＳ／３０％スクロースを含む溶液中で貯蔵した。その後脳をパラフィン包埋（ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ＡＴｈＡら（２０１１）、ベテリナリーパソロジー（Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ）、４８（４）：８３４－８）した後に、次の免疫組織化学分析を行った。以下のＰＧＲＮ抗体を用いて、ヒトＰＧＲＮ様及びＰＳＡＰ様の免疫反応性をモニタリングした。ＭＡＢ２４２０及びＡＦ２４２０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ）、ペンタＨｉｓ（抗ｈｉｓタグに向けられた抗体（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、フェンロ（Ｖｅｎｌｏ）、ＮＬ））、及びＰＳＡＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）ｃａｔ ｎｏ．Ｈ００００５６６０－Ｍ０１、０．４３ｍｇ／ｍｌ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北、ＴＷ）及び（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（登録商標）ｃａｔ ｎｏ．ＨＰＡ００４４２６、０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（登録商標）、ローズモント（Ｒｏｓｅｍｏｎｔ）、ＩＬ））。適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした後、ＨＲＰに対する基質としてのＤＡＢによって、ＰＧＲＮ様及びＰＳＡＰ様並びにＨｉｓ様の免疫反応性を検出した。図１３は、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞からの濃縮条件培地と、ＰＧＲＮ－Ｈｉｓと混合したＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ条件培地とを注射したマウスからの、ＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの脳内への重複する拡散を示す。より高い拡大率において、これらの脳におけるＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの細胞内共局在が検出され、Ｈｉｓ様及びＰＳＡＰ様の免疫反応性の細胞内共局在も検出され、ＩＣＶ投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は脳内に拡散して脳細胞によって内部移行されることが示唆される。図１４は、実施例２３に記載されるとおりに精製された組み換えＰＧＲＮ－Ｆｃ、ＰＧＲＮ、及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体が、ラットの脳に取り込まれて広く分布することを示す。加えて、ブタにカテーテルＩＴを介して投与した精製ＰＧＲＮと、ブタにおける２週間のＩＣＶ ＥＣＢ－ＰＧＲＮ処置との結果、ＰＧＲＮの脳取り込みがもたらされる。よって、ＩＴ及びＩＣＶ送達したＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰは、マウス、ラット、及びブタの脳内に拡散する。
ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ及びＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞から条件培地を調製し、濃縮し、緩衝剤をＰＢＳに交換した。組み換えＰＧＲＮ－Ｈｉｓ（ｃａｔ ｎｏ．２４２０－ＰＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ））をＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ細胞からの濃縮条件培地と混合し、ウエスタンブロット分析（図２）によって示されるとおりＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体を形成した。ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞からのＡＲＰＥ由来ＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体をウエスタンブロット分析によって識別した（図２）。ＰＢＳ中で調製した反応混合物を、蠕動ポンプ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ウォルサム、ＭＡ）を用いた脳室内（ＩＣＶ）注射（Ｈａｍｉｌｔｏｎ（登録商標）社、リノ（Ｒｅｎｏ）、ＮＶ）によって、１分当り０．５μｌの速度で約２分間検査対象に投与した。ＩＣＶ注射の３時間後にマウスを屠殺して脳を回収し、固定液（４％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液）に４８時間漬け、次いで必要となるまで＋４℃の温度でＰＢＳ／３０％スクロースを含む溶液中で貯蔵した。その後脳をパラフィン包埋（ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ＡＴｈＡら（２０１１）、ベテリナリーパソロジー（Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ）、４８（４）：８３４－８）した後に、次の免疫組織化学分析を行った。以下のＰＧＲＮ抗体を用いて、ヒトＰＧＲＮ様及びＰＳＡＰ様の免疫反応性をモニタリングした。ＭＡＢ２４２０及びＡＦ２４２０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ミネアポリス、ＭＮ）、ペンタＨｉｓ（抗ｈｉｓタグに向けられた抗体（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、フェンロ（Ｖｅｎｌｏ）、ＮＬ））、及びＰＳＡＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）ｃａｔ ｎｏ．Ｈ００００５６６０－Ｍ０１、０．４３ｍｇ／ｍｌ（Ａｂｎｏｖａ（登録商標）社、台北、ＴＷ）及び（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（登録商標）ｃａｔ ｎｏ．ＨＰＡ００４４２６、０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（登録商標）、ローズモント（Ｒｏｓｅｍｏｎｔ）、ＩＬ））。適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした後、ＨＲＰに対する基質としてのＤＡＢによって、ＰＧＲＮ様及びＰＳＡＰ様並びにＨｉｓ様の免疫反応性を検出した。図１３は、ＡＲＰＥ－ＰＧＲＮ細胞からの濃縮条件培地と、ＰＧＲＮ－Ｈｉｓと混合したＡＲＰＥ－ＰＳＡＰ条件培地とを注射したマウスからの、ＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの脳内への重複する拡散を示す。より高い拡大率において、これらの脳におけるＰＧＲＮ及びＰＳＡＰの細胞内共局在が検出され、Ｈｉｓ様及びＰＳＡＰ様の免疫反応性の細胞内共局在も検出され、ＩＣＶ投与されたＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体は脳内に拡散して脳細胞によって内部移行されることが示唆される。図１４は、実施例２３に記載されるとおりに精製された組み換えＰＧＲＮ－Ｆｃ、ＰＧＲＮ、及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰ複合体が、ラットの脳に取り込まれて広く分布することを示す。加えて、ブタにカテーテルＩＴを介して投与した精製ＰＧＲＮと、ブタにおける２週間のＩＣＶ ＥＣＢ－ＰＧＲＮ処置との結果、ＰＧＲＮの脳取り込みがもたらされる。よって、ＩＴ及びＩＣＶ送達したＰＧＲＮ及びＰＧＲＮ／ＰＳＡＰは、マウス、ラット、及びブタの脳内に拡散する。
【0062】
［定義］
便宜上、明細書、実施例、及び添付の請求項において用いられる特定の用語をここに集めている。当業者はこれらの定義を本開示に照らして読んで理解するべきである。
便宜上、明細書、実施例、及び添付の請求項において用いられる特定の用語をここに集めている。当業者はこれらの定義を本開示に照らして読んで理解するべきである。
【0063】
本明細書において用いられる「バイオリアクター」という用語は、生物学的に活性な環境を支援する任意の製造されたデバイス又はシステムを示す。様々な実施形態において、バイオリアクターは化学プロセスが行われる容器であり、そこには生物又はこうした生物に由来する生化学的に活性な物質が含まれる。このプロセスは好気性でも嫌気性でもあり得る。更なる実施形態において、バイオリアクターは、細胞培養の状況において細胞又は組織を生育させるように設計されたデバイス又はシステムを示すこともある。なおも更なる実施形態において、バイオリアクター内で生育した細胞によって分泌又は産生された分子が収集及び精製されてもよい。
【0064】
本明細書において用いられる、「カプセル」又は代替的に「封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）」若しくは「封入される（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）」という用語は、好ましくは、例えば細胞代謝に必須の酸素、栄養素、増殖因子などの流入、並びに廃棄物及び治療タンパク質の外向きの拡散などの、分子の双方向拡散を可能にする半透膜によって細胞を含有する、囲い込まれたデバイス（又は前記デバイスの使用方法）を示す。同時にこの膜の半透過性の性質は、免疫細胞及び抗体が、封入された細胞を異物侵入とみなして破壊することを防ぐ。
【0065】
本明細書において用いられる「細胞株」という用語は、繰り返し又は不確定的に増殖できる単一の前駆細胞に由来する細胞の集団を示す。前駆細胞は、より大きな動物又は植物の器官又は組織に由来していてもよい。
【0066】
本明細書において用いられる「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、又は代替的に「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）」、「発現された（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」、若しくは「発現するために（ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ）」という用語は、核酸又はポリヌクレオチドに由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を示す。発現は、ｍＲＮＡからタンパク質又はポリペプチドへの翻訳も示してもよい。
【0067】
本明細書において用いられる「発現コンストラクト」という用語は、核酸又はポリヌクレオチドがコードするタンパク質又はＲＮＡを発現する目的のために、細胞内にその核酸又はポリヌクレオチドを導入するように設計された任意の分子、ウイルス、又は生物を示す。好ましい実施形態において、発現コンストラクトはプラスミドであってもよい。発現コンストラクトは発現ベクターも示してもよく、これらの用語は交換可能に用いられる。
【0068】
本明細書において用いられる「フラグメント」又は代替的に「そのフラグメント」という用語は、ポリヌクレオチド配列に適用されるときは、参照核酸よりも短い長さの共通部分にわたって参照核酸と同じヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を示す。本発明によるこうした核酸フラグメントは、適切なときは、自身がその構成物であるより大きいポリヌクレオチドに含まれていてもよい。
【0069】
本明細書において用いられる「ヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）」、又は代替的に「ヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ）」若しくは「ヘテロダイマー化」という用語は、２つのタンパク質単量体又は複数の単一タンパク質によって形成される巨大分子複合体を示し、ここで２つのタンパク質単量体は２つの異なるタンパク質配列を含む。
【0070】
本明細書において用いられる「免疫隔離的」という用語は、例えば生体高分子、細胞、又は薬物放出キャリアなどの埋め込まれた材料を免疫反応から保護するか、又は免疫反応を最小化する方法若しくは手段を示す。ある実施形態において、埋め込み型デバイスは、デバイスが宿主に埋め込まれた後にデバイスの内側の材料を免疫反応から保護するという点で免疫隔離的であってもよい。
【0071】
本明細書において用いられる「埋め込み型（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ）」、又は代替的に「埋め込む（ｉｍｐｌａｎｔ）」、「埋め込む（ｉｍｐｌａｎｔｓ）」、「埋め込まれた（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ）」、若しくは「埋め込むために（ｔｏ ｉｍｐｌａｎｔ）」という用語は、宿主の既存の生物学的構造又は機能を置換、増強、又は支持する目的のために、長期間にわたって宿主の体内に導入されるように設計されたデバイスを示す。
【0072】
本明細書において用いられる「マトリックス」という用語は、周囲の細胞に構造的及び生化学的な支援を提供する、例えばポリマー、コラーゲン、酵素、ラミニン、フィブロネクチン、又は糖タンパク質などの細胞外巨大分子の３次元ネットワークを示す。
【0073】
本明細書において用いられる「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」、又は代替的に「改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」、「改変する（ｍｏｄｉｆｉｅｓ）」、「改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「改変する（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）」、若しくは「改変するために（ｔｏ ｍｏｄｉｆｙ）」という用語は、物質の単数又は複数の特性を直接的又は間接的に促進、減少、追加、又は除去する、前記物質の任意の変更を示す。
【0074】
本明細書において用いられる「神経疾患」及び「神経障害」という用語は交換可能に用いられ、脳、脊髄、又はその他の神経における構造的、生化学的、又は電気的な異常によって引き起こされる神経系の任意の機能の異常又は障害を示す。
【0075】
本明細書において用いられる「その他のクロマトグラフィー法」という用語は、提出時に当該技術分野において公知であるか、又はその後発見される、調製又は分析のための、混合物の分離のために用いられる任意の技術を示す。
【0076】
本明細書において用いられる「前駆体ポリペプチド」、「タンパク質前駆体」、又は「プロタンパク質」という用語は交換可能に用いられ、例えば分子の断片の切断又は別の分子の追加などの翻訳後修飾によって活性型にできる不活性タンパク質（又はペプチド）を示す。
【0077】
本明細書において用いられる「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」、又は代替的に「精製する（ｐｕｒｉｆｙ）」、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」、「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、若しくは「精製するために（ｔｏ ｐｕｒｉｆｙ）」という用語は、濃度を実質的に増加させたか、又は混入物をなくした物質を示す。別様に示されない限り、この用語は必ずしも絶対的な純度を示すものではない。
【0078】
本明細書において用いられる「スリーピングビューティートランスポザーゼシステム」という用語は、スリーピングビューティートランスポザーゼ及びトランスポゾンによってＤＮＡ配列を細胞のゲノムに導入する方法、並びに前記方法を実行するための材料を示す。
【0079】
本明細書において用いられる「サブペプチド（ｓｕｂｐｅｐｔｉｄｅ）」、又は代替的に「サブペプチド（ｓｕｂｐｅｐｔｉｄｅｓ）」若しくは「そのサブペプチド」という用語は、もっと大きなタンパク質又はポリペプチドの一部に由来するポリペプチドを示す。ある実施形態において、サブペプチドは、もっと大きなタンパク質又はポリペプチドのフラグメントであってもよい。
【0080】
本明細書において用いられる「治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」、又は代替的に「治療薬（ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」、「治療薬物（ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇ）」、「治療薬剤（ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」、「治療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」、「治療法（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」、「治療計画（ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｇｉｍｅｎ）」、若しくは「治療法（ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）」という用語は、分子によって処置される対象に対する有益な機能を与える任意の分子（又は前記分子を用いる方法）を示す。治療薬はペプチド、ポリペプチド、単鎖又は複数鎖タンパク質、融合タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイム、及びＲＮＡ外部ガイド配列を含んでもよいが、それに限定されない。治療薬は、自然発生する配列、合成配列、又は自然及び合成配列の組み合わせを含んでもよい。
【0081】
本明細書において用いられる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、又はその任意のその他の変形の用語は、非排他的な包含をカバーすることが意図される。例えば、構成要素のリストを含むプロセス、方法、品物、又は装置は、必ずしもそれらの構成要素のみに限定されず、明確に挙げられていないか、又はこうしたプロセス、方法、品物、若しくは装置に固有ではないその他の構成要素を含んでもよい。更に、反対のことが明確に述べられていない限り、「又は（ｏｒ）」は包含的論理和を示し、排他的論理和を示さない。例えば、Ａ又はＢという状態は、次のうちのいずれか１つによって満たされる。Ａが真（又は存在）かつＢが偽（又は不在）、Ａが偽（又は不在）かつＢが真（又は存在）、並びにＡ及びＢの両方が真（又は存在）。加えて「ａ」又は「ａｎ」という用語の使用は、本発明の構成要素及び構成成分を記載するために用いられる。これは単に便宜上本発明の一般的な意味を与えるために行われたものである。この記載は１つ又は少なくとも１つを含むものと読取られるべきであり、別様を意味することが自明でない限り、単数形は複数形も含む。別様に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料が本発明の実施又は検査に用いられ得るが、好適な方法及び材料は上記に考察されている。本明細書において言及される全ての出版物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体が引用により援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が統制する。加えてこれらの材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することは意図されない。以下の記載において、本発明の実施形態の理解を提供するために、例えば様々なシステム構成要素の識別などの多数の特定の詳細が提供される。しかし当業者は、特定の詳細のうちの１つ以上を伴わずに、又は他の方法、構成要素、材料などによって本発明の実施形態が実施され得ることを認識するだろう。更に他の場合においては、本発明の様々な実施形態の態様を曖昧にすることを避けるために、周知の構造、材料、又は動作を詳細に図示又は記述していない。この明細書全体にわたる「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「ある実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」の参照は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって明細書全体にわたる様々な場所での「一実施形態において」又は「ある実施形態において」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を参照するものではない。更に、１つ以上の実施形態において、特定の特徴、構造、又は特性が任意の好適な方式で組み合わされてもよい。
【0082】
本明細書において用いられる「及び／又は」という用語は、一方又は他方又は両方を有する可能性と定義される。例えば「Ａ及び／又はＢ」は、Ａのみ、又はＢのみ、又はＡ及びＢの組み合わせを有するシナリオを提供する。請求項が「Ａ及び／又はＢ及び／又はＣ」と読取られるとき、その構成はＡ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ｃを除くＡ及びＢ、Ａを除くＢ及びＣ、Ｂを除くＡ及びＣ、又はＡ、Ｂ、及びＣの３つ全ての構成要素を含んでもよい。
【0083】
［頭字語］
便宜上、明細書、実施例、及び添付の請求項において用いられる特定の用語をここに集めている。これらの定義は本開示に照らして読取られ、当業者による理解と同様に理解されるべきである。
ＡＡＶ アデノ随伴ウイルスベクター（ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）
ＡＤ アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＬＳ 筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）
ＡＰＲＥ－１９ 成人網膜色素上皮細胞株１９（ａｄｕｌｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－１９）
ｂＦＧＦ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）
ＢＨＫ ベビーハムスター腎臓細胞（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）
ＢＭＴ 骨髄移植（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）
ＢＳＡ ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）
ＢＳＣ オナガザル腎細胞（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）
ＣＡＣ 循環血管新生細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ）
ＣＤ３ 表面抗原分類３（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３）
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）
ＣＤＮＡ１ 相補ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）
ＣＤＮＦ 脳ドーパミン神経栄養因子（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）
ＣＭＶ （ヒト）サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
ＣＮＳ 中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）
ＣＯＳ ＣＶ－１（サル）起源（ＣＶ－１（ｓｉｍｉａｎ）ｉｎ Ｏｒｉｇｉｎ）
ＣＳＦ 脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）
ＤＥＡＥ ジエチルアミノエチルセルロース（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）
ＤＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）
ＥＣＢ 封入細胞生物送達（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ）
ＥＤＴＡ ２，２′，２″，２″′－（エタン）－１，２－ジイルジニトリロ）四酢酸（２，２′，２″，２″′－（Ｅｔｈａｎｅ）－１，２－ｄｉｙｌｄｉｎｉｔｒｉｌｏ）ｔｅｔｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＥＧＦ 上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
ＦＣＳ ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）
ｂＦＧＦ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）
ＦＩＴＣ フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）
ＦＴＤ 前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）
ＦＵＳ 肉腫内融合（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）
ＧＢＡ１ β－グルコセレブロシダーゼ（β－Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）
ＧＣａｓｅ グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）
ＧＣＦＮ グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）
ＧＤＮＦ グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）別称ＡＲＭＥＴ様タンパク質１
ＧＦＡＰ グリア線維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）
ＧＲＮ グラニュリン（ｇｒａｎｕｌｉｎ）
ＨＩＶ ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）
ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）
ＨＥＫ ヒト胎児由来腎臓（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）
Ｉｂａ１ カルシウムイオン結合アダプター分子１（ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）
ＩＣＣ 免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）
ＩＣＶ 脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）
ｉＰＳ 誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）
ＩＲ／ＤＲ 逆方向反復／直列反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ／ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ）
ＫＥＧＧ ゲノムと遺伝子の百科事典（Ｋｙｏｔｏ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅｓ）
ＬＡＭＰ１ リソソーム膜タンパク質１（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、別称リソソーム膜糖タンパク質１、別称表面抗原分類１０７ａ
ＬＡＴＥ 辺縁系優位型加齢性ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質－４３（ＴＤＰ－４３）脳症（ｌｉｍｂｉｃ－ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ＴＡＲ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－４３（ＴＤＰ－４３）ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）
ＬＢ レビー小体（Ｌｅｗｉｓ ｂｏｄｙ）
ＬＢＤ レビー小体認知症（Ｌｅｗｉｓ ｂｏｄｙ ｄｅｍｅｎｔｉａ）
ＭＡＮＦ 中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）
ＭＣＳ 間葉性軟骨肉腫（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）
ＭＳＡ 多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ）
ＭＳＣ 間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）
ＭＳＯ 間葉性軟骨肉腫－１（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｈｏｎｄｒｏＳａｒｃｏｍａ－１）
ＮＣＬ 神経セロイドリポフスチン症（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）
ＮＴ ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）
ＮＳ０ マウス骨髄腫細胞（ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ）
６－ＯＨＤＡ ６－ヒドロキシドーパミン（６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ）
ＰＢＳ リン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
ＰＣ 褐色細胞腫（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）（１２及び１２Ａ）
ＰＤ パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＰＥＳＴ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）
ＰＧＲＮ プログラニュリン（ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）
ＰＲＯＴＡＣ 標的タンパク質分解キメラ（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒａ）
ＰＳＡＰ プロサポシン（ｐｒｏｓａｐｏｓｉｎ）
ＲＣＦ 相対遠心力（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｏｒｃｅ）
ＲＮ ラットニューロン（ｒａｔ ｎｅｕｒｏｎａｌ）
ＲＮＡ リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）
ＲＰＥ 網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）
ＲＴ 室温（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）
ＳＣＣ 扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
ｓｃＦｖ 単鎖可変フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ＳＥＣ 分子ふるいクロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ＳＩＲＣ スターツス・セルムインスティトゥート・ウサギ角膜（Ｓｔａｒｔｕｓ Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｉｔｕｔ ｒａｂｂｉｔ ｃｏｒｎｅａ）
ＴＡＲ トランザクティブレスポンス（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）
ＴＡＴ 転写のトランスアクチベーター（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
ＴＤＰ ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＡＲ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）
ｈＴＥＲＴ ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）
ＴＨ チロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）
ＴＭＢ ３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（３，３′，５，５′－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）
便宜上、明細書、実施例、及び添付の請求項において用いられる特定の用語をここに集めている。これらの定義は本開示に照らして読取られ、当業者による理解と同様に理解されるべきである。
ＡＡＶ アデノ随伴ウイルスベクター（ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）
ＡＤ アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＬＳ 筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）
ＡＰＲＥ－１９ 成人網膜色素上皮細胞株１９（ａｄｕｌｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－１９）
ｂＦＧＦ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）
ＢＨＫ ベビーハムスター腎臓細胞（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）
ＢＭＴ 骨髄移植（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）
ＢＳＡ ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）
ＢＳＣ オナガザル腎細胞（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）
ＣＡＣ 循環血管新生細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ）
ＣＤ３ 表面抗原分類３（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３）
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）
ＣＤＮＡ１ 相補ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）
ＣＤＮＦ 脳ドーパミン神経栄養因子（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）
ＣＭＶ （ヒト）サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）
ＣＮＳ 中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）
ＣＯＳ ＣＶ－１（サル）起源（ＣＶ－１（ｓｉｍｉａｎ）ｉｎ Ｏｒｉｇｉｎ）
ＣＳＦ 脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）
ＤＥＡＥ ジエチルアミノエチルセルロース（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）
ＤＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）
ＥＣＢ 封入細胞生物送達（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ）
ＥＤＴＡ ２，２′，２″，２″′－（エタン）－１，２－ジイルジニトリロ）四酢酸（２，２′，２″，２″′－（Ｅｔｈａｎｅ）－１，２－ｄｉｙｌｄｉｎｉｔｒｉｌｏ）ｔｅｔｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＥＧＦ 上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
ＦＣＳ ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）
ｂＦＧＦ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）
ＦＩＴＣ フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）
ＦＴＤ 前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ）
ＦＵＳ 肉腫内融合（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）
ＧＢＡ１ β－グルコセレブロシダーゼ（β－Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）
ＧＣａｓｅ グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）
ＧＣＦＮ グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）
ＧＤＮＦ グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）別称ＡＲＭＥＴ様タンパク質１
ＧＦＡＰ グリア線維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）
ＧＲＮ グラニュリン（ｇｒａｎｕｌｉｎ）
ＨＩＶ ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）
ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）
ＨＥＫ ヒト胎児由来腎臓（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）
Ｉｂａ１ カルシウムイオン結合アダプター分子１（ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）
ＩＣＣ 免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）
ＩＣＶ 脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）
ｉＰＳ 誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）
ＩＲ／ＤＲ 逆方向反復／直列反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ／ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ）
ＫＥＧＧ ゲノムと遺伝子の百科事典（Ｋｙｏｔｏ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅｓ）
ＬＡＭＰ１ リソソーム膜タンパク質１（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、別称リソソーム膜糖タンパク質１、別称表面抗原分類１０７ａ
ＬＡＴＥ 辺縁系優位型加齢性ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質－４３（ＴＤＰ－４３）脳症（ｌｉｍｂｉｃ－ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ＴＡＲ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－４３（ＴＤＰ－４３）ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）
ＬＢ レビー小体（Ｌｅｗｉｓ ｂｏｄｙ）
ＬＢＤ レビー小体認知症（Ｌｅｗｉｓ ｂｏｄｙ ｄｅｍｅｎｔｉａ）
ＭＡＮＦ 中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）
ＭＣＳ 間葉性軟骨肉腫（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）
ＭＳＡ 多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ）
ＭＳＣ 間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）
ＭＳＯ 間葉性軟骨肉腫－１（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｈｏｎｄｒｏＳａｒｃｏｍａ－１）
ＮＣＬ 神経セロイドリポフスチン症（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）
ＮＴ ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）
ＮＳ０ マウス骨髄腫細胞（ｍｏｕｓｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ）
６－ＯＨＤＡ ６－ヒドロキシドーパミン（６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ）
ＰＢＳ リン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
ＰＣ 褐色細胞腫（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）（１２及び１２Ａ）
ＰＤ パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＰＥＳＴ ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）
ＰＧＲＮ プログラニュリン（ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）
ＰＲＯＴＡＣ 標的タンパク質分解キメラ（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒａ）
ＰＳＡＰ プロサポシン（ｐｒｏｓａｐｏｓｉｎ）
ＲＣＦ 相対遠心力（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｏｒｃｅ）
ＲＮ ラットニューロン（ｒａｔ ｎｅｕｒｏｎａｌ）
ＲＮＡ リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）
ＲＰＥ 網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）
ＲＴ 室温（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）
ＳＣＣ 扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
ｓｃＦｖ 単鎖可変フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ＳＥＣ 分子ふるいクロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ＳＩＲＣ スターツス・セルムインスティトゥート・ウサギ角膜（Ｓｔａｒｔｕｓ Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｉｔｕｔ ｒａｂｂｉｔ ｃｏｒｎｅａ）
ＴＡＲ トランザクティブレスポンス（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）
ＴＡＴ 転写のトランスアクチベーター（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
ＴＤＰ ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＡＲ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）
ｈＴＥＲＴ ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）
ＴＨ チロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）
ＴＭＢ ３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（３，３′，５，５′－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）
【0084】
［均等物］
本発明の全範囲は、請求項及びそれらの均等物の全範囲、並びに明細書及びこうした変形を参照して決定されるべきである。
本発明の全範囲は、請求項及びそれらの均等物の全範囲、並びに明細書及びこうした変形を参照して決定されるべきである。
【0085】
別様に示されない限り、明細書及び請求項において用いられる成分及び反応条件などの量を表現する全ての数字は、全ての場合に±５％と定義される「約」という用語で修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対のことが示されていない限り、この明細書及び添付の請求項に示される数的パラメータは近似値であり、本発明によって得られることが求められる所望の特性に依存して変動することがある。
【0086】
上記の考察は、本発明の原理及び様々な実施形態の例示となることが意図される。上記の開示を完全に認識した当業者には、多数の変形、組み合わせ、及び修正が明らかになるだろう。以下の請求項は、こうした変形及び修正を全て包含すると解釈されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図14F】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】