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▶ ボード オブ トラスティーズ オブ ミシガン ステート ユニバーシティの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-18
(54)【発明の名称】多能性幹細胞由来の心臓オルガノイド
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20230710BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230710BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20230710BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/10
C12N5/0735
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022577624
(86)(22)【出願日】2021-06-17
(85)【翻訳文提出日】2023-02-14
(86)【国際出願番号】 US2021037808
(87)【国際公開番号】W WO2021257812
(87)【国際公開日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】63/041,545
(32)【優先日】2020-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/155,596
(32)【優先日】2021-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】502243376
【氏名又は名称】ボード オブ トラスティーズ オブ ミシガン ステート ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】アギーレ，アイトール
(72)【発明者】
【氏名】イスラエリ，ヨナタン ラズ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065BC50
4B065CA44
4B065CA60
(57)【要約】
心臓オルガノイドを生成するための方法が提供される。前記方法は、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成する工程、前記細胞凝集体におけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、前記細胞凝集体を三次元心臓中胚葉に分化させる工程、および、前記心臓中胚葉における前記Ｗｎｔシグナル伝達を阻害して、前記心臓オルガノイドを形成する工程を含む。前記心臓オルガノイドは、心筋組織、少なくとも１つのチャンバを画定する心内膜組織、前記心筋組織の少なくとも外面上に配置された心外膜組織を含む。前記心臓オルガノイドは、拍動する。前記方法に従って製造された心臓オルガノイドも提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
心臓オルガノイドを生成するための方法であって、前記方法は：多能性幹細胞を含む細胞凝集体を形成する工程；
前記細胞凝集体におけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、前記細胞凝集体を三次元心臓中胚葉に分化させる工程；および、
前記三次元心臓中胚葉における前記Ｗｎｔシグナル伝達を阻害して、前記心臓オルガノイドを形成する工程、
を含み、
前記心臓オルガノイドは、心筋組織、少なくとも１つのチャンバを画定する心内膜組織、および前記心筋組織の少なくとも外面上に配置された心外膜組織を含み、
前記心臓オルガノイドは、拍動する、
方法。
【請求項2】
前記Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させる前記工程は、前記細胞凝集体を（ＧＳＫ－３）阻害剤と接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＧＳＫ－３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させる前記工程と同時に、前記細胞凝集体を少なくとも１つの成長剤と接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する前記工程は、前記三次元心臓中胚葉をポルクピン（ＰＯＲＣＮ）阻害剤と接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ＰＯＲＣＮ阻害剤は、Ｗｎｔ－Ｃ５９である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、前記心臓オルガノイドにおける心外膜前駆組織の量を増加させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記心臓オルガノイドは、約２ｍＭ以上、約７ｍＭ以下の濃度のグルコース、および約２０ｐＭ以上、約２５０ｐＭ以下の濃度のインスリンを含む培地中で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記心臓オルガノイドは、約８ｍＭ以上、約３０ｍＭ以下の濃度のグルコース、および約２５０ｐＭ以上、約７５ｎＭ以下の濃度のインスリンを含む培地中で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
請求項１に記載の方法に従って製造された、心臓オルガノイド。
【請求項11】
心臓オルガノイドを生成するための方法であって、前記方法は：多能性幹細胞を含む細胞凝集体を形成する工程；
前記細胞凝集体を第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と約２時間以上、約４８時間以下接触させて、前記細胞凝集体におけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、前記細胞凝集体を三次元心臓中胚葉に分化させる工程；
前記三次元心臓中胚葉をＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤と約２４時間以上、約７２時間以下接触させて、前記細胞凝集体における前記Ｗｎｔシグナル伝達を阻害し、前記心臓オルガノイドを形成する工程であって、前記心臓オルガノイドは：
内部および外面を有する三次元主部であって、前記内部が心筋組織を含む、三次元主部；
少なくとも１つのチャンバを画定する心内膜組織；および、
前記外面の少なくとも一部に配置された心外膜組織；を含み、
前記心臓オルガノイドは、拍動する、
工程；ならびに、
前記心臓オルガノイドを第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と約１５分間以上、約２４時間以下接触させて、前記心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、前記心臓オルガノイドにおいてさらなる心外膜組織および心外膜前駆細胞を生成する工程、
を含む、方法。
【請求項12】
前記細胞凝集体を前記第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、前記細胞凝集体を、約１μＭ以上、約１５μＭ以下のＣＨＩＲ９９０２１を含むＷｎｔ活性化組成物と接触させる工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記三次元心臓中胚葉を前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させる前記工程は、前記三次元心臓中胚葉を、約１μＭ以上、約１５μＭ以下のＷｎｔ－Ｃ５９を含むＷｎｔ阻害組成物と接触させる工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記心臓オルガノイドを前記第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、前記細胞凝集体を、約１μＭ以上、約１５μＭ以下のＣＨＩＲ９９０２１を含むＷｎｔ活性化組成物と接触させる工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞凝集体を形成する前記工程は：前記多能性幹細胞を基材に移す工程；および、
前記基材を、約５０ｇ以上、約５００ｇ以下で約１分間以上、約１０分間以下遠心分離する工程、
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記細胞凝集体を形成する前記工程は、－２日目に実行され；前記細胞凝集体を前記第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、０日目に実行され；
前記三次元心臓中胚葉を前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させる前記工程は、２日目に実行され；
前記心臓オルガノイドを前記第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、７日目に実行される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
請求項１１に記載の方法に従って製造された、心臓オルガノイド。
【請求項18】
心臓オルガノイドであって：内部および外面を有する三次元主部であって、前記内部が心筋組織を含む、三次元主部；
前記心筋組織内の少なくとも１つのチャンバを画定する心内膜細胞；および、
前記外面の少なくとも一部に配置された心外膜組織、
を含み、
前記心臓オルガノイドは、拍動し、
前記心臓オルガノイドは、培養多能性幹細胞に由来する、
心臓オルガノイド。
【請求項19】
前記心臓オルガノイド内に少なくとも部分的に埋め込まれた内皮血管系；および、前記心筋組織内に配置された心臓線維芽細胞、
をさらに含む、請求項１８に記載の心臓オルガノイド。
【請求項20】
心臓特異的細胞外マトリックスをさらに含む、請求項１８に記載の心臓オルガノイド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔関連出願の参照〕
本出願は、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，５４５号、および２０２１年３月２日に出願された米国仮特許出願第６３／１５５，５９６号の利益を主張する。上記出願の内容全体が、参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，５４５号、および２０２１年３月２日に出願された米国仮特許出願第６３／１５５，５９６号の利益を主張する。上記出願の内容全体が、参照により本明細書に援用される。
【0002】
〔政府の権利〕
本発明は、国立衛生研究所によって与えられるＨＬ１３５４６４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一部の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって与えられるＨＬ１３５４６４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一部の権利を有する。
【0003】
〔分野〕
本開示は、多能性幹細胞由来の心臓オルガノイドに関する。
本開示は、多能性幹細胞由来の心臓オルガノイドに関する。
【0004】
〔背景〕
この節は、必ずしも従来技術ではない、本開示に関連する背景情報を提供する。
この節は、必ずしも従来技術ではない、本開示に関連する背景情報を提供する。
【0005】
心血管疾患（ＣＶＤ）および先天性心疾患（ＣＨＤ）はそれぞれ、先進国における主要な死因であり、ヒトにおける最も一般的な種類の先天性欠損である。治療および予防のためにヒト心血管障害を理解することが重要であるにもかかわらず、ＣＶＤ研究のためのヒト心臓オルガノイドモデルの開発に関する進歩は非常に限定的であり、他の臓器（例えば、腎臓、結腸、腸管、脳）について達成された進歩よりも著しく遅れている。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を用いて、インビトロで重要な発生段階を再現し、比較的容易で、高純度で、かつ大量に特定の心臓細胞型を産生することができる。しかしながら、現行の細胞モデルは、それらが表現しようとする組織および臓器の構造的および細胞的な複雑さ（例えば、三次元マトリックスの欠如、無秩序な細胞、および多細胞型相互作用の欠如）とは依然として極めて異なっている。結果として、単離された細胞型が研究されることが頻繁に起こり、他の心臓細胞（例えば、心外膜細胞、心内膜細胞）または疾患表現型に関する細胞－細胞間伝達の寄与を最小化または無視している。ヒト心臓のより忠実なインビトロモデルを産生することは、研究および翻訳用途のための健康状態および病態のより良いモデル化を可能にするので、この技術および知識の差を埋めることには強い需要がある。
【0006】
インビトロヒト心臓モデルの要求を網羅するために、組織工学的手法を用いて、より複雑で多細胞型の三次元心臓組織を製造する重要な試みが、過去２０年間にわたってなされてきた。これらの手法は、最終的な構築物をよく制御することを可能にするが、費用がかかり、手間がかかり、容易に拡張可能ではない傾向がある。さらに、これらの手法は、本来の細胞組成（例えば、真皮線維芽細胞またはヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の使用）および心臓の構成（例えば、心球）を忠実には表していない。これらの手法は、機能的組織をもたらすが、生理学的および構造的関連性、ならびに細胞および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の複雑さに関しては不十分である。したがって、ヒト心臓によりよく似たオルガノイドが望まれている。
【0007】
〔概要〕
この節は、本開示の一般的な概要を提供するものであり、その範囲すべてまたはその特徴すべての包括的な開示ではない。
この節は、本開示の一般的な概要を提供するものであり、その範囲すべてまたはその特徴すべての包括的な開示ではない。
【0008】
様々な態様において、本技術は、心臓オルガノイドを生成するための方法であって、当該方法は、多能性幹細胞を含む細胞凝集体を形成する工程、細胞凝集体におけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、細胞凝集体を三次元心臓中胚葉に分化させる工程、および、三次元心臓中胚葉におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害して、心臓オルガノイドを形成する工程、を含み、心臓オルガノイドは、心筋組織、少なくとも１つのチャンバを画定する心内膜組織、および心筋組織の少なくとも外面上に配置された心外膜組織を含み、心臓オルガノイドは、拍動する、方法を提供する。
【0009】
一態様において、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させる工程は、細胞凝集体をグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ－３）阻害剤と接触させる工程を含む。
【0010】
一態様において、ＧＳＫ－３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
【0011】
一態様において、当該方法は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させる工程と同時に、細胞凝集体を少なくとも１つの成長剤と接触させる工程をさらに含む。
【0012】
一態様において、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する工程は、三次元心臓中胚葉をポルクピン（ＰＯＲＣＮ）阻害剤と接触させる工程を含む。
【0013】
一態様において、ＰＯＲＣＮ阻害剤は、Ｗｎｔ－Ｃ５９である。
【0014】
一態様において、当該方法は、心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、心臓オルガノイドにおける心外膜前駆組織の量を増加させる工程をさらに含む。
【0015】
一態様において、心臓オルガノイドは、約２ｍＭ以上、約７ｍＭ以下の濃度のグルコース、および約２０ｐＭ以上、約２５０ｐＭ以下の濃度のインスリンを含む培地中で生成される。
【0016】
一態様において、心臓オルガノイドは、約８ｍＭ以上、約３０ｍＭ以下の濃度のグルコース、および約２５０ｐＭ以上、約７５ｎＭ以下の濃度のインスリンを含む培地中で生成される。
【0017】
本技術はまた、上記方法に従って製造された、心臓オルガノイドも提供する。
【0018】
様々な態様において、本技術は、心臓オルガノイドを生成するための方法であって、当該方法は、多能性幹細胞を含む細胞凝集体を形成する工程；細胞凝集体を第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と約２時間以上、約４８時間以下接触させて、細胞凝集体におけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、細胞凝集体を三次元心臓中胚葉に分化させる工程；三次元心臓中胚葉をＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤と約２４時間以上、約７２時間以下接触させて、細胞凝集体におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害し、心臓オルガノイドを形成する工程であって、心臓オルガノイドは、内部および外面を有する三次元主部であって、内部が心筋組織を含む、三次元主部、少なくとも１つのチャンバを画定する心内膜組織、および、外面の少なくとも一部に配置された心外膜組織、を含み、心臓オルガノイドは、拍動する、工程；ならびに、心臓オルガノイドを第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と約１５分間以上、約２４時間以下接触させて、心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、心臓オルガノイドにおいてさらなる心外膜組織および心外膜前駆細胞を生成する工程、を含む、方法をさらに提供する。
【0019】
一態様において、細胞凝集体を第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる工程は、細胞凝集体を、約１μＭ以上、約１５μＭ以下のＣＨＩＲ９９０２１を含むＷｎｔ活性化組成物と接触させる工程を含む。
【0020】
一態様において、三次元心臓中胚葉をＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させる工程は、三次元心臓中胚葉を、約１μＭ以上、約１５μＭ以下のＷｎｔ－Ｃ５９を含むＷｎｔ阻害組成物と接触させる工程を含む。
【0021】
一態様において、心臓オルガノイドを第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる工程は、細胞凝集体を、約１μＭ以上、約１５μＭ以下のＣＨＩＲ９９０２１を含むＷｎｔ活性化組成物と接触させる工程を含む。
【0022】
一態様において、細胞凝集体を形成する工程は、多能性幹細胞を基材に移す工程、および、基材を、約５０ｇ以上、約５００ｇ以下で約１分間以上、約１０分間以下遠心分離する工程、を含む。
【0023】
一態様において、細胞凝集体を形成する工程は、－２日目に実行され、細胞凝集体を第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる工程は、０日目に実行され、三次元心臓中胚葉をＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させる工程は、２日目に実行され、心臓オルガノイドを第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる工程は、７日目に実行される。
【0024】
一態様において、当該方法はまた、細胞凝集体を第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる工程に加えて、０日目に細胞凝集体を少なくとも１つの成長因子と接触させる工程も含む。
【0025】
本技術はまた、上記方法に従って製造された、心臓オルガノイドも提供する。
【0026】
様々な態様において、本技術は、心臓オルガノイドであって：内部および外面を有する三次元主部であって、内部が心筋組織を含む、三次元主部；心筋組織内の少なくとも１つのチャンバを画定する心内膜細胞；および、外面の少なくとも一部に配置された心外膜組織、を含み、心臓オルガノイドは、拍動し、心臓オルガノイドは、培養多能性幹細胞に由来する、心臓オルガノイドをさらに提供する。
【0027】
一態様において、心臓オルガノイドは、心臓オルガノイド内に少なくとも部分的に埋め込まれた内皮血管系、および、心筋組織内に配置された心臓線維芽細胞、をさらに含む。
【0028】
一態様において、心臓オルガノイドは、心臓特異的細胞外マトリックスをさらに含む。
【0029】
さらなる適用領域は、本明細書に提供される記載から明らかになるであろう。本概要における記載および具体的な例は、例示のみを意図されており、本開示の範囲を限定することは意図されていない。
【0030】
〔図面〕
本明細書に記載された図面は、すべてのあり得る実装形態ではなく、選択された実施形態の例示のみを目的としており、本開示の範囲を限定することは意図されていない。
本明細書に記載された図面は、すべてのあり得る実装形態ではなく、選択された実施形態の例示のみを目的としており、本開示の範囲を限定することは意図されていない。
【0031】
図１は、本技術の様々な態様に係る心臓オルガノイドを生成する方法を説明するフローチャートである。
【0032】
図２Ａは、本技術の様々な態様に係る心臓オルガノイドの説明図である。
【0033】
【0034】
図３は、本技術の様々な態様に従って製造されたスペクトル領域光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ－ＯＣＴ）撮像系の説明図である。
【0035】
図４Ａ～４Ｆは、本技術の様々な態様に係るヒト心臓オルガノイド（ｈＨＯ）におけるＷｎｔシグナル伝達指向性心筋細胞分化を示すデータを提供する。図４Ａは、胚様体においてＴＮＮＴ２＋心筋細胞を分化させるために使用されるプロトコルを示す模式図である。ＣＨＩＲ９９０２１は、０日目で変化する。図４Ｂは、０～１５日目（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）からの、１５日間にわたる分化の発生オルガノイドの明視野画像（上段）、および、１日当たり３つの代表的なオルガノイドのＤＡＰＩ（青色）およびＴＮＮＴ２（赤色）についての共焦点免疫蛍光画像を示す。図４Ｃは、４μＭのＣＨＩＲを用いて分化させた１５日目のオルガノイドにおけるＤＡＰＩ（青色）およびＴＮＮＴ２（赤色）についての共焦点免疫蛍光画像を示し、サルコメアバンド（スケールバー：２５μｍ）を示す。図４Ｄは、複数のｚ平面で取られたオルガノイド内の心筋細胞領域の面積解析を、３つのＣＨＩＲ９９０２１濃度それぞれについて、オルガノイドそれぞれのＤＡＰＩ＋領域に対するＴＮＮＴ２＋領域の割合として示す（４μＭのＣＨＩＲ９９０２１処理についてはｎ＝１０、６．６μＭおよび８μＭについてはｎ＝６）。図４Ｅは、ｈＨＯの共焦点画像におけるＤＡＰＩ＋領域に対して正規化されたＴＮＮＴ２＋領域の割合を示すグラフである。図４Ｆは、３つの誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株および１つの胚性幹細胞（ＥＳＣ）株における拍動頻度を示すグラフである。（数値＝平均±標準偏差、一元配置分散多重比較検定；＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）
【0036】
図５Ａ～５Ｃは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおけるＷｎｔシグナル伝達指向性心筋細胞分化を示すさらなるデータを提供する。図５Ａは、１５日目、ＣＨＩＲ９９０２１曝露濃度が４μＭ（上段）、６．６μＭ（中段）および８μＭ（下段）のオルガノイドにおけるＤＡＰＩ（青色）およびＴＮＮＴ２（赤色）についての共焦点免疫蛍光画像を示す（スケールバー：５００μｍ）。図５Ｂは、ｈＨＯの１分間当たりの拍動の頻度を示すグラフである。図５Ｃは、１処理当たりの拍動するｈＨＯの割合を示すグラフである。（数値＝平均±標準偏差、一元配置分散多重比較検定；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）
【0037】
図６Ａ～６Ｄは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおいて、第２のＣＨＩＲ曝露が心外膜細胞分化を導くことを示すデータを提供する。図６Ａは、ｈＨＯにおいてＴＮＮＴ２＋心筋細胞およびＷＴ１＋／ＴＪＰ１＋心外膜細胞を分化させるために使用される改変プロトコルを示す模式図である。図６Ｂは、複数のｚ平面で取られたオルガノイド内の心筋細胞領域（ＴＮＮＴ２＋）および心外膜領域（ＷＴ１＋およびＴＪＰ１＋）の面積解析を、オルガノイドそれぞれのＤＡＰＩ＋領域の割合として示す（各条件当たりｎ＝７）。図６Ｃは、７日目に第２のＣＨＩＲ曝露を様々な濃度で行った、ＤＡＰＩ（青色）、ＷＴ１（緑色）、ＴＮＮＴ２（赤色）およびＴＪＰ１（白色）についての分化１５日目のｈＨＯの共焦点免疫蛍光画像を、第２のＣＨＩＲ曝露なしのコントロール（スケールバー：５００μｍ）に対して、示す。図６Ｄは、２μＭの第２のＣＨＩＲ曝露を行ったｈＨＯの高倍率画像を示し、ＴＮＮＴ２＋心筋組織およびＷＴ１＋／ＴＪＰ１＋心外膜組織の近接領域（スケールバー：５０μｍ）を示す。（数値＝平均±標準偏差、二元配置分散多重比較検定；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）
【0038】
図７Ａ～７Ｃは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおいて、第２のＣＨＩＲ曝露が心外膜細胞分化を導くことを示すさらなるデータを提供する。図７Ａは、ｈＨＯにおけるＤＡＰＩ（青色）およびＴＮＮＴ２（赤色）についての共焦点免疫蛍光画像を示し、オルガノイドの端部付近の心外膜マーカーＡＬＤＨ２Ａ（緑色）およびＴＰＪＰ１（白色）を示す。図７Ｂは、７日目に種々の持続時間でＣＨＩＲ９９０２１を用いて処理されたオルガノイドそれぞれのＤＡＰＩ＋領域の割合としての、複数のｚ平面で取られたオルガノイド内の心筋細胞領域（ＴＮＮＴ２＋）および心外膜領域（ＷＴ１＋およびＴＪＰ１＋）の面積解析である。図７Ｃは、これらの持続時間からのオルガノイドの代表的な共焦点免疫蛍光画像を示す（スケールバー：５００μｍ）。（数値＝平均±標準偏差、一元配置分散多重比較検定；＊ｐ＜０．０５）
【0039】
図８Ａ～８Ｅは、トランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図８Ａは、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）による心臓オルガノイドトランスクリプトームのＫ－ｍｅａｎｓクラスタ分析を示す。胎児の心臓発生と強く関連するクラスタ（例えば、２、１０および１４）は、９日目以降に現れる。パスウェイエンリッチメント解析もまた、代表的な心臓特異的クラスタについて提供される（下段）。図８Ｂは、心臓オルガノイド分化過程における第１および第２の心臓領域マーカー（それぞれ、ＦＨＦおよびＳＨＦ）の遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。図８Ｃは、心外膜細胞、線維芽細胞、心内膜細胞、および内皮細胞を含む、心臓オルガノイドにおける心臓特異的細胞型集団についての遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。図８Ｄは、妊娠５７～６７日目における、心臓オルガノイド、単層分化法、および胎児心臓にわたる心臓機能に関与する主要遺伝子の正規化された比較を示す。図８Ｅは、心臓オルガノイド、単層分化、および胎児心臓の階層的クラスタ解析を示す。
【0040】
図９Ａ～９Ｅは、別のトランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図９Ａは、遺伝子発現解析を示しており、心臓オルガノイド分化過程よりも多くのＦＨＦおよびＳＨＦマーカーを示す。図９Ｂは、（左上から右下へ）心内膜細胞、心外膜細胞、内皮細胞、および心臓線維芽細胞を含む、心臓オルガノイドにおける心臓特異的細胞型集団についての遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。図９Ｃは、心筋細胞マーカーについての遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。図９Ｄは、心臓組織に存在するＥＣＭタンパク質コード遺伝子についての遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。図９Ｅは、経時的な心臓オルガノイド分化の主成分分析を示す。
【0041】
図１０Ａ～１０Ｃは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯにおける心臓領域の発生および心筋細胞の詳細を示す画像である。分化８日目のｈＨＯの共焦点免疫蛍光画像は、強固なＨＡＮＤ１（図１０Ａ）およびＨＡＮＤ２（図１０Ｂ）転写因子発現（緑色）、ＴＮＮＴ２（赤色）、およびＤＡＰＩ（青色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。図１０Ｃは、１５日目のｈＨＯの共焦点免疫蛍光画像を示しており、十分に分化した心室領域（ＭＹＬ２、緑色）および心房領域（ＭＹＬ７、赤色）およびＤＡＰＩ（青色）を含む（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。
【0042】
図１１Ａ～１１Ｅは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯの心臓細胞系統組成に関するデータを提供する。図１１Ａ～１１Ｄには、ｈＨＯを構成する様々な細胞系統の免疫蛍光画像が示される。図１１Ａは、ｈＨＯ全体に存在する心臓線維芽細胞マーカーＴＨＹ１（緑色）およびＶＩＭＥＮＴＩＮ（ホワイト）、ＴＮＮＴ２＋（赤色）、ならびにＤＡＰＩ（青色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。図１１Ｂは、オルガノイド全体にわたる血管の画定されたネットワークを示す内皮細胞マーカーＰＥＣＡＭ１（緑色）、ならびに隣接するＴＮＮＴ２＋（赤色）組織およびＤＡＰＩ（青色）を示す（スケールバー：５００μｍ）。図１１Ｃは、ＴＮＮＴ２＋心筋組織に極めて近接するＰＥＣＡＭ１＋内皮組織の６０倍拡大図を示す（スケールバー：５０μｍ）。図１１Ｄは、ＴＮＮＴ２＋（赤色）組織のマイクロチャンバ内で高度に発現された心内膜マーカーＮＦＡＴＣ１（緑色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。図１１Ｅは、ＩｍａｇｅＪを用いてオルガノイド面積全体の割合として計算された、ｈＨＯにおける平均細胞組成の円グラフである。
【0043】
図１２Ａ～１２Ｄは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯのマイクロチャンバ形成、超微細構造、および電気生理現象を示す。図１２Ａは、光コヒーレンストモフラフィー（ＯＣＴ）画像を示しており、マイクロチャンバを明らかにするオルガノイドの断面を示す（スケールバー：５００μｍ）。図１２Ｂは、チャンバ構造（スケールバー：５００μｍ）を明らかにするＡＦ４８８二次抗体を用いてＴＮＮＴ２について染色したｈＨＯのライトシート画像を示す。図１２Ｃは、ｈＨＯの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示しており、小胞体（ＥＲ）、ギャップ結合（Ｇｊ）、グリコーゲン顆粒（Ｇｙ）、脂質滴（Ｌｄ）、ミトコンドリア（Ｍｉ）、核（Ｎ）、およびサルコメア（Ｓ）を示す（左側のスケールバー：２μｍ、右側のスケールバー：１μｍ）。図１２Ｄは、１５秒間にわたるマイクロ電極アレイ（ＭＥＡ）上のオルガノイド（左側）および代表的な活動電位波（右側）の電気生理現象の記録を示す。
【0044】
図１３Ａ～１３Ｄは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関連するデータを提供する。図１３Ａは、ＯＣＴ画像の三次元再構成を示す。図１３Ｂは、ｈＨＯの明視野画像を示す。図１３Ｃは、中央チャンバを明らかにする９つの異なるオルガノイドの中心の断面を示すＯＣＴ画像を提供する（スケールバー：５００μｍ）。図１３Ｄは、ＦｌｉｐＧＦＰトランスジェニックｉＰＳＣ－Ｌ１株に由来するオルガノイドの免疫蛍光画像を提供し、コントロールｈＨＯにおいてはアポトーシスを示さず（左側）、５μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ）で処理したｈＨＯにおいては高いアポトーシスを示す（右側）（スケールバー：５００μｍ）。
【0045】
図１４は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チャンバ内の金電極アレイを示すＭＥＡ記録システムの説明図である。ここで、本技術の心臓オルガノイドは、インキュベータ内のファラデーケージ内に配置されている。
【0046】
図１５Ａ～１５Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関して、心臓の分化および発生に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の影響を示す。図１５Ａ～１５Ｈはすべて、ＣＨＩＲ単独で分化したｈＨＯ（コントロール）およびＣＨＩＲ＋ＢＭＰ４＋ＡｃｔＡで分化したｈＨＯ（処理）を比較する。図１５Ａは、総オルガノイド面積の割合として、心筋細胞および心外膜陽性領域の面積を示すグラフである。図１５Ｂは、オルガノイドの直径（１条件当たりｎ＝８）を示すグラフである。図１５Ｃは、直径を決定するために平均化された、コントロールオルガノイド（左側）および処理オルガノイド（右側）の直径を示す破線を提供する。図１５Ｄは、ＴＮＮＴ２＋領域におけるマイクロチャンバの数を示す。図１５Ｅは、細いＴＮＮＴ２＋フィラメントまたは細いチャネルによるマイクロチャンバの分離によって測定されたマイクロチャンバの相互接続性を示し、明確な接続を示す。図１５Ｄ～１５Ｅにおいて、１条件当たりＮ＝１２である。図１５Ｆは、総オルガノイド面積の割合としてＰＥＣＡＭ１＋組織の量を示す（ＩｍａｇｅＪ上でＭａｘＥｎｔｒｏｐｙ閾値を用いて測定し、２５μｍ２の微粒子すべてを分析して小さなスペックルを回避する。１条件当たりｎ＝７）。図１５Ｇは、ｈＨＯの免疫蛍光画像を示しており、相互接続されたマイクロチャンバ（黄色の矢印）、ＴＮＮＴ２＋フィラメント（白色の矢印）、およびマイクロチャンバを接続するチャネル（緑色の矢印）；ＤＡＰＩ（青色）；ならびにＴＮＮＴ２（赤色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：１００μｍ）。図１５Ｈは、ｈＨＯの免疫蛍光画像を示しており、ＤＡＰＩ（青色）、ＰＥＣＡＭ１＋組織（緑色）、およびＴＮＮＴ２＋組織（赤色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。（数値＝平均±標準偏差、両側の対応のないｔ検定）
【0047】
図１６Ａ～１６Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが妊娠糖尿病（diabetes during pregnancy、ＤＤＰ）誘導ＣＨＤの特徴を忠実に再現することを示す。図１６Ａは、２週間の分化にわたる、正常血糖条件下（ＮＨＯ、左側）および糖尿病条件下（ＤＤＰＨＯ、右側）での１０個のｈＨＯの発生後の明視野画像を示す。図１６Ｂは、分化の最初の２週間におけるｈＨＯの面積を示す（平均±標準偏差；ｎ＝１２；二元配置分散Ｓｉｄａｋ多重比較検定）。図１６Ｃは、１５日目にＮＨＯおよびＤＤＰＨＯに対して実施された電気生理学的分析を示し；矢印は、不整脈事象を示す。図１６Ｄは、酸素消費速度（ＯＣＲ）のシーホース分析（seahorse analysis）を示す。図１６Ｅは、正常ｈＨＯおよび糖尿病性ｈＨＯの細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を示す。図１６Ｆは、ＮＨＯおよびＤＤＰＨＯのＴＥＭによる超微細構造分析であり、小胞体（ＥＲ）、ギャップ結合（Ｇｊ）、グリコーゲン顆粒（Ｇｙ）、脂質滴（Ｌｄ）、ミトコンドリア（Ｍｉ）、核（Ｎ）、およびサルコメア（Ｓ）を示す。図１６Ｇは、心臓（ＴＮＮＴ２）および心外膜（ＷＴ１）形成について分化１５日目での共焦点免疫蛍光画像を示す。図１６Ｈは、正常条件下および糖尿病様条件下での心室（ＭＹＬ２）および心房（ＭＹＬ７）チャンバ形成についての共焦点画像を示す（スケールバー：５００μｍ）。
【0048】
図１７Ａ～１７Ｆは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが健康条件および糖尿病条件における機能的特徴をモデル化することを示すデータを提供する。図１７Ａは、心管形成および心臓の４つのチャンバへのループの模式図を示す。図１７Ｂは、１５日目のＮＨＯおよびＤＤＰＨＯの明視野画像を示しており、セグメンテーション（赤色の矢印）および初期心臓構造に類似する別々の心臓領域（黄色の矢印）を示す。図１７Ｃは、正常なオルガノイド対糖尿病性オルガノイドの代表的なＭＥＡ電気生理学的詳細を示す。図１７Ｄは、正常ｈＨＯおよび糖尿病性ｈＨＯにおける活動電位μＶの振幅の大きさを示す（１条件当たり３回の反復でｎ＞１２；対応のないｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１７Ｅは、ＭＥＡによって記録された正常オルガノイドおよび糖尿病性オルガノイドにおける１分間当たりの拍動の拍動周波数（ＢＰＭ）を示す（平均±標準偏差、ｎ＞５オルガノイド；対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。図１７Ｆは、正常オルガノイドおよび糖尿病様オルガノイドのシーホースエネルギーマップ（seahorse energy map）を示す（平均±標準偏差）。
【0049】
〔詳細な説明〕
実施形態の例は、本開示が完全であり、その範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。本開示の実施形態の完全な理解を提供するために、具体的な組成物、成分、装置および方法の例など、多数の具体的な詳細が記載される。当業者には明らかなように、具体的な詳細が使用される必要はなく、実施形態の例は多くの異なる形態で実施されてもよく、いずれも本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。いくつかの実施形態の例においては、公知の方法、公知の装置構成および公知の技術は、詳細には説明されない。
実施形態の例は、本開示が完全であり、その範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。本開示の実施形態の完全な理解を提供するために、具体的な組成物、成分、装置および方法の例など、多数の具体的な詳細が記載される。当業者には明らかなように、具体的な詳細が使用される必要はなく、実施形態の例は多くの異なる形態で実施されてもよく、いずれも本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。いくつかの実施形態の例においては、公知の方法、公知の装置構成および公知の技術は、詳細には説明されない。
【0050】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態の例のみを説明することを目的としており、限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうではないことを文脈が明らかに示さない限り、複数形も含むことが意図され得る。用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（including）」および「有する（having）」は、包括的であり、したがって記載された特徴、要素、組成物、工程、整数、動作および／または成分の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、動作、要素、成分および／またはそれらの群の存在または追加を排除しない。オープンエンドな用語「含む（comprising）」は、本明細書に記載される様々な実施形態を説明し、特許請求するために使用される非限定的な用語として理解されるべきであるが、特定の態様において当該用語は代替的に、「からなる」または「本質的にからなる」などのより限定的かつ制限的な用語であると代わりに理解されてもよい。したがって、組成物、材料、成分、要素、特徴、整数、動作および／または処理工程を記載する任意の所与の実施形態について、本開示はまた、そのような記載された組成物、材料、成分、要素、特徴、整数、動作および／または処理工程からなるか、または本質的にこれらからなる実施形態も具体的に記載している。「からなる」の場合、代替の実施形態は、任意の追加の組成物、材料、成分、要素、特性、整数、動作および／または処理工程を除外する。一方で、「本質的にからなる」の場合、基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼす任意の追加の組成物、材料、成分、要素、特徴、整数、動作および／または処理工程は、そのような実施形態から除外されるが、基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさない任意の組成物、材料、成分、要素、特徴、整数、動作および／または処理工程は、当該実施形態に含まれ得る。
【0051】
本明細書で説明される如何なる方法工程、処理および動作も、性能の順序として具体的に判別されない限り、説明または図示される特定の順序でそれらの性能を必ずしも必要とすると解釈されるべきではない。また、特段の記載がない限り、追加または代替の工程が採用され得ることを理解されたい。
【0052】
ある成分、要素または層が別の要素または層の「上にある」、「係合される」、「に接続される」、または「に結合される」と言及されるとき、当該成分、当該要素または当該層は、他の成分、要素または層の上に直接的にあってもよく、直接的に係合されてもよく、直接的に接続されてもよく、もしくは直接的に結合されてもよく、または、介在する要素または層が存在していてもよい。対照的に、ある要素が別の要素または層の「上に直接的にある」、「直接的に係合される」、「直接的に接続される」、または「直接に結合される」と言及されるとき、介在する要素または層は存在しなくてもよい。要素間の関係を説明するために使用される他の語は、同様の様式で解釈されるべきである（例えば、「間に」と「直接的に間に」、「隣接する」と「直接的に隣接する」など）。本明細書で使用される場合、用語「および／または」は、関連する列挙された項目のうち１つ以上の任意かつすべての組合せを含む。
【0053】
第１、第２、第３などの用語が様々な工程、要素、成分、領域、層および／または区域を説明するために本明細書で使用され得るが、これらの工程、要素、成分、領域、層および／または区域は、特段の記載がない限り、これらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、１つの工程、要素、成分、領域、層または区域を、別の工程、要素、成分、領域、層または区域と区別するためのみに使用され得る。本明細書で使用される場合、「第１」、「第２」および他の数値用語は、文脈によって明確に示されない限り、配列または順序を含意しない。したがって、以下に説明する第１の工程、要素、成分、領域、層または区域は、実施形態の例の示唆から逸脱することがなければ、第２の工程、要素、成分、領域、層または区域と呼ばれることもあり得る。
【0054】
「前」、「後」、「内側」、「外側」、「下（beneath）」、「下（below）」、「上（above）」、「上（upper）」などの空間的または時間的に相対的な用語は、図に示されるような１つの要素または特徴と別の要素または特徴との関係を説明する記載を容易にするために、本明細書で使用され得る。空間的または時間的に相対的な用語は、図に示される方位に加えて、使用中または動作中の装置またはシステムの様々な方位を包含することが意図され得る。
【0055】
本開示を通して、数値は、言及された値を概ね有する所与の値および実施形態、ならびに言及された値を正確に有する所与の値および実施形態からの小さな偏差を包含する範囲に対する近似的な測定または境界を表す。詳細な説明の最後に提供される実施例以外に、添付の特許請求の範囲を含む、本明細書中のパラメータ（例えば、量または条件のもの）の数値すべては、「約」が数値よりも先に実際に出現するか否かにかかわらず、すべての場合において、用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。「約」は、記載された数値がいくらかのわずかな不正確性を許容することを表す（値の正確性へのいくらかのアプローチを伴う；値に概ねまたは合理的に近い；ほぼ）。「約」によって提供される不正確性が、この通常の意味で当技術分野において他に理解されない場合、本明細書で使用される「約」は、そのようなパラメータを測定および使用する通常の方法から生じ得る変動を少なくとも示す。例えば、「約」は、５％以下、任意に４％以下、任意に３％以下、任意に２％以下、任意に１％以下、任意に０．５％以下、特定の態様においては任意に０．１％以下の変動を含んでもよい。
【0056】
さらに、範囲の開示は、すべての値の開示、および、範囲について与えられた端点および部分範囲を含む、全範囲内のさらに分割された範囲を含む。本明細書において言及される場合、別段の指定がない限り、範囲は、端点を含み、全範囲内の別個の値、およびさらに分割された範囲のすべての開示を含む。したがって、例えば、「Ａ～Ｂ」または「約Ａ～約Ｂ」は、ＡおよびＢを含む。
【0057】
以下、実施形態の例について、添付の図面を参照してより完全に説明する。
【0058】
本技術は、心臓発生プログラムを操作することによって、ｈＰＳＣを使用して、ｈＨＯを含む、高度に複雑で生理学的に関連する心臓オルガノイドを作製するための小分子ベースの方法を提供する。当該方法は、懸濁液胚様体の特定時点での３つの連続的なＷｎｔ調節段階（活性化／阻害／活性化）に主に依存しており、構造、組織化、機能性、心臓細胞型複雑性、ＥＣＭ組成物および血管新生に関して重要な心臓様構造を生成する。さらに、当該方法は、成長因子ベースのアプローチと比較してより安価であり、処理の点で比較的単純である。当該方法はまた、自動化可能であり、拡張可能であり、高含有量／ハイスループット薬理学的スクリーニングに適している。本技術はまた、当該方法から生成されたｈＨＯも提供する。ｈＨＯは、発生中の胚性心臓に対するＤＤＰの作用など、様々な条件および疾患を模し、治療対象を同定するために使用することができる。
【0059】
図１に関して、本技術は、心臓オルガノイドを生成するための方法１０を提供する。ブロック１２において、当該方法は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む細胞凝集体を形成することを含む。細胞凝集体は、細胞培養フラスコまたはプレートなどの細胞培養基材上でＰＳＣを培養することによって、形成される。ＰＳＣは、非限定的であり、例えば、ｈＰＳＣ、ヒト誘導ＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）、任意の他のヒト幹細胞由来多能性細胞、およびそれらの組み合わせを含む、任意のヒト由来ＰＳＣであり得る。ｈＰＳＣの特定の非限定的な例は、ｈｉＰＳＣ株ｉＰＳＣ－Ｌ１、ＡＩＣＳ－００３７－１７２およびｉＰＳＣＯＲＥ＿１６＿３、ｈＥＳＣ株Ｈ９、ならびにそれらの組合せを含む。ＰＳＣを培養するための培地、ならびにＰＳＣを継代培養するための方法および試薬は、当技術分野で公知である。
【0060】
ＰＳＣがコンフルエントに達する前に、ＰＳＣは、非限定的な例として、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）細胞剥離溶液（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの剥離組成物で解離される。解離した細胞を、約１００ｇ、約１５０ｇ、約２００ｇ、約２５０ｇ、約３００ｇ、約３５０ｇ、約４００ｇ、約４５０ｇおよび約５００ｇを含む約１００ｇ以上、約５００ｇ以下で、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間および約１０分間を含む約１分間以上、約１０分間以下遠心分離して、ペレットを形成する。ペレットは、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培養培地において、例えばチアゾビビン、Ｙ－２７６３２、ファスジルおよびそれらの組合せからなる群から選択されるＲＯＣＫ阻害剤を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地において、再懸濁される。ＲＯＣＫ阻害剤は、約７５０ｎＭ以上、約１５０μＭ以下など、対応する業者によって推奨される濃度で含まれる。次いで、懸濁したＰＳＣを計数し、所定数のＰＳＣを基材に移す。特定の態様において、基材は、６ウェル、２４ウェルまたは９６ウェルなどの複数の丸底ウェルを含む超低吸着培養プレートであり得る。非限定的な例として、約２５００以上、約１５０００以下、例えば約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約７０００、約７５００、約８０００、約８５００、約９０００、約９５００、約１００００、約１０５００、約１１０００、約１１５００、約１２０００、約１２５００、約１３０００、約１３５００、約１４０００、約１４５００および約１５０００のＰＳＣを、培養培地中で、９６ウェル超低吸着培養プレートの少なくとも１つの丸底ウェルに移すことができる。次いで、基材を、約５０ｇ以上約５００ｇ以下、約５０ｇ、約７５ｇ、約１００ｇおよび約１５０ｇを含む約５０ｇ以上約１５０ｇ以下で、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間および約１０分間を含む約１分間以上、約１０分間以下遠心分離して、細胞凝集体を形成する。細胞凝集体を担持する基材は、約３７℃および約５％ＣＯ２のインキュベータ中で維持される。培養培地の少なくとも一部は、例えば約２４時間後に、交換され得る。細胞凝集体は、三次元構造中で共に結合またはクラスタ化された複数のＰＳＣを含む。三次元構造は、球状であってもよい。
【0061】
ブロック１４に示すように、方法１０はまた、細胞凝集体における「Ｗｎｔシグナル変換経路」とも呼ばれるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、細胞凝集体を三次元心臓中胚葉に分化させることも含む。既知のＷｎｔシグナル伝達経路は、カノニカルまたは非カノニカルとして特徴付けられる。この点に関して、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路は、細胞凝集体を心臓中胚葉に分化させる。カノニカル経路の簡単な説明として、Ｗｎｔは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー膜貫通受容体の細胞外領域に結合する。Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー膜貫通受容体は、細胞質リンタンパク質Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄを活性化させる。活性化されたＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄは、ＧＳＫ－３をＡｘｉｎから解離させることによって、Ａｘｉｎ、大腸腺腫症ポリポーシス（ＡＰＣ）およびＧＳＫ－３を含む「破壊複合体」を不活性化させ、ＧＳＫ－３の阻害をもたらす。破壊複合体はβ－カテニンの分解を引き起こすので、破壊複合体の不活性化はβ－カテニンが核に転位することを可能にし、そこで、β－カテニンはＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子の転写共活性化因子として作用する。
【0062】
したがって、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、破壊複合体のβ－カテニン分解能を調節することによって、例えばＧＳＫ－３を阻害することによって、またはＷｎｔシグナル伝達経路における他のタンパク質を標的化することによって、活性化され得る。Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子の非限定的な例は、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ－３阻害剤）、塩化リチウム（ＧＳＫ－３阻害剤）、ＳＢ－２１６７６３（ＧＳＫ－３阻害剤）、ＢＩＯ（ＧＳＫ－３阻害剤）、ケンパウロン（Kenpaullone）（ＧＳＫ－３阻害剤）、ＢＭＬ－２８４、ＷＡＹ－２６２６１１、ＷＡＹ－３１６６０６、ＬＰ－９２２０５６、ＡＢＣ９９、ＩＱ－１、ＬＹ２０９０３１４、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ＫＹ－０２０６１、ＫＹ－０２３２７、ＱＳ１１、およびそれらの組合せを含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、約５００ｎＭ以上約１００ｍＭ以下、約７５０ｎＭ以上約１ｍＭ以下、約１μＭ以上約５０μＭ以下、または約１μＭ以上約１５μＭ以下などの当技術分野で公知の濃度で培養培地に含まれ得る。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させることは、細胞凝集体を第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と、約２時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間および約４８時間を含む約２時間以上、約４８時間以下接触させることを含む。ＰＳＣを分化させることに好適な培養培地は、当技術分野で公知であり、非限定的な例として、Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０を含む。
【0063】
三次元心臓中胚葉の成長を促進するために、当該方法はまた、細胞凝集体を、心臓成長（すなわち、心臓オルガノイドの成長）を促進する少なくとも１つの成長剤または成長因子、非限定的な例として例えばＢＭＰ４、ＡｃｔＡ、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）および形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、ならびにこれらの組合せと接触させることを含むことができる。成長剤それぞれは、約１ｆＭ以上約５０μＭ以下、約１ｆＭ以上約１μＭ以下、または約１ｆＭ以上約１ｐＭ以下の個別の濃度で培養培地に含まれ得る。非限定的な例として、特定の態様において、ＢＭＰ４およびＡｃｔＡは、それぞれ約０．１ｐＭ以上約１ｐＭ以下、および約１ｆＭ以上約２００ｆＭ以下の濃度で培養培地に含まれる。接触させることは、約３０分間、約１時間、約２時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、またはそれ以上を含む、約３０分間以上、約１５日間以下実行される。いくつかの態様において、成長剤は、第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と同時に細胞凝集体と接触させられる。したがって、培養培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子および少なくとも１つの成長剤を含み得る。
【0064】
ブロック１６に示すように、方法１０はまた、三次元心臓中胚葉におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害して、心臓オルガノイドを形成することも含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤は、当技術分野で公知であり、例えばポルクピン（ＰＯＲＣＮ；Ｗｎｔをパルミトイル化（Ｗｎｔ活性に必要な修飾）する）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、タンキラーゼ（ＴＮＫＳ；タンパク質分解のためにアキシンを標的化する）、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写レポーター、破壊複合体、およびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）を標的化する化合物を含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤の非限定的な例は、Ｗｎｔ－Ｃ５９（ＰＯＲＣＮ阻害剤）、ＩＷＰ－Ｌ６、（ＰＯＲＣＮ阻害剤）、ＩＷＰ－２（ＰＯＲＣＮ阻害剤）、ＬＧＫ９７４、ＥＴＣ－１５９、ケルセチン、ＢＣ２０５９、ニクロサミド、ＸＡＶ９３９、Ｅ７４４９、ＩＷＲ－１、Ｇ００７－ＬＫ、ＩＣＧ－００１、ＰＮＵ－７４６５４、ウィンドルフェン（windorphen）、デリシン、デリシジン、カルノシン酸、ピルビニウム、ＮＳＣ６６８０３６、３２８９－８６２５、Ｊ０１－０１７ａ、ＴＭＥＭ８８、ＢＭＤ４７０２、ＤＫ－５２０、スリンダク、およびそれらの組合せを含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤は、約５００ｎＭ以上約５０ｍＭ以下、約７５０ｎＭ以上約５００μＭ以下、約１μＭ以上約５０μＭ以下、または約１μＭ以上約１５μＭ以下などの当技術分野で公知の濃度で培養培地に含まれ得る。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することは、三次元心臓中胚葉をＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤と、約２時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間および約７２時間を含む約２時間以上、約７２時間以下接触させることを含む。
【0065】
ｈＨＯであり得る心臓オルガノイドは、上述のように、内部および外面を有する三次元主部を含み、第１および第２の心臓領域（それぞれ、ＦＨＦおよびＳＨＦ）の両方を示す。内部は、心筋組織を含む。心臓オルガノイドはまた、心筋組織によって画定される少なくとも１つのチャンバまたはマイクロチャンバも含み、当該少なくとも１つのチャンバまたはマイクロチャンバは、心内膜細胞で裏打ちされている。心外膜組織（心外膜細胞を含む）は、表面の少なくとも一部に配置される。心臓オルガノイド心臓はまた、心臓線維芽細胞および内皮血管系も含む。さらに、心臓オルガノイドは拍動する。心臓オルガノイドのより詳細な説明は、以下に提供される。
【0066】
ブロック１８に示すように、方法１０はまた、心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させることも任意に含む。この第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化（すなわち、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路活性化）は、心臓オルガノイドにおいてさらなる心外膜組織および／または心外膜細胞ならびに心外膜前駆細胞を生成し、心臓オルガノイドの複雑さを増大させる。好適なＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、上記で議論されている。したがって、心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達は、第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子によって活性化させることができ、ここで、第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と同じであるか、または異なっている。第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、約５００ｎＭ以上約１００ｍＭ以下、約７５０ｎＭ以上約１ｍＭ以下、約１μＭ以上約５０μＭ以下、または約１μＭ以上約１５μＭ以下などの当技術分野で公知の濃度で培養培地に含まれ得る。したがって、心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達の活性化は、心臓オルガノイドを第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と、約１５分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間および約４８時間を含む、約１５分間以上約４８時間以下、約１５分間以上約２４時間以下、約１５分間以上約６時間以下、または約１５分間以上約２時間以下接触させることを含む。第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化に好適な培養培地は、非限定的な例として、Ｂ２７ＴＭサプリメントインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０を含む。接触させた後、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子を含む培地を除去し、培地を、例えばＢ２７ＴＭサプリメントインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０などのＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子を含まない新鮮な培地で置き換えることにより、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子を除去する。
【0067】
ブロック２０に示すように、方法１０は、心臓オルガノイドを維持することをさらに含む。維持することは、約４８時間ごとに培地を交換することによって実行され、その間、心臓オルガノイドは成長し、成熟し、より複雑になり続ける。
【0068】
方法１０は、所定の条件下で心臓オルガノイドを生成するように調整され得ることが理解される。いくつかの例示的な態様において、培地は、約２ｍＭ以上、約３０ｍＭ以下のグルコース、および約２０ｐＭ以上、約７５ｎＭ以下のインスリンを含み得、ここで、グルコースおよびインスリンの相対的な量は、「正常」または「糖尿病」条件下で心臓オルガノイドを形成するように調整される。例えば、正常な心臓オルガノイドは、生理学的濃度のグルコースおよびインスリン、例えば約２ｍＭ以上約７ｍＭ以下、または約３ｍＭ以上約６ｍＭ以下の濃度のグルコース、および約２０ｐＭ以上約２５０ｐＭ以下、または約１００ｐＭ以上約２５０ｐＭ以下の濃度のインスリンを含む培地を用いて、方法１０を実行することによって、生成することができる。これらの「正常」条件下で、方法１０のブロック２０の心臓オルガノイドを維持することの間に、心臓オルガノイドが充分なエネルギー源を有することを保証するために、培地に脂肪酸組成物を補充してもよい。脂肪酸組成物は、オレイン酸－ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リノール酸－ＢＳＡ、またはＬ－カルニチンのうち少なくとも１つを含み、総脂肪酸濃度は、約１５０μＭ以上、約２５０μＭ以下である。一態様において、脂肪酸組成物は、約３０μＭ以上、約５０μＭ以下の濃度のオレイン酸－ＢＳＡ、約１０μＭ以上、約３０μＭ以下の濃度のリノール酸－ＢＳＡ、および約１００μＭ以上、約１５０μＭ以下の濃度のＬ－カルニチンを含み、例えば４０．５μＭのオレイン酸－ＢＳＡ、２２．５μＭのリノール酸－ＢＳＡ、および１２０μＭのＬ－カルニチンを含む。あるいは、糖尿病、例えば妊娠糖尿病またはＤＤＰを患う母親の中で発生中の心臓を模倣する心臓オルガノイドは、本明細書中で「ＤＤＰ心臓オルガノイド（ＤＤＰＨＯ）」と呼ばれ、生理学的濃度より高いグルコースおよびインスリン、例えば約８ｍＭ以上約３０ｍＭ以下、または約１１ｍＭ以上約２５ｍＭ以下の濃度のグルコース、および約２５０ｐＭ以上約７５ｎＭ以下の濃度のインスリンを含む培地を使用して方法１０を実行することによって、生成することができる。しかしながら、方法１０において使用される培地の他の成分は調整され得るか、または、調整可能な条件下で心臓オルガノイドを生成するために、追加の成分、例えば成長因子、大分子、小分子などが培地に含まれ得る。
【0069】
いくつかの態様において、方法１０は、所定の時間スケールを基準にして実行され得る。例えば、ブロック１２のＰＳＣを含む細胞凝集体を形成することは、－２日目に実行され得る。ブロック１４の細胞凝集体におけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、三次元心臓中胚葉を形成すること（すなわち、第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化）は、０日目に実行され得る。ブロック１６の三次元心臓中胚葉におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害して、心臓オルガノイドを形成することは、２日目に実行され得る。ブロック１８の、任意に、心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、心臓オルガノイドにおいて心外膜細胞および心外膜前駆細胞を生成すること（すなわち、任意の第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化）は、７日目に実行され得る。ブロック２０の心臓オルガノイドを維持することは、７日目から完了まで、または約１５日目以降まで、形成され得る。
【0070】
方法１０の非限定的な例が以下に提供される。この非限定的な例において、培地は、所定の様式で、例えば「正常」濃度またはＤＤＰに関連する濃度のグルコースおよびインスリンを含むように、調整され得る。
【0071】
－２日目：成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）細胞外マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養されたサブコンフルエントのＰＳＣをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、それらをＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）と接触させることによってＰＳＣの細胞懸濁液を調製し、約３００ｇで約５分間、細胞懸濁液を遠心分離し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地中でチアゾビビンを用いてＰＳＣを再懸濁し、チアゾビビンを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地を用いて９６ウェル超低吸着プレートのウェルにＰＳＣをプレーティングし、９６ウェル超低吸着プレートを約１００ｇで約３分間、遠心分離し、９６ウェル超低吸着プレートを約３７℃および約５％ＣＯ２に設定されたインキュベータ中に載置することによって、ブロック１２のＰＳＣを含む細胞凝集体を形成することが実行される。
【0072】
－１日目：チアゾビビンを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地を、チアゾビビンを含まない新鮮なＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地に置き換える。
【0073】
０日目：チアゾビビンを含まないＥ８ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地を、第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子ＢＭＰ４およびＡｃｔＡを含み、Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０で置き換え、約２４時間インキュベートすることによって、ブロック１４の細胞凝集体におけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、三次元心臓中胚葉を形成することが実行される。
【0074】
１日目：培地を、Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む新鮮なＲＰＭＩ １６４０で置き換える。
【0075】
２日目：培地を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤を含み、Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０で置き換え、約２４時間インキュベートすることによって、ブロック１６の三次元心臓中胚葉におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害して、心臓オルガノイドを形成することが実行される。
【0076】
４日目：培地を、Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む新鮮なＲＰＭＩ １６４０で置き換える。
【0077】
６日目：培地を、Ｂ２７ＴＭサプリメントインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む新鮮なＲＰＭＩ １６４０で置き換える。
【0078】
７日目：培地を、第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子を含み、Ｂ２７ＴＭサプリメントインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０で置き換え；約１時間インキュベートし；培地を、Ｂ２７ＴＭサプリメントインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０（「正常」濃度のグルコースおよびインスリンを模倣する場合には脂肪酸組成物を含む）で置き換え；約４８時間インキュベートすることによって、ブロック１８の心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、心臓オルガノイドにおいて心外膜細胞および心外膜前駆細胞を生成することが実行される。
【0079】
９～１５日目、またはそれ以降：培地を、Ｂ２７ＴＭサプリメントインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む新鮮なＲＰＭＩ １６４０で置き換える。
【0080】
図２Ａ～２Ｂは、上述のように、方法１０によって調製され、培養ＰＳＣに由来する心臓オルガノイド３０の説明図を示し、図２Ｂは、図２Ａに示される心臓オルガノイド３０の断面図である。心臓オルガノイド３０は、内部３４および外面３６を有する三次元主部３２を含む。三次元主部３２、ひいては心臓オルガノイド３０は、約０．１ｍｍ以上の最長径（最も離れた部分である２点間の距離）を有する。いくつかの態様において、最長径は、約０．１ｍｍ以上、約５ｍｍ以下である。しかしながら、最長直径は、限定的なものではなく、０．１ｍｍよりも小さくてもよく、または５ｍｍよりも大きくてもよいことが理解される。
【0081】
内側部分３４、および、いくつかの態様においては外面３６の一部は、心筋細胞を含む心筋組織３８を含み、ここで、心筋細胞の少なくとも一部はサルコメアを画定する。さらに、心筋組織３８は、心内膜細胞または心内膜組織を含む少なくとも１つの心内膜層４０を含む。ここで、心内膜層４０は、例えば１個のチャンバ４２から約１０個以上のチャンバ４２までの、少なくとも１つのチャンバ４２を画定する。様々な態様において、心臓オルガノイドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のチャンバ４２を有し、当該チャンバ４２は、マイクロチャンバであってもよい。チャンバそれぞれは、心臓オルガノイドが完全に形成されるときに、例えば第１のＷｎｔ活性化の約１４日間後に、約５０μｍ以上、約５００μｍ以下の個別で独立した最長径を有する。したがって、チャンバ４２それぞれは、心内膜層４０で少なくとも部分的に裏打ちされている。心臓オルガノイド３０が２つ以上のチャンバ４２を有する場合、チャンバ４２のうち少なくとも２つ、例えばすべてのチャンバは、相互接続されていてもよい。「相互接続されている」とは、チャンバ４２が、例えば心筋組織３８または心内膜層４０のうち少なくとも１つによって画定されるチャンネル、導管または通路４４によって、少なくとも１つの他のチャンバ４２と流体連通していることを意味する。
【0082】
心臓オルガノイド３０は、心外膜細胞を含む心外膜組織４６をさらに含む。心外膜組織４６は、外面３６の少なくとも一部を画定する。しかしながら、心外膜組織４６はまた、内部３４内に存在してもよいが、通常は外面３６の近傍に存在している。したがって、心筋組織３８は、通常は、心外膜組織４６と、少なくとも１つのチャンバ４２を画定する心内膜層４０との間に配置される。いくつかの態様において、心外膜細胞は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）して、心臓線維芽細胞などの他の細胞型を生じ得る。
【0083】
心臓オルガノイド３０は、心筋組織３８全体に分散した心臓線維芽細胞４８、および心臓特異的でありＥＣＭタンパク質を含むＥＣＭ５０をさらに含む。内皮血管５２（または脈管脈叢）は、外面３６上および心臓オルガノイド３０の内部３４内に配置される。内皮血管５２は、毛細血管で流体連通している動脈（例えば、動脈および／または細動脈を含む）および静脈（例えば、静脈および／または細静脈を含む）によって画定される。さらに、十分に成熟したときに、例えば方法１０の約６日目の後に、心臓オルガノイド３０は拍動する。
【0084】
チャンバ４２は、天然に存在する心臓の静脈または動脈に対応し、天然に存在する心臓と肺との間、および天然に存在する心臓と末梢血管系との間を通過する静脈または動脈と流体連通していない。チャンバ４２は、心臓オルガノイド３０内に収容されており、ＰＳＣに由来する内皮血管系５２と流体連通している。
【0085】
本技術はまた、心臓オルガノイドを生成するための方法において使用される様々な種類の培地のうち少なくとも２つを含むシステムまたはキットを提供する。当該システムまたはキットは、以下からなる群から選択される少なくとも２つの培地を含む：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地；Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン細胞培養サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子（例えば、約４μＭおよび／または約１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１）を含むＲＰＭＩ １６４０；Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン細胞培養サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０；Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン細胞培養サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤（例えば、約２μＭのＷｎｔ－Ｃ５９）を含むＲＰＭＩ １６４０；Ｂ２７ＴＭサプリメント細胞培養サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０；ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、約２μＭのチアゾビビン）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地；Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン細胞培養サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含み、ＧＳＫ阻害剤（例えば、約４μＭのＣＨＩＲ９９０２１）、ＢＭＰ４（例えば、約０．３６ｐＭのＢＭＰ４）、およびＡｃｔＡ（例えば、約０．０８ｐＭのＡｃｔＡ）を含むＲＰＭＩ １６４０；およびそれらの組合せ。いくつかの態様において、システムまたはキット中の培地は、基礎培地（例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地、ＲＰＭＩ １６４０）、ならびに追加成分のアリコート、例えばＢ２７ＴＭサプリメント細胞培養サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン細胞培養サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ４および／またはＡｃｔＡを含む。システムまたはキットは、本明細書にて記載したように、心臓オルガノイドを生成するために使用することができる。
【0086】
本技術の実施形態は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【0087】
〔実施例〕
〔概要〕
〔概要〕
【0088】
ＣＨＤは、ヒトにおける最も一般的な先天性欠損を構成し、全生児出生の約１％に影響を及ぼす。これらの障害がどのように発生するのかを理解する能力は、インビトロでヒト心臓の複雑さをモデル化する能力が限定されているために、妨げられている。インビトロでヒトの発生および疾患を研究するために、複雑なインビボ表現型を再現する、より忠実な臓器様のプラットホームを開発することが差し迫って必要とされている。多能性幹細胞を用いた自己組織化によってｈＨＯを生成する例示的な新規の方法が、本実施例において報告される。当該方法は、明確であり、高度に効率的であり、拡張可能であり、高い再現性を示し、スクリーニングおよびハイスループットアプローチに適合可能である。ｈＨＯは、完全に規定された培養条件において、化学的阻害剤および成長因子の組合せを使用する２工程のカノニカルＷｎｔシグナル伝達調節戦略を使用して、生成される。ｈＨＯは、ヒト心臓の発生を忠実に再現し、トランスクリプトームレベル、構造レベル、および細胞レベルで、同齢の胎児心臓組織に類似する。ｈＨＯは、よく組織化された多系統細胞型領域の独自性を有し、心臓領域ならびに心房および心室チャンバ、加えて心外膜、心内膜および冠状血管を暗示する、洗練された内部チャンバを発生させ、機能的活性を示す。また、胚性ＣＨＤを研究するためのＤＤＰの最初のインビトロヒトモデルを確立することによって、ｈＨＯがＣＨＤに関連する複雑な代謝障害を再現できることも示された。グルコースおよびインスリンの増加による形態学的効果および代謝効果は、ＤＤＰの効果をモデル化する能力を示している。心臓オルガノイドモデルは、ヒト心臓の発生および疾患における移行研究のための強力で新規なツールを構成する。
【0089】
〔導入〕
【0090】
本実施例は、心臓発生プログラムを操作することによって、ｈＰＳＣを使用して、高度に複雑で生理学的に関連するｈＨＯを作製するための新規な小分子ベースの方法を記載する。当該方法は、懸濁液胚様体の特定時点での３つの連続的なＷｎｔ調節段階（活性化／阻害／活性化）に主に依存しており、構造、組織化、機能性、心臓細胞型複雑性、ＥＣＭ組成物および血管新生に関して重要な心臓様構造を生成する。さらに、当該方法は、成長因子ベースのアプローチと比較してより安価であり、処理の点で比較的単純である。当該方法はまた、自動化可能であり、拡張可能であり、高含有量／ハイスループット薬理学的スクリーニングに適している。当該方法がヒト心疾患をモデル化するためにどのように使用できるのかを実証するために、本実施例は、発生中の胚性心臓に対するＤＤＰの影響をモデル化する方法（すなわち、オルガノイドシステム）を採用し、当該方法が治療対象を同定できることを実証する。
【0091】
〔材料および方法〕
【0092】
幹細胞培養。本実施例で使用したヒトｉＰＳＣ株は、ｉＰＳＣ－Ｌ１、ＡＩＣＳ－００３７－１７２（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；別名ＡＩＣＳ）、ｉＰＳＣＯＲＥ＿１６＿３（ＷｉＣｅｌｌ；別名ｉＰＳＣ－１６）およびｈＥＳＣ株Ｈ９であった。すべてのＰＳＣ株は、多能性およびゲノム完全性について妥当であると確認した。ｈＰＳＣを、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地中で、成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした６ウェルプレート上で、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベータ中で、６０～８０％コンフルエントに達するまで培養した。その時点で、ＲｅＬｅＳＲＴＭ継代試薬（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞を新しいウェルに分割した。
【0093】
ＰＳＣ単層心臓分化。わずかな改変と共に上記のような小分子Ｗｎｔ調節戦略を使用して、分化を実行した。簡潔に述べると、分化細胞を、分化０～７日目からはＢ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリンを含むＲＰＭＩ １６４０中で維持し、分化７～１５日目からはＢ２７ＴＭサプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ １６４０中で維持した。細胞を、分化０日目に２４時間、１０μＭのＧＳＫ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ）で処理し、分化３～５日目から４８時間、２μＭのＰＯＲＣＮ阻害剤Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｓｅｌｌｅｃｋ）で処理した。代替の分化プロトコルは、Ｂｅｒｔｅｒｏら（"Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory." Nature Communications, Vol. 10, No. 1538, 2019）に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0094】
自己組織化ｈＨＯ分化。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＰＳＣを解離させ、球状体を形成させた。解離後、細胞を３００ｇで５分間遠心分離して、２μＭのＲＯＣＫ阻害剤チアゾビビン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地に再懸濁した。次いで、ｈＰＳＣを、Ｍｏｘｉ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｏｒｆｌｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて計数し、－２日目に丸底超低吸着９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１００００細胞／ウェルで播種した。次いで、プレートを、１００ｇで３分間遠心分離して、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベータに載置した。２４時間後（－１日目）、ウェルそれぞれから５０μｌの培地を注意深く除去し、２００μｌの新鮮なＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ培地を加え、最終体積２５０μｌ／ウェルとした。プレートをインキュベータにさらに２４時間戻した。０日目に、１６６μｌ（総ウェル体積の約２／３）の培地をウェルそれぞれから除去し、１６６μｌの、Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリン（Ｇｉｂｃｏ）を含み、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むＲＰＭＩ １６４０を最終濃度４μＭ／ウェルで、０．３６ｐＭ（１．２５ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ４および０．０８ｐＭ（１ｎｇ／ｍｌ）のＡｃｔＡと共に、２４時間加えた。１日目に、１６６μｌの培地を除去し、Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリンを含む新鮮なＲＰＭＩ １６４０で置き換えた。２日目に、Ｂ２７ＴＭサプリメントマイナスインスリンを含み、Ｗｎｔ－Ｃ５９ （Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むＲＰＭＩ １６４を加え、Ｗｎｔ－Ｃ５９の最終濃度を２μＭとし、サンプルを４８時間インキュベートした。培地を４日目および６日目に交換した。６日目に、培地を、Ｂ２７ＴＭサプリメント（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ １６４０で交換した。７日目に、第２の４μＭのＣＨＩＲ９９０２１曝露を、Ｂ２７ＴＭサプリメントを含むＲＰＭＩ １６４０中で１時間行った。その後、オルガノイドが分析できるようになるまで、４８時間ごとに培地を交換した。１１．１ｍＭのグルコースおよび５８ｎＭのインスリンを含む基礎ＲＰＭＩ培地を用いて、糖尿病状態をシミュレートし、３．５ｍＭのグルコースおよび１７０ｐＭのインスリンを含むコントロール培地と比較した。
【0095】
レンチウイルス形質導入。製造業者の指示に従って、ＺｙｍｏＰＵＲＥＴＭ ＩＩ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＦｌｉｐＧＦＰプラスミド（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ）をＬ１ ｉＰＳＣ株に形質導入した。ＨＥＫ２９３ｔをＤ１０培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ）中で培養し、後に還元血清ＯｐｔｉＭｅｍＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間スイッチした。リポフェクタミン混合物（室温で５分間静置した、１００μｌのリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋４ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍＴＭ）を、ＰＬＵＳＴＭ試薬混合物（２００μｌのＰＬＵＳＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋４ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍＴＭ＋２０μｇのレンチＣＲＩＳＰＲプラスミド＋１０μｇのｐＭＤ２．ｇｐＶＳＶｇ（またはｐＶＳＶｇｐＭＤ２．ｇ）＋１５μｇのｐｓＰＡＸ２）と混合し、次いでＨＥＫ２９３ｔ細胞に加え、３７℃で６時間インキュベートした。その後、抗菌薬を使用せずに、培地を３０ｍｌのＤ１０＋１％ＢＳＡ／フラスコに交換した。４８～６０時間後、培地を収集し、３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）に移し、卓上遠心機中、３２００ｇで３０分間、４℃で回転させた。フロースルーを取り除き、処理を繰り返した。濃縮ウイルスをアリコートし、－８０℃で保存した。ウイルスアリコートおよびポリブレン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３７℃で解凍した。ウイルスおよびポリブレンを、低程度～中程度のコンフルエントでｉＰＳＣ－Ｌ１に送達し、一晩インキュベートした。翌朝、培地を交換し、細胞を２４時間静置した。ピューロマイシンをウェルに加え、選別を約３～５日間続けた。生存しているクローンを収集し、再びプレーティングし、成長させた。
【0096】
免疫蛍光法。ｈＨＯを、オルガノイドへの破壊を避けるために切断した１０００μＬピペットチップを用いて、微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒド溶液（ＰＢＳに溶解）中で固定化した。固定化の後、ＰＢＳ－グリシン（２０ｍＭ）中で３回洗浄し、ブロッキング／透過処理溶液（１０％ロバ正常血清、０．５％ＴｒｉｔｏｎＴＭ Ｘ－１００、０．５％ＢＳＡ、ＰＢＳ中）中、熱ミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、４℃で一晩、３００ＲＰＭでインキュベートした。次いで、ｈＨＯをＰＢＳ中で３回洗浄し、抗体溶液（１％ロバ正常血清、０．５％ＴｒｉｔｏｎＴＭ Ｘ－１００、０．５％ＢＳＡ、ＰＢＳ中）中の一次抗体（表１を参照）で、熱ミキサー上で、４℃で２４時間、３００ＲＰＭでインキュベートした。一次抗体曝露の後、ＰＢＳ中で３回洗浄し、熱ミキサー上で、暗所の４℃で２４時間、３００ＲＰＭで、抗体溶液中の二次抗体（表１を参照）でインキュベートした。染色されたｈＨＯをＰＢＳ中で３回洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）ＶｉｂｒａｎｃｅＴＭ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ガラス顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にマウントした。９０μｍのＰｏｌｙｂｅａｄ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．）を、スライドとカバーガラス（番号１．５）との間に配置し、共焦点顕微鏡の透過能力に対応しながら、オルガノイドの三次元構造の一部を保存した。
【表1】
【0097】
共焦点顕微鏡法および画像解析。サンプルを２つの共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ａ１ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０ ＮＬＯ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて撮像し、Ｆｉｊｉ（ハイパーテキストトランスファープロトコル、ｉｍａｇｅｊ．ｎｅｔ／Ｆｉｊｉが保障）を用いて画像を解析した。オルガノイド中の組織領域を定量化するため、ＤＡＰＩ陽性細胞を用いて、それぞれのオルガノイド全体にわたる３つのｚ平面で、該当する対象細胞マーカーに対する正規化を行った。ＭａｘＥｎｔｒｏｐｙ閾値を用いてＰＥＣＡＭ１＋組織を測定し、ノイズを除去するために２５μｍ２未満を占めるあらゆる染色部位を廃棄した。
【0098】
ＲＮＡ－ｓｅｑおよびトランスクリプトーム解析。図６Ａに示すように、ｈＨＯ作製および分化のプロトコルを通じて１１の異なる時点で、ＲＮＡを抽出した。当該時点は、以下の通りである：０、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９日目。それぞれの時点で、８つのオルガノイドを除去し、すべてのサンプルが収集されるまで－２０℃でＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）に保存した。製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０４）に従って、ＲＮＥａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（登録商標）を用いてＲＮＡを抽出し、ＱｕｂｉｔＴＭ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＲＮＡの量を測定した。ＲＮＡサンプルをＭＳＵ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅに送り、サンプルの品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、続いてＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標） ＨｉＳｅｑ（登録商標） ４０００システムを使用するＲＮＡ－ｓｅｑを用いて、試験した。ＲＮＡ－ｓｅｑサンプル処理のために、Ｇａｌａｘｙにおいてパイプラインを作製した。簡潔に述べると、サンプルランの品質をＦＡＳＴＱＣで評価し、ＨＩＳＡＴ２を用いてｈｇ３８へのアラインメントを行った。ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを用いて総数を取得し、ＥｄｇｅＲを用いて差次的発現解析を行った。さらなる下流バイオインフォマティクス解析を、Ｐｈａｎｔａｓｕｓ １．５．１（ａｒｔｙｏｍｏｖｌａｂ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／Ｐｈａｎｔａｓｕｓ）およびＴｏｐｐＧｅｎｅにおいて行った。
【0099】
ＯＣＴ分析。図３に示すように、カスタマイズＳＤ－ＯＣＴ装置１００を作製し、心臓オルガノイドの三次元画像を取得した。ＳＤ－ＯＣＴシステム１００は、約１３２０ｎｍの中心波長および約１１０ｎｍのスペクトル範囲を有する広帯域照明を提供するための光源として、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）１０２（例えば、ＳＬＤ１３２５、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を備える。ＳＬＤ１０２の出力は、第１のアーム１０４を通ってファイバーカプラ１０６に送られる。ここで、出力は、５０／５０に分割され、サンプルアーム１０８および基準アーム１１０に送られる。サンプルアーム１０８において、光は、第１の偏光コントローラ１１２を透過し、第１のコリメータ１１４を透過し、第１のレンズ１１６および第２のレンズ１１８を透過して、ガルバノメータ１２０（例えば、ＧＶＳＭ００２－ＥＣ／Ｍ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）に至り、サンプル１２４上を横方向に、対物レンズ１２２を通して光ビームを走査する。基準アーム１１０において、光は、第２の偏光コントローラ１２６を透過し、第２のコリメータを透過し、ガラス１３０を透過し、第３のレンズ１３２を透過し、ミラー１３４に至る。ＳＤ－ＯＣＴシステム１００はまた、検出アーム１３６も備え、シグナルを第３のコリメータ１３８を通してカスタム設計された分光計１４０に通過させる。ここで、シグナルは、回折格子１４２および第４のレンズ１４４を介して、カメラ１４６に通過させられる。カメラ１４６は１０２４ピクセル線走査カメラ（ＳＵ１０２４－ＬＤＨ２、センサに制限は無い）であり得、解説格子１４２は１１４５線ペア／ｍｍ回折格子（１３１０ｎｍでのＨＤ １１４５線ペア／ｍｍ、Ｗａｓａｔｃｈ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）であり得、第４のレンズ１４４はｆ＝１００ｍｍのＦ－シータレンズ（ＦＴＨ１００－１０６４、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）であり得る。ＳＤ－ＯＣＴシステム１００の感度は、２０ｋＨｚのＡ走査速度で動作する場合、約１０４ｄＢとして測定される。ＳＤ－ＯＣＴシステム１００の軸方向分解能は、組織において約７ｍｍであると測定される。対物レンズ１２２に関しては、５Ｘ対物レンズ（５Ｘ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＮＩＲ、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）を使用して、約７ｍｍの横断画像解像度を達成し、心臓オルガノイド撮像に使用される走査範囲は約２ｍｍ×２ｍｍであった。ｈＨＯを、ＰＢＳを含む９６ウェルプレートに配置し、２０ｋＨｚのＡ走査速度で撮像した。得られた心臓オルガノイドのＯＣＴデータセットをまず処理して、補正されたスケールを有するＯＣＴ画像を生成した。次いで、スペックルノイズを低減するために、スペックル変調敵対的生成ネットワークを用いて、ＯＣＴ画像をさらに脱ノイズした。ＯＣＴ画像の三次元レンダリングを、Ａｍｉｒａソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実行した。
【0100】
光シート撮像および解析。自学開発のカスタマイズ高速軸方向掃引光シート蛍光顕微鏡を用いた。顕微鏡は、３つの内蔵レーザチャネル（４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、および５６１ｎｍ）および８３２ｘ８３２μｍのＦＯＶを有し、２つのカスタムメイドの多重浸漬高ＮＡ対物レンズ（１６Ｘ倍率、ＡＳＩ）およびｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ Ｚｙｌａ ４．２）を備える。固定化オルガノイド撮像は、サンプルをプレート皿に配置し、両面テープ（３Ｍ）で固定することによって、達成した。次いで、オルガノイドを水中に浸漬した。ＡＳＩコントロールステージは、オルガノイドサンプルを光シート焦点面に入れ、２つの対物レンズを水中に沈めて、撮像のための屈折率に適合させる。走査は、走査ステップ幅を１μｍに設定したＡＳＩコントロールボックスを用いて実行した。異なるレーザチャネルを有する３つの同一の走査を、１個のオルガノイドに適用した。捕捉後、ＩｍａｇｅＪを用いて蛍光画像を処理した。
【0101】
ＴＥＭサンプルの撮像および撮像。オルガノイドを４％ＰＦＡ中で３０分間固定化し、続いて水中で３回、それぞれ１０分間洗浄した。カコジル酸緩衝液（ｐＨ７．３）中の１％オスミウムテトロキシド中で、室温で６０分間、後固定化を実行した。オルガノイドを水中で２％アガロースに包埋し、操作のために氷を用いて固定化した。次いで、アセトンの連続希釈を、それぞれ１０分間、脱水（２５％、５０％、７５％、９０％、および１００％で３回）のために使用した。撹拌下で各３時間、樹脂のアセトン溶液１：３、２：２、および３：１に浸漬することによって、オルガノイドにＳｐｕｒｒ樹脂（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含浸させ、その後、１００％樹脂に２４時間包埋し、６０℃で一晩重合した。ＲＭＣ ＰＴＸＬ Ｌｅｉｃａ Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅを用いて超薄切片（５０～７０ｎｍ）を切断し、２００メッシュの炭素被覆銅グリッドに収集した。観察前に、すべてのサンプルを、２％酢酸ウラニルおよび１％クエン酸鉛でそれぞれ６分間および３分間、陽性染色した。グリッドは、ＪＥＯＬ １４００ Ｆｌａｓｈ透過型電子顕微鏡を用いて、１００ｋｅＶで検査した。
【0102】
電気生理現象。前述の自学開発のＭＥＡシステムを使用して、個々のオルガノイドの電気的活性を記録した。１５ｍＭのＨＥＰＥＳを補充した培養培地中のＰＤＭＳウェル内のＭＥＡ上に、生きたオルガノイドを配置した。ＭＥＡシステムへの損傷を避けるために、低湿度、３７℃のインキュベータ内のファラデーケージ内にＭＥＡを配置した。各オルガノイドを３０分間記録し、ＰＤＭＳウェルをオルガノイド間のＰＢＳで洗浄した。
【0103】
シーホース代謝分析。シーホースＸＦｐ分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、製造業者の指示に従って解糖速度アッセイを行った。それぞれのアッセイにおいて、ＳＴＥＭｄｉｆｆＴＭ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、１条件当たり３つのオルガノイドを別々に解離させた。
【0104】
データの入手可能性。本実施例に示されるすべてのオルガノイドデータセットは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙからアクセス番号ＧＳＥ１５３１８５で入手可能である。単層分化法２および胎児心臓のＲＮＡ－ｓｅｑをＧＳＥ１０６６９０から入手した。本実施例の間に生成および／または分析された他の情報すべては、本明細書に含まれる。
【0105】
統計解析。すべての解析は、ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて行った。すべてのデータは正規分布を示した。統計学的有意性は、適切ならば、標準的な対応のないスチューデントｔ検定（両側検定；Ｐ＜０．０５）を用いて評価した。多重比較分析では、適切ならば、ＴｕｋｅｙまたはＤｕｎｎｅｔｔの検定後補正を用いた一元配置分散が適用された（Ｐ＜０．０５）。すべてのデータは、平均±標準偏差として表され、特に明記しない限り、少なくとも３回の技術的反復を用いた最低３回の独立した実験を表す。
【0106】
〔結果〕
【0107】
Ｗｎｔシグナル伝達調節によって生成された自己組織化ｈＨＯ。本方法は、少なくとも４つの最初の管理点を満たすように設計された：（１）高いオルガノイドの品質および再現性；（２）ハイスループット／高含有量フォーマット；（３）相対的に単純（従来の細胞培養装置以外の特殊な装置を必要としない）；および（４）最も高い制御性について規定された化学的条件および下流の用途の多様性。本方法は、超低吸着９６ウェルプレート中で遠心分離して、続いて誘導前に３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートすることによって、ｈＰＳＣを胚様体に集合させることから開始する。他のインキュベーション時間（１２時間、２４時間）は、分化が開始すると、劣った結果を提供するので、このインキュベーションは、球状体の安定化を可能にし、効率を増加させるために重要である。誘導後、使用済み培地の２／３を除去し、それぞれの培地交換のために新鮮な培地と交換し、使用した様々なシグナルへの曝露を徐々に遷移させた。カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子であるＣＨＩＲ９９０２１（特異的なＧＳＫ－３阻害を介する）、およびＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤であるＷｎｔ－Ｃ５９（ＰＯＲＣＮ阻害を介する）への連続的曝露によって、中胚葉および心臓性中胚葉の誘導が達成された（図４Ａ）。ｈＨＯの明視野および免疫蛍光画像は、分化プロトコルを通してサイズが有意に増大したことを示す（図４Ｂ）。心筋細胞特異的なＴＮＮＴ２抗体で染色されたｈＨＯの共焦点顕微鏡観察は、オルガノイドが早くも７日目にサルコメアを発生させ始め（図４Ｂ）、１５日目までに容易に見える明確なサルコメア形成および繊維集合を有することを示している（図４Ｃ）。拍動するｈＨＯは、早くも分化プロトコルの６日目に出現し、１０日目までにすべてのサンプルに強固で規則的な拍動が出現した（第１および第２の動画は、拍動するｈＨＯを示すように製作された）。最初のＷｎｔ活性化のための最適条件を決定するために、０日目に２４時間、胚様体を様々な濃度のＣＨＩＲ９９０２１（４μＭ、６．６μＭ、および８μＭ）に曝露した。１５日目に、共焦点顕微鏡観察によって、心臓系統形成についてｈＨＯを評価した（図５Ａ）。試験したすべてのｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣ株についての最適な心臓性中胚葉の誘導は、心筋細胞単層分化プロトコルについて以前に報告された濃度よりも低いＣＨＩＲ９９０２１濃度で起こり、これは典型的には１０～１２μＭのＣＨＩＲの範囲である。４μＭのＣＨＩＲ９９０２１曝露が１５日目に６４±５％のＴＮＮＴ２＋細胞を含む最も高い心筋細胞含有量をもたらしたことに対して、６．６μＭおよび８μＭのＣＨＩＲ９９０２１ではそれぞれ９．６±５％および２．４±２％であった（図４Ｄおよび５Ａ）。この差はおそらく、発生中のｈＨＯにおける内因性モルフォゲン産生およびパラクリンシグナル伝達に起因するものであり、これは、オルガノイドの三次元環境および固有の自己組織化特性によって与えられたものである。４μＭのＣＨＩＲ９９０２１で処理されたｈＨＯはまた、３つの濃度のうち最良の機能的特性も示した（図５Ｂ～５Ｃ）。最初のｈＨＯ分化プロトコルは、複数のｈＰＳＣ株（ｉＰＳＣ－Ｌ１、ＡＩＣＳ－３７－ＴＮＮＩ１－ｍＥＧＦＰ、ｉＰＳＣＯＲＥ＿１６＿３、Ｈ９）にわたって、再現可能であった。種々のｈＰＳＣ株に由来するｈＨＯは、同様の分化効率、拍動距離およびサイズを示した（図４Ｅ～４Ｆ）。
【0108】
ｈＨＯにおける心外膜系統の制御誘導。オルガノイドの複雑さを増大させ、より発生的に関連する構造を作製するために、心外膜細胞の特異的誘導のために単層ｈＰＳＣ分化において成功裏に使用される方法を、適合および改変した。当該方法は、二次心臓系統を誘導するために、分化７～９日目にカノニカルＷｎｔシグナル伝達の第２の活性化を含む。この第２の活性化がｈＨＯを刺激して複雑さを増し、心臓発生をよりよく再現するかどうかを決定するために、７日目の第２のＣＨＩＲ９９０２１曝露の影響（図６Ａ）を試験した。ＣＨＩＲ９９０２１を、様々な濃度（２、４、６、および８μＭ）および曝露時間（１、２、１２、２４、および４８時間）で、発生中のｈＨＯに加えた。１５日目の十分に確立した心外膜（ＷＴ１、ＡＬＤＨ１Ａ２、ＴＪＰ１）および心筋細胞（ＴＮＮＴ２）マーカーの共焦点撮像および定量を用いて、心外膜細胞および心筋細胞の形成の効率を評価した（図６Ｂ～６Ｃおよび７Ａ～７Ｂ）。処理が、心外膜前駆細胞および心外膜細胞の形成を強力に促進することが分かった（図６Ｂ～６Ｄおよび７Ａ）。さらに、高濃度または長時間の曝露が、心外膜細胞以外の他の心臓細胞型の形成を著しく阻害し、特に心筋細胞形成に影響することが分かった。分化７日目に２μＭのＣＨＩＲ９９０２１で１時間、１回の処理を行うと、最も生理学的に関連する心外膜対心筋の比率（６０％心筋細胞、１０～２０％心外膜細胞）をもたらした（図６Ｂ～６Ｃおよび７Ｂ～７Ｃ）。構造的には、心外膜組織の大部分が、オルガノイドの外層上に、および、明確な心筋組織（ＴＮＮＴ２＋）に近接して、見出され（図６Ｄ）、したがって心臓に見出される構造的組織化を再現した。心外膜細胞膜上のＴＪＰ１の強力な発現もまた、これらの細胞の上皮表現型を確認した（図６Ｃ～６Ｄ）。
【0109】
トランスクリプトーム解析は、ｈＨＯがヒト胎児心臓発達に厳密にモデル化し、すべての主要な心臓細胞系統を産生することを明らかにする。発生段階およびオルガノイド中の細胞の分子同一性をより良く特徴付けるために、オルガノイド形成の異なる段階でトランスクリプトーム解析を実行した。分化の異なる時点（０～１９日目）でｈＨＯを収集した（図８Ａ～８Ｅ）。教師なしＫ－ｍｅａｎｓクラスタ分析は、オルガノイドが３つの主要な発生段階を進行することを明らかにした：多能性および初期中胚葉コミットメントに関連する０～１日目；初期心臓発生に関連する３～７日目；および、胎児心臓成熟に関連する９～１９日目（図８Ａおよび９Ａ～Ｅ）。遺伝子オントロジーの生物学的過程分析により、心血管の発生および心臓形成を促進する重要な遺伝子回路が同定された（図８Ａ：ＧＳＥ１５３１８５でＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）に寄託された生データ）。ｈＨＯにおける心臓発生を従前の方法の心臓発生と比較するために、十分に確立されたプロトコルを用いて、単層ｉＰＳＣ由来心臓分化細胞上のＲＮＡ－ｓｅｑを実行した。ＲＮＡ－ｓｅｑ結果を、以前に報告された単層心臓分化プロトコルおよびヒト胎児心臓組織（妊娠５７～６７日目）（ＧＳＥ１０６６９０）から公的に入手可能なデータセットと比較した。すべての場合において、ＦＨＦおよびＳＨＦ特異性を調節するｈＨＯ心臓発生転写因子発現は、単層ＰＳＣ由来心臓分化において観察されたものと同様であり、胎児心臓組織において観察されたものとよく一致した（図８Ｂおよび９Ａ）。興味深いことに、遺伝子発現プロファイルは、ｈＨＯが、とりわけ心外膜、内皮、心内膜および心臓線維芽細胞集団において、単層分化を受けた細胞よりも高い心臓細胞系統の複雑さを有することを示した（図８Ｃおよび９Ｂ～９Ｃ）。これらの結果は、ｈＨＯの構造的および細胞的複雑さが著しく向上し、したがってｈＨＯが胎児心臓と一致することを示唆する。このことは、遺伝子発現解析を拡張して、とりわけ、コンダクタンス、収縮機能、カルシウム処理および心臓代謝を含む、古典的な心臓機能に関与するいくつかの広範かつ重要な遺伝子クラスタを調べることによって、確認された（図８Ｄ）。特に興味深いことに、ｈＨＯは、かなりの量の心臓特異的細胞外マトリックス、胎児心臓に存在するが、単層分化プロトコルには完全には存在しない特徴を産生した（図８Ｄおよび９Ｄ）。主成分分析は、０～１９日目からのｈＨＯにおける発生の明確な進行を示した（図９Ｅ）。全体として、ｈＨＯは、胎児心臓のものと最もよく一致する個々の発現プロファイルを有し、全体的なｈＨＯトランスクリプトームは、階層的クラスタリングによって決定されたように、単層プロトコルのいずれよりも胎児心臓で観察されるものに類似していた（図８Ｅ）。
【0110】
ｈＨＯは、心臓領域の詳細ならびに心房および心室チャンバの形成を再現する。ＦＨＦおよびＳＨＦは、発生中の心臓において見出される２つの細胞集団である。ＦＨＦからの細胞は線状心臓管形成に寄与し、続いて、ＳＨＦに属する遊走細胞は、さらなる膨張およびチャンバ形成に寄与する。両方の心臓領域を表す細胞の証拠がオルガノイドで見出された。ＨＡＮＤ１（ＦＨＦ）およびＨＡＮＤ２（ＳＨＦ）は、発生中の心臓における多数の細胞型の調節において重要な役割を果たす塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子のＴｗｉｓｔファミリーの一員である。８日目のｈＨＯの免疫蛍光は、ＨＡＮＤ１（図１０Ａ）およびＨＡＮＤ２（図１０Ｄ）細胞のよく分化した分離領域を示しており、ＦＨＦおよびＳＨＦの両方の前駆細胞が存在し、それぞれの心臓領域に分離していることを示唆した。ヒト心臓において、左心室は最終的にＦＨＦ前駆細胞から形成され、心房はＳＨＦ前駆細胞から形成される。したがって、ｈＨＯが心房系統または心室系統のいずれかに関与する心筋細胞を含有するかどうかについて、決定を行った。１５日目のｈＨＯにおけるＭＹＬ２（ミオシン軽鎖－２、心室サブタイプをコードする）およびＭＹＬ７（ミオシン軽鎖２、心房サブタイプをコードする）の免疫蛍光は、両方のサブタイプについて心筋細胞陽性を示した。２つの異なる集団は、オルガノイドの異なる領域に局在し、極めて近接しており、ヒト心臓に見られる発現パターンを反映する（図１０Ｃ）。ｈＨＯにおけるＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２およびＭＹＬ７転写物の発現は、分化プロトコルを通して増加し、ヒト胎児心臓において観察されたものと同様であった一方、ＭＹＬ２はより低い程度まで増加した（図９Ａおよび９Ｃ）。コントラストのために培地にインディアインキを加え、光学顕微鏡を用いて拍動するオルガノイドを記録し、拍動する組織によって囲まれた中央のチャンバ様組織を観察した（第３の動画は、拍動する組織を示すために製作された）。まとめると、これらの結果は、ｈＨＯの分化には、心臓領域形成、チャンバの詳細、ならびに心房および心室サブ集団への心筋細胞の詳細が関与することを示唆しており、いずれもヒト心臓発生の再現性をさらに強調している。
【0111】
心臓オルガノイドは、多数の細胞心臓系統を産生し、心臓特異的形態学的機能を獲得する。トランスクリプトーム解析の結果（図８Ａ～８Ｅ）は、第２のＣＨＩＲ９９０２１曝露が他の間葉系統の形成およびｈＨＯのより高い複雑さにつながることを示唆している。この知見を評価するために、二次心臓細胞系統について免疫蛍光解析を行った。共焦点画像は、ＴＨＹ１およびＶＩＭについて陽性である心臓線維芽細胞の存在を確認し（図１１Ａ）、これは、文献に記載されている胎児心臓の組成と同様に、ｈＨＯにおける組織の１２±２％を占めた（図１１Ｅ）。さらに、共焦点画像は、内皮細胞（ＰＥＣＡＭ１＋）の強固な相互接続した網目構造、およびオルガノイド全体にわたる血管様形成を明らかにした（図１１Ｂ）。より高倍率の画像は、心筋組織に隣接するか、または埋め込まれている内皮細胞の複雑な網目を明らかにした（図１１Ｃ；第４の動画は、網目および心筋組織を示すように製作された）。共焦点画像スタックの三次元再構成は、ｈＨＯ組織に絡み合った良く接続された内皮網目構造を示した（第４の動画は網目構造を示し、第５の動画が製作され、これもまた網目構造を示した）。これらの結果は、ｈＨＯ発生中に、自己組織化内皮血管網目構造が三次元心血管環境に応答して出現し、オルガノイドに冠状動脈様血管網目構造を付加する（これまで観察されなかった現象）ことを強く示唆する。ＴＮＮＴ２＋内のチャンバ様領域が観察され、チャンバ様の性質を有し、初期心臓チャンバ形成を模倣することが疑われた。心内膜マーカーＮＦＡＴＣ１の免疫蛍光解析は、心臓の心内膜裏打ちと同様に、これらの空間を裏打ちするＮＦＡＴＣ１＋細胞の心内膜が形成されていることを明らかにした（図１１Ｄ）。図１１Ｅは、オルガノイドに対するこれらの種々の細胞集団の寄与の定量化を示す。次に、ＯＣＴを使用して、最小侵襲手段を使用してチャンバ特性を特徴付け、したがってチャンバの物理的特性および形態学的特性を保存した。ＯＣＴは、典型的にはオルガノイドの中心付近に１つまたは２つの大きなチャンバを有する、ｈＨＯ内の透明なチャンバ空間を示した（図１２Ａおよび１３Ａ～１３Ｃ）。内部ｈＨＯトポロジーの三次元再構成は、これらのチャンバ間の高度な相互接続性を明らかにした（第６、第７および第８の動画は、相互接続したチャンバを示すように製作された）。チャンバの存在は、全オルガノイドの光シート画像を用いてさらに確認された（図１２Ｂ）。心臓オルガノイドが比較的大きなサイズ（最大１ｍｍ）であることを考慮して、これらのチャンバの形成が内部細胞の死に関連し得るかどうかを検証した。検証を行うために、エフェクターカスパーゼ活性化時に蛍光し、したがってアポトーシスのレポーターである非蛍光人工ＧＦＰ変異体であるＦｌｉｐＧＦＰを発現するトランスジェニックｈｉＰＳＣ株を作製した。コントロール条件におけるＦｌｉｐＧＦＰオルガノイドは、蛍光を示さず、大規模なプログラムされた細胞死がないことを示した（図１３Ｄ）。この観察は、共焦点撮像中に観察される内部細胞残屑が欠如していることによって、さらに支持される（データは示されていない）。ドキソルビシン処理ｈＨＯをアポトーシスのポジティブコントロールとして使用すると（図１３Ｄ）、細胞死の明らかな証拠があった。
【0112】
ｈＨＯの超微細構造分析は、ミトコンドリアに囲まれた明確なサルコメア、ならびにギャップ結合およびＴ細管の存在といった、同齢のヒト胎児心臓において典型的に見出されるものと同様の特徴を示した（図１２Ｃ）。機能性を決定するために、電気生理学的活性を測定した。自学開発のマルチ電極アレイ（ＭＥＡ）センサ１５０の技術（図１４）を開発および使用して、ｈＨＯ１５２が、明確なＱＲＳ複合体ならびにＴ波およびＰ波、規則的な活動電位といった正常な電気生理学的活性を示すことを示した（図１２Ｄ）。図１４に示すように、ｈＨＯ１５２に適用されるＭＥＡセンサ１５０は、インキュベータ１５６内に配置されたファラデーケージ１５４内に配置される。記録ボード１５８は、ＭＥＡセンサ１５０からのシグナルをソフトウェアインタフェース１６０に中継する。
【0113】
ＢＭＰ４およびＡｃｔＡは、心臓オルガノイドチャンバ形成および血管新生を改善する。成長因子ＢＭＰ４およびＡｃｔＡは、初期胚性心臓性中胚葉を模倣し、インビボで心臓領域の詳細を決定する内因性モルフォゲンであるため、小分子Ｗｎｔシグナル伝達操作の選択肢として、頻繁に使用されている。ＢＭＰ４およびＡｃｔＡが、小分子Ｗｎｔ活性化／阻害プロトコルと組み合わせると、インビトロで心臓発生を再現するｈＨＯの能力を相乗的に改善し得ることが疑われた。最適化されたプロトコルの状況で、２つのモルフォゲンをそれぞれ１．２５ｎｇ／ｍｌおよび１ｎｇ／ｍｌ（文献に見られる推奨濃度）で、４μＭのＣＨＩＲ９９０２１と併せて分化０日目に加えることによって、ＢＭＰ４およびＡｃｔＡの効果を試験した。コントロールと処理ｈＨＯとの間で、心筋（ＴＮＮＴ２＋）または心外膜（ＷＴ１＋／ＴＪＰ１＋）組織の形成に有意な差は見られなかった（図１５Ａ）。しかしながら、オルガノイドのサイズには有意な差が観察され、成長因子で処理したｈＨＯは、直径が約１５％大きかった（図１５Ｂ～１５Ｃ）。この差は、マイクロチャンバの数および接続性の増加と一致する可能性があり、ＢＭＰ４／ＡｃｔＡ処理ｈＨＯは、コントロールｈＨＯと比較して、約５０％超が他のチャンバと相互接続されているマイクロチャンバをより多く有した（図１５Ｄ～１５Ｅおよび１５Ｇ）。ＢＭＰ４およびＡｃｔＡで処理したオルガノイドの免疫蛍光および共焦点分析は、ＰＥＣＡＭ１＋組織の面積が４００％増加したことを示し、オルガノイド血管形成に対する重要な影響を示しており（図１５Ｆおよび１５Ｈ）、これはまた、ｈＨＯサイズの増大も説明できる。
【0114】
ｈＨＯを用いたＤＤＰ誘導ＣＨＤのモデリング。システムの有用性に関する概念実証として、心臓発生に対するＤＤＰの効果を調査するために、ｈＨＯモデルを使用することを決定した。糖尿病は、出産年齢の女性集団の大多数に影響を及ぼし、妊娠最初の３ヶ月間の糖尿病をＣＨＤのリスク増加（最大１２％、場合によっては１２倍の増加）と関連づける顕著な疫学的証拠があるものの、根底にあるメカニズムについてはほとんど解明されていない。調査を行うために、ｈＨＯ培養条件を、グルコースおよびインスリンの報告された正常な生理学的濃度（３．５ｍＭグルコース、１７０ｐＭインスリン、ＮＨＯ）、ならびに報告された糖尿病条件（１１．１ｍＭグルコースおよび５８ｎＭインスリン、ＤＤＰＨＯ）を反映するように改変した。興味深いことに、正常条件もまた、元々のプロトコルの血糖およびインスリン条件とは異なっていた（ほとんどの培地が、本来はがん細胞培養のために開発され、異常に高い濃度のグルコースを含むため）。ＮＨＯは、より高血糖の対象物より遅いペースで発生したが、より良好な物理的組織化を示し、心臓の管状構造の形成、および、その後の、心臓のループおよびチャンバ形成を連想させる種々の明確な領域へのセグメンテーションを示したが（図１７Ａ）、細胞死または異常な生理機能の証拠は示さなかった（図１６Ａ～１６Ｈおよび１７Ａ～１７Ｆ）。しかしながら、それらの構造はまた、著しく繊細でもあり、容易に損傷し得た（図１６Ａ）。ＮＨＯおよびＤＤＰＨＯは、早くも分化４日目に有意な形態学的差異を示した。ＮＨＯは成長がより遅く、４～８日目にパターン形成および伸長を示した一方、ＤＤＰＨＯは２週間にわたって球状を維持した（図１６Ａ）。ＤＤＰＨＯはまた、１週間の分化後にもサイズが有意により大きく（図１６Ｂ）、肥大、すなわち、典型的にはすべての臓器において巨人症に罹患している新生児における糖尿病の一般的な転帰を示唆している。電気生理学的分析は、ＤＤＰＨＯにおける活動電位の振幅および周波数の増加を示し（図１６Ｃおよび１７Ｂ～１７Ｄ）、糖尿病性オルガノイドにおけるより高い活性を示唆した。解糖および酸素消費についての代謝アッセイは、ＮＨＯと比較した場合、ＤＤＰＨＯにおける酸素消費速度の低下、および解糖の増加を示した（図１６Ｂ、１６Ｅおよび１７Ｅ）。ＴＥＭ画像は、ＤＤＰＨＯがサルコメアを囲むミトコンドリアの数が減少し（図１６Ｆ）、脂質滴の数が有意に多いことを明らかにし、機能不全の脂質代謝を示唆した。これらの表現型はいずれもＮＨＯには見られなかった。心筋および心外膜マーカーの共焦点顕微鏡観察は、形態学的組織化において劇的な差異を示し、予想された通り、ＤＤＰＨＯは心筋組織に囲まれた心外膜組織を含んでいたのに対して、ＮＨＯは心筋組織の頂部または横に心外膜組織を含んでいた（図１６Ｇ）。さらに、正常な血糖条件と比較すると、糖尿病性ｈＨＯはＭＹＬ２＋心室心筋細胞の減少およびチャンバの拡大を示し、やはり拡張型心筋症様表現型を示唆した（図１６Ｈ）。ＤＤＰＨＯにおける構造的／発生的組織化の障害および脂質代謝におけるこれらの差異は、高グルコース／インスリンに曝露された糖尿病患者および新生児に見られる予想される表現型と一致する。以上を総合すると、データは、ＮＨＯとＤＤＰＨＯとの間の有意な分子的および代謝的混乱が、酸化的ストレスの増大、心筋症および脂質プロファイルの変化を示唆するＤＤＰに関する以前の研究と一致することを示唆しており、ヒトオルガノイドにおける代謝障害をモデル化するための重要な一歩を構成する。
【0115】
〔考察〕
【0116】
近年、ｈＰＳＣ由来心筋細胞は、心臓発生、ヒト遺伝性心疾患、治療的スクリーニングおよび心毒性試験の態様をモデリングするための極めて有益な手段となっている。それにもかかわらず、ヒト心臓中に存在する複雑な構造形態および多数の組織の種類は、現行のインビトロモデルに厳しい制限を課している。三次元心臓組織を生成するためのこれまでの試みは、典型的には心筋細胞、および１つまたは２つの他の心臓細胞系統のみを含んだ。ここでは、高度に再現性があり、拡張性があり、新規な分化プロトコルであって、ｈＰＳＣを用いて、高度な構造的および多細胞型の複雑さを有する生理学的に関連するｈＨＯを生じるプロトコルを作製することが望まれた。ＧＳＫ－３およびＰＯＲＣＮ阻害剤を使用するカノニカルＷｎｔシグナル伝達のための多段階操作条件を作成し、最適化した。これらの条件は、胎児心臓と同様の特性を有する自己組織化心臓オルガノイドにおける、ほとんどの心臓系統の形成をもたらす。この方法は、約５９％の心筋細胞、１５％の心外膜細胞、１３％の心内膜細胞、１２％の心臓線維芽細胞、および１％の内皮細胞（面積基準）から構成される心臓オルガノイドを一貫して生じ、分化開始から１週間以内に全組織にわたって強い拍動を示す。ＨＡＮＤ１およびＨＡＮＤ２系統由来の細胞は心筋、心外膜、心内膜および血管系の発達に寄与するので、これらの細胞型の組織化および詳細は、少なくとも部分的にはＨＡＮＤ転写因子発現によって制御される可能性が高い。ＦＨＦおよびＳＨＦ両方のＨＡＮＤマーカーが存在するという事実は、それらが、ｈＨＯにおいて見られる構造的および細胞型の複雑さの発達に関与していることを示唆している。特に、ｈＨＯは、３つの独立したｉＰＳＣ株および１つのＥＳＣ株から首尾よく誘導され、再現性を実証した。心筋細胞の胎児様形態およびｈＨＯの自己組織化特性は、様々な心臓組織間のより高次の相互作用を可能にする多数の心臓細胞系統を含む複雑な三次元構造を示唆する。従来の心筋細胞単層分化法と比較すると、ｈＨＯは、コンダクタンス、収縮機能、カルシウム処理、および種々の心臓細胞集団に関連する遺伝子のより高い発現を示し、これは、ヒト胎児心臓から得られた遺伝子発現データによりよく類似する。ヒト胎児心臓組織に高度に再現される複雑なトランスクリプトームの描写は、ヒト心臓発生のモデルとしてのｈＨＯの複雑さおよび妥当性をさらに補強する。
【0117】
ヒト心臓を包み込む上皮である心外膜は、心臓の発生、代謝、脂質ホメオスタシス、および心筋損傷応答を含む多くの心臓プロセスに関与している。心外膜シグナル伝達カスケードは、心臓系統の詳細に不可欠である。胚発生の間、胚性細胞の心臓外クラスタである心外膜前駆器官（ＰＥＯ）からの細胞は、心臓の表層に遊走して、心外膜を形成する。これらの細胞のいくつかは、ＥＭＴを経て、心臓線維芽細胞を含む他の心臓系統を生成することができる。心筋との伝達能力および幹細胞集団を移動させる能力に起因して、心外膜は、心臓再生および修復における研究の重要な焦点となっている。心外膜はまた、糖尿病性心筋症、冠状動脈疾患およびメタボリックシンドロームを含む、複数の種類の心血管疾患および代謝疾患において、基礎的であるが未だ探求されていない役割も果たす。この最後の状況において、心外膜由来脂肪は、大きな膨張を起こし、罹病率と強く相関し、ヒト疾患に対する心外膜の潜在的関連性を強調する。これまでの心外膜分化法に着想を得て、心筋組織に近接する心外膜組織の明確な領域を有する心臓オルガノイドを生成するための条件を作成し、最適化した。これらの心外膜－心筋相互作用は、哺乳動物の心臓発生および機能において重要であり、心外膜細胞は、三次元人工心臓組織（ＥＨＴ）における心筋細胞成長を増進させ、また、両方の細胞型をラット心臓に共移植すると、内皮細胞産生が増大する。本明細書に記載されているｈＨＯプロトコルは、インビトロにおける生理学的に関連する心外膜－心筋相互作用の研究およびモデル化を容易にするであろう。
【0118】
心臓線維芽細胞が心臓発生および心臓マトリックス産生／組織化において果たす重要な役割は、インビトロモデルにおいて見落とされることが多い。胚発生における心臓線維芽細胞の大部分は、ＰＥＯから生じ、発生心臓モデルにおける心外膜誘導の必要性を強調する。これらの線維芽細胞は、ｈＰＳＣ由来の三次元心臓微小組織における心筋細胞の機能性を促進し、そのため、任意のインビトロヒト心臓モデルにおいてそれらが含まれることが最も重要である。ｈＨＯの免疫蛍光解析は、細胞－細胞および細胞マトリックス接着に関与する膜糖タンパク質Ｔｈｙ１、および間葉系統の細胞に典型的に見られる中間体フィラメントタンパク質ビメンチンを含む心臓線維芽細胞マーカーの存在を明らかにした。ＥＭＴに重要な役割を果たすＤＤＲ２、および発生中の血管新生にも重要であるＦＨＦマーカーＰＤＧＦＲαを含む、他の心臓線維芽細胞マーカーは、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析によってｈＨＯ中に見出された。これらの結果は、ｈＨＯシステムの複雑さが増加したこと、および胎児心臓組織との密接な類似性を強く示唆する。
【0119】
多くのオルガノイドシステムの深刻な制限は、栄養素の交換および老廃物の除去を促進するための機能的血管網が欠如していることであり、その代わりに、交換および除去は拡散のみに依存している。いくつかの血管新生オルガノイドは、脳、腎臓および血管をモデル化する文献に記載されているが；心臓オルガノイドに記載されているものはない。これらの研究において、血管新生を誘導するために、マウスへの移植、流動下でのオルガノイドの培養、ならびに、内皮細胞のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）／コラーゲンマトリックスへの包埋、および血管網目構造を作り出すための内皮細胞遊走の誘導を含む、様々な技術が使用される。注目すべきことに、ｈＨＯの最終的なプロトコルでは、いかなる追加の工程も無しに、強固で相互接続された脈管脈叢の形成が観察された。
【0120】
血管系に加えて、胎児様オルガノイド形成の再現を示す強力な三次元特徴である、相互接続されたチャンバへの自発的ｈＨＯ再構成も観察された。インビトロでのマイクロチャンバ形成のこれまでの研究は、細胞を含まない領域、筋線維芽細胞周辺部および新生小柱を有する三次元心臓マイクロチャンバを形成するために、限られた領域へのｈＰＳＣのマイクロパターン化を利用した。他の報告は、三次元バイオプリントされたｈＰＳＣを含む足場を作製し、それらを、２つのチャンバを含む拍動する心臓微小組織に分化させていた。これらの研究において生成された構造は、心臓マイクロチャンバのいくつかの胎児様形成を示した一方で、それらは、心臓成熟および形態形成において重要なプレーヤーである心内膜組織を欠いていた。ここで報告されたｈＨＯは、ＯＣＴ断面画像に見られる（第６、第７および第８の動画に見ることができる）ように、相互接続されたＮＦＡＴＣ１＋心内膜細胞で裏打ちされた多数のマイクロチャンバを形成する。ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＦＢＮ１、ＥＭＩＬＩＮ１、ＨＳＰＧ２およびＬＡＭＡ２（図９Ｄ）などの、胎児心臓マトリックスに似たｈＨＯにおける特異的ＥＣＭ遺伝子の発現は、チャンバ組織化における重大な因子である可能性があり、ＥＣＭ成分はチャンバ化されたマウス心臓オルガノイドの形成を媒介することが示されている。したがって、ｈＨＯにおけるこれらの遺伝子の発現は、将来さらに調査されるべきである。マイクロチャンバはまた、心房様および心室様領域にさらに特定し得、両方の系統由来の心筋細胞がｈＨＯ中の別々の領域に見られる。
【0121】
カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路を操作する小分子阻害剤の使用と共に、ＢＭＰ４およびＡｃｔＡなどのモルフォゲンを使用して、心筋細胞分化の成功が過去に達成されている。これらの成長因子は、胚における心臓中胚葉の誘導をもたらし、それらを用いる確立された分化プロトコルは、様々な心臓中胚葉前駆体への効果的な分化を示す。近年、ＦＨＦおよびＳＨＦ形成の詳細において、特定濃度のＢＭＰ４およびＡｃｔＡへの勾配曝露が研究されている。ｈＨＯ分化プロトコルにおける最初のＣＨＩＲ曝露へのこれらの成長因子の追加は、マイクロチャンバの相互接続性および血管新生の増加などの、形態学的特徴の改善をもたらした。
【0122】
ここ数年間、三次元ヒト心臓組織は、遺伝的および非遺伝的状態（心筋梗塞、薬物心毒性）をモデル化するために使用されてきた。本実施例は、ｈＨＯが、十分に研究されていない医学的課題である、ＤＤＰにおけるＣＨＤを研究するための貴重なモデルであり得ることを示している。妊娠糖尿病は、新生児ＣＨＤの最も一般的な原因の１つである（糖尿病の母親からの新生児の最大１２％が何らかの形態のＣＨＤを有する）。分化培地におけるグルコースおよびインスリンの健常濃度および糖尿病性濃度を用いて、ｈＨＯの発生過程に及ぼす糖尿病条件の影響を実証した。健常条件で発生したオルガノイドは、パターン形成を含む活発な構造変化を示したが、糖尿病条件におけるｈＨＯは、より大きく球状に発生した。この知見は、心臓管を適切に形成する初期心臓の能力に対する影響に対するヒントであり、心臓管が４つのチャンバへとループするにつれて、心臓の奇形につながる。さらに、糖尿病性ｈＨＯのサイズが大きいことは、妊娠ＤＤＰの特徴である心肥大の初期徴候を示唆する。ミトコンドリアの明らかな減少、脂質代謝の機能不全、および主要な組織型の構造的組織化の障害は、ＤＤＰにおけるＣＨＤの病因を解明するヒントである。今後の研究では、このオルガノイド分化プロトコルを利用して、これらの機能不全および奇形を調査し、治療薬の潜在的標的のハイスループットスクリーニングを実施する。要約すると、本実施例は、発生中のヒト胎児心臓のものを厳密に再現する多細胞型および形態学的複雑さを有する、高度に再現可能でハイスループットのｈＨＯ誘導法を記載する。このモデルは、ヒト心臓の発生および先天性心臓欠損の病因を研究するための貴重な手段である。さらに、洗練され改善された成熟プロトコルは、心毒性スクリーニングおよび心血管関連疾患などの成人心臓設定のモデル化を可能にし得る。
【0123】
実施形態の前述の説明は、例示および説明のために提供されている。網羅的であること、または本開示を限定することは意図されていない。特定の実施形態の個々の要素または特徴は一般に、その特定の実施形態に限定されないが、適用可能である場合、交換可能であり、具体的に図示または説明されない場合であっても、選択された実施形態において使用され得る。同じものがまた、多くの様式で変更され得る。このような変形は、本開示からの逸脱とみなされるべきではなく、すべてのこのような改変は本開示の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0124】
【図4A】図４Ａ～４Ｆは、本技術の様々な態様に係るヒト心臓オルガノイド（ｈＨＯ）におけるＷｎｔシグナル伝達指向性心筋細胞分化を示すデータを提供する。図４Ａは、胚様体においてＴＮＮＴ２＋心筋細胞を分化させるために使用されるプロトコルを示す模式図である。ＣＨＩＲ９９０２１は、０日目で変化する。
【図4B】図４Ａ～４Ｆは、本技術の様々な態様に係るヒト心臓オルガノイド（ｈＨＯ）におけるＷｎｔシグナル伝達指向性心筋細胞分化を示すデータを提供する。図４Ｂは、０～１５日目（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）からの、１５日間にわたる分化の発生オルガノイドの明視野画像（上段）、および、１日当たり３つの代表的なオルガノイドのＤＡＰＩ（青色）およびＴＮＮＴ２（赤色）についての共焦点免疫蛍光画像を示す。
【図4C】図４Ａ～４Ｆは、本技術の様々な態様に係るヒト心臓オルガノイド（ｈＨＯ）におけるＷｎｔシグナル伝達指向性心筋細胞分化を示すデータを提供する。図４Ｃは、４μＭのＣＨＩＲを用いて分化させた１５日目のオルガノイドにおけるＤＡＰＩ（青色）およびＴＮＮＴ２（赤色）についての共焦点免疫蛍光画像を示し、サルコメアバンド（スケールバー：２５μｍ）を示す。
【図4D】図４Ａ～４Ｆは、本技術の様々な態様に係るヒト心臓オルガノイド（ｈＨＯ）におけるＷｎｔシグナル伝達指向性心筋細胞分化を示すデータを提供する。図４Ｄは、複数のｚ平面で取られたオルガノイド内の心筋細胞領域の面積解析を、３つのＣＨＩＲ９９０２１濃度それぞれについて、オルガノイドそれぞれのＤＡＰＩ＋領域に対するＴＮＮＴ２＋領域の割合として示す（４μＭのＣＨＩＲ９９０２１処理についてはｎ＝１０、６．６μＭおよび８μＭについてはｎ＝６）。
【図4E】図４Ａ～４Ｆは、本技術の様々な態様に係るヒト心臓オルガノイド（ｈＨＯ）におけるＷｎｔシグナル伝達指向性心筋細胞分化を示すデータを提供する。図４Ｅは、ｈＨＯの共焦点画像におけるＤＡＰＩ＋領域に対して正規化されたＴＮＮＴ２＋領域の割合を示すグラフである。
【図4F】図４Ａ～４Ｆは、本技術の様々な態様に係るヒト心臓オルガノイド（ｈＨＯ）におけるＷｎｔシグナル伝達指向性心筋細胞分化を示すデータを提供する。図４Ｆは、３つの誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株および１つの胚性幹細胞（ＥＳＣ）株における拍動頻度を示すグラフである。
【図5A】図５Ａ～５Ｃは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおけるＷｎｔシグナル伝達指向性心筋細胞分化を示すさらなるデータを提供する。図５Ａは、１５日目、ＣＨＩＲ９９０２１曝露濃度が４μＭ（上段）、６．６μＭ（中段）および８μＭ（下段）のオルガノイドにおけるＤＡＰＩ（青色）およびＴＮＮＴ２（赤色）についての共焦点免疫蛍光画像を示す（スケールバー：５００μｍ）。
【図6A】図６Ａ～６Ｄは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおいて、第２のＣＨＩＲ曝露が心外膜細胞分化を導くことを示すデータを提供する。図６Ａは、ｈＨＯにおいてＴＮＮＴ２＋心筋細胞およびＷＴ１＋／ＴＪＰ１＋心外膜細胞を分化させるために使用される改変プロトコルを示す模式図である。
【図6B】図６Ａ～６Ｄは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおいて、第２のＣＨＩＲ曝露が心外膜細胞分化を導くことを示すデータを提供する。図６Ｂは、複数のｚ平面で取られたオルガノイド内の心筋細胞領域（ＴＮＮＴ２＋）および心外膜領域（ＷＴ１＋およびＴＪＰ１＋）の面積解析を、オルガノイドそれぞれのＤＡＰＩ＋領域の割合として示す（各条件当たりｎ＝７）。
【図6C】図６Ａ～６Ｄは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおいて、第２のＣＨＩＲ曝露が心外膜細胞分化を導くことを示すデータを提供する。図６Ｃは、７日目に第２のＣＨＩＲ曝露を様々な濃度で行った、ＤＡＰＩ（青色）、ＷＴ１（緑色）、ＴＮＮＴ２（赤色）およびＴＪＰ１（白色）についての分化１５日目のｈＨＯの共焦点免疫蛍光画像を、第２のＣＨＩＲ曝露なしのコントロール（スケールバー：５００μｍ）に対して、示す。
【図6D】図６Ａ～６Ｄは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおいて、第２のＣＨＩＲ曝露が心外膜細胞分化を導くことを示すデータを提供する。図６Ｄは、２μＭの第２のＣＨＩＲ曝露を行ったｈＨＯの高倍率画像を示し、ＴＮＮＴ２＋心筋組織およびＷＴ１＋／ＴＪＰ１＋心外膜組織の近接領域（スケールバー：５０μｍ）を示す。
【図7A】図７Ａ～７Ｃは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおいて、第２のＣＨＩＲ曝露が心外膜細胞分化を導くことを示すさらなるデータを提供する。図７Ａは、ｈＨＯにおけるＤＡＰＩ（青色）およびＴＮＮＴ２（赤色）についての共焦点免疫蛍光画像を示し、オルガノイドの端部付近の心外膜マーカーＡＬＤＨ２Ａ（緑色）およびＴＰＪＰ１（白色）を示す。
【図7B】図７Ａ～７Ｃは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおいて、第２のＣＨＩＲ曝露が心外膜細胞分化を導くことを示すさらなるデータを提供する。図７Ｂは、７日目に種々の持続時間でＣＨＩＲ９９０２１を用いて処理されたオルガノイドそれぞれのＤＡＰＩ＋領域の割合としての、複数のｚ平面で取られたオルガノイド内の心筋細胞領域（ＴＮＮＴ２＋）および心外膜領域（ＷＴ１＋およびＴＪＰ１＋）の面積解析である。
【図7C】図７Ａ～７Ｃは、本技術の様々な態様に係るｈＨＯにおいて、第２のＣＨＩＲ曝露が心外膜細胞分化を導くことを示すさらなるデータを提供する。図７Ｃは、これらの持続時間からのオルガノイドの代表的な共焦点免疫蛍光画像を示す（スケールバー：５００μｍ）。
【図8A】図８Ａ～８Ｅは、トランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図８Ａは、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）による心臓オルガノイドトランスクリプトームのＫ－ｍｅａｎｓクラスタ分析を示す。胎児の心臓発生と強く関連するクラスタ（例えば、２、１０および１４）は、９日目以降に現れる。パスウェイエンリッチメント解析もまた、代表的な心臓特異的クラスタについて提供される（下段）。
【図8B】図８Ａ～８Ｅは、トランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図８Ｂは、心臓オルガノイド分化過程における第１および第２の心臓領域マーカー（それぞれ、ＦＨＦおよびＳＨＦ）の遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。
【図8C】図８Ａ～８Ｅは、トランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図８Ｃは、心外膜細胞、線維芽細胞、心内膜細胞、および内皮細胞を含む、心臓オルガノイドにおける心臓特異的細胞型集団についての遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。
【図8D】図８Ａ～８Ｅは、トランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図８Ｄは、妊娠５７～６７日目における、心臓オルガノイド、単層分化法、および胎児心臓にわたる心臓機能に関与する主要遺伝子の正規化された比較を示す。
【図8E】図８Ａ～８Ｅは、トランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図８Ｅは、心臓オルガノイド、単層分化、および胎児心臓の階層的クラスタ解析を示す。
【図9A】図９Ａ～９Ｅは、別のトランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図９Ａは、遺伝子発現解析を示しており、心臓オルガノイド分化過程よりも多くのＦＨＦおよびＳＨＦマーカーを示す。
【図9B】図９Ａ～９Ｅは、別のトランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図９Ｂは、（左上から右下へ）心内膜細胞、心外膜細胞、内皮細胞、および心臓線維芽細胞を含む、心臓オルガノイドにおける心臓特異的細胞型集団についての遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。
【図9C】図９Ａ～９Ｅは、別のトランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図９Ｃは、心筋細胞マーカーについての遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。
【図9D】図９Ａ～９Ｅは、別のトランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図９Ｄは、心臓組織に存在するＥＣＭタンパク質コード遺伝子についての遺伝子発現解析（ｌｏｇ２倍率変化対Ｄ０）を示す。
【図9E】図９Ａ～９Ｅは、別のトランスクリプトーム解析を示しており、本技術の様々な態様に従って製造された心臓オルガノイドが胚性胎児心臓と同様の多細胞型の複雑さ、発生および成熟段階を再現することを示す。図９Ｅは、経時的な心臓オルガノイド分化の主成分分析を示す。
【図10A】図１０Ａ～１０Ｃは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯにおける心臓領域の発生および心筋細胞の詳細を示す画像である。分化８日目のｈＨＯの共焦点免疫蛍光画像は、強固なＨＡＮＤ１（図１０Ａ）およびＨＡＮＤ２（図１０Ｂ）転写因子発現（緑色）、ＴＮＮＴ２（赤色）、およびＤＡＰＩ（青色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。
【図10B】図１０Ａ～１０Ｃは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯにおける心臓領域の発生および心筋細胞の詳細を示す画像である。分化８日目のｈＨＯの共焦点免疫蛍光画像は、強固なＨＡＮＤ１（図１０Ａ）およびＨＡＮＤ２（図１０Ｂ）転写因子発現（緑色）、ＴＮＮＴ２（赤色）、およびＤＡＰＩ（青色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。
【図10C】図１０Ａ～１０Ｃは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯにおける心臓領域の発生および心筋細胞の詳細を示す画像である。図１０Ｃは、１５日目のｈＨＯの共焦点免疫蛍光画像を示しており、十分に分化した心室領域（ＭＹＬ２、緑色）および心房領域（ＭＹＬ７、赤色）およびＤＡＰＩ（青色）を含む（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。
【図11A】図１１Ａ～１１Ｅは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯの心臓細胞系統組成に関するデータを提供する。図１１Ａ～１１Ｄには、ｈＨＯを構成する様々な細胞系統の免疫蛍光画像が示される。図１１Ａは、ｈＨＯ全体に存在する心臓線維芽細胞マーカーＴＨＹ１（緑色）およびＶＩＭＥＮＴＩＮ（ホワイト）、ＴＮＮＴ２＋（赤色）、ならびにＤＡＰＩ（青色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。
【図11B】図１１Ａ～１１Ｅは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯの心臓細胞系統組成に関するデータを提供する。図１１Ａ～１１Ｄには、ｈＨＯを構成する様々な細胞系統の免疫蛍光画像が示される。図１１Ｂは、オルガノイド全体にわたる血管の画定されたネットワークを示す内皮細胞マーカーＰＥＣＡＭ１（緑色）、ならびに隣接するＴＮＮＴ２＋（赤色）組織およびＤＡＰＩ（青色）を示す（スケールバー：５００μｍ）。
【図11C】図１１Ａ～１１Ｅは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯの心臓細胞系統組成に関するデータを提供する。図１１Ａ～１１Ｄには、ｈＨＯを構成する様々な細胞系統の免疫蛍光画像が示される。図１１Ｃは、ＴＮＮＴ２＋心筋組織に極めて近接するＰＥＣＡＭ１＋内皮組織の６０倍拡大図を示す（スケールバー：５０μｍ）。
【図11D】図１１Ａ～１１Ｅは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯの心臓細胞系統組成に関するデータを提供する。図１１Ａ～１１Ｄには、ｈＨＯを構成する様々な細胞系統の免疫蛍光画像が示される。図１１Ｄは、ＴＮＮＴ２＋（赤色）組織のマイクロチャンバ内で高度に発現された心内膜マーカーＮＦＡＴＣ１（緑色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。
【図11E】図１１Ａ～１１Ｅは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯの心臓細胞系統組成に関するデータを提供する。図１１Ｅは、ＩｍａｇｅＪを用いてオルガノイド面積全体の割合として計算された、ｈＨＯにおける平均細胞組成の円グラフである。
【図12A】図１２Ａ～１２Ｄは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯのマイクロチャンバ形成、超微細構造、および電気生理現象を示す。図１２Ａは、光コヒーレンストモフラフィー（ＯＣＴ）画像を示しており、マイクロチャンバを明らかにするオルガノイドの断面を示す（スケールバー：５００μｍ）。
【図12B】図１２Ａ～１２Ｄは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯのマイクロチャンバ形成、超微細構造、および電気生理現象を示す。図１２Ｂは、チャンバ構造（スケールバー：５００μｍ）を明らかにするＡＦ４８８二次抗体を用いてＴＮＮＴ２について染色したｈＨＯのライトシート画像を示す。
【図12C】図１２Ａ～１２Ｄは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯのマイクロチャンバ形成、超微細構造、および電気生理現象を示す。図１２Ｃは、ｈＨＯの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示しており、小胞体（ＥＲ）、ギャップ結合（Ｇｊ）、グリコーゲン顆粒（Ｇｙ）、脂質滴（Ｌｄ）、ミトコンドリア（Ｍｉ）、核（Ｎ）、およびサルコメア（Ｓ）を示す（左側のスケールバー：２μｍ、右側のスケールバー：１μｍ）。
【図12D】図１２Ａ～１２Ｄは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯのマイクロチャンバ形成、超微細構造、および電気生理現象を示す。図１２Ｄは、１５秒間にわたるマイクロ電極アレイ（ＭＥＡ）上のオルガノイド（左側）および代表的な活動電位波（右側）の電気生理現象の記録を示す。
【図13C】図１３Ａ～１３Ｄは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関連するデータを提供する。図１３Ｃは、中央チャンバを明らかにする９つの異なるオルガノイドの中心の断面を示すＯＣＴ画像を提供する（スケールバー：５００μｍ）。
【図13D】図１３Ａ～１３Ｄは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関連するデータを提供する。図１３Ｄは、ＦｌｉｐＧＦＰトランスジェニックｉＰＳＣ－Ｌ１株に由来するオルガノイドの免疫蛍光画像を提供し、コントロールｈＨＯにおいてはアポトーシスを示さず（左側）、５μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ）で処理したｈＨＯにおいては高いアポトーシスを示す（右側）（スケールバー：５００μｍ）。
【図14】図１４は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チャンバ内の金電極アレイを示すＭＥＡ記録システムの説明図である。ここで、本技術の心臓オルガノイドは、インキュベータ内のファラデーケージ内に配置されている。
【図15A】図１５Ａ～１５Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関して、心臓の分化および発生に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の影響を示す。図１５Ａ～１５Ｈはすべて、ＣＨＩＲ単独で分化したｈＨＯ（コントロール）およびＣＨＩＲ＋ＢＭＰ４＋ＡｃｔＡで分化したｈＨＯ（処理）を比較する。図１５Ａは、総オルガノイド面積の割合として、心筋細胞および心外膜陽性領域の面積を示すグラフである。
【図15B】図１５Ａ～１５Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関して、心臓の分化および発生に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の影響を示す。図１５Ａ～１５Ｈはすべて、ＣＨＩＲ単独で分化したｈＨＯ（コントロール）およびＣＨＩＲ＋ＢＭＰ４＋ＡｃｔＡで分化したｈＨＯ（処理）を比較する。図１５Ｂは、オルガノイドの直径（１条件当たりｎ＝８）を示すグラフである。
【図15C】図１５Ａ～１５Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関して、心臓の分化および発生に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の影響を示す。図１５Ａ～１５Ｈはすべて、ＣＨＩＲ単独で分化したｈＨＯ（コントロール）およびＣＨＩＲ＋ＢＭＰ４＋ＡｃｔＡで分化したｈＨＯ（処理）を比較する。図１５Ｃは、直径を決定するために平均化された、コントロールオルガノイド（左側）および処理オルガノイド（右側）の直径を示す破線を提供する。
【図15D】図１５Ａ～１５Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関して、心臓の分化および発生に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の影響を示す。図１５Ａ～１５Ｈはすべて、ＣＨＩＲ単独で分化したｈＨＯ（コントロール）およびＣＨＩＲ＋ＢＭＰ４＋ＡｃｔＡで分化したｈＨＯ（処理）を比較する。図１５Ｄは、ＴＮＮＴ２＋領域におけるマイクロチャンバの数を示す。図１５Ｄ～１５Ｅにおいて、１条件当たりＮ＝１２である。
【図15E】図１５Ａ～１５Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関して、心臓の分化および発生に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の影響を示す。図１５Ａ～１５Ｈはすべて、ＣＨＩＲ単独で分化したｈＨＯ（コントロール）およびＣＨＩＲ＋ＢＭＰ４＋ＡｃｔＡで分化したｈＨＯ（処理）を比較する。図１５Ｅは、細いＴＮＮＴ２＋フィラメントまたは細いチャネルによるマイクロチャンバの分離によって測定されたマイクロチャンバの相互接続性を示し、明確な接続を示す。図１５Ｄ～１５Ｅにおいて、１条件当たりＮ＝１２である。
【図15F】図１５Ａ～１５Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関して、心臓の分化および発生に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の影響を示す。図１５Ａ～１５Ｈはすべて、ＣＨＩＲ単独で分化したｈＨＯ（コントロール）およびＣＨＩＲ＋ＢＭＰ４＋ＡｃｔＡで分化したｈＨＯ（処理）を比較する。図１５Ｆは、総オルガノイド面積の割合としてＰＥＣＡＭ１＋組織の量を示す（ＩｍａｇｅＪ上でＭａｘＥｎｔｒｏｐｙ閾値を用いて測定し、２５μｍ２の微粒子すべてを分析して小さなスペックルを回避する。１条件当たりｎ＝７）。
【図15G】図１５Ａ～１５Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関して、心臓の分化および発生に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の影響を示す。図１５Ａ～１５Ｈはすべて、ＣＨＩＲ単独で分化したｈＨＯ（コントロール）およびＣＨＩＲ＋ＢＭＰ４＋ＡｃｔＡで分化したｈＨＯ（処理）を比較する。図１５Ｇは、ｈＨＯの免疫蛍光画像を示しており、相互接続されたマイクロチャンバ（黄色の矢印）、ＴＮＮＴ２＋フィラメント（白色の矢印）、およびマイクロチャンバを接続するチャネル（緑色の矢印）；ＤＡＰＩ（青色）；ならびにＴＮＮＴ２（赤色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：１００μｍ）。
【図15H】図１５Ａ～１５Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯに関して、心臓の分化および発生に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）およびアクチビンＡ（ＡｃｔＡ）の影響を示す。図１５Ａ～１５Ｈはすべて、ＣＨＩＲ単独で分化したｈＨＯ（コントロール）およびＣＨＩＲ＋ＢＭＰ４＋ＡｃｔＡで分化したｈＨＯ（処理）を比較する。図１５Ｈは、ｈＨＯの免疫蛍光画像を示しており、ＤＡＰＩ（青色）、ＰＥＣＡＭ１＋組織（緑色）、およびＴＮＮＴ２＋組織（赤色）を示す（スケールバー：５００μｍ、挿入図：５０μｍ）。
【図16A】図１６Ａ～１６Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが妊娠糖尿病（diabetes during pregnancy、ＤＤＰ）誘導ＣＨＤの特徴を忠実に再現することを示す。図１６Ａは、２週間の分化にわたる、正常血糖条件下（ＮＨＯ、左側）および糖尿病条件下（ＤＤＰＨＯ、右側）での１０個のｈＨＯの発生後の明視野画像を示す。
【図16B】図１６Ａ～１６Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが妊娠糖尿病（diabetes during pregnancy、ＤＤＰ）誘導ＣＨＤの特徴を忠実に再現することを示す。図１６Ｂは、分化の最初の２週間におけるｈＨＯの面積を示す（平均±標準偏差；ｎ＝１２；二元配置分散Ｓｉｄａｋ多重比較検定）。
【図16C】図１６Ａ～１６Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが妊娠糖尿病（diabetes during pregnancy、ＤＤＰ）誘導ＣＨＤの特徴を忠実に再現することを示す。図１６Ｃは、１５日目にＮＨＯおよびＤＤＰＨＯに対して実施された電気生理学的分析を示し；矢印は、不整脈事象を示す。
【図16D】図１６Ａ～１６Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが妊娠糖尿病（diabetes during pregnancy、ＤＤＰ）誘導ＣＨＤの特徴を忠実に再現することを示す。図１６Ｄは、酸素消費速度（ＯＣＲ）のシーホース分析（seahorse analysis）を示す。
【図16E】図１６Ａ～１６Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが妊娠糖尿病（diabetes during pregnancy、ＤＤＰ）誘導ＣＨＤの特徴を忠実に再現することを示す。図１６Ｅは、正常ｈＨＯおよび糖尿病性ｈＨＯの細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を示す。
【図16F】図１６Ａ～１６Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが妊娠糖尿病（diabetes during pregnancy、ＤＤＰ）誘導ＣＨＤの特徴を忠実に再現することを示す。図１６Ｆは、ＮＨＯおよびＤＤＰＨＯのＴＥＭによる超微細構造分析であり、小胞体（ＥＲ）、ギャップ結合（Ｇｊ）、グリコーゲン顆粒（Ｇｙ）、脂質滴（Ｌｄ）、ミトコンドリア（Ｍｉ）、核（Ｎ）、およびサルコメア（Ｓ）を示す。
【図16G】図１６Ａ～１６Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが妊娠糖尿病（diabetes during pregnancy、ＤＤＰ）誘導ＣＨＤの特徴を忠実に再現することを示す。図１６Ｇは、心臓（ＴＮＮＴ２）および心外膜（ＷＴ１）形成について分化１５日目での共焦点免疫蛍光画像を示す。
【図16H】図１６Ａ～１６Ｈは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが妊娠糖尿病（diabetes during pregnancy、ＤＤＰ）誘導ＣＨＤの特徴を忠実に再現することを示す。図１６Ｈは、正常条件下および糖尿病様条件下での心室（ＭＹＬ２）および心房（ＭＹＬ７）チャンバ形成についての共焦点画像を示す（スケールバー：５００μｍ）。
【図17A】図１７Ａ～１７Ｆは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが健康条件および糖尿病条件における機能的特徴をモデル化することを示すデータを提供する。図１７Ａは、心管形成および心臓の４つのチャンバへのループの模式図を示す。
【図17B】図１７Ａ～１７Ｆは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが健康条件および糖尿病条件における機能的特徴をモデル化することを示すデータを提供する。図１７Ｂは、１５日目のＮＨＯおよびＤＤＰＨＯの明視野画像を示しており、セグメンテーション（赤色の矢印）および初期心臓構造に類似する別々の心臓領域（黄色の矢印）を示す。
【図17C】図１７Ａ～１７Ｆは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが健康条件および糖尿病条件における機能的特徴をモデル化することを示すデータを提供する。図１７Ｃは、正常なオルガノイド対糖尿病性オルガノイドの代表的なＭＥＡ電気生理学的詳細を示す。
【図17D】図１７Ａ～１７Ｆは、本技術の様々な態様に従って製造されたｈＨＯが健康条件および糖尿病条件における機能的特徴をモデル化することを示すデータを提供する。図１７Ｄは、正常ｈＨＯおよび糖尿病性ｈＨＯにおける活動電位μＶの振幅の大きさを示す（１条件当たり３回の反復でｎ＞１２；対応のないｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図15G】
【図15H】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図16G】
【図16H】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図17F】
【手続補正書】
【提出日】2023-02-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
心臓オルガノイドを生成するための方法であって、前記方法は：多能性幹細胞を含む細胞凝集体を形成する工程；
前記細胞凝集体を第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させることによって、前記細胞凝集体におけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、前記細胞凝集体を三次元心臓中胚葉に分化させる工程を含む、第１の活性化工程；および、
前記三次元心臓中胚葉をＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させることによって、前記三次元心臓中胚葉における前記Ｗｎｔシグナル伝達を阻害して、前記心臓オルガノイドを形成する工程、
を含み、
前記心臓オルガノイドは、心筋組織、少なくとも１つのチャンバを画定する心内膜組織、および前記心筋組織の少なくとも外面上に配置された心外膜組織を含み、
前記心臓オルガノイドは、拍動する、
方法。
【請求項2】
前記第１の活性化工程は、前記細胞凝集体を少なくとも１つの成長剤と接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記心臓オルガノイドを第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させることによって、前記心臓オルガノイドにおけるＷｎｔシグナル伝達を活性化させて、前記心臓オルガノイドにおける心外膜前駆組織の量を増加させる工程を含む、第２の活性化工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記心臓オルガノイドは、約２ｍＭ以上、約７ｍＭ以下の濃度のグルコース、および約２０ｐＭ以上、約２５０ｐＭ以下の濃度のインスリンを含む培地中で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記心臓オルガノイドは、約８ｍＭ以上、約３０ｍＭ以下の濃度のグルコース、および約２５０ｐＭ以上、約７５ｎＭ以下の濃度のインスリンを含む培地中で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
請求項１に記載の方法に従って製造された、心臓オルガノイド。
【請求項7】
前記細胞凝集体を前記第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、約２時間以上、約４８時間以下の間であり；前記三次元心臓中胚葉を前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させる前記工程は、約２４時間以上、約７２時間以下の間であり；
前記心臓オルガノイドを前記第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、約１５分間以上、約２４時間以下の間である、
請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記細胞凝集体を前記第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、前記細胞凝集体を、約１μＭ以上、約１５μＭ以下の前記第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子を含むＷｎｔ活性化組成物と接触させる工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記三次元心臓中胚葉を前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させる前記工程は、前記三次元心臓中胚葉を、約１μＭ以上、約１５μＭ以下の前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤を含むＷｎｔ阻害組成物と接触させる工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記心臓オルガノイドを前記第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、前記細胞凝集体を、約１μＭ以上、約１５μＭ以下の前記第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子を含むＷｎｔ活性化組成物と接触させる工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞凝集体を形成する前記工程は：前記多能性幹細胞を基材に移す工程；および、
前記基材を、約５０ｇ以上、約５００ｇ以下で約１分間以上、約１０分間以下遠心分離する工程、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞凝集体を形成する前記工程は、－２日目に実行され；前記細胞凝集体を前記第１のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、０日目に実行され；
前記三次元心臓中胚葉を前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤と接触させる前記工程は、２日目に実行され；
前記心臓オルガノイドを前記第２のＷｎｔシグナル伝達経路活性化因子と接触させる前記工程は、７日目に実行される、
請求項７に記載の方法。
【請求項13】
請求項７に記載の方法に従って製造された、心臓オルガノイド。
【請求項14】
心臓オルガノイドであって：内部および外面を有する三次元主部であって、前記内部が心筋組織を含む、三次元主部；
前記心筋組織内の少なくとも１つの心臓チャンバを画定する心内膜細胞；および、
前記外面の少なくとも一部に配置された心外膜組織、
を含み、
前記心臓オルガノイドは、拍動し、
前記心臓オルガノイドは、培養多能性幹細胞に由来する、
心臓オルガノイド。
【請求項15】
前記心臓オルガノイド内に少なくとも部分的に埋め込まれた内皮血管系；および、前記心筋組織内に配置された心臓線維芽細胞、
をさらに含む、請求項１４に記載の心臓オルガノイド。
【請求項16】
心臓特異的細胞外マトリックスをさらに含む、請求項１４に記載の心臓オルガノイド。
【請求項17】
多能性幹細胞を含む前記細胞凝集体を形成する前記工程は、細胞外マトリックス上で培養されたサブコンフルエントの多能性幹細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する工程、ならびに、前記多能性幹細胞および培地を含む細胞懸濁液を調製する工程を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記心臓オルガノイドは、細胞のヒドロゲルマトリックスへの包埋を行わずに生成される、
請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記心臓オルガノイドは、実質的に心筋細胞、心外膜細胞、心内膜細胞、心臓線維芽細胞および内皮細胞からなる、
請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記心臓オルガノイドは、
内部および外面を有する三次元主部であって、前記内部が心筋組織を含む、三次元主部；
少なくとも１つの心臓チャンバを画定する心内膜組織；および、
前記外面の少なくとも一部に配置された心外膜組織、を含み、
前記心臓オルガノイドは、拍動する、
請求項７に記載の方法。
【国際調査報告】