▶ ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-19
(54)【発明の名称】近赤外シアニン色素およびそのコンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C07D 209/24 20060101AFI20230711BHJP
C07D 417/14 20060101ALI20230711BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230711BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230711BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230711BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230711BHJP
A61K 31/404 20060101ALI20230711BHJP
C07K 7/64 20060101ALI20230711BHJP
C09B 23/14 20060101ALI20230711BHJP
C09B 23/01 20060101ALI20230711BHJP
C07D 403/14 20060101ALI20230711BHJP
【ＦＩ】
C07D209/24
C07D417/14
A61K49/00
A61K47/64
A61K47/68
A61K47/54
A61K31/404
C07K7/64
C09B23/14
C09B23/01
C07D403/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022567490
(86)(22)【出願日】2021-06-22
(85)【翻訳文提出日】2022-11-14
(86)【国際出願番号】 EP2021066920
(87)【国際公開番号】W WO2021259899
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】20181771.5
(32)【優先日】2020-06-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504448162
【氏名又は名称】ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニ
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＡＣＣＯ ＩＭＡＧＩＮＧ Ｓ．Ｐ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100113376
【弁理士】
【氏名又は名称】南条 雅裕
(74)【代理人】
【識別番号】100179394
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬田 あや子
(74)【代理人】
【識別番号】100185384
【弁理士】
【氏名又は名称】伊波 興一朗
(74)【代理人】
【識別番号】100137811
【弁理士】
【氏名又は名称】原 秀貢人
(72)【発明者】
【氏名】ブラージ フランチェスコ
(72)【発明者】
【氏名】ブオンサンティ フェデリカ
(72)【発明者】
【氏名】クリヴェリン フェデリコ
(72)【発明者】
【氏名】フェラーリス アンドレア
(72)【発明者】
【氏名】オリオ ローラ
(72)【発明者】
【氏名】ピッツート ロリーナ
(72)【発明者】
【氏名】ナポリターノ ロバータ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァルブーサ ジョヴァンニ
【テーマコード（参考）】
4C063
4C076
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C063AA05
4C063BB09
4C063CC67
4C063DD42
4C063EE01
4C076AA95
4C076CC41
4C076CC50
4C076DD61
4C076EE41
4C076EE59
4C085HH01
4C085HH11
4C085KA04
4C085KA27
4C085KB56
4C085KB82
4C085LL01
4C085LL13
4C085LL18
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC13
4C086GA07
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZC78
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA13
4H045BA35
4H045BA70
4H045EA50
4H045FA10
(57)【要約】
本発明は、光学イメージングの分野に関する。より具体的には、本発明は、改善された物理化学的および生物学的特性を特徴とする近赤外発光を有するシアニンファミリーの化合物ならびに生物学的リガンドとのそのコンジュゲートに関する。本発明はまた、固形腫瘍のイメージングまたは治療法における光学診断薬としてのこれらの化合物の使用、それらの調製方法およびそれらを含む組成物にも関する。化合物は式（Ｉ）を有しており、式中、Ｘは、直接結合または－Ｏ－であり；Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり；Ｒ１およびＲ２は各々独立に、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２および－ＣＯＯ－Ｃ１－Ｃ６アルキルから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり；および、Ｒ３は、水素、－ＳＯ３Ｈ、または、－ＣＯＯＨもしくは－ＣＯＮＨ－Ｙによって置換された直鎖もしくは分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）の化合物であって、
式中、
Ｘは、直接結合または－Ｏ－であり；
Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ１およびＲ２は各々独立に、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２および－ＣＯＯ－Ｃ１－Ｃ６アルキルから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ３は、水素、－ＳＯ３Ｈ、または、－ＣＯＯＨもしくは－ＣＯＮＨ－Ｙによって置換された直鎖もしくは分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基である、化合物、
またはその立体異性体または薬学的に許容できる塩。
【請求項2】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物であって、式中、Ｙは、
からなる群から選択される、
化合物。
【請求項3】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物であって、式（Ｉａ）によって表され、
化合物。
【請求項4】
請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物であって、
【請求項5】
式（ＩＩ）の化合物によって表される、請求項１において定義される化合物（Ｉ）のコンジュゲートであって、
Ｘは、直接結合または－Ｏ－であり；
Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ１は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２および－ＣＯＯ－Ｃ１－Ｃ６アルキルから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中、
Ｓは、スペーサーであり；
Ｔは、標的化部分であり；
ｍは、０または１と等しい整数である；および
Ｒ５は、水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨもしくは－ＣＯＮＨ－Ｙによって置換された直鎖もしくは分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、および、基ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔから選択され、式中、Ｙ、Ｓ、Ｔおよびｍは上記に定義したとおりであり；
式中、Ｒ４およびＲ５のうちの少なくとも１つは、ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔによって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルである、コンジュゲート、
またはその立体異性体または薬学的に許容できる塩。
【請求項6】
請求項５に記載の式（ＩＩ）の化合物であって、式中、Ｓは、－（ＣＨ２）ｐＣＯＯ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－および－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－から選択され、式中、ｐは、０と２０の間に含まれる整数である、
化合物。
【請求項7】
請求項５または６に記載の式（ＩＩ）の化合物であって、式中、Ｔは、小分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、酵素基質、抗体またはそのフラグメント、およびアプタマーからなる群から選択される標的化部分である、
化合物。
【請求項8】
請求項７に記載の式（ＩＩ）の化合物であって、式中、Ｔは、インテグリン受容体と相互作用する部分である、
化合物。
【請求項9】
請求項５～８のいずれか一項に記載の式（ＩＩ）の化合物であって、式（ＩＩａ）によって表され、
化合物。
【請求項10】
請求項９に記載の式（ＩＩ）の化合物であって、
および
化合物。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物であって、哺乳類における生物医学的光学イメージング適用のための蛍光プローブとしての使用のための化合物。
【請求項12】
請求項１１に記載の使用のための化合物であって、前記イメージング適用が、正常組織の検出を目的としており、血管造影、灌流イメージング、胆管イメージングおよび神経イメージングを含む、
化合物。
【請求項13】
請求項１１に記載の使用のための化合物であって、前記イメージング適用が、原発性腫瘍病変、局所もしくは遠隔転移、または前腫瘍性病変を含む異常組織の検出を目的としており、ＮＩＲ放射線下で行なわれる、
化合物。
【請求項14】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物および少なくとも１つの薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む、医薬診断組成物。
【請求項15】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの化合物を、生物医学的光学イメージング適用を実施するための追加のそのアジュバントとともに含む、診断キット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、光学イメージングの分野に関する。より具体的には、本発明は、改善された物理化学的および生物学的特性を特徴とする近赤外発光を有するシアニンファミリーの化合物ならびに生物学的リガンドとのそのコンジュゲートに関する。本発明はまた、固形腫瘍のイメージングまたは治療法における光学診断薬としてのこれらの化合物の使用、それらの調製方法およびそれらを含む組成物にも関する。
【背景技術】
【0002】
色素は、光励起の際に特有の波長の光子を吸収し、量子効率に応じて、通常は、より長い波長において、そのエネルギーの一部を再発光する化学物質である。具体的には、シアニン色素は、ポリメチン架橋に広がり２つの窒素原子間に制限されている非局在化電子系を特徴とする蛍光有機分子である。それらの一部は、好ましい光学特性、低い毒性および水性媒体における良好な溶解度を有しており、生物医学的イメージングのための造影剤として用いることができる。近赤外領域（７００～９００ｎｍ）で発光するシアニン色素は、可視スペクトルで蛍光放射する色素と比較して、より高い侵入深度に起因して、生物医学的イメージング適用に特に有用である。
【0003】
生物医学的イメージングに用いられる近赤外色素のうち、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、現在のところヒト用途に承認された唯一の医薬品である。ＩＣＧは、血漿タンパク質に対する強い結合（血液プール効果）および肝臓による未結合画分の迅速なクリアランスに起因して（Ｃｈｅｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９６０；３９（４）：５９２－６００）、組織灌流の評価および血管造影適用に日常的に用いられている。さらに、ＩＣＧはまた、診断および介入（蛍光ガイド外科的処置）の手順中の腫瘍イメージングのための治験医薬品として試験されている。ＩＣＧは、受動拡散ならびに透過性および滞留性亢進（ＥＰＲ）効果の組み合わせによって、腫瘍組織内に分布および蓄積する（Ｏｎｄａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１６；１３９，６７３－６８２）。偽陽性は、非特異的な蓄積特性に起因して、腫瘍イメージングのためのＩＣＧの使用と関連する一般的な臨床知見である（Ｔｕｍｍｅｒｓ Ｑ．ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏｓＯｎｅ ２０１５；１０（６）：ｅ０１２９７６６）。
【0004】
検出の感度および特異性を改善するために、過剰発現された腫瘍エピトープを標的とする担体部分（すなわち、生体分子）にコンジュゲートされた色素を利用する、近赤外イメージングのためのさらなる造影剤が開発中である（Ａｃｈｉｌｅｆｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２００２；４５，２００３－２０１５）。例えば、ＩＣＧおよびＳ０４５６は、腫瘍標的化部分にコンジュゲートされた近赤外色素の例であり、術中の腫瘍検出のために臨床試験において現在試験されている（Ｆｉｄｅｌ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１５；１５；７５（２０）：４２８３－４２９１；Ｈｏｇｓｔｉｎｓ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１６；２２（１２）；２９２９－３８）。
【0005】
適切なイメージング剤を見つけ出す様々な試みにもかかわらず、水性媒体における最適な溶解度および低い凝集性、高い蛍光効率、ならびに最適な生物学的特性を付与する改善された色素を探す必要性が未だ存在している。色素の生物学的特性、特に、アルブミンなどの血漿タンパク質に対する結合親和性は、生体内に投与された時点で、分布および組織蓄積に強く影響し得る。例えば、ヒトアルブミンに対して高い結合親和性を有する色素は、静脈内投与後に血漿区画内に隔離され、低い組織溢出率を有し、その診断適用を強く制限する。さらに、色素の生物学的特性は、色素自体と病理学的組織上の生物学的エピトープを標的とする生体分子とからなるコンジュゲートの組織分布に影響し得る。ヒト血清アルブミンに対する低い結合親和性および非特異的な蓄積が付与された近赤外色素は、生体における適用に好ましい。この必要性は、分子エピトープまたは病理学的組織（例えば腫瘍）に特異的に結合する生体分子に色素がコンジュゲートされた場合に最も重要である。本発明は、これらおよび他の必要性を対処する。
【0006】
ＷＯ２００２／０２４８１５およびＷＯ２００７／１３６９９６（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｉｎｃ．）およびＷＯ２００４／０６５４９１（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）は、光学イメージング適用に有用であり、水性媒体における高溶解度および生体分子との直接コンジュゲートのための官能基を特徴とする、安定なシアニン色素を報告している。しかしながら、最適な生物学的特性を有する色素を得る方法に関する教示は提供されていない。
【0007】
ＷＯ２０１５／１１４１７１は、がん細胞を阻害する薬物の送達のための小分子標的化薬物コンジュゲートを開示している。特に、腫瘍のフローサイトメトリー分析およびインビボイメージングに用いられるＩＲＤｙｅ ７５０コンジュゲート「Ｃ６」を報告している。
【0008】
Ｗａｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１８，３４０（３）：５１－５７は、術中のｐａｎリンパ節マッピングおよびリアルタイム光学イメージングのためのマンノース－コンジュゲートＺＷ８００－１誘導体を用いたＮＩＲ蛍光ナノプローブを開示している。
【0009】
Ｖｅｎｄｒｅｌｌ Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１，９（１３）：４７６０－４７６２は、がん細胞における優先的な取り込みを示したＮＩＲ蛍光デオキシグルコース類似体ＣｙＮＥ２－ＤＧを報告しており、腫瘍イメージングにおける光学薬剤として検証された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
適切なイメージング剤を見つけ出す様々な試みにもかかわらず、最適な安定性および蛍光効率、ならびに最適な物理化学的および生物学的特性が付与され、生体の光学イメージングのためにデザインされた、改善された色素を探す必要性が未だ存在している。この必要性は、特に、分子エピトープまたは病理学的組織（例えば腫瘍）に特異的に結合する生体分子に色素がコンジュゲートされた場合に最も重要である。本発明は、これらおよび他の必要性を対処する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
概して、本発明は、光学イメージングのための造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｅｄｉｕｍ）として有用であり上述の課題を解決することを目指した新規のシアニン色素、または結合部分に対するそれらの対応するコンジュゲートを提供することを目的とする。
【0012】
本明細書に記載される新規のシアニン誘導体は、驚くべきことに、顕著な光学特性および水性媒体における高い溶解度を有する。驚くべきことに、本発明の化合物は、従来技術で公知の近赤外色素と比較して、ヒトアルブミンに関して非常に低い結合親和性を有することが見いだされ、そのことは、これらの化合物が静脈内投与後に用いられる場合に特に有利であり；前記の低親和性は、アルブミンなどの血中に存在する大きなタンパク質による血漿区画における化合物の隔離と、その結果として生じる細胞外スペースにおける効率的な溢出および分布に利用可能な遊離色素の画分の減少とを防止する。
【0013】
新規のシアニン色素は、結合部位として作用する適切な官能基を介して適切な標的化部分に好適にコンジュゲートすることができ、したがって、分子イメージングのための非常に特異的かつ高感度の造影剤を提供する。本発明の化合物の、この低いアルブミン結合親和性は、色素－コンジュゲートの場合に特に重要である。なぜならば、それらの遊離画分（アルブミンに結合していない）のみが、分子標的と効率的に相互作用することができるからである。
【0014】
本発明のさらなる態様は、光学イメージングの方法における使用のための診断薬としての、具体的には、ヒトまたは動物の臓器または組織の光学イメージングにおける使用のための、そのような色素に関し、ここで、イメージングは、臓器の断層撮影イメージングであり、臓器機能のモニタリングは、血管造影、組織灌流イメージング、尿路イメージング、胆管イメージング、神経イメージング、術中のがん特定、蛍光ガイド外科的処置、蛍光内視鏡検査、蛍光腹腔鏡検査、ロボット外科的処置、開放（ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ）外科的処置、レーザーガイド外科的処置、光線力学的療法、蛍光寿命イメージング、または光音響もしくは音響蛍光（ｓｏｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の方法を含む。
【0015】
さらに本発明は、提供される色素、対応するコンジュゲートおよび／またはその薬学的に許容できる塩の調製のための製造プロセス、ならびに診断薬の調製におけるそれらの使用に関する。
【0016】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明の少なくとも１つの色素もしくは色素－コンジュゲート化合物、またはその薬学的に許容できる塩を含む、１つまたは複数の生理的に許容できる担体または賦形剤との混合物における、薬学的に許容できる組成物に関する。前記組成物は、ヒトまたは動物の臓器または組織の有用なイメージングを提供するための光学イメージング剤として特に有用である。
【0017】
別の態様では、本発明は、効果的な用量の本発明の化合物の使用を含む光学イメージング技術の使用による、体の臓器、組織または領域の光学イメージングのための方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【0018】
したがって、本発明の第１の目的は、式（Ｉ）の化合物、
式中、
Ｘは、直接結合または－Ｏ－であり；
Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ１およびＲ２は各々独立に、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２および－ＣＯＯ－Ｃ１－Ｃ６アルキルから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ３は、水素、－ＳＯ３Ｈ、または、－ＣＯＯＨもしくは－ＣＯＮＨ－Ｙによって置換された直鎖もしくは分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基である、
またはその立体異性体または薬学的に許容できる塩を提供することである。
式中、
Ｘは、直接結合または－Ｏ－であり；
Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ１およびＲ２は各々独立に、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２および－ＣＯＯ－Ｃ１－Ｃ６アルキルから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ３は、水素、－ＳＯ３Ｈ、または、－ＣＯＯＨもしくは－ＣＯＮＨ－Ｙによって置換された直鎖もしくは分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基である、
またはその立体異性体または薬学的に許容できる塩を提供することである。
【0019】
本発明の別の目的は、式（ＩＩ）の化合物によって表される対応するコンジュゲート色素：
式中、
Ｘは、直接結合または－Ｏ－であり；
Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ１は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２および－ＣＯＯ－Ｃ１－Ｃ６アルキルから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中、
Ｓは、スペーサーであり；
Ｔは、標的化部分であり；
ｍは、０または１と等しい整数である；および
Ｒ５は、水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨもしくは－ＣＯＮＨ－Ｙによって置換された直鎖もしくは分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、および、基ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔから選択され（R5 is selected from hydrogen, -SO3H, a linear or branched C1-C6 alkyl, substituted by -COOH or -CONH-Y, and a group CONH-(S)m-T）、式中、Ｙ、Ｓ、Ｔおよびｍは上記に定義したとおりであり；
式中、Ｒ４およびＲ５のうちの少なくとも１つは、ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔによって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルである、
またはその立体異性体または薬学的に許容できる塩に関する。
式中、
Ｘは、直接結合または－Ｏ－であり；
Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ１は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２および－ＣＯＯ－Ｃ１－Ｃ６アルキルから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中、
Ｓは、スペーサーであり；
Ｔは、標的化部分であり；
ｍは、０または１と等しい整数である；および
Ｒ５は、水素、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨもしくは－ＣＯＮＨ－Ｙによって置換された直鎖もしくは分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、および、基ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔから選択され（R5 is selected from hydrogen, -SO3H, a linear or branched C1-C6 alkyl, substituted by -COOH or -CONH-Y, and a group CONH-(S)m-T）、式中、Ｙ、Ｓ、Ｔおよびｍは上記に定義したとおりであり；
式中、Ｒ４およびＲ５のうちの少なくとも１つは、ＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔによって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルである、
またはその立体異性体または薬学的に許容できる塩に関する。
【0020】
本発明はまた、合成の変換ステップを用いて式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を調製するための方法にも関する。
【0021】
本発明はまた、生物医学的光学イメージング適用のための蛍光プローブとしての使用のための式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物も含む。
【0022】
定義
本説明において、別段の提示がない限り、本明細書において用いられる以下の用語および語句は、以下の意味を有することを意図している。
本説明において、別段の提示がない限り、本明細書において用いられる以下の用語および語句は、以下の意味を有することを意図している。
【0023】
「直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル」という表現は、直鎖または分岐鎖であり得る、鎖内に１～６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素ラジカル基を指す。例えば、「Ｃ４アルキル」は、その意味内に、４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖を含む。同様に、「Ｃ１－Ｃ２０アルキル」は、１～２０個の炭素原子を含むアルキルである。代表的な好ましいアルキル基は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチルおよびヘキシルを含む。別段の定めのない限り、直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルは、一価ラジカル基である。場合によっては、２つ以上の水素原子が上記炭化水素ラジカル基から取り除かれて置換されている「二価」または「多価」ラジカル基であってよい（例えばメチレン、エチレン、イソ－プロピレン基など）。
【0024】
本明細書で用いられる用語「Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル」は、その意味内に、３～７個の炭素原子を含む飽和（すなわち脂環式）炭素環を含む。適切な例は、Ｃ５－Ｃ７炭素環、例えばシクロヘキシル環を含む。
【0025】
本明細書で用いられる用語「ヘテロシクリル」は、飽和脂環式環、好ましくは５～７員の飽和環を含み、Ｎ、ＯおよびＳから選択される環状鎖におけるヘテロ原子をさらに含む。好ましくは、それはテトラヒドロピランを指す。
【0026】
用語「ヒドロキシアルキル」は、１つまたは複数の水素原子がヒドロキシル基によって置換された任意の対応するアルキル鎖を指す。
【0027】
用語「アルコキシ」は、その意味内に、１つまたは複数の酸素原子をさらに含む上記に定義したアルキル鎖を含み；例としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソ－プロポキシなどのアルキル－オキシ基、および、アルキル鎖に１つまたは複数の酸素原子が割り込んだアルキル－（ポリ）オキシ基が挙げられる。
【0028】
本説明では、用語「保護基」（Ｐｇ）は、それが結合する基の機能を保存するように適合された保護基を指す。具体的には、保護基は、アミノ、ヒドロキシルまたはカルボキシル機能を保存するために用いられる。適切な保護基としては、例えば、ベンジル、カルボニル、例えばホルミル、９－フルオロメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニルまたはアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、アルキル、例えばｔｅｒｔ－ブチルまたはトリフェニルメチル、スルホニル、アセチル基、例えばトリフルオロアセチル、ベンジルエステル、アリル、または、そのような機能の保護のために一般に用いられており当業者に公知の他の置換基（例えば、一般的な参考文献Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．２００７，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｈ．５を参照）を挙げることができる。
【0029】
さらに、本発明は、所望の式（Ｉ）の化合物またはその塩の調製に適切な前駆体または中間体化合物も含む。そのような誘導体においては、Ｒ１－Ｒ５の官能基、例えばカルボン酸またはカルボキサミドを、上記に定義した適切な保護基（Ｐｇ）、好ましくはアルキルまたはエステル基を用いて保護することができる。必要に応じて、Ｙ基のヒドロキシル基も、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の調製中に適切な保護基（Ｐｇ）で保護することができ、したがって、例えば、アセトキシ、アルコキシまたはエステル基を形成する。
【0030】
「カップリング試薬」という表現は、例えば、カルボキシル部分とアミノ部分との間のアミド結合の形成において用いられる試薬を指す。反応は、以下の２つの連続するステップ：カルボキシル部分の活性化に次いで、活性化されたカルボン酸によるアミノ基のアシル化からなり得る。そのようなカップリング剤の非限定的な例は、以下：カルボジイミド、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）；ホスホニウム試薬、例えば、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）および３－（ジエトキシホスホリルオキシ）－１，２，３－ベンゾトリアジン－４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）；およびアミニウム／ウロニウム－イモニウム試薬、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＡＴＵ）、Ｏ－（１Ｈ－６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、１－［１－（シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデン－アミノオキシ）－ジメチルアミノ－モルホリノ］－ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）およびフルオロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）または当業者に公知の他の化合物からなる群から選択される。
【0031】
用語「小分子」は、本明細書において、約５０００ダルトン未満の分子量を有しており、ヒトを含む動物に投与した場合に生物学的プロセスを調節することが可能な、または生物学的効果を生じさせることが可能な、有機、無機または有機金属化合物を指すために広く用いられる。用語「小分子」はまた、用語「薬物」または「生物学的活性部分」と互換的に用いることもできる。例えば、腫瘍に対して有益な効果を提供し、特異的な生物学的標的に結合することによって患者において局所的または全身性効果を生じる任意の薬剤、活性分子または化合物を含むことができる。小分子はまた、活性化または化学的修飾されて本発明のコンジュゲート色素に共有結合した親薬物の部分または残基を指すこともできる。
【0032】
「活性化されたカルボン酸」という表現は、遊離カルボキシル基よりも求核攻撃を受けやすいカルボキシル基の誘導体を指し；適切な誘導体は、例えば、酸無水物、チオエステル、ハロゲン化アシル、ＮＨＳエステルおよびスルホＮＨＳエステルを含み得る。
【0033】
さらに、用語「部分」または「残基」は、分子の残りに直接または適切なリンカーおよび／またはスペーサーを介して適切に結合またはコンジュゲートした場合の、所与の分子の残りの部分を定義することが本明細書において意図される。
【0034】
標的化部分（Ｔ）
本発明によれば、標的化部分（Ｔ）は、特定の選択性で生物学的標的に結合し、特異的な組織または体の部位における造影剤の蓄積を促進する分子である。一般に、生体系における使用のための天然または合成の分子によって表される。
本発明によれば、標的化部分（Ｔ）は、特定の選択性で生物学的標的に結合し、特異的な組織または体の部位における造影剤の蓄積を促進する分子である。一般に、生体系における使用のための天然または合成の分子によって表される。
【0035】
そのような特異的な結合は、目的の組織または細胞の表面上に発現された特異的な生物学的標的と相互作用する、例えば小分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、酵素基質、抗体もしくはそのフラグメント、またはアプタマーなどのリガンドを介して達成することができる。
【0036】
本発明の化合物に適切な生物学的標的は、例えば、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２などの上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体；ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２などの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体；ＣＡＩＸ、ＣＡＩＩまたはＣＡＸＩＩなどの炭酸脱水酵素（ＣＡ）酵素；ＭＵＣ１などのムチン糖タンパク質；ＧＬＵＴ－１などのグルコース輸送体；ＮＨＥ１などのナトリウム－水素交換輸送体；がん胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児性糖タンパク質；ケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）などのケモカイン受容体；ＩＣＡＭ、ＥＰＣＡＭ、ＶＣＡＭ、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチンなどの細胞接着分子；肝細胞増殖因子ＨＧＦＲ（ｃ－ｍｅｔ）；トランスフェリンのための受容体；ＥＰＨＡ２などのエフリン受容体；ＦＲ－αなどの葉酸のための受容体；ＣＤ４４などのヒアルロン酸に結合する糖タンパク質；ＢＢ１、ＢＢ２、ＢＢ３などのボンベシン受容体；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）などのＮ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタメート（ＮＡＡＧ）ペプチダーゼ；および、特にαｖβ３、αｖβ５、αｖβ６またはα５β１インテグリン受容体などのインテグリン受容体であり得る。
【0037】
例えば、インテグリン受容体標的化部分は、配列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含む線状または環状ペプチドによって表される。このトリペプチドは、受容体に対して高い結合特異性を有しており、細胞膜に存在するインテグリン受容体のファミリーによりリガンドとして認識される。実際に、このＲＧＤモチーフを利用して細胞接着を媒介する、フィブロネクチンまたはビトロネクチンなどのいくつかの細胞外マトリックス糖タンパク質において同定されている。
【0038】
したがって、配列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含む線状および環状ペプチドおよびペプチド模倣薬、例えば、ｃＲＧＤ、ｃＲＧＤｆＫ、ｃＲＧＤｙＫ、ｃＲＧＤｆＣ、ＲＧＤ－４Ｃ、ＲＧＤ－２Ｃ、ＡＨ１１１５８５、ＮＣ１００６９２、ＲＧＤ－Ｋ５（Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１７，７：３９０５）、またはそれらの類似体およびそれらの誘導体は、細胞膜インテグリンが健康組織と比較して上方制御されているがん組織を標的化する結合モチーフの公知の例である。
【0039】
一実施形態では、本発明の化合物は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的化することが知られているベクターにコンジュゲートさせることができ、したがって、前立腺がんの検出およびイメージングを可能にする。これらのリガンドは、例えば、ベクターグルタミン酸－尿素－リジン（ＥｕＫ）またはＥＰ３６３６６３５Ａ１に記載される式「ＥｕＸ」の他のＰＳＭＡ結合ベクター、すなわち、別のアミノ酸または類似物に架橋尿素を介して結合されたグルタミン酸、例えばＥｕＦＡ（グルタミン酸－尿素－３－（２－フリル）－アラニン）、ＥｕＰＧ（グルタミン酸－尿素－２－（２’－プロピニル）－アラニン）、ＥｕＥ（グルタミン酸－尿素－グルタミン酸）、または他の尿素に基づくペプチド模倣薬、例えば、Ｂｅｎｅｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１５，５６：９１４－９２０に記載されるＥｕＫ－（３－（２－ナフチル）－アラニン）－トラネキサム酸によって表される。
【0040】
別の実施形態では、本発明の化合物は、治療法に既に使用されている他の小分子、ペプチド、タンパク質または抗体、例えばモノクローナル抗体にコンジュゲートすることができる。薬物アセタゾラミドを含む小分子、例えば、化合物４ａ、５ａ、６ａ、７ａおよび８ａ（Ｗｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ ２０１５，７：２４１－２４９）、またはそれらの類似体およびそれらの誘導体は、酵素ＣＡＩＸを標的化する小分子の例である。線状および環状ペプチドおよびペプチド模倣薬、例えばペプチドＧＥ１１（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００５，１９：１９７８－８５に記載）および／またはペプチドＬ１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ２０１８，９１：６０５－６１９に記載）、またはそれらの類似体およびそれらの誘導体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的化するペプチドの例である。タンパク質のうち、上皮成長因子（ＥＧＦ）の誘導体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的化する小タンパク質の例である。抗体のうち、パニツムマブおよびセツキシマブは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的化するモノクローナル抗体の例である。
【0041】
好ましくは、本発明の標的化リガンドは、腫瘍細胞または組織に選択的に結合することができる。特に、それらは、脳腫瘍、乳がん、頭頚部がん、卵巣がん、前立腺がん、食道がん、皮膚がん、胃がん、膵がん、膀胱がん、口腔がん、肺がん、腎がん、子宮がん、甲状腺がん、肝臓がん、および結腸直腸がんから選択される腫瘍に結合することができる。さらに、標的化リガンドは、原発の由来とは異なる組織および臓器における上述のがんの転移の広がりに結合することができる。さらに、標的化リガンドは、異なる組織および臓器における前腫瘍性病変および形成異常に結合することができる。
【0042】
スペーサーＳ
本発明によれば、Ｓは、標的化部分を色素から分離するスペーサーである（存在してもしなくてもよい）。スペーサーの存在は、標的化部分および色素が互いに負の相互作用をするリスクがある一部の実施形態について特に関連がある。さらに、スペーサーの存在は、色素が相対的に大きく、標的部位への標的化部分の結合を妨げ得る場合に必要であり得る。
本発明によれば、Ｓは、標的化部分を色素から分離するスペーサーである（存在してもしなくてもよい）。スペーサーの存在は、標的化部分および色素が互いに負の相互作用をするリスクがある一部の実施形態について特に関連がある。さらに、スペーサーの存在は、色素が相対的に大きく、標的部位への標的化部分の結合を妨げ得る場合に必要であり得る。
【0043】
スペーサーは、柔軟（例えば、単純なアルキル鎖）または剛性（例えば、シクロアルキルまたはアリール鎖）のいずれかであってよく、それにより、色素が標的から離れて配向される。スペーサーは、生体においてイメージング剤として用いられる式（Ｉ）のコンジュゲートの薬物動態および代謝を改変することもできる。
【0044】
親水性スペーサーは、血漿タンパク質との相互作用を減少させ、血中循環時間を減少させ、排泄を促進させ得る。例えば、スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である場合、インビボでのイメージング剤の薬物動態および血中クリアランス速度は変更され得る。そのような実施形態では、スペーサーは、バックグラウンド組織（すなわち、筋肉、血液）からのイメージング剤のクリアランスを改善することができ、したがって、高い標的－対－バックグラウンドのコントラストに起因して、より良好な診断画像を提供する。さらに、特定の親水性スペーサーの導入により、造影剤の排泄を肝臓から腎臓へ移行させることができ、したがって、全体的な体内滞留を減少させる。
【0045】
したがって、好ましい一実施形態では、スペーサーは、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルまたはアリール基を含む親水性部分である。好ましくは、スペーサーは、－（ＣＨ２）ｐＣＯＯ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－および－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－からなる群から選択され、式中、ｐは０と２０の間の整数である。好ましくは、ｐは、２、６または１２である。
【0046】
必要でない場合は、スペーサーは好ましくは存在せず、すなわちｍは０であり、Ｓは直接結合を表わす。
【0047】
スペーサー、あるいはスペーサーがない場合の標的化部分は、式（ＩＩ）の化合物においてＲ４および／またはＲ５残基で結合され得る。
【0048】
Ｒ４－Ｒ５の結合基は、化学結合の形成によって色素を標的化部分にコンジュゲートするのに適切なカルボン酸またはカルボキシアミド残基などの反応性官能基である。
【0049】
例えば、アミン含有標的化部分（Ｔ）が式（ＩＩ）の化合物とコンジュゲートされる場合であって、Ｒ４および／またはＲ５が、カルボン酸によって置換されたアルキルである場合、このカルボン酸は、コンジュゲートを行なう前に活性化試薬を用いてより反応性の形態における転換を通して活性化されてもよく、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルまたは混合無水物を形成する。それから、式（ＩＩ）の対応する化合物を得るために、アミン含有標的化部分が、生じた活性化酸によって処理されて、アミド結合を形成する。典型的に、この反応は水性バッファー中で行なわれ（ＤＭＳＯまたはＤＭＦ（ｐＨ８～９）との共溶媒であってもよい）、または、ＤＩＰＥＡ、ＴＥＡもしくはＮＭＭなどの有機塩基を含む有機溶媒中で行なわれる。
【0050】
そうでなければ、「非活性化」カルボン酸を用いた直接コンジュゲートが行われ得る。
【0051】
同様に、Ｒ４および／またはＲ５の結合基がカルボキシアミド基である場合は、適切な標的化部分の付着のための手順は同様であるが、リンカーの活性化ステップは一般に必要ではなく、色素および標的化部分は直接処理される。
【0052】
上記式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、１つまたは複数の不斉炭素原子（あるいはキラル炭素原子と呼ばれる）を有してよく、したがって、ジアステレオマーおよび光学異性体を生じさせ得る。別段の提示がない限り、本発明は、すべてのそのようなあり得るジアステレオマーならびにそれらのラセミ混合物、それらの実質的に純粋な分割鏡像異性体、すべてのあり得る幾何異性体、およびそれらの薬学的に許容できる塩をさらに含む。
【0053】
非限定的な例として、式（Ｉ）または（ＩＩ）の色素がＤ－グルカミン基によって置換された場合（Ｙは、５個のヒドロキシ基によって置換されたＣ６アルキルである）、本発明は、対応する鏡像異性的に純粋な化合物ならびに任意のそれらの立体異性体、例えば、Ｌ－グルカミン基を有する化合物、または、それらのＤ－／Ｌ－光学異性体の任意のあり得る混合物を含む。
【0054】
本発明はさらに、Ｒ１、Ｒ２／Ｒ４および／またはＲ３／Ｒ５の官能基、例えばスルホニル、カルボキシアミノまたはカルボン酸基が、薬学的に許容できる塩の形態であり得る、上記式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関する。
【0055】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関し、式中、Ｙは、２～５個のヒドロキシル基で置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される。
【0056】
好ましい実施形態では、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関し、式中、Ｙは、
からなる群から選択される。
【0057】
より好ましくは、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関し、式中、Ｙは、上記に定義した式（ｉｉ）の基である。好ましくは、基（ｉｉ）は、化合物の調製においてＤ－グルカミンを用いることによって得られる以下の立体化学的配置を有する：
【0058】
本発明の別の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物に関し、式中、ｍは０でありスペーサーＳは直接結合によって表されるか、またはｍは１でありスペーサーはＣ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルまたはアリール基を含む親水性部分である。好ましくは、スペーサーは、－（ＣＨ２）ｐＣＯＯ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ－および－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ－から選択され、式中、ｐは０と２０の間の整数である。好ましくは、ｐは２、６または１２である。
【0059】
さらなる一実施形態では、Ｔは、小分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、酵素基質、抗体またはその任意のフラグメントおよびアプタマーから選択される標的化部分である。
【0060】
好ましくは、Ｔは、ペプチドによって表され、特に、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１などのインテグリン受容体と、好ましくはαｖβ３インテグリン受容体と相互作用する部分によって表される。
【0061】
好ましい一実施形態では、Ｒ１は、－ＳＯ３Ｈによって置換された直鎖Ｃ４アルキルである。
【0062】
別の好ましい実施形態では、本発明は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物に関し、式中、Ｙは、上記に定義した基（ｉｉ）を表わし、そうでなければ、以下の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）によってそれぞれ表わされる：
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＸは上記に定義したとおりである。
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＸは上記に定義したとおりである。
【0063】
特に好ましいのは、表Ｉａに列挙した式（Ｉ）の化合物および表Ｉｂに列挙した式（ＩＩ）の化合物である。
【0064】
【0065】
【0066】
本発明はまた、結合基を介して標的化部分にコンジュゲートされてもよい近赤外色素である、以下の説明に例示されるように調製される式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を合成する方法に関する。
【0067】
したがって、本発明は、哺乳類（ヒトおよび動物）における診断生物医学的適用のための光学イメージング剤としての使用のための上記に定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供する。好ましくは、イメージングされる哺乳類対象はヒトである。
【0068】
好ましい一実施形態では、本発明の化合物は、正常（健康）組織または異常（病理学的）組織、特に腫瘍の検出における、イメージング剤としての使用のためのものである。
【0069】
好ましくは、上記に定義される式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、例えば血管造影、灌流イメージング、胆管イメージングおよび神経イメージングを含むイメージング技術を用いた正常（健康）組織の検出における使用のためのものである。
【0070】
さらなる好ましい一実施形態では、本発明は、異常（病理学的）組織、例えば、原発性腫瘍病変、局所もしくは遠隔転移、または前腫瘍性病変、特に形成異常および過形成の検出における使用のための、上記に定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供する。特に、上記に定義した式（ＩＩ）の化合物は、好ましくは、個々の患者のガイド外科的処置における腫瘍の縁の検出および境界決定における使用のためのものである。好ましい使用は、前記腫瘍が、例えば、細胞表面上に存在する受容体、酵素、糖タンパク質、脂質ラフト、膜貫通タンパク質、および、血清、血漿または間質空間に存在する可溶性因子から選択される、生物学的エピトープの過剰発現を示している腫瘍である場合である。好ましくは、前記生物学的エピトープは、ビトロネクチン、フィブロジェン（Ｆｉｂｒｏｇｅｎ）および／または形質転換増殖因子－β（ＴＧＦ－β）のためのインテグリン受容体である。
【0071】
本発明はまた、上記に定義した蛍光プローブとしての使用のための式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供し、ここで、腫瘍の検出および境界決定は、ＮＩＲ放射線下で行なわれる。好ましくは、腫瘍のそのような検出および境界決定は、そのような腫瘍組織を除去する外科的手順前、外科的手順中、または外科的手順後に行なわれる。蛍光ガイド外科的処置手順は、そのような使用の例である。
【0072】
さらに、本発明は、炎症組織、線維化組織、虚血性組織、または異常な代謝速度を有する組織の検出における使用のための上記に定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を提供する。
【0073】
本発明はまた、以下のステップを含む、組織および細胞をイメージングする方法を提供する：
ｉ）細胞または組織を式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物と接触させるステップ；
ｉｉ）イメージング剤によって吸収される波長で組織または細胞を照射するステップ；
ｉｉｉ）蛍光カメラを用いて近赤外発光を検出するステップ。
ｉ）細胞または組織を式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物と接触させるステップ；
ｉｉ）イメージング剤によって吸収される波長で組織または細胞を照射するステップ；
ｉｉｉ）蛍光カメラを用いて近赤外発光を検出するステップ。
【0074】
好ましくは、細胞または組織を式（Ｉ）または（ＩＩ）のイメージング剤と接触させる前記ステップは、局部的または局所的適用によって（例えば、噴霧、浸漬、または軟膏、フォームもしくはクリーム塗布によって）、または全身性適用（腸内または非経口投与）によって達成される。
【0075】
本発明はさらに、上記に定義した式（Ｉ）の化合物または式（ＩＩ）のコンジュゲート、および少なくとも１つの薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む、医薬診断組成物に関する。
【0076】
特に、本発明は、式（Ｉ）の色素、またはその塩、および１つまたは複数の薬学的に許容できるアジュバント、賦形剤または希釈剤を含む、医薬組成物に関する。
【0077】
あるいは、本発明は、Ｒ４および／またはＲ５が、上記に定義したようにＣＯＮＨ－（Ｓ）ｍ－Ｔによって置換されたＣ１－Ｃ６アルキルである式（ＩＩ）のコンジュゲート、またはその塩、および１つまたは複数の薬学的に許容できるアジュバント、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【0078】
本発明の別の態様は、上記に定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を含む診断キットに関する。さらにキットは、光学イメージングを実施するための追加のアジュバントを含むことができる。これらのアジュバントは、例えば、適切なバッファー、容器、検出試薬、または使用法である。キットは、好ましくは、本発明の化合物の静脈内投与のためのすべての材料を含む。
【0079】
本発明の化合物は、イメージング手順の前にイメージングされる臓器または組織へ全身性または局所的のいずれかで投与され得る。例えば、化合物は、静脈内に投与することができる。別の実施形態では、非経口的または経腸的に投与され得る。
【0080】
組成物は、腫瘍、組織または臓器の所望の光学画像を取得するのに効果的な用量で投与され、それは、用いられる化合物、イメージング手順に供せられる組織、用いられるイメージング装置などによって広く異なり得る。
【0081】
イメージング剤の正確な濃度は、実験的条件および所望の結果に依存するが、典型的に０．０００００１ｍＭ～０．１ｍＭの範囲であり得る。最適な濃度は、最小限のバックグラウンド蛍光で満足な結果が得られるまで、体系的な変動によって決定される。
【0082】
投与された時点で、本発明のイメージング剤は、光または組織層を通過することのできる他の形態のエネルギーに曝される。好ましくは、放射線の波長または波長帯は、光感作剤の励起波長または波長帯と同等であり、非標的細胞および対象の残りのもの（血中タンパク質を含む）による低吸収を有する。
【0083】
典型的に、光学シグナルは、観察または機器によって検出可能であり、その応答は、蛍光または光強度、分布および寿命と関連する。
【0084】
合成の説明
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の（それ自体としてまたは生理的に許容できる塩の形態での）調製は、本発明のさらなる目的である。本発明のシアニン色素および色素－コンジュゲートは、例えば、以下のセクションおよび実験パートに記載される方法に従って調製することができる。
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の（それ自体としてまたは生理的に許容できる塩の形態での）調製は、本発明のさらなる目的である。本発明のシアニン色素および色素－コンジュゲートは、例えば、以下のセクションおよび実験パートに記載される方法に従って調製することができる。
【0085】
シアニン色素の調製に関する全般的教示は、スルホインドシアニン色素の合成および標識に関するＭｕｊｕｍｄａｒ Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９３，４（２）：１０５－１１１に見いだすことができる。しかしながら、本発明のシアニンは、当該分野の化合物に存在しない特有の官能化パターンを特徴とし、そのためには適切な合成手法の設定が必要とされた。実際に、他の公知のシアニンとは異なり、本発明の化合物は、異なる方法で誘導体化されるべき３つの機能性部分（カルボン酸またはアミド基）を有しており、したがって、所望の官能基での反応に向かわせるために、ほとんどの場合で保護基の使用が必要である。
【0086】
保護基の除去に必要な強ｐＨおよび温度条件でシアニンを操作すると、シクロヘキセニル－ポリメチン足場の安定性が損なわれることがあり、場合によっては色素がひどく分解されるため、困難が生じることが知られている。
【0087】
さらに、Ｒ１－Ｒ５のカルボン酸基を脱保護するときに、アミド基－ＣＯＮＨ－Ｙのあり得る加水分解および分解に起因して、さらなる障害に遭遇する場合がある（典型的に、アミド誘導体は、濃縮されたアルカリ媒体中で加水分解し得る。例えば、Ｙａｍａｎａ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９７２、２０（５），８８１－８９１を参照）。
【0088】
１つの好ましい実施形態では、部分Ｒ４またはＲ５のための保護基はエステル基である。より好ましくは、エチルエステル基を有利に用いることができる。
【0089】
式（Ｉ）のシアニン色素の調製
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物は、以下のスキーム１に報告される合成ステップの一般的順序によって調製することができる。
本発明によれば、式（Ｉ）の化合物は、以下のスキーム１に報告される合成ステップの一般的順序によって調製することができる。
【0090】
【0091】
上記スキーム１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ＸおよびＹは上記に定義したとおりであり、Ｐｇは存在しないか、または適切な保護基である。
【0092】
したがって、本発明のプロセスは以下のステップを含む：
ａ）適切な量の式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の５－カルボキシ－２，３，３－トリメチルインドレニンを、ヒドロキシ部分に適切な保護基を有するグルカミン、メグルミン、グルコサミン、トロメタモール、セリノールまたはイソセリノールなどのポリヒドロキシル化アミンで処理するステップ；
ｂ）ステップａ）で得られた中間体（Ｖ）および中間体（ＶＩ）を、２－クロロ－１－ホルミル－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセンと反応させて、式（ＶＩＩ）のシアニン中間体を得るステップ（式中、Ｒ１、Ｒ２、ＹおよびＰｇは定義したとおりである）；
ｃ）中間体（ＶＩＩ）からＹ基の保護基（Ｐｇ）を除去するステップがあってもよい；
ｄ）中間体（ＶＩＩ）上のクロロ原子を適切な求核試薬で置換して、式（Ｉ）の最終生成物またはその塩を得るステップ。
ａ）適切な量の式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の５－カルボキシ－２，３，３－トリメチルインドレニンを、ヒドロキシ部分に適切な保護基を有するグルカミン、メグルミン、グルコサミン、トロメタモール、セリノールまたはイソセリノールなどのポリヒドロキシル化アミンで処理するステップ；
ｂ）ステップａ）で得られた中間体（Ｖ）および中間体（ＶＩ）を、２－クロロ－１－ホルミル－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセンと反応させて、式（ＶＩＩ）のシアニン中間体を得るステップ（式中、Ｒ１、Ｒ２、ＹおよびＰｇは定義したとおりである）；
ｃ）中間体（ＶＩＩ）からＹ基の保護基（Ｐｇ）を除去するステップがあってもよい；
ｄ）中間体（ＶＩＩ）上のクロロ原子を適切な求核試薬で置換して、式（Ｉ）の最終生成物またはその塩を得るステップ。
【0093】
ステップａ）によれば、ポリヒドロキシル化アミンと誘導体（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の反応は、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリルなどの溶媒中で、３０分～数時間の範囲の適切な時間、室温で、例えばＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＳＣおよびＤＣＣ－ＮＨＳから選択されるカップリング剤、およびＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭまたはピリジンなどの有機塩基による、カルボキシレート基の活性化によって行なうことができる。カルボン酸のこの誘導体化は、四級化の前に、アルキル化インドレニンまたはインドールに対して行なうことができる。この場合、スルトンまたはブロモヘキサン酸によるアルキル化の前に、アセチルなどの適切な保護基によってポリヒドロキシル化アミンのヒドロキシル基を保護することが重要である。このアルキル化は、高温で（例えば９０℃～１８０℃）、数時間（典型的には１２時間から５日間）溶液を撹拌しながら、ニートで、またはブチロニトリル、スルホラン、１，２－ジクロロベンゼン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドもしくはジメチルスルホキシドなどの高沸点溶剤中で、行なうことができる。
【0094】
ステップｂ）によれば、反応は、ビスアニリド形態またはビスアルデヒド形態でＶｉｌｓｍｅｉｅｒ試薬を用いて行なうことができる（スキーム１で報告される）。反応は、例えばエタノール、メタノール、無水酢酸または酢酸などの様々な溶媒中で、トリメチルアミン、ピリジン、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどの種々の塩基を添加して、または添加せずに、４５℃～１２０℃の範囲の種々の温度で数時間（典型的に２～２４時間）混合物を撹拌して行なうことができる。
【0095】
ステップｃ）によれば、中間体（ＶＩＩ）の任意の保護基は、例えばＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．２００７，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｈ．５に記載の公知の手順に従って、部分Ｙから除去される。他のクラスのシアニンとは異なり、これらの色素は、酸性ｐＨにおいて、より高温でさえも数時間、より高い安定性を示した。
【0096】
ステップｄ）によれば、反応は、Ｘ－Ｒ３置換基に応じて様々なプロトコルを用いて行なうことができる。フェノールまたはその誘導体、例えばフェノール－ＳＯ３Ｈが導入される場合は、色素を、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムなどの無機塩基の存在下、ＤＭＳＯ中で加熱することができる。一方で、クロロがフェニルまたはその誘導体によって置換される場合は、反応は、脱気水中で、または脱気水とメタノール、エタノールなどの共溶媒との混合物中で、酢酸ＰｄまたはテトラキスＰｄなどのＰｄ触媒存在下で（炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムなどの塩基であってもよい）、より短時間加熱して行なうことができる。
【0097】
Ｒ１がＲ２と同一の意味を有する場合は、１つの反応ａ）のみを行ない、その後のステップｂ）は１ユニットの中間体（Ｖ）および１ユニットの中間体（ＶＩ）の代わりに、２ユニットの中間体（Ｖ）または（ＶＩ）を用いて行なわれる。
【0098】
あるいは、Ｒ１がＲ２と同一の意味を有しており、－ＳＯ３Ｈによって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルである場合は、式（Ｉ）の化合物は、以下のスキーム２に従って調製することもできる：
【0099】
上記スキーム２において、Ｒ１は、－ＳＯ３Ｈによって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、Ｘ、ＹおよびＲ３は上記に定義したとおりである。
【0100】
したがって、本発明の別のプロセスは以下のステップを含む：
ｆ）少なくとも２つの同等物インドレニン中間体（ＩＩＩ）（式中、Ｒ１は、－ＳＯ３Ｈによって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルである）を、Ｖｉｌｓｍｅｉｅｒ試薬（ビスアルデヒドまたはビスアニリドの形態）と反応させて、式（ＩＸ）の対応するシアニン中間体を得るステップ；
ｇ）中間体（ＩＸ）上のクロロ原子を適切な求核試薬で置換して、中間体（Ｘ）を得るステップ；
ｈ）適切な量の式（Ｘ）の中間体を、例えばグルカミン、メグルミン、グルコサミン、トロメタモール、セリノールまたはイソセリノールなどのポリヒドロキシル化アミンで処理して、式（Ｉ）の最終生成物またはその塩を得るステップ。
ｆ）少なくとも２つの同等物インドレニン中間体（ＩＩＩ）（式中、Ｒ１は、－ＳＯ３Ｈによって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルである）を、Ｖｉｌｓｍｅｉｅｒ試薬（ビスアルデヒドまたはビスアニリドの形態）と反応させて、式（ＩＸ）の対応するシアニン中間体を得るステップ；
ｇ）中間体（ＩＸ）上のクロロ原子を適切な求核試薬で置換して、中間体（Ｘ）を得るステップ；
ｈ）適切な量の式（Ｘ）の中間体を、例えばグルカミン、メグルミン、グルコサミン、トロメタモール、セリノールまたはイソセリノールなどのポリヒドロキシル化アミンで処理して、式（Ｉ）の最終生成物またはその塩を得るステップ。
【0101】
ステップｆ）によれば、反応は、例えばエタノール、メタノール、無水酢酸または酢酸などの様々な溶媒中で、トリメチルアミン、ピリジン、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどの種々の塩基を添加して、または添加せずに、４５℃～１２０℃の範囲の種々の温度で数時間（典型的に２～２４時間）混合物を撹拌して行なうことができる。
【0102】
ステップｇ）によれば、反応は、Ｘ－Ｒ３置換基に応じて様々なプロトコルを用いて行なうことができる。フェノールまたはその誘導体、例えばフェノール－ＳＯ３Ｈが導入される場合は、色素を、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムなどの無機塩基の存在下、ＤＭＳＯ中で加熱することができる。一方で、クロロがフェニルまたはその誘導体によって置換される場合は、反応は、脱気水中で、または脱気水とメタノール、エタノールなどの共溶媒との混合物中で、酢酸ＰｄまたはテトラキスＰｄなどのＰｄ触媒存在下で（炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムなどの塩基であってもよい）、より短時間加熱して行なうことができる。
【0103】
ステップｈ）によれば、ポリヒドロキシル化アミンと誘導体（Ｘ）の反応は、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリルなどの溶媒中で、３０分～数時間の範囲の適切な時間、室温で、例えばＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＳＣおよびＤＣＣ－ＮＨＳから選択されるカップリング剤、およびＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭまたはピリジンなどの有機塩基による、カルボキシレート基の活性化によって行なうことができる。
【0104】
さらなる一実施形態では、本発明のプロセスに従って調製される式（Ｉ）の化合物は、公知の合成の条件に従って操作することによって式（Ｉ）の別の化合物に好適に転換することができ、以下があり得る転換の例である：
ｅ）式（Ｉ）の化合物（式中、Ｒ２は－ＣＯＯＨであり、すなわち式（Ｉｂ）の化合物である）を、式（Ｉ）の対応する化合物に転換するステップ（式中、Ｒ２は－ＣＯＮＨ２であり、すなわち式（Ｉｃ）の化合物である）：
ｅ）式（Ｉ）の化合物（式中、Ｒ２は－ＣＯＯＨであり、すなわち式（Ｉｂ）の化合物である）を、式（Ｉ）の対応する化合物に転換するステップ（式中、Ｒ２は－ＣＯＮＨ２であり、すなわち式（Ｉｃ）の化合物である）：
【0105】
ステップｅ）によれば、式（Ｉｂ）のカルボン酸を式（Ｉｃ）の対応するカルボキサミドに転換することは、カルボキサミドの調製のために当技術分野で広く知られている様々な方法および実験的条件において達成することができる。一例として、カルボン酸を、最初に適切な活性化されたエステルにおいて転換し、次いで、好ましくは、ＨＢＴＵなどのカップリング剤の存在下で、ＮＨ４Ｃｌなどのアンモニウム塩と反応させることができる。
【0106】
式（ＩＩ）のコンジュゲート化合物の調製
式（Ｉ）のシアニン誘導体、またはその塩は、適切な標的化部分とコンジュゲートさせて（スペーサーの挿入があってもよい）、式（ＩＩ）の対応する化合物を得ることができる。コンジュゲートは、当技術分野で知られている種々の手順に従って、例えば、化合物のカルボン酸基と標的化部分の求核残基の直接カップリングを介して（またはスペーサーがあってもよい）、または、カップリング前にカルボン酸基がより反応性の基、例えばＮＨＳなどのエステルに変換される以前の活性化によって、達成することができる。
式（Ｉ）のシアニン誘導体、またはその塩は、適切な標的化部分とコンジュゲートさせて（スペーサーの挿入があってもよい）、式（ＩＩ）の対応する化合物を得ることができる。コンジュゲートは、当技術分野で知られている種々の手順に従って、例えば、化合物のカルボン酸基と標的化部分の求核残基の直接カップリングを介して（またはスペーサーがあってもよい）、または、カップリング前にカルボン酸基がより反応性の基、例えばＮＨＳなどのエステルに変換される以前の活性化によって、達成することができる。
【0107】
一実施形態では、ＮＨＳエステルの形成を介したカルボン酸の活性化の場合、本発明は、式（ＸＩａ）の色素
または式（ＸＩｂ）の色素
を用いて標的化部分を標識する方法を提供し、
式中、
Ｘは、直接結合または－Ｏ－であり；
Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ１は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２および－ＣＯＯ－Ｃ１－Ｃ６アルキルから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ３は、水素、－ＳＯ３Ｈ、または、－ＣＯＯＨもしくは－ＣＯＮＨ－Ｙによって置換された直鎖もしくは分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり、
本方法は、式（ＸＩａ）または（ＸＩｂ）の色素を標的化部分と反応させるステップを含む。
式中、
Ｘは、直接結合または－Ｏ－であり；
Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり；
Ｒ１は、－ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２および－ＣＯＯ－Ｃ１－Ｃ６アルキルから選択される基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり；および
Ｒ３は、水素、－ＳＯ３Ｈ、または、－ＣＯＯＨもしくは－ＣＯＮＨ－Ｙによって置換された直鎖もしくは分岐のＣ１－Ｃ６アルキルであり、式中Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基によって置換された直鎖または分岐のＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される基であり、
本方法は、式（ＸＩａ）または（ＸＩｂ）の色素を標的化部分と反応させるステップを含む。
【0108】
上述のプロセスに従って調製された式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物が異性体の混合物として得られた場合、従来の技術を用いて式（Ｉ）または（ＩＩ）の単一の対応する異性体にそれらを分離することは本発明の範囲内である。
【0109】
最終化合物は、従来の手順、例えばクロマトグラフィーおよび／または結晶化および塩形成を用いて単離および精製され得る。
【0110】
上記に定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、薬学的に許容できる塩に変換することができる。上記に定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容できる塩を、続いて、薬学的に許容できる担体または希釈剤によって製剤化して、医薬組成物を提供することができる。
【実施例】
【0111】
［実験的パート］
以下のパートに記載される本発明およびその特定の実施形態はほんの例示であり、本発明の限定とみなされない。それらは本発明をどのように実施することができるのかを示すものであり、本発明の範囲を限定せずに例示を意味する。
以下のパートに記載される本発明およびその特定の実施形態はほんの例示であり、本発明の限定とみなされない。それらは本発明をどのように実施することができるのかを示すものであり、本発明の範囲を限定せずに例示を意味する。
【0112】
材料および装置
反応に用いられるすべての化学物質および溶媒は試薬グレードであった。分析グレードの溶媒をクロマトグラフィー精製に用いた。試薬のほとんどは、別段の報告をしない限り、標的化部分を含み市販製品である（例えばパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ、Ａｍｇｅｎ；ＣＡＳＮｒ：３３９１７７－２６－３）；ｃ（ＲＧＤｆＫ）（Ｃｙｃｌｏ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）、Ｂａｃｈｅｍ；ＣＡＳＮｒ：１６１５５２－０３－０）。
反応に用いられるすべての化学物質および溶媒は試薬グレードであった。分析グレードの溶媒をクロマトグラフィー精製に用いた。試薬のほとんどは、別段の報告をしない限り、標的化部分を含み市販製品である（例えばパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ、Ａｍｇｅｎ；ＣＡＳＮｒ：３３９１７７－２６－３）；ｃ（ＲＧＤｆＫ）（Ｃｙｃｌｏ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）、Ｂａｃｈｅｍ；ＣＡＳＮｒ：１６１５５２－０３－０）。
【0113】
すべての合成化合物は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製し、ＵＶ－ＶＩＳ検出器およびＥＳＩ源を備えたＬＣ／ＭＳ機器を用いた質量分析法によって特徴付けた。分析は、Ａ相ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４ １０ｍＭおよびＢ相アセトニトリルの勾配を用いてＷａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８ ５μｍ、４．６×１５０ｍｍカラムで行なった。測定した質量／電荷比を各化合物についてリスト化する。
【0114】
デュアルビームＵＶ－ＶＩＳ分光光度計（Ｌａｍｂｄａ ４０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて本発明の化合物の吸光度（Ａｂｓ）を決定した。発光／励起（Ｅｍ／Ｅｘ）スペクトルおよび絶対蛍光量子収率（Φ）の測定を、Ｆ－３０１８積分球アクセサリを備えた分光蛍光計（ＦｌｕｏｒｏＬｏｇ－３ １ＩＨＲ－３２０、Ｈｏｒｉｂａ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ）で行なった。測定は、種々の色素の最大吸光度で励起波長を用いて行ない、サンプルを４５０Ｗキセノン光源で励起した。検出は、光電子増倍管（ＰＭＴ－ＮＩＲ）冷却検出器またはＴＢＸ－０４検出器によって行なった。０．１（光学密度）よりも低い吸光度を有するように色素溶液を注意深く調製して再吸収現象を最小限にした。
【0115】
インビボイメージングの実験は、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて行なった。システムは、１０狭帯域励起フィルター（３０ｎｍ帯域幅）および１８狭帯域励起フィルター（２０ｎｍ帯域幅）（４３０～８５０ｎｍの範囲）を備える。
【0116】
【0117】
個々のアミノ酸残基の略称は従来のどおりである：例えば、ＡｓｐまたはＤはアスパラギン酸であり、ＧｌｙまたはＧはグリシンであり、ＡｒｇまたはＲはアルギニンである。本明細書において言及されるアミノ酸は、別段の指示がない限りＬ異性体の立体配置であることが理解されるべきである（例えば、略称リストに示されるｃ（ＲＧＤｆＫ）のＰｈｅまたは「ｆ」は、Ｄ異性体の形態である）。
【0118】
［実施例１：化合物１１の合成］
中間体（Ｖａ）の調製
５－カルボキシ－２，３，３－トリメチル－１－（４－スルホブチル）－３Ｈ－インドール－１－イウム（１０．８ｇ、３１．９ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１００ｍＬ）中に懸濁し：Ｄ－グルカミン（６．９ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１１ｍＬ、６３．７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１４．５ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで１６時間攪拌し、次いで、冷却ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を添加した。混合物を濾過し、固形物を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄した。固形物を水中に溶解し、０．１％酢酸アンモニウム／アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、淡桃色固体（１３．６ｇ、８０％収率）、ＨＰＬＣ純度（２７０ｎｍ）：９４％を得た。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋５０４．２。
中間体（Ｖａ）の調製
５－カルボキシ－２，３，３－トリメチル－１－（４－スルホブチル）－３Ｈ－インドール－１－イウム（１０．８ｇ、３１．９ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１００ｍＬ）中に懸濁し：Ｄ－グルカミン（６．９ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１１ｍＬ、６３．７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１４．５ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで１６時間攪拌し、次いで、冷却ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を添加した。混合物を濾過し、固形物を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄した。固形物を水中に溶解し、０．１％酢酸アンモニウム／アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、淡桃色固体（１３．６ｇ、８０％収率）、ＨＰＬＣ純度（２７０ｎｍ）：９４％を得た。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋５０４．２。
【0119】
中間体（ＶＩＩａ）の調製
酢酸（８．６５ｍＬ）を、無水酢酸（１０ｍＬ）中の中間体（Ｖａ）（２．０ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。混合物を４５℃で加熱し、２－クロロ－１－ホルミル－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセン（３７７．８ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を添加して黄色溶液を得た。温度を７５℃まで上げて（溶液は緑色－褐色になった）、酢酸ナトリウム（４０８ｍｇ、４．９７ｍｍｏｌ）を添加して、直ちに緑色溶液を得た。溶液を１００℃で３時間攪拌し、次いで、ＲＴまで冷却して、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を水－アセトニトリルに溶解し、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留して、緑色固体（２．５ｇ、４０％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：９０％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１５６０．５。
酢酸（８．６５ｍＬ）を、無水酢酸（１０ｍＬ）中の中間体（Ｖａ）（２．０ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。混合物を４５℃で加熱し、２－クロロ－１－ホルミル－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセン（３７７．８ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を添加して黄色溶液を得た。温度を７５℃まで上げて（溶液は緑色－褐色になった）、酢酸ナトリウム（４０８ｍｇ、４．９７ｍｍｏｌ）を添加して、直ちに緑色溶液を得た。溶液を１００℃で３時間攪拌し、次いで、ＲＴまで冷却して、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を水－アセトニトリルに溶解し、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留して、緑色固体（２．５ｇ、４０％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：９０％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１５６０．５。
【0120】
中間体（ＶＩＩＩａ）の調製
中間体（ＶＩＩａ）（２．５ｇ、１．５９ｍｍｏｌ）を水／アセトニトリル１／１（２０ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを２．２から１．５に調整した。溶液を８０℃で１６時間撹拌した。粗生成物を、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、緑色固体（１．０９ｇ、６０％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９５％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１４０．７。
中間体（ＶＩＩａ）（２．５ｇ、１．５９ｍｍｏｌ）を水／アセトニトリル１／１（２０ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを２．２から１．５に調整した。溶液を８０℃で１６時間撹拌した。粗生成物を、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、緑色固体（１．０９ｇ、６０％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９５％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１４０．７。
【0121】
化合物１１の合成
脱気水（２０ｍＬ）中の中間体（ＶＩＩＩａ）（１．０９ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）の溶液に、４（２－カルボキシエチル）－ベンゼンボロン酸（３３２ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１６５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１８１ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８０℃で１６時間、窒素雰囲気下で撹拌した。次いで、ＲＴで冷却後、２Ｎ ＨＣｌでｐＨを６．５に調整した。粗混合物を水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、緑色固体（０．７１４ｇ、６０％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：９９％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２５３．５。
脱気水（２０ｍＬ）中の中間体（ＶＩＩＩａ）（１．０９ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）の溶液に、４（２－カルボキシエチル）－ベンゼンボロン酸（３３２ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１６５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１８１ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８０℃で１６時間、窒素雰囲気下で撹拌した。次いで、ＲＴで冷却後、２Ｎ ＨＣｌでｐＨを６．５に調整した。粗混合物を水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、緑色固体（０．７１４ｇ、６０％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：９９％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２５３．５。
【0122】
［実施例２：化合物１２の合成］
実施例１で調製した化合物１１（５６ｍｇ、０．０４３４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に窒素雰囲気下で懸濁した。ＮＭＭ（１９μＬ、０．１７４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６６ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）およびＤ－グルカミン（３９ｍｇ、０．２１７ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで２時間攪拌後、混合反応物を冷却酢酸エチル（３０ｍＬ）中に沈殿させ、緑色固体を水に溶解して、０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、緑色固体をアンモニウム塩として得た（６９．８８ｍｇ）。アンモニウム対イオンを除去するために、固形物を水に溶解し、Ｃ１８カートリッジ上にチャージし、水（２ＣＶ）、０．１％ＨＣＯＯＨ（２ＣＶ）、水（５ＣＶ）で洗浄し、水／アセトニトリル１／１で溶出させた。溶媒を真空下で蒸留し、凍結乾燥させて、緑色固体（３７ｍｇ、６０％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：１００％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１４１９．４。
実施例１で調製した化合物１１（５６ｍｇ、０．０４３４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に窒素雰囲気下で懸濁した。ＮＭＭ（１９μＬ、０．１７４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６６ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）およびＤ－グルカミン（３９ｍｇ、０．２１７ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで２時間攪拌後、混合反応物を冷却酢酸エチル（３０ｍＬ）中に沈殿させ、緑色固体を水に溶解して、０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、緑色固体をアンモニウム塩として得た（６９．８８ｍｇ）。アンモニウム対イオンを除去するために、固形物を水に溶解し、Ｃ１８カートリッジ上にチャージし、水（２ＣＶ）、０．１％ＨＣＯＯＨ（２ＣＶ）、水（５ＣＶ）で洗浄し、水／アセトニトリル１／１で溶出させた。溶媒を真空下で蒸留し、凍結乾燥させて、緑色固体（３７ｍｇ、６０％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：１００％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１４１９．４。
【0123】
［実施例３：化合物１３の合成］
中間体（ＶＩｂ）の調製
乾燥した丸底フラスコにおいて、２，３，３－トリメチル－３Ｈ－インドール－５－カルボン酸（７１１ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）中に可溶化し、次いで、ＤＩＰＥＡ（３８０μＬ、４．９０ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで３０分の撹拌後、乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＴＢＴＵ（６０３ｍｇ、４．２０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。ＲＴで１時間の撹拌後、乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＤ－グルカミン（３１２ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ）の懸濁液を添加した。一晩後、反応は完了していなかったので、同量のＴＢＴＵ、ＤＩＰＥＡおよびＤ－グルカミンを添加し、さらに２時間撹拌した。混合物を真空下で乾燥させ、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、白褐色粉末を得た（８８８．２ｍｇ、７０％収率）。ＨＰＬＣ純度（２７０ｎｍ）９３％純度、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋５０２．５７。
中間体（ＶＩｂ）の調製
乾燥した丸底フラスコにおいて、２，３，３－トリメチル－３Ｈ－インドール－５－カルボン酸（７１１ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）中に可溶化し、次いで、ＤＩＰＥＡ（３８０μＬ、４．９０ｍｍｏｌ）を添加した。ＲＴで３０分の撹拌後、乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＴＢＴＵ（６０３ｍｇ、４．２０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。ＲＴで１時間の撹拌後、乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＤ－グルカミン（３１２ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ）の懸濁液を添加した。一晩後、反応は完了していなかったので、同量のＴＢＴＵ、ＤＩＰＥＡおよびＤ－グルカミンを添加し、さらに２時間撹拌した。混合物を真空下で乾燥させ、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。純生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、白褐色粉末を得た（８８８．２ｍｇ、７０％収率）。ＨＰＬＣ純度（２７０ｎｍ）９３％純度、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋５０２．５７。
【0124】
無水酢酸（３ｍＬ）およびピリジン（０．５ｍＬ）をこの中間体（８８８．２ｍｇ、２．４２ｍｍｏｌ）に添加して、時間中に徐々に可溶化する懸濁液を得た。混合物をＲＴで４時間、窒素雰囲気中に攪拌下で維持した。溶液を真空下で濃縮し、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。純粋な生成物を含む画分を回収し、真空下で濃縮し、凍結乾燥して、白褐色固体を得た（８６１．４ｍｇ、６２％収率）。ＨＰＬＣ純度（２７０ｎｍ）９７．５％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋２０４。
【0125】
丸底フラスコにおいて、このようにして得られた生成物（１．１０３ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）および１－ブロモヘキサン酸（９３３ｍｇ、４．７７ｍｍｏｌ）を、１，２－ジクロロベンゼン（６ｍＬ）に可溶化した。混合物を窒素雰囲気下で６時間、１３０℃で加熱し、次いで、他の１－ブロモヘキサン酸（９３３ｍｇ、４．７７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を同一の条件下で一晩維持した。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を静かに移し、固形物をアセトニトリルに溶解して、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。生成物を含む画分を回収し、真空中で濃縮して、赤色油状物を得た（８６１．４ｍｇ、６２％収率）。ＨＰＬＣ純度（２７０ｎｍ）９７．５％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋６９１．０。
【0126】
中間体（ＶＩＩｂ）の調製
乾燥した丸底フラスコにおいて、実施例１のとおりに調製した中間体（Ｖａ）（１．１７０ｇ、２．３３ｍｍｏｌ）、および（ＶＩｂ）（１．７９ｇ、２．３３ｍｍｏｌ）を無水酢酸（２０ｍＬ）および酢酸（５ｍＬ）に懸濁した。混合物を、２つの粉末が完全に可溶化するまで４５℃で加熱した。次いで、２－クロロ－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセン－１－カルボキサルデヒド（４３０ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱した。酢酸カリウム（２３７ｍｇ、２．８９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１００℃で２時間加熱した。溶媒を真空下で除去し、粗製緑色固体を、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。生成物を含む画分を回収し、真空中で濃縮し、凍結乾燥して、緑色粉末を得た（１．２２１ｇ、３５％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）７２％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１５４０．６。
乾燥した丸底フラスコにおいて、実施例１のとおりに調製した中間体（Ｖａ）（１．１７０ｇ、２．３３ｍｍｏｌ）、および（ＶＩｂ）（１．７９ｇ、２．３３ｍｍｏｌ）を無水酢酸（２０ｍＬ）および酢酸（５ｍＬ）に懸濁した。混合物を、２つの粉末が完全に可溶化するまで４５℃で加熱した。次いで、２－クロロ－３－（ヒドロキシメチレン）－１－シクロヘキセン－１－カルボキサルデヒド（４３０ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃まで加熱した。酢酸カリウム（２３７ｍｇ、２．８９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１００℃で２時間加熱した。溶媒を真空下で除去し、粗製緑色固体を、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。生成物を含む画分を回収し、真空中で濃縮し、凍結乾燥して、緑色粉末を得た（１．２２１ｇ、３５％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）７２％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１５４０．６。
【0127】
中間体（ＶＩＩＩｂ）の調製
中間体（ＶＩＩｂ）（７０１ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３ｍＬ）に可溶化し、水（１５ｍＬ）を添加した。溶液を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ１．６に酸性化し、８０℃で４時間加熱し、次いで、５５℃で一晩加熱した。有機溶媒を減圧下で除去し、水溶液を、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。生成物を含む画分を回収し、真空下で濃縮し、凍結乾燥して、緑色粉末を得た（１７９ｍｇ、５０％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９５％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１２０．３。
中間体（ＶＩＩｂ）（７０１ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３ｍＬ）に可溶化し、水（１５ｍＬ）を添加した。溶液を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ１．６に酸性化し、８０℃で４時間加熱し、次いで、５５℃で一晩加熱した。有機溶媒を減圧下で除去し、水溶液を、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。生成物を含む画分を回収し、真空下で濃縮し、凍結乾燥して、緑色粉末を得た（１７９ｍｇ、５０％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９５％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１２０．３。
【0128】
化合物１３の合成
乾燥した丸底フラスコにおいて、中間体（ＶＩＩＩｂ）（１１５ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）を脱気水（３ｍＬ）に可溶化し、次いで、フェニルボロン酸（２２．７ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１９．６ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）およびパラジウムテトラキス（１７．８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素雰囲気下で２時間、８０℃で加熱した。溶液を０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．１５にして、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。生成物を含む画分を回収し、真空下で濃縮し、凍結乾燥して、緑色粉末を得た（９９ｍｇ、８３％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１６２．２。
乾燥した丸底フラスコにおいて、中間体（ＶＩＩＩｂ）（１１５ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）を脱気水（３ｍＬ）に可溶化し、次いで、フェニルボロン酸（２２．７ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１９．６ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）およびパラジウムテトラキス（１７．８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素雰囲気下で２時間、８０℃で加熱した。溶液を０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．１５にして、水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。生成物を含む画分を回収し、真空下で濃縮し、凍結乾燥して、緑色粉末を得た（９９ｍｇ、８３％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１６２．２。
【0129】
［実施例４：化合物１４の合成］
実施例２のとおりに調製した中間体（ＶＩＩＩｂ）（１２０ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中の溶液を、フェノール（１０１ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）および無水炭酸カリウム（１４８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（７ｍＬ）中の懸濁液に窒素下で滴下した。混合物を５０℃で４時間撹拌した。ＲＴに冷却後、冷却ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を添加し、固形物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。それを水に溶解させ、０．５Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを１１．５から６に調整した。粗固形物を０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留した。アンモニウム対イオンを除去するために、ｐＨを１．６に調整し、生成物をＣ１８シリカカートリッジ上にチャージし、水で洗浄し、水－アセトニトリル１：１で溶出させた。溶媒を真空下で蒸留し、水溶液を凍結乾燥して、緑色固体（４２ｍｇ、３３％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９９．３％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１７８．３。
実施例２のとおりに調製した中間体（ＶＩＩＩｂ）（１２０ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中の溶液を、フェノール（１０１ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）および無水炭酸カリウム（１４８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（７ｍＬ）中の懸濁液に窒素下で滴下した。混合物を５０℃で４時間撹拌した。ＲＴに冷却後、冷却ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を添加し、固形物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。それを水に溶解させ、０．５Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを１１．５から６に調整した。粗固形物を０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留した。アンモニウム対イオンを除去するために、ｐＨを１．６に調整し、生成物をＣ１８シリカカートリッジ上にチャージし、水で洗浄し、水－アセトニトリル１：１で溶出させた。溶媒を真空下で蒸留し、水溶液を凍結乾燥して、緑色固体（４２ｍｇ、３３％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９９．３％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１７８．３。
【0130】
［実施例５：化合物１５の合成］
実施例２のとおりに調製した中間体（ＶＩＩＩｂ）（２０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の溶液を、４－ヒドロキシベンゼンナトリウムスルホネート（３５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）および無水炭酸カリウム（２５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中の懸濁液に窒素雰囲気下で滴下した。混合物を５０℃で４日間攪拌した。冷却ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を褐色混合物に添加し、固形物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。固形物を水に溶解し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨを１１．５から６に調整した。溶液は再度緑色になった。粗生成物を水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、緑色固体（１５ｍｇ、６５％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）１００％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２５７．３。
実施例２のとおりに調製した中間体（ＶＩＩＩｂ）（２０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の溶液を、４－ヒドロキシベンゼンナトリウムスルホネート（３５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）および無水炭酸カリウム（２５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中の懸濁液に窒素雰囲気下で滴下した。混合物を５０℃で４日間攪拌した。冷却ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を褐色混合物に添加し、固形物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。固形物を水に溶解し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨを１１．５から６に調整した。溶液は再度緑色になった。粗生成物を水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、緑色固体（１５ｍｇ、６５％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）１００％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２５７．３。
【0131】
［実施例６：化合物１６の合成］
実施例１のとおりに調製した中間体（ＶＩＩＩａ）（３０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の溶液を、４－ヒドロキシベンゼンナトリウムスルホネート（１４ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）および無水炭酸カリウム（１０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の懸濁液に窒素雰囲気下で滴下した。混合物を８０℃で６時間撹拌した。冷却酢酸エチル（２０ｍＬ）を褐色混合物に添加し、固形物を濾過し、水に溶解し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨを１１．５から３に調整した。溶液は再度緑色になった。粗生成物を水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、緑色固体（１４ｍｇ、４２％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９７．８％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２７７．３。
実施例１のとおりに調製した中間体（ＶＩＩＩａ）（３０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の溶液を、４－ヒドロキシベンゼンナトリウムスルホネート（１４ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）および無水炭酸カリウム（１０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の懸濁液に窒素雰囲気下で滴下した。混合物を８０℃で６時間撹拌した。冷却酢酸エチル（２０ｍＬ）を褐色混合物に添加し、固形物を濾過し、水に溶解し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨを１１．５から３に調整した。溶液は再度緑色になった。粗生成物を水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、緑色固体（１４ｍｇ、４２％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９７．８％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２７７．３。
【0132】
［実施例７：化合物１７の合成］
乾燥した丸底フラスコにおいて、実施例１のとおりに調製した中間体（ＶＩＩＩａ）（９ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を脱気水（２ｍＬ）に可溶化し、次いで、フェニルボロン酸（２．２ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）および酢酸パラジウム（０．１５ｍｇ、０．０００６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素雰囲気下で２時間還流した。溶液を水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。生成物を含む画分を回収し、真空下で濃縮し、凍結乾燥して、緑色粉末を得た（７ｍｇ、７５％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１８４．３。
乾燥した丸底フラスコにおいて、実施例１のとおりに調製した中間体（ＶＩＩＩａ）（９ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を脱気水（２ｍＬ）に可溶化し、次いで、フェニルボロン酸（２．２ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）および酢酸パラジウム（０．１５ｍｇ、０．０００６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素雰囲気下で２時間還流した。溶液を水－アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムで精製した。生成物を含む画分を回収し、真空下で濃縮し、凍結乾燥して、緑色粉末を得た（７ｍｇ、７５％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１８４．３。
【0133】
［実施例８：化合物１９の合成］
中間体（ＩＸａ）の調製
化合物（ＩＩＩａ）（１８０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）、Ｎ－［（３－（アニリノメチレン）－２－クロロ－１－シクロヘキセン－１－イル）メチレン］アニリン一塩酸塩（１０１ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（１０９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を無水エタノール（５５ｍＬ）に溶解し、溶液を２６時間還流した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を、水／アセトニトリルの勾配を用いてシリカＣ１８カラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、緑色固体（１５４ｍｇ、７２％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９７％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８１５．２。
中間体（ＩＸａ）の調製
化合物（ＩＩＩａ）（１８０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）、Ｎ－［（３－（アニリノメチレン）－２－クロロ－１－シクロヘキセン－１－イル）メチレン］アニリン一塩酸塩（１０１ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（１０９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を無水エタノール（５５ｍＬ）に溶解し、溶液を２６時間還流した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を、水／アセトニトリルの勾配を用いてシリカＣ１８カラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、緑色固体（１５４ｍｇ、７２％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９７％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８１５．２。
【0134】
中間体（Ｘａ）の調製
中間体（ＩＸａ）（４０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（４ｍＬ）中の溶液を、フェノール（４５ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）および無水炭酸カリウム（６８ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（８ｍＬ）中の懸濁液に窒素雰囲気下で滴下した。混合物を５０℃で８時間撹拌した。ＲＴに冷却後、冷却ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を添加し、固形物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。それを水に溶解し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨを１２から６に調整した。粗固形物を、水／アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留した。溶媒を減圧下で蒸留し、水溶液を凍結乾燥して、緑色固体（２６ｍｇ、６１％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８７２．１
中間体（ＩＸａ）（４０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（４ｍＬ）中の溶液を、フェノール（４５ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）および無水炭酸カリウム（６８ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（８ｍＬ）中の懸濁液に窒素雰囲気下で滴下した。混合物を５０℃で８時間撹拌した。ＲＴに冷却後、冷却ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を添加し、固形物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。それを水に溶解し、０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨを１２から６に調整した。粗固形物を、水／アセトニトリル勾配を用いてプレパックＣ１８シリカカラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留した。溶媒を減圧下で蒸留し、水溶液を凍結乾燥して、緑色固体（２６ｍｇ、６１％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８７２．１
【0135】
化合物１９の合成
ＴＢＴＵ（５．１ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を、中間体（Ｘａ）（３．３ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６μＬ、０．０３１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の溶液に添加した。溶液をＲＴで３０分攪拌し、次いで、セリノール（１ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を９０分攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を、水－アセトニトリルの勾配により溶出するシリカＣ１８カラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、濃緑色固体（２ｍｇ、５３％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８．５％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１０１９．１。
ＴＢＴＵ（５．１ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を、中間体（Ｘａ）（３．３ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６μＬ、０．０３１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中の溶液に添加した。溶液をＲＴで３０分攪拌し、次いで、セリノール（１ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を９０分攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を、水－アセトニトリルの勾配により溶出するシリカＣ１８カラムでフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、濃緑色固体（２ｍｇ、５３％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８．５％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１０１９．１。
【0136】
同様に、化合物１８、２０、２１、２２および２３を同様の手順に従うが、異なる水酸化アミンを用い（Ｙ基として）、または、フェノールの代わりにフェニルを有する足場から開始して、上述のように調製した。
【0137】
［実施例９：化合物１の合成］
化合物１１（５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）中に不活性雰囲気下で溶解した。ＤＩＰＥＡ（６．８μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（１２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液をＲＴで４８時間撹拌した。次いで、冷却ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加し、沈殿物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄して、緑色固体を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：９０％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１３５１。
化合物１１（５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）中に不活性雰囲気下で溶解した。ＤＩＰＥＡ（６．８μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（１２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液をＲＴで４８時間撹拌した。次いで、冷却ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加し、沈殿物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄して、緑色固体を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：９０％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１３５１。
【0138】
ＮＨＳエステルを、１ｍＬのホウ酸バッファー（ｐＨ９）中のｃ（ＲＧＤｆＫ）（２．７ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）の溶液に溶解した。反応物をＲＴで２４時間攪拌し、次いで、生成物を冷却ジエチルエーテル中に沈殿させ、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄して、緑色固体を得た。粗固形物を、０．１％酢酸アンモニウム／アセトニトリルの線形勾配を用いてＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ８カラムでＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、緑色固体（３．９ｍｇ、５０％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：９７．６％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１８４０．６。
【0139】
［実施例１０：化合物３の合成］
［直接カップリングを介した手順Ａ］
乾燥した丸底フラスコにおいて、化合物１３（２ｍｇ、０．００１７ｍｍｏｌ）を、窒素流下ＲＴでＤＩＰＥＡ（０．６μｌ、０．００３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１ｍＬ）中に可溶化した。ＲＴで３０分の撹拌後、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＴＢＴＵ（０．６ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。ＲＴで１時間の撹拌後、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中のｃ（ＲＧＤｆＫ）（１．４ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌溶液中に滴下した。反応物をＲＴで一晩攪拌し、次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を、０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリル勾配を用いて分析用ＨＰＬＣ Ｃ１８シリカカラムで精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で濃縮し、凍結乾燥を３回行なって、緑色粉末を得た（０．７ｍｇ、２３％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８％、ＭＳ：［Ｍ／２］＋８７２．８。
［直接カップリングを介した手順Ａ］
乾燥した丸底フラスコにおいて、化合物１３（２ｍｇ、０．００１７ｍｍｏｌ）を、窒素流下ＲＴでＤＩＰＥＡ（０．６μｌ、０．００３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１ｍＬ）中に可溶化した。ＲＴで３０分の撹拌後、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＴＢＴＵ（０．６ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。ＲＴで１時間の撹拌後、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中のｃ（ＲＧＤｆＫ）（１．４ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌溶液中に滴下した。反応物をＲＴで一晩攪拌し、次いで、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を、０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリル勾配を用いて分析用ＨＰＬＣ Ｃ１８シリカカラムで精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で濃縮し、凍結乾燥を３回行なって、緑色粉末を得た（０．７ｍｇ、２３％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８％、ＭＳ：［Ｍ／２］＋８７２．８。
【0140】
［ＮＨＳエステルを介した手順Ｂ］
乾燥した丸底フラスコにおいて、化合物１３（５ｍｇ、０．００４３ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡ（２．２μｌ、０．０１２９ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中に可溶化し、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＴＳＴＵ（３．７８ｍｇ、．０１２９ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素流の下で室温にて添加した。緑色溶液をＲＴで一晩攪拌し、次いで、冷却ジエチルエーテルの添加によって生成物を沈殿させた。固形物を遠心分離して、ジエチルエーテルで２回洗浄し、さらに精製せずに以下のステップにおいて用いた。ＮＨＳエステルを、ホウ酸バッファー（ｐＨ９）（１ｍＬ）中のｃ（ＲＧＤｆＫ）（２．２ｍｇ、０．００４３ｍｍｏｌ）の溶液に溶解し、溶液を室温で一晩攪拌した。次いで、０．１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを７に調整し、粗生成物を、０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリル勾配を用いて分析用ＨＰＬＣＣ１８シリカカラムで精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で濃縮し、凍結乾燥を３回行なって、緑色粉末を得た（３．９ｍｇ、５２％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９７．７％、ＭＳ：［Ｍ／２］＋８７２．８。
乾燥した丸底フラスコにおいて、化合物１３（５ｍｇ、０．００４３ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡ（２．２μｌ、０．０１２９ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中に可溶化し、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＴＳＴＵ（３．７８ｍｇ、．０１２９ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素流の下で室温にて添加した。緑色溶液をＲＴで一晩攪拌し、次いで、冷却ジエチルエーテルの添加によって生成物を沈殿させた。固形物を遠心分離して、ジエチルエーテルで２回洗浄し、さらに精製せずに以下のステップにおいて用いた。ＮＨＳエステルを、ホウ酸バッファー（ｐＨ９）（１ｍＬ）中のｃ（ＲＧＤｆＫ）（２．２ｍｇ、０．００４３ｍｍｏｌ）の溶液に溶解し、溶液を室温で一晩攪拌した。次いで、０．１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを７に調整し、粗生成物を、０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリル勾配を用いて分析用ＨＰＬＣＣ１８シリカカラムで精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で濃縮し、凍結乾燥を３回行なって、緑色粉末を得た（３．９ｍｇ、５２％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９７．７％、ＭＳ：［Ｍ／２］＋８７２．８。
【0141】
［実施例１１：化合物２の合成］
化合物１５（６ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（６ｍＬ）中に懸濁し、次いで、ＮＭＭ（２．６μＬ、０．０２４ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（７．２ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで１６時間攪拌した。冷却ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を添加し、沈殿物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。緑色固体をさらに精製することなく以下のステップにおいて用いた。ＨＰＬＣ（７８０ｎｍ）：８８％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１３５４．３。
化合物１５（６ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（６ｍＬ）中に懸濁し、次いで、ＮＭＭ（２．６μＬ、０．０２４ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（７．２ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を添加した。溶液をＲＴで１６時間攪拌した。冷却ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を添加し、沈殿物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。緑色固体をさらに精製することなく以下のステップにおいて用いた。ＨＰＬＣ（７８０ｎｍ）：８８％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１３５４．３。
【0142】
ＮＨＳエステルをホウ酸バッファー（ｐＨ９）（１ｍＬ）に溶解し、ホウ酸バッファー（ｐＨ９）（１ｍＬ）中のｃ（ＲＧＤｆＫ）（３．４ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。溶液をＲＴで５時間攪拌し、次いで、０．１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを６．５に調整し、粗生成物を、０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリルの線形勾配を用いてフェニル－Ｃ１８カラムでＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、緑色固体（６．４ｍｇ、７１％収率）を得た。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９９．６％。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１８４５．５。
【0143】
［実施例１２：化合物４の合成］
化合物１４（１２ｍｇ、０．０１０２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に窒素雰囲気下で溶解した。ＤＩＰＥＡ（４．８μＬ、０．０２８６ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（４．６ｍｇ、０．０１４３ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＴで１時間の撹拌後に、ｃ（ＲＧＤｆＫ）（６．１５ｍｇ、０．０１０２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をＲＴで１６時間攪拌し、次いで、冷却ジエチルエーテル（２５ｍＬ）を添加し、沈殿物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。粗固形物を水に溶解し、０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリルの線形勾配を用いてフェニル－Ｃ１８カラムでＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、緑色固体を得た（１２．３ｍｇ、６７％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８．３％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１７６３．６。
化合物１４（１２ｍｇ、０．０１０２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に窒素雰囲気下で溶解した。ＤＩＰＥＡ（４．８μＬ、０．０２８６ｍｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（４．６ｍｇ、０．０１４３ｍｍｏｌ）を添加し、ＲＴで１時間の撹拌後に、ｃ（ＲＧＤｆＫ）（６．１５ｍｇ、０．０１０２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をＲＴで１６時間攪拌し、次いで、冷却ジエチルエーテル（２５ｍＬ）を添加し、沈殿物を濾過し、冷却ジエチルエーテルで２回洗浄した。粗固形物を水に溶解し、０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリルの線形勾配を用いてフェニル－Ｃ１８カラムでＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせて、真空下で蒸留し、凍結乾燥を３回行なって、緑色固体を得た（１２．３ｍｇ、６７％収率）。ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）９８．３％、ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１７６３．６。
【0144】
［実施例１３：化合物５の合成］
モノクローナル抗体ＥＧＦＲリガンドパニツムマブ（６ｍｇ）をＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、１２０μＬの１．０Ｍリン酸カリウム（ｐＨ９）を添加することによってｐＨを調整した。化合物１５－ＮＨＳエステル（実施例１１において化合物２について記載したとおりに調製した）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解し；次いで、色素および抗体を２．５：１のモル比で直ちに混合し、室温で暗所に３時間維持した。３時間後、コンジュゲート反応混合物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡されたＺｅｂａ Ｓｐｉｎカラム上に層化し、１５００ｇで２分間遠心分離し、コンジュゲートを遊離色素から分離した。０．２２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を通して濾過した後、ＰＢＳ中のコンジュゲート化パニツムマブ溶液（ｐＨ７．４）をＳＥ－ＨＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度法によって分析して、濃度および純度を決定した。モルのコンジュゲート比（抗体あたりの結合した色素分子）は１．５３であった。
モノクローナル抗体ＥＧＦＲリガンドパニツムマブ（６ｍｇ）をＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、１２０μＬの１．０Ｍリン酸カリウム（ｐＨ９）を添加することによってｐＨを調整した。化合物１５－ＮＨＳエステル（実施例１１において化合物２について記載したとおりに調製した）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解し；次いで、色素および抗体を２．５：１のモル比で直ちに混合し、室温で暗所に３時間維持した。３時間後、コンジュゲート反応混合物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡されたＺｅｂａ Ｓｐｉｎカラム上に層化し、１５００ｇで２分間遠心分離し、コンジュゲートを遊離色素から分離した。０．２２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を通して濾過した後、ＰＢＳ中のコンジュゲート化パニツムマブ溶液（ｐＨ７．４）をＳＥ－ＨＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度法によって分析して、濃度および純度を決定した。モルのコンジュゲート比（抗体あたりの結合した色素分子）は１．５３であった。
【0145】
［実施例１４：化合物６の合成］
小分子ＣＡＩＸリガンド４ａ（Ｗｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ ２０１５，７，２４１－２４９に記載）を、開示されている手順に従って調製し、化合物１５にコンジュゲートした。１１ｍｇの化合物１５（８．７μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、次いで、４．５ｍｇのＰｙＢＯＰ（８．７μｍｏｌ）および６μＬのＤＩＰＥＡ（３５．０μｍｏｌ）を連続的な撹拌下で添加した。２０分後、８ｍｇの小分子４ａ（１３．０μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、反応混合物に添加して、これをさらに３０分間室温で攪拌した。分取ＨＰＬＣによる精製を５０％の収率で行なった。単離された純生成物を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８カラム（μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣ－ＵＶ－ＶＩＳ－ＭＳ－ＥＳＩ（＋）によって特徴付けた。ＨＰＬＣ純度（７７９ｎｍ）：９９％；ＭＳ：［Ｍ／２］＋９２９．７。
小分子ＣＡＩＸリガンド４ａ（Ｗｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ ２０１５，７，２４１－２４９に記載）を、開示されている手順に従って調製し、化合物１５にコンジュゲートした。１１ｍｇの化合物１５（８．７μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、次いで、４．５ｍｇのＰｙＢＯＰ（８．７μｍｏｌ）および６μＬのＤＩＰＥＡ（３５．０μｍｏｌ）を連続的な撹拌下で添加した。２０分後、８ｍｇの小分子４ａ（１３．０μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、反応混合物に添加して、これをさらに３０分間室温で攪拌した。分取ＨＰＬＣによる精製を５０％の収率で行なった。単離された純生成物を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８カラム（μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣ－ＵＶ－ＶＩＳ－ＭＳ－ＥＳＩ（＋）によって特徴付けた。ＨＰＬＣ純度（７７９ｎｍ）：９９％；ＭＳ：［Ｍ／２］＋９２９．７。
【0146】
［実施例１５：化合物７の合成］
小分子ＣＡＩＸリガンド８ａ（Ｗｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ ２０１５，７，２４１－２４９に記載）を、開示されている手順に従って調製し、化合物１５にコンジュゲートした。９ｍｇの化合物１５（７．１μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、次いで、３．７ｍｇのＰｙＢＯＰ（７．１μｍｏｌ）および５μＬのＤＩＰＥＡ（２８．０μｍｏｌ）を連続的な撹拌下で添加した。２０分後、１１ｍｇの分子８ａ（１１．０μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、反応混合物に添加して、これをさらに３０分間ＲＴで撹拌した。分取ＨＰＬＣによる精製を５０％の収率で行なった。単離された純生成物を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８カラム（μｍ、４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣ－ＵＶ－ＶＩＳ－ＭＳ－ＥＳＩ（＋）によって特徴付けた。
ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：９９％；ＭＳ：［Ｍ／２］＋１１５７．８。
小分子ＣＡＩＸリガンド８ａ（Ｗｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ ２０１５，７，２４１－２４９に記載）を、開示されている手順に従って調製し、化合物１５にコンジュゲートした。９ｍｇの化合物１５（７．１μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、次いで、３．７ｍｇのＰｙＢＯＰ（７．１μｍｏｌ）および５μＬのＤＩＰＥＡ（２８．０μｍｏｌ）を連続的な撹拌下で添加した。２０分後、１１ｍｇの分子８ａ（１１．０μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、反応混合物に添加して、これをさらに３０分間ＲＴで撹拌した。分取ＨＰＬＣによる精製を５０％の収率で行なった。単離された純生成物を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８カラム（μｍ、４．６ｘ１５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣ－ＵＶ－ＶＩＳ－ＭＳ－ＥＳＩ（＋）によって特徴付けた。
ＨＰＬＣ純度（７８０ｎｍ）：９９％；ＭＳ：［Ｍ／２］＋１１５７．８。
【0147】
［実施例１６：化合物８の合成］
９．９ｍｇの化合物１５（７．９μｍｏｌ）を３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解し、次いで、２μＬのＮＭＭ（１８．２μｍｏｌ）および７．１１ｍｇのＴＳＴＵ（２３．６μｍｏｌ）を添加し、混合物をＲＴで２時間撹拌した。化合物１５のＮＨＳエステル（ＨＰＬＣ転換８５．９％）を２５ｍＬの氷冷酢酸エチル中で沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、Ｎ２流の下で乾燥させた。
９．９ｍｇの化合物１５（７．９μｍｏｌ）を３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解し、次いで、２μＬのＮＭＭ（１８．２μｍｏｌ）および７．１１ｍｇのＴＳＴＵ（２３．６μｍｏｌ）を添加し、混合物をＲＴで２時間撹拌した。化合物１５のＮＨＳエステル（ＨＰＬＣ転換８５．９％）を２５ｍＬの氷冷酢酸エチル中で沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、Ｎ２流の下で乾燥させた。
【0148】
化合物１５のＮＨＳエステルを１ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解した。１ｍＬのＤＭＦ中に５．７４ｍｇのＥｕＫ ＴＦＡ塩（１３．４３μｍｏｌ）を溶解することによって調製した溶液を滴下した。次いで、１ｍＬ ＤＭＦ中の１３．７２μＬのＤＩＰＥＡ（７．８μｍｏｌ）の溶液を滴下した。溶液をＮ２雰囲気下、ＲＴで一晩攪拌させた。生成物（ＨＰＬＣ転換８４％）を２５ｍＬの氷冷ジエチルエーテル中に沈殿させ、水／アセトニトリル勾配を用いて溶出する自動化フラッシュクロマトグラフィーシステム（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｒｆ＋）を備えるプレパック・シリカＣ１８カラム（ＢＩＯＴＡＧＥ（登録商標）ＳＮＡＰ ＵＬＴＲＡ ２６ｇ）で精製した。所望の純生成物を含む画分を合わせて、真空下で濃縮し、凍結乾燥して、６．６５ｍｇの緑色固体を回収した（ＨＰＬＣ純度面積％：９８．７％（７８５ｎｍ）および１００％（２５４ｎｍ）；［Ｍ－Ｈ］＋１５５８．７）。化合物１５からの収率は５４．０％であった。
【0149】
［実施例１７：化合物９の合成］
９．９ｍｇの化合物１５（７．９μｍｏｌ）を３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解した。２μＬのＮＭＭ（１８．２μｍｏｌ）および７．１１ｍｇのＴＳＴＵ（２３．６μｍｏｌ）を添加し、混合物をＲＴで２時間撹拌した。化合物１５のＮＨＳエステル（ＨＰＬＣ転換８５．９％）を２５ｍＬの氷冷酢酸エチル中に沈殿させた、沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、Ｎ２流の下で乾燥させた。
９．９ｍｇの化合物１５（７．９μｍｏｌ）を３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解した。２μＬのＮＭＭ（１８．２μｍｏｌ）および７．１１ｍｇのＴＳＴＵ（２３．６μｍｏｌ）を添加し、混合物をＲＴで２時間撹拌した。化合物１５のＮＨＳエステル（ＨＰＬＣ転換８５．９％）を２５ｍＬの氷冷酢酸エチル中に沈殿させた、沈殿物を酢酸エチルで洗浄し、Ｎ２流の下で乾燥させた。
【0150】
化合物１５のＮＨＳエステルを乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解した。Ｂｅｎｅｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１５，５６：９１４－９２０に記載のとおりに調製したＥｕＫ－（３－（２－ナフチル）－アラニン）－トラネキサム酸ＴＦＡ塩（７．２３ｍｇ、０．００９４５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中の溶液を滴下した。次いで、ＤＩＰＥＡ（６．８６μＬ、０．０３９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中の溶液を滴下した。溶液を、Ｎ２雰囲気下で、ＲＴで一晩攪拌させた。生成物（ＨＰＬＣ転換９３％）を２５ｍＬの氷冷ジエチルエーテル中に沈殿させ、水／アセトニトリル勾配を用いて溶出する自動化フラッシュクロマトグラフィーシステム（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｒｆ＋）を備えるプレパック・シリカＣ１８カラム（ＢＩＯＴＡＧＥ（登録商標）ＳＮＡＰ ＵＬＴＲＡ ２６ｇ）で精製した。所望の純生成物を含む画分を合わせて、真空下で濃縮し、凍結乾燥して、４．２５ｍｇの緑色固体を回収した（ＨＰＬＣ純度面積％：９９．６％（７８５ｎｍ）および９８％（２５４ｎｍ）；［Ｍ－Ｈ］＋１８９４．６）。化合物１５からの収率は２８．０％であった。
【0151】
［実施例１８：光学特性］
水性媒体（すなわち、水／ＰＢＳ ｐＨ７．４）およびヒト血清の化学組成物および光学特性を模倣している臨床化学コントロール血清（Ｓｅｒｏｎｏｒｍ，Ｓｅｒｏ ＳＡ）において、本発明の化合物をそれらのインビトロでの光学特性の観点から特徴付けた。すべての色素または色素コンジュゲート溶液を新たに調製した。ＩＣＧおよびＳ０４５６を市販参照として用いた。
水性媒体（すなわち、水／ＰＢＳ ｐＨ７．４）およびヒト血清の化学組成物および光学特性を模倣している臨床化学コントロール血清（Ｓｅｒｏｎｏｒｍ，Ｓｅｒｏ ＳＡ）において、本発明の化合物をそれらのインビトロでの光学特性の観点から特徴付けた。すべての色素または色素コンジュゲート溶液を新たに調製した。ＩＣＧおよびＳ０４５６を市販参照として用いた。
【0152】
特に、式（Ｉ）の代表的な化合物および式（ＩＩ）のコンジュゲートの励起および発光の最大値および絶対蛍光量子収率（Φ）を表ＩＩに示す。
【0153】
【0154】
本発明の化合物は、約７６０ｎｍ～８１０ｎｍの範囲内に含まれる吸収最大値によって特徴付けられる。色素は、標的化部分にコンジュゲートした場合でさえも、近赤外領域における蛍光発光および高い蛍光量子収率を有する。概して、色素およびコンジュゲートは、ＩＣＧおよびＳ０４５６よりも高い蛍光量子収率を示す。
【0155】
［実施例１９：ヒトアルブミン（ＨＳＡ）の親和性］
本発明の化合物のヒトアルブミンに対する結合親和性の分析を行ない、結果を参照としてのＩＣＧおよびＳ０４５６と比較した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ９５１１）への結合親和性を、化合物の結合親和性のレベルに従って２つの方法を用いて測定した。
本発明の化合物のヒトアルブミンに対する結合親和性の分析を行ない、結果を参照としてのＩＣＧおよびＳ０４５６と比較した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ９５１１）への結合親和性を、化合物の結合親和性のレベルに従って２つの方法を用いて測定した。
【0156】
第１の方法は、ＨＳＡと強く相互作用する化合物に最適であり、ＨＳＡを含む溶液における色素のインキュベーション後の吸光度スペクトルピークのシフトの分析に基づく。簡潔には、測定前に、リン酸バッファー中で５分間、２５℃で分光光度計において、サンプルを固定濃度（１μＭ）でＨＳＡ希釈物（１×１０－６～４×１０－４Ｍ）とともにインキュベートした。測定は、シフトしたピークの最大吸光度波長で行なった。
【0157】
第２の方法は、ＨＳＡに対して低親和性を有する化合物に適切であり、限外濾過後の色素および様々な濃度のＨＳＡを含む溶液の吸光度の変動の測定に基づく。簡潔には、リン酸バッファー中で、各化合物を固定濃度（２μＭ）でＨＳＡ希釈物（１×１０－６～４×１０－４Ｍ）とともにインキュベートした。サンプルをＭｉｃｒｏｃｏｎ装置（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ，Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備える）において遠心分離し（１０，０００ｇ、２５℃で３０分間）、濾液の吸光度測定を、フルオロフォアの最大吸光度波長で分光光度計を用いて得た。
【0158】
両方の方法について、親和定数（ＫＡ、Ｍ－１）を、以下の式を用いて生データをフィッテイングすることによって計算した：
式中、
ΔＡ／ｂ＝測定した吸光度（ｂ＝１ｃｍ）
ＫＲＬ＝回帰分析によって計算したＫＡ（カーブフィッティング）
Δε・回帰分析によって計算したＲｔ（カーブフィッティング）
［Ｌ］＝アルブミン濃度
ΔＡ／ｂ＝測定した吸光度（ｂ＝１ｃｍ）
ＫＲＬ＝回帰分析によって計算したＫＡ（カーブフィッティング）
Δε・回帰分析によって計算したＲｔ（カーブフィッティング）
［Ｌ］＝アルブミン濃度
【0159】
第１の方法では、ΔＡ／ｂは、各サンプルについて測定した吸光度に相当し、一方で第２の方法では、ΔＡ／ｂは、互いのサンプルの吸光度に対してコントロールサンプル（ＨＳＡなしの色素）の吸光度を差し引くことによって得られる。
【0160】
両方の方法は、第１の方法（ＨＳＡ ＫＡ＝２１５，０００Ｍ－１）および第２の方法（ＨＳＡ ＫＡ＝２１６，０００Ｍ－１）を用いて市販シアニン色素ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷカルボキシレート（ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｎｃ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＳＡ）に対して行なった並行実験によって示されるように、同等の結果を提供することが示された。しかしながら、親和定数の測定は、化合物の親和性レベルの関数として適切な方法を用いた場合に、より正確であった。
【0161】
２つの方法の一方を用いて本発明の代表的な化合物について測定した結合親和性の結果を表ＩＩＩに報告し、参照化合物としてのシアニン色素ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷカルボキシレート色素について得られた結果と比較する。
【0162】
【0163】
表ＩＩＩに示されるように、本発明の色素および色素－コンジュゲートの両方とも、公知の近赤外色素ＩＣＧおよびＳ０４５６と比較してヒトアルブミンに対する著しく低い結合親和性を示し、親和定数は１桁または２桁低かった。
【0164】
この有利な特徴は、標的化部分と色素のコンジュゲートはヒトアルブミンに対する親和性に影響しないので、本発明の色素において標的化部分とコンジュゲートした場合でさえも保存されている（例えば、化合物２および４）。
【0165】
［実施例２０：受容体結合親和性］
式（ＩＩ）のコンジュゲートの特異的な受容体に対する結合親和性を決定して、分子ベクターの標的化有効性が本発明の色素による標識後に保存されるかどうか評価した。
式（ＩＩ）のコンジュゲートの特異的な受容体に対する結合親和性を決定して、分子ベクターの標的化有効性が本発明の色素による標識後に保存されるかどうか評価した。
【0166】
小分子およびペプチド／ペプチド模倣薬のコンジュゲートの例として、代表的なインテグリン－結合コンジュゲートの受容体親和性を、それらのＩＣ５０（半数最大阻害濃度）を以前に報告されたように（Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１７，７，３９８０５）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて計算することによって評価した。
【0167】
簡潔には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、カーボネートバッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質ビトロネクチンによって４℃で一晩コーティングした。次いで、各ウェルをＰＢＳ－Ｔ－バッファー（リン酸緩衝生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ２０、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、ＴＳ－Ｂ－バッファー（トリス－塩類／ＢＳＡバッファー；２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５、１％ＢＳＡ）を用いてＲＴで１時間ブロッキングした。その間に、化合物および内部標準の希釈系列を余分プレートにおいて調製した。アッセイプレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、５０μＬの希釈系列を各ウェルに移した。ＴＳ－Ｂ－バッファー中のヒト組み換えインテグリンαｖβ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１μｇ／ｍＬ）の溶液５０μＬをウェルに移し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔバッファーで３回洗浄し、次いで、一次抗体抗－αｖβ３をプレートに添加した。インキュベーションおよびＰＢＳ－Ｔを用いた３回の洗浄後、二次抗－ＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体をプレートに添加し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、プレートを３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の迅速な添加によって展開し、暗所で５分間インキュベートした。３Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を止め、プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0168】
代表的な化合物１、２および４のＩＣ５０をデュプリケートで試験し、生じた阻害曲線を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。変曲点はＩＣ５０値を定義する。すべての実験は、内部標準としてｃ（ＲＧＤｆＫ）を用いて行なった。
【0169】
ｃ（ＲＧＤｆＫ）に結合された試験された分子プローブは、表ＩＶに報告するように、ヒトαｖβ３受容体に対する同等の親和性、および非コンジュゲート参照ペプチド模倣薬ｃ（ＲＧＤｆＫ）に対する同様の親和性を示した。
【0170】
【0171】
［実施例２１：細胞取り込み］
ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ－２６６－４（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６７６）をインビトロモデルとして用いて、代表的なインテグリン結合化合物１、２および４の細胞取り込みを評価した。（これらの細胞の膜上のインテグリン受容体、特にαｖβ３の高発現に基づく（Ｃａｐａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏｓＯｎｅ ２０１４））。
ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ－２６６－４（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６７６）をインビトロモデルとして用いて、代表的なインテグリン結合化合物１、２および４の細胞取り込みを評価した。（これらの細胞の膜上のインテグリン受容体、特にαｖβ３の高発現に基づく（Ｃａｐａｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏｓＯｎｅ ２０１４））。
【0172】
約７０％コンフルエンスの接着細胞を、化合物１または３（１μＭ）とともに３７°Ｃ（５％ＣＯ２）で２時間、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の存在下でインキュベートした。ＰＢＳを用いた２回の洗浄ステップ後、ＰＢＳ中の０．１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞を引き離し、遠心分離し、フローサイトメトリー実験のためにバッファー（ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡ、０．１％ ＮａＮ３）中に懸濁した。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、細胞取り込みの尺度として細胞内の蛍光シグナルを検出した。サンプルをアルゴンレーザーで励起し、６７０ｎｍロングパスフィルターを用いて発光を検出した。蛍光強度の値を、機器ソフトウェアによって生成されたヒストグラム統計から取得した。
【0173】
受容体が介在する細胞取り込みの特異性を評価するために、競合物として高濃度（１００μＭ）の非標識分子ベクターｃ（ＲＧＤｆＫ）の存在下で、細胞を分子プローブとインキュベートすることによって実験を行なった。残存する内在化を、競合物の不存在下での蛍光強度の値を１００％とすることによって計算した。
【0174】
さらに、細胞取り込みに対する生物学的流体の効果を評価するために、男性ＡＢ血漿由来のヒト血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｈ４５２２）の存在下で本発明の化合物と細胞をインキュベートする並行実験を行なった。残存する内在化を、血清の不存在下での蛍光強度の値を１００％とすることによって計算した。そのような取り込み評価はまた、目的組織および特定の標的化受容体に到達する前に、血管区画を通って拡散するときに血漿タンパク質によって隔離される化合物のパーセンテージの示度を表わす。表Ｖにおいて、本発明の代表的な化合物２および４の細胞取り込み能力を示す。
【0175】
本化合物は、ヒト血清の存在下で高い細胞取り込みを示した。したがって、本化合物について、細胞における内在化が受容体によって媒介され、ヒト血清タンパク質、特にアルブミンに対する結合によってほんのわずかにしか影響を受けないことが観察され（残存取り込みの約１０～２０％）、本化合物のヒトアルブミンに対する中程度～低い結合親和性が確認される（実施例１０に示されるように、ＫＡ＝約１～６×１０３Ｍ－１）。さらに、本発明の化合物を、参照化合物ＩＣＧ－ＲＧＤ（Ｃａｐｏｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ２０１８，１１，３６－４５）およびＩＣＧ－ＲＧＤと同じ方法で調製されたＩＣＧ－ｃ（ＲＧＤｆＫ）と比較した。これらの結果は、ヒト血清の存在下でインキュベートした場合に、本発明の化合物が、驚くべきことに、当技術分野で知られている同様の化合物と比べて、細胞内在化におけるより高い有効性を付与することが見いだされたことを示している。
【0176】
【0177】
顕著なことに、細胞表面上の受容体と本化合物の相互作用も、細胞内の受容体－プローブ複合体の内在化も、コンジュゲート色素構造によって、および特に、化合物の位置Ｙにおける非常に親水性かつ高度の立体障害を有する部分の存在によって、損なわれなかった。したがって、コンジュゲート色素上の親水性部分の存在は、親水性部分のないコンジュゲートを隔離して結合効率に負の影響を及ぼす血漿タンパク質の存在下でさえも、非常に効率的かつ特異的な受容体結合およびプローブ内在化を与える。
【0178】
［実施例２２：動物モデルにおける腫瘍取り込み］
ヒト膠芽腫
腫瘍取り込み実験を、インテグリン受容体、特にαｖβ３を過剰発現するヒト膠芽腫（皮下）の動物モデルにおいて行なった。簡潔には、ヒト膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－１４）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充されたイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。雄Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス、４～６週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、０．１ｍＬのＥＭＥＭ中に懸濁した約１０００万細胞を皮下移植した（右脇腹）。飼料および水を適宜与えてケージあたり４匹のマウスを収容した。動物に、順化期間（５日）の最後までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌｔｄ）を与えた。次いで、自家蛍光を減少させる特殊な食物であるＡＩＮ－７６ａ齧歯類飼料（照射）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を、実験の終わりまで用いた。腫瘍増殖を、３００～６００ｍｍ３の標的サイズ（細胞移植の３～４週間後）まで、カリパスを用いて縦断的評価（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）によってモニターした。イメージング実験を、前臨床光学システムＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行なった。
ヒト膠芽腫
腫瘍取り込み実験を、インテグリン受容体、特にαｖβ３を過剰発現するヒト膠芽腫（皮下）の動物モデルにおいて行なった。簡潔には、ヒト膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－１４）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充されたイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。雄Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス、４～６週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、０．１ｍＬのＥＭＥＭ中に懸濁した約１０００万細胞を皮下移植した（右脇腹）。飼料および水を適宜与えてケージあたり４匹のマウスを収容した。動物に、順化期間（５日）の最後までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌｔｄ）を与えた。次いで、自家蛍光を減少させる特殊な食物であるＡＩＮ－７６ａ齧歯類飼料（照射）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を、実験の終わりまで用いた。腫瘍増殖を、３００～６００ｍｍ３の標的サイズ（細胞移植の３～４週間後）まで、カリパスを用いて縦断的評価（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）によってモニターした。イメージング実験を、前臨床光学システムＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行なった。
【0179】
インビボイメージングをガス麻酔下で行なった（酸素中のＳｅｖｏｆｌｕｏｒａｎｅ６～８％）。動物に化合物を静脈内注入して（側尾静脈）、投与の２４時間後に安楽死させた。関心領域（ＲＯＩ）を摘出腫瘍および健常筋組織に設定し、シグナル強度を評価した（平均放射効率として表される）。次いで、腫瘍および筋肉（バックグラウンド組織）における蛍光シグナル間の比を計算して、コントラストを評価した。
【0180】
代表的な化合物１および４の腫瘍－対－バックグラウンド比を表ＶＩに示す。これらの結果は、著しく高い腫瘍取り込みを示し、腫瘍特異的な蓄積を示唆している。
【0181】
【0182】
ヒト頭頚部がん
腫瘍取り込み実験を、特にインテグリン受容体αｖβ６を過剰発現するＤｅｔｒｏｉｔ－５６２細胞を用いて、ヒト頭頚部がん（同所性）の動物モデルにおいて行なった。簡潔には、ヒト咽頭がん腫細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ－５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１３８）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充されたイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。雄Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス、４～６週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、０．０３ｍＬのｄｉ ＥＭＥＭ中に懸濁した約２５０万細胞を、舌の前部に同所性移植した。飼料および水を適宜与えてケージあたり４匹のマウスを収容した。動物に、順化期間（５日）の最後までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌｔｄ）を与えた。次いで、自家蛍光を減少させる特殊な食物であるＡＩＮ－７６ａ齧歯類飼料（照射）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を、実験の終わりまで用いた。腫瘍増殖を、１０～２０ｍｍ３の標的サイズ（細胞移植の７～１０日後）まで、カリパスを用いて縦断的評価によってモニターした。
腫瘍取り込み実験を、特にインテグリン受容体αｖβ６を過剰発現するＤｅｔｒｏｉｔ－５６２細胞を用いて、ヒト頭頚部がん（同所性）の動物モデルにおいて行なった。簡潔には、ヒト咽頭がん腫細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ－５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１３８）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充されたイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。雄Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス、４～６週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、０．０３ｍＬのｄｉ ＥＭＥＭ中に懸濁した約２５０万細胞を、舌の前部に同所性移植した。飼料および水を適宜与えてケージあたり４匹のマウスを収容した。動物に、順化期間（５日）の最後までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌｔｄ）を与えた。次いで、自家蛍光を減少させる特殊な食物であるＡＩＮ－７６ａ齧歯類飼料（照射）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を、実験の終わりまで用いた。腫瘍増殖を、１０～２０ｍｍ３の標的サイズ（細胞移植の７～１０日後）まで、カリパスを用いて縦断的評価によってモニターした。
【0183】
イメージング実験を、前臨床光学システムＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行なった。動物に３ｎｍｏｌ／マウスで静脈内注入して（側尾静脈）、投与後２４時間に、麻酔の過量投与によって安楽死させて、エクスビボでの光学イメージングのために舌を摘出した。関心領域（ＲＯＩ）を舌の前部（腫瘍細胞移植の部位）および後部領域（健常組織）に設定し、腫瘍－対－バックグラウンド比を得た。
【0184】
化合物１および２の投与の２４時間後に行なったエクスビボのイメージングにより、腫瘍細胞を移植した舌部位において明領域が明らかとなった。それとは異なり、舌の後方の健常領域は低いシグナルを示し、健常組織における低い保持が示唆された。本発明の化合物の投与は、表ＶＩＩに示されるように、適度の（ｍｏｄｅｒａｔｅ）（ＴＢＲ約２）腫瘍－対－バックグラウンドのコントラストで腫瘍の位置を解明する。
【0185】
【0186】
ヒト結腸直腸がん
腫瘍取り込み実験を、低レベルのインテグリン受容体を発現するＨＴ－２９細胞を用いて、ヒト結腸直腸がん（皮下）の動物モデルにおいて行なった。簡潔には、ヒト結腸直腸腺がん細胞ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３８）を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充されたＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地中で培養した。雄無胸腺ｎｕｄｅマウス、４～６週齢（Ｅｎｖｉｇｏ）に、０．１ｍＬの血清フリー培地中に懸濁した約５００万細胞を皮下移植した（右脇腹）。飼料および水を適宜与えてケージあたり４匹のマウスを収容した。動物に、順化期間（５日）の最後までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌｔｄ）を与えた。次いで、自家蛍光を減少させる特殊な食物であるＡＩＮ－７６ａ齧歯類飼料（照射）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を、実験の終わりまで用いた。腫瘍増殖を、３００～６００ｍｍ３の標的サイズ（細胞移植の３～４週後）まで、カリパスを用いて縦断的評価によってモニターした。イメージング実験を、前臨床光学システムＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行なった。
腫瘍取り込み実験を、低レベルのインテグリン受容体を発現するＨＴ－２９細胞を用いて、ヒト結腸直腸がん（皮下）の動物モデルにおいて行なった。簡潔には、ヒト結腸直腸腺がん細胞ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３８）を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充されたＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地中で培養した。雄無胸腺ｎｕｄｅマウス、４～６週齢（Ｅｎｖｉｇｏ）に、０．１ｍＬの血清フリー培地中に懸濁した約５００万細胞を皮下移植した（右脇腹）。飼料および水を適宜与えてケージあたり４匹のマウスを収容した。動物に、順化期間（５日）の最後までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌｔｄ）を与えた。次いで、自家蛍光を減少させる特殊な食物であるＡＩＮ－７６ａ齧歯類飼料（照射）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を、実験の終わりまで用いた。腫瘍増殖を、３００～６００ｍｍ３の標的サイズ（細胞移植の３～４週後）まで、カリパスを用いて縦断的評価によってモニターした。イメージング実験を、前臨床光学システムＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行なった。
【0187】
インビボイメージングをガス麻酔下で行なった（酸素中のＳｅｖｏｆｌｕｏｒａｎｅ６～８％）。動物に目的の化合物を静脈内注入して（側尾静脈）、投与の２４時間後に安楽死させた。関心領域（ＲＯＩ）を摘出腫瘍および健常参照組織（筋肉）に設定し、シグナル強度を評価した（平均放射効率として表される）。次いで、腫瘍および筋肉（バックグラウンド組織）における蛍光シグナル間の比を計算して、腫瘍－対－バックグラウンド比（ＴＢＲ）を評価した。
【0188】
表ＶＩＩＩに示されるように、代表的な化合物１および２は、適度の（ｍｏｄｅｒａｔｅ）腫瘍－対－バックグラウンド比（ＴＢＲ約４）を示し、健常バックグラウンドから腫瘍組織を明確に線引きするのを可能にした。
【0189】
【0190】
【国際調査報告】