特表 2023-530584 鶏卵卵白からのタンパク質の新規精製方法とＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する抗ウイルス剤としての使用法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-19

(54)【発明の名称】鶏卵卵白からのタンパク質の新規精製方法とＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する抗ウイルス剤としての使用法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/36 20060101AFI20230711BHJP

   C07K 14/465 20060101ALI20230711BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230711BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20230711BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230711BHJP

   A61K 31/4706 20060101ALI20230711BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230711BHJP

   A61K 38/13 20060101ALI20230711BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20230711BHJP

   A61K 31/4965 20060101ALI20230711BHJP

   A61K 31/53 20060101ALI20230711BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20230711BHJP

   C07K 1/20 20060101ALN20230711BHJP

   C07K 1/22 20060101ALN20230711BHJP

   C07K 1/36 20060101ALN20230711BHJP

【ＦＩ】

C12N9/36

C07K14/465

A61P31/14

A61K38/46

A61P43/00 121

A61K31/4706

A61K39/395 S

A61K38/13

A61K31/436

A61K31/4965

A61K31/53

A61K38/16

C07K1/20

C07K1/22

C07K1/36

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2022569195

(86)(22)【出願日】2021-05-11

(85)【翻訳文提出日】2022-11-29

(86)【国際出願番号】 IB2021053999

(87)【国際公開番号】W WO2021229430

(87)【国際公開日】2021-11-18

(31)【優先権主張番号】63/022,638

(32)【優先日】2020-05-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】102020000016663

(32)【優先日】2020-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522442227

【氏名又は名称】バイオセウティカ ベーフェー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＳＥＵＴＩＣＡ ＢＶ

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】フェラーリ、 ヴァレリオ マリア

(72)【発明者】

【氏名】バッジオ、 マリア カーラ

(72)【発明者】

【氏名】グリセンティ、 パリデ

【テーマコード（参考）】

4B050

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050DD11

4B050FF11E

4B050FF14E

4B050HH03

4B050JJ03

4B050KK02

4B050LL01

4C084AA02

4C084AA06

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084CA41

4C084DA11

4C084DC22

4C084MA13

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4C084MA56

4C084MA59

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4C084MA65

4C084MA66

4C084NA03

4C084NA05

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4C084ZC75

4C085AA14

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4C085DD62

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG08

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC28

4C086BC48

4C086CB05

4C086CB22

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA17

4C086MA52

4C086MA56

4C086MA59

4C086MA60

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA03

4C086NA05

4C086ZB33

4C086ZC75

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA29

4H045FA71

4H045GA25

4H045GA26

(57)【要約】

【課題】鶏卵白からのタンパク質の精製とＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する抗ウイルス剤としての使用方法を提供する。
【解決手段】本発明は、鶏卵白（ＨＥＷ）からリゾチーム塩酸塩を高い化学純度で製造するための新規方法、および任意に他の抗ウイルス剤および／または免疫抑制剤およびオボトランスフェリンと組み合わせた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する前記抗ウイルス剤の使用について説明するものである。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

鶏卵白からリゾチーム塩酸塩を精製する方法であって、
ａ）原液の鶏卵白（ＨＥＷ）から弱酸性カチオン樹脂を用い、攪拌下で粗リゾチーム塩基を単離し、その後、生理食塩水で処理する工程、
ｂ）リゾチーム塩酸塩の粗溶液を調製する工程、
ｃ）無機塩類を除去する工程、
ｄ）ウイルスの不活性化／抗ウイルス剤の活性化をする工程、
ｅ）スプレードライ法により非晶質リゾチーム塩酸塩を分離する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られたリゾチーム塩酸塩を熱処理する工程、
を含む方法。

【請求項2】

工程ａ）において、ｐＨ７．０～９．０に事前調整された、粒径範囲３００～１６００μｍの弱酸性ポリアクリルマクロポーラスカチオニック樹脂が使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程ａ）において、炭酸ナトリウムの１５％ｗ／ｗ水溶液でｐＨを調整する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

工程ａ）において、原液のＨＥＷと樹脂との相対比が８～１２ｌ／ｌの範囲である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

工程ａ）において、樹脂を最大６０ｒｐｍの攪拌速度および２５℃から４０℃の範囲の温度で攪拌下に維持する、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

工程ａ）において、弱酸性カチオン性樹脂がピューロライト^(R)Ｃ１０６ＥＰまたは同等品であり、総容量≧２．７ｅｑ／ｌである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

工程ａ）において、樹脂を２５～４０℃、好ましくは３０～３５℃の範囲の温度で２～７％ＮａＣｌ溶液で処理する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

工程ｂ）において、工程ａ）で溶出したＮａＣｌの水溶液を、０～８℃の範囲の温度で４～２４時間、最終ｐＨ値が１０～１１の間に達するまで水性無機塩基で処理して、まずろ過によって回収し、次に最終ｐＨが２．５～３．５の範囲になるまで塩酸の水溶液に溶解してリゾチーム塩基を得る、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

工程ｂ）の水性無機塩基が水酸化ナトリウムの４～８％ｗ／ｖ水溶液である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

工程ｂ）において、粗リゾチーム塩基を、ＨＥＷの初期量に対して１／３０～１／６０ｖ／ｖの範囲の相対比で脱塩水中に分散させる、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

工程ｃ）において、粗リゾチーム塩酸塩溶液を、２～８％塩酸水溶液を用いて、最終ｐＨ３．０～４．０の範囲に調整し、限外ろ過および／または透析ろ過により無機塩を除去する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

工程ｃ）が、１０ｋダルトンのカットオフを有する限外ろ過膜および透析ろ過膜を用いて実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

工程ｄ）において、限外濾過／透析ろ過水溶液を任意に４０℃～１００℃の範囲の温度で最大７日間、好ましくは９０℃で２～６分間加熱する、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

工程ｆ）において、工程ｅ）で得られた粉末に対して、任意に、４０℃～１００℃の範囲の温度で最大７日間、好ましくは７４℃で１時間又は９９℃で４０分間、リゾチーム塩酸塩の熱処理を行う、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

加熱処理したリゾチームが、処理終了時に不変のクロマトグラフィー純度および酵素活性を示す（±１．０％）、請求項１３および１４に記載の方法。

【請求項16】

工程ｅ）において、工程ｃ）またはｄ）で得られた溶液を４０℃で加熱し、スプレードライヤーで処理する、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

工程ｅ）において、脱溶媒室の温度が１６０～２２０℃の範囲にあり、純粋な非晶質リゾチーム塩酸塩を提供する、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス剤として使用するための、請求項１～１７に記載の方法により得られるリゾチーム塩酸塩。

【請求項19】

クロロキン、ファビラビル、レムデシビル、アビガン、トシリズマブ、シクロスポリンＡ、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ミコフェノール酸モフェチル及びピメクロリムスから選ばれる抗ウイルス剤及び／又は免疫抑制剤と組み合わせて用いる、請求項１８による使用のためのリゾチーム塩酸塩。

【請求項20】

オボトランスフェリンと組み合わせて用いる、請求項１９に記載の使用のためのリゾチーム塩酸塩。

【請求項21】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の予防及び治療のための、経口、局所、吸入、注射、静脈内、胃腸内、腹腔内、胸膜内、気管支内、鼻腔内又は直腸用の医薬組成物であって、抗ウイルス有効量のリゾチーム塩酸塩、任意でオボトランスフェリンと適切な担体及び／又は賦形剤との組み合わせを含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、鶏卵白（ＨＥＷ）からリゾチーム塩酸塩を高い化学純度で製造するための新規プロセス、および任意に他の抗ウイルス剤および／または免疫抑制剤およびオボトランスフェリンと組み合わせた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する前記抗ウイルス剤の使用について開示している。

【背景技術】

【0002】

ＨＥＷのタンパク質組成は、まだ十分に解明されていない。卵白に含まれるタンパク質の混合物は特に複雑で、分子量が非常に異なるため（１２．７ｘ１０^３から２４０ｘ１０^６ダルトンの範囲）、分析上の特殊な問題がある。卵白におけるそれらの濃度も大きく異なり、オボアルブミンはもっとも豊富なタンパク質である。プロテオミクス技術は、ＨＥＷの解析に応用され、前記タンパク質組成の同定・定量に用いられてきた。ＨＥＷに存在する全タンパク質の約５０％を占めるオボアルブミンのほか、オボトランスフェリン、オボムコイド、アビジン、リゾチーム、オボグロブリンが代表的なタンパク質である。具体的には、リゾチームとオボトランスフェリンがＨＥＷに存在する全タンパク質のそれぞれ３．５％と１２－１３％を占めている（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００１，４９，４５５３－４５６）。

【0003】

リゾチーム（別名ムラミダーゼ）は、抗生物質および抗ウイルス作用を有する粘液溶解酵素であり、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｆｌｅｍｉｎｇによって初めて発見された（Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ９３Ｂ，３０６（１９２２））。リゾチームは自然界にも広く存在し、ＨＥＷだけでなく、涙、鼻粘液、牛乳、唾液、血清、脊椎動物、無脊椎動物を問わず様々な動物の組織や分泌物、カビの一部、植物の乳液にも含まれる。リゾチームはその起源が異なるため、細菌細胞壁の主要ポリマーであるペプチドグリカンのＮ－アセチルムラム酸とＮ－アセチルグルコサミン間のグリコシドβ－（１，４）結合を切断するという共通の特徴を持つ、異なるタイプのものが同定されている。前記加水分解酵素は、グリコシラーゼファミリーに属し、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ）により３．２．１．１７の番号で同定されるものである。ＨＥＷリゾチームは分子量約１４，８３６ダルトンで、その一次、二次、三次構造は１９６３年に完全に明らかにされた（Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４０（５），９９７－２００２；Ｂｌａｋｅ ＣＣＦら、Ｎａｔｕｒｅ，１９６，１１７３，１９６２）。

【0004】

オボトランスフェリン（別名コンアルブミン）は、ＨＥＷに存在するタンパク質で、１９００年に初めて記載され（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２２，４２２（１９００）；卵白に存在する他のタンパク質からその精製は、１９４０年に初めて報告された（Ｌｏｎｇｗｏｒｔｈら、Ｉｂｉｄ．６２，２５８０（１９４０））。鶏のオボトランスフェリンの一次構造、およびその精製、特性、鉄イオン結合特性は１９８２年から知られている（Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２，２９７（１９８２）；ｗ．ｍ．Ｋｅｕｎｇら、Ｊ．ビオールケム２５７，１１７７，１１８４（１９８２））。前記タンパク質は、約７６，０００ダルトンの分子量を有し、抗菌活性（Ｐ．Ｖａｌｅｎｔｉら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２１，８４０（１９８２））、抗ウイルス活性を有する（Ｆ．Ｇｉａｎｓａｎｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｉｓ．Ｃｏｍｍ．３３１，（２００５），６９－７３）。また、鉄を結合・放出する特性から、ヒトの鉄分補給剤としての利用も視野に入れた評価が行われている（Ｆ．Ｇｉａｎｓａｎｔｉら、２０１１，１８２０（３），２１８－２５）。

【0005】

リゾチームを有効成分として使用するためには、クロマトグラフィーの純度が高く、天然由来の鳥類ウイルス（鳥アブラウイルス１型、インフルエンザＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ９など）を含まない製品を提供する精製方法を工業規模で研究・開発する必要がある。塩または溶媒による沈殿によってＨＥＷからリゾチームを単離するための実験室の手順の種々の例が既に記載されており、タンパク質の変性または低純度によるいくつかの欠点を伴う（Ｌｉｎｚ Ｒ．ら、Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ ｄｅｓ Ｓeａｎｃｅｓ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｔe ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ ｅｔ ｄｅ Ｓｅｓ Ｆｉｌｉａｌｅｓ，２６，１２７９－８０；Ａｌｄｅｒｔｏｎら、，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５７，４３（１９４５）；Ａｌｄｅｒｔｏｎ，Ｆｅｖｏｌｄ，ｉｂｉｄ．１６４，１（１９４６）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｒｅｐｎｓ １，６７（１９４９）；Ｓｏｐｈｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２３７，１１０７（１９６２））。

【0006】

液体クロマトグラフィー、特にイオン交換クロマトグラフィーを用いたＨＥＷタンパク質の精製プロセスは、この場合、タンパク質の電荷と移動相のイオン強度に依存して分離されるため、より効果的であることが証明された。しかし、この方法は、ＨＥＷの原液で操作する大規模生産には、当該製品の密度が吸着問題を引き起こし、低い溶出流量を引き起こすという欠点がある。さらに、文献に報告されているデータから、卵タンパク質間で許容できるクロマトグラフィー分離を得るために、樹脂の容量以下で操作する必要があり、大量の固定相を操作する必要があることが確認されている。例えば、イオン交換カラム（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^(R) Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなどの第４級アンモニウム樹脂を使用）、グラジエント溶出（ｐＨ９のＴｒｉｓ塩酸塩緩衝液と０．３％のＮａＣｌ水溶液）を用いた場合、リゾチームの回収率は６０％と非常に低くなる。リゾチームとオボトランスフェリンを分離するために開発されたこの方法は、リゾチームのクロマトグラフィー純度が９９％と８８％（２つのピークに分かれている）の許容範囲であるのに対し、分離したオボトランスフェリンのクロマトグラフィー純度は７５％に過ぎない（Ｖａｃｈｉｅｒ，ＭＣら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，６６４（１９９５），２０１－２１０）。さらに、異なるイオン交換樹脂、すなわちＩＲＣ５０樹脂（カルボン酸官能基を有する弱酸性樹脂）を選択し、移動相としてｐＨ７．１８のリン酸バッファーを用いても、純度や収率の面で悪い結果となっている（Ｓｔｅｉｎら、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｃｈｅｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１９５２，１７－３０）。

【0007】

ＨＥＷリゾチームとオボトランスフェリンを工業規模で調製するためのより効率的なクロマトグラフィー工程の必要性から、アフィニティークロマトグラフィー、より効率の高い樹脂の使用、特に陽イオン交換樹脂、磁気安定化流動床、表面インプリント技術を用いたクロマトグラフィー、クライオゲルの使用などのクロマトグラフィー代替アプローチの研究が行われている。

【0008】

アフィニティークロマトグラフィーは１９９３年にＣｈｉａｎｇ Ｂ．Ｈ．らによってテストされ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５８（２），３０３－６，１９９３）、最近ではＦｅｄｅｒｉｃｏ Ｊ．Ｗ．らが発表している（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３１，１８１－１８８（２０１０））。この技術は、リゾチームとキチンのＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンモノマーとの親和性相互作用を利用したものである。特に、Ｆｅｄｅｒｉｃｏ Ｊ．Ｗ．らが説明したプロセスは、ＨＥＷリゾチームの原液のバッチ精製プロセスを提供し、８０％のリゾチームがＨＥＷから除去され、マトリックスがフィルターを通してろ過により回収され、総収率が６４％であることを特徴とする。このプロセスでは、酸化ケイ素マトリックスの層間にキチン質を非共有結合で保持した生体用吸着剤複合体を用いるが、このマトリックスは本研究グループが独自に開発したものである。前記固定相が商業的に入手できないこと、前記固定相の再使用を保証するための試験回数が少ないこと、および前記固定相におけるリゾチームの吸収速度が極めて遅いこと（約１０時間）は、この方法のスケールアップの可能性についての未解決の問題である。

【0009】

卵白リゾチームのクロマトグラフィー精製に陽イオン交換樹脂を用いた例も報告されているが、純度、収率ともに悪い結果であった。例えば、２００３年のＨｙｏｕｎｇ Ｗ．Ｋ．ら（Ｈｗａｈａｋ Ｋｏｎｇｈａｋ，４１（３），３３２－３３６，２００３）は、同文献で報告されているＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析で示されるように、低い収率と純度をもたらすＮａＣｌグラジエントで異なる溶出を行う弱カチオン交換樹脂の性能を評価している。ＳＰセファロースＦＦのような強陽イオン交換樹脂を用いても、リゾチームのクロマトグラフィー精製性能は向上せず、あらかじめオボムチンを沈殿分離した希釈ＨＥＷから出発し、そのろ液を前記ＳＰセファロースＦＦ樹脂で精製したプロセスシミュレーションでは、リゾチームの回収率は８０％に達している（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２７（３），７３３－４３，２０１１）。

【0010】

最近では、磁気安定流動床（ＭＳＦＢ）を用いた希薄なＨＥＷからのリゾチームの精製プロセスも報告されている。例えば、Ｆｅ_２Ｏ_４ナノ粉末の存在下、２－ヒドロキシエチルメタクリレートの懸濁液中で重合して調製した平均球形粒子径８０－１２０μｍのＭＳＦＢを用いて、リゾチームの分離は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度が８７％、回収率が８０％で達成されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，４１（３），２３４－４２，２００７）。さらに、鶏卵白リゾチームの疎水性親和性を利用して、ポリ（グリシジルメタクリレート－Ｎ－メタクリル－Ｌ－トリプトファン）のモノサイズ磁性マイクロビーズ（直径１．６μｍ）も使用した。リゾチーム吸着試験は、磁気安定化流動床システムにおいて、異なる実験条件（リゾチーム濃度、温度、イオン抵抗など）で実施した（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２９（５），１６２７－１６３４，２００９）。しかし、希釈したＨＥＷで操作する必要があること（これらの固定相の粒子径が小さいため）、工業用大型カラムで磁場を使用するという未解決の技術的問題、リゾチームの非定量回収、およびこれらの固定相が商業的に入手できないことが、これらの技術のスケールアップに制限を与えている。

【0011】

また、分子インプリント技術は、希釈したＨＥＷからリゾチームを分離・精製するためにも使用されている。この手法を用いて、ヒドロキシエチルメタクリレートから二重重合性結合を導入できるように、β－シクロデキストリンとアクリルアミドを機能性モノマーとして表面にグラフトさせたポリ（グリシジルメタクリレート）マイクロビーズを作製した（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２８，（４），５３４－５４０，２０１４）。このポリマーを分子インプリンティングすることで、８０％のリゾチームをクロマトグラフィーで濃縮できることを発見し、「実サンプル」での産業利用の可能性を想定している。使用した固定相のサイズ（約５ミクロン）が高い操作圧力を必要とすることと、このテストが希釈したＨＥＷに対して行われたという事実は、この技術のスケールアップの可能性に対して未解決の問題を示している。

【0012】

最後に、ＨＥＷリゾチームの精製における最新のクロマトグラフィーアプローチの１つに、クライオジェルを使用する方法がある。クライオゲルは一般に、特定のモノマーやポリマー前駆体を氷点下で低温ゲル化することにより発現する超多孔質ゲルのネットワークである（Ｒｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２００２，７１，４８９－５１１）。この手順は、モノマーまたはポリマー前駆体を含むコロイド溶液または分散液を適度に凍結し、凍結状態で保存し、その後解凍することで行われる。前記クライオゲルの三次元構造は特異であり、例えばポリアクリルアミドクライオゲルは、主にクライオトロピックゲル化温度によってスポンジ状のモルフォロジーが誘起される。ＨＥＷリゾチームを精製するための前記クライオゲルシステムには、その表面に様々なリガンドを結合させたり、ポリマー鎖をクライオゲルの表面にグラフト化させたりする様々な改良が開発されてきた。例えば、分散重合で製造したポリ（グリシジルメタクリレート－Ｎ－メタクリロイル－（Ｌ）－トリプトファンメチルエステル）［ＰＧＭＡＴｒｙｐ］ビーズをポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）［ＰＨＥＭＡ］クライオゲルにロードし、－１２℃でＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチレンジアミンと過硫酸アンモニウムを用いて複合クライオゲルを提供した（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，１２３，８５９－８６５，（２０１４））。前記複合クライオゲルを固定相として用い、ｐＨ７で希釈したＨＥＷからリゾチームを精製し、エチレングリコールを含むｐＨ４の移動相で溶出後、純度８５％、収率７８％のリゾチームを得ることができた。前記複合クライオゲルの最大吸収容量は、ポリマー１ｇあたり約３５０ｍｇのリゾチームであった。希釈したＨＥＷから得られたリゾチームを精製するために用いられるビーズに組み込まれた複合クライオジェルの他の使用例としては、最終回収収率が報告されていない、ポリマー１ｇあたり５７ｍｇのリゾチームの最大吸収容量を有するポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート－Ｎ－メタクリロイル）－Ｌ－フェニルアラニンの固定相（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２（２），２００－７，２０１５）；および、反応性色素（シバクロンブルーＦ３ＢＡおよびアルカリブルー６Ｂブルー）を固定化して調製した、ポリマー１ｇあたり１０３～１０７ｍｇの最大吸収容量を有するポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）からなるクライオゲルディスクがある（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７５（６），２７９５－８０５，２０１５）。この場合、前記ディスクを溶液中で使用してバッチ処理を行い、チオシアン酸カリウムの水溶液で脱着を行って吸収容量を測定した。

【0013】

これらのアプローチには、非商用固定相やクライオゲルディスクの使用、希釈したＨＥＷでの操作（固定相の粒径分布が約５ミクロンと小さいため、クロマトグラフィー精製にはこれが不可欠）という共通の制約がある。さらに、上記のプロセスの中には、脱着段階でエチレングリコールやチオシアン酸カリウム（人体に有毒）など、最終製品から徹底的に除去しなければならない有毒化合物を使用しているものもある。

【0014】

そのため、より簡便かつ効果的に精製し、抗ウイルス剤や抗菌剤の原薬として使用可能な純度で収率のよいリゾチームを得ることが求められている。

【0015】

リゾチーム（ヒトまたはＨＥＷから分離）の潜在的な抗ウイルスおよび抗菌活性について、単独または他の抗生物質や抗ウイルス剤との併用について、様々な文献で研究されている。特に、リゾチームの抗ウイルス活性は、パラインフルエンザウイルス３型（ＮＹ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｐｔ．Ｄｉｖ．Ｌａｂ．Ｒｅｓ，５５，１９６１）、ＨＩＶ－１感染（Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１８）１８５：７８６－７９８）、単純ヘルペスウイルス１型（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０（１９８４），３５－４０）、Ａ型肝炎ウイルス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２６６（２０１８）１０４－１０８）、牛ウイルス下痢ウイルス（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１９）１５：３１８）およびポリオウイルス（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｅａｒｃｈｇａｔｅ．ｎｅｔ／ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ／３２０２３８０１０）などがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

当該ウイルス株に対するリゾチームの抗ウイルス作用のメカニズムは未だ不明であるが、ヘルペスの場合、低ポリソチーム血症が起こると感染が再発する傾向があり（フレミングのリゾチーム、Ｅｄｉｚｉｏｎｉ Ｍｉｎｅｒｖａ Ｍｅｄｉｃａ、１９７６）、ウイルス感染とリゾチームの生理濃度の直接的相関が示唆されている。リゾチームの抗ウイルス剤としての治療的使用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験されているが、ＨＥＷから分離したリゾチームをウイルス感染に対する予防的細胞保護および／または既に感染した細胞の治療のためのＡＰＩとして使用するための明確な証拠はこれまでに提供されていない。

【0017】

２０１９年１２月、中国保健当局は武漢市（中国湖北省）で原因不明の肺炎患者群を報告し、当該患者の病原体は、未だ有効な治療法が見つかっていない新規コロナウイルス（仮称：２０１９－ｎＣｏＶ）であることが確認された。ＣＯＶＩＤ－１９の原因ウイルスは、国際ウイルス分類委員会コロナウイルス研究グループ（ＣＳＧ）によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と分類され、指定されている。最近では、Ｃａｃｏ－２細胞をモデルとして得られた実験結果から、「ネイティブ」リゾチーム（ヒト好中球および鶏卵白から精製）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を防御しないこと、特に直接的な抗ウイルス活性を有しないことが示唆されている（Ｃａｒｉｎａ Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎら、Ａｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｆｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｎｔｉｖｉｒａｌ．２０２０．１０４８８２）。

【0018】

したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して活性を持ち、できれば低毒性で化学純度の高い新しい抗ウイルス剤を得ることが緊急かつ必要である。

【課題を解決するための手段】

【0019】

定義
Ｖｅｒｏ細胞は、アフリカミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓｐ．）から抽出した腎臓上皮細胞から分離した細胞培養に用いる細胞株である。前記細胞株は、多数の分裂サイクルを経て複製することができ、かつ、老化しない。

【0020】

ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）とは、病原体（ウイルスや細菌など）と感染細胞の比率のことである。

【0021】

ΔＣｔは、未処理細胞の上清と処理した感染細胞の上清のＣｔ（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値の差を表す（ΔＣｔ＝未処理細胞の上清のＣｔ－感染細胞の上清のＣｔ）。

【0022】

ＰＦＵ（Ｐｌａｑｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）は、ウイルス学において、単位体積あたりにプラークを形成することができるウイルス粒子の数を表すために使用される測定値である。ＰＦＵ／ｍＬは試料中の感染性粒子の数を表し、形成されたプラークがそれぞれ感染性ウイルス粒子を代表していると仮定した結果である。

【0023】

本発明は、ＨＥＷから、アブラウイルス１やインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ９などの鳥類ウイルスを含まない高化学純度のリゾチーム塩酸塩を製造する新規プロセスを開示し、得られた生成物を、任意に他の抗ウイルス剤および免疫抑制剤および／またはオボトランスフェリンと組み合わせてＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する抗ウイルス剤として使用することを開示する。

【0024】

本発明に従って製造されたリゾチーム塩酸塩は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御剤としてｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で有効性が証明されており、既に感染した細胞におけるウイルスの複製を減少させることができる。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明は、鶏卵白から分離したリゾチーム塩酸塩を精製するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
ａ）原液の鶏卵白から弱酸性カチオン樹脂を用い、攪拌下で粗リゾチーム塩基を単離し、その後、生理食塩水での処理する工程；
ｂ）リゾチーム塩酸塩の粗溶液を調製する工程；
ｃ）無機塩類を除去する工程；
ｄ）ウイルスの不活性化／抗ウイルスの活性化をする工程；
ｅ）スプレードライ法による非晶質リゾチーム塩酸塩を分離する工程；
ｆ）工程ｅ）で得られたリゾチーム塩酸塩を熱処理する工程。

【0026】

工程ａ）は、例えば炭酸ナトリウムの１５％ｗ／ｗ水溶液を加えてｐＨ７．０～９．０に事前調整した、粒径３００～１６００μｍの弱酸性ポリアクリルマクロポーラスカチオニック樹脂で行うのが好ましい。原液ＨＥＷと樹脂との相対比は８～１２ｌ／ｌの範囲であり、樹脂は通常、最大６０ｒｐｍの攪拌速度、２５℃から４０℃の範囲の温度で攪拌下に維持される。工程ａ）で使用される弱酸性カチオン性樹脂は、好ましくはピューロライト^(R)Ｃ１０６ＥＰまたは全容量≧２．７ｅｑ／ｌを有する同等の樹脂で、好ましくは２５～４０℃、好ましくは３０～３５℃の範囲の温度で２～７％ＮａＣｌ溶液で処理される。

【0027】

工程ｂ）では、工程ａ）で溶出したＮａＣｌの水溶液を、０～８℃の温度で４～２４時間、最終ｐＨ値が１０～１１の間に達するまで無機塩基水溶液で処理して、リゾチーム塩基を得、これをまずろ過により回収し、次に最終ｐＨ間隔２．５～３．５になるまで塩酸水溶液に溶解させる。

【0028】

工程ｂ）で使用する無機塩基水溶液は、水酸化ナトリウムの４～８％ｗ／ｖ水溶液であることが好ましい。

【0029】

工程ｂ）では、粗リゾチーム塩基を、ＨＥＷの初期量に対して１／３０～１／６０ｖ／ｖの範囲の相対比で脱塩水中に分散させる。

【0030】

粗リゾチーム塩酸塩溶液は、工程ｃ）で、２～８％の塩酸水溶液を用いて最終的なｐＨ間隔を３．０～４．０に補正し、カットオフ１０ｋダルトンの限外ろ過膜と透析ろ過膜を用いて、無機塩を除去する限外ろ過及び／又は透析ろ過を行う。

【0031】

次に、工程ｄ）において、限外ろ過／透析ろ過された水溶液を任意に、４０℃～１００℃の範囲の温度で最大７日間、好ましくは７４℃で１時間、または９０℃で２～６分間加熱される。

【0032】

工程ｃ）またはｄ）で得られた溶液を最後に４０℃に加熱し、脱溶媒室温度が１６０～２２０℃の範囲でスプレードライ処理し、純粋な非晶質リゾチーム塩酸塩を得ることができる。

【0033】

工程ｄ）は、４０℃～１００℃の範囲の温度で最大７日間、好ましくは７４℃で１時間のスプレードライ処理後に得られた粉末状リゾチーム塩酸塩に対して代替的／同時に実施することができる（工程ｅ）。

【0034】

本発明はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス剤として、ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防または治療に使用するためのリゾチーム塩酸塩を提供し、任意に他の抗ウイルス剤および／または免疫抑制剤および／またはオボトランスフェリンと併用することができる。前記薬剤の例としては、クロロキン、ファビラビル、レムデシビル、アビガン、トシリズマブ、シクロスポリンＡ、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ミコフェノール酸モフェチル及びピメクロリムスなどが挙げられる。

【0035】

必要な治療用途のために、リゾチーム塩酸塩は、適切な医薬組成物を用いて、経口、局所、吸入または注射、静脈内、胃腸内、腹腔内、気管支内、鼻腔内または直腸内に投与される。

【0036】

次に、独立請求項に定義された範囲内の主題、条件およびパラメータの変形が本発明に含まれることを但し書きして、以下に報告される実施形態例によって、本発明を詳細に説明する。

【0037】

本発明に従って製造されたリゾチーム塩酸塩は、以下の一連の精製手順：ＨＥＷに存在する他の卵タンパク質からの粗リゾチーム塩基の分離、粗リゾチーム塩酸塩溶液の調製、無機塩の除去、ウイルスの不活化およびスプレードライ法による固体リゾチーム塩酸塩の分離、その後の熱処理、を含む精製プロセスによってＨＥＷから分離される。

【0038】

前記精製工程に従って製造されたリゾチーム塩酸塩は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して抗ウイルス活性を示す。特に、リゾチーム塩酸塩は、未感染細胞ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する予防的細胞保護作用を示し、既感染細胞では抗ウイルス作用を示した。

【0039】

粗ＨＥＷリゾチームは、以下の精製工程で精製した。原液のＨＥＷを、粒径３００～１６００μｍ、容量≧２．７ｅｑ／ｌのポリアクリルカチオン樹脂にロードし、ｐＨ間隔９．０～７．０で前処理を施した。ＨＥＷと樹脂の相対比は８～１２ｌ／ｌの範囲で、樹脂は１．０～１．５ベッド量の蒸留水で２回洗浄した。その後、樹脂を、２～７％の範囲の濃度および２５～４０℃の範囲の温度のＮａＣｌの水溶液の１．５～２．１ベッド容量で洗浄した。前記工程を実行するとき、樹脂は任意に、最大６０ｒｐｍの攪拌速度で攪拌下に維持することができる。

【0040】

ＮａＣｌの水溶液で溶出したフラクションを、４～８％ｗ／ｖ水酸化ナトリウムの水溶液で最終ｐＨ値が１０～１１の範囲で塩基処理を行い、得られた混合物を０～８℃で４～２４時間撹拌下に維持した。得られた沈殿物を吸引して回収した。湿潤固体を脱塩水（脱塩水と初期ＨＥＷとの相対比１／６０～１／１００ｌ／ｌ）中に撹拌下に分散させ、得られた混合物を２０～５０℃の範囲の温度で３０分～２時間撹拌下に維持し、塩酸の４～８％ｗ／ｖ水溶液で最終ｐＨ間隔２．５～３．５に調整した。次に、得られた溶液を攪拌下に２０～６０℃の範囲の温度で３０分～２時間加熱した後、冷却し、１～４％ｗ／ｖの水酸化ナトリウム水溶液を添加して最終ｐＨ値を８．０～１０の範囲の間隔に調整した。前記溶液を活性炭（粉末）で１～４時間撹拌下に処理し、次いでろ過した（フィルターは任意に脱塩水で洗浄することができる）。その後、ろ液（任意で洗浄水も）を２～８％塩酸水溶液で最終ｐＨを３．０～４．０に調整し、限外ろ過および／または透析ろ過して無機塩を除去した。次に、得られた水溶液を任意に４０℃から１００℃の範囲の温度で７日間まで加熱した後、４０℃まで冷却し、または直接４０℃まで加熱し、スプレードライヤー（脱溶媒室温度１６０～２２０℃）で処理して、純粋な非晶質リゾチーム塩酸塩を象牙色粉末（回収率９９％以上）として得た。また、スプレードライ処理後に得られた粉末状のリゾチーム塩酸塩に対して、溶液中のリゾチーム塩酸塩を４０℃～１００℃の温度で最大７日間（好ましくは７４℃で１時間）熱処理する上記工程を交互／同時に行うことも可能である。

【0041】

前記制御された熱処理は、本明細書に記載の製造方法により調製されたリゾチームに、前記処理後、ＨＰＬＣ純度及び酵素活性が変化しないリゾチームを変性させずに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス／殺ウイルス活性を付与するものである。特に、リゾチームを変性させない前記加熱処理であることが好ましく：
１．固形リゾチーム塩酸塩の場合：９９℃、４０分または７４℃、１時間での処理
２．リゾチーム塩酸塩の水溶液の場合：９０℃、２～６分間の加熱処理
が好ましい。

【0042】

前記工程で得られたリゾチーム塩酸塩は、鳥アブラウイルス１、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ９などの鳥類ウイルスを含まず、乾物に対する酵素測定値（酵素比濁法）＞９７．０％、好ましくは＞９８．０％、およびＨＰＬＣ純度＞９９．０％、好ましくは＞９９．５％を呈する。

【0043】

前記リゾチーム塩酸塩は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、０．７５～１．５ｍｇ／ｍｌの範囲でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して高い抗ウイルス活性を示した。

【0044】

リゾチーム塩酸塩の活性は、実質的に同じ濃度で、ウイルス感染にさらされた未感染細胞と既に感染した細胞に対して、細胞保護作用を示すことが確認されている。実際、リゾチーム塩酸塩の濃度が０．７５～１．５ｍｇ／ｍｌの範囲では、ウイルスの複製率は非常に低く、ゼロに近い状態であった。

【0045】

さらに、我々が発見したリゾチーム塩酸塩とオボトランスフェリンを３種類の濃度（１．２５、２．５、５ｍｇ／ｌ）で併用した場合のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性は、相乗効果があることが証明された。当該条件下では、オボトランスフェリン１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度が最も高い相乗効果を発揮した。得られた相乗的な抗ウイルス効果は用量依存的であり、リゾチーム濃度０．７５ｍｇ／ｍｌでウイルスの複製を完全に除去した（この濃度のリゾチーム塩酸塩、およびオボトランスフェリン非存在下では、ウイルスの複製は約６２％抑制された）。オボトランスフェリン単独で、１０ｍｇ／ｍｌから１．２５ｍｇ／ｍｌの範囲で濃度を変えて試験したが、当該範囲では抗ウイルス活性は検出されなかった。

【0046】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するリゾチーム塩酸塩の抗ウイルス活性は、リゾチーム塩酸塩（溶液および粉末）の熱処理と密接な関係があり、抗ウイルス活性と殺ウイルス活性の両方を示した。

【実施例】

【0047】

材料と方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に使用したオボトランスフェリン（製品コード ５０１Ｐ２００１Ｏ９０）は、Ｂｉｏｓｅｕｔｉｃａ ＢＶ（Ｌａｎｄｂｏｕｗｗｅｇ ８３ ３８９９ Ｚｅｅｗｏｌｄｅ ＢＤ（オランダ））で製造されている。

【0048】

リゾチーム塩酸塩のクロマトグラフィーによる純度測定のＨＰＬＣ法
・ＨＰＬＣカラム：ＴＳＫｇｅｌ逆相ＨＰＬＣカラム（ポリマーベース、Ｐｈｅｎｙｌ－５ＰＷ ＲＰ）、ＩＤ ４．６ｍｍｘ７．５ｃｍ（１０μｍ）；東ソー・バイオサイエンス社製
・検出器：ＵＶ
・波長：２８１ｎｍ
・試料の調製：リゾチーム塩酸塩８０ｍｇを水で２０ｍｌに希釈（４μｇ／μｌ）
・インジェクション量：２５μｌ
・移動相Ａ：水／アセトニトリル＝９０／１０ｖ／ｖ、０．２％トリフルオロ酢酸含有
・移動相Ｂ：水／アセトニトリル＝３０／７０ｖ／ｖ、０．２％トリフルオロ酢酸含有
・溶出：以下の組成による。

【0049】

【表1】

【0050】

測定値の決定（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を用いた酵素比濁法）：ＦＩＰ法（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｚｙｍｅ，Ｅｄ １９９７，８４，３７５）およびＪ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．誌による。２００１；５３（４）；５４９－５４。

【実施例1】

【0051】

ＨＥＷのクロマトグラフィーによる精製
吸収段階：３０リットルのＨＥＷを３リットル／時間の供給速度で、３００～１６００μｍの範囲の粒子径と２．７ｅｑ／ｌ以上の容量を有する弱酸性マクロポーラスカチオニックポリアクリル樹脂２．９リットルを含むＮｕｔｓｃｈｅフィルターを備えた乾燥機にロードし、炭酸ナトリウムの水溶液（１５％ｗ／ｗ）でｐＨ８．０に前調整し、水で洗浄して窒素で流し、重力で溶離液を収集した。その後、樹脂を攪拌下に維持しながら１ベッド量の脱塩水を投入し、得られた懸濁液を攪拌下に２０分間維持した後、重力により水を排出し、当該処理を同じ実験条件でもう１度繰り返した。

【0052】

溶出段階：３０～３５℃の３．５％ＮａＣｌ水溶液（１．８ベッド容量）を重力で溶出させる。

【0053】

粗リゾチーム塩基の沈殿：６％ＮａＯＨの水溶液（ｗ／ｖ）を、２０～２５℃で攪拌しながら、最終ｐＨ値が１０．５±２になるまで、先の粗リゾチーム塩基の２％水溶液に添加した。その後、得られた溶液を１２～１８時間で４℃まで冷却し、攪拌下に当該温度で６時間維持した。得られた沈殿物を吸引して回収した。

【0054】

精製リゾチーム塩酸塩の非晶質粉末の調製：前工程で得られた湿潤固体を、３５℃の脱塩水（０．６６ｌ）中で１時間撹拌下に分散させ、その後、６％ｗ／ｖ塩酸水溶液を最終ｐＨ値２．９±０．１に達するまで添加した。次に、得られた溶液を４０℃で１時間攪拌下に加熱した後、冷却し、２％ｗ／ｖ水酸化ナトリウム水溶液を加えて最終ｐＨ値が８．５から９．０の範囲となるようにした。前記溶液にチャコール（粉末）（２．５ｇ）を加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。次に得られた懸濁液を吸引ろ過し、そのフィルターを水（１６ｍｌ）で洗浄した。ろ液と洗浄水を回収し、６％ｗ／ｖ塩酸水溶液を３２℃以下の温度で最終ｐＨ値３．６±０．２になるまで添加した。得られた溶液を限外ろ過（カットオフ１０ｋダルトン）し、３０％ｗ／ｖのリゾチーム塩酸塩含量を得、透析ろ過（カットオフ１０ｋダルトン）して存在する無機塩類を除去した。次に、得られた水溶液を７４℃で１時間、あるいは９０℃で２～６分間加熱した後、４０℃に冷却し、スプレードライヤー（脱溶媒室温度１８０℃）で処理して、純粋な非晶質リゾチーム塩酸塩を象牙色粉末（１０５ｇ、回収効率９９％）として得た。

【0055】

得られた生成物のアッセイ値（比濁法）は９８．６％、ＨＰＬＣ純度は９９．７％であった。

【0056】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するリゾチーム塩酸塩のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性の評価
リゾチーム塩酸塩の無毒性濃度の測定
細胞毒性は、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓の上皮細胞）に対するリゾチーム塩酸塩の効果を確立することによってモニターされた。１ｘ１０^４細胞／ウェルの濃度で９６－ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、リゾチーム塩酸塩またはクロロキン（対照として）の連続希釈液で、最終容量２００μｌで、細胞を３重に処理した。５％ＣＯ_２、３７℃で７２時間培養後、細胞生存率をＭＴＴアッセイで測定した（Ｄ’Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ，Ｍ．ら、，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， ｄｉｈｙｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ａｎｄ ａｒｔｅｍｉｓｏｎｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｍｂｒｙｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．２４１（２００７）６６－７４．Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｏｘ．２００７．０８．０８４）。

【0057】

データは、下記式により細胞生存率（％）として算出した。
［（サンプルの吸光度－無細胞サンプルのブランク）／培地の対照の平均吸光度］ｘ１００。

【0058】

未処理の対照細胞に比べ、５０％のＶｅｒｏ細胞を死滅させる５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を決定した。光学顕微鏡で目に見える形態変化を観察した。

【0059】

Ｖｅｒｏ細胞に対するリゾチーム塩酸塩のＣＣ５０は１３．３ｍｇ／ｍｌと測定された。

【0060】

オボトランスフェリンとクロロキンの無毒性濃度の測定
オボトランスフェリンとクロロキン（ＣＱ）の細胞毒性は、リゾチーム塩酸塩で用いた方法と同様にＭＴＴアッセイで測定した。オボトランスフェリンは最大濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）で無毒であることが証明された（対照細胞と比較して１００％の生存率）。ＣＱのＣＣ５０とＣＣ１０はそれぞれ９５．３±１８と２０．９３±４．３９μｇであることが証明された。

【0061】

鼻咽頭スワブからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の分離
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は５００μｌの鼻咽頭スワブから分離し、８０％コンフルエントのＶｅｒｏ細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ_２で３時間培養した後に接種物を除去し、細胞障害作用が明らかになった時点で３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間培養をした。

【0062】

細胞上清中のウイルスコピー数は、特異的定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）で測定した（（世界保健機関（ＷＨＯ）。コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）技術ガイダンス。ヒトにおける２０１９－ｎＣｏＶの検査室検査。ＵＳ ＣＤＣ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ２０１９－Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（２０２０年１月２８日）。Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｍｅｄｉａ／１３４９２２／ｄｏｗｎｌｏａｄ［ｌａｓｔ ａｃｃｅｓｓ ２０ Ｍａｒｃｈ ２０２０］。

【0063】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は製造元の指示に従いＰＥＧで沈殿させ、１０～１０^９の希釈倍率でＰｌａｑｕｅ Ａｓｓａｙによりウイルス量を測定した。

【0064】

以下の実験では、ウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）が０．０５となるように使用した。

【0065】

細胞感染と化合物の処理
Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェルプレートに１×１０^４個／ウェルの密度で播種し、５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間培養した。その後、ＭＯＩ ０．０５（１０００ＰＦＵ／ウェル）で感染させ、５％ＣＯ_２、３７℃で２時間培養した。その後、ウイルスを除去し、リゾチーム塩酸塩またはクロロキン（対照として）を異なる濃度で含む培地で処理し、３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間培養した。プレインキュベーションの工程を追加したプロトコルを実施した。細胞単層に添加する前に、様々な濃度のリゾチーム塩酸塩の存在下で３７℃、１時間ウイルス（ＭＯＩ ０．０５）を培養した。

【0066】

リゾチーム塩酸塩の抗ウイルス作用の評価
細胞上清中のウイルスコピー数は、特異的定量リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により定量化した。

【0067】

結果（表１）は、未処理の感染Ｖｅｒｏ細胞での複製を考慮し、１００％となるようにウイルス複製率で表した。

【0068】

さらに、化合物の殺ウイルス活性を確認するために、６ウェルプレートに植え付けたウイルス＋化合物の細胞に接種した後、プラークテストを実施した。簡単に説明すると、接種後、細胞を０．３％のアガロースで覆い、細胞培地に溶かし、３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間培養したものである。アガロースを除去した後、４％ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定し、メチレンブルーで染色した。各ウェルのプラークを数え、結果をプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬとして、また未処理対照と処理細胞のＰＦＵ間の比率として表した。

【0069】

【表2】

【0070】

各実験は二重または三重に行われ、独立した２つの実験が行われた。

【0071】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するリゾチーム塩酸塩およびオボトランスフェリンの抗ウイルス活性
オボトランスフェリン単独で、１０ｍｇ／ｍｌから１．２５ｍｇ／ｍｌの範囲で濃度を変えて試験したが、当該区間では抗ウイルス活性は検出されなかった。表２は、リゾチーム塩酸塩と３つの異なる濃度のオボトランスフェリンを組み合わせた場合の抗ウイルス活性を、ΔＣｔとウイルス複製率（３回の実験の平均値）で表したものである。すべての条件下で、オボトランスフェリンはリゾチーム塩酸塩の抗ウイルス活性を増加させた。興味深いことに、最低濃度のオボトランスフェリン（１．２５ｍｇ／ｍｌ）が最も高い相乗効果を示した。得られた抗ウイルス作用の相乗効果は、用量依存的である。

【0072】

【表3】

【0073】

表３は、リゾチーム塩酸塩とリゾチーム塩酸塩にオボトランスフェリンを配合した場合のウイルス複製率の比較データを示す。

【0074】

【表4】

【0075】

殺ウイルス活性
リゾチーム塩酸塩の殺ウイルス活性を確認するために、熱処理したリゾチーム塩酸塩（９９℃、４０分）と非熱処理したリゾチーム塩酸塩を用いて、プラークのアッセイを実施した。表４は、得られた結果を平均ＰＦＵ／ｍｌで表したものである（３回の実験の平均値）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染力は、０．４２ｍｇ／ｍｌ、０．５６ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌで、それぞれ５７．２％、５８．９％、６９．６％減少した。非加熱処理したリゾチーム塩酸塩は、どの用量でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染力を低下させることはなかった（表４）。

【0076】

【表5】

【0077】

表５では、異なる実験条件で熱処理したリゾチーム塩酸塩の試料の酵素活性とＨＰＬＣ純度を比較分析し、異なる温度、乾燥処理時間（固体製品上）または水溶液中での処理時間を評価し、１試料あたり平均９回の実験でウイルスの複製度で表される活性との比較により検討した。得られたデータから、実施したすべての熱処理が高い抗ウイルス活性をもたらすことが確認され、調べたすべてのサンプルで熱劣化（変性）がないことが確認された。ただし、水溶液で６分を超える時間処理したサンプルでは、ＨＰＬＣ純度の著しい低下（－３～－４％）と酵素活性の著しい低下（－８～－１２％）が観察された。

【0078】

最初にＨＰＬＣ分析と酵素活性で確認した、調べた試料に熱劣化がないことは、さらにＤ_２Ｏ溶液中の試料のＨＳＱＣ ＮＭＲ（異核一量子相関核磁気共鳴）分析で確認された。熱処理していないネイティブなリゾチームと乾熱処理（９９℃、４０分）したリゾチームの^１Ｈ－^１３Ｃ－ＨＳＱＣスペクトルは同じであり、熱処理したリゾチームが変性していないことが確認された。

【0079】

【表6】

【手続補正書】

【提出日】2022-03-08

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

鶏卵白からリゾチーム塩酸塩を精製する方法であって、
ａ）原液の鶏卵白から弱酸性カチオン樹脂を用い、攪拌下で粗リゾチーム塩基を単離し、その後、生理食塩水で溶出する工程、
ｂ）工程ａ）で溶出した生理食塩水を、０～８℃の温度で４～２４時間、最終ｐＨ値が１０～１１の間に達するまで無機塩基水溶液で処理し、まずろ過により回収した後、最終ｐＨ間隔２．５～３．５となるまで塩酸の水溶液に溶かしてリゾチーム塩基を得ることにより、リゾチーム塩酸塩の粗溶液を調製する工程、
ｃ）無機塩類を除去する工程、
ｄ）ウイルスの不活性化／抗ウイルス剤の活性化をする工程、
ｅ）スプレードライ法により非晶質リゾチーム塩酸塩を分離する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られたリゾチーム塩酸塩を熱処理する工程、
を含む方法。

【請求項2】

工程ａ）において、ｐＨ７．０～９．０に事前調整された、粒径範囲３００～１６００μｍの弱酸性ポリアクリルマクロポーラスカチオニック樹脂が使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程ａ）において、炭酸ナトリウムの１５％ｗ／ｗ水溶液でｐＨを調整する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

工程ａ）において、原液の鶏卵白と樹脂との相対比が８～１２ｌ／ｌの範囲である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

工程ａ）において、樹脂を最大６０ｒｐｍの攪拌速度および２５℃から４０℃の範囲の温度で攪拌下に維持する、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

工程ａ）において、弱酸性カチオン性樹脂がピューロライト^(R)Ｃ１０６ＥＰまたは同等品であり、総容量≧２．７ｅｑ／ｌである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

工程ａ）において、樹脂を２５～４０℃、好ましくは３０～３５℃の範囲の温度で２～７％ＮａＣｌ溶液で溶出する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

工程ｂ）の水性無機塩基が水酸化ナトリウムの４～８％ｗ／ｖ水溶液である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

工程ｂ）において、粗リゾチーム塩基を、鶏卵白の初期量に対して１／３０～１／６０ｖ／ｖの範囲の相対比で脱塩水中に溶解させる、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

工程ｃ）において、粗リゾチーム塩酸塩溶液を、２～８％塩酸水溶液を用いて、最終ｐＨ３．０～４．０の範囲に調整し、限外ろ過および／または透析ろ過により無機塩を除去する、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

工程ｃ）が、１０ｋダルトンのカットオフを有する限外ろ過膜および透析ろ過膜を用いて実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

工程ｄ）において、限外濾過／透析ろ過水溶液を４０℃～１００℃の範囲の温度で最大７日間、好ましくは９０℃で２～６分間加熱する、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

工程ｆ）において、工程ｅ）で得られた粉末に対して、４０℃～１００℃の範囲の温度で最大７日間、好ましくは７４℃で１時間又は９９℃で４０分間、リゾチーム塩酸塩の熱処理を行う、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

加熱処理したリゾチームが、処理終了時に不変のクロマトグラフィー純度および酵素活性を示す（±１．０％）、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

工程ｅ）において、工程ｃ）またはｄ）で得られた溶液を４０℃で加熱し、スプレードライヤーで処理する、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

工程ｅ）において、脱溶媒室の温度が１６０～２２０℃の範囲にあり、純粋な非晶質リゾチーム塩酸塩を提供する、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス剤として使用するための、請求項１～１６に記載の方法により得られるリゾチーム塩酸塩。

【請求項18】

クロロキン、ファビラビル、レムデシビル、アビガン、トシリズマブ、シクロスポリンＡ、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ミコフェノール酸モフェチル及びピメクロリムスから選ばれる抗ウイルス剤及び／又は免疫抑制剤と組み合わせて用いる、請求項１７による使用のためのリゾチーム塩酸塩。

【請求項19】

オボトランスフェリンと組み合わせて用いる、請求項１８に記載の使用のためのリゾチーム塩酸塩。

【請求項20】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の予防及び治療のための、経口、局所、吸入、注射、静脈内、胃腸内、腹腔内、胸膜内、気管支内、鼻腔内又は直腸用の医薬組成物であって、抗ウイルス有効量のリゾチーム塩酸塩、任意でオボトランスフェリンと適切な担体及び／又は賦形剤との組み合わせを含む、医薬組成物。

【国際調査報告】